Compositions of bioactive agents

Abstract

Compositions useful for delaying reproductive aging in an individual comprise L-ergothioneine and ginsenoside Rb1. Methods of delaying reproductive aging, such as methods of treating age-related ovarian granulosa cell injury.

Description

COMPOSITIONS OF BIOACTIVE AGENTSFIELD

[0001] The present disclosure in some aspects relates generally to compositions useful for delaying reproductive aging in an individual. The present disclosure in some aspects relates generally to methods of delaying reproductive aging, such as methods of treating age-related ovarian granulosa cell injury.BACKGROUND

[0002] Female infertility and the probability of spontaneous abortion increase significantly with maternal age, which has become the focus in the field of reproductive medicine in recent years. Studies have revealed that age-related physiological and pathological changes play a significant role in ovarian dysfunction and infertility, which suggests a potential target for delaying or treating reproductive aging. However, there remains a great need for effective interventions to delay reproductive aging and treat conditions associated with reproductive aging, such as to improve pregnancy outcomes, especially effective interventions based on natural products. The present application addresses such needs.SUMMARY

[0003] In one aspect, provided herein is a method of delaying reproductive aging in an individual, comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of L-ergothioneine (EGT) . In one aspect, provided herein is a method of treating age-related ovarian dysfunction in an individual, comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of L-ergothioneine (EGT) . In one aspect, provided herein is a method of treating oxidative stress-induced ovarian granulosa cell injury in an individual, comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of L-ergothioneine (EGT) . In some embodiments, the method further comprises administering to the individual a therapeutically effective amount of ginsenoside Rb1 (Rb1) .

[0004] In some embodiments, the EGT and the Rb1 are administered in a single composition. In some embodiments, the EGT is present in a range of 0.375%to 1.125%by weight of the single composition. In some embodiments, the EGT is present in a weight percentage of 0.75%of the single composition. In some embodiments, the Rb1 is present in  a range of 0.0375%to 0.1125%by weight of the single composition. In some embodiments, the Rb1 is present in a weight percentage of 0.075%of the single composition. In some embodiments, the EGT and Rb1 are present in the single composition in a weight ratio of about 1: 1 to about 20: 1. In some embodiments, the EGT and Rb1 are present in the single composition in a weight ratio of about 10: 1. In some embodiments, the single composition further comprises a pharmaceutically acceptable excipient. In some embodiments, the single composition further comprises water.

[0005] In some embodiments, the EGT is administered in a first composition and the Rb1 is administered in a second composition. In some embodiments, the weight ratio of EGT administered in each administration of the first composition to Rb1 administered in each administration of the second composition is about 1: 1 to about 20: 1. In some embodiments, the weight ratio of EGT administered in each administration of the first composition to Rb1 administered in each administration of the second composition is about 10: 1.

[0006] In some embodiments, the EGT and Rb1 are administered simultaneously. In some embodiments, the EGT and Rb1 are administered sequentially. In some embodiments, the EGT is administered orally. In some embodiments, the Rb1 is administered orally.

[0007] In one aspect, provided herein is a composition for delaying reproductive aging in an individual, comprising EGT and Rb1. In some embodiments, the EGT and Rb1 are present in a weight ratio of about 1: 1 to about 20: 1. In some embodiments, the EGT and Rb1 are present in a weight ratio of about 10: 1. In some embodiments, the EGT is present in a range of 0.375%to 1.125%by weight of the composition. In some embodiments, the EGT is present in a weight percentage of 0.75%of the composition. In some embodiments, the Rb1 is present in a range of 0.0375%to 0.1125%by weight of the composition. In some embodiments, the Rb1 is present in a weight percentage of 0.075 %of the composition. In some embodiments, the composition further comprises a pharmaceutically acceptable excipient. In some embodiments, the composition further comprises water

[0008] In some embodiments, the composition treats age-related ovarian dysfunction. In some embodiments, the composition treats oxidative stress-induced ovarian granulosa cell injury. In some embodiments, the composition treats infertility.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0009] The drawings illustrate certain embodiments of the features and advantages of this disclosure. These embodiments are not intended to limit the scope of the appended claims in any manner.

[0010] FIG. 1A shows the body weight of tested mice with an average age of 8 months before EGT, Rb1, or EGT and Rb1 treatment.

[0011] FIG. 1B shows the body weight of tested mice after one month of EGT, Rb1, or EGT and Rb1 treatment.

[0012] FIG. 1C shows the change of average days per estrus cycle in tested mice after EGT, Rb1, or EGT and Rb1 treatment.

[0013] FIG. 2A shows the change in number of live births in tested mice upon EGT, Rb1, or EGT and Rb1 treatment.

[0014] FIG. 2B shows the change of pups per female in tested mice after EGT, Rb1, or EGT and Rb1 treatment.

[0015] FIG. 3A shows images of the ovary in tested mice after EGT, Rb1, or EGT and Rb1 treatment.

[0016] FIG. 3B shows the change of ovary weight (g) in tested mice after EGT, Rb1, or EGT and Rb1 treatment.

[0017] FIG. 3C shows the change of ovary weight / body weight ratio in tested mice after EGT, Rb1, or EGT and Rb1 treatment.

[0018] FIG. 4A shows images of follicles in ovary in tested mice after EGT, Rb1, or EGT and Rb1 treatment.

[0019] FIG. 4B shows the change in number of total follicles per ovary in tested mice after EGT, Rb1, or EGT and Rb1 treatment.

[0020] FIG. 4C shows the change in number of primordial follicles per ovary in tested mice after EGT, Rb1, or EGT and Rb1 treatment.

[0021] FIG. 4D shows the change in number of growing follicles per ovary in tested mice after EGT, Rb1, or EGT and Rb1 treatment.DETAILED DESCRIPTION

[0022] The following description is presented to enable a person of ordinary skill in the art to make and use the various embodiments. Descriptions of specific compositions, methods, and uses are provided only as examples. Various modifications to the examples described herein will be readily apparent to those of ordinary skill in the art, and the general principles defined herein may be applied to other examples and applications without departing from the spirit and scope of the various embodiments. Thus, the various embodiments are not intended  to be limited to the examples described herein and shown, but are to be accorded the scope consistent with the claims.

[0023] The present application provides methods and compositions for delaying reproductive aging, and / or treating conditions associated with ovarian aging. The methods are based on the surprising finding that the naturally occurring antioxidant L-ergothioneine (EGT) , used alone or in combination with another naturally occurring antioxidant Rb1 (Rb1) , led to a significant delay in reproductive aging. This is demonstrated by, for example, the decrease in average days per estrus cycle in mice, the increased number of growing follicles per ovary, and increased live births.

[0024] L-ergothioneine (EGT) and ginsenoside Rb1 (Rb1) are both natural, well-known, selective, and safe anti-oxidants. EGT is a naturally occurring hydrophilic amino acid that is only synthesized by certain bacteria and fungi, and is present in many natural food. As a natural antioxidant compound, EGT has been reported to have anti-senescence, anti-inflammatory and anti-neurodegenerative properties. The natural antioxidant compound ginsenoside Rb1 has been widely investigated for its pharmacological anti-aging effects and its efficacy in inhibiting oxidative stress-induced ovarian granulosa cell injury through Akt-FoxO1 interaction, which improves age-related ovarian dysfunction. However, until today, nobody has ever tied these antioxidants to age-related ovarian dysfunction. The present application has for the first time provided efficacious pharmaceutical compositions based on EGT, optionally comprising Rb1, for use in delaying reproductive aging.

[0025] Thus, the present application in one aspect provides a method of delaying reproductive aging in an individual, comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of L-ergothioneine (EGT) . In some variations, the method further comprises administering to the individual a therapeutically effective amount of ginsenoside Rb1 (Rb1) . In another aspect, there is provide a composition comprising EGT and Rb1.

[0026] I. Definition

[0027] As used in the present specification, the following words and phrases are generally intended to have the meanings as set forth below, except to the extent that the context in which they are used indicates otherwise.

[0028] As used herein and in the appended claims, the singular forms “a” , “an” and “the” include plural forms, unless the context clearly dictates otherwise.

[0029] The term “about” indicates and encompasses an indicated value and a range above and below that value. In certain embodiments, the term “about” indicates the designated value ± 10%, ± 5%, or ± 1%. In certain embodiments, the term “about” indicates the designated value ± one standard deviation of that value.

[0030] The terms “effective amount” , “therapeutically effective amount” and “pharmaceutically effective amount” refer to a sufficient amount of an agent to provide the desired biological result. That result can be a reduction (e.g., reducing at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, or 100%) and / or alleviation of the signs, symptoms, or causes of a disease or disorder, or any other desired alteration of a biological system. An appropriate effective amount in any individual case may be determined by one of ordinary skill in the art using routine experimentation.

[0031] The terms “patient, ” “subject, ” “individual, ” and the like are used interchangeably herein, and refer to any animal, in some embodiments a mammal, and in some embodiments a human, having a complement system, including a human in need of therapy for, or susceptible to, a condition or its sequelae. The individual may include, for example, dogs, cats, pigs, cows, sheep, goats, horses, rats, rabbits, hamsters, guinea pigs, monkeys, mice, and humans. In some embodiments, the individual is a human.

[0032] The term “treatment” typically refers to a clinical intervention designed to alter the natural course of the individual or cell being treated during the course of clinical pathology. Desirable effects of treatment include decreasing the rate of disease progression, ameliorating or palliating the disease state, and remission or improved prognosis. For example, an individual is successfully “treated” if one or more symptoms associated with disease or disorder are mitigated or eliminated, including, but not limited to, decreasing the frequency and / or severity of a sign and / or symptoms resulting from the disease, increasing the quality of life of those suffering from the disease, decreasing the dose of other medications required to treat the disease, and / or prolonging survival of individuals.

[0033] In certain instances, the terms "prevention" , "prophylaxis" and "preclusion" are used synonymously and refer to the avoidance or reduction of the risk of contracting, experiencing, suffering from or having a disease, a condition, a disorder (e.g., a disorder associated with ovarian aging) , a symptom or a health problem, or a development or advancement of such states and / or the symptoms of such states. In certain instances, prevention of a disorder associated with ovarian aging means to delay, defer, hinder, slow,  retard, stabilize, and / or postpone the development of the disorder or any symptom thereof. This delay can be of varying lengths of time, depending on the history of the disease and / or the individual being treated. A method that prevents the development of a disorder associated with ovarian aging (e.g., primary ovarian insufficiency) is a method that reduces the probability of disease development in a given time frame and / or reduces the extent of the disorder in a given time frame, when compared to not using the method. Development may also refer to disease progression that may be initially undetectable and includes occurrence, recurrence, and onset. The treatment or prevention of a disease, a condition, a disorder, an injury or a health problem may be partial or complete.

