Methods of reducing allogenic rejection of cell therapy

Abstract

Provided herein are methods for treating a disease or disorder, or for reducing immune clearance in a human subject using modified immune cells and a calcineurin inhibitor. The human subject does not undergo lymphodepletion using one or more lymphodepleting agents or radiation therapy.

Description

METHODS OF REDUCING ALLOGENIC REJECTION OF CELL THERAPY

[0001] CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATION

[0002] This application claims benefit of priority of International Patent Application No. PCT / CN2024 / 141873 filed on December 24, 2024, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety.TECHNICAL FIELD

[0003] This disclosure relates to methods of treating a disease or disorder in a human subject using modified immune cells and a calcineurin inhibitor (CNI) under non-lymphodepletion conditions.BACKGROUND

[0004] The development of universal off-the-shelf cell therapy products (e.g., CAR-T) is a major goal of next-generation cell therapies. General-purpose cell therapies based on “allogeneic” cells generally have the issue of “transplantation rejection, ” where the transplanted cells induce Host-versus-Graft (HvG) reactions, and are cleared by the patient's immune system, especially by natural killer cells (NK cells) and T lymphocytes. This reduces the persistence and curative effects of the allogeneic cell therapies in the patient. Thus, there is a need to prevent or reduce HvG reactions and at the same time, improve the efficacy of allogeneic cell therapies.SUMMARY

[0005] The present disclosure relates to the prevention or mitigation of HvG reactions related to cell therapies (e.g., CAR-NK therapies) . Specifically, the disclosure relates to methods to promote allogeneic cell engraftment using a combination therapy of a calcineurin inhibitor (CNI) and modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) under non-lymphodepletion conditions. This approach helps to further reduce rejection in allogeneic cell transplantation while avoiding hematology-related toxicity caused by lymphatic pretreatment.

[0006] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a disease or disorder in a human subject, comprising (a) administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the human subject, and (b) administering an effective amount of modified immune cells to the human subject after step (a) , in some embodiments, the human subject is not administered with cyclophosphamide and fludarabine for lymphodepletion prior to step (b) .

[0007] In one aspect, the disclosure is related to a method of reducing immune clearance of modified immune cells in a human subject, comprising (a) administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the human subject, and (b) administering an effective amount of modified immune cells to the human subject after step (a) , in some embodiments, the human subject is not administered with cyclophosphamide and fludarabine for lymphodepletion prior to step (b) .

[0008] In some embodiments, the human subject is not administered with cyclophosphamide, fludarabine, or a combination thereof for lymphodepletion prior to step (b) . In some embodiments, the human subject is not administered with one or more lymphodepleting agents for lymphodepletion, in some embodiments, the one or more lymphodepleting agents are selected from: (a) one or more chemotherapeutic agents selected from bendamustine, busulfan, etoposide, cytarabine, and clofarabine; and / or (b) one or more biologic agents selected from an anti-CD52 antibody (e.g., alemtuzumab) and an anti-CD45 antibody (e.g., apamistamab) . In some embodiments, the human subject is not treated with radiation therapy for lymphodepletion, e.g., total body irradiation (TBI) . In some embodiments, the human subject does not undergo lymphodepletion, e.g., prior to step (b) .

[0009] In some embodiments, the CNI is cyclosporine, in some embodiments, the cyclosporine is administered at a dose level of about 1 mg / kg / day to about 25 mg / kg / day or about 0.5 mg / kg / twice a day to about 12.5 mg / kg / twice a day. In some embodiments, the CNI is tacrolimus, in some embodiments, the tacrolimus is administered at a dose level of about 0.01 mg / kg / day to about 1 mg / kg / day.

[0010] In some embodiments, step (a) occurs at least 1 hour, at least 2 hours, at least 3 hours, at least 4 hours, at least 5 hours, at least 6 hours, at least 7 hours, at least 8 hours, at least 9 hours, at least 10 hours, at least 11 hours, at least 12 hours, at least 18 hours, at least 1 day, at least 2 days, at least 3 days, at least 4 days, at least 5 days, at least 6 days, or at least 7 days prior to step (b) . In some embodiments, step (a) occurs less than 1 hour, less than 2 hours, less than 3 hours, less than 4 hours, less than 5 hours, less than 6 hours, less than 7 hours, less than 8 hours, less than 9 hours, less than 10 hours, less than 11 hours, less than 12 hours, less than 18 hours, less than 1 day, less than 2 days, less than 3 days, less than 4 days, less than 5 days, less than 6 days, or less than 7 days prior to step (b) . In some embodiments, the method further comprises monitoring the blood concentration of the CNI in the human subject before step (b) , in some embodiments, step (b) is performed when the blood concentration of the CNI is within a pre-determined range. In some embodiments, the CNI is cyclosporine and the pre-determined range is at least 25 ng / ml to about 2000 ng / ml. In some embodiments, the CNI is tacrolimus, and the pre-determined range is at least 1 ng / ml to about 100 ng / ml. In some embodiments, the blood concentration is blood trough concentration. In some embodiments, the CNI is cyclosporine and the pre-determined range is at least 25 ng / ml to about 500 ng / ml. In some embodiments, the CNI is tacrolimus, and the pre-determined range is at least 1 ng / ml to about 20 ng / ml.

[0011] In some embodiments, the CNI is administered intravenously and / or orally. In some embodiments, the CNI is administered intravenously by continuous infusion, or an infusion for about 2 to about 6 hours, optionally at a frequency of once daily or twice daily. In some embodiments, the CNI is administered orally with an effective amount of a formulation comprising cyclosporine liquid, cyclosporine capsules, tacrolimus liquid, immediate-release tacrolimus capsules, and / or extended-release tacrolimus capsules; optionally the CNI is administered at a frequency of once daily or twice daily.

[0012] In some embodiments, the method further comprises administering an effective amount of the CNI to the human subject after step (b) , in some embodiments, the CNI is administered intravenously and / or orally. In some embodiments, the effective amount of the CNI is administered to the human subject orally after step (b) . In some embodiments, the effective amount of the CNI is administered to the human subject after step (b) to maintain a blood trough concentration within a pre-determined range over a period of time. In some embodiments, the CNI is cyclosporine, and the pre-determined range is at least 25 ng / ml to about 500 ng / ml. In some embodiments, the CNI is tacrolimus, and the pre-determined range is at least 1 ng / ml to about 20 ng / ml. In some embodiments, the period of time is at least 7 days, at least 15 days, at least 20 days, at least 1 month, at least 2 months, or at least 3 months. In some embodiments, the CNI is cyclosporine, in some embodiments, the cyclosporine is administered at a dose level of about 1 mg / kg / day to about 25 mg / kg / day or about 0.5 mg / kg / twice a day to about 12.5 mg / kg / twice a day. In some embodiments, the CNI is tacrolimus, in some embodiments, the tacrolimus is administered at a dose level of about 0.01 mg / kg / day to about 1 mg / kg / day. In some embodiments, the effective amount of the CNI is administered to the human subject at least 1 hour, at least 2 hours, at least 3 hours, at least 6 hours, at least 12 hours, at least 18 hours, at least 1 day after step (b) .

[0013] In some embodiments, the method further comprises monitoring the blood concentration of one or more cytokines (e.g., IL-15, IL-7, IL-2, or a combination thereof) .

[0014] In some embodiments, the modified immune cells are allogeneic cells isolated from a donor for being administered to the human subject. In some embodiments, the immune clearance of the modified immune cells is through host immune cell-mediated cytotoxicity, e.g., host T cell-mediated cytotoxicity.

[0015] In some embodiments, proliferation of the modified immune cells is increased as compared to that when the human subject is subject to lymphodepletion. In some embodiments, T cell activation level in the human subject (e.g. in the peripheral blood or spleen) is decreased as compared to that when the human subject is subject to lymphodepletion.

[0016] In some embodiments, the modified immune cells are natural killer (NK) cells, T cells, NKT cells, monocytes, dendritic cells, macrophages, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) , B cells, or a combination thereof. In some embodiments, the modified immune cells express a chimeric antigen receptor (CAR) . In some embodiments, the modified immune cells are CAR-NK cells or CAR-T cells. In some embodiments, the CAR specifically binds to a target antigen. In some embodiments, the target antigen is selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, and PD-L2. In some embodiments, the modified immune cells are modified natural killer (NK) cells that do not comprise any modification that renders the modified NK cells resistant to the CNI. In some embodiments, the modified immune cells are modified T cells that comprise one or more modifications that render the modified T cells resistant to the CNI. In some embodiments, the modified immune cells are modified NK cells, in some embodiments, the modified NK cells express an armor protein (e.g., a cytokine) that stimulates NK cell proliferation.

[0017] In some embodiments, the human subject has a disease or disorder. In some embodiments, the disease or disorder is a cancer, an autoimmune disease, or an infection. In some embodiments, the human subject has a bone-marrow-related disease or disorder, optionally the bone-marrow-related disease or disorder is a bone-marrow-related autoimmune disease, e.g., a B-cell regulated autoimmune disease. In some embodiments, the human subject has a cancer, optionally the cancer is a hematological cancer, e.g., a lymphoma or a leukemia. In some embodiments, the human subject has acute lymphoblastic leukemia, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, Hodgkin lymphoma, non-Hodgkin lymphoma, Waldenstrom macroglobulinemia, follicular lymphoma, B-cell lymphoma, cutaneous T-cell lymphoma, multiple myeloma, and / or plasmacytoma. In some embodiments, the human subject has an autoimmune disease, optionally the autoimmune disease is systemic lupus erythematosus (SLE) , rheumatoid arthritis, Wegener's disease, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) , thrombotic throbocytopenic purpura (TTP) , autoimmune thrombocytopenia, multiple sclerosis (MS) , Systemic sclerosis / scleroderma (SSc) , Idiopathic inflammatory myopathy (IIM) , antiphospholipid syndrome (APS) , psoriasis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathies, myasthenia gravis (MG) , ANCA (Anti-neutrophil cytoplastic antibodies) associated vasculitis, diabetes mellitus, Reynaud's syndrome, Sjorgen's syndrome, Neuromyelitis Optica (NMO) , glomerulonephritis, or myelin oligodendrocyte glycoprotein-IgG associated disorders (MOGAD) .

[0018] Other features and advantages of the disclosure will be apparent from the following detailed description and figures, and from the claims.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0019] FIG. 1A shows an experimental scheme to test the expansion of allogenic MPC-11 tumor cells in C57BL / 6 receipt mice that were treated with fludarabine (Flu) and cyclophosphamide (Cyc) for lymphodepletion on Day -2, and then treated with Cyclosporine A (CsA) on Day -1. CsA is a calcineurin inhibitor (CNI) used for inhibiting rejection reactions of the allogenic MPC-11 tumor cells. BALB / c-derived MPC-11 tumor cells were administered on Day 0.

[0020] FIG. 1B shows the luminescence intensity of inoculated MPC-11 tumor cells in C57BL / 6 receipt mice. G1 group mice were not treated with Flu / Cyc on Day -2, and with vehicle on Day -1. G2 group mice were not treated with Flu / Cyc on Day -2, and with CsA on Day -1. G3 group mice were treated with Flu / Cyc on Day -2, and with CsA on Day -1. G4 group mice were treated with Flu / Cyc on Day -2, and with vehicle on Day -1.

[0021] FIG. 2A shows the percentage of CD71+ activated T cells among CD45+CD3+ T cells in peripheral blood of MPC-11 inoculated mice on Day 11 and Day 14. The mice were either treated with Flu / Cyc for lymphodepletion ( “LD” ) or not treated for lymphodepletion (“nonLD” ) . All mice were treated with CsA.

[0022] FIG. 2B shows the percentage of CD71+ cells in CD4+CD3+ or CD4-CD3+ T cells in the spleen of C57BL / 6 mice. The mice were either treated with Flu / Cyc for lymphodepletion ( “LD” ) or not treated for lymphodepletion ( “nonLD” ) .

[0023] FIG. 3A shows a schematic diagram of a 2-way MLR (Mixed Lymphocyte Reaction) reaction. PBMCs from two different donors were mixed. The cells were treated with CsA, with or without cytokines.

[0024] FIG. 3B shows the percentage of CD71+ cells in T cells in the MLR reaction (Donor 1) .Cells were treated with CsA alone ( “Ctrl” ) , or together with IL7, IL15, a combination of IL7 and IL15, or IL2. IL2 was used as a benchmark control.

[0025] FIG. 3C shows the percentage of CD71+ cells in T cells in the MLR reaction (Donor 2) .Cells were treated with CsA alone ( “Ctrl” ) , or together with IL7, IL15, a combination of IL7 and IL15, or IL2. IL2 was used as a benchmark control.

[0026] FIG. 4A is a set of flow cytometry results of peripheral blood of mice with reconstructed humanized immune systems that were reinfused with IL-15-armored CAR-NK cells targeting CD19 / BCMA. The mice were either treated with tacrolimus ( “CAR-NK +Tacrolimus” ; right panel) or not treated with tacrolimus ( “CAR-NK only” ; left panel) .

[0027] FIG. 4B shows the percentage of CAR-NK cells (CD45+ ScFv+) in the peripheral blood of the tacrolimus-treated group ( “CAR-NK+Tac” ) and the untreated group ( “CAR-NK”) .

[0028] FIG. 4C shows the serum IgG change in the peripheral blood of the tacrolimus-treated group ( “CAR-NK+Tac” ) and the untreated group ( “CAR-NK” ) .DETAILED DESCRIPTION

[0029] Before the reinfusion of immune cell therapy preparations, the use of cytotoxic drugs (e.g., fludarabine / cyclophosphamide, etc. ) to deplete host lymphocytes (lymphodepletion, or LD) has become a standard treatment plan in the field of cell therapy. It is generally believed that lymphocyte depletion can promote the expansion and therapeutic effect of cell therapy products through various pathways. This includes eliminating regulatory T cells, reducing the consumption of cytokines such as IL-7 / IL-15 by endogenous T cells, inducing tumor cell death, promoting antigen presentation, etc. It should be noted that although there are sufficient clinical practices to support the critical role of lymphodepletion in promoting the expansion and efficacy of cell therapy products, the establishment of these practice paradigms is mainly based on the experience of autologous cell reinfusion.

[0030] Compared with autologous cell therapy preparations, allogeneic cell therapy preparations additionally face the problem of transplant rejection, in which host T lymphocytes play a crucial role in rejection. Intuitively, lymphodepletion reduces the number of T cells, so it is speculated that lymphodepletion can reduce the intensity of rejection reactions. However, a large number of studies have shown that the remaining T lymphocytes after lymphodepletion can restore the number of lymphocytes through “homeostatic proliferation. ” During this process, the activation threshold of T cells can be further reduced, showing an activated cell phenotype and entering the cell cycle. “Decreased cell number” and “activated cell phenotype” coexist, leading to seemingly contradictory results of lymphodepletion. It is yet unknown how lymphodepletion can ultimately affect the rejection reactions of autologous cell therapy.

[0031] In mouse heart allograft experiments, researchers found that lymphodepletion breaks immune tolerance and thereby reduces heart graft survival, suggesting that lymphodepletion promotes transplant rejection. In clinical trials, the use of anti-CD52 monoclonal antibodies was often accompanied by the occurrence of secondary autoimmune diseases, leading to the clonal expansion of T lymphocytes, suggesting that lymphocyte clearance may be related to an imbalance in the homeostasis of the immune system or related to overactivation. Importantly, lymphodepletion is not necessary to suppress rejection in solid organ transplantation. Non-lymphocytic, basiliximab-based rejection prevention regimens have shown similar effectiveness to rejection prevention regimens based on anti-thymocyte globulin (ATG) or anti-CD52 monoclonal antibodies. Because no lymphodepletion is performed, the risk of infection is lower.

[0032] Details of lymphodepletion and its applications can be found, e.g., in Klebanoff, C. A., et al. "Sinks, suppressors and antigen presenters: how lymphodepletion enhances T cell-mediated tumor immunotherapy. " Trends in Immunology 26.2 (2005) : 111-117; Kirk, A. D. "Induction immunosuppression. " Transplantation 82.5 (2006) : 593-602; Eldershaw, S., et al. "Lymphopenia-induced lymphoproliferation drives activation of naive T cells and expansion of regulatory populations. " iScience 24.3 (2021) ; Wu, Z., et al. "Homeostatic proliferation is a barrier to transplantation tolerance. " Nature Medicine 10.1 (2004) : 87-92; Jones, J. L., et al. "Human autoimmunity after lymphocyte depletion is caused by homeostatic T-cell proliferation. " Proceedings of the National Academy of Sciences 110.50 (2013) : 20200-20205; Kaufman, D. B., et al. "Alemtuzumab induction and prednisone-free maintenance immunotherapy in kidney transplantation: Comparison with basiliximab induction-Long-term results. " American Journal of Transplantation 5.10 (2005) : 2539-2548; and Wei, W., et al. "A retrospective comparison of the efficacy and safety in kidney transplant recipients with basiliximab and anti-thymocyte globulin. " Chinese Medical Journal 125.6 (2012) : 1135-1140; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0033] PCT / CN2023 / 121132 describes methods to inhibit rejection and promote CAR-NK amplification using calcineurin inhibitors (CNIs) , e.g., tacrolimus or cyclosporine. Without wishing to be bound by theory and to further optimize the above methods, it is hypothesized that the combined use of CNI or other immunosuppressants under non-lymphodepletion conditions may avoid the steady-state expansion of host T cells and further extend the survival time of allogeneic immune cell preparations.

[0034] To test this hypothesis, the present disclosure compared the effectiveness of cyclosporine in controlling rejection with or without lymphodepletion. The results showed that in non-depleted hosts, cyclosporine can more effectively inhibit the occurrence of rejection reactions and promote the expansion and long-term survival of allogeneic cells. Consistently, lymphodepletion caused T cells to exhibit an activated phenotype. In addition, in the mouse model of the humanized immune system (HIS) , tacrolimus significantly promoted the expansion of CAR-NK under non-lymphodepletion conditions.

[0035] Accordingly, in one aspect, the disclosure provides methods of treating a disease or disorder in a human subject, the method comprising (a) administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the human subject, and (b) administering an effective amount of modified immune cells to the human subject after step (a) . In some embodiments, the human subject is not administered with cyclophosphamide and fludarabine for lymphodepletion prior to step (b) .

[0036] In one aspect, the disclosure provides methods of reducing immune clearance of modified immune cells in a human subject, the method comprising (a) administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the human subject, and (b) administering an effective amount of modified immune cells to the human subject after step (a) . In some embodiments, the human subject is not administered with cyclophosphamide and fludarabine for lymphodepletion prior to step (b) .

[0037] In some embodiments, the human subject does not undergo lymphodepletion using any of the methods described herein.

[0038] As used herein, the term “chimeric antigen receptor” or “CAR” as used herein refers to genetically engineered receptors, which can be used to graft one or more antigen specificity onto immune effector cells, such as T cells. Some CARs are also known as “artificial T-cell receptors, ” “chimeric T cell receptors, ” or “chimeric immune receptors. ” A CAR may comprise an extracellular ligand binding domain or an extracellular antigen binding domain specific for one or more ligands or antigens (such as tumor antigens, autoimmune disease antigens) , a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain. “CAR-T cell” refers to a T cell that expresses a CAR.

[0039] As used herein, the term “cancer” refers to cells having the capacity for autonomous growth. Examples of such cells include cells having an abnormal state or condition characterized by rapidly proliferating cell growth. The term is meant to include cancerous growths, e.g., tumors; oncogenic processes, metastatic tissues, and malignantly transformed cells, tissues, or organs, irrespective of histopathologic type or stage of invasiveness. Also included are malignancies of the various organ systems, such as respiratory, cardiovascular, renal, reproductive, hematological, neurological, hepatic, gastrointestinal, and endocrine systems; as well as adenocarcinomas which include malignancies such as most colon cancers, renal-cell carcinoma, prostate cancer and / or testicular tumors, non-small cell carcinoma of the lung, and cancer of the small intestine. Cancer that is “naturally arising” includes any cancer that is not experimentally induced by implantation of cancer cells into a subject, and includes, for example, spontaneously arising cancer, cancer caused by exposure of a patient to a carcinogen (s) , cancer resulting from insertion of a transgenic oncogene or knockout of a tumor suppressor gene, and cancer caused by infections, e.g., viral infections. The term “carcinoma” is art recognized and refers to malignancies of epithelial or endocrine tissues. The term also includes carcinosarcomas, which include malignant tumors composed of carcinomatous and sarcomatous tissues. An “adenocarcinoma” refers to a carcinoma derived from glandular tissue or in which the tumor cells form recognizable glandular structures. The term “sarcoma” is art recognized and refers to malignant tumors of mesenchymal derivation. The term “hematopoietic neoplastic disorders” includes diseases involving hyperplastic / neoplastic cells of hematopoietic origin. A hematopoietic neoplastic disorder can arise from myeloid, lymphoid or erythroid lineages, or precursor cells thereof.

[0040] As used herein, the term “a bone-marrow-related autoimmune disease” indicates a group of diseases that affect the bone marrow. Some pathogenic cells of these diseases can be located in the bone marrow, develop in the bone marrow, and / or invade the bone marrow, thereby affecting the function of the bone marrow. The bone-marrow-related autoimmune disease includes a B-cell regulated autoimmune disease. The term "a B-cell regulated autoimmune disease" is an autoimmune disorder that involves misregulation of B-cells. The B-cell regulated autoimmune disease can be an autoimmune disorder associated with autoreactive plasma cells and / or autoreactive memory B cells.

[0041] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human, to whom treatment according to the methods of the present disclosure is provided. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated by the present disclosure. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals.

[0042] As used herein, the term “donor” represents an organism from which a biological sample is produced from, for example, a human from whom cells can be obtained. The organism includes mammals such as rats, mice, rabbits, sheep, cats, dogs, cows, pigs, and non-human primates. The term “donor” also encompasses any vertebrate including but not limited to mammals, reptiles, amphibians and fish. A “donor” can also refer to more than one donor, for example one or more humans or non-human animals or non-human mammals. However, advantageously, the donor is a mammal such as a human. The donor can be a cancer patient that is to be treated with a population of cells generated by the methods described herein (i.e., an autologous donor) , or can be an individual who donates a sample that, upon generation of the population of cells generated by the methods described herein, will be used to treat a different individual or cancer patient (i.e., an allogeneic donor) .

[0043] As used herein, the term “derived from” indicates a relationship between a first and a second molecule. It generally refers to structural similarity between the first molecule and a second molecule and does not connotate or include a process or source limitation on a first molecule that is derived from a second molecule. For example, in the case of an intracellular signaling domain that is derived from a CD3 zeta molecule, the intracellular signaling domain retains sufficient CD3 zeta sequence / structure such that is has the required function, namely, the ability to generate a signal under the appropriate conditions. It does not connotate or include a limitation to a particular process of producing the intracellular signaling domain, for example, it does not mean that, to provide the intracellular signaling domain, one must start with a CD3 zeta sequence and delete unwanted sequence, or impose mutations, to arrive at the intracellular signaling domain. A domain derived from a particular protein may have a sequence that is at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to the relevant functional portion of the particular protein.

[0044] As used herein, the terms “modified cell” or “engineered cell” refer interchangeably to a genetically altered e.g., transduced, transformed, transfected, and / or conjugated) cell. The term refers to the particular subject cell and also to the progeny or potential progeny of such a cell. Because certain modifications may occur in succeeding generations due to either mutation or environmental influences, such progeny may not, in fact, be identical to the parent cell, but are still included within the scope of the term as used herein. In certain embodiments, a nucleic acid (e.g., a vector) and / or a polypeptide (e.g., a protein and / or a peptide) may be introduced (e.g., transduced, transformed, transfected, and / or conjugated) into a cell, for example, according to the methods described herein. Once a nucleic acid and / or a polypeptide has been introduced into the cell, it may be referred to as a “modified cell” herein. Once the nucleic acid molecule or vector is introduced into the subject’s cell, the resultant modified cell should be capable of expressing an encoded polypeptide and, e.g., correctly localizing the encoded polypeptide for its intended function, e.g., transporting the encoded polypeptide to the cell surface) .

[0045] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs. Methods and materials are described herein for use in the present disclosure; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0046] Lymphodepletion (LD)

[0047] Lymphodepletion, also known as lymphodepleting chemotherapy or lymphodepleting regimen, is a short-term preconditioning treatment designed to eliminate host immune cells, particularly lymphocytes, or T and B cells, resulting in lymphopenia or cytopenia. This process reduces lymphocyte counts and raises levels of homeostatic cytokines (e.g., IL-7 and IL-15) , creating an environment for the engraftment and expansion of transferred immune cells.

[0048] It is generally thought that lymphodepletion can improve engraftment and activity of engineered receptor-expressing cells, such as CAR-T cells. For example, lymphodepletion may enhance adoptively transferred tumor-specific T cells to proliferate in vivo through homeostatic proliferation; lymphodepletion may reduce or eliminate CD4+CD25+ regulatory T cells, which can suppress the function of tumor-targeted adoptively transferred T cells; lymphodepletion prior to adoptive T-cell therapy may enhance the expression of stromal cell-derived factor 1 (SDF-1) in the bone marrow, enhancing the homing of modified T cells to the primary tumor site through binding of SDF-1 with CXCR-4 expressed on the T-cell surface; lymphodepletion may further reduce the subject’s tumor burden and potentially lower the risk and severity of cytokine release syndrome (CRS) .

[0049] Currently, prior to CAR-T cell therapy, patients are often pre-treated with a round of chemotherapy for purposes of lymphodepletion. Typically, the chemotherapeutic lymphodepletion agents are fludarabine, cyclophosphamide, or a combination thereof. This is typically carried out 2 days to 1 week prior to administration of the CAR-T cells. In terms of autologous cell therapy, this is generally sufficient to eliminate enough of the host lymphocytes to make space for the incoming CAR-T cells to benefit from the microenvironment of the host and promote expansion of the incoming CAR-T cells. Commonly used lymphodepleting agents include cytotoxic chemotherapy drugs such as cyclophosphamide, fludarabine, bendamustine, busulfan, etoposide, cytarabine, and clofarabine. Lymphodepletion can also be achieved through total body irradiation or biologics such as anti-CD52 antibodies (e.g., alemtuzumab) and anti-CD45 antibodies (e.g., apamistamab) .

[0050] As commonly used in the art, lymphodepletion can be performed on a subject, e.g., prior to administering engineered cells, e.g., CAR-expressing cells. In some embodiments, the lymphodepletion comprises administering one or more of melphalan, cyclophosphamide, and / or fludarabine. In some embodiments, a lymphodepleting chemotherapy is administered to the subject prior to, concurrently with, or after administration (e.g., infusion) of engineered cells, e.g., CAR-expressing cells. For example, the lymphodepleting chemotherapy may be administered to the subject prior to administration of engineered cells, e.g., CAR-expressing cells. In some embodiments, the lymphodepleting chemotherapy is administered 1 to 10 days prior to administration of engineered cells, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 days prior to the initiation of administration of engineered cells, or at least 2 days prior, such as at least 3, 4, 5, 6, or 7 days prior, to the initiation of administration of engineered cell. In some embodiments, the subject is administered a preconditioning agent no more than 7 days prior, such as no more than 6, 5, 4, 3, or 2 days prior, to the initiation of administration of engineered cell. The number of days after lymphodepleting chemotherapy that the engineered cells are administered can be determined based on clinical or logistical circumstances. In some examples, dose adjustments or other changes to the lymphodepleting chemotherapy regimen can be implemented due to a subject’s health, such as the subject’s underlying organ function, as determined by the treating physician. The engineered cells may include any of the modified immune cells described herein.

[0051] As commonly used in the art, lymphodepletion comprises administration of a lymphodepleting agent, such as cyclophosphamide, fludarabine, or combinations thereof. In some embodiments, the subject is administered cyclophosphamide at a dose between or between about 20 mg / kg and 100 mg / kg body weight of the subject, such as between about 40 mg / kg and 80 mg / kg. In some aspects, the subject is administered about 60 mg / kg of cyclophosphamide. In some embodiments, the cyclophosphamide is administered once daily for one or two days. In some embodiments, where the lymphodepleting agent comprises cyclophosphamide, the subject is administered cyclophosphamide at a dose between or between about 100 mg / m2 and 500 mg / m2 body surface area of the subject, such as between or between about 200 mg / m2 and 400 mg / m2, or 250 mg / m2 and 350 mg / m2, inclusive. In some instances, the subject is administered about 300 mg / m2 of cyclophosphamide. In some embodiments, the cyclophosphamide can be administered in a single dose or can be administered in a plurality of doses, such as given daily, every other day or every three days. In some embodiments, cyclophosphamide is administered daily, such as for 1-5 days, for example, for 2 to 4 days. In some instances, the subject is administered about 300 mg / m2 of cyclophosphamide, daily for 3 days, prior to initiation of the cell therapy.

[0052] As commonly used in the art, where the lymphodepleting agent comprises fludarabine, the subject is administered fludarabine at a dose between or between about 1 mg / m2 and 100 mg / m2 body surface area of the subject, such as between or between about 10 mg / m2 and 75 mg / m2, 15 mg / m2 and 50 mg / m2, 20 mg / m2 and 40 mg / m2, or 24 mg / m2 and 35 mg / m2, inclusive. In some instances, the subject is administered about 30 mg / m2 of fludarabine. In some embodiments, the fludarabine can be administered in a single dose or can be administered in a plurality of doses, such as given daily, every other day or every three days. In some embodiments, fludarabine is administered daily, such as for 1-5 days, for example, for 2 to 4 days. In some instances, the subject is administered about 30 mg / m2 of fludarabine, daily for 3 days, prior to initiation of the cell therapy.

[0053] As commonly used in the art, the lymphodepleting agent may comprise a combination of agents, such as a combination of cyclophosphamide and fludarabine. Thus, the combination of agents may include cyclophosphamide at any dose or administration schedule, such as those described above, and fludarabine at any dose or administration schedule, such as those described above. For example, in some aspects, the subject is administered fludarabine at or about 30 mg / m2, daily, and cyclophosphamide at or about 300 mg / m2, daily, for 3 days.

[0054] Details of methods for lymphodepletion can be found, e.g., in Hay, K. A. et al. "Chimeric antigen receptor (CAR) T cells: lessons learned from targeting of CD19 in B-cell malignancies. " Drugs 77 (2017) : 237-245; and Lickefett, B. et al. "Lymphodepletion –an essential but undervalued part of the chimeric antigen receptor T-cell therapy cycle. Front Immunol. 2023; 14: 1303935; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0055] In some embodiments, the human subject described herein does not undergo lymphodepletion, e.g., using one or more lymphodepletion agents or radiation therapy for lymphodepletion purposes. For example, the human subject described herein may not be administered with cyclophosphamide, fludarabine, or a combination thereof for lymphodepletion. In some embodiments, the human subject is not administered with one or more lymphodepleting agents for lymphodepletion. The one or more lymphodepleting agents may include: one or more chemotherapeutic agents selected from bendamustine, busulfan, etoposide, cytarabine, and clofarabine; and one or more biologic agents selected from an anti-CD52 antibody (e.g., alemtuzumab) and an anti-CD45 antibody (e.g., apamistamab) . In some embodiments, the human subject described herein is not treated with radiation therapy for lymphodepletion, e.g., total body irradiation (TBI) .

[0056] In some embodiments, the human subject described herein may have been administered with one or more chemotherapeutic agents (e.g., any of the chemotherapeutic agents described herein, such as cyclophosphamide, fludarabine, bendamustine, busulfan, etoposide, cytarabine, and clofarabine) or biologic agents (e.g., any of the biologic agents described herein, such as alemtuzumab and apamistamab) or treated with radiation therapy (e.g., any of the radiation therapies described herein) for purposes other than lymphodepletion. In some embodiments, the human subject described herein may have been administered with one or more chemotherapeutic agents or biologic agents or treated with radiation therapy for purposes of treating a tumor.

[0057] In some embodiments, the human subject described herein does not undergo lymphodepletion, e.g., one or more lymphodepletion agents or radiation therapy for lymphodepletion purposes, prior to, at substantially the same time, and / or after the administration of modified immune cells (e.g., any of the modified immune cells described herein) . In some embodiments, the human subject described herein does not undergo lymphodepletion, e.g., one or more lymphodepletion agents or radiation therapy for lymphodepletion purposes, prior to, at substantially the same time, and / or after the administration of CNIs (e.g., any of the CNIs described herein) .

[0058] Calcineurin inhibitors (CNIs)

[0059] Calcineurin inhibitors (CNIs) are immunosuppressants used to manage autoimmune conditions including but not limited to lupus nephritis, idiopathic inflammatory myositis, interstitial lung disease, and atopic dermatitis. In addition, they are used as mainstays for immunosuppression in solid organ transplants.

[0060] In contrast to lymphodepletion agents, calcineurin inhibitors are non-lymphodepleting immunosuppressants. Rather than directly killing immune cells, they inhibit immune cell functions, especially those of T and B cells, and reduce cytokine production.

[0061] a. Cyclosporine

[0062] Cyclosporin (cyclosporin A, or CsA) is a cyclic nonribosomal peptide of eleven amino acids, an immunosuppressant drug widely used in post-allogeneic organ transplant to reduce the activity of the patient's immune system, and therefore the risk of organ rejection. The structure and chemical and physical properties of CsA is known in the art (see, e.g., the PubChem website, PubChem CID 5284373) . Cyclosporine can be used together with other medicines to prevent the body from rejecting a transplanted organ (e.g., kidney, liver, or heart) . Cyclosporine is also used to treat severe rheumatoid arthritis in patients who have failed treatment with methotrexate. This medicine is also used to treat adults with severe plaque psoriasis after other treatments (e.g., PUVA, retinoids, or methotrexate) failed.

[0063] The mechanism of action of cyclosporine is as a calcineurin inhibitor, a cytochrome P450 3A4 inhibitor, and a P-glycoprotein inhibitor. CsA inhibits the synthesis of interleukins (IL) , including IL-2, which is essential for the self-activation of T lymphocytes (LT) and their differentiation. Cyclosporine is effective due to specific and reversible inhibition of immunocompetent lymphocytes in the G0 and G1-phase of the cell cycle. The T-helper cell is the primary target, although it may also suppress T-suppressor cells. The LT-B-lymphocyte (LB) co-operation is essential for activation of LB, and the latter also gets inhibited. In addition, research has demonstrated that CsA had an inhibiting effect on CD4+ CD25+ Tregs, which might block the host immune tolerance potentiality.

