Compositions and methods for treating metabolic dysfunction-associated steatotic liver diseases

Abstract

Provided is a composition comprising (1) an effective amount of Lactobacillus paracasei, L. paracasei culture medium, or indole-3-lactic acid (ILA); and (2) a physiologically acceptable excipient. The composition is effective for improving liver health or for treating or preventing metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD). Also provided are corresponding methods and kits for the prophylactic or therapeutic uses against liver diseases such as MASLD.

Description

COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING METABOLIC DYSFUNCTION-ASSOCIATED STEATOTIC LIVER DISEASESRELATED APPLICATIONS

[0001] This application claims priority to U.S. Provisional Patent Application No. 63 / 728,068, filed December 4, 2024, the contents of which are hereby incorporated by reference in the entirety for all purposes.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Nonalcoholic fatty liver disease, or NAFLD, is a liver problem that affects people who drink little to no alcohol. In NAFLD, too much fat builds up in the liver. It is seen most often in people who are overweight or obese. NAFLD is becoming more common, especially in Middle Eastern and Western nations as the number of people with obesity rises. It is the most common form of liver disease in the world, ranging in severity from hepatic steatosis, called fatty liver, to a more severe form of disease called nonalcoholic steatohepatitis (NASH) . NASH causes the liver to swell and become damaged due to the fat deposits in the liver. NASH may get worse and may lead to serious liver scarring, called cirrhosis, and even liver cancer (e.g., hepatocellular carcinoma or HCC) . This damage is similar to the damage caused by heavy alcohol use. In recent years, experts are moving to change the term nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) to metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) . Correspondingly, the term nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is changed to metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH) .

[0003] Hepatocellular carcinoma (HCC) is the third leading cause among all cancer deaths worldwide. Its mortality rates are increasing, particularly in the Western world. Cirrhosis remains the predominant risk factor for HCC. Epidemiological shifts in the incidence of HCC from patients with virus-related liver diseases to those with non-viral etiologies, including alcohol-associated and metabolic dysfunction-associated steatotic liver diseases, however, have important implications for prevention, surveillance and treatment.

[0004] About 38 trillion bacteria exist in the human intestine. Because of their symbiotic and co-operative relationship with the human body, these bacteria have a close association with the pathogenesis and progression of liver cancer. The association of liver diseases, including liver cancer, with altered gut microbiota has been studied in different populations, with certain bacterial species identified for their potential roles, either beneficial or detrimental, in tumorigenesis. Disease management and facilitation of treatment among patients with liver pathologies by way of modifying the profile of gut microorganisms is a highly desirable means of medical intervention due to its high efficacy, low cost, and low risk of side effects. Thus, there exists a pressing need for developing new methods and compositions useful for the purpose of reducing risk of liver diseases and / or treating liver diseases, especially MASLD, including HCC associated with MASLD, by way of modifying patient gut microbiota. This invention fulfills this and other related needs. BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION

[0005] The present inventors discovered in their studies that certain gut microbial species and prebiotics can help improve liver health, including alleviating liver diseases such as MASLD and suppressing the proliferation of liver cancer cells. These microorganisms and prebiotics so identified now serve to provide new methods and compositions for enhancing or improving liver health and for treating or preventing MASLD and MASLD-associated hepatocellular carcinoma (MASLD-HCC) .

[0006] In a first aspect, the present invention provides a composition that is useful for composition for use in improving liver health or for treating or preventing a metabolic dysfunction associated steatotic liver disease (MASLD) in a person in need thereof, comprising (1) an effective amount of Lactobacillus paracasei; and (2) one or more physiologically acceptable excipient. In some embodiments, the person has not been diagnosed with MASLD. In some embodiments, the person has been diagnosed with MASLD but not MASLD-associated hepatocellular carcinoma (MASLD-HCC) . In some embodiments, the Lactobacillus paracasei is a strain deposited at Guangdong Microbial Culture Collection Center (GDMCC) under deposit No. 63727. In some embodiments, the composition further comprises an effective amount of vitamin B5. In some embodiments, the composition is formulated for oral ingestion, for example, in the form of a food or beverage item, or in the form of a powder, liquid, paste, cream, tablet, capsule, or caplet. In some embodiments, the composition is formulated in a daily dosage comprising about 109 to about 1011 CFU of L. paracasei per kg recipient bodyweight, for example, about 109 to about 1010, about 109, about 1010, or about 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 x 109 CFU of L. paracasei per kg recipient bodyweight. In some embodiments, the composition is formulated in a daily dosage comprising about 1 mg to about 100 mg, e.g., about 5, 10, 20, or 50 mg, of vitamin B5 per kg recipient bodyweight. In some embodiments, the composition is formulated in a daily dose of about 5 x 109 CFU of L. paracasei and about 10 mg vitamin B5 per kg recipient bodyweight. In some embodiments, the composition consists essentially of an effective amount of Lactobacillus paracasei, optionally with an effective amount of vitamin B5, and one or more physiologically acceptable excipients. In some embodiments, the composition consists of an effective amount of Lactobacillus paracasei, optionally with an effective amount of vitamin B5, and one or more physiologically acceptable excipients. In some embodiments, the composition does not comprise any other microbial species other than Lactobacillus paracasei, for example, no other bacterial species, or no fungus, or no virus, at a detectable level of viability.

[0007] In some embodiments, the composition of the present invention for improving liver health or for treating or preventing a metabolic dysfunction associated steatotic liver disease (MASLD) in a person in need thereof comprises (1) an effective amount of an extract of a Lactobacillus paracasei culture medium that is free of Lactobacillus paracasei, optionally free of any other microorganism, especially bacterial species, and (2) one or more physiologically acceptable excipients. In some embodiments, the extract is a cell-free supernatant of a Lactobacillus paracasei culture medium. In other embodiments, the composition of the present invention for improving liver health or for treating or preventing a metabolic dysfunction associated steatotic liver disease (MASLD) in a person in need thereof comprises (1) an effective amount of indole-3-lactic acid (ILA) ; and (2) one or more physiologically acceptable excipients. Optionally, the composition is free of microorganism at a detectable level, especially bacterial species, such as Lactobacillus paracasei. In some embodiments, the person is not suffering from colorectal cancer or known to have an elevated risk of developing colorectal cancer.

