Fusion proteins and methods of use thereof

Abstract

It relates to fusion proteins (e.g., inverted cytokine receptors) comprising the extracellular domain of an immunosuppressive cytokine receptor (e.g., IL-4R) and the intracellular domain of an immunostimulatory receptor (e.g., the IL-23 receptor complex). The fusion proteins (e.g., inverted cytokine receptors) bind inhibitory / suppressive cytokines and convert their intracellular signal to an immunostimulatory / activating signal. It further relates to polynucleotides encoding such fusion proteins, engineered cells expressing such fusion proteins, therapeutic use of such fusion proteins, and pharmaceutical compositions comprising such fusion proteins.

Description

FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE THEREOF

[0001] CROSS REFERENCE

[0002] This application claims benefit of priority of International Patent Application No. PCT / CN2023 / 107742 filed on July 17, 2023, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0003] SEQUENCE LISTING

[0004] This application incorporates by reference a Sequence Listing submitted with this application as XML file format, entitled “IEC240173PCT SEQUENCE LISTING. xml, ” created on July 16, 2024 having a size of 51,855 bytes.TECHNICAL FIELD

[0005] This disclosure relates to fusion proteins (e.g., inverted cytokine receptors) comprising the extracellular domain of an immunosuppressive cytokine receptor (e.g., IL-4R) and the intracellular domain of an immunostimulatory receptor (e.g., IL-23 receptor complex) .BACKGROUND

[0006] Although the adoptive transfer of T cells genetically engineered with a chimeric antigen receptor (CAR) has shown great promise as a therapeutic for hematological malignancies, limited success has been made in the application of CAR-T cells for the treatment of solid tumors. Existing theories believe that the immunosuppressive microenvironment of solid tumors, which features limited nutrients and oxygen, accumulation of inhibitory cells and cytokines, vascular disturbances, and endothelial dysfunction, poses a major obstacle for cancer immunotherapy including CAR-T cell therapy.

[0007] To increase immune cell proliferation and anti-tumor efficacy in the suppressive microenvironment, immune cell expressing CAR need to be modified to become intrinsically resistant to anti-inflammatory cytokines. Inverted cytokine receptors (ICR) can be used to increase immune cell (e.g., T cell) potency.SUMMARY

[0008] This disclosure relates to fusion proteins (e.g., inverted cytokine receptors (ICRs) ) comprising the extracellular domain of an immunosuppressive cytokine receptor (e.g., IL-4R) and  the intracellular domain of an immunostimulatory receptor (e.g., IL-23 receptor complex) . The fusion proteins bind inhibitory / suppressive cytokines and convert their intracellular signal to an immunostimulatory / activating signal. The disclosure further provides nucleic acids encoding such fusion proteins, polypeptides containing such fusion proteins, engineered cells expressing such fusion proteins, therapeutic use of such fusion proteins, and pharmaceutical compositions comprising such fusion proteins.

[0009] In one aspect, the disclosure is related to a fusion protein comprising: (1) an extracellular domain that specifically binds to interleukin-4 (IL-4) , and (2) an intracellular domain; wherein upon binding to IL-4, the fusion protein transmits an interleukin-23 (IL-23) pathway signal.

[0010] In some embodiments, the fusion protein comprises a first polypeptide chain and a second polypeptide chain.

[0011] In some embodiments, the first polypeptide chain comprises (1) a first extracellular domain that comprises an interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα) extracellular domain, and (2) a first intracellular domain that comprises an interleukin-12 receptor beta 1 subunit (IL-12Rβ1) intracellular domain or an interleukin-23 receptor (IL-23R) intracellular domain.

[0012] In some embodiments, the second polypeptide chain comprises (1) a second extracellular domain that comprises an interleukin-2 receptor gamma (IL-2Rγ) extracellular domain, and (2) a second intracellular domain that comprises an IL-12Rβ1 intracellular domain or an IL-23R intracellular domain.

[0013] In some embodiments, the first polypeptide chain comprises (1) a first extracellular domain that comprises an IL-4Rα extracellular domain, and (2) a first intracellular domain that comprises an IL-12Rβ1 intracellular domain, and the second polypeptide chain comprises (1) a second extracellular domain that comprises an IL-2Rγ extracellular domain, and (2) a second intracellular domain that comprises an IL-23R intracellular domain.

[0014] In some embodiments, the first polypeptide chain comprises (1) a first extracellular domain that comprises an IL-4Rα extracellular domain, and (2) a first intracellular domain that comprises an IL-23R intracellular domain, and the second polypeptide chain comprises (1) a second extracellular domain that comprises an IL-2Rγ extracellular domain, and (2) a second intracellular domain that comprises an IL-12Rβ1 intracellular domain.

[0015] In one aspect, the disclosure is related to a fusion protein comprising:

[0016] (a) a first polypeptide chain that comprises

[0017] (1) a first extracellular domain that comprises an IL-4Rα extracellular domain, and

[0018] (2) a first intracellular domain that comprises an IL-12Rβ1 intracellular domain, and

[0019] a second polypeptide chain that comprises

[0020] (1) a second extracellular domain that comprises an IL-2Rγ extracellular domain, and

[0021] (2) a second intracellular domain that comprises an IL-23R intracellular domain; or

[0022] (b) a first polypeptide chain that comprises

[0023] (1) a first extracellular domain that comprises an IL-4Rα extracellular domain, and

[0024] (2) a first intracellular domain that comprises an IL-23R intracellular domain, and

[0025] a second polypeptide chain that comprises

[0026] (1) a second extracellular domain that comprises an IL-2Rγ extracellular domain, and

[0027] (2) a second intracellular domain that comprises an IL-12Rβ1 intracellular domain.

[0028] In some embodiments, the first polypeptide chain and the second polypeptide chain are linked to each other via a 2A cleavable linker.

[0029] In some embodiments, the first extracellular domain and the second extracellular domain form a binding site for IL-4, wherein the first intracellular domain and the second intracellular domain form an IL-23 receptor complex, and wherein upon binding of the fusion protein to IL-4, signaling through the IL-23 receptor complex is transmitted.

[0030] In some embodiments, the IL-4Rα extracellular domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

[0031] In some embodiments, the IL-2Rγ extracellular domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.

[0032] In some embodiments, the IL-12Rβ1 intracellular domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.

[0033] In some embodiments, the IL-23R intracellular domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.

[0034] In some embodiments, the fusion protein further comprises a transmembrane domain.

[0035] In some embodiments, the transmembrane domain is selected from the group consisting of a transmembrane domain of IL-4Rα, a transmembrane domain of IL-2Rγ, a transmembrane domain of IL-12Rβ1, and a transmembrane domain of IL-23R.

[0036] In some embodiments, the transmembrane domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 7, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 7.

[0037] In some embodiments, the fusion protein comprises a first transmembrane domain in the first polypeptide chain and a second transmembrane domain in the second polypeptide chain; optionally, the first transmembrane domain and the second transmembrane domain can dimerize.

[0038] In some embodiments, the fusion protein further comprises a connection sequence located between the C-terminus of the extracellular domain and the N-terminus of the transmembrane domain.

[0039] In some embodiments, the connection sequence comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 6, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 6.

[0040] In some embodiments, the fusion protein comprises a first and / or a second polypeptide chain that comprises an amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9-14, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9-14.

[0041] In some embodiments, the fusion protein is an inverted cytokine receptor (ICR) .

[0042] In one aspect, the disclosure is related to a nucleic acid comprising one or more nucleic acid sequences encoding the fusion protein described herein or a portion thereof.

[0043] In some embodiments, the nucleic acid further comprises a second nucleic acid sequence encoding an engineered receptor, wherein the engineered receptor comprises an extracellular antigen binding domain or ligand binding domain, and optionally an intracellular signaling domain.

[0044] In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding the engineered receptor is upstream or downstream to at least one of the one or more nucleic acid sequences encoding the fusion protein, and optionally wherein the engineered receptor nucleic acid sequence and the fusion protein nucleic acid sequence are separated by a linker nucleic acid sequence encoding a 2A cleavable linker.

[0045] In some embodiments, the 2A cleavable linker comprises an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 31-33, or a functional variant having at least about 90%sequence identity thereto.

[0046] In some embodiments, the engineered receptor is selected from the group consisting of an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) , a T cell antigen coupler (TAC) or a portion thereof.

[0047] In some embodiments, the engineered receptor is a CAR.

[0048] In some embodiments, the CAR comprises an extracellular antigen binding domain that specifically binds to an antigen, wherein the antigen is a tumor antigen selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2 (HER-2) , ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, and PD-L2.

[0049] In some embodiments, the tumor antigen is GPC3.

[0050] In some embodiments, the CAR comprises a primary intracellular signaling domain of an immune cell, and / or a co-stimulatory signaling domain.

[0051] In some embodiments, the primary intracellular signaling domain is derived from CD3ζ, and wherein the co-stimulatory signaling domain is derived from a co-stimulatory molecule selected from the group consisting of CD27, CD28, CD137, OX40, CD30, CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligands of CD83 and combinations thereof.

[0052] In some embodiments, the CAR comprises a transmembrane domain derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 and PD1.

[0053] In some embodiments, the CAR further comprises a hinge domain located between the C-terminus of the extracellular antigen binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain.

[0054] In some embodiments, the CAR further comprises a signal peptide located at the N-terminus of the extracellular antigen binding domain.

[0055] In some embodiments, the nucleic acid encodes an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 9-14 and 20-22, or a functional variant having at least about 90%sequence identity thereto.

[0056] In one aspect, the disclosure is related to a vector comprising the nucleic acid described herein.

[0057] In one aspect, the disclosure is related to an engineered cell comprising the fusion protein described herein, the nucleic acid described herein, and / or the vector described herein.

[0058] In some embodiments, the engineered cell further comprises an engineered receptor, wherein the engineered receptor comprises an extracellular antigen binding domain or ligand binding domain, and optionally an intracellular signaling domain.

[0059] In some embodiments, the engineered receptor is selected from the group consisting of an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) , a T cell antigen coupler (TAC) or a portion thereof.

[0060] In some embodiments, the engineered receptor specifically binds to an antigen.

[0061] In some embodiments, the engineered cell comprises a polypeptide encoding a fusion protein and / or a polypeptide encoding a CAR, and wherein the polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9-14 and 20-22, or a functional variant having at least about 90%sequence identity thereto.

[0062] In some embodiments, the engineered cell is an immune cell.

[0063] In some embodiments, the immune cell is selected from a group consisting of T cell, NK cell, peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , hematopoietic stem cell, pluripotent stem cell, an embryonic stem cell, and a combination thereof.

[0064] In some embodiments, the immune cell is a T cell, optionally the immune cell is an αβT cell or a γδT cell.

[0065] In one aspect, the disclosure is related to a pharmaceutical composition, comprising the engineered cell described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0066] In one aspect, the disclosure is related to a method for producing an engineered cell, the method comprising introducing the vector described herein into a cell.

[0067] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering to the subject in need thereof a therapeutically effective amount of the engineered cell described herein, or the pharmaceutical composition described herein.

[0068] In some embodiments, the disease or disorder is cancer, autoimmune disease, or tumor.

[0069] In some embodiments, the disease or disorder is breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, melanoma, oral cancer, mesothelioma, ovarian cancer, colorectal cancer, gastric cancer, cervical cancer, brain cancer, skin cancer, multiple myeloma, lymphoma, epithelial neoplasms, soft tissue sarcoma, esophageal cancers, or CNS tumors.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0070] FIGs. 1a-1b show the design schemes of two IL4R-IL23R inverted cytokine receptors (ICRs) . The IL4R-IL23R ICR is composed of two fusion polypeptide chains, two fusion polypeptide chains formed by a self-cleaving 2A linker cleavage after expression of IL4R-IL23R ICR nucleic acid sequence. The two polypeptide chains can form a dimeric fusion protein. As shown in FIG. 1a, the nucleic acid sequence of IL4R-IL23R#01 from the 5'end to the 3'end comprises an IL-4Rα extracellular domain (ECD) , and IL-12Rβ1 transmembrane domain (TM) and intracellular domain (ICD) , a 2A linker, an IL-2Rγ extracellular domain (ECD) , and IL-23R transmembrane domain (TM) and intracellular domain (ICD) . As shown in FIG. 1b, the nucleic acid sequence of IL4R-IL23R#02 from the 5'end to the 3'end comprises an IL-2Rγ extracellular domain (ECD) , and an IL-12Rβ1 intracellular domain (ICD) a 2A linker, an IL-4Rα extracellular domain (ECD) , and an IL-23R intracellular domain (ICD) . Then the ICR sequence was linked to the sequence encoding CAR by a self-cleaving 2A (e.g., P2A) linker.

[0071] FIGs. 2a-2h show the pSTATs signaling pathway activation of CAR-T cells after being treated with IL-4 in vitro. FIGs. 2a-2f show the histogram of phosphorylated STAT3 and STAT4 expression by flow cytometry under the action of different concentrations of IL-4. FIGs. 2g-2h show the median fluorescence intensity (median) of phosphorylated STAT3 and STAT4 expression under the action of IL-4. Results showed that after being treated with IL-4, the expression levels of pSTAT3 and pSTAT4 in H93-IL4R-IL23R#01 and H93-IL4R-IL23R#02 CAR-T cells were increased significantly, while the expression levels of pSTAT3 and pSTAT4 in H93 CAR-T cells had no obvious changes.

[0072] FIGs. 3a-3c show the HCC CAR-T cell expansion ability after being treated with five stimulation rounds in the re-challenge assay. The CAR positive percentage (FIG. 3a) , CAR-T cell amplification fold (FIG. 3b) and CAR-T cell viability were detected (FIG. 3c) . After serial antigen stimulation, H93-IL4R-IL23R#01 CAR-T cells showed superior expansion ability. R0, R1, R2, R3, R4 and R5 mean round 1, round2, round3, round 4 and round 5, respectively.

[0073] FIGs. 4a-4b show the results of an in vitro long-term cytotoxicity assay of GPC3 CAR-T cells against HCC positive cell line (Hep3B2.1-7) with or without 10 ng / mL IL-4, respectively. The result showed that the long-term cytotoxicity of H93-IL4R-IL23R#01 CAR-T cells was significantly enhanced in the presence of 10 ng / mL IL-4.

[0074] FIGs. 5a-5b show the IFNγ and TNFα release of GPC3 CAR-T cells co-cultured with target cells in the long-term cytotoxicity assay with or without 10 ng / mL IL-4, respectively. In the presence of 10 ng / mL IL-4, the IFNγ and TNFα release of H93-IL4R-IL23R#01 CAR-T cells were up-regulated, while the IFNγ and TNFα release of H93 CAR-T cells were significantly decreased.

[0075] FIG. 6 shows the sequences listed in the present application.DETAILED DESCRIPTION

[0076] Cytokines are a broad category of small proteins important in cell signaling. Cytokines are peptides and cannot cross the lipid bilayer of cells to enter the cytoplasm. Cytokines have been shown to be involved in autocrine, paracrine and endocrine signaling as immunomodulating agents. Among these cytokines, interleukins (ILs) are typically expressed and secreted by white blood cells (leukocytes) as well as some other body cells. Each cytokine has different functions and can provoke different responses depending on the target, cellular source and different phase of immune response. It is well-recognized that cytokines, chemokines and their receptors play pivotal roles in regulating the functional and phenotypic features of CAR expressing cells (e.g., CAR-T cells) ; and influencing parameters such as persistence, trafficking, memory cell formation and proliferation.

[0077] Immunosuppressive cytokines including IL-10, TGFβ and IL-4, are one of the key components of tumor microenvironment (TME) contributing to CAR-T cell dysfunction. These cytokines induce immunosuppression via several mechanisms such as recruitment and activation of regulatory T cells (Tregs) , myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) , inhibition of the effector function of CAR-T cells. In addition, they can inhibit the activity of several endogenous antitumor immune cells like T cells, NK cells, dendritic cells, and M1 macrophages.

[0078] To increase immune cell potency in the suppressive microenvironment, CAR expressing immune cells can be modified to become intrinsically resistant to anti-inflammatory cytokines. An inverted cytokine receptor (ICR) is a modified form of cytokine receptor designed to enhance the activity of immune cells by overcoming cytokine-induced immunosuppression.