[0034] “Pharmaceutically acceptable salts” are those salts which retain at least some of the biological activity of the free (non-salt) compound and which can be administered as drugs or pharmaceuticals to an individual. Such salts, for example, include: (1) acid addition salts, formed with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, and the like; or formed with organic acids such as acetic acid, oxalic acid, propionic acid, succinic acid, maleic acid, tartaric acid and the like; (2) salts formed when an acidic proton present in the parent compound either is replaced by a metal ion, e.g., an alkali metal ion, an alkaline earth ion, or an aluminum ion; or coordinates with an organic base. Acceptable organic bases include ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine and the like. Acceptable inorganic bases include aluminum hydroxide, calcium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydroxide, and the like. Pharmaceutically acceptable salts can be prepared in situ in the manufacturing process, or by separately reacting a purified compound of the invention in its free acid or base form with a suitable organic or inorganic base or acid, respectively, and isolating the salt thus formed during subsequent purification.

[0035] It is understood that embodiments described herein as “comprising” include “consisting of” and “consisting essentially of” embodiments.

[0036] II. Method of Treatment

[0037] In one aspect, provided herein is a method of delaying reproductive aging in an individual, comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of L-ergothioneine (EGT) . In some embodiments, the method further comprises administering to the individual a therapeutically effective amount of ginsenoside Rb1 (Rb1) . In some  embodiments, the EGT and the Rb1 are administered in a single composition. In some embodiments, the method provided herein comprises administering to the individual a therapeutically effective amount of EGT and a therapeutically effective amount of Rb1 in a single composition, wherein the EGT is present in a range of 0.375%to 1.125% (e.g., 0.75%) by weight of the single composition, and wherein Rb1 is present in a range of 0.0375%to 0.1125% (e.g., 0.075%) by weight of the single composition. In some embodiments, the EGT and Rb1 are present in the single composition in a weight ratio of about 1: 1 to about 20: 1 (e.g., 10: 1) . In some embodiments, the method provided herein comprises administering to the individual a therapeutically effective amount of EGT in a first composition and administering to the individual a therapeutically effective amount of Rb1 in a second composition. In some embodiments, the weight ratio of EGT administered in each administration to Rb1 administered in each administration is about 1: 1 to about 20: 1 (e.g., 10: 1) . In some embodiments, the EGT and Rb1 are administered simultaneously. In some embodiments, the EGT and Rb1 are administered orally.

[0038] In some embodiments, provided herein is a method of delaying reproductive aging in an individual comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of EGT and a therapeutically effective amount of Rb1. In some embodiments, provided herein is a method of delaying ovarian aging. In some embodiments, provided herein is a method for treating oxidative stress-induced ovarian granulosa cell injury in an individual comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of EGT and a therapeutically effective amount of Rb1. In some embodiments, provided herein is a method for treating infertility in an individual comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of EGT and a therapeutically effective amount of Rb1. In some embodiments, provided herein is a method for treating conditions associated with ovarian aging in an individual comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of EGT and a therapeutically effective amount of Rb1. In some embodiments, provided herein is use of EGT in the manufacture of a medicament for delaying reproductive aging. In some embodiments, provided herein is use of EGT and Rb1 in the manufacture of a medicament for delaying reproductive aging. In some embodiments, provided herein is use of EGT in the manufacture of a medicament for delaying ovarian aging. In some embodiments, provided herein is use of EGT and Rb1 in the manufacture of a medicament for delaying ovarian aging. In some embodiments, provided herein is use of EGT in the manufacture of a medicament for treating oxidative stress-induced ovarian  granulosa cell injury. In some embodiments, provided herein is use of EGT and Rb1 in the manufacture of a medicament for treating oxidative stress-induced ovarian granulosa cell injury. In some embodiments, provided herein is use of EGT in the manufacture of a medicament for treating infertility. In some embodiments, provided herein is use of EGT and Rb1 in the manufacture of a medicament for treating infertility. In some embodiments, provided herein is use of EGT in the manufacture of a medicament for treating conditions associated with ovarian aging. In some embodiments, provided herein is use of EGT and Rb1 in the manufacture of a medicament for treating conditions associated with ovarian aging. In some embodiments, conditions associated with ovarian aging include, but are not limited to, primary ovarian insufficiency (POI) , premature ovarian failure (POF) , polycystic ovary syndrome (PCOS) and diminished ovarian reserve (DOR) . In some embodiments, provided herein is a method of reversing, delaying the progression, or preventing ovarian cancer.

[0039] In some embodiments, the compositions provided herein can be used to improve the longevity of the female's reproductive lifespan; preserve ovarian reserve; preserve the functions of the follicles and granulosa cells (GCs) ; or any combination thereof, for example as assessed over a period of months or years. In some embodiments, the compositions provided herein can be used to prolong the duration of each menstrual cycle (e.g., prolong the duration of each menstrual cycle by at least about any of 12 hours, 24 hours, 36 hours, 48 hours, or 60 hours. In some embodiments, compositions provided herein can be used to prolong the time to menopause, such as delay the onset of menopause by at least about any of 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, or more months. In some embodiments, the compositions provided herein can be used to restore or maintain fertility. For example, in some embodiments, the compositions provided herein can be used to restore hormone production to levels that are consistent with retained fertility and ovarian function as measured by blood testing. In some embodiments, the compositions provided herein can be used to increase (e.g., at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1-fold, 2-fold, 2.5-fold, 5-fold, 10-fold, or more) number of total follicle per ovary in female.

