A method for preparing an antibody with site-specific modifications

Abstract

Provided is a method for preparing an antibody with site-specific modifications, the antibody with site-specific modifications prepared by the method, the use of the antibody with site-specific modifications and use of amino acid or compound with imidazolyl or a salt thereof in the preparation of an antibody with site-specifications. As compared with conventional conjugation method, the homogeneity of ADCs produced from the method of the present application can be dramatically improved. Specifically, the time of the method for preparing ADC with D2 is shorter and the homogeneity of ADC with D2 is improved. The homogeneity of ADC with D4 is improved by the method in the present disclosure.

Description

A METHOD FOR PREPARING AN ANTIBODY WITH SITE-SPECIFIC MODIFICATIONS

[0001] CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This application claims the priority to PCT Application No. PCT / CN2024 / 143980, filed on December 30, 2024. The contents of the prior PCT applications are considered as a part of the present disclosure and are incorporated herein in its entiretyTECHNICAL FIELD

[0003] The disclosure relates to a method for preparing an antibody with site-specific modifications.BACKGROUND

[0004] The statements in this section merely provide background information related to the present disclosure and do not necessarily constitute prior art.

[0005] Site-specific modification approaches have been extensively employed in the development of protein-based technologies. The modification of proteins has emerged as a valuable approach to interrogate and to intervene in biological systems. A protein modification approach, without altering the structure or activity of the protein, is crucial to the development of protein-drug conjugates, including antibody-drug conjugates (ADCs) .

[0006] Generally, antibody conjugation to cytotoxic agents commonly involves conjugation to exposed residues including lysines or reduction of disulfide bonds to expose free interchain cysteines on a therapeutic IgG (Immunoglobulin G) antibody. There are other, more recent approaches that introduce conjugation sites to the mAb such as site-specific glycan conjugation, cysteine engineering, incorporation of unnatural amino acids and coupling short peptide tags to drug-linkers. There are typically 80 lysine residues on an antibody; however, less than ten residues are chemically accessible for conjugation. Cysteine conjugation eventuates in the reduction of four interchain disulfide bonds. These bonds are reduced under specific conditions and subsequently result in two, four, six or eight exposed sulfhydryl groups. Both Cys and Lys conjugation methods result in heterogeneous mixtures. ( “Advances and Limitations of Antibody Drug Conjugates for Cancer” . Biomedicines. 2021 Aug; 9 (8) : 872. ) .

[0007] The drug-antibody ratio (DAR) , or number of drug molecules conjugated to a single ADC, is very important for the determination of efficacy of ADCs. DAR widely varies and depends on other ADC variables. The DAR values are also dependent on the site of conjugation and the use of light or heavy conjugated chains. The DAR value influences the effectiveness of the medicine due to the depression in potency caused by low drug loading, while elevated drug loading can impact toxicity and pharmacokinetics ( “Introduction to Antibody-Drug Conjugates” . Antibodies (Basel) . 2021 Dec; 10 (4) : 42. ) .

[0008] A number of methods have been developed to improve the homogeneity of ADCs. For example, Synaffix’s technology GlycoConnectTM (US2015 / 0320882, synaffix. com / platform / technology / ) has been developed to covert an antibody into a stably conjugated ADC with DAR2, DAR4 or even DAR1 and DAR6, by modifying the native antibody glycan through a three-step process: enzyme digestion, enzyme mediated ligation and metal-free click chemistry

[0009] US20210040145 discloses a 14-amino acid peptide Tub-tag used to the C-terminus of any protein of interest (POI) and catalyzes the addition of a variety of different tyrosine derivatives. Taking advantage of this enzyme, Tub-tag technology repurposed tubulin-tyrosine ligase for the attachment of functional moieties at the C-terminus of antibody to homogeneously generate antibody conjugates with DAR 2.

[0010] However, those technologies suffer from several drawbacks, such as immunogenicity risk, complicated purification, and / or high cost.

[0011] Therefore, there is still a need for site-specific modification of an antibody.SUMMARY

[0012] For the above-mentioned purpose, provided herein is a method for preparing an antibody with site-specific modifications. By the method in the present disclosure, the present disclosure provides many kinds of ADCs with high homogeneity. Specifically, the time of the method for preparing ADC with D2 is shorter and the homogeneity of ADC with D2 is improved. The homogeneity of ADC with D4 is improved by the method in the present disclosure.

[0013] In one aspect, provided herein is a method for preparing an antibody with site-specific modifications, the method comprises any one of the following Groups I-IV, the Group I comprises step (R1) and step (O1) in order; the Group II comprises step (R1’ ) and step (O1’ ) in order; the Group III comprises step (R1) and step (C1) in order; or the Group IV comprises step (R1’ ) and step (C1’ ) ,

[0014] wherein,

[0015] (R1) contacting a first reductant or salt thereof and an antibody in a buffer system in the presence of transition metal ions to selectively reduce interchain disulfide bonds within the antibody to afford the antibody bearing reduced thiol groups;

[0016] (R1’ ) contacting a first reductant or salt thereof and an antibody in a buffer system to reduce interchain disulfide bonds within the antibody to afford the antibody bearing reduced thiol groups;

[0017] (O1) introducing an oxidant to selectively re-oxidize the reduced thiol groups resulted from step (R1) , wherein, reaction system in step (O1) comprises additive, optionally, the additive has binding capacity for the transition metal ions, and the binding capacity of the additive for the transition metal ions is stronger than that of a single hydroxyl group and weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions, optionally, the additive comprises amino acid or compound with imidazolyl;

[0018] (O1’ ) introducing an oxidant to selectively re-oxidize the reduced thiol groups resulted from step step (R1’ ) , wherein, reaction system in step (O1) comprises additive, optionally, the additive has binding capacity for the transition metal ions, and the binding capacity of the additive for the transition metal ions is stronger than that of a single hydroxyl group and weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions, between step (R1’ ) and step (O1’ ) ; adding transition metal ions;

[0019] (C1) incubating a first conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (R1) , wherein, the first conjugating group is a first linker-payload or a first thiobridge reagent, optionally, the first thiobridge reagent bears the first linker-payload or reactive groups, wherein, reaction system in step (C1) comprises additive, optionally, the additive has binding capacity for the transition metal ions, and the binding capacity of the additive for the transition metal ions is stronger than that of a single hydroxyl group and weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions, optionally, the additive comprises amino acid or compound with imidazolyl;

[0020] (C1’ ) incubating a first conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (R1’ ) , wherein, the first conjugating group is a first linker-payload or a first thiobridge reagent, optionally, the first thiobridge reagent bears the first linker-payload or reactive groups, wherein, reaction system in step (C1’ ) comprises additive, optionally, the additive has binding capacity for the transition metal ions, and the binding capacity of the additive for the transition metal ions is stronger than that of a single hydroxyl group and weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions, optionally, the additive comprises amino acid or compound with imidazolyl or a salt thereof; between step (R1’ ) and step (C1’ ) , adding transition metal ions.

[0021] By introducing the additive with suitable binding capacity for transition metal ions, specifically, by introducing the additive comprising amino acid or compound with imidazolyl or a salt thereof in the reaction system in or before step (O1) , (O1’ ) , (C1) and / or (C1’ ) , the homogeneity of an antibody with site-specific modifications is improved.

[0022] In one aspect, provided herein is an antibody with site-specific modifications prepared by the method above.

[0023] In some embodiments, the antibody with site-specific modifications is conjugated with one, two, three or four kinds of conjugating groups.

[0024] In one aspect, provided herein is a pharmaceutical composition comprising the antibody with site-specific modifications prepared by the method above, the antibody with site-specific modifications according to the present disclosure, and at least one pharmaceutically acceptable ingredient.

[0025] In one aspect, provided herein is the use of the antibody with site-specific modifications prepared by the method above, the antibody with site-specific modifications according to the present disclosure or the pharmaceutical composition according to the present disclosure in the manufacture of a therapeutic agent for preventing, diagnosing, or treating a disease.

[0026] In one aspect, provided herein is a method of preventing or treating a disease in a subject in need thereof, comprising administrating to the subject a therapeutically effective amount of the antibody with site-specific modifications prepared by the method above, the antibody with site-specific modifications according to the present disclosure or the pharmaceutical composition according to the present disclosure.

[0027] In one aspect, provides herein is use of amino acid or compound with imidazolyl or a salt thereof in the preparation of an antibody with site-specifications, optionally, the amino acid or compound with imidazolyl comprises at least one of the groups of histidine, imidazole, glutamic acid or Asparic acid, optionally, the antibody with site-specific modifications is an antibody drug conjugate (ADC) .BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0028] The following is a brief description of the drawings, which are presented for the purposes of illustrating the exemplary embodiments disclosed herein and not for the purposes of limiting the same.

[0029] Figures 1 show HIC-HPLC chromatogram of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 2 conjugate, prepared by examples I. 1-I. 2 and comparative example I. 1.

[0030] Figure 2 shows HIC-HPLC chromatogram of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugate prepared by examples III. 1-III. 2 and comparative example III. 1.

[0031] Figure 3 shows HIC-HPLC chromatogram of Farletuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugate prepared by examples III. 3-III. 4 and comparative example III. 2.

[0032] Figure 4 shows HIC-HPLC chromatogram of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugate prepared by examples III. 5-III. 6.

[0033] Figure 5 shows HIC-HPLC chromatogram of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugate prepared by examples III. 7-III. 9.

[0034] Figure 6 shows HIC-HPLC chromatogram of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugate prepared by example III. 10-III. 12.

[0035] Figure 7 A shows HIC-HPLC chromatogram of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugate prepared by examples III. 13 and example III. 14; B shows HIC-HPLC of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 [MC-GGFG-DXd] 2 conjugate prepared by example III. 13; C shows HIC-HPLC of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 [MC-MMAF] 2 conjugate prepared by example III. 14.

[0036] Figures 8 show HIC-HPLC chromatogram of Trastuzumab Mut- [MC-VC-PAB-MMAE] 2 conjugate, prepared by examples I. 3.

[0037] Figures 9 show HIC-HPLC chromatogram of Trastuzumab Mut- [MC-VC-PAB-MMAE] 2 conjugate, prepared by examples II. 1.

[0038] Figures 10 show HIC-HPLC chromatogram of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 2 conjugate, prepared by examples II. 2.

[0039] Figures 11 show HIC-HPLC chromatogram of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 2 conjugate, prepared by comparative example II. 1.DETAILED DESCRIPTION

[0040] The present disclosure is explained in greater detail below. This description is not intended to be a detailed catalog of all the different ways in which the invention may be implemented, or all the features that may be added to the instant invention. For example, features illustrated with respect to one embodiment may be incorporated into other embodiments, and features illustrated with respect to a particular embodiment may be deleted from that embodiment. In addition, numerous variations and additions to the various embodiments suggested herein will be apparent to those skilled in the art in light of the instant disclosure which do not depart from the instant invention. Hence, the following description is intended to illustrate some particular embodiments of the invention, and not to exhaustively specify all permutations, combinations and variations thereof.

[0041] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the disclosure pertains. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice for testing of the present disclosure, the preferred materials and methods are described herein. In describing and claiming the present disclosure, the following terminology will be used.

[0042] Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in connection with the present disclosure shall have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art. Further, unless otherwise required by context, singular terms shall include pluralities and plural terms shall include the singular. More specifically, as used in this specification and the appended claims, the singular forms “a, ” “an” and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “an antibody” includes a plurality of antibodies; reference to “atransition metal ion” includes mixtures of transition metal ions, and the like. In this application, the use of “or” means “and / or” unless stated otherwise.

[0043] Throughout this disclosure, unless the context requires otherwise, the words “comprise” , “comprises” , “comprising” , “contain” , “contains” and “containing” will be understood to imply the inclusion of a stated step or element or group of steps or elements but not the exclusion of any other step or element or group of steps or elements. By “consisting of” is meant including, and limited to, whatever follows the phrase “consisting of” . Thus, the phrase “consisting of” indicates that the listed elements are required or mandatory, and that no other elements may be present.

[0044] As used herein, the term “room temperature” refers to 23℃±2℃, 25℃±5℃ or 20℃±5℃.

[0045] For the antibody with site-specific modifications, which could be antibody-drug conjugates (ADCs) , a mixture of ADCs will be generated by the conventional conjugation processes or the method of the present disclosure. In general, one antibody molecule belonging to IgG1 or IgG4 subclass has 4 inter-chain disulfide bonds, each of which is formed with two -SH groups. The antibody molecule can be subjected to partial or complete reduction of one or more interchain disulfide bonds to form 2n (n is an integer selected from 1, 2, 3 or 4) reactive -SH groups, and thus, the number of drugs (or payloads) coupling to a single antibody molecule is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8. In accordance with the number of drugs coupling to a single antibody molecule, the different conjugates containing different number of drug molecules are denominated as D1, D2, D4, D4+D2, D4+D1, D2+D2, D2+D1, D4+D2+D2, D4+D2+D1, D4+D1+D2, D4+D1+D1, D2+D2+D2, D2+D2+D1, D2+D1+D2, D2+D1+D1, D1+D4+D2, D1+D4+D1, D1+D2+D2, D1+D2+D1, D2+D4+D2, D2+D4+D1. In some embodiments, the engineered antibody can be subjected to partial or complete reduction of one or more interchain disulfide bonds or cysteine to form more amount of the reactive -SH groups, such 9 or 10. Accordingly, ACD with D1+D4+D2+D1, D1+D4+D1+D1, D1+D2+D2+D1, D1+D2+D1+D1, D1+D4+D2+D2, D1+D4+D1+D2, D1+D2+D2+D2, D1+D2+D1+D2, D2+D4+D2+D1, D2+D4+D1+D1, D2+D2+D2+D1, D2+D2+D1+D1, D2+D4+D2+D2, D2+D4+D1+D2, D2+D2+D2+D2 or D2+D2+D1+D2 could be prepared. And thus, the “homogeneity” of antibody-drug conjugates is used to describe the property of dominance of one specific type of antibody-drug conjugate (i.e., one type selected from D1, D2, D4, D4+D2, D4+D1, D2+D2, D2+D1, D4+D2+D2, D4+D2+D1, D4+D1+D2, D4+D1+D1, D2+D2+D2, D2+D2+D1, D2+D1+D2, D2+D1+D1, D1+D4+D2, D1+D4+D1, D1+D2+D2, D1+D2+D1, D2+D4+D2, D2+D4+D1, D1+D4+D2+D1, D1+D4+D1+D1, D1+D2+D2+D1, D1+D2+D1+D1, D1+D4+D2+D2, D1+D4+D1+D2, D1+D2+D2+D2, D1+D2+D1+D2, D2+D4+D2+D1, D2+D4+D1+D1, D2+D2+D2+D1, D2+D2+D1+D1, D2+D4+D2+D2, D2+D4+D1+D2, D2+D2+D2+D2 or D2+D2+D1+D2 conjugates) in one given mixture of antibody-drug conjugates.

[0046] Drug to Antibody Ratio (DAR) of ADC is the average number of drugs linked to each antibody. DAR is a key property used to measures the quality of ADC because it can significantly affect ADC efficacy. The DAR distribution (D1, D2, D4, D4+D2, D4+D1, D2+D2, D2+D1, D4+D2+D2, D4+D2+D1, D4+D1+D2, D4+D1+D1, D2+D2+D2, D2+D2+D1, D2+D1+D2, D2+D1+D1, D1+D4+D2, D1+D4+D1, D1+D2+D2, D1+D2+D1, D2+D4+D2, D2+D4+D1, D1+D4+D2+D1, D1+D4+D1+D1, D1+D2+D2+D1, D1+D2+D1+D1, D1+D4+D2+D2, D1+D4+D1+D2, D1+D2+D2+D2, D1+D2+D1+D2, D2+D4+D2+D1, D2+D4+D1+D1, D2+D2+D2+D1, D2+D2+D1+D1, D2+D4+D2+D2, D2+D4+D1+D2, D2+D2+D2+D2 or D2+D2+D1+D2) could reflect the homogeneity of the ADC.

[0047] Drug loading is represented by the number of drug moieties per antibody in a molecule of ADC. For some antibody-drug conjugates, the drug loading may be limited by the number of attachment sites on the antibody. For example, where the attachment is a cysteine thiol, as in certain exemplary embodiments described herein, the drug loading may range from 0 to 8 drug moieties per antibody. In certain embodiments, the average drug loading for an antibody-drug conjugate ranges from 1 to about 8;from about 2 to about 6; or from about 3 to about 5.

[0048] As used herein, the term “D0” or “the ADC with D0” refers to the ADC in which the average number of drugs coupling to a single antibody molecule is about zero.

[0049] As used herein, the term “D1” or “the ADC with D1” refers to DAR about 1, it means about one drug molecules (e.g., 0.5, 1.0, 1.4 molecules) are coupled to one single antibody molecule on average. Drug molecules may be coupled to -SH groups generated by a mutant cysteine obtained by asymmetrical single-point mutation on a bispecific antibody or reduction of the disulfide bond between heavy and light chains or heavy and heavy chains via linkers. In some embodiments, D1 refers to the ADC in which one of the first thiobridge group bearing the linker-payload re-bridges two thiol groups of one single antibody molecule. In some embodiments, D1 refers to the ADC in which one of the first linker-payload is coupled to one single antibody molecule.

[0050] As used herein, the term “D2” or “the ADC with D2” refers to DAR about 2, it means about two drug molecules (e.g., 1.5, 2.0, 2.4 molecules) are coupled to one single antibody molecule on average. Drug molecules may be coupled to -SH groups generated by two mutant cysteines obtained by symmetrical single-point mutation on the antibody or reduction of the interchain disulfide bonds between heavy and light chains and / or heavy and heavy chains via linkers. In some embodiments, D2 refers to the ADC in which two of the linker-payloads are coupled to one single antibody molecule. In some embodiments, D2 refers ADC in which two of the first thiobridge group bearing the linker-payload re-bridges two thiol groups of one single antibody molecule.

[0051] As used herein, the term “D4” or “the ADC with D4” refers to the ADC in which about four drug molecules (e.g., 3.5, 4.0, 4.4 molecules) are coupled to one single antibody molecule on average, where the drug molecules may be coupled to -SH groups generated by reduction of the interchain disulfide bonds. In some embodiments, D4 refers to the ADC in which four of the linker-payloads are coupled to one single antibody molecule.

[0052] As used herein, the term “D6” or “the ADC with D6” refers to the ADC in which about six drug molecules (e.g., 5.5, 6.0, 6.4 molecules) are coupled to one single antibody molecule on average, where the drug molecules may be coupled to six -SH groups generated by reduction of three disulfide bond. In some embodiments, D6 refers to the ADC in which six of the linker-payloads are coupled to one single antibody molecule.

[0053] As used herein, the term “D8” refers to the ADC in which about eight drug molecules (e.g., 7.5, 8.0, 8.4 molecules) are coupled to one single antibody molecule on average, where the drug molecules may be coupled to eight-SH groups generated by reduction of four disulfide bond. In some embodiments, D8 refers to the ADC in which eight of the linker-payloads are coupled to one single antibody molecule.

[0054] As used herein, the term “about” refers to a quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length that varies by as much as 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1%to a reference quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length. In particular embodiments, the terms “about” when preceding a numerical value indicates the value plus or minus a range of 50%, 30%, 15%, 10%, 5%, or 1%.

[0055] In some embodiments, by conjugating two different linker-payloads to a single antibody to form a bi-payload ADC. According to the DAR value of each linker-payload, the bi-payload ADC may be with two DAR values, such as D6 for first linker-payload and D2 for second linker-payload. The DAR value of di-payload ADC in present disclosure is referred to as DN+DM, of which N denotes the average number of the first linker-payload coupled to one single antibody molecule on average, and M denotes the average number of the second linker-payload coupled to one single antibody molecule on average. The meaning of a three-payload ADC and a four-payload ADC are analogous with the bi-payload.

[0056] In some embodiments, “D4+D2” or “the ADC with D4+D2” refers to the ADC with two kinds of drugs wherein the one kind drug comprises four drug molecules and the other kind drug comprises two drug molecules. Specifically, “D4+D2” or “the ADC with D4+D2” refers to the ADC in which four of the first linker-payloads and two of the second linker-payloads are coupled to one single antibody molecule, or, refers to the ADC in which four of the first linker-payloads and two of the second thiobridge group bearing the linker-payload re-bridges two thiol groups are coupled to one single antibody molecule.

[0057] In some embodiments, “D2+D2” or “the ADC with D2+D2” refers to the ADC with two kinds of drugs wherein the one kind drug comprises two drug molecules and the other kind drug comprises two drug molecules. Specifically, “D2+D2” or “the ADC with D2+D2” refers to the ADC in which two of the first thiobridge group bearing the linker-payload re-bridges two thiol groups and two of the second linker-payloads are coupled to one single antibody molecule, or, refers to the ADC in which two of the first linker-payloads and two of the second linker-payloads are coupled to one single antibody molecule, or, refers to the ADC in which two of the first linker-payloads and two of the second thiobridge group bearing the linker-payload re-bridges two thiol groups are coupled to one single antibody molecule.

[0058] Method for preparing an antibody with site-specific modifications

[0059] Provided herein is a method for preparing an antibody with site-specific modifications. By the method in the present disclosure, the present disclosure provides many kinds of ADCs with high homogeneity. Specifically, the time of the method for preparing ADC with D2 is shorter and the homogeneity of ADC with D2 is improved. The homogeneity of ADC with D4 is improved by the method in the present disclosure.

[0060] The present disclosure provides a method for preparing an antibody with site-specific modifications, the method comprises any one of the following Groups I-IV, the Group I comprises step (R1) and step (O1) in order; the Group II comprises step (R1’ ) and step (O1’ ) in order; the Group III comprises step (R1) and step (C1) in order; or the Group IV comprises step (R1’ ) and step (C1’ ) ,

[0061] wherein,

[0062] (R1) contacting a first reductant or salt thereof and an antibody in a buffer system in the presence of transition metal ions to selectively reduce interchain disulfide bonds within the antibody to afford the antibody bearing reduced thiol groups;

[0063] (R1’ ) contacting a first reductant or salt thereof and an antibody in a buffer system to reduce interchain disulfide bonds within the antibody to afford the antibody bearing reduced thiol groups;

[0064] (O1) introducing an oxidant to selectively re-oxidize the reduced thiol groups resulted from step (R1) , wherein, reaction system in step (O1) comprises additive, optionally, the additive has binding capacity for the transition metal ions, and the binding capacity of the additive for the transition metal ions is stronger than that of a single hydroxyl group and weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions;

[0065] (O1’ ) introducing an oxidant to selectively re-oxidize the reduced thiol groups resulted from step (R1’ ) , wherein, reaction system in step (O1) comprises additive, optionally, the additive has binding capacity for the transition metal ions, and the binding capacity of the additive for the transition metal ions is stronger than that of a single hydroxyl group and weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions, between step (R1’ ) and step (O1’ ) , adding transition metal ions;

[0066] (C1) incubating a first conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (R1) , wherein, the first conjugating group is a first linker-payload or a first thiobridge reagent, optionally, the first thiobridge reagent bears the first linker-payload or reactive groups, wherein, reaction system in step (C1) comprises additive, optionally, the additive has binding capacity for the transition metal ions, and the binding capacity of the additive for the transition metal ions is stronger than that of a single hydroxyl group and weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions;

[0067] (C1’ ) incubating a first conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (R1’ ) , wherein, the first conjugating group is a first linker-payload or a first thiobridge reagent, optionally, the first thiobridge reagent bears the first linker-payload or reactive groups, wherein, reaction system in step (C1’ ) comprises additive, optionally, the additive has binding capacity for the transition metal ions, and the binding capacity of the additive for the transition metal ions is stronger than that of a single hydroxyl group and weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions; between step (R1’ ) and step (C1’ ) , adding transition metal ions.

[0068] In some embodiments, the additive could be introduced in step (R1) or in step (R1) ’ . In some embodiments, the additive could be introduced in step (O1) or in step (O1) ’ . In some embodiments, the additive could be introduced in step (C1) or in step (C1) ’ . In some embodiments, the additive could be introduced between step (R1) and step (O1) , between step (R1’ ) and step (O1’ ) , between step (R1) and step (C1) or between step (R1’ ) and step (C1’ ) .

[0069] In some embodiments, the additive has binding capacity for the transition metal ions, and the binding capacity of the additive for the transition metal ions is stronger than that of a single hydroxyl group and much weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions.

[0070] In some embodiments, the binding capacity of the additive for the transition metal ions is 99.99999999999%weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions. In some embodiments, the binding capacity of the additive for the transition metal ions is 99.9999999999%weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions. In some embodiments, the binding capacity of the additive for the transition metal ions is 99.999999999%weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions. In some embodiments, the binding capacity of the additive for the transition metal ions is 99.99999999%weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions. In some embodiments, the binding capacity of the additive for the transition metal ions is 99.9999999%weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions. In some embodiments, the binding capacity of the additive for the transition metal ions is 99.999999%weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions. In some embodiments, the binding capacity of the additive for the transition metal ions is 99.99999%weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions. In some embodiments, the binding capacity of the additive for the transition metal ions is 99.9999%weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions. In some embodiments, the binding capacity of the additive for the transition metal ions is 99.999%weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions. In some embodiments, the binding capacity of the additive for the transition metal ions is 99.99%weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions. In some embodiments, the binding capacity of the additive for the transition metal ions is 99.9%weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions. In some embodiments, the binding capacity of the additive for the transition metal ions is 99%weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions.

[0071] In some embodiments, the additive comprises amino acid or compound with imidazolyl or a salt thereof.

[0072] As used herein, the term “amino acid” or “amino acids” refers to a class of amphoteric organic compounds containing basic amino groups and acidic carboxyl groups, which is the basic building blocks of biologically functional macromolecular proteins. The amino acids in the present disclosure refer to natural amino acids, non-natural amino acids and amino acid analogs.

[0073] In some embodiments, the additive comprises at least one of the groups of alanine, leucine, arginine, lysine, asparagines, methionine, aspartic acid, phenylalanine, praline, glutamine, serine, glutamic acid, threonine, glycine, tryptophan, histidine, tyrosine, isoleucine, valine or imidazole.

[0074] In some embodiments, the additive comprises at least one of the groups of histidine, imidazole, glutamic acid or asparic acid.

[0075] By introducing the additive comprising amino acid or compound with imidazolyl or a salt thereof in the reaction system in or before step (O1) , (O1’ ) , (C1) and / or (C1’ ) , the homogeneity of an antibody with site-specific modifications is improved.

[0076] In some embodiments, the concentration of the additive in step (O1) , in step (O’ ) , in step (C1) and / or in step (C1’ ) is 0.1 mM-50 mM. In some embodiments, the concertation of the additive in step (O1) , in step (C1) and / or in step (C1’ ) is 1 mM-5 mM. In some embodiments, the concertation of the additive in step (O1) , in step (C1) and / or in step (C1’ ) is 1 mM-2 mM.

[0077] In some embodiments, the concentration of the additive in step (O1) , in step (O’ ) , in step (C1) and / or in step (C1’ ) is 0.1 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM, 1 mM, 1.2 mM, 1.4 mM, 1.6 mM, 1.8 mM, 2.0 mM, 2.2 mM, 2.4 mM, 2.6 mM, 2.8 mM, 3.0 mM, 3.2 mM, 3.4 mM, 3.6 mM, 3.8 mM, 4.0 mM, 4.2 mM, 4.4 mM, 4.6 mM, 4.8 mM, 5.0 mM, 6.0 mM, 7.0 mM, 8.0 mM, 9.0 mM, 10.0 mM, 12.0 mM, 14.0 mM, 16.0 mM, 18.0 mM, 20.0 mM, 22.0 mM, 24.0 mM, 26.0 mM, 28.0 mM, 30.0 mM, 32.0 mM, 34.0 mM, 36.0 mM, 38.0 mM, 40.0 mM, 42.0 mM, 44.0 mM, 46.0 mM, 48.0 mM or 50 mM.

[0078] In some embodiments, when the first thiobridge reagent bears the reactive groups, the step (C1) and / or the step (C1’ ) comprises the following step, introducing the first thiobridge reagent bearing the reactive groups to re-bridge the reduced thiol groups resulted from step (R1) , then, incubating the first linker-payload in the buffer system to react with the reactive groups of the thiobridge group.

[0079] As used herein, the term “disulfide bond” refers to a covalent bond with the structure R-S-S-R'. The amino acid cysteine comprises a thiol group that can form a disulfide bond with a second thiol group, for example from another cysteine residue. The disulfide bond can be formed between the thiol groups of two cysteine residues residing respectively on the two polypeptide chains, thereby forming an interchain bridge or interchain bond.

[0080] As used herein, the term “antibody” refers to any immunoglobulin, monoclonal antibody, polyclonal antibody, multispecific antibody, or bispecific (bivalent) antibody that binds to a specific antigen. A native intact antibody comprises two heavy chains and two light chains. Each heavy chain consists of a variable region ( “HCVR” ) and a first, second, and third constant region (CH1, CH2 and CH3) , while each light chain consists of a variable region ( “LCVR” ) and a constant region (CL) . Mammalian heavy chains are classified as α, δ, ε, γ and μ, and mammalian light chains are classified as λ or κ. The antibody has a "Y" shape, with the stem of the Y consisting of the second and third constant regions of two heavy chains bound together via disulfide bonding. Each arm of the Y includes the variable region and first constant region of a single heavy chain bound to the variable and constant regions of a single light chain. The variable regions of the light and heavy chains are responsible for antigen binding. The variable regions in both chains generally contain three highly variable loops called the complementarity determining regions (CDRs) (light (L) chain CDRs including LCDR1, LCDR2, and LCDR3, heavy (H) chain CDRs including HCDR1, HCDR2, HCDR3) . CDR boundaries for antibodies may be defined or identified by the conventions of Kabat, Chothia, or Al-Lazikani (Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 273 (4) , 927 (1997) ; Chothia, C. et al., J Mol Biol. Dec 5; 186 (3) : 651-63 (1985) ; Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 196, 901 (1987) ; Chothia, C. et al., Nature. Dec 21-28; 342 (6252) : 877-83 (1989) ; Kabat E.A. et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) . The three CDRs are interposed between flanking stretches known as framework regions (FRs) , which are more highly conserved than the CDRs and form a scaffold to support the hypervariable loops. Each HCVR and LCVR comprises four FRs, and the CDRs and FRs are arranged from amino terminus to carboxy terminus in the order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The constant regions of the heavy and light chains are not involved in antigen binding, but exhibit various effector functions. Antibodies are assigned to classes based on the amino acid sequence of the constant region of their heavy chain. The five major classes or isotypes of antibodies are IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, which are characterized by the presence of α, δ, ε, γ, and μ heavy chains, respectively. Several of the major antibody classes are divided into subclasses such as IgG1 (γ1 heavy chain) , IgG2 (γ2 heavy chain) , IgG3 (γ3 heavy chain) , IgG4 (γ4 heavy chain) , IgA1 (α1 heavy chain) , or IgA2 (α2 heavy chain) .

[0081] The reductant, optionally, with the transition metal ions, has reducibility and reduces the disulfide bond of the antibody. Optionally, the reductant selectively reduces the interchain disulfide bonds in step (R1) , thus the antibody is selectively modified.

[0082] In some embodiments, in the method of the Group I and / or of the Group II, two or more than two of the interchain disulfide bonds of the antibody are reduced in step (R1) and / or in step (R1’ ) . In some embodiments, two, three or four of the interchain disulfide bonds of the antibody are reduced in step (R1) and / or in step (R1’ ) . In some embodiments, three of the interchain disulfide bonds of the antibody are reduced in step (R1’ ) . In some embodiments, in the method of the Group I and / or of the Group II, the amount of the interchain disulfide bonds of the antibody reduced in step (R1) and / or in step (R1’ ) is 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 or 4. In some embodiments, in the method of the Group I and / or of the Group II, the amount of the interchain disulfide bonds of the antibody reduced in step (R1) and / or in step (R1’ ) is the average number.

[0083] In some embodiments, the method of the Group I and / or of the Group II further comprises the following step,

[0084] (C1) incubating an amount of metal chelators and the first conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (O1) and / or from step (O1’ ) ;

[0085] or,

[0086] (R2) incubating a second reductant or salt thereof in the buffer system to reduce the interchain disulfide bond of the antibody resulted from step (O1) , optionally, reduce one of the interchain disulfide bond of the antibody resulted from step (O1) ;

[0087] (C2) incubating the first conjugating group to react with the reduced thiol groups of the reaction product resulted from step (R2) ;

[0088] wherein, incubating an amount of metal chelators in step (R2) or in step (C2) .

[0089] In some embodiments, the method of the Group I and / or of the Group II further comprises the following step,

[0090] (C1) incubating an amount of metal chelators and the first conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (O1) and / or from step (O1’ ) .

[0091] In some embodiments, by the method of the Group I comprising step (R1) , (O1) and (C1) in order and / or of the Group II comprising step (R1’ ) , (O1’ ) and (C1) in order, ADC with D1 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, or the first conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the first linker-payload.

[0092] In some embodiments, by the method of the Group I comprising step (R1) , (O1) and (C1) in order and / or of the Group II comprising step (R1’ ) , (O1’ ) and (C1) in order, ADC with D2 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first linker-payload.

[0093] In some embodiments, the method of the Group I further comprises the following step,

[0094] (R2) incubating a second reductant or salt thereof in the buffer system to reduce the interchain disulfide bond of the antibody resulted from step (O1) , optionally, reduce one of the interchain disulfide bond of the antibody resulted from step (O1) ;

[0095] (C2) incubating the first conjugating group to react with the reduced thiol groups of the reaction product resulted from step (R2) ;

[0096] wherein, incubating an amount of metal chelators in step (R2) or in step (C2) .

[0097] In some embodiments, by the method of the Group I comprising step (R1) , (O1) , (R2) and (C2) in order and / or of the Group II comprising step (R1’ ) , (O1’ ) (R2) and (C2) in order, ADC with D2 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, or the first conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the first linker-payload.

[0098] In some embodiments, by the method of the Group I comprising step (R1) , (O1) , (R2) and (C2) in order and / or of the Group II comprising step (R1’ ) , (O1’ ) , (R2) and (C2) in order, ADC with D4 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first linker-payload.

[0099] In some embodiments, the method of the Group I and / or of the Group II further comprises the following step,

[0100] (R2) incubating the reaction product from step (C1) and a second reductant or salt thereof in the buffer system to reduce the interchain disulfide bonds of the reaction product resulted from step (C1) , optionally, introducing the transition metal ions;

[0101] (C2) introducing a second conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (R2) , optionally, introducing the metal chelator; wherein, the second conjugating group is a second linker-payload or a second thiobridge reagent, optionally, the second thiobridge reagent bears the second linker-payload or the reactive groups.

[0102] In some embodiments, in the Group I and / or in the Group III, when introducing the transition metal ions in step (R2) , introducing the metal chelators to trap the excess transition metal ions in step (C2) .

[0103] In some embodiments, in the Group I and / or in the Group III, one, two or three of the interchain disulfide bonds of the antibody is reduced. In some embodiments, in the Group I and / or in the Group III, when the antibody is the engineered antibody I, one or two of the interchain disulfide bonds of the antibody is reduced.

[0104] In some embodiments, in step (R2) of the Group I and / or of the Group III, three of the interchain disulfide bonds of the antibody is reduced.

[0105] In some embodiments, by the method of the Group I comprising (R1) , (O1) , (C1) , (R2) and (C2) in order and / or of the Group II comprising (R1’ ) , (O1’ ) , (C1) , (R2) and (C2) , ADC with D2+D6 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first linker-payload, and the second conjugating group is the second linker-payload.

[0106] In some embodiments, by the method of the Group I comprising (R1) , (O1) , (C1) , (R2) and (C2) in order and / or of the Group II comprising (R1’ ) , (O1’ ) , (C1) , (R2) and (C2) , ADC with D1+D6 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, or the first conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the first linker-payload, and the second conjugating group is the second linker-payload.

[0107] In some embodiments, by the method of the Group I comprising (R1) , (O1) , (C1) , (R2) and (C2) in order and / or of the Group II comprising (R1’ ) , (O1’ ) , (C1) , (R2) and (C2) , ADC with D2+D3 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first linker-payload, and the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing the second linker-payload, or the second conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the second linker-payload.

[0108] In some embodiments, by the method of the Group I comprising (R1) , (O1) , (C1) , (R2) and (C2) in order and / or of the Group II comprising (R1’ ) , (O1’ ) , (C1) , (R2) and (C2) , ADC with D1+D3 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, or the first conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the first linker-payload, and the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing the second linker-payload, or the second conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the second linker-payload.

[0109] In some embodiments, in step (R2) of the Group I and / or of the Group II, when the antibody is the engineered antibody I, two of the interchain disulfide bonds of the antibody is reduced. In some embodiments, in step (R2) of the Group I and / or of the Group II, when introducing the transition metal ions, two of the interchain disulfide bonds of the antibody is reduced.

[0110] In some embodiments, by the method of the Group I comprising (R1) , (O1) , (C1) , (R2) and (C2) in order and / or of the Group II comprising (R1’ ) , (O1’ ) , (C1) , (R2) and (C2) , ADC with D2+D4 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first linker-payload, and the second conjugating group is the second linker-payload.

[0111] In some embodiments, by the method of the Group I comprising (R1) , (O1) , (C1) , (R2) and (C2) in order and / or of the Group II comprising (R1’ ) , (O1’ ) , (C1) , (R2) and (C2) , when the antibody is the engineered antibody I, ADC with D1+D4 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, or the first conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the first linker-payload, and the second conjugating group is the second linker-payload.

[0112] In some embodiments, by the method of the Group I comprising (R1) , (O1) , (C1) , (R2) and (C2) in order and / or of the Group II comprising (R1’ ) , (O1’ ) , (C1) , (R2) and (C2) , when the antibody is the engineered antibody I, ADC with D2+D2 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first linker-payload, and the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing the second linker-payload, or the second conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the second linker-payload.

[0113] In some embodiments, by the method of the Group I comprising (R1) , (O1) , (C1) , (R2) and (C2) in order and / or of the Group II comprising (R1’ ) , (O1’ ) , (C1) , (R2) and (C2) , when the antibody is the engineered antibody I, ADC with D1+D2 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, or the first conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the first linker-payload, and the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing the second linker-payload, or the second conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the second linker-payload.

[0114] In some embodiments, in step (R2) of the Group I and / or of the Group II, when introducing the transition metal ions, one of the interchain disulfide bonds of the antibody is reduced.

[0115] In some embodiments, by the method of the Group I comprising (R1) , (O1) , (C1) , (R2) and (C2) in order and / or of the Group II comprising (R1’ ) , (O1’ ) , (C1) , (R2) and (C2) , ADC with D2+D2 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first linker-payload, and the second conjugating group is the second linker-payload.

[0116] In some embodiments, by the method of the Group I comprising (R1) , (O1) , (C1) , (R2) and (C2) in order and / or of the Group II comprising (R1’ ) , (O1’ ) , (C1) , (R2) and (C2) , when the antibody is the engineered antibody I, ADC with D1+D2 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, or the first conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the first linker-payload, and the second conjugating group is the second linker-payload.

[0117] In some embodiments, by the method of the Group I comprising (R1) , (O1) , (C1) , (R2) and (C2) in order and / or of the Group II comprising (R1’ ) , (O1’ ) , (C1) , (R2) and (C2) , when the antibody is the engineered antibody I, ADC with D2+D1 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first linker-payload, and the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing the second linker-payload, or the second conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the second linker-payload.

[0118] In some embodiments, by the method of the Group I comprising (R1) , (O1) , (C1) , (R2) and (C2) in order and / or of the Group II comprising (R1’ ) , (O1’ ) , (C1) , (R2) and (C2) , when the antibody is the engineered antibody I, ADC with D1+D1 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, or the first conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the first linker-payload, and the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing the second linker-payload, or the second conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the second linker-payload.

[0119] In some embodiments, in the method of the Group III and / or of the Group IV, more than two of the interchain disulfide bonds of the antibody are reduced in step (R1) and / or in step (R1’ ) . In some embodiments, three of the interchain disulfide bonds of the antibody are reduced in step (R1) and / or in step (R1’ ) . In some embodiments, in the method of the Group III and / or of the Group IV, the amount of the interchain disulfide bonds of the antibody reduced in step (R1) and / or in step (R1’ ) is 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, or 3.3. In some embodiments, in the method of the Group III and / or of the Group IV, the amount of the interchain disulfide bonds of the antibody reduced in step (R1) and / or in step (R1’ ) is the average number.

[0120] In some embodiments, the method of the Group III and / or of the Group IV further comprises the following step, (E1) introducing an amount of metal chelators and the oxidant to re-oxidize the reduced thiol groups remained from step (C1) .

[0121] In some embodiments, by the method of the Group III comprising step (R1) , step (C1) and step (E1) and / or of the Group IV comprising step (R1’ ) , step (C1’ ) and step (E1) , ADC with D4 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first linker-payload.

[0122] In some embodiments, by the method of the Group III comprising step (R1) , step (C1) and step (E1) and / or of the Group IV comprising step (R1’ ) , step (C1’ ) and step (E1) , ADC with D2 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, or the first conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the first linker-payload.

[0123] In some embodiments, the method of the Group III and / or of the Group IV further comprises the following step, (C2) introducing an amount of metal chelators and a second conjugating group to react with the reduced thiol groups remained from step (C1) , wherein, the second conjugating group is a second linker-payload or a second thiobridge reagent, optionally, the second thiobridge reagent bears the second linker-payload or the reactive groups.

[0124] In some embodiments, when the second thiobridge reagent bears the reactive groups, the step (C2) comprises the following step, introducing the second thiobridge reagent bearing the reactive groups to re-bridge the reduced thiol groups remained from step (C1) , then, incubating the second linker-payload in the buffer system to react with the reactive groups of the thiobridge group.

[0125] In some embodiments, when the method of the Group III and / or of the Group IV comprises step (C2) , three of the interchain disulfide bonds of the antibody are reduced in step (R1) and / or in step (R1’ ) .

[0126] In some embodiments, by the method of the Group III comprising step (R1) , step (C1) and step (C2) in order and / or of the Group IV comprising step (R1’ ) , step (C1’ ) and step (C2) in order, ADC with D4+D2 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first linker-payload, and the second conjugating group is the second linker-payload.

[0127] In some embodiments, by the method of the Group III comprising step (R1) , step (C1) and step (C2) in order and / or of the Group IV comprising step (R1’ ) , step (C1’ ) and step (C2) in order, ADC with D4+D1 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first linker-payload, and the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing the second linker-payload, or the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the second linker-payload.

[0128] In some embodiments, by the method of the Group III comprising step (R1) , step (C1) and step (C2) in order and / or of the Group IV comprising step (R1’ ) , step (C1’ ) and step (C2) in order, ADC with D2+D2 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, or the first conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the first linker-payload, and the second conjugating group is the second linker-payload.

[0129] In some embodiments, by the method of the Group III comprising step (R1) , step (C1) and step (C2) in order and / or of the Group IV comprising step (R1’ ) , step (C1’ ) and step (C2) in order, ADC with D2+D1 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, or the first conjugating group is the thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the first linker-payload, and the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing the second linker-payload, or the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the second linker-payload.

[0130] In some embodiments, the method of the Group III further comprises the following step,

[0131] (R2) incubating the reaction product from step (C2) and a second reductant or salt thereof in the buffer system to reduce the interchain disulfide bonds of the reaction product resulted from step (C2) ;

[0132] (C3) introducing a third conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (R2) , wherein, the third conjugating group is a third linker-payload or a third thiobridge reagent, optionally, the third thiobridge reagent bears the third linker-payload or the reactive groups.

[0133] In some embodiments, when the third thiobridge reagent bears the reactive groups, the step (C3) comprises the following step, introducing the third thiobridge reagent bearing the reactive groups to re-bridge the reduced thiol groups resulted from step (R2) , then, incubating the third linker-payload in the buffer system to react with the reactive groups of the thiobridge group.

[0134] In some embodiments, in step (R2) , one of the interchain disulfide bonds of the reaction product from step (C2) is reduced.

[0135] In some embodiments, by the method of the Group III comprising step (R1) , step (C1) step (C2) , step (R2) and step (C3) in order, ADC with D4+D2+D2 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first linker-payload, the second conjugating group is the second linker-payload and the third conjugating group is the third linker-payload.

[0136] In some embodiments, by the method of the Group III comprising step (R1) , step (C1) step (C2) , step (R2) and step (C3) in order, ADC with D4+D2+D1 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first linker-payload, the second conjugating group is the second linker-payload and the third conjugating group is the third thiobridge reagent bearing the third linker-payload, or the third conjugating group is the third thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the third linker-payload.

[0137] In some embodiments, by the method of the Group III comprising step (R1) , step (C1) step (C2) , step (R2) and step (C3) in order, ADC with D4+D1+D2 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first linker-payload, the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing the second linker-payload, or the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the second linker-payload and the third conjugating group is the third linker-payload.

[0138] In some embodiments, by the method of the Group III comprising step (R1) , step (C1) step (C2) , step (R2) and step (C3) in order, ADC with D4+D1+D1 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first linker-payload, the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing the second linker-payload, or the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the second linker-payload and the third conjugating group is the third thiobridge reagent bearing the third linker-payload, or the third conjugating group is the third thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the third linker-payload.

[0139] In some embodiments, by the method of the Group III comprising step (R1) , step (C1) step (C2) , step (R2) and step (C3) in order, ADC with D2+D2+D2 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, or the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the first linker-payload, the second conjugating group is the second linker-payload and the third conjugating group is the third linker-payload.

[0140] In some embodiments, by the method of the Group III comprising step (R1) , step (C1) , step (C2) , step (R2) and step (C3) in order, ADC with D2+D2+D1 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, or the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the first linker-payload, the second conjugating group is the second linker-payload and the third conjugating group is the third thiobridge reagent bearing the third linker-payload, or the third conjugating group is the third thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the third linker-payload.

[0141] In some embodiments, by the method of the Group III comprising step (R1) , step (C1) , step (C2) , step (R2) and step (C3) in order, ADC with D2+D1+D2 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, or the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the first linker-payload, the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing the second linker-payload, or the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the second linker-payload and the third conjugating group is the third linke r-payload.

[0142] In some embodiments, by the method of the Group III comprising step (R1) , step (C1) , step (C2) , step (R2) and step (C3) in order, ADC with D2+D1+D1 is prepared, wherein, the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, or the first conjugating group is the first thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the first linker-payload, the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing the second linker-payload, or the second conjugating group is the second thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the second linker-payload and the third conjugating group is the third thiobridge reagent bearing the third linker-payload, or the third conjugating group is the third thiobridge reagent bearing reactive groups which reacts with the third linker-payload.

[0143] In some embodiments, the salt refers to acid addition salts or base addition salts.

[0144] In some embodiments, acid addition salts can be formed with inorganic acids and organic acids. The inorganic acids from which salts can be derived include, for example, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like. The organic acids from which salts can be derived include, for example, acetic acid, propionic acid, glycolic acid, oxalic acid, maleic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, toluenesulfonic acid, sulfosalicylic acid, and the like.

[0145] In some embodiments, base addition salts can be formed with inorganic bases and organic bases. The inorganic bases from which salts can be derived include groups 1 to 2 of the periodic table. In certain embodiments, the salts are derived from lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium and the like. The organic bases from which salts can be derived include, for example, primary, secondary, and tertiary amines, substituted amines including naturally occurring substituted amines, cyclic amines, basic ion exchange resins, and the like. Certain organic amines include isopropylamine, benzathine, cholinate, diethanolamine, diethylamine, meglumine, piperazine and tromethamine.

[0146] The method of the Group I

[0147] In some embodiments, in step (R1) , the molar ratio of the first reductant and the antibody is 1.5: 1-30: 1.

[0148] In some embodiments, in step (R1) of the Group I, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 2: 1-30: 1. In some embodiments, in step (R1) of the Group I, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 2: 1-10: 1. In some embodiments, in step (R1) of the Group I, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 2: 1, 2.5: 1, 3: 1, 3.5: 1, 4: 1, 4.5: 1, 5: 1, 5.5: 1, 6: 1, 6.5: 1, 7: 1, 7.5: 1, 8: 1, 8.5: 1, 9: 1, 9.5: 1, 10: 1, 10.5: 1, 11: 1, 11.5: 1, 12: 1, 12.5: 1, 13: 1, 13.5: 1, 14: 1, 14.5: 1, 15: 1, 15.5: 1, 16: 1, 16.5: 1, 17: 1, 17.5: 1, 18: 1, 18.5: 1, 19: 1, 19.5: 1, 20: 1, 20.5: 1, 21: 1, 21.5: 1, 22: 1, 22.5: 1, 23: 1, 23.5: 1, 24: 1, 24.5: 1, 25: 1, 25.5: 1, 26: 1, 26.5: 1, 27: 1, 27.5: 1, 28: 1, 28.5: 1, 29: 1, 29.5: 1 or 30: 1.

[0149] In some embodiments, in method of the group I, the first reductant and the antibody with specific molar ratio selectively reduce two or more than two of the interchain disulfide bonds within antibody. In some embodiments, in method of the group I, the first reductant and the antibody with specific molar ratio selectively reduce three of the interchain disulfide bonds within antibody. In some embodiments, in method of the group I, the first reductant and the antibody with specific molar ratio selectively reduce four the interchain disulfide bonds within antibody.

[0150] In some embodiments, in step (R1) , the molar ratio of the transition metal ions and the antibody is 0.5: 1 to 100: 1.

[0151] In some embodiments, in step (R1) of the Group I, the molar ratio of the transition metal ions and the antibody is 1: 1-15: 1. In some embodiments, in step (R1) of the Group I, the molar ratio of the transition metal ions and the antibody is 1: 1, 1.5: 1, 2: 1, 2.5: 1, 3: 1, 3.5: 1, 4: 1, 4.5: 1, 5: 1, 5.5: 1, 6: 1, 6.5: 1, 7: 1, 7.5: 1, 8: 1, 8.5: 1, 9: 1, 9.5: 1, 10: 1, 10.5: 1, 11: 1, 11.5: 1, 12: 1, 12.5: 1, 13: 1, 13.5: 1, 14: 1, 14.5: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1, 20: 1, 22: 1, 24: 1, 26: 1, 28: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1, 55: 1, 60: 1, 65: 1, 70: 1, 75: 1, 80: 1, 85: 1, 90: 1, 95: 1 or 100: 1.