[0079] The present disclosure provides a fusion protein comprising: (1) an extracellular domain that specifically binds to interleukin-4 (IL-4) , and (2) an intracellular domain; wherein upon binding to IL-4, the fusion protein transmits an interleukin-23 (IL-23) pathway signal. In some embodiments, the fusion protein is an inverted cytokine receptor (ICR) . The ICRs may comprise the extracellular domain of an immunosuppressive cytokine receptor (e.g., IL-4R) and the intracellular domain of an immunostimulatory receptor (e.g., IL-23R) .

[0080] As used herein, the term “inverted cytokine receptor” or “ICR” generally means a chimeric protein comprising the extracellular domain of one cytokine receptor and the intracellular domain of a different cytokine receptor. This chimeric protein may be designed to act as a “switch receptor, ” which can counteract the effects of immunosuppressive cytokines in certain diseases, particularly cancer. ICRs may be created by swapping the extracellular domain of a cytokine receptor that recognizes immunosuppressive cytokines with the extracellular domain of a cytokine receptor that recognizes cytokines involved in immune activation. When the ICR encounters an immunosuppressive cytokine, it may trigger the downstream signaling pathway of the activating cytokine receptor, which can help to restore or enhance immune function.

[0081] As used herein, the term “IL-4Rα” refers to a polypeptide derived from a wild-type IL-4 receptor alpha or a functional variant thereof. The IL-4Rα may be a wild-type IL-4Rα (e.g., human IL-4Rα) . The IL-4Rα may have one or more mutations (e.g., insertions, deletions, or substitutions) . The IL-4Rα may be a human IL-4Rα. An IL-4Rα extracellular domain can encompass the extracellular domain derived from a wild-type IL-4Rα or a functional variant thereof, or a portion thereof.

[0082] As used herein, the term “IL-23R” refers to a polypeptide derived from a wild-type IL-23R or a functional variant thereof. The IL-23R may be a wild-type IL-23R (e.g., human IL-23R) . The IL-23R may have one or more mutations (e.g., insertions, deletions, or substitutions) . The IL-23R may be a human IL-23R.

[0083] As used herein, the term “IL-2Rβ” refers to a polypeptide derived from a wild-type IL-2Rβ or a functional variant thereof. The IL-2Rβ may be a wild-type IL-2Rβ (e.g., human IL-2Rβ) .  The IL-2Rβ may have one or more mutations (e.g., insertions, deletions, or substitutions) . The IL-2Rβ may be a human IL-2Rβ.

[0084] As used herein, the term “IL-2Rγ” refers to a polypeptide derived from a wild-type IL-2Rγ or a functional variant thereof. The IL-2Rγ may be a wild-type IL-2Rγ (e.g., human IL-2Rγ) . The IL-2Rγ may have one or more mutations (e.g., insertions, deletions, or substitutions) . The IL-2Rγ may be a human IL-2Rγ.

[0085] As used herein, the term “IL-12Rβ1” refers to a polypeptide derived from a wild-type IL-12Rβ1 or a functional variant thereof. The IL-12Rβ1 may be a wild-type IL-12Rβ1 (e.g., human IL-12Rβ1) . The IL-12Rβ1 may have one or more mutations (e.g., insertions, deletions, or substitutions) . The IL-12Rβ1 may be a human IL-12Rβ1.

[0086] As used herein, the terms “extracellular domain” or “extracellular region” are used interchangeably herein to refer to the portion of a receptor that is outside the cell membrane. The extracellular domain can be entire portion of a receptor that is outside the cell membrane, or just a part thereof (e.g., at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%of the entire portion) . The extracellular domain can be derived from the extracellular domain of a wild-type receptor or a functional variant thereof. The extracellular domain may have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, or substitutions. An IL-4Rα extracellular domain may be the extracellular domain derived from a wild-type IL-4Rα or a functional variant thereof, or a portion thereof.

[0087] As used herein, the terms “intracellular domain” , “intracellular region” or “cytoplasmic region” are used interchangeably herein to refer to the portion of a receptor that is inside the cell. The intracellular domain can be entire portion of a receptor that is inside the cell, or just a part thereof (e.g., at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%of the entire portion) . The intracellular domain can be derived from the intracellular domain of a wild-type receptor or a functional variant thereof. The intracellular domain may have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, or substitutions. An IL-23R intracellular domain may be the intracellular domain derived from a wild-type IL-23R or a functional variant thereof, or a portion thereof. An IL-12Rβ1 intracellular domain may be the intracellular domain derived from a wild-type IL-12Rβ1 or a functional variant thereof, or a portion thereof.

[0088] As used herein, the terms “transmembrane domain” or “transmembrane region” or are used interchangeably herein to refer to the portion of a receptor that is embedded in the cell  membrane. The transmembrane domain can be entire portion of a receptor that is embedded in the cell membrane, or just a part thereof (e.g., at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%of the entire portion) . The transmembrane domain can be derived from the transmembrane domain of a wild-type receptor or a functional variant thereof. The transmembrane domain may have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, or substitutions. The transmembrane domain may be a transmembrane domain of an ICR. The transmembrane domain may be a transmembrane domain of a CAR.

[0089] As used herein, the terms “hinge domain” or “hinge region” or are used interchangeably herein to refer to the portion of a receptor that connects the transmarine region and the extracellular domain. The hinge region may be part of an extracellular domain. The hinge region can be derived from the hinge region of a wild-type receptor or a functional variant thereof. The hinge region may have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, or substitutions. The hinge region may be a hinge region of an ICR. The hinge region may be a hinge region of a CAR.

[0090] As used herein, a “vector” is any construct capable of delivering one or more polynucleotides of interest to a host cell when the vector is introduced to the host cell. An “expression vector” is capable of delivering and expressing the one or more polynucleotides of interest as an encoded polypeptide in a host cell into which the expression vector has been introduced. Thus, in an expression vector, the polynucleotide of interest is positioned for expression in the vector by being operably linked with regulatory elements such as a promoter, enhancer, and / or a poly-Atail, either within the vector or in the genome of the host cell at or near or flanking the integration site of the polynucleotide of interest such that the polynucleotide of interest will be translated in the host cell introduced with the expression vector.

[0091] As used herein, the term “chimeric antigen receptor” or “CAR” as used herein refers to genetically engineered receptors, which can be used to graft one or more antigen specificity onto immune effector cells, such as T cells. Some CARs are also known as “artificial T-cell receptors, ” “chimeric T cell receptors, ” or “chimeric immune receptors. ” The CAR may comprise an extracellular ligand binding domain or an extracellular antigen binding domain specific for one or more antigens (such as tumor antigens) , a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain of a T cell and / or other receptors. “CAR-T cell” refers to a T cell that expresses a CAR.

[0092] As used herein, the term “T-cell receptor” or “TCR” as used herein refers to an endogenous or modified T-cell receptor comprising an extracellular antigen binding domain that  binds to a specific antigenic peptide bound in an MHC molecule. The TCR may comprise a TCRαpolypeptide chain and a TCRβ polypeptide chain. The TCR may comprise a TCRγ polypeptide chain and a TCRδ polypeptide chain. The TCR may specifically bind a tumor antigen. “TCR-T” refers to a T cell that expresses a recombinant TCR. Expression of a heterologous antigen receptor, such as a heterologous TCR or CAR, can alter the immunogenic specificity of the T cells so that they recognize or display improved recognition for one or more tumor antigens that are present on the surface of the cancer cells of an individual with cancer.

[0093] As used herein, the term “fusion protein” refers to a protein complex having one or more polypeptides with desired functions. The construct may comprise or consist of one polypeptide. The fusion protein may be a fusion polypeptide.

[0094] As used herein, the term “cancer” refers to cells having the capacity for autonomous growth. Examples of such cells include cells having an abnormal state or condition characterized by rapidly proliferating cell growth. The term is meant to include cancerous growths, e.g., tumors; oncogenic processes, metastatic tissues, and malignantly transformed cells, tissues, or organs, irrespective of histopathologic type or stage of invasiveness. Also included are malignancies of the various organ systems, such as respiratory, cardiovascular, renal, reproductive, hematological, neurological, hepatic, gastrointestinal, and endocrine systems; as well as adenocarcinomas which include malignancies such as most colon cancers, renal-cell carcinoma, prostate cancer and / or testicular tumors, non-small cell carcinoma of the lung, and cancer of the small intestine. Cancer that is “naturally arising” includes any cancer that is not experimentally induced by implantation of cancer cells into a subject, and includes, for example, spontaneously arising cancer, cancer caused by exposure of a patient to a carcinogen (s) , cancer resulting from insertion of a transgenic oncogene or knockout of a tumor suppressor gene, and cancer caused by infections, e.g., viral infections. The term “carcinoma” is art recognized and refers to malignancies of epithelial or endocrine tissues. The term also includes carcinosarcomas, which include malignant tumors composed of carcinomatous and sarcomatous tissues. An “adenocarcinoma” refers to a carcinoma derived from glandular tissue or in which the tumor cells form recognizable glandular structures. The term “sarcoma” is art recognized and refers to malignant tumors of mesenchymal derivation. The term “hematopoietic neoplastic disorders” includes diseases involving hyperplastic / neoplastic cells of hematopoietic origin. A hematopoietic neoplastic disorder can arise from myeloid, lymphoid or erythroid lineages, or precursor cells thereof.

[0095] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human, to whom treatment according to the methods of the present disclosure is provided. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated by the present disclosure. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals.

[0096] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs. Methods and materials are described herein for use in the present disclosure; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0097] Fusion Protein (e.g., Inverted Cytokine Receptor)

[0098] In one aspect, the present disclosure provides a fusion protein comprising: (1) an extracellular domain that specifically binds to interleukin-4 (IL-4) , and (2) an intracellular domain; wherein upon binding to IL-4, the fusion protein transmits an interleukin-23 (IL-23) pathway signal.

[0099] In one aspect, the present disclosure provides a fusion protein comprising: (a) a first polypeptide chain that comprises (1) a first extracellular domain that comprises an extracellular domain of a cytokine receptor, and (2) a first intracellular domain that comprises an intracellular domain of a cytokine receptor, and (b) a second polypeptide chain that comprises (3) a second extracellular domain that comprises an extracellular domain of a cytokine receptor, and (4) a second intracellular domain that comprises an intracellular domain of a cytokine receptor, wherein the first extracellular domain and the second extracellular domain form a binding site for IL-4, and the first intracellular domain and the second intracellular domain form an IL-23 receptor complex,  and wherein upon binding of the fusion protein to IL4, signaling through the IL-23 receptor complex is transmitted.

[0100] The the first extracellular domain and the second extracellular domain may be derived from a cytokine receptor for an immunosuppressive cytokine, e.g., TGFβ, IL-10, IL-4, IL-13, IL-6, IL-8, IL-5, VEGF, IL-22, IL-1, IL-1β, IL-35, TNF, GM-CSF, M-CSF, or G-CSF. The first intracellular domain and the second intracellular domain may be derived from a cytokine receptor for an immunostimulatory cytokine, e.g., TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, CD28, OX-40, 4-1BB, CD80, CD86, ICOS, CD40, CD27, CD30, CD226, IL-7, IL-2, IL-15, IL-21, IL-12, IL-18, IL-9, IL-23, or IFN-γ.

[0101] In some embodiments, the fusion protein comprises a first polypeptide chain comprises (1) a first extracellular domain that comprises an interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα) extracellular domain, and (2) a first intracellular domain that comprises an interleukin-12 receptor beta 1 subunit (IL-12Rβ1) intracellular domain or an interleukin-23 receptor (IL-23R) intracellular domain. In some embodiments, the fusion protein comprises a second polypeptide chain comprises (1) a second extracellular domain that comprises an interleukin-2 receptor gamma (IL-2Rγ) extracellular domain, and (2) a second intracellular domain that comprises an interleukin-12 receptor beta 1 subunit (IL-12Rβ1) intracellular domain or an IL-23R intracellular domain.

[0102] Particularly, the present disclosure provides a fusion protein comprising a first extracellular domain and a second extracellular domain derived from an IL-4 receptor (e.g., IL-4Rα, or IL-2Rγ) for IL-4, and a first intracellular domain and a second intracellular domain derived from an IL-23 receptor complex (e.g., IL-12Rβ1, or IL-23R) . In some embodiments, the fusion protein comprising:

[0103] (a) a first polypeptide chain that comprises

[0104] (1) a first extracellular domain that comprises an IL-4Rα extracellular domain, and

[0105] (2) a first intracellular domain that comprises an IL-12Rβ1 intracellular domain, and a second polypeptide chain that comprises

[0106] (3) a second extracellular domain that comprises an IL-2Rγ extracellular domain, and

[0107] (4) a second intracellular domain that comprises an IL-23R intracellular domain; or

[0108] (b) a first polypeptide chain that comprises

[0109] (1) a first extracellular domain that comprises an IL-4Rα extracellular domain, and

[0110] (2) a first intracellular domain that comprises an IL-23R intracellular domain, and a second polypeptide chain that comprises

[0111] (3) a second extracellular domain that comprises an IL-2Rγ extracellular domain, and

[0112] (4) a second intracellular domain that comprises an IL-12Rβ1 intracellular domain.

[0113] In some embodiments, the fusion protein is an inverted cytokine receptor (ICR) .

[0114] Inverted cytokine receptor (ICR) is a fusion protein created by fusing the extracellular domain (s) of one or more cytokine receptors with the intracellular domain (s) of a different cytokine receptors. This fusion protein can be designed to act as a “switch receptor, ” which can counteract the effects of immunosuppressive cytokines in certain diseases, particularly cancer. ICRs may be created by swapping the extracellular domain of a cytokine receptor that recognizes immunosuppressive cytokines with the extracellular domain of a cytokine receptor that recognizes cytokines involved in immune activation. When the ICR encounters an immunosuppressive cytokine, it may trigger the downstream signaling pathway of the activating cytokine receptor, which can help to restore or enhance immune function.

[0115] IL-4 is largely immunosuppressive. IL-4 is involved in the differentiation of CD4 T cells into IL-4-producing Th2 cells, which have been associated with less antitumor activity than IFNγ-producing CD4 T cells (Th1) . Adoptive transfer of tumor-specific IL-4-producing cytotoxic CD8 T cells (Tc2) was also less effective in controlling tumor growth compared to IFNγ-producing CD8 T cells (Tc1) . Additionally, several cancer types express IL-4 and the IL-4R, which suggests a role in tumor progression. The IL-4Rα chain (CD124) is a 140 kDa heterodimeric complex, serving as a common monomer in both the type 1 and type 2 receptor complexes. IL-4Rα interacts with the γ chain of the IL-2 receptor (also called IL-2Rγ, γc, common gamma chain, or CD132) chain to form the type 1 IL-4 receptor, and can also interacts with the 65–70 kDa IL-13-binding receptor alpha 1 (IL-13Rα1) chain to form the type 2 IL-4 / IL-13 receptor.

[0116] IL-2 regulates the activities of white blood cells (leukocytes, often lymphocytes) that are responsible for immunity. IL-2 is part of the body's natural response to microbial infection, and in discriminating between foreign ( "non-self" ) and "self" . IL-2 mediates its effects by binding to IL-2 receptors, which are expressed by lymphocytes. The major sources of IL-2 are activated CD4+ T cells and activated CD8+ T cells. IL-2 binds to the IL-2 receptor, which has three forms, generated by different combinations of three different proteins, often referred to as "chains" : α (alpha) (also called IL-2Rα, CD25, or Tac antigen) , β (beta) (also called IL-2Rβ, or CD122) , and  γ (gamma) (also called IL-2Rγ, γc, common gamma chain, or CD132) . These subunits are also parts of receptors for other cytokines. The three IL-2R forms include α, βγ, and αβγ. The α chain binds IL-2 with low affinity. The combination of β and γ together form a βγ complex that binds IL-2 with intermediate affinity, primarily on memory T cells and NK cells. All three receptor chains form the αβγ complex that binds IL-2 with high affinity (Kd ～ 10-11 M) on activated T cells and regulatory T cells. The α chain does not participate in signaling, but the β chain is complexed with an enzyme called Janus kinase 1 (JAK1) , that is capable of adding phosphate groups to molecules. Similarly the γ chain complexes with another tyrosine kinase called JAK3. These enzymes are activated by IL-2 binding to the external domains of the IL-2R. As a consequence, three intracellular signaling pathways are initiated, the MAP kinase pathway, the Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) pathway, and the JAK-STAT pathway.