[0008] In the second aspect, the present invention provides a method for improving liver health or for treating MASLD or for preventing MASLD in a person, comprising administering to the person an effective amount of the composition described above and herein, namely containing (1) an effective amount of Lactobacillus paracasei; and (2) one or more physiologically acceptable excipients. In some embodiments, the person has not been diagnosed with MASLD. In some embodiments, the person has been diagnosed with MASLD but not MASLD-associated hepatocellular carcinoma (MASLD-HCC) . In some embodiments, the person is administered one composition comprising both L. paracasei and vitamin B5, such as in different variations described above or herein. In some embodiments, the person is administered two compositions, each comprising L. paracasei and vitamin B5, respectively. In some embodiments, the administering step comprises oral ingestion of the one or two compositions. In some embodiments, the administering step comprises oral ingestion of the composition or compositions prior to or with food intake. In some embodiments, the one or two compositions are formulated to provide together in a daily dosage comprising about 109 to about 1011 CFU of L. paracasei per kg recipient bodyweight, for example, about 109 to about 1010, about 109, about 1010, or about 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 x 109 CFU of L. paracasei per kg recipient bodyweight. In some embodiments, the one or two compositions are formulated in a daily dosage together comprising about 1 mg to about 100 mg, e.g., about 5, 10, 20, or 50 mg, of vitamin B5 per kg recipient bodyweight. In some embodiments, the one or two compositions are formulated to provide together in a daily dose of about 5 x 109 CFU of L. paracasei and about 10 mg vitamin B5 per kg recipient bodyweight. In some embodiments, the one composition consists essentially of an effective amount of Lactobacillus paracasei, optionally with an effective amount of vitamin B5, and one or more physiologically acceptable excipients. In some embodiments, the one composition consists of an effective amount of Lactobacillus paracasei, optionally with an effective amount of vitamin B5, and one or more physiologically acceptable excipients. In some embodiments, the one or two compositions do not comprise any other microbial species other than Lactobacillus paracasei, for example, no other bacterial species, or no fungus, or no virus, at a detectable level of viability.

[0009] In some embodiments, the method of the present invention for improving liver health or for treating or preventing a metabolic dysfunction associated steatotic liver disease (MASLD) in a person in need thereof comprises a step of administering to the person a composition comprising (1) an effective amount of an extract of a Lactobacillus paracasei culture medium that is free of Lactobacillus paracasei, optionally free of any other microorganism, especially bacterial species, and (2) one or more physiologically acceptable excipients. In some embodiments, the extract is a cell-free supernatant of a Lactobacillus paracasei culture medium. In other embodiments, the method of the present invention for improving liver health or for treating or preventing a metabolic dysfunction associated steatotic liver disease (MASLD) in a person in need thereof comprises a step of administering to the person a composition comprising (1) an effective amount of indole-3-lactic acid (ILA) ; and (2) one or more physiologically acceptable excipients. Optionally, the composition is free of any microorganism, especially bacterial species, such as Lactobacillus paracasei. In some embodiments, the person receiving treatment according to the method of this invention is not suffering from colorectal cancer or known to have an elevated risk of developing colorectal cancer.

[0010] In a related aspect, the present invention provides a novel use of a composition described above and herein for making a medicament or supplement for improving liver health or for treating or preventing MASLD in a person. The composition contains (1) an effective amount of Lactobacillus paracasei; and (2) one or more physiologically acceptable excipients. In some embodiments, the person has not been diagnosed with MASLD. In some embodiments, the person has been diagnosed with MASLD but not MASLD-associated hepatocellular carcinoma (MASLD-HCC) . In some embodiments, the Lactobacillus paracasei is a strain deposited at Guangdong Microbial Culture Collection Center (GDMCC) under deposit No. 63727. In some embodiments, the composition further comprises an effective amount of vitamin B5. In some embodiments, the composition is formulated for oral ingestion, for example, in the form of a food or beverage item, or in the form of a powder, liquid, paste, cream, tablet, capsule, or caplet. In some embodiments, the composition is formulated in a daily dosage comprising about 109 to about 1011 CFU of L. paracasei per kg recipient bodyweight, for example, about 109 to about 1010, about 109, about 1010, or about 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 x 109 CFU of L. paracasei per kg recipient bodyweight. In some embodiments, the composition is formulated in a daily dosage comprising about 1 mg to about 100 mg, e.g., about 5, 10, 20, or 50 mg, of vitamin B5 per kg recipient bodyweight. In some embodiments, the composition is formulated in a daily dose of about 5 x 109 CFU of L. paracasei and about 10 mg vitamin B5 per kg recipient bodyweight. In some embodiments, the composition consists essentially of an effective amount of Lactobacillus paracasei, optionally with an effective amount of vitamin B5, and one or more physiologically acceptable excipients. In some embodiments, the composition consists of an effective amount of Lactobacillus paracasei, optionally with an effective amount of vitamin B5, and one or more physiologically acceptable excipients. In some embodiments, the composition does not comprise any other microbial species other than Lactobacillus paracasei, for example, no other bacterial species, or no fungus, or no virus, at a detectable level of viability.

[0011] In some embodiments, the composition referred to in the last paragraph comprises (1) an effective amount of an extract of a Lactobacillus paracasei culture medium that is free of Lactobacillus paracasei, optionally free of any other microorganism, especially bacterial species, and (2) one or more physiologically acceptable excipients. In some embodiments, the extract is a cell-free supernatant of a Lactobacillus paracasei culture medium. In other embodiments, the composition comprises (1) an effective amount of indole-3-lactic acid (ILA) ; and (2) one or more physiologically acceptable excipients. Optionally, the composition is free of microorganism at a detectable level, especially bacterial species, such as Lactobacillus paracasei. In some embodiments, the person being treated with the medicament is not suffering from colorectal cancer or known to have an elevated risk of developing colorectal cancer.

[0012] In a third aspect, the present invention provides a kit for improving liver health or for treating or preventing MASLD in a person. The kit comprises two compositions, the first comprising an effective amount of L. paracasei, optionally with an effective amount of vitamin B5, and the second comprising an effective amount of liver protective agent. In some embodiments, the first composition further comprises an effective amount of vitamin B5. In some embodiments, the first composition is formulated for oral ingestion. In some embodiments, the first composition is formulated in a daily dosage comprising about 109 to about 1011 CFU of L. paracasei per kg recipient bodyweight, for example, about 109 to about 1010, about 109, about 1010, or about 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 x 109 CFU of L. paracasei per kg recipient bodyweight. In some embodiments, the first composition is formulated in a daily dosage comprising about 1 mg to about 100 mg, e.g., about 5, 10, 20, or 50 mg, of vitamin B5 per kg recipient bodyweight. In some embodiments, the first composition is formulated in a daily dosage comprising about 109 to about 1011 CFU of L. paracasei and optionally about 1 mg to about 100 mg vitamin B5 per kg recipient bodyweight. In some embodiments, the first composition is formulated in a daily dose of about 5 x 109 CFU of L. paracasei and about 10 mg vitamin B5 per kg recipient bodyweight. In some embodiments, the first composition consists essentially of an effective amount of Lactobacillus paracasei, optionally with an effective amount of vitamin B5, and one or more physiologically acceptable excipients. In some embodiments, the first composition consists of an effective amount of Lactobacillus paracasei, optionally with an effective amount of vitamin B5, and one or more physiologically acceptable excipients. In some embodiments, the composition does not comprise any other microbial species other than Lactobacillus paracasei, for example, no other bacterial species, or no fungus, or no virus, at a detectable level of viability.

[0013] In some embodiments of the kit of this invention, the first composition comprises (1) an effective amount of an extract of a Lactobacillus paracasei culture medium that is free of Lactobacillus paracasei, optionally free of any other microorganism, especially bacterial species, and (2) one or more physiologically acceptable excipients. In some embodiments, the extract is a cell-free supernatant of a Lactobacillus paracasei culture medium. In other embodiments, the first composition of the kit comprises (1) an effective amount of indole-3-lactic acid (ILA) ; and (2) one or more physiologically acceptable excipients. Optionally, the composition is free of microorganism at a detectable level, especially bacterial species, such as Lactobacillus paracasei. In some embodiments, the kit further comprises user instructions guiding a user to properly administer the compositions contained in the kit for a suitable recipient, for example, a person who has not been diagnosed with MASLD but has known elevated risks to later develop MASLD. In some embodiments, the person has been diagnosed with MASLD but not MASLD-associated hepatocellular carcinoma (MASLD-HCC) . In some embodiments, the recipient is not suffering from colorectal cancer or known to have an elevated risk of developing colorectal cancer.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0014] Figure 1. L. paracasei suppressed MASH-HCC development in two tumourigenesis mouse model. (A) Experimental design for the dietary treatment and L. paracasei gavage in DEN+HFHC mouse model. (B) Experimental design for DEN+CDHF mouse model. (C) Representative gross morphology, H&E images and tumor measurement of liver tissues of DEN+HFHC mouse model. (D) Representative gross morphology, H&E images and tumor measurement of liver tissues of DEN+ CDHF mouse model. (E) Representative Ki-67 images and scoring of liver tissues. (F) Measurement of serum makers. HFHC, high-fat / high-cholesterol; CDHF, choline-deficient / high-fat; NC, normal chow; L. p, Lactobacillus. paracasei; DEN, diethylnitrosamine; IHC, immunohistochemistry; ALT, Alanine transaminase; AST, Aspartate aminotransferase.

[0015] Figure 2. L. paracasei modulated tumor microenvironment in two tumourigenesis mouse model. (A) L. paracasei significantly promoted the production of IFN-γ in CD8+ T cells in two MASH-HCC mouse models. (B) L. paracasei significantly promoted the production of Granzyme B in CD8+ T cells in two MASH-HCC mouse models. (C) L. paracasei suppressed the proportion of CD25+ Foxp3+ Tregs in the DEN+HFHC mouse model. (D) L. paracasei suppressed the proportion of CD25+ Foxp3+ Tregs in the DEN+CDHF mouse model. HFHC, high-fat / high-cholesterol; CDHF, choline-deficient / high-fat; L. p, Lactobacillus. paracasei; DEN, diethylnitrosamine.

[0016] Figures 3A-3E. L. paracasei modulated tumor microenvironment in two tumourigenesis mouse model. (Figure 3A) Experimental design for in vitro T cell co-culture assay. (Figure 3B) Lp-CM (Total, heat-inactivated, PK-inactivated) increased the level of IFN-γ and Granzyme B in CD8+ T cells. (Figure 3C) Lp-CM with small molecular weight (< 3kDa) but not high molecular weight (>3kDa) increased the level of IFN-γ and Granzyme B in CD8+ T cells. (Figure 3D) Lp-CM promoted the expression of Ki-67 in CD8+ T cells. (Figure 3E) Lp-CM inhibited the proportion of CD25+ Foxp3+ Tregs in a concentration-dependent manner. Lp-CM, Lactobacillus. paracasei conditioned medium; PK, Proteinase K.

[0017] Figure 4. Indole-3-lactic acid is the protective molecules of L. paracasei to inhibit MASLD-HCC. (A, B) Schematic workflow diagram (A) and heatmap (B) of untargeted metabolomics L. p-CM with small molecular weight (<3kDa) , compared to MRS broth control. (C) Targeted metabolomics of L. p-CM with small molecular weight, compared to broth control. (D) Heatmap of targeted metabolomics of stools, portal vein, and liver tissues of germ-free mice gavaged with L. paracasei or PBS control. (E) ILA increased the level of IFN-γ and Granzyme B in CD8+ T cells. (F) Immunofluorescent staining showing ILA localisation in the nucleus of CD8+ T cells. (G-I) Cell viability (G) , colony formation (H) , and cell apoptosis assay (I) of human MASLD-HCC cells (HKCI2 and HKCI10) treated with ILA. ILA, indole-3-lactic acid; L. p-CM, Lactobacillus paracasei conditioned medium.

[0018] Figure 5. L. paracasei boosted anti-PD-1 therapy in orthotopic MASLD-HCC mouse model. (A) Experimental design for L. paracasei with anti-PD-1 therapy in orthotopic MASLD-HCC mouse model. (B-D) Representative liver macroscopic pictures (B) , representative H&E images of live tissues (C) , and liver tumour measurements (D) in orthotopic MASLD-HCC mouse model. (E-G) Level of IFN-γ in CD8+ T cells (E) , granzyme B in CD8+ T cells (F) , or CD25+ Foxp3+ Tregs (G) in orthotopic MASLD-HCC mouse model. H&E, haematoxylin and eosin; HFHC, high-fat high-cholesterol; IgG, immunoglobulin G; i, p., intraperitoneal; PBS, phosphate-buffered saline; PD-1, programmed cell death protein 1.

[0019] Figure 6. CD8+ T cell depletion abolished tumour-suppressing effects of L. paracasei on MASLD-HCC. (A) Experimental design for CD8+ T cell depletion in orthotopic MASLD-HCC mouse model. (B-D) Representative liver macroscopic pictures (B) , representative H&E images of live tissues (C) , and liver tumour measurements (D) in CD8+ T cell-depletion mice. (E) Flow cytometric analysis of blood and liver tumour tissues in CD8+T cell depletion mice. H&E, haematoxylin and eosin; HFHC, high-fat high-cholesterol; IgG, immunoglobulin G; i, p., intraperitoneal; PBS, phosphate-buffered saline; PD-1, programmed cell death protein 1. DEFINITIONS

[0020] In this disclosure, the terms "metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) " and "non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) " have the same meaning and refer to a disease of the liver seen in patients who did not consume alcohol in excessive quantity (e.g., consumed little to no alcohol) , characterized by fatty deposits in a patient’s liver tissue, ranging from hepatic steatosis, or fatty liver, to metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH) or nonalcoholic steatohepatitis (NASH) . The terms "MASLD" and "NAFLD" in this disclosure further include more advanced liver diseases stemmed from MASH or NASH, such as liver cirrhosis and liver cancer associated with MASLD (e.g., MASLD-associated hepatocellular carcinoma or MASLD-HCC) .

[0021] The term "inhibiting" or "inhibition, " as used herein, refers to any detectable negative effect on a target biological process, such as RNA / protein expression of a target gene, the biological activity of a target protein, cellular signal transduction, cell proliferation, presence / level of an organism especially a micro-organism, any measurable biomarker, bio-parameter, or symptom in a subject, and the like. Typically, an inhibition is reflected in a decrease of at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%or greater in the target process (e.g., a subject’s bodyweight, or the blood glucose / cholesterol level, or any measurable symptom or biomarker in a subject, such as an infection rate among subjects by a pathogenic infectious agent or the rate of tumorigenesis for a pre-determined cancer type) , or any one of the downstream parameters mentioned above, when compared to a control. “Inhibition” further includes a 100%reduction, i.e., a complete elimination, prevention, or abolition of a target biological process or signal. The other relative terms such as “suppressing, ” “suppression, ” “reducing, ” and “reduction” are used in a similar fashion in this disclosure to refer to decreases to different levels (e.g., at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%or greater decrease compared to a control level) up to complete elimination of a target biological process or signal. On the other hand, terms such as “activate, ” “activating, ” “activation, ” “increase, ” “increasing, ” “promote, ” “promoting, ” “enhance, ” “enhancing, ” or “enhancement” are used in this disclosure to encompass positive changes at different levels (e.g., at least about 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, or greater such as 3, 5, 8, 10, 20-fold increase compared to a control level in a target process, signal, or parameter.

[0022] As used herein, the term "treatment" or "treating" includes both therapeutic and preventative measures taken to address the presence of a disease or condition or the risk of developing such disease or condition at a later time. It encompasses therapeutic or preventive measures for alleviating ongoing symptoms, inhibiting or slowing disease progression, delaying of onset of symptoms, or eliminating or reducing downstream-effects caused by such disease or condition. A preventive measure in this context and its variations do not require 100%elimination of the occurrence of an event; rather, they refer to a suppression or reduction in the likelihood or severity of such occurrence or a delay in such occurrence.

[0023] The term “severity” of a disease refers to the level and extent to which a disease progresses to cause detrimental effects on the well-being and health of a patient suffering from the disease, such as short-term and long-term physical, mental, and psychological disability, up to and including death of the patient. Severity of a disease can be reflected in the nature and quantity of the necessary therapeutic and maintenance measures, the time duration required for patient recovery, the extent of possible recovery, the percentage of patient full recovery, the percentage of patients in need of long-term care, and mortality rate.

[0024] A “patient” or “subject” receiving the composition or treatment method of this invention is a human, including both adult and juvenile human, of any age, gender, and ethnic background, who has been diagnosed with MASLD or who has deemed to have an elevated risk for later developing MASLD, including MASLD-HCC, and therefore in need of therapeutic or prophylactic intervention. Typically, the patient or subject receiving treatment according to the method of this invention for MASLD is not otherwise in need of treatment by the same therapeutic agent (s) . For example, if a subject is receiving the synbiotic composition according to the claimed method, the subject is not suffering from any other disease that is known to be treated by the same therapeutic agent (s) . Although a patient may be of any age, in some cases the patient is at least 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, or 85 years of age; in some cases, a patient may be between 40 and 45 years old, or between 50 and 65 years of age, or between 65 and 85 years of age. A “child” subject is one under the age of 18 years, e.g., about 5-17, 9 or 10-17, or 12-17 years old, including an “infant, ” who is younger than about 12 months old, e.g., younger than about 10, 8, 6, 4, or 2 months old, whereas an “adult” subject is one who is 18 years or older.

[0025] The term “effective amount, ” as used herein, refers to an amount that produces intended (e.g., therapeutic or prophylactic) effects for which a substance is administered. The effects include the prevention, correction, or inhibition of progression of the symptoms of a particular disease / condition and related complications to any detectable extent, e.g., incidence of disease, progression rate, severity of disease, including tumor mass, distant metastasis, and up to mortality. The exact amount will depend on the purpose of the treatment, and will be ascertainable by one skilled in the art using known techniques (see, e.g., Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992) ; Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999) ; and Pickar, Dosage Calculations (1999) ) .

[0026] The term “about” when used in reference to a given value denotes a range encompassing ±10%of the value.

[0027] A "pharmaceutically acceptable" or "pharmacologically acceptable" excipient is a substance that is not biologically harmful or otherwise undesirable, i.e., the excipient may be administered to an individual along with a bioactive agent without causing any undesirable biological effects. Neither would the excipient interact in a deleterious manner with any of the components of the composition in which it is contained.

[0028] The term "excipient" refers to any essentially accessory substance that may be present in the finished dosage form of the composition of this invention. For example, the term "excipient" includes vehicles, binders, disintegrants, fillers (diluents) , lubricants, glidants (flow enhancers) , compression aids, colors, sweeteners, preservatives, suspending / dispersing agents, film formers / coatings, flavors and printing inks.

[0029] The term “consisting essentially of, ” when used in the context of describing a composition containing an active ingredient or multiple active ingredients, refer to the fact that the composition does not contain other ingredients possessing any similar or relevant biological activity of the active ingredient (s) or capable of enhancing or suppressing the activity, whereas one or more inactive ingredients such as physiological or pharmaceutically acceptable excipients may be present in the composition. For example, a composition consisting essentially of an active agent (for instance, ILA, a live Lactobacillus paracasei cuture, or a cell-free Lactobacillus paracasei cuture medium) effective for treating or preventing MASLD including MASLD-HCC in a subject is a composition that does not contain any other agents that may have any detectable positive or negative effect on the same target process (e.g., therapeutic efficacy against MASLD or MASLD-HCC) or that may increase or decrease to any measurable extent of the disease severity or outcome among the receiving subjects.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTIONI. Introduction

[0030] Probiotic compositions comprising Lactobacillus paracasei have been reported to confer a variety of health benefits ranging from alleviating allergies (such as allergic rhinitis and hay fever) , improving skin health (such as reducing occurrence and symptoms of eczema) and gut health (such as reducing occurrence and symptoms of gastrointestinal inflammation including diarrhea and constipation in addition to enhancing intestinal barrier) , improving immunity (such as enhancing host resistance to bacterial and viral infections including common cold and COVID-19) , improving dental health, improving metabolic health (such as lowering blood cholesterol, lowering blood triglyceride, reducing food intake and therefore bodyweight, reducing insulin resistance, and reducing liver fat deposit) , much of such reporting remains anecdotal in nature and lacks adequate support by scientific testing. The present inventors for the first time disclose experimental evidence that Lactobacillus paracasei can help lowing the risk of liver carcinogenesis risen from metabolic dysfunction-associated liver diseases (MASLD) , therefore can be used in the treatment and prevention of MASLD, especially MASLD-associated hepatocellular carcinoma (MASLD-HCC) . As such, this invention provides a method of administering a probiotic composition containing Lactobacillus paracasei, optionally further combination with certain prebiotics (e.g., vitamin B5) , for improving liver health or for treating MASLD or for reducing the risk of developing MASLD in a person, who may or may not have received a diagnosis of MASLD. The practical use of the invention includes development and manufacturing of commercial food / beverage products or health supplements containing live Lactobacillus paracasei, or a L. paracasei culture medium, or L. paracasei metabolite indole-3-lactic acid (ILA) , in an effective quantity, for example, in the form of a powder, tablet, capsule, or liquid, which can be taken alone or added to food or beverages in connection with anti-MASLD-HCC prevention or treatment efforts at or around the same time. II. Pharmaceutical Compositions and Administration