[0152] In some embodiments, in step (R1) of the Group I, there is no specific limitation to the concentration of the first reductant, as long as scaling up or down the concentration of the transition metal ions and the antibody in equal proportions. In some embodiment, the concentration of the first reductant is 0.01 mM to 0.2 mM, 0.02 mM to 0.15 mM or 0.05 mM to 0.1 mM. In some embodiments, the concentration of the first reductant is 0.01 mM, 0.02 mM, 0.03 mM, 0.04 mM, 0.05 mM, 0.06 mM, 0.07 mM, 0.08 mM, 0.09 mM, 0.10 mM, 0.11 mM, 0.12 mM, 0.13 mM, 0.14 mM, 0.15 mM, 0.16 mM, 0.17 mM, 0.18 mM, 0.19 mM or 0.20 mM.

[0153] In some embodiment, there is no specific limitation to the concentration of the transition metal ions in step (R1) of the Group I, as long as scaling up or down the concentration of the first reductant and the antibody in equal proportions.

[0154] In some embodiments, there is no specific limitation to the concentration of the antibody in step (R1) of The Group I, as long as scaling up or down the concentration of the first reductant and the transition metal ions in equal proportions.

[0155] In some embodiment, the concentration of the first reductant, the transition metal ions and the antibody in step (R1) of the Group I applies to that in step (R1) of the Group III.

[0156] In some embodiment, the concentration of the first reductant and the antibody in step (R1) of the Group I applies to that in step (R1’ ) of the Group II and of the Group IV.

[0157] In some embodiments, in step (R1) of the Group I, the incubation temperature is 0℃ to 37℃, 0℃to 25℃, 0℃ to 15℃, 0℃ to 10℃, or 0℃ to 5℃. In some embodiments, in step (R1) of the Group I, incubation temperature is 4℃, 8℃, 12℃, 15℃, 18℃, 24℃, 30℃, 35℃ or 37℃. In some embodiments, the incubation temperature in step (R1) of the Group I also applies to that in step (R1) of the Group III and that in step (R1’ ) of the Group II and IV.

[0158] In some embodiments, in step (R1) of the Group I, the incubation time is 10 min to 48h or 30min to 24h. In some embodiments, in step (R1) of the Group I, the incubation time is 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min, 60 min, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h, 8h, 9h, 10h, 11h, 12h, 13h, 14h, 15h, 16h, 17h, 18h, 19h, 20h, 31h, 32h, 33h, 34h, 35h, 36h, 37h, 38h, 39h, 40h, 41h, 42h, 43h, 44h, 45h, 46h, 47h or 48h.

[0159] In the disclosure, there is no specific limitation to the oxidant of step (O1) , as long as the oxidant can re-oxidize the reduced thiol groups. In some embodiments, the oxidant is Dehydroascorbic acid (DHAA) , H2O2, KClO3, H2S2O8, H2SO4, NaClO, NaCr2O7, CuSO4, permanganate compounds, sodium perborate, nitrous oxide, NaBiO3, ceric sulfate, 5, 5'-Dithiobis- (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) , nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) , nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) or 2-aminophenyl disulfide (DDD) in step (O1) .

[0160] In some embodiments, in step (O1) of the Group I, the molar ratio of oxidant and the antibody is 2: 1 to 50: 1, 2: 1 to 20: 1, 4: 1 to 22: 1, 4: 1 to 15: 1, or 6: 1 to 14: 1. In some embodiments, in step (O1) of the Group I, the molar ratio of oxidant and the antibody is 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1, 20: 1, 21: 1, 22: 1, 23: 1, 24: 1, 25: 1, 26: 1, 27: 1, 28: 1, 29: 1, 30: 1, 31: 1, 32: 1, 33: 1, 34: 1, 35: 1, 36: 1, 37: 1, 38: 1, 39: 1, 40: 1, 41: 1, 42: 1, 43: 1, 44: 1, 45: 1, 46: 1, 47: 1, 48: 1, 49: 1 or 50: 1. In some embodiment, the molar ratio of oxidant and the antibody in step (O1) of the Group I applies to that in step (O1’ ) of the Group II.

[0161] In some embodiments, the oxidation reaction is performing in darkness.

[0162] In some embodiments, in step (O1) of the Group I, the oxidation reaction is performing at temperature of 0℃ to 37℃, 0℃ to 30℃, 15℃ to 30℃, or 20℃ to 30℃. In some embodiments, in step (O1) of the Group I, the oxidation reaction is performing at temperature of 0℃, 4℃, 8℃, 12℃, 15℃, 18℃, 24℃, 30℃, 35℃ or 37℃. In some embodiments, the oxidation temperature in step (O1) of the Group I also applies to that in step (O1’ ) of the Group II.

[0163] In some embodiments, in step (O1) of the Group I, the oxidation time is 1h to 48h, 1h to 8h, 1h to 5h, or 1h to 3h. In some embodiments, in step (O1) of the Group I, the oxidation time is 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h, 8h, 9h, 10h, 11h, 12h, 13h, 14h, 15h, 16h, 17h, 18h, 19h, 20h, 31h, 32h, 33h, 34h, 35h, 36h, 37h, 38h, 39h, 40h, 41h, 42h, 43h, 44h, 45h, 46h, 47h or 48h. In some embodiments, the oxidation time in step (O1) of the Group I also applies to that in step (O1’ ) of the Group II.

[0164] In some embodiments, the method of the Group I further comprises the following step,

[0165] (C1) incubating an amount of metal chelators and the first conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (O1) and / or from step (O1’ ) .

[0166] In some embodiments, in step (C1) of the Group I, the reaction temperature with the reduced thiol groups is 4℃ to 40℃, 10℃ to 40℃, 10℃ to 35℃, 10℃ to 30℃, 10℃ to 25℃, 15℃ to 35℃, 20℃to 30℃, 4℃ to 37℃, 20℃ to 30℃ or 20℃ to 25℃. In some embodiments, in step (C1) of the Group I, the reaction temperature with the reduced thiol groups is 4℃, 6℃, 8℃, 10℃, 13℃, 17℃, 20℃, 23℃, 27℃, 30℃, 34℃, 35℃, 37℃, 39℃ or 40℃. In some embodiments, in step (C1) of the Group I, the reaction temperature with the reduced thiol groups is 24℃. In some embodiments, the reaction temperature in step (C1) of the Group I also applies to that in step (C1) of the Group II.

[0167] In some embodiments, in step (C1) of the Group I, the reaction time with the reduced thiol groups is 2 h to 12 h, 0.5h to 10h, 0.5 h to 6 h, 0.5h to 5h, 0.5h to 4h, 0.5 h to 3 h, 0.5 h to 3 h, 0.5 h to 2 h, 0.5 h to 1h. In some embodiments, in step (C1) of the Group I, the reaction time with the reduced thiol groups is 0.5h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h, 8h, 9h, 10h, 11h or 12h. In some embodiments, the reaction time with the reduced thiol groups in step (C1) of the Group I also applies to that in step (C1) of the Group II.

[0168] In some embodiments, in step (C1) , according to the amount of the antibody, the first conjugating group is excess.

[0169] In some embodiments, in step (C1) of the Group I, the molar ratio of the first conjugating group and the antibody is 1: 1 to 50: 1, 1: 1 to 20: 1, 1: 1 to 10: 1, 1: 1 to 8: 1, 1: 1 to 6: 1, 1: 1 to 5: 1, 2: 1 to 8: 1, or 2: 1 to 6: 1.

[0170] In some embodiments, in step (C1) of the Group I, the molar ratio of the first thiobridge reagent and the antibody is 10: 1 to 1: 1, 5: 1 to 1: 1, 2: 1 to 1: 1, 1.5: 1 to 1: 1, 1.2: 1 to 1: 1 or 1.1: 1 to 1: 1. In some embodiment, in step (C1) of the Group I, the molar ratio of the firs thiobrige reagent and the antibody is 1: 1, 1.5: 1, 2: 1, 3: 1, 3.8: 1, 4: 1, 4.8: 1 or 5: 1.

[0171] In some embodiments, in step (C1) of the Group I, when the first linker-payload reacts with the reactive groups in the first thiobridge reagent, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 10: 1 to 1: 1, 5: 1 to 1: 1, 4: 1 to 1: 1, 3: 1 to 1: 1 or 2: 1 to 1: 1.

[0172] In some embodiments, in step (C1) of the Group I, when the first linker-payload reacts with the reduced thiol groups, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 2: 1 to 20: 1, 2: 1 to 10: 1, 3: 1 to 10: 1, 4: 1 to 9: 1 or 5: 1 to 7: 1. In some embodiments, in step (C1) of the Group I, when the first linker-payload reacts with the reduced thiol groups, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1 or 20: 1..

[0173] In some embodiments, the molar ratio of the first conjugating group and the antibody in step (C1) of the Group I also applies to that in step (C1) of the Group II.

[0174] In some embodiments, the DAR value of conjugates prepared by the method of the Group I comprising step (R1) , step (O1) and step (C1) is 2 (or D2) , in this case, two of the first linker-payloads are linked to the antibody. In some embodiments, the DAR value of conjugates prepared by the method of the Group I comprising step (R1) , step (O1) and step (C1) is 1 (or D1) , in this case, one of the first thiobridge reagent bearing the first linker-payloads are linked to an antibody.

[0175] In some embodiments, the method of the Group I further comprises the following step,

[0176] (R2) incubating a second reductant or salt thereof in the buffer system to reduce the interchain disulfide bond of the antibody resulted from step (O1) , optionally, reduce one of the interchain disulfide bond of the antibody resulted from step (O1) ;

[0177] (C2) incubating the first conjugating group to react with the reduced thiol groups of the reaction product resulted from step (R2) ;

[0178] wherein, incubating an amount of metal chelators in step (R2) or in step (C2) .

[0179] In some embodiments, in step (R2) of the Group I, introducing the metal chelators.

[0180] In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the molar ratio of the second reductant and the antibody is 10: 1 to 25: 1, 10: 1 to 23: 1, 10: 1 to 20: 1, 10: 1 to 19: 1, 10: 1 to 18: 1, 15: 1 to 25: 1, 15: 1 to 20: 1, 1: 1 to 8: 1, 1: 1 to 5: 1, 1: 1 to 3: 1 or 1: 1 to 2: 1. In some embodiments, in step (R2) of the method IV, the molar ratio of the second reductant and the antibody is 1: 1, 1.2: 1, 1.4: 1, 1.6: 1, 1.8: 1, 2: 1, 2.2: 1, 2.4: 1, 2.6: 1, 2.8: 1 or 3: 1.

[0181] In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the reduction temperature is 0-37℃. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the reduction temperature is 0℃, 2℃, 4℃, 6℃, 8℃, 10℃, 12℃, 14℃, 16℃, 18℃, 20℃, 22℃, 24℃, 26℃, 28℃, 30℃, 32℃, 34℃, 36℃ or 37℃.

[0182] In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the reduction time is 1-8h. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the reduction time is 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h or 8h.

[0183] In some embodiments, in step (C2) of the Group I, introducing the metal chelators.

[0184] In some embodiments, the reaction temperature and the reaction time in step (C2) of the Group I are the same as that in step (C1) of the Group I.

[0185] In some embodiments, in step (C2) of the Group I, according to the amount of the antibody, the first conjugating group is excess.

[0186] In some embodiments, in step (C2) of the Group I, the molar ratio of the first thiobridge reagent and the antibody is 2: 1 to 10: 1. In some embodiment, the molar ratio of the firs thiobrige reagent and the antibody is 2: 1, 3: 1, 3.3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1 or 10: 1.

[0187] In some embodiments, in step (C2) of the Group I, when the first linker-payload reacts with the reactive groups in the first thiobridge reagent, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 2: 1 to 10: 1. In some embodiments, in step (C1) of the method IV, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1 or 10: 1.

[0188] In some embodiments, when the first linker payload reacts with the reduced thiol groups, the molar ratio of the first linker payload and the antibody is 4: 1 to 20: 1. In some embodiments, when the first linker payload reacts with the reduced thiol groups, the molar ratio of the first linker payload and the antibody is 4: 1, 5: 1, 6: 1, 20: 3, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 15: 1 or 20: 1.

[0189] In some embodiments, the DAR value of conjugates prepared by the method of the Group I comprising step (R1) , step (O1) , step (R2) and step (C2) is 4 (or D4) , in this case, four of the first linker-payloads are linked to the antibody. In some embodiments, the DAR value of conjugates prepared by the method of the Group I comprising step (R1) , step (O1) , step (R2) and step (C2) is 2 (or D2) , in this case, two of the first thiobridge reagent bearing the first linker-payloads are linked to an antibody.

[0190] In some embodiments, the method of the Group I further comprises the following step,

[0191] (R2) incubating the reaction product from step (C1) and a second reductant or salt thereof in the buffer system to reduce the interchain disulfide bonds of the reaction product resulted from step (C1) ; (C2) introducing a second conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (R2) ; wherein, the second conjugating group is a second linker-payload or a second thiobridge reagent, optionally, the second thiobridge reagent bears thesecond linker-payload or the reactive groups.

[0192] In some embodiments, in step (R2) of the Group I, three of the interchain disulfide bonds of the antibody is reduced without the transition metal ions. In some embodiments, when the antibody is the engineered antibody I, two of the interchain disulfide bonds of the antibody is reduced without the transition metal ions. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the molar ratio of the second reductant and the antibody is 3: 1 to 20: 1. In some embodiments, in step (R2) , the molar ratio of the second reductant and the antibody is 3: 1 to 10: 1. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the molar ratio of the second reductant and the antibody is 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1 or 20: 1. In some embodiments, the molar ratio of the second reductant and the antibody of the method I also applies to that in step (R2) of the Group II. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the incubation temperature is 0℃ to 37℃, or 5℃ to 30℃. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the incubation temperature is 2℃, 4℃, 6℃, 8℃, 10℃, 12℃, 14℃, 16℃, 18℃, 20℃, 22℃ or 25℃. In some embodiments, the incubation temperature in step (R2) of the Group I also applies to that in step (R2) of the Group II. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the incubation time is 0.5 h to 24h, 5 h to 20 h or 6 h to 18 h. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the incubation time is 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h, 14h, 16h, 18h, 20h, 22 or 24h. In some embodiments, the incubation time in step (R2) of the Group I also applies to that in step (R2) of the Group II.

[0193] In some embodiments, the method of the Group I further comprises the following step,

[0194] (R2) incubating the reaction product from step (C1) and a second reductant or salt thereof in the buffer system in the presence of transition ions to selectively reduce the interchain disulfide bonds of the reaction product resulted from step (C1) ;

[0195] (C2) introducing an amount of the metal chelators and a second conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (R2) ; wherein, the second conjugating group is a second linker-payload or a second thiobridge reagent, optionally, the second thiobridge reagent bears the second linker-payload or the reactive groups.

[0196] In some embodiments, in step (R2) of the Group I, introducing the transition metal ions, two of the interchain disulfide bonds of the antibody is reduced. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the molar ratio of the second reductant and the transition metal ions is 1: 0.05 to 1: 40. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the molar ratio of the second reductant and the transition metal ions is 1: 0.05, 1: 0.08, 1: 0.1, 1: 0.2, 1: 0.3, 1: 0.4, 1: 0.5, 1: 0.6, 1: 0.7, 1: 0.8, 1: 0.9, 1: 1, 1: 2, 1: 4, 1: 6, 1: 8, 1: 10, 1: 12, 1: 14, 1: 16, 1: 18 or 1: 20. In some embodiments, the molar ratio of the second reductant and the transition metal ions in step (R2) of the method I also applies to that in step (R2) of the Group II. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the molar ratio of the second reductant and the antibody is 2.5: 1 to 20: 1. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the molar ratio of the second reductant and the antibody is 2.5: 1, 3: 1, 5: 1, 7: 1, 9: 1, 11: 1, 13: 1, 15: 1, 17: 1, 19: 1 or 20: 1. In some embodiments, the molar ratio of the second reductant and the antibody in step (R2) of the method I also applies to that in step (R2) of the Group II. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the incubation temperature is 0℃ to 37℃, 0℃ to 37℃, 0℃ to 30℃, 15℃ to 30℃, or 20℃ to 30℃. In some embodiments, the incubation temperature in step (R2) of the method I also applies to that in step (R2) of the Group II. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the incubation time is 0.2h to 24h or 1h to 10h. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the incubation time is 0.2h, 0.4h, 0.6h, 0.8h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h, 14h, 16h, 18h, 20h, 22 or 24h. In some embodiments, the incubation time in step (R2) of the method I also applies to that in step (R2) of the Group II.

[0197] In some embodiments, in step (R2) of the Group I, when introducing the transition metal ions, one of the interchain disulfide bonds of the antibody is reduced. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the molar ratio of the second reductant and the transition metal ions is 1: 0.4 to 1: 100. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the molar ratio of the second reductant and the transition metal ions is 1: 0.5, 1: 1, 1: 4, 1: 8, 1: 12, 1: 24, 1: 30, 1: 40, 1: 50, 1: 50, 1: 70, 1: 80, 1: 90 or 1: 100. In some embodiments, the molar ratio of the second reductant and the transition metal ions in step (R2) of the method I also applies to that in step (R2) of the Group II. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the molar ratio of the second reductant and the antibody is 0.8: 1 to 2.5: 1. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the molar ratio of the second reductant and the antibody is 0.5: 1, 1: 1, 1.2: 1, 1.4: 1, 1.6: 1, 1.8: 1, 2: 1, 2.2: 1, 2.4: 1 or 2.5: 1. In some embodiments, the molar ratio of the second reductant and the antibody in step (R2) of the method I also applies to that in step (R2) of the Group II. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the incubation temperature is 0℃ to 37℃, 0℃ to 37℃, 0℃ to 30℃, 15℃ to 30℃, or 20℃ to 30℃. In some embodiments, the incubation temperature in step (R2) of the method I also applies to that in step (R2) of the Group II. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the incubation time is 0.5h to 24h. In some embodiments, in step (R2) of the Group I, the incubation time is 0.5h, 0.8h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h, 14h, 16h, 18h, 20h, 22 or 24h. In some embodiments, the incubation time in step (R2) of the method I also applies to that in step (R2) of the Group II.

[0198] In some embodiments, the reaction temperature and the reaction time in step (C2) of the Group I are the same as that in step (C1) of the Group I.

[0199] In some embodiments, in step (C2) of the Group I, according to the amount of the antibody, the first conjugating group is excess.

[0200] In some embodiments, in step (C2) of the Group I, the molar ratio of the second thiobridge reagent and the antibody is 1: 1 to 30: 1, 1: 1 to 20: 1, 1: 1 to 10: 1, 1: 1 to 8: 1, 1: 1 to 6: 1, 1: 1 to 5: 1, 2: 1 to 8: 1, or 2: 1 to 6: 1. In some embodiments, in step (C2) of the Group I, the molar ratio of the second thiobridge reagent and the antibody is 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1, 20: 1, 21: 1, 22: 1, 23: 1, 24: 1, 25: 1, 26: 1, 27: 1, 28: 1, 29: 1 or 30: 1.

[0201] In some embodiments, in the method of the Group I comprising step (R1) , step (O1) , step (C1) , step (R2) and step (C2) in order, the conjugates with two kinds of payloads are prepared, which includes D2+D6, D1+D6, D2+D3, D1+D3, D2+D4, D2+D2, D1+D2, D2+D1 and / or D1+D1.

[0202] In some embodiments, the method further comprises a step of purification after step (R1) , (O1) , (C1) , (R2) and / or (C2) .

[0203] In some embodiments, the purification method comprises a de-salting column, size exclusion chromatography, ultrafiltration, dialysis, ultrafiltration (UF) -diafiltration (DF) , and the like. If needed, further product enrichment (e.g., D2) may be applied in some case using hydrophobic interaction chromatography (HIC) . In some embodiments. the method further comprises a step of purification after step (R1) to remove excessive the first reductant. In some embodiments. the method further comprises a step of purification after step (O1) to remove excessive the oxidant.

[0204] In some embodiments, when the method of the Group I comprises a step of purification after step (R1) , independently adding a proper amount of the transition metal ions or salt thereof and / or the additive before step (O1) . In some embodiments, the concentration of the additive is 0.1 mM-50 mM. In some embodiments, the concertation of the additive is 1 mM-2 mM. In some embodiments, the concentration of the additive is 0.1 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM, 1 mM, 1.2 mM, 1.4 mM, 1.6 mM, 1.8 mM, 2.0 mM, 2.2 mM, 2.4 mM, 2.6 mM, 2.8 mM, 3.0 mM, 3.2 mM, 3.4 mM, 3.6 mM, 3.8 mM, 4.0 mM, 4.2 mM, 4.4 mM, 4.6 mM, 4.8 mM, 5.0 mM, 6.0 mM, 7.0 mM, 8.0 mM, 9.0 mM, 10.0 mM, 12.0 mM, 14.0 mM, 16.0 mM, 18.0 mM, 20.0 mM, 22.0 mM, 24.0 mM, 26.0 mM, 28.0 mM, 30.0 mM, 32.0 mM, 34.0 mM, 36.0 mM, 38.0 mM, 40.0 mM, 42.0 mM, 44.0 mM, 46.0 mM, 48.0 mM or 50 mM. In some embodiments, in step (O1) of the Group I, the molar ratio of the transition metal ions and the antibody is 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1 or 15: 1.

[0205] In some embodiments, the excess amount of metal chelators and a complex of the metal chelators and the transition metal ions are filtered out in dialysis, ultrafiltration or gel filtration.

[0206] In some embodiments, in the method of the Group II, the antibody is wild type antibody.

[0207] In some embodiments, in the method of the Group I, the antibody is an engineered antibody I comprising two amino acid substitutions of two interchain cysteines forming one interchain disulfide bond in the hinge region, optionally, the amino acid substitutions are selected from the following, cysteine to alanine, to leucine, to arginine, to lysine, to asparagines, to methionine, to aspartic acid, to phenylalanine, to praline, to glutamine, to serine, to glutamic acid, to threonine, to glycine, to tryptophan, to histidine, to tyrosine, to isoleucine or to valine, respectively, more optionally, the amino acid substitutions are selected from the following, cysteine to serine.

[0208] The method of the Group II

[0209] In some embodiments, in step (R1’ ) of the Group II, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 2.5: 1 or more than 2.5: 1. In some embodiments, in step (R1’ ) of the Group II, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 2.5: 1-15: 1. In some embodiments, in step (R1’ ) of the Group II, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 2.5: 1, 3: 1, 3.5: 1, 4: 1, 4.5: 1, 5: 1, 5.5: 1, 6: 1, 6.5: 1, 7: 1, 7.5: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1 or 15: 1.

[0210] In some embodiments, in method of the group II, the first reductant and the antibody with specific molar ratio selectively reduce four of the interchain disulfide bonds within antibody. In some embodiments, in method of the group II, when the antibody is the engineered antibody I, the first reductant and the antibody with specific molar ratio selectively reduce three of the interchain disulfide bonds within antibody.

[0211] In some embodiment, the concentration of the first reductant and the antibody in step (R1’ ) of the Group II are the same as that in step (R1) of the Group I.

[0212] In some embodiments, the incubation temperature and the incubation time in step (R1’ ) of the Group II are the same as that in step (R1) of the Group I.

[0213] In some embodiments, the molar ratio of the transition metal ions and the antibody in step (O1’ ) of the Group II is 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1 or 15: 1.

[0214] In the disclosure, there is no specific limitation to the oxidant of step (O1’ ) , as long as the oxidant can re-oxidize the reduced thiol groups. In some embodiments, the oxidant is Dehydroascorbic acid (DHAA) in step (O1’ ) .

[0215] In some embodiments, the molar ratio of oxidant and the antibody, the oxidation temperature and the oxidation time in step (O1’ ) of the Group II are the same as that in step (O1) of the Group I.

[0216] In some embodiments, the reaction temperature and time with the reduced thiol groups in step (C1) of the Group II are the same as that in step (C1) of the Group I.

[0217] In some embodiments, the molar ratio of the first conjugating group and the antibody in step (C1) of the Group II are the same as that in step (C1) of the Group I.

[0218] In some embodiments, the method further comprises a step of purification after step (R1’ ) , (O1’ ) and / or (C1) . In some embodiments, the purification method of the Group II is the same as that of the Group I.

[0219] In some embodiments. the method further comprises a step of purification after step (R1’ ) to remove excessive the first reductant. In some embodiments. the method further comprises a step of purification after step (O1’ ) to remove excessive the oxidant.

[0220] In some embodiments, when the method of the Group II comprises a step of purification after step (R1’ ) , adding a proper amount of the additive before step (O1’ ) . In some embodiments, the concentration of the additive is 0.1 mM-50 mM. In some embodiments, the concertation of the additive is 1 mM-2 mM. In some embodiments, the concentration of the additive is 0.1 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM, 1 mM, 1.2 mM, 1.4 mM, 1.6 mM, 1.8 mM, 2.0 mM, 2.2 mM, 2.4 mM, 2.6 mM, 2.8 mM, 3.0 mM, 3.2 mM, 3.4 mM, 3.6 mM, 3.8 mM, 4.0 mM, 4.2 mM, 4.4 mM, 4.6 mM, 4.8 mM, 5.0 mM, 6.0 mM, 7.0 mM, 8.0 mM, 9.0 mM, 10.0 mM, 12.0 mM, 14.0 mM, 16.0 mM, 18.0 mM, 20.0 mM, 22.0 mM, 24.0 mM, 26.0 mM, 28.0 mM, 30.0 mM, 32.0 mM, 34.0 mM, 36.0 mM, 38.0 mM, 40.0 mM, 42.0 mM, 44.0 mM, 46.0 mM, 48.0 mM or 50 mM.

[0221] In some embodiments, the excess amount of metal chelators and a complex of the metal chelators and the transition metal ions are filtered out in dialysis, ultrafiltration or gel filtration.

[0222] In some embodiments, the DAR value of conjugates prepared by method of Group II is 2 (or D2) , in this case, two of the first linker-payloads are linked to the antibody. In some embodiments, the DAR value of conjugates prepared by method of the Group II is 1 (or D1) , in this case, one of the first thiobridge reagent bearing the first linker-payloads are linked to an antibody.

[0223] In some embodiments, the method of the Group II further comprises the following step,

[0224] (R2) incubating a second reductant or salt thereof in the buffer system to reduce the interchain disulfide bond of the antibody resulted from step (O1) , optionally, reduce one of the interchain disulfide bond of the antibody resulted from step (O1) ;

[0225] (C2) incubating the first conjugating group to react with the reduced thiol groups of the reaction product resulted from step (R2) ;

[0226] wherein, incubating an amount of metal chelators in step (R2) or in step (C2) .

[0227] In some embodiments, in the method of the Group II, the parameters in step (R2) of the Group II are same as that in step (R2) of the Group I.

[0228] In some embodiments, in the method of the Group II, the parameters in step (C2) of the Group II are same as that in step (C2) of the Group I.

[0229] In some embodiments, the DAR value of conjugates prepared by the method of the Group II comprising step (R1’ ) , step (O1’ ) , step (R2) and step (C2) is 4 (or D4) , in this case, four of the first linker-payloads are linked to the antibody. In some embodiments, the DAR value of conjugates prepared by the method of the Group II comprising step (R1’ ) , step (O1’ ) , step (R2) and step (C2) is 2 (or D2) , in this case, two of the first thiobridge reagent bearing the first linker-payloads are linked to an antibody.

[0230] In some embodiments, the method of the Group II further comprises the following step,

[0231] (R2) incubating the reaction product from step (C1) and a second reductant or salt thereof in the buffer system to reduce the interchain disulfide bonds of the reaction product resulted from step (C1) ;

[0232] (C2) introducing a second conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (R2) ; wherein, the second conjugating group is a second linker-payload or a second thiobridge reagent, optionally, the second thiobridge reagent bears thesecond linker-payload or the reactive groups.

[0233] In some embodiments, the method of the Group II further comprises the following step,

[0234] (R2) incubating the reaction product from step (C1) and a second reductant or salt thereof in the buffer system in the presence of transition ions to selectively reduce the interchain disulfide bonds of the reaction product resulted from step (C1) ;

[0235] (C2) introducing an amount of the metal chelators and a second conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (R2) ; wherein, the second conjugating group is a second linker-payload or a second thiobridge reagent, optionally, the second thiobridge reagent bears the second linker-payload or the reactive groups.

[0236] In some embodiments, in the method of the Group II, the parameters in step (R2) of the Group II are same as that in step (R2) of the Group I.

[0237] In some embodiments, in the method of the Group II, the parameters in step (C2) of the Group II are same as that in step (C2) of the Group I.

[0238] In some embodiments, in the method of the Group II comprising (R1’ ) , (O1’ ) , (C1) , (R2) and (C2) in order, the conjugates with two kinds of payloads are prepared, which includes D2+D6, D1+D6, D2+D3, D1+D3, D2+D4, D2+D2, D1+D2, D2+D1 and / or D1+D1.

[0239] In some embodiments, in the method of the Group II, the antibody is wild type antibody.

[0240] In some embodiments, in the method of the Group II, the antibody is an engineered antibody I comprising two amino acid substitutions of two interchain cysteines forming one interchain disulfide bond in the hinge region, optionally, the amino acid substitutions are selected from the following, cysteine to alanine, to leucine, to arginine, to lysine, to asparagines, to methionine, to aspartic acid, to phenylalanine, to praline, to glutamine, to serine, to glutamic acid, to threonine, to glycine, to tryptophan, to histidine, to tyrosine, to isoleucine or to valine, respectively, more optionally, the amino acid substitutions are selected from the following, cysteine to serine.

[0241] The method of the Group III

[0242] In some embodiments, in step (R1) , the molar ratio of the first reductant and the antibody is 2.5: 1-15: 1.

[0243] In some embodiments, in step (R1) of the Group III, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 2.5: 1-10: 1. In some embodiments, in step (R1) of the Group III, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 4: 1-8: 1. In some embodiments, in step (R1) of the Group III, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 2.5: 1, 3: 1, 3.5: 1, 4: 1, 4.5: 1, 5: 1, 5.5: 1, 6: 1, 6.5: 1, 7: 1, 7.5: 1, 8: 1, 8.5: 1, 9: 1, 9.5: 1, 10: 1, 10.5: 1, 11: 1, 11.5: 1, 12: 1, 12.5: 1, 13: 1, 13.5: 1, 14: 1, 14.5: 1 or 15: 1.

[0244] In some embodiments, when the method of the Group III comprises step (C2) , the molar ratio of the first reductant and the antibody is 3.5: 1-10: 1 in step (R1) of the Group III.

[0245] In some embodiments, in method of the group III, the first reductant and the antibody with specific molar ratio selectively reduce more than two of the interchain disulfide bonds within antibody.

[0246] In some embodiments, in step (R1) , the molar ratio of the transition metal ions and the antibody is 0.5: 1 to 100: 1.

[0247] In some embodiments, in step (R1) of the Group III, the molar ratio of the transition metal ions and the antibody is 0.5: 1-100: 1. In some embodiments, in step (R1) of the Group III, the molar ratio of the transition metal ions and the antibody is 0.5: 1-10: 1. In some embodiments, in step (R1) of the Group III, the molar ratio of the transition metal ions and the antibody is 2: 1-6: 1. In some embodiments, in step (R1) of the Group III, the molar ratio of the transition metal ions and the antibody is 1: 1, 1.5: 1, 2: 1, 2.5: 1, 3: 1, 3.5: 1, 4: 1, 4.5: 1, 5: 1, 5.5: 1, 6: 1, 6.5: 1, 7: 1, 7.5: 1, 8: 1, 8.5: 1, 9: 1, 9.5: 1, 10: 1, 10.5: 1, 11: 1, 11.5: 1, 12: 1, 12.5: 1, 13: 1, 13.5: 1, 14: 1, 14.5: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1, 20: 1, 22: 1, 24: 1, 26: 1, 28: 1, 30: 1, 35: 1, 40: 1, 45: 1, 50: 1, 55: 1, 60: 1, 65: 1, 70: 1, 75: 1, 80: 1, 85: 1, 90: 1, 95: 1 or 100: 1.

[0248] In some embodiment, the concentration of the first reductant, the transition metal ions and the antibody in step (R1) of the Group III are the same as that in step (R1) of the Group I.

[0249] In some embodiments, the incubation temperature and the incubation time in step (R1) of the Group III are the same as that in step (R1) of the Group I. In some embodiments, in step (R1) of the Group III, the incubation time is 30min to 24h.

[0250] In some embodiments, in step (C1) of the Group III, the reactive temperature is 4℃-40℃ or 20℃-37℃. In some embodiments, in step (C1) of the Group III, the reactive temperature is 4℃, 6℃, 8℃, 10℃, 13℃, 17℃, 20℃, 23℃, 27℃, 30℃, 34℃, 35℃ or 37℃. In some embodiments, improve the reactive temperature in step (C1) of the Group III are useful to increase the content of the ADC with D4.

[0251] In some embodiments, in step (C1) of the Group III, the reaction time with the reduced thiol groups is 2 h to 12 h, 0.5h to 10h, 0.5 h to 6 h, 0.5h to 5h, 0.5h to 4h, 0.5 h to 3 h, 0.5 h to 3 h, 0.5 h to 2 h, 0.5 h to 1h. In some embodiments, in step (C1) of the Group III, the reaction time with the reduced thiol groups is 0.5h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h, 8h, 9h, 10h, 11h or 12h. In some embodiments, improve the reaction time in step (C1) of the Group III are useful to increase the content of the ADC with D4.

[0252] In some embodiments, in step (C1) of the Group III, according to the amount of the antibody, the first conjugating group is excess.

[0253] In some embodiments, in step (C1) of the Group III, the molar ratio of the first conjugating group and the antibody is 2: 1 to 15: 1.

[0254] In some embodiments, in step (C1) of the Group III, the molar ratio of the first thiobridge reagent and the antibody is 2: 1 to 6: 1. In some embodiments, in step (C1) of the Group III, the molar ratio of the first thiobridge reagent and the antibody is 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1 or 6: 1.

[0255] In some embodiments, in step (C1) of the Group III, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 6: 1 to 20: 1. In some embodiments, in step (C1) of the Group III, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 6: 1 to 15: 1. In some embodiments, in step (C1) of the Group III, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 6: 1 to 12: 1. In some embodiments, in step (C1) of the Group III, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 6: 1 to 8: 1. In some embodiments, in step (C1) of the Group III, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1 or 20: 1.

[0256] In some embodiments, in step (C1) of the Group III, when the first linker-payload reacts with the reactive groups in the first thiobridge reagent, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 2: 1 to 5: 1. In some embodiments, in step (C1) of the Group III, when the first linker-payload reacts with the reactive groups in the first thiobridge reagent, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 2: 1, 3: 1, 4: 1 or 5: 1.

[0257] In some embodiments, in step (C1) of the Group III, when the first linker-payload reacts with the reduced thiol groups, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 6: 1 to 30: 1. In some embodiments, in step (C1) of the Group III, when the first linker-payload reacts with the reduced thiol groups, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 6: 1, 8: 1, 12: 1, 16: 1, 20: 1, 24: 1 or 28: 1. In some embodiments, improve the molar ratio of the first linker-payload and the antibody in step (C1) of the Group III are useful to increase the content of the ADC with D4.

[0258] In some embodiments, in step (E1) of the Group III, introducing an amount of metal chelators and the oxidant to re-oxidize the reduced thiol groups remained from step (C1) .

[0259] In some embodiments, there is no specific limitation to the concentration of the metal chelators in step (E1) of the Group III, as long as the metal chelators could trap the excess the transition metal ions. Before introducing the metal chelators, the first conjugating groups could react with four of the reduced thiol groups from step (R1) .

[0260] In some embodiments, there is no specific limitation to the concentration of the oxidant in step (E1) of the Group III, as long as the oxidant could re-oxidize the reduced thiol groups remained from step (C1) .

[0261] In some embodiments, in step (E1) of the Group III, the temperature is 0-40℃. In some embodiments, in step (E1) of the Group III, the temperature is 0℃, 5℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃ or 40℃.

[0262] In some embodiments, in step (E1) of the Group III, the time is 0.1h-24h. In some embodiments, in step (E1) of the Group III, the time is 0.1h, 0.2h, 0.3h, 0.4h, 0.5h, 0.6h, 0.7h, 0.8h, 0.9h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h, 14h, 18h, 20h or 24h.

[0263] In some embodiments, the DAR value of conjugates prepared by the method of the Group III comprising step (R1) and step (C1) or comprising step (R1) , step (C1) and step (E1) is 4 (or D4) , in this case, four of the first linker-payloads are linked to the antibody. In some embodiments, the DAR value of conjugates prepared by method of the Group III comprising step (R1) and step (C1) or comprising step (R1) , step (C1) and step (E1) is 2 (or D2) , in this case, two of the first thiobridge reagent bearing the first linker-payloads are linked to an antibody.

[0264] In some embodiments, there is no specific limitation to the concentration of the metal chelators in step (C2) of the Group III, as long as the metal chelators could trap the excess the transition metal ions. Before introducing the metal chelators, the first conjugating groups could react with four of the reduced thiol groups from step (R1) . After introducing the metal chelators, the second conjugating groups could react with two of the reduced thiol groups remained from step (C1) .

[0265] In some embodiments, the reaction temperature and time with the reduced thiol groups in step (C2) of the Group III are the same as that in step (C1) of the Group I.

[0266] In some embodiments, the molar ratio of the second conjugating group and the antibody in step (C2) of the Group III are the same as the molar ratio of the first conjugating group and the antibody in step (C1) of the Group I.

[0267] In some embodiments, in the method of the Group III comprising step (R1) , step (C1) and step (C2) , the bi-payload conjugates are prepared, which includes D4+D2, D4+D1, D2+D2 and / or D2+D1.

[0268] In some embodiments, in step (R2) of the Group III, the rest of the interchain disulfide bond in the reaction product from step (C2) is reduced completely without the transition metal ions.

[0269] In some embodiments, in step (R2) of the Group III, the molar ratio of the second reductant and the antibody is 1: 1 to 15: 1. In some embodiments, in step (R2) of the Group III, the molar ratio of the second reductant and the antibody is 1.5: 1-3: 1. In some embodiments, in step (R2) of the Group III, the molar ratio of the second reductant and the antibody is 1: 1, 2: 1, 4: 1, 6: 1, 8: 1, 10: 1, 12: 1, 14: 1 or 15: 1.

[0270] In some embodiments, in step (R2) of the Group III, the second reductant and the reaction product from step (C2) are incubated at temperature of 0℃ to 37℃, 0℃ to 30℃, 15℃ to 30℃, or 20℃ to 30℃. In some embodiments, in step (R3) of the Group III, the second reductant and the reaction product from step (C2) are incubated at temperature of 0℃, 2℃, 4℃, 6℃, 8℃, 10℃, 12℃, 14℃, 16℃, 18℃, 20℃, 22℃, 24℃, 26℃, 28℃, 30℃, 32℃, 34℃, 36℃ or 37℃.

[0271] In some embodiments, in step (R2) of the Group III, the incubation time is 0.2h to 24h, 1h to 10h, 5h to 10h, 1h to 5h, or 1h to 3h. In some embodiments, in step (R2) of the Group III, the incubation time is 0.2h, 0.5h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h, 8 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h or 24 h.

[0272] In some embodiments, in step (R2) of the Group III, the incubation temperature is 4℃, and the incubation time is 8h to 12h. In some embodiments, in step (R2) of the Group III, the incubation temperature is 37℃, and the incubation time is 1h.

[0273] In some embodiments, in step (C3) of the Group III, the reaction temperature with the reduced thiol groups is 4℃ to 40℃, 10℃ to 40℃, 10℃ to 35℃, 10℃ to 30℃, 10℃ to 25℃, 15℃ to 35℃, 20℃ to 30℃, 4℃ to 37℃, 20℃ to 30℃ or 20℃ to 25℃. In some embodiments, in step (C3) of the Group III, the reaction temperature with the reduced thiol groups is 4℃, 6℃, 8℃, 10℃, 13℃, 17℃, 20℃, 23℃, 27℃, 30℃, 34℃, 35℃, 37℃, 39℃ or 40℃.

[0274] In some embodiments, in step (C3) of the Group III, the reaction time with the reduced thiol groups is 2 h to 12 h, 0.5h to 10h, 0.5 h to 6 h, 0.5h to 5h, 0.5h to 4h, 0.5 h to 3 h, 0.5 h to 3 h, 0.5 h to 2 h, 0.5 h to 1h. In some embodiments, in step (C3) of the Group III, the reaction time with the reduced thiol groups is 0.5h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7h, 8h, 9h, 10h, 11h or 12h.

[0275] In some embodiments, in step (C3) of the Group III, according to the amount of the antibody, the third conjugating group is excess.

[0276] In some embodiments, in step (C3) of the Group III, the molar ratio of the third thiobridge reagent and the antibody is 1: 1 to 3: 1. In some embodiments, in step (C3) of the Group III, the molar ratio of the third thiobridge reagent and the antibody is 1: 1, 1.5: 1, 2: 1 or 3: 1.

[0277] In some embodiments, in step (C3) of the Group III, when the third linker-payload reacts with the reactive groups in the third thiobridge reagent, the molar ratio of the third linker-payload and the antibody is 1: 1 to 8: 1. In some embodiments, in step (C3) of the Group III, when the third linker-payload reacts with the reactive groups in the third thiobridge reagent, the molar ratio of the third linker-payload and the antibody is 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1 or 8: 1.

[0278] In some embodiments, in step (C3) of the Group III, when the third linker-payload reacts with the reduced thiol groups, the molar ratio of the third linker-payload and the antibody is 2: 1 to 20: 1. In some embodiments, in step (C3) of the Group III, when the third linker-payload reacts with the reduced thiol groups, the molar ratio of the third linker-payload and the antibody is 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 10: 1, 12: 1, 14: 1, 16: 1 or 18: 1.

[0279] In some embodiments, the method of the Group III further comprises a step of purification after step (R1) , step (C1) , step (E1) , step (C2) , step (R2) or step (C3) . In some embodiments, the purification method of the Group III is the same as that of the Group I.

[0280] In some embodiments. the method further comprises a step of purification after step (R1) to remove excessive the first reductant. In some embodiments. the method further comprises a step of purification after step (R2) to remove excessive the second reductant. In some embodiments. the method further comprises a step of purification after step (E1) to remove excessive the oxidant.

[0281] In some embodiments, when the method of the Group III comprises a step of purification after step (R1) , independently adding a proper amount of the transition metal ions or salt thereof and / or the additive before step (C1) . In some embodiments, the concentration of the additive is 0.1 mM-50 mM. In some embodiments, the concertation of the additive is 1 mM-2 mM. In some embodiments, the concentration of the additive is 0.1 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM, 1 mM, 1.2 mM, 1.4 mM, 1.6 mM, 1.8 mM, 2.0 mM, 2.2 mM, 2.4 mM, 2.6 mM, 2.8 mM, 3.0 mM, 3.2 mM, 3.4 mM, 3.6 mM, 3.8 mM, 4.0 mM, 4.2 mM, 4.4 mM, 4.6 mM, 4.8 mM, 5.0 mM, 6.0 mM, 7.0 mM, 8.0 mM, 9.0 mM, 10.0 mM, 12.0 mM, 14.0 mM, 16.0 mM, 18.0 mM, 20.0 mM, 22.0 mM, 24.0 mM, 26.0 mM, 28.0 mM, 30.0 mM, 32.0 mM, 34.0 mM, 36.0 mM, 38.0 mM, 40.0 mM, 42.0 mM, 44.0 mM, 46.0 mM, 48.0 mM or 50 mM. In some embodiments, in step (C1) of the Group III, the molar ratio of the transition metal ions and the antibody is 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1 or 15: 1.

[0282] In some embodiments, the excess amount of metal chelators and a complex of the metal chelators and the transition metal ions are filtered out in dialysis, ultrafiltration or gel filtration.

[0283] In some embodiments, in the method of the Group III comprising step (R1) , step (C1) , step (C2) , step (R2) and step (C3) in order, the conjugates with three kinds of payloads are prepared, which includes D4+D2+D2, D4+D2+D1, D4+D1+D2, D4+D1+D1, D2+D2+D2, D2+D2+D1, D2+D1+D2 and / or D2+D1+D1.

[0284] The method of the Group IV

[0285] In the method of the Group IV, the antibody is an engineered antibody I comprising two amino acid substitutions of two interchain cysteines forming one interchain disulfide bond in the hinge region, optionally, the amino acid substitutions are selected from the following, cysteine to alanine, to leucine, to arginine, to lysine, to asparagines, to methionine, to aspartic acid, to phenylalanine, to praline, to glutamine, to serine, to glutamic acid, to threonine, to glycine, to tryptophan, to histidine, to tyrosine, to isoleucine or to valine, respectively, more optionally, the amino acid substitutions are selected from the following, cysteine to serine.

[0286] In some embodiments, in step (R1’ ) of the Group IV, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 3.5: 1 or more than 3.5: 1. In some embodiments, in step (R1’ ) of the Group IV, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 3.5: 1-8: 1. In some embodiments, in step (R1’ ) of the Group IV, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 3.5: 1, 4: 1, 4.5: 1, 5: 1, 5.5: 1, 6: 1, 6.5: 1, 7: 1, 7.5: 1 or 8: 1.

[0287] In some embodiments, in step (R1’ ) of the Group IV, when the antibody is an engineered antibody I, the first reductant reduces about three of the interchain disulfide bonds within antibody.

[0288] In some embodiment, the concentration of the first reductant and the antibody in step (R1’ ) of the Group IV are the same as that in step (R1) of the Group I.

[0289] In some embodiments, the incubation temperature and the incubation time in step (R1’ ) of the Group IV are the same as that in step (R1) of the Group III.

[0290] In some embodiments, the molar ratio of the transition metal ions and the antibody in step (C1’ ) of the Group IV is 0.5: 1-10: 1. In some embodiments, the molar ratio of the transition metal ions and the antibody in step (C1’ ) of the Group IV is 2: 1-6: 1. In some embodiments, the molar ratio of the transition metal ions and the antibody in step (C1’ ) of the Group IV is 0.5: 1, 1: 1, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1 or 10: 1.

[0291] In some embodiments, the reactive temperature and the reactive time in step (C1’ ) of the Group IV are the same as that in step (C1) of the Group III.

[0292] In some embodiments, the molar ratio of the first conjugating group and the antibody in step (C1’ ) of the Group IV are the same as that in step (C1) of the Group III.

[0293] In some embodiments, the parameters in step (E1) and step (C2) are the same as that in step (E1) and step (C2) of the Group III.

[0294] In some embodiments, the DAR value of conjugates prepared by the method of the Group IV comprising step (R1’ ) and step (C1’ ) or comprising step (R1’ ) , step (C1’ ) and step (E1) is 4 (or D4) , in this case, four of the first linker-payloads are linked to the antibody. In some embodiments, the DAR value of conjugates prepared by method of the Group IV comprising step (R1’ ) and step (C1’ ) or comprising step (R1’ ) , step (C1’ ) and step (E1) is 2 (or D2) , in this case, two of the first thiobridge reagent bearing the first linker-payloads are linked to an antibody.

[0295] In some embodiments, in the method of the Group IV comprising step (R1’ ) , step (C1’ ) and step (C2) , the bi-payload conjugates are prepared, which includes D4+D2, D4+D1, D2+D2 and / or D2+D1.

[0296] In some embodiments, the method of the Group IV further comprises a step of purification after step (R1’ ) , step (C1’ ) , step (E1) or step (C2) . In some embodiments, the purification method of the Group IV is the same as that of the Group I.

[0297] In some embodiments. the method further comprises a step of purification after step (R1’ ) to remove excessive the first reductant. In some embodiments. the method further comprises a step of purification after step (E1) to remove excessive the oxidant.

[0298] In some embodiments, when the method of the Group IV comprises a step of purification after step (R1’ ) , adding a proper amount of the additive before step (C1’ ) . In some embodiments, the concentration of the additive is 0.1 mM-50 mM. In some embodiments, the concertation of the additive is 1 mM-2 mM. In some embodiments, the concentration of the additive is 0.1 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM, 1 mM, 1.2 mM, 1.4 mM, 1.6 mM, 1.8 mM, 2.0 mM, 2.2 mM, 2.4 mM, 2.6 mM, 2.8 mM, 3.0 mM, 3.2 mM, 3.4 mM, 3.6 mM, 3.8 mM, 4.0 mM, 4.2 mM, 4.4 mM, 4.6 mM, 4.8 mM, 5.0 mM, 6.0 mM, 7.0 mM, 8.0 mM, 9.0 mM, 10.0 mM, 12.0 mM, 14.0 mM, 16.0 mM, 18.0 mM, 20.0 mM, 22.0 mM, 24.0 mM, 26.0 mM, 28.0 mM, 30.0 mM, 32.0 mM, 34.0 mM, 36.0 mM, 38.0 mM, 40.0 mM, 42.0 mM, 44.0 mM, 46.0 mM, 48.0 mM or 50 mM.

[0299] In some embodiments, the excess amount of metal chelators and a complex of the metal chelators and the transition metal ions are filtered out in dialysis, ultrafiltration or gel filtration.

[0300] In some embodiments, the method of the Group I, of the Group II, of the Group III and / or the Group IV, further comprises the following steps,

[0301] introducing a compound that contains at least one thiol group to consume excessive the first conjugating group in step (C1) , the second conjugating group in step (C2) and / or the third conjugating group in step (C3) .

[0302] there is no specific limitation to the compound to consume excessive the first conjugating group, the second conjugating group and / or the third conjugating group, as long as the compound contains at least one thiol group. In some embodiments, the compound comprises any one of the groups consisting of cysteine or acetylcysteine.