[0117] IL-4 binds to a cell surface receptor complex that consists of IL-4Rα and IL-2Rγ. The receptors for IL-4 and IL-2 have several features in common; both use the IL-2Rγ as a receptor component, and both activate the Janus kinases JAK-1 and JAK-3. In spite of these similarities, IL-4 evokes specific responses, including the tyrosine phosphorylation of 4PS / IRS-2 and the induction of CD23.

[0118] IL-23 is one of the STAT3-activating cytokines and consists of IL-23α p19 and IL-12βp40 subunits, both of which are expressed by activated macrophages and dendritic cells. IL-23 is part of the IL-12 family of cytokines. IL-23 is known to promote the proliferation of memory T cells and especially T helper type 17 (TH17) cells expressing the IL-23 receptor (IL-23R) . IL-23 is expressed chiefly by the macrophages and DCs. The IL-23R is found on memory T cells, NKT cells, macrophages, DCs, and naive T cells upon activation by TGF-β and IL-6. The main biological effects of IL-23 identified initially consist of stimulation of antigen presentation by DCs, T cell differentiation to Th17 cells, and production of interferon-γ (IFN-γ) . IL-23 acts also as an end-stage effector cytokine through direct action on macrophages. This can be in part interpreted as an autocrine loop of IL-23 on macrophages. In addition, intraperitoneal administration of recombinant IL-23 in mice induces expression of mRNA coding for IL-1 and TNF-α in peritoneal macrophages. Incorporating p40 in CAR-or TCR-engineered T cells enhanced their antitumor activity in xenograft and syngeneic mouse models.

[0119] The functional receptor for IL-23 (the IL-23 receptor complex) consists of a heterodimer between the interleukin-12 receptor β1 subunit (IL-12Rβ1) and IL-23R. In complex  with IL-12Rβ1, IL-23R is activated by the cytokine IL-23. IL-23R is a type I penetrating protein and includes a signal peptide, an N-terminal fibronectin III-like domain and an intracellular part that contains three potential tyrosine phosphorylation domains.

[0120] In one aspect, the present disclosure provides a fusion protein (e.g., ICR) comprising an extracellular domain derived from an IL-4 receptor (e.g., IL-4Rα) . The extracellular domain (i.e., IL-4Rα, or IL-2Rγ) may specifically bind to IL-4. Upon binding to IL-4, the fusion protein (e.g., ICR) may be activated by IL-4 (e.g., human IL-4) . Upon binding IL-4 by the IL-4R extracellular domain, the fusion protein (e.g., ICR) may activate signaling of the IL-23R intracellular signaling domain that is transduced through native cellular elements to provide for a biological activity that mimics the native response of the IL-23R (e.g., phosphorylation of STAT3 and / or STAT4) .

[0121] The ICR may be a fusion protein that comprises two polypeptide chains. The ICR may comprise a first polypeptide chain and a second polypeptide chain. The first polypeptide chain may comprise a first extracellular domain derived from an IL-4R (e.g., IL-4Rα) and a first intracellular domain derived from an IL-12Rβ1. The second polypeptide chain may comprise a second extracellular domain derived from an IL-2R (e.g., IL-2Rγ) and a second intracellular domain derived from an IL-23R. Alternatively, the first polypeptide chain may comprise a first extracellular domain derived from an IL-2R (e.g., IL-2Rγ) and a first intracellular domain derived from an IL-12Rβ1. The second polypeptide chain may comprise a second extracellular domain derived from an IL-4R (e.g., IL-4Rα) and a second intracellular domain derived from an IL-23R. The ICRs described herein may have the structures and or sequences described in Table 1.

[0122] Each of the first polypeptide chain and the second polypeptide chain may further comprise a transmembrane domain between the extracellular domain and the intracellular domain. In some embodiments, the fusion protein comprises a first transmembrane domain in the first polypeptide chain and a second transmembrane domain in the second polypeptide chain; optionally, the first transmembrane domain and the second transmembrane domain can dimerize. The first polypeptide chain may comprise, from the N-terminus to the C-terminus, a first extracellular domain derived from an IL-4R (e.g., IL-4Rα) , a first transmembrane domain (e.g., a transmembrane domain derived from IL-12Rβ1) , and a first intracellular domain derived from an IL-12Rβ1. The second polypeptide chain may comprise, from the N-terminus to the C-terminus, a second extracellular domain derived from an IL-2R (e.g., IL-2Rγ) , a second transmembrane  domain (e.g., a transmembrane domain derived from IL-23R) , and a second intracellular domain derived from an IL-23R. Alternatively, the first polypeptide chain may comprise, from the N-terminus to the C-terminus, a first extracellular domain derived from an IL-2R (e.g., IL-2Rγ) , a first transmembrane domain (e.g., a transmembrane domain derived from IL-12Rβ1) , and a first intracellular domain derived from an IL-12Rβ1. The second polypeptide chain may comprise, from the N-terminus to the C-terminus, a second extracellular domain derived from an IL-4R (e.g., IL-4Rα) , a second transmembrane domain (e.g., a transmembrane domain derived from IL-23R) , and a second intracellular domain derived from an IL-23R.

[0123] The fusion protein (e.g., ICR) may comprise an IL-4Rα extracellular domain (ECD) . The IL-4Rα extracellular domain may comprise an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The IL-4Rαextracellular domain (ECD) may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations (e.g., as compared to SEQ ID NO: 1 or the entire wild-type IL-4Rα extracellular domain) . These mutations can be amino acid insertions, deletions, or substitutions. The insertions, deletions, and substitutions can be within the IL-4Rα extracellular domain, or at one or both terminal ends of the IL-4Rα extracellular domain.

[0124] The fusion protein (e.g., ICR) may comprise an IL-2Rγ extracellular domain (ECD) . The IL-2Rγ extracellular domain may comprise an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. The IL-2Rγextracellular domain (ECD) may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations (e.g., as compared to SEQ ID NO: 5 or the entire wild-type IL-2Rγ extracellular domain) . These mutations can be amino acid insertions, deletions, or substitutions. The insertions, deletions, and substitutions can be within the IL-2Rγ extracellular domain, or at one or both terminal ends of the IL-2Rγ extracellular domain.

[0125] The fusion protein (e.g., ICR) may comprise an IL-23R intracellular domain (ICD) . IL-23R intracellular domain may comprise an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. The IL-23R ICD may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations (e.g., as compared to SEQ ID NO: 8 or the  entire wild-type IL-23R ICD) . These mutations can be amino acid insertions, deletions, or substitutions. The insertions, deletions, and substitutions can be within the IL-23R ICD, or at one or both terminal ends of the IL-23R ICD.

[0126] The fusion protein (e.g., ICR) may comprise an IL-12Rβ1 intracellular domain (ICD) . The IL-12Rβ1 intracellular domain may comprise an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. The IL-12Rβ1 ICD may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations (e.g., as compared to SEQ ID NO: 4 or the entire wild-type IL-12Rβ1 ICD) . These mutations can be amino acid insertions, deletions, or substitutions. The insertions, deletions, and substitutions can be within the IL-12Rβ1 ICD, or at one or both terminal ends of the IL-12Rβ1 ICD.

[0127] The fusion protein (e.g., ICR) may comprise an IL-2Rβ intracellular domain (ICD) . The IL-2Rβ intracellular domain may comprise an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17. The IL-2Rβ ICD may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations (e.g., as compared to SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, or the entire wild-type IL-2Rβ ICD) . These mutations can be amino acid insertions, deletions, or substitutions. The insertions, deletions, and substitutions can be within the IL-2Rβ ICD, or at one or both terminal ends of the IL-2Rβ ICD.

[0128] The fusion protein (e.g., ICR) may comprise an IL-23R transmembrane domain (TM) . The IL-23R transmembrane domain may be a transmembrane domain derived from a wild-type IL-23R or a functional variant thereof, or a portion thereof. The IL-23R transmembrane domain may comprise an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. The IL-23R TM may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations (e.g., as compared to SEQ ID NO: 7 or the entire wild-type IL-23R TM) . These mutations can be amino acid insertions, deletions, or substitutions. The insertions, deletions, and substitutions can be within the IL-23R TM, or at one or both terminal ends of the IL-23R TM.

[0129] The fusion protein (e.g., ICR) may comprise an IL-12Rβ1 transmembrane domain (TM) . The IL-12Rβ1 transmembrane domain may be a transmembrane domain derived from a  wild-type IL-12Rβ1 or a functional variant thereof, or a portion thereof. The IL-12Rβ1 transmembrane domain may comprise an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. The IL-12Rβ1 TM may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations (e.g., as compared to SEQ ID NO: 3 or the entire wild-type IL-12Rβ1 TM) . These mutations can be amino acid insertions, deletions, or substitutions. The insertions, deletions, and substitutions can be within the IL-12Rβ1 TM, or at one or both terminal ends of the IL-12Rβ1 TM.

[0130] The fusion protein (e.g., ICR) may comprise an IL-2Rβ transmembrane domain (TM) . The IL-2Rβ transmembrane domain may be a transmembrane domain derived from a wild-type IL-2Rβ or a functional variant thereof, or a portion thereof. The IL-2Rβ transmembrane domain may comprise an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. The IL-2Rβ TM may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations (e.g., as compared to SEQ ID NO: 15 or the entire wild-type IL-2RβTM) . These mutations can be amino acid insertions, deletions, or substitutions. The insertions, deletions, and substitutions can be within the IL-2Rβ TM, or at one or both terminal ends of the IL-2Rβ TM.

[0131] The fusion protein (e.g., ICR) may further comprise a connection sequence. The connection sequence may be selected from a sequence of IL-23R extracellular domain near the membrane (named as IL-23R connection sequence) or a sequence of IL-12Rβ1 extracellular domain near the membrane (named as IL-12Rβ1 connection sequence) . The fusion protein (e.g., ICR) may comprise an IL-23R connection sequence. The IL-23R connection sequence may comprise an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. The IL-23R connection sequence may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations (e.g., as compared to SEQ ID NO: 6) . These mutations can be amino acid insertions, deletions, or substitutions. The insertions, deletions, and substitutions can be within the IL-23R connection sequence, or at one or both terminal ends of the IL-23R connection sequence. The fusion protein (e.g., ICR) may comprise an IL-12Rβ1 connection sequence. The IL-12Rβ1 connection sequence may comprise an amino acid sequence that is at  least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The IL-12Rβ1 connection sequence may have 1, 2, or 3 mutations (e.g., as compared to SEQ ID NO: 2) . These mutations can be amino acid insertions, deletions, or substitutions. The insertions, deletions, and substitutions can be within the IL-12Rβ1 connection sequence, or at one or both terminal ends of the IL-12Rβ1 connection sequence.

[0132] The fusion protein (e.g., ICR) may comprise two polypeptide chains. The first polypeptide chain may comprise, from N-terminal to C-terminal, an IL-4Rα extracellular domain (e.g., SEQ ID NO: 1) , an IL-12Rβ1 transmembrane domain (e.g., SEQ ID NO: 3) , and an IL-12Rβ1 intracellular domain (e.g., SEQ ID NO: 4) . The first polypeptide chain may comprise an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. The first polypeptide e chain may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations (e.g., as compared to SEQ ID NO: 9) . These mutations can be amino acid insertions, deletions, or substitutions. The insertions, deletions, and substitutions can be within the first polypeptide chain, or at one or both terminal ends of the first polypeptide chain.

[0133] The fusion protein (e.g., ICR) may comprise two polypeptide chains. The second polypeptide chain may comprise, from N-terminal to C-terminal, an IL-2Rγ extracellular domain (e.g., SEQ ID NO: 5) , an IL-23R transmembrane domain (e.g., SEQ ID NO: 7) , and an IL-23R intracellular domain (e.g., SEQ ID NO: 8) . The second polypeptide chain may comprise an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. The second polypeptide chain may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations (e.g., as compared to SEQ ID NO: 10) . These mutations can be amino acid insertions, deletions, or substitutions. The insertions, deletions, and substitutions can be within the second polypeptide chain, or at one or both terminal ends of the second polypeptide chain.

[0134] The fusion protein (e.g., ICR) may comprise two polypeptide chains. The first polypeptide chain may comprise, from N-terminal to C-terminal, an IL-2Rγ extracellular domain (e.g., SEQ ID NO: 5) , an IL-12Rβ1 transmembrane domain (e.g., SEQ ID NO: 3) , and an IL- 12Rβ1 intracellular domain (e.g., SEQ ID NO: 4) . The first polypeptide chain may comprise an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11. The first polypeptide chain may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations (e.g., as compared to SEQ ID NO: 11) . These mutations can be amino acid insertions, deletions, or substitutions. The insertions, deletions, and substitutions can be within the first polypeptide chain, or at one or both terminal ends of the first polypeptide chain.

[0135] The fusion protein (e.g., ICR) may comprise two polypeptide chains. The second polypeptide chain may comprise, from N-terminal to C-terminal, an IL-4Rα extracellular domain (e.g., SEQ ID NO: 1) , an IL-23R transmembrane domain (e.g., SEQ ID NO: 7) , and an IL-23R intracellular domain (e.g., SEQ ID NO: 8) . The second polypeptide chain may comprise an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. The second polypeptide chain may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more than 10 mutations (e.g., as compared to SEQ ID NO: 12) . These mutations can be amino acid insertions, deletions, or substitutions. The insertions, deletions, and substitutions can be within the second polypeptide chain, or at one or both terminal ends of the second polypeptide chain.

[0136] The fusion protein (e.g., ICR) may comprise two polypeptide chains. In some embodiments, the first polypeptide chain and the second polypeptide chain are linked to each other via a 2A cleavable linker, such as P2A or T2A linker. The fusion protein (e.g., ICR) may comprise a first polypeptide chain that comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and a second polypeptide chain that comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. The fusion protein (e.g., ICR) may comprise a first polypeptide chain that comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and a second polypeptide chain that comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. The fusion protein (e.g., ICR) may comprise a polypeptide that comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-14 prior to cleavage by a 2A linker. In some embodiments, the fusion protein (e.g., ICR) comprises a first and / or a second polypeptide chain that comprises an amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9-14, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9-14.

[0137] Engineered receptor (e.g., CAR and TCR)

[0138] One aspect of the present disclosure provides cells (e.g., immune cells) that express the inverted cytokine receptors described herein and express an engineered receptor. The engineered receptor can comprise an extracellular ligand binding domain or an extracellular antigen binding domain, and optionally an intracellular signaling domain. Exemplary engineered receptors include, but are not limited to, chimeric antigen receptor (CAR) , engineered T-cell receptor (TCR) , and T-cell antigen coupler (TAC) receptor. The engineered receptor can comprise an extracellular antigen binding domain that specifically binds to an antigen (e.g., a tumor antigen) , a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain. The intracellular signaling domain can comprise a primary intracellular signaling domain and / or a co-stimulatory signaling domain. The intracellular signaling domain can comprise an intracellular signaling domain of a TCR co-receptor. The engineered receptor can be encoded by a heterologous polynucleotide operably linked to a promoter (such as a constitutive promoter or an inducible promoter) .

[0139] The engineered receptor can comprise one or more specific binding domains that target at least one tumor antigen, and one or more intracellular effector domains, such as one or more primary intracellular signaling domains and / or co-stimulatory signaling domains.

[0140] The engineered receptor can be a chimeric antigen receptor (CAR) . Many chimeric antigen receptors are known in the art and can be suitable for the engineered cells described herein. CARs can also be constructed with a specificity for any cell surface marker by utilizing antigen binding fragments or antibody variable domains of, for example, antibody molecules.

[0141] CARs of the present disclosure may comprise an extracellular domain comprising at least one antigen binding domain that specifically binds at least one tumor antigen, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain.