[0031] The present invention provides pharmaceutical compositions comprising an effective amount of Lactobacillus paracasei, including a live culture of L. paracasei, or a L. paracasei cell-free culture medium, or L. paracasei metabolite ILA, optionally in further combination with vitamin B5, for improving liver health or for treating MASLD or for reducing risk for developing MASLD (including MASLD-HCC) in a patient who has been diagnosed with MASLD or who does not have MASLD but has an elevated risk for MASLD. Pharmaceutical compositions of the invention are suitable for use in a variety of drug delivery systems. Suitable formulations for use in the present invention are found in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985) . For a brief review of methods for drug delivery, see, Langer, Science 249: 1527-1533 (1990) .

[0032] The pharmaceutical compositions of the present invention can be administered by various routes, e.g., systemic administration or local administration. The preferred route of administering the pharmaceutical compositions is oral administration at daily doses of about 106 to about 1014 CFU, about 107 to about 1012 CFU, about 108 to about 1011 CFU, about 109 to about 1010 CFU of Lactobacillus paracasei per kg patient bodyweight, for example, about 109 CFU, about 1010 CFU, about 2 × 109 CFU, about 3 × 109 CFU, about 4 × 109 CFU, or about 5 × 109 CFU per patient bodyweight. When ILA is used as the active ingredient, typically about 0.02 to about 10 mg, for example, about 0.05 to about 5 mg, or about 0.1 to about 1 mg, per kg patient weight is administered each time. Optionally, the prebiotic vitamin B5 is further administered to the subject, either in one single composition or in multiple compositions with Lactobacillus paracasei. One preferred Lactobacillus paracasei strain is one that has been deposited at Guangdong Microbial Culture Collection Center (GDMCC) under the deposit No. 63727. Typically, vitamin B5 is present in the composition in total amount of about 50 mg to about 200 grams, for example, about 100 mg to about 100 grams, about 200 mg to about 25 or 50 grams, or about 500 mg to about 10 or 20 grams. Additionally, the composition may be formulated in a daily dosage format comprising vitamin B5 in the total amount of about 0.1 to about 1000 mg / kg, about 0.5 to about 500 mg / kg, about 1 to about 100 mg / kg, about 2 to about 200 mg / kg, about 5 to about 50 mg / kg, for example, about 10 mg / kg, about 20 or 25 mg / kg of the patient bodyweight. The appropriate dose may be administered in a single daily dose or as divided doses presented at appropriate intervals, for example as two, three, four, or more subdoses per day. The time duration of administration may range from weeks to months to years, e.g., about 1 week to about 20 weeks, or about 1 month to about 20 months, or for about 2, 3, 5 years or even longer as deemed appropriate for the patient.

[0033] For preparing pharmaceutical compositions containing Lactobacillus paracasei, optionally with vitamin B5, one or more inert and pharmaceutically acceptable carriers may be used. The pharmaceutical carrier can be either solid or liquid. Solid form preparations include, for example, powders, tablets, dispersible granules, capsules, cachets, and suppositories. A solid carrier can be one or more substances that can also act as diluents, flavoring agents, solubilizers, lubricants, suspending agents, binders, or tablet disintegrating agents; it can also be an encapsulating material.

[0034] In powders, the carrier is generally a finely divided solid that is in a mixture with the finely divided active component, e.g., Lactobacillus paracasei, L. paracasei culture medium, or ILA, optionally further in combination with vitamin B5. In tablets, the active ingredient is mixed with the carrier having the necessary binding properties in suitable proportions and compacted in the shape and size desired.

[0035] For preparing pharmaceutical compositions in the form of suppositories, a low-melting wax such as a mixture of fatty acid glycerides and cocoa butter is first melted and the active ingredient is dispersed therein by, for example, stirring. The molten homogeneous mixture is then poured into convenient-sized molds and allowed to cool and solidify.

[0036] Powders and tablets preferably contain between about 5%to about 100%by weight of the active ingredient (s) (e.g., Lactobacillus paracasei, L. paracasei culture medium, or ILA, optionally further in combination with vitamin B5) . Suitable carriers include, for example, magnesium carbonate, magnesium stearate, talc, lactose, sugar, pectin, dextrin, starch, tragacanth, methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, a low-melting wax, cocoa butter, and the like.

[0037] The pharmaceutical compositions can include the formulation of the active ingredient (s) e.g., Lactobacillus paracasei, L. paracasei culture medium, or ILA, optionally further in combination with vitamin B5, with encapsulating material as a carrier providing a capsule in which the active ingredient (s) (with or without other carriers) is surrounded by the carrier, such that the carrier is thus in association with the active ingredient (s) . In a similar manner, sachets can also be included. Tablets, powders, sachets, and capsules can be used as solid dosage forms suitable for oral administration.

[0038] Liquid pharmaceutical compositions include, for example, solutions suitable for oral administration or local delivery, suspensions, and emulsions suitable for oral administration. Sterile water solutions of the active component (e.g., Lactobacillus paracasei, L. paracasei culture medium, or ILA, optionally further in combination with vitamin B5) or sterile solutions of the active component in solvents comprising water, buffered water, saline, PBS, ethanol, or propylene glycol are examples of liquid or semi-liquid compositions suitable for oral administration or local delivery such as by rectal suppository. The compositions may contain pharmaceutically acceptable auxiliary substances as required to approximate physiological conditions, such as pH adjusting and buffering agents, tonicity adjusting agents, wetting agents, detergents, and the like.

[0039] Sterile solutions can be prepared by dissolving the active component (e.g., a live culture of Lactobacillus paracasei, L. paracasei culture medium, or ILA, optionally further with vitamin B5) in a previously sterilized solvent under sterile conditions. In some cases, the composition will consist essentially of Lactobacillus paracasei, optionally with vitamin B5, plus one or more physiological excipients, without another microorganism (e.g., other bacterial species such as other Lactobacilli or Bifidobacteria) present at a detectable level, which is defined as undetectable by means of a polymerase chain reaction. Similarly, in some cases, the composition will consist essentially of a Lactobacillus paracasei culture medium or ILA, optionally with vitamin B5, plus one or more physiological excipients, without any microorganism, including Lactobacillus paracasei, present at a detectable level. The resulting aqueous solutions may be packaged for use as is, or lyophilized, the lyophilized preparation being combined with a sterile aqueous carrier prior to administration. The pH of the preparations typically will be between 3 and 11, more preferably from 5 to 9, and most preferably from 7 to 8.