[0064] b. Tacrolimus

[0065] Tacrolimus (anhydrous) , or Tac, is a macrolide lactam containing a 23-membered lactone ring, originally isolated from the fermentation broth of a Japanese soil sample that contained the bacteria Streptomyces tsukubaensis. It has a role as an immunosuppressive agent and a bacterial metabolite. The structure and chemical and physical properties of Tac is known in the art (see, e.g., the PubChem website, PubChem CID 445643) .

[0066] Tacrolimus (also known as FK-506 or Fujimycin) is an immunosuppressive drug whose main use is after organ transplant to reduce the activity of the patient's immune system and so the risk of organ rejection. It is also used in a topical preparation in the treatment of severe atopic dermatitis, severe refractory uveitis after bone marrow transplants, and the skin condition vitiligo. Tacrolimus is chemically known as a macrolide. It reduces peptidyl-prolyl isomerase activity by binding to the immunophilin FKBP-12 (FK506 binding protein) creating a new complex. This FKBP12-FK506 complex inhibits calcineurin which inhibits T-lymphocyte signal transduction and IL-2 transcription.

[0067] Other uses of tacrolimus include prophylaxis for prevention of corneal, pancreatic, renal, and small intestine transplant rejection, induction therapy of lupus nephritis, treatment of Crohn disease, membranous glomerulonephritis, and myasthenia gravis, and to reduce the incidence of pancreatitis in patients undergoing liver transplantation after endoscopic retrograde cholangiopancreatography.

[0068] c. Other CNIs

[0069] Other CNIs for treating a disease or disorder or reducing immune clearance in a human subject as described herein may include, e.g., pimecrolimus and voclosporin.

[0070] Pimecrolimus is approved as a 1%topical formulation and is FDA-approved for the treatment of mild to moderate atopic dermatitis. Its other uses include oral lichen planus, psoriasis on the face and intertriginous areas, vitiligo, lichen sclerosis of the vulva, and seborrheic dermatitis (see, e.g., Ayer J, Young HS. Pimecrolimus for psoriasis. Expert Opin Pharmacother. 2013 Apr; 14 (6) : 767-74) . The CNI used in the methods described herein may be pimecrolimus. The pimecrolimus may be administered at any suitable dosage.

[0071] Voclosporin is a novel drug of the class and got FDA approval in 2021 in its oral form to be used with other immunosuppressants for the treatment of active lupus nephritis in adults (see, e.g., Rovin BH, et al., Efficacy and safety of voclosporin versus placebo for lupus nephritis (AURORA 1) : a double-blind, randomised, multicentre, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 2021 May 29; 397 (10289) : 2070-2080; and Ponticelli C et al., Old and New Calcineurin Inhibitors in Lupus Nephritis. J Clin Med. 2021 Oct 21; 10 (21) ) . The CNI used in the methods described herein may be voclosporin. The voclosporin may be administered at any suitable dosage.

[0072] Administration of CNIs

[0073] Provided herein are methods of treating a disease or disorder or reducing immune clearance of modified immune cells in a human subject under non-lymphodepletion conditions. In some embodiments, the methods include administering an effective amount of a CNI (e.g., any of the CNIs described herein) and an effective amount of modified immune cells (e.g., any of the modified immune cells described herein) . In some embodiments, the administration of the CNI is performed prior to, at substantially the same time, and / or after the administration of the modified immune cells. In some embodiments, the trough concentration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) is monitored during the administration of the CNI.

[0074] In some embodiments, the methods described herein further include monitoring the blood concentration of one or more cytokines, e.g., IL-15, IL-7, IL-2, or a combination thereof. In some embodiments, the one or more cytokines are hemostatic cytokines. In some embodiments, the one or more cytokines are not hemostatic cytokines.

[0075] a. Administration of CNIs prior to administration of modified immune cells

[0076] In one aspect, the disclosure relates to methods of treating a disease or disorder or reducing immune clearance of modified immune cells in a human subject, comprising: (a) administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the human subject, and (b) administering an effective amount of modified immune cells to the human subject. In some embodiments, step (a) occurs prior to step (b) . In some embodiments, the human subject does not undergo lymphodepletion using any of the lymphodepletion methods described herein.

[0077] The CNI used in the methods described herein may be cyclosporine, which may be administered at a dose level of about 1 mg / kg / day to about 25 mg / kg / day. In some embodiments, the dose level of cyclosporine is about 1, about 2, about 3, about 4, about 5, about 6, about 7, about 8, about 9, about 10, about 11, about 12, about 13, about 14, about 15, about 16, about 17, about 18, about 19, about 20, about 21, about 22, about 23, about 24, or about 25 mg / kg / day. In some embodiments, the dose level of cyclosporine is about 1 to about 25 mg / kg / day, about 5 to about 25 mg / kg / day, about 10 to about 25 mg / kg / day, about 15 to about 25 mg / kg / day, about 20 to about 25 mg / kg / day, about 1 to about 20 mg / kg / day, about 5 to about 20 mg / kg / day, about 10 to about 20 mg / kg / day, about 15 to about 20 mg / kg / day, about 1 to about 15 mg / kg / day, about 5 to about 15 mg / kg / day, about 10 to about 15 mg / kg / day, about 15 to about 25 mg / kg / day, about 20 to about 25 mg / kg / day, or about 20 to about 25 mg / kg / day. Cyclosporine may be administered at a dose level of about 0.5 mg / kg / twice a day to about 12.5 mg / kg / twice a day. In some embodiments, the dose level of cyclosporine is about 0.5, about 1, about 2, about 3, about 4, about 5, about 6, about 7, about 8, about 9, about 10, about 11, about 12, or about 12.5 mg / kg / twice a day. In some embodiments, the dose level of cyclosporine is about 0.5 to about 12.5 mg / kg / twice a day, about 1 to about 12.5 mg / kg / twice a day, about 2 to about 12.5 mg / kg / twice a day, about 3 to about 12.5 mg / kg / twice a day, about 4 to about 12.5 mg / kg / twice a day, about 5 to about 12.5 mg / kg / twice a day, about 6 to about 12.5 mg / kg / twice a day, about 7 to about 12.5 mg / kg / twice a day, about 8 to about 12.5 mg / kg / twice a day, about 9 to about 12.5 mg / kg / twice a day, about 10 to about 12.5 mg / kg / twice a day, about 11 to about 12.5 mg / kg / twice a day, about 12 to about 12.5 mg / kg / twice a day, about 0.5 to about 10 mg / kg / twice a day, about 1 to about 10 mg / kg / twice a day, about 2 to about 10 mg / kg / twice a day, about 3 to about 10 mg / kg / twice a day, about 4 to about 10 mg / kg / twice a day, about 5 to about 10 mg / kg / twice a day, about 6 to about 10 mg / kg / twice a day, about 7 to about 10 mg / kg / twice a day, about 8 to about 10 mg / kg / twice a day, about 9 to about 10 mg / kg / twice a day, about 0.5 to about 5 mg / kg / twice a day, about 1 to about 5 mg / kg / twice a day, about 2 to about 5 mg / kg / twice a day, about 3 to about 5 mg / kg / twice a day, about 4 to about 5 mg / kg / twice a day, about 0.5 to about 2 mg / kg / twice a day, about 1 to about 2 mg / kg / twice a day, or about 0.5 to about 1 mg / kg / twice a day. Cyclosporine may be administered at any suitable dose level. For example, the dose level of cyclosporine can be about 1 to about 200 mg / kg / day, about 1 to about 175 mg / kg / day, about 1 to about 150 mg / kg / day, about 1 to about 125 mg / kg / day, about 1 to about 100 mg / kg / day, about 1 to about 75 mg / kg / day, about 1 to about 50 mg / kg / day, about 1 to about 25 mg / kg / day, about 1 to about 12.5 mg / kg / day, 5 to about 200 mg / kg / day, about 5 to about 175 mg / kg / day, about 5 to about 150 mg / kg / day, about 5 to about 125 mg / kg / day, about 5 to about 100 mg / kg / day, about 5 to about 75 mg / kg / day, about 5 to about 50 mg / kg / day, about 5 to about 25 mg / kg / day, 10 to about 200 mg / kg / day, about 10 to about 175 mg / kg / day, about 10 to about 150 mg / kg / day, about 10 to about 125 mg / kg / day, about 10 to about 100 mg / kg / day, about 10 to about 75 mg / kg / day, about 10 to about 50 mg / kg / day, about 10 to about 25 mg / kg / day, about 10 to about 12.5 mg / kg / day, about 12.5 to about 200 mg / kg / day, about 12.5 to about 175 mg / kg / day, about 12.5 to about 150 mg / kg / day, about 12.5 to about 125 mg / kg / day, about 12.5 to about 100 mg / kg / day, about 12.5 to about 75 mg / kg / day, about 12.5 to about 50 mg / kg / day, about 12.5 to about 25 mg / kg / day, about 15 to about 200 mg / kg / day, about 15 to about 175 mg / kg / day, about 15 to about 150 mg / kg / day, about 15 to about 125 mg / kg / day, about 15 to about 100 mg / kg / day, about 15 to about 75 mg / kg / day, about 15 to about 50 mg / kg / day, about 15 to about 25 mg / kg / day, about 20 to about 200 mg / kg / day, about 20 to about 175 mg / kg / day, about 20 to about 150 mg / kg / day, about 20 to about 125 mg / kg / day, about 20 to about 100 mg / kg / day, about 20 to about 75 mg / kg / day, about 20 to about 50 mg / kg / day, about 20 to about 25 mg / kg / day, about 25 to about 200 mg / kg / day, about 25 to about 175 mg / kg / day, about 25 to about 150 mg / kg / day, about 25 to about 125 mg / kg / day, about 25 to about 100 mg / kg / day, about 25 to about 75 mg / kg / day, about 25 to about 50 mg / kg / day, about 50 to about 200 mg / kg / day, about 50 to about 175 mg / kg / day, about 50 to about 150 mg / kg / day, about 50 to about 125 mg / kg / day, about 50 to about 100 mg / kg / day, about 50 to about 75 mg / kg / day, about 75 to about 200 mg / kg / day, about 75 to about 175 mg / kg / day, about 75 to about 150 mg / kg / day, about 75 to about 125 mg / kg / day, about 75 to about 100 mg / kg / day, about 100 to about 200 mg / kg / day, about 100 to about 175 mg / kg / day, about 100 to about 150 mg / kg / day, about 100 to about 125 mg / kg / day, about 125 to about 200 mg / kg / day, about 125 to about 175 mg / kg / day, about 125 to about 150 mg / kg / day, about 150 to about 200 mg / kg / day, or about 150 to about 175 mg / kg / day.

[0078] The CNI used in the methods described herein may be tacrolimus, which may be administered at a dose level of about 0.01 mg / kg / day to about 1 mg / kg / day. In some embodiments, the dose level of tacrolimus is about 0.01, about 0.03, about 0.05, about 0.1, about 0.3, about 0.5, or about 1 mg / kg / day. In some embodiments, the dose level of tacrolimus is about 0.01 to about 1 mg / kg / day, about 0.03 to about 1 mg / kg / day, about 0.05 to about 1 mg / kg / day, about 0.1 to about 1 mg / kg / day, about 0.3 to about 1 mg / kg / day, about 0.5 to about 1 mg / kg / day, about 0.01 to about 0.5 mg / kg / day, about 0.03 to about 0.5 mg / kg / day, about 0.05 to about 0.5 mg / kg / day, about 0.1 to about 0.5 mg / kg / day, about 0.3 to about 0.5 mg / kg / day, about 0.01 to about 0.3 mg / kg / day, about 0.02 to about 0.3 mg / kg / day, about 0.05 to about 0.3 mg / kg / day, about 0.1 to about 0.3 mg / kg / day, about 0.01 to about 0.1 mg / kg / day, about 0.03 to about 0.1 mg / kg / day, about 0.05 to about 0.1 mg / kg / day, about 0.01 to about 0.05 mg / kg / day, about 0.03 to about 0.05 mg / kg / day, or about 0.01 to about 0.03 mg / kg / day. Tacrolimus may be administered at any suitable dose level. For example, the dose level of tacrolimus can be about 0.01 to about 20 mg / kg / day, about 0.01 to about 17.5 mg / kg / day, about 0.01 to about 15 mg / kg / day, about 0.01 to about 12.5 mg / kg / day, about 0.01 to about 10 mg / kg / day, about 0.01 to about 7.5 mg / kg / day, about 0.01 to about 5 mg / kg / day, about 0.01 to about 2.5 mg / kg / day, about 0.01 to about 1.25 mg / kg / day, about 0.01 to about 1 mg / kg / day, 0.5 to about 20 mg / kg / day, about 0.5 to about 17.5 mg / kg / day, about 0.5 to about 15 mg / kg / day, about 0.5 to about 12.5 mg / kg / day, about 0.5 to about 10 mg / kg / day, about 0.5 to about 7.5 mg / kg / day, about 0.5 to about 5 mg / kg / day, about 0.5 to about 2.5 mg / kg / day, about 1 to about 20 mg / kg / day, about 1 to about 17.5 mg / kg / day, about 1 to about 15 mg / kg / day, about 1 to about 12.5 mg / kg / day, about 1 to about 10 mg / kg / day, about 1 to about 7.5 mg / kg / day, about 1 to about 5 mg / kg / day, about 1 to about 2.5 mg / kg / day, about 2.5 to about 20 mg / kg / day, about 2.5 to about 17.5 mg / kg / day, about 2.5 to about 15 mg / kg / day, about 2.5 to about 12.5 mg / kg / day, about 2.5 to about 10 mg / kg / day, about 2.5 to about 7.5 mg / kg / day, about 2.5 to about 5 mg / kg / day, about 5 to about 20 mg / kg / day, about 5 to about 17.5 mg / kg / day, about 5 to about 15 mg / kg / day, about 5 to about 12.5 mg / kg / day, about 5 to about 10 mg / kg / day, about 5 to about 7.5 mg / kg / day, about 7.5 to about 20 mg / kg / day, about 7.5 to about 17.5 mg / kg / day, about 7.5 to about 15 mg / kg / day, about 7.5 to about 12.5 mg / kg / day, about 7.5 to about 10 mg / kg / day, about 10 to about 20 mg / kg / day, about 10 to about 17.5 mg / kg / day, about 10 to about 15 mg / kg / day, or about 10 to about 12.5 mg / kg / day.

[0079] For allogeneic cell therapies, it is recommended to administer CNI prior to the adaptive cell transfer, typically between 1 hour and 3 days or longer before infusion. This timing allows blood CNI levels to reach therapeutic concentrations. Tacrolimus and cyclosporine generally require 2-3 days to achieve a steady-state concentration, with the trough concentration serving as a reference for effective therapeutic levels.

[0080] In some embodiments, step (a) occurs prior to step (b) for about 1 hour, about 2 hours, about 3 hours, about 4 hours, about 5 hours, about 6 hours, about 7 hours, about 8 hours, about 9 hours, about 10 hours, about 11 hours, about 12 hours, about 18 hours, about 1 day, about 2 days, about 3 days, about 4 days, about 5 days, about 6 days, or about 7 days. For example, step (a) may occur prior to step (b) for about 1 hour to about 7 days, about 6 hours to about 7 days, about 12 hours to about 7 days, about 1 day to 7 days, about 2 days to about 7 days, about 3 days to about 7 days, about 4 days to about 7 days, about 5 days to about 7 days, about 6 days to about 7 days, about 1 hour to about 6 days, about 6 hours to about 6 days, about 12 hours to about 6 days, about 1 day to 6 days, about 2 days to about 6 days, about 3 days to about 6 days, about 4 days to about 6 days, about 5 days to about 6 days, about 1 hour to about 5 days, about 6 hours to about 5 days, about 12 hours to about 5 days, about 1 day to 5 days, about 2 days to about 5 days, about 3 days to about 5 days, about 4 days to about 5 days, about 1 hour to about 4 days, about 6 hours to about 4 days, about 12 hours to about 4 days, about 1 day to 4 days, about 2 days to about 4 days, about 3 days to about 4 days, about 1 hour to about 3 days, about 6 hours to about 3 days, about 12 hours to about 3 days, about 1 day to 3 days, about 2 days to about 3 days, about 1 hour to about 2 days, about 6 hours to about 2 days, about 12 hours to about 2 days, about 1 day to 2 days, about 1 hour to about 1 day, about 6 hours to about 1 day, about 12 hours to about 1 day, about 1 hour to about 12 hours, about 6 hours to about 12 hours, or about 1 hour to about 6 hours. In some embodiments, step (a) occurs prior to step (b) for about 1 hour, about 2 hours, about 3 hours, about 4 hours, about 5 hours, about 6 hours, about 7 hours, about 8 hours, about 9 hours, about 10 hours, about 11 hours, about 12 hours, about 13 hours, about 14 hours, about 15 hours, about 16 hours, about 17 hours, about 18 hours, about 19 hours, about 20 hours, about 21 hours, about 22 hours, about 23 hours, or about 24 hours.

[0081] In some embodiments, the methods described herein further comprises monitoring the blood concentration of the CNI in the human subject before step (b) , wherein step (b) is performed when the blood concentration of the CNI is within a pre-determined range. The blood concentration described herein may be a trough concentration.