[0142] The intracellular signaling domain may generate a signal that promotes an immune effector function of the CAR-containing cell, e.g., a CAR-T cell. Immune effector function or immune effector response refers to function or response, e.g., of an immune effector cell, that enhances or promotes an immune attack of a target cell. For example, an immune effector function or response can refer to a property of a T or NK cell that promotes killing or the inhibition of growth or proliferation, of a target cell. Examples of immune effector function, e.g., in a CAR-T cell, include cytolytic activity (such as antibody-dependent cellular toxicity, or ADCC) and helper activity (such as the secretion of cytokines) . The intracellular signaling domain may generate a  signal that promotes proliferation and / or survival of the CAR containing cell. The CAR may comprise one or more intracellular signaling domains selected from the signaling domains of CD28, CD137, CD3, CD27, CD40, ICOS, GITR, and OX40. The signaling domain of a naturally occurring molecule can comprise the entire intracellular or cytoplasmic portion, or the entire native intracellular signaling domain, of the molecule, or a fragment or derivative thereof.

[0143] The intracellular signaling domain of a CAR can comprise a primary intracellular signaling domain. “Primary intracellular signaling domain” refers to cytoplasmic signaling sequence that acts in a stimulatory manner to induce immune effector functions. The primary intracellular signaling domain may contain a signaling motif known as Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif, or ITAM. The primary intracellular signaling domain may comprise a functional signaling domain of a protein selected from the group consisting of CD3 zeta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, common FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon Rib) , CD79a, CD79b, Fcgamma R IIa, DAP10, and DAP 12. The primary intracellular signaling domain may comprise a nonfunctional or attenuated signaling domain of a protein selected from the group consisting of CD3 zeta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, common FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon Rib) , CD79a, CD79b, Fcgamma R IIa, DAP10, and DAP 12. The nonfunctional or attenuated signaling domain can be a mutant signaling domain having a point mutation, insertion or deletion that attenuates or abolishes one or more immune effector functions, such as cytolytic activity or helper activity, including antibody-dependent cellular toxicity (ADCC) . The CAR may comprise a nonfunctional or attenuated CD3 zeta (i.e. CD3ζ or CD3z) signaling domain. The intracellular signaling domain may not comprise a primary intracellular signaling domain. An attenuated primary intracellular signaling domain may induce no more than about any of 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%or less of an immune effector function (such as cytolytic function against target cells) compared to CARs having the same construct, but with the wild-type primary intracellular signaling domain.

[0144] The intracellular signaling domain of a CAR can comprise one or more (such as any of 1, 2, 3, or more) co-stimulatory signaling domains. “Co-stimulatory signaling domain” can be the intracellular portion of a co-stimulatory molecule. The term “co-stimulatory molecule” refers to a cognate binding partner on an immune cell (such as T cell) that specifically binds with a co-stimulatory ligand, thereby mediating a co-stimulatory response by the immune cell, such as, but not limited to, proliferation and survival. Co-stimulatory molecules are cell surface molecules  other than antigen receptors or their ligands that contribute to an efficient immune response. A co-stimulatory molecule can be represented in the following protein families: TNF receptor proteins, Immunoglobulin-like proteins, cytokine receptors, integrins, signaling lymphocytic activation molecules (SLAM proteins) , and activating NK cell receptors. Co-stimulatory molecules include, but are not limited to an MHC class I molecule, BTLA and a Toll ligand receptor, as well as OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a / CD18) , ICOS (CD278) , and 4-1BB (CD137) . Further examples of such co-stimulatory molecules include CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE / RANKL, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CDIOO (SEMA4D) , CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG / Cbp, CD19a, and a ligand that specifically binds with CD83.

[0145] The CAR can comprise a single co-stimulatory signaling domain. The CAR can comprise two or more co-stimulatory signaling domains. The intracellular signaling domain can comprise a functional primary intracellular signaling domain and one or more co-stimulatory signaling domains. The CAR may not comprise a functional primary intracellular signaling domain (such as CD3ζ) . The CAR can comprise an intracellular signaling domain consisting of or consisting essentially of one or more co-stimulatory signaling domains. The CAR can comprise an intracellular signaling domain consisting of or consisting essentially of a nonfunctional or attenuated primary intracellular signaling domain (such as a mutant CD3ζ) and one or more co-stimulatory signaling domains. Upon binding of the antigen binding domain to tumor antigen, the co-stimulatory signaling domains of the CAR can transduce signals for enhanced proliferation, survival and differentiation of the modified immune cells having the CAR (such as T cells) , and inhibit activation induced cell death. The one or more co-stimulatory signaling domains can be derived from one or more molecules selected from the group consisting of CD27, CD28, 4-1BB (i.e., CD137) , OX40, CD30, CD40, CD3, lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) , CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 and ligands that specially bind to CD83.

[0146] The intracellular signaling domain of a CAR can comprise a co-stimulatory signaling domain derived from CD28. The intracellular signaling domain can comprise a primary intracellular signaling domain of CD3ζ and a co-stimulatory signaling domain of CD28. The intracellular signaling domain in the chimeric receptor of the present application can comprise a co-stimulatory signaling domain derived from 4-1BB (i.e., CD137) . The intracellular signaling domain can comprise a primary intracellular signaling domain of CD3ζ and a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB. The intracellular signaling domain can comprise a polypeptide comprising from the N-terminus to the C-terminus: a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB and a primary intracellular signaling domain of CD3ζ.

[0147] The intracellular signaling domain of the CAR can comprise a co-stimulatory signaling domain of CD28 and a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB. The intracellular signaling domain can comprise a primary intracellular signaling domain of CD3ζ, a co-stimulatory signaling domain of CD28, and a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB. The intracellular signaling domain can comprise a polypeptide comprising from the N-terminus to the C-terminus: a co-stimulatory signaling domain of CD28, a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB, and a primary intracellular signaling domain of CD3ζ.

[0148] The antigen binding domain of a CAR may comprise one or more (such as any one of 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more) antibodies or antibody fragments, which can be selected from an scFv, a Fv, a Fab, a (Fab′) 2, a minibody, a diabody, a single domain antibody (sdAb) , or a VHH domain. The antigen binding domain of a CAR can comprise a ligand or an extracellular portion of a receptor that specifically binds to a tumor antigen. The CAR can be a monospecific, bispecific or multispecific CAR. The antigen binding domain of a CAR can specifically bind to a single tumor antigen. The antigen binding domain of a CAR can bind to two or more tumor antigens. The engineered receptor (e.g., CAR) may redirect the specificity of the engineered cells through the expression of a chimeric antigen receptor (CAR) or TCR on these cells.

[0149] The antigen may be a tumor antigen selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, hTERT, IL-13Rα2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase,  survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, PD-L2, and other tumor antigens with clinical significance, and combinations thereof. The antigen may be GPC3.

[0150] The tumor antigen can be derived from an intracellular protein of tumor cells. The tumor antigen can be expressed on the surface of tumor cells. Many TCRs specific for tumor antigens (including tumor-associated antigens) have been described, including, for example, NY-ESO-1 cancer-testis antigen, the p53 tumor suppressor antigens, TCRs for tumor antigens in melanoma (e.g., MARTI, gp 100) , leukemia (e.g., WT1, minor histocompatibility antigens) , and breast cancer (e.g., HER2, NY-BR1) .

[0151] The transmembrane domain of a CAR can be selected from the transmembrane domain of an alpha, beta or zeta chain of a T-cell receptor, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18) , ICOS (CD278) , 4-1BB (CD137) , GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , CD160, CD19, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CDIOO (SEMA4D) , SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, PAG / Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, and / or NKG2C. The transmembrane domain of the CAR can be a CD4, CD3, CD8α, or CD28 transmembrane domain. The transmembrane domain of the CAR can comprise a CD8α transmembrane domain. The transmembrane domain can be derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 and PD1.

[0152] The extracellular domain can be connected to the transmembrane domain by a hinge domain. The hinge domain can be a hinge domain of CD8α.

[0153] The CAR can also comprise a signal peptide (SP) , such as a CD8α signal peptide. The signal peptide can comprise a sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.

[0154] Many CARs targeting different tumor antigens have been widely disclosed in the field, such as CD19 CARs or BCMA CARs. The extracellular antigen binding domain of CD19 CARs can be or include the CD19 binding fragment (e.g., FMC63, SJ25C1, or those disclosed in different patents such as WO 2022 / 012683, etc) . BCMA CARs also have been well described, related patents include but not limited to WO 2016 / 014789, WO 2016 / 014565, WO 2013 / 154760, and WO 2018 / 028647, etc. The extracellular antigen binding domain of BCMA CARs may be or include BCMA binding fragment. The BCMA binding fragment may bind to one or more epitopes on BCMA. The BCMA CARs may be bivalent CARs comprising two anti-BCMA sdAbs targeting same or different BCMA epitopes.

[0155] The CAR may be a GPC3 CAR ( “H93” or “H93 CAR” ) . The GPC3 CAR may be monospecific. The GPC3 CAR may be bispecific or bivalent. The extracellular antigen binding domain of GPC3 CAR may be or include one or more GPC3 binding moieties. The GPC3 binding moiety may bind to one or more epitopes on GPC3. The GPC3 CAR may be bivalent CARs comprising one or more anti-GPC3 scFvs targeting same or different GPC3 epitopes.

[0156] The GPC3 CAR can comprise from the N-terminus to the C-terminus: a CD8α signal peptide, an extracellular antigen binding domain comprising an anti-GPC3 scFv, a CD8α hinge domain, a CD8α transmembrane domain, a 4-1BB co-stimulatory signaling domain, and a CD3ζprimary intracellular signaling domain. The anti-GPC3 scFv can comprise a sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.

[0157] The CD8α hinge domain can comprise a sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.

[0158] The CD8α transmembrane domain can comprise a sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27.

[0159] The 4-1BB co-stimulatory signaling domain can comprise a sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.

[0160] The CD3ζ primary intracellular signaling domain can comprise a sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.

[0161] The GPC3 CAR can comprise a sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. The GPC3 CAR may specifically bind to GPC3-positive tumor cells (e.g., PLCPRF5 cells) .

[0162] The engineered receptor can be a modified T-cell receptor or engineered T-cell receptor. The engineered TCR can be specific for a tumor antigen. The tumor antigen can be selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, PD-L2, and other tumor antigens with clinical significance, and combinations thereof. The tumor antigen can be derived from an intracellular protein of tumor cells. The tumor antigen can be expressed on the surface of tumor cells. Many TCRs specific for tumor antigens (including tumor-associated antigens) have been described, including, for example, NY-ESO-1 cancer-testis antigen, the p53 tumor suppressor antigens, TCRs for tumor antigens in melanoma (e.g., MARTI, gp 100) , leukemia (e.g., WT1, minor histocompatibility antigens) , and breast cancer (e.g., HER2, NY-BR1) . Any of the TCRs known in the art can be used. The TCR can have an enhanced affinity to the tumor antigen. Exemplary TCRs and methods for introducing the TCRs to immune cells have been described, for example, in U. S. Pat. No. 5, 830, 755, and Kessels et al. Immunotherapy through TCR gene transfer. Nat. Immunol. 2, 957-961 (2001) , which are incorporated herein by reference in the entirety.

[0163] The TCR receptor complex is an octomeric complex formed by variable TCR receptor α and β chains (or γ and δ chains on case of γδ T cells) with three dimeric signaling modules CD3δ / ε, CD3γ / ε and CD247 (T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain) ζ / ζ or ζ / η. Ionizable  residues in the transmembrane domain of each subunit form a polar network of interactions that hold the complex together. TCR complex has the function of activating signaling cascades in T cells.

[0164] The engineered receptor can be an engineered TCR comprising one or more T-cell receptor (TCR) fusion proteins (TFPs) . Exemplary TFPs have been described, for example, in US20170166622A1, which is incorporated herein by reference in its entirety. The TFP can comprise an extracellular domain of a TCR subunit that comprises an extracellular domain or portion thereof of a protein selected from the group consisting of a TCR alpha chain, a TCR beta chain, a CD3 epsilon TCR subunit, a CD3 gamma TCR subunit, a CD3 delta TCR subunit, functional fragments thereof, and amino acid sequences thereof having at least one but not more than 20 modifications. The TFP can comprise a transmembrane domain that comprises a transmembrane domain of a protein selected from the group consisting of a TCR alpha chain, a TCR beta chain, a CD3 epsilon TCR subunit, a CD3 gamma TCR subunit, a CD3 delta TCR subunit, functional fragments thereof, and amino acid sequences thereof having at least one but not more than 20 modifications. The TFP can comprise a transmembrane domain that comprises a transmembrane domain of a protein selected from the group consisting of a TCR alpha chain, a TCR beta chain, a TCR zeta chain, a CD3 epsilon TCR subunit, a CD3 gamma TCR subunit, a CD3 delta TCR subunit, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, functional fragments thereof, and amino acid sequences thereof having at least one but not more than 20 modifications.

[0165] The TFP can comprise a TCR subunit comprising at least a portion of a TCR extracellular domain, and a TCR intracellular domain comprising a stimulatory domain from an intracellular signaling domain of CD3 epsilon; and an antigen binding domain, wherein the TCR subunit and the antigen binding domain are operatively linked, and wherein the TFP incorporates into a TCR when expressed in a T cell.

[0166] The engineered receptor can be a T-cell antigen coupler (TAC) receptor. Exemplary TAC receptors have been described, for example, in US20160368964A1, which is incorporated herein by reference. The TAC can comprise an antigen binding domain, a TCR-binding domain that specifically binds a protein associated with the TCR complex, and a T-cell receptor signaling domain. The antigen binding domain can be an antibody fragment, such as scFv or VHH, which specifically binds to a tumor antigen. The antigen binding domain can be a designed Ankyrin  repeat (DARPin) polypeptide. The tumor antigen can be selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, PD-L2, and other tumor antigens with clinical significance, and combinations thereof. The tumor antigen can be derived from an intracellular protein of tumor cells. The tumor antigen can be expressed on the surface of tumor cells. The protein associated with the TCR complex can be CD3, such as CD3E. The TCR-binding domain can be a single chain antibody, such as scFv, or a VHH. The TCR-binding domain can be derived from UCHT1. The TAC receptor can comprise a cytosolic domain and a transmembrane domain. The T-cell receptor signaling domain can comprise a cytosolic domain derived from a TCR co-receptor. Exemplary TCR co-receptors include, but are not limited to, CD4, CD8, CD28, CD45, CD4, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 and CD 154. The TAC receptor can comprise a transmembrane domain and a cytosolic domain derived from CD4. The TAC receptor can comprise a transmembrane domain and a cytosolic domain derived from CD8 (such as CD8α) .

[0167] T cell co-receptors are expressed as membrane proteins on T cells. They can provide stabilization of the TCR: peptide: MEC complex and facilitate signal transduction. The two subtypes of T cell co-receptor, CD4 and CD8, display strong specificity for particular MEC classes. The CD4 co-receptor can only stabilize TCR: MEC II complexes while the CD8 co-receptor can only stabilize the TCR: MEC I complex. The differential expression of CD4 and CD8 on different T cell types results in distinct T cell functional subpopulations. CD8+ T cells are cytotoxic T cells.

[0168] The engineered receptor (such as CAR, TCR, or TAC) can target one or more tumor antigens. Tumor antigens are proteins that are produced by tumor cells that can elicit an immune response, particularly T-cell mediated immune responses. The selection of the targeted antigen will depend on the particular type of cancer to be treated. Exemplary tumor antigens include, for example, a glioma-associated antigen, carcinoembryonic antigen (CEA) , β-human chorionic  gonadotropin, alphafetoprotein (AFP) , lectin-reactive AFP, thyroglobulin, RAGE-1, MN-CAIX, human telomerase reverse transcriptase, RU1, RU2 (AS) , intestinal carboxyl esterase, mut hsp70-2, M-CSF, prostase, prostate-specific antigen (PSA) , PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, prostein, PSMA, HER2 / neu, survivin and telomerase, prostate-carcinoma tumor antigen-1 (PCTA-1) , MAGE, ELF2M, neutrophil elastase, ephrinB2, CD22, insulin growth factor (IGF) -I, IGF-II, IGF-I receptor and mesothelin.