[0040] Single or multiple administrations of the compositions can be carried out with dose levels and pattern being selected by the treating physician. In any event, the pharmaceutical formulations should provide a quantity of an active agent sufficient to effectively improve liver health, to treat MASLD, or to reduce risk for MASLD, especially MASLD-HCC, in a recipient. III. Additional Therapeutic Agents

[0041] Additional known therapeutic agent or agents may be used in combination with an active agent such as Lactobacillus paracasei, optionally further in combination with a prebiotic such as vitamin B5, in the practice of the present invention for the purpose of improving liver health, treating or preventing MASLD (including MASLD-HCC) in a patient in need thereof. In such applications, one or more of agents previously known effective for promoting liver health or for treating liver diseases, including anti-cancer therapeutic agents, can be administered to patients concurrently with an effective amount of the active agent (s) of this invention either together in a single composition or separately in two or more different compositions.

[0042] For example, nutraceutical known to promote liver health, including silymarin, vitamin E, vitamin D, polyunsaturated fatty acids of the omega-3 series, astaxanthin, coenzyme Q10, berberine, curcumin, resveratrol, extracts of Salvia milthiorriza, or any combinations thereof, may be used together with the compositions of this invention.

[0043] On the other hand, therapeutic agents that are known to be effective for use to treat cancer, especially liver cancer, include Atezolizumab, Avastin (Bevacizumab) , Cabometyx (Cabozantinib-S-Malate) , Cyramza (Ramucirumab) , Durvalumab, Imfinzi (Durvalumab) , Imjudo (Tremelimumab-actl) , Ipilimumab, Keytruda (Pembrolizumab) , Lenvima (Lenvatinib Mesylate) , Lytgobi (Futibatinib) , Nexavar (Sorafenib Tosylate) , Opdivo (Nivolumab) , Pemazyre (Pemigatinib) , Pembrolizumab, Ramucirumab, Stivarga (Regorafenib) , Tecentriq (Atezolizumab) , Tremelimumab-actl, Yervoy (Ipilimumab) , and their combinations may be used along with the active agents (such as the probiotics, optionally with the prebiotics) of the present invention to enhance anti-HCC therapy’s effectiveness, reduce potential disease severity (including morbidity and mortality) , prevent / reduce risk of metastasis or recurrence, and improve patient survival and recovery from the disease. IV. Kits

[0044] The invention also provides kits for improving liver health, reducing risk for MASLD, or for treating MASLD, including MASLD-HCC, in an individual deemed appropriate recipient, e.g., one who has an elevated risk for MASLD, including MASLD-HHC, but has not yet diagnosed with the disease, according to the method disclosed herein. The kits typically include a plurality of containers, each containing a composition comprising an effective amount of Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paracasei culture medium, or ILA. Optionally, additional container (s) may be included in the kit providing composition (s) comprising vitamin B5. Further, additional liver-protecting nutraceutical agents or drugs that are known to be therapeutically effective for treating liver cancer, including for ameliorating the symptoms and reducing the severity of the disease, as well as for facilitating survival / recovery from the disease (such as those described in the last section or otherwise known in the pertinent technical field) may be included in the kit. The plurality of containers of the kit each may contain a different active agent / drug or a distinct combination of two or more of the active agents or drugs.

[0045] The kit may further include informational material providing instructions on how to dispense the pharmaceutical composition (s) , including description of the type of patients who may be treated (e.g., human patients who have been diagnosed with MASLD and are thus at increased risk for MASLD-HCC) , and in some cases information about the type of patients not to be included in the claimed method (e.g., those who have been diagnosed with a pre-existing condition that already requires the administration of the active component such as Lactobacillus paracasei, L. paracasei culture medium, or ILA, optionally along with vitamin B5, for example, cancer other than HCC, such as colorectal cancer) , as well as the dosage, frequency, and manner of administration, and the like. EXAMPLES

[0046] The following examples are provided by way of illustration only and not by way of limitation. Those of skill in the art will readily recognize a variety of non-critical parameters that could be changed or modified to yield essentially the same or similar results.MATERIALS AND METHODS MASH-HCC mouse models

[0047] Male C57BL / 6 mice at two-week-old were intraperitoneally injected with diethylnitrosamine (DEN; 25 mg / kg) . When coming to six-week-old, the mice were orally gavaged with L. paracasei (1×108 colony forming units / 200 μL) and 200 μL of phosphate-buffered saline (PBS) as negative control. At the same time, diet was changed from normal chow (NC) to high-fat high-cholesterol (HFHC) diet (36.6%carbohydrate, 43.7%fat, 19.7%protein, and 0.203%cholesterol; #SF11-078, Specialty Feeds, WA) . HFHC-fed DEN-treated mice were sacrificed at 28 weeks old. Mice fed with NC diet was considered as model control.

[0048] Another mouse model for MASH-HCC was also established. Two-week-old male C57BL / 6 mice were also intraperitoneally injected with DEN. Meanwhile, the NC diet was changed to a choline-deficient / high-fat diet (CDHFD; 60 kcal%fat, no choline; D19042402, Research Diets, New Brunswick, USA) . The mice were gavaged with L. paracasei or PBS. At 30 weeks old, the CDHFD-fed DEN-treated mice were sacrificed. Orthotopic MASH-HCC allograft model

[0049] Male conventional C54BL / 6 mice were firstly fed with HFHC diet for 12 weeks. Then, Murine Hepa 1-6 cells (2×106 cells / 10μL) were suspended in a mixture solution of PBS and Matrigel (1: 1) and intrahepatically injected into the left liver lobe of mice. After that, mice were gavaged with L. paracasei, PA or PBS. Tumor growth was monitored by weekly bioluminescence imaging (150mg / kg, i. p., Promega) . Mice were sacrificed at 3 weeks after intrahepatic injection. Anti-PD-1 antibody (clone RMP1-14, BioXCell) or IgG2α antibody control (clone 2A3, BioXCell) was given via i. p. injection (100μg / mouse, every 5 days) . For CD8+ T cell depletion, mice were injected with anti-mouse CD8α antibody (400μg for the first injection, i. p., clone 2.43, BioXCell) or IgG2β control (clone LTF-2, BioXCell) , followed by 200μg doses every three days for four times. Bacterial strains isolation and culture conditions

[0050] Healthy human fecal samples were collected and suspended in the PBS within 30 minutes. The obtained suspension was homogenized in beater and filtered through a 100μm strainer to remove larger particles. The fecal suspension was then plated on the agar plate and incubated in aerobic incubator at 37 ℃ for 24 hours. All colonies were purified by streak plate method and individually cultured for 24 hours in broth (Thermo Fisher Scientific, West Palm Beach, FL) at 37 ℃ in aerobic incubator. L. paracasei strain was confirmed by third generation sequencing. Metabolite extraction

[0051] For untargeted metabolomic profiling, 50 μL of bacterial conditional medium was mixed with 500 μL of extraction solution (methanol-to-water = 3: 1) containing an isotope-labelled internal standard. Sample mixtures were ultrasonicated in ice water and incubated at -40℃ for 60 minutes. Samples were then centrifuged at 12000 rpm for 15 minutes and supernatants were collected. The quality control sample was prepared by mixing an equal volume of supernatants from all samples.