[0082] In some embodiments, the CNI is cyclosporine, and the pre-determined range is about 25 ng / ml to about 2000 ng / ml, e.g., about 25 ng / ml, about 50 ng / ml, about 75 ng / ml, about 100 ng / ml, about 200 ng / ml, about 300 ng / ml, about 400 ng / ml, about 500 ng / ml, about 1000 ng / ml, about 1500 ng / ml, or about 2000 ng / ml. In some embodiments, the pre-determined range for cyclosporine is about 25 to about 2000 ng / ml, about 50 to about 2000 mg / ml, about 75 to about 2000 ng / ml, about 100 to about 2000 ng / ml, about 200 to about 2000 ng / ml, about 300 to about 2000 ng / ml, about 400 to about 2000 ng / ml, about 500 to about 2000 ng / ml, about 1000 to about 2000 ng / ml, about 1500 to about 2000 ng / ml, about 25 to about 1500 ng / ml, about 50 to about 1500 mg / ml, about 75 to about 1500 ng / ml, about 100 to about 1500 ng / ml, about 200 to about 1500 ng / ml, about 300 to about 1500 ng / ml, about 400 to about 1500 ng / ml, about 500 to about 1500 ng / ml, about 1000 to about 1500 ng / ml, about 25 to about 1000 ng / ml, about 50 to about 1000 mg / ml, about 75 to about 1000 ng / ml, about 100 to about 1000 ng / ml, about 200 to about 1000 ng / ml, about 300 to about 1000 ng / ml, about 400 to about 1000 ng / ml, about 500 to about 1000 ng / ml, about 25 to about 500 ng / ml, about 50 to about 500 mg / ml, about 75 to about 500 ng / ml, about 100 to about 500 ng / ml, about 200 to about 500 ng / ml, about 300 to about 500 ng / ml, about 400 to about 500 ng / ml, about 25 to about 400 ng / ml, about 50 to about 400 mg / ml, about 75 to about 400 ng / ml, about 100 to about 400 ng / ml, about 200 to about 400 ng / ml, about 300 to about 400 ng / ml, about 25 to about 300 ng / ml, about 50 to about 300 mg / ml, about 75 to about 300 ng / ml, about 100 to about 300 ng / ml, about 200 to about 300 ng / ml, about 25 to about 200 ng / ml, about 50 to about 200 mg / ml, about 75 to about 200 ng / ml, about 100 to about 200 ng / ml, about 25 to about 100 ng / ml, about 50 to about 100 mg / ml, about 75 to about 100 ng / ml, about 25 to about 75 ng / ml, about 50 to about 75 mg / ml, or 25 to about 50 ng / ml. In some embodiments, the pre-determined range for cyclosporine is about 100 to about 350 ng / ml. The dose for cyclosporine should be adjusted according to the targeted blood concentration, e.g., trough concentration.

[0083] In some embodiments, the CNI is tacrolimus, and the pre-determined range is about 1 ng / ml to about 100 ng / ml, e.g., about 1 ng / ml, about 5 ng / ml, about 10 ng / ml, about 15 ng / ml, about 20 ng / ml, about 30 ng / ml, about 40 ng / ml, about 50 ng / ml, about 60 ng / ml, about 70 ng / ml, about 80 ng / ml, about 90 ng / ml, or about 100 ng / ml. In some embodiments, the pre-determined range for tacrolimus is about 1 to about 100 ng / ml, about 5 to about 100 ng / ml, about 10 to about 100 ng / ml, about 15 to about 100 ng / ml, about 20 to about 100 ng / ml, about 30 to about 100 ng / ml, about 40 to about 100 ng / ml, about 50 to about 100 ng / ml, about 60 to about 100 ng / ml, about 70 to about 100 ng / ml, about 80 to about 100 ng / ml, about 90 to about 100 ng / ml, about 1 to about 90 ng / ml, about 5 to about 90 ng / ml, about 10 to about 90 ng / ml, about 15 to about 90 ng / ml, about 20 to about 90 ng / ml, about 30 to about 90 ng / ml, about 40 to about 90 ng / ml, about 50 to about 90 ng / ml, about 60 to about 90 ng / ml, about 70 to about 90 ng / ml, about 80 to about 90 ng / ml, about 1 to about 80 ng / ml, about 5 to about 80 ng / ml, about 10 to about 80 ng / ml, about 15 to about 80 ng / ml, about 20 to about 80 ng / ml, about 30 to about 80 ng / ml, about 40 to about 80 ng / ml, about 50 to about 80 ng / ml, about 60 to about 80 ng / ml, about 70 to about 80 ng / ml, about 1 to about 70 ng / ml, about 5 to about 70 ng / ml, about 10 to about 70 ng / ml, about 15 to about 70 ng / ml, about 20 to about 70 ng / ml, about 30 to about 70 ng / ml, about 40 to about 70 ng / ml, about 50 to about 70 ng / ml, about 60 to about 70 ng / ml, about 1 to about 60 ng / ml, about 5 to about 60 ng / ml, about 10 to about 60 ng / ml, about 15 to about 60 ng / ml, about 20 to about 60 ng / ml, about 30 to about 60 ng / ml, about 40 to about 60 ng / ml, about 50 to about 60 ng / ml, about 1 to about 50 ng / ml, about 5 to about 50 ng / ml, about 10 to about 50 ng / ml, about 15 to about 50 ng / ml, about 20 to about 50 ng / ml, about 30 to about 50 ng / ml, about 40 to about 50 ng / ml, about 1 to about 40 ng / ml, about 5 to about 40 ng / ml, about 10 to about 40 ng / ml, about 15 to about 40 ng / ml, about 20 to about 40 ng / ml, about 30 to about 40 ng / ml, about 1 to about 30 ng / ml, about 5 to about 30 ng / ml, about 10 to about 30 ng / ml, about 15 to about 30 ng / ml, about 20 to about 30 ng / ml, about 1 to about 20 ng / ml, about 5 to about 20 ng / ml, about 10 to about 20 ng / ml, about 15 to about 20 ng / ml, about 1 to about 15 ng / ml, about 5 to about 15 ng / ml, about 10 to about 15 ng / ml, about 1 to about 10 ng / ml, about 5 to about 10 ng / ml, or about 1 to about 5 ng / ml. In some embodiments, the pre-determined range for tacrolimus is about 6 to about 15 ng / ml. The dose for tacrolimus should be adjusted according to the targeted blood concentration, e.g., trough concentration.

[0084] The CNI (e.g., any of the CNIs described herein) may be administered intravenously, orally, or both intravenously and orally. In some embodiments, the CNI (e.g., any of the CNIs described herein) is administered intravenously by continuous infusion, or an infusion that may take about 1 hour, about 2 hours, about 3 hours, about 4 hours, about 5 hours, about 6 hours, about 7 hours, about 8 hours, about 9 hours, about 10 hours, about 11 hours, or about 12 hours. In some embodiments, the infusion takes about 1 to about 12 hours, about 1 to about 10 hours, about 1 to about 8 hours, about 1 to about 6 hours, about 1 to about 4 hours, about 1 to about 2 hours, about 2 to about 12 hours, about 2 to about 10 hours, about 2 to about 8 hours, about 2 to about 6 hours, about 2 to about 4 hours, about 4 to about 12 hours, about 4 to about 10 hours, about 4 to about 8 hours, about 4 to about 6 hours, about 6 to about 12 hours, about 6 to about 10 hours, about 6 to about 8 hours, about 8 to about 12 hours, about 8 to about 10 hours, or about 10 to about 12 hours. In some embodiments, the CNI (e.g., any of the CNIs described herein) is administered orally with an effective amount of a formulation comprising cyclosporine liquid, cyclosporine capsules, tacrolimus liquid, immediate-release tacrolimus capsules, and / or extended-release tacrolimus capsules. In some embodiments, the CNI (e.g., any of the CNIs described herein) is administered at a frequency of about once daily or twice daily.

[0085] b. Administration of CNIs after administration of modified immune cells

[0086] The methods of treating a disease or disorder or reducing immune clearance of modified immune cells in a human subject described herein may further include administering an effective amount of an CNI (e.g., any of the CNIs described herein) to the human subject after step (b) . In some embodiments, the same CNI that is used in step (a) is administered after step (b) . In some embodiments, a different CNI is administered after step (b) . In some embodiments, the CNI (e.g., any of the CNIs described herein) is administered using any of the administration routes described herein, e.g., intravenously and / or orally. In some embodiments, the effective amount of the CNI is administered to the human subject orally after step (b) .

[0087] In some embodiments, the effective amount of the CNI is administered to the human subject after step (b) to maintain a blood concentration (e.g., a blood trough concentration) within a pre-determined range over a period of time. The pre-determined range of the CNI can be any of the pre-determined ranges described herein. In some embodiments, the blood concentration is maintained within the pre-determined range for at least 7 days, at least 10 days, at least 15 days, at least 20 days, about 25 days, at least 1 month, at least 2 months, or about 3 months. In some embodiments, the blood concentration is maintained within the pre-determined range for about 7 days to about 3 months, about 7 days to about 2 months, about 7 days to about 1 month, about 7 days to about 25 days, about 7 days to about 20 days, about 7 days to about 15 days, about 7 days to about 10 days, about 10 days to about 3 months, about 10 days to about 2 months, about 10 days to about 1 month, about 10 days to about 25 days, about 10 days to about 20 days, about 10 days to about 15 days, about 15 days to about 3 months, about 15 days to about 2 months, about 15 days to about 1 month, about 15 days to about 25 days, about 15 days to about 20 days, about 20 days to about 3 months, about 20 days to about 2 months, about 20 days to about 1 month, about 20 days to about 25 days, about 25 days to about 3 months, about 25 days to about 2 months, about 25 days to about 1 month, about 1 month to about 3 months, about 1 month to about 2 months, or about 2 months to about 3 months.

[0088] In some embodiments, the CNI is cyclosporine, and the cyclosporine is administered at any of the dose levels described herein after step (b) . In some embodiments, the CNI is tacrolimus, and the tacrolimus is administered at any of the dose levels described herein after step (b) . In some embodiments, the CNI is administered after step (b) for at least 7 days, at least 10 days, at least 15 days, at least 20 days, about 25 days, at least 1 month, at least 2 months, or about 3 months. In some embodiments, the CNI is administered after step (b) for about 7 days to about 3 months, about 7 days to about 2 months, about 7 days to about 1 month, about 7 days to about 25 days, about 7 days to about 20 days, about 7 days to about 15 days, about 7 days to about 10 days, about 10 days to about 3 months, about 10 days to about 2 months, about 10 days to about 1 month, about 10 days to about 25 days, about 10 days to about 20 days, about 10 days to about 15 days, about 15 days to about 3 months, about 15 days to about 2 months, about 15 days to about 1 month, about 15 days to about 25 days, about 15 days to about 20 days, about 20 days to about 3 months, about 20 days to about 2 months, about 20 days to about 1 month, about 20 days to about 25 days, about 25 days to about 3 months, about 25 days to about 2 months, about 25 days to about 1 month, about 1 month to about 3 months, about 1 month to about 2 months, or about 2 months to about 3 months.

[0089] Engineered Receptor

[0090] The present disclosure relates to methods of treating a disease or disorder or reducing immune clearance of modified immune cells in a human subject under non-lymphodepletion conditions, comprising administering to the subject an effective amount of modified immune cells (e.g., any of the modified immune cells described herein) and a CNI (e.g., any of the CNIs described herein) .

[0091] The modified immune cells may express a chimeric antigen receptor (CAR) . A chimeric antigen receptor (CAR) typically comprises an extracellular domain capable of binding to an antigen, and an intracellular domain comprising one or more intracellular signaling domains derived from signal transducing proteins. These intracellular signaling domains are typically different from the polypeptide from which the extracellular domain is derived. The extracellular domain can be any proteinaceous molecule or part thereof that can specifically bind to a predetermined antigen. The extracellular domain may comprise an antibody or antigen binding fragment thereof. The intracellular signaling domain may be any oligopeptide or polypeptide domain known to function to transmit a signal causing activation or inhibition of a biological process in a cell, for example, activation of an immune cell such as an NK cell.

[0092] Chimeric antigen receptors (CARs) combine many facets of normal T cell or NK cell activation into a single protein. They link an extracellular antigen recognition domain to an intracellular signaling domain, which activates the T cell or NK cell when an antigen is bound. CARs typically have the following regions: an antigen binding domain, an extracellular hinge region, a transmembrane domain, and an intracellular domain. The intracellular region comprises an intracellular signaling domain or an intracellular signaling region.

[0093] A detailed review of CARs and CAR-expressing cells can be found in, e.g., J Exp Clin Cancer Res, 2022 Mar 31; 41 (1) : 119; Mol Cancer, 2023 Jan 30; 22 (1) : 20; and Br J Haematol, 2021 Apr; 193 (2) : 216-230. doi: 10.1111 / bjh. 17186. Epub 2020 Nov 20, each of which is incorporated by reference in its entirety. Exemplary structure of antigen receptors, including the hinge, the transmembrane domain, and the intracellular cell signaling domain, and methods for engineering and introducing such receptors into cells, are described, for example, in Chandran et al., "T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. " Immunological Reviews 290.1 (2019) : 127-147; Cartellieri, Marc, et al., "Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of cancer. " BioMed Research International 2010 (2010) ; and PCT publication No. WO2017173256A1; US2002 / 131960, US2013 / 287748, US2013 / 0149337, U.S. 6,451,995, U.S. 7,446,190, U.S. 8,252,592; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0094] CARs expressed on the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) of the present disclosure may comprise an extracellular domain comprising at least one antigen binding domain that specifically binds at least one tumor antigen, a transmembrane region, and an intracellular signaling domain. The intracellular signaling domain may generate a signal that promotes an immune effector function of the CAR-containing cell, e.g., a CAR-NK cell. “Immune effector function or immune effector response” refers to function or response, e.g., of an immune effector cell, that enhances or promotes an immune attack of a target cell. For example, an immune effector function or response can refer to a property of an NK cell that promotes killing or the inhibition of growth or proliferation, of a target cell. The intracellular signaling domain may generate a signal that promotes proliferation and / or survival of the CAR containing cell. The CAR may comprise one or more intracellular signaling domains. The signaling domain of a naturally occurring molecule can comprise the entire intracellular or cytoplasmic portion, or the entire native intracellular signaling domain, of the molecule, or a fragment or derivative thereof.

[0095] The intracellular signaling domain of a CAR may comprise a primary intracellular signaling domain. “Primary intracellular signaling domain” refers to cytoplasmic signaling sequence that acts in a stimulatory manner to induce immune effector functions. The primary intracellular signaling domain may contain a signaling motif known as Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif, or ITAM. The primary intracellular signaling domain may comprise a functional signaling domain of a protein selected from the group consisting of CD3 zeta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, common FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon Rib) , CD79a, CD79b, FcgammaRIIa, DAP10, and DAP12. The primary intracellular signaling domain may comprise a nonfunctional or attenuated signaling domain of a protein selected from the group consisting of CD3 zeta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, common FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon Rib) , CD79a, CD79b, FcgammaRIIa, DAP10, and DAP12. The primary intracellular signaling domain may comprise a functional signaling domain of CD3 zeta.

[0096] The intracellular signaling domain of a CAR may comprise one or more (such as any of 1, 2, 3, or more) co-stimulatory signaling domains. “Co-stimulatory signaling domain” can be the intracellular portion of a co-stimulatory molecule. The term “co-stimulatory molecule” refers to a cognate binding partner on an immune cell (such as NK cell) that specifically binds with a co-stimulatory ligand, thereby mediating a co-stimulatory response by the immune cell, such as, but not limited to, proliferation and survival. Co-stimulatory molecules are cell surface molecules other than antigen receptors or their ligands that contribute to an efficient immune response. A co-stimulatory molecule can be represented in the following protein families: TNF receptor proteins, Immunoglobulin-like proteins, cytokine receptors, integrins, signaling lymphocytic activation molecules (SLAM proteins) , and activating NK cell receptors. Co-stimulatory molecules include, but are not limited to an MHC class I molecule, BTLA and a Toll ligand receptor, as well as OX40, DAP12, DAP10, CD27, CD28, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11a / CD18) , ICOS (CD278) , and 4-1BB (CD137) . Further examples of such co-stimulatory molecules include GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE / RANKL, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CDIOO (SEMA4D) , CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG / Cbp, CD19a, and a ligand that specifically binds with CD83.

[0097] The CAR may comprise a single co-stimulatory signaling domain. The CAR may comprise two or more co-stimulatory signaling domains. The intracellular signaling domain may comprise a functional primary intracellular signaling domain and one or more co-stimulatory signaling domains. The one or more co-stimulatory signaling domains may be derived from one or more molecules selected from the group consisting of CD27, CD28, 4-1BB (i.e., CD137) , OX40, CD30, CD40, CD3, lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) , CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 and ligands that specially bind to CD83. The co-stimulatory signaling domains may be derived from CD137.

[0098] The CAR may further comprise a DAP12 intracellular signaling domain, and the DAP12 intracellular signaling domain may be located at the C-terminus of the intracellular signaling domain. The intracellular signaling domain may comprise a functional primary intracellular signaling domain and one or more co-stimulatory signaling domains, and a DAP12 intracellular signaling domain. The intracellular signaling domain may comprise from N-terminus to the C-terminus as following: a CD137 co-stimulatory signaling domain, a CD3 zeta primary intracellular signaling domain, and a DAP12 intracellular signaling domain.

[0099] The antigen binding domain of a CAR may be an antibody or an antibody fragment, such as an scFv, a Fv, a Fab, a (Fab′) 2, a single domain antibody (sdAb) , or a VHH domain. The antigen binding domain of a CAR may comprise a ligand or an extracellular portion of a receptor that specifically binds to a target antigen, e.g., a tumor antigen or autoimmune disease antigens. The CAR may be a monospecific, bispecific or multispecific CAR. The antigen binding domain of a CAR may specifically bind a single target antigen, e.g., a single tumor antigen or an autoimmune disease antigen. The antigen binding domain of a CAR may bind two or more target antigens, e.g., tumor antigens or autoimmune disease antigens. The antigen binding domain of a CAR may bind BCMA and CD19.

[0100] The target antigen may be selected from a tumor antigen, an autoimmune disease antigen, an inflammatory disease antigen, a neuronal disorder antigen, HIV / AIDS, a diabetes antigen, a cardiovascular disease antigen, and an infectious disease antigen (including a viral antigen, a protozoan antigen, a bacterial antigen, and an allergen) , or combinations thereof.

[0101] The target antigen may be selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, and PD-L2, and other target antigens with clinical significance, and combinations thereof.

[0102] The target antigen may be a tumor antigen. The target antigen may comprise one or more antigenic cancer epitopes associated with a malignant tumor. Malignant tumors express a number of proteins that can serve as target antigens for an immune attack. These molecules include but are not limited to tissue-specific antigens such as MART-1, tyrosinase and gp100 in melanoma and prostatic acid phosphatase (PAP) and prostate-specific antigen (PSA) in prostate cancer. Other target molecules belong to the group of transformation-related molecules such as the oncogene HER2 / Neu / ErbB-2. Yet another group of target antigens are onco-fetal antigens such as carcinoembryonic antigen (CEA) . In B-cell lymphoma the tumor-specific idiotype immunoglobulin constitutes a truly tumor-specific immunoglobulin antigen that is unique to the individual tumor. B cell differentiation antigens such as CD19, CD20 and CD37 are other candidates for target antigens in B-cell lymphoma.

[0103] The target antigen may be a tumor-specific antigen (TSA) or a tumor-associated antigen (TAA) . A TSA is unique to tumor cells and does not occur on other cells in the body. A TAA associated antigen is not unique to a tumor cell, and instead is also expressed on a normal cell under conditions that fail to induce a state of immunologic tolerance to the antigen. The expression of the antigen on the tumor can occur under conditions that enable the immune system to respond to the antigen. TAAs can be antigens that are expressed on normal cells during fetal development, when the immune system is immature, and unable to respond or they can be antigens that are normally present at extremely low levels on normal cells, but which are expressed at much higher levels on tumor cells.

[0104] The target antigen, e.g., tumor antigen may be derived from an intracellular protein of tumor cells. The tumor antigen may be expressed on the surface of tumor cells. Many TCRs specific for tumor antigens (including tumor-associated antigens) have been described, including, for example, NY-ESO-1 cancer-testis antigen, the p53 tumor suppressor antigens, TCRs for tumor antigens in melanoma (e.g., MARTI, gp 100) , leukemia (e.g., WT1, minor histocompatibility antigens) , and breast cancer (e.g., HER2, NY-BR1) .

[0105] The target antigen may be an autoimmune disease antigen. The autoimmune disease antigen, as used herein, refers to a self antigen or an antigen that cross reacts with a self antigen to which the body produces a dysfunctional immune response that causes disease. The autoimmune disease antigen can be a nucleic acid, protein, or and / or polypeptide encoding the autoimmune disease antigen. The autoimmune disease antigen can be associated with any autoimmune disease.

[0106] Many CARs targeting different target antigens have been widely disclosed in the field, such as CD19 CARs or BCMA CARs. The extracellular antigen-binding domain of CD19 CARs can be or include the CD19 binding fragment (e.g., FMC63, SJ25C1, or those disclosed in different patents or patent publications such as PCT Publication No. WO 2022 / 012683, etc) . BCMA CARs also have been well described, related patents include but not limited to PCT Publication Nos. WO 2016 / 014789, WO 2016 / 014565, WO 2013 / 154760, and WO 2018 / 028647, etc.

[0107] The transmembrane region of a CAR may comprise or be chosen from the transmembrane region of an alpha, beta or zeta chain of a T-cell receptor, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18) , ICOS (CD278) , 4-1BB (CD137) , GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , CD160, CD19, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CDIOO (SEMA4D) , SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, PAG / Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, and / or NKG2C. The transmembrane region may comprise a transmembrane region of CD8α.

[0108] The extracellular domain may be connected to the transmembrane region by a hinge region. The hinge region may comprise a hinge region of CD8α.

[0109] The CAR may comprise a signal peptide (SP) , such as a CD8α signal peptide.

[0110] The CAR may be a BCMA CAR. A wide variety of antigen binding domain sequences can be used as the antigen binding domain of the CAR. The CAR may specifically bind to BCMA-positive tumor cells.

[0111] The CAR may be a single CAR, dual CAR, tandem CAR or split CAR.

[0112] In some embodiments, the CAR is expressed by introducing a nucleic acid encoding it into a cell in vivo (in vivo cell therapy) or in vitro (including autologous cell therapy and allogeneic cell therapy) . In some embodiments, the cell is immune cell.

[0113] Modified Cells

[0114] The present disclosure relates to methods of treating a disease or disorder or reducing immune clearance of modified cells (e.g., modified immune cells) in a human subject under non-lymphodepletion conditions, comprising administering to the human subject an effective amount of modified cells (e.g., any of the modified immune cells described herein) and a CNI (e.g., any of the CNIs described herein) .

[0115] The modified cells (e.g., modified immune cells) may express an engineered receptor (e.g., any of the engineered receptors described herein) , e.g., a CAR (e.g., any of the CARs described herein) .

[0116] The modified cells can be modified stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) , pluripotent stem cells (PSCs) , induced pluripotent stem cells (iPSCs) , or hematopoietic stems cells (HSCs) . The modified cells can be cells (e.g., immune cells) differentiated from engineered stem cells.

[0117] The modified cells can be modified immune cells. The modified immune cells can be NK cells, T cells, NKT cells, monocytes, dendritic cells, macrophages, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) , B cells, or any combinations thereof. The T cells may be selected from the group consisting of killer T cells (Tc, cytotoxic T lymphocytes, or CTLs) , helper T cells (Th) , regulatory T cells (Tregs) , αβ T cells, γδ T cells, and any combination thereof.

[0118] The modified cells may comprise one or more polynucleotides encoding a CAR described herein. Accordingly, such modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) possess the specificity directed by the engineered receptor (e.g., CAR) that is expressed therein. For example, a modified cell of the present disclosure comprising a CAR possesses specificity for one or more target antigen (s) on a target cell (e.g., one or more tumor antigen (s) on a cancer cell) . The modified cells may express an armor protein. In some embodiments, the armor protein can stimulate modified cells proliferation.

[0119] The modified immune cells may be NK cells expressing a CAR (i.e., CAR-NK cells) . Human natural killer cells (NK cells) play an important role in innate immune defense against malignant lymphoma cells, and thus are suitable for adoptive immune therapy (i.e., adoptive cellular immunotherapy) . The CAR-NK cells may express an armor protein. In some embodiments, the armor protein can stimulate NK cells proliferation.

[0120] As used herein, an "armor protein" refers to a protein encoded by a transgene that, when expressed by an immune cell, e.g., an NK cell or a T cell (e.g., an NK cell expressing a CAR) , increases persistency and / or proliferation of the immune cell, e.g., NK cell or T cell, and / or the cytotoxicity of the immune cell, e.g., NK cell or T cell, toward a target cell, e.g., through signaling (e.g., cytokine signaling) to improve, e.g., cell persistence, cell viability, activation and other desired characteristics. An armor protein can be a membrane-bound protein or a soluble protein. For example, armor proteins include membrane-bound proteins, such as a membrane-bound receptor (e.g., IL-15R, e.g., IL-15Rβ and IL-15Rα, αβ TCR, a natural cytotoxicity receptor (e.g., NKp30, NKp44, or NKp46) , a cytokine receptor (e.g., IL-12 receptor) , and / or a chemokine receptor (e.g., CCR2 receptor) and / or a membrane-bound ligand or cytokine (e.g., membrane-bound IL-15, membrane-bound IL-7, membrane-bound CD40L, membrane-bound 4-1BB, membrane-bound 4-1BBL, membrane bound CCL19) . Additionally, or alternatively, armor proteins can be soluble proteins, such as soluble ligands or cytokines (e.g., soluble IL-15, soluble IL-7, soluble IL-12, soluble IL-2, soluble CD40L, soluble 4-1BBL, and / or soluble CCL19) .

[0121] Exemplary armor can be selected from dnTGFβRII, truncated PD-1 (decoy) , PD-1 dominant-negative (PD-1dn) , synthetic PD-1 activating receptor, truncated CTLA-4, truncated Tim-3, truncated TIGIT, TIGIT neutralizing antibody, TIGIT intrabody, TIGIT shRNA) , one or more extracellular matrix enzymes (ECMs) , one or more chemokine receptors (CXCL8, CCL2) one or more stroma-targeting molecules (FAP, LRRC15, CD276 / B7-H3, TEM7, TEM8, TEM1) , one or more TME-digestive element (heparanase (HPSE) , MMP (MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-12, MMP-13) and hyaluronidase 1, hyaluronidase 2, hyaluronidase 3, hyaluronidase 4 PH-20, and hyaluronoglucosaminidase pseudogene 1 (HYALPI) , tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4) , hyaluronidase) , one or more switches (tag, kill switch, on switch, off switch, adapter switch, truncated EGF receptor, truncated CD19, truncated CD20, CD20 mimotope, truncated CD34, truncated LNGF receptor) , chimeric costimulatory receptor (CCR) , and / or one or more cytokines (membrane-bound or soluble IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, TNFα, IFNγ (each of the aforementioned may be with or without FC (antibody fragment crystallizable) element) ) , or a combination of membrane bound receptor and tethered cytokine ligand (mbIL15, mbIL7, mbIL-21) , innate system inducting ligands (TLR ligands, LPS, bacterial products) , or any combination thereof.

[0122] Additional information for armor polypeptides can be found, e.g., in PCT / US2024 / 29745 and PCT / CN2024 / 124484, the relevant disclosures of each of which are incorporated by reference for the subject matter and purpose referenced herein.

[0123] The armor protein may be a cytokine. The cytokine may be selected from IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, TNFα, IFNγ, or any combination thereof. The cytokine may be secreted. The cytokine may be membrane-bound.

[0124] The armor protein may be a secreted IL-15 (e.g., a wildtype IL-15, a preprotein IL-15, or a mutant IL-15, see, e.g., PCT Publication No. WO2023280307A1, and the entire content of which is incorporated herein by reference in its entirety) . The CAR may be fused with secreted IL-15 by a self-cleaving peptide. The self-cleaving peptide may be selected from the group consisting of T2A, P2A, E2A, and F2A. The cleavable linker may be a P2A peptide.

[0125] The armor protein may be a membrane-bound IL-15 (mbIL-15) . The membrane-bound IL-15 (mbIL-15) may comprise an IL-15 moiety and a transmembrane domain (e.g., a transmembrane domain located at the C-terminus of the IL-15) . Cells transduced with membrane-bound IL-15 will express IL-15 on their surface. In several embodiments, the expression of mbIL-l5 enhances the persistence of engineered cells (such as engineered NK cells) . Non-limiting information regarding membrane bound IL-15 can be found in PCT Patent Application No. PCT / US2019 / 050679 and PCT / CN2024 / 124484, which documents are incorporated in its entirety by reference herein. In some embodiments, the transmembrane domain may be derived from a molecule selected from a group consisting of CD8α, DAP12, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152, and PD-1. In some embodiments, the transmembrane domain may be derived from CD8α. In some embodiments, the transmembrane domain may be derived from DAP12.

[0126] In some embodiments, the membrane-bound IL-15 may further comprise a hinge domain located between the C-terminus of the IL-15 and the N-terminus of the transmembrane domain. In some embodiments, the hinge domain may be derived from CD8α.

[0127] In some embodiments, the membrane-bound IL-15 may further comprise a signal peptide located at the N-terminus. In some embodiments, the signal peptide is derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, DAP12, IgE, and IgG1 heavy chain. In some embodiments, the signal peptide may be derived from CD8α.

[0128] In some embodiments, the membrane-bound IL-15 comprises from N’ to C’ : an IL-15 moiety (e.g., a mature wildtype human IL-15 polypeptide) , and a transmembrane domain derived from CD8α. In some embodiments, the IL-15 construct comprises from N’ to C’ : an IL-15 moiety (e.g., a mature wildtype human IL-15 polypeptide) , a hinge domain (e.g., derived from CD8) , and a transmembrane domain derived from CD8α. In some embodiments, the IL-15 construct comprises from N’ to C’ : a signal peptide, an IL-15 moiety (e.g., a mature wildtype human IL-15 polypeptide) , a hinge domain (e.g., derived from CD8) , and a transmembrane domain derived from CD8α.

[0129] In some embodiments, the membrane-bound IL-15 may be fused to the N-terminal and / or C-terminal of the CAR, optionally via a self-cleaving peptide, such as a P2A linker. The self-cleaving peptide may be selected from the group consisting of T2A, P2A, E2A, and F2A. The cleavable linker may be a P2A peptide.

[0130] NK cells are part of the innate immune system, providing the first line of defense against pathogens and cancer cells. They produce cytokines and mediate cytotoxicity without the need for prior sensitization and have the ability to interact with, and activate other immune cells. NK cells for immunotherapy can be generated from multiple sources, such as expanded autologous or allogeneic peripheral blood, umbilical cord blood, hematopoietic stem cells, induced pluripotent stem cells, as well as cell lines.

[0131] NK cells activation and effector function is a complex process as it depends upon the integration of signals from two distinct types of receptors-activating and inhibitory receptors. Normal healthy cells express MHC class I molecules on their surface, which act as ligands for inhibitory receptors and contribute to self-tolerance of NK cells. Cellular stress associated with viral infection or tumor development such as DNA damage, senescence or tumor suppressor genes upregulate ligands for activating receptors. This results in shift of balance to NK cells activation. Transmembrane and cytoplasmic stimulatory / activator molecules in NK cells can affect NK cell differentiation pathways, metabolic cycles, apoptosis as well as activation induced cell death.

[0132] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be autologous cells, syngeneic cells, allogeneic cells, or xenogeneic cells with respect to the individual receiving them.

[0133] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) described herein may be eukaryotic cells, e.g., mammalian cells. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be human cells. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be equine, bovine, murine, ovine, canine, or feline cells.

[0134] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be allogeneic cells obtained from a donor (e.g., a human) to be administered to the human subject receiving them. The modified immune cells may be modified allogeneic NK cells (e.g., allogeneic CAR-NK cells) obtained from a donor (e.g., a human) to be administered to the human subject receiving them.

[0135] The modified immune cells may be modified CAR-NK cells. The expression of CAR by the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) can be determined by flow cytometry (FACS) . The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) can have a CAR positive rate of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may have a CAR positive rate of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may have a CAR positive rate of 70%-80%, 70%-90%, 75%-85%, or 75%-90%.

[0136] The purity of the modified immune cells can be determined by flow cytometry (FACS) . The modified immune cells may have a purity of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. The modified immune cells may have a purity of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%. The modified immune cells may have a purity of 90%-100%, 95%-100%, 98%-100%, or 98%-99%.

[0137] The modified immune cells described herein may include engineered NK cells (e.g., CAR-NK cells) , or engineered T cells (e.g., CAR-T cells) modified to resist calcineurin inhibitors (CNIs) . The engineered NK cells may not include any modification that renders the cells resistant to CNI (e.g., any of the CNIs described herein) . The engineered T cells may include any modification that renders the cells resistant to CNI (e.g., any of the CNIs described herein) . The modification that renders the cells resistant to CNI may be gene-editing or knockout of FKBP12 or PPIA gene. The modification that renders the cells resistant to CNI may be overexpression of at least one miRNA of miR-17-92 cluster or paralogs thereof or inactivation of at least one miR-17-92 cluster target gene. The modification that renders the cells resistant to CNI may reduce the expression or activity of NR3C1. The modification that renders the cells resistant to CNI may express a mutant calcineurin A subunit and / or a mutant calcineurin B subunit. Details of engineered T cells modified to resist calcineurin inhibitors (CNI) can be found, e.g., in WO2024027758A1, WO2022034233A1, WO2020157288A1, and WO2024197020A2; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0138] The modified immune cells described herein may include engineered NKT cells, monocytes, engineered dendritic cells, engineered macrophages, engineered peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) , engineered B cells, these cells may not include any modification that renders the cells resistant to CNI (e.g., any of the CNIs described herein) .

[0139] In some embodiments, under non-lymphodepletion conditions, the proliferation of modified immune cells (e.g., any of the modified immune cells described herein) is increased by at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 1-fold, at least 2-fold, at least 5-fold, at least 10-fold, at least 20-fold, at least 50-fold, at least 100-fold, at least 200-fold, at least 500-fold, at least 1000-fold, at least 2000-fold, at least 5000-fold, or at least 10000-fold as compared to that when the human subject is subject to lymphodepletion.

[0140] In some embodiments, under non-lymphodepletion conditions, the T cell activation level, e.g., as reflected by the percentage of CD71+ cells in a population of T cells, in the human subject (e.g. in the peripheral blood or spleen) is decreased to less than 90%, less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%, less than 40%, less than 30%, less than 20%, less than 10%, less than 5%, less than 4%, less than 3%, less than 2%, less than 1%, less than 0.5%, less than 0.1%, less than 0.05%, or less than 0.01%as compared to that when the human subject is subject to lymphodepletion.

[0141] Allogeneic Cell or Allogeneic Cells

[0142] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the methods described herein may be allogeneic cells (or allogenic cells) . The terms “allogeneic cells, ” “allogeneic immune cells, ” or “allogeneic engineered immune cells” are used interchangeably herein to refer to the cells are obtained from an allogeneic donor. The allogeneic cells may be NK cells or CAR-NK cells.

[0143] The allogeneic CAR-NK cells described herein may not have genetic modifications that affect its HLA complexes, including, for example, B2M mutation (e.g., knockout of B2M gene) , or mutations to the HLA alleles. Compared to allogeneic CAR-NK cells having MHC or B2M mutations (e.g., knockout) , the allogeneic CAR-NK cells described herein may have reduced recognition by host NK cells, for example, reduces proliferation or killing by host NK cells by about or at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%. Compared to the administration of allogeneic CAR-NK cells without the CNI, the administration of the allogeneic CAR-NK cells with the CNI described herein may do not elicit killing by host T cells.

[0144] Methods of Treatment

[0145] In one aspect, the disclosure provides methods of treating a disease or disorder or reducing immune clearance of modified immune cells in a human subject under non-lymphodepletion conditions, the method comprising administering to the human subject an effective amount of modified immune cells (e.g., any of the modified immune cells described herein) and a CNI (e.g., any of the CNIs described herein) .

[0146] The term “effective amount” as used herein means an amount effective, at dosages and for periods of time necessary to achieve the desired results.

[0147] The disease or disorder may be a cancer, an autoimmune disease, or an infection.

[0148] In another aspect, the present disclosure provides a method for treating cancer comprising administering an effective amount of modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) described herein and a calcineurin inhibitor (CNI) described herein to a subject under non-lymphodepletion conditions in need thereof. Examples of cancer that can be treated include, but are not limited to, leukemias including chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute myelogenous leukemia, acute lymphoblastic leukemia, and T cell and B cell leukemias, lymphomas (Hodgkin's and non-Hodgkins) , lymphoproliferative disorders, plasmacytomas, histiocytomas, melanomas, adenomas, sarcomas, carcinomas of solid tissues, hypoxic tumors, squamous cell carcinomas, genitourinary cancers such as cervical and bladder cancer, hematopoietic cancers, head and neck cancers, and nervous system cancers.

[0149] The disclosure further includes the use of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) described herein in the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition to modulate an immune response or to treat disease or disorder as described hereinabove.

[0150] The disclosure further includes the use of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) described herein in the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition for use in (a) reducing immune clearance of modified immune cells in a subject; (b) increasing the in vivo infiltration of a modified immune cell into a tissue in a subject; and / or (c) preventing and / or reversing modified immune cells in a subject exhaustion in a subject; wherein the subject is under the treatment of modified immune cells described herein; wherein the human subject does not undergo lymphodepletion. The disclosure further includes the use of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) described herein in the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition for use in preventing or mitigating Host-versus-Graft (HvG) reactions resulting from the administration to a patient with cancer of modified immune cells described herein, wherein the modified immune cells are for treating said cancer or said autoimmune disease in said patients, wherein the HvG reactions are host T cell-mediated. The modified allogeneic cells may be isolated from a donor for being administered to a subject. The modified immune cells may be a modified natural killer (NK) cell. The modified NK cell may be a CAR-NK cell that expresses a chimeric antigen receptor (CAR) .

[0151] The CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) described herein can increase the in vivo infiltration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) into a tissue. The tissue may be a tumor tissue. One of the limitations of cell therapies is the low ability of the cells to infiltrate into tumor tissues. The CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) described herein may increase the infiltration of the modified immune cells described herein (e.g., CAR-NK cells) into tumor tissues in vivo. The infiltration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) into the tissue may be determined by the number of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the tumor tissue or the tumor area. The tissue may be organs or tissues affected by autoimmune diseases, such as the kidneys of patients with Lupus nephritis, which is a type of kidney disease caused by systemic lupus erythematosus link (SLE or lupus) . The CNI (e.g., CsA or Tac) described herein may increase the infiltration of the modified immune cells described herein (e.g., CAR-NK cells) into these organs or tissues in vivo. Compared to the modified immune cells without the administration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) , the tissue infiltration of the modified immune cells (e.g., the number of the modified immune cells in the tumor tissue or the tumor area) may be increased by about or at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, or 90%. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) described herein may have an increased tissue infiltration of about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more folds, compared to the tissue infiltration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) without the administration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) .

[0152] The increase tissue infiltration (e.g., tumor tissue infiltration, kidneys of patients with Lupus nephritis infiltration) ability of the modified immune cells described herein may be due to the increased expression of tumor infiltration marker CX3CR1 on the modified immune cells and the increased interactions between CX3CL1 and CX3CR1. The increase tissue infiltration (e.g., tumor tissue infiltration, kidneys of patients with Lupus nephritis infiltration) ability of the modified immune cells described herein may be via the interaction between CX3CR1 expressed on the modified immune cell and CX3CL1 expressed on the cells in the tissue (e.g., T cells, NK cells and macrophages in the tumor tissue, T cells, NK cells and macrophages in the kidneys of patients with Lupus nephritis infiltration) .

[0153] CX3CL1 is a transmembrane protein from which a soluble form can be generated by proteolytic shedding. Membranal and soluble forms of CX3CL1 exhibit different functions, although both bind to the CX3CR1 chemokine receptor. The CX3CL1-CX3CR1 axis mediates the adhesion of leukocytes and is also involved in cell survival and recruitment of immune cell subpopulations. The function of CX3CL1 is finely tuned by cytokines and transcription factors regulating its expression and post-translational modifications. On homeostasis, the CX3CL1-CX3CR1 axis participates in the removal of damaged neurons and neurogenesis, and it is also involved on several pathological contexts. The CX3CL1-CX3CR1 axis induces several cellular responses relevant to cancer such as proliferation, migration, invasion and apoptosis resistance. The CX3CL1-CX3CR1 axis is also involved in a number of autoimmune diseases, including systemic lupus erythematosus (SLE) , kidney disease, and rheumatoid arthritis (RA) . CX3CL1 is also produced by renal tubular epithelium, CX3CR1 and its ligand are highly regulated in human kidney diseases such as IgA nephritis, systemic lupus erythematosus, and inflammatory conditions such as transplant rejection (von Vietinghoff S, Kurts C. Regulation and function of CX3CR1 and its ligand CX3CL1 in kidney disease. Cell Tissue Res. 2021 Aug; 385 (2) : 335-344) .

[0154] Compared to the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) without the administration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) , the expression of CX3CR1 on the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be increased by about or at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, or 90%. The expression of CX3CR1 on the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be increased by about or at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more folds, compared to the expression of CX3CR1 on the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) without the administration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) .

[0155] The administration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may promote the enrichment of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the bone marrow of the subject. The subject in the methods described herein may have a bone-marrow-related disease or disorder, or a hematological cancer, e.g., a lymphoma or a leukemia. The subject may have a disease or disorder selected from acute lymphoblastic leukemia, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, Hodgkin lymphoma, non-Hodgkin lymphoma, Waldenstrom macroglobulinemia, follicular lymphoma, B-cell lymphoma, cutaneous T-cell lymphoma, multiple myeloma, and plasmacytoma. The subject may have an autoimmune disease, e.g., a B-cell regulated autoimmune disease. The subject may have systemic lupus erythematosus (SLE) , rheumatoid arthritis, Wegener's disease, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) , thrombotic throbocytopenic purpura (TTP) , autoimmune thrombocytopenia, multiple sclerosis (MS) , Systemic sclerosis / scleroderma (SSc) , Idiopathic inflammatory myopathy (IIM) , antiphospholipid syndrome (APS) , psoriasis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathies, myasthenia gravis (MG) , ANCA (Anti-neutrophil cytoplastic antibodies) associated vasculitis, diabetes mellitus, Reynaud's syndrome, Sjorgen's syndrome, Neuromyelitis Optica (NMO) , and glomerulonephritis, myelin oligodendrocyte glycoprotein-IgG associated disorders (MOGAD) .

[0156] Compared to the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) without the administration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) , the distribution of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the bone marrow (e.g., the number of the modified immune cells in the bone marrow of the subject) may be increased by about or at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, or 90%. The distribution of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the bone marrow (e.g., the number of the modified immune cells in the bone marrow of the subject) may be increased by about or at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 or more folds, compared to the distribution of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the bone marrow (e.g., the number of the modified immune cells in the bone marrow of the subject) without the administration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) .

[0157] The administration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) can promote the expansion or proliferation of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The expansion of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be increased by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%compared to cells without the administration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) . The expansion of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be increased by about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more folds compared to cells without the administration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) . Cell expansion or proliferation can be measured by an in vitro cell proliferation assay. Comparing to cells without the administration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) , the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) described herein may have a cell number that is higher by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. Comparing to a cells without the administration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) , the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) described herein may have a cell number that is higher by less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%.

[0158] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) can kill tumor cells. The cytotoxicity of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) against tumor cells can be determined by an in vitro long-term cytotoxicity assay. The effector cell: target cell (E: T) ratio can be about 1: 10, 1: 5, 1: 4.5, 1: 4, 1: 3.5, 1: 3, 1: 2.5, 1: 2, 1: 1, 2: 1, 2.5: 1, 3: 1, 3.5: 1, 4: 1, 4.5: 1, 5: 1, or 10: 1. The E: T ratio can be 1: 4. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may have a cytotoxicity of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, or more than 90%, after 1 round, 2 rounds, 3 rounds, 4 rounds, or 5 rounds of stimulation in a re-challenge assay. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may have a cytotoxicity of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 30%, less than 40%, less than 50%, less than 60%, less than 70%, less than 80%, or less than 90%, after 1 round, 2 rounds, 3 rounds, 4 rounds, or 5 rounds of stimulation in a re-challenge assay. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may have a cytotoxicity of 10-100%, 10%-50%, 20-100%, 20-60%, 20-40%, 30-70%, 40-80%, 50-90%, 70-100%, 80-100%, or 90-100%, after 1 round, 2 rounds, 3 rounds, 4 rounds, or 5 rounds of stimulation in a re-challenge assay. Comparing to the cytotoxicity of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) without the administration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) , the cytotoxicity of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may increase by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 10, 00%, after 1 round, 2 rounds, 3 rounds, 4 rounds, or 5 rounds of stimulation in a re-challenge assay. Under non-lymphodepletion conditions, the cytotoxicity of the modified immune cells (e.g., any of the modified immune cells described herein) is increased by at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 1-fold, at least 2-fold, at least 5-fold, at least 10-fold, at least 20-fold, at least 50-fold, at least 100-fold, at least 200-fold, at least 500-fold, at least 1000-fold, at least 2000-fold, at least 5000-fold, or at least 10000-fold as compared to that when the human subject is subject to lymphodepletion.

[0159] In one aspect, the disclosure provides methods of reducing immune clearance of modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in a subject, comprising administering an effective amount of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and a CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) to the subject, wherein the human subject does not undergo lymphodepletion.

[0160] The administration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may protect the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) described herein from immune clearance (e.g., host T cell-mediated cytotoxicity or host immune cell-mediated cytotoxicity) . The T cell-or immune cell-mediated killing of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be decreased by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%compared to the cytotoxicity without the administration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) . The T cell-or immune cell-mediated killing of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be decreased by about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more folds compared to cells without the administration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) .

[0161] Under non-lymphodepletion conditions, the cytotoxicity of the modified immune cells (e.g., any of the modified immune cells described herein) is increased by at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 1-fold, at least 2-fold, at least 5-fold, at least 10-fold, at least 20-fold, at least 50-fold, at least 100-fold, at least 200-fold, at least 500-fold, at least 1000-fold, at least 2000-fold, at least 5000-fold, or at least 10000-fold as compared to that when the human subject is subject to lymphodepletion.

[0162] The CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may protect the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) described herein from immune clearance (e.g., host T cell-mediated cytotoxicity or host immune cell-mediated cytotoxicity) under non-lymphodepletion conditions. The T cell-or immune cell-mediated killing of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be decreased by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%compared to that when the human subject is subject to lymphodepletion. The T cell-or immune cell-mediated killing of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be decreased by about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more folds compared to that when the human subject is subject to lymphodepletion.

[0163] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) can also be used in experimental models, for example, to further study and elucidate the function of the cells.

[0164] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) can be administered via any suitable method. One or more of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) described herein can be administered to a subject in a single, unified form, such as an intravenous injection, or in multiple forms, for example, as multiple intravenous infusions or injections, or subcutaneous injections. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) can be administered via different methods. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) can be administered via one or more injections and the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) can be administered via separate injections or orally, or a combination thereof (e.g., the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) is injected during the time the subject is hospitalized and administered orally after the subject is discharged from the hospital) .

[0165] In some cases, the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) can expand within a subject's body, in vivo, after administration to a subject. In some cases, the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) have been expanded in vitro before administered to the subject. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) can be frozen to provide cells for multiple treatments with the same cell preparation. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) of the disclosure, and pharmaceutical compositions comprising the same and any additional therapeutic agent (e.g., the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) ) , can be packaged as a kit. A kit can include instructions (e.g., written instructions) on the use of the modified cells and the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) , and compositions comprising the same.

[0166] In one aspect, the present disclosure provides a method of treatment that comprises administering to a subject a therapeutically-effective amount of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) described herein and the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) described herein. The therapeutically-effective amount of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be administered for a single time. The therapeutically-effective amount of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be administered for multiple times (such as any of 2, 3, 4, 5, 6, or more times) . The CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may be administered for at least 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, or 1 year. The optimal dosage and treatment regime for a particular patient can readily be determined by one skilled in the art of medicine by monitoring the patient for signs of disease and adjusting the treatment accordingly.

[0167] The CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may be administered prior to, during, and / or after the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the methods described herein. For example, the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) can be administered prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) to provide an immunosuppressed environment in the subject for the enhanced efficacy of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . During the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) , the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) can continue to be injected throughout the course of administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . After the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) , the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) can continued to be administered for the maintenance of the immunosuppressed condition in the subject to reduce, e.g., HvG reactions. The frequency and dosages of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may vary depending on attributes particular to the disease or disorder and / or patient and / or other treatments. For example, the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may be administered twice a day, every day, every two days, every three days, every four days, every five days, every six days, every week, every two weeks or more.

[0168] The CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may be administered prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the methods described herein. The CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may be administered at least 1 hour, 2 hours, 5 hours, 12 hours, 18 hours, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days, 17 days, 18 days, 19 days, 20 days, 21 days, 22 days, 23 days, 24 days, 25 days, 26 days, 27 days, 28 days, 29 days, 30 days or more prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The CNI may be administered 7 days prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The CNI may be administered prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) , typically between 1 hour and 3 days or longer before infusion.

[0169] The CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may be administered during and throughout the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may be administered concurrently with the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the methods described herein.

[0170] The CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may be administered after the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may be administered about 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days or more after the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The CNI may be administered to the human subject at least 1 hour, at least 2 hours, at least 3 hours, at least 6 hours, at least 12 hours, at least 18 hours, at least 1 day after the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) .

[0171] The CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may be administered for about or at least 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 20 days, 1 month, or 2 months after the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may be administered for about at least 15 days, at least 20 days, at least 1 month, 2 months or 3 months after the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may be administered for about 20 days after the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) .

[0172] The CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may be administered for about or at least 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days, 17 days, 18 days, 19 days, 20 days, 21 days, 22 days, 23 days, 24 days, 25 days, 26 days, 27 days, 28 days, 29 days, 30 days, 1 month, 2 months, or 3 months.

[0173] In the methods described herein, a lymphodepletion may not have been performed in the subject prior to the administration of CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) . In the methods described herein, a lymphodepletion may not be performed in the subject after the administration of CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) .

[0174] In the methods described herein, a lymphodepletion may not have been performed in the subject prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The lymphodepletion may not have been performed in the subject at least 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days, 17 days, 18 days, 19 days, 20 days, 21 days, 22 days, 23 days, 24 days, 25 days, 26 days, 27 days, 28 days, 29 days, 30 days or more prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The lymphodepletion may not have been performed in the subject about 3 or 4 days prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The lymphodepletion may not be performed for multiple times (such as any of 2, 3, 4, 5, 6, or more times) . The lymphodepletion may be not performed for 3 times.

[0175] The lymphodepletion may not have been performed in the subject after the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The lymphodepletion may not have been performed in the subject about or at least 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, or 10 days after the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) .

[0176] The CNI may be administered 1 hour to 3 days prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may be administered for at least 24 hours, at least 48 hours, at least 72 hours, at least 96 hours, at least 1 week, at least 2 weeks, at least 3 weeks, at least 4 weeks, at least 1 month, at least 2 months, at least 3 months. The lymphodepletion may have not been performed in the subject about 3 or 4 days prior to the administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) . The lymphodepletion may not be performed for 3 times.

[0177] In the methods described herein, the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may be administered by oral administration after the subject is discharged from the hospital.

[0178] In the methods described herein, the blood concentration of the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) may be monitored throughout the course of the treatment.

[0179] The trough blood concentration of cyclosporine may be about 25-500 ng / ml, 25-400 ng / ml, 25-350 ng / mL, 25-300 ng / ml, 25-200 ng / ml, 25-100 ng / ml, 25-50 ng  / ml, 100-500 ng / ml, 100-400 ng / ml, 100-350 ng / mL, 100-300 ng / ml, 100-200 ng / ml, 200-500 ng / ml, 200-400 ng / ml, 200-350 ng / mL, 200-300 ng / ml. The trough blood concentration of cyclosporine at the beginning of the treatment (e.g., prior, during or immediately after the administration of the modified immune cells) may be about 100-350 ng / ml. The trough blood concentration of cyclosporine at a later time point of the treatment (e.g., at least 1, 2, 3, or 4 week (s) after the administration of the modified immune cells) may be about less than 350ng / ml, 300ng / ml, less than 200 ng / ml, less than 100 ng / ml, less than 50 ng / ml or less than 10 ng / ml.

[0180] The trough blood concentration of tacrolimus may be about 1-50 ng / ml, 1-40 ng / ml, 1-30 ng / ml, 1-20 ng / ml, 1-10 ng / ml, 1-5 ng  / ml, 5-50 ng / ml, 5-40 ng / ml, 5-30 ng / ml, 5-20 ng / ml, or 5-10 ng / ml. The trough blood concentration of tacrolimus at the beginning of the treatment (e.g., prior, during or immediately after the administration of the modified immune cells) may be about 6-15 ng / ml. The trough blood concentration of tacrolimus at a later time point of the treatment (e.g., at least 1, 2, 3, or 4 week (s) after the administration of the modified immune cells) may be about less than 30ng / ml, less than 20 ng / ml, less than 15 ng / ml, less than 10 ng / ml, less than 5 ng / ml or less than 1 ng / ml.

[0181] Also provided herein are methods of enhancing degranulation of modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in a human subject, the method comprising administering to the human subject an effective amount of modified immune cells (e.g., any of the modified immune cells described herein) and a CNI (e.g., any of the CNIs described herein) .

[0182] NK cells kill by a mechanism involving the release of small cytolytic granules containing granzyme B and perforin that induce cell death in the target cell. Although NK cell numbers can be enumerated by immunophenotyping on the flow cytometer, an important limitation in the study of NK cells is the lack of availability of high throughput assays for the detection of the functional activity of NK cells.

[0183] During degranulation, cytolytic granules in NK cells are released and the lysosome-associated membrane protein-1 (LAMP-1, CD107a) which is present on cytolytic granules surface is transported to the cell surface and becomes accessible for antibody binding. This allows identification of activated NK cells, making it an attractive biomarker for assessing the integrity of the granule exocytosis mechanism.

[0184] The administration of the CNI may enhance the degranulation of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the methods described herein. The degranulation may be enhanced by about or at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or about or at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 folds.

[0185] The administration of the CNI may increase the expression of CD107a on the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) in the methods described herein. The expression of CD107a on the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) may be increased by about or at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or about or at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 folds.

[0186] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) described herein can be administered before, during, or after the occurrence of a disease or condition, and the timing of administering the modified cells can vary. For example, the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) can be used as a prophylactic and can be administered continuously to subjects with a propensity to conditions or diseases in order to lessen a likelihood of the occurrence of the disease or condition. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) can be administered to a subject during or as soon as possible after the onset of the symptoms. The administration of the modified cells can be initiated immediately within the onset of symptoms, within the first 3 hours of the onset of the symptoms, within the first 6 hours of the onset of the symptoms, within the first 24 hours of the onset of the symptoms, within 48 hours of the onset of the symptoms, or within any period of time from the onset of symptoms. The initial administration can be via any route practical (e.g., intravenous infusions or injections) , such as by any route described herein using any formulation described herein. The administration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) of the disclosure can be an intravenous administration. One or multiple dosages of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) can be administered as soon as is practicable after the onset of a cancer or an infectious disease, and for a length of time necessary for the treatment of the disease, such as, for example, from about 24 hours to about 48 hours, from about 48 hours to about 1 week, from about 1 week to about 2 weeks, from about 2 weeks to about 1 month, from about 1 month to about 3 months. For the treatment of cancer, one or multiple dosages of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) can be administered years after onset of the cancer and before or after other treatments. The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) can be administered for at least about 10 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, at least 48 hours, at least 72 hours, at least 96 hours, at least 1 week, at least 2 weeks, at least 3 weeks, at least 4 weeks, at least 1 month, at least 2 months, at least 3 months, at least 4 months, at least 5 months, at least 6 months, at least 7 months, at least 8 months, at least 9 months, at least 10 months, at least 11 months, at least 12 months, at least 1 year, at least 2 years at least 3 years, at least 4 years, or at least 5 years. The length of treatment can vary for each subject.

[0187] Methods for administration of modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) for adoptive cell therapy are known and can be used in connection with the provided methods and compositions. For example, adoptive T cell or NK cell therapy methods are described, e.g., in US Patent Application Publication No. 2003 / 0170238 to Gruenberg et al; US Patent No. 4, 690, 915 to Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (10) : 577-85) . See, e.g., Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31 (10) : 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1) : 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8 (4) : e61338.

[0188] The cell therapy (e.g., adoptive NK cell therapy) may be carried out by allogeneic transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from a subject other than a subject who is to receive or who ultimately receives the cell therapy, e.g., a first subject. The cells may then be administered to a different subject, e.g., a second subject, of the same species. The first and second subjects may be genetically identical. The first and second subjects may be genetically similar. The second subject may express the same HLA class or supertype as the first subject.

[0189] The subject may have been treated with a therapeutic agent targeting the disease or condition, e.g., the tumor, prior to administration of the cells or composition containing the cells and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) . In some aspects, the subject is refractory or non-responsive to the other therapeutic agent. The subject may have persistent or relapsed disease, e.g., following treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) , e.g., allogeneic HSCT. The administration may effectively treat the subject despite the subject having become resistant to another therapy.

[0190] The subject may be responsive to the other therapeutic agent, and treatment with the therapeutic agent reduces disease burden. In some aspects, the subject is initially responsive to the therapeutic agent, but exhibits a relapse of the disease or condition over time. The subject may not have relapsed. The subject may be determined to be at risk for relapse, such as at a high risk of relapse, and thus the cells are administered prophylactically, e.g., to reduce the likelihood of or prevent relapse. In some aspects, the subject has not received prior treatment with another therapeutic agent.

[0191] The subject may have persistent or relapsed disease, e.g., following treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) , e.g., allogeneic HSCT. The administration may effectively treat the subject despite the subject having become resistant to another therapy.

[0192] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) described herein can be administered to an animal, preferably a mammal, even more preferably a human, to treat a cancer. In addition, the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) can be used for the treatment of any condition related to a cancer, especially a cell-mediated immune response against a tumor cell (s) , where it is desirable to treat or alleviate the disease. The types of cancers to be treated with the modified cells or pharmaceutical compositions include, carcinoma, blastoma, and sarcoma, and certain leukemia or lymphoid malignancies, benign and malignant tumors, and malignancies e.g., sarcomas, carcinomas, and melanomas. Other exemplary cancers include but are not limited breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, skin cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, renal cancer, liver cancer, brain cancer, lymphoma, leukemia, lung cancer, thyroid cancer, and the like. The cancers can be non-solid tumors (such as hematological tumors) or solid tumors. Adult tumors / cancers and pediatric tumors / cancers are also included. The cancer can be a solid tumor or a hematological tumor. The cancer can be a carcinoma. The cancer can be a sarcoma. The cancer can be a leukemia. The cancer can be a solid tumor.

[0193] Solid tumors are abnormal masses of tissue that usually do not contain cysts or liquid areas. Solid tumors can be benign or malignant. Different types of solid tumors are named for the type of cells that form them (such as sarcomas, carcinomas, and lymphomas) . Examples of solid tumors, such as sarcomas and carcinomas, include fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteosarcoma, and other sarcomas, synovioma, mesothelioma, Ewing's tumor, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, colon carcinoma, lymphoid malignancy, pancreatic cancer, breast cancer, lung cancers, ovarian cancer, prostate cancer, hepatocellular carcinoma, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, medullary thyroid carcinoma, papillary thyroid carcinoma, pheochromocytomas sebaceous gland carcinoma, papillary carcinoma, papillary adenocarcinomas, medullary carcinoma, bronchogenic carcinoma, renal cell carcinoma, hepatoma, bile duct carcinoma, choriocarcinoma, Wilms'tumor, cervical cancer, testicular tumor, seminoma, bladder carcinoma, melanoma, and CNS tumors (such as a glioma (such as brainstem glioma and mixed gliomas) , glioblastoma (also known as glioblastoma multiforme) astrocytoma, CNS lymphoma, germinoma, medulloblastoma, Schwannoma craniopharyogioma, ependymoma, pinealoma, hemangioblastoma, acoustic neuroma, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma and brain metastases) .

[0194] Carcinomas that can be amenable to therapy by a method disclosed herein include, but are not limited to, esophageal carcinoma, hepatocellular carcinoma, basal cell carcinoma (aform of skin cancer) , squamous cell carcinoma (various tissues) , bladder carcinoma, including transitional cell carcinoma (a malignant neoplasm of the bladder) , bronchogenic carcinoma, colon carcinoma, colorectal carcinoma, gastric carcinoma, lung carcinoma, including small cell carcinoma and non-small cell carcinoma of the lung, adrenocortical carcinoma, thyroid carcinoma, pancreatic carcinoma, breast carcinoma, ovarian carcinoma, prostate carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, sebaceous gland carcinoma, papillary carcinoma, papillary adenocarcinoma, cystadenocarcinoma, medullary carcinoma, renal cell carcinoma, ductal carcinoma in situ or bile duct carcinoma, choriocarcinoma, seminoma, embryonal carcinoma, Wilm's tumor, cervical carcinoma, uterine carcinoma, testicular carcinoma, osteogenic carcinoma, epithelial carcinoma, and nasopharyngeal carcinoma.

[0195] Sarcomas that can be amenable to therapy by a method disclosed herein include, but are not limited to, fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, chordoma, osteogenic sarcoma, osteosarcoma, angiosarcoma, endotheliosarcoma, lymphangiosarcoma, lymphangioendotheliosarcoma, synovioma, mesothelioma, Ewing's sarcoma, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, and other soft tissue sarcomas.

[0196] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) described herein can be administered to an animal, preferably a mammal, even more preferably a human, to treat a bone-marrow-related autoimmune disease. In addition, the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., CsA or Tac) can be used for the treatment of any condition related to a bone-marrow-related autoimmune disease. A bone-marrow-related autoimmune disease is a group of diseases that affect the bone marrow. Some pathogenic cells of these diseases can be located in the bone marrow, develop in the bone marrow, and / or invade the bone marrow, thereby affecting the function of the bone marrow. The bone-marrow-related autoimmune disease includes a B-cell regulated autoimmune disease. The B-cell regulated autoimmune disease is an autoimmune disorder that involves misregulation of B-cells. The B-cell regulated autoimmune disease can be an autoimmune disorder associated with autoreactive plasma cells and / or autoreactive memory B cells.

[0197] Examples of bone-marrow-related autoimmune disease, such as systemic lupus erythematosus (SLE) , rheumatoid arthritis, Wegener's disease, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) , thrombotic throbocytopenic purpura (TTP) , autoimmune thrombocytopenia, multiple sclerosis (MS) , Systemic sclerosis / scleroderma (SSc) , Idiopathic inflammatory myopathy (IIM) , antiphospholipid syndrome (APS) , psoriasis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathies, myasthenia gravis (MG) , ANCA (Anti-neutrophil cytoplastic antibodies) associated vasculitis, diabetes mellitus, Reynaud's syndrome, Sjorgen's syndrome, Neuromyelitis Optica (NMO) , and glomerulonephritis, and myelin oligodendrocyte glycoprotein-IgG associated disorders (MOGAD) .

[0198] Bone-marrow-related autoimmune disease that can be amenable to therapy by a method disclosed herein include, but are not limited to, systemic lupus erythematosus (SLE) , Wegener's disease, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, Sjogren's syndrome, graft-versus-host disease, multiple sclerosis, Systemic sclerosis / scleroderma (SSc) , systemic sclerosis, myasthenia gravis, rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, Idiopathic inflammatory myopathy (IIM) , antiphospholipid syndrome (APS) , psoriasis, ANCA associated vasculitis, diabetes mellitus, Neuromyelitis Optica (NMO) , osteoarthritis, psoriatic arthritis, dermatitis, atopic dermatitis, chronic autoimmune urticaria, polymyositis / dermatomyositis, toxic epidermal necrolysis, systemic scleroderma and sclerosis, respiratory distress syndrome, adult respiratory distress syndrome (ARDS) , meningitis, allergic rhinitis, encephalitis, uveitis, colitis, glomerulonephritis, myelin oligodendrocyte glycoprotein-IgG associated disorders (MOGAD) , allergic conditions, eczema, asthma, atherosclerosis, autoimmune myocarditis, leukocyte adhesion deficiency, lupus (nephritis, non-renal, discoid, alopecia) , allergic encephalomyelitis, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis, Wegener's granulomatosis, agranulocytosis, vasculitis, aplastic anemia, Coombs positive anemia, Diamond Blackfan anemia, immune hemolytic anemia, hemolytic anemia (AIHA) , pernicious anemia, pure red cell aplasia (PRCA) , Factor VIII deficiency, hemophilia A, autoimmune neutropenia, pancytopenia, leukopenia, diseases involving leukocyte diapedesis, multiple organ injury syndrome, anti-glomerular basement membrane disease, anti-phospholipid antibody syndrome, allergic neuritis, Bechet disease, Castleman's syndrome, Goodpasture's Syndrome, Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome, Reynaud's syndrome, Sjorgen's syndrome, Stevens-Johnson syndrome, solid organ transplant rejection, graft versus host disease (GVHD) , pemphigoid bullous, pemphigus, vulgaris, foliaceus, autoimmune polyendocrinopathies, Reiter's disease, stiff-man syndrome, giant cell arteritis, immune complex nephritis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathies, IgM mediated neuropathy, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) , thrombotic throbocytopenic purpura (TTP) , autoimmune thrombocytopenia, autoimmune orchitis, autoimmune oophoritis, primary hypothyroidism; autoimmune endocrine diseases, autoimmune thyroiditis, chronic thyroiditis (Hashimoto's Thyroiditis) , subacute thyroiditis, idiopathic hypothyroidism, Addison's disease, Grave's disease, polyglandular endocrinopathy syndromes, Sheehan's syndrome, autoimmune hepatitis, Lymphoid interstitial pneumonitis (HIV) , non-transplant bronchiolitis obliterans, Guillain-Barre'S yndrome, Large Vessel Vasculitis, Polymyalgia Rheumatica, Giant Cell (Takayasu's ) Arteritis, Medium Vessel Vasculitis, Kawasaki's Disease, Polyarteritis Nodosa, ankylosing spondylitis, Berger's Disease, Rapidly Progressive Glomerulonephritis, Primary biliary cirrhosis, Celiac sprue, Cryoglobulinemia, ALS, and coronary artery disease.

[0199] Since the CNI (e.g., CsA or Tac) can promote the infiltration of the modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) into the bone marrow, the method described herein is helpful for the treatment of the bone-marrow-related autoimmune disease.

[0200] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) described herein can be included in a composition for immunotherapy. The composition can include a pharmaceutical composition and further include a pharmaceutically acceptable carrier. A therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition comprising the modified cells can be administered.

[0201] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) can be immediately used in the above therapeutic, experimental or commercial applications or the cells can be cryopreserved for use at a later date. The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration.

[0202] The modified immune cells (e.g., CAR-NK cells) and / or the CNI (e.g., cyclosporine or tacrolimus) disclosed herein can be formulated in unit dosage forms suitable for single administration of precise dosages. In some cases, the unit dosage forms comprise additional lymphocytes. In unit dosage form, the formulation is divided into unit doses containing appropriate quantities of one or more compounds. The unit dosage can be in the form of a package containing discrete quantities of the formulation. Non-limiting examples are packaged tablets or capsules, and powders in vials or ampoules. Aqueous suspension compositions can be packaged in single-dose non-reclosable containers. Multiple-dose reclosable containers can be used, for example, in combination with a preservative or without a preservative. In some examples, the pharmaceutical composition does not comprise a preservative. Formulations for parenteral injection can be presented in unit dosage form, for example, in ampoules, or in multi-dose containers with a preservative.

[0203] EXAMPLES

[0204] The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

[0205] Example 1. CsA inhibited rejection more effectively and promoted allogeneic cell implantation in non-lymphodepletion conditions

[0206] To test the hypothesis that "non-lymphodepletion combined with calcineurin inhibitors (CNIs) can promote the implantation of allogeneic cells, " we constructed an allogeneic cell transplantation model in mice. Specifically, C57BL / 6 mice (GemPharmatech Co., Ltd. ) were used as recipient mice. As shown in FIG. 1A, 2 days before allogeneic MPC-11 tumor cell transplantation (Day -2) , 200 mg / kg fludarabine (BAXTER ONCOLOGY GMBH, Approval No.: J20140131) and 50 mg / kg cyclophosphamide (Selleck, Cat#: NSC-26271) were administered to G3 / G4 group mice by intraperitoneal injection to perform lymphodepletion. Lymphodepletion was not performed in G1 / G2 group mice, which were used as control groups. 1 day before allogeneic MPC-11 tumor cell transplantation (Day -1) , G2 / G3 group mice were orally administered with 50 mg / kg Cyclosporine A (CsA; Selleck, Cat#: S223008) , at a frequency of once a day for 22 days. G1 / G4 group mice were administered with vehicle (PBS, 250 μL) at the same time. On Day 0, BALB / c-derived luciferase-labeled tumor cell MPC-11 (ATCC, CCL-167TM) were used for inoculation, and the luminescence intensity was monitored by  Lumina LT (PerkinElmer) to indicate the expansion of MPC-11.

[0207] As shown in FIG. 1B, the results showed that compared with the control groups that were treated with vehicle (G1 / G4) , CsA treatment (G2 / G3) significantly promoted the amplification of MPC-11, regardless of whether lymphodepletion (LD) was performed. Interestingly, under lymphodepletion conditions, significant rejection of MPC-11 cells in the CsA-treated group (G3) was observed 10-15 days after inoculation. However, the non-lymphodepletion and CsA-treated group (G2) generally showed better MPC-11 amplification, with 50%of mice having persisting MPC-11, and no rejection was observed during the experimental period. The results indicate that pretreatment of lymphodepletion may increase the risk of rejection; whereas in non-lymphodepletion conditions, CsA can more effectively improve the success rate of allogeneic cell transplantation.

[0208] Example 2. Lymphodepletion promoted T cell activation phenotype

[0209] To study the impact of lymphodepletion on the activation phenotype of T cells, we further analyzed the activation phenotype of T cells in peripheral blood in a similar model as described above. Specifically, On Day 11 and Day 14 post-MPC-11 inoculation, mice were sacrificed and peripheral blood cells were harvested for red blood cell lysis. The cells were then incubated with anti-mouse CD45 antibody (BioLegend, Cat#: 103116) , anti-mouse CD3 antibody (Thermo Fisher Scientific, Cat#: 53-0032-82) , and anti-mouse CD71 antibody (BioLegend, Cat#: 113813) in PBS for 30 minutes at 4℃ for flow cytometry staining. After washing, the cells were resuspended in 200 μL of PBS containing 0.5%fetal bovine serum (FBS) , and phenotypic analysis of mouse peripheral blood cells was performed using a flow cytometer (CytoFLEX Flow Cytometer) . In particular, the percentage of CD71+ activated T cells among CD45+CD3+ T cells was determined. As shown in FIG. 2A, even with CsA treatment, lymphodepletion increased the CD71 expression level in T cells, suggesting that lymphodepletion enhanced T cell activation.

[0210] In a different experiment, we only performed lymphodepletion or control treatment on C57BL / 6 mice, and the mice were sacrificed on Day 10 post-lymphodepletion. After obtaining the spleen to prepare a single-cell suspension, similar steps as described above were used for cell staining and flow cytometry analysis. Specifically, the cells were incubated with anti-mouse CD4 antibody (BioLegend, Cat#: 100412) , anti-mouse CD3 antibody (Thermo Fisher Scientific, Cat#: 53-0032-82) , and anti-mouse CD71 antibody (BioLegend, Cat#: 113813) in PBS for 30 minutes at 4℃. The percentages of CD71+ T cells in the spleen were compared between conditions with and without lymphodepletion. Consistently, lymphodepletion also increased the percentage of CD71+ cells in CD4+CD3+ or CD4-CD3+T cells, suggesting that lymphodepletion can promote the generation of T cell activation phenotype (FIG. 2B) .

[0211] Example 3. Cytokines promoted T cell activation phenotype and reduced the inhibitory effect of CsA

[0212] Lymphodepletion can lead to the expression of homeostatic cytokines such as IL-7 and IL-15. To explore the stimulating effect of lymphodepletion on T cell activation, we constructed a 2-way MLR (Mixed Lymphocyte Reaction) reaction. Specifically, 0.4 × 106 PBMCs from two different donors (Sailybio) were mixed at a cell number ratio of 1: 1, and different cytokines and a sub-optimal dose of CsA were added to the mixed cells (FIG. 3A) . After 6 days of culture, the cells were incubated with anti-human CD3 antibody (BD Biosciences, Cat#: 557597) and anti-human CD71 antibody (BioLegend, Cat#: 334104) in PBS for 30 minutes at 4℃ for flow cytometry staining. After washing, the cells were resuspend in 200 μL of PBS containing 0.5%FBS, and the percentage of CD71+ T cells was analyzed using a flow cytometer (CytoFLEX Flow Cytometer) to indicate the activation status of T cells. As shown in FIGS. 3B-3C, CsA at 12.5-50 ng / ml significantly inhibited T cell activation. The cytokines IL-7 (MILTENYI, Cat#: 130-095-367, 10 ng / ml) , IL-15 (MILTENYI, Cat#: 130-095-760, 10 ng / ml) , IL-7+IL-15 and IL-2 (Recombinant Human Interleukin-2 for Injection, Jiangsu Kingsley Pharmaceutical Co., Ltd., 300 IU) weakened the inhibition of T cell activation by CsA, suggesting that the addition of these cytokines weakened the inhibitory effect of CsA.

[0213] Example 4. Tacrolimus promoted the expansion of allogeneic CAR-NK under non-lymphodepletion conditions

[0214] To further verify whether calcineurin inhibitors (CNIs) can inhibit rejection reactions and promote the expansion of IL-15-armored (The IL-15 armor used in this experiment was membrane-bound IL-15 armor-1 described in PCT Application No. PCT / CN2024 / 124484) CAR-NK cells targeting CD19 / BCMA (The CD19 / BCMA CAR can be any suitable CAR used in the art, e.g., those disclosed in PCT Application No. PCT / CN2024 / 139275) and their B cell clearance effect in non-lymphodepletion conditions, 3 × 106 CAR-NK cells were reinfused in mice with a reconstructed humanized immune system (HIS-NOG-EXL, purchased from Charles River Laboratories) . Specifically, when NOG-EXL mice were 6-8 weeks old, 100 cGy irradiation was performed, and CD34+ HSCs are reinfused after irradiation. About 14-15 weeks after reconstruction, mice with hCD45%over 25%were selected for subsequent experiments. Next, the mice with humanized immune systems were treated with or without 5 mg / kg / day tacrolimus (MedChemExpress, Cat#: HY-13756 / 263190) . 8 days after CAR-NK reinfusion, peripheral blood of mice was collected for red blood cell lysis. The cells were then incubated with anti-human CD45 antibody (Thermo Fisher Scientific, Cat#: 56-9459-42) , anti-human CD19 antibody (BioLegend, Cat#: 302218) and anti-human ScFv antibody (GenScript, Cat#: A02285) in PBS at 4℃ for 30 minutes for flow cytometry staining. After washing, the cells were resuspend in 200 μL of PBS containing 0.5%FBS, and phenotypic analysis of peripheral blood cells of the mice with reconstructed human immune systems was performed using a flow cytometer (CytoFLEX Flow Cytometer) . The percentages of B cells (CD45+CD19+ ScFv-) and CAR-NK cells (CD45+CD19-ScFv+) in the peripheral blood of the tacrolimus-treated group (CAR-NK +Tacrolimus) and the untreated group (CAR-NK only) were compared. As shown in FIGS. 4A-4B, relative to the CAR-NK only group, tacrolimus treatment further reduced the percentage of B cells, which was accompanied by a large expansion of CAR-NK cells.

[0215] In addition, we also used ELISA (Liankebio, Cat#: EK171-96T) to detect the changing levels of human IgG in the peripheral blood of mice before and after treatment. Consistently, tacrolimus treatment reduced peripheral blood IgG levels. These data suggest that tacrolimus can inhibit the rejection of allogeneic CAR-NK cells by the mice with a reconstructed human immune system and promote CAR-NK expansion. As a result, the CAR-NK cells targeting CD19 and BCMA eliminated B cells and IgG more effectively (FIG. 4C) .

[0216] OTHER EMBODIMENTS

[0217] It is to be understood that while the invention has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the invention, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims

1.A method of treating a disease or disorder in a human subject, comprising(a) administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the human subject, and(b) administering an effective amount of modified immune cells to the human subject after step (a) ,wherein the human subject is not administered with cyclophosphamide and fludarabine for lymphodepletion prior to step (b) .2.A method of reducing immune clearance of modified immune cells in a human subject, comprising(a) administering an effective amount of a calcineurin inhibitor (CNI) to the human subject, and(b) administering an effective amount of modified immune cells to the human subject after step (a) ,wherein the human subject is not administered with cyclophosphamide and fludarabine for lymphodepletion prior to step (b) .3.The method of claim 1 or 2, wherein the human subject is not administered with cyclophosphamide, fludarabine, or a combination thereof for lymphodepletion prior to step (b) .4.The method of any one of claims 1-3, wherein the human subject is not administered with one or more lymphodepleting agents for lymphodepletion, wherein the one or more lymphodepleting agents are selected from:(a) one or more chemotherapeutic agents selected from bendamustine, busulfan, etoposide, cytarabine, and clofarabine; and / or(b) one or more biologic agents selected from an anti-CD52 antibody (e.g., alemtuzumab) and an anti-CD45 antibody (e.g., apamistamab) .5.The method of any one of claims 1-4, wherein the human subject is not treated with radiation therapy for lymphodepletion, e.g., total body irradiation (TBI) .6.The method of any one of claims 1-5, wherein the human subject does not undergo lymphodepletion, e.g., prior to step (b) .7.The method of any one of claims 1-6, wherein the CNI is cyclosporine, wherein the cyclosporine is administered at a dose level of about 1 mg / kg / day to about 25 mg / kg / day or about 0.5 mg / kg / twice a day to about 12.5 mg / kg / twice a day.8.The method of any one of claims 1-6, wherein the CNI is tacrolimus, wherein the tacrolimus is administered at a dose level of about 0.01 mg / kg / day to about 1 mg / kg / day.9.The method of any one of claims 1-8, wherein step (a) occurs at least 1 hour, at least 2 hours, at least 3 hours, at least 4 hours, at least 5 hours, at least 6 hours, at least 7 hours, at least 8 hours, at least 9 hours, at least 10 hours, at least 11 hours, at least 12 hours, at least 18 hours, at least 1 day, at least 2 days, at least 3 days, at least 4 days, at least 5 days, at least 6 days, or at least 7 days prior to step (b) .10.The method of any one of claims 1-9, wherein step (a) occurs less than 1 hour, less than 2 hours, less than 3 hours, less than 4 hours, less than 5 hours, less than 6 hours, less than 7 hours, less than 8 hours, less than 9 hours, less than 10 hours, less than 11 hours, less than 12 hours, less than 18 hours, less than 1 day, less than 2 days, less than 3 days, less than 4 days, less than 5 days, less than 6 days, or less than 7 days prior to step (b) .11.The method of any one of claims 1-10, wherein the method further comprises monitoring the blood concentration of the CNI in the human subject before step (b) , wherein step (b) is performed when the blood concentration of the CNI is within a pre-determined range.12.The method of claim 11, wherein the CNI is cyclosporine and the pre-determined range is at least 25 ng / ml to about 2000 ng / ml; or wherein the CNI is tacrolimus, and the pre-determined range is at least 1 ng / ml to about 100 ng / ml.13.The method of claim 11 or 12, wherein the blood concentration is blood trough concentration.14.The method of claim 13, wherein the CNI is cyclosporine and the pre-determined range is at least 25 ng / ml to about 500 ng / ml; or wherein the CNI is tacrolimus, and the pre-determined range is at least 1 ng / ml to about 20 ng / ml.15.The method of any one of claims 1-14, wherein the CNI is administered intravenously and / or orally.16.The method of claim 15, wherein the CNI is administered intravenously by continuous infusion, or an infusion for about 2 to about 6 hours, optionally at a frequency of once daily or twice daily.17.The method of claim 15, wherein the CNI is administered orally with an effective amount of a formulation comprising cyclosporine liquid, cyclosporine capsules, tacrolimus liquid, immediate-release tacrolimus capsules, and / or extended-release tacrolimus capsules; optionally the CNI is administered at a frequency of once daily or twice daily.18.The method of any one of claims 1-17, wherein the method further comprises administering an effective amount of the CNI to the human subject after step (b) , wherein the CNI is administered intravenously and / or orally.19.The method of claim 18, wherein the effective amount of the CNI is administered to the human subject orally after step (b) .20.The method of claim 18 or 19, wherein the effective amount of the CNI is administered to the human subject after step (b) to maintain a blood trough concentration within a pre-determined range over a period of time.21.The method of claim 20, wherein the CNI is cyclosporine, and the pre-determined range is at least 25 ng / ml to about 500 ng / ml; or wherein the CNI is tacrolimus, and the pre-determined range is at least 1 ng / ml to about 20 ng / ml.22.The method of claim 20 or 21, wherein the period of time is at least 7 days, at least 15 days, at least 20 days, at least 1 month, at least 2 months, or at least 3 months.23.The method of any one of claim 18-22, wherein the CNI is cyclosporine, wherein the cyclosporine is administered at a dose level of about 1 mg / kg / day to about 25 mg / kg / day or about 0.5 mg / kg / twice a day to about 12.5 mg / kg / twice a day; or wherein the CNI is tacrolimus, wherein the tacrolimus is administered at a dose level of about 0.01 mg / kg / day to about 1 mg / kg / day.24.The method of any one of claim 18-23, wherein the effective amount of the CNI is administered to the human subject at least 1 hour, at least 2 hours, at least 3 hours, at least 6 hours, at least 12 hours, at least 18 hours, at least 1 day after step (b) .25.The method of any one of claims 1-24, wherein the method further comprises monitoring the blood concentration of one or more cytokines (e.g., IL-15, IL-7, IL-2, or a combination thereof) .26.The method of any one of claims 1-25, wherein the modified immune cells are allogeneic cells isolated from a donor for being administered to the human subject.27.The method of any one of claims 1-26, wherein the immune clearance of the modified immune cells is through host immune cell-mediated cytotoxicity, e.g., host T cell-mediated cytotoxicity.28.The method of any one of claims 1-27, wherein proliferation of the modified immune cells is increased as compared to that when the human subject is subject to lymphodepletion.29.The method of any one of claims 1-28, wherein T cell activation level in the human subject (e.g. in the peripheral blood or spleen) is decreased as compared to that when the human subject is subject to lymphodepletion.30.The method of any one of claims 1-29, wherein the modified immune cells are natural killer (NK) cells, T cells, NKT cells, monocytes, dendritic cells, macrophages, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) , B cells, or a combination thereof.31.The method of claim 30, wherein the modified immune cells express a chimeric antigen receptor (CAR) .32.The method of claim 30 or 31, wherein the modified immune cells are CAR-NK cells or CAR-T cells.33.The method of any one of claims 30-32, wherein the CAR specifically binds to a target antigen.34.The method of claim 33, wherein the target antigen is selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, and PD-L2.35.The method of any one of claims 30-34, wherein the modified immune cells are modified natural killer (NK) cells that do not comprise any modification that renders the modified NK cells resistant to the CNI; or wherein the modified immune cells are modified T cells that comprise one or more modifications that render the modified T cells resistant to the CNI.36.The method of any one of claims 30-35, wherein the modified immune cells are modified NK cells, wherein the modified NK cells express an armor protein (e.g., a cytokine) that stimulates NK cell proliferation.37.The method of any one of claims 2-36, wherein the human subject has a disease or disorder.38.The method of claim 1 or 37, wherein the disease or disorder is a cancer, an autoimmune disease, or an infection.39.The method of claim 38, wherein the human subject has a bone-marrow-related disease or disorder, optionally the bone-marrow-related disease or disorder is a bone-marrow-related autoimmune disease, e.g., a B-cell regulated autoimmune disease.40.The method of claim 38, wherein the human subject has a cancer, optionally the cancer is a hematological cancer, e.g., a lymphoma or a leukemia.41.The method of claim 40, wherein the human subject has acute lymphoblastic leukemia, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, Hodgkin lymphoma, non-Hodgkin lymphoma, Waldenstrom macroglobulinemia, follicular lymphoma, B-cell lymphoma, cutaneous T-cell lymphoma, multiple myeloma, and / or plasmacytoma.42.The method of claim 38, wherein the human subject has an autoimmune disease, optionally the autoimmune disease is systemic lupus erythematosus (SLE) , rheumatoid arthritis, Wegener's disease, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) , thrombotic throbocytopenic purpura (TTP) , autoimmune thrombocytopenia, multiple sclerosis (MS) , Systemic sclerosis / scleroderma (SSc) , Idiopathic inflammatory myopathy (IIM) , antiphospholipid syndrome (APS) , psoriasis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathies, myasthenia gravis (MG) , ANCA (Anti-neutrophil cytoplastic antibodies) associated vasculitis, diabetes mellitus, Reynaud's syndrome, Sjorgen's syndrome, Neuromyelitis Optica (NMO) , glomerulonephritis, or myelin oligodendrocyte glycoprotein-IgG associated disorders (MOGAD) .

Images