[0169] The tumor antigen can comprise one or more antigenic cancer epitopes associated with a malignant tumor. Malignant tumors express a number of proteins that can serve as target antigens for an immune attack. These molecules include but are not limited to tissue-specific antigens such as MART-1, tyrosinase and gp100 in melanoma and prostatic acid phosphatase (PAP) and prostate-specific antigen (PSA) in prostate cancer. Other target molecules belong to the group of transformation-related molecules such as the oncogene HER2 / Neu / ErbB-2. Yet another group of target antigens are onco-fetal antigens such as carcinoembryonic antigen (CEA) . In B-cell lymphoma the tumor-specific idiotype immunoglobulin constitutes a truly tumor-specific immunoglobulin antigen that is unique to the individual tumor. B cell differentiation antigens such as CD 19, CD20 and CD37 are other candidates for target antigens in B-cell lymphoma.

[0170] The tumor antigen can be a tumor-specific antigen (TSA) or a tumor-associated antigen (TAA) . A TSA is unique to tumor cells and does not occur on other cells in the body. A TAA associated antigen is not unique to a tumor cell, and instead is also expressed on a normal cell under conditions that fail to induce a state of immunologic tolerance to the antigen. The expression of the antigen on the tumor can occur under conditions that enable the immune system to respond to the antigen. TAAs can be antigens that are expressed on normal cells during fetal development, when the immune system is immature, and unable to respond or they can be antigens that are normally present at extremely low levels on normal cells, but which are expressed at much higher levels on tumor cells.

[0171] Non-limiting examples of TSA or TAA antigens include the following: Differentiation antigens such as MART-1 / MelanA (MART-I) , gp 100 (Pmel 17) , tyrosinase, TRP-1, TRP-2 and tumor-specific multilineage antigens such as MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; overexpressed embryonic antigens such as CEA; overexpressed oncogenes and mutated tumor-suppressor genes such as p53, Ras, HER2 / neu; unique tumor antigens resulting from chromosomal translocations; such as BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; and viral antigens,  such as the Epstein Barr virus antigens EBVA and the human papillomavirus (HPV) antigens E6 and E7. Other large, protein-based antigens include TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-Catenin, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alpha-fetoprotein, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB / 70K, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, TA-90\Mac-2 binding protein\cyclophilin C-associated protein, TAAL6, TAG72, TLP, and TPS.

[0172] Nucleic acids

[0173] The present disclosure provides (i) nucleic acids encoding a fusion protein (e.g., ICR) described herein, and (ii) nucleic acids encoding an engineered receptor (e.g., CAR, TAC or TCR) . The nucleic acids of the present disclosure can comprise a nucleic acid sequence encoding any one of the ICRs, CARs, and / or TCRs disclosed herein. The nucleic acid can encode both (1) a CAR and (2) a fusion protein (e.g., ICR) . The nucleic acid may comprise one, two, three, four, five or more copies of the coding sequence of a fusion protein (e.g., ICR) . The expression of the fusion protein (e.g., ICR) may be controlled by a non-native regulatory element.

[0174] A nucleic acid of the present disclosure may comprise a first nucleic acid sequence and a second nucleic acid sequence. The first nucleic acid may be upstream of the second nucleic acid or the first nucleic acid may be downstream of the second nucleic acid. The first and second nucleic acid sequence can be separated by a linker. A linker for use in the present disclosure allows for multiple proteins to be encoded by the same nucleic acid sequence (e.g., a multicistronic or bicistronic sequence) , which are translated as a polyprotein that is dissociated into separate protein components. The nucleic acid may comprise from 5'end to 3'end of the first nucleic acid sequence, the linker, and the second nucleic acid sequence. The nucleic acid may comprise from 5'end to 3'end the second nucleic acid sequence, the linker, and the first nucleic acid sequence. The first nucleic acid sequence may encode a CAR described herein and the second nucleic acid sequence may encode a fusion protein (e.g., ICR) described herein.

[0175] The linker may comprise a nucleic acid sequence that encodes for an internal ribosome entry site (IRES) . As used herein, “an internal ribosome entry site” or “IRES” refers to an element that promotes direct internal ribosome entry to the initiation codon, such as ATG, of a protein  coding region, thereby leading to cap-independent translation of the gene. Various internal ribosome entry sites are known to those of skill in the art, including, without limitation, IRES obtainable from viral or cellular mRNA sources, e.g., immunogloublin heavy-chain binding protein (BiP) ; vascular endothelial growth factor (VEGF) ; fibroblast growth factor 2; insulin-like growth factor; translational initiation factor eIF4G; yeast transcription factors TFIID and HAP4; and IRES obtainable from, e.g., cardiovirus, rhinovirus, aphthovirus, HCV, Friend murine leukemia virus (FrMLV) , and Moloney murine leukemia virus (MoMLV) . Those of skill in the art would be able to select the appropriate IRES.

[0176] The linker may comprise a nucleic acid sequence that encodes for a self-cleaving peptide. As used herein, a “self-cleaving peptide” or “2A linker” refers to an oligopeptide that allow multiple proteins to be encoded as polyproteins, which dissociate into component proteins upon translation. Use of the term “self-cleaving” is not intended to imply a proteolytic cleavage reaction. Various self-cleaving or 2A linkers are known to those of skill in the art, including, without limitation, those found in members of the Picornaviridae virus family, e.g., foot-and-mouth disease virus (FMDV) , equine rhinitis A virus (ERAV0, Thosea asigna virus (TaV) , and porcine tescho virus-1 (PTV-1) ; and carioviruses such as Theilovirus and encephalomyocarditis viruses. 2A linkers derived from FMDV, ERAV, PTV-1, and TaV are referred to herein as “F2A, ” “E2A, ” “P2A, ” and “T2A, ” respectively. The P2A linker may have a sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 32. The T2A linker may have a sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33.

[0177] Various linker sequences are known in the art, including, without limitation, glycine serine (GS) spacers (also known as GS linkers) such as (GS) n, (SG) n, (GSGGS) n and (GGGS) n, where n represents an integer of at least 1. Exemplary linker sequences can comprise an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, or SEQ ID NO: 39.

[0178] A nucleic acid of the present disclosure may comprise a restriction enzyme site sequence. Exemplary restriction enzyme site sequences can comprise a nucleic acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the nucleic acid sequence of GTTAAC or ACTAGT.

[0179] A nucleic acid of the present disclosure can be operably linked to a transcriptional control element, e.g., a promoter, and enhancer, etc.

[0180] The promoter may be a CD8 cell-specific promoter, a CD4 cell-specific promoter, a neutrophil-specific promoter, or an NK-specific promoter. For example, a CD4 gene promoter can be used; see, e.g., Salmon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 7739; and Marodon et al. (2003) Blood 101: 3416. As another example, a CD8 gene promoter can be used. NK cell-specific expression can be achieved by use of an NcrI (p46) promoter; see, e.g., Eckelhart et al. Blood (2011) 117: 1565.

[0181] Other examples of suitable promoters include the immediate early cytomegalovirus (CMV) promoter sequence. This promoter sequence is a strong constitutive promoter sequence capable of driving high levels of expression of any nucleic acid sequence operatively linked thereto. Other constitutive promoter sequences can also be used, including, but not limited to a simian virus 40 (SV40) early promoter, a mouse mammary tumor virus (MMTV) or human immunodeficiency virus (HIV) long terminal repeat (LTR) promoter, a MoMuLV promoter, an avian leukemia virus promoter, an Epstein-Barr virus immediate early promoter, a Rous sarcoma virus promoter, the EF-1 alpha promoter, as well as human gene promoters such as, but not limited to, an actin promoter, a myosin promoter, a hemoglobin promoter, and a creatine kinase promoter. Further, the disclosure should not be limited to the use of constitutive promoters. Inducible promoters are also contemplated as part of the disclosure. The use of an inducible promoter provides a molecular switch capable of turning on expression of the nucleic acid sequence which it is operatively linked when such expression is desired, or turning off the expression when expression is not desired. Examples of inducible promoters include, but are not limited to a metallothionine promoter, a glucocorticoid promoter, a progesterone promoter, and a tetracycline promoter.

[0182] The nucleic acid of the present disclosure may be provided for the production of (i) a fusion protein (e.g., ICR) described herein, and / or (ii) a CAR described herein (e.g., in a  mammalian cell) . The nucleic acid of the present disclosure may provide for amplification of the nucleic acid.

[0183] A vector, for example an expression vector (e.g., a lentiviral vector) can be used to introduce the nucleic acid described herein into an immune cell (e.g., a T cell) or precursor thereof. The vector (e.g., a lentiviral vector) of the present disclosure may comprise one or more nucleic acids encoding for the fusion protein (e.g., ICR) described herein. The vector (e.g., lentiviral vector) may comprise additional elements that will aid in the functional expression of the fusion protein (e.g., ICR) described herein, and / or the CAR described herein. The expression vector may comprise a mammalian promoter. The vector may comprise an elongation-factor-1-alpha promoter (EF-1α promoter) . The use of an EF-1α promoter may increase the efficiency in expression of downstream transgenes (e.g., a CAR encoding nucleic acid) . Physiologic promoters (e.g., an EF-1α promoter) may be less likely to induce integration mediated genotoxicity, and may abrogate the ability of the retroviral vector to transform stem cells. Other physiological promoters suitable for use in a vector (e.g., lentiviral vector) can be incorporated into a vector of the present disclosure. The vector (e.g., lentiviral vector) may comprise a non-requisite cis acting sequence that can improve titers and gene expression.

[0184] The nucleic acid can encode a naked CAR. The nucleic acid can comprise from the 5'end to the 3'end, a CD8α signal peptide, an extracellular antigen binding domain, a CD8α hinge domain, a CD8α transmembrane domain, a CD137 co-stimulatory signaling domain, a CD3ζprimary intracellular signaling domain. The nucleic acid may encode an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20.

[0185] The fusion protein (e.g., ICR) may comprise two polypeptide chains. The nucleic acid may encode (1) a first polypeptide chain and / or (2) a second polypeptide chain. The nucleic acid may comprise from the 5'end to the 3'end of the coding sequences of a first polypeptide chain. The nucleic acid may comprise from the 5'end to the 3'end of the coding sequences of a second polypeptide chain. The nucleic acid may encode an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 9-12. The nucleic acid may comprise from the 5'end to the 3'end, the coding sequences of a first  polypeptide chain, a 2A cleavable linker, and a second polypeptide chain. The nucleic acid may encode an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14. Exemplary structures of the nucleic acids described herein are shown in FIGs. 1a-1b. The first polypeptide chain may comprise a first extracellular domain derived from an IL-4Rα and a first intracellular domain derived from an IL-12Rβ1. The second polypeptide chain may comprise a second extracellular domain derived from an IL-2Rγ and a second intracellular domain derived from an IL-23R. The nucleic acid may encode an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13. The first polypeptide chain may comprise a first extracellular domain derived from an IL-2Rγ and a first intracellular domain derived from an IL-12Rβ1. The second polypeptide chain may comprise a second extracellular domain derived from an IL-4Rα and a second intracellular domain derived from an IL-23R. The nucleic acid may encode an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14.

[0186] The nucleic acid can encode (1) a CAR and (2) an ICR. The nucleic acid can comprise from the 5'end to the 3'end, the coding sequences of a CAR, a 2A cleavable linker, and an ICR. The ICR may be a fusion protein that comprises two polypeptide chains. The ICR may comprise a first polypeptide chain and a second polypeptide chain. The nucleic acid can comprise from the 5'end to the 3'end, the coding sequences of a CAR, a 2A cleavable linker, a first polypeptide chain, a 2A cleavable linker and a second polypeptide chain. The nucleic acid may encode an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22. The first polypeptide chain may comprise a first extracellular domain derived from an IL-4Rα and a first intracellular domain derived from an IL-12Rβ1. The second polypeptide chain may comprise a second extracellular domain derived from an IL-2Rγ and a second intracellular domain derived from an IL-23R. The nucleic acid may encode an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the  amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21. The first polypeptide chain may comprise a first extracellular domain derived from an IL-2Rγ and a second intracellular domain derived from an IL-12Rβ1. The second polypeptide chain may comprise a second extracellular domain derived from an IL-4Rα and a second intracellular domain derived from an IL-23R. The nucleic acid may encode an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22.

[0187] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The length of a reference sequence aligned for comparison purposes is at least 80%of the length of the reference sequence, and may be at least 90%, 95%, or 100%. The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For example, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0188] Engineered cells

[0189] One aspect of the present disclosure provides engineered cells comprising the fusion protein (e.g., ICR) described herein. The engineered cells comprising the fusion protein (e.g., ICR) described herein may further comprise an engineered receptor (e.g., CAR) . The engineered cells comprising the ICR described herein may further comprise a CAR (CAR armored with ICR) .

[0190] The engineered receptor (e.g., CAR) may redirect the specificity of the engineered cells through the expression of a chimeric antigen receptor (CAR) or TCR on these cells. CAR expression may be induced through electroporation of engineered cells for the insertion of genetic  material, or by infecting these cells with viral vectors, such as lentiviruses or retroviruses containing the desired genetic material. Such genetic editing may improve the potency of the engineered cells by improving homing, cytokine production, recycle killing, and / or improved engraftment.

[0191] The engineered cells comprising the fusion protein (e.g., ICR) described herein may express more than one polypeptide chains. The engineered cells comprising the fusion protein (e.g., ICR) described herein may express more than one engineered receptors, such as any combination of CAR, TCR, or TAC receptors. The modified cell comprising the fusion protein (e.g., ICR) described herein may be used to treat cancer.

[0192] Comparing to a cell without the fusion protein (e.g., ICR) described herein, the modified cell comprising the fusion protein (e.g., ICR) described herein may have a higher cytotoxicity against tumor cells. Comparing to a cell without the ICR described herein, the modified cell comprising the ICR described herein may have a higher persistence and / or proliferation in the tumor microenvironment.

[0193] In one aspect, the present disclosure provides an engineered cell comprising (i) a fusion protein (e.g., ICR) described herein and (ii) an engineered receptor (e.g., CAR) described herein. The modified cell can be an immune cell. The modified cell may comprise one or more nucleic acids encoding (i) a fusion protein (e.g., ICR) described herein and (ii) an engineered receptor (e.g., CAR) described herein. Accordingly, such engineered cells may possess the specificity directed by the engineered receptor (e.g., CAR) that is expressed therein. For example, a modified cell of the present disclosure comprising a CAR (s) may possess specificity for one or more antigen (s) on a target cell (e.g., one or more tumor antigen (s) on a cancer cell) .

[0194] The engineered cells may be modified immune cells. The engineered cells may be selected from a group consisting of T cells, αβT cells, γδT cells, NK cells, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) , hematopoietic stem cells, pluripotent stem cells, embryonic stem cells, and a combination thereof. The engineered cells may be T cells. The engineered cells may be NK cells. The engineered cells may be αβ T cells. The engineered cells may be γδ T cells. The engineered cells may be Vδ1 T cells.

[0195] The engineered cells may be an autologous cells, syngeneic cells, allogeneic cells, or xenogeneic cells with respect to the individual receiving them. The engineered cells may be modified by changing the major histocompatibility complex (MHC) profile, by inactivating β2- microglobulin to prevent the formation of functional Class I MHC molecules, or by inactivating Class II MHC molecules. The engineered cells may be autologous cells obtained from the human subject receiving them. The engineered cells may be autologous T cells obtained from the human subject receiving them.

[0196] The engineered cells described herein may include eukaryotic cells, e.g., mammalian cells. The engineered cells may be human cells. The engineered cells may be equine, bovine, murine, ovine, canine, or feline cells.

[0197] In one aspect, the present disclosure provides a modified cell that expresses a fusion protein (e.g., ICR) comprising an extracellular domain derived from an IL-4 receptor (e.g., IL-4Rα) and an intracellular domain derived from an IL-23 receptor complex. The fusion protein (e.g., ICR) comprising the extracellular domain of IL-4R (i.e., IL-4Rα) on the engineered cells may specifically bind to IL-4. Upon binding IL-4, the fusion protein (e.g., ICR) may activate signaling of the IL-23R intracellular signaling domain that is transduced through native cellular elements to provide for a biological activity that mimics the native response of the IL-23R.

[0198] The fusion protein (e.g., ICR) may comprise a first polypeptide chain and a second polypeptide chain. The first polypeptide chain may comprise a first extracellular domain derived from an IL-4Rα and a first intracellular domain derived from an IL-12Rβ1. The second polypeptide chain may comprise a second extracellular domain derived from an IL-2Rγ and a second intracellular domain derived from an IL-23R. The first polypeptide chain may comprise a first extracellular domain derived from an IL-2Rγ and a first intracellular domain derived from an IL-12Rβ1. The second polypeptide chain may comprise a second extracellular domain derived from an IL-4Rα and a second intracellular domain derived from an IL-23R.

[0199] The engineered cell may comprise a polypeptide encoding a fusion protein (e.g., ICR) , and wherein the fusion protein (e.g., ICR) comprises a first and / or a second polypeptide chain that comprises an amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9-14, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9-14. The fusion protein (e.g., ICR) may comprise a first polypeptide chain that comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and a second polypeptide chain that comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. The fusion protein (e.g., ICR) may comprise a first polypeptide chain that comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and a second polypeptide chain that comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. The fusion protein  (e.g., ICR) may comprise a polypeptide that comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-14 prior to cleavage by a 2A linker (e.g., P2A linker or T2A linker) .

[0200] Comparing to the cells that do not comprise the ICR, the engineered cells comprising the ICR may have enhanced proliferation upon exposure to an immunosuppressive cytokine in a tumor microenvironment (TME) . The engineered cells comprising the ICR may have reduced or no proliferation when one or more immunosuppressive cytokines are reduced or eliminated from the TME (e.g., upon killing of the tumor cells) . Comparing to the cells that do not comprise the ICR, the engineered cells comprising the ICR may have enhanced cytotoxicity upon exposure to an immunosuppressive cytokine in the TME.

[0201] The engineered receptor may be a CAR. The CAR may comprise a polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: a CD8α signal peptide, an extracellular antigen binding domain, a CD8α hinge domain, a CD8α transmembrane domain, a CD137 co-stimulatory signaling domain, and a CD3ζ primary intracellular signaling domain. The CAR may be a GPC3 CAR ( “H93” or “H93 CAR” ) . The CAR may comprise a polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 20.

[0202] The engineered cell may comprise (i) a fusion protein (e.g., ICR) described herein and (ii) an engineered receptor (e.g., CAR) described herein, wherein the fusion protein (e.g., ICR) described herein and (ii) an engineered receptor (e.g., CAR) are linked to each other via a 2A cleavable linker. In some embodiments, the engineered cell comprises a polypeptide encoding a fusion protein and / or a polypeptide encoding a CAR, and wherein the polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9-14 and 20-22, or a functional variant having at least about 90%sequence identity thereto.

[0203] The engineered cells may comprise both an ICR and a CAR (CAR armored with ICR) . The engineered cells may be modified CAR-T cells (ICR armored CAR-T cells) . The expression of CAR and ICR by the engineered cells can be determined by flow cytometry (FACS) . The engineered cells (e.g., H93-IL4R-IL23R cells) may have a CAR positive rate of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, more than 90%, or more than 95%. The engineered cells may have a CAR positive rate of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less  than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, less than 90%, or less than 95%. The engineered cells may have a CAR positive rate of 10%-100%, 20%-100%, 30%-100%, 40%-100%, or 30%-95%.

[0204] IL-4 (e.g., 20 ng / ml IL-4) may activate STAT signaling (e.g., phosphorylated STAT3 or phosphorylated STAT4) in the engineered cells. IL-4 (e.g., 20 ng / ml IL-4) may increase the amount of phosphorylated STAT3 in the engineered cells by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 1000%. IL-4 (e.g., 20 ng / ml IL-4) may increase the amount of phosphorylated STAT4 in the engineered cells by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 1000%. Comparing to the cells that do not comprise the ICR (e.g., H93 cells) , the engineered cells comprising the ICR (e.g., H93-IL4R-IL23R cells) may be more responsive to the IL-4 stimulation. Comparing to the cells that do not comprise the ICR, upon IL-4 stimulation, the phosphorylation of STAT3 and / or STAT4 in the engineered cells comprising the ICR may be higher by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 1000%.

[0205] To evaluate the CAR positive rate, amplification and viability of the engineered cells in vitro, the engineered cells are repeatedly stimulated by tumor cells (e.g., Hep3B2.1-7 cells) for several rounds with or without IL-4 (e.g., 10 ng / mL IL-4) in a re-challenge assay. The effector cell: target cell (E: T) ratio may be 0.5: 1, 1: 1, 2: 1, 2.5: 1, 5: 1, or 10: 1. The engineered cells may be amplified by more than 1 fold, more than 2 fold, more than 3 fold, more than 4 fold, more than 5 fold, more than 6 fold, more than 7 fold, more than 8 fold, more than 9 fold, more than 10 fold, more than 15 fold, more than 20 fold, more than 25 fold, more than 30 fold, more than 35 fold,  more than 40 fold, more than 45 fold, more than 50 fold, more than 60 fold, more than 70 fold, more than 80 fold, more than 90 fold, more than 100 fold, more than 110 fold, more than 120 fold, more than 150 fold, more than 200 fold, more than 300 fold, or more than 400 fold, after 1 round, 2 rounds, 3 rounds, 4 rounds, or 5 rounds of stimulation in a re-challenge assay. Each round of stimulation lasts for 1 day, 2 days, 3 days, 4 days or 5 days. Comparing to the cells that do not comprise the ICR (e.g., H93 cells) , the amount of amplification of the engineered cells comprising the ICR (e.g., H93-IL4R-IL23R cells) may increase by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 1000%.

[0206] The engineered cells may have a CAR positive rate of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%, after 1 round, 2 rounds, 3 rounds, 4 rounds, or 5 rounds of stimulation in a re-challenge assay. The engineered cells may have a CAR positive rate of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%, after 1 round, 2 rounds, 3 rounds, 4 rounds, or 5 rounds of stimulation in a re-challenge assay. Comparing to the cells that do not comprise the ICR (e.g., H93 cells) , the engineered cells comprising the ICR (e.g., H93-IL4R-IL23R cells) may have a similar CAR positive rate, after 1 round, 2 rounds, 3 rounds, 4 rounds, or 5 rounds of stimulation in a re-challenge assay.

[0207] The engineered cells may have a viability of more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%, after 1 round, 2 rounds, 3 rounds, 4 rounds, or 5 rounds of stimulation in a re-challenge assay. The engineered cells may have a viability of less than 5%, less than 10%, less than 15%, less than 20%, less than 25%, less than 30%, less than 35%, less than 40%, less than 45%, less than 50%, less than 55%, less than 60%, less than 65%, less than 70%, less than 75%, less than 80%, or less than 90%, after 1 round, 2 rounds, 3 rounds, 4 rounds,  or 5 rounds of stimulation in a re-challenge assay. Comparing to the cells that do not comprise the ICR (e.g., H93 cells) , the engineered cells comprising the ICR (e.g., H93-IL4R-IL23R cells) may have a similar viability, after 1 round, 2 rounds, 3 rounds, 4 rounds, or 5 rounds of stimulation in a re-challenge assay.

[0208] The cytotoxicity of the engineered cells against tumor cells may be evaluated in a long-term cytotoxicity assay, where the engineered cells are co-cultured with tumor cells (e.g., Hep3B2.1-7 cells) with or without IL-4 (e.g., 10 ng / ml IL-4) . The effector cell: target cell (E: T) ratio may be 1: 40, 0.5: 1, 1: 1, 2: 1, 2.5: 1, 5: 1, or 10: 1. The long-term cytotoxicity can be measured by the normalized cell index (the real-time cell index / the cell index at a time point before adding effector cells) . The engineered cells may have a normalized cell index that is above 1, above 2, above 3, above 4, above 5, above 6, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells (e.g., Hep3B2.1-7 cells) with or without IL-4 (e.g., 10 ng / ml IL-4) . Comparing to the cells that do not comprise the ICR (e.g., H93 cells) , the normalized cell index of the engineered cells comprising the ICR (e.g., H93-IL4R-IL9R cells) may be lower by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 1000%, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells (e.g., Hep3B2.1-7 cells) with or without IL-4 (e.g., 10 ng / ml IL-4) .

[0209] The engineered cells can secrete cytokines (e.g., IFN-γ and / or TNF-α) in a long-term cytokine release assay, where the engineered cells are co-cultured with tumor cells (e.g., Hep3B2.1-7 cells) with or without IL-4 (e.g., 10 ng / ml IL-4) . The effector cell: target cell (E: T) ratio may be 1: 40, 0.5: 1, 1: 1, 2: 1, 2.5: 1, 5: 1, or 10: 1. The engineered cells may secrete an amount of IFNγ that is more than 50 pg / ml, more than 100 pg / ml, more than 200 pg / ml, more than 300 pg / ml, more than 400 pg / ml, more than 500 pg / ml, more than 1000 pg / ml, more than 1500 pg / ml, more than 2000 pg / ml, more than 2500 pg / ml, more than 3000 pg / ml, more than 4000 pg / ml, more than 5000 pg / ml, more than 6000 pg / ml, more than 7000 pg / ml, more than 8000 pg / ml, more than 10000 pg / ml, more than 15000 pg / ml, more than 20000 pg / ml, or more than 25000 pg / ml, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of  co-culture with tumor cells (e.g., Hep3B2.1-7 cells) with or without IL-4 (e.g., 10 ng / ml IL-4) . The engineered cells secrete an amount of IFNγ that is less than 50 pg / ml, less than 100 pg / ml, less than 200 pg / ml, less than 300 pg / ml, less than 400 pg / ml, less than 500 pg / ml, less than 1000 pg / ml, less than 1500 pg / ml, less than 2000 pg / ml, less than 2500 pg / ml, or less than 3000 pg / ml, less than 4000 pg / ml, less than 5000 pg / ml, less than 6000 pg / ml, less than 7000 pg / ml, less than 8000 pg / ml, less than 10000 pg / ml, less than 15000 pg / ml, less than 20000 pg / ml, or less than 25000 pg / ml, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells (e.g., Hep3B2.1-7 cells) with or without IL-4 (e.g., 10 ng / ml IL-4) . The engineered cells may secrete an amount of IFNγ that is 500-5000 pg / ml, 1000-4000 pg / ml, 1000-3000 pg / ml, 1500-3000 pg / ml, 50-500 pg / ml, 50-400 pg / ml, 100-1000 pg / ml, 100-800 pg / ml, 100-600 pg / ml, 100-400 pg / ml, 200-400 pg / ml, 200-300 pg / ml, 200-1000 pg / ml, 200-800 pg / ml, 1500-3000 pg / ml, 1000-15000 pg / ml, 5000-15000 pg / ml, or 10000-20000 pg / ml, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells (e.g., Hep3B2.1-7 cells) with or without IL-4 (e.g., 10 ng / ml IL-4) . Comparing to the cells that do not comprise the ICR (e.g., H93 cells) , the secretion of IFNγof the engineered cells comprising the ICR (e.g., H93-IL4R-IL9R cells) may be higher by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 10, 00%, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells (e.g., Hep3B2.1-7 cells) with IL-4 (e.g., 10 ng / ml IL-4) .

[0210] The engineered cells may secrete an amount of TNFα that is more than 10 pg / ml, more than 20 pg / ml, more than 30 pg / ml, more than 40 pg / ml, more than 50 pg / ml, more than 60 pg / ml, more than 70 pg / ml, more than 80 pg / ml, more than 90 pg / ml, more than 100 pg / ml, more than 200 pg / ml, more than 300 pg / ml, more than 400 pg / ml, more than 500 pg / ml, more than 600 pg / ml, more than 700 pg / ml, more than 800 pg / ml, or more than 900 pg / ml, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells (e.g., Hep3B2.1-7 cells) with or without IL-4 (e.g., 10 ng / ml IL-4) . The engineered cells may secrete an amount of TNFα that is less than 10 pg / ml, less than 20 pg / ml, less than 30 pg / ml, less than 40 pg / ml, less than 50 pg / ml, less than 60 pg / ml, less than 70 pg / ml, less than 80 pg / ml, less  than 90 pg / ml, less than 100 pg / ml, less than 200 pg / ml, less than 300 pg / ml, less than 400 pg / ml, less than 500 pg / ml, less than 600 pg / ml, less than 700 pg / ml, less than 800 pg / ml, or less than 900 pg / ml, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells (e.g., Hep3B2.1-7 cells) with or without IL-4 (e.g., 10 ng / ml IL-4) . The engineered cells may secrete an amount of TNFα that is 10-1000 pg / ml, 10-800 pg / ml, 10-500 pg / ml, 10-400 pg / ml, 10-300 pg / ml, 10-200 pg / ml, 20-200 pg / ml, 20-300 pg / ml, 20-400 pg / ml, 50-1000 pg / ml, 50-800 pg / ml, 50-400 pg / ml, 50-200 pg / ml, 50-150 pg / ml, 100-800 pg / ml, 200-800 pg / ml, 200-600 pg / ml, 200-500 pg / ml, 200-400 pg / ml, 300-800 pg / ml, 400-800 pg / ml, 400-900 pg / ml 400-600 pg / ml, 300-600 pg / ml, or 350-600 pg / ml, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells (e.g., Hep3B2.1-7 cells) with or without IL-4 (e.g., 10 ng / ml IL-4) . Comparing to the cells that do not comprise the ICR (e.g., H93 cells) , the secretion of TNFα of the engineered cells comprising the ICR (e.g., H93-IL4R-IL9R cells) may be higher by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 1000%, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells (e.g., Hep3B2.1-7 cells) with IL-4 (e.g., 10 ng / ml IL-4) .

[0211] The engineered cells may secrete more cytokines (e.g., IFNγ and / or TNFα) when the engineered cells are exposed to tumor cells (e.g., Hep3B2.1-7 cells) . The effector cell: target cell (E: T) ratio may be 1: 40, 0.5: 1, 1: 1, 2: 1, 2.5: 1, 5: 1, or 10: 1. Exposure to tumor cells (e.g., Hep3B2.1-7 cells) may increase the secretion of IFNγ by the engineered cells by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 1000%. Exposure to tumor cells (e.g., Hep3B2.1-7 cells) may increase the secretion of TNFα by the engineered cells by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%,  more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 1000%.

[0212] Methods of treatment

[0213] The ICRs described herein, the polynucleotides described herein and the engineered cells described herein can be used in a variety of experimental, therapeutic and commercial applications.

[0214] In one aspect, the disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the engineered cell described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0215] In one aspect, the disclosure provides a method of treating a disease or disorder in a subject (e.g., human subject) , the method comprising administering to the subject, an effective amount of the engineered cell described herein, or the pharmaceutical composition described herein. The disease or disorder may be cancer, an autoimmune disease, a tumor, or an infection.

[0216] The disease or disorder may be solid tumor. “Solid tumor” refers to an abnormal mass of tissue that usually does not contain cysts or liquid areas. Solid tumors may be benign (not cancer) , or malignant (cancer) . Different types of solid tumors are named for the type of cells that form them. Examples of solid tumors are sarcomas, carcinomas, and lymphomas. Leukemias (cancers of the blood) generally do not form solid tumors.

[0217] In one aspect, the disclosure provides a method of modulating an immune response comprising administering an effective amount of engineered cells described herein to a subject in need thereof.

[0218] The term “effective amount” as used herein means an amount effective, at dosages and for periods of time necessary to achieve the desired results.

[0219] In another aspect, the present disclosure provides a method for treating cancer comprising administering an effective amount of engineered cells described herein to a subject in need thereof. Examples of cancer that can be treated include, but are not limited to, small cell lung cancer (SCLC) , large cell neuroendocrine cancer (LCNC) , neuroendocrine prostate cancer (NEPC) , pancreatic neuroendocrine tumor (PNET) , gastrointestinal neuroendocrine cancers, leukemias including chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, acute myelogenous leukemia, acute lymphoblastic leukemia, and T cell and B cell leukemias, lymphomas (Hodgkin's and non-Hodgkins) , lymphoproliferative disorders, plasmacytomas, histiocytomas, melanomas,  adenomas, sarcomas, carcinomas of solid tissues, hypoxic tumors, squamous cell carcinomas, genitourinary cancers such as cervical and bladder cancer, hematopoietic cancers, head and neck cancers, and nervous system cancers. The cancer may be breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, melanoma, oral cancer, mesothelioma, ovarian cancer, colorectal cancer, gastric cancer, cervical cancer, brain cancer, skin cancer, multiple myeloma, lymphoma, epithelial neoplasms, soft tissue sarcoma, esophageal cancers, or CNS tumors.

[0220] The disclosure further includes the use of the engineered cells described herein in the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition to modulate an immune response, to treat an infection or to treat cancer as described hereinabove.

[0221] The engineered cells can also be used in experimental models, for example, to further study and elucidate the function of the cells.

[0222] One or more of the engineered cells described herein can be administered to a subject in a single, unified form, such as an intravenous injection, or in multiple forms, for example, as multiple intravenous infusions or injections, or subcutaneous injections. The engineered cells may expand within a subject's body, in vivo, after administration to a subject. The engineered cells can be frozen to provide cells for multiple treatments with the same cell preparation. The engineered cells of the disclosure, and pharmaceutical compositions comprising the same, can be packaged as a kit. A kit can include instructions (e.g., written instructions) on the use of the engineered cells and compositions comprising the same.

[0223] A method of treatment can comprise administering to a subject a therapeutically effective amount of the engineered cells. The therapeutically effective amount of the engineered cells may be administered for at least 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, or 1 year. The therapeutically effective amount of the engineered cells may be administered for at least one week. The therapeutically effective amount of the engineered cells may be administered for at least two weeks.

[0224] The engineered cells described herein can be administered before, during, or after the occurrence of a disease or condition, and the timing of administering the engineered cells can vary. For example, the engineered cells can be used as a prophylactic and can be administered continuously to subjects with a propensity to conditions or diseases in order to lessen a likelihood of the occurrence of the disease or condition. The engineered cells can be administered to a subject during or as soon as possible after the onset of the symptoms. The administration of the engineered  cells can be initiated immediately within the onset of symptoms, within the first 3 hours of the onset of the symptoms, within the first 6 hours of the onset of the symptoms, within the first 24 hours of the onset of the symptoms, within 48 hours of the onset of the symptoms, or within any period of time from the onset of symptoms. The initial administration can be via any route practical (e.g., intravenous infusions or injections) , such as by any route described herein using any formulation described herein. In some examples, the administration of the engineered cells of the disclosure is an intravenous administration. One or multiple dosages of the engineered cells can be administered as soon as is practicable after the onset of a cancer or an infectious disease, and for a length of time necessary for the treatment of the disease, such as, for example, from about 24 hours to about 48 hours, from about 48 hours to about 1 week, from about 1 week to about 2 weeks, from about 2 weeks to about 1 month, from about 1 month to about 3 months. For the treatment of cancer, one or multiple dosages of the engineered cells can be administered years after onset of the cancer and before or after other treatments. In some examples, the engineered cells can be administered for at least about 10 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, at least 48 hours, at least 72 hours, at least 96 hours, at least 1 week, at least 2 weeks, at least 3 weeks, at least 4 weeks, at least 1 month, at least 2 months, at least 3 months, at least 4 months, at least 5 months, at least 6 months, at least 7 months, at least 8 months, at least 9 months, at least 10 months, at least 11 months, at least 12 months, at least 1 year, at least 2 years at least 3 years, at least 4 years, or at least 5 years. The length of treatment can vary for each subject.

[0225] Methods for administration of engineered cells for adoptive cell therapy are known and can be used in connection with the provided methods and compositions. For example, adoptive T cell therapy methods are described, e.g., in US Patent Application Publication No. 2003 / 0170238 to Gruenberg et al; US Patent No. 4, 690, 915 to Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (10) : 577-85) . See, e.g., Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31 (10) : 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1) : 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8 (4) : e61338. The cell therapy, e.g., adoptive T cell therapy can be carried out by autologous transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from the subject who is to receive the cell therapy, or from a sample derived from such a subject. Thus, the cells may be derived from a subject, e.g., patient, in need of a treatment and the cells, following isolation and processing are administered to the same subject.

[0226] The cell therapy (e.g., adoptive T cell therapy) can be carried out by allogeneic transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from a subject other than a subject who is to receive or who ultimately receives the cell therapy, e.g., a first subject. In such embodiments, the cells then are administered to a different subject, e.g., a second subject, of the same species. The first and second subjects may be genetically identical. The first and second subjects may be genetically similar. The second subject may express the same HLA class or supertype as the first subject.

[0227] The subject (e.g., human subject) may have been treated with a therapeutic agent targeting the disease or condition, e.g., the tumor, prior to administration of the cells or composition containing the cells. The subject may be refractory or non-responsive to the other therapeutic agent. The subject may have persistent or relapsed disease, e.g., following treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) , e.g., allogenic HSCT. The administration may effectively treat the subject despite the subject having become resistant to another therapy.

[0228] The subject may be responsive to the other therapeutic agent, and treatment with the therapeutic agent reduces disease burden. The subject may be initially responsive to the therapeutic agent, but exhibits a relapse of the disease or condition over time. The subject may have not relapsed. The subject may be determined to be at risk for relapse, such as at a high risk of relapse, and thus the cells are administered prophylactically, e.g., to reduce the likelihood of or prevent relapse. The subject may has not received prior treatment with another therapeutic agent.

[0229] The subject may have persistent or relapsed disease, e.g., following treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) , e.g., allogenic HSCT. The administration may effectively treat the subject despite the subject having become resistant to another therapy.

[0230] The engineered cells described herein can be administered to an animal, such as a mammal, even more a human, to treat a cancer. In addition, the engineered cells can be used for the treatment of any condition related to a cancer, especially a cell-mediated immune response against a tumor cell (s) , where it is desirable to treat or alleviate the disease.

[0231] The engineered cells (e.g., immune cells, T cells, or NK cells) described herein can be included in a composition for immunotherapy. The composition can include a pharmaceutical  composition and further include a pharmaceutically acceptable carrier. A therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition comprising the engineered cells can be administered.

[0232] The engineered cells can be immediately used in the above therapeutic, experimental or commercial applications or the cells can be cryopreserved for use at a later date. The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration.

[0233] The engineered cells disclosed herein can be formulated in unit dosage forms suitable for single administration of precise dosages. The unit dosage forms may comprise additional lymphocytes. In unit dosage form, the formulation is divided into unit doses containing appropriate quantities of one or more compounds. The unit dosage can be in the form of a package containing discrete quantities of the formulation. Non-limiting examples are packaged tablets or capsules, and powders in vials or ampoules. Aqueous suspension compositions can be packaged in single-dose non-reclosable containers. Multiple-dose reclosable containers can be used, for example, in combination with a preservative or without a preservative. The pharmaceutical composition may not comprise a preservative. Formulations for parenteral injection can be presented in unit dosage form, for example, in ampoules, or in multi-dose containers with a preservative.

[0234] EXAMPLES

[0235] The disclosure is further described in the following examples, which do not limit the scope of the disclosure described in the claims.

[0236] Example 1. Generation of GPC3 CAR-T cells expressing IL-4Rα inverted cytokine receptor (ICR)

[0237] CAR backbone sequence encoding a GPC3 CAR (H93 CAR, SEQ ID NO: 20) backbone polypeptide comprising from the N-terminus to the C-terminus: a CD8α signal peptide (SEQ ID NO: 25) , an antigen binding domain having an anti-GPC3 scFv (SEQ ID NO: 30) , CD8αhinge domain (SEQ ID NO: 26) , a CD8α transmembrane domain (SEQ ID NO: 27) , a CD137 co-stimulatory signaling domain (SEQ ID NO: 28) , and CD3ζ primary intracellular signaling domain (SEQ ID NO: 29) was chemically synthesized and cloned into a pre-modified lentiviral vector (pLSINK-BBzBB) downstream and operably linked to a constitutive hEF1α promoter for in vitro transcription. To co-express the armor element, IL4R-IL23R, ICR5 and ICR6 sequences were also  chemically synthesized and linked to the C-terminus of a CD3ζ primary intracellular signaling domain by cloneEZ method, respectively. The ICRs were linked to the sequence encoding CAR by a self-cleaving 2A (e.g., P2A, SEQ ID NO: 31) linker, as shown in FIGs. 1a-1b. Lentiviral expression vectors co-expressing IL4R-IL23R#01 (SEQ ID NO: 13) and H93 CAR (SEQ ID NO: 20) (together, H93-IL4R-IL23R#01, SEQ ID NO: 21) , or IL4R-IL23R#02 (SEQ ID NO: 14) and H93 CAR (SEQ ID NO: 20) (together, H93-IL4R-IL23R#02, SEQ ID NO: 22) were prepared. The ICR structures and sequences of the IL-4 inverted cytokine receptors described herein are shown in Table 1.

[0238] Table 1. List of IL4R-IL23R inverted cytokine receptors (ICR) structures

[0239] The lentivirus packaging plasmid mixture containing pMDLg. pRRE (Addgene#12251) , pRSV-REV (Addgene#12253) and pMD2. G (Addgene#12259) were pre-mixed with the vectors expressing CAR constructs at a pre-optimized ratio with polyetherimide (PEI) , then incubated at 25 ℃ for 5 min. The transfection mix were then added into HEK293 cells. Afterwards, cells were incubated overnight in a cell incubator with 5%CO2 at 37℃. The supernatants were collected after centrifuged at 4℃ and 3000 g for 15 min, and filtered through a 0.45 μm PES filter followed by ultra-centrifugation for lentivirus concentration. Then the supernatants were carefully discarded and the virus pellets were rinsed cautiously with pre-chilled DPBS. The viruses were resuspended properly, and stored at -80 ℃. The virus titer was determined by a titration method via transduction of CHO (Chinese hamster ovarian) cell line.

[0240] Human T cells were purified from commercialized PBMCs using Miltenyi Pan T cell isolation kit (Cat#130-096-535) , following manufacturer’s protocols as described below. Cell number was first determined and the cell suspension was centrifuged at 300 g for 10 min. The  supernatant was then discarded completely, and the cell pellets were re-suspended in 40 μL MACS buffer (DPBS supplemented with 8 μM EDTA + 0.5%FBS) per 107 total cells. 10 μL of Pan T Cell Biotin-Antibody Cocktail was added per 107 total cells, mixed thoroughly and incubated for about 5 min in the refrigerator (2～8 ℃) . 30μL of MACS buffer was then added per 107 cells. 20 μL of Pan T Cell MicroBead Cocktail was added per 107 cells. The cell suspension mixture was mixed well and incubated for additional 10 min in the refrigerator (2～8℃) . A minimum of 500 μL was required for magnetic separation. For magnetic separation, an LS column was placed in the magnetic field of a suitable MACS Separator. The column was prepared by rinsing with 3mL of buffer. The cell suspension was then applied onto the column, and flow-through containing the unlabeled cells was collected, which represented the enriched T cell fractions. Additional T cells were collected by washing the column with 3 mL of buffer and collecting unlabeled cells that passed through. These unlabeled cells again represented the enriched T cells, and were combined with the flow-through from previous step. The pooled enriched T cells were then centrifuged and re-suspended in TexMACS GMP Medium&1L (Miltenyi #170-076-309) with 300 IU / mL IL-2.

[0241] The prepared T cells were subsequently pre-activated for 48-96 h with human T cell activation / expansion kit (Miltenyi #130-091-441) according to manufacturer’s protocol in which anti-CD3 / CD28 MACSiBead particles were added at a bead-to-cell ratio of 1: 2.

[0242] The pre-activated T cells were transduced with lentivirus stocks, by adding lentivirus stock directly into the culture medium (TexMACS GMP Medium supplemented with 300 IU / mL IL-2) . The transduced cells were then transferred to a cell culture incubator with 5%CO2 at 37 ℃for transgene expression.

[0243] On day7, CAR expression levels were assessed by flow cytometry. Briefly, 3×105 T cells were collected from each group, then incubated with FITC-GPC3 protein-Fc tag (Acrobiosystems#GP3-HF258-200UG) and PE-anti IL4Rα antibody (Biolegend#355004) , then incubated for 30 min at 4 ℃. As shown in the table below, the CAR positive rates of UnT, H93, H93-IL4R-IL23R#01, H93-IL4R-IL23R#02, H93-ICR5 and H93-ICR6 CAR-T cells were 0.30%, 60.09%, 45.52%, 33.32%, 61.48%and 61.96%, respectively. The IL4Rα expression levels of UnT, H93, H93-IL4R-IL23R#01, H93-IL4R-IL23R#02, H93-ICR5 and H93-ICR6 CAR-T cells were 0.56%, 0.32%, 47.14%, 32.50%, 51.89%and 49.11%, respectively.

[0244] Table 2. CAR and ICR Expression

[0245] Example 2. The expression levels of pSTAT3 and pATAT4 in CAR-T cells expressing IL4R-IL23R treated with IL-4

[0246] To study the intracellular signal transduction of CAR-T cells in vitro in the presence of IL-4, CAR-T cells were treated with 20 ng / mL recombinant human IL-4 (ACRO#IL4-H4218) for 15 min, and then the cells were measured by FACS for pSTAT3 and pSTAT4. The CAR-T cells were fixed with paraformaldehyde and permeabilized with Tween-20 for 10 min. The cells were re-suspended with 100 μL DPBS containing FITC-GPC3 protein-Fc tag (Acrobiosystems#GP3-HF258-200UG) and pSTAT3 antibody (Biolegend#651004) for 30 min at 4℃. The cells were washed with DPBS and re-suspended with 100 μL DPBS then detected by FACS. As shown in FIGs. 2a-2c, after being treated with 20 ng / mL IL-4, the phosphorylation of STAT3 in H93-IL4R-IL23R#01 and H93-IL4R-IL23R#02 CAR-T cells obviously increased compared to that in H93 CAR-T cells. As shown in FIG. 2g, the median fluorescence intensity (MFI) of pSTAT3 in H93-IL4R-IL23R#01, H93-IL4R-IL23R#02 and H93 CAR-T cells without IL-4 were 1267, 952 and 1792. However, the MFI of pSTAT3 in H93-IL4R-IL23R#01, H93-IL4R-IL23R#02 and H93 CAR-T cells treated with 20 ng / mL IL-4 were 8867, 8000 and 3644.

[0247] After being treated with 20 ng / mL IL-4 for 15 min, the cells were measured by FACS using FITC-GPC3 protein-Fc tag (Acrobiosystems#GP3-HF258-200UG) and Phospho-STAT4 (Tyr693) Antibody (Invitrogen #17-9044-42) . As shown in FIGs. 2d-2f, the phosphorylation of STAT4 in H93-IL4R-IL23R#01 and H93-IL4R-IL23R#02 CAR-T cells obviously increased after being treated with 20 ng / mL IL-4 compared to that in H93 CAR-T cells. The MFI of pSTAT4 in H93-IL4R-IL23R#01, H93-IL4R-IL23R#02 and H93 CAR-T cells without IL-4 were 349, 346 and 363. However, the MFI of pSTAT4 in H93-IL4R-IL23R#01, H93-IL4R-IL23R#02 and H93 CAR-T cells treated with 20 ng / mL IL-4 were 1224, 1087 and 477, respectively.

[0248] These results show that H93-IL4R-IL23R#01 and H93-IL4R-IL23R#02 CAR-T cells co-expressing GPC3 CAR and IL4R-IL23R fusion proteins can promote the phosphorylation of STAT3 and STAT4 under the stimulation of IL-4, indicating that H93-IL4R-IL23R#01 and H93- IL4R-IL23R#02 CAR-T cells can convert IL-4R signaling into IL23R signaling and cause the response in downstream. To sum up, the results above firmly show that IL4R-IL23R construct converts an IL-4 mediated inhibitory signal to an IL-23R mediated signal in CAR-T cells, which grants CAR-T cells more potency to kill target cells (e.g., tumor cells) even thought at the present of IL-4.

[0249] Example 3. The re-challenge model in GPC3 CAR-T cells expressing IL4R-IL23R

[0250] To evaluate the persistence of CAR-T cells in vitro, CAR-T cells repeat challenge model was set up. There were two groups of treatment in re-challenged assay: H93 CAR-T group (the initial CAR-T cell was H93 CAR-T cell) , H93-IL4R-IL23R#01 CAR-T group (the initial CAR-T cell was H93-IL4R-IL23R#01 CAR-T cell) . As the first round (Round1) , the CAR-T cells were co-cultured with PLCPRF5 cells (ATCC#CRL-8024) expressing GPC3 at an E / T ratio of 2: 1 overnight. CAR-T cells were re-suspended in fresh medium (RPMI 1640 medium, 10%FBS and 300 IU / mL IL2) after centrifuged at 300 g for 10 min, then cultured for another two days. The viability, count and CAR positive ratio of cells were analyzed. The cells were reused for the same treatments as Round1, for another four rounds. PLCPRF5 cells newly added were adjusted at each round according to the number of CAR-T cells after each round of target cells stimulation.

[0251] The percentage of CAR positive T cells after co-cultured with PLCPRF5 cells were detected by FACS at the end of each stimulation round (FIG. 3a) . In the absence of exogenous addition of IL4, the percentage of CAR positive T cells increased almost similarly between the H93 CAR-T group and H93-IL4R-IL23R#01 CAR-T group, from 35%to 98.58%and to 99.12%, respectively, during the re-challenge model assay.

[0252] The counts and viability of CAR-T cells after co-culture with PLCPRF5 cells were detected by T4 Cell Counter with Trypan blue staining at end of each round. The 20 μL cells suspension were mixed with 20 μL Trypan blue, pipetted into the disposable counting chamber and analyzed by Cellometer T4. And the amplification fold of CAR-T cells was calculated according to the total number of T cells.

[0253] As shown in FIGs. 3b-3c, the amplification folds of H93 CAR-T cells increased from 1 to 18.42, while H93-IL4R-IL23R#01 CAR-T cells increased from 1 to 387.85 folds during the re-challenge model assay. These results indicate that compared with expressing CAR alone, co- expressing with IL4R-IL23R construct provides the CAR-T cells a higher potency to proliferate at present low concentrations of IL4 released by T cells and target cells themselves.

[0254] Example 4. The real time cellular analysis (RTCA) assay and cytokine release in CAR-T cells expressing ICRs

[0255] The real time cytotoxicity potency in CAR-T cells co-cultured with Hep3B2.1-7 cells were measured by RTCA assay. The Hep3B2.1-7 cells (6×103 / well each) were seeded in 96-well E-plates and detected by RTCA analyzer overnight. Then the target cells were incubated with CAR-T or UnT cells at the E / T ratio of 1: 40 with or without 10 ng / mL IL-4, during which the cytotoxicity potency of T cells was detected in real time. The cell index indicates the activity, adhesion and number of the target cells (normalized cell index = the real-time cell index / the cell index at a time point before adding effector cells) .

[0256] During the co-culture process, the monitoring was suspended every 3 days, and 90 μL of culture supernatant was collected from each well for cytokine determination, and then 90 μL of fresh medium was added to continue monitoring. For cytokine release analyzed, the concentration of IFN-γ produced in the culture supernatant were measured by HTRF kit (Cisbio, Cat#62HIFNGPEG) and TNF-α were measured by HTRF kit (Cisbio, Cat#62HTNFAPEG) . Briefly, HTRF reagents were allowed to warm up to room temperature for at least 30 min before the assay. 16 μL / well supernatants from co-culture assay were transferred to 384 well assay plate (Greiner Bio-One, #784075) , followed by adding with 4 μL / well pre-mixed HTRF reagents prepared according to the kit manual. The plate was then sealed with parafilm and incubated overnight at room temperature for IFN-γ test or incubated 2 hours at room temperature for TNF-αtest. The plate was read on an HTRF compatible reader Tecan Spark 10M. IFN-γ and TNF-αconcentration was calculated by referring to the signal obtained by standard curves provided by the kit.

[0257] As shown in FIGs. 4a-4b, the cell index of Hep3B2.1-7 cells co-cultured with UnT cells increased over time significantly and the normalized cell index at the end of the experiment with or without 10 ng / mL IL4 were 4.13 and 3.76. The H93, H93-IL4R-IL23R#01, H93-ICR5 and H93-ICR6 CAR-T cells showed cytotoxicity on Hep3B2.1-7 cells at different extent with the extension of time. As shown in FIG. 4a, the normalized cell indexes of Hep3B2.1-7 cells co-cultured with H93, H93-IL4R-IL23R#01, H93-ICR5 and H93-ICR6 CAR-T cells without 10  ng / mL IL-4 were 1.96, 1.85, 2.43 and 1.52, respectively. As shown in FIG. 4b, the normalized cell indexes of H93, H93-IL4R-IL23R#01, H93-ICR5 and H93-ICR6 CAR-T cells with 10 ng / mL IL-4 were 2.26, 0.03, 1.03 and 0.17, respectively. These results suggest that the long-term cytotoxicity of CAR-T cells co-expressing IL4R-IL23R or IL4R-IL2R constructs are enhanced in the presence of IL-4 (10 ng / mL) , and H93 CAR-T co-expressing IL4R-IL23R showed significantly stronger long-term cytotoxicity than that of H93 CAR-T co-expressing IL4R-IL2R (H93-ICR5 or H93-ICR6) .

[0258] As shown in FIG. 5a, the IFN-γ release of H93 CAR-T cells with or without 10 ng / mL IL-4 were 125 pg / mL and 21511 pg / mL, respectively. The IFN-γ release of H93-IL4R-IL23R#01, H93-ICR5 and H93-ICR6 CAR-T cell without 10 ng / mL IL-4 at Day12 were 1410 pg / mL, 353 pg / mL and 438 pg / mL, respectively. And the IFN-γ release of H93-IL4R-IL23R#01, H93-ICR5 and H93-ICR6 CAR-T cell with 10 ng / mL IL-4 at Day12 were 16382 pg / mL, 193 pg / mL, and 7379 pg / mL, respectively. As shown in FIG. 5b, the TNF-α release of H93 CAR-T cell with or without 10 ng / mL IL-4 at Day12 were 50 pg / mL and 226 pg / mL, respectively. The TNF-α release of H93-IL4R-IL23R#01, H93-ICR5 and H93-ICR6 CAR-T cell without 10 ng / mL IL-4 at Day12 were 64 pg / mL, 57 pg / mL and 57 pg / mL, respectively. And the TNF-α release of H93-IL4R-IL23R#01, H93-ICR5 and H93-ICR6 CAR-T cell with 10 ng / mL IL-4 at Day12 were 858 pg / mL, 62 pg / mL, and 363 pg / mL, respectively. These results suggest that IL-4 can significantly inhibit H93 cytokines release, and the cytokine release of H93-IL4R-IL23R#01 is higher than that of H93 CAR-T cells co-expressing IL4R-IL2R (H93-ICR5 or H93-ICR6) .

[0259] OTHER EMBODIMENTS

[0260] It is to be understood that while the disclosure has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the disclosure, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims

1.A fusion protein comprising: (1) an extracellular domain that specifically binds to interleukin-4 (IL-4) , and (2) an intracellular domain; wherein upon binding to IL-4, the fusion protein transmits an interleukin-23 (IL-23) pathway signal.2.The fusion protein of claim 1, wherein the fusion protein comprises a first polypeptide chain and a second polypeptide chain.3.The fusion protein of claim 2, wherein the first polypeptide chain comprises (1) a first extracellular domain that comprises an interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα) extracellular domain, and (2) a first intracellular domain that comprises an interleukin-12 receptor beta 1 subunit (IL-12Rβ1) intracellular domain or an interleukin-23 receptor (IL-23R) intracellular domain.4.The fusion protein of claim 2 or claim 3, wherein the second polypeptide chain comprises (1) a second extracellular domain that comprises an interleukin-2 receptor gamma (IL-2Rγ) extracellular domain, and (2) a second intracellular domain that comprises an IL-12Rβ1 intracellular domain or an IL-23R intracellular domain.5.The fusion protein of any one of claims 2-4, wherein(a) the first polypeptide chain comprises (1) a first extracellular domain that comprises an IL-4Rα extracellular domain, and (2) a first intracellular domain that comprises an IL-12Rβ1 intracellular domain, and the second polypeptide chain comprises (1) a second extracellular domain that comprises an IL-2Rγ extracellular domain, and (2) a second intracellular domain that comprises an IL-23R intracellular domain; or(b) the first polypeptide chain comprises (1) a first extracellular domain that comprises an IL-4Rα extracellular domain, and (2) a first intracellular domain that comprises an IL-23R intracellular domain, and the second polypeptide chain comprises (1) a second extracellular domain that comprises an IL-2Rγ extracellular domain, and (2) a second intracellular domain that comprises an IL-12Rβ1 intracellular domain.6.A fusion protein comprising:(a) a first polypeptide chain that comprises(1) a first extracellular domain that comprises an IL-4Rα extracellular domain, and(2) a first intracellular domain that comprises an IL-12Rβ1 intracellular domain, anda second polypeptide chain that comprises(1) a second extracellular domain that comprises an IL-2Rγ extracellular domain, and(2) a second intracellular domain that comprises an IL-23R intracellular domain; or(b) a first polypeptide chain that comprises(1) a first extracellular domain that comprises an IL-4Rα extracellular domain, and(2) a first intracellular domain that comprises an IL-23R intracellular domain, anda second polypeptide chain that comprises(1) a second extracellular domain that comprises an IL-2Rγ extracellular domain, and(2) a second intracellular domain that comprises an IL-12Rβ1 intracellular domain.7.The fusion protein of any one of claims 2-6, wherein the first polypeptide chain and the second polypeptide chain are linked to each other via a 2A cleavable linker.8.The fusion protein of any one of claims 2-7, wherein the first extracellular domain and the second extracellular domain form a binding site for IL-4, wherein the first intracellular domain and the second intracellular domain form an IL-23 receptor complex, and wherein upon binding of the fusion protein to IL-4, signaling through the IL-23 receptor complex is transmitted.9.The fusion protein of any one of claims 3-8, wherein the IL-4Rα extracellular domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.10.The fusion protein of any one of claims 4-8, wherein the IL-2Rγ extracellular domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence  having at least 90%, 95%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.11.The fusion protein of any one of claims 3-10, wherein the IL-12Rβ1 intracellular domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.12.The fusion protein of any one of claims 3-11, wherein the IL-23R intracellular domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.13.The fusion protein of any one of claims 1-12, wherein the fusion protein further comprises a transmembrane domain.14.The fusion protein of claim 13, wherein the transmembrane domain is selected from the group consisting of a transmembrane domain of IL-4Rα, a transmembrane domain of IL-2Rγ, a transmembrane domain of IL-12Rβ1, and a transmembrane domain of IL-23R.15.The fusion protein of claim 13 or claim 14, wherein the transmembrane domain comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 7, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 7.16.The fusion protein of any one of claims 13-15, wherein the fusion protein comprises a first transmembrane domain in the first polypeptide chain and a second transmembrane domain in the second polypeptide chain; optionally, the first transmembrane domain and the second transmembrane domain can dimerize.17.The fusion protein of any one of claims 13-16, further comprising a connection sequence located between the C-terminus of the extracellular domain and the N-terminus of the transmembrane domain.18.The fusion protein of claim 17, wherein the connection sequence comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 6, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 6.19.The fusion protein of any one of claims 1-18, wherein the fusion protein comprises a first and / or a second polypeptide chain that comprises an amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9-14, or an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 9-14.20.The fusion protein of any one of claims 1-19, wherein the fusion protein is an inverted cytokine receptor (ICR) .21.A nucleic acid comprising one or more nucleic acid sequences encoding the fusion protein of any one of claims 1-20 or a portion thereof.22.The nucleic acid of claim 21, wherein the nucleic acid further comprises a second nucleic acid sequence encoding an engineered receptor, wherein the engineered receptor comprises an extracellular antigen binding domain or ligand binding domain, and optionally an intracellular signaling domain.23.The nucleic acid of claim 22, wherein the nucleic acid sequence encoding the engineered receptor is upstream or downstream to at least one of the one or more nucleic acid sequences encoding the fusion protein, and optionally wherein the engineered receptor nucleic acid sequence and the fusion protein nucleic acid sequence are separated by a linker nucleic acid sequence encoding a 2A cleavable linker.24.The nucleic acid of claim 23, wherein the 2A cleavable linker comprises an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 31-33, or a functional variant having at least about 90%sequence identity thereto.25.The nucleic acid of any one of claims 22-24, wherein the engineered receptor is selected from the group consisting of an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) , a T cell antigen coupler (TAC) or a portion thereof.26.The nucleic acid of claim 25, wherein the engineered receptor is a CAR.27.The nucleic acid of claim 26, wherein the CAR comprises an extracellular antigen binding domain that specifically binds to an antigen, wherein the antigen is a tumor antigen selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2 (HER-2) , ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, hTERT, IL-13R-α2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44V6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, and PD-L2.28.The nucleic acid of claim 27, wherein the tumor antigen is GPC3.29.The nucleic acid of any one of claims 26-28, wherein the CAR comprises a primary intracellular signaling domain of an immune cell, and / or a co-stimulatory signaling domain.30.The nucleic acid of claim 29, wherein the primary intracellular signaling domain is derived from CD3ζ, and wherein the co-stimulatory signaling domain is derived from a co-stimulatory molecule selected from the group consisting of CD27, CD28, CD137, OX40, CD30,  CD40, CD3, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ligands of CD83 and combinations thereof.31.The nucleic acid of any one of claims 26-30, wherein the CAR comprises a transmembrane domain derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, CD4, CD28, CD137, CD80, CD86, CD152 and PD1.32.The nucleic acid of any one of claims 26-31, wherein the CAR further comprises a hinge domain located between the C-terminus of the extracellular antigen binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain.33.The nucleic acid of any one of claims 26-32, wherein the CAR further comprises a signal peptide located at the N-terminus of the extracellular antigen binding domain.34.The nucleic acid of any one of claims 21-33, wherein the nucleic acid encodes an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 9-14 and 20-22, or a functional variant having at least about 90%sequence identity thereto.35.A vector comprising the nucleic acid of any one of claims 21-34.36.An engineered cell comprising the fusion protein of any one of claims 1-20, the nucleic acid of claims 21-34, and / or the vector of claim 35.37.The engineered cell of claim 36, further comprising an engineered receptor, wherein the engineered receptor comprises an extracellular antigen binding domain or ligand binding domain, and optionally an intracellular signaling domain.38.The engineered cell of claim 37, wherein the engineered receptor is selected from the group consisting of an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) , a T cell antigen coupler (TAC) or a portion thereof.39.The engineered cell of claim 37 or claim 38, wherein the engineered receptor specifically binds to an antigen.40.The engineered cell of any one of claims 36-39, wherein the engineered cell comprises a polypeptide encoding a fusion protein and / or a polypeptide encoding a CAR, and wherein the polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9-14 and 20-22, or a functional variant having at least about 90%sequence identity thereto.41.The engineered cell of any one of claims 36-40, wherein the engineered cell is an immune cell.42.The engineered cell of claim 41, wherein the immune cell is selected from a group consisting of T cell, NK cell, peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , hematopoietic stem cell, pluripotent stem cell, an embryonic stem cell, and a combination thereof.43.The engineered cell of claim 42, wherein the immune cell is a T cell, optionally the immune cell is an αβT cell or a γδT cell.44.A pharmaceutical composition, comprising the engineered cell of any one of claims 36-43, and a pharmaceutically acceptable carrier.45.A method for producing an engineered cell, the method comprising introducing the vector of claim 35 into a cell.46.A method of treating a disease or disorder in a subject, the method comprising administering to the subject in need thereof a therapeutically effective amount of the engineered cell of any one of claims 36-43, or the pharmaceutical composition of claim 44.47.The method of claim 46, wherein the disease or disorder is cancer, autoimmune disease, or tumor.48.The method of claim 46 or claim 47, wherein the disease or disorder is breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, melanoma, oral cancer, mesothelioma, ovarian cancer, colorectal cancer, gastric cancer, cervical cancer, brain cancer, skin cancer, multiple myeloma, lymphoma, epithelial neoplasms, soft tissue sarcoma, esophageal cancers, or CNS tumors.

Images