[0052] For targeted detection of SCFAs, 50 μL of bacterial conditional medium or mouse portal vein serum was added to 200 μL of methanol containing an internal standard (4-chlorophenol, 1 μg / mL) . For mouse liver tissues and stools, 20 mg of samples was added to 200 μL of extraction solution (acetonitrile-to-methanol-to-water = 4: 4: 2) with the internal standard. After homogenisation, 80 μL of sample mixtures was vacuum dried for 2 hours and then derivatised by adding 40 μL of 3-nitrophenylhydrazine hydrochloride and 40 μL of N‐ (3‐dimethylaminopropyl) ‐N’ ‐ethylcarbodiimide hydrochloride, with incubation at 40℃ for 30 minutes. Upon centrifugation at 20000 ×g for 10 minutes, 90 μL of supernatants was collected and transferred to a fresh glass vial for liquid-chromatography-mass spectrometry (LC-MS) . LC-MS and metabolite annotation

[0053] LC-MS was performed by TSQ Altis Plus Triple Quadrupole Mass Spectrometer, coupled with Vanquish Flex UHPLC System (Thermo Fisher Scientific) . Chromatography separation was conducted using ACQUITY UPLC HSS T3 column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm;Waters, Milford, MA) . The auto-sampler temperature was 4℃, and the injection volume was 2 μL. MS / MS spectra were acquired on information-dependent acquisition mode in the acquisition software (Xcalibur, version 4.2 SP1) . The ESI source conditions were set as following: sheath gas flow rate = 50 Arb; aux gas flow rate = 15 Arb; capillary temperature =320oC; full MS resolution = 60000; MS / MS resolution = 15000; collision energy = 10 / 30 / 60 in NCE mode; spray voltage = 3.8 kV (positive) or -3.4 kV (negative) .

[0054] Raw data were converted to mzXML format using ProteoWizard (version 3.0.21229) and processed by XCMS (version 3.2) . R package CAMERA (version 3.16) was used for peak annotation. Peaks with relative standard deviation > 30%in quality control samples, or peaks with missing value (intensity = 0) in > 50%of samples, were discarded. Only matched MS and MS / MS spectra were included for metabolite annotation. The filtered MS / MS spectra were assessed by Human Metabolome Database, METLIN metabolite database, and an in-house database to characterise metabolites. Metabolites with MS2 score > 0.8 were included for subsequent analysis, with a total of 652 annotated MS / MS features. RNA sequencing

[0055] Total RNA extracted from cell line HKCI-2 was subjected to RNA sequencing (Illumina NovaSeq 6000 Sequencing System) performed by Novogene (Beijing, China) . TruSeq RNA Sample Preparation Kit (Illumina, San Diego, CA) was used for the construction of sequencing library. Data were presented as reads per kilobase of exon per million reads mapped (RPKM) . Sequencing reads were preceded by removing adapters using cutadapt (version 1.18) and mapped on the reference human genome (GENCODE version 30) by HISAT2 (version 2.1.0) with the default options. The number of reads mapped to each single gene was counted by HTSeq (version 0.11.2) with the option “-m 1 intersection-nonempty” . Gene expression levels were calculated as fragments per kilobase of exon per million mapped fragments (FPKM) by DESeq2 (version 3.16) . Differentially expressed genes (log2 fold change ≥ 2, -log (P) ≥ 10) were included for functional analysis using GO, KEGG, and Reactome pathway databases. Statistical analyses

[0056] All results are shown as mean ± standard deviation. Unpaired Student t-test or Mann-Whitney U test was used to compare the difference in numerical variables between two groups, and multiple t-test was used to compare different timepoints or stages between two groups. Two-way analysis of variance was used to compare the difference in numerical variables among three groups. Categorical variables between two groups were compared by Fisher’s exact test. All statistical analyses were performed and plotted using GraphPad Prism (version 9.0) or R language. Two-tailed p value smaller than 0.05 was considered statistically significant.RESULTS

[0057] To evaluate the role of L. paracasei, we first established two different MASLH-HCC mouse models by carcinogen injection (diethylnitrosamine (DEN) ) plus feeding of high-fat high-cholesterol diet (HFHC) (Figure 1A) or choline-deficient high-fat diet (CDHF) (Figure 1B) . Mice were daily gavaged with L. paracasei. Upon sacrifice, L. paracasei-treated mice had visually smaller tumor number and tumor load in both models, which was confirmed by histological examination (Figure 1C and 1D) . Significantly decreased cell proliferation in liver tissues was also observed in L. paracasei-treated mice (Figure 1E) . Moreover, L. paracasei markedly reduced serum levels of alanine aminotransferase (ALT) , aspartate aminotransferase (AST) , cholesterol, and triglycerides (Figure 1F) . Hence, the consistent findings between two mouse models indicated the antitumor effects of L. paracasei against MASLD-HCC.

[0058] We performed flow cytometric analysis to investigate the effects of L. paracasei on tumor microenvironment. In two MASLD-HCC mouse models, a consistent upregulation of IFN-γ (Figure 2A) and Granzyme B (Figure 2B) in CD8+ T cells was observed after L. paracasei treatment, indicating increased intratumoral infiltration of functional antitumor CD8+ T cells. In contrast, L. paracasei significantly reduced immunosuppressive Foxp3+CD25+ regulatory T cells (Treg) in mouse tumor tissues (Figure 2C and 2D) .

[0059] Given that L. paracasei was undetected in liver tissues of the gavaged mice, we speculated that its antitumor effects were attributed to its derivatives. We therefore cultured L. paracasei culture medium (Lp-CM) with mouse primary T cells, followed by flow cytometric analysis (Figure 3A) . Lp-CM significantly upregulated IFN-γ and Granzyme B in CD8+ T cells (Figure 3B) . Interestingly, both heat-inactivated or proteinase K-inactivated Lp-CM still increased IFN-γ and Granzyme B expression, indicating the molecules in Lp-CM that boosted antitumor T cell functions were not proteins (Figure 3B) . We then separated Lp-CM based on molecular weight (<3 kDa or ≥3 kDa) . Lp-CM with small molecular weight fraction significantly upregulated IFN-γ and Granzyme B in CD8+ T cells, whereas Lp-CM with large molecular weight fraction had no effects (Figure 3C) . Lp-CM also promoted the proliferation of CD8+ T cells, except for Lp-CM with large molecular weight fraction (Figure 3D) . Moreover, Lp-CM induced a reduction of Treg in a concentration-dependent manner (Figure 3E) . Collectively, these findings demonstrated that L. paracasei secretes non-protein small molecules to modulate antitumor immunity with enhanced effector CD8+ T cell function and reduced Treg infiltration, thereby inhibiting MASLD-HCC.