[0040] In some embodiments, the ovarian function and parameters of female fertility may be measured to determine the therapeutically effective amount of EGT and / or Rb1. In some embodiments, the ovarian function and parameters of female fertility may be monitored before or following the administration of a therapeutically effective amount of EGT and a therapeutically effective amount of Rb1 to an individual in need thereof. Accordingly, one or more of several methods may be implemented. Ultrasonographic assessment of ovarian  aging, including antral follicle count, ovarian volume, and ovarian blood flow measurement may be performed. In some embodiments, B-scan may be utilized to determine the number of developed follicles in ovaries. In some embodiments, transvaginal color Doppler ultrasonography may be performed to evaluate blood flow. In some embodiments, blood testing for follicle-stimulating hormone (FSH) , luteinizing hormone (LH) , estradiol, inhibin B, progesterone (P4) , and FSH / LH ratio can be performed. In some embodiments, anti-Müllerian hormone (AMH) can be measured to evaluate ovarian aging. AMH is a dimeric glycoprotein secreted to the serum from the granulosa cells of early developing follicles, especially from pre-antral and small antral follicles, and thus is correlated with antral follicle count. In some embodiments, dynamic tests that can be performed, which include, but are not limited to clomiphene citrate challenge test (CCCT) and Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH) agonist stimulation. In some embodiments, ovary-or adrenal-specific antibody testing may be performed. In some embodiments, fertility testing may also be performed. For example, basal body temperature may be measured or ovulation predictor kits known in the art may be utilized to evaluate, where applicable, if ovulation has occurred. In some embodiments, the individuals may be monitored long-term to determine the number of successful pregnancy and live births.

[0041] In some embodiments, the individual is an aged female, such as a female with an age of at least about any of 40, 45, 50, 55, 60, 65, or 70. In some embodiments, the individual is a female at premenopausal age. In some embodiments, the individual is a female experiencing perimenopause or any symptom thereof, such as hot flashes, night sweats, change in sexual desire, trouble with sleep, or any combination thereof. In some embodiments, the female has been diagnosed with primary ovarian insufficiency (POI) , premature ovarian failure (POF) , polycystic ovary syndrome (PCOS) , or diminished ovarian reserve (DOR) , or any combination thereof. In some embodiments, the female is at risk of developing POI, POF, PCOS, DOR, or any combination thereof. For example, in some embodiments, the female has elevated FSH level in blood (e.g., a blood FSH level of more than about any of 25 IU / L, 30 IU / L, 35 IU / L, or 40 IU / L) , has follicular atresia, has apoptosis in primordial follicle oocytes, has reduced synthesis and / or secretion of at least one steroid hormone (e.g., estrogen) , or has any combination thereof.

[0042] II. EGT, Rb1, and Compositions Thereof

[0043] In some embodiments, the method provided herein comprises administering a therapeutically effective amount of EGT to an individual in need thereof. In some variations, the method provided herein comprises administering a therapeutically effective amount of EGT and a therapeutically effective amount of Rb1 in pharmaceutically acceptable composition (s) , such as in a single composition, or in separate compositions.

[0044] EGT

[0045] In some embodiments, L-Ergothioneine (EGT) , as used herein, has the chemical formula:

[0046] In some embodiments, EGT, as used herein, can also be referred to as ergothioneine, L-EGT, L- (+) -Ergothioneine (ERG) , 2-mercapto histidine trimethyl betaine, 2-mercapto-L-histidine betaine (ESH) ; S-alpha-carboxy-2, 3-dihydro-N, N-N-trimethyl-thioxo-1H-imida-zole-4-eth-anaminium hydroxide, thiasine, or thiol histidine betaine. In some embodiments, depending on the pH value of the composition, EGT may be protonated or deprotonated to form a pharmaceutically acceptable salt. It is understood that any pharmaceutically acceptable salt of EGT is also encompassed in the present invention.

[0047] Also encompassed in the present invention are isotopically-labeled and / or isotopically-enriched forms of EGT. Exemplary isotopes that can be incorporated into EGT include isotopes of hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, sulfur, such as 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15O, 17O, and 35S. As used herein, each instance of enrichment, substitution, or replacement of an atom with corresponding isotope of that atom encompasses isotopic enrichment levels of one of about: 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99, 6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, or 100%, or a range between any two of the preceding percentages.

[0048] In some embodiments, the exact compound of EGT is used for any of the methods or compositions described herein.

[0049] Rb1

[0050] In some embodiments, the method provided herein comprises administering a therapeutically effective amount of ginsenoside (Rb1) . In some embodiments, ginsenoside, as used herein, has the chemical formula:

[0051] In some embodiments, Rb1 can be extracted from the natural product Ginseng (family Araliaceae) . In some embodiments, depending on the pH value of the composition, Rb1 may be protonated or deprotonated to form a pharmaceutically acceptable salt. It is understood that any pharmaceutically acceptable salt of Rb1 is also encompassed in the present invention.

[0052] Also encompassed in the present invention are isotopically-labeled and / or isotopically-enriched forms of Rb1. Exemplary isotopes that can be incorporated into EGT include isotopes of hydrogen, carbon, oxygen, such as 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 15O, and 17O. As used herein, each instance of enrichment, substitution, or replacement of an atom with corresponding isotope of that atom encompasses isotopic enrichment levels of one of about: 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99, 6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, or 100%, or a range between any two of the preceding percentages.

[0053] In some embodiments, the exact compound of Rb1 is used for any of the methods or compositions described herein.

[0054] Composition

[0055] In some embodiments, the method provided herein comprises administering a therapeutically effective amount of EGT and a therapeutically effective amount of Rb1 in a single composition (such as a single pharmaceutical composition) . Also provided herein is a  composition (e.g., composition for delaying reproductive aging) in an individual comprising EGT and Rb1.

[0056] In some embodiments, the EGT is present at a weight percentage of at least 0.1 % (e.g., at least about any of 0.15 %, 0.2 %, 0.25 %, 0.275 %, 0.3 %, 0.325 %, 0.35 %, 0.375 %, 0.4%, 0.45 %, 0.5 %, 0.55 %, 0.6 %, 0.65 %, 0.7 %, or 0.75 %) . In some embodiments, the EGT is present at a weight percentage of no more than 1.5 % (e.g., no more than about any of 1.45 %, 1.4 %, 1.35 %, 1.3 %, 1.25 %, 1.2 %, 1.15 %, 1.125 %, 1.1 %, 1.05 %, 1 %, 0.95 %, 0.9 %, 0.85 %, 0.8 %, or 0.75 %) . In some embodiments, the EGT is present in a range of about 0.1 %to about 1.5%, about 0.25 %to about 1.25%, about 0.375%to about 1.125%, or about 0.75%by weight of the composition.

[0057] In some embodiments, the Rb1 is present at a weight percentage of at least 0.01 % (e.g., at least about any of 0.015 %, 0.02 %, 0.025 %, 0.0275 %, 0.03 %, 0.0325 %, 0.035 %, 0.0375 %, 0.04%, 0.045 %, 0.05 %, 0.055 %, 0.06 %, 0.065 %, 0.07 %, or 0.075 %) . In some embodiments, the Rb1 is present at a weight percentage of no more than 0.15 % (e.g., no more than about any of 0.145 %, 0.14 %, 0.135 %, 0.13 %, 0.125 %, 0.12 %, 0.115 %, 0.1125 %, 0.11 %, 0.105 %, 0.1 %, 0.095 %, 0.09 %, 0.085 %, 0.08 %, or 0.075 %) . In some embodiments, the Rb1 is present in a range of about 0.01 %to about 0.15 %, about 0.025 to about 0.125 %, about 0.0375%to about 0.1125%, or about 0.075%by weight of the composition.

[0058] In some embodiments, the EGT is present at a weight percentage of at least 0.1 % (e.g., at least about any of 0.15 %, 0.2 %, 0.25 %, 0.275 %, 0.3 %, 0.325 %, 0.35 %, 0.375 %, 0.4%, 0.45 %, 0.5 %, 0.55 %, 0.6 %, 0.65 %, 0.7 %, or 0.75 %) , and the Rb1 is present at a weight percentage of at least 0.01 % (e.g., at least about any of 0.015 %, 0.02 %, 0.025 %, 0.0275 %, 0.03 %, 0.0325 %, 0.035 %, 0.0375 %, 0.04%, 0.045 %, 0.05 %, 0.055 %, 0.06 %, 0.065 %, 0.07 %, or 0.075 %) . In some embodiments, the EGT is present in a range of about 0.1 %to about 1.5%, about 0.25 %to about 1.25%, about 0.375%to about 1.125%, or about 0.75%by weight of the single composition and the Rb1 is present in a range of about 0.01 %to about 0.15 %, about 0.025 to about 0.125 %, about 0.0375%to about 0.1125%, or about 0.075%by weight of the composition.

[0059] In some embodiments, the EGT and Rb1 are present in a weight ratio of at least 1: 1 (e.g. at least about 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, or 10: 1) . In some embodiments, the EGT and Rb1 are present in a weight ratio of no more than 20: 1 (e.g., no more than about 19: 1, 18: 1, 17: 1, 16: 1, 15: 1, 14: 1, 13: 1, 12: 1, 11: 1, or 10: 1) . In some embodiments, the EGT  and Rb1 are present in a weight ratio of about 1: 1 to about 20: 1, about 5: 1 to about 15: 1, or about 10: 1. In some embodiments, the EGT and Rb1 are present in a molar ratio of at least 10: 1 (e.g. at least about 15: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, or 40: 1) . In some embodiments, the EGT and Rb1 are present in a molar ratio of no more than 100: 1 (e.g., no more than about 80: 1, 60: 1, 55: 1, 50: 1, 45: 1, 40: 1, or 35: 1) . In some embodiments, the EGT and Rb1 are present in a molar ratio of about 10: 1 to about 100: 1, about 20: 1 to about 60: 1, about 30: 1 to about 40: 1, or about 35: 1.

[0060] In some embodiments, the single composition (e.g. the composition for delaying reproductive aging in an individual) comprises EGT and Rb1, and further comprises a pharmaceutically acceptable excipient. In some embodiments, the pharmaceutically acceptable excipient can be determined based on the administration route. In some embodiments, the composition only contains EGT and Rb1 as active ingredients. In some embodiments, the composition comprises one or more additional active ingredient. In some embodiments, the composition consists of or consists essentially of EGT, Rb1, and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0061] In some embodiments, for instance, the single composition (e.g. the composition for delaying reproductive aging in an individual) is administered orally, and the composition can be in the form of (a) liquid solutions, such as an effective amount of EGT and Rb1 dissolved in diluents, such as water, saline, or orange juice, (b) capsules, sachets or tablets, each containing a predetermined amount of the EGT and Rb1, as solids or granules, (c) suspensions in an appropriate liquid, and (d) suitable emulsions. In some embodiments, the composition is in the form of tablets, and suitable pharmaceutically acceptable excipient may include, but are not limited to, lactose, mannitol, corn starch, potato starch, microcrystalline cellulose, acacia, gelatin, colloidal silicon dioxide, croscarmellose sodium, talc, magnesium stearate, stearic acid, and other excipients, colorants, diluents, buffering agents, moistening agents, preservatives, flavoring agents, and pharmacologically compatible excipients. Examples of suitable carriers, excipients, and diluents include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starches, gum acacia, calcium phosphate, alginates, tragacanth, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, saline solution, syrup, methylcellulose, talc, magnesium stearate, and mineral oil. The composition can additionally include lubricating agents, wetting agents, emulsifying and suspending agents, preserving agents, sweetening agents or flavoring agents.

[0062] In some embodiments, for another instance, the single composition (e.g. the composition for delaying reproductive aging in an individual) can be administered in aqueous or non-aqueous, optionally isotonic, and optionally sterile solutions or suspensions. In some embodiments, suitable pharmaceutically acceptable excipient may include, but are not limited to, anti-oxidants, buffers, bacteriostats, suspending agents, solubilizers, thickening agents, stabilizers, and preservatives. In some embodiments, the single composition (e.g. the composition for delaying reproductive aging in an individual) can be administered in aqueous solutions. In some embodiments, the single composition (e.g. the composition for delaying reproductive aging in an individual) further comprises water.

[0063] In some embodiments, the single composition (e.g. the composition for delaying reproductive aging in an individual) comprises about 0.1 wt. % to about 2 wt. % (e.g., about 0.5 wt. %to about 1.5 wt. %, or about 0.75 wt. %) of EGT, about 0.01 wt. % to about 0.2 wt. % (e.g., about 0.05 wt. %to about 0.15 wt. %, 0.075 wt. %) of Rb1, and about 98 wt. %to about 99.5 wt. % (e.g., about 99 wt. %) water. In some embodiments, the single composition may be further diluted or concentrated.

[0064] In some embodiments, the single composition (e.g. the composition for delaying reproductive aging in an individual) can be formulated to have a pH range of about 4.5 to about 9.0, including for example pH ranges of any of about 5.0 to about 8.0, about 6.5 to about 7.5, and about 6.5 to about 7.0. In some embodiments, the pH of the composition is formulated to no less than about 6, including for example no less than about any of 6.5, 7, or 8 (such as about 8) .

[0065] In some embodiments, the combination of administration of EGT and Rb1 produces supra-additive effect.

[0066] III. Modes of administration

[0067] In some embodiments, the method provided herein comprises administering to an individual in need thereof a therapeutically effective amount of EGT and a therapeutically effective amount of Rb1, wherein the EGT and Rb1 are administered simultaneously, either in the same composition or in separate compositions.

[0068] In some embodiments, the EGT and Rb1 are administered sequentially (i.e., EGT is administered either prior to or after the administration of the Rb1) . In some embodiments, the administration of EGT and Rb1 are concurrent, (i.e., the administration period of the EGT  and Rb1) overlap with each other. In some embodiments, the administration of EGT and Rb1 are non-concurrent. For example, in some embodiments, the administration of EGT is terminated before Rb1 is administered. In some embodiments, the administration of Rb1 is terminated before EGT is administered.

[0069] In some embodiments, the method provided herein comprises administering a therapeutically effective amount of EGT and a therapeutically effective amount of Rb1 in a single composition. In some embodiments, the method provided herein comprises administering EGT in a first composition and administering Rb1 in a second composition.

[0070] In some embodiments, the weight ratio of EGT administered in each administration of the first composition to Rb1 administered in each administration of the second composition is at least 1: 1 (e.g. at least about 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 6: 1, 7: 1, 8: 1, 9: 1, or 10: 1) . In some embodiments, the weight ratio of EGT administered in each administration of the first composition to Rb1 administered in each administration of the second composition is no more than 20: 1 (e.g., no more than about 19: 1, 18: 1, 17: 1, 16: 1, 15: 1, 14: 1, 13: 1, 12: 1, 11: 1, or 10: 1) . In some embodiments, the weight ratio of EGT administered in each administration of the first composition to Rb1 administered in each administration of the second composition is about 1: 1 to about 20: 1, about 5: 1 to about 15: 1, or about 10: 1. In some embodiments, the molar ratio of EGT administered in each administration of the first composition to Rb1 administered in each administration of the second composition is at least 10: 1 (e.g. at least about 15: 1, 20: 1, 25: 1, 30: 1, 35: 1, or 40: 1) . In some embodiments, the molar ratio of EGT administered in each administration of the first composition to Rb1 administered in each administration of the second composition is no more than 100: 1 (e.g., no more than about 80: 1, 60: 1, 55: 1, 50: 1, 45: 1, 40: 1, or 35: 1) . In some embodiments, the molar ratio of EGT administered in each administration of the first composition to Rb1 administered in each administration of the second composition is about 10: 1 to about 100: 1, about 20: 1 to about 60: 1, about 30: 1 to about 40: 1, or about 35: 1.

[0071] In some embodiments, the method comprises administering EGT in a first composition, wherein the first composition further comprises a pharmaceutically acceptable excipient. In some embodiments, the method comprises administering Rb1 in a second composition, wherein the second composition further comprises a pharmaceutically acceptable excipient. In some embodiments, the pharmaceutically acceptable excipient of the first and second composition is independently selected from any pharmaceutically acceptable excipients described herein. In some embodiments, the pharmaceutically acceptable excipient  of the first and second composition is the same. In some embodiments, the pharmaceutically acceptable excipient of the first and second composition is different. In some embodiments, the first composition comprises water. In some embodiments, the second composition comprises water. In some embodiments, the first composition and the second composition are contained in a single package. In some embodiments, the first composition and the second composition are provided in separate packages.

[0072] In some embodiments, the therapeutically effective dose and dosing regimen of EGT, Rb1, or any composition comprising EGT and / or Rb1 may be varied depending upon the subject and disease condition being treated, the weight and age of the subject, the severity of the disease condition, the manner of administration and the like, which can readily be determined by one of ordinary skill in the art. For example, in some embodiments, the therapeutically effective dose of the pharmaceutical compositions described herein can be determined by measuring the concentration of EGT and Rb1 in whole blood or plasma of young and normal groups, and aged females, and calculating the dose based on the concentration. The level of EGT and / or Rb1 in whole blood or plasma of aged females can be determined periodically before or after the administration of the compositions. Further, in some embodiments, hormones levels indicating follicles development, such as serum levels of P4, E2, FSH, LH and AMH in the serum can be monitored to determine the therapeutically effective dose. In some embodiments, visualization of the number of antral follicles in aged women via B-scan may also be used to determine the therapeutically effective dose.

[0073] In some embodiments, EGT, Rb1, or any composition comprising EGT and / or Rb1 may be administered in a form suitable for oral use, such as a tablet, capsule (e.g., in the form of delayed release, extended release, sustained release, enteric coated release) ; hard gelatin capsules, soft gelatin capsules in an oily vehicle for sublingual use; effervescent tablets; aqueous or oily solution; suspension or emulsion; bead; nanoparticles; caplet; granule; agglomerate; chewable tablet; lozenge; troche; rapidly dissolving film; or gel. In some embodiments, EGT, Rb1, or any composition comprising EGT and / or Rb1 may be administered in a form suitable for topical use including transmucosal and transdermal use, such as a cream, ointment, gel, aqueous or oil solution or suspension, salve, parch or plaster. In some embodiments, EGT, Rb1, or any composition comprising EGT and / or Rb1 may be administered in a form suitable for nasal use, such as a snuff nasal spray or nasal drops. In some embodiments, EGT, Rb1, or any composition comprising EGT and / or Rb1 may be administered in a form suitable for vaginal or rectal use, such as a suppository. In some  embodiments, EGT, Rb1, or any composition comprising EGT and / or Rb1 may be administered by inhalation, such as in a form of a finely divided powder or a liquid aerosol. In some embodiments, EGT, Rb1, or any composition comprising EGT and / or Rb1 may be administered in a form suitable for sub-lingual or buccal use, such as a tablet or capsule or film. In some embodiments, EGT, Rb1, or any composition comprising EGT and / or Rb1 may be administered in a form suitable for parenteral use including intravenous, subcutaneous, intramuscular, intravascular, infusion, intraperitoneal, intracerebral, intracerebroventricular, or intradermal.

[0074] IV. Kits

[0075] The invention also provides kits for use in the instant methods. Kits of the invention include one or more containers comprising EGT and / or Rb1, and in some embodiments, further comprise instructions for use in accordance with any of the methods described herein. The kit may further comprise a description of a selection of an individual suitable or treatment. Instructions supplied in the kits of the invention are typically written instructions on a label or package insert (e.g., a paper sheet included in the kit) , but machine-readable instructions (e.g., instructions carried on a magnetic or optical storage disk) are also acceptable. In some embodiments, the kit comprises a) an effective amount of EGT; b) an effective amount of Rb1; and c) instructions for administering the EGT and Rb1 simultaneously and / or sequentially, for the treatment of a disease associated with reproductive aging. In some embodiments, the EGT and the Rb1 can be present in separate containers or in a single container. It is understood that the kit may comprise one distinct composition or two or more compositions wherein one composition comprises EGT and one composition comprises Rb1. The kits of the invention are in suitable packaging. Suitable packaging include, but is not limited to, vials, bottles, jars, flexible packaging (e.g., sealed Mylar or plastic bags) , and the like. The instructions relating to the use of the nanoparticle compositions generally include information as to dosage, dosing schedule, and route of administration for the intended treatment. The containers may be unit doses, bulk packages (e.g., multi-dose packages) or sub-unit doses. Those skilled in the art will recognize that several variations are possible within the scope and spirit of this invention.

[0076] EXAMPLES

[0077] Example 1. Delay of Reproductive Aging in Mice

[0078] To verify the positive roles of EGT and Rb1 composition in delaying female reproductive aging, mice aged 8 months were fed drinking an aqueous solution containing EGT and / or Rb1 for 1 month, while the mice in the control group were not. The aqueous solution comprised 0.75 % (w / w) EGT, 0.075 % (w / w) Rb1, or 0.75 % (w / w) EGT and 0.075 % (w / w) Rb1. The results are summarized in FIGS. 1A-1C, 2A, 2B, 3A-3C, and 4A-4D.

[0079] The change in body weight of mice before and after treatment was tracked and monitored. As shown in FIG. 1A and FIG. 1B, the average body weight did not change between mice drinking water with or without drugs indicating that drinking water with EGT and / or Rb1 has no significant side effects on mice. During feeding, the estrous cycle of mice was detected by using vaginal smear to analyze the effect of the drugs on the ovaries of mice. As shown in FIG. 1C, EGT, Rb1, and EGT + Rb1 combination therapy all decreased the average days per estrus cycle in tested mice. Surprisingly, a greater decrease was observed after treatment with EGT + Rb1 combination therapy, suggesting a synergistic effect of EGT + Rb1 combination therapy in regulating the ovarian development in aged mice.

[0080] To determine the function of EGT and Rb1 in delaying reproductive aging, we detected the fertility of these four groups (Control, Rb1, EGT, EGT with Rb1) after feeding drinking water for 1 month. By mating aged female mice with adult healthy male mice in the ratio of 2: 1 for 1 month, we recorded the number of aged female mice with live births and the number of pups. The results are summarized in FIG. 2A and FIG. 2B. As shown in FIG. 2A, Rb1 increases the number of aged female mice with live births but there was no significant difference, while the Rb1 significantly increases the number of pups per female compared to the female in the control group. Furthermore, both EGT and the composition of EGT and Rb1 significantly increase the number of aged female mice with live births and the average numbers of pups per females. A synergistic effect was also observed for EGT + Rb1 combination therapy in delaying female reproductive aging.

[0081] To analyze the mechanism of EGT and Rb1 in delaying female reproductive aging, we further collected the ovaries from different groups (Control, Rb1, EGT, EGT with Rb1) after feeding drinking water for 1 month. The bodies and the ovaries of the tested mice were weighed. Statistical analysis is summarized in FIG. 3A, FIG. 3B, and FIG. 3C. As shown in FIG. 3A, FIG. 3B, and FIG. 3C, although Rb1 did not increase the ovarian weight,  EGT and the composition of EGT and Rb1 dramatically increased the ovarian weight of the mice. The ratio of the ovary to body weight also showed a similar trend. These results showed that EGT and / or Rb1 might increase the fertility of aged mice by promoting ovarian development.

[0082] To validate this mechanism, we further analyzed the histological of the ovaries. After slicing the ovaries into 8 μm per section and staining them with hematoxylin, we then checked and pictured them with a microscope. The follicle counting results are summarized in FIG. 4A to FIG. 4D, which showed that EGT and / or Rb1 significantly increase the number of total follicles in tested mice. As shown in FIG. 4A, EGT, Rb1, or EGT + Rb1 combination therapy all increased the numbers of follicles in tested mice compared to control. As shown in FIG. 4B, EGT, Rb1, or EGT + Rb1 combination therapy all increased the number of total follicles per ovary in tested mice compared to the control, with a synergistic effect observed for EGT + Rb1 combination therapy. As shown in FIG. 4C, EGT, Rb1, or EGT + Rb1 combination therapy all increased the number of primordial follicles per ovary in tested mice compared to the control, with a synergistic effect observed for EGT + Rb1 combination therapy. As shown in FIG. 4D, EGT, Rb1, or EGT + Rb1 combination therapy all increased the number of growing follicles per ovary in tested mice compared to the control, with a synergistic effect observed for EGT + Rb1 combination therapy. These results indicated that EGT and / or Rb1 may be delaying female reproductive aging through rescuing the number of follicles in mice.

[0083] These results collectively demonstrated that EGT + Rb1 combination therapy significantly delayed reproductive aging in mice and ameliorated the symptoms associated with reproductive aging. Furthermore, stronger potency and efficacy were observed when EGT was combined with Rb1 compared to EGT or Rb1 alone.

Claims

1.A method of delaying reproductive aging in an individual, comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of L-ergothioneine (EGT) .2.A method of treating age-related ovarian dysfunction in an individual, comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of L-ergothioneine (EGT) .3.A method of treating oxidative stress-induced ovarian granulosa cell injury in an individual, comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of L-ergothioneine (EGT) .4.A method of treating infertility in an individual, comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of L-ergothioneine (EGT) .5.The method of any one of claims 1-4, further comprising administering to the individual a therapeutically effective amount of ginsenoside Rb1 (Rb1) .6.The method of claim 5, wherein the EGT and the Rb1 are administered in a single composition.7.The method of claim 6, wherein the EGT is present in a range of 0.375%to 1.125%by weight of the single composition.8.The method of claims 6 or 7, wherein the EGT is present in a weight percentage of 0.75%of the single composition.9.The method of any one of claims 6-8, wherein the Rb1 is present in a range of 0.0375%to 0.1125%by weight of the single composition.10.The method of any one of claims 6-9, wherein the Rb1 is present in a weight percentage of 0.075%of the single composition.11.The method of any one of claims 6-10, wherein the EGT and Rb1 are present in the single composition in a weight ratio of about 1: 1 to about 20: 1.12.The method of any one of claims 6-11, wherein the EGT and Rb1 are present in the single composition in a weight ratio of about 10: 1.13.The method of any one of claims 6-12, wherein the single composition further comprises a pharmaceutically acceptable excipient.14.The method of any one of claims 1-13, wherein the single composition further comprises water.15.The method of claim 5, wherein the EGT is administered in a first composition and the Rb1 is administered in a second composition.16.The method of claim 15, wherein the weight ratio of EGT administered in each administration of the first composition to Rb1 administered in each administration of the second composition is about 1: 1 to about 20: 1.17.The method of claims 15 or 16, wherein the weight ratio of EGT administered in each administration of the first composition to Rb1 administered in each administration of the second composition is about 10: 1.18.The method of any one of claims 5-17, wherein the EGT and Rb1 are administered simultaneously.19.The method of any one of claims 5 or 15-17, wherein the EGT and Rb1 are administered sequentially.20.The method of any one of claims 1-19, wherein the EGT is administered orally.21.The method of any one of claims 5-20, wherein the Rb1 is administered orally.22.A composition for delaying reproductive aging in an individual, comprising EGT and Rb1.23.The composition of claim 22, wherein the EGT and Rb1 are present in a weight ratio of about 1: 1 to about 20: 1.24.The composition of claims 22 or 23, wherein the EGT and Rb1 are present in a weight ratio of about 10: 1.25.The composition of any one of claims 22-24, wherein the EGT is present in a range of 0.375%to 1.125%by weight of the composition.26.The composition of any one of claims 22-25, wherein the EGT is present in a weight percentage of 0.75%of the composition.27.The composition of any one of claims 22-26, wherein the Rb1 is present in a range of 0.0375%to 0.1125%by weight of the composition.28.The composition of any one of claims 22-27, wherein the Rb1 is present in a weight percentage of 0.075 %of the composition.29.The composition of any one of claims 22-28, further comprising a pharmaceutically acceptable excipient.30.The composition of any one of claims 22-29, further comprising water.

Images