[0303] In some embodiments, the first reductant and the second reductant comprise at least one of the group consisting of tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) , TCEP derivatives, 3- [tris (hydroxymethyl) phosphonio] propionate (THPP) , 2-diphenylphosphanybenzensulfonic acid (diPPBs) , Dithiothreitol (DTT) , 2-diphenylphosphino) acetic acid (DPAA) , dithioerythritol (DTE) , β-Mercaptoethanol, LiAlH4, Na2S2O3, KBH4 or Hydrazine.

[0304] As used in herein, the term “TCEP derivatives” refers to the modified structure of TCEP.

[0305] In some embodiments, the first reductant and the second reductant comprise at least one of the groups consisting of TCEP, THPP or TCEP derivatives selected from the following structure,

[0306] As used herein, the term “transition metal ions” refers to the elements of groups 4-12, justified by their typical chemistry, i.e., a large range of complex ions in various oxidation states, colored complexes, and catalytic properties either as the element or as ions (or both) . Sc and Y in Group 3 are also generally recognized as transition metals.

[0307] In some embodiments, the transition metal ions in the method of the Group I. II, III and IV comprises at least one of Zn2+, Cd2+, Hg2+, Ni2+, Co2+, or the combination thereof. In some embodiments, the transition metal ions are Zn2+.

[0308] In some embodiments, there is no specific limitation to the salts of the transition metal ions or the complexes of the transition metal ions, as long as the transition metal ions are soluble in the reaction solution and act as the resource of free transition metal ion for any further function or complexation in the reaction solution. In some embodiments, the salts of the transition metal ions are lactate, chloride, nitrate, sulfate, acetate, iodide, bromine, formate or tetrafluorborate.

[0309] In some embodiments, the salts of Zn2+ are ZnCl2, Zn (NO3) 2, ZnSO4, Zn (CH3COO) 2, ZnI2, ZnBr2, Zinc formate, or zinc tetrafluoroborate. In some embodiments, the salts of Zn2+ are ZnCl2.

[0310] In some embodiments, The buffer system of the Group I, II, III and IV comprises at least one of His buffer, MES buffer, Bis-Tris buffer, PIPES buffer, MOPS buffer, BES buffer, HEPES buffer, ADA buffer, PB buffer, DIPSO buffer, MOBS buffer, MOPSO buffer, TES buffer, ACES buffer, TAPSO buffer, PBS, Acetate buffer, BTP buffer, HEPPSO buffer, POPSO buffer, EPPS buffer or Tris buffer. In some embodiments, the buffer system of the Group I, II, III and IV comprises at least one of His buffer, Bis-Tris buffer, MOPS buffer, BES buffer, HEPES buffer, DIPSO buffer, MOBS buffer, MOPSO buffer, TES buffer, ACES buffer, TAPSO buffer or MES buffer.

[0311] In some embodiments, in the method of the Group III and / or of the Group IV, the buffer system comprises at least one of His buffer, Bis-Tris buffer, MOPS buffer, BES buffer, HEPES buffer, DIPSO buffer, MOBS buffer, MOPSO buffer, TES buffer, ACES buffer, TAPSO buffer, PIPES buffer or MES buffer.

[0312] As used herein, the term “ADA buffer” refers to N- (Carbamoylmethyl) iminodiacetic acid buffer.

[0313] As used herein, the term “MES buffer” refers to 2- (N-morpholino) ethane sulfonic acid buffer.

[0314] As used herein, the term “Bis-Tris buffer” refers to Bis (2-hydroxyethyl) amino-tris (hydroxymethyl) methane buffer.

[0315] As used herein, the term “PIPES buffer” refers to piperazine-1, 4-bisethanesulfonic acid buffer.

[0316] As used herein, the term “MOPS buffer” refers to 3-morpholinopropanesulfonic Acid buffer.

[0317] As used herein, the term “BES buffer” refers to N, N-Bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulphonic acid buffer.

[0318] As used herein, the term “HEPES buffer” refers to 4-hydroxyethyl piperazine ethane sulfonic acid buffer.

[0319] As used herein, the term “DIPSO buffer” refers to 3- [bis (2-hydroxyethyl) amino] -2-hydroxypropanesulphonic acid buffer.

[0320] As used herein, the term “MOBS buffer” refers to 3-morpholinopropanesulfonic Acid buffer.

[0321] As used herein, the term “MOPSO buffer” refers to 3- (N-morpholino) -2-hydroxy-1-propanesulfonic acid buffer.

[0322] As used herein, the term “TES buffer” refers to 2- [tris (hydroxymethyl) methylamino] -1-ethanesulfonic acid buffer.

[0323] As used herein, the term “ACES buffer” refers to N- (carbamoylmethyl) taurine buffer.

[0324] As used herein, the term “TAPSO buffer” refers to 3- [N-tris- (hydroxymethyl) methylamino] -2-hydroxypropanesulphonic acid buffer.

[0325] As used herein, the term “PBS” refers to phosphate buffer saline.

[0326] As used herein, the term “ADA buffer” refers to N- (Carbamoylmethyl) iminodiacetic acid buffer.

[0327] As used herein, the term “PB buffer” refers to refers to phosphate buffer.

[0328] As used herein, the term “BTP buffer” refers to Bis-tris propane buffer.

[0329] As used herein, the term “Heppso buffer” refers to N- (Hydroxyethyl) piperazine-N'-2-hydroxypropanesulfonicacid buffer.

[0330] As used herein, the term “POPSO buffer” refers to piperazine-N, N’ -bis (2-hydroxy-propane sulfonic) acid buffer.

[0331] As used herein, the term “EPPS buffer” refers to 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinepropanesulfonic acid buffer.

[0332] As used herein, the term “Tris buffer” refers to tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer.

[0333] As used herein, the term “His buffer” refers to the buffer comprises histidine.

[0334] In some embodiments, when the buffer system is His buffer, the additive could be introduced by the buffer system. In some embodiments, the buffer system of step (R1) and (R2) is the same. In some embodiments, the buffer system of step (R1) and (R2) is different.

[0335] In some embodiments, the concentration of the buffer system independently is 10 mM to 100 mM (mmol / L) . In some embodiments, the concertation of the buffer system is 10 mM to 100 mM, 20 mM to 80 mM, 20 mM to 40 mM, 20 mM to 60 mM, 40 mM to 80 mM, or 40 mM to 60 mM. In some embodiments, the concertation of the buffer system is 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM,

[0336] In some embodiments, the concentration of buffer system of step (R1) and (R2) is the same. In some embodiments, the concentration of buffer system of step (R1) and (R2) is different.

[0337] In some embodiments, the pH value of the buffer system is 5.8 to 8.0. In some embodiments, the pH value of the buffer system is 6.4 to 7.4. In some embodiments, the pH value of the buffer system is 6.7 to 7.4. In some embodiments, the pH value of the buffer system is 6.0, 6.2, 6.5, 6.8, 7.0, 7.2 or 7.4.

[0338] In some embodiments, the buffer system is His buffer, the concentration of the buffer system is 10mM to 50mM, the pH of the buffer system is 5.5-7.5, and / or the in step (R1) and / or in step (R1’ ) , the incubation temperature is 0℃ to 10℃. In some embodiments, the buffer system is His buffer, the concentration of the buffer system is 10mM, 15mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM or 50mM, the pH of the buffer system is 5.5, 5.7, 5.9, 6.0, 6.2, 6.4, 6.5, 6.7, 6.9, 7.0, 7.2, 7.4 or 7.5, and the in step (R1) and / or in step (R1’ ) , the incubation temperature is 0℃, 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃ or 10℃.

[0339] In the present disclosure, the metal chelators can trap excessive the transition metal ions. There is no specific limitation to the metal chelators, as long as the metal chelators can trap the excessive transition metal ions and do not affect the reduction of the disulfide bonds within the antibody. In some embodiments, the metal chelators are selected from a group consisting of ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) , ethylenediamine, 2, 2’ -bipyridine, 1, 10-phenanthroline, nitrilotriacetic acid (NTA) , diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) , citric Acid (CA) , tartaric acid (TA) , gluconic acid (GA) or N- (2-hydroxyethyl) ethylenediamine-N, N', N'-triacetic acid (HEDTA) .

[0340] In some embodiments, the metal chelators are selected from a group consisting of EDTA, NTA and DTPA, or their sodium salt. In some embodiments, the metal chelators in the method are Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA-2Na) .

[0341] In some embodiments, A linker-payload includes a linker and a payload, which are covalently linked.

[0342] In some embodiments, a linker of the first linker-payload, the second liner payload and the third linker-payload is selected from any one of which the one terminal can be connected to the reduced thiol group of the antibody or the reactive groups of the thiobridge reagent, and the other terminal can be connected to the payload.

[0343] As used herein, the term “linker” refers to a molecule which contains at least two substituted groups, one of which can covalently bond a drug molecule and the other of which can covalently couple to an antibody or the reactive groups of the thiobridge reagent.

[0344] In some embodiments, when the first linker-payload, the second linker-payload and / or the third linker-payload react (s) with the reduced thiol groups, the linker of the first linker-payload, the second linker-payload and / or the third linker-payload independently includes a cleavable linker or a noncleavable linker. Cleavable linkers optionally are chemically labile and enzyme-labile linkers. Due to the high plasma stability and good intracellular cleaving selectivity and efficiency, enzyme-labile linkers (such as cathepsin B) are broadly selected as cleavable linker candidates in antibody-drug conjugates (ADCs) . In some embodiments, enzyme-labile linkers include a peptide unit (-AAs-) , -maleimidocaproyl- (-MC-) , -maleimidocaproyl-peptide moiety- (-MC-peptide moiety-) , -p-aminobenzyl alcohol- (-PAB-) . In some embodiments, the peptide unit is dipeptides, tripeptides, tetrapeptides or pentapeptides.

[0345] In some embodiments, without the limitation, the dipeptides may be valine-alanine (VA) , valine-citrulline (VC) , alanine-asparagine (AD) , alanine-phenylalanine (AF) , phenylalanine-lysine (FK) , alanine-lysine (AK) , alanine-valine (AV) , valine-lysine (VK) , lysine-lysine (KK) , phenylalanine-citrulline (FC) , leucine-citrulline (LC) , isoleucine-citrulline (IC) , tryptophan-citrulline (WC) or phenylalanine-alanine (FA) . In some embodiments, the dipeptides can be valline-citruline- (-Val-Cit-) , -valline-lysine- (-Val-Lys-) , -valline-arginine- (-Val-Arg-) , -phenylalanine-citruline- (-Phe-Cit-) , -phenylalanine-lysine- (-Phe-Lys-) , and -phenylalanine-arginine- (-Phe-Arg-) . Typical enzyme-labile linkers include -Val-Cit-and -Phe-Lys-, which can be recognized by cathepsin B.

[0346] In some embodiments, without the limitation, the tripeptides may be alanine-alanine-asparagine (AAD) , glycine-valine-citrulline (GVC) , glycine-glycine-glycine (GGG) , phenylalanine-phenylalanine-lysine (FFK) , glutamic acid-valine-citrulline (EVC) , or glycine-phenylalanine-lysine (GFK) .

[0347] In some embodiments, without the limitation, the tetrapeptides may be glycine-glycine-phenylalanine-glycine (GGFG) .

[0348] In some embodiments, without the limitation, when the first linker-payload, the second linker-payload and / or the third linker-payload react (s) with the reduced thiol groups, the linker of the first linker-payload, the second linker-payload and the third linker-payload can be MC-VA-PAB, MC-VC-PAB, MC-AD-PAB, MC-AF-PAB, MC-FK-PAB, MC-AK-PAB, MC-AV-PAB, MC-VK-PAB, MC-KK-PAB, MC-FC-PAB, MC-LC-PAB, MC-IC-PAB, MC-WC-PAB or MC-FA-PAB independently. In some embodiments, without the limitation, when the first linker-payload, the second linker-payload and / or the third linker-payload react (s) with the reduced thiol groups, the linker of the first linker-payload, the second linker-payload and / or the third linker-payload can be MC-AAD-PAB, MC-GVC-PAB, MC-GGG-PAB, MC-FFK-PAB, MC-EVC-PAB, or MC-GFK-PAB independently. In some embodiments, without the limitation, when the first linker-payload, the second linker-payload and / or the third linker-payload react (s) with the reduced thiol groups, the linker of the first linker-payload, the second linker-payload and the third linker-payload can be MC-GGFG.

[0349] In some embodiments, the linker comprises a maleimide bearing a drug, an organic chloride bearing a drug, an organic bromide bearing a drug, an organic iodide bearing a drug and / or vinylpyrimidine bearing a drug.

[0350] In some embodiments, the linker includes a maleimide bearing a drug, an organic chloride bearing a drug, an organic bromide bearing a drug, an organic iodide bearing a drug and / or vinylpyrimidine bearing a drug.

[0351] In some embodiments, when the first linker-payload, the second linker-payload and / or the third linker-payload react (s) with the reactive groups in the thiobridgee reagent, the linker of the first linker-payload, the second linker-payload and / or the third linker-payload further include (s) azido and / or dibenzocyclooctyne (DBCO) . In some embodiments, when the linker of the first linker-payload, the second linker-payload and / or the third linker-payload contains azido, the reactive groups of the thiobridge group contain DBCO. In some embodiments, when the linker of the first linker-payload, the second linker-payload and / or the third linker-payload contains DBCO, the reactive groups of the thiobridge group contain azido.

[0352] In some embodiments, when the linker of the first linker-payload, the second linker-payload and / or the third linker-payload react (s) with the reactive groups in the thiobridge reagent, the linker of the first linker-payload, the second linker-payload and the third linker-payload is independently selected from any one of the groups consisting of

[0353] wherein, n is integer of 0-20, and m is integer of 0-20 in the linker. In some embodiments, n is 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10; and m is 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 in the linker.

[0354] In the method, the linker optionally bears an azido and / or dibenzocyclooctyne (DBCO) , so that the linker links to the antibody.

[0355] In some embodiments, the payload of linker-payload is selected from any one of which contains at least one substituted group allowing a connection from the payload to the linker. In some embodiments, the payload is a cytotoxic agent, a cytokine, a nucleic acid, a radionuclide, a chemokine, an immuno (co) -stimulatory molecule, an immunosuppressive molecule, a kinase, a prodrug-converting enzyme, a RNase, a growth factor, a hormone, a coagulation factor, a fibrinolytic protein, peptides mimicking these, and fragments, fusion proteins, or derivatives thereof.

[0356] As used herein, the term “payload” refers to any cytotoxic molecule at least one substituted group or a partial structure allowing connection to a linker structure. The payload may kill cancer cells and / or inhibit growth, proliferation, or metastasis of cancer cells, thereby reducing, alleviating, or eliminating one or more symptoms of a disease or disorder.

[0357] In some embodiments, the payload is a cytotoxic molecule at least one substituted group or a partial structure allowing connection to a linker structure. The payload may kill cancer cells and / or inhibit growth, proliferation, or metastasis of cancer cells, thereby reducing, alleviating, or eliminating one or more symptoms of a disease or disorder. The payload includes but not limited to topoisomerases inhibitor and tubulin inhibitors.

[0358] Exemplary payloads are monomethyl auristatin E (MMAE) , monomethyl auristatin D (MMAD) , monomethyl auristatin EF (MMAF) , calicheamicins (CLM) , mertansine (DM1) , maytansinoids, duocarmycins, anthracyclines, pyrrolobenzodiazepine dimers, amatoxin, quinolinealkaloid, Dxd, doxorubicin hydrochloride, methotrexate, erlotinib, bortezomib, fulvestrant, sunitib imatinib mesylate, letrozole, finasunate, platins such as oxaliplatin, carboplatin, and cisplatin, finasunate, fluorouracil, rapamycin, leucovorin, lapatinib, lonafamib, sorafenib, gefitinib, capmtothecin, topotecan, bryostatin, adezelesin, anthracyclin, carzelesin, bizelesin, dolastatin, auristatins, duocarmycin, eleutherobin, taxols such as paclitaxel or docetaxel, cyclophasphamide, doxorubicin, vincristine, prednisone or prednisolone, other alkylating agents such as mechlorethamine, chlorambucil, and ifosfamide, antimetabolites such as azathioprine or mercaptopurine, vincristine, vinblastine, vinorelbine, vindesine, etoposide, teniposide, etoposide phosphate, epipodophyllotoxins, actinomycin, daunorubicin, valrubicin, idarubicin, edrecolomab, epirubicin bleomycin, plicamycin or mitomycin, and salts thereof.

[0359] In some embodiments, the payload is deruxtecan (DXd) , cyanine 3 (Cy3) , MMAE, MMAD or MMAF. In some embodiments of the present application, the payload is MMAE, DXd or Cy3.

[0360] The linker-payload is a chemical moiety, which is synthesized by connecting the linker to the payload. Depending on the desired payload and selected linker, those skilled in the art can select suitable method for coupling them together. For example, some conventional coupling methods, such as amine coupling methods, may be used to form the desired linker-payload which still contains reactive groups for conjugating to the antibodies through covalent linkage. A drug-maleimide complex (i.e., maleimide linking drug) is taken as an example of the payload bearing reactive group in the present disclosure. Most common reactive group capable of bonding to thiol group is maleimide. Additionally, organic chloride, bromides, iodides also are frequently used.

[0361] The linker-payload could be any physical active compound, or any compound used to diagnose, prevent or treat a disease, such as MC-GGFG-DXd, MC-VC-PAB-MMAE, MC-VC-PAB-MMAD, and MC-VC-PAB-MMAF.

[0362] In some embodiments, the first linker-payload, the second linker-payload and the third linker-payload are the same. In some embodiments, the first linker-payload, the second linker-payload and the third linker-payload are different.

[0363] The first thiobridge reagent, the second thiobridge reagent and the third thiobridge reagent independently contain at least two substituted groups a allowing re-bridging of the thiol groups.

[0364] In some embodiments, without the limitation, the first thiobridge reagent, the second thiobridge reagent and the third thiobridge reagent are independently selected from the group consisting of

[0365] In some embodiments, the reactive groups contain an azido and / or dibenzocyclooctyne (DBCO) .

[0366] In some embodiments, the thiobridge reagent and the reactive groups are connected by alkyl group or polyethylene glycol (PEG) .

[0367] In some embodiments, without the limitation, the first thiobridge reagent bearing reactive groups, the second thiobridge reagent and the second thiobridge reagent bearing reactive groups are independently selected from the group consisting of

[0368] Wherein n is an integer of 0-20, optionally, n is 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 8, 9, 10 in the first thiobridge reagent bearing reactive groups, in the second thiobridge reagent bearing reactive groups and in the third thiobridge reagent bearing reactive groups.

[0369] In some embodiments, the first thiobridge reagent bearing reactive groups, the second thiobridge reagent bearing reactive groups and the third thiobridge reagent bearing reactive groups are dibromomaleimide-PEG4-N3 having the following formula

[0370] On appropriate conditions, the reactive groups could react with the linker-payloads, and the linker-payload is connected to thiobridge reagent by covalence. With the change of reactive groups or linker-payloads, the reaction products maybe change. In the disclosure, the products of different reactive groups and linker-payloads are collectively referred to as thiobridge reagent bearing linker-payload.

[0371] In some embodiments, the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, the second thiobridge reagent bearing the second linker-payload and the third thiobridge reagent bearing the third linker-payload have the following formula:

[0372] Q-S-T

[0373] Wherein, Q is selected from the groups consisting of

[0374] S is selected from a cleavable linker or a non-cleavable linker, without the limitation, S is selected from the groups consisting of

[0375] wherein, n is 0-20, m is 0-20, optionally, n is 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10, m is 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.

[0376] T is payload.

[0377] In some embodiments, the first thiobridge reagent bearing the first linker-payload, the second thiobridge bearing the second linker-payload and the third thiobridge bearing the third linker-payload are independently selected from the group consisting of

[0378] In some embodiments, the first conjugating group is the first linker-payload. In some embodiments, the first conjugating group is the first thiobridge reagent, optinally, the first thiobridge reagent bearing the reactive groups or the first liker-payload.

[0379] In some embodiments, the second conjugating group is the second linker-payload. In some embodiments, the second conjugating group is the second thiobridge reagent, optinally, the second thiobridge reagent bearing the reactive groups or the second liker-payload.

[0380] In some embodiments, the third conjugating group is the third linker-payload. In some embodiments, the third conjugating group is the third thiobridge reagent, optinally, the third thiobridge reagent bearing the reactive groups or the third liker-payload.

[0381] In some embodiments, the first conjugating group, the second conjugating group and the third conjugating group include Maleimide-PEG4-N3-DBCO-Cy3, Maleimide-VC-PAB-MMAE or MC-GGFG-DXd independently.

[0382] In some embodiments, there is no specific limitation to the antibody. According to the antigens associated with the disease, those skilled in the art can select suitable antibody useful in method of the present disclosure. In some embodiments, the antibody is a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a mono-specific antibody or a multi-specific antibody.

[0383] In some embodiments, the antibody is a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, or an antigen-binding moiety thereof.

[0384] As used herein, the term “human antibody” refers to one which possesses an amino acid sequence which corresponds to that of an antibody produced by a human or a human cell or derived from anon-human source that utilizes human antibody repertoires or other human antibody-encoding sequences. This definition of a human antibody specifically excludes a humanized antibody comprising non-human antigen-binding residues.

[0385] As used herein, the term “humanized antibody” refers to a chimeric antibody comprising amino acid residues from non-human heavy chain variable regions (HVRs) and amino acid residues from human FRs. In certain embodiments, a humanized antibody will include substantially all or at least one, and typically two, variable domains, in which all or substantially all of the HVRs (e.g., CDRs) correspond to those of a non-human antibody, and all or substantially all of the FRs correspond to those of a human antibody. A humanized antibody optionally may include at least a portion of an antibody constant region derived from a human antibody. A “humanized form” of an antibody, e.g., a non-human antibody, refers to an antibody that has undergone humanization.

[0386] As used herein, the term “chimeric antibody” refers to an antibody in which a portion of the heavy and / or light chain is derived from a particular source or species, while the remainder of the heavy and / or light chain is derived from a different source or species.

[0387] In some embodiments, the antibody means an immunoglobulin and is a molecule containing an antigen-binding site immunospecifically binding to an antigen. In some embodiments of the present application, the class of the antibody is IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, or IgY. In some embodiments of the present application, the class of the antibody is IgG.

[0388] In some embodiments, the class of the antibody is IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4. In some embodiments, the antibody is IgG1 or IgG4.

[0389] In some embodiment, the antibody is wild type antibody.

[0390] As use herein, the term “wild type” refers to naturally occurring and without mutation.

[0391] In some embodiments, the antibody is an engineered antibody I comprising two amino acid substitutions of two interchain cysteines forming one interchain disulfide bond in the hinge region.

[0392] In some embodiments, the amino acid substitutions are selected from the following, cysteine to alanine, to leucine, to arginine, to lysine, to asparagine, to methionine, to aspartic acid, to phenylalanine, to praline, to glutamine, to serine, to glutamic acid, to threonine, to glycine, to tryptophan, to histidine, to tyrosine, to isoleucine or to valine, respectively.

[0393] In some embodiments, the amino acid substitutions are selected from the following, cysteine to asparagines, to leucine, to glutamine, to serine, to threonine or to tyrosine, respectively.

[0394] In some embodiments, the amino acid substitution is cysteine to serine. In some embodiments, the amino acid substitutions is cysteine to leucine.

[0395] In some embodiments, in Eu numbering, the engineered antibody I includes a mutation at residue position C229. In some embodiments, in IMGT exon numbering, the engineered antibody I includes a mutation at residue position C11. In some embodiments, in Kabat numbering, the engineered antibody I includes a mutation at residue position C242. In some embodiments, the residue position is in reference to IgGl.

[0396] In some embodiments, when the antibody is wild type, the hinge region of the antibody comprises the animo acid sequence CPPCPAPE. In some embodiments, the hinge region of the engineered antibody I comprises the animo acid sequence CPPXPAPE, wherein, X is selected from any one of the groups consisting of A, L, R, K, N, M, D, F, Q, S, T, G, W, H, Y, I, V, P or E.

[0397] In some embodiments, in step (R1’ ) of the Group II and / or of the Group IV, the antibody is the engineered antibody I. In some embodiments, in step (R1) of the Group I and / or of the Group III, the antibody is the engineered antibody I.

[0398] In some embodiments, the antibody includes at least one mutation in the Fc region. In some embodiments, the at least one mutation modulates effector function, or attenuates or eliminates Fcγreceptor binding.

[0399] In some embodiments, the one or more mutations are to stabilize the antibody and / or to increase half-life. In some instances, the one or more mutations are to modulate Fc receptor interactions, to reduce or eliminate Fc effector functions such as FcγR, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC) . In additional instances, the one or more mutations are to modulate glycosylation.

[0400] In some embodiments, the one or more mutations are located in the Fc region. In some embodiments, the Fc region includes a mutation at residue position L234, L235, or a combination thereof. In some instances, the mutations include L234 and L235. In some instances, the mutations include L234A and L235A. In some cases, the residue positions are in reference to IgGl.

[0401] In some embodiments, the Fc region includes a mutation at residue position L234, L235, D265, N21, K46, L52, or P53, or a combination thereof. In some instances, the mutations include L234 and L235 in combination with a mutation at residue position K46, L52, or P53. In some cases, the residue positions are in reference to IgGl.

[0402] In some embodiments, the Fc region includes mutations at L234, L235, and K46. In some cases, the Fc region includes mutations at L234, L235, and L52. In some cases, the Fc region includes mutations at L234, L235, and P53. In some cases, the Fc region includes mutations at D265 and N21. In some cases, the residue position is in reference to IgGl.

[0403] In some instances, the Fc region includes L234A, L235A, D265A, N21G, K46G, L52R, or P53G, or a combination thereof. In some instances, the Fc region includes L234A and L235A in combination with K46G, L52R, or P53G. In some cases, the Fc region includes L234A, L235A, and K46G. In some cases, the Fc region includes L234A, L235A, and L52R. In some cases, the Fc region includes L234A, L235A, and P53G. In some cases, the Fc region includes D265A and N21G. In some cases, the residue position is in reference to IgGl.

[0404] In some embodiments, the Fc region includes a mutation at residue position L233, L234, D264, N20, K45, L51, or P52. In some instances, the Fc region includes mutations at L233 and L234 in combination with a mutation at residue position K45, L51, or P52. In some cases, the Fc region includes mutations at L233, L234, and K45. In some cases, the Fc region includes mutations at L233, L234, and L51. In some cases, the Fc region includes mutations at L233, L234, and K45. In some cases, the Fc region includes mutations at L233, L234, and P52. In some instances, the Fc region includes mutations at D264 and N20. In some cases, equivalent positions to residue L233, L234, D264, N20, K45, L51, or P52 in an IgGl, IgG2, IgG3, or IgG4 framework are contemplated.

[0405] In some embodiments, the Fc region includes L233A, L234A, D264A, N20G, K45G, L51R, or P52G. In some instances, the Fc region includes L233A and L234A. In some instances, the Fc region includes L233A and L234A in combination with K45G, L51R, or P52G. In some cases, the Fc region includes L233A, L234A, and K45G. In some cases, the Fc region includes L233A, L234A, and L51R. In some cases, the Fc region includes L233A, L234A, and K45G. In some cases, the Fc region includes L233A, L234A, and P52G. In some instances, the Fc region includes D264A and N20G. In some cases, the residue position is in reference to IgGl.

[0406] In some embodiments, the human IgG constant region is modified to alter antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and / or complement-dependent cytotoxicity (CDC) , e.g., with an amino acid modification described inNatsume et al., 2008 Cancer Res, 68 (10) : 3863-72; Idusogie et al., 2001 J Immunol, 166 (4) : 2571-5; Moore et al., 2010 mAbs, 2 (2) : 181-189; Lazar etal, 2006 PNAS, 103 (11) : 4005-4010, Shields etal, 2001 JBC, 276 (9) : 6591-6604; Stavenhagen etal., 2007 Cancer Res, 67 (18) : 8882-8890; Stavenhagen etal., 2008 Advan. Enzyme Regul., 48: 152-164; Alegre et al, 1992 J Immunol, 148: 3461-3468; Reviewed in Kaneko and Niwa, 2011 Biodrugs, 25 (1) : 1-11.

[0407] In some embodiments, the antibody of IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 is human or humanized antibody. The information of IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 can be obtained on NCBI or UniProt (https:  / / www. uniprot. org / ) .

[0408] In some embodiments, the antibody is bispecific antibodies. In some embodiments, the antibody is IgG1 like bispecific antibodies.

[0409] In some embodiments of the present application, those skilled in the art can select suitable method to prepare the bispecific antibodies. In some embodiments, the bispecific antibodies can be obtained by Knobs-in-holes technology (Ridgway J B B, Presta L G, Paul C. 'Knobs-into-holes'engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization [J] . Protein Engineering (7) : 617 (2023-08-11) . ) , format chain exchange (FORCE) technology, a common light chain format technology (De Nardis C, Hendriks L J A, Poirier E, et al . A new approach for generating bispecific antibodies based on a common light chain format and the stable architecture of human immunoglobulin G1 [J] . Journal of Biological Chemistry, 2017: jbc. M117.793497. ) , controlled Fab arm exchange technology (Yanakieva De, Pekar L, Evers A, et al. Beyond bispecificity: Controlled Fab arm exchange for the generation of antibodies with multiple specificities [J] . MABS, 2022, 14 (1) , e2018960) , CrossMAb technology (Klein C, Schaefer W, Regula J T. The use of CrossMAb technology for the generation of bi-and multispecific antibodies [J] . MABS, 2016, 8 (6) , P1010-P1020. ) or their combination.

[0410] As used herein, the term “knobs-into-holes” is used in its broadest sense and encompasses various situations, such as the CH1 domain of one heavy chain with the knob mutations and the CH1 domain of the other heavy chain with the hole mutations, the CH2 domain of one heavy chain with the knob mutations and the CH2 domain of the other heavy chain with the hole mutations, and / or the CH3 domain of one heavy chain with the knob mutations and the CH3 domain of the other heavy chain with the hole mutations. For example, and generally, “knobs-into-holes” may refer to an intra-interface modification between two antibody heavy chains in the CH3 domains: i) in the CH3 domain of one heavy chain (first CH3 domain) , an amino acid residue is substituted with another amino acid residue bearing a large side chain, thereby creating a protrusion ( “knob” ) in the interface in the first CH3 domain; ii) in the CH3 domain of the other heavy chain (second CH3 domain) , an amino acid residue is substituted with another amino acid residue bearing a smaller side chain, thereby creating a cavity ( “hole” ) within the interface in the second CH3 domain, in which a protrusion ( “knob” ) in the first CH3 domain can be placed.

[0411] In some embodiment, the antibody is selected from any one of cytotoxic antibodies, inhibitors of cell proliferation, regulators of cell activation and interaction, regulators of the human immune system, neutralizations of antigens, antibodies that are immunospectific for viral antigens or antibodies that are immunospectific for microbial antigens.

[0412] In some embodiment, the antibody can be target-specific antibodies, In some embodiments of the present application, without the limitation, the antibody can be anti-HER2 antibody, anti-FAP antibody, anti-OX-40 antibody, anti-41BB antibody, anti-Angiopoietin-2 antibody, anti-ant-IL-4Rα antibody, anti-BCMA antibody, anti-Blys antibody, anti-BTNO2 antibody, anti-C5 antibody, anti-CD122 antibody, anti-CD13 antibody, anti-CD133 antibody, anti-CD137 antibody, anti-CD138 antibody, anti-CD16a antibody, anti-CD19 antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD22 antibody, anti-CD27 antibody, anti-CD28 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD30 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD38 antibody, anti-CD40 antibody, anti-CD47 antibody, anti-CD-8 antibody, anti-CD79 antibody, anti-CEA antibody, anti-CGPR / CGRPR antibody, anti-CSPGs antibody, anti-CTLA4 antibody, anti-CTLA-4domains antibody, anti-DLL-4 antibody, anti-EGFR antibody, anti-EpCAM antibody, anti-factor IXa antibody, anti-factor X antibody, anti-GITR antibody, anti-GP130 antibody, anti-Her3 antibody, anti-HSG antibody, anti-ICOS antibody, anti-IGF1 antibody, anti-IGF1 / 2 antibody, anti-IGF-1R antibody, anti-IGF2 antibody, anti-IGFR antibody, anti-IL-1 antibody, anti-IL-12 antibody, anti-IL-12p40 antibody, anti-IL-13 antibody, anti-IL-17A antibody, anti-IL-1β antibody, anti-IL-23 antibody, anti-IL-5 antibody, anti-IL-6 antibody, anti-IL-6R antibody, anti-Lag-3 antibody, anti-LAG3 antibody, anti-MAG antibody, anti-Met antibody, anti-NgR antibody, anti-NogoA antibody, anti-OMGp antibody, anti-OX40 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PDGFR antibody, anti-PDL-1 antibody, anti-PSMA antibody, anti-RGMA antibody, anti-RGMB antibody, anti-SARS-CoV-2 antibody, anti-Te38 antibody, anti-TIM-3 antibody, anti-TNF antibody, anti-TNFα antibody, anti-TROP-2 antibody, anti-TWEAK antibody, anti-VEGF antibody, or anti-VEGFR antibody.

[0413] In some embodiments, the antibody is target-specific, which is targeted to, HER2 (Human Epidermal GrowthFactor Receptor 2) , TROP2 (TACSTD2, tumor associated calcium signal transducer 2) , BCMA (TNFRSF17, TNF receptor superfamily member 17) .

[0414] In some embodiments, the antibody is Trastuzumab, Sacituzumab or Belantamab.

[0415] In some embodiments, the antibody can be obtained commercially or produced by any method known to those skilled in the art.

[0416] In some embodiments, in step (R1) and / or in step (R1’ ) , the antibody is a modification antibody, wherein the method for preparing the modification antibody comprising the following step,

[0417] (R0) contacting the first reductant or salt thereof and an engineered antibody II in the buffer system to reduce interchain disulfide bonds within the engineered antibody II to afford the engineered antibody II bearing reduced thiol groups, wherein,

[0418] the engineered antibody II comprises one amino acid sequence with a mutant cysteine obtained by asymmetrical single-point mutation on a bispecific antibody,

[0419] and / or,

[0420] the engineered antibody II comprises one amino acid sequence with two mutant cysteines obtained by symmetrical single-point mutation on the antibody, the mutant cysteines don’ t form one interchain disulfide with each other;

[0421] (O0) introducing the oxidant to re-oxidize the reduced thiol groups resulted from step (R0) ;

[0422] (C0) incubating the first conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (O0) , then recovering the modification antibody.

[0423] As used herein, the term “asymmetrical single-point mutation” refers to the single mutation locates on light chain1, light chain2, heavy chain 1 or heavy chain 2 of IgG-like bispecific antibody or Fc-nanbody fused bispecific antibody.

[0424] As used herein, the term “symmetrical single-point mutation” refers to the single-point mutation on light chain or heavy chain of antibody with IgG1 format.

[0425] In some embodiments, by asymmetrical single-point mutation on a bispecific antibody, the engineered antibody II gets one more cysteine than the wild-type bispecific antibody.

[0426] In some embodiments, by symmetrical single-point mutation on the antibody, the engineered antibody II gets two more cysteine than the wild-type antibody.

[0427] In some embodiments, the engineered antibody II can be obtained commercially or produced by the thiomab technology ( “Anti-CD79B Antibody-Drug Conjugate DCDS0780A in Patients with B-Cell Non-Hodgkin Lymphoma: Phase 1 Dose-Escalation Study” , Clin Cancer Res. 2022 Apr 1; 28 (7) : 1294-1301; “Effect of Conjugation Site and Technique on the Stability and Pharmacokinetics of Antibody-Drug Conjugates” , J Pharm Sci. 2021 Dec; 110 (12) : 3776-3785.

[0428] In some embodiments, in step (R0) , the molar ratio of the first reductant and the engineered antibody II is 5: 1 to 15: 1. In some embodiments, in step (R0) , the molar ratio of the first reductant and the engineered antibody II is 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 11: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1 or 15: 1.

[0429] In some embodiments, in step (R0) , the incubation temperature is 4-37 ℃. In some embodiments, in step (R0) , the incubation temperature is 4℃, 6℃, 8℃, 10℃, 12℃, 14℃, 16℃, 18℃, 20℃, 22℃, 24℃, 26℃, 28℃, 30℃, 32℃, 34℃, 36℃ or 37℃, .

[0430] In some embodiments, in step (R0) , the incubation time is 3-24h. In some embodiments, in step (R0) , the incubation time is 3h, 5h, 7h, 9h, 11h, 13h, 15h, 17h, 19h, 21h, 23h or 24h.

[0431] In some embodiments, in step (R0) , all the interchain disulfide bonds within the engineered antibody II are reduced and the mutant cysteine (s) has free thiol group.

[0432] In some embodiments, in step (O0) , the molar ratio of the oxidant and the engineered antibody II is 4: 1 to 30: 1. In some embodiments, in step (O0) , the molar ratio of the oxidant and the engineered antibody II is 4: 1, 6: 1, 8: 1, 10: 1, 12: 1, 14: 1, 16: 1, 18: 1, 20: 1, 22: 1, 24: 1, 26: 1, 28: 1 or 30: 1.

[0433] In some embodiments, in step (O0) , the oxidation temperature is 4-27℃. In some embodiments, in step (O0) , the oxidation temperature is 4℃, 6℃, 8℃, 10℃, 12℃, 14℃, 16℃, 18℃, 20℃, 22℃, 24℃ or 27℃.

[0434] In some embodiments, in step (O0) , the oxidation time is 1-24h. In some embodiments, in step (O0) , the oxidation time is 1h, 3h, 5h, 7h, 9h, 11h, 13h, 15h, 17h, 19h, 21h, 23h or 24h..

[0435] In some embodiments, the reduced thiol groups resulted from the interchain disulfide bonds from step (R0) are re-oxidized and the mutant cysteine (s) has free thiol group.

[0436] In some embodiments, in step (C0) , according to the amount of the engineered antibody II, the first conjugating group is excess.

[0437] In some embodiments, the engineered antibody II comprises one amino acid sequence with a mutant cysteine obtained by asymmetrical single-point mutation on a bispecific antibody, in step (C0) , the first conjugating group is the first linker-payload, and the molar ratio of the first conjugating group and the engineered antibody II is 10: 1 to 1: 1, 5: 1 to 1: 1, 4: 1 to 1: 1, 3: 1 to 1: 1 or 2: 1 to 1: 1.

[0438] In some embodiments, when the engineered antibody II comprises one amino acid sequence with two mutant cysteines obtained by symmetrical single-point mutation on the antibody and the mutant cysteines don’ t form one interchain disulfide with each other, in step (0) , the first conjugating group is the first linker-payload.

[0439] In some embodiments, in step (C0) , when the first linker-payload reacts with the reduced thiol groups, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 1: 1 to 20: 1, 2: 1 to 10: 1, 3: 1 to 10: 1, 4: 1 to 9: 1 or 5: 1 to 7: 1. In some embodiments, in step (C0) , when the first linker-payload reacts with the reduced thiol groups, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, 10: 1, 12: 1, 13: 1, 14: 1, 15: 1, 16: 1, 17: 1, 18: 1, 19: 1 or 20: 1.

[0440] In some embodiments, the DAR value of conjugates prepared by method comprising is step (R0) , step (O0) and step (C0) in order is 2 (or D2) , in this case, two of the first linker-payloads are linked to the engineered antibody II. In some embodiments, the DAR value of conjugates prepared by comprising is step (R0) , step (O0) and step (C0) in order is 1 (or D1) , in this case, one of the first linker-payloads are linked to the engineered antibody II.

[0441] In some embodiments, in the method of the Group I comprising step (R0) , step (O0) , step (C0) , step (R1) , step (O1) and step (C1) in order and / or in the method of the Group II comprising step (R0) , step (O0) , step (C0) , step (R1’ ) , step (O1’ ) and step (C1) in order, the bis-payload conjugates are prepared, which includes D1+D2, D1+D1, D2+D2 or D2+D1.

[0442] In some embodiments, in the method of the Group I comprising step (R0) , step (O0) , step (C0) , step (R1) , step (O1) , step (R2) and step (C2) and / or in the method of the Group II comprising step (R0) , step (O0) , step (C0) , step (R1’ ) , step (O1’ ) , step (R2) and step (C2) in order, the bis-payload conjugates are prepared, which includes D1+D4, D1+D2, D2+D4 or D2+D2.

[0443] In some embodiments, in the method of the Group I comprising step (R0) , step (O0) , step (C0) , step (R1) , step (O1) , step (C1) , step (R2) and step (C2) in order and / or in the method of the Group II comprising step (R0) , step (O0) , step (C0) , step (R1’ ) , step (O1’ ) , step (C1) , step (R2) and step (C2) in order, the conjugates with three kinds of payloads are prepared, which includes D1+D2+D6, D1+D1+D6, D1+D2+D3, D1+D1+D3, D1+D2+D4, D1+D2+D2, D1+D1+D2, D1+D2+D1, D1+D1+D1, D2+D2+D6, D2+D1+D6, D2+D2+D3, D2+D1+D3, D2+D2+D4, D2+D2+D2, D2+D1+D2, D2+D2+D2, D2+D1+D2, D2+D2+D1 and / or D2+D1+D1.

[0444] In some embodiments, in the method of the Group III comprising step (R0) , step (O0) , step (C0) , step (R1) and step (C1) in order and / or in the method of the Group IV comprising step (R0) , step (O0) , step (C0) , step (R1’ ) and step (C1’ ) in order, the bis-payload conjugates are prepared, which includes D1+D4, D1+D2, D2+D4 or D2+D2.

[0445] In some embodiments, in the method of the Group III comprising step (R0) , step (O0) , step (C0) , step (R1) , step (C1) and step (C2) in order and / or in the method of the Group IV comprising step (R0) , step (O0) , step (C0) , step (R1’ ) , step (C1’ ) and step (C2) in order, the conjugates with three kinds of payplaods are prepared, which includes D1+D4+D2, D1+D4+D1, D1+D2+D2, D1+D2+D1, D2+D4+D2, D2+D4+D1, D2+D2+D2 and / or D2+D2+D1.

[0446] In some embodiments, in the method of the Group III comprising step (R0) , step (O0) , step (C0) , step (R1) , step (C1) , step (C2) , step (R2) and step (C3) in order, the conjugates with four kinds payloads are prepared, which includes D1+D4+D2+D1, D1+D4+D1+D1, D1+D2+D2+D1, D1+D2+D1+D1, D1+D4+D2+D2, D1+D4+D1+D2, D1+D2+D2+D2, D1+D2+D1+D2, D2+D4+D2+D1, D2+D4+D1+D1, D2+D2+D2+D1, D2+D2+D1+D1, D2+D4+D2+D2, D2+D4+D1+D2, D2+D2+D2+D2 and / or D2+D2+D1+D2.

[0447] Antibody with site-specific modifications

[0448] The present disclosure provides an antibody with site-specific modifications prepared by the method according to the method described above.

[0449] In some embodiments, the antibody with site-specific modifications is conjugated with one, two, three or four kinds of conjugating groups.

[0450] In some embodiments, the antibody with site-specific modifications is an antibody drug conjugate (ADC) with D1, D2, D4, D2+D6, D1+D6, D2+D3, D1+D3, D2+D4, D1+D2, D1+D2, D4+D2, D4+D1, D2+D2, D2+D1, D1+D2+D6, D1+D1+D6, D1+D2+D3, D1+D1+D3, D1+D2+D4, D1+D1+D2, D1+D1+D1, D2+D2+D6, D2+D1+D6, D2+D2+D3, D2+D1+D3, D2+D2+D4, D2+D1+D2, D4+D2+D2, D4+D2+D1, D4+D1+D2, D4+D1+D1, D2+D2+D2, D2+D2+D1, D2+D1+D2, D2+D1+D1, D1+D4+D2, D1+D4+D1, D1+D2+D2, D1+D2+D1, D2+D4+D2, D2+D4+D1, D1+D4+D2+D1, D1+D4+D1+D1, D1+D2+D2+D1, D1+D2+D1+D1, D1+D4+D2+D2, D1+D4+D1+D2, D1+D2+D2+D2, D1+D2+D1+D2, D2+D4+D2+D1, D2+D4+D1+D1, D2+D2+D2+D1, D2+D2+D1+D1, D2+D4+D2+D2, D2+D4+D1+D2, D2+D2+D2+D2 and / or D2+D2+D1+D2.

[0451] In some embodiments, the ADC is Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 2, Sacituzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 2, Belantamab- [MC-VC-PAB-MMAE] 2, Farletuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4, Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4, Trastuzumab- [MC-GGFG-DXd] 2, Trastuzumab- [Maleimide-PEG4-N3-DBCO-Cy3] 1 or Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 [MV-GGFG DXd] 2.

[0452] Various analytical methods can be used to determine the yields and isomeric mixtures of the antibody with site-specific modification. In some embodiments, the analytical method is HIC-HPLC (Hydrophobic interaction chromatography-High performance liquid chromatography) . HIC-HPLC can separate the antibodies loaded with various numbers of linker-payload. The loading level of payload can be determined based on the ratio of absorbances, e.g., at 250 nm and 280 nm. For example, if a payload (e.g., drug) can absorb at 250 nm while the antibody absorbs at 280nm. The 250 / 280 ratio therefore increases with drug loading.

[0453] The process of the disclosure is less complicate, the homogeneity of the resultant antibodies with site-specific modification (antibody-drug conjugate) is dramatically improved.

[0454] In some embodiments, the homogeneity of the ADC with D2 is at least up to 60%of the total weight. In some embodiments, the homogeneity of the ADC with D2 is up to 95%of the total weight. In some embodiments, the homogeneity of the ADC with D2 is 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%or 95%of the total weight.

[0455] In some embodiments, the homogeneity of the ADC with D4 is at least up to 60%of the total weight. In some embodiments, the homogeneity of the ADC with D4 is up to 90%of the total weight. In some embodiments, the homogeneity of the ADC with D4 is 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%or 90%of the total weight.

[0456] In some embodiments, the homogeneity of the ADC with D4+D2 is at least up to 60%of the total weight. In some embodiments, the homogeneity of the ADC with D4+D2 is up to 85%of the total weight. In some embodiments, the homogeneity of the ADC with D4+D2 is at 60%, 65%, 70%, 75%, 80%or 85%of the total weight.

[0457] The method of the present disclosure is compatible with current thiol-reactive linker-drug technologies with minimum conformation change and intact Fc function. Meanwhile it has simple manipulation and reduced cost. The method provided herein is simple to operate, and it is fully compatible with current thiol-reactive linker-drug technologies.

[0458] pharmaceutical composition

[0459] The disclosure also provides a pharmaceutical composition comprising the antibody with site-specific modifications prepared according to the method described above, the antibody with site-specific modifications described above, and at least a pharmaceutically acceptable ingredient.

[0460] In some embodiments, the antibody with site-specific modifications is the ADC.

[0461] As use herein, the term “pharmaceutically acceptable” indicates that the designated carrier, vehicle, diluent, excipient (s) , and / or salt is generally chemically and / or physically compatible with the other ingredients comprising the formulation, and physiologically compatible with the recipient thereof.

[0462] As use herein, the term “pharmaceutically acceptable ingredient” refers to a substance useful in the preparation or use of a pharmaceutical composition and includes, for example, suitable diluents, solvents, dispersion media, surfactants, antioxidants, preservatives, isotonic agents, buffering agents, emulsifiers, absorption delaying agents, salts, drug stabilizers, binders, excipients, disintegration agents, lubricants, wetting agents, sweetening agents, flavoring agents, dyes, and combinations thereof, as would be known to those skilled in the art (see, for example, Remington The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed. Pharmaceutical Press, 2013, pp. 1049-1070) .

[0463] Pharmaceutical compositions provided herein may be formulated in any manner known in the art, such as, pharmaceutical compositions provided herein can be formulated for parenteral (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) administration in dosage unit form (i.e., physically discrete units containing a predetermined quantity of active compound for ease of administration and uniformity of dosage) .

[0464] Pharmaceutical compositions are formulated to be compatible with their intended route of administration (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) .

[0465] Pharmaceutical acceptable ingredient for use in the pharmaceutical compositions disclosed herein may include, for example, pharmaceutically acceptable liquid, gel, or solid carriers, aqueous vehicles, nonaqueous vehicles, antimicrobial agents, isotonic agents, buffers, antioxidants, anesthetics, suspending / dispending agents, sequestering or chelating agents, diluents, adjuvants, excipients, or non-toxic auxiliary substances, other components known in the art, or various combinations thereof.

[0466] Suitable components may include, for example, antioxidants, fillers, binders, disintegrants, buffers, preservatives, lubricants, flavorings, thickeners, coloring agents, emulsifiers or stabilizers such as sugars and cyclodextrins. Suitable antioxidants may include, for example, methionine, ascorbic acid, EDTA, sodium thiosulfate, platinum, catalase, citric acid, cysteine, thioglycerol, thioglycolic acid, thiosorbitol, butylated hydroxyanisole, butylated hydroxytoluene, and / or propyl gallate. As disclosed herein, inclusion of one or more antioxidants such as methionine in a composition comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof and conjugates provided herein decreases oxidation of the antibody or antigen-binding fragment thereof. This reduction in oxidation prevents or reduces loss of binding affinity, thereby improving antibody stability and maximizing shelf-life. Therefore, in certain embodiments, pharmaceutical compositions are provided that include one or more antibodies or antigen-binding fragments thereof as disclosed herein and one or more antioxidants such as methionine.

[0467] In some embodiments, the pharmaceutical compositions can be a liquid solution, suspension, or emulsion. In some embodiments, the pharmaceutical compositions are formulated into an injectable composition. The injectable pharmaceutical compositions may be prepared in any conventional form, such as for example liquid solution, suspension, emulsion, or solid forms suitable for generating liquid solution, suspension, or emulsion. Preparations for injection may include sterile and / or non-pyretic solutions ready for injection, sterile dry soluble products, such as lyophilized powders, ready to be combined with a solvent just prior to use, including hypodermic tablets, sterile suspensions ready for injection, sterile dry insoluble products ready to be combined with a vehicle just prior to use, and sterile and / or non-pyretic emulsions. The solutions may be either aqueous or nonaqueous.

[0468] In some embodiments, there is the pH regulator in the pharmaceutical compositions, and the pH regulator is sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, boric acid, acetic acid, sodium acetate, citric acid, sodium citrate, tartaric acid, sodium tartrate, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium bicarbonate, potassium bicarbonate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, hydrochloric acid, phosphoric acid or the like.

[0469] In some embodiments, there is stabilizer in the pharmaceutical compositions, and the stabilizer is disodium edilate, calcium disodium edilate, dipotassium edilate, diamine edilate, α-lipoic acid, ethylene glycol dimethacrylate, sodium oleate, anhydrous sodium sulfite, sodium ascorbate, desferric amine, malate, citric acid, succinate, sodium, calcium and magnesium salts of malate, citric acid, succinate or the like.

[0470] In some embodiments, the pharmaceutical composition is combined with other therapeutic agents. There is no specific limitation to the other therapeutic agents, as long as the other therapeutic agents can reduce the side effects of the pharmaceutical composition or increase the efficacy of the pharmaceutical composition. The other therapeutic agents are anti-cancer agents, anti-autoimmune disease agent, anti-emetics, anti-allergic and the like.

[0471] In some embodiments, the anti-cancer agents can include, but not limited to, erlotinib, bortezomib, fulvestrant, sunitib imatinib, mesylate, letrozole, finasunate, platins such as oxaliplatin, carboplatin, and cisplatin, finasunate, fluorouracil, rapamycin, leucovorin, lapatinib, lonafamib, sorafenib, gefitinib, capmtothecin, topotecan, bryostatin, adezelesin, anthracyclin, carzelesin, bizelesin, dolastatin, auristatins, duocarmycin, eleutherobin, taxols such as paclitaxel or docetaxel, cyclophasphamide, doxorubicin, vincristine, prednisone or prednisolone, other alkylating agents such as mechlorethamine, chlorambucil, and ifosfamide, antimetabolites such as azathioprine or mercaptopurine, other microtubule inhibitors (vinca alkaloids like vincristine, vinblastine, vinorelbine and vindesine, as well as taxanes) , podophyllotoxins (etoposide, teniposide, etoposide phosphate, and epipodophyllotoxins) , topoisomerase inhibitors, other cytotoxins such as actinomycin, daunorubicin, valrubicin, idarubicin, epirubicin, bleomycin, plicamycin, mitomycin and the like.

[0472] The disclosure provides the use of the antibody with site-specific modifications prepared according to the method provided herein, the antibody with site-specific modifications provided herein or the pharmaceutical composition provided herein in the manufacture of a therapeutic agent for preventing, diagnosing or treating a disease.

[0473] As use herein, the term “treat” of any disease refers to alleviating or ameliorating the disease (i.e., slowing or arresting the development of the disease or at least one of the clinical symptoms thereof) ; or alleviating or ameliorating at least one physical parameter or biomarker associated with the disease, including those which may not be discernible to the patient. For cancer, “treating” may refer to dampen or slow the tumor or malignant cell growth, proliferation, or metastasis, or some combination thereof. For tumors, “treatment” includes removal of all or part of the tumor, inhibiting or slowing tumor growth and metastasis, delaying the development of a tumor, or some combination thereof.

[0474] As used herein, the term “prevent" of any disease refers to the prophylactic treatment of the disease; or delaying the onset or progression of the disease.

[0475] In some embodiments, the disease is a tumor or cancer. In some embodiments, the disease is an autoimmune disease and the like.

[0476] In some embodiments, the cancer can include, but not limited to, carcinoma, lymphoma, blastema, sarcoma, and leukemia or lymphoid malignancies. More particular examples of the cancer include squamous cell cancer (e.g., epithelial squamous cell cancer) , lung cancer including small-cell lung cancer, non-small cell lung cancer ( “NSCLC” ) , adenocarcinoma of the lung and squamous carcinoma of the lung, cancer of the peritoneum, hepatocellular cancer, gastric or stomach cancer including gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatoma, breast cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, endometrial or uterine carcinoma, salivary gland carcinoma, kidney or renal cancer, prostate cancer, vulval cancer, thyroid cancer, hepatic carcinoma, anal carcinoma, penile carcinoma, as well as head and neck cancer.

[0477] In some embodiments, the pharmaceutical composition is combined with other therapeutic agents. There is no specific limitation to the other therapeutic agents, as long as the other therapeutic agents can reduce the side effects of the pharmaceutical composition or increase the efficacy of the pharmaceutical composition. The other therapeutic agents are anti-cancer agents, anti-autoimmune disease agent, anti-emetics, anti-allergic and the like.

[0478] In some embodiments, the anti-cancer agents include, but not limited to, erlotinib, bortezomib, fulvestrant, sunitib imatinib, mesylate, letrozole, finasunate, platins such as oxaliplatin, carboplatin, and cisplatin, finasunate, fluorouracil, rapamycin, leucovorin, lapatinib, lonafamib, sorafenib, gefitinib, capmtothecin, topotecan, bryostatin, adezelesin, anthracyclin, carzelesin, bizelesin, dolastatin, auristatins, duocarmycin, eleutherobin, taxols such as paclitaxel or docetaxel, cyclophasphamide, doxorubicin, vincristine, prednisone or prednisolone, other alkylating agents such as mechlorethamine, chlorambucil, and ifosfamide, antimetabolites such as azathioprine or mercaptopurine, other microtubule inhibitors (vinca alkaloids like vincristine, vinblastine, vinorelbine and vindesine, as well as taxanes) , podophyllotoxins (etoposide, teniposide, etoposide phosphate, and epipodophyllotoxins) , topoisomerase inhibitors, other cytotoxins such as actinomycin, daunorubicin, valrubicin, idarubicin, epirubicin, bleomycin, plicamycin, mitomycin and the like.

[0479] In some embodiments, the anti-autoimmune disease agent includes, but not limited to, ibuprofen, loxoprofen, naproxen, diclofenac, indomethacin, meloxicam, lornoxicam, nabumetone, celecoxib, paracetamol, glucocorticoids, azathioprine, cyclophosphamide and the like.

[0480] In some embodiments, patients may experience nausea during and after administration of the ADCs of the present application. Therefore, anti-emetics may be administered in preventing nausea (upper stomach) and vomiting. The anti-emetics can include, but not limited to, aprepitant, ondansetron, granisetron HCl, lorazepam, dexamethasone, prochlorperazine, casopitant and the like.

[0481] In some embodiments, patients may experience allergic reactions during and after administration of the ADCs of the present application. Therefore, anti-allergic agents may be administered to minimize the risk of an allergic reaction. The anti-allergic agents include dexamethasone, beclomethasone, hydrocortisone, prednisolone, prednisone, methylprednisolone, hydroxyzine, cyproheptadine, bronchodilators, terbutaline and the like.

[0482] The disclosure provides the method of preventing, diagnosing or treating a disease in a subject in need thereof, comprising administrating to the subject a therapeutically effective amount of the antibody with site-specific modifications prepared by the method described above, the antibody with site-specific modifications provided herein or the pharmaceutical composition provided herein.

[0483] As use herein, the term “subject” refers to mammals, primates (e.g., humans, male or female) , dogs, rabbits, guinea pigs, pigs, rats and mice. In certain embodiments, the subject is a primate. In yet other embodiments, the subject is a human.

[0484] As used herein, the term "a therapeutically effective amount" refers to an amount of the ADC of the present disclosure that will elicit the biological or medical response of a subject, for example, ameliorate symptoms, alleviate conditions, slow or delay disease progression, or prevent a disease, etc. The therapeutically effective amount will vary with the type and severity of the condition to be alleviated. It is to be further understood that for any particular subject, specific dosage regimens should be adjusted over time according to the individual need and the professional judgment of the person administering or supervising the administration of the compositions. In some embodiments, the therapeutically effective amount is based on a variety of factors, such as the type of disease, the age, weight, sex, medical condition of the patient, the severity, of the condition, the route of administration, and the particular antibody employed. In some embodiments, the therapeutically effective amount can vary widely, but can be determined routinely using standard methods. In some embodiments, the therapeutically effective amount can be adjusted based on the pharmacokinetic or pharmacodynamic parameters, which may include clinical effects such as toxic effects and / or laboratory values.

[0485] The present disclosure also provides use of amino acid or compound with imidazolyl or a salt thereof in the preparation of an antibody with site-specifications.

[0486] In some embodiments, the amino acid or compound with imidazolyl comprises at least one of the groups of histidine, imidazole, glutamic acid or Asparic acid, optionally, the antibody with site-specific modifications is an antibody drug conjugate (ADC) .

[0487] It will be readily apparent to those skilled in the art that other suitable modifications and adaptations of the present disclosure described herein are obvious and may be made using suitable equivalents without departing from the scope of the disclosure or the embodiments disclosed herein. Having now described the disclosure in detail, the same will be more clearly understood by reference to the following examples, which are included for purposes of illustration only and are not intended to be limiting. Further, unless specifically described otherwise, the reagent and the solvent described in the description can be easily obtained from a commercial supplier.

[0488] EXAMPLES

[0489] The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

[0490] Reagent and Manufacturer

[0491] Trastuzumab is commercially available from Roche.

[0492] Farletuzumab is commercially available from HOEK.

[0493] MC-VC-PAB-MMAE and MC-GGFG-DXd are commercially available from Levena biopharma.

[0494] Desalting column (type: 40K, 0.5 mL, REF: 87766, Lot SJ251704) is commercially available from Thermo Scientific.

[0495] TCEP is commercially available from Bidepharm.

[0496] The buffer systems are commercially available from Macklin.

[0497] Dibromomaleimide, EDTA, cysteine, acetylcysteine is commercially available from Aladdin.

[0498] TCEP-2, TCEP-3, TCEP-28, TCEP-30 and TCEP-31 are prepared according to the PCT application WO2024041542A1.

[0499] The reagents used in examples, include but not limited to histidine, are commercially available.

[0500] Homogeneity Assays I

[0501] The drug / antibody ratio (DAR) and product distribution were analyzed using HIC-HPLC (Agilent1200) with a TSK gel Butyl-NPR column (4.6 mm IDX 3.5cm) (commercially available from Tosoh Biosciences) at a flow rate of 0.5 mL / min at 30℃. Solvent A was 1.5M (NH4) 2SO4 and 50 mM potassium phosphate pH 7. Solvent B was 75%v / v 50 mM potassium phosphate pH 7 and 25%v / v isopropanol. The washout procedure is as follows:

[0502] AKTA with HIC chromatography:

[0503] The ADCs purification was performed using AKTA explorer with a polar MC30-HIC butyl column (4.2 mL,  30 μm) (commercially available from Sepax Technologies) . Solvent A was 50 mM PB and 1 M (NH4) 2SO4. Solvent B was 50mM PB and 20%v / v isopropanol. Solvent C was 50 mM PB and 2 M (NH4) 2SO4. ADC sample was mixed with solvent C in 1: 1 volume ratio, filtered and then loaded at a flow rate of 2 mL / min. At a flow rate of 3 mL / min at 25℃, the target component was washed out with solvent A / solvent B between v / v 65% / 35%and v / v 0% / 100%, and the collected product solution was concentrated and exchanged into His buffer (20mM, pH5.5) through ultracentrifugation.

[0504] Example I. 1: Preparation of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 2 conjugates (The ADC with D2)

[0505] (1) ZnCl2 (0.0270 mM) , TCEP (0.0743 mM) and histidine (1 mM) were added to a solution of a monoclonal antibody Trastuzumab (0.0135 mM) in BES buffer (pH7.0, 20mM) and the reaction mixture was allowed to stay at 4 ℃ for 18h;

[0506] (2) DHAA (0.1622 mM) was added and vortexed for mixing. The mixture was then incubated in darkness, the reaction temperature is 22 ℃ and the reaction time is 2h;

[0507] (3) EDTA (0.4054 mM) and MC-VC-PAB-MMAE (0.1081 mM) in DMA were added and the mixture was then incubated at 22 ℃ for 0.5 h.

[0508] (4) The reaction mixture was subjected to purification using a de-salting column.

[0509] Example I. 2: Preparation of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 2 conjugates (The ADC with D2)

[0510] The method of example I. 2 is the same as example I. 1, the difference is that the concentration of histidine is 2mM.

[0511] Comparative example I. 1: Preparation of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 2 conjugate (without histidine)

[0512] The method of comparative example I. 1 is the same as example I. 1, the difference is that there is not histidine in the method.

[0513] The homogeneity assay result and the chromatographic peak area of examples I. 1-I. 2 and comparative example I. 1 were shown in Table I-1.

[0514] Table I-1 “E” was short for Example, and “CE” was short for comparative example in the present disclosure.

[0515] As the results shown in table I-1 and the Figure 1A-1C, linker-payloads (MC-VC-PAB-MMAE) were successfully linked to Trastuzumab, which indicated ADCs with D2 were successfully synthesized.

[0516] As shown in examples I. 1-I. 2 and Comparative example I. 1, the content of D2 is up to 88%when there is histidine in the oxidation step, and the oxidation time of step (1) is shorter to 2h.

[0517] Example I. 3: Preparation of Trastuzumab Mut- [MC-VC-PAB-MMAE] 2 conjugates (The ADC with D2)

[0518] (1) ZnCl2 (0.051 mM, 3eq) , TCEP (0.094mM, 5.5eq) and histidine (4.3mM) were added to a solution of an engineered antibody I (0.017 mM, 1eq) in BES buffer (pH7.0, 20 mM) and the reaction mixture was allowed to react overnight at 4 ℃, wherein the engineered antibody I is Trastuzumab Mut (Compared with Trastuzumab, the heavy chain of Trastuzumab Mut comprises C229L mutation, L234A mutation and L235A mutation in accordance with the EU numbering system) provided by HOEKBIO, and the amino acid sequence of the heavy chain of Trastuzumab Mut as set forth in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of the light chain of Trastuzumab Mut as set forth in SEQ ID NO: 2;

[0519] (2) Oxidation was performed by adding DHAA (0.17 mM, 10eq) and reacted at 25 ℃ for 2 h.

[0520] (3) EDTA-2Na (0.17 mM, 10eq) and MC-VC-PAB-MMAE (0.068 mM, 4eq) in DMA was introduced and the reaction was continued at room temperature for 0.5h;

[0521] (4) Purifying ADC from step (3) using a de-salting column to give ADC with D2.

[0522] The homogeneity assay result of examples I. 3 were shown in Table I-2.

[0523] Table I-2

[0524] As the results shown in table I-2 and Figure 8, linker-payloads (MC-VC-PAB-MMAE) were successfully linked to the antibody, which indicated ADCs with D2 were successfully synthesized.

[0525] As shown in examples I. 3 and Comparative example I. 1, the content of D2 is up to 90%when there is histidine in the oxidation step and the antibody comprises C229L mutation in accordance with the EU numbering system.

[0526] Example II. 1: Preparation of Trastuzumab Mut- [MC-VC-PAB-MMAE] 2 conjugates (The ADC with D2)

[0527] (1) Reductant TCEP (0.119mM, 7.0eq, ) and histidine (4.3mM) were added to a solution of an engineered antibody I (0.017 mM, 1eq. ) in BES buffer (pH7.0, 20 mM) and The reaction mixture was allowed to react overnight at 4 ℃, wherein the engineered antibody I is Trastuzumab Mut (Compared with Trastuzumab, the heavy chain of Trastuzumab Mut comprises C229L mutation, L234A mutation and L235A mutation in accordance with the EU numbering system) provided by HOEKBIO, and the amino acid sequence of the heavy chain of Trastuzumab Mut as set forth in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of the light chain of Trastuzumab Mut as set forth in SEQ ID NO: 2;

[0528] (2) ZnCl2 (0.051 mM, 3eq) was added to the reaction mixture of step (1) and then oxidation was performed by adding DHAA (0.34 mM, 20eq) and reacted at 25 ℃ for 2 h.

[0529] (3) EDTA-2Na (0.17 mM, 10eq. ) and MC-VC-PAB-MMAE (0.068 mM, 4eq. ) in DMA was introduced and the reaction was continued at room temperature for 0.5h;

[0530] (4) Purifying ADC from step (2) using a de-salting column to give ADC with D2.

[0531] Example II. 2: Preparation of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 2 conjugates (The ADC with D2)

[0532] (1) Reductant TCEP (0.051mM, 3eq, ) were added to a solution of a monoclonal antibody Trastuzumab (0.017 mM, 1eq. ) in BES buffer (pH7.0, 20 mM) and the reaction mixture was allowed to react for 2hrs at 37 ℃;

[0533] (2) Added to a final concentration of 1 mM Histidine (pH 5.5) and ZnCl2 (0.051 mM, 3eq) were added into reaction mixture. After thorough mixing, incubate for 5 minutes. Oxidation was performed by adding DHAA (0.51mM, 30eq) and reacted at 25 ℃ for 2 h.

[0534] (3) EDTA-2Na (0.17 mM, 10eq. ) and MC-VC-PAB-MMAE (0.068 mM, 4eq. ) in DMA was introduced and the reaction was continued at room temperature for 0.5h;

[0535] (4) Purifying ADC from step (2) using ultrafiltration tube (a) , UF-DF (b) or chromatography (c) to give ADC with D2.

[0536] Comparative example II. 1: Preparation of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 2 conjugate (without histidine)

[0537] (1) Reductant TCEP (0.051mM, 3eq, ) were added to a solution of a monoclonal antibody Trastuzumab (0.017 mM, 1eq. ) in BES buffer (pH7.0, 20 mM) and the reaction mixture was allowed to react overnight at 4 ℃;

[0538] (2) ZnCl2 (0.051 mM, 3eq) were added into reaction mixture. After thorough mixing, incubate for 5 minutes, oxidation was performed by adding DHAA (0.51 mM, 30eq) and reacted at 25 ℃ for 2 h.

[0539] (3) EDTA-2Na (0.17 mM, 10eq. ) and MC-VC-PAB-MMAE (0.068 mM, 4eq. ) in DMA was introduced and the reaction was continued at room temperature for 0.5h;

[0540] (4) Purifying ADC from step (2) using ultrafiltration tube (a) , UF-DF (b) or chromatography (c) to give ADC with D2.

[0541] The homogeneity assay results of examples II. 1-2 and comparative example II. 1 were shown in Table II-1.

[0542] Table II-1 “E” was short for Example, and “CE” was short for comparative example in the present disclosure.

[0543] As the results shown in table II-1 and Figure 9-11, linker-payloads (MC-VC-PAB-MMAE) were successfully linked to the antibody, which indicated ADCs with D2 were successfully synthesized.

[0544] As shown in examples II. 1-II. 2 and comparative example II. 1, the content of D2 is up to 90%when there is histidine before the oxidation step, while the content of D2 is only 41.28%without histidine.

[0545] Further, with the method of the Group II of the present disclosure and with the antibody comprising C229L mutation in accordance with the EU numbering system, the content of D2 up to 91.27%.

[0546] Example III. 1: Preparation of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugate (The ADC with D4)

[0547] (1) ZnCl2 (0.0270 mM) , TCEP (0.0743 mM) and histidine (1mM) were added to a solution of a monoclonal antibody Trastuzumab (0.0135 mM) , in BES buffer (pH7.0, 20 mM) and the reaction mixture was allowed to stay at 4 ℃ for 18 h;

[0548] (2) MC-VC-PAB-MMAE (0.2027 mM) in DMA was introduced and the reaction was continued at 22 ℃ for 0.5 h;

[0549] (3) Acetylcysteine (0.2027 mM) was introduced and the mixture was allowed to stay at 22 ℃ for 0.5 h;

[0550] (4) EDTA (0.135 mM) and CuSO4 (0.0135 mM) was introduced and the mixture was allowed to stay at 22 ℃ for 10min;

[0551] (5) The reaction mixture was subjected to purification using a desalting column.

[0552] Comparative example III. 1: Preparation of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugate (without histidine)

[0553] The method of comparative example III. 1 is the same as example III. 1, the difference is that there is no histidine in the method.

[0554] Example III. 2: Preparation of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugates (The ADC with D4)

[0555] The method of example III. 2 is the same as example III. 1, the difference is that histidine was added in step (2) .

[0556] The homogeneity assay result and the chromatographic peak area of examples III. 1-III. 2 and Comparative example III. 1 were shown in Table III-1 and Table III-2.

[0557] Table III-1

[0558] Table III-2

[0559] As the results shown in table III-1, table III-2 and the Figure 2A-2C, linker-payloads (MC-VC-PAB-MMAE) were successfully linked to Trastuzumab, which indicated ADCs with D4 were successfully synthesized.

[0560] As shown in examples III. 1-III. 2 and Comparative example III. 1, the content of D4 is up to 82%when there is histidine in the reduction step (step (1) ) or in the conjugation step (step (2) ) .

[0561] Examples III. 3: Preparation of Farletuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugate (The ADC with D4)

[0562] The method of example III. 3 is similar to Example III. 1. The difference is the concentration of histidine is 2 mM, antibody is Farletuzumab and the molar ratio of TCEP and the antibody is 5: 1.

[0563] Examples III. 4: Preparation of Farletuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugate (The ADC with D4)

[0564] The method of example III. 4 is similar to Example III. 1. The difference is that the antibody is Farletuzumab, the molar ratio of TCEP and the antibody is 5: 1 and the molar ratio of Zn2+ and the antibody is 6.0.

[0565] Comparative example III. 2: Preparation of Farletuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugate (without histidine)

[0566] The method of comparative example III. 2 is the same as example III. 3, the difference is that there is not histidine in the method.

[0567] The homogeneity assay result and the chromatographic peak area of examples III. 3-III. 4 and Comparative example III. 2 were shown in Table III-3 and Table III-4.

[0568] Table III-3

[0569] Table III-4

[0570] As the results shown in table III-3, table III-4 and the Figure 3A-3C, linker-payloads (MC-VC-PAB-MMAE) were successfully linked to Farletuzumab, which indicated ADCs with D4 were successfully synthesized.

[0571] As shown in examples III. 3 and Comparative example III. 1, the content of D4 is also up when the concentration of histidine is 2mM. As shown in examples III. 1 and example III. 3, the method of the present disclosure is suitable for different kinds of antibody. As shown in examples III. 3 and example III. 4, the content of D4 increase as the molar ratio of Zn2+ / antibody increasing and the concentration of histidine reducing. Thus, it is useful for increasing the content of D4 by adjusting the molar ratio of Zn2+ / antibody and the concentration of histidine.

[0572] Examples III. 5-III. 6: Preparation of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugate (The ADC with D4)

[0573] The method of example III. 4 is similar to Example III. 1. The difference is the molar ratio of TCEP and the antibody is 5.6: 1 and the molar ratio of Zn2+ and the antibody is 3: 1.

[0574] The method of example III. 5 is similar to Example III. 1. The difference is the molar ratio of TCEP and the antibody is 5.6: 1, the molar ratio of Zn2+ and the antibody is 3: 1 and the transition metal ions salt is Zinc lactate.

[0575] The homogeneity assay result and the chromatographic peak area of examples III. 5-III. 6 were shown in Table III-5 and Table III-6.

[0576] Table III-5

[0577] Table III-6

[0578] As the results shown in table III-5, table III-6 and the Figure 4A-4B, linker-payloads (MC-VC-PAB-MMAE) were successfully linked to Trastuzumab, which indicated ADCs with D4 were successfully synthesized.

[0579] As shown in examples III. 1 and example III. 5, the content of D4 is up to 86.37%when the molar ratio of Zn2+ / antibody is 2: 1 to 3: 1. As shown in examples III. 5 and example III. 6, the method of the present disclosure is suitable for different kinds of salt of the transition metal ions.

[0580] Examples III. 7-III. 9: Preparation of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugate (The ADC with D4)

[0581] The method of example III. 7-III. 9 is similar to Example III. 1. The difference is the molar ratio of TCEP and the antibody and the molar ratio of Zn2+ and the antibody, which are shown on table III. 7.

[0582] The homogeneity assay result and the chromatographic peak area of examples III. 7-III. 9 were shown in Table III-7 and Table III-8.

[0583] Table III-7

[0584] Table III-8

[0585] As the results shown in table III-7, table III-8 and the Figure 5A-5C, linker-payloads (MC-VC-PAB-MMAE) were successfully linked to Trastuzumab, which indicated ADCs with D4 were successfully synthesized.

[0586] As shown in examples III. 7 and example III. 8, the content of D4 is up to 89%when the molar ratio of Zn2+ / antibody is 4: 1 and the molar ratio of TCEP / antibody is 6: 1 to 8: 1.

[0587] Example III. 10: Preparation of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugate (The ADC with D4)

[0588] The method of example III. 10 is similar to Example III. 1. The difference are that the molar ratio of TCEP and the antibody is 5: 1, the molar ratio of Zn2+ and the antibody is 10: 1, the incubation temperature in step (1) is 25℃, the incubation time in step (1) is 3h and the molar ratio of MC-VC-PAB-MMAE and the antibody is 10: 1.

[0589] The homogeneity assay result and the chromatographic peak area of example III. 10 was shown in Table III-9 and Table III-10.

[0590] Table III-9

[0591] Table III-10

[0592] As the results shown in table III-9, table III-10 and the Figure 6A, linker-payloads (MC-VC-PAB-MMAE) were successfully linked to Trastuzumab, which indicated ADCs with D4 were successfully synthesized.

[0593] As shown in examples III. 10, the content of D4 is up to 83%when the reduction temperature is 25℃ in step (1) .

[0594] Example III. 11: Preparation of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugate (The ADC with D4)

[0595] (1) ZnCl2 (0.167 mM) , TCEP (0.092 mM) were added to a solution of a monoclonal antibody Trastuzumab (0.017 mM) , in His buffer (pH6.4, 20 mM) and the reaction mixture was allowed to stay at 25℃ for 3 h;

[0596] (2) MC-VC-PAB-MMAE (0.167 mM) in DMA was introduced and the reaction was continued at 22 ℃ for 0.5 h;

[0597] (3) The reaction mixture was subjected to purification using a desalting column.

[0598] Example III. 12: Preparation of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 conjugate (The ADC with D4)

[0599] The method of example III. 12 is similar to Example III. 11. The difference are that the molar ratio of TCEP and the antibody is 6: 1, the incubation temperature in step (1) is 4℃ and the incubation time in step (1) is 16h.

[0600] The homogeneity assay result and the chromatographic peak area of examples III. 11-III. 12 was shown in Table III-11 and Table III-12.

[0601] Table III-11

[0602] Table III-12

[0603] As the results shown in table III-11, table III-12 and the Figure 6B-6C, linker-payloads (MC-VC-PAB-MMAE) were successfully linked to Trastuzumab, which indicated ADCs with D4 were successfully synthesized.

[0604] As shown in example III. 11, the content of D4 is up to 73.6%when the reduction temperature is 25℃ and the buffer system is His buffer in step (1) . As shown in example III. 12 and III. 11, when the reduction temperature in step (1) is 4℃, the content of D4 is up to 87%. As shown in example III. 12 and III. 1, when the buffer system is His buffer and the concentration of His buffer is 20mM in step (1) , the content of D4 is up to 87%.

[0605] Example III. 13: preparation of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 [MC-GGFG-DXd] 2 (the ADC with D4+D2)

[0606] (1) incubating TCEP (0.133 mM) , trastuzumab (0.017 mM) and histidine (1mM) in the presence of an effective amount of ZnCl2 (0.067mM) in BES (20 mM, pH7.0) , The incubation temperature is 4 ℃ and the incubation time is 16h;

[0607] (2) introducing MC-VC-PAB-MMAE (0.25 mM) to react with reduced thiol groups resulted from step (1) , the reaction temperature is room temperature and the reaction time is 0.5h. then recovering the product using a desalting column and AKTA with HIC chromatography to afford Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4;

[0608] (3) introducing EDTA (0.5 mM) and introducing MC-GGFG-DXd (0.083 mM) to react with the reduced thiol groups resulted from step (2) , the reaction temperature is room temperature and the reaction time is 1 h;

[0609] (4) the reaction mixture was subjected to purification using a desalting column.

[0610] Example III. 14: preparation of Trastuzumab- [MC-VC-PAB-MMAE] 4 [MC-MMAF] 2 (the ADC with D4+D2)

[0611] The method of example III. 14 is similar to Example III. 13. The difference is the second linker-payload in step (3) is MC-MMAF.

[0612] The homogeneity assay result and the chromatographic peak area of examples III. 13-III. 14 were shown in Table III-13 and Table III-14.

[0613] Table III-13

[0614] Table III-14

[0615] As shown in the above table and Figure 7A-7C, the result demonstrated that the content of the ADC with D4+D2 was generally up to 72%or 76%, which indicated the process of method was benefit for site-specific modifying the antibody with D4+D2, improving the homogeneity and simplifying the preparation method.

[0616] While particular embodiments have been described, alternatives, modifications, variations, improvements, and substantial equivalents that are or may be presently unforeseen may arise to applicants or others skilled in the art. Accordingly, the appended claims as filed and as they may be amended are intended to embrace all such alternatives, modifications, variations, improvements, and substantial equivalents.

Claims

A method for preparing an antibody with site-specific modifications, which is characterized in that, the method comprises any one of the following Groups I-IV, the Group I comprises step (R1) and step (O1) in order; the Group II comprises step (R1’ ) and step (O1’ ) in order; the Group III comprises step (R1) and step (C1) in order; or the Group IV comprises step (R1’ ) and step (C1’ ) ,wherein,(R1) contacting a first reductant or salt thereof and an antibody in a buffer system in the presence of transition metal ions to selectively reduce interchain disulfide bonds within the antibody to afford the antibody bearing reduced thiol groups;(R1’ ) contacting a first reductant or salt thereof and an antibody in a buffer system to reduce interchain disulfide bonds within the antibody to afford the antibody bearing reduced thiol groups;(O1) introducing an oxidant to selectively re-oxidize the reduced thiol groups resulted from step (R1) , wherein, reaction system in step (O1) comprises additive, optionally, the additive has binding capacity for the transition metal ions, and the binding capacity of the additive for the transition metal ions is stronger than that of a single hydroxyl group and weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions, optionally, the additive comprises amino acid or compound with imidazolyl or a salt thereof;(O1’ ) introducing an oxidant to selectively re-oxidize the reduced thiol groups resulted from step (R1’ ) , wherein, reaction system in step (O1) comprises additive, optionally, the additive has binding capacity for the transition metal ions, and the binding capacity of the additive for the transition metal ions is stronger than that of a single hydroxyl group and weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions, optionally, the additive comprises amino acid or compound with imidazolyl or a salt thereof; between step (R1’ ) and step (O1’ ) , adding transition metal ions;(C1) incubating a first conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (R1) , wherein, the first conjugating group is a first linker-payload or a first thiobridge reagent, optionally, the first thiobridge reagent bears the first linker-payload or reactive groups, wherein, reaction system in step (C1) comprises additive, optionally, the additive has binding capacity for the transition metal ions, and the binding capacity of the additive for the transition metal ions is stronger than that of a single hydroxyl group and weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions , optionally, the additive comprises amino acid or compound with imidazolyl or a salt thereof;(C1’ ) incubating a first conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (R1’ ) , wherein, the first conjugating group is a first linker-payload or a first thiobridge reagent, optionally, the first thiobridge reagent bears the first linker-payload or reactive groups, wherein, reaction system in step (C1’ ) comprises additive, optionally, the additive has binding capacity for the transition metal ions, and the binding capacity of the additive for the transition metal ions is stronger than that of a single hydroxyl group and weaker than that of the metal chelators for the transition metal ions , optionally, the additive comprises amino acid or compound with imidazolyl or a salt thereof; between step (R1’ ) and step (C1’ ) , adding transition metal ions.The method according to claim 1, which is characterized in that, in the method of the Group I and / or of the Group II, two or more than two of the interchain disulfide bonds of the antibody are reduced in step (R1) and / or in step (R1’ ) , optionally, two, three or four of the interchain disulfide bonds of the antibody are reduced in step (R1) and / or in step (R1’ ) .The method according to claim 1, which is characterized in that, in the method of the Group III and / or of the Group IV, more than two of the interchain disulfide bonds of the antibody are reduced in step (R1) and / or in step (R1’ ) , optionally, three of the interchain disulfide bonds of the antibody are reduced in step (R1) and / or in step (R1’ ) .The method according to claim 1 or 2, which is characterized in that, the method of the Group I and / or of the Group II further comprises the following step,(C1) incubating an amount of metal chelators and the first conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (O1) and / or from step (O1’ ) ;or,(R2) incubating a second reductant or salt thereof in the buffer system to reduce the interchain disulfide bond of the antibody resulted from step (O1) , optionally, reduce one of the interchain disulfide bond of the antibody resulted from step (O1) ;(C2) incubating the first conjugating group to react with the reduced thiol groups of the reaction product resulted from step (R2) ;wherein, incubating an amount of metal chelators in step (R2) or in step (C2) .The method according to claim 4, which is characterized in that, the method of the Group I and / or of the Group II further comprises the following step,(R2) incubating the reaction product from step (C1) and a second reductant or salt thereof in the buffer system to reduce the interchain disulfide bonds of the reaction product resulted from step (C1) , optionally, introducing the transition metal ions;(C2) introducing a second conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (R2) , optionally, introducing the metal chelator; wherein, the second conjugating group is a second linker-payload or a second thiobridge reagent, optionally, the second thiobridge reagent bears thesecond linker-payload or the reactive groups.The method according to claim 1 or 3, which is characterized in that, the method of the Group III and / or of the Group IV further comprises the following step,(E1) introducing an amount of metal chelators and the oxidant to re-oxidize the reduced thiol groups remained from step (C1) .The method according to claim 1 or 3, which is characterized in that, the method of the Group III and / or of the Group IV further comprises the following step,(C2) introducing an amount of metal chelators and a second conjugating group to react with the reduced thiol groups remained from step (C1) , wherein, the second conjugating group is a second linker-payload or a second thiobridge reagent, optionally, the second thiobridge reagent bears the second linker-payload or the reactive groups.The method according to claim 7, which is characterized in that, the method of the Group III further comprises the following step,(R2) incubating the reaction product from step (C2) and a second reductant or salt thereof in the buffer system to reduce the interchain disulfide bonds of the reaction product resulted from step (C2) ;(C3) introducing a third conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (R2) , wherein, the third conjugating group is a third linker-payload or a third thiobridge reagent, optionally, the third thiobridge reagent bears the third linker-payload or the reactive groups.The method according to any one of claims 1-8, which is characterized in that, the first thiobridge reagent, the second thiobridge reagent and the third thiobridge reagent independently contain at least two substituted groups allowing a re-bridging of the thiol groups, optionally, the first thiobridge reagent, the second thiobridge reagent and the third thiobridge reagent are independently comprise at least one of the group consisting ofand / or,the reactive groups independently include azido and / or dibenzocyclooctyne (DBCO) .The method according to any one of claims 1-9, which is characterized in that, the additive comprises at least one of the groups of histidine, imidazole, glutamic acid or asparic acid.The method according to claim 1, which is characterized in that, the concentration of the additive in step (O1) , in step (O’ ) , in step (C1) and / or in step (C1’ ) is 0.1 mM-50 mM, optionally, the concertation of the additive in step (O1) , in step (C1) and / or in step (C1’ ) is 1 mM-5 mM, more optionally, the concertation of the additive in step (O1) , in step (C1) and / or in step (C1’ ) is 1 mM-2 mM.The method according to claim 1, which is characterized in that, in step (R1) , the molar ratio of the first reductant and the antibody is 1.5: 1-30: 1;and / or,in step (R1’ ) , the molar ratio of the first reductant and the antibody is 2.5: 1 or more than 2.5: 1.The method according to claim 1 or 2, which is characterized in that, in step (R1) of the Group I, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 2: 1-30: 1, optionally, in step (R1) of the Group I, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 2: 1-10: 1;and / or,in step (R1’ ) of the Group II, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 2.5: 1 or more than 2.5: 1, optionally, in step (R1’ ) of the Group II, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 2.5: 1-15: 1.The method according to claim 1 or 3, which is characterized in that, in step (R1) of the Group III, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 2.5: 1-10: 1, optionally, in step (R1) of the Group III, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 4: 1 to 8: 1;and / or,in step (R1’ ) of the Group IV, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 3.5: 1 or more than 3.5: 1, optionally, in step (R1’ ) of the Group IV, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 3.5: 1-8: 1.The method according to claim 7, which is characterized in that, in step (R1) of the Group III, the molar ratio of the first reductant and the antibody is 3.5: 1-10: 1.The method according to claim 1, which is characterized in that, in step (R1) , the molar ratio of the transition metal ions and the antibody is 0.5: 1 to 100: 1.The method according to claim 1 or 2, which is characterized in that, in step (R1) of the Group I and / or in step (O1’ ) of the Group II, the molar ratio of the transition metal ions and the antibody is 1: 1-15: 1.The method according to claim 1 or 3, which is characterized in that, in step (R1) of the Group III and / or in step (C1’ ) of the Group IV, the molar ratio of the transition metal ions and the antibody is 0.5: 1-10: 1, optionally, in step (R1) of the Group III and / or in step (C1’ ) of the Group IV, the molar ratio of the transition metal ions and the antibody is 2: 1-6: 1.The method according to any one of claims 1-18, which is characterized in that, in step (R1) and / or in step (R1’ ) , the incubation temperature is 0℃ to 37℃, 0℃ to 25℃, 0℃ to 15℃, 0℃ to 10℃, or 0℃ to 5℃, the incubation time is 10 min to 48h or 30min to 24h.The method according to any one of claims 1-19, which is characterized in that, the transition metal ions comprise at least one of Zn2+, Cd2+, Hg2+, Ni2+, Co2+ or the combination thereof, optionally, the transition metal ions are Zn2+.The method according to any one of claims 1-20, which is characterized in that, the buffer system comprises at least one of His buffer, MES buffer, Bis-Tris buffer, PIPES buffer, MOPS buffer, BES buffer, HEPES buffer, ADA buffer, PB buffer, DIPSO buffer, MOBS buffer, MOPSO buffer, TES buffer, ACES buffer, TAPSO buffer, PBS, Acetate buffer, BTP buffer, HEPPSO buffer, POPSO buffer, EPPS buffer or Tris buffer, optionally, the buffer system comprises at least one of His buffer, Bis-Tris buffer, MOPS buffer, BES buffer, HEPES buffer, DIPSO buffer, MOBS buffer, MOPSO buffer, TES buffer, ACES buffer, TAPSO buffer or MES buffer.The method according to any one of claims 1-21, which is characterized in that, in the method of the Group III and / or of the Group IV, the buffer system comprises at least one of His buffer, Bis-Tris buffer, MOPS buffer, BES buffer, HEPES buffer, DIPSO buffer, MOBS buffer, MOPSO buffer, TES buffer, ACES buffer, TAPSO buffer, PIPES buffer or MES buffer.The method according to any one of claims 1-22, which is characterized in that, the concentration of the buffer system is 10 mM to 100 mM, 20 mM to 80 mM, 20 mM to 40 mM, 20 mM to 60 mM, 40 mM to 80 mM, or 40 mM to 60 mM;and / or,the pH value of the buffer system is 5.5 to 8, optionally, the pH value of the buffer system is 6.4 to 7.4, or 6.7 to 7.4.The method according to claim 1 or 2, which is characterized in that, in step (O1) of the Group I and / or in step (O1’ ) of the Group II, the molar ratio of oxidant and the antibody is 2: 1 to 50: 1, 2: 1 to 20: 1, 4: 1 to 22: 1, 4: 1 to 15: 1, or 6: 1 to 14: 1.The method according to claim 1 or 2, which is characterized in that, in step (O1) of the Group I and / or in step (O1’ ) of the Group II, the oxidation reaction is performing, optionally in darkness, at temperature of 0℃ to 37℃, 0℃ to 30℃, 15℃ to 30℃, or 20℃ to 30℃, and / or the oxidation time is 1h to 48h, 1h to 8h, 1h to 5h, or 1h to 3h.The method according to claim 1 or 3, which is characterized in that, in step (C1) of the Group III and / or in step (C1’ ) of the Group IV, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 6: 1 to 20: 1, optionally, in step (C1) of the Group III and / or of the Group IV, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 6: 1 to 12: 1, more optionally, in step (C1) of the Group III and / or of the Group IV, the molar ratio of the first linker-payload and the antibody is 6: 1 to 8: 1.The method according to claim 5, which is characterized in that, in step (R2) , the molar ratio of the second reductant and the antibody is 3: 1 to 20: 1, optionally, in step (R2) , the molar ratio of the second reductant and the antibody is 3: 1 to 10: 1;and / or,in step (R2) , the incubation temperature is 0℃ to 37℃, or 5℃ to 30℃;and / or,in step (R2) , the incubation time is 0.5 h to 24h, 5 h to 20 h or 6 h to 18 h.The method according to claim 5, which is characterized in that, in step (R2) , the molar ratio of the second reductant and the transition metal ions is 1: 0.05 to 1: 40;and / or.in step (R2) , the molar ratio of the second reductant and the antibody is 2.5: 1 to 20: 1;and / or,in step (R2) , the incubation temperature is 0℃ to 37℃, 0℃ to 37℃, 0℃ to 30℃, 15℃ to 30℃, or 20℃ to 30℃;and / or,in step (R2) , the incubation time is 0.2h to 24h or 1h to 10h.The method according to claim 5, which is characterized in that, in step (R2) , the molar ratio of the second reductant and the transition metal ions is 1: 0.4 to 1: 100;and / or,in step (R2) , the molar ratio of the second reductant and the antibody is 0.8: 1 to 2.5: 1;and / or,in step (R2) , the incubation temperature is 0℃ to 37℃, 0℃ to 37℃, 0℃ to 30℃, 15℃ to 30℃, or 20℃ to 30℃;and / or,in step (R2) , the incubation time is 0.5h to 24h.The method according to claim 8, which is characterized in that, in step (R2) , the molar ratio of the second reductant and the antibody is 1: 1 to 15: 1, optionally, in step (R2) , the molar ratio of the second reductant and the antibody is 1.5: 1 -3: 1;and / or,in step (R2) , the second reductant and the reaction product from step (C2) are incubated at temperature of 0℃ to 37℃, 0℃ to 30℃, 15℃ to 30℃, or 20℃ to 30℃;and / or,in step (R2) , the incubation time is 0.2h to 24h, 1h to 10h, 5h to 10h, 1h to 5h, or 1h to 3h.The method according to claim 1 or 4, which is characterized in that, when the first thiobridge reagent bears the reactive groups, the step (C1) and / or the step (C1’ ) comprises the following step,introducing the first thiobridge reagent bearing the reactive groups to re-bridge the reduced thiol groups resulted from step (R1) , then, incubating the first linker-payload in the buffer system to react with the reactive groups of the thiobridge group.The method according to claim 5 or 7, which is characterized in that, when the second thiobridge reagent bears the reactive groups, the step (C2) comprises the following step,introducing the second thiobridge reagent bearing the reactive groups to re-bridge the reduced thiol groups remained from step (C1) , then, incubating the second linker-payload in the buffer system to react with the reactive groups of the thiobridge group.The method according to claim 8, which is characterized in that, when the third thiobridge reagent bears the reactive groups, the step (C3) comprises the following step,introducing the third thiobridge reagent bearing the reactive groups to re-bridge the reduced thiol groups resulted from step (R2) , then, incubating the third linker-payload in the buffer system to react with the reactive groups of the thiobridge group.The method according to any one of claims 1-33, which is characterized in that, the method further comprises a step of purification after step (R1) , (R1’ ) , (O1) , (O1’ ) , (C1) , (C1’ ) , (C2) , (R2) and / or (C3) .The method according to any one of claims 1-34, which is characterized in that, the first reductant and the second reductant comprise at least one of the group consisting of tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) , TCEP derivatives, 3- [tris (hydroxymethyl) phosphonio] propionate (THPP) , 2-diphenylphosphanybenzensulfonic acid (diPPBs) , Dithiothreitol (DTT) , 2-diphenylphosphino) acetic acid (DPAA) , dithioerythritol (DTE) , β-Mercaptoethanol, LiAlH4, Na2S2O3, KBH4 or Hydrazine.The method according to any one of claims 1-35, which is characterized in that, the oxidant comprises Dehydroascorbic acid (DHAA) , H2O2, KClO3, H2S2O8, H2SO4, NaClO, NaCr2O7, CuSO4, permanganate compounds, sodium perborate, nitrous oxide, NaBiO3, ceric sulfate, 5, 5'-Dithiobis- (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) , nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) , nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) or 2-aminophenyl disulfide (DDD) ;and / or,the metal chelators comprise Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA-2Na) , ethylenediamine, 2, 2’ -bipyridine or 1, 10-phenanthroline, nitrilotriacetic acid (NTA) , diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) , citric Acid (CA) , tartaric acid (TA) , gluconic acid (GA) or N- (2-hydroxyethyl) ethylenediamine-N, N', N'-triacetic acid (HEDTA) .The method according to any one of claims 1-36, which is characterized in that, the antibody is a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a mono-specific antibody or a multi-specific antibody, optionally, the antibody is IgG1 or IgG4.The method according to any one of claims 1-37, which is characterized in that, the antibody is an engineered antibody I comprises two amino acid substitutions of two interchain cysteines forming one interchain disulfide bond in the hinge region, optionally, the amino acid substitutions are selected from the following, cysteine to alanine, to leucine, to arginine, to lysine, to asparagines, to methionine, to aspartic acid, to phenylalanine, to praline, to glutamine, to serine, to glutamic acid, to threonine, to glycine, to tryptophan, to histidine, to tyrosine, to isoleucine or to valine, respectively, more optionally, the amino acid substitutions are selected from the following, cysteine to serine, optionally, in step (R1) of the Group I, and / or, in step (R1’ ) of the Group II and / or of the Group IV, the antibody is the engineered antibody I.The method according to claim 1, which is characterized in that, in step (R1) and / or in step (R1’ ) , the antibody is a modification antibody, wherein the method for preparing the modification antibody comprising the following step,(R0) contacting the first reductant or salt thereof and an engineered antibody II in the buffer system to reduce interchain disulfide bonds within the engineered antibody II to afford the engineered antibody II bearing reduced thiol groups, wherein,the engineered antibody II comprises one amino acid sequence with a mutant cysteine obtained by asymmetrical single-point mutation on a bispecific antibody,and / or,the engineered antibody II comprises one amino acid sequence with two mutant cysteines obtained by symmetrical single-point mutation on the antibody, the mutant cysteines don’ t form one interchain disulfide with each other;(O0) introducing the oxidant to re-oxidize the reduced thiol groups resulted from step (R0) ;(C0) incubating the first conjugating group to react with the reduced thiol groups resulted from step (O0) , then recovering the modification antibody.The method according to any one of claims 1-39, which is characterized in that, a linker of the first linker-payload, the second linker payload and the third linker payload is selected from any one of which the one terminal can be connected to the reduced thiol group of the antibody or the reactive groups of the thiobridge reagent, and the other terminal can be connected to the payload.The method according to any one of claims 1-40, which is characterized in that, the payload of linker-payload is selected from any one of which contains at least one substituted group allowing a connection from the payload to the linker, optionally, the payload is a cytotoxic agent, a cytokine, a nucleic acid, a radionuclide, a chemokine, an immuno (co) -stimulatory molecule, an immunosuppressive molecule, a kinase, a prodrug-converting enzyme, a RNase, a growth factor, a hormone, a coagulation factor, a fibrinolytic protein, peptides mimicking these, and fragments, fusion proteins, or derivatives thereof.An antibody with site-specific modifications prepared by the method according to any one of claims 1-41.The antibody with site-specific modifications according to claim 42, which is characterized in that, the antibody with site-specific modifications is conjugated with one, two, three or four kinds of conjugating groups.The antibody with site-specific modifications according to claim 42 or 43, which is characterized in that, the antibody with site-specific modifications is an antibody drug conjugate (ADC) with D1, D2, D4, D2+D6, D1+D6, D2+D3, D1+D3, D2+D4, D1+D2, D1+D2, D4+D2, D4+D1, D2+D2, D2+D1, D1+D2+D6, D1+D1+D6, D1+D2+D3, D1+D1+D3, D1+D2+D4, D1+D1+D2, D1+D1+D1, D2+D2+D6, D2+D1+D6, D2+D2+D3, D2+D1+D3, D2+D2+D4, D2+D1+D2, D4+D2+D2, D4+D2+D1, D4+D1+D2, D4+D1+D1, D2+D2+D2, D2+D2+D1, D2+D1+D2, D2+D1+D1, D1+D4+D2, D1+D4+D1, D1+D2+D2, D1+D2+D1, D2+D4+D2, D2+D4+D1, D1+D4+D2+D1, D1+D4+D1+D1, D1+D2+D2+D1, D1+D2+D1+D1, D1+D4+D2+D2, D1+D4+D1+D2, D1+D2+D2+D2, D1+D2+D1+D2, D2+D4+D2+D1, D2+D4+D1+D1, D2+D2+D2+D1, D2+D2+D1+D1, D2+D4+D2+D2, D2+D4+D1+D2, D2+D2+D2+D2 and / or D2+D2+D1+D2.A pharmaceutical composition comprising the antibody with site-specific modifications prepared according to the method of any one of claims 1-41 or the antibody with site-specific modifications according to any one of claims 42-44, and at least one pharmaceutically acceptable ingredient.Use of the antibody with site-specific modifications prepared according to the method of any one of claims 1-41, the antibody with site-specific modifications according to any one of claims 42-44 or the pharmaceutical composition according to claim 45 in the manufacture of a therapeutic agent for preventing, diagnosing, or treating a disease.A method of preventing or treating a disease in a subject in need thereof, comprising administrating to the subject a therapeutically effective amount of the antibody with site-specific modifications prepared according to the method of any one of claims 1-41, the antibody with site-specific modifications according to any one of claims 42-44 or the pharmaceutical composition according to claim 45.Use of amino acid or compound with imidazolyl or a salt thereof in the preparation of an antibody with site-specifications, optionally, the amino acid or compound with imidazolyl comprises at least one of the groups of histidine, imidazole, glutamic acid or Asparic acid, optionally, the antibody with site-specific modifications is an antibody drug conjugate (ADC) .

Images