[0060] To characterize the functional molecule of L. paracasei, we performed untargeted metabolomics (Figure 4A) and identified that indole-3-lactic acid (ILA) is among the most enriched metabolite in L. paracasei conditioned medium (L. p CM) , compared to broth control (Figure 4B) . Targeted metabolomics confirmed elevated ILA levels in L. p CM (Figure 4C) and stools, portal vein serum, and liver tissues of L. paracasei-treated germ-free mice (Figure 4D) . We identified that ILA is accumulated in the nucleus of CD8+ T cells (Figure 4E) , and it enhanced CD8+ T cell function by increasing secretion of IFN-γ and Granzyme B (Figure 4F) . In addition, ILA treatment significantly reduced the growth (Figure 4G) and proliferation (Figure 4H) of human MASLD-HCC cells, meanwhile inducing cell apoptosis (Figure 4I) . Collectively, these findings indicates that ILA is the functional metabolite of L. paracasei to inhibit MASLD-HCC and boost antitumour immunity.

[0061] Patients with MALSD-HCC are known to have poor response to immune checkpoint blockade. Given by its immunomodulatory function, we evaluated the impacts of L. paracasei on anti-PD-1 immunotherapy in MASLD-HCC. We first established an orthotopic MASLD-HCC mouse model by inoculating a murine HCC cell line (Hepa1-6) into mouse liver with HFHC feeding (Figure 5A) . Once tumors were developed, mice were treated with anti-PD1 antibody by intraperitoneal injection, with oral gavage of L. paracasei or control. L. paracasei significantly boosted the efficacy of anti-PD-1 therapy, as evidenced by reduced tumor weight and tumor size compared to mice receiving anti-PD-1 monotherapy (Figure 5C and 5D) . Combined anti-PD-1 treatment plus L. paracasei also significantly upregulated IFN-γ+CD8+ T cells (Figure 5E) and Granzyme B+CD8+ T cells (Figure 5F) , indicating enhanced antitumor function of effector T cells. On the other hand, the proportion of immunosuppressive Foxp3+CD25+Treg was decreased by combined anti-PD-1 treatment plus L. paracasei (Figure 5G) .

[0062] To confirm whether L. paracasei exhibits antitumor effects by modulating tumor microenvironment, we depleted CD8+ T cells in orthotopic MASLD-HCC mice (Figure 6A) . Indeed, the antitumor effects of L. paracasei were abolished upon CD8+ T cell depletion, as no significant changes in tumor weight and tumor size were observed (Figure 6B-6D) . Flow cytometric analysis confirmed the successful depletion of CD8+ T cells in mouse peripheral blood and tumor tissues (Figure 6E) . Taken together, our findings illustrated that L. paracasei and its derived ILA protects against MASLD-HCC and boosts immunotherapy efficacy by promoting cytotoxic function of CD8+ T cells in the tumor microenvironment.DISCUSSION

[0063] This invention identified novel probiotics effective for the treatment and prevention of MASH, including MASH-HCC, development. MASH is a growing cause of HCC, with its related mortality expected to increase more than double in the next decade. Currently, there are no effective therapeutic and prophylactic methods for this highly prevalent disease. Probiotic therapy is a safe, inexpensive, and non-invasive strategy that can improve liver health as well as prevent / ameliorate liver diseases without side effects. This invention directs the development of probiotic compositions containing Lactobacillus paracasei, which are safe for oral ingestion, as a novel prophylactic as well as therapeutic strategy for individual suffering from or at risk of MASH, including MASH-HCC.

[0064] All patents, patent applications, and other publications, including GenBank Accession Numbers and equivalents, cited in this application are incorporated by reference in the entirety for all purposes.

Claims

1.A composition for use in improving liver health or for treating or preventing a metabolic dysfunction associated steatotic liver disease (MASLD) in a person in need thereof, comprising (1) an effective amount of Lactobacillus paracasei, L. paracasei culture medium, or indole-3-lactic acid (ILA) ; and (2) a physiologically acceptable excipient.2.The composition of claim 1, wherein the person has not been diagnosed with MASLD.3.The composition of claim 1, wherein the person has been diagnosed with MASLD but not MASLD-associated hepatocellular carcinoma (MASLD-HCC) .4.The composition of any one of claims 1-3, wherein the Lactobacillus paracasei is a strain deposited at Guangdong Microbial Culture Collection Center (GDMCC) under deposit No. 63727.5.The composition of any one of claims 1-4, further comprising an effective amount of vitamin B5.6.The composition of any one of claims 1-5, which is formulated for oral ingestion.7.The composition of claim 6, which is in the form of a food or beverage item.8.The composition of claim 6 or 7, which is formulated in the form of a powder, liquid, paste, cream, tablet, capsule, or caplet.9.The composition of claim 6 or 7, which is formulated in a daily dosage comprising about 109 to about 1011 CFU of L. paracasei or about 0.1 to about 1 mg of ILA per kg recipient bodyweight.10.The composition of claim 6 or 7, which is formulated in a daily dosage comprising about 1 mg to about 100 mg vitamin B5 per kg recipient bodyweight.11.A method for improving liver health or for treating or preventing MASLD in a person, comprising administering to the person an effective amount of the composition of any one of claims 1-10.12.The method of claim 11, wherein the person has not been diagnosed with MASLD.13.The method of claim 11, wherein the person has been diagnosed with MASLD but not MASLD-associated hepatocellular carcinoma (MASLD-HCC) .14.The method of claim 11, wherein the person is administered one composition comprising both L. paracasei and vitamin B5.15.The method of claim 11, wherein the person is administered two compositions, each comprising L. paracasei and vitamin B5, respectively.16.The method of any one of claims 11-15, wherein the administering step comprises oral ingestion of the composition (s) .17.The method of claim 16, wherein the administering step comprises oral ingestion prior to or with food intake.18.A kit for improving liver health or for treating or preventing MASLD in a person, comprising two compositions, the first comprising an effective amount of L. paracasei, L. paracasei culture medium, or indole-3-lactic acid (ILA) , optionally with an effective amount of vitamin B5, and the second comprising an effective amount of liver protective agent.19.The kit of claim 18, wherein the first composition further comprises an effective amount of vitamin B5.20.The kit of claim 18 or 19, wherein the first composition is formulated for oral ingestion.21.The kit of any one of claims 18 to 20, which is formulated in a daily dosage comprising about 109 to about 1011 CFU of L. paracasei or about 0.1 to about 1 mg of ILA and optionally about 1 mg to about 100 mg vitamin B5 per kg recipient bodyweight.

Images