An engineered cell

Abstract

Provided is a cell comprising a protein complex, a single chain peptide fragment, and a protein scaffold, wherein the protein complex comprises an α chain and a β chain, the single chain peptide fragment can specifically bind to the given structural region formed by the α chain and the β chain of the protein complex, thereby forming a peptide / αβ complex trimer comprising the single chain peptide fragment, the α chain and the β chain, the protein scaffold binds to the shared binding surface of the trimer by specifically recognizing the peptide / αβ complex trimer and forms a multimer of protein scaffold / peptide / αβ complex. Wherein the shared binding surface of the trimer is the surface where the single chain peptide fragment binds to the α chain and the β chain of the protein complex.

Description

AN ENGINEERED CELLTECHNICAL FIELD

[0001] The application relates to cell surface display technology, particularly to the display of human MHC and its antigen peptide specific immune receptors or receptor analogues on the surface of yeast cells.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Characterizing antigen peptide fragments (hereinafter referred to as “neoantigens” ) presented by major histocompatibility complexes (MHCs) , identifying neoantigen-specific T cell receptors (TCRs) , and developing TCR mimics have shed light on the future direction of medical development and pharmaceutical industry, particularly when battling against solid tumors. These neoantigens are derived from intracellular protein molecules and often have high specificity in relevance to target cells or microorganisms (such as tumor cells, autoimmune cells, viruses, etc. ) . Therefore, targeting neoantigens is not only key to the development of personalized precision medicine against cancer, but also emerging as innovative solutions for managing autoimmune and infectious diseases. At present, drug candidates with TCR-like features (i.e., recognition of neoantigens) , include recombinant TCR protein themselves, TCR-like monoclonal antibodies (hereinafter referred to as “TCRL Ab” ) , and other protein scaffolds with special quaternary structures that mimic TCR conformation or function (hereinafter collectively referred to as “TCRL” or “TCR-like proteins” ) .

[0003] TCR, as a natural membrane protein that can specifically recognize peptide / MHC trimers (pMHCs) , plays an important role in the primary signaling pathway of T cell-mediated immunity. However, TCR proteins, especially their ectodomains that are recombinantly engineered and produced, have poor thermal stability and low pMHC-binding affinity, with equilibrium dissociation constants (kd) at the micromolar scale. As cell membrane receptors, TCR complexes with low affinity can temporarily associate with antigenic pMHC via oligomerization and stimulate T cell activation signals. However, engineering TCR ectodomains and thus developing corresponding neoantigen-targeting drugs remain challenging, as low stability and pMHC-binding affinity limit the application of soluble TCRs and their derivatives in the development of therapeutics.

[0004] Unlike TCRs, TCRL Abs have high thermal stability and high pMHC-binding affinity (Kd in the range of nanomolar to picomolar) . However, designing and screening TCRL Abs is  comprehensive, as naturally occurring Abs do not possess the TCR-like feature, in terms of structurally distinguishing the subtle differences in peptides accommodated within the antigen binding groove of an MHC molecule. In addition to common receptor proteins that recognize antigens such as TCR and Ab, other protein scaffolds capable of binding pMHCs are available for further modification and optimization. However, current strategies and platforms for TCRL development are still in the exploratory and initial stage.

[0005] Here, the bottleneck in developing therapeutic candidates using TCR, TCRL or their derivatives lies in: 1) identifying the subtle differences between neoantigens in the context of pHLA (peptide in complex with human MHC) derived from mutated protein products (i.e., cancer driver genes or mutation-associated neoantigen, MANA) and other antigenic peptides in the context of pHLA, whereas these other peptides may be derived from the corresponding wild-type (WT) protein or other protein products; 2) affinity maturation and screening of the TCR / TCRL protein receptor that can identify these subtle differences, and then performing functional validation to guide downstream drug development and production.SUMMARY OF THE INVENTION

[0006] The application provides engineered cells that display both the TCRL protein scaffold and the trimer composed of major histocompatibility complexes and antigenic peptides, nucleic acids that encode the TCRL protein scaffold and the trimer, and the use and preparation method of the engineered cells. These engineered cells can be used for efficient preparation of preferred TCRL, such as antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors, Darpin, or conjugates comprising any of the above structures.

[0007] Specifically, the application relates to the following content:

[0008] 1. A cell comprising a protein complex, a single chain peptide fragment, and a protein scaffold, wherein the protein complex comprises an α chain and a β chain,

[0009] the single chain peptide fragment can specifically bind to a given structural region formed by the α chain and the β chain of the protein complex, thereby forming a peptide / αβ complex trimer comprising the single chain peptide fragment, the α chain and the β chain,

[0010] the protein scaffold associates with the peptide / αβ complex trimer by specifically recognizing a shared binding surface of the trimer, thereby constituting a multimer of protein scaffold / peptide / αβcomplex,

[0011] wherein the shared binding surface of the trimer is a surface where the single chain peptide fragment binds to the α chain and the β chain of the protein complex.

[0012] 2. The cell according to item 1, wherein

[0013] the single chain peptide fragment is covalently bound to the α chain or the β chain, preferably, the protein scaffold is non-covalently bound to the shared binding surface.

[0014] 3. The cell according to item 1 or 2, wherein,

[0015] the α chain is covalently bound to the β chain;

[0016] preferably, the protein scaffold is selected from the group consisting of antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors, Darpin, or conjugates comprising any of the above structures;

[0017] further preferably, the antibody or antigen binding fragment is an antibody fragment, more preferably an antibody fragment lacking at least the Fc domain; particularly the fragment is or comprises (Fab') 2 fragment, Fab' fragment or Fab fragment, VhH fragment, scFv fragment, scFv Fc fragment, or micro antibody, more particularly Fab fragment.

[0018] 4. The cell according to any one of items 1-3, wherein the cell is a yeast cell.

[0019] 5. The cell according to item 1, wherein the protein scaffold and a molecule on the surface of the cell are covalently fused and attached to the surface of the cell.

[0020] 6. The cell according to item 5, wherein the peptide / αβ complex trimer attaches to the molecule on the cell surface by non-covalently binding to the protein scaffold.

[0021] 7. The cell according to item 5 or 6, wherein the molecule is a protein.

[0022] 8. The cell according to item 7, wherein the protein is endogenous to the cell.

[0023] 9. The cell according to item 8, wherein the protein is selected from Aga2p, a-lectin, α-lectin, flocculant, Cwp1p, Cwp2p, or Tip1p.

[0024] 10. The cell according to item 9, wherein the protein is Aga2p.

[0025] 11. The cell according to item 9, wherein the amino acid sequence of the Aga2p is represented by SEQ ID NO: 1.

[0026] 12. The cell according to item 1, wherein the single chain peptide fragment is an MHC epitope peptide, preferably a tumor related or specific antigen peptide fragment, more preferably a peptide fragment of 5-100 amino acids in length, preferably a peptide fragment of 7-50 amino acids in length, and further preferably a peptide fragment of 8-30 amino acids in length.

[0027] 13. The cell according to item 12, wherein the amino acid sequence of the single chain peptide fragment is as shown in any one of SEQ ID NOs: 2-6.

[0028] 14. The cell according to item 1, wherein the α chain and the β chain are separate chains or domains of MHC class I molecules or MHC class II molecules, preferably the α chain and the βchain are separate chains or domains of HLA class I molecules or HLA class II molecules.

[0029] 15. The cell according to item 14, wherein,

[0030] the α chain is encoded by HLA-A*02 or other alleles of family HLA-A, and the β chain is encoded by B2M gene; or

[0031] the α chain is encoded by HLA-B*07 or other alleles of family HLA-B, and the β chain is encoded by B2M gene; or

[0032] the α chain is encoded by HLA-C*01 or other alleles of family HLA-C, and the β chain is encoded by B2M gene; or

[0033] the α chain is encoded by HLA-DRA*01 or other alleles of family HLA-DRA, and the β chain is encoded by HLA-DRB1*01 or other alleles of family HLA-DRB; or

[0034] the α chain is encoded by HLA-DQA1*01 or other alleles of family HLA-DQA1, and the βchain is encoded by HLA-DQB1*06 or other alleles of family HLA-DQB1; or

[0035] the α chain is encoded by HLA-DPA1*01: 03 or other alleles of family HLA-DPA1, and the βchain is encoded by HLA-DPB1*04: 01 or other alleles of family HLA-DPB1.

[0036] 16. A nucleic acid encoding a peptide / αβ complex trimer, wherein the peptide / αβ complex trimer comprises a protein complex and a single chain peptide fragment, and the protein complex comprises an α chain and a β chain,

[0037] and the single chain peptide fragment can specifically bind to a given structural region formed by the α chain and the β chain of the protein complex, thereby forming a peptide / αβ complex trimer comprising the single chain peptide fragment, the α chain and the β chain.

[0038] 17. The nucleic acid according to item 16, wherein the peptide / αβ complex trimer encoded by the nucleic acid is the peptide / αβ complex trimer involved in any one of items 1-15.

[0039] 18. A nucleic acid encoding a protein scaffold, wherein the protein scaffold is selected from the group consisting of antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors, Darpin, or conjugates comprising any of the above structures;

[0040] preferably, the antibody or antigen binding fragment is an antibody fragment, more preferably an antibody fragment lacking at least the Fc domain, particularly the fragment is or comprises (Fab') 2 fragment, Fab' fragment or Fab fragment, VhH fragment, scFv fragment, scFv Fc fragment, or micro antibody, more particularly Fab fragment,

[0041] and the protein scaffold can specifically bind to the peptide / αβ complex trimer encoded by the nucleic acid according to item 16 or 17 on a shared binding surface of the trimer, thereby forming a multimer of protein scaffold / peptide / αβ complex.

[0042] 19. A nucleic acid combination comprising:

[0043] a nucleic acid encoding a peptide / αβ complex trimer; and

[0044] a nucleic acid encoding a protein scaffold, wherein,

[0045] the peptide / αβ complex trimer comprises a protein complex and a single chain peptide fragment, the protein complex comprises an α chain and a β chain, and the single chain peptide fragment can specifically bind to the given structural region formed by the α chain and the β chain of the protein complex, thereby forming a peptide / αβ complex trimer comprising the single chain peptide fragment, the α chain and the β chain;

[0046] and the protein scaffold can specifically bind to the peptide / αβ complex trimer on a shared binding surface of the trimer, thereby forming a multimer of protein scaffold / peptide / αβ complex.

[0047] 20. The nucleic acid combination according to item 19, wherein,

[0048] the peptide / αβ complex trimer encoded is the peptide / αβ complex trimer involved in any one of items 1-15; or

[0049] the protein scaffold is selected from the group consisting of antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors, Darpin, or conjugates comprising any of the above structures;

[0050] preferably, the antibody or antigen binding fragment is an antibody fragment, more preferably an antibody fragment lacking at least the Fc domain, particularly the fragment is or comprises (Fab') 2  fragment, Fab' fragment or Fab fragment, VhH fragment, scFv fragment, scFv Fc fragment, or micro antibody, more particularly Fab fragment.

[0051] 21. A method for preparing a peptide / αβ complex trimer, comprising:

[0052] transforming cells by using the nucleic acid according to item 16 or 17, or the nucleic acid combination according to item 19 or 20;

[0053] and culturing the cells under the condition that is optimized for of expressing the peptide / αβcomplex trimer involved in any one of items 1-15.

[0054] 22. A method for preparing a protein scaffold, comprising:

[0055] transforming cells by using the nucleic acid according to item 18, or the nucleic acid combination according to item 19 or 20,

[0056] and culturing the cells under the condition that is optimized for expressing the protein scaffold involved in any one of items 1-15.

[0057] 23. The method according to item 21 or 22, wherein the cell is a yeast cell.

[0058] 24. A method for characterizing and determining a protein scaffold binding to a peptide / αβcomplex trimer, comprising:

[0059] i) enabling the cell according to any one of items 1-15 to display a protein scaffold library,

[0060] and ii) characterizing the peptide / αβ complex trimer on the surface of single clones in a cell library displaying protein scaffold variants, thereby determining the protein scaffold binding to a peptide / αβ complex trimer.

[0061] 25. The method according to item 24, wherein the protein scaffold is selected from the group consisting of antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors, Darpin, or conjugates comprising any of the above structures.

[0062] 26. The method according to item 24 or 25, wherein the protein scaffold is non-covalently bound to the peptide / αβ complex trimer.

[0063] 27. A method for screening and identifying a potential target protein scaffold, comprising:

[0064] i) enabling the cell according to any one of items 1-15 to display a potential target protein scaffold library,

[0065] and ii) detecting the peptide / αβ complex trimer on the surface of single clones in a cell library displaying protein scaffold variants, thereby screening and identifying the protein scaffold binding to a peptide / αβ complex trimer.

[0066] 28. The method according to item 27, wherein the target protein scaffold is a drug molecule or functional biomolecule, preferably, the drug molecule or functional biomolecule is selected from the group consisting of antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors, Darpin, or conjugates comprising any of the above structures.

[0067] 29. The method according to item 27 or 28, wherein the protein scaffold is non-covalently bound to the peptide / αβ complex trimer.

[0068] 30. Use of the cell according to any one of items 1-15 for characterizing, determinging, screening, or identifying drug molecules or functional biomolecules.

[0069] Invention effects

[0070] The application provides an innovative strategy for screening and identifying large molecule biologics targeting neoantigens. Using the only available eukaryotic single-cell protein expression and surface display system, the yeast display system, a key milestone for the first time has been achieved, whereby the yeast-derived engineered cells described in the application is capable of simultaneously expressing multimeric protein complexes that are comprehensive, human-derived, and polymorphic (including neoantigens and neoantigen-specific TCRL) . Among them, the neoantigens specifically refer to antigenic peptides that bind to major histocompatibility complexes (MHCs) , especially antigenic peptide fragments carrying mutated amino acid residues or at a high risk of mutagenesis. Through the construction of exquisite plasmid vectors and cell transformation, this antigenic pMHC complex can be selectively displayed on the surface of yeast or secreted by yeast in a soluble form. More importantly, when yeast secreting neoantigens simultaneously expresses and displays TCRL non-covalent heterodimers that specifically recognize neoantigens, flow cytometric fluorescence signals related to neoantigens can be detected definitively on the cell surface.

[0071] These engineered cells that display both TCRL and neoantigens binding to TCRL can be used for efficient preparation of preferred TCRL, such as antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors, Darpin, or conjugates comprising any of the above structures. Site-directed gene editing of the nucleic acid encoding the TCRL can drive a rapid construction of a parental library of TCRL variants. Since each yeast cell in the parental library  displays a TCRL variant while secreting a neoantigen, yeast cells that can simultaneously display the TCRL and the neoantigen can be screened and isolated for further development of biologics targeting the neoantigen. The preparation process of the engineered cell of the application is simple and straightforward, substantially lowering the time and labor cost used to be heavily spent on the synthesis of complex human proteins such as neoantigens and TCRLs. As a single-cell organism, yeast exhibit advantages, such as easy cloning, high protein yield, and rapid cell growth, the TCRL screening strategy established on top of this novel platform where yeast co-expresses and co-displays TCRL and neoantigens (at least one month) will expedite the research and development by more than one order of magnitude as compared to other TCRL screening methods (>10 months) . In addition, as a eukaryotic cell, yeast has similar biophysical characteristics to other advanced multicellular organisms. Meanwhile, yeast cells are large enough for high throughput analysis and optimization through flow cytometry. Therefore, various interaction parameters between TCRL and neoantigens expressed and displayed on yeast can be directly analyzed qualitatively and quantitatively on the yeast surface through flow cytometry, thereby significantly reducing the turnaround time and cost of the following research and development (expected to decrease by 3-5 times, respectively) .BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0072] Figure 1: Illustration of the DOMAINN system in the application. The pMHC specific receptor fused to Aga2p-HA can be immunofluorescently labeled by receptor specific antibodies, and the abundance of displayed molecules can be determined by flow cytometric analysis. The single chain peptide fragment / MHC extracellular domain (pMHC) is expressed under the guidance of an independent vector and linked to a V5 epitope tag for immunofluorescent labeling and flow cytometric identification. After protein translation and expression, the pMHC specific receptor protein (dimer shown in the diagram) (i.e., protein scaffold) can be fused and anchored on the cell surface through a-agglutinin protein (composed of Aga1p and Aga2p subunits) secreted and assembled by yeast. The pMHC trimer can be anchored on the cell surface through non-covalent binding to specific receptors, thereby achieving the co-display of receptors and pMHC multimeric complexes on the yeast surface for efficiently quantitative analysis by flow cytometry. GPI: glycosylphosphatidylinositol.

[0073] Figure 2: the parental EBY100 yeast strain is subjected to indirect anti-human β2m (left) or anti-V5 label (right) monoclonal antibody immunofluorescent labeling for flow cytometry  experiment. The result of flow cytometry is presented by Histogram: the horizontal axis represents the fluorescence intensity coupled with β2m (left) or V5 (right) specific antibody on the cell surface (Alexa Fluor 647 detection channel FL4) , and the vertical axis represents the number of yeast cells with different fluorescence intensities on the surface.

[0074] Figure 3: the first type of daughter yeast strain that successfully receives transformation of the vector for yeast displaying IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 single chain trimer is subjected to indirect anti-human β2m (left) or anti-V5 label (right) monoclonal antibody immunofluorescent labeling for flow cytometry experiment. The result of flow cytometry is presented by Histogram: the horizontal axis represents the fluorescence intensity coupled with β2m (left) or V5 (right) specific antibody on the cell surface (Alexa Fluor 647 detection channel FL4) , and the vertical axis represents the number of yeast cells with different fluorescence intensities on the surface.

[0075] Figure 4: the second type of daughter yeast strain that successfully receives transformation of the vector for yeast secreting IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 is subjected to indirect anti-human β2m (left) or anti-V5 label (right) monoclonal antibody immunofluorescent labeling for flow cytometry experiment. The result of flow cytometry is presented by Histogram: the horizontal axis represents the fluorescence intensity coupled with β2m (left) or V5 (right) specific antibody on the cell surface (Alexa Fluor 647 detection channel FL4) , and the vertical axis represents the number of yeast cells with different fluorescence intensities on the surface.

[0076] Figure 5: the granddaughter yeast strain that successfully receives transformation of the vector for yeast secreting IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 and the shuttle vector for yeast displaying 2Q1 TCRL Fab dimer is subjected to indirect anti-human β2m (left) or anti-V5 label (right) monoclonal antibody immunofluorescent labeling for flow cytometry experiment. The result of flow cytometry is presented by Histogram: the horizontal axis represents the fluorescence intensity coupled with β2m (left) or V5 (right) specific antibody on the cell surface (Alexa Fluor 647 detection channel FL4) , and the vertical axis represents the number of yeast cells with different fluorescence intensities on the surface.

[0077] Figure 6: the third type of daughter yeast strain that successfully receives transformation of the shuttle vector for yeast displaying 2Q1 TCRL Fab is subjected to indirect anti-human β2m (left) or anti-V5 label (right) monoclonal antibody immunofluorescent labeling for flow cytometry experiment. The result of flow cytometry is presented by Histogram: the horizontal axis represents the fluorescence intensity coupled with β2m (left) or V5 (right) specific antibody on the cell surface  (Alexa Fluor 647 detection channel FL4) , and the vertical axis represents the number of yeast cells with different fluorescence intensities on the surface.

[0078] Figure 7: the first type of daughter yeast strain that successfully receives transformation of the vector for yeast displaying MART1 / HLA-A*02: 01 single chain trimer is subjected to indirect anti-human β2m (left) or anti-V5 label (right) monoclonal antibody immunofluorescent labeling for flow cytometry experiment. The result of flow cytometry is presented by Histogram: the horizontal axis represents the fluorescence intensity coupled with β2m (left) or V5 (right) specific antibody on the cell surface (Alexa Fluor 647 detection channel FL4) , and the vertical axis represents the number of yeast cells with different fluorescence intensities on the surface.

[0079] Figure 8: the second type of daughter yeast strain that successfully receives transformation of the vector for yeast secreting MART1 / HLA-A*02: 01 single chain trimer is subjected to indirect anti-human β2m (left) or anti-V5 label (right) monoclonal antibody immunofluorescent labeling for flow cytometry experiment. The result of flow cytometry is presented by Histogram: the horizontal axis represents the fluorescence intensity coupled with β2m (left) or V5 (right) specific antibody on the cell surface (Alexa Fluor 647 detection channel FL4) , and the vertical axis represents the number of yeast cells with different fluorescence intensities on the surface.

[0080] Figure 9: the third type of daughter yeast strain that successfully receives transformation of the shuttle vector for yeast displaying MA2 TCRL Fab dimer is subjected to indirect anti-human β2m (left) or anti-V5 label (right) monoclonal antibody immunofluorescent labeling for flow cytometry experiment. The result of flow cytometry is presented by Histogram: the horizontal axis represents the fluorescence intensity coupled with β2m (left) or V5 (right) specific antibody on the cell surface (Alexa Fluor 647 detection channel FL4) , and the vertical axis represents the number of yeast cells with different fluorescence intensities on the surface.

[0081] Figure 10: the granddaughter yeast strain that successfully receives transformation of the vector for yeast secreting MART1 / HLA-A*02: 01 and the shuttle vector for yeast displaying MA2 TCRL Fab dimer is subjected to indirect anti-human β2m (left) or anti-V5 label (right) monoclonal antibody immunofluorescent labeling for flow cytometry experiment. The result of flow cytometry is presented by Histogram: the horizontal axis represents the fluorescence intensity coupled with β2m (left) or V5 (right) specific antibody on the cell surface (Alexa Fluor 647 detection channel FL4) , and the vertical axis represents the number of yeast cells with different fluorescence intensities on the surface.

[0082] Figure 11: after the exchange of HLA heavy and light chain gene cassettes, the first type of daughter yeast strain that successfully receives transformation of the vector for yeast displaying IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 single chain trimer (left) or MART1 / HLA-A*02: 01 single chain trimer (right) is subjected to indirect anti-human β2m monoclonal antibody immunofluorescent labeling for flow cytometry experiment. The result of flow cytometry is presented by Histogram: the horizontal axis represents the fluorescence intensity coupled with β2m specific antibody on the cell surface (Alexa Fluor 647 detection channel FL4) , and the vertical axis represents the number of yeast cells with different fluorescence intensities on the surface.

[0083] Figure 12: after the exchange of HLA heavy and light chain gene cassettes, the second type of daughter yeast strain that successfully receives transformation of the vector for yeast secreting IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 single chain trimer (left) of MART1 / HLA-A*02: 01 single chain trimer (right) is subjected to indirect anti-human β2m monoclonal antibody immunofluorescent labeling for flow cytometry experiment. The result of flow cytometry is presented by Histogram: the horizontal axis represents the fluorescence intensity coupled with β2m specific antibody on the cell surface (Alexa Fluor 647 detection channel FL4) , and the vertical axis represents the number of yeast cells with different fluorescence intensities on the surface.

[0084] Figure 13: after the exchange of HLA heavy and light chain gene cassettes, the granddaughter yeast strain that successfully receives transformation of the vector for yeast secreting IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 and the shuttle vector for yeast displaying 2Q1 TCRL Fab dimer (left) , and the granddaughter yeast strain that successfully receives transformation of the vector for yeast secreting MART1 / HLA-A*02: 01 and the shuttle vector for yeast displaying MA2 TCRL Fab dimer (right) are subjected to indirect anti-human β2m monoclonal antibody immunofluorescent labeling for flow cytometry experiment. The result of flow cytometry is presented by Histogram: the horizontal axis represents the fluorescence intensity coupled with β2m specific antibody on the cell surface (Alexa Fluor 647 detection channel FL4) , and the vertical axis represents the number of yeast cells with different fluorescence intensities on the surface.

[0085] DETAIL DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0086] The method of the application relies on yeast, a eukaryotic single-cell system, which simultaneously expresses two sets of protein multimeric complexes: pMHC and a protein scaffold that recognizes pMHC. It not only efficient screens and identifies MHC binding peptides, but also  effectively charaterizes the interaction between the protein scaffold and neoantigens in the context of pMHC, thereby identifying novel neoantigen receptors based on this. The inventor has named the “dual operational system for simultaneous characterization and development of drugs and their targeting neoantigens” developed in the application as Dual Operational system for MHC / peptide-specific scaffold AIming at NeoantigeN (DOMAINN) .

[0087] This system is different from any previous yeast expression or yeast display system. Other systems either only express or display single chain peptide fragments, or only express or display MHC proteins including covalent or non-covalent linked MHCα / β dimeric complex, or expresses or displays various pMHC trimers while requiring the additional synthesis of protein scaffolds that recognize pMHC, or expresses or displays various protein scaffolds that recognize pMHC (including TCR / TCRL) while requiring the additional synthesis of pMHC trimers. The DOMAINN system of the application can achieve simultaneous expression of pMHC trimer and specific binding protein scaffold, and the key is that all protein domains come from a single yeast cell and are displayed on the surface of this cell through interaction. The DOMAINN system of the application avoids inefficient labor-intensive steps such as additional purification of peptides, pMHC, or proteins that can recognize pMHC.

[0088] Avoiding the protein purification and preparation process, the novel DOMAINN system uses a yeast cell to simultaneously express and co-display two sets of multimeric protein complexes, largely reducing time and expenses in the identification of neoantigen pMHC complexes. More importantly, co-display will substantially shorten the time and lower the costs in the development and production of TCRL proteins that can recognize neoantigen pMHC complexes. For example, using this simple and efficient method, one can develop tumor antigen-specific drug candidates within a few weeks, which will pave the way for initiating downstream pre-clinical or clinical trials for anti-tumor biologics.

[0089] Definition

[0090] Although this application displays and describes various embodiments and aspects of the present application, it is evident to those skilled in the art that these embodiments and aspects are only provided as examples. Without departing from the present application, those skilled in the art will now contemplate many changes, alterations, and replacements. It should be understood that various alternative embodiments of the present application described herein may be employed in the  implementation of the present application.

[0091] As used herein, the term “antibody” refers to a full antibody or can also be referred to as an intact antibody or a complete antibody. The antibody is a glycoprotein that comprises at least two heavy chains (HC) and two light chains (LC) interlinked by disulfide bonds. Each heavy chain is composed of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region is composed of three structural domains (CH1, CH2, and CH3) . Each light chain is composed of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region. The light chain constant region is composed of a structural domain (CL) . The VH and VL regions can be further subdivided into highly variable regions called complementary determining regions (CDRs) , interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FRs) . Each VH and VL is typically composed of three CDRs and four FRs, arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The variable regions of heavy and light chains comprise binding domains that interact with antigens. The constant region of antibodies can mediate the binding of immunoglobulins to host tissues or factors, including various cells of the immune system (such as effector cells) and the first component of the classical complement system (CIq) . In this application, the term "antibody" has its broadest meaning and encompasses immunological active fragments of immunoglobulin molecules and immunoglobulin molecules, i.e., molecules containing antigen binding sites or domains, and can be used to refer to antigen structural fragments with antigen binding activity (such as antigen binding fragments) or complexes of one or more antigen binding fragments (such as scFv) . Immunoglobulin molecules can be of any category (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY) , or any type (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2) , or any subclass, or any source (e.g., human, mouse, rabbit, camel, fish, etc. ) .

[0092] As used herein, the terms “antigen binding fragment” or “antibody fragment” refer to one or more fragments in an antibody that retain the ability to bind specifically to a given antigen and thereby exhibit the required antigen binding activity. The antigen binding function of antibodies can be performed through fragments of complete antibodies. Examples of binding fragments within the term “antigen binding fragments of antibodies” include but are not limited to examples of antibody fragments, including but not limited to: Fab, Fab’, Fab’-SH, F (ab’) 2; bispecific antibodies; linear antibodies; single chain antibody molecules (such as scFv and scFab) ; single domain antibody (dAb) ; multispecific antibodies formed by antibody fragments; Fd fragments composed of VH and CH1 domains; Fv fragments composed of VL and VH domains of the antibody’s single arm; single  domain antibody (dAb) fragments composed of VH or VL domains; and an isolated complementary determining region (CDR) . For a review of certain antibody fragments, see Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1136 (2005) . In addition, although the two domains VL and VH of the Fv fragment is encoded by individual genes, they can be linked through artificial peptide linkers using recombination methods to form a single protein chain, where the VL and VH regions pair to form a monovalent molecule (called single chain Fv (scFv) ) . These single chain antibodies may include one or more antigen-binding fragments of the antibody. These antigen binding fragments are obtained using conventional techniques known to those skilled in the art, and the practicality of the fragments are screened in the same way as complete antibodies. Antigen binding fragments can also be incorporated into single domain antibodies, maxibodies, minibodies, single domain antibodies, intrabodies, diabodies, triabodies, tetrabodies, v-NAR and bis-scFv. Antigen binding fragments can be incorporated into a single chain molecule containing a pair of tandem Fv fragments (VH-CH1-VH-CH1) , forming a pair of antigen binding regions together with complementary light chain peptides. The term “antibodies” comprise both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies.

[0093] Papain digestion antibodies produce two identical antigen binding fragments (called “Fab” fragments, each with a single antigen binding site) and a residual Fc fragment, whose name reflects its ability to crystallize easily. The Fab fragment also comprises the constant domain of the light chain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. The difference between the “Fab” fragment and the Fab fragment lies in the addition of several residues at the carboxyl terminus of the heavy chain CH1 domain, including one or more cysteine residues from the antibody hinge region. “Fab'-SH” refers to Fab' with a constant domain of cysteine residues containing free thiol groups. The “F (ab') ” fragment is produced by the cleavage of the hinge cysteine disulfide bond of the digestive product “F (ab') 2” of gastric protease.

[0094] The “Fd” fragment is composed of VH and CH1 domains. The “dAb” fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546) is composed of VH domains. The combination of separated complementary determining regions (CDRs) and two or more separated CDRs can be optionally linked through synthetic linkers.

[0095] The Fv fragment is composed of the VL and VH domains of the antibody's single arm. Single chain Fv (scFv) is composed of a heavy chain variable region and a light chain variable region, which are covalently linked into a single chain polypeptide chain through flexible peptide linkers.

[0096] A covalent bond, also known as a molecular bond, is a chemical bond that involves sharing electron pairs between atoms. These electron pairs are called shared electron pairs or bonded electron pairs, and when they share electrons, the stable equilibrium of interatomic attraction and repulsion is called covalent bond.

[0097] As used herein, the term “Darpin” (abbreviation for designed ankyrin repeat protein) refers to an antibody mimetic protein that typically exhibits high specificity and affinity for target protein binding. They are typically genetically modified, derived from natural anchor proteins, and composed of at least three, typically four or five, repeated motifs of these proteins. For four or five repeated Darpins, their molecular weights are approximately 14 kDa or 18 kDa, respectively.

[0098] Ligands are substances that form complexes or conjugates with biological molecules to achieve their biological goals. In protein ligand binding, ligands are typically molecules that generate signals by binding to sites on target proteins. This binding typically leads to conformational changes in the target protein. In DNA ligand binding studies, ligands can be small molecules, ions, or proteins bound to the double helix of DNA. The relationship between ligands and conjugated ligands is a function of charge, hydrophobicity, and molecular structure. The binding occurs within an infinitely small range of time and space, so the rate constant is usually a very small number. Ligands can be naturally occurring ligands or non naturally occurring ligands. In addition, it may be an agonist, partial agonist, antagonist, or reverse agonist.

[0099] The difference between non-covalent or non-covalent bond and covalent bond binding and interactions is that they do not involve electron sharing, but rather involve more dispersed changes in electromagnetic interactions between or within molecules. Non-covalent interactions can be classified into different categories, such as electrostatic, π-effects, van der Waals forces, and hydrophobic effects. Preferably, the conjugate is provided in a separated form.

[0100] Proteins are large molecular polypeptide chains (peptides) composed of long chains of one or more amino acid residues. Proteins perform a series of functions within living organisms, including catalyzing metabolic reactions, DNA replication, responding to stimuli, providing structure for cells and organisms, and transporting molecules from one location to another. The main difference between proteins lies in their amino acid sequence, which is determined by the nucleotide sequence of their genes and typically leads to protein folding into a specific three-dimensional structure that determines their activity. Short peptides containing less than 20-30 residues are sharedly referred to as peptides.

[0101] As used herein, “protein conjugate” or “conjugate” refers to a protein that is non-covalently bound to other molecular structures.

[0102] Receptors are chemical structures typically composed of proteins that receive and transduce signals that may be integrated into biological systems. These signals are typically chemical messengers (ligands) that bind to receptors, causing some form of cellular / tissue response, such as changes in cellular activity. The main action modes of receptors can be divided into three types: signal relay, amplification, or integration. The relay sends the signal forward, the amplification increases the effect of a single ligand, and allows the signal to be incorporated into another biochemical pathway. In this sense, receptors are protein molecules that recognize and respond to endogenous chemical signals. Therefore, in the context of the present application, receptors or fragments containing ligand binding sites and their ligands are suitable binding counterparts (first component and therapeutic targets) .

[0103] As used herein, the percentage of “identity” , such as 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99%, and 99.5%, refers to the degree of similarity determined by sequence alignment between amino acid sequences or nucleotide sequences, which is 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99%, and 99.5%. For example, by introducing vacancies and other methods, two sequences can have the same residue in as many positions as possible, and the proportion of positions with the same base or amino acid residue to the total number of positions can be determined. The percentage of “identity” can be determined using software programs known in the art. The preferred method is to use default parameters for comparison. A preferred comparison program is BLAST. Preferred programs are BLASTN and BLASTP. The details of these programs can be found at the following internet address: ncbi. nlm. nih. gov / cgi-bin / BLAST.

[0104] As used herein, “complementarity” of nucleic acids refers to the ability of one nucleic acid to form hydrogen bonds with another through traditional Watson Crick base pairing. The percentage complementarity represents the percentage of residues in a nucleic acid molecule that can form hydrogen bonds (i.e., Watson Crick base pairing) with another nucleic acid molecule (for example, 5, 6, 7, 8, 9, and 10 out of 10 are approximately 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, and 100%complementary, respectively) . “Complete complementarity” refers to the formation of hydrogen bonds between all consecutive residues of a nucleic acid sequence and the same number of consecutive residues in the second nucleic acid sequence. As used herein, “basically complementary” refers to the degree of complementarity of any one of at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or  100%within a region of approximately 40, 50, 60, 70, 80, 100, 150, 200, 250 or more nucleotides, or two nucleic acids hybridized under strict conditions. For a single base or nucleotide, according to the Watson-Crick base pairing principle, when A pairs with T or U, C pairs with G or I, it is called complementary or matching, and vice versa; and other base pairing is called non complementarity. The “complementary polynucleotide sequence” of a certain polynucleotide sequence in the application refers to a polynucleotide sequence that is completely complementary to that particular polynucleotide sequence.

[0105] As used herein, a “conservative substitution variant” of a protein, peptide, or amino acid sequence refers to one or more amino acid residues being substituted by amino acids without altering the overall conformation and function of the protein or enzyme, including but not limited to replacing amino acids in the amino acid sequence of the parent protein in the manner described in the aforementioned “conservative substitution” . Therefore, the similarity between two proteins or amino acid sequences with similar functions may differ. For example, 70%to 99%similarity (identity) based on the MEGALIGN algorithm. Conservative substitution variants also include peptides or enzymes that have more than 60% (it is better to achieve 75%or more, preferably 85%or even 90%or more) amino acid identity determined through BLAST or FASTA algorithms, and they have similar or basically similar properties or functions compared to natural or parental proteins or enzymes.

[0106] In this application, “coding” refers to i) DNA sequences containing genetic information that can be transcribed into RNA molecules, and / or ii) RNA molecules containing genetic information that can be translated into amino acid sequences. Therefore, as used herein, “coding sequences” can refer to ribonucleotide (RNA) sequences or fragments thereof that can be translated into proteins in mRNA precursors or mature mRNA, and can also refer to complementary sequences or fragments thereof of deoxyribonucleotide (DNA) sequences that serve as templates for transcription of mRNA precursors or mature mRNA. In addition, the “coding sequence” of the application may further include coding proteins, functional nucleic acids, or fragments thereof, such as miRNA, shRNA, dsRNA, guide RNA, Poly (A) tail, 5'UTR, 3'UTR, and other polynucleotide sequences. Among them, the DNA molecule containing genetic information that can be transcribed into RNA molecules is called the “coding nucleic acid” of the RNA molecule; RNA molecules containing genetic information that can be translated into amino acid sequences are called “coding nucleic acids” of the amino acid sequence.

[0107] The term “MHC” or “MHC complex” used in the application refers to the major histocompatibility complex (MHC) molecules typically found on antigen-presenting cells (including dendritic cells, B cells, and macrophages) . The MHC complex helps regulate the immune system, for example, by presenting antigen peptides. The MHC complex comprises two categories of classical complexes: MHC-I and MHC-II. The human MHC-I complex is composed of two human leukocyte antigen (HLA) proteins, referred to as the “alpha chain” or “α chain” or “heavy chain” and “beta2m chain” or “β2m chain” or “light chain” , which associate with each other to form heterodimers. α1 and α2 domain form a peptide binding region. α3 domain and β2m are located closer to the cell membrane and form a immunoglobulin like construct. α1 domain is located at the N-terminus of the α chain, α3 domain is located at the C-terminus of the α chain. The α chain and β chain are usually linked to the cell surface through transmembrane domains.

[0108] The term “human leukocyte antigen” or “HLA” refers to polymorphic proteins encoded by the human major histocompatibility complex (MHC) genes. The HLA gene has different alleles, providing different functions for gene products. HLA proteins belonging to MHC-I (such as HLA-A, HLA-B, HLA-C) typically present peptides derived from intracellular antigens. MHC-I HLA proteins comprise HLA-A, HLA-B, and HLA-C, including heterodimeric cell surface receptors of the α chain and the β2m chain. HLA proteins belonging to MHC-II (such as HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR) typically present peptides derived from extracellular antigens. MHC-II proteins comprise HLA-DP, HLA-DQ, and HLA-DR, including heterodimeric cell surface receptors of the α chain and the βchain.

[0109] The term “HLA-Aheavy chain” or “HLA-Aα chain” or “HLA-Aα chain protein” provided in the application includes any recombinant or naturally occurring form of human leukocyte antigen (HLA) HLA-Aα heavy chain proteins, also known as MHC-I A, or their variants or homologs, which maintain activity of the HLA-Aα chain protein (e.g., compared to HLA-Aα chain, at least 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%activity) . In some aspects, compared to the naturally occurring HLA-Aα chain peptides, variants or homologs have at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity throughout the entire sequence or a portion of the sequence (such as 50, 100, 150, or 200 consecutive amino acid portions) . In the embodiment, HLA-Aα chain is a protein, its homolog, or functional fragment identified by the UniProt sequence reference P04439.

[0110] The term “HLA-B heavy chain” or “HLA-B α chain” or “HLA-B α chain protein” provided in  the application includes any recombinant or naturally occurring form of human leukocyte antigen (HLA) HLA-B α heavy chain proteins, also known as MHC-I B, or their variants or homologs, which maintain activity of the HLA-B α chain protein (e.g., compared to HLA-B α chain, at least 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%activity) . In some aspects, compared to the naturally occurring HLA-B α chain peptides, variants or homologs have at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity throughout the entire sequence or a portion of the sequence (such as 50, 100, 150, or 200 consecutive amino acid portions) . In the embodiment, HLA-B α chain is a protein, its homolog, or functional fragment identified by the UniProt sequence reference P01889.

[0111] The term “β2m chain” or “β2m chain protein” provided in the application includes the light chain protein component β2-microglobulin of any recombinant or naturally occurring form of human leukocyte antigen. In the embodiment, β2m chain is a protein, its homolog, or functional fragment identified by UniProt sequence reference P61769.

[0112] For the specific protein in the application, the designated protein includes any natural form, variant, or homolog of the protein that maintains the activity of the protein transcription factor (e.g., at least 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%activity compared to natural proteins) . In some embodiments, variants or homologs have at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%amino acid sequence identity throughout the entire sequence or a portion of the sequence (such as 50, 100, 150, or 200 consecutive amino acid portions) compared to their naturally occurring forms. In other embodiments, the protein is identified by its NCBI sequence reference. In other embodiments, the protein is a protein, its homolog, or functional fragment identified by its NCBI sequence reference.

[0113] “Contact” is used in its simple and common sense, referring to the process of allowing at least two different substances (such as peptides and MHC-I complexes) to become close enough for reactions, interactions, or physical contact. It should be understood that the obtained reaction products can be directly generated by the reaction between the added reagents, or by the intermediate of one or more added reagents, which can be generated in the reaction mixture. The term “contact” may include allowing two substances to react, interact, or physically contact, wherein these two substances may be, for example, nucleic acids and cells provided in the application. In the embodiment, contact includes, for example, allowing the nucleic acid in the application to enter the cell.

[0114] As used herein, “cell” refers to a cell that performs metabolism or other functions sufficient to preserve or replicate its genomic DNA. Cells can be identified through well-known methods in the art, including the presence of intact membranes, specific dye staining, or the ability to produce offspring. Cells can include prokaryotic and eukaryotic cells. Prokaryotic cells include but are not limited to bacteria. Eukaryotic cells include but are not limited to yeast cells and cells derived from plants and animals, such as mammals, insects (such as armyworms) , and human cells.

[0115] When referring to cells, nucleic acids, proteins, or carriers, the term “recombination” refers to cells, nucleic acids, proteins, or carriers that have been modified by introducing heterologous nucleic acids or proteins, or changes in natural nucleic acids or proteins, or cells derived from cells so modified. For example, recombinant proteins are proteins produced by recombinant nucleic acid molecules. Nucleic acid molecules can include genetic material from multiple sources, including non naturally occurring sequences. Recombinant DNA can be generated through known methods in the field of molecular biology or through synthetic methods. Therefore, for example, recombinant cells express genes that are not found in natural (non recombinant) forms of cells, or express natural genes that are abnormally expressed, underexpressed, or not expressed at all. Transgenic cells and plants are those that express heterologous genes or coding sequences, usually as a result of recombination methods.

[0116] The term “heterologous” when used to refer to a part of a nucleic acid, indicates that the nucleic acid comprises two or more subsequences that do not have the same relationship with each other in nature. For example, nucleic acids are typically produced by recombination, with two or more sequences from unrelated genes arranged to produce new functional nucleic acids, such as a promoter from one source and a coding region from another source. Similarly, heterologous proteins indicate that the protein comprises two or more subsequences that do not have the same relationship with each other in nature (such as fusion proteins) .

[0117] The term “exogenous” refers to molecules or substances (such as compounds, nucleic acids, or proteins) originating from the outside of a given cell or organism. For example, the “exogenous promoter” mentioned in the application is a promoter that does not originate from the cell or organism expressing it. On the contrary, the term “endogenous” or “endogenous promoter” refers to molecules or substances that are natural or originate from a given cell or organism. For example, endogenous proteins in yeast cells refer to proteins naturally expressed in yeast cells. Nucleic acids encoding endogenous proteins can be introduced into cells to allow for protein expression. For  example, the nucleic acid encoding Aga2p can be introduced into yeast cells to express Aga2p.

[0118] The term “expression” includes any step involved in peptide production, including but not limited to transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification, and secretion. Conventional techniques for protein detection, such as ELISA, Western blotting, flow cytometry, immunofluorescence, immunohistochemistry, etc., can be used to detect expression.

[0119] “Biological samples” or “samples” refer to materials obtained or derived from subjects or patients. Biological samples include tissue sections, such as biopsy and autopsy samples, and frozen sections used for histological purposes. Such sample includes body fluids, such as blood and blood components or products (such as serum, plasma, platelets, red blood cells, etc. ) , sputum, tissue, cultured cells (such as primary cultures, explants, and transformed cells) , feces, urine, synovial fluid, joint tissue, synovial tissue, synovial cells, immune cells, hematopoietic cells, fibroblasts, macrophages, T cells, etc. Biological samples are usually obtained from eukaryotes, such as mammals, such as primates, such as chimpanzees or humans; cow; dogs; cats; rodents, such as guinea pigs, rats, and mice; rabbit; birds; reptiles; or fish.

[0120] “Control” or “standard control” refers to a sample, measurement, or value used as a reference, usually a known reference, for comparison with a test sample, measurement, or value. For example, test samples can be obtained from patients suspected of having a given disease and compared with known normal (non diseased) individuals (such as standard control subjects) . Standard control can also represent the average measurement values or values collected from similar individuals (such as standard control subjects) , such as healthy individuals with similar medical backgrounds, age, and weight, without a given disease (i.e., standard control population) . Standard control values can also be obtained from the same individual, such as from patient samples obtained earlier before the onset of the disease. For example, a control group can be designed to compare the therapeutic benefits based on pharmacological data (e.g., half-life) or treatment measures (e.g., comparison of side effects) . Control is also valuable in determining the importance of data. For example, if the value of a given parameter changes significantly in the control, the changes in the test sample will not be considered significant. Technicians in this field can recognize that standard controls can be designed to evaluate any number of parameters (such as RNA levels, protein levels, specific cell types, specific body fluids, specific tissues, etc. ) .

[0121] Those skilled in the art will understand which standard controls are most suitable in a given situation and can analyze data based on comparisons with standard control values. Standard control  is also valuable for determining the significance of data, such as statistical significance. For example, if the value of a given parameter varies significantly in the standard control, the change in the test sample will not be considered significant.

[0122] It should be understood that the application includes various aspects, embodiments, and combinations of the aspects and / or embodiments described herein. The above description and subsequent embodiments are intended to illustrate rather than limit the scope of the application. Other aspects, improvements, and modifications within the scope of the application will be apparent to those skilled in the art to which the application belongs. Therefore, ordinary technical personnel in the art should recognize that the scope of the application also includes the improvements and modifications to the aspects and embodiments.

[0123] Specifically, the application relates to the components of the DOMAIN system and the system itself, and a method for using the DOMAIN system to screen TCR like monoclonal antibodies (TCRL Ab) for specific antigens (such as protein products related to cancer driven hotspot, protein mutants, etc. ) . Furthermore, the application also relates to nucleic acid molecules encoding protein components in the DOMAIN system. Among them, the DOMAIN system includes: host yeast cells, yeast surface protein / MHC specific receptor complexes, and antigenic peptide / MHC extracellular domains (pMHC) . Among them, yeast surface protein / MHC specific receptor complexes can be labeled or unlabeled, and exemplary yeast surface protein / MHC specific receptor complexes include, for example, peptide / MHC specific receptors fused with Aga2p-HA; PMHC can also be labeled or unlabeled, and exemplary pMHC includes, for example, IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 and MART1 / HLA-A*02: 01. As used herein, the “yeast surface protein” can be any protein that can be expressed on the yeast surface, or any protein that can be covalently linked to yeast membrane proteins or proteins expressed on the yeast cell wall. Exemplary yeast surface proteins include but are not limited to: Aga2p, a-lectin α-lectin, flocculant, Cwp1p, Cwp2p, and Tip1p. The “MHC specific receptor” can be used to refer to any protein that can recognize or bind to pMHC, including at least TCR protein itself and TCRL Ab. At present, TCRL Ab itself is structurally difficult to distinguish from ordinary antibodies or antigen binding fragments of antibodies (such as scFv) . Therefore, when the DOMAIN system is used to screen TCRL Ab for targeting a specific pMHC, the MHC specific receptor can be replaced by any antibody targeting the antigen or neoantigen in pMHC or the antigen binding fragment of the antibody.

[0124] Cells

[0125] On the one hand, the present application relates to a cell comprising a protein complex, a single chain peptide fragment, and a protein scaffold, wherein the protein complex comprises an α chain and a β chain, the single chain peptide fragment can specifically bind to the given structural region formed by the α chain and the β chain of the protein complex, thereby forming a peptide / αβ complex trimer comprising the single chain peptide fragment, the α chain and the β chain, the protein scaffold binds to the shared binding surface of the trimer by specifically recognizing the peptide / αβ complex trimer and forms a multimer of protein scaffold / peptide / αβ complex, wherein the shared binding surface of the trimer is the surface where the single chain peptide fragment binds to the α chain and the β chain of the protein complex.

[0126] In addition, the present application also provides three cells, cell 1, cell 2, and cell 3, wherein cell 1 expresses and displays the aforementioned protein scaffold on its surface, cell 2 expresses and displays the aforementioned peptide / αβ complex on its surface, and cell 3 expresses and secretes the aforementioned peptide / αβ complex.

[0127] The application also provides a cell composition comprising cell 1 and cell 3, wherein cell 1 displays the aforementioned protein scaffold on its surface, and cell 3 expresses or secretes the aforementioned peptide / αβ complex.

[0128] The application also provides a composition comprising a cell displaying the aforementioned protein scaffold on the surface, and the aforementioned peptide / αβ complex or a nucleic acid molecule encoding the aforementioned peptide / αβ complex.

[0129] Among them, the protein complex comprises at least an extracellular domain of MHC, wherein the α chain and β chain is the α chain and β chain of MHC, or the α chain comprises at least the extracellular part of the MHCα chain, and the β chain comprises at least the extracellular part of the MHCβ chain.

[0130] In some embodiments, the single chain peptide fragment is covalently bound to the α chain or the β chain. In some embodiments, the protein scaffold is non-covalently bound to the shared binding surface.

[0131] In some embodiments, the single chain peptide fragment is covalently bound to the β chain, which can further promote the specific binding of the single chain peptide fragment to a given structural region formed by the α chain and the β chain.

[0132] In some embodiments, the α chain is covalently bound to the β chain. In some embodiments, the  single chain peptide fragment is covalently bound to the β chain, and the α chain is covalently bound to the β chain. Such linking mode can ensure that cells express the α chain and the β chain in equal proportion, thus providing excellent monomer ratio, high adjacent molecular binding probability and satisfactory spatial dimerization conformation for the formation of αβ heterodimer. At the same time, such linking mode can effectively improve the local contact probability and spatial concentration of the peptide and the αβ heterodimer, and further promote the peptide and the αβ heterodimer to form a peptide / αβ complex trimer / Furthermore, the peptide / αβ complex trimer high expressed and formed by correct spatial conformation is helpful for the protein scaffold to recognize the shared binding surface of peptide / αβ and bind to it efficiently.

[0133] In some embodiments, the protein scaffold at least comprises an antibody obtained by immunizing animals with the peptide / αβ complex trimer, a chimeric antibody or humanized antibody of the antibody, or an antigen binding fragment of the aforementioned antibody, or the antibody or antigen binding fragment expressed or synthesized by bioengineering technology. In some embodiments, the protein scaffold at least comprises a structure selected from the group consisting of antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors, Darpin, or conjugates comprising any of the above structures. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment is an antibody fragment. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment is an antibody fragment lacking at least the Fc domain. In some embodiments, the antigen binding fragment is or comprises (Fab') 2 fragment, Fab' fragment or Fab fragment, VhH fragment, scFv fragment, scFv Fc fragment, or micro antibody, more particularly Fab fragment. In some embodiments, the antibody is a Fab fragment. In some embodiments, the antibody is a bispecific antibody or a multispecific antibody.

[0134] In some embodiments, the cells are yeast cells. In some embodiments, the yeast cells are Saccharomyces cerevisiae. In some embodiments, the yeast cell is a Saccharomyces cerevisiae strain EBY100.

[0135] In some embodiments, the protein scaffold is covalently fused with molecules on the cell surface to bind to the surface of the cell. In some embodiments, the protein scaffold itself comprises or is covalently linked to the cell surface molecules. In some embodiments, the protein scaffold comprises or is covalently linked to molecules that bind to cell surface molecules. In some embodiments, the covalent bond is a peptide bond. In some embodiments, the binding is achieved  through covalent or non-covalent bonding. In some embodiments, the peptide / αβ complex trimer binds to the molecule on the cell surface by non-covalently binding to the protein scaffold. In some embodiments, the molecule is a protein. In some embodiments, the protein is endogenous to the cell. In some embodiments, the protein is selected from Aga2p, a-lectin, α-lectin, flocculant, Cwp1p, Cwp2p, or Tip1p. In some embodiments, the protein is Aga2p. In some embodiments, Aga2p is a protein encoded by the gene with GENE ID of 852851 in the NCBI database. Aga2p, also known as Aga2 protein, is a binding subunit of a-lectin, which can bind to the core subunit of a-lectin, Aga1 protein, through disulfide bonds. In some embodiments, Aga2p is a protein encoded by the gene with GENE ID of 852851 in the NCBI database. In some embodiments, Aga2p has 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more mutations in its amino acid sequence compared to the protein encoded by the gene with GENE ID of 852851 in the NCBI database. In some embodiments, the amino acid sequence of Aga2p comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a conservative substitution variant of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence with at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the amino acid sequence of Aga2p is represented by SEQ ID NO: 1.

[0136] In some embodiments, the single chain peptide fragment is selected from any known peptide that can bind to MHC, such as an antigenic epitope peptide. In some embodiments, the single chain peptide fragment can specifically bind to a given structural region formed by the α chain and the βchain of the protein complex, and is further connected with the protein complex through covalent bonds such as peptide bonds. In some embodiments, the single chain peptide fragment is an MHC epitope peptide. In some embodiments, the single chain peptide fragment is a tumor related or specific antigenic peptide fragment. The tumor related or specific antigenic peptide fragment can be presented by the α chain and the β chain of the protein complex through the engineered cells of the application, and such a structure can better present tumor related or specific antigenic peptide fragments presented by the main histocompatibility complex (MHC) in human body, so that the interaction between protein scaffold and tumor related or specific antigenic peptide fragments can be better studied.

[0137] In some embodiments, the single chain peptide fragment is a peptide fragment of 5-100 amino acids in length. The single chain peptide fragment can be, for example, a peptide fragment of 5.6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,  36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 81, 82, 83, 84, 85 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100 amino acids in length. In some embodiments, the length of the single chain peptide fragment suitable for presentation through protein complexes comprising an α chain and a β chain is usually set to be 7-50 amino acids. In some embodiments, the length of the single chain peptide fragment suitable for presentation through protein complexes comprising an α chain and a β chain is usually set to be 8-30 amino acids. By setting length of the single chain peptide fragment to the above range, it can effectively ensure that the single chain peptide fragment is presented through a protein complex comprising an α chain and a β chain, specifically binds to a given structural region formed by the alpha chain and the beta chain of the protein complex, forms a specific structural region formed by the α chain and the β chain of the protein complex, and is more beneficial for the protein scaffold to bind to the shared binding surface of the trimer by specifically recognizing the peptide / αβ complex trimer, and forms a protein scaffold / peptide / αβ complex multimer.

[0138] In some embodiments, the tumor antigen peptides are selected from: antigen peptides produced by tumor-associated antigen of the melanoma antigen family A1 (MAGE-A1) , antigen peptides produced by cancer-testis antigen New York esophageal squamous cell carcinoma-1 (NY-ESO-1) , antigen peptides produced by Wilms tumor oncoprotein 1 (WT1) , antigen peptides produced by tumor specific isocitrate dehydrogenase 2 mutant protein, and antigen peptides produced by melanoma antigen recognized by T-cells 1 (MART1) . In some embodiments, the amino acid sequence of the single chain peptide fragment is represented by any one of SEQ ID NOs: 2-6.

[0139] In some embodiments, the α chain is encoded by HLA-A*02 or other alleles of family HLA-A, and the β chain is encoded by B2M gene; or

[0140] the α chain is encoded by HLA-B*07 or other alleles of family HLA-B, and the β chain is encoded by B2M gene; or

[0141] the α chain is encoded by HLA-C*01 or other alleles of family HLA-C, and the β chain is encoded by B2M gene; or

[0142] the α chain is encoded by HLA-DRA*01 or other alleles of family HLA-DRA, and the β chain is encoded by HLA-DRB1*01 or other alleles of family HLA-DRB; or

[0143] the α chain is encoded by HLA-DQA1*01 or other alleles of family HLA-DQA1, and the βchain is encoded by HLA-DQB1*06 or other alleles of family HLA-DQB1; or

[0144] the α chain is encoded by HLA-DPA1*01: 03 or other alleles of family HLA-DPA1, and the βchain is encoded by HLA-DPB1*04: 01 or other alleles of family HLA-DPB1.

[0145] Protein complexes, single chain peptide fragments, and protein scaffolds.

[0146] Among them, the protein complex comprises an α chain and a β chain, or the protein complex is composed of the α chain and β chain;

[0147] the single chain peptide fragment can specifically bind to the given structural region formed by the α chain and the β chain of the protein complex, thereby forming a peptide / αβ complex trimer comprising the single chain peptide fragment, the α chain and the β chain,

[0148] the protein scaffold binds to the shared binding surface of the trimer by specifically recognizing the peptide / αβ complex trimer and forms a multimer of protein caffold / peptide / αβ complex.

[0149] Among them, the shared binding surface of the trimer is the surface where the single chain peptide fragment binds to the α chain and the β chain of the protein complex.

[0150] Among them, the protein complex comprises at least an extracellular domain of MHC, wherein the α chain and β chain is the α chain and β chain of MHC, or the α chain comprises at least the extracellular part of the MHCα chain, and the β chain comprises at least the extracellular part of the MHCβ chain.

[0151] In this application, those skilled in the art can understand the meanings of other alleles of family HLA-A, other alleles of family HLA-B, other alleles of family HLA-C, other alleles of family HLA-DRA, other alleles of family HLA-DQA1, other alleles of family HLA-DQB1, other alleles of family HLA-DPA1, and other alleles of family HLA-DPB1. These alleles can be queried and selected based on publicly available data in existing databases, as long as they can be used to encode the α chain and β chain of MHC from human required by this application. Existing databases can be referenced, for example https:  / / www. ebi. ac. uk / ipd / imgt / hla / .

[0152] Engineered nucleic acid molecules

[0153] The application also provides an engineered nucleic acid molecule that encodes a peptide / αβcomplex trimer expressed in the aforementioned cells. Specifically, the peptide / αβ complex trimer comprises a protein complex and a single chain peptide fragment, the protein complex comprises an α chain and a β chain, and the single chain peptide fragment can specifically bind to the given structural region formed by the α chain and the β chain of the protein complex, thereby forming a peptide / αβ complex trimer comprising the single chain peptide fragment, the α chain and the β chain.

[0154] The application also provides another engineered nucleic acid molecule that encodes a protein scaffold expressed in the aforementioned cells, wherein the protein scaffold comprises at least antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors or Darpin, or a conjugate containing any of the above structures. In the application, antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors, and Darpin, and conjugates containing any of the above structures, may be collectively referred to as potential TCRL. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment is an antibody fragment. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment is an antibody fragment lacking at least the Fc domain. In some embodiments, the antigen binding fragment is or comprises (Fab') 2 fragment, Fab' fragment or Fab fragment, VhH fragment, scFv fragment, scFv Fc fragment, or micro antibody. In some embodiments, the potential TCRL is a Fab fragment. In some embodiments, the protein scaffold can specifically bind to the aforementioned peptide / αβ complex trimer on the shared binding surface of the trimer and forms a multimer of protein scaffold / peptide / αβ complex, wherein the shared binding surface of the trimer is the surface where the single chain peptide fragment binds to the α chain and the β chain of the protein complex. In some embodiments, the protein scaffold further comprises protein molecules covalently linked to the TCRL, which are either cell surface molecules themselves or can be covalently bound to cell surface molecules. In some embodiments, the covalent bond is a peptide bond. In some embodiments, the binding is the binding through covalent or non-covalent bonds. In some embodiments, the protein molecule is endogenous to the cell. In some embodiments, the protein molecules are selected from Aga2p, a-lectin α-lectin, flocculant, Cwp1p, Cwp2p, or Tip1p. In some embodiments, the protein molecule is Aga2p. In some embodiments, Aga2p is a protein encoded by the gene with GENE ID of 852851 in the NCBI database. In some embodiments, Aga2p is a protein encoded by the gene with GENE ID of 852851 in the NCBI database. In some embodiments, Aga2p has 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more mutations in its amino acid sequence compared to the protein encoded by the gene with GENE ID of 852851 in the NCBI database. In some embodiments, the amino acid sequence of Aga2p comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a conservative substitution variant of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence with at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:  1. In some embodiments, the amino acid sequence of Aga2p is represented by SEQ ID NO: 1.

[0155] In addition, the application also provides an engineered nucleic acid molecule that simultaneously encodes the aforementioned peptide / αβ complex trimer and the aforementioned protein scaffold, wherein the peptide / αβ complex trimer and the aforementioned protein scaffold are not expressed in fusion. In some embodiments, the aforementioned peptide / αβ complex trimer and the aforementioned protein scaffold expressed by the engineered nucleic acid molecules are linked by a 2A peptide.

[0156] The application also provides a nucleic acid combination, comprising:

[0157] a nucleic acid encoding the aforementioned peptide / αβof complex trimer; and

[0158] a nucleic acid encoding the aforementioned protein scaffold, wherein,

[0159] the peptide / αβ complex trimer comprises a protein complex and a single chain peptide fragment, the protein complex comprises an α chain and a β chain, and the single chain peptide fragment can specifically bind to the given structural region formed by the α chain and the β chain of the protein complex, thereby forming a peptide / αβ complex trimer comprising the single chain peptide fragment, the α chain and the β chain;

[0160] and the protein scaffold can specifically bind to the peptide / αβ complex trimer on the shared binding surface of the trimer and forms a multimer of protein scaffold / peptide / αβ complex.

[0161] In some embodiments, the protein scaffold is selected from the group consisting of antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors, Darpin, or conjugates comprising any of the above structures. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment is an antibody fragment. In some embodiments, the antigen binding fragment is an antibody fragment that lacks at least the Fc domain. In some embodiments, the antigen binding fragment is or comprises (Fab') 2 fragment, Fab' fragment or Fab fragment, VhH fragment, scFv fragment, scFv Fc fragment, or micro antibody. In some embodiments, the antigen binding fragment is a Fab fragment.

[0162] In some embodiments, the engineered nucleic acid molecule is an engineered DNA molecule. In some embodiments, DNA molecules can be replicated and / or expressed in cells. In some embodiments, the DNA molecule can be replicated and / or expressed in eukaryotic cells. In some embodiments, the DNA molecule can be replicated and / or expressed in prokaryotic cells. In some embodiments, the DNA molecule can be expressed in eukaryotic cells and replicated in prokaryotic cells. Therefore, the DNA molecule comprises not only the nucleic acid fragments encoding the  aforementioned peptide / αβ complex trimer and / or the aforementioned protein scaffold, but also comprises gene manipulation or regulatory elements used for replication and / or expression in prokaryotic and / or eukaryotic cells.

[0163] The necessary structural elements for replicating or efficiently replicating the engineered DNA molecule in cells are known in the art, including, for example, a replication starting point (ORI) . In some embodiments, the engineered DNA molecule further comprises a marker gene or its fragment and / or a reporter gene or its fragment, and a unique restriction endonuclease site that allows insertion of DNA elements, preferably restriction endonuclease site in the form of a polyclonal site (MCS) . The marker genes are beneficial for identifying cells containing plasmids containing the marker genes, which can be selected from, for example, antibiotic resistance genes. Each restriction endonuclease site in the MCS can be specifically recognized by different restriction endonucleases.

[0164] In some embodiments, the DNA molecule is a DNA plasmid. As used herein, the term “DNA plasmid” refers to a plasmid composed of double stranded DNA molecules. In some embodiments, the “plasmid” is a circular DNA molecule. In some embodiments, the “plasmid” may also encompass linear DNA molecules. Specifically, the term “plasmid” also encompasses molecules obtained by linearizing circular plasmids by, for example, cutting circular plasmids with restriction endonucleases to transform them into linear molecules, and linear molecules that can be replicated in prokaryotes. Plasmids can replicate, i.e., amplify in cells independent of genomic genetic information stored in prokaryotic cells, and can be used for cloning, i.e., for amplifying genetic information in bacterial cells. Preferably, the DNA plasmid according to the present application is a medium copy or high copy plasmid, and more preferably a high copy plasmid. Examples of such high copy plasmids are vectors based on pUC, pTZ plasmids, or any other plasmids containing ORI that support high copy plasmids (such as pMB1, pCoIE1) .

[0165] In some embodiments, the engineered DNA molecule is a DNA molecule or a fragment thereof that constitutes a prokaryotic nucleoid, or a DNA molecule or a fragment thereof that constitutes a eukaryotic genome, i.e., the coding sequence comprising the aforementioned peptide / αβ complex trimer and / or the aforementioned protein scaffold or its complementary sequence can be replicated with the prokaryotic genome.

[0166] In some embodiments, the engineered DNA molecules can be transcribed into mRNA. In some embodiments, the engineered DNA molecule also includes a coding sequence of elements that can be transcribed to initiate or regulate the expression of the protein, peptide, or fragment thereof,  including but not limited to 5'UTR, 3'UTR, poly (A) tail (or tail signal) , etc. In some embodiments, the engineered DNA molecule comprises at least an encoding sequence of one untranslated region (UTR) . In some embodiments, the engineered DNA molecule comprises at least a coding sequence of 5 'UTR and a coding sequence of the protein, peptide, or fragment thereof. In some embodiments, the engineered DNA molecule from 5’ to 3’ comprises at least a coding sequence of 5’ UTR, a coding sequence of the peptide / αβ complex trimer and / or the aforementioned protein scaffold, a coding sequence of 3’ UTR, a DNA sequence corresponding to the tail signal or Ploy (A) tail sequence, and the coding sequence of the peptide / αβ complex trimer and / or the aforementioned protein scaffold may also comprise a start codon (5’ terminus) and a stop codon (3’ terminus) at both terminuses, which are the translatable first three nucleotides and last three nucleotides of the mRNA molecule, respectively. 5’ UTR typically comprises at least one ribosome binding site (RBS) , such as the Shine-Dalgarno sequence in prokaryotes, or at least one translation start site, such as the Kozak sequence in eukaryotes. RBS promotes effective and accurate translation of mRNA molecules by recruiting ribosomes at the beginning of translation. The activity of a given RBS or translation inspiration site can be optimized by changing its length and sequence, and its distance from the starting codon. Optionally or alternatively, 5’ UTR comprises internal ribosome entry sites or IRES. 3’ UTR can comprise one or more regulatory sequences, such as binding sites of amino acid sequences that enhance the stability of mRNA molecules, binding sites of the regulatory RNA molecules (such as miRNA molecules) , and / or signaling sequences involved in intracellular transport of mRNA molecules.

[0167] On the basis of the aforementioned embodiment, in some embodiments, the target gene fragment further comprises one or more additional regulatory sequences, such as binding sites of amino acid sequences that enhance mRNA molecular stability, binding sites of amino acid sequences that enhance mRNA molecular translation, regulatory elements (such as riboswitches) , and / or nucleotide sequences that have a positive impact on translation initiation. In addition, within the 5’ UTR, preferably there are no functional upstream open reading frames, upstream translation start sites outside the frame, upstream start codons outside the frame, and / or nucleotide sequences that produce secondary structures that reduce or prevent translation. The presence of such nucleotide sequences in 5’ UTR can have a negative impact on translation.

[0168] The coding sequence comprising the aforementioned peptide / αβ complex trimer and / or the aforementioned protein scaffold comprises codons that can be translated into amino acid sequences.  All codons contained in the coding sequence can be natural codons encoding amino acids, or some or all of them can be composed of artificially synthesized codons. In some embodiments, some or all of the codons have undergone codon optimization. In some embodiments, some or all of the codons encode unnatural amino acids.

[0169] In some embodiments, the engineered DNA molecule further comprises structural elements necessary to initiate or regulate RNA transcription on the 5’ terminus side of the target gene fragment, and the structural elements are known in the art. In some embodiments, the structural elements at least comprise a promoter. Promoters and their sequences are known in the art, including weak promoters, medium intensity promoters, strong promoters, mini promoters, or core promoters. In some specific embodiments, the promoter is a strong promoter. In some embodiments, the promoter can initiate the transcription of the coding sequence of the aforementioned peptide / αβ complex trimer and / or the aforementioned protein scaffold. In some embodiments, the promoter can initiate the transcription of the coding sequence of the aforementioned peptide / αβ complex trimer and / or the aforementioned protein scaffold. The promoter comprises at least one transcription recognition site and subsequent transcription factor binding sites. The recognition and binding sites can interact with amino acid sequences that mediate or regulate transcription. Compared to the recognition site, the binding site is closer to the aforementioned target gene fragment. The binding site can be, for example, the Pribnow frame in prokaryotes or the TATA frame in eukaryotes. For example, in some embodiments, when using the Pribnow frame, the transcription recognition site can be located about 35bp upstream of the transcription start site, and the transcription factor binding site can be located about 10bp upstream of the transcription start site. In some embodiments, the promoter comprises at least one additional regulatory element, such as an upstream element rich in AT located approximately 40 and / or 60 nucleotides before the transcription start site, and / or another regulatory element enhancing promoter activity located between the recognition site and the binding site. In some embodiments, the promoter is a strong promoter, that is, the promoter comprises a sequence that promotes transcription of the aforementioned RNA coding sequence. Strong promoters are known to those skilled in the art, such as OXB18, OXB19, and OXB20 promoters derived from RecA promoters in Escherichia coli, or can be identified or synthesized through conventional laboratory procedures. In some embodiments, the promoter is T7 promoter. In some embodiments, the promoter also includes additional regulatory elements, such as enhancers included in DNA plasmids that promote transcription of the aforementioned RNA coding sequences.

[0170] In some embodiments, the eukaryotic cells are yeast cells. In some embodiments, the yeast cells are Saccharomyces cerevisiae cells. In some embodiments, the DNA molecule is a yeast display vector or called yeast shuttle plasmid. In some embodiments, the yeast display vector is yeast shuttle vector pRS315.

[0171] In addition, the application also provides a RNA molecule encoding the aforementioned peptide / αβ complex trimer and / or the aforementioned protein scaffold. In some embodiments, the RNA molecule is transcribed from the above engineered DNA molecule.

[0172] In some embodiments, the engineered nucleic acid molecule may also be a hybrid molecule of DNA and RNA.

[0173] Furthermore, the application further relates to the peptide / αβ complex trimer and protein scaffold expressed by the aforementioned engineered nucleic acid molecule or nucleic acid combination, and proteins with the same amino acid sequence and / or protein conformation as the peptide / αβ complex trimer and protein scaffold.

[0174] In addition, the application also encompasses any cell comprising the aforementioned engineered nucleic acid molecules.

[0175] Preparation and identification methods

[0176] The application also provides a method for preparing the aforementioned peptide / αβ complex trimer, comprising: transforming cells using the aforementioned nucleic acid, or the aforementioned nucleic acid combination;

[0177] and culturing the cells under the condition of expressing the aforementioned peptide / αβcomplex trimer.

[0178] In some embodiments, the cells are yeast cells. In some embodiments, the yeast cells are Saccharomyces cerevisiae. In some embodiments, the yeast cell is a Saccharomyces cerevisiae strain EBY100.

[0179] The application also provides a method for preparing a protein scaffold, comprising:

[0180] transforming cells using the aforementioned nucleic acid, or the aforementioned nucleic acid combination,

[0181] and culturing the cells under the condition of expressing the aforementioned protein scaffold.

[0182] In some embodiments, the cells are yeast cells. In some embodiments, the yeast cells are Saccharomyces cerevisiae. In some embodiments, the yeast cell is a Saccharomyces cerevisiae strain  EBY100.

[0183] The application also provides a method for identifying a protein scaffold binding to a peptide / αβcomplex trimer, comprising:

[0184] i) enabling the cell to display the potential target protein scaffold;

[0185] ii) enabling the cell to secrete and contact with the peptide / αβ complex trimer; and

[0186] iii) detecting the peptide / αβ complex trimer on the surface of the cell, thereby identifying the protein scaffold binding to a peptide / αβ complex trimer.

[0187] The application also provides a method for screening a potential target protein scaffold binding to the peptide / αβ complex trimer, comprising:

[0188] i) enabling the cell to display the potential target protein scaffold to construct cell library displaying different protein scaffolds;

[0189] ii) enabling the monoclonal cell in the displayed cell library to secrete and contact with the peptide / αβ complex trimer; and

[0190] iii) detecting the cell monoclones binding to the peptide / αβ complex trimer in the cell library, thereby screening the protein scaffold binding to a peptide / αβ complex trimer.

[0191] In some embodiments of the above identification and screening methods, the protein scaffold comprises at least or is antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors, Darpin, or conjugates comprising any of the above structures. In the above identification and screening methods, the protein scaffold comprises or covalently binds to a molecule that can be located on the cell surface or can bind to molecules on the cell surface through covalent bonds. In some embodiments, the molecule is a protein or peptide molecule. In some embodiments, the protein or peptide molecules are endogenous to the cells. In some embodiments, the protein or peptide molecules are selected from Aga2p, a-lectin α-lectin, flocculant, Cwp1p, Cwp2p, or Tip1p. In some embodiments, the protein molecule is Aga2p. In some embodiments, Aga2p is a protein encoded by the gene with GENE ID of 852851 in the NCBI database. In some embodiments, Aga2p is a protein encoded by the gene with GENE ID of 852851 in the NCBI database. In some embodiments, Aga2p has 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more mutations in its amino acid sequence compared to the protein encoded by the gene with GENE ID of 852851 in the NCBI database. In some embodiments, the amino acid sequence of Aga2p comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a conservative substitution variant of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an  amino acid sequence with at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the amino acid sequence of Aga2p is represented by SEQ ID NO: 1.

[0192] In some embodiments of the above identification and screening methods, step i) enabling the cell to display the potential target protein scaffold can be carried out by culturing the aforementioned cells under the conditions of expressing the protein scaffold, or by introducing the aforementioned engineered nucleic acid molecules into the cells and culturing the cells under the conditions of expressing the protein scaffold. Among them, the protein scaffold is the potential target protein scaffold.

[0193] In some embodiments of the above identification and screening methods, ii) enabling the cell or the monoclonal cell in the displayed cell library to secrete and contact with the peptide / αβ complex trimer with the peptide / αβ complex trimer is to enable the cell to simultaneously express the protein scaffold and the peptide / αβ complex trimer; in this embodiment, the cell can be the aforementioned cell, which simultaneously expresses the peptide / αβ complex trimer and the protein scaffold, wherein the protein scaffold is the potential target protein scaffold; in this embodiment, steps i) and ii) can also be carried out by introducing the cell into the aforementioned nucleic acid group. In some embodiments, ii) contacting the displayed cell library with the peptide / αβ complex trimer is to contact the cell with the peptide / αβ complex trimeric protein, which is not expressed by cells displaying the potential target protein scaffold. In some embodiments, ii) contacting the displayed cell library with the peptide / αβ complex trimer is to contact the cell with other cells secreting or displaying the peptide / αβ complex trimer. In some embodiments, the cells are yeast cells. In some embodiments, the yeast cells are Saccharomyces cerevisiae. In some embodiments, the yeast cell is a Saccharomyces cerevisiae strain EBY100.

[0194] In addition, the application also provides use of the aforementioned cells for identifying or screening drug molecules or functional biomolecules. In some embodiments, the drug molecule or functional biomolecule is an antigen peptide, which serves as a single chain peptide fragment part in the peptide / αβ complex in the use. By the antigen peptide identified, it is possible to determine the antigen suitable for targeting the aforementioned protein scaffold. In some embodiments, the drug molecule or functional biomolecule is a TCRL, and by identifying the TCRL, a TCRL that can be used for targeting the aforementioned peptide / αβ complex can be obtained.

[0195] Example

[0196] Example 1:

[0197] TCRL Ab has great potential as an immunotherapeutic agent for cancer. Given somatic hypermutation and affininty maturation in B cells and the high selectivity and diversity of the six complementary determining regions (CDRs) , particularly the heavy chain (HC) CDR3 and light chain (LC) CDR3, Ab has evolved into an antigen binding receptor with high affinity. Therefore, the engineering and affinity maturation of TCRL Abs possess a profound theoretical basis as compared to the engineering of unstable TCRs that also harbor six CDRs. With very low pHLA binding affinity, TCR mainly utilizes the germline CDR1α / β and CDR2α / β to contact HLA, whereas utilizing CDR3α / β to contact the up-pointing residues of antigenic peptide in the HLA peptide binding groove.

[0198] By simulating the capability of a TCR to bind various HLA allelic proteins while distinguishing subtle differences between the accommodated peptides, scientists have already developed some TCRL Abs by modifying their six CDRs, especially the two CDR3 HC / LCs of the Ab. For example, the TCRL Ab clone Hyb3 specifically recognizes the MAGE-A1 / HLA-A*01: 01: 01 complex, the TCRL Ab clone 3M4E5 specifically recognizes the NY-ESO-1 / HLA-A*02: 01 complex, the TCRL Ab clone ESK1 specifically recognizes the WT1 / HLA-A*02: 01 complex, the TCRL Ab clone 2Q1 specifically recognizes the IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 complex, and the TCRL Ab clone MA2 specifically recognizes the MART1 / HLA-A*02: 01 complex. Among them, the information of five established human tumor antigen peptides is as follows: the amino acid sequence of the antigen peptide produced by melanoma antigen family A1 (MAGE-A1) is represented by SEQ ID NO: 2; the amino acid sequence of the antigen peptide produced by cancer-testis antigen New York esophageal squamous cell carcinoma-1 (NY-ESO-1, aa157-165) is represented by SEQ ID NO: 3; the amino acid sequence of the antigen peptide produced by Wilms tumor oncoprotein 1 (WT1) is represented by SEQ ID NO: 4; the amino acid sequence of the antigenic peptide produced by tumor specific isocitrate dehydrogenase 2 mutant protein (IDH2R140Q, aa134-143) is represented by SEQ ID NO: 5; the amino acid sequence of the antigen peptide produced by melanoma antigen recognized by T-cells 1 (MART1, aa26-35, A2L mutant) is represented by SEQ ID NO: 6.

[0199] We selected two most representative TCRL pHLA receptor ligand combinations to validate the effectiveness of the DOMAINN system: (1) 2Q1-IDH2R140Q / HLA-B*07: 02, (2) MA2-MART1 / HLA-A*02: 01. Firstly, we used traditional methods such as vector construction,  plasmid transformation, yeast culture, and protein expression to express the Fab functional domain of TCRL Ab antigen binding fragment on yeast cells and display it on the surface of yeast cells. Regardless of whether it binds to pHLA trimer or not, TCRL Fab can be anchored on the corresponding transformed yeast cells through fusion with the yeast endogenous adhesion receptor subunit Aga2p (Figure 1) . Among them, Aga2p binds to another yeast derived surface protein Aga1p through disulfide bonds. Meanwhile, we constructed a second yeast shuttle plasmid vector system to transform the gene reading frames that drive the expression of IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 or MART1 / HLA-A*02: 01 trimer into the aforementioned yeast cells. The correct folding of pHLA trimer expressed by this reading frames does not have a direct connection or binding effect with the yeast surface native protein, but is directly secreted by the yeast cell. In this way, the same yeast cell will receive two different plasmid vector systems, which respectively drive the surface display of the TCRL Fab and secretion of the pHLA trimer.

[0200] Example 2: materials and methods

[0201] The materials and reagents used can be obtained from commercial sources unless otherwise specified. All experimental methods used are conventional methods unless otherwise specified.

[0202] Construction of the shuttle vector

[0203] The entire gene expression cassette (GAL1-10 / / GOI / / AGA2-HA / / MFα Term. ) was subcloned into the yeast shuttle vector pRS315 (commercially available) partially digested by KpnI / SacI, and a yeast surface display plasmid with the LEU nutrient marker gene was formed (Jiang&Boder, 2010) . The DNA strand encoding GOI in the aforementioned plasmid was then replaced with a segment of DNA strand encoding IDH2R140Q peptide (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5) +HLA-I light chain β2m (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7) + HLA-B*07: 02 heavy chain (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8) + V5 tag (GKPIPNPPLLGLDST, amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14) , to construct a vector for yeast displaying the IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 trimeric fusion protein. Similarly, DNA strands encoding the amino acid sequences of the IDH2R140Q and HLA-B*07: 02 alleles were replaced with the DNA strands encoding MART1 (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6) and HLA-A*02: 01 alleles (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9) , respectively, to construct a vector for yeast displaying the MART1 / HLA-A*02: 01 trimeric fusion protein. Next, the DNA strand encoding AGA2-HA was knocked out from the aforementioned two yeast display vectors through gene deletion to construct a  vector for yeast secreting IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 trimeric fusion protein or yeast secreting MART1 / HLA-A*02: 01 trimeric fusion protein. Finally, using gene deletion and molecular cloning techniques, gene exchange was achieved between HLA-I heavy and light chains in the above vectors for yeast displaying IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 single chain trimer and MART1 / HLA-A*02: 01 single chain trimer, respectively. Two new vectors were constructed for displaying IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 single chain trimer and MART1 / HLA-A*02: 01 single chain trimer. Another two new vectors were constructed for yeast secreting IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 single chain trimer and MART1 / HLA-A*02: 01 single chain trimer by deleting the DNA strand encoding AGA2-HA after the gene exchange between HLA-I heavy and light chains.

[0204] To create a shuttle plasmid for displaying the 2Q1 TCRL Fab, the reading fragments of DRαand DRβ genes driving DR4 expression for yeast display in the plasmid (Liu, Jiang, &Mellins, 2021) were replaced by LC and HC gene fragments of the 2Q1 antibody Fab (amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, respectively) in the same reading frame, respectively. Similarly, in order to create a shuttle plasmid for displaying MA2 TCRL Fab, the reading fragments of DRα and DRβ genes driving DR4 expression for yeast display in the plasmid were replaced by LC and HC gene fragments of the MA2 antibody Fab in the same reading frame, respectively (amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, respectively) .

[0205] Electrotransformation

[0206] The electroporation technique was used for transformation of the constructed vector into the Saccharomyces cerevisiae strain EBY100 (GAL1-AGA1: URA3 ura3-52 trp1 leu2Δ1 his3Δ200 pep4: HIS2 prb1Δ1.6R can1 GAL) . Eelectrotransformation used MicroPulser electroporation equipment (BioRad) , and the typical method referred to the BioRad MicroPulser manual. Yeast cell single clone receiving the vector formed visible individual yeast colonies on solid medium agar plates containing tryptophan and / or leucine nutrient dropout supplements after 2-3 days of incubation in a constant temperature incubator at 30℃. Solid agar medium SD-SCAA comprises 2% (wt / vol) glucose, 0.67% (wt / vol) yeast nitrogen source medium without amino acids, 0.062-0.1% (wt / vol) amino acid dropout supplement mixture (Clontech) , 38mