Anti-CD19 antibody, chimeric antigen receptor and use thereof

Abstract

Provided herein are an anti-CD19 antibody, a pharmaceutical composition comprising same, a chimeric antigen receptor (CAR) and use thereof. In particular, the anti-CD19 antibody or the antigen binding fragment thereof retains its binding capability to human CD19 with improved humanness following humanization. Further, provided is a chimeric antigen receptor (CAR) prepared using the anti-CD19 antibody or the antigen binding fragment thereof.

Description

ANTI-CD19 ANTIBODY, CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR AND USE THEREOF

[0001] CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0002] This application claims benefit of priority of International Patent Application No. PCT / CN2024 / 144259 filed on December 31, 2024, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0003] SUBMISSION OF SEQUENCE LISTING ON XML FILE

[0004] The content of the following submission on XML file is incorporated herein by reference in its entirety: a computer readable form (CRF) of the Sequence Listing (file name: IEC250825PCT SEQUENCE LISTING. XML, date recorded: December 31, 2025, size: 160 KB) .1.TECHNICAL FIELD

[0005] The present disclosure belongs to the field of biomedicine, and relates to an anti-CD19 antibody, a pharmaceutical composition comprising same, a chimeric antigen receptor (CAR) and use thereof.2.BACKGROUND

[0006] CD19 is expressed on normal B cells and by cells and tissues of various diseases and conditions, including most B cell malignancies. CD19 is critically involved in establishing intrinsic B cell signaling thresholds through modulating both B cell receptor-dependent and independent signaling. CD19 functions as the dominant signaling component of a multimolecular complex on the surface of mature B cells, and it plays a critical role in maintaining the balance between humoral, antigen-induced response and tolerance induction. See Wang et al., Exp Hematol Oncol. 1: 36 (2012) .

[0007] Various CD19-binding molecules, including anti-CD19 antibodies, and chimeric antigen receptors containing anti-CD19 antibody portions, and cells expressing such chimeric receptors, are available. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is an emerging and effective cancer immunotherapy. Especially in hematological malignancies, CAR-T cells have achieved exciting results. Four anti-CD19 scFv based CAR-T therapies have been approved for the treatment of CD19-positive leukemia or lymphoma.

[0008] However, the major disadvantage associated with the anti-CD19 CAR therapies reported to date is that the T cells suffer from the problem of not surviving and remaining active in vivo for longer duration of time. Also, the potential risk associated with current anti-CD19 CARs are the generation of human anti-mouse immune responses which can induce significant toxicity associated with elevated levels of serum cytokines (Brudno &Kochenderfer, Blood. 2016 Jun 30; 127 (26) : 3321-30) . Further, it is also essential that the generated CAR-T cells remain active for longer duration and not induce toxicity. Thus, there remains a need in the art for an improved anti-CD19 CARs for treatment of B-cell malignancies with improved efficacy and / or reduced toxicities.

[0009] B-cell maturation antigen (BCMA or CD269) , also known as tumor necrosis factor receptor superfamily member 17 (TNFRSF17) , is a protein that in humans is encoded by the TNFRSF17 gene. It is expressed on differentiated plasma cells and plasmablasts under physiological conditions and is expressed on almost all multiple myeloma (MM) tumor cells. BCMA's ligands include APRIL (aproliferation-inducing ligand) and BAFF (B-cell activating factor) , which are involved in the maturation and differentiation of PCs and are essential for sustained humoral immunity. Therefore, BCMA is an important target in humoral immunity-mediated autoimmune diseases (e.g., SLE) and multiple myeloma.3.SUMMARY

[0010] Through intensive studies and creative efforts, the inventors have obtained anti-CD19 antibody. The inventors have surprisingly found that the anti-CD19 antibody of the present disclosure (also referred to as the antibody or the antibody of the present disclosure for short) retains their binding capability to human CD19 (comparable or superior to that of FMC63) with improved humanness after humanization. Further, a chimeric antigen receptor (CAR) is prepared using the anti-CD19 antibody or the antigen binding fragment thereof. The present disclosure is detailed below.

[0011] One aspect of the present disclosure relates to an anti-CD19 antibody or an antigen-binding fragment thereof, wherein, the antibody comprises a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions HCDR1 to HCDR3 (HCDR1, HCDR2 and HCDR3) and a light chain variable region (VL) comprising complementarity determining regions LCDR1 to LCDR3 (LCDR1, LCDR2 and LCDR3) , wherein:

[0012] (1) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;

[0013] (2) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;

[0014] (3) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 36, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0015] (4) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0016] (5) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0017] (6) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 40;

[0018] (7) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; or

[0019] (8) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 114, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39.

[0020] In one or more embodiments of the present disclosure, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof is provided, wherein the HCDR1 to HCDR3 and the LCDR1 to LCDR3 are defined according to Kabat numbering system, AbM numbering system, IMGT numbering system, Chothia numbering system or Contact numbering system.

[0021] An anti-CD19 antibody or an antigen-binding fragment thereof is provided, wherein, the antibody comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1 to HCDR3 and a light chain variable region comprising LCDR1 to LCDR3, wherein:

[0022] (1) the VH comprises HCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 41, HCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 42 and HCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 43, and, the VL comprises LCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 46, LCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 47 and LCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 48;

[0023] (2) the VH comprises HCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 44, HCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 45 and HCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 43, and, the VL comprises LCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 46, LCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 47 and LCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 48; or

[0024] (3) the VH comprises HCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 44, HCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 45 and HCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 43, and, the VL comprises LCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 49, LCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 50 and LCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 51.

[0025] In one or more embodiments of the present disclosure, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof is provided, wherein:

[0026] (1) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;

[0027] (2) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;

[0028] (3) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 36, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0029] (4) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0030] (5) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0031] (6) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 40;

[0032] (7) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; or

[0033] (8) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 114, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39.

[0034] In one or more embodiments of the present disclosure, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof is provided, wherein the VH comprises an amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-37, and 114, and the VL comprises an amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 38-40;

[0035] preferably,

[0036] (1) the VH comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;

[0037] (2) the VH comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;

[0038] (3) the VH comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 36, and the VL comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0039] (4) the VH comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0040] (5) the VH comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0041] (6) the VH comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 40;

[0042] (7) the VH comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; or

[0043] (8) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 114, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39.

[0044] In one or more embodiments of the present disclosure, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises a non-CDR region derived from human, mouse or rabbit;

[0045] preferably, the non-CDR region is framework regions, heavy chain constant region, and / or light chain constant region.

[0046] In one or more embodiments of the present disclosure, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof is provided, wherein the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment is selected from the group consisting of Fab, Fab', F (ab') 2, single chain fragment variable (scFv) , scFv-Fc, and disulfide-stabilized Fv fragment (dsFv) ;

[0047] preferably, the scFv comprises a VH comprising an amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-37, and 114, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 38-40;

[0048] preferably, the scFv comprises, from N-terminus to C-terminus:

[0049] (1) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34;

[0050] (2) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35;

[0051] (3) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 36;

[0052] (4) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34;

[0053] (5) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35;

[0054] (6) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 40, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37;

[0055] (7) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37;

[0056] (8) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;

[0057] (9) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;

[0058] (10) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 36, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0059] (11) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0060] (12) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0061] (13) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 40;

[0062] (14) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; or

[0063] (15) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 114; or

[0064] (16) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 114, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0065] preferably, the linker comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 32, 33, 66, 67 and 68.

[0066] In one or more embodiments of the present disclosure, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 13-19, and 115;

[0067] preferably, the antibody or the antigen-binding fragment thereof has an amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 13-19, and 115.

[0068] Another aspect of the present disclosure relates to a polypeptide construct, comprising the anti-CD19 antibody or an antigen-binding fragment thereof according to the disclosure.

[0069] In one or more embodiments of the present disclosure, the polypeptide construct is a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, a human engineered antibody, a monospecific molecule, a bispecific molecule, a multispecific molecule, or chemically modified derivatives thereof.

[0070] Another aspect of the present disclosure relates to an immunoconjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of according to the disclosure, linked to a therapeutic agent.

[0071] In some embodiments of the present disclosure, the therapeutic agent is a drug, a cytotoxin, or a radioactive isotope.

[0072] Another aspect of the present disclosure relates to a nucleic acid molecule, encoding the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof or the polypeptide construct according to the disclosure.

[0073] Yet another aspect of the present disclosure relates to a vector, comprising the nucleic acid molecule according to the disclosure.

[0074] Another aspect of the present disclosure relates to a host cell, comprising the nucleic acid molecule according to the disclosure or the vector according to the disclosure.

[0075] Yet another aspect of the present disclosure relates to a chimeric antigen receptor (CAR) comprising a polypeptide comprising:

[0076] (a) an extracellular antigen binding domain comprising anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to the disclosure;

[0077] (b) a transmembrane domain; and

[0078] (c) an intracellular signaling domain.

[0079] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR is provided, wherein the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof is a scFv;

[0080] preferably, the scFv is any one of the scfvs described above.

[0081] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR further comprises a hinge domain located between the C-terminus of the extracellular antigen binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain;

[0082] preferably, the hinge domain is derived from IgG4Fc, CD28 or CD8α;

[0083] preferably, the hinge domain comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 5-7 and 109, or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 5-7 and 109.

[0084] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR is provided, wherein the transmembrane domain is derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 and PD1;

[0085] preferably, the transmembrane domain comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 8.

[0086] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR is provided, wherein the intracellular signaling domain comprises a co-stimulatory signaling domain;

[0087] preferably, the co-stimulatory signaling domain is derived from a co-stimulatory molecule selected from the group consisting of CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligands of CD83 and combinations thereof;

[0088] preferably, the co-stimulatory signaling domain is derived from CD137;

[0089] preferably, the co-stimulatory signaling domain comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 9, or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 9.

[0090] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR is provided, wherein the intracellular signaling domain comprises a primary intracellular signaling domain;

[0091] preferably, the primary intracellular signaling domain is derived from CD3ζ;

[0092] preferably, the primary intracellular signaling domain comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 10, or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 10.

[0093] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 52, 53, or 116.

[0094] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR is provided, wherein the intracellular signaling domain further comprises a DAP12 intracellular signaling domain at the C-terminus;

[0095] preferably, the DAP12 intracellular signaling domain comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 11, or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 11.

[0096] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 54-58.

[0097] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR is provided, wherein the extracellular antigen-binding domain further comprises one or more additional antigen-binding domain (s) .

[0098] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR is provided, wherein the one or more additional antigen-binding domain (s) binds to BCMA.

[0099] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR is provided, wherein the additional antigen-binding domain binding to BCMA is an anti-BCMA single domain antibody (sdAb) .

[0100] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR is provided, wherein:

[0101] (1) the additional antigen-binding domain comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 76; or

[0102] (2) the additional antigen-binding domain comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 77.

[0103] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR is provided, wherein:

[0104] (1) the additional antigen-binding domain comprises a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72; or

[0105] (2) the additional antigen-binding domain comprises a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75.

[0106] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR is provided, wherein:

[0107] (1) the additional antigen-binding domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 76 or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 76; or

[0108] (2) the additional antigen-binding domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 77 or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 77.

[0109] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR is provided, wherein the anti-CD19 scFv and the additional antigen-binding domain are connected via a linker.

[0110] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR is provided, wherein the extracellular antigen binding domain comprises from N-terminus to C-terminus:

[0111] (1) an anti-BCMA sdAb, a linker, and an anti-CD19 scFv;

[0112] (2) a VL of anti-CD19 scFv, a linker, an anti-BCMA sdAb, a linker, and a VH of anti-CD19 scFv;

[0113] (3) a VH of anti-CD19 scFv, a linker, an anti-BCMA sdAb, a linker, and a VL of anti-CD19 scFv; or

[0114] (4) an anti-CD19 scFv, a linker, and an anti-BCMA sdAb.

[0115] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR is provided, wherein the linker comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 32, 33, 66, 67 and 68.

[0116] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR is provided, wherein the extracellular antigen binding domain comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 78-84.

[0117] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 85-91.

[0118] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR further comprises a signal peptide located at the N-terminus of the polypeptide;

[0119] preferably, the signal peptide is derived from CD8α, CD28 or CD4;

[0120] preferably, the signal peptide comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO:4, or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 4.

[0121] In one or more embodiments of the present disclosure, the CAR comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 22, 23, 59-63, 92-98, and 117.

[0122] Yet another aspect of the present disclosure relates to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding the CAR according to the disclosure.

[0123] Yet another aspect of the present disclosure relates to a vector, comprising the nucleic acid molecule according to the disclosure.

[0124] In one or more embodiments of the present disclosure, the vector is provided, wherein the vector further comprises a nucleic acid molecule encoding a membrane bound IL-15 (mbIL-15) .

[0125] In one or more embodiments of the present disclosure, the vector is provided, wherein the nucleic acid molecule encoding the CAR and the nucleic acid molecule encoding the mbIL-15 are operably linked to a single promoter and are connected by a linking sequence.

[0126] In one or more embodiments of the present disclosure, the vector is provided, wherein the linking sequence encodes a self-cleaving 2A peptide;

[0127] preferably, the self-cleaving 2A peptide is selected from the group consisting of P2A, T2A, E2A and F2A;

[0128] preferably, the P2A comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 31.

[0129] In one or more embodiments of the present disclosure, the vector is provided, wherein the vector encodes the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 25-29, 64-65, and 99-101.

[0130] Yet another aspect of the present disclosure relates to an engineered cell, comprising the CAR according to the disclosure, the nucleic acid molecule according to the disclosure, or the vector according to the disclosure;

[0131] preferably, the engineered cell is an engineered immune cell.

[0132] In one or more embodiments of the present disclosure, the engineered cell is provided, wherein the engineered cell is selected from the group consisting of T cell (e.g., αβ T cell, γδ T cell) , NK cell, peripheral blood mononuclear cell, hematopoietic stem cell, pluripotent stem cell, and embryonic stem cell.

[0133] In one or more embodiments of the present disclosure, the engineered cell is provided, wherein the engineered cell is an NK cell.

[0134] In one or more embodiments of the present disclosure, the engineered cell is provided, wherein at least a portion of the engineered immune cells are engineered to express mbIL-15.

[0135] In one or more embodiments of the present disclosure, the engineered cell is provided, wherein the mbIL-15 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 12, 69, 106 or 107.

[0136] In one or more embodiments of the present disclosure, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to the disclosure, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the CAR, or the engineered cell according to the disclosure, for use in treating or preventing a disease or disorder;

[0137] preferably, the disease or disorder is a B cell associated disease or disorder and / or CD19 associated disease or disorder;

[0138] preferably, the disease or disorder is cancer;

[0139] preferably, the disease or disorder is a B cell malignancy; preferably, the B cell malignancy is a B cell leukemia or B cell lymphoma;

[0140] preferably, the disease or disorder is selected from a group consisting of marginal zone lymphoma (e.g., splenic marginal zone lymphoma) , diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , primary central nervous system (CNS) lymphoma, primary mediastinal B cell lymphoma (PMBL) , small lymphocytic lymphoma (SLL) , B cell prolymphocytic leukemia (B-PLL) , follicular lymphoma (FL) , burkitt lymphoma, primary intraocular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , acute lymphoblastic leukemia (ALL) , hairy cell leukemia (HCL) , precursor B lymphoblastic leukemia, non-hodgkin lymphoma (NHL) , high-grade B-cell lymphoma (HGBL) , and multiple myelomia (MM) ;

[0141] preferably, the disease or disorder is an autoimmune disease; preferably, the autoimmune disease is associated with inappropriate or enhanced B cell numbers and / or activation; the autoimmune disease is systemic lupus erythematosus (SLE) .

[0142] Yet another aspect of the present disclosure relates to a pharmaceutical composition, comprising the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to the disclosure, the polypeptide construct, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the CAR, or the engineered cell according to the disclosure, wherein optionally, the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable excipient.

[0143] Yet another aspect of the present disclosure relates to use of anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to the disclosure, the polypeptide construct, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the CAR, or the engineered cell according to the disclosure, in the preparation of a medicament for treating or preventing a disease or disorder;

[0144] preferably, the disease or disorder is a B cell associated disease or disorder and / or CD19 associated disease or disorder;

[0145] preferably, the disease or disorder is cancer;

[0146] preferably, the disease or disorder is a B cell malignancy; preferably, the B cell malignancy is a B cell leukemia or B cell lymphoma;

[0147] preferably, the disease or disorder is selected from a group consisting of marginal zone lymphoma (e.g., splenic marginal zone lymphoma) , diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , primary central nervous system (CNS) lymphoma, primary mediastinal B cell lymphoma (PMBL) , small lymphocytic lymphoma (SLL) , B cell prolymphocytic leukemia (B-PLL) , follicular lymphoma (FL) , burkitt lymphoma, primary intraocular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , acute lymphoblastic leukemia (ALL) , hairy cell leukemia (HCL) , precursor B lymphoblastic leukemia, non-hodgkin lymphoma (NHL) , high-grade B-cell lymphoma (HGBL) , and multiple myelomia (MM) ;

[0148] preferably, the disease or disorder is an autoimmune disease; preferably, the autoimmune disease is associated with inappropriate or enhanced B cell numbers and / or activation; the autoimmune disease is systemic lupus erythematosus (SLE) .

[0149] Yet another aspect of the present disclosure relates to a method for treating or preventing a disease or disorder in a subject, comprising a step of administering to the subject in need an effective amount of the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to the disclosure, the polypeptide construct, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the CAR, or the engineered cell according to the disclosure;

[0150] preferably, the disease or disorder is a B cell associated disease or disorder and / or CD19 associated disease or disorder;

[0151] preferably, the disease or disorder is cancer;

[0152] preferably, the disease or disorder is a B cell malignancy; preferably, the B cell malignancy is a B cell leukemia or B cell lymphoma;

[0153] preferably, the disease or disorder is selected from a group consisting of marginal zone lymphoma (e.g., splenic marginal zone lymphoma) , diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , primary central nervous system (CNS) lymphoma, primary mediastinal B cell lymphoma (PMBL) , small lymphocytic lymphoma (SLL) , B cell prolymphocytic leukemia (B-PLL) , follicular lymphoma (FL) , burkitt lymphoma, primary intraocular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , acute lymphoblastic leukemia (ALL) , hairy cell leukemia (HCL) , precursor B lymphoblastic leukemia, non-hodgkin lymphoma (NHL) , high-grade B-cell lymphoma (HGBL) , and multiple myelomia (MM) ;

[0154] preferably, the disease or disorder is an autoimmune disease; preferably, the autoimmune disease is associated with inappropriate or enhanced B cell numbers and / or activation; the autoimmune disease is systemic lupus erythematosus (SLE) .4.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0155] FIG. 1: shows the cytotoxicity of different CD19 CAR-T cells against tumor cells. Un-transduced T cells (UnT) and FMC63 CAR-T cells (FMC63) serve as assay controls.

[0156] FIG. 2A: shows the CD3 T cells percentage in the persistent cytotoxicity assay.

[0157] FIG. 2B: shows the persistence of CAR-T cells in the persistent cytotoxicity assay.

[0158] FIG. 3: shows the in vivo evaluation of different CD19 CAR-T cells in Nalm6-CD20-luc-B2M KO bearing NCG model.

[0159] FIG. 4: shows the in vitro long-term cytotoxicity of different CD19 CAR-NK cells under repeated antigen stimulation of NALM-6 cells. Un-transduced NK cells (UnNK) and FMC63 CAR-NK cells (19-F) serve as assay controls.

[0160] FIG. 5A and FIG. 5B show the in vitro cytotoxicity of different CD19 CAR-NK cells on primary SLE B cells.

[0161] FIG. 5A: shows the CD19 CAR-NK cytotoxicity on primary B cell with 4 hours’ co-culture. Un-transduced NK cells (Un-NK) and FMC63 CAR-NK cells (19-F) serve as assay controls.

[0162] FIG. 5B: shows the CD19 CAR-NK cytotoxicity on primary B cell with 22 hours’ co-culture. Un-transduced NK cells (Un-NK) and FMC63 CAR-NK cells (19-F) serve as assay controls.

[0163] FIG. 6A and FIG. 6B show the in vivo evaluation of different CD19 CAR-NK cells in NALM-6-luc bearing NCG model. Un-transduced NK cells (Un-NK) , 19-F CAR-NK cells, H-78 CAR-NK cells, H-80 CAR-NK cells, H-84 CAR-NK cells, H-87 CAR-NK cells, H-88 CAR-NK cells and H-90 CAR-NK cells were evaluated in a NCG mouse model (NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22 / NjuCrl) having a human B cell precursor leukemia tumor xenograft with a CD19-positive tumor cell line -NALM-6. Mice in vehicle group were treated with HBSS (- / -) , intravenously.

[0164] FIG. 6A: shows quantification of mean tumor flux over the days following CAR-NK infusion.

[0165] FIG. 6B: shows the representative luciferase imaging of treatment mice over the course of the experiment.

[0166] FIG. 7A to FIG. 7E show the cytotoxicity of tandem CAR-T cells.

[0167] FIG. 7A: shows the cytotoxicity of different tandem CAR-T cells against RPMI8226 tumor cells. Un-transduced T cells (UnT) and GC012F CAR-T cells (GC012F) serve as assay controls.

[0168] FIG. 7B: shows the cytotoxicity of different tandem CAR-T cells against Nalm6 tumor cells. Un-transduced T cells (UnT) and GC012F CAR-T cells (GC012F) serve as assay controls.

[0169] FIG. 7C: shows the cytotoxicity of different tandem CAR-T cells against Z138 tumor cells. Un-transduced T cells (UnT) and GC012F CAR-T cells (GC012F) serve as assay controls.

[0170] FIG. 7D: shows the cytotoxicity of different tandem CAR-T cells against Z138-CD19 KO tumor cells. Un-transduced T cells (UnT) and GC012F CAR-T cells (GC012F) serve as assay controls.

[0171] FIG. 7E: shows the cytotoxicity of different tandem CAR-T cells against Z138-BCMA KO tumor cells. Un-transduced T cells (UnT) and GC012F CAR-T cells (GC012F) serve as assay controls.

[0172] FIG. 8A: shows the sensitivity killing of tandem CAR-T cells against gradient CD19 expressed CHO-K1 Luc cells.

[0173] FIG. 8B: shows the sensitivity killing of tandem CAR-T cells against gradient BCMA expressed CHO-K1 Luc cells.

[0174] FIG. 9A: shows the in vivo evaluation of different tandem CAR-T cells in Z138-BCMA KO xenograft model.

[0175] FIG. 9B: shows the in vivo evaluation of different tandem CAR-T cells in RPMI8226 xenograft model.

[0176] FIG. 10A to FIG. 10C show the in vitro cytotoxicity of different CD19 / BCMA tandem CAR-NK cells on different tumors.

[0177] FIG. 10A: shows the CD19 / BCMA tandem CAR-NK cell cytotoxicity on Z138 BCMA KO with twice tumor stimulation.

[0178] FIG. 10B: shows the CD19 / BCMA tandem CAR-NK cell cytotoxicity on NCI-H929 with twice tumor stimulation.

[0179] FIG. 10C: show the CD19 / BCMA tandem CAR-NK cell cytotoxicity on NALM-6 BCMA KO with twice tumor stimulation. Un-transduced NK cells (Un-NK) , FMC63 CAR-NK cells (19-F-1) and humanized CD19 / BCMA tandem CAR-NK cells (HBCMA / HCD19-G) which binder from Gracell Biotechnologies Ltd. were used as controls.

[0180] FIG. 11: shows the in vivo evaluation of different CD19 / BCMA tandem CAR-NK cells in NALM-6-luc / NCI-H929-luc systemic mix bearing NCG model. Un-transduced NK cells (Un-NK) , FMC63 CAR-NK cells (19-F-1) and hBCMA / HCD19-88 CAR-NK cells were evaluated in a mixed cell line-derived xenograft NCG mouse model having human B cell precursor leukemia CD19+ tumor NALM-6 mixture with human multiple myeloma BCMA+ tumor NCI-H929. Mice in vehicle group were treated with HBSS (- / -) , intravenously. FIG. 11 shows the BLI data of the experiment.

[0181] FIG. 12: shows the in vitro cytotoxicity of humanized anti-FMC63 scFv-based CAR-T cells (VL1g10VH14 CAR) against target cells Raji-Luc at E: T ratios of 10: 1, 3: 1 and 1: 1. Parental FMC63 CAR-T cells (FMC63 CAR-1) serve as positive control, UnT refers to γδT cells un-transduced with CAR and serve as negative control.

[0182] FIG. 13: shows the in vitro killing sensitivity of humanized anti-FMC63 scFv-based CAR-T cells (VL1g10VH14 CAR) against K562-luc cells with different human CD19 expression level at an E: T ratio of 5: 1. Parental FMC63 CAR-T cells (FMC63 CAR-1) serve as positive control, UnT refers to γδT cells un-transduced with CAR and serve as negative control.5.DETAILED DESCRIPTION

[0183] 5.1 Definitions

[0184] In the present invention, unless otherwise defined, the scientific and technical terms used herein have the meanings generally understood by those skilled in the art. In addition, the laboratory operations of cell culture, molecular genetics, nucleic acid chemistry and immunology used herein are the routine procedures widely used in the corresponding fields. Meanwhile, in order to better understand the present invention, the definitions and explanations of the relevant terms are provided below.

[0185] As used herein, the term “antibody” refers to an immunoglobulin molecule that generally consists of two pairs of polypeptide chains (each pair with one “light” (L) chain and one “heavy” (H) chain) . Antibody light chains are classified into κ and λ light chains. Heavy chains are classified into μ, δ, γ, α, or ε. Isotypes of antibodies are defined as IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE. In light chains and heavy chains, the variable region and constant region are linked by a “J” region of about 12 or more amino acids, and the heavy chain further comprises a “D” region of about 3 or more amino acids. Each heavy chain consists of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) . The heavy chain constant region consists of 3 domains (CH1, CH2, and CH3) . Each light chain consists of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) . The light chain constant region consists of one domain CL. The constant region of the antibody can mediate the binding of immunoglobulins to host tissues or factors, including the binding of various cells of the immune system (e.g., effector cells) to the first component (C1q) of the classical complement system. The VH and VL regions can be further subdivided into hypervariable regions (called complementarity determining regions (CDRs) ) , between which conservative regions called framework regions (FRs) are distributed. Each VH and VL consists of 3 CDRs and 4 FRs arranged from amino terminus to carboxyl terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, and FR4. The variable regions (VH and VL) of each heavy chain / light chain pair form an antibody-binding site. The assignment of amino acids to the regions or domains is based on Bethesda M. d., Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, (1987 and 1991) ) , or Chothia &Lesk J.Mol. Biol., 1987; 196: 901-917; Chothia et al., Nature, 1989; 342: 878-883, or the definition of the IMGT numbering system, see the definition in Ehrenmann F, Kaas Q, Lefranc M P., IMGT / 3Dstructure-DB and IMGT / DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF [J] ., Nucleic acids research, 2009; 38 (suppl_1) : D301-D307.

[0186] CDR regions are well known to those skilled in the art and have been defined by well-known numbering systems. For example, the Kabat Complementarity Determining Regions (CDRs) are based on sequence variability and are the most commonly used (see, e.g., Kabat et al., supra) . Chothia refers instead to the location of the structural loops (see, e.g., Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-17 (1987) ) . The end of the Chothia CDR-H1 loop when numbered using the Kabat numbering convention varies between H32 and H34 depending on the length of the loop (this is because the Kabat numbering scheme places the insertions at H35A and H35B; if neither 35A nor 35B is present, the loop ends at 32; if only 35A is present, the loop ends at 33; if both 35A and 35B are present, the loop ends at 34) . The AbM hypervariable regions represent a compromise between the Kabat CDRs and Chothia structural loops, and are used by Oxford Molecular’s AbM antibody modeling software (see, e.g., Antibody EngineeringVol. 2 (Kontermann and Dübel eds., 2d ed. 2010) ) . The “contact” hypervariable regions are based on an analysis of the available complex crystal structures. Another universal numbering system that has been developed and widely adopted is ImMunoGeneTics (IMGT) Information (Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27 (1) : 55-77 (2003) ) . IMGT is an integrated information system specializing in immunoglobulins (IG) , T-cell receptors (TCR) , and major histocompatibility complex (MHC) of human and other vertebrates. Herein, the CDRs are referred to in terms of both the amino acid sequence and the location within the light or heavy chain. As the “location” of the CDRs within the structure of the immunoglobulin variable domain is conserved between species and present in structures called loops, by using numbering systems that align variable domain sequences according to structural features, CDR and framework residues are readily identified. This information can be used in grafting and replacement of CDR residues from immunoglobulins of one species into an acceptor framework from, typically, a human antibody. An additional numbering system (AHon) has been developed by Honegger and Plückthun, J. Mol. Biol. 309: 657-70 (2001) . Correspondence between the numbering system, including, for example, the Kabat numbering and the IMGT unique numbering system, is well known to one skilled in the art (see, e.g., Kabat, supra; Chothia and Lesk, supra; Martin, supra; Lefranc et al., supra) . The residues from each of these hypervariable regions or CDRs are exemplified in Table I below.

[0187] Table I. Exemplary CDRs According to Various Numbering Systems

[0188] The boundaries of a given CDR may vary depending on the scheme used for identification. Thus, unless otherwise specified, the terms “CDR” and “complementary determining region” of a given antibody or region thereof, such as a variable region, as well as individual CDRs (e.g., CDR-H1, CDR-H2) of the antibody or region thereof, should be understood to encompass the complementary determining region as defined by any of the known schemes described herein above. In some instances, the scheme for identification of a particular CDR or CDRs is specified, such as the CDR as defined by the IMGT, Kabat, Chothia, or Contact method. In other cases, the particular amino acid sequence of a CDR is given. It should be noted CDR regions may also be defined by a combination of various numbering systems, e.g., a combination of Kabat and Chothia numbering systems, or a combination of Kabat and IMGT numbering systems. Therefore, the term such as “aCDR1 as set forth in a specific VH or VHH” includes any CDR1 as defined by the exemplary CDR numbering systems described above, but is not limited thereby. Once a variable region (e.g., a VHH, VH or VL) is given, those skilled in the art would understand that CDRs within the region can be defined by different numbering systems or combinations thereof.

[0189] Hypervariable regions may comprise “extended hypervariable regions” as follows: 24-36 or 24-34 (L1) , 46-56 or 50-56 (L2) , and 89-97 or 89-96 (L3) in the VL, and 26-35 or 26-35A (H1) , 50-65 or 49-65 (H2) , and 93-102, 94-102, or 95-102 (H3) in the VH.

[0190] The term “constant region” or “constant domain” refers to a carboxy terminal portion of the light and heavy chain which is not directly involved in binding of the antibody to antigen but exhibits various effector function, such as interaction with the Fc receptor. The term refers to the portion of an immunoglobulin molecule having a more conserved amino acid sequence relative to the other portion of the immunoglobulin, the variable region, which contains the antigen binding site. The constant region may contain the CH1, CH2, and CH3 regions of the heavy chain and the CL region of the light chain.

[0191] The term “framework” or “FR” refers to those variable region residues flanking the CDRs. FR residues are present, for example, in chimeric, humanized, human, domain antibodies (e.g., single domain antibodies) , diabodies, linear antibodies, and bispecific antibodies. FR residues are those variable domain residues other than the hypervariable region residues or CDR residues.

[0192] The term “Fc region” herein is used to define a C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain, including, for example, native sequence Fc regions, recombinant Fc regions, and variant Fc regions. Although the boundaries of the Fc region of an immunoglobulin heavy chain might vary, the human IgG heavy chain Fc region is often defined to stretch from an amino acid residue at position Cys226, or from Pro230, to the carboxyl-terminus thereof. The C-terminal lysine (residue 447 according to the EU numbering system) of the Fc region may be removed, for example, during production or purification of the antibody, or by recombinantly engineering the nucleic acid encoding a heavy chain of the antibody. Accordingly, a composition of intact antibodies may comprise antibody populations with all K447 residues removed, antibody populations with no K447 residues removed, and antibody populations having a mixture of antibodies with and without the K447 residue. A “functional Fc region” possesses an “effector function” of a native sequence Fc region. Exemplary “effector functions” include C1q binding; CDC; Fc receptor binding; ADCC; phagocytosis; downregulation of cell surface receptors (e.g., B cell receptor) , etc. Such effector functions generally require the Fc region to be combined with a binding region or binding domain (e.g., an antibody variable region or domain) and can be assessed using various assays known to those skilled in the art. A “variant Fc region” comprises an amino acid sequence which differs from that of a native sequence Fc region by virtue of at least one amino acid modification (e.g., substituting, addition, or deletion) . In certain embodiments, the variant Fc region has at least one amino acid substitution compared to a native sequence Fc region or to the Fc region of a parent polypeptide, for example, from about one to about ten amino acid substitutions, or from about one to about five amino acid substitutions in a native sequence Fc region or in the Fc region of a parent polypeptide. The variant Fc region herein can possess at least about 80%homology with a native sequence Fc region and / or with an Fc region of a parent polypeptide, or at least about 90%homology therewith, for example, at least about 95%homology therewith.

[0193] The term “antibody” is not limited by any specific method for producing the antibody. For example, the antibody includes a recombinant antibody, a monoclonal antibody, and a polyclonal antibody. The antibody may be antibodies of different isotypes, such as IgG (e.g., subtype IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4) , IgA1, IgA2, IgD, IgE, or IgM.

[0194] As used herein, the term "antigen-binding fragment"of antibody refers to a polypeptide comprising a fragment of a full-length antibody that retains the ability to specifically bind to the same antigen bound by the full-length antibody and / or competes with the full-length antibody for specific binding to the antigen, which is also referred to as an "antigen-binding portion". See generally, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd edition, Raven Press, N. Y. (1989) , which is incorporated herein by reference in its entirety for all purposes. Antigen-binding fragments of antibodies can be produced by recombinant DNA techniques or by enzymatic or chemical cleavage of intact antibodies. Non-limiting examples of antigen-binding fragments include Fab, Fab', F (ab')2, Fd, Fv, dAb and complementary determining region (CDR) fragments, single-chain antibodies (e.g., scFv) , chimeric antibodies, diabodies, linear antibodies, nanobodies (technology from Domantis) , domain antibodies (technology from Ablynx) , probodies, and polypeptides that contain at least a portion of an antibody sufficient to confer specific antigen binding ability to the polypeptide. Engineered antibody variants are reviewed in Holliger et al., 2005; Nat Biotechnol, 23: 1126-1136.

[0195] As used herein, the term "full-length antibody"means an antibody consisting of two "full-length heavy chains"and two "full-length light chains", wherein, "full-length heavy chain"refers to a polypeptide chain that is composed of a heavy chain variable region (VH) , a heavy chain constant region CH1 domain, a hinge region (HR) , a heavy chain constant region CH2 domain, and a heavy chain constant region CH3 domain in the direction from N-terminal to C-terminal; and, when the full-length antibody is an IgE isotype, it optionally further comprises a heavy chain constant region CH4 domain. Preferably, a "full-length heavy chain"is a polypeptide chain consisting of VH, CH1, HR, CH2 and CH3 in the direction from N-terminal to C-terminal. A "full-length light chain"is a polypeptide chain consisting of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) in the direction from N-terminal to C-terminal. Two pairs of full-length antibody chains are linked together by disulfide bonds between CL and CH1 and between the HRs of two full-length heavy chains. The full-length antibody of the present invention may be from a single species, such as human; and it may also be a chimeric antibody or humanized antibody. The full-length antibody of the present invention comprises two antigen binding sites formed by VH and VL pairs, respectively, which specifically recognize / bind to the same antigen.

[0196] As used herein, the term "Fd fragment"refers to an antibody fragment consisting of VH and CH1 domains; the term "dAb fragment"refers to an antibody fragment consisting of VH domain (Ward et al., Nature 341: 544 546 (1989) ) ; the term "Fab fragment"refers to an antibody fragment consisting of VL, VH, CL and CH1 domains; the term "F (ab')2 fragment"refers to an antibody fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; the term "Fab'fragment"refers to a fragment obtained after reduction of the disulfide bonds linking the two heavy chain fragments in F (ab')2 fragment, consisting of a complete light chain and the Fd fragment of heavy chain (consisting of VH and CH1 domains) .

[0197] As used herein, the term "Fv fragment"refers to an antibody fragment consisting of VL and VH domains of a single arm of an antibody. The Fv fragment is generally considered to be the smallest antibody fragment that can form a complete antigen binding site. It is generally believed that the six CDRs confer antigen binding specificity to an antibody. However, even a single variable region (e.g., an Fd fragment, which contains only three CDRs specific for an antigen) can recognize and bind to an antigen, although its affinity may be lower than that of the complete binding site.

[0198] As used herein, the term "Fc fragment"refers to an antibody fragment formed by disulfide bonding of the second and third constant regions of the first heavy chain of an antibody to the second and third constant regions of the second heavy chain. The Fc fragment of an antibody has a variety of different functions, but does not participate in antigen binding.

[0199] As used herein, the term "scFv" refers to a single polypeptide chain comprising VL and VH domains, wherein the VL and VH are connected by a linker. Such scFv molecules may have a general structure: NH2-VL-linker-VH-COOH or NH2-VH-linker-VL-COOH. Suitable prior art linkers consist of repeated GGGGS amino acid sequences or variants thereof. For example, a linker having an amino acid sequence (GGGGS) 4 may be used, but variants thereof may also be used (Holliger et al. (1993) , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448) . In some cases, a disulfide bond may also exist between the VH and VL of scFv. As used herein, the term "di-scFv" refers to an antibody fragment formed by linking two scFvs.

[0200] As used herein, the terms “mAb” and “monoclonal antibody” refer to an antibody or a fragment of an antibody that is derived from a group of highly homologous antibodies, i.e., from a group of identical antibody molecules, except for natural mutations that may occur spontaneously. The monoclonal antibody is highly specific for a single epitope on an antigen. The polyclonal antibody, relative to the monoclonal antibody, generally comprises at least 2 or more different antibodies which generally recognize different epitopes on an antigen. Monoclonal antibodies can generally be obtained using hybridoma technology first reported by Kohler et al. (   G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity [J] . Nature, 1975; 256 (5517) : 495) , but can also be obtained using recombinant DNA technology (see, e.g., U.S. Patent 4,816,567) .

[0201] As used herein, the term “humanized antibody” refers to an antibody or antibody fragment obtained when all or a part of CDRs of a human immunoglobulin (receptor antibody) is replaced by the CDRs of a non-human antibody (donor antibody) , wherein the donor antibody may be a non-human (e.g., mouse, rat or rabbit) antibody having expected specificity, affinity or reactivity. In addition, some amino acid residues in the framework regions (FRs) of the receptor antibody can also be replaced by the amino acid residues of corresponding non-human antibodies or by the amino acid residues of other antibodies to further improve or optimize the performance of the antibody. For more details on humanized antibodies, see, e.g., Jones et al., Nature, 1986; 321: 522-525; Reichmann et al., Nature, 1988; 332: 323-329; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 1992; 2: 593-596; and Clark, Immunol. Today, 2000; 21: 397-402.

[0202] As used herein, the term “vector” refers to a nucleic acid vehicle into which a polynucleotide can be inserted. When a vector allows the expression of the protein encoded by the inserted polynucleotide, the vector is referred to as an expression vector. The vector can be introduced into a host cell by transformation, transduction or transfection, such that the genetic substance elements carried by the vector can be expressed in the host cell. Vectors are well known to those skilled in the art, including but not limited to: plasmids; phagemids; cosmids; artificial chromosomes, such as yeast artificial chromosome (YAC) , bacterial artificial chromosome (BAC) , or P1-derived artificial chromosome (PAC) ; phages such as lambda phages or M13 phages; and animal viruses. Animal viruses that can be used as vectors include, but are not limited to retroviruses (including lentiviruses) , adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses (such as herpes simplex virus) , poxviruses, baculoviruses, papillomaviruses, and papovaviruses (such as SV40) . A vector may comprise a variety of elements that control expression, including, but not limited to, promoter sequences, transcription initiation sequences, enhancer sequences, selection elements, and reporter genes. In addition, the vector may further comprise a replication initiation site.

[0203] As used herein, the term “host cell” refers to cells to which vectors can be introduced, including, but not limited to, prokaryotic cells such as E. coli or bacillus subtilis, fungal cells such as yeast cells or aspergillus, insect cells such as S2 drosophila cells or Sf9, or animal cells such as fibroblasts, CHO cells, GS cells, COS cells, NSO cells, HeLa cells, BHK cells, HEK 293 cells, or human cells.

[0204] As used herein, the term “specific binding” refers to a non-random binding reaction between two molecules, such as a reaction between an antibody and an antigen it targets. In some embodiments, an antibody specifically binding to an antigen (or an antibody specific to an antigen) means that the antibody binds to the antigen with an affinity (KD) of less than about 10-5 M, such as less than about 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, or 10-10 M, or less.

[0205] As used herein, the term “KD” refers to a dissociation equilibrium constant for a specific antibody-antigen interaction, which is used to describe the binding affinity between the antibody and the antigen. A smaller dissociation equilibrium constant indicates a stronger antibody-antigen binding and a higher affinity between the antibody and the antigen. Generally, antibodies bind to antigens (e.g., CD19 protein) with a dissociation equilibrium constant (KD) of less than about 10-5 M, such as less than about 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, or 10-10 M, or less. KD can be determined using methods known to those skilled in the art, e.g., using a Fortebio molecular interaction instrument.

[0206] As used herein, the terms “monoclonal antibody” and “mAb” have the same meaning and can be used interchangeably; the terms “polyclonal antibody” and “pAb” have the same meaning and can be used interchangeably. Besides, as used herein, amino acids are generally represented by single-letter and three-letter abbreviations known in the art. For example, alanine can be represented by A or Ala.

[0207] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient” refers to a carrier and / or excipient that is pharmacologically and / or physiologically compatible with the subject and the active ingredient. Such carriers and / or excipients are well known in the art (see, e.g., Remington’s Pharmaceutical Sciences, edited by Gennaro AR, 19th Ed., Pennsylvania, Mack Publishing Company, 1995) , including but not limited to: pH regulators, surfactants, adjuvants and ionic strength enhancers. For example, the pH regulators include, but are not limited to, phosphate buffer; the surfactants include, but are not limited to, cationic, anionic or non-ionic surfactants, such as Tween-80; the ionic strength enhancers include, but are not limited to, sodium chloride.

[0208] As used herein, the term “effective amount” refers to an amount sufficient to obtain or at least partially obtain a desired effect. For example, a prophylactically effective amount against a disease (e.g., a tumor) refers to an amount sufficient to prevent, stop, or delay the onset of the disease (e.g., a tumor) ; a therapeutically effective amount refers to an amount sufficient to cure or at least partially stop diseases and complications thereof in patients suffering from the disease. It is undoubtedly within the ability of those skilled in the art to determine such an effective amount. For example, the amount effective for therapeutic purpose will depend on the severity of the disease to be treated, the overall state of the patient’s own immune system, the general condition of the patient such as age, body weight and gender, the route of administration, and other treatments given concurrently, etc.

[0209] As used herein, the term “Chimeric antigen receptor” or “CAR” as refers to genetically engineered receptors, which can be used to graft one or more antigen specificity onto immune effector cells, such as T cells. Some CARs are also known as “artificial T-cell receptors” , “chimeric T cell receptors” or “chimeric immune receptors” . In some embodiments, the CAR comprises an extracellular antigen binding domain specific for one or more antigens (such as tumor antigens) , a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain of a T cell and / or other receptors. “CAR-T cell” refers to a T cell that expresses a CAR.

[0210] The term “effective amount” or “therapeutically effective amount” as used herein refers to the amount of a single domain antibody or a therapeutic molecule comprising an agent and the single domain antibody or pharmaceutical composition provided herein which is sufficient to result in the desired outcome.

[0211] The terms “subject” and “patient” may be used interchangeably. As used herein, in certain embodiments, a subject is a mammal, such as a non-primate or a primate (e.g., human) . In specific embodiments, the subject is a human. In one embodiment, the subject is a mammal, e.g., a human, diagnosed with a disease or disorder. In another embodiment, the subject is a mammal, e.g., a human, at risk of developing a disease or disorder.

[0212] “Administer” or “administration” refers to the act of injecting or otherwise physically delivering a substance as it exists outside the body into a patient, such as by mucosal, intradermal, intravenous, intramuscular delivery, and / or any other method of physical delivery described herein or known in the art.

[0213] As used herein, the terms “treat” , “treatment” and “treating” refer to the reduction or amelioration of the progression, severity, and / or duration of a disease or condition resulting from the administration of one or more therapies. Treating may be determined by assessing whether there has been a decrease, alleviation and / or mitigation of one or more symptoms associated with the underlying disorder such that an improvement is observed with the patient, despite that the patient may still be afflicted with the underlying disorder. The term “treating” includes both managing and ameliorating the disease. The terms “manage” “managing” and “management” refer to the beneficial effects that a subject derives from a therapy which does not necessarily result in a cure of the disease.

[0214] The terms “prevent” , “preventing, ” and “prevention” refer to reducing the likelihood of the onset (or recurrence) of a disease, disorder, condition, or associated symptom (s) (e.g., diabetes or a cancer) .

[0215] As used herein, “delaying” the development of cancer means to defer, hinder, slow, retard, stabilize, and / or postpone development of the disease. This delay can be of varying lengths of time, depending on the history of the disease and / or individual being treated. As is evident to one skilled in the art, a sufficient or significant delay can, in effect, encompass prevention, in that the individual does not develop the disease. A method that "delays"development of cancer is a method that reduces probability of disease development in a given time frame and / or reduces the extent of the disease in a given time frame, when compared to not using the method. Such comparisons are typically based on clinical studies, using a statistically significant number of individuals. Cancer development can be detectable using standard methods, including, but not limited to, computerized axial tomography (CAT Scan) , Magnetic Resonance Imaging (MRI) , abdominal ultrasound, clotting tests, arteriography, or biopsy. Development may also refer to cancer progression that may be initially undetectable and includes occurrence, recurrence, and onset.

[0216] The terms “about” and “approximately” mean within 20%, within 15%, within 10%, within 9%, within 8%, within 7%, within 6%, within 5%, within 4%, within 3%, within 2%, within 1%, or less of a given value or range.

[0217] As used in the present disclosure and claims, the singular forms “a” , “an” and “the” include plural forms unless the context clearly dictates otherwise.

[0218] It is understood that wherever embodiments are described herein with the term “comprising” otherwise analogous embodiments described in terms of “consisting of” and / or “consisting essentially of” are also provided. It is also understood that wherever embodiments are described herein with the phrase “consisting essentially of” otherwise analogous embodiments described in terms of “consisting of” are also provided.

[0219] The term “between” as used in a phrase as such “between A and B” or “between A-B” refers to a range including both A and B.

[0220] The term “and / or” as used in a phrase such as “A and / or B” herein is intended to include both A and B; A or B; A (alone) ; and B (alone) .

[0221] 5.2 ANTIBODIES AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENTS

[0222] The present disclosure provides antibodies and antigen-binding fragments thereof that bind to CD19 (anti-CD19 antibodies or the antigen-binding fragments thereof) . The disclosure provides e.g., antibodies and antigen-binding fragments thereof, the chimeric antibodies thereof, and the humanized antibodies thereof (e.g., antibodies as shown in Table A) .

[0223] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to CD19 comprises: a heavy chain variable region (VH) comprising VH complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, and 3; and a light chain variable region (VL) comprising VL CDRs 1, 2, and 3.

[0224] In some embodiments, the present disclosure provides antibodies and antigen-binding fragments thereof with VH and VL CDRs that are derived from H-01, H-02, H-78, H-80, H-84, H-87, H-88, VL1g10VH14. In some embodiments, the present disclosure provides antibodies and antigen-binding fragments thereof of H-01, H-02, H-78, H-80, H-84, H-87, H-88, VL1g10VH14.

[0225] Thus, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof provided herein may comprise one or more CDR sequences of any one of H-01, H-02, H-78, H-80, H-84, H-87, H-88, VL1g10VH14.

[0226] In some embodiments, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises: (a) a VH CDR1 (HCDR1) comprising the amino acid sequence of the CDR1 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-37; (b) a VH CDR2 (HCDR2) comprising the amino acid sequence of the CDR2 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-37; (c) a VH CDR3 (HCDR3) comprising the amino acid sequence of the CDR3 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-37; (d) a VL CDR1 (LCDR1) comprising the amino acid sequence of the CDR1 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 38-40; (e) a VL CDR2 (LCDR2) comprising the amino acid sequence of the CDR2 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 38-40; and / or (f) a VL CDR3 (LCDR3) comprising the amino acid sequence of the CDR3 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 38-40.

[0227] In some embodiments, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises: (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of the CDR1 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-37; (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of the CDR2 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-37; (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of the CDR3 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-37; (d) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of the CDR1 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 38-40; (e) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of the CDR2 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 38-40; and (f) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of the CDR3 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 38-40.

[0228] In some embodiments, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises: (1) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 38; (2) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 38; (3) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 36, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; (4) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; (5) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; (6) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 40; (7) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; (8) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 40; (9) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 40; (10) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 36, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 38; (11) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 36, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 40; (12) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 38; (13) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 114, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39.

[0229] CDR sequences can be determined according to well-known numbering systems, for example, a numbering system according to Table I. In some embodiments, the CDRs are determined according to IMGT numbering scheme. In some embodiments, the CDRs are determined according to Kabat numbering scheme. In some embodiments, the CDRs are determined according to AbM numbering scheme. In other embodiments, the CDRs are determined according to Chothia numbering scheme. In other embodiments, the CDRs are determined according to Contact numbering scheme. The CDRs may be determined according to a combination of any numbering scheme described above.

[0230] In some embodiments, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises: (a) the VH CDR1 amino acid sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 41 and 44; (b) the VH CDR2 amino acid sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 42 and 45; (c) the VH CDR3 amino acid sequence is SEQ ID NO:43; (d) the VL CDR1 amino acid sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 46 and 49; (e) the VL CDR2 amino acid sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 47 and 50; and (f) the VL CDR3 amino acid sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 48 and 51.

[0231] In some embodiments, the anti-CD19 antibody or an antigen-binding fragment comprises: (1) the VH comprises HCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 41, HCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 42 and HCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 43, and, the VL comprises LCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 46, LCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 47 and LCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 48; (2) the VH comprises HCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 44, HCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 45 and HCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 43, and, the VL comprises LCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 46, LCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 47 and LCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 48; or (3) the VH comprises HCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 44, HCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 45 and HCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO:43, and, the VL comprises LCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO:49, LCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 50 and LCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 51.

[0232] Furthermore, in some embodiments, the anti-CD19 antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein can also contain one, two, or three heavy chain variable region CDRs selected from VH CDRs in Table B, and one, two, or three light chain variable region CDRs selected from VL CDRs in Table B. In some embodiments, the CDRs are determined according to AbM numbering scheme.

[0233] In some embodiments, the anti-CD19 antibodies or an antigen-binding fragment can have a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, 3, wherein the CDR1 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to a selected VH CDR1 amino acid sequence, the CDR2 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to a selected VH CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to a selected VH CDR3 amino acid sequence. In some embodiments, the antibodies can have a light chain variable region (VL) comprising CDRs 1, 2, 3, wherein the CDR1 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to a selected VL CDR1 amino acid sequence, the CDR2 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to a selected VL CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to a selected VL CDR3 amino acid sequence. The selected VH CDRs 1, 2, 3 amino acid sequences and the selected VL CDRs, 1, 2, 3 amino acid sequences are shown in Table A and Table B.

[0234] In some embodiments, the anti-CD19 antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a heavy chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs in Table B with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions in each of the CDRs. In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment described herein can contain a light chain variable domain containing one, two, or three of the CDRs in Table B with zero, one or two amino acid insertions, deletions, or substitutions in each of the CDRs.

[0235] The amino acid sequences for heavy chain variable regions and light variable regions of the various antibodies are also provided. As there are different ways to humanize an antibody (e.g., a sequence can be modified with different amino acid substitutions) , the heavy chain and the light chain of an antibody can have more than one version of humanized sequences.

[0236] The disclosure also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that bind to CD19. The antibodies or antigen-binding fragments thereof contain a heavy chain variable region (VH) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to a selected VH sequence, and a light chain variable region (VL) comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identical to a selected VL sequence. In some embodiments, the selected VH sequence is one of the following: the selected VH sequence is SEQ ID NO: 34; the selected VH sequence is SEQ ID NO: 35; the selected VH sequence is SEQ ID NO: 36; the selected VH sequence is SEQ ID NO: 37; the selected VH sequence is SEQ ID NO: 114. In some embodiments, the selected VL sequence is one of the following: the selected VL sequence is SEQ ID NO: 38; the selected VL sequence is SEQ ID NO: 39; the selected VL sequence is SEQ ID NO: 40.

[0237] In certain embodiments, the anti-CD19 antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) , wherein:

[0238] (1) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 34, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto; and / or, the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 38, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto;

[0239] (2) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 35, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto; and / or, the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 38, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto;

[0240] (3) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 36, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto; and / or, the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 39, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto;

[0241] (4) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 34, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto; and / or, the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 39, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto;

[0242] (5) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 35, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto; and / or, the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 39, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto;

[0243] (6) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 37, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto; and / or, the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 40, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto;

[0244] (7) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 37, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto; and / or, the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 39, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto;

[0245] (8) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 34, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto; and / or, the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 40, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto;

[0246] (9) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 35, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto; and / or, the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 40, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto;

[0247] (10) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 36, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto; and / or, the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 38, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto;

[0248] (11) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 36, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto; and / or, the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 40, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto; or

[0249] (12) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 37, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto; and / or, the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 38, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto.

[0250] (13) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 114, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto; and / or, the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 39, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto.

[0251] In some embodiments, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises a non-CDR region derived from human, mouse or rabbit; preferably, the non-CDR region is framework regions, heavy chain constant region, and / or light chain constant region.

[0252] In some embodiments, anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment is selected from the group consisting of Fab, Fab', F (ab') 2, single chain fragment variable (scFv) , scFv-Fc, and disulfide-stabilized Fv fragment (dsFv) .

[0253] In some embodiments, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof is an anti-CD19 single chain fragment variable (scFv) .

[0254] In some embodiments, the scFv comprises a VH comprising an amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-37, and 114, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 38-40.

[0255] In some embodiments, the scFv comprises, from N-terminus to C-terminus:

[0256] (1) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34;

[0257] (2) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35;

[0258] (3) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 36;

[0259] (4) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34;

[0260] (5) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35;

[0261] (6) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 40, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37;

[0262] (7) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37;

[0263] (8) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;

[0264] (9) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;

[0265] (10) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 36, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0266] (11) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0267] (12) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0268] (13) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 40;

[0269] (14) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;

[0270] (15) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 114; or

[0271] (16) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 114, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39.

[0272] In some embodiments, the linker comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 32, 33, 66, 67 and 68.

[0273] In some embodiments, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises or consists of the sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-19, and 115, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto.

[0274] In another aspect, provided herein is a CD19-binding polypeptide construct comprising any one of the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof described above. The polypeptide construct may be a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, a human engineered antibody, a monospecific molecule, a bispecific molecule, a multispecific molecule, or chemically modified derivatives thereof.

[0275] In some embodiments, the polypeptide construct may be a fusion protein comprising an anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof provided herein, and an immunoglobulin Fc region or a fragment thereof. In some embodiments, the fusion protein may further comprise a hinge region of an immunoglobulin. In some embodiments, the Fc region and / or the hinge region each may be independently derived from an IgG (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4) , IgM or IgA. In some embodiments, the fusion protein may comprise a peptide chain comprising from N-terminal to C-terminal an anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment provided herein, the immunoglobulin hinge region, and the immunoglobulin Fc region or a fragment thereof. In some embodiments, the fusion protein may be a HCAb.

[0276] In some embodiments, the fusion protein may comprise two peptide chains each comprising from N-terminal to C-terminal an anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment provided herein, the immunoglobulin hinge region, and the immunoglobulin Fc region or a fragment thereof.

[0277] In some embodiments, the two peptide chains may have the same or different anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment, the same or different immunoglobulin hinge regions, and / or, the same or different immunoglobulin Fc regions or fragments thereof.

[0278] In another aspect, provided herein is an immunoconjugate. The immunoconjugate may comprise the anti-CD19 antibody or antigen-binding fragment thereof, linked to a therapeutic agent. In some embodiments, the therapeutic agent is a drug, a cytotoxin, or a radioactive isotope.

[0279] In another aspect, provided herein is a bispecific molecule. The bispecific molecule is a bispecific antibody or antigen-binding fragment that targets CD19 and another target antigen. In some embodiments, another target antigen is selected from a group consisting of BCMA, CD20, CD22, CD33, CD38, CD3, CS1, ROR1, GPC3, CD123, IL-13R, CD138, c-Met, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1, MAGE A3, glycolipid F77, GPRC5D. In some embodiments, another target antigen is BCMA.

[0280] In one aspect, the present invention provides a bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof that targets CD19 and BCMA, characterized in that the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a first antibody or antigen-binding fragment thereof targeting CD19 and a second antibody or antigen-binding fragment thereof targeting BCMA, the first antibody or antigen-binding fragment thereof targeting CD19 comprises a heavy chain variable region (VH) and / or a light chain variable region (VL) as described above, and the second antibody or antigen-binding fragment thereof targeting BCMA (anti-BCMA antibody or antigen-binding fragment thereof) comprises an anti-BCMA sdAb (single domain antibody, e.g., VHH) . Exemplary anti-BCMA sdAbs provided herein are referred to as AS43938VH7 and AS44688VH10.

[0281] In some embodiments, the anti-BCMA antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 76. In some embodiments, the anti-BCMA antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein comprise a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 77. In some embodiments, the CDRs are determined according to IMGT numbering scheme. In some embodiments, the CDRs are determined according to Kabat numbering scheme. In some embodiments, the CDRs are determined according to AbM numbering scheme. In other embodiments, the CDRs are determined according to Chothia numbering scheme. In other embodiments, the CDRs are determined according to Contact numbering scheme. The CDRs may be determined according to a combination of any numbering scheme described above. In some embodiments, the anti-BCMA antibody or antigen-binding fragment thereof is an anti-BCMA single domain antibody (sdAb) . In some embodiments, the anti-BCMA single domain antibody is camelid. In some embodiments, the anti-BCMA single domain antibody is humanized. In some embodiments, the anti-BCMA single domain antibody is chimeric. In some embodiments, the anti-BCMA single domain antibody comprises an acceptor human framework, e.g., a human immunoglobulin framework or a human consensus framework.

[0282] In some embodiments, the anti-BCMA antibody or antigen-binding fragment thereof (e.g., anti-BCMA sdAb) provided herein may comprise: (i) a CDR1 comprising the amino acid sequence of the CDR1 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 70 and 73; (ii) a CDR2 comprising the amino acid sequence of the CDR2 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 71 and 74; and (iii) a CDR3 comprising the amino acid sequence of the CDR3 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 72 and 75.

[0283] In some embodiments, the anti-BCMA antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein may comprise:

[0284] (i) a CDR1 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 70; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto;

[0285] (ii) a CDR2 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 71; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto; and / or,

[0286] (iii) a CDR3 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 72; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto.

[0287] In some embodiments, the anti-BCMA antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein may comprise:

[0288] (i) a CDR1 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 73; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto;

[0289] (ii) a CDR2 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 74; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto; and / or,

[0290] (iii) a CDR3 comprising: (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 75; (b) an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto; or (c) an amino sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2 or 3 amino acids) as compared thereto.

[0291] In some embodiments, the anti-BCMA antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72. In some embodiments, the anti-BCMA antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75.

[0292] In some embodiments, the anti-BCMA antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein comprises an anti-BCMA sdAb comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 76 or 77; or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0293] In some embodiments, the anti-CD19 antibody or antigen-binding fragment and the anti-BCMA antibody or antigen-binding fragment are connected via a linker. In some embodiments, the anti-CD19 antibody or antigen-binding fragment is an scFv, and the anti-BCMA antibody or antigen-binding fragment is an sdAb.

[0294] In some embodiments, the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof that targets CD19 and BCMA comprises from N-terminus to C-terminus:

[0295] (1) an anti-BCMA sdAb, a linker, and an anti-CD19 scFv;

[0296] (2) a VL of anti-CD19 scFv, a linker, an anti-BCMA sdAb, a linker, and a VH of anti-CD19 scFv;

[0297] (3) a VH of anti-CD19 scFv, a linker, an anti-BCMA sdAb, a linker, and a VL of anti-CD19 scFv; or

[0298] (4) an anti-CD19 scFv, a linker, and an anti-BCMA sdAb.

[0299] In some embodiments, the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof that targets CD19 and BCMA comprises from N-terminus to C-terminus:

[0300] (1) an anti-BCMA sdAb, a linker, and a VL of anti-CD19 scFv, a linker, and a VH of anti-CD19 scFv;

[0301] (2) an anti-BCMA sdAb, a linker, and a VH of anti-CD19 scFv, a linker, and a VL of anti-CD19 scFv;

[0302] (3) a VL of anti-CD19 scFv, a linker, an anti-BCMA sdAb, a linker, and a VH of anti-CD19 scFv;

[0303] (4) a VH of anti-CD19 scFv, a linker, an anti-BCMA sdAb, a linker, and a VL of anti-CD19 scFv; or

[0304] (5) a VL of anti-CD19 scFv, a linker, and a VH of anti-CD19 scFv, a linker, and an anti-BCMA sdAb; or

[0305] (6) a VH of anti-CD19 scFv, a linker, and a VL of anti-CD19 scFv, a linker, and an anti-BCMA sdAb.

[0306] In some embodiments, the linker is a GS linker. In some embodiments, the linker comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 32, 33, 66, 67 and 68.

[0307] In some embodiments, the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof that targets CD19 and BCMA comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 78-84; or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0308] 5.3 Chimeric antigen receptors

[0309] A chimeric antigen receptor (CAR) typically comprises an extracellular domain capable of binding to an antigen, and an intracellular domain comprising one or more intracellular signaling domains derived from signal transducing proteins. These intracellular signaling domains are typically different from the polypeptide from which the extracellular domain is derived. The extracellular domain can be any proteinaceous molecule or part thereof that can specifically bind to a predetermined antigen. The extracellular domain may comprise an antibody or antigen binding fragment thereof. The intracellular signaling domain may be any oligopeptide or polypeptide domain known to function to transmit a signal causing activation or inhibition of a biological process in a cell, for example, activation of an immune cell such as a T cell or a NK cell.

[0310] In some embodiments, the chimeric antigen receptor (CAR) provided herein comprises a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising antibody or the antigen-binding fragment thereof as provided herein, and optionally one or more additional binding domain (s) ; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain. Each component and additional regions are described in more detail below.

[0311] 5.3.1 Extracellular Antigen Binding Domain

[0312] The extracellular antigen binding domain of the CAR may comprise (e.g., consist of, or consist essentially of) an antigen-binding moiety selected from the group consisting of a Fab, a Fab’ , a (Fab’ ) 2, an Fv, an scFv, an sdAb, and a peptide ligand specifically recognizing the target antigen, or a combination thereof. The extracellular antigen binding domain can be monovalent or multivalent. The extracellular antigen binding domain can be monospecific or multispecific. In some embodiments, the extracellular antigen binding domain of the CAR comprise one or more antigen-binding moieties (e.g., scFv or sdAb) specifically recognizing one or more epitopes of one or more target antigens. In some embodiments, the extracellular antigen binding domain comprises two or more antigen-binding moieties (e.g., scFv or sdAb) connected in tandem. In some embodiments, the two or more antigen-binding moieties specifically recognize two or more epitopes of the same target antigen. The two or more antigen-binding moieties can be the same or different. The two or more antigen-binding moieties can recognize the same epitope or different epitopes. In some embodiments, the antigen-binding moiety is an antibody moiety (e.g., scFv or sdAb) .

[0313] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain of the CAR comprises an (e.g., one or more) antibody moiety (e.g., scFv or sdAb) specifically recognizing a (e.g., one or more) target epitope or target antigen (e.g., tumor antigen, autoimmune disease antigen, viral or bacterial antigen) . In some embodiments, the target antigen is a pathogen-specific antigen, such as a viral antigen, a bacterial antigen, a fungal antigen (e.g., from Aspergillus or Candida) , or a parasitic antigen. In some embodiments, the viral antigen is from Herpes simplex virus (HSV) , respiratory syncytial virus (RSV) , metapneumovirus (hMPV) , rhinovirus, parainfluenza (NV) , Epstein-Barr virus (EBV) , Cytomegalovirus (CMV) , JC virus (John Cunningham virus) , BK virus, HIV, Zika virus, human coronavirus, norovirus, encephalitis virus, or Ebola. In some embodiments, the target antigen is associated with an autoimmune or inflammatory disease. In some embodiments, the target antigen is selected from the group consisting of BCMA, AFP, CLL1, CD4, GPC2, GPC3, GPRC5D, GUCY2C (GCC) , CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, CD228, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2 (HER-2) , ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, and PD-L2. In some embodiments, the target antigen is a tumor antigen, such as tumor-specific antigens (TSA) or tumor-associated antigen (TAA) . In some embodiments, the tumor antigen is selected from the group consisting of CD19, BCMA, Claudin 18.2, NY-ESO-1, VEGFR2, MAGE-A3, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA, EGFR, GD2, HER2, IGF1R, mesothelin, PSMA, ROR1, GPC3, GUCY2C, DLL3, GPRC5D, CLL1, WT1, and combinations thereof.

[0314] In another aspect, provided herein is a chimeric antigen receptor (CAR) comprising an extracellular antigen binding domain comprising anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof (e.g., anti-CD19 scFv) provided herein.

[0315] In some embodiments, the chimeric antigen receptor (CAR) provided herein comprises a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof as provided herein; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain.

[0316] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain that binds to CD19 can be or comprise the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof. The anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof are identical to any of the antibody or antigen binding fragments described herein (e.g., H-01, H-02, H-78, H-80, H-84, H-87, H-88, VL1g10VH14 as shown in Table B. )

[0317] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain that binds to CD19 can be or comprises anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof. The anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises: (a) a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of the CDR1 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-37; (b) a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of the CDR2 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-37; (c) a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of the CDR3 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-37; (d) a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of the CDR1 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 38-40; (e) a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of the CDR2 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 38-40; and (f) a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of the CDR3 as set forth in any one of SEQ ID NOs: 38-40.

[0318] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain that binds to CD19 can be or comprises anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof. The anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises: (1) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 38; (2) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;(3) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 36, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; (4) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; (5) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; (6) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 40; (7) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;(8) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 40; (9) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 40; (10) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 36, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 38; (11) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 36, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 40; (12) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;(13) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 114, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39. In some embodiments, the CDRs are determined according to IMGT numbering scheme. In some embodiments, the CDRs are determined according to Kabat numbering scheme. In some embodiments, the CDRs are determined according to AbM numbering scheme. In other embodiments, the CDRs are determined according to Chothia numbering scheme. In other embodiments, the CDRs are determined according to Contact numbering scheme. The CDRs may be determined according to a combination of any numbering scheme described above.

[0319] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain that binds to CD19 can be or comprises anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof. The anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises: (a) the VH CDR1 amino acid sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 41 and 44; (b) the VH CDR2 amino acid sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 42 and 45; (c) the VH CDR3 amino acid sequence is SEQ ID NO: 43; (d) the VL CDR1 amino acid sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 46 and 49; (e) the VL CDR2 amino acid sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 47 and 50; and (f) the VL CDR3 amino acid sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 48 and 51.

[0320] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain that binds to CD19 can be or comprises anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof. The anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises: (1) the VH comprises HCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 41, HCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 42 and HCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 43, and, the VL comprises LCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 46, LCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 47 and LCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 48; (2) the VH comprises HCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 44, HCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 45 and HCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 43, and, the VL comprises LCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 46, LCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 47 and LCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO:48; or (3) the VH comprises HCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 44, HCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 45 and HCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 43, and, the VL comprises LCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 49, LCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 50 and LCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 51.

[0321] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain that binds to CD19 can be or comprises anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof. The anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) , wherein: (1) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 34; and the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 38; (2) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 35; and the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 38; (3) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 36; and the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 39; (4) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 34; and the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 39; (5) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 35; and the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 39; (6) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 37; and the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 40; (7) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 37; and the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 39; (8) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 34; and the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 40; (9) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 35; and the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 40; (10) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 36; and the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 38; (11) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 36; and the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 40; (12) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 37; and the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 38; or (13) the VH comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 114; and the VL comprises or consists of the sequence of SEQ ID NO: 39.

[0322] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain that binds to CD19 can be or comprises anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof is a scFv. In some embodiments, the scFv comprises a VH comprising an amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-37, and 114, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 38-40.

[0323] In some embodiments, the scFv comprises, from N-terminus to C-terminus: (1) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34; (2) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35; (3) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 36; (4) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34; (5) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35; (6) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 40, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37; (7) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37; (8) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38; (9) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38; (10) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 36, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; (11) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; (12) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; (13) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 40; or (14) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; (15) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 114; or (16) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 114, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39. In some embodiments, the linker comprises or consists of an amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 32, 33, 66, 67, and 68.

[0324] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain that binds to CD19 can be or comprises anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises or consists of the sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-19, and 115, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto.

[0325] In some embodiments, the chimeric antigen receptor (CAR) provided herein comprises a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof and one or more additional antigen-binding domain (s) ; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the one or more additional antigen-binding domain (s) binds to BCMA. In some embodiments, the additional antigen-binding domain comprises (1) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 76; or (2) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 77. In some embodiments, (1) the additional antigen-binding domain comprises a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72; or (2) the additional antigen-binding domain comprises a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75. In some embodiments, (1) the additional antigen-binding domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 76 or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 76; or (2) the additional antigen-binding domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 77 or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 77.

[0326] In another aspect, provided herein is a chimeric antigen receptor (CAR) comprising an extracellular antigen binding domain comprising anti-BCMA antibody or the antigen-binding fragment thereof (e.g., anti-BCMA sdAb) provided herein.

[0327] In some embodiments, the chimeric antigen receptor (CAR) provided herein comprises a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising anti-BCMA antibody or the antigen-binding fragment thereof as provided herein; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain. Each component and additional regions are described in more detail below.

[0328] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain that binds to BCMA can be or comprise the anti-BCMA antibody or the antigen-binding fragment thereof. The anti-BCMA antibody or the antigen-binding fragment thereof are identical to any of the antibody or antigen binding fragments of AS43938VH7, AS44688VH10 (as shown in Table C.)

[0329] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain that binds to BCMA can be or comprises anti-BCMA antibody or the antigen-binding fragment thereof. The anti-BCMA antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises: (1) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 76; or (2) a CDR1, a CDR2, and a CDR3 having the amino acid sequences of the CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, as set forth in SEQ ID NO: 77. The CDR1, CDR2 or CDR3 may be determined according to the Kabat numbering scheme, the IMGT numbering scheme, the AbM numbering scheme, the Chothia numbering scheme, the Contact numbering scheme, or a combination thereof.

[0330] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain that binds to BCMA can be or comprises anti-BCMA antibody or the antigen-binding fragment thereof. The anti-BCMA antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises: (1) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72; or (2) a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73; a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75.

[0331] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain that binds to BCMA can be or comprises anti-BCMA antibody or the antigen-binding fragment thereof. The anti-BCMA antibody or the antigen-binding fragment thereof comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 76-77; or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0332] In another aspect, provided herein is a chimeric antigen receptor (CAR) comprising an extracellular antigen binding domain comprising a bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein, the CAR can be called tandem CAR. In some embodiments, the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof targets CD19 and BCMA (anti-CD19×BCMA antibody or antigen-binding fragment thereof) .

[0333] In some embodiments, the chimeric antigen receptor (CAR) provided herein comprises a polypeptide comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof as provided herein; (b) a transmembrane domain; and (c) an intracellular signaling domain. Each component and additional regions are described in more detail below.

[0334] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain that binds to CD19 and BCMA can be or comprise the anti-CD19×BCMA antibody or antigen-binding fragment thereof. The anti-CD19×BCMA antibody or antigen-binding fragment thereof are identical to any of the antibody or antigen binding fragments of DCAR-01 antigen binding domain, DCAR-02 antigen binding domain, DCAR-03 antigen binding domain, DCAR-04 antigen binding domain, hBCMA / hCD19-80 antigen binding domain, hBCMA / hCD19-88 antigen binding domain, Loop hBCMA / hCD19-80 antigen binding domain (as shown in Table D. ) In some embodiments, the extracellular antigen binding domain that binds to CD19 and BCMA can be or comprise the anti-CD19×BCMA antibody or antigen-binding fragment thereof. The anti-CD19×BCMA antibody or antigen-binding fragment thereof comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 78-84, or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 80% (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) sequence identity thereto.

[0335] 5.3.2 Transmembrane Domain

[0336] The CARs of the present disclosure comprise a transmembrane domain that can be directly or indirectly fused to the extracellular antigen binding domain. The transmembrane domain may be derived either from a natural or from a synthetic source. As used herein, a “transmembrane domain” refers to any protein structure that is thermodynamically stable in a cell membrane, for example a eukaryotic cell membrane. Transmembrane domains compatible for use in the CARs described herein may be obtained from a naturally occurring protein. Optionally, it can be a synthetic, non-naturally occurring protein segment, e.g., a hydrophobic protein segment that is thermodynamically stable in a cell membrane.

[0337] The transmembrane domain of the CAR described herein may be derived from a Type I single-pass membrane protein. The transmembrane domains from multi-pass membrane proteins may also be compatible for use in the CARs described herein. Multi-pass membrane proteins may comprise a complex (at least 2, 3, 4, 5, 6, 7 or more) alpha helices or a beta sheet structure. The N-terminus and the C-terminus of a multi-pass membrane protein may be present on opposing sides of the lipid bilayer, e.g., the N-terminus of the protein is present on the cytoplasmic side of the lipid bilayer and the C-terminus of the protein is present on the extracellular side.

[0338] The transmembrane domain of the CAR may comprise a transmembrane domain chosen from the transmembrane domain of an alpha, beta or zeta chain of a T-cell receptor, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDl la, CD18) , ICOS (CD278) , 4-1BB (CD137) , GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRFl) , CD160, Claudin-6, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDl ld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CDIOO (SEMA4D) , SLAMF6 (NTB-A, Lyl08) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, PAG / Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, and / or NKG2C. In some embodiments, the transmembrane domain is derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 and PD1.

[0339] In some specific embodiments, the transmembrane domain is derived from CD8α. In some embodiments, the transmembrane domain is a transmembrane domain of CD8αcomprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0340] 5.3.3 Intracellular Signaling Domain

[0341] The CARs of the present disclosure comprise an intracellular signaling domain. The intracellular signaling domain is responsible for activation of at least one of the normal effector functions of the immune effector cell expressing the CARs. The term “effector function” refers to a specialized function of a cell. Effector function of a T cell, for example, may be cytolytic activity or helper activity including the secretion of cytokines. Thus, the term “cytoplasmic signaling domain” refers to the portion of a protein which transduces the effector function signal and directs the cell to perform a specialized function. While usually the entire cytoplasmic signaling domain can be employed, in many cases it is not necessary to use the entire chain. To the extent that a truncated portion of the cytoplasmic signaling domain is used, such truncated portion may be used in place of the intact chain as long as it transduces the effector function signal. The term cytoplasmic signaling domain is thus meant to include any truncated portion of the cytoplasmic signaling domain sufficient to transduce the effector function signal.

[0342] In some embodiments, the intracellular signaling domain comprises a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell. In some embodiments, the CAR comprises an intracellular signaling domain consisting essentially of a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell. “Primary intracellular signaling domain” refers to cytoplasmic signaling sequence that acts in a stimulatory manner to induce immune effector functions. The primary intracellular signaling domain may contain a signaling motif known as immunoreceptor tyrosine-based activation motif, or ITAM. An “ITAM” as used herein, is a conserved protein motif that is generally present in the tail portion of signaling molecules expressed in many immune cells. The motif may comprises two repeats of the amino acid sequence YxxL / I separated by 6-8 amino acids, wherein each x is independently any amino acid, producing the conserved motif YxxL / Ix (6-8) YxxL / I. ITAMs within signaling molecules are important for signal transduction within the cell, which is mediated at least in part by phosphorylation of tyrosine residues in the ITAM following activation of the signaling molecule. ITAMs may also function as docking sites for other proteins involved in signaling pathways. Exemplary ITAM-containing primary cytoplasmic signaling sequences include those derived from CD3ζ, FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon Rib) , CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, and CD66d.

[0343] In some embodiments, the primary intracellular signaling domain is derived from CD3ζ. The intracellular signaling domain may consist of the cytoplasmic signaling domain of CD3ζ. The primary intracellular signaling domain of CD3ζ may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. The primary intracellular signaling domain may be a cytoplasmic signaling domain of wild-type CD3ζ. The primary intracellular signaling domain may be a functional mutant of the cytoplasmic signaling domain of CD3ζ containing one or more mutations, such as Q65K.

[0344] 5.3.4 Co-stimulatory Signaling Domain

[0345] Many immune effector cells require co-stimulation, in addition to stimulation of an antigen-specific signal (e.g., the primary signal) , to promote cell proliferation, differentiation and survival, as well as to activate effector functions of the cell. In some embodiments, the CAR further comprises at least one co-stimulatory intracellular signaling domain. The term “co-stimulatory intracellular signaling domain, ” as used herein, refers to at least a portion of a protein that mediates a secondary or co-stimulatory signal transduction within a cell to induce an immune response such as an effector function. The co-stimulatory intracellular signaling domain can act in an antigen-independent manner to provide a secondary or co-stimulatory signal to immune cells. The co-stimulatory intracellular signaling domain of the CAR can be an intracellular signaling domain from a co-stimulatory protein, which transduces a secondary or co-stimulatory signal and modulates responses mediated by immune cells, such as T cells, NK cells, macrophages, neutrophils, or eosinophils. The term "co-stimulatory molecule"refers to a cognate binding partner on an immune cell (such as T cell or NK cell) that specifically binds with a co-stimulatory ligand, thereby mediating a co-stimulatory response by the immune cell, such as, but not limited to, proliferation and survival. Activation of a co-stimulatory intracellular signaling domain in a host cell (e.g., an immune cell) may induce the cell to increase or decrease the production and secretion of cytokines, phagocytic properties, proliferation, differentiation, survival, and / or cytotoxicity. The co-stimulatory intracellular signaling domain of any co-stimulatory molecule may be compatible for use in the CAR described herein. The type (s) of co-stimulatory intracellular signaling domain is selected based on factors such as the type of the immune effector cells in which the CAR would be expressed (e.g., T cells, NK cells, macrophages, neutrophils, or eosinophils) and the desired immune effector function (e.g., ADCC effect) . In some embodiments, the co-stimulatory molecule is selected from the group consisting of CD27, CD28, 4-1BB (CD137) , OX40, CD40, PD-1, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, TNFRSF9, TNFRSF4, TNFRSF8, CD40LG, ITGB2, KLRC2, TNFRSF18, TNFRSF14, HAVCR1, LGALS9, DAP10, DAP12, CD83, and ligands of CD83. The intracellular signaling domain in the CAR of the present disclosure may comprise a co-stimulatory signaling domain derived from CD137 (i.e., 4-1BB) . The intracellular signaling domain may comprise a cytoplasmic signaling domain of CD3ζ and a co-stimulatory signaling domain of CD137. The intracellular signaling domain may comprise a co-stimulatory signaling domain of CD137 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0346] The intracellular signaling domain may comprise a single co-stimulatory signaling domain. The intracellular signaling domain may comprise two or more (such as about any of 2, 3, 4, or more) co-stimulatory signaling domains. The intracellular signaling domain may comprise two or more of the same co-stimulatory signaling domains. The intracellular signaling domain may comprise two or more co-stimulatory signaling domains from different co-stimulatory proteins, such as any two or more co-stimulatory proteins described herein. The intracellular signaling domain comprises a primary intracellular signaling domain (such as cytoplasmic signaling domain of CD3ζ) and one or more co-stimulatory signaling domains. The one or more co-stimulatory signaling domains and the primary intracellular signaling domain (such as cytoplasmic signaling domain of CD3ζ) may be fused to each other via optional peptide linkers. The primary intracellular signaling domain, and the one or more co-stimulatory signaling domains may be arranged in any suitable order. Multiple co-stimulatory signaling domains may provide additive or synergistic stimulatory effects.

[0347] In some embodiments, the intracellular signaling domain further comprises a DAP12 intracellular signaling domain at the C-terminus. In some embodiments, the DAP12 intracellular signaling domain comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 11, or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 11.

[0348] In some embodiments, the intracellular signaling domain comprising or consisting of a CD137 (4-1BB) co-stimulatory signaling domain, a CD3ζ primary intracellular signaling domain, and a DAP12 intracellular signaling domain.

[0349] 5.3.5 Hinge Domain

[0350] The CARs of the present disclosure may comprise a hinge domain that is located between the extracellular antigen binding domain and the transmembrane domain. A hinge domain is an amino acid segment that is generally found between two domains of a protein and may allow for flexibility of the protein and movement of one or both of the domains relative to one another. Any amino acid sequence that provides such flexibility and movement of the extracellular antigen binding domain relative to the transmembrane domain of the effector molecule can be used.

[0351] In some embodiments, the hinge domain may be fused with the extracellular antigen-binding domain optionally via a peptide bond or a peptide linker.

[0352] The hinge domain may be a hinge domain of a naturally occurring protein. Hinge domains of any protein known in the art to comprise a hinge domain are compatible for use in the chimeric receptors described herein. The hinge domain may be at least a portion of a hinge domain of a naturally occurring protein and confers flexibility to the chimeric receptor. In some embodiments, the hinge domain is derived from a molecule selected from a group consisting of CD8α, CD28 and IgG4Fc. In some embodiments, the hinge domain is derived from CD8α. The hinge domain may be a portion of the hinge domain of CD8α, e.g., a fragment containing at least 15 (e.g., 20, 25, 30, 35, or 40) consecutive amino acids of the hinge domain of CD8α. In some embodiments, the hinge domain of CD8α comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 5-7 and 109, or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0353] Hinge domains of antibodies, such as an IgG, IgA, IgM, IgE, or IgD antibodies, are also compatible for use in the pH-dependent chimeric receptor systems described herein. The hinge domain may be the hinge domain that joins the constant domains CH1 and CH2 of an antibody. The hinge domain may be of an antibody and comprises the hinge domain of the antibody and one or more constant regions of the antibody. The hinge domain may comprise the hinge domain of an antibody and the CH3 constant region of the antibody. The hinge domain may comprise the hinge domain of an antibody and the CH2 and CH3 constant regions of the antibody. The antibody may be an IgG, IgA, IgM, IgE, or IgD antibody. Optionally, the antibody is an IgG antibody. The antibody may be an IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 antibody. The hinge region may comprise the hinge region and the CH2 and CH3 constant regions of an IgG1 antibody. The hinge region may comprise the hinge region and the CH3 constant region of an IgG1 antibody. In some embodiments, the hinge domain is derived from IgG4.

[0354] Non-naturally occurring peptides may also be used as hinge domains for the chimeric receptors described herein. The hinge domain between the C-terminus of the extracellular ligand-binding domain of an Fc receptor and the N-terminus of the transmembrane domain may be a peptide linker, such as a (GxS) n linker, wherein x and n, independently can be an integer between 3 and 12, including 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, or more.

[0355] 5.3.6 Signal Peptide

[0356] The CARs of the present disclosure may comprise a signal peptide (also known as a signal sequence) at the N-terminus of the polypeptide. In general, signal peptides are peptide sequences that target a polypeptide to the desired site in a cell. The signal peptide may target the effector molecule to the secretory pathway of the cell and would allow for integration and anchoring of the effector molecule into the lipid bilayer. Signal peptides including signal sequences of naturally occurring proteins or synthetic, non-naturally occurring signal sequences, which are compatible for use in the CARs described herein will be evident to one of skill in the art. The signal peptide may be derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, CD28, CD4, GM-CSF receptor α, and IgG1 heavy chain. In some embodiments, the signal peptide is derived from CD8α. In some embodiments, the signal peptide of CD8α comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0357] 5.3.7 Exemplary CARs

[0358] Exemplary CARs that binding CD19 are generated as shown in Section 6 (Examples) below, such as hCAR01, hCAR02, H-78 CAR, H-80 CAR, H-84 CAR, H-87 CAR, H-88 CAR, VL1g10VH14 CAR. In some embodiments, the CAR provided herein may comprise or consist of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 52-58, and 116; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. In some embodiments, the CAR provided herein further comprises a signal peptide, and may comprise or consist of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 22-23, 25-29, 59-65, and 117; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0359] In some embodiments, provided herein is a nucleic acid comprising a sequence encoding any of the CD19 CARs provided herein. In some embodiments, the CD19 CAR is expressed by introducing a nucleic acid encoding it into a cell in vivo (e.g., in vivo cell therapy) or in vitro (e.g., autologous cell therapy and allogeneic cell therapy) . In some embodiments, the cell is an immune cell. More detailed description regarding nucleic acid sequences and vectors are provided below.

[0360] Exemplary CARs that binding BCMA are generated as shown in Section 6 (Examples) below, such as hCAR003 and AS44688VH10 CAR. In some embodiments, the CAR provided herein may comprise or consist of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 110 and 111; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. In some embodiments, the CAR provided herein further comprises a signal peptide, and may comprise or consist of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 112 and 113; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0361] In some embodiments, provided herein is a nucleic acid comprising a sequence encoding any of the BCMA CARs provided herein. In some embodiments, the BCMA CAR is expressed by introducing a nucleic acid encoding it into a cell in vivo (e.g., in vivo cell therapy) or in vitro (e.g., autologous cell therapy and allogeneic cell therapy) . In some embodiments, the cell is an immune cell. More detailed description regarding nucleic acid sequences and vectors are provided below.

[0362] A tandem CAR is a single chimeric antigen polypeptide comprising two distinct extracellular ligand-binding domains capable of interacting with two different cell surface molecules, wherein the extracellular ligand-binding domains are linked together by a flexible linker and share one or more costimulatory domains, wherein the binding of the first or the second extracellular ligand-binding domain will signal through one or more the costimulatory domains and a signaling transducing domain. Tandem CARs are constructed by fusing two binding domains specifically recognizing different targets via a peptide linker to form the extracellular domain in a single CAR molecule. Tandem CARs can respond to cells expressing either one of the two target molecules, such as CD19 and BCMA.

[0363] Exemplary tandem CARs that binding and BCMA are generated as shown in Section 6 (Examples) below, such as DCAR-01, DCAR-02, DCAR-03, DCAR-04, hBCMA / hCD19-80, hBCMA / hCD19-88, and Loop hBCMA / hCD19-80. In some embodiments, the tandem CAR provided herein may comprise or consist of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 85-91; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. In some embodiments, the CAR provided herein further comprises a signal peptide, and may comprise or consist of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 92-101; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0364] In another aspect, provided herein is a dual chimeric antigen receptor (CAR) system, dual CAR systems are constructed by expressing two fully functional CARs against distinct targets. In some embodiments, the dual CAR system comprising (a) a first chimeric antigen receptor (CAR) comprising: i) a first antigen binding domain specifically recognizing a first antigen; ii) a first transmembrane domain; and iii) a first intracellular signaling domain; and (b) a second chimeric antigen receptor (CAR) comprising: i) a second antigen binding domain specifically recognizing a second antigen; ii) a second transmembrane domain; and iii) a second intracellular signaling domain. In some embodiments, the first CAR comprising a first antigen binding domain specifically recognizing CD19 and the second CAR comprising a first antigen binding domain specifically recognizing BCMA. In some embodiments, dual CAR system can respond to cells expressing CD19 and / or BCMA. In some embodiments, the first CAR is selected from hCAR01, hCAR02, H-78 CAR, H-80 CAR, H-84 CAR, H-87 CAR, H-88 CAR, VL1g10VH14 CAR. In some embodiments, the first CAR provided herein may comprise or consist of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 22-23, 25-29, 52-65, 116, and 117; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. In some embodiments, the second CAR is selected from hCAR003 and AS44688VH10 CAR. In some embodiments, the second CAR provided herein may comprise or consist of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 110-113; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0365] In some embodiments, the dual CAR system comprises: (1) the first CAR comprising the amino acid sequence of the anti-CD19 CAR as set forth in SEQ ID NOs: 22 or 52, and the second CAR comprising the amino acid sequence of the anti-BCMA CAR as set forth in SEQ ID NOs: 110 or 112; (2) the first CAR comprising the amino acid sequence of the anti-CD19 CAR as set forth in SEQ ID NOs: 23 or 53, and the second CAR comprising the amino acid sequence of the anti-BCMA CAR as set forth in SEQ ID NOs: 110 or 112; (3) the first CAR comprising the amino acid sequence of the anti-CD19 CAR as set forth in SEQ ID NOs: 26, 55 or 60, and the second CAR comprising the amino acid sequence of the anti-BCMA CAR as set forth in SEQ ID NOs: 111 or 113; or (4) the first CAR comprising the amino acid sequence of the anti-CD19 CAR as set forth in SEQ ID NOs: 29, 58 or 63, and the second CAR comprising the amino acid sequence of the anti-BCMA CAR as set forth in SEQ ID NOs: 111 or 113.

[0366] 5.4 Membrane-bound IL-15

[0367] In one aspect, provided herein is a membrane-bound IL-15, wherein the membrane-bound IL-15 (mbIL-15) comprises an IL-15 moiety and a transmembrane domain (e.g., a transmembrane domain located at the C-terminus of the IL-15) . Cells transduced with membrane-bound IL-15 will express IL-15 on their surface. In several embodiments, the expression of mbIL-l5 enhances the persistence of engineered cells (such as engineered NK cells) .

[0368] Non-limiting information regarding membrane bound IL-15 can be found in PCT Patent Application No. PCT / US2019 / 050679 and PCT / CN2024 / 124484, which documents are incorporated in its entirety by reference herein.

[0369] In some embodiments, the transmembrane domain may be derived from a molecule selected from a group consisting of CD8α, DAP12, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152, and PD-1. In some embodiments, the transmembrane domain may be derived from CD8α. In some embodiments, the transmembrane domain may be derived from DAP12.

[0370] In some embodiments, the membrane-bound IL-15 may further comprise a hinge domain located between the C-terminus of the IL-15 and the N-terminus of the transmembrane domain. In some embodiments, the hinge domain may be derived from CD8α.

[0371] In some embodiments, the membrane-bound IL-15 may further comprise a signal peptide located at the N-terminus. In some embodiments, the signal peptide is derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, DAP12, IgE, and IgG1 heavy chain. In some embodiments, the signal peptide may be derived from CD8α.

[0372] In some embodiments, the membrane-bound IL-15 comprises from N’ to C’ : an IL-15 moiety (e.g., a mature wildtype human IL-15 polypeptide) , and a transmembrane domain derived from CD8α. In some embodiments, the IL-15 construct comprises from N’ to C’ : an IL-15 moiety (e.g., a mature wildtype human IL-15 polypeptide) , a hinge domain (e.g., derived from CD8) , and a transmembrane domain derived from CD8α. In some embodiments, the IL-15 construct comprises from N’ to C’ : a signal peptide, an IL-15 moiety (e.g., a mature wildtype human IL-15 polypeptide) , a hinge domain (e.g., derived from CD8) , and a transmembrane domain derived from CD8α.

[0373] In some embodiments, the membrane-bound IL-15 provided herein may comprise or consist of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or 69; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0374] In some embodiments, the membrane-bound IL-15 comprises from N’ to C’ : an IL-15 moiety (e.g., a mature wildtype human IL-15 polypeptide) , and a transmembrane domain derived from DAP12. In some embodiments, the IL-15 construct comprises from N’ to C’ : an IL-15 moiety (e.g., a mature wildtype human IL-15 polypeptide) , a hinge domain (e.g., derived from CD8) , and a transmembrane domain derived from DAP12. In some embodiments, the IL-15 construct comprises from N’ to C’ : a signal peptide, an IL-15 moiety (e.g., a mature wildtype human IL-15 polypeptide) , a hinge domain (e.g., derived from CD8) , and a transmembrane domain derived from DAP12.

[0375] In some embodiments, the membrane-bound IL-15 provided herein may comprise or consist of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 106 or 107; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0376] In some embodiments, the membrane-bound IL-15 may be fused to the N-terminal and / or C-terminal of the CAR (mbIL-15 armored CAR) , optionally via a cleavage linker, such as a P2A linker (SEQ ID NO: 31) . The self-cleaving peptide may be selected from the group consisting of T2A, P2A, E2A, and F2A. In some embodiments, the mbIL-15 armored CAR comprise or consist of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 25-29, 64-65 and 99-101; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto.

[0377] 5.5 Engineered Cells

[0378] In another aspect, provided herein are engineered cells comprising any one of the CARs as described herein.

[0379] Any cells (e.g., immune cells) can be used herein to make the engineered cells (e.g., engineered immune cells) . In some embodiments, the engineered cells are produced in vivo. In some embodiments, the engineered cells are engineered immune cells. In some embodiments, the immune cells are in vivo cells (e.g., cells in an individual) . In some embodiments, the engineered immune cells are produced in vivo. In some embodiments, the engineered cells are engineered stem cells. In some embodiments, the stem cell is a hematopoietic stem cell (HSC) , pluripotent stem cell (PSC) , induced pluripotent stem cell (iPSC) , or embryonic stem cell (ESC) . In some embodiments, the engineered cell is a cell (e.g., immune cell) derived from or differentiated from an engineered stem cell. In some embodiments, the stem cell is engineered to express the chimeric antigen receptor (e.g. a CAR) and / or the membrane-bound IL-15 described herein and allowed to differentiate into a mature engineered cell (e.g., mature engineered immune cell, such as an NK cell) .

[0380] In some embodiments, the engineered cell is an engineered immune cell. In some embodiments, the engineered immune cell is selected from the group consisting of a T cell, a monocyte, a dendritic cell, a macrophage, a B cell, an NK cell, a natural killer T (NKT) cell, and any combination thereof. In some embodiments, the engineered immune cell is peripheral blood mononuclear cell (PBMC) . In some embodiments, the T cell is selected from the group consisting of a killer T cell (Tc, cytotoxic T lymphocyte, or CTL) , a helper T cell (Th) , a regulatory T cell (Treg) , an αβ T cell, a γδ T cell, an NKT cell, and any combination thereof. In some embodiments, the engineered immune cell is an immune effector cell that can exhibit immune effector functions. For example, immune effector cells comprise T cells (cytotoxic T cells, helper T cells, tumor infiltrating T cells) , B cells, NK cells, neutrophils, macrophages, and dendritic cells. The immune effector cell may express FcγRIII and perform ADCC effector function. Examples of immune effector cells which mediate ADCC include PBMC, NK cells, monocytes, cytotoxic T cells, neutrophils, and eosinophils.

[0381] In some embodiments, the engineered immune cell is generated from PBMC. In some embodiments, the engineered immune cell is an NK cell. In some embodiments, the engineered NK cells are CD16+, CD38+, CD56+ / NCAM-1+, CD57+, CD3-, CD3- / CD56+, CD7+, CD127-, Nkp46+, T-bet+, Eomes+, KIR Family receptor+, NKG2A+, NKG2D+, NKp30+, NKp44+, and / or NKp80+, or any combination thereof. In some embodiments, the engineered NK cells produce IFNγ, TNFα, and / or GM-CSF upon activation. In some embodiments, the engineered NK cells (e.g., CAR-NK) lyse target cells upon recognition and binding to the target cells. In some embodiments, the engineered immune cell is made from established cell lines, for example, NK-92 cells.

[0382] In some embodiments, the engineered immune cell is a T cell. The engineered T cells may be αβ T cells, or γδ T cells. In some embodiments, the engineered T cells are CD4+ / CD8-, CD4- / CD8+, CD4+ / CD8+, CD4- / CD8-, or combinations thereof. In some embodiments, the engineered T cells produce IL-2, TFN, and / or TNF upon activation.

[0383] The present disclosure provides engineered cells (e.g., engineered immune cells) that comprise any of the chimeric antigen receptors (e.g., anti-CD19 CAR, anti-BCMA CAR, anti-CD19×BCMA tandem CAR, dual CAR system) , any of the nucleic acids encoding said chimeric antigen receptors, and / or any of the vectors encoding said chimeric antigen receptors described herein. The present disclosure provides engineered cells (e.g., engineered immune cells) that further comprise the membrane-bound IL-15, any of the nucleic acids and / or any of the vectors encoding said membrane-bound IL-15 described herein. In some embodiments, the engineered cells (e.g., engineered immune cells) comprise any one of the anti-CD19 CARs described herein. In some embodiments, the engineered cells (e.g., engineered immune cells) comprise any one of the anti-BCMA CARs described herein. In some embodiments, the engineered cells (e.g., engineered immune cells) comprise any one of the anti-CD19×BCMA tandem CARs (CD19 / BCMA tandem CAR) described herein. In some embodiments, the engineered cells (e.g., engineered immune cells) comprise any one of the anti-CD19 CARs described herein and any one of the anti-BCMA CARs described herein. In some embodiments, the engineered cells (e.g., engineered immune cells) further comprise the membrane-bound IL-15 described herein.

[0384] Cells (e.g., immune cells or stem cells) for making the engineered cells (e.g., engineered immune cells) described herein can be from any sources, such as derived from related (e.g., an individual, such as a human to be treated) or unrelated (e.g., healthy individual) humans, non-human animals, cell lines, or cultures. In some embodiments, the engineered cell (e.g., engineered immune cell) is allogeneic (e.g., derived from a healthy individual) . In some embodiments, the engineered cell (e.g., engineered immune cell) is autologous (e.g., derived from the individual to be treated) .

[0385] 5.6 Polynucleotides

[0386] In another aspect, the disclosure provides polynucleotides that encode the present anti-CD19 antibody or an antigen-binding fragment thereof (e.g., scFv) , or polypeptide construct comprising the anti-CD19 antibody or an antigen-binding fragment thereof. The polynucleotides of the disclosure can be in the form of RNA or in the form of DNA. DNA includes cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA; and can be double-stranded or single-stranded, and if single stranded can be the coding strand or non-coding (anti-sense) strand. The polynucleotide may be in the form of cDNA. The polynucleotide may be a synthetic polynucleotide.

[0387] In another aspect, the disclosure provides polynucleotides that encode the CAR (e.g., anti-CD19 CAR, anti-BCMA CAR, anti-CD19×BCMA tandem CAR) provided herein. The polynucleotides of the disclosure can be in the form of RNA or in the form of DNA. DNA includes cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA; and can be double-stranded or single-stranded, and if single stranded can be the coding strand or non-coding (anti-sense) strand. The polynucleotide may be in the form of cDNA. The polynucleotide may be a synthetic polynucleotide.

[0388] In some embodiment, the polynucleotides described herein can be introduced into a cell in vivo using any suitable techniques known in the art. In some embodiments, the cell is an immune cell. In some embodiments, the polynucleotides can be modified to make it suitable for in vivo gene therapy.

[0389] The present disclosure further relates to variants of the polynucleotides described herein, wherein the variant encodes, for example, fragments, analogs, and / or derivatives of the antibody or CAR of the disclosure. The present disclosure may provide a polynucleotide comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence at least about 75%identical, at least about 80%identical, at least about 85%identical, at least about 90%identical, at least about 95%identical, or, at least about 96%, 97%, 98%or 99%identical to a polynucleotide encoding the antibody or CAR of the disclosure. As used herein, the phrase “apolynucleotide having a nucleotide sequence at least, for example, 95% “identical” to a reference nucleotide sequence” is intended to mean that the nucleotide sequence of the polynucleotide is identical to the reference sequence except that the polynucleotide sequence can include up to five point mutations per each 100 nucleotides of the reference nucleotide sequence. In other words, to obtain a polynucleotide having a nucleotide sequence at least 95%identical to a reference nucleotide sequence, up to 5%of the nucleotides in the reference sequence can be deleted or substituted with another nucleotide, or a number of nucleotides up to 5%of the total nucleotides in the reference sequence can be inserted into the reference sequence. These mutations of the reference sequence can occur at the 5′or 3′terminal positions of the reference nucleotide sequence or anywhere between those terminal positions, interspersed either individually among nucleotides in the reference sequence or in one or more contiguous groups within the reference sequence.

[0390] The polynucleotide variants can contain alterations in the coding regions, non-coding regions, or both. A polynucleotide variant may contain alterations which produce silent substitutions, additions, or deletions, but does not alter the properties or activities of the encoded polypeptide. A polynucleotide variant may comprise silent substitutions that results in no change to the amino acid sequence of the polypeptide (due to the degeneracy of the genetic code) . Polynucleotide variants can be produced for a variety of reasons, for example, to optimize codon expression for a particular host (i.e., change codons in the human mRNA to those preferred by a bacterial host such as E. coli) . A polynucleotide variant may comprise at least one silent mutation in a non-coding or a coding region of the sequence.

[0391] A polynucleotide variant may be produced to modulate or alter expression (or expression levels) of the encoded polypeptide. A polynucleotide variant may be produced to increase expression of the encoded polypeptide. A polynucleotide variant may be produced to decrease expression of the encoded polypeptide. A polynucleotide variant may have increased expression of the encoded polypeptide as compared to a parental polynucleotide sequence. A polynucleotide variant may have decreased expression of the encoded polypeptide as compared to a parental polynucleotide sequence.

[0392] Also provided are vectors comprising the nucleic acid molecules described herein. The nucleic acid molecules can be incorporated into a recombinant expression vector. The present disclosure provides recombinant expression vectors comprising any of the nucleic acids of the disclosure. As used herein, the term “recombinant expression vector” means a genetically-modified oligonucleotide or polynucleotide construct that permits the expression of an mRNA, protein, polypeptide, or peptide by a host cell, when the construct comprises a nucleotide sequence encoding the mRNA, protein, polypeptide, or peptide, and the vector is contacted with the cell under conditions sufficient to have the mRNA, protein, polypeptide, or peptide expressed within the cell. The vectors described herein are not naturally occurring as a whole; however, parts of the vectors can be naturally occurring. The described recombinant expression vectors can comprise any type of nucleotides, including, but not limited to DNA and RNA, which can be single-stranded or double-stranded, synthesized or obtained in part from natural sources, and which can contain natural, non-natural or altered nucleotides. The recombinant expression vectors can comprise naturally occurring or non-naturally occurring internucleotide linkages, or both types of linkages. The non-naturally occurring or altered nucleotides or internucleotide linkages do not hinder the transcription or replication of the vector.

[0393] The recombinant expression vector of the disclosure can be any suitable recombinant expression vector, and can be used to transform or transfect any suitable host. Suitable vectors include those designed for propagation and expansion or for expression or both, such as plasmids and viruses. The vector can be selected from the group consisting of the pUC series (Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, Md. ) , the pBluescript series (Stratagene, LaJolla, Calif. ) , the pET series (Novagen, Madison, Wis. ) , the pGEX series (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) , and the pEX series (Clontech, Palo Alto, Calif. ) . Bacteriophage vectors, such as λGT10, λGT11, λEMBL4, and λNM1149, λZapII (Stratagene) can be used. Examples of plant expression vectors include pBI01, pBI01.2, pBI121, pBI101.3, and pBIN19 (Clontech) . Examples of animal expression vectors include pEUK-Cl, pMAM, and pMAMneo (Clontech) . The recombinant expression vector may be a viral vector, e.g., a retroviral vector, e.g., a gamma retroviral vector.

[0394] The recombinant expression vectors can be prepared using standard recombinant DNA techniques described in, for example, Sambrook et al., supra, and Ausubel et al., supra. Constructs of expression vectors, which are circular or linear, can be prepared to contain a replication system functional in a prokaryotic or eukaryotic host cell. Replication systems can be derived, e.g., from ColE1, SV40, 2μ plasmid, λ, bovine papilloma virus, and the like.

[0395] The recombinant expression vector may comprise regulatory sequences, such as transcription and translation initiation and termination codons, which are specific to the type of host (e.g., bacterium, plant, fungus, or animal) into which the vector is to be introduced, as appropriate, and taking into consideration whether the vector is DNA-or RNA-based.

[0396] The recombinant expression vector can include one or more marker genes, which allow for selection of transformed or transfected hosts. Marker genes include biocide resistance, e.g., resistance to antibiotics, heavy metals, etc., complementation in an auxotrophic host to provide prototrophy, and the like. Suitable marker genes for the described expression vectors include, for instance, neomycin / G418 resistance genes, histidinol x resistance genes, histidinol resistance genes, tetracycline resistance genes, and ampicillin resistance genes.

[0397] The recombinant expression vector can comprise a native or normative promoter operably linked to the nucleotide sequence of the disclosure. The selection of promoters, e.g., strong, weak, tissue-specific, inducible and developmental-specific, is within the ordinary skill of the artisan. Similarly, the combining of a nucleotide sequence with a promoter is also within the skill of the artisan. The promoter can be a non-viral promoter or a viral promoter, e.g., a cytomegalovirus (CMV) promoter, an RSV promoter, an SV40 promoter, or a promoter found in the long-terminal repeat of the murine stem cell virus.

[0398] The recombinant expression vectors can be designed for either transient expression, for stable expression, or for both. Also, the recombinant expression vectors can be made for constitutive expression or for inducible expression.

[0399] Further, the recombinant expression vectors can be made to include a suicide gene. As used herein, the term “suicide gene” refers to a gene that causes the cell expressing the suicide gene to die. The suicide gene can be a gene that confers sensitivity to an agent, e.g., a drug, upon the cell in which the gene is expressed, and causes the cell to die when the cell is contacted with or exposed to the agent. Suicide genes are known in the art and include, for example, the Herpes Simplex Virus (HSV) thymidine kinase (TK) gene, cytosine deaminase, purine nucleoside phosphorylase, and nitroreductase.

[0400] A polynucleotide may be isolated. A polynucleotide may be substantially pure.

[0401] Also provided are host cells comprising the nucleic acid molecules described herein. The host cell may be any cell that contains a heterologous nucleic acid. The heterologous nucleic acid can be a vector (e.g., an expression vector) . For example, a host cell can be a cell from any organism that is selected, modified, transformed, grown, used or manipulated in any way, for the production of a substance by the cell, for example the expression by the cell of a gene, a DNA or RNA sequence, a protein or an enzyme. An appropriate host may be determined. For example, the host cell may be selected based on the vector backbone and the desired result. By way of example, a plasmid or cosmid can be introduced into a prokaryote host cell for replication of several types of vectors. Bacterial cells such as, but not limited to DH5α, JM109, and KCB,   Competent Cells, and SOLOPACK Gold Cells, can be used as host cells for vector replication and / or expression. Additionally, bacterial cells such as E. coli LE392 could be used as host cells for phage viruses. Eukaryotic cells that can be used as host cells include, but are not limited to yeast (e.g., YPH499, YPH500 and YPH501) , insects and mammals. Examples of mammalian eukaryotic host cells for replication and / or expression of a vector include, but are not limited to, HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, COS, Saos, PC12, SP2 / 0 (American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, VA, CRL-1581) , NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC) , Salisbury, Wiltshire, UK, ECACC No. 85110503) , FO (ATCC CRL-1646) and Ag653 (ATCC CRL-1580) murine cell lines. An exemplary human myeloma cell line is U266 (ATCC CRL-TIB-196) . Other useful cell lines include those derived from Chinese Hamster Ovary (CHO) cells such as CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD) , CHO-K1 (ATCC CRL-61) or DG44.

[0402] 5.7 Vectors

[0403] The present disclosure provides vectors for cloning and expressing any one of the CARs described herein. In some embodiments, the CAR described herein is expressed by introducing the nucleic acid or the vector comprising a sequence encoding the CAR into a cell in vivo (in vivo cell therapy) or in vitro (including autologous cell therapy and allogeneic cell therapy) . The vector is suitable for replication and integration in eukaryotic cells, such as mammalian cells. The vector may be a viral vector. Examples of viral vectors include, but are not limited to, adenoviral vectors, adeno-associated virus vectors, lentiviral vector, retroviral vectors, vaccinia vector, herpes simplex viral vector, and derivatives thereof. Viral vector technology is well known in the art and is described, for example, in Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) , and in other virology and molecular biology manuals. In some embodiments, the vector is a non-viral vector (e.g., lipid nanoparticles (LNPs) ) . In some embodiments, the vector is a virus-like particles (VLPs) , or enveloped delivery vehicles (EDVs) .

[0404] A number of viral based systems have been developed for gene transfer into mammalian cells. For example, retroviruses provide a convenient platform for gene delivery systems. The heterologous nucleic acid can be inserted into a vector and packaged in retroviral particles using techniques known in the art. The recombinant virus can then be isolated and delivered to the engineered mammalian cell in vitro or ex vivo. A number of retroviral systems are known in the art. Adenovirus vectors may be used. A number of adenovirus vectors are known in the art. Lentivirus vectors may be used. Self-inactivating lentiviral vectors may be used. For example, self-inactivating lentiviral vectors carrying the immunomodulator (such as immune checkpoint inhibitor) coding sequence and / or self-inactivating lentiviral vectors carrying chimeric antigen receptors can be packaged with protocols known in the art. The resulting lentiviral vectors can be used to transduce a mammalian cell (such as primary human T cells) using methods known in the art. Vectors derived from retroviruses such as lentivirus are suitable tools to achieve long-term gene transfer, because they allow long-term, stable integration of a transgene and its propagation in progeny cells. Lentiviral vectors also have low immunogenicity, and can transduce non-proliferating cells.

[0405] In some embodiments, the vector is a non-viral vector. In some embodiments, the non-viral vector is or includes a polynucleotide, e.g., a DNA or RNA polynucleotide, that is suitable for transduction and / or transfection by any suitable and / or known non-viral method for gene delivery, such as but not limited to microinjection, electroporation, transient cell compression or squeezing (e.g., as described in Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27) , lipid-mediated transfection, peptide-mediated delivery, or a combination thereof.

[0406] In some embodiments, the vector comprises or is a polymer. In some embodiments, the polymer comprises a polymer nanoparticle. In some embodiments, the vector comprises or is a lipid nanoparticle. In some embodiments, the vector comprises or is a cell penetrating peptide.

[0407] Any viral vectors described herein can be introduced into a cell in vivo using any suitable techniques known in the art. The viral based systems can be engineered to target (i.e. infect) a range of cells, target a narrow subset of cells, or target a specific type of cell. In general, the envelope protein chosen for the viral based systems will determine the viral tropism. In some embodiments, the virus used in the viral based systems can be pseudotyped to target a specific cell type of interest. For example, the envelope protein on the viral vectors can be modified to have reduced binding affinity to its natural receptor on host cells and the viral vectors can be modified to display a ligand (e.g., antibody or fragment thereof) that specifically binds to a cell surface marker. In some embodiments, the cell is an immune cell. Exemplary envelope proteins include, but are not limited to, VSV-G (vesicular stomatitis virus glycoprotein) , COCAL-G (cocal virus glycoprotein) and their known mutants that have a reduced binding affinity with low-density lipoprotein receptor (LDL-R) . Accordingly, one skilled in the art can select the appropriate tropism, pseudotype, and / or envelope protein that are well known for targeting a desired cell type.

[0408] A number of non-viral vectors have also been developed for gene transfer into mammalian cells. The non-viral vectors include but are not limited to, lipid nanoparticles (LNPs) , and stimuli-responsive polymer / inorganic nanoparticles. Any non-viral vectors described herein can be introduced into a cell in vivo using any suitable techniques known in the art. In some embodiments, LNPs are used. In some embodiments, LNPs are conjugated to a ligand (e.g., antibody or fragment thereof) that specifically binds to a cell surface marker (targeting moiety) . In some embodiments, the cell is an immune cell.

[0409] In some embodiments, the vector comprises at least one targeting moiety that specifically targets a T cell (e.g., αβT, γδT, NKT) , an NK cell, a spleen, or a lymph node.

[0410] In some embodiments, the vector comprises at least one targeting moiety that binds CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, TCR, CD9, CD11a, CD16, CD18, CD25, CD27, CD28, CD44, CD45, CD45RA, CD45RB, CD45RO, CD47, CD53, CD56, CD57, CD62L, CD63, CD69, CD80, CD81, CD82, CD94, CD95, CD103, CD122, CD127, CD137, CD161, CD183 (CXCR3) , CD184 (CXCR4) , CD185 (CXCR5) , CD193 (CCR3) , CD194 (CCR4) , CD195 (CCR5) , CD196 (CCR6) , CD197 (CCR7) , CCR10, CTLA4, DNAM1, HLA-DR, ICOS, 4-1BB, AhR, IL-2 receptor, IL-6ST, IL-7 receptor, IL-15 receptor, KAR receptors, KIR receptors, KIR2DL1, KIR3D51, KIR3DS1, LAG3, NKG2A, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NTBA, OX40, P2RX7, PD1, SIGLEC-7, TIGIT, TIM3, TLR2, TLR4, TLR5. In some embodiments, the vector comprises at least one targeting moiety that binds CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, TCR, CD8, CD56, CD16, and / or NKG2D. In some embodiments, the targeting moiety described above is an antibody or fragment thereof (e.g., scFv, VHHs) .

[0411] Exemplary targeting moieties can be found in e.g., US 11, 174, 481 B2, US 11, 191, 784 B2, US 2015 / 0320693 A1, WO 2022 / 058298 A1, US 11, 337, 929 B2, US 11, 324, 837 B2, and WO 2017 / 165683 A1, the contents of which are hereby incorporated in their entirety.

[0412] In some embodiments, the vector comprises any one of the nucleic acids encoding a CAR described herein. The nucleic acid can be cloned into the vector using any known molecular cloning methods in the art, including, for example, using restriction endonuclease sites and one or more selectable markers. The nucleic acid may be operably linked to a promoter. Varieties of promoters have been explored for gene expression in mammalian cells, and any of the promoters known in the art may be used in the present disclosure. Promoters may be roughly categorized as constitutive promoters or regulated promoters, such as inducible promoters.

[0413] The nucleic acid encoding the CAR may be operably linked to a constitutive promoter. Constitutive promoters allow heterologous genes (also referred to as transgenes) to be expressed constitutively in the host cells. Exemplary constitutive promoters contemplated herein include, but are not limited to, Cytomegalovirus (CMV) promoters, human elongation factors-1 alpha (hEF1α) , ubiquitin C promoter (UbiC) , phosphoglycerokinase promoter (PGK) , simian virus 40 early promoter (SV40) , and chicken β-Actin promoter coupled with CMV early enhancer (CAGG) . The efficiencies of such constitutive promoters on driving transgene expression have been widely compared in a huge number of studies. For example, Michael C. Milone et al compared the efficiencies of CMV, hEF1α, UbiC and PGK to drive chimeric antigen receptor expression in primary human T cells, and concluded that hEF1αpromoter not only induced the highest level of transgene expression, but was also optimally maintained in the CD4 and CD8 human T cells (Molecular Therapy, 17 (8) : 1453-1464 (2009) ) . The nucleic acid encoding the CAR may be operably linked to a hEF1α promoter.

[0414] The nucleic acid encoding the CAR may be operably linked to an inducible promoter. Inducible promoters belong to the category of regulated promoters. The inducible promoter can be induced by one or more conditions, such as a physical condition, microenvironment of the engineered immune cell, or the physiological state of the engineered immune cell, an inducer (i.e., an inducing agent) , or a combination thereof.

[0415] The inducing condition may not induce the expression of endogenous genes in the engineered mammalian cell, and / or in the subject that receives the pharmaceutical composition. The inducing condition may be selected from the group consisting of inducer, irradiation (such as ionizing radiation, light) , temperature (such as heat) , redox state, tumor environment, and the activation state of the engineered mammalian cell.

[0416] The vector may also contain a selectable marker gene or a reporter gene to select cells expressing the CAR from the population of host cells transfected through lentiviral vectors. Both selectable markers and reporter genes may be flanked by appropriate regulatory sequences to enable expression in the host cells. For example, the vector may contain transcription and translation terminators, initiation sequences, and promoters useful for regulation of the expression of the nucleic acid sequences.

[0417] The vector may comprise a nucleic acid encoding the CAR and a membrane-bound IL-15 as described above. The vector may comprise a nucleic acid comprising a first nucleic acid sequence encoding the CAR and a second nucleic acid sequence encoding the membrane-bound IL-15, wherein the first nucleic acid is operably linked to the second nucleic acid via a third nucleic acid sequence encoding a self-cleaving peptide. The self-cleaving peptide may be selected from the group consisting of T2A, P2A and F2A. In some embodiments, the vector encodes the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 25-29, 64-65, and 99-101.

[0418] The vector may comprise more than one nucleic acid encoding CARs. The vector may comprise a nucleic acid comprising a first nucleic acid sequence encoding a first CAR (e.g., CD19 CAR) and a second nucleic acid sequence encoding a second CAR (e.g., BCMA CAR) , wherein the first nucleic acid is operably linked to the second nucleic acid via a third nucleic acid sequence encoding a self-cleaving peptide. The self-cleaving peptide may be selected from the group consisting of T2A, P2A and F2A.

[0419] 5.8 Pharmaceutical Compositions

[0420] In one aspect, the present disclosure further provides pharmaceutical compositions comprising an antibody or the antigen-binding fragment thereof, a polypeptide construct, or an engineered cell of the present disclosure. A pharmaceutical composition may comprise a therapeutically effective amount of the antibody or the antigen-binding fragment thereof, the polypeptide construct, or the engineered immune cell of the present disclosure and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0421] A pharmaceutical composition provided herein may comprise the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof (e.g., an anti-CD19 scFv) , the polypeptide construct, the host cell, the CAR, the nucleic acid molecule, the vector, or the engineered cell provided herein, and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0422] A pharmaceutical composition provided herein may comprise a therapeutically effective amount of the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof (e.g., an anti-CD19 scFv provided herein) and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0423] A pharmaceutical composition provided herein may comprise a therapeutically effective amount of the polypeptide construct comprising the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof provided herein and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0424] A pharmaceutical composition provided herein may comprise a therapeutically effective amount of CAR comprising the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof provided herein and a pharmaceutically acceptable excipient. The CAR can be a CD19 targeting CAR provided herein. The CAR can be a CD19×BCMA tandem CAR provided herein.

[0425] A pharmaceutical composition provided herein may comprise a therapeutically effective amount of engineered immune cells provided herein and a pharmaceutically acceptable excipient. The engineered immune cells can comprise a CD19 targeting CAR provided herein. The engineered immune cells can comprise a CD19×BCMA tandem CAR provided herein.

[0426] In some embodiments, provided herein is a pharmaceutical composition comprising: (a) a first nucleic acid comprising a sequence encoding a chimeric receptor (e.g., a CD19 CAR, a BCMA CAR, a CD19×BCMA tandem CAR) provided herein, (b) optionally a second nucleic acid comprising a sequence encoding a membrane-bound IL-15 provided herein, and (c) optionally a pharmaceutically acceptable excipient.

[0427] In some embodiments, provided herein is a pharmaceutical composition comprising: i) a vector comprising (a) a first nucleic acid comprising a sequence encoding a chimeric receptor (e.g., a CD19 CAR, a BCMA CAR, a CD19×BCMA tandem CAR) provided herein, (b) optionally a second nucleic acid comprising a sequence encoding a membrane-bound IL-15 provided herein, and ii) optionally a pharmaceutically acceptable excipient.

[0428] In some embodiments, provided herein is a pharmaceutical composition comprising: i) a first vector comprising a nucleic acid comprising a sequence encoding a chimeric receptor (e.g., a CD19 CAR, a BCMA CAR, a CD19×BCMA tandem CAR) provided herein; ii) optionally a second vector comprising a nucleic acid comprising a sequence encoding a membrane-bound IL-15 provided herein; and iii) optionally a pharmaceutically acceptable excipient.

[0429] The term “excipient” can also refer to a diluent, adjuvant (e.g., Freunds’a djuvant (complete or incomplete) , carrier or vehicle. Pharmaceutical excipients can be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid excipients. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol and the like. The composition, if desired, can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents. These compositions can take the form of solutions, suspensions, emulsion, tablets, pills, capsules, powders, sustained-release formulations and the like. Examples of suitable pharmaceutical excipients are described in Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA. Such compositions will contain a prophylactically or therapeutically effective amount of the active ingredient provided herein, such as in purified form, together with a suitable amount of excipient so as to provide the form for proper administration to the patient. The formulation should suit the mode of administration.

[0430] The choice of excipient may be determined in part by the particular cell, binding molecule, and / or antibody, and / or by the method of administration. Accordingly, there are a variety of suitable formulations.

[0431] Typically, acceptable carriers, excipients, or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include buffers, antioxidants including ascorbic acid, methionine, Vitamin E, sodium metabisulfite; preservatives, isotonicifiers, stabilizers, metal complexes (e.g., Zn-protein complexes) ; chelating agents such as EDTA and / or non-ionic surfactants.

[0432] Buffers may be used to control the pH in a range which optimizes the therapeutic effectiveness, especially if stability is pH dependent. Suitable buffering agents for use with the present disclosure include both organic and inorganic acids and salts thereof. For example, citrate, phosphate, succinate, tartrate, fumarate, gluconate, oxalate, lactate, acetate. Additionally, buffers may comprise histidine and trimethylamine salts such as Tris.

[0433] Preservatives may be added to retard microbial growth. Suitable preservatives for use with the present disclosure include octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium halides (e.g., chloride, bromide, iodide) , benzethonium chloride; thimerosal, phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexanol, 3-pentanol, and m-cresol.

[0434] Tonicity agents, sometimes known as “stabilizers” can be present to adjust or maintain the tonicity of liquid in a composition. When used with large, charged biomolecules such as proteins and antibodies, they are often termed “stabilizers” because they can interact with the charged groups of the amino acid side chains, thereby lessening the potential for inter and intra-molecular interactions. Exemplary tonicity agents include polyhydric sugar alcohols, trihydric or higher sugar alcohols, such as glycerin, erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol and mannitol.

[0435] Additional exemplary excipients include: (1) bulking agents, (2) solubility enhancers, (3) stabilizers and (4) agents preventing denaturation or adherence to the container wall. Such excipients include: polyhydric sugar alcohols (enumerated above) ; amino acids such as alanine, glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, lysine, ornithine, leucine, 2-phenylalanine, glutamic acid, threonine, etc. ; organic sugars or sugar alcohols such as sucrose, lactose, lactitol, trehalose, stachyose, mannose, sorbose, xylose, ribose, ribitol, myoinisitose, myoinisitol, galactose, galactitol, glycerol, cyclitols (e.g., inositol) , polyethylene glycol; sulfur containing reducing agents, such as urea, glutathione, thioctic acid, sodium thioglycolate, thioglycerol, α-monothioglycerol and sodium thio sulfate; low molecular weight proteins such as human serum albumin, bovine serum albumin, gelatin or other immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; monosaccharides (e.g., xylose, mannose, fructose, glucose; disaccharides (e.g., lactose, maltose, sucrose) ; trisaccharides such as raffinose; and polysaccharides such as dextrin or dextran.

[0436] Non-ionic surfactants or detergents (also known as “wetting agents” ) may be present to help solubilize the therapeutic agent as well as to protect the therapeutic protein against agitation-induced aggregation, which also permits the formulation to be exposed to shear surface stress without causing denaturation of the active therapeutic protein or antibody. Suitable non-ionic surfactants include, e.g., polysorbates (20, 40, 60, 65, 80, etc. ) , polyoxamers (184, 188, etc. ) ,   polyols,   polyoxyethylene sorbitan monoethers ( -20,  -80, etc. ) , lauromacrogol 400, polyoxyl 40 stearate, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 10, 50 and 60, glycerol monostearate, sucrose fatty acid ester, methyl celluose and carboxymethyl cellulose. Anionic detergents that can be used include sodium lauryl sulfate, dioctyle sodium sulfosuccinate and dioctyl sodium sulfonate. Cationic detergents include benzalkonium chloride or benzethonium chloride.

[0437] In order for the pharmaceutical compositions to be used for in vivo administration, they may be sterile. The pharmaceutical composition may be rendered sterile by filtration through sterile filtration membranes. The pharmaceutical compositions herein generally can be placed into a container having a sterile access port, for example, an intravenous solution bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle.

[0438] The route of administration is in accordance with known and accepted methods, such as by single or multiple bolus or infusion over a long period of time in a suitable manner, e.g., injection or infusion by subcutaneous, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intralesional or intraarticular routes, topical administration, inhalation or by sustained release or extended-release means.

[0439] The pharmaceutical compositions described herein may also contain more than one active compound or agent as necessary for the particular indication being treated. Alternatively, or in addition, the composition may comprise a cytotoxic agent, chemotherapeutic agent, cytokine, immunosuppressive agent, or growth inhibitory agent. Such molecules are suitably present in combination in amounts that are effective for the purpose intended.

[0440] The active ingredients may also be entrapped in microcapsules prepared, for example, by coascervation techniques or by interfacial polymerization, for example, hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly- (methylmethacylate) microcapsules, respectively, in colloidal drug delivery systems (for example, liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nano-particles and nanocapsules) or in macroemulsions. Such techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition.

[0441] Various compositions and delivery systems are known and can be used with the therapeutic agents provided herein, including, but not limited to, encapsulation in liposomes, microparticles, microcapsules, recombinant cells capable of expressing the antibody or therapeutic molecule provided herein, construction of a nucleic acid as part of a retroviral or other vector, etc.

[0442] The pharmaceutical composition provided herein may contain the binding molecules and / or cells in amounts effective to treat or prevent the disease or disorder, such as a therapeutically effective or prophylactically effective amount. Therapeutic or prophylactic efficacy may be monitored by periodic assessment of treated subjects. For repeated administrations over several days or longer, depending on the condition, the treatment is repeated until a desired suppression of disease symptoms occurs. However, other dosage regimens may be useful and can be determined.

[0443] 5.9 Therapeutic Methods and Uses

[0444] Such methods and uses include therapeutic methods and uses, for example, involving administration of the molecules, cells, or compositions containing the same, to a subject having a disease, condition, or disorder associated with CD19. The molecule, cell, and / or composition may be administered in an effective amount to effect treatment of the disease or disorder. Uses include uses of the molecules and cells in such methods and treatments, and in the preparation of a medicament in order to carry out such therapeutic methods. The methods may be carried out by administering the molecules or cells, or compositions comprising the same, to the subject having or suspected of having the disease or condition. The methods thereby may treat the disease or disorder in the subject.

[0445] The treatment provided herein may cause complete or partial amelioration or reduction of a disease or disorder, or a symptom, adverse effect or outcome, or phenotype associated therewith. Desirable effects of treatment include, but are not limited to, preventing occurrence or recurrence of disease, alleviation of symptoms, diminishment of any direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing metastasis, decreasing the rate of disease progression, amelioration or palliation of the disease state, and remission or improved prognosis. The terms include, but do not imply, complete curing of a disease or complete elimination of any symptom or effect (s) on all symptoms or outcomes.

[0446] As used herein, the treatment provided herein may delay development of a disease or disorder, e.g., defer, hinder, slow, retard, stabilize, suppress and / or postpone development of the disease (such as cancer) . This delay can be of varying lengths of time, depending on the history of the disease and / or individual being treated. As is evident to one skilled in the art, a sufficient or significant delay can, in effect, encompass prevention, in that the individual does not develop the disease or disorder. For example, a late-stage cancer, such as development of metastasis, may be delayed. The method or the use provided herein may prevent a disease or disorder.

[0447] The disease or disorder may be a B cell associated disease or disorder and / or CD19 associated disease or disorder. The disease or disorder may be a cancer. The disease or disorder may be a B cell malignancy. The B cell malignancy may be a B cell leukemia or B cell lymphoma.

[0448] The disease or disorder may be selected from a group consisting of marginal zone lymphoma (e.g., splenic marginal zone lymphoma) , diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , primary central nervous system (CNS) lymphoma, primary mediastinal B cell lymphoma (PMBL) , small lymphocytic lymphoma (SLL) , B cell prolymphocytic leukemia (B-PLL) , follicular lymphoma (FL) , burkitt lymphoma, primary intraocular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , acute lymphoblastic leukemia (ALL) , hairy cell leukemia (HCL) , precursor B lymphoblastic leukemia, non-hodgkin lymphoma (NHL) , high-grade B-cell lymphoma (HGBL) , and multiple myeloma (MM) .

[0449] The disease or disorder may be an autoimmune disease. The disease or disorder may be an autoimmune disease (e.g., a humoral immunity-mediated autoimmune disease) associated with CD19. The autoimmune disease may be associated with inappropriate or enhanced B cell numbers and / or activation. The autoimmune disease may be systemic lupus erythematosus (SLE) , multiple sclerosis, N-methyl-d-aspartate receptor (NMDAR) encephalitis, myasthenia gravis, rheumatoid arthritis, myelin oligodendrocyte glycoprotein spectrum disorder (MOGSD) , neuromyelitis optica spectrum disorder (NMOSD) , and any combination thereof.

[0450] The methods may include adoptive cell therapy, whereby genetically engineered cells expressing the provided CD19 targeting CARs are administered to a subject. Such administration can promote activation of the cells (e.g., T cell activation) in a CD19 targeted manner, such that the cells of the disease or disorder are targeted for destruction. The genetically engineered cells expressing the provided CD19 targeted CARs may further express one or more additional antigen binding domain (s) . The genetically engineered cells expressing the provided CD19 targeted CARs may further express anti-BCMA antigen binding domain (s) .

[0451] The methods may include administration of the cells or a composition containing the cells to a subject, tissue, or cell, such as one having, at risk for, or suspected of having the disease or disorder. The cells, cell populations and compositions may be administered to a subject having the particular disease or disorder to be treated, e.g., via adoptive cell therapy, such as adoptive T cell therapy. The cells, cell populations or compositions may be administered to the subject, such as a subject having or at risk for the disease or disorder. The methods thereby may treat, e.g., ameliorate one or more symptom of the disease or disorder, such as by lessening tumor burden in a CD19-expressing cancer.

[0452] Methods for administration of cells for adoptive cell therapy are known, as described, e.g., in US Patent Application Publication No. 2003 / 0170238; U.S. Pat. No. 4,690,915; Rosenberg, Nat Rev Clin Oncol. 8 (10) : 577-85 (2011) ; Themeli et al., Nat Biotechnol. 31 (10) : 928-933 (2013) ; Tsukahara et al., Biochem Biophys Res Commun 438 (1) : 84-9 (2013) ; and Davila et al., PloS ONE 8 (4) : e61338 (2013) . These methods may be used in connection with the methods and compositions provided herein.

[0453] The cell therapy (e.g., adoptive T cell therapy) may be carried out by autologous transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from the subject who is to receive the cell therapy, or from a sample derived from such a subject. Thus, in some aspects, the cells are derived from a subject in need of a treatment and the cells, following isolation and processing are administered to the same subject. The cell therapy (e.g., adoptive T cell therapy) may be carried out by allogeneic transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from a subject other than a subject who is to receive or who ultimately receives the cell therapy, e.g., a first subject. The cells then are administered to a different subject, e.g., a second subject, of the same species. The first and second subjects may be genetically identical. The first and second subjects may be genetically similar. The second subject may expresse the same HLA class or supertype as the first subject. The cell therapy (e.g., adoptive T cell therapy) may be carried out by allogeneic transfer.

[0454] The subject, to whom the cells, cell populations, or compositions are administered may be a primate, such as a human. The subject can be male or female and can be any suitable age, including infant, juvenile, adolescent, adult, and geriatric subjects. In some examples, the subject is a validated animal model for disease, adoptive cell therapy, and / or for assessing toxic outcomes.

[0455] The anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof and chimeric antigen receptors that bind to CD19 and cells expressing the same, can be administered by any suitable means, for example, by injection, e.g., intravenous or subcutaneous injections, intraocular injection, periocular injection, subretinal injection, intravitreal injection, trans-septal injection, subscleral injection, intrachoroidal injection, intracameral injection, subconjectval injection, subconjuntival injection, sub-Tenon's injection, retrobulbar injection, peribulbar injection, or posterior juxtascleral delivery. They may be administered by parenteral, intrapulmonary, and intranasal, and, if desired for local treatment, intralesional administration. Parenteral infusions include intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, or subcutaneous administration.

[0456] The amount of a prophylactic or therapeutic agent provided herein that will be effective in the prevention and / or treatment of a disease or condition can be determined by standard clinical techniques. Effective doses may be extrapolated from dose-response curves derived from in vitro or animal model test systems. For the prevention or treatment of disease, the appropriate dosage of the binding molecule or cell may depend on the type of disease or disorder to be treated, the type of binding molecule, the severity and course of the disease or disorder, whether the therapeutic agent is administered for preventive or therapeutic purposes, previous therapy, the patient's clinical history and response to the agent, and the discretion of the attending physician. The compositions, molecules and cells may be suitably administered to the patient at one time or over a series of treatments.

[0457] For example, depending on the type and severity of the disease, dosages of antibodies may include about 10 μg / kg to 100 mg / kg or more. Multiple doses may be administered intermittently. An initial higher loading dose, followed by one or more lower doses may be administered. Wherein the pharmaceutical composition may comprise any one of the antibodies described herein, the pharmaceutical composition is administered at a dosage of about 10 ng / kg up to about 100 mg / kg of body weight of the individual or more per day, for example, at about 1 mg / kg / day to 10 mg / kg / day, depending upon the route of administration. Guidance as to particular dosages and methods of delivery is provided in the literature (see, e.g., U.S. Pat. Nos. 4,657,760; 5,206,344; and 5,225,212) .

[0458] In the context of genetically engineered cells containing the binding molecules, a subject may be administered the range of about one million to about 100 billion cells and / or that amount of cells per kilogram of body weight. Wherein the pharmaceutical composition may comprise any one of the engineered immune cells described herein, the pharmaceutical composition is administered at a dosage of at least about any of 104, 105, 106, 107, 108, or 109 cells / kg of body weight of the individual. Dosages may vary depending on attributes particular to the disease or disorder and / or patient and / or other treatments.

[0459] The pharmaceutical composition may be administered for a single time. The pharmaceutical composition may be administered for multiple times (such as any of 2, 3, 4, 5, 6, or more times) . The pharmaceutical composition may be administered once or multiple times during a dosing cycle. A dosing cycle can be, e.g., 1, 2, 3, 4, 5 or more week (s) , or 1, 2, 3, 4, 5, or more month (s) . The optimal dosage and treatment regime for a particular patient can be determined by one skilled in the art of medicine by monitoring the patient for signs of disease and adjusting the treatment accordingly. Once the cells are administered to a mammal (e.g., a human) , the biological activity of the engineered cell populations and / or antibodies may be measured by any of a number of known methods. Parameters to assess include specific binding of an engineered or natural T cell or other immune cell to antigen, in vivo, e.g., by imaging, or ex vivo, e.g., by ELISA or flow cytometry. The ability of the engineered cells to destroy target cells can be measured using any suitable method known in the art, such as cytotoxicity assays described in, for example, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7) : 689-702 (2009) , and Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1) : 25-40 (2004) . The biological activity of the cells also can be measured by assaying expression and / or secretion of certain cytokines, such as CD107a, IFNγ, IL-2, and TNF. In some aspects, the biological activity is measured by assessing clinical outcome, such as reduction in tumor burden or load.

[0460] In another aspect, provided herein is a method for treating a disease or disorder in a subject comprising administering to the subject an anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof, such as an anti-CD19 scFv, as described above, including, e.g., those comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-19, and 115; or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. The disease or disorder may be a CD19 associated disease or disorder.

[0461] In another aspect, provided herein is a method for treating a disease or disorder in a subject comprising administering to the subject an engineered immune cell expressing a CAR (anti-CD19 CAR) provided herein, including, e.g., those comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 22-23, 25-29, 52-65, 116, and 117; or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. The disease or disorder may be a B cell associated disease or disorder and / or CD19 associated disease or disorder. The disease or disorder may be a cancer. The disease or disorder may be a B cell malignancy. The B cell malignancy may be a B cell leukemia or B cell lymphoma. The disease or disorder may be selected from a group consisting of marginal zone lymphoma (e.g., splenic marginal zone lymphoma) , diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , primary central nervous system (CNS) lymphoma, primary mediastinal B cell lymphoma (PMBL) , small lymphocytic lymphoma (SLL) , B cell prolymphocytic leukemia (B-PLL) , follicular lymphoma (FL) , burkitt lymphoma, primary intraocular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , acute lymphoblastic leukemia (ALL) , hairy cell leukemia (HCL) , precursor B lymphoblastic leukemia, non-hodgkin lymphoma (NHL) , high-grade B-cell lymphoma (HGBL) , and multiple myeloma (MM) . The disease or disorder may be an autoimmune disease. The disease or disorder may be an autoimmune disease (e.g., a humoral immunity-mediated autoimmune disease) associated with CD19. The autoimmune disease may be associated with inappropriate or enhanced B cell numbers and / or activation. The autoimmune disease may be systemic lupus erythematosus (SLE) , multiple sclerosis, N-methyl-d-aspartate receptor (NMDAR) encephalitis, myasthenia gravis, rheumatoid arthritis, myelin oligodendrocyte glycoprotein spectrum disorder (MOGSD) , neuromyelitis optica spectrum disorder (NMOSD) , and any combination thereof.

[0462] In another aspect, provided herein is a method for treating a disease or disorder in a subject comprising administering to the subject an engineered immune cell expressing a CAR (anti-CD19×BCMA tandem CAR) provided herein, including, e.g., those comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 85-101; or an amino acid sequence having a substitution, deletion and / or addition of one or several amino acids (e.g., a substitution, deletion and / or addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids) as compared thereto; or an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more sequence identity thereto. The disease or disorder may be a B cell associated disease or disorder. The disease or disorder may be CD19 and / or BCMA associated disease or disorder. The disease or disorder may be a cancer. The disease or disorder may be a B cell malignancy. The B cell malignancy may be a B cell leukemia or B cell lymphoma. The disease or disorder may be selected from a group consisting of marginal zone lymphoma (e.g., splenic marginal zone lymphoma) , diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , primary central nervous system (CNS) lymphoma, primary mediastinal B cell lymphoma (PMBL) , small lymphocytic lymphoma (SLL) , B cell prolymphocytic leukemia (B-PLL) , follicular lymphoma (FL) , burkitt lymphoma, primary intraocular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , acute lymphoblastic leukemia (ALL) , hairy cell leukemia (HCL) , precursor B lymphoblastic leukemia, non-hodgkin lymphoma (NHL) , high-grade B-cell lymphoma (HGBL) , multiple myeloma (MM) , acute myeloid leukemia (AML) , B-cell acute lymphoid leukemia (BALL) , T-cell acute lymphoid leukemia (TALL) , chronic myelogenous leukemia (CML) , myelodysplastic syndrome (MDS) , myeloproliferative neoplasms (MPNs) , blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN) , plasmacytomas and any combination thereof. The disease or disorder may be an autoimmune disease. The disease or disorder may be an autoimmune disease (e.g., a humoral immunity-mediated autoimmune disease) associated with CD19 and / or BCMA. The autoimmune disease may be associated with inappropriate or enhanced B cell numbers and / or activation. The autoimmune disease may be systemic lupus erythematosus (SLE) , multiple sclerosis, N-methyl-d-aspartate receptor (NMDAR) encephalitis, myasthenia gravis, rheumatoid arthritis, myelin oligodendrocyte glycoprotein spectrum disorder (MOGSD) , neuromyelitis optica spectrum disorder (NMOSD) , and any combination thereof.

[0463] 5.10 Sequences

[0464] The sequences involved in the present disclosure are shown in Tables A-D below, in which the CDRs are each determined according to the AbM numbering system.

[0465] Table A

[0466] Table B

[0467] Table C Table D

[0468] 6.EXAMPLES

[0469] The embodiments of the present disclosure will be described in detail below with reference to the examples. Those skilled in the art will appreciate that the following examples are only for illustrating the present disclosure, and should not be construed as limitations to the scope of the present disclosure. Examples where the specific technologies or conditions are not specified are performed according to the technologies or conditions described in the publications of the art (e.g., see, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, authored by J. Sambrook et al., and translated by Huang Peitang et al., third edition, Science Press) or according to the package insert. Reagents or instruments used are commercially available conventional products if the manufacturers thereof are not specified.

[0470] Example 1: Humanization of anti-human CD19 murine antibody FMC63

[0471] FMC63 is a murine IgG2a, kappa antibody isolated from mice immunized with the human prolymphocytic leukaemia cell line JVM3 (Zola H. et al, . Immunology and cell biology 69.6 (1991) : 411-422. ) , and for which variable regions are known and publicly available (Heavy chain variable region, NCBI accession number, CAA74659 (SEQ ID NO: 2);Light chain variable region, NCBI accession number, CAA74660 (SEQ ID NO: 3) ) .

[0472] Humanization of anti-human CD19 murine antibody FMC63 was performed using CDR grafting method (see, e.g., U.S. Pat. No. 5,225,539) . The VH and VL sequences of murine FMC63 were BLASTed against NCBI human germline V gene database so human VH and VL germline sequences with the highest identity to murine FMC63 (i.e. human acceptor) were identified. In the CDR grafting approach, CDRs of the human acceptors were replaced by those of murine FMC63, which makes the straight-graft sequences. Straight-graft antibody usually loses binding activity, which needs to be restored by replacing the framework residues that are critical for the activity of the antibody with murine residues. Germlining was also carried out so that more murine CDR residues were changed to their human germline counterparts, thus further increases the humanness of FMC63. A series of humanized variants were designed using this method (SEQ ID NOs: 13-19, and 115) .

[0473] The parental and humanized VH and VL sequences were used to construct heavy and light chains. Heavy chain and light chain plasmids were prepared and used for IgG production by Free-style 293 cells. Crude IgG proteins secreted to the medium were subjected to SPR affinity measurement as follows: Antibodies were captured onto the sensorchip pre-coated with goat-anti-human pAb (Jackson ImmunoResearch, Cat. #109-005-098) through the interaction between polyclonal antibody and human Fc. Increasing concentrations (ranging from 20 nM to 1280 nM) of human CD19 (ACROBiosystems, Cat. #CD9-H52H2) were injected over the sensorchip surface, and were allowed to bind the captured antibody for 100 s followed by injection of the running buffer to allow dissociation of the complex for 900 s. After each cycle the surfaces were regenerated by an injection of 50 mM HCl. Langmuir model, which describes a simple 1: 1 interaction where one ligand molecule interacts with one analyte, was used to fit the experimental data to obtain the kinetic values of the on-rate (ka) and off-rate (kd) , which were used to calculate the equilibrium dissociation constant (KD) . According to the result summarized in Table 1, all antibodies retained their binding capability to human CD19 with improved humanness after humanization.

[0474] Table 1. Affinity and humanness of humanized antibodies

[0475] Example 2: Plasmid generation of monospecific humanized CARs

[0476] To generate CAR, the murine FMC63 antibody or the humanized version of the murine FMC63 antibody fragment was fused with additional protein sequences yielding a full CAR comprising a CD8α signal peptide (SEQ ID NO: 4) , murine FMC63 antibody (sequence provided in SEQ ID NO: 1) or a humanized version of the murine FMC63 antibody (one sequence provided in SEQ ID NOs: 13-14) , a CD8α hinge domain (SEQ ID NO: 5) , a CD8α transmembrane domain (SEQ ID NO: 8) , a CD137 cytoplasmic domain (SEQ ID NO: 9) and a CD3ζ cytoplasmic domain (SEQ ID NO: 10) . The full CAR sequences were listed as SEQ ID NOs: 21-23.

[0477] The CAR fragment was then cloned into lentiviral vectors to create a full-length CAR construct in a single coding frame, using human EF1 alpha promoter for expression. The lentiviral vector was modified using pLVX-Puro (Clontech#632164) by replacing the original promoter with human elongation factor 1α promoter (hEF1α) and by removing the puromycin resistance gene with EcoRI and BamHI by GenScript. PLVX-EF1A was further subjected to the lentivirus packaging procedure as described above.

[0478] Example 3: Virus preparation and titer evaluation

[0479] Lentivirus packaging plasmid mixture including pMDLg / pRRE (Addgene#11251) , pRSV-Rev (Addgene#11253) , and pMD2. G (Addgene#11259) were pre-mixed with a PLVX-EF1A (including target system) vector at a pre-optimized ratio with polyetherimide (PEI) , mixed properly, and incubated at room temperature for 5 minutes. The transfection mix was added dropwise to 293-T cells and mixed gently. Transfected 293-T cells were incubated overnight at 37℃ and 5%CO2. Forty-eight hours post-transfection, supernatants were collected and centrifuged at 4℃, 500 g for 10 min to remove any cellular debris. Centrifuged supernatants were filtered through a 0.45 μm PES filter to concentrate the viral supernatants post ultracentrifugation. After centrifugation, the supernatants were carefully discarded and the virus pellets were rinsed with pre-chilled DPBS. The concentration of virus was measured. The virus was aliquoted and stored at -80℃. Viral titers were determined by functional transduction on a T cell line.

[0480] Example 4: Generation of CAR-T cells

[0481] T cells were isolated from healthy donor PBMCs (Sailybio) using CytoSinctTM CD4 Nanobeads (Genscript, L00863) and CytoSinctTM CD8 Nanobeads (Genscript, L00864) . Isolated T cells were cultured under TexMACS GMP (Miltenyi Biotec, 170-076-309) medium with 300IU / mL IL-2 (Jiangsu Jinsili Pharmaceutical, S10970055) and further activated by EnceedTM T cell Activation reagent (Genscript, L00899-1) . Using 5 μL of EnceedTM T cell Activation reagent for activation of 1×106 T cells in the 37℃, 5%CO2 incubator. 48 hours after initial activation, T cells were transduced with lentivirus expressing a CD19 targeting CAR at proper multiplicity of infection (MOI) in the presence of 8 μg / ml polybrene (SIGMA-ALDRICH, H9268-10G) . Additional IL-2 was supplemented to a final concentration of 300 IU / ml. Fresh medium was replaced 24 hours post lentiviral infection. Infected T cells were maintained under TexMACS GMP medium and 300 IU / ml IL-2 at a cell density between 5.0 × 105 to 1.0 × 106 cells / ml.

[0482] CAR expression was determined at 5-7 days post infection by a FITC labeled human CD19 protein (ACROBIOSYSTEM, CD9-HF2H2-200μg) via flow cytometry (Agilent, NovoCyte 3130) . As shown in table 2, the CAR positive rates of FMC63, hCAR01 and hCAR02 were all around 70%.

[0483] Table 2. The CAR positive rate of humanized CAR-T

[0484] Example 5: Characterization of CAR-T cells with humanized FMC63

[0485] Nalm6 (ATCC CRL-3273) is a lymphocyte-like cell line derived from the peripheral blood of a 19-year-old male patient with ALL expressing CD19. The cell lines were engineered to express firefly luciferase with the techniques known in the art. CD19 CAR-T cells and target cells were mixed with an E: T ratio of 3: 1, cultured in 384-well plates for 24 hours. To assay the cytotoxicity of CAR-T on tumor cells, One-Lite Luciferase Assay System reagent mix (Vazyme, DD1203-03) were prepared according to manufacturer's protocol and added to the co-cultured cells to detect the remaining luciferase activity in the well. Since luciferase is expressed only in tumor cells, the remaining luciferase activity in the well correlates directly to the number of viable target cells in the well. The maximum luciferase activity was obtained by adding culture media to target cells in the absence of effector cells. The minimum luciferase activity was determined by adding Triton X-100 at a final concentration of 1%at the time when the cytotoxicity assays were initiated. The specific cytotoxicity was calculated by the formula: Specific Cytotoxicity %=100%× (1- (RLUSample-RLUMin)  /  (RLUUnT-RLUMin) ) .

[0486] As shown in FIG. 1, in contrast to little cytotoxicity of UnT against tumor cells, specific cytotoxicity was observed in CAR-T cell groups against CD19-positive Nalm6 cells. Notably, compared to murine FMC63 CAR-T, humanized FMC63 CAR-T (hCAR01 and hCAR02) maintained comparable potency towards Nalm6. Thus, the cytolytic activity facilitated the selection of humanized FMC63 version.

[0487] Example 6: Persistent cytotoxicity assayed by repetitive TAA stimulations

[0488] Persistence of CAR-T cells was evaluated in a repetitive tumor challenge assay. In brief, 1 ×105 CAR+ T cells were co-cultured with 3 × 105 Nalm6 cells in a 24 well. Three days later, cells were harvested to determine the relative ratio of viable T cell and tumor cell, CAR+ T was quantified and re-plated with fresh Nalm6 cells at a specific ratio for the next round, details were listed in FIG. 2.

[0489] Analysis of tumor cell killing as reflected remaining percentage of T cells followed by calculating of T cell proliferation highlights the top humanized candidate. The more detailed description is below. In FIG. 2A and FIG. 2B, hCAR01 and hCAR02 had higher CD3 T cells percentage and expansion than FMC63.

[0490] Example 7: In vivo efficacy of CD19 CAR-T cells

[0491] Nalm6 (ATCC CRL-3273) is a lymphocyte-like cell line derived from the peripheral blood of a 19-year-old male patient with ALL expressing CD19. The cell lines were engineered to express firefly luciferase with the techniques known in the art. This engineered target cell was then engineered to express CD20 and further knock-out B2M, creating a Nalm6-CD20-luc-B2M KO cell line. The in vivo tumor suppression effects of CAR-T cells were evaluated in a tumor xenograft NCG mouse model. Mice in a blank group only received PBS. To create the tumor xenograft, NCG mice (NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22 / NjuCrl) of all other groups were injected intravenously with 0.3 million Nalm6-CD20-luc-B2M KO cells. A single dose of CAR T cells (1.5 × 106) or a corresponding equal number of untransduced T (UnT) cells was administered intravenously to tumor engrafted mice 7 days after tumor inoculation. Mice in the Vehicle group were treated with HBSS (- / -) . Tumor progression was monitored on day 0, 4, 9, 14 after CAR-T infusion, using in vivo bioluminescence imaging (BLI) . As shown in Figure 3, tumor regression of hCAR01 and hCAR02 CAR T cells was more pronounced than UnT cells and FMC63 CAR T cells, the mice treated with tested CAR showed more pronounced tumor regression. The data highlighted the superiority of humanized CD19 CAR T cells in tumor regression and protection of mice from disease progression.

[0492] Example 8: Preparation of CAR-NK cells expressing CD19 scFv CAR and membrane bound IL-15

[0493] CAR-NK cells expressing engineered CD19 CAR and membrane bound IL-15 (mbIL15) are constructed and tested.

[0494] 1.Construction of chimeric antigen receptors (CARs)

[0495] To construct CD19 CAR, a CAR backbone sequence encoding a CAR backbone polypeptide comprising from the N-terminus to the C-terminus: a CD8α signal peptide (SEQ ID NO: 4) , an antigen binding domain having an anti-CD19 scFv (e.g., humanized anti-CD19 scFv, any one of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 20; murine FMC63 antibody, SEQ ID NO: 1) , a CD8α hinge domain (SEQ ID NO: 7) , a CD8α transmembrane domain (SEQ ID NO: 8) , a CD137 co-stimulatory signaling domain (SEQ ID NO: 9) , a CD3ζ activation domain (SEQ ID NO: 10) a DAP12 activation domain (SEQ ID NO: 11) . FMC63 and H-90 (from EP3773918A1) were introduced to design controls. Additionally, each of these CD19 CARs and a membrane bound IL-15 (mbIL15, CD8αSP-IL-15-CD8α Hinge &TM, SEQ ID NO: 12) was chemically synthesized and cloned into a pre-modified retroviral vector, downstream and operably linked to a constitutive hEF1α promoter for in vitro transcription. Transient retroviral supernatants were produced refer to below literature: Blood (2006) 108 (12) : 3890–3897. Table 2 shows the structure of each mb-IL15 armored anti-CD19 CAR. The exemplified engineered CD19 CARs were named as 19-F CAR, H-78 CAR, H-80 CAR, H-84 CAR, H-87 CAR, H-88 CAR and H-90 CAR (see Table 3) , respectively.

[0496] 2.CAR-NK cell preparation

[0497] NK expansion:

[0498] Human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were purchased from HemaCare Corporation. PBMCs were thawed and co-cultured with K562 cells (chronic myelogenous leukemia (CML) cell line, lacking surface expression of HLA class I and II molecules) genetically modified to express membrane bound IL-15 and 4-1BB ligand (K562-mb15-41BBL) , which could stimulate cytotoxic NK cells generation. See Fujisaki et al., Cancer Res. 2009; 69 (9) : 4010-7. Cultures were expanded using stem cell growth medium (SCGM; Cell Genix, Freiburg) supplemented with 200 IU / mL of IL-2 (R&D Cat#MAB202-SP) . After 7 days of culture, cells were collected and purified using anti-CD3 dynabeads (Miltenyi, Cat#11365D) to remove T cells. Remaining NK cells were then cultured in SCGM supplemented with 200 IU / mL of IL-2.

[0499] Virus Transduction of NK Cells:

[0500] NK cells were collected and suspended at a concentration of 0.25×l06 cells in 2 mL of RPMI-1640 medium. The NK cells were then incubated with retrovirus supernatant obtained from section 1 above in a 37℃ incubator overnight. Supernatant volume is determined on a per-batch basis, and NK cells are treated with a multiplicity of infection (MOI) of about 1. Following overnight incubation, cells were gently centrifuged and replaced with the fresh SCGM containing 200 IU / mL of IL-2.

[0501] Transduced NK cells were maintained in SCGM with 200 IU / mL of IL-2 and used for experiments after 10 to 20 days of expansion in culture. The transduced CAR-NK cells were named as H-78 CAR-NK cells, H-80 CAR-NK cells, H-84 CAR-NK cells, H-87 CAR-NK cells, H-88 CAR-NK cells, H-90 CAR-NK cells and 19-F CAR-NK cell. H-90 CAR-NK cells and 19-F CAR-NK cells serve as controls.

[0502] Example 9: In vitro screening of different CD19 binder CAR-NK on CD19 positive cell line

[0503] CD19 CAR-NK cells with membrane-bound IL-15 were generated using the method described in Example 8. The different CD19 CAR-NK cells were tested by in vitro long-term cell killing assay. CD19 positive B cell precursor leukemia tumor cell line NALM-6 (#ATCC CRL-3273TM) was used as target cells. Before the experiment, the CAR%of each CAR-NK cells in each group was determined by flow cytometry. CAR-NK cells were normalized for CAR%by using un-transduced NK cells. CD19 CAR-NK cell and NALM-6 cells were incubated in 24-w plate at a E: T ratio of 1: 2, after 20 h co-culture, cells from each well were collected for further analysis by flow cytometry (R1) . After 24 h coculture, additional tumor cells were added into CAR-NK cells to start the 2nd repeat antigen stimulation (R2) . Same steps were performed in the following experiment by treating different CD19 CAR-NK cells with the different amount of tumor cells. After 20 h of each round of tumor stimulation, cells were collected for further analysis by flow cytometry.

[0504] FIG. 4 shows in vitro long-term killing results of H-78 CAR-NK cells, H-80 CAR-NK cells, H-84 CAR-NK cells, H-87 CAR-NK cells, H-88 CAR-NK cells, H-90 CAR-NK cells and 19-F CAR-NK cell on NALM-6 cells. CD19 CAR-NK cells and NALM-6 cells were plated in 24-w plate at ET ratio of 1: 2 at day 0 (2x antigen stimulation for round 1, R1) , then increase the tumor cell amount to 3x, 4x, 8x, 16x, 64x and 64x antigen stimulation for round 2 (R2, day 1) , round 3 (R3, day 2) , round 4 (R4, day 3) , round 5 (R5, day 4) , round 6 (R6, day 5) , round 7 (R7, day 6) and round 8 (R8, day 8) , respectively. After 20 h after each stimulation, cells were collected for further analysis by flow cytometry. As shown in FIG. 4, H-80, H-84 and H-88 CAR-NK cell showed better anti-tumor efficacy than original FMC63 binder (19-F) CAR-NK cells and H-90 CAR-NK.

[0505] Example 10: In vitro screening of different CD19 binder CAR-NK on primary B cells

[0506] CD19 CAR-NK cells with membrane-bound IL-15 were generated using the method described in Example 8. The cytotoxicity of different CD19 CAR-NK cells on primary SLE B cells was tested by in vitro short-term cell killing assay. Before the experiment, the CAR%of each CAR-NK cell in each group was determined by flow cytometry. CAR-NK cells were normalized for CAR%by using un-transduced NK. CD19 CAR-NK cell and SLE PBMCs were incubated in 24-w plate at a E: T ratio of 1: 1, 0.2: 1 and, 0.04: 1, respectively. After 4 hours and 22 hours of co-culture, cells from each well were collected for further analysis by flow cytometry.

[0507] FIG. 5 shows in vitro killing results of H-80 CAR-NK cells, H-84 CAR-NK cells, H-87 CAR-NK cells, H-88 CAR-NK cells, and 19-F CAR-NK cells on SLE B cells (CD3-CD56-CD20+ B cells was used as target cells with 7-AAD analysis) . As shown in FIG. 5A and FIG. 5B, H-80 and H-84 CAR-NK cells showed better anti-tumor efficacy than original FMC63 binder (19-F) CAR-NK cells, H-88 CAR-NK cell showed comparable anti-tumor efficacy to original FMC63 binder (19-F) CAR-NK cells.

[0508] Example 11: In vivo evaluation of different CD19 binder CAR-NK cells

[0509] To create the tumor xenograft, NCG mice were injected intravenously with NALM-6-Luc cells (CD19 positive human B cell precursor leukemia cell line NALM-6 (#ATCC CRL-3273TM) transduced with Luciferase) at 3×106 cells / mouse. Six days later, tumor engrafted NCG mice (NALM-6-Luc model) were treated with the un-transduced NK cells (Un-NK) , 19-F CAR-NK cells, H-78 CAR-NK cells, H-80 CAR-NK cells, H-84 CAR-NK cells, H-87 CAR-NK cells, H-88 CAR-NK cells and H-90 CAR-NK cells, respectively. Each mouse was infused with 1 million of the frozen CAR NK cells at day 0, and tumor size was monitored using in vivo bioluminescence imaging (BLI, PerkinElmer   Lumina LT In Vivo Imaging System) following NK cell administration, tumor flux corresponds to tumor size. Mice in the Un-NK group were treated with Un-NK. Mice not inoculated with NALM-6-Luc cells served as blank control.

[0510] As shown in FIG. 6A and 6B, mice receiving H-80, H-88, H-84, and H-78 CAR-NK cells showed better anti-tumor efficacy than original FMC63 binder (19-F) CAR-NK cells and H-90 CAR-NK cells. Mice receiving H-87 CAR-NK cells showed comparable anti-tumor efficacy to original FMC63 binder (19-F) CAR-NK cells and H-90 CAR-NK cells.

[0511] Example 12: Plasmid generation of BCMA / CD19 tandem CARs

[0512] Tandem CARs for dual targeting of BCMA and CD19 tumor antigens were developed in order to overcome tumor antigen escape. VHH binders targeting BCMA and humanized scFv binders targeting CD19 were connected in tandem by a flexible linker to generate antigen binding domains, then, the antigen binding domains were fused with additional protein sequences yielding a full CAR comprising a CD8α signal peptide (SEQ ID NO: 4) , a BCMA and CD19 dual binder (one sequence provided in SEQ ID NO: 78-81) , a CD8α hinge (SEQ ID NO: 5) and transmembrane domain (SEQ ID NO: 8) or an extended CD8α hinge (SEQ ID NO: 109) and transmembrane domain (SEQ ID NO: 8) , a CD137 cytoplasmic domain (SEQ ID NO: 9) and a CD3ζ cytoplasmic domain (SEQ ID NO: 10) . The full CAR sequences were listed as SEQ ID NO: 95-98. The full CAR sequence of tandem CAR-T benchmark GC012F was listed as SEQ ID NO: 102.

[0513] The CAR fragment was then cloned into lentiviral vectors to create a full-length CAR construct in a single coding frame, using human EF1 alpha promoter for expression. The lentiviral vector was modified using pLVX-Puro (Clontech#632164) by replacing the original promoter with human elongation factor 1α promoter (hEF1α) and by removing the puromycin resistance gene with EcoRI and BamHI by GenScript. PLVX-EF1A was further subjected to the lentivirus packaging procedure as described above.

[0514] Example 13: Generation of CAR-T cells

[0515] Virus preparation and titer evaluation were performed using the method described in Example 3. CAR-T cells were generated using the method described in Example 4.

[0516] CAR expression was determined at 5-7 days post infection by a Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody (BioSWanLab, Cat No. 200102) and FITC-Labeled Human BCMA (acrobiosystems, BCA-HF254) via flow cytometry. As shown in table 4, the CAR positive rates of DCAR-01, DCAR-02, DCAR-03, DCAR-04, GC012F, hCAR003, hCAR01 and hCAR02 were all above 50%.

[0517] Table 4. The CAR positive rate of humanized CAR-T

[0518] Example 14: Characterization of CD19 binder, BCMA binder and BCMA / CD19 binder in dual targeting CAR-T cells

[0519] Nalm6 (ATCC CRL-3273) is a lymphocyte-like cell line derived from the peripheral blood of a 19-year-old male patient with ALL expressing CD19. The cell lines were engineered to express firefly luciferase with the techniques known in the art. Z138 (ATCC CRL-3001) is a lymphoblast cell line isolated in 1990 from a White male who initially was diagnosed with chronic lymphocytic leukemia expressing CD19 and BCMA. The cell lines were engineered to express firefly luciferase with the techniques known in the art. This engineered target cell was then engineered to knock-out BCMA, creating a Z138-luc-BCMA-KO cell line. In addition, another Z138-luc cell line was engineered to knock-out CD19, creating a Z138-luc-CD19-KO cell line. RPMI8226 (ATCC#CCL-155) are myeloma cells with BCMA antigen expression. The cell lines were engineered to express firefly luciferase with the techniques known in the art. Dual targeting CAR-T cells and target cells were mixed with an E: T ratio of 1: 1, cultured in 384-well plates for 24 hours. To assay the cytotoxicity of CAR-T on tumor cells, One-Lite Luciferase Assay System reagent mix (Vazyme, DD1203-03) were prepared according to manufacturer's protocol and added to the co-cultured cells to detect the remaining luciferase activity in the well. Since luciferase is expressed only in tumor cells, the remaining luciferase activity in the well correlates directly to the number of viable target cells in the well. The maximum luciferase activity was obtained by adding culture media to target cells in the absence of effector cells. The minimum luciferase activity was determined by adding Triton X-100 at a final concentration of 1%at the time when the cytotoxicity assays were initiated. The specific cytotoxicity was calculated by the formula: Specific Cytotoxicity %=100%× (1- (RLUSample-RLUMin)  /  (RLUUnT-RLUMin) ) .

[0520] As shown in FIG. 7B and FIG. 7E, in contrast to little cytotoxicity of UnT and hCAR003 against tumor cells, specific cytotoxicity was observed in tandem CAR-T cell groups against CD19-positive Nalm6 cells and Z138-luc-BCMA-KO cells. Notably, compared to hCAR01, hCAR02 and benchmark GC012F, BCMA / CD19 tandem CAR-T (DCAR-01, DCAR-02, DCAR-03, and DCAR-04) maintained comparable potency towards Nalm6 cells and Z138-luc-BCMA-KO cells. Thus, the cytolytic activity facilitated the selection of BCMA / CD19 tandem CAR-T version.

[0521] As shown in FIG. 7A and FIG. 7D, in contrast to little cytotoxicity of UnT, hCAR01 and hCAR02 against tumor cells, specific cytotoxicity was observed in tandem CAR-T cell groups against BCMA-positive RPMI8226 cells and Z138-luc-CD19-KO cells. Notably, compared to hCAR003 and benchmark GC012F, BCMA / CD19 tandem CAR-T (DCAR-01, DCAR-02, DCAR-03, and DCAR-04) maintained comparable potency towards RPMI8226 cells and Z138-luc-CD19-KO cells. Thus, the cytolytic activity facilitated the selection of BCMA / CD19 tandem CAR-T version.

[0522] As shown in FIG. 7C, in contrast to little cytotoxicity of UnT against tumor cells, specific cytotoxicity was observed in tandem CAR-T cell groups against Z138-luc cells. Notably, compared to hCAR01, hCAR02, hCAR003 and benchmark GC012F, BCMA / CD19 tandem CAR-T (DCAR-01, DCAR-02, DCAR-03, and DCAR-04) maintained comparable potency towards Z138 cells. Thus, the cytolytic activity facilitated the selection of BCMA / CD19 tandem CAR-T version.

[0523] Example 15: CD19 Sensitivity killing assay

[0524] In vitro transcribed RNA (IVT-RNA) was prepared as described, plasmids were lineared by restriction enzyme digestions at site downstream the ORF. IVT-RNA is prepared using the mMESSAGE mMACHINE T7 Kit (Invitrogen, Cat No. AM1344) and Poly (A) Tailing Kit (Invitrogen, Cat No. AM1350) , and further purified by the RNeasy Mini Kit (Invitrogen, Cat No. 74104) .

[0525] To generate CHO-CD19. Luc cells with escalating CD19 expression levels, different amounts of CD19 mRNA were delivered to CHO. Luc cells by electroporation. CD19 expression level was determined by APC anti-human CD19 (Biolegend, Cat No. 302212) .

[0526] Tandem CAR-T cells and target cells were mixed with an E: T ratio of 3: 1, cultured in 384-well plates for 24 hours. To assay the cytotoxicity of CAR-T on tumor cells, One-Lite Luciferase Assay System reagent mix (Vazyme, DD1203-03) were prepared according to manufacturer's protocol and added to the co-cultured cells to detect the remaining luciferase activity in the well. The remaining live target cells indicated by active luciferase activities were read as Relative light unit (RLU) in microplate reader (Tecan Spark 10M) . The cytotoxicity of CAR-T on target cells were calculated with formula as Cytotoxicity = [1-(RLUSample-RLUMin)  /  (RLUUnT-RLUMin) ] .

[0527] As shown in FIG. 8A, CHO-CD19-Luc had a gradient CD19 expression on cell surface. Cells transfected with 20μg CD19 mRNA showed a high CD19 expression level, those transfected with 1.25μg CD19 mRNA showed a medium CD19 expression level, and cells transfected with 0.078μg CD19 mRNA showed a low CD19 expression level. The cytotoxicity of CAR-T cells against CHO-CD19-Luc cells is positively correlated with the CD19 expression on the surface of CHO-CD19-Luc cells. Compared to benchmark GC012F, all of the tandem CAR-T cells exhibited better potency against CHO-Luc cells with high to low CD19 expression levels (FIG. 8A) .

[0528] Example 16: BCMA Sensitivity killing assay

[0529] In vitro transcribed RNA (IVT-RNA) was prepared as described, plasmids were lineared by restriction enzyme digestions at site downstream the ORF. IVT-RNA is prepared using the mMESSAGE mMACHINE T7 Kit (Invitrogen, Cat No. AM1344) and Poly (A) Tailing Kit (Invitrogen, Cat No. AM1350) , and further purified by the RNeasy Mini Kit (Invitrogen, Cat No. 74104) .

[0530] To generate CHO-BCMA. Luc cells with escalating BCMA expression levels, different amounts of BCMA mRNA were delivered to CHO. Luc cells by electroporation. BCMA expression level was determined by anti-CD269-PE (Biolegend, Cat No. 357504) .

[0531] Tandem CAR-T cells and target cells were mixed with an E: T ratio of 3: 1, cultured in 384-well plates for 24 hours. To assay the cytotoxicity of CAR-T on tumor cells, One-Lite Luciferase Assay System reagent mix (Vazyme, DD1203-03) were prepared according to manufacturer's protocol and added to the co-cultured cells to detect the remaining luciferase activity in the well. The remaining live target cells indicated by active luciferase activities were read as Relative light unit (RLU) in microplate reader (Tecan Spark 10M) . The cytotoxicity of CAR-T on target cells were calculated with formula as Cytotoxicity = [1-(RLUSample-RLUMin)  /  (RLUUnT-RLUMin) ] × 100%.

[0532] As shown in FIG. 8B, CHO-BCMA-Luc had a gradient BCMA expression on cell surface. Cells transfected with 20μg BCMA mRNA showed a high BCMA expression level, those transfected with 2.5μg BCMA mRNA showed a medium BCMA expression level, and cells transfected with 0.3125μg BCMA mRNA showed a low BCMA expression level. The cytotoxicity of CAR-T cells against CHO-BCMA-Luc cells is positively correlated with the BCMA expression on the surface of CHO-BCMA-Luc cells. Compared to benchmark GC012F, all of the tandem CAR-T cells exhibited better potency against BCMA expressed CHO-Luc cells with high to low BCMA expression levels (FIG. 8B) .

[0533] Example 17: In vivo evaluation of tandem CAR-T in Z138-BCMA KO xenograft model

[0534] The in vivo tumor suppression effects of CAR-T cells were evaluated in a tumor xenograft NCG mouse model. Mice in a blank group only received PBS. To create the tumor xenograft, NCG mice (NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22 / NjuCrl) of all other groups were injected intravenously with 0.3 million Z138-luc-BCMA-KO cells. A single dose of CAR T cells (1.0 × 106) or a corresponding equal number of untransduced T (UnT) cells was administered intravenously to tumor engrafted mice 7 days after tumor inoculation. Mice in the Vehicle group were treated with HBSS (- / -) . Tumor progression was monitored on day0, 4, 9, 15, 23, 29 after CAR-T infusion, using in vivo bioluminescence imaging (BLI) . As shown in Figure. 9A, tumor regression of all tandem CAR T candidates was more pronounced than UnT cells and benchmark GC012F cells, the mice treated with tested CAR showed more pronounced tumor regression. The data highlighted the superiority of tandem CAR T candidates in tumor regression and protection of mice from disease progression.

[0535] Example 18: In vivo evaluation of tandem CAR-T in RPMI8226 xenograft model

[0536] The in vivo tumor suppression effects of CAR-T cells were evaluated in a tumor xenograft NCG mouse model. Mice in a blank group only received PBS. To create the tumor xenograft, NCG mice (NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22 / NjuCrl) of all other groups were injected intravenously with 5 million RPMI8226 cells. A single dose of CAR T cells (0.5 ×106) or a corresponding equal number of untransduced T (UnT) cells was administered intravenously to tumor engrafted mice 14 days after tumor inoculation. Tumor progression was monitored on day0, 5, 9, 15, 22 after CAR-T infusion, using in vivo bioluminescence imaging (BLI) . As shown in Figure. 9B, tumor regression of all tandem CAR T candidates was more pronounced than UnT cells and benchmark GC012F cells, the mice treated with tested CAR showed more pronounced tumor regression. The data highlighted the superiority of tandem CAR T candidates in tumor regression and protection of mice from disease progression.

[0537] Example 19: In vitro evaluation of different CD19 / BCMA dual targeting binder CAR-NK cells on different tumor cells

[0538] CD19 / BCMA dual targeting CAR-NK cells armored with membrane-bound IL-15 were generated using the method described in Example 8. Table 5 shows the structure of each mb-IL15 armored CD19 / BCMA tandem CAR. The different CD19 / BCMA tandem CAR-NK cells were tested by in vitro cell killing assay. BCMA knockout CD19 positive lymphoblast tumor cell line Z-138 (#ATCC CRL-3001TM) , BCMA positive B cell plasmacytoma myeloma tumor cell line NCI-H929 (#ATCC CRL-3580TM) , and BCMA knockout CD19 positive B cell precursor leukemia tumor cell line NALM-6 (#ATCC CRL-3273TM) were used as target cells. Before the experiment, the CAR%of each CAR-NK cells in each group was determined by flow cytometry. CAR-NK cells were normalized for CAR%by using un-transduced NK cells. CAR-NK cells and target cells were incubated in 24-w plate at a E: T ratio of 12: 1, respectively. After 24 h coculture, additional tumor cells were added into CAR-NK cells to start the 2nd repeat antigen stimulation. After 24 h coculture for 2nd tumor stimulation, cells were collected for tumor lysis analysis by flow cytometry.

[0539] FIG. 10A-10C show in vitro tumor lysis results of Un-transduced NK cells (UnNK) , FMC63 binder CAR-NK cells (19-F-1 CAR) , hBCMA / hCD19-G, hBCMA / hCD19-80, hBCMA / hCD19-88, and loop hBCMA / hCD19-80 on Z-138BCMA KO, NCI-H929, and NALM-6BCMA KO tumor cells, respectively. As shown in FIG. 10A-10C, hBCMA / hCD19-80 and hBCMA / hCD19-88 CAR-NK cell showed better anti-tumor efficacy than original FMC63 binder CAR (19-F-1 CAR) -NK cells and hBCMA / hCD19-G CAR-NK cells.

[0540] Example 20: In vivo evaluation of different CD19 / BCMA binder CAR-NK cells

[0541] To create the tumor xenograft, NCG mice were injected intravenously with NCI-H929-Luc (BCMA positive B cell plasmacytoma myeloma tumor cell line NCI-H929 (#ATCC CRL-3580TM) transduced with Luciferase) at 2×106 cells / mouse. After eight days, the mice were injected intravenously with NALM-6-Luc cells (CD19 positive human B cell precursor leukemia cell line NALM-6 (#ATCC CRL-3273TM) transduced with Luciferase) at 0.3×106 cells / mouse. Four days later, tumor engrafted NCG mice (NALM-6-Luc mix with NCI-H929-Luc model) were treated with HBSS (- / -) , the un-transduced NK cells (UnNK) , 19-F-1 CAR-NK cells, hBCMA / hCD19-88 CAR-NK cells and unarmored hBCMA / hCD19-88 CAR-NK cells, respectively. Each mouse was infused with 2 million of the frozen CAR NK cells at day 0, and tumor size was monitored using in vivo bioluminescence imaging (BLI, PerkinElmer   Lumina LT In Vivo Imaging System) following NK cell administration, tumor flux corresponds to tumor size. Mice not inoculated with tumor cells served as blank control.

[0542] As shown in FIG. 11, mice receiving hBCMA / hCD19-88 CAR-NK cells showed better anti-tumor efficacy than original FMC63 binder CAR (19-F-1 CAR) -NK cells and unarmored hBCMA / hCD19-88 CAR-NK cells.

[0543] Example 21: Luciferase based cytotoxicity of γδT cells expressing humanized anti-FMC63 scFv-based CAR against tumor cells

[0544] Raji (ATCC_CCL-86_63905419) cell lines were genetically engineered and stably transduced with the reporter gene for cell cytotoxicity -firefly luciferase. To generate CAR, the murine FMC63 antibody or the humanized version of the murine FMC63 antibody fragment was fused with additional protein sequences yielding a full CAR comprising a CD8α signal peptide (SEQ ID NO: 4) , murine FMC63 antibody (sequence provided in SEQ ID NO: 1) or a humanized version of the murine FMC63 antibody (SEQ ID NO: 115) , a CD8α hinge domain (SEQ ID NO: 6) , a CD8α transmembrane domain (SEQ ID NO: 8) , a CD137 cytoplasmic domain (SEQ ID NO: 9) and a CD3ζ cytoplasmic domain (SEQ ID NO: 10) . Both parental and humanized anti-FMC63 scFv-based CAR-γδT cells and untransduced γδT cells (UnT) were mixed with Raji-Luc target cells at E: T ratios of 10: 1, 3: 1 and 1: 1, and co-cultured in 96-well plates for 24 hours. Parental FMC63 CAR-T cells and UnT cells served as controls. To assay the in vitro cytotoxicity of FMC63 CAR-T cells on tumor cells, One-Lite Luciferase Assay System reagent mix (Vazyme, DD1203-03) was prepared according to the manufacturer's protocol and added to the co-cultured cells to detect the remaining luciferase activity in each well. Since luciferase is expressed only in tumor cells, the remaining luciferase activity in the well correlates directly to the number of viable target cells in the well. The maximum luciferase activity was obtained by adding culture media to target cells in the absence of effector cells. The minimum luciferase activity was determined by adding Triton X-100 at a final concentration of 1%at the time when the cytotoxicity assays were initiated. The specific cytotoxicity was calculated by the formula: Specific Cytotoxicity %= 100%× (1- (RLUSample-RLUMin)  /  (RLUUnT-RLUMin) ) . As shown in FIG. 12, in contrast to the little cytotoxicity of UnT against tumor cells, specific cytotoxicity of FMC63 CAR-T cells on CD19-positive Raji-Luc cells was observed. Notably, compared to parental FMC63 CAR-T cells (FMC63 CAR-1, SEQ ID NO: 118) , humanized FMC63 CAR-T cells (VL1g10VH14 CAR, SEQ ID NO: 117) showed more potent cytotoxicity against Raji-Luc cells.

[0545] Example 22: Killing sensitivity of γδT cells in co-culture with cells expressing different levels of human CD19

[0546] Different amounts of linearized CD19 mRNA were delivered to CD19-negative expressing K562-luc cells by the electroporation method. The expression of CD19 on the cell surface of K562-luc cells was confirmed by flow cytometry. These K562-luc cells with different CD19 expression levels were then used as target cells in the following cytotoxicity assay. Subsequently, CAR-γδT cells were co-cultured with target cells at an E: T ratio of 5: 1 for 24 hours. The cytotoxicity of CAR-γδT cells was assessed by the One-Lite Luciferase Assay System from Vazyme (Reference Example 21) .

[0547] As shown in FIG. 13, in contrast to the little cytotoxicity of UnT against tumor cells no matter what the CD19 mRNA amount was, specific cytotoxicity of FMC63 CAR-T cells on CD19-positive K562-Luc cells was observed. Notably, the killing of CAR-γδT cells was enhanced in a gradient-dependent manner with the increase of human CD19 mRNA amounts. More importantly, the killing sensitivity of humanized FMC63 CAR-T (VL1g10VH14 CAR) is greater than that of the parental FMC63 CAR-T (FMC63 CAR-1) particularly at the lowest amount of CD19 mRNA.

[0548] Although specific embodiments of the present disclosure have been described in detail, those skilled in the art will appreciate that various modifications and substitutions can be made to those details according to all the teachings that have been disclosed, and these changes shall all fall within the protection scope of the present disclosure. The full scope of the present disclosure is given by the appended claims and any equivalent thereof.

Claims

1.An anti-CD19 antibody or an antigen-binding fragment thereof, wherein, the antibody comprises a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions HCDR1 to HCDR3 (HCDR1, HCDR2 and HCDR3) and a light chain variable region (VL) comprising complementarity determining regions LCDR1 to LCDR3 (LCDR1, LCDR2 and LCDR3) , wherein:(1) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;(2) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;(3) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 36, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;(4) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;(5) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;(6) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 40;(7) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; or(8) the VH comprises HCDR1 to HCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 114, and the VL comprises LCDR1 to LCDR3 in an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 39.2.The anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to claim 1, wherein the HCDR1 to HCDR3 and the LCDR1 to LCDR3 are defined according to Kabat numbering system, AbM numbering system, IMGT numbering system, Chothia numbering system or Contact numbering system.3.An anti-CD19 antibody or an antigen-binding fragment thereof, wherein, the antibody comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1 to HCDR3 and a light chain variable region comprising LCDR1 to LCDR3, wherein:(1) the VH comprises HCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 41, HCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 42 and HCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 43, and, the VL comprises LCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 46, LCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 47 and LCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 48;(2) the VH comprises HCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 44, HCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 45 and HCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 43, and, the VL comprises LCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 46, LCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 47 and LCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 48; or(3) the VH comprises HCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 44, HCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 45 and HCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 43, and, the VL comprises LCDR1 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 49, LCDR2 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 50 and LCDR3 with the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 51.4.The anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 3, wherein:(1) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;(2) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;(3) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 36, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;(4) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;(5) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;(6) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 40;(7) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; or(8) the VH comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 114, and the VL comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39.5.The anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 4, wherein the VH comprises an amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-37, and 114, and the VL comprises an amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 38-40;preferably,(1) the VH comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;(2) the VH comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;(3) the VH comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 36, and the VL comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;(4) the VH comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, and the VL comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;(5) the VH comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, and the VL comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;(6) the VH comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 40;(7) the VH comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, and the VL comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39; or(8) the VH comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 114, and the VL comprises an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39.6.The anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 5, which comprises a non-CDR region derived from human, mouse or rabbit;preferably, the non-CDR region is framework regions, heavy chain constant region, and / or light chain constant region.7.The anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 6, wherein the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment is selected from the group consisting of Fab, Fab', F (ab') 2, single chain fragment variable (scFv) , scFv-Fc, and disulfide-stabilized Fv fragment (dsFv) ;preferably, the scFv comprises a VH comprising an amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 34-37, and 114, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 38-40;preferably, the scFv comprises, from N-terminus to C-terminus:(1) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34;(2) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35;(3) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 36;(4) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34;(5) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35;(6) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 40, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37;(7) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37;(8) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;(9) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 38;(10) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 36, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;(11) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 34, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;(12) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 35, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;(13) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 40;(14) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 37, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;(15) a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39, a linker, and a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 114; or(16) a VH comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 114, a linker, and a VL comprising an amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 39;preferably, the linker comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 32, 33, 66, 67 and 68.8.The anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 7, which comprises an amino sequence having at least 80%sequence identity to the amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 13-19, and 115;preferably, the antibody or the antigen-binding fragment thereof has an amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 13-19, and 115.9.A polypeptide construct, comprising the anti-CD19 antibody or an antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-8.10.The polypeptide construct of claim 9, wherein the polypeptide construct is a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, a human engineered antibody, a monospecific molecule, a bispecific molecule, a multispecific molecule, or chemically modified derivatives thereof.11.An immunoconjugate, comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-8, linked to a therapeutic agent.12.The immunoconjugate of claim 11, wherein the therapeutic agent is a drug, a cytotoxin, or a radioactive isotope.13.A nucleic acid molecule, comprising a nucleotide sequence encoding the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 8, or the polypeptide construct of claim 9 or 10.14.A vector, comprising the nucleic acid molecule according to claim 13.15.A host cell, comprising the nucleic acid molecule according to claim 13 or the vector according to claim 14.16.A chimeric antigen receptor (CAR) comprising a polypeptide comprising:(a) an extracellular antigen binding domain comprising anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 8;(b) a transmembrane domain; and(c) an intracellular signaling domain.17.The CAR according to claim 16, wherein the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof is a scFv;preferably, the scFv is any one of the scfvs in claim 7.18.The CAR according to claim 16 or 17, further comprising a hinge domain located between the C-terminus of the extracellular antigen binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain;preferably, the hinge domain is derived from IgG4Fc, CD28 or CD8α;preferably, the hinge domain comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 5-7 and 109, or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 5-7 and 109.19.The CAR according to any one of claims 16 to 18, wherein the transmembrane domain is derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 and PD1;preferably, the transmembrane domain comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 8.20.The CAR according to any one of claims 16 to 19, wherein the intracellular signaling domain comprises a co-stimulatory signaling domain;preferably, the co-stimulatory signaling domain is derived from a co-stimulatory molecule selected from the group consisting of CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligands of CD83 and combinations thereof;preferably, the co-stimulatory signaling domain is derived from CD137;preferably, the co-stimulatory signaling domain comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 9, or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 9.21.The CAR according to any one of claims 16 to 20, wherein the intracellular signaling domain comprises a primary intracellular signaling domain;preferably, the primary intracellular signaling domain is derived from CD3ζ;preferably, the primary intracellular signaling domain comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 10, or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 10.22.The CAR according to any one of claims 16 to 21, comprising an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 52, 53, or 116.23.The CAR according to any one of claims 16 to 22, wherein the intracellular signaling domain further comprises a DAP12 intracellular signaling domain at the C-terminus;preferably, the DAP12 intracellular signaling domain comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 11, or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 11.24.The CAR according to claim 23, comprising an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 54-58.25.The CAR according to any one of claims 16 to 24, wherein the extracellular antigen-binding domain further comprises one or more additional antigen-binding domain (s) .26.The CAR according to claim 25, wherein the one or more additional antigen-binding domain (s) binds to BCMA.27.The CAR according to claim 25 or 26, wherein the additional antigen-binding domain binding to BCMA is an anti-BCMA single domain antibody (sdAb) .28.The CAR according to any one of claims 25 to 27, wherein:(1) the additional antigen-binding domain comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 76; or(2) the additional antigen-binding domain comprises a CDR1, a CDR2, and a CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 77.29.The CAR according to any one of claims 25 to 28, wherein:(1) the additional antigen-binding domain comprises a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72; or(2) the additional antigen-binding domain comprises a CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73, a CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74, and a CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75.30.The CAR according to any one of claim 25 to 29, wherein:(1) the additional antigen-binding domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 76 or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 76; or(2) the additional antigen-binding domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 77 or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 77.31.The CAR according to any one of claims 25 to 30, wherein the anti-CD19 scFv and the additional antigen-binding domain are connected via a linker.32.The CAR according to any one of claims 25 to 31, wherein the extracellular antigen binding domain comprises from N-terminus to C-terminus:(1) an anti-BCMA sdAb, a linker, and an anti-CD19 scFv;(2) a VL of anti-CD19 scFv, a linker, an anti-BCMA sdAb, a linker, and a VH of anti-CD19 scFv;(3) a VH of anti-CD19 scFv, a linker, an anti-BCMA sdAb, a linker, and a VL of anti-CD19 scFv; or(4) an anti-CD19 scFv, a linker, and an anti-BCMA sdAb.33.The CAR according to any one of claims 31 to 32, wherein the linker comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 32, 33, 66, 67 and 68.34.The CAR according to any one of claims 25 to 33, wherein the extracellular antigen binding domain comprises an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 78-84.35.The CAR according to any one of claims 25 to 34, comprising an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 85-91.36.The CAR according to any one of claims 16 to 35, further comprising a signal peptide located at the N-terminus of the polypeptide;preferably, the signal peptide is derived from CD8α, CD28 or CD4;preferably, the signal peptide comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO:4, or an amino acid sequence having at least 85%sequence identity to the amino sequence as set forth in SEQ ID NO: 4.37.The CAR according to claim 36, comprising an amino acid sequence as set forth in any one of SEQ ID NOs: 22, 23, 59-63, 92-98, and 117.38.A nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding the CAR according to any one of claims 16 to 37.39.A vector, comprising the nucleic acid molecule according to claim 38.40.The vector of claim 39, wherein the vector further comprises a nucleic acid molecule encoding a membrane bound IL-15 (mbIL-15) .41.The vector of claim 40, wherein the nucleic acid molecule encoding the CAR and the nucleic acid molecule encoding the mbIL-15 are operably linked to a single promoter and are connected by a linking sequence.42.The vector of claim 41, wherein the linking sequence encodes a self-cleaving 2A peptide;preferably, the self-cleaving 2A peptide is selected from the group consisting of P2A, T2A, E2A and F2A;preferably, the P2A comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 31.43.The vector of any one of claims 40 to 42, wherein the vector encodes the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 25-29, 64-65, and 99-101.44.An engineered cell, comprising the CAR according to any one of claims 16 to 37, the nucleic acid molecule of claim 38, or the vector of any one of claims 39 to 43;preferably, the engineered cell is an engineered immune cell.45.The engineered cell according to claim 44, wherein the engineered cell is selected from the group consisting of T cell (e.g., αβ T cell, γδ T cell) , NK cell, peripheral blood mononuclear cell, hematopoietic stem cell, pluripotent stem cell, and embryonic stem cell.46.The engineered cell of claim 45, wherein the engineered cell is an NK cell.47.The engineered cell according to any one of claims 44 to 46, wherein at least a portion of the engineered immune cells are engineered to express mbIL-15.48.The engineered cell according to claim 47, wherein the mbIL-15 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 12, 69, 106 or 107.49.A pharmaceutical composition, comprising the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 8, the polypeptide construct of claim 9 or 10, the nucleic acid molecule according to claim 13, the vector according to claim 14, the host cell according to claim 15, the CAR according to any one of claims 16 to 37, the nucleic acid molecule according to claim 38, the vector according to any one of claims 39 to 43, or the engineered cell according to any one of claims 44 to 48, wherein optionally, the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable excipient.50.Use of anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 8, the polypeptide construct of claim 9 or 10, the nucleic acid molecule according to claim 13, the vector according to claim 14, the host cell according to claim 15, the CAR according to any one of claims 16 to 37, the nucleic acid molecule according to claim 38, the vector according to any one of claims 39 to 43, or the engineered cell according to any one of claims 44 to 48, in the preparation of a medicament for treating or preventing a disease or disorder;preferably, the disease or disorder is a B cell associated disease or disorder and / or CD19 associated disease or disorder;preferably, the disease or disorder is cancer;preferably, the disease or disorder is a B cell malignancy; preferably, the B cell malignancy is a B cell leukemia or B cell lymphoma;preferably, the disease or disorder is selected from a group consisting of marginal zone lymphoma (e.g., splenic marginal zone lymphoma) , diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , primary central nervous system (CNS) lymphoma, primary mediastinal B cell lymphoma (PMBL) , small lymphocytic lymphoma (SLL) , B cell prolymphocytic leukemia (B-PLL) , follicular lymphoma (FL) , burkitt lymphoma, primary intraocular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , acute lymphoblastic leukemia (ALL) , hairy cell leukemia (HCL) , precursor B lymphoblastic leukemia, non-hodgkin lymphoma (NHL) , high-grade B-cell lymphoma (HGBL) , and multiple myelomia (MM) ;preferably, the disease or disorder is an autoimmune disease; preferably, the autoimmune disease is associated with inappropriate or enhanced B cell numbers and / or activation; the autoimmune disease is systemic lupus erythematosus (SLE) .51.The anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 8, the nucleic acid molecule according to claim 9, the vector according to claim 10, the host cell according to claim 11, the CAR according to any one of claims 16 to 37, the nucleic acid molecule according to claim 38, the vector according to any one of claims 39 to 43, or the engineered cell according to any one of claims 44 to 48, for use in treating or preventing a disease or disorder;preferably, the disease or disorder is a B cell associated disease or disorder and / or CD19 associated disease or disorder;preferably, the disease or disorder is cancer;preferably, the disease or disorder is a B cell malignancy; preferably, the B cell malignancy is a B cell leukemia or B cell lymphoma;preferably, the disease or disorder is selected from a group consisting of marginal zone lymphoma (e.g., splenic marginal zone lymphoma) , diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , primary central nervous system (CNS) lymphoma, primary mediastinal B cell lymphoma (PMBL) , small lymphocytic lymphoma (SLL) , B cell prolymphocytic leukemia (B-PLL) , follicular lymphoma (FL) , burkitt lymphoma, primary intraocular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , acute lymphoblastic leukemia (ALL) , hairy cell leukemia (HCL) , precursor B lymphoblastic leukemia, non-hodgkin lymphoma (NHL) , high-grade B-cell lymphoma (HGBL) , and multiple myelomia (MM) ;preferably, the disease or disorder is an autoimmune disease; preferably, the autoimmune disease is associated with inappropriate or enhanced B cell numbers and / or activation; the autoimmune disease is systemic lupus erythematosus (SLE) .52.A method for treating or preventing a disease or disorder in a subject, comprising a step of administering to the subject in need an effective amount of the anti-CD19 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 8, the polypeptide construct of claim 9 or 10, the nucleic acid molecule according to claim 13, the vector according to claim 14, the host cell according to claim 15, the CAR according to any one of claims 16 to 37, the nucleic acid molecule according to claim 38, the vector according to any one of claims 39 to 43, or the engineered cell according to any one of claims 44 to 48;preferably, the disease or disorder is a B cell associated disease or disorder and / or CD19 associated disease or disorder;preferably, the disease or disorder is cancer;preferably, the disease or disorder is a B cell malignancy; preferably, the B cell malignancy is a B cell leukemia or B cell lymphoma;preferably, the disease or disorder is selected from a group consisting of marginal zone lymphoma (e.g., splenic marginal zone lymphoma) , diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) , mantle cell lymphoma (MCL) , primary central nervous system (CNS) lymphoma, primary mediastinal B cell lymphoma (PMBL) , small lymphocytic lymphoma (SLL) , B cell prolymphocytic leukemia (B-PLL) , follicular lymphoma (FL) , burkitt lymphoma, primary intraocular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , acute lymphoblastic leukemia (ALL) , hairy cell leukemia (HCL) , precursor B lymphoblastic leukemia, non-hodgkin lymphoma (NHL) , high-grade B-cell lymphoma (HGBL) , and multiple myelomia (MM) ;preferably, the disease or disorder is an autoimmune disease; preferably, the autoimmune disease is associated with inappropriate or enhanced B cell numbers and / or activation;the autoimmune disease is systemic lupus erythematosus (SLE) .

Images