Anti-ox40l / il-31rΑ bispecific antibody and uses thereof

Abstract

The present invention provides an anti-OX40L / IL-31Rot bispecific antibody and uses thereof. Specifically, the present invention provides for the first time a bispecific antibody that simultaneously targets OX40L and IL-31Rot for the treatment of skin diseases such as atopic 5 dermatitis (AD). The anti-OX40L / IL-31Rot bispecific antibody of the present invention exhibits high binding activity to both OX40L and IL-31Rot, synergistically regulates pathogenic T cells, effectively suppresses pruritus while providing long-lasting therapeutic efficacy, thereby offering patients a better treatment experience. The bispecific antibody of the present invention has promising applications in the treatment of skin diseases.

Description

Anti-OX40L / IL-31Rα Bispecific Antibody and Uses ThereofTECHNICAL FIELD

[0001] The present invention relates to the field of biomedicine, and specifically to an anti-OX40L / IL-31Rα bispecific antibody and uses thereof.BACKGROUND ART

[0002] According to the Global Burden of Disease, the global prevalence of atopic dermatitis (AD) has increased annually over the past 30 years (1987-2017) , with up to one-fifth of the population in developed countries affected by AD. AD is a disease with complex etiology and high heterogeneity. It manifests as a wide range of diverse symptoms, severely impacting patients' quality of life. Statistics indicate that it affects approximately 15%-20%of children and 10%of adults in the United States. Additionally, two studies from the United States reported that the total direct and indirect costs for children and adults reached as high as $3, 300 per person per year in 2013. In recent years, the number of AD patients in China has shown an increasing trend annually, and AD has developed into a common refractory skin disease in dermatology.

[0003] Studies have shown that T-cell imbalance is the fundamental cause of AD. OX40 / OX40L, as one of the major cytokines regulating T cells, is one of the therapeutic targets for AD. Several anti-OX40 / OX40L monoclonal antibodies, represented by Sanofi's Amlitelimab, have demonstrated positive clinical effects. Amlitelimab, which targets OX40L, not only shows efficacy not inferior to another approved AD-specific drug (the IL-4R-targeting monoclonal antibody dupilumab) , but also exhibits excellent long-lasting activity in its Phase IIb 52-week data. This may be closely related to its broader regulatory activity on T cells compared to IL-4R, validating the effectiveness of targeting OX40 / OX40L in the treatment of AD.

[0004] The cytokine IL-31 plays a key role in the pathogenesis of both atopic dermatitis and prurigo nodularis (PN) . Prurigo nodularis (PN) is a refractory chronic pruritic disease and the most common subtype of chronic prurigo. It is estimated that more than 180,000 people in the United States suffer from PN. Among various chronic pruritic diseases, PN has the highest intensity and frequency of itching. Long-term recurrent severe itching severely affects patients' quality of life. Patients with PN suffer from a range of debilitating symptoms over the long term, including, in addition to itching, skin nodules covering large areas of the body and poor sleep quality.

[0005] IL-31 initiates itching by binding to the heterodimeric receptor IL-31Rα on itch-sensing neurons and is a cytokine directly involved in pruritus. Monoclonal antibodies targeting IL-31Rα can specifically inhibit IL-31 cytokine signaling, thereby suppressing the pruritus induced by such signaling, as well as pathological conditions including pro-inflammatory responses and epidermal fibrosis mediated by this signaling pathway. Based on its positive performance in the Phase III OLYMPIA clinical trial, Nemluvio (Nemolizumab) from Galderma received FDA approval for marketing in August 2024, and also met all clinical endpoints in two Phase III ARCADIA clinical trials for the treatment of AD.

[0006] Bispecific antibodies represent a novel class of therapeutic antibodies with potential therapeutic advantages in clinical applications. However, there are currently no bispecific antibodies in the art that simultaneously target OX40L and IL-31Rα for the treatment of pruritic skin diseases.

[0007] Therefore, there is an urgent need in the art to develop bispecific antibodies that simultaneously target OX40L and IL-31Rα.SUMMARY OF THE INVENTION

[0008] An object of the present invention is to provide a bispecific antibody that simultaneously targets OX40L and IL-31Rα.

[0009] In a first aspect of the present invention, provided is a bispecific antibody, wherein the bispecific antibody comprises:

[0010] a first antigen-binding domain D1, and

[0011] a second antigen-binding domain D2;

[0012] wherein the D1 specifically binds to the target molecule OX40L protein, and the D2 specifically binds to the target molecule IL-31Rα protein.

[0013] In another preferred embodiment, said D1 is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to OX40L protein.

[0014] In another preferred embodiment, said D2 is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to IL-31Rα protein.

[0015] In another preferred embodiment, the antibody comprises: a nanobody, a single-chain antibody, a diabody, a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a murine antibody, or a humanized antibody.

[0016] In another preferred embodiment, the antigen-binding fragment comprises a Fab fragment, an F (ab') 2 fragment, an Fv fragment, or a single-chain Fv (scFv) .

[0017] In another preferred embodiment, the D1 and / or D2 is a VHH.

[0018] In another preferred embodiment, the D2 and / or D1 is an IgG antibody.

[0019] In another preferred embodiment, the D1 comprises one, two, three, or more anti-OX40L VHHs.

[0020] In another preferred embodiment, the D1 comprises two anti-OX40L VHHs.

[0021] In another preferred embodiment, the D2 is an IgG antibody.

[0022] In another preferred embodiment, the IgG antibody is an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 antibody.

[0023] In another preferred embodiment, the D1 is connected to the N-terminus of the heavy chain of D2.

[0024] In another preferred embodiment, the D1 and said D2 are connected via a linker or directly connected.

[0025] In another preferred embodiment, the bispecific antibody comprises an anti-IL-31Rα IgG antibody and an anti-OX40L VHH, wherein the anti-OX40L VHH is tandemly connected via a linker to the anti-IL-31Rα IgG antibody.

[0026] In another preferred embodiment, said bispecific antibody comprises one or more anti-OX40L VHHs.

[0027] In another preferred embodiment, the bispecific antibody comprises two anti-OX40L VHHs.

[0028] In another preferred embodiment, the anti-OX40L VHH is connected to the heavy chain variable region of the anti-IL-31Rα IgG antibody.

[0029] In another preferred embodiment, the bispecific antibody is a homodimer or a heterodimer.

[0030] In another preferred embodiment, the bispecific antibody is a homodimer.

[0031] In another preferred embodiment, the bispecific antibody comprises a monomer having the structure of Formula I from the N-terminus to the C-terminus:

[0032] wherein,

[0033] VHH represents an anti-OX40L VHH;

[0034] VH represents the heavy chain variable region of the anti-IL-31Rα antibody;

[0035] VL represents the light chain variable region of the anti-IL-31Rα antibody;

[0036] CH represents the heavy chain constant region;

[0037] CL represents the light chain constant region;

[0038] L represents a linker or bond;

[0039] “～” represents a disulfide bond;

[0040] “-” represents a peptide bond.

[0041] In another preferred embodiment, the anti-OX40L VHH comprises the following three complementarity-determining regions HCDR:

[0042] HCDR1 as set forth in SEQ ID NO: 1 or 2; HCDR2 as set forth in SEQ ID NO: 3; and HCDR3 as set forth in SEQ ID NO: 4 or 5.

[0043] In another preferred embodiment, the anti-OX40L VHH comprises a complementarity-determining region HCDR selected from the group consisting of:

[0044] (1) HCDR1 as set forth in SEQ ID NO: 1; HCDR2 as set forth in SEQ ID NO: 3; and HCDR3 as set forth in SEQ ID NO: 4;

[0045] (2) HCDR1 as set forth in SEQ ID NO: 1; HCDR2 as set forth in SEQ ID NO: 3; and HCDR3 as set forth in SEQ ID NO: 5; or

[0046] (3) HCDR1 as set forth in SEQ ID NO: 2; HCDR2 as set forth in SEQ ID NO: 3; and HCDR3 as set forth in SEQ ID NO: 4.

[0047] In another preferred embodiment, the amino acid sequence of the VHH is as set forth in any one of SEQ ID NO: 6, 8, or 10.

[0048] In another preferred embodiment, the anti-IL-31Rα antibody comprises the following three complementarity-determining regions HCDR:

[0049] HCDR1 as set forth in SEQ ID NO: 12 or 15; HCDR2 as set forth in SEQ ID NO: 13 or 16; and HCDR3 as set forth in SEQ ID NO: 14.

[0050] In another preferred embodiment, the anti-IL-31Rα antibody comprises complementarity-determining regions HCDR selected from the group consisting of:

[0051] (1) HCDR1 as set forth in SEQ ID NO: 12; HCDR2 as set forth in SEQ ID NO: 13; and HCDR3 as set forth in SEQ ID NO: 14; or

[0052] (2) HCDR1 as set forth in SEQ ID NO: 15; HCDR2 as set forth in SEQ ID NO: 16; and HCDR3 as set forth in SEQ ID NO: 14.

[0053] In another preferred embodiment, the anti-IL-31Rα antibody comprises the following three complementarity-determining regions LCDR:

[0054] LCDR1 as set forth in SEQ ID NO: 17; LCDR2 as set forth in SEQ ID NO: 18; and LCDR3 as set forth in SEQ ID NO: 19.

[0055] In another preferred embodiment, the VH sequence of the anti-IL-31Rα antibody is as set forth in SEQ ID NO: 20 or 22.

[0056] In another preferred embodiment, the VL sequence of the anti-IL-31Rα antibody is as set forth in SEQ ID NO: 24.

[0057] In another preferred embodiment, the heavy chain constant region is selected from human IgG1, human IgG2, human IgG3, or human IgG4.

[0058] In another preferred embodiment, the heavy chain constant region comprises CH1, CH2, and CH3.

[0059] In another preferred embodiment, the light chain constant region is selected from human κ (Kappa) or human λ (Lambda) .

[0060] In another preferred embodiment, the sequence of the linker L is (G4S) n, preferably, n is 1-5.

[0061] In another preferred embodiment, the amino acid sequence of the linker L is as set forth in SEQ ID NO: 26.

[0062] In another preferred embodiment, the sequence of the bispecific antibody is as follows:

[0063] (1) said bispecific antibody has a heavy chain amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, or 37, and said bispecific antibody has a light chain amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0064] (2) a polypeptide derived from (1) , wherein the derivation refers to a sequence formed by substitution, deletion, or addition of one or more amino acid residues, and the polypeptide has a polypeptide sequence with both anti-OX40L activity and anti-IL-31Rα activity.

[0065] In another preferred embodiment, the bispecific antibody comprises active fragments and / or derivatives thereof, wherein the active fragments and / or said derivatives retain 70-100% (such as 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) of the anti-OX40L activity and 70-100% (such as 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) of the anti-IL-31Rα activity of the bispecific antibody.

[0066] In another preferred embodiment, the derivative of said bispecific antibody is a polypeptide obtained by one or several amino acid mutations (amino acid deletion, insertion, and / or substitution) of said bispecific antibody and retaining at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity.

[0067] In another preferred embodiment, the amino acid mutation is a conservative amino acid substitution.

[0068] In another preferred embodiment, the amino acid mutation is located in a framework region or a constant region.

[0069] In another preferred embodiment, the bispecific antibody has a heavy chain amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 27 or 29, and the bispecific antibody has a light chain amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39.

[0070] In another preferred embodiment, the bispecific antibody has a heavy chain amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 31 or 33, and the bispecific antibody has a light chain amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39.

[0071] In another preferred embodiment, the bispecific antibody has a heavy chain amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 35 or 37, and the bispecific antibody has a light chain amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39.

[0072] In another preferred embodiment, the bispecific antibody has activity of simultaneously binding OX40L and binding IL-31Rα.

[0073] In another preferred embodiment, the bispecific antibody blocks the binding of OX-40L and OX-40LR.

[0074] In another preferred embodiment, the bispecific antibody blocks the binding of IL-31 and IL-31Rα.

[0075] In a second aspect of the present invention, provided is a polynucleotide molecule, the polynucleotide molecule encoding the bispecific antibody according to the first aspect of the present invention.

[0076] In another preferred embodiment, the polynucleotide molecule is as set forth in any one of SEQ ID NO: 28, 30, 32, 34, 36, 38, or 40.

[0077] In a third aspect of the present invention, provided is an expression vector, the expression vector containing the polynucleotide molecule according to the second aspect of the present invention.

[0078] In another preferred embodiment, the expression vector is a virus or plasmid, preferably a lentivirus, bacteriophage, or phagemid.

[0079] In another preferred embodiment, the expression vector is selected from the group consisting of: pcDNA3.4, pDR1, pcDNA3.1 (+) , pcDNA3.1 / ZEO (+) , pDHFR, pTT5, pDHFF, pGM-CSF, or pCHO 1.0, preferably pcDNA3.4.

[0080] In a fourth aspect of the present invention, provided is a host cell, the host cell containing the expression vector according to the third aspect of the present invention.

[0081] In another preferred embodiment, the host cell is selected from the group consisting of: COS, CHO, NS0, sf9, sf21, DH5α, BL21 (DE3) , or TG1, more preferably E. coli TG1, BL21 (DE3) cells (expressing single-chain antibodies or Fab antibodies) or CHO-K1 cells (expressing full-length IgG antibodies) .

[0082] In another preferred embodiment, the host cell is a eukaryotic cell, preferably a CHO cell or a 293F cell.

[0083] In a fifth aspect of the present invention, provided is a method for preparing the bispecific antibody according to the first aspect of the present invention, the preparation method comprising the following steps:

[0084] a) culturing the host cell according to the fourth aspect of the present invention under expression conditions, thereby expressing the bispecific antibody;

[0085] b) isolating and purifying the bispecific antibody from step a) .

[0086] In a sixth aspect of the present invention, provided is a pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition comprising an effective amount of the bispecific antibody according to the first aspect of the present invention and one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents, or excipients.

[0087] In a seventh aspect of the present invention, provided is a use of the bispecific antibody according to the first aspect of the present invention, or the pharmaceutical composition according to the sixth aspect of the present invention, in the manufacture of a medicament for treating a skin disease, a pruritic disease, or an inflammatory disease.

[0088] In another preferred embodiment, the skin disease is a pruritic skin disease.

[0089] In another preferred embodiment, the skin disease is selected from the group consisting of: atopic dermatitis (AD) , prurigo nodularis (PN) , pruritus, chronic dermatitis, urticaria, psoriasis, rheumatism, arthritis, allergy, inflammatory bowel disease, chronic kidney disease, interstitial lung disease associated with systemic sclerosis, celiac disease, hidradenitis suppurativa, asthma, eczema, systemic scleroderma, poikiloderma, alopecia, alopecia areata, autoimmune disease, or associated pruritus, skin lesions, or inflammation.

[0090] In another preferred embodiment, the disease is associated with the IL-31 / IL-31RA and / or OX40 / OX40L signaling pathway.

[0091] In another preferred embodiment, the disease is associated with high expression of IL-31 / IL-31RA and / or OX40 / OX40L.

[0092] In an eighth aspect of the present invention, provided is an immunoconjugate, the immunoconjugate comprising:

[0093] (a) the bispecific antibody according to the first aspect of the present invention; and

[0094] (b) a conjugate moiety selected from the group consisting of: a detectable label, a drug, a toxin, a cytokine, a radionuclide, or an enzyme.

[0095] In another preferred embodiment, the immunoconjugate includes an antibody-drug conjugate (ADC) .

[0096] In another preferred embodiment, the immunoconjugate is for use in the preparation of a pharmaceutical composition for treating a skin disease.

[0097] In a ninth aspect of the present invention, provided is a method for treating a skin disease, a pruritic disease, or an inflammatory disease, the method includes administering to a subject in need thereof the bispecific antibody according to the first aspect of the present invention, the pharmaceutical composition according to the sixth aspect of the present invention, or the immunoconjugate according to the eighth aspect of the present invention.

[0098] In another preferred embodiment, the method further includes co-administration with other skin disease drugs.

[0099] In a ninth aspect of the present invention, provided is an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to IL-31RA, comprising a heavy chain variable region VH and a light chain variable region VL, wherein the VH comprises heavy chain complementarity determining regions HCDR1-3, and the VL comprises light chain complementarity determining regions LCDR1-3, wherein the amino acid sequence of HCDR3 is as set forth in SEQ ID NO: 14; and the amino acid sequences of LCDR1-3 are as set forth in SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 19, respectively.

[0100] In another preferred embodiment, the amino acid sequence of HCDR1 of the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to IL-31RA is DYNMX1, wherein X1 is selected from N or H; the amino acid sequence of HCDR2 is NIDPYYX2ITX3X4NQX5FKG, wherein X2 is selected from D or G, X3 is selected from S or T, X4 is selected from Y or F, and X5 is selected from M or K.

[0101] In another preferred embodiment, the amino acid sequence of HCDR1 is as set forth in SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 15; the amino acid sequence of HCDR2 is as set forth in SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 16.

[0102] In another preferred embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to IL-31RA is selected from any one of the following:

[0103] (1) a VH as set forth in SEQ ID NO: 20, and a VL as set forth in SEQ ID NO: 24;

[0104] (2) a VH as set forth in SEQ ID NO: 22, and a VL as set forth in SEQ ID NO: 24;

[0105] (3) a VH as set forth in SEQ ID NO: 55, and a VL as set forth in SEQ ID NO: 56;

[0106] (4) a VH as set forth in SEQ ID NO: 57, and a VL as set forth in SEQ ID NO: 58; or

[0107] (5) an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to IL-31RA having at least 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%amino acid sequence identity to the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to IL-31RA according to any one of (1) to (4) ; preferably, having at least 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%amino acid sequence identity in the framework region to the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to IL-31RA according to any one of (1) to (4) .

[0108] In a tenth aspect of the invention, provided is a use of the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to IL-31RA according to the ninth aspect of the invention in the manufacture of a medicament for treating or preventing a pruritic disease, an inflammatory disease, or a skin disease; preferably, the disease is associated with IL-31 or IL-31R.

[0109] In another preferred embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to IL-31RA is for use in the manufacture of a medicament for treating or preventing pruritus, atopic dermatitis, chronic dermatitis, urticaria, psoriasis, rheumatism, arthritis, allergy, inflammatory bowel disease, prurigo nodularis, chronic kidney disease, systemic scleroderma, poikiloderma, alopecia, alopecia areata, or associated pruritus, skin lesion, inflammation, or sleep disorder.

[0110] It is to be understood that within the scope of the present invention, the various technical features of the present invention described above and the various technical features specifically described below (e.g., in the examples) may be combined with each other to constitute new or preferred technical solutions. Due to space limitations, each and every one is not exhaustively described herein.BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0111] Figure 1A shows a schematic structural diagram of the bispecific antibody of the present invention.

[0112] Figure 1B shows an HPLC-SEC chromatogram of the bispecific antibody.

[0113] Figure 2 shows the binding activity of the bispecific antibody to human OX40L protein.

[0114] Figure 3 shows the ability of the bispecific antibody to block the binding of human OX40R to human OX40L.

[0115] Figure 4 shows the ability of the bispecific antibody to block the binding of human OX40L to 293F-OX40-puro cells.

[0116] Figure 5 shows the binding activity of the bispecific antibody to human IL-31Rα protein.

[0117] Figure 6 shows the ability of the bispecific antibody to block the binding of human IL-31 to 292FT-IL-31RA-OSMR cells.

[0118] Figure 7 shows the ability of the bispecific antibody to inhibit signal activation in human OX40 (luc) HEK293 Reporter Cells.

[0119] Figure 8 shows the ability of the bispecific antibody to inhibit the proliferation of BaF3-IL-31RA-OSMR cells.

[0120] Figure 9 shows the ability of the bispecific antibody to inhibit IL-6 secretion by DU145 cells.

[0121] Figure 10 shows the ability of the bispecific antibody to inhibit IFN-γ secretion by PBMCs.

[0122] Figure 11 shows the inhibitory effect of a human anti-IL-31RA antibody on IL-31-induced pruritus.

[0123] Figure 12 shows the effect of a human anti-IL-31RA antibody on changes in clinical scores of alopecia areata in mice. Data are expressed as mean ± SEM.

[0124] Figure 13 shows the effect of a human anti-IL-31RA antibody on changes in the hair loss rate in mice with alopecia areata. Data are expressed as mean ± SEM.

[0125] Figure 14 shows changes in skin scores in a pharmacodynamic evaluation test of a cynomolgus monkey atopic dermatitis model.

[0126] Figure 15 shows statistical results of scratching frequency in a pharmacodynamic evaluation test of a cynomolgus monkey atopic dermatitis model.

[0127] Figure 16 shows the results of histopathological scoring of skin tissue in a pharmacodynamic evaluation test of a cynomolgus monkey atopic dermatitis model.

[0128] Figure 17 shows the detection results of cytokine IL-25 in skin tissue on day 28 in a pharmacodynamic evaluation test of a cynomolgus monkey atopic dermatitis model.

[0129] Figure 18 shows the detection results of cytokine IL-4 in skin tissue on day 28 in a pharmacodynamic evaluation test of a cynomolgus monkey atopic dermatitis model.

[0130] Figure 19 shows the detection results of cytokine TSLP in skin tissue on day 28 in a pharmacodynamic evaluation test of a cynomolgus monkey atopic dermatitis model.

[0131] Figure 20 shows the detection results of cytokine IL-33 in skin tissue on day 28 in a pharmacodynamic evaluation test of a cynomolgus monkey atopic dermatitis model.

[0132] Figure 21 shows the detection results of cytokine IL-6 in skin tissue on day 28 in a pharmacodynamic evaluation test of a cynomolgus monkey atopic dermatitis model.

[0133] DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS

[0134] Through extensive and in-depth research, the inventors have for the first time provided a bispecific antibody that simultaneously targets OX40L and IL-31Rα for the treatment of atopic dermatitis (AD) and similar skin diseases. On one hand, the two targets, OX40L and IL-31Rα, exhibit synergy in regulating pathogenic T cells and pro-inflammatory cytokines produced by T cells; on the other hand, by simultaneously targeting OX40L to achieve long-lasting efficacy in the treatment of AD, and blocking the IL-31 pathway to achieve rapid and effective suppression of pruritus, a better treatment experience is provided for patients, thereby achieving complementary functions that cannot be realized by either monoclonal antibody alone. The bispecific antibody of the present invention simultaneously exhibits high binding activity to both OX40L and IL-31Rα, demonstrating promising applications in the treatment of skin diseases. The present invention has been accomplished on this basis.

[0135] TERMINOLOGY

[0136] To facilitate a better understanding of the present disclosure, certain terms are defined first. As used in this application, unless otherwise expressly specified herein, each of the following terms shall have the meaning given below. Additional definitions are set forth throughout the application.

[0137] The term “about” may refer to a value or set that is within an acceptable error range for a particular value or set as determined by those of ordinary skill in the art, and the value or set partially depends on how the value or set is measured or determined.

[0138] As used herein, the terms “contain” or “comprise (comprising) ” may be open-ended, semi-closed and closed-ended. In other words, the terms also include "consisting essentially of" or "consisting of. "

[0139] In the present invention, the terms "antibody (Ab) " and "immunoglobulin G (IgG) " refer to heterotetrameric glycoproteins with the same structural characteristics, each composed of two identical light chains (L) and two identical heavy chains (H) . Each light chain is linked to a heavy chain by a covalent disulfide bond, while the number of disulfide bonds between heavy chains varies among different immunoglobulin isotypes. Each heavy chain and light chain also has regularly spaced intrachain disulfide bonds. One end of each heavy chain has a variable region (VH) , followed by a constant region; the heavy chain constant region consists of three domains: CH1, CH2, and CH3. One end of each light chain has a variable region (VL) , and the other end has a constant region; the light chain constant region comprises one domain, CL; the constant region of the light chain pairs with the CH1 domain of the heavy chain constant region, and the variable region of the light chain pairs with the variable region of the heavy chain. The constant regions do not directly participate in the binding of the antibody to antigens, but they exhibit various effector functions, such as involvement in antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) . The heavy chain constant regions include IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 subtypes; the light chain constant regions include κ (Kappa) or λ (Lambda) . The heavy and light chains of the antibody are covalently linked via disulfide bonds between the CH1 domain of the heavy chain and the CL domain of the light chain, and the two heavy chains of the antibody are covalently linked via interchain disulfide bonds formed within the hinge region.

[0140] The "immunoglobulin antibody IgG" described in the present invention is a molecule of approximately 150 kDa, composed of four peptide chains, containing two identical γ heavy chains of approximately 50 kDa each and two identical light chains of approximately 25 kDa each, thereby exhibiting a tetrameric quaternary structure. The two heavy chains are interconnected by disulfide bonds, and each is linked to one light chain. The resulting tetramer has two identical halves, forming a fork-like or Y-shaped structure, with each end of the fork containing an identical antigen-binding site. IgG antibodies can be classified into several subclasses (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) based on minor differences in the amino acid sequences of their heavy chain constant regions.

[0141] In the present invention, the term "bispecific antibody (or bispecific Ab) " refers to an antibody molecule capable of simultaneously and specifically binding two antigens (targets) or two epitopes. Based on symmetry, bispecific antibodies can be classified into structurally symmetric and asymmetric molecules. Based on the number of binding sites, the bispecific antibodies can be classified into bivalent, trivalent, tetravalent, and multivalent molecules.

[0142] In the present invention, the term "monoclonal antibody (mAb) " refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous population, wherein the individual antibodies contained in the population are identical except for a few naturally occurring mutations that may be present. Monoclonal antibodies are highly specific for a single antigenic site. Moreover, unlike conventional polyclonal antibody preparations (which are typically mixtures of different antibodies directed against different antigenic determinants) , each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen. In addition to their specificity, the advantage of monoclonal antibodies lies in the fact that they can be synthesized by hybridoma culture without being contaminated by other immunoglobulins. The modifier "monoclonal" indicates the characteristic of the antibody as being derived from a substantially homogeneous population of antibodies and should not be construed as requiring production by any particular method.

[0143] As used herein, the terms "single-domain antibody (VHH) " and "nanobody" have the same meaning, referring to the variable region of a cloned antibody heavy chain, constructed as a single-domain antibody (VHH) consisting solely of one heavy chain variable region, which is the smallest antigen-binding fragment with complete functionality. Typically, after obtaining an antibody naturally lacking a light chain and the heavy chain constant region 1 (CH1) , the variable region of the antibody heavy chain is cloned to construct a single-domain antibody (VHH) consisting solely of one heavy chain variable region.

[0144] As used herein, the term "antigen-binding fragment" refers to a Fab fragment, Fab' fragment, F (ab') 2 fragment, or single Fv fragment that exhibits antigen-binding activity. Non-limiting examples of antigen-binding fragments include: (i) Fab fragments; (ii) F (ab') 2 fragments; (iii) Fv fragments; or (iv) single-chain Fv (scFv) . As used herein, the expression "antigen-binding fragment" also encompasses other engineered molecules, such as domain-specific antibodies, single-domain antibodies, domain-deleted antibodies, chimeric antibodies, CDR-grafted antibodies, diabodies, triabodies, tetrabodies, minibodies, nanobodies (e.g., monovalent nanobodies, bivalent nanobodies, etc. ) , small modular immunopharmaceuticals (SMIPs) , and shark variable IgNAR domains.

[0145] In the present invention, the terms "Fab" and "Fc" refer to the cleavage of an antibody by papain into two identical Fab fragments and one Fc fragment. The Fab fragment consists of the VH and CH1 domains of the heavy chain and the VL and CL domains of the light chain of the antibody. The Fc fragment, i.e., the fragment crystallizable (Fc) , consists of the CH2 and CH3 domains of the antibody. The Fc fragment lacks antigen-binding activity and is the region where the antibody interacts with effector molecules or cells. The term "F (ab') 2 fragment" refers to an antibody fragment obtained by pepsin digestion of the entire IgG antibody, which removes most of the Fc region while retaining some hinge region intact, resulting in two antigen-binding F (ab) portions connected by disulfide bonds.

[0146] In the present invention, the term "scFv" or "single-chain variable fragment scFv" refers to a single-chain antibody fragment (scFv) , which is a fusion protein comprising the immunoglobulin heavy chain VH and light chain VL variable regions, wherein VH and VL are connected by a linker of 15 to 25 amino acids, and wherein the fusion protein retains the same antigen specificity as the intact immunoglobulin.

[0147] In the present invention, the terms "Fv fragment" or "Fv antibody" refer to the smallest antibody fragment that contains the heavy chain variable region and light chain variable region of an antibody, lacks constant regions, and possesses all antigen-binding sites. Generally, the Fv fragment further includes a polypeptide linker between the VH and VL domains and is capable of forming the structure required for antigen binding.

[0148] In the present invention, the term "variable" denotes that some moieties of the variable region of an antibody are somewhat different in sequence, which contribute to the binding and specificity of various particular antibodies to their particular antigens. However, variability is not uniformly distributed across the variable region of an antibody. It is concentrated in three segments known as complementarity-determining regions (CDRs) or hypervariable regions within the heavy and light chain variable regions. The more conserved portions of the variable regions are referred to as framework regions (FRs) . The variable regions of the natural heavy and light chains each comprise four FRs, which are roughly in a β-sheet configuration and linked by three CDRs that form a linking loop, and which in some cases may form a partially β-sheet structure. The CDRs in each chain are close together through the FRs and form, together with the CDRs of the other chain, the antigen-binding site of the antibody (see Kabat et al, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pp. 647-669 (1991) ) .

[0149] As used herein, the term “framework region” (FR) refers to an amino acid sequence inserted between CDRs, that is, those moieties of the light and heavy chain variable regions of relatively conserved immunoglobulins among different immunoglobulins in a single species. The light and heavy chains of an immunoglobulin each have four FRs, referred to as FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L and FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H, respectively. Accordingly, the light chain variable domain may thus be referred to as (FR1-L) - (CDR1-L) - (FR2-L) - (CDR2-L) - (FR3-L) - (CDR3-L) - (FR4-L) , and the heavy chain variable domain may thus be denoted as (FR1-H) - (CDR1-H) - (FR2-H) - (CDR2-H) - (FR3-H) - (CDR3-H) - (FR4-H) . Preferably, the FR in the present invention is a human antibody FR or a derivative thereof, and the derivative of the human antibody FR is substantially identical to the FR of a naturally occurring human antibody, i.e., the sequence identity being up to 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%.

[0150] Once the amino acid sequence of the CDR is known, those skilled in the art can readily determine the framework regions FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L and / or FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.

[0151] As used herein, the term “human framework region” is a framework region that is substantially identical (about 85%or more, specifically 90%, 95%, 97%, 99%, or 100%) to the framework region of a naturally occurring human antibody.

[0152] As used herein, the term “linker” refers to one or more amino acid residues that are inserted into the immunoglobulin structural domains to provide sufficient mobility to the light and heavy chain domains for pleating of the domains into an exchanged dual variable region immunoglobulin.

[0153] Examples of appropriate linkers include single glycine (Gly) or serine (Ser) residues, and the identifications and sequences of amino acid residues in the linker can vary depending on the type of secondary structure elements to be achieved in the linker.

[0154] In the present invention, the terms "anti-" , "bind to" , and "specifically bind to" refer to a non-random binding reaction between two molecules, such as the reaction between an antibody and the antigen it targets. Generally, an antibody binds to the antigen with an equilibrium dissociation constant (KD) of less than about 10-7 M, for example, less than about 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, or smaller. In the present invention, the term "KD" refers to the equilibrium dissociation constant of a specific antibody-antigen interaction, which is used to describe the binding affinity between the antibody and the antigen. The smaller the equilibrium dissociation constant, the tighter the antibody-antigen binding, and the higher the affinity between the antibody and the antigen. For example, the binding affinity of an antibody to an antigen is measured using surface plasmon resonance (SPR) in a BIACORE instrument, or the relative binding affinity of an antibody to an antigen is determined using ELISA.

[0155] In the present invention, the term "epitope" refers to a polypeptide determinant that specifically binds to an antibody. The epitope of the present invention is the region of the antigen that is bound by the antibody.

[0156] OX40L

[0157] As used herein, OX40L is also referred to as CD252, TNFSF4, CD134L, or gp34, and is the ligand of OX40. OX40L is a type II glycoprotein with a 23-amino acid cytoplasmic tail and a 133-amino acid extracellular domain, and is a member of the TNF superfamily.

[0158] OX40 / OX40L is one of the major cytokines regulating T cells and plays a critical role in the proliferation and activation of pathogenic T cells, whether Th2 or Th1. Inhibiting the OX40 / OX40L signaling pathway can effectively suppress the effects of pathogenic T cells; clinically, several anti-OX40 / OX40L monoclonal antibodies have demonstrated long-lasting efficacy in treating AD.

[0159] IL-31Rα

[0160] As used herein, IL-31Rα, IL31Rα, and IL31RA are used interchangeably and all refer to the heterodimeric receptor A for the cytokine interleukin-31.

[0161] IL-31Rα binds with OSMRβ to form a functional receptor complex that mediates IL-31 signaling. IL-31 plays a critical role in the pathogenesis of both atopic dermatitis and prurigo nodularis (PN) . IL-31 has a unique role in directly stimulating itch-associated sensory neurons and causing inflammation and barrier dysfunction; IL-31 serves as a bridge between the immune system and the nervous system, and can also directly act on structural cells in the skin. The exact cause of pruritus is not yet fully understood, but IL-4, IL-13, and IL-31 are clearly associated with the onset and progression of pruritus. IL-31 directly initiates pruritus by binding to the heterodimeric receptor IL-31Rα on pruriceptive neurons, making it a cytokine directly involved in itch.

[0162] In the present invention, an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to IL-31RA is provided, comprising a heavy chain variable region VH and a light chain variable region VL, wherein the VH comprises heavy chain complementarity-determining regions HCDR1-3, and the VL comprises light chain complementarity-determining regions LCDR1-3, wherein the amino acid sequence of HCDR3 is as set forth in SEQ ID NO: 14; and the amino acid sequences of LCDR1-3 are as set forth in SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 19, respectively.

[0163] The HCDR1 amino acid sequence of the antibody or antigen-binding fragment thereof against IL-31RA of the present invention is DYNMX1, wherein X1 is selected from N or H; the HCDR2 amino acid sequence is NIDPYYX2ITX3X4NQX5FKG, wherein X2 is selected from D or G, X3 is selected from S or T, X4 is selected from Y or F, and X5 is selected from M or K.

[0164] In a preferred embodiment, the HCDR1 amino acid sequence is as set forth in SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 15; the HCDR2 amino acid sequence is as set forth in SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 16.

[0165] In a preferred embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof is a chimeric antibody or antigen-binding fragment thereof, or a humanized antibody or antigen-binding fragment thereof. Preferably, the antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from the group consisting of a full-length antibody, scFv, Fv, Fab, F (ab') , F (ab') 2, Fv, or Fd. Preferably, the antibody is a monoclonal antibody. Preferably, the antibody is a diabody or a single-chain antibody.

[0166] In a preferred embodiment, the heavy chain variable region of the antibody further comprises a human framework region, and / or the light chain variable region of the antibody further comprises a human framework region; or the heavy chain variable region of the antibody further comprises a murine framework region, and / or the light chain variable region of the antibody further comprises a murine framework region.

[0167] In a preferred embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof against IL-31RA is selected from any one of the following:

[0168] (1) a VH as set forth in SEQ ID NO: 20, and a VL as set forth in SEQ ID NO: 24;

[0169] (2) a VH as set forth in SEQ ID NO: 22, and a VL as set forth in SEQ ID NO: 24;

[0170] (3) a VH as set forth in SEQ ID NO: 55, and a VL as set forth in SEQ ID NO: 56;

[0171] (4) a VH as set forth in SEQ ID NO: 57, and a VL as set forth in SEQ ID NO: 58; or

[0172] (5) an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to IL-31RA having at least 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%amino acid sequence identity to the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to IL-31RA according to any one of (1) to (4) ; preferably, having at least 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%amino acid sequence identity in the framework region to the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to IL-31RA according to any one of (1) to (4) .

[0173] In a preferred embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof against IL-31RA comprises a heavy chain constant region and a light chain constant region. Preferably, the heavy chain constant region is human or murine, and / or the light chain constant region is human or murine. Preferably, the heavy chain constant region is selected from human IgG1, human IgG2, human IgG3, human IgG4, or variants thereof, and the light chain constant region is selected from human κ (Kappa) , human λ (Lambda) , or variants thereof.

[0174] In a preferred embodiment, the constant region variant comprises mutations that extend half-life or reduce antibody effector functions such as ADCC or CDC, for example, M252Y / S254T / T256E (YTE) mutations. Preferably, comprising a heavy chain constant region of human IgG2 or a YTE variant thereof, and a Kappa light chain constant region.

[0175] In a preferred embodiment, any one of the amino acid sequences of the aforementioned antibody or antigen-binding fragment thereof further comprises a derivative sequence that optionally has undergone addition, deletion, modification, and / or substitution of at least one amino acid and is capable of retaining binding affinity to IL-31RA.

[0176] The anti-IL-31RA antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention possesses one or more characteristics selected from the group consisting of:

[0177] 1) binding to human IL-31RA;

[0178] 2) neutralizing IL-31 signaling, such as inhibiting IL-31-dependent cellular activity;

[0179] 3) inhibiting IL-31-mediated downstream signaling pathways, such as suppressing IL-31-stimulated IL-6 production;

[0180] 4) alleviating pruritus, such as reducing the frequency of pruritus episodes.

[0181] BISPECIFIC ANTIBODY

[0182] In the present invention, a bispecific antibody that specifically binds both OX40L and IL-31Rα is provided, comprising an anti-IL-31Rα antibody portion and an anti-OX40L antibody portion. Specifically, it comprises an immunoglobulin antibody IgG and two identical single-domain antibodies VHH, wherein each VHH is connected in tandem to the immunoglobulin antibody IgG via a linker L.

[0183] The "bispecific antibody" as described in the present invention refers to a bispecific antibody possessing two distinct antigen-binding sites capable of simultaneously binding OX40L and IL-31Rα, comprising two VHHs and an immunoglobulin antibody IgG conjugated thereto, wherein each VHH is connected via a peptide linker L to each heavy chain of the immunoglobulin antibody IgG, forming a heavy chain fusion protein of the bispecific antibody.

[0184] Typically, the peptide linker has sufficient length and flexibility to ensure that the two connected proteins have adequate spatial freedom to exert their functions. Preferably, it is a flexible peptide linker (linker) , for example, comprising 0-25 amino acids. More preferably, it is (G4S) n, wherein n is a positive integer from 1 to 5.

[0185] As described above, the anti-IL-31Rα antibody portion in the bispecific antibody of the present invention is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds the IL-31Rαprotein, and the anti-OX40L antibody portion is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds the OX40L protein; the structure of the antigen-binding fragment may be selected from the group consisting of: (i) Fab fragment; (ii) F (ab') 2 fragment; (iii) Fv fragment; or (iv) single-chain Fv (scFv) .

[0186] The bispecific antibody of the present invention may be a dimer, trimer, or multimer, preferably a homodimer or heterodimer. The antibody portion against IL-31Rα or OX40L in the bispecific antibody of the present invention may comprise one or more antibodies or antigen-binding fragments thereof, preferably 1, 2, 3, 4, 5, or 6.

[0187] As a preferred embodiment, the bispecific antibody of the present invention comprises an anti-OX40L VHH and an IL-31Rα IgG antibody, wherein the anti-OX40L VHH comprises complementarity-determining regions HCDR1, HCDR2, and HCDR3, wherein the amino acid sequence of HCDR1 is as shown in SEQ ID NO: 1 or 2, the amino acid sequence of HCDR2 is as shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of HCDR3 is as shown in SEQ ID NO: 4 or 5;

[0188] Preferably, the anti-OX40L VHH of the present invention has a sequence as shown in any one of SEQ ID NO: 6, 8, or 10.

[0189] As a preferred embodiment, the VH of the IL-31Rα IgG antibody comprises complementarity-determining region HCDR1 as shown in SEQ ID NO: 12, HCDR2 as shown in SEQ ID NO: 13, and HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 14; or the VH of the IL-31Rα IgG antibody has complementarity-determining region HCDR1 as described in SEQ ID NO: 15, HCDR2 as shown in SEQ ID NO: 16, and HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 14.

[0190] The VL of the IL-31Rα IgG antibody comprises complementarity-determining regions LCDR1, LCDR2, and LCDR3, wherein the amino acid sequence of LCDR1 is as shown in SEQ ID NO: 17, the amino acid sequence of LCDR2 is as shown in SEQ ID NO: 18, and the amino acid sequence of LCDR3 is as shown in SEQ ID NO: 19.

[0191] In the present invention, the bispecific antibody of the present invention further includes conservative variants thereof, which refer to polypeptides formed by replacing at most 10, preferably at most 8, more preferably at most 5, and most preferably at most 3 amino acids in the amino acid sequence of the bispecific antibody of the present invention with amino acids having similar or analogous properties. These conservative variant polypeptides are preferably produced by amino acid substitutions according to Table A. Amino acids with similar or analogous properties are known to those skilled in the art.

[0192] As a preferred embodiment, the amino acid sequence of the peptide linker L is as shown in SEQ ID NO: 26.

[0193] During the construction of the bispecific antibody of the present invention, issues related to the chemical and physical stability of the bispecific antibody have also been addressed, such as expressing physically stable molecules, enhancing thermal and salt-dependent stability, reducing aggregation, increasing solubility at high concentrations, and maintaining affinity for the two antigens OX40L and IL-31Rα, respectively.

[0194] ENCODING NUCLEIC ACID AND EXPRESSION VECTOR

[0195] In another aspect, the present invention provides a polynucleotide molecule encoding the bispecific antibody described above. The polynucleotide of the present invention may be in a DNA or RNA form. The DNA form includes cDNA, genomic DNA or synthetic DNA. The DNA may be single-stranded or double-stranded. The DNA may be a coding or non-coding strand.

[0196] The method for preparing the nucleotide molecule of the present invention is a conventional method in the art, preferably including the following preparation methods: obtaining a nucleotide molecule encoding the aforementioned monoclonal antibody through gene cloning techniques such as PCR, or obtaining a nucleotide molecule encoding the aforementioned monoclonal antibody through full-length artificial synthesis.

[0197] Those skilled in the art are aware that nucleotide sequences encoding the amino acid sequences of the aforementioned bispecific antibody may be appropriately substituted, deleted, altered, inserted, or added to provide a homolog of the polynucleotide. In the present invention, a homolog of the polynucleotide can be prepared by substituting, deleting, or adding one or more bases of the gene encoding the bispecific antibody within a range that preserves antibody activity.

[0198] In another aspect, the present invention provides an expression vector comprising the aforementioned nucleotide molecule.

[0199] The expression vector is a conventional expression vector in the art, referring to an expression vector comprising appropriate regulatory sequences, such as promoter sequences, terminator sequences, polyadenylation sequences, enhancer sequences, marker genes and / or sequences, and other appropriate sequences. The expression vector may be a virus or plasmid, such as an appropriate lentivirus, bacteriophage, or phagemid. For further technical details, refer to, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Many known techniques and protocols for nucleic acid manipulation can be found in Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, edited by Ausubel et al. The expression vector of the present invention is preferably pDR1, pcDNA3.1 (+) , pcDNA3.4, pcDNA3.1 / ZEO (+) , pDHFR, pTT5, pDHFF, pGM-CSF, or pCHO 1.0, and more preferably pcDNA3.4.

[0200] The present invention further provides a host cell comprising the aforementioned expression vector. The host cell of the present invention is a conventional host cell in the art, as long as it allows the recombinant expression vector to stably self-replicate and enables effective expression of the nucleotide carried therein. The host cell includes prokaryotic expression cells and eukaryotic expression cells. The host cell preferably includes: COS, CHO (Chinese Hamster Ovary) , NS0, sf9, sf21, DH5α, BL21 (DE3) , or TG1, and more preferably E. coli TG1, BL21 (DE3) cells (for expressing single-chain antibodies or Fab antibodies) or CHO-K1 cells (for expressing full-length IgG antibodies) . The recombinant expression transformant of the present invention can be obtained by transforming the aforementioned expression vector into a host cell. The transformation method is a conventional transformation method in the art, preferably chemical transformation, heat shock, or electroporation.

[0201] As a preferred embodiment, the host cell is a eukaryotic cell. CHO cells or 293F cells are preferred. Once the related sequence has been obtained, the recombination method may be used to obtain the sequence on a large scale. This is typically done by cloning into a vector, transferring into a cell, and then isolating the related sequence from proliferated host cells by a conventional method.

[0202] The present invention further relates to vectors comprising appropriate DNA sequences as described above, as well as appropriate promoters or control sequences. These vectors can be used to transform appropriate host cells to enable them to express the protein.

[0203] Another aspect of the present invention provides a method for preparing the aforementioned bispecific antibody capable of specifically binding to OX40L and IL-31Rα, wherein the preparation method comprises the following steps:

[0204] a) culturing the aforementioned host cell under expression conditions to express the bispecific antibody capable of specifically binding to OX40L and IL-31Rα;

[0205] b) isolating and purifying the bispecific antibody from step a) .

[0206] The method for culturing the host cell and the method for isolating and purifying the antibody are conventional in the art. For specific operational procedures, refer to the corresponding cell culture technical manuals and antibody isolation and purification technical manuals. The method for preparing the anti-OX40L / IL-31Rα bispecific antibody disclosed in the present invention comprises: culturing the aforementioned host cell under expression conditions to express the bispecific antibody capable of specifically binding to OX40L and IL-31Rα; and isolating and purifying the anti-OX40L / IL-31Rα bispecific antibody. Using the aforementioned methods, the recombinant protein can be purified to a substantially homogeneous substance.

[0207] The anti-OX40L / IL-31Rα bispecific antibody disclosed in the present invention may be isolated and purified by affinity chromatography. Depending on the characteristics of the affinity column used, conventional methods such as high-salt buffer or pH adjustment may be employed to elute the anti-OX40L / IL-31Rα bispecific antibody bound to the affinity column. The inventors of the present invention conducted detection experiments on the obtained anti-OX40L / IL-31Rα bispecific antibody. The experimental results demonstrate that the anti-OX40L / IL-31Rα bispecific antibody binds effectively to target cells and antigens with high affinity.

[0208] PHARMACEUTICAL COMPOSITION

[0209] Another aspect of the present invention provides a composition comprising the aforementioned bispecific antibody capable of specifically binding to OX40L and IL-31Rα and one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents, or excipients. Preferably, the composition is a pharmaceutical composition.

[0210] The bispecific antibody provided by the present invention may be formulated with pharmaceutically acceptable carriers into pharmaceutical preparation compositions to achieve more stable therapeutic efficacy. These formulations can preserve the conformational integrity of the amino acid core sequence of the bispecific antibody of the present invention while also protecting the multifunctional groups of the protein from degradation (including, but not limited to, aggregation, deamidation, or oxidation) . Typically, these substances may be formulated in a non-toxic, inert, and pharmaceutically acceptable aqueous carrier medium, with the pH typically of about 5-8, and preferably about 6-8, although the pH may vary depending on the nature of the substance to be formulated and the condition to be treated. The formulated pharmaceutical composition may be administered via conventional routes, including but not limited to: intravenous injection, intravenous infusion, subcutaneous injection, local injection, intramuscular injection, intratumoral injection, intraperitoneal injection (e.g., intraperitoneally) , intracranial injection, , or intracavitary injection. Typically, for liquid formulations, stability can be maintained for at least one year under conditions of 2℃ to 8℃, while for lyophilized formulations, stability can be maintained for at least six months at 30℃. The bispecific antibody formulation may be in forms commonly used in the pharmaceutical field, such as suspensions, aqueous injections, or lyophilized formulations.

[0211] In the present invention, the term "pharmaceutical composition" refers to a formulation wherein the bispecific antibody of the present invention is combined with a pharmaceutically acceptable carrier to achieve more stable therapeutic efficacy. These formulations ensure the conformational integrity of the amino acid core sequence of the disclosed bispecific antibody while protecting the multifunctional groups of the protein from degradation (including, but not limited to, aggregation, deamidation, or oxidation) .

[0212] The pharmaceutical composition of the present invention comprises a safe and effective amount (e.g., 0.001 wt%to 99 wt%, preferably 0.01 wt%to 90 wt%, more preferably 0.1 wt%to 80 wt%) of the bispecific antibody (or its conjugate) of the present invention as described above, and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Such carriers include (but are not limited to) : saline, buffer solutions, glucose, water, glycerol, ethanol, and their combination. The pharmaceutical preparation should match the route of administration. The pharmaceutical composition of the present invention may be prepared into an injectable form, for example, by conventional methods using normal saline or aqueous solutions containing glucose and other excipients. The pharmaceutical composition in a form such as an injection or a solution should be manufactured under sterile conditions. The administration dose of an active ingredient is a therapeutically effective amount, for example, about 10 micrograms per kilogram of body weight to about 50 micrograms per kilogram of body weight on a daily basis. Furthermore, the bispecific antibody of the present invention may also be used in combination with other therapeutic agents.

[0213] When the pharmaceutical composition is used, a safe and effective amount of the bispecific antibody or immunoconjugate thereof is administered to a mammal, with the safe and effective amount typically of at least about 10 micrograms per kilogram of body weight, and in most cases not more than about 50 milligrams per kilogram of body weight, preferably about 10 micrograms to about 10 milligrams per kilogram of body weight. Without doubt, the specific dose should also take factors such as the route of administration and the patient's health status into consideration, all of which fall within the area of expertise of skilled physicians.

[0214] APPLICATIONS

[0215] Another aspect of the present invention provides the use of the above-described bispecific antibody capable of specifically binding to OX40L and IL-31Rα, or the above-described pharmaceutical composition, in the manufacture of a medicament for treating skin diseases.

[0216] The skin diseases targeted by the medicament of the present invention preferably include skin diseases accompanied by pruritus symptoms, including but not limited to: atopic dermatitis (AD) , prurigo nodularis (PN) , and the like.

[0217] When administering the bispecific antibody and composition thereof of the present invention to animals including humans, the dosage varies depending on the age and body weight of the patient, the nature and severity of the disease, and the route of administration, and may be determined with reference to the results of animal experiments and various circumstances, provided that the total administered amount does not exceed a certain range. For example, the intravenous injection dose is 1-1800 mg / day.

[0218] The bispecific antibody and composition thereof of the present invention may also be administered in combination with other medicaments for treating skin diseases to achieve a more effective treatment of skin diseases.

[0219] THE MAIN ADVANTAGES OF THE PRESENT INVENTION INCLUDE:

[0220] (1) The present invention for the first time provides a bispecific antibody capable of simultaneously targeting the cell surface molecules OX40L and IL-31Rα antigens.

[0221] (2) The bispecific antibody provided by the present invention is capable of blocking the binding of human OX40L to human OX40LR, inhibiting the secretion of IL-6 and IFNγ, and exhibits synergy in regulating pathogenic T cells.

[0222] (3) The bispecific antibody provided by the present invention exhibits long-lasting therapeutic efficacy, while rapidly and effectively suppressing pruritus, thereby providing patients with an improved treatment experience and enhancing their quality of life.

[0223] The following further describes the present invention in conjunction with specific examples. It should be understood that these examples are intended only for illustrating the present invention, rather than limiting the scope of the present invention. Experimental methods for which specific conditions are not indicated in the following examples are generally carried out under conventional conditions, such as those described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) , or as recommended by the manufacturer. Unless otherwise stated, percentages and fractions are by weight.

[0224] Example 1: Preparation and Functional Detection of Anti-IL-31Rα Antibody

[0225] (I) Preparation of Anti-IL-31Rα Monoclonal Antibodies

[0226] Two murine anti-IL-31Rα monoclonal antibodies, designated m127H8 and m139E9, were obtained by screening via hybridoma technology. The sequences of their heavy chain variable regions and light chain variable regions are shown in Table 1 below:

[0227] Table 1: Sequences of Anti-IL-31Rα Monoclonal Antibodies

[0228] Humanization of murine antibodies 127H8 and 139E9 was performed via CDR grafting, resulting in the humanized antibody 127H2 (designated as hu-127H8) and the humanized antibody 139H1 (designated as hu-139E9) , respectively. The VH sequence of 127H2 is shown in SEQ ID NO: 20, the VH sequence of 139H1 is shown in SEQ ID NO: 22, and both 127H2 and 139H1 share the same VL sequence as shown in SEQ ID NO: 24. The variable region sequences were recombined with the kappa chain constant region (SEQ ID NO: 59) and the human IgG2 constant region (SEQ ID NO: 60) to obtain full-length light chain and heavy chain sequences, which were then ligated into the pcDNA3.4 expression vector, transfected into HEK-293E cells, and purified by Protein A affinity chromatography to obtain the humanized antibodies.

[0229] Kappa chain constant region (SEQ ID NO: 59) :

[0230]

[0231] Human IgG2 Constant Region (SEQ ID NO: 60) :

[0232] (II) Functional Detection of Anti-IL-31Rα Monoclonal Antibodies

[0233] In the following functional detection experiments for the IL-31Rα monoclonal antibodies of the present invention, Nemolizumab was used as a positive control, with its heavy chain sequence shown in SEQ ID NO: 45 and its light chain sequence shown in SEQ ID NO: 47.

[0234] 1. Inhibitory Activity Against IL-31-Dependent Proliferation Cell Line

[0235] The human IL-31Rα was introduced into the mouse cell line Ba / F3 to construct an IL-31-dependent proliferation cell line (huIL31RA huOSMR / BaF3 cells) . After culturing huIL31RA huOSMR / BaF3 cells, they were plated into a 96-well cell culture plate at 150 μL / well. The IL-31Rα antibody was serially diluted with culture medium and added to the 96-well plate at 50 μL / well, with a starting final antibody concentration of 20 nM and a 2.5-fold dilution. Incubation was carried out at 37℃ with 5%CO for 3 days. 20 μL of CCK8 solution was added to each well, followed by incubation at 37℃ for 2 h, and then the absorbance at 450 nm (A450) was measured using a microplate reader. Using wells without anti-IL-31Rα antibody as the control and Nemolizumab as the positive control, the inhibitory activity of the humanized antibodies 127H2 and 139H1 was assessed. The results are shown in Table 2.

[0236] Table 2. Detection of Inhibitory Activity of Human Anti-IL-31Rα Antibodies Against huIL-31-Dependent Proliferation Cell Line

[0237] The results showed that the humanized antibodies 127H2 and 139H1 demonstrated neutralizing activity against human IL-31 signaling in the huIL-31-dependent proliferation cell line (huIL31RA / huOSMR / BaF3) and were superior to the positive control antibody Nemolizumab.

[0238] 2. Neutralizing Activity Against IL-31

[0239] The neutralizing activity of the antibodies was evaluated by assessing their ability to inhibit IL-6 production induced by IL-31 stimulation in DU145 (a human prostate cancer cell line) . The method was as follows: DU145 human prostate cancer cells were cultured, digested, and counted, then plated in a 96-well plate at a density of 1.5×10  / mL, 150 μL / well, and allowed to adhere overnight. The IL-31Ra antibody was diluted with medium containing 400 ng / mL huIL31-his protein (starting at 20 nM, 5-fold serial dilution) , and 50 μL / well was added to the plate, with a final concentration of 100 ng / mL huIL31-his. After 48 hours of incubation, the supernatant was collected. ELISA assay: Anti-human IL-6 antibody (2 μg / mL) was coated, after blocking, standards or 4-fold diluted supernatant were added, followed by sequential incubation with biotinylated anti-human IL-6 antibody and streptavidin-HRP. After color development, the reaction was terminated, and the absorbance at 450 nm (A450) was measured. Data were analyzed using GraphPad Prism 9. The experimental results are shown in Table 3.

[0240] Table 3 Inhibition of IL-6 Production Induced by IL-31 Stimulation by Human Anti-IL-31RA Antibodies

[0241] The results showed that the humanized antibodies 127H2 and 139H1 concentration-dependently inhibited IL-6 production induced by IL-31 stimulation in the DU145 cell line, demonstrating neutralizing activity against human IL-31 signaling and superiority over the positive control antibody Nemolizumab.

[0242] 3. Inhibitory Activity Against IL-31-Induced Pruritic Behavior

[0243] For 6-10-week-old female B-hIL31 / hIL31RA / hOSMA transgenic C57BL / 6 mice (Biocytogen Jiangsu Gene Biotechnology Co., Ltd. ) , intraperitoneal administration was performed on Day 0 and Day 3, with a total of two administrations; on Day 1 and Day 4, 20 μg huIL-31 (Novoprotein) or PBS (Gibco) was administered intradermally in the cheek. Scratching behavior was recorded by video and analyzed for one hour after IL-31 administration.

[0244] The results are shown in Figure 11: Compared with the PBS administration group (n=6) , a significant increase in the number of scratching events at approximately 1 hour after administration was observed in the IL-31-administered Vehicle group (n=6) . Furthermore, the IL-31-induced scratching behavior was significantly inhibited by intraperitoneal administration of the anti-huIL31RA neutralizing antibody groups Nemolizumab (n=6) , 127H2 (n=6) , and 139H1 (n=6) at 350 mg / kg prior to IL-31 administration. These results confirm that the anti-IL-31RA neutralizing antibodies 127H2 and 139H1 exhibit inhibitory effects on IL-31-induced pruritus, with 127H2 showing statistically significant differences on Day 1 and Day 4 and outperforming the control Nemolizumab. Additionally, 127H2 demonstrated excellent pruritus-inhibitory effects up to Day 7 after administration.

[0245] 4. Alopecia Areata Animal Model

[0246] To extend the half-life of the antibody, the M252Y / S254T / T256E (YTE) mutation was introduced into the constant region of the 127H2 antibody, and the resulting mutant antibody was designated 127H2-YTE.

[0247] Thirty-two B-hIL31 / hIL31RA / hOSMR mice (Biocytogen Jiangsu Gene Biotechnology Co., Ltd. ) were randomly divided into 4 groups based on body weight, with 8 mice per group. G1 was the Vaseline control group for IMQ (Imiquimod) , while G2-G4 were IMQ-modeled mice, with G2 as the negative (Vehicle) control group and G3-G4 as the test article 127H2-YTE treatment groups. All animals in each group were weighed and photographed on Day 0. From Day 0 to Day 28, animals in Groups G2-G4 were topically administered 140 mg IMQ for modeling at the nape of the neck, with a modeling area of 1.5 cm × 1.5 cm, three times per week for a total of 12 applications. From Day 0 to Day 28, animals in each group received intraperitoneal injections according to the following dosing regimens: Groups G1-G2 were administered Vehicle twice per week for a total of 8 doses. Group G3 was administered 350 mg / kg 127H2-YTE twice per week from Day 0 to Day 13 and once per week from Day 14 to Day 25, for a total of 6 doses. Group G4 was administered 350 mg / kg 127H2-YTE twice per week for a total of 6 doses. During the experimental period, mice were evaluated for alopecia areata clinical scores (Figure 12, Alopecia Areata scores) and photographed to quantify the hair loss rate (Figure 13, Hair loss rate) .

[0248] Experimental results demonstrated that the test article 127H2-YTE significantly reduced the clinical scores of alopecia areata in B-hIL31 / hIL31RA / hOSMR mice and exhibited certain pharmacological effects in improving the hair loss rate.

[0249] Example 2: Construction and Expression of the Bispecific Antibody

[0250] (I) Construction of the Bispecific Antibody

[0251] The present invention constructed an anti-OX40L / IL-31Rα bispecific antibody by tandemly linking an anti-OX40L VHH to an anti-IL-31Rα IgG monoclonal antibody. Specifically, two identical anti-OX40L VHHs were respectively connected to the N-termini of the two heavy chains of the anti-IL-31Rα IgG monoclonal antibody, resulting in a homodimeric bispecific antibody, the structural schematic of which is shown in Figure 1A.

[0252] In the present invention, three anti-OX40L VHH sequences were respectively connected to two anti-IL-31Rα IgG monoclonal antibody sequences, resulting in six anti-OX40L / IL-31Rα bispecific antibody molecules, designated as D50-60, D50-139-60, D50-5, D50-139-5, D50-98, and D50-139-98. The six bispecific antibody molecules share a common light chain (amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 39, encoded nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 40) ; the heavy chain sequences are as shown in SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, and 37, respectively, and the encoded nucleotides are as shown in SEQ ID NO: 28, 30, 32, 34, 36, and 38, respectively.

[0253] The CDR sequences of the antibodies involved in the bispecific antibody of the present invention are as follows:

[0254] Anti-OX40L VHH:

[0255] HCDR1: SIYAKG (SEQ ID NO: 1) or SLYAKG (SEQ ID NO: 2) ; HCDR2: AISRSGRSTSYADSVKG (SEQ ID NO: 3) ; HCDR3: VGGATTVTASEWDY (SEQ ID NO: 4) or VGGGTTVTASEWDY (SEQ ID NO: 5) ;

[0256] The full-length amino acid sequences of the anti-OX40L VHH are as shown in SEQ ID NO: 6, 8, and 10, respectively; the full-length nucleotide sequences are as shown in SEQ ID NO: 7, 9, and 11, respectively.

[0257] Anti-IL-31Rα monoclonal antibody a (127H2) :

[0258] HCDR1: DYNMN (SEQ ID NO: 12) ; HCDR2: NIDPYYDITSYNQMFKG (SEQ ID NO: 13) ; HCDR3: QGNDYDKGPMDY (SEQ ID NO: 14) ; LCDR1: RASGNIHNYLA (SEQ ID NO: 17) ; LCDR2: NAKTLAD (SEQ ID NO: 18) ; LCDR3: QHFWSTPWT (SEQ ID NO: 19) ;

[0259] The amino acid sequence of the heavy chain variable region VH of 127H2 is as shown in SEQ ID NO: 20, and the nucleotide sequence is as shown in SEQ ID NO: 21; the amino acid sequence of the light chain variable region VL of 127H2 is as shown in SEQ ID NO: 24, and the nucleotide sequence is as shown in SEQ ID NO: 25.

[0260] Anti-IL-31Rα monoclonal antibody b (139H1) :

[0261] HCDR1: DYNMH (SEQ ID NO: 15) ; HCDR2: NIDPYYGITTFNQKFKG (SEQ ID NO: 16) ; HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are the same as those of anti-IL-31Rα monoclonal antibody a (127H2) ;

[0262] The amino acid sequence of the heavy chain variable region VH of 139H1 is as shown in SEQ ID NO: 22, and the nucleotide sequence is as shown in SEQ ID NO: 23; the amino acid sequence of the light chain variable region VL of 139H1 is as shown in SEQ ID NO: 24, and the nucleotide sequence is as shown in SEQ ID NO: 25.

[0263] Some sequences involved in the present invention are shown in Table 4 below:

[0264] Table 4 Partial Sequence Information (using Kabat system numbering rules)

[0265] Note: Underlined sequences in the table indicate CDR regions.

[0266] Amlitelimab is a clinically validated monoclonal antibody targeting OX40L with excellent efficacy, and Nemolizumab is a validated monoclonal antibody targeting IL-31Rα with excellent efficacy, both serving as positive controls in the examples of the present invention; the amino acid sequence of the Amlitelimab heavy chain is shown in SEQ ID NO: 41, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 42; the amino acid sequence of the Amlitelimab light chain is shown in SEQ ID NO: 43, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 44; the amino acid sequence of the Nemolizumab heavy chain is shown in SEQ ID NO: 45, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 46; the amino acid sequence of the Nemolizumab light chain is shown in SEQ ID NO: 47, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 48.

[0267] The E72-FC molecule is composed of two monomers as shown in SEQ ID NO: 49, and is a bivalent molecule obtained by linking the anti-OX40L VHH amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) to an Fc region, serving as a control molecule in the examples of the present invention; the amino acid sequence of E72-FC is shown in SEQ ID NO: 49, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 50.

[0268] The heavy chain amino acid sequence of anti-IL-31Rα monoclonal antibody a (also referred to as 127H2) is shown in SEQ ID NO: 51, the heavy chain nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 52, the light chain amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 39, and the light chain nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 40. IL-31Rα monoclonal antibody a (also referred to as 127H2) serves as a control molecule in the examples of the present invention.

[0269] The heavy chain amino acid sequence of anti-IL-31Rα monoclonal antibody b (also referred to as 139H1) is shown in SEQ ID NO: 53, the heavy chain nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 54, the light chain amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 39, and the light chain nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 40. IL-31Rα monoclonal antibody b (also referred to as 139H1) serves as a control molecule in the examples of the present invention.

[0270] (II) Expression and Purification of Bispecific Antibodies

[0271] The DNA fragments encoding the heavy and light chains of the aforementioned bispecific antibodies were individually cloned into the pcdna3.4 vector, and recombinant plasmids were extracted and co-transfected into CHO cells and / or 293F cells. After culturing the cells for 5-7 days, the culture medium was subjected to high-speed centrifugation and vacuum filtration through a microporous membrane, followed by loading onto a HiTrap MabSelectSuRe column. The protein was eluted in a single step using an elution buffer containing 100 mM citrate at pH 3.5. The target sample was collected and dialyzed into PBS at pH 7.4.

[0272] The purified protein was analyzed by HPLC. The HPLC-SEC chromatogram of the bispecific antibodies is shown in Figure 1B, indicating homogeneous antibody molecular states with monomer purity exceeding 98%.

[0273] The control antibodies Amlitelimab, Nemolizumab, E72-FC, anti-IL-31Rα monoclonal antibody a, and anti-IL-31Rα monoclonal antibody b were obtained using the same expression and purification methods as those for the bispecific antibodies.

[0274] Example 3: Detection of Binding Activity of Bispecific Antibodies to Human OX40L Protein

[0275] In this example, the binding activity of various antibody groups to human OX40L protein was determined by ELISA, with specific steps as follows:

[0276] Human OX40L protein was diluted to 0.1 μg / mL using coating buffer, added to the microplate at 100 μL / well, and incubated overnight at 4 ℃. The plate was washed three times with PBST, patted dry, blocked with 300 μL / well of 1%BSA blocking buffer, incubated at 37 ℃ for 1 hour, washed three times with PBST, patted dry, and then reserved for use. Antibodies were diluted to 50 nM using PBS containing 1%BSA, followed by six-fold serial dilution to generate nine concentration gradients. The diluted antibodies were sequentially added to the blocked microplate at 100 μL / well and incubated at 37 ℃ for 1 hour. The plate was washed three times with PBST, patted dry, and incubated with HRP-labeled goat anti-human Fc antibody (working concentration 1: 3000) at 100 μL / well at 37 ℃ for 1 hour. After washing the plate three times with PBST, residual droplets were thoroughly removed by patting on absorbent paper. Then, 100 μL of TMB substrate was added to each well, and the plate was incubated at room temperature (20 ± 5 ℃) in the dark for 5 minutes. The reaction was terminated by adding 70 μL of 1 M H SO stop solution per well. The optical density (OD) was measured at 450 nm using a microplate reader, and data analysis was performed with GraphPad Prism 9 to generate curves and calculate EC50 values.

[0277] The results are shown in Figure 2. The binding activity of the anti-OX40L / IL-31Rα bispecific antibody molecules D50-60 and D50-139-60 of the present invention to human OX40L was significantly enhanced compared to the positive control Amlitelimab.

[0278] Since the bispecific antibody molecule of the present invention comprises bivalent anti-OX40L VHH, an E72-FC molecule containing bivalent VHH was constructed as a control to compare the binding activity of both to OX40L. The binding activity results to OX40L are shown in Table 5. The equilibrium dissociation constant (KD) of the monovalent anti-OX40L VHH molecule (1E07 VHH, SEQ ID NO: 6) binding to OX40L was 1.49 × 10-9 M, while the KD value of the E72-FC molecule was less than 1.0 × 10-12 M. The binding activity of the E72-FC molecule was superior to that of the individual anti-OX40L VHH molecule.

[0279] Table 5

[0280] Compared to the E72-FC molecule containing bivalent VHH, the bispecific antibody molecules D50-60 and D50-139-60 of the present invention exhibited superior binding activity, indicating that the anti-OX40L VHH of the present invention, when fused with the IL-31Rα monoclonal antibody, possesses excellent OX40L molecular binding activity. The anti-human IL-31Rα monoclonal antibody Nemolizumab did not bind to human OX40L. The above results demonstrate that the anti-OX40L / IL-31Rα bispecific antibody molecule of the present invention exhibits excellent OX40L binding activity.

[0281] Example 4: Detection of the Ability of the Bispecific Antibody to Block the Binding of Human OX40L to Human OX40LR

[0282] Human OX40LR protein was diluted to 5 μg / mL using coating buffer, added to the microplate at 100 μL / well, and incubated overnight at 4℃. The plate was washed three times with PBST, patted dry, blocked with 300 μL / well of 1%BSA blocking solution, incubated at 37℃ for 1 hour, washed three times with PBST, patted dry, and reserved for use. Antibodies were diluted to 50 nM (final concentration 25 nM) in PBS containing 1%BSA, serially diluted twofold to generate seven concentration gradients, and added sequentially to the blocked microplate at 50 μL / well. Then, 50 μL of 100 nM (final concentration 50 nM) biotin-labeled human OX40L protein was added to each well, followed by incubation at 37℃ for 1 hour. The plate was washed three times with PBST, patted dry, and incubated with SA-HRP secondary antibody (working concentration 1: 3000) at 100 μL / well for 1 hour at 37℃. After washing three times with PBST, residual droplets were thoroughly removed by patting on absorbent paper. Then, 100 μL of TMB substrate was added to each well and incubated at room temperature (20 ± 5℃) for 5 minutes protected from light. The reaction was terminated by adding 70 μL of 1 M H SO stop solution per well. The optical density (OD) was measured at 450 nm using a microplate reader, and data were analyzed using GraphPad Prism 9 to generate curves and calculate IC50 values.

[0283] The results are shown in Figure 3. The blocking activity of D50-60 and D50-139-60 against the binding of human OX40LR to human OX40L was significantly enhanced compared to Amlitelimab. The blocking activity of D50-60 and D50-139-60 was superior to that of E72-FC, while Nemolizumab did not exhibit any blocking activity. These results indicate that the anti-OX40L / IL-31Rα bispecific antibody molecule of the present invention possesses the most excellent blocking activity in inhibiting the binding between OX40LR and OX40L.

[0284] Example 5: Detection of the Ability of the Bispecific Antibody to Block the Binding of Human OX40L Protein to 293FT-OX40-puro Cells

[0285] The ability of the bispecific antibody to block the binding of human OX40L protein to the stably OX40 receptor-expressing cell line (293FT-OX40-puro cells) was determined using fluorescence-activated cell sorting (FACS) . The specific steps are as follows:

[0286] Adherently cultured 293FT-OX40-puro cells in the logarithmic growth phase were collected by discarding the growth medium, washing once with DPBS, digesting with 0.25%trypsin, neutralizing with DMEM containing 10%FBS, 1%PS, and 1%SP, centrifuging at 250g for 5 minutes, and discarding the supernatant. The cells were resuspended in medium for counting, and the required total amount of cell suspension was taken, washed once with PBS containing 1%BSA, centrifuged at 500 g for 5 minutes, and the supernatant was discarded. The cells were resuspended in PBS containing 1%BSA and plated into a 96-well plate at 1×10 cells / well, 100 μL / well. The plate was centrifuged at 500 g for 5 minutes; the supernatant was removed; the plate was set aside for future use. N-HIS-OX40L-488 (N-HIS-OX40L protein labeled with Alexa FluorTM 488 NHS ester) was diluted to 1 μg / ml (final concentration 0.5 μg / ml) with PBS containing 1%BSA, 50 μL / well. Antibodies were diluted to 60 nM (final concentration 30 nM) with PBS containing 1%BSA, followed by 3-fold serial dilution to generate 7 concentration gradients, which were sequentially added to the aforementioned 96-well plate at 50 μL / well, mixed thoroughly, and incubated at 4℃ for 1 h. The plate was taken out, centrifuged at 500 g for 5 minutes; the supernatant was removed; the plate was washed using PBS with 1%BSA for 3 times. Cells were resuspended in 200 μL of PBS containing 1%BSA, and analyzed by flow cytometry. Data analysis was performed using GraphPad Prism 9 based on the FITC mean value per well, and IC50 values were calculated and plotted.

[0287] The results are shown in Figure 4. The blocking activities of D50-5, D50-139-5, D50-60, D50-139-60, D50-98, and D50-139-98 in blocking the binding of human OX40L to 293FT-OX40-puro cells were significantly enhanced compared to Amlitelimab and E72-FC, while Nemolizumab showed no blocking activity.

[0288] Example 6: Detection of Binding Activity of Bispecific Antibody to Human IL-31R Protein

[0289] This example used ELISA to determine the binding activity of each antibody group to human IL-31R protein. The specific steps are as follows:

[0290] Human IL-31R protein was diluted to 2 μg / mL with coating buffer, added to the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) plate at 100 μL / well, and incubated overnight at 4 ℃. The plate was washed three times with PBST, patted dry, blocked with 300 μL / well of 1%BSA blocking buffer, incubated at 37 ℃ for 1 hour, washed three times with PBST, patted dry, and stored for later use. Antibodies were diluted to 10 nM with PBS containing 1%BSA, followed by 4-fold serial dilution to generate 9 concentration gradients, which were sequentially added to the blocked ELISA plate at 100 μL / well and incubated at 37 ℃ for 1 hour. The plate was washed three times with PBST, patted dry, and incubated with HRP-labeled goat anti-human Fc antibody (working concentration 1: 3000) at 100 μL / well at 37 ℃ for 1 hour. After washing the plate three times with PBST, residual droplets were thoroughly removed by patting on absorbent paper. Then, 100 μL of TMB substrate was added to each well, and the plate was incubated at room temperature (20 ± 5 ℃) in the dark for 5 minutes. The reaction was terminated by adding 70 μL of 1 M H SO stop solution per well. The optical density (OD) was measured at 450 nm using a microplate reader, and data analysis was performed with GraphPad Prism 9 to generate curves and calculate EC50 values.

[0291] The results are shown in Figure 5. Panel A of Figure 5 demonstrates that the binding activities of D50-60 and D50-139-60 to human IL-31R are comparable to that of Nemolizumab, while Amlitelimab does not bind to human IL-31R. Panel B of Figure 5 shows that the binding activity of the D50-5 molecule to human IL-31R is superior to that of the parental anti-IL-31Rα monoclonal antibody a (also referred to as 127H2) and monoclonal antibody b (also referred to as 139H1) . These results indicate that the anti-OX40L / IL-31Rα bispecific antibody molecules of the present invention possess excellent IL-31R binding activity.

[0292] Example 7: Detection of the Ability of Bispecific Antibodies to Block the Binding of Human IL-31 Protein to 292FT-IL-31RA-OSMR Cells

[0293] The ability of the antibodies to block the binding of human IL-31 protein to a monoclonal cell line stably expressing IL-31RA and OSMR (292FT-IL-31RA-OSMR cells) was determined using fluorescence-activated cell sorting (FACS) . The specific steps are as follows:

[0294] Adherently cultured 292FT-IL-31RA-OSMR cells in the logarithmic growth phase were collected. The growth medium was discarded, and the cells were washed once with DPBS, digested with 0.25%trypsin, neutralized with DMEM containing 10%FBS, 1%PS, and 1%SP, centrifuged at 250 g for 5 minutes, and the supernatant was discarded. The cells were resuspended in medium for counting, and the required total amount of cell suspension was taken, washed once with PBS containing 1%BSA, centrifuged at 500 g for 5 minutes, and the supernatant was discarded. The cells were resuspended in PBS containing 1%BSA and plated into a 96-well plate at 1×10 cells / well, 100 μL / well. The plate was centrifuged at 500 g for 5 minutes; the supernatant was removed; the plate was set aside for future use. IL31-his-647 (Alexa FluorTM 647 NHS ester-labeled IL31-HIS protein) was diluted to 3.2 μg / mL (final concentration 1.6 μg / mL) with PBS containing 1%BSA, 50 μL / well. Antibodies were diluted to 16 nM (final concentration 8 nM) with PBS containing 1%BSA, followed by 2.5-fold serial dilutions to generate 7 concentration gradients. These were sequentially added to the aforementioned 96-well plate at 50 μL / well, mixed, and incubated at 4 ℃ for 1 hour. The plate was taken out, centrifuged at 500 g for 5 minutes; the supernatant was removed; the plate was washed using PBS with 1%BSA for 3 times. The cells were resuspended in 200 μL of PBS containing 1%BSA and analyzed using a flow cytometer. Data analysis was performed with GraphPad Prism 9 based on the APC mean value per well, and IC50 values were calculated and plotted.

[0295] The results are shown in Figure 6. The blocking activities of D50-5, D50-139-5, D50-60, D50-139-60, D50-98, and D50-139-98 in blocking the binding of human IL31R to 292FT-IL31RA-OSMR cells were comparable to that of Nemolizumab, while Amlitelimab did not exhibit any blocking activity.

[0296] Example 8: Detection of the Ability of Bispecific Antibodies to Inhibit Signaling Activation in Human OX40 (Luc) HEK293 Reporter Cells

[0297] This example employed a firefly luciferase reporter gene assay (Bio-Lite Luciferase Assay System) to determine the effect of antibodies in inhibiting the activation of signaling in human OX40 (Luc) HEK293 Reporter Cells stimulated by human OX40L protein.

[0298] Adherently cultured human OX40 (luc) HEK293 Reporter Cells in the logarithmic growth phase were centrifuged and counted. Cells adjusted to the appropriate density were added to the aforementioned 3903 cell plate at 1×10  / well, 50 μL / well. Antibodies were diluted to 400 nM (final concentration 100 nM) using DMEM medium (containing 10%FBS and 1%PS) , followed by 3-fold serial dilution. A volume of 25 μL was added to the aforementioned 3903 cell plate. Human OX40L was diluted to 4 μg / mL (final concentration 1 μg / mL) using DMEM medium (containing 10%FBS and 1%PS) , and 25 μL / well was added to the 3903 cell plate. The cell plate was incubated in a 37 ℃ incubator for 48 hours. Prior to assay, the plate was equilibrated at room temperature for approximately 15 minutes. Then, 100 μL of Bio-Lite Luciferase Assay System reagent was added to each well, followed by incubation at room temperature for 10 minutes. Luminescence (RLU) values were measured using a microplate reader. Data analysis was performed with GraphPad Prism 9, and IC50 values were calculated and plotted.

[0299] The results are shown in Figure 7. The ability of D50-60 and D50-139-60 to inhibit the activation of signaling in human OX40 (Luc) HEK293 Reporter Cells stimulated by human OX40L protein was significantly enhanced compared to that of Amlitelimab and E72-FC, while Nemolizumab did not exhibit inhibitory activity.

[0300] Example 9: Detection of the Ability of Bispecific Antibodies to Inhibit the Proliferation of BaF3-IL31RA-OSMR Cells

[0301] BaF3-IL31RA-OSMR cells in the logarithmic growth phase were centrifuged and counted, and the cell density was adjusted using 1640 medium (containing 10%FBS and 1%PS) and added to a 3599 plate at 1.5×10  / well, 50 μL / well. IL31-his was diluted with medium to 40 ng / mL (final concentration 10 ng / mL) , and 25 μL / well was added to the aforementioned 3599 plate. Antibodies were diluted with medium to 80 nM (final concentration 20 nM) , followed by 4-fold serial dilution to generate 6 concentration gradients, and 25 μL / well was added to the aforementioned 3599 plate. The plate was gently tapped to mix. The cell plate was incubated in a 37 ℃ incubator for 3 days. The plate was then equilibrated at room temperature for approximately 15 minutes, and 100 μL of CellCounting-Lite 2.0 Luminescent Cell Viability Assay reagent was added to each well. After incubation at room temperature for 10 minutes, luminescence (RLU) values were measured using a microplate reader. Data analysis was performed with GraphPad Prism 9, and IC50 values were calculated and plotted.

[0302] The results are shown in Figure 8. The ability of D50-60 and D50-139-60 to inhibit the proliferation of BaF3-IL31RA-OSMR cells was enhanced compared to that of Nemolizumab, while Amlitelimab did not exhibit significant inhibitory activity.

[0303] Example 10: Detection of the Ability of Bispecific Antibodies to Inhibit IL6 Secretion by DU145 Cells

[0304] DU145 cells in the logarithmic growth phase were centrifuged and counted, and the cell density was adjusted using 1640 medium (containing 10%FBS and 1%PS) and added to a 3599 plate at 2.25×10  / well, 100 μL / well. IL31-his was diluted with medium to 400 ng / mL (final concentration 100 ng / mL) , and 50 μL / well was added to the aforementioned 3599 plate. Antibodies were diluted with medium to 66.7 nM (final concentration 16.7 nM) , followed by 6-fold serial dilution to generate 6 concentration gradients, and 50 μL / well was added to the aforementioned 3599 plate. The plate was gently tapped to mix. The cell plate was incubated in a 37 ℃ incubator for 3 days, then centrifuged at 1000 g for 10 minutes. The supernatant was transferred to a 3799 plate, and the IL6 content in the supernatant was measured. Data analysis was performed with GraphPad Prism 9, and IC50 values were calculated and plotted.

[0305] The results are shown in Figure 9. The results in panel A of Figure 9 demonstrate that the ability of D50-60 and D50-139-60 to inhibit IL6 secretion by DU145 cells was enhanced compared to that of Nemolizumab, and no inhibitory activity was detected for Amlitelimab; the results in panel B of Figure 9 show that the ability of D50-60 to inhibit IL6 secretion by DU145 cells was superior to that of anti-IL-31Rα monoclonal antibody a (127H2) .

[0306] Example 11: Detection of the Ability of Bispecific Antibodies to Inhibit IFNγ Secretion by PBMCs

[0307] Fresh human PBMCs were centrifuged and counted, and the cell density was adjusted using 1640 medium (containing 10%FBS and 1%PS) and added to a 3599 plate at 2×10  / well, 100 μL / well. N-his-OX40L was diluted with medium to 2 μg / mL (final concentration 0.5 μg / mL) , and 50 μL / well was added to the aforementioned 3599 plate. Antibodies were diluted with medium to 2000 nM (final concentration 500 nM) , followed by 4-fold serial dilution to generate 8 concentration gradients, and 50 μL / well was added to the aforementioned 3599 plate. The plate was gently tapped to mix. The cell plate was incubated in a 37 ℃ incubator for 5 days, then centrifuged at 1000 g for 10 minutes. The supernatant was transferred to a 3799 plate for IFNγ detection. The IFNγ detection kit was purchased from SinoBiological (Catalog No. SEKA11725) , and the undiluted cell supernatant was used for detection. Data analysis was performed with GraphPad Prism 9, and IC50 values were calculated and plotted.

[0308] The results are shown in Figure 10. The ability of D50-5 to inhibit IFNγ secretion by PBMCs was enhanced compared to that of Amlitelimab.

[0309] Example 12: Efficacy Evaluation of Bispecific Antibodies in a Cynomolgus Monkey Model of Atopic Dermatitis

[0310] (I) Experimental Design

[0311] Modeling protocol: Induction with DNCB (2, 4-Dinitrochlorobenzene) . On the day before induction (Day -1) , the back skin was depilated over an area of 4×6 cm. On Day 1, Day 2, and Day 3, induction was performed consecutively with 1%DNCB. From Day 5 to Day 27, 0.5%DNCB was applied once every two days. Model induction continued until Day 27. IL-31 induction: Intravenous injection of IL-31 at 1 μg / kg. Scratching events within 2 hours of video recording after induction were counted, twice per week for a total of 8 times.

[0312] Dosing regimen: Cynomolgus monkeys (sourced from Guangxi Fangchenggang Changchun Biotechnology Development Co., Ltd. ) , 3 per group, intravenous infusion, once per week for a total of 4 doses (Day 1, Day 8, Day 15, Day 21) . Groups A and B were administered normal saline. Test articles were thawed at 2-8 ℃ one day in advance. On the day of administration, they were brought to room temperature and diluted to the dosing concentration with normal saline. Grouping and dosing regimen are detailed in Table 6 below (Note: 1276 refers to D50-60; 1396 refers to D50-139-60; Amab refers to Amlitelimab) :

[0313] Table 6

[0314] (II) Experimental Results

[0315] 1. Clinical Observations and Body Weight

[0316] During the trial, aside from atopic dermatitis-like symptoms at the induction site, no abnormalities were observed in clinical observations across all groups. Body weight fluctuations were minor in all groups.

[0317] 2. Clinical Scoring

[0318] The skin scoring criteria are as shown in Table 7. After model induction, animals began to exhibit disease symptoms from day 5. Group B (model control group) showed obvious model symptoms at the induction site, with skin manifestations including erythema, scaling, thickening, and dryness. Compared with Group B, Group E showed no significant improvement in scores (P > 0.05) . Group F showed significant improvement in scores on days 12, 15, 22, 26, and 28 (P < 0.05) . Group G showed significant improvement in scores from day 19 to day 28 (P < 0.05) . Group H showed significant improvement in scores from day 19 to day 28 (P < 0.05) . Compared with Group E, Group G exhibited superior scores from day 15 to day 28. Compared with Group F, Group H exhibited superior scores from day 8 to day 28. Statistical results are shown in Figure 14.

[0319] Table 7 Skin Scoring Criteria

[0320] 3. Pruritus Statistical Results

[0321] The results are shown in Figure 15. After model induction, compared with Group A (blank control group) , Group B (model control group) exhibited significantly increased scratching episodes from day 1 to day 26 (P < 0.0001) . Compared with Group B (model control group) , Group C exhibited significant improvement in scratching episodes on day 5, day 8, and day 19 (P < 0.05) ; Group D exhibited significant improvement in scratching episodes from day 5 to day 26 (P <0.0001) ; Group E exhibited significant improvement in scratching episodes on day 1, day 8, day 12, day 15, day 22, and day 26 (P < 0.05) ; Group F exhibited significant improvement in scratching episodes from day 1 to day 26 (P < 0.0001) ; Group G exhibited significant improvement in scratching episodes on day 1, day 5, day 8, day 12, day 22, and day 26 (P < 0.01) ; Group H exhibited significant improvement in scratching episodes from day 1 to day 26 (P < 0.0001) . The improvement effect on pruritus in Group H was comparable to that in Group F. Groups E, F, G, and H exhibited significant improvement in pruritus on day 1, whereas Groups C and D exhibited improvement only on day 5.

[0322] 4. Histopathological Examination of SkinTissue

[0323] At the experimental endpoint, skin from the induced dorsal area was collected for pathological staining. The results are shown in Figure 16 (scoring criteria for skin lesions are provided in Table 8) . Pathological results indicated that, compared with Group A (blank control group) , Group B (model control group) exhibited a significantly increased pathological score (P < 0.01) . Compared with Group B (model control group) , Groups F and H exhibited significantly reduced pathological scores (P < 0.05) .

[0324] Table 8 Scoring Criteria for Dorsal Skin Lesions

[0325] Note: Each item scored 0-4 points, totaling 12 points.

[0326] 5. Skin Cytokine Test

[0327] At the endpoint (Day 28) , skin from the induction site was collected for ELISA detection of multiple cytokines. Results are shown in Figures 17-21. Compared with Group A (blank control group) , the level of cytokine IL-4 in skin tissue of Group B (model control group) was significantly increased (P<0.05) , while IL-25, TSLP, IL-33, and IL-6 showed an increasing trend. Compared with Group B (model control group) , all other groups exhibited a decreasing trend in skin tissue cytokines IL-25, TSLP, and IL-6.

[0328] For cytokine IL-25, compared with Group A (blank control group) , Group B (model control group) showed an increased level of IL-25 in skin tissue. Compared with Group B (model control group) , all other groups exhibited a decreasing trend in skin tissue cytokine IL-25.

[0329] For cytokine IL-4, compared with Group A (blank control group) , Group B (model control group) showed a significantly increased level of IL-4 in skin tissue (P<0.05) . Compared with Group B (model control group) , all groups except Group E exhibited a decreasing trend in skin tissue cytokine IL-4.

[0330] For cytokine TSLP, compared with Group A (blank control group) , Group B (model control group) showed an increased level of TSLP in skin tissue. Compared with Group B (model control group) , all other groups exhibited a decreasing trend in skin tissue cytokine TSLP.

[0331] For cytokine IL-33, compared with Group A (blank control group) , Group B (model control group) showed an increased level of IL-33 in skin tissue. Compared with Group B (model control group) , Group G and Group H exhibited a decreasing trend in skin tissue cytokine IL-33.

[0332] For cytokine IL-6, compared with Group A (blank control group) , Group B (model control group) showed an increased level of IL-6 in skin tissue; compared with Group B (model control group) , all other groups exhibited a decreasing trend in skin tissue cytokine IL-6.

[0333] In summary, in the pharmacodynamic evaluation study of the cynomolgus monkey atopic dermatitis model, test articles 1276 (26.265 mg / kg) and 1396 (26.28 mg / kg) significantly improved the clinical score, pruritus statistics, skin pathology score, and cytokines of cynomolgus monkey atopic dermatitis, with optimal efficacy and 1396 (26.28 mg / kg) being superior to 1276 (26.265 mg / kg) . Its improvement effects on clinical score, pruritus statistics, and skin pathology scorewere superior to the combination therapyAmab + 127h2 (21.9 mg / kg + 21.72 mg / kg) , and its improvement effects on clinical score, pruritus statistics, and some cytokines were superior to the monotherapy Amab (21.9 mg / kg) .

[0334] All publications mentioned in the present invention are incorporated in the present application by reference to the same extent as if each individual publication was individually indicated to be incorporated by reference. Furthermore, it should be understood that, after reading the above teachings of the present invention, those skilled in the art can make various changes or modifications to the present invention, and these equivalent forms shall also fall within the scope defined by the claims attached to the present application.

Claims

A bispecific antibody, characterized in that the bispecific antibody comprises:a first antigen-binding domain D1, anda second antigen-binding domain D2;wherein said D1 specifically binds to the target molecule OX40L protein, and said D2 specifically binds to the target molecule IL-31Rα protein.The bispecific antibody according to claim 1, characterized in that said D1 is an anti-OX40L antibody or an antigen-binding fragment thereof; and said D2 is an anti-IL-31Rα antibody or an antigen-binding fragment thereof.The bispecific antibody according to claim 1, characterized in that said bispecific antibody comprises an anti-IL-31Rα IgG antibody and an anti-OX40L VHH, wherein said anti-OX40L VHH is tandemly linked to the anti-IL-31Rα IgG antibody via a linker.The bispecific antibody according to claim 1, characterized in that said bispecific antibody comprises a monomer, and said monomer has the structure of Formula I from the N-terminus to the C-terminus:wherein,VHH represents an anti-OX40L VHH;VH represents the heavy chain variable region of the anti-IL-31Rα antibody;VL represents the light chain variable region of the anti-IL-31Rα antibody;CH represents the heavy chain constant region;CL represents the light chain constant region;L represents a linker or bond;“～” represents a disulfide bond;“-” represents a peptide bond.The bispecific antibody according to claim 3, characterized in that said anti-OX40L VHH comprises the following three complementarity-determining regions HCDR:HCDR1 as set forth in SEQ ID NO: 1 or 2; HCDR2 as set forth in SEQ ID NO: 3; and HCDR3 as set forth in SEQ ID NO: 4 or 5.The bispecific antibody according to claim 3, characterized in that the amino acid sequence of said anti-OX40L VHH is as set forth in any one of SEQ ID NO: 6, 8, or 10.The bispecific antibody according to claim 2, characterized in that the anti-IL-31Rα antibody comprises a heavy chain complementarity-determining region HCDR selected from the group consisting of:(1) HCDR1 as set forth in SEQ ID NO: 12; HCDR2 as set forth in SEQ ID NO: 13; and HCDR3 as set forth in SEQ ID NO: 14; or(2) HCDR1 as set forth in SEQ ID NO: 15; HCDR2 as set forth in SEQ ID NO: 16; and HCDR3 as set forth in SEQ ID NO: 14;and said anti-IL-31Rα antibody comprises the following three light chain complementarity-determining regions LCDR:LCDR1 as set forth in SEQ ID NO: 17; LCDR2 as set forth in SEQ ID NO: 18; and LCDR3 as set forth in SEQ ID NO: 19.The bispecific antibody according to claim 2, characterized in that the VH sequence of said anti-IL-31Rα antibody is as set forth in SEQ ID NO: 20 or 22; and the VL sequence of the anti-IL-31Rα antibody is as set forth in SEQ ID NO: 24.The bispecific antibody according to claim 1, characterized in that the sequence of said bispecific antibody is as follows:(1) said bispecific antibody has a heavy chain amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33, 35, or 37, and said bispecific antibody has a light chain amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;(2) a polypeptide derived from (1) , wherein said derivation refers to a sequence formed by substitution, deletion, or addition of one or more amino acid residues, and said polypeptide has a polypeptide sequence with both anti-OX40L activity and anti-IL-31Rα activity.A polynucleotide molecule, characterized in that said polynucleotide molecule encodes the bispecific antibody according to claim 1.An expression vector, characterized in that said expression vector contains the polynucleotide molecule according to claim 10.A host cell. characterized in that said host cell contains the expression vector according to claim 11.A method for preparing the bispecific antibody according to claim 1, characterized in that said preparation method comprises the following steps:a) culturing the host cell according to claim 12 under expression conditions, thereby expressing the bispecific antibody;b) isolating and purifying the bispecific antibody from step a) .A pharmaceutical composition, characterized in that said pharmaceutical composition comprises an effective amount of the bispecific antibody according to claim 1 and one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents, or excipients.Use of the bispecific antibody according to claim 1, or the pharmaceutical composition according to claim 14, in the manufacture of a medicament for treating a skin disease, pruritic disease, or inflammatory disease.An immunoconjugate, characterized in that said immunoconjugate comprises:(a) the bispecific antibody according to claim 1; and(b) a conjugate moiety selected from the group consisting of: a detectable label, a drug, a toxin, a cytokine, a radionuclide, or an enzyme.A method for treating a skin disease, pruritic disease, or inflammatory disease, characterized in that said method comprises administering to a subject in need thereof the bispecific antibody according to claim 1, the pharmaceutical composition according to claim 14, or the immunoconjugate according to claim 16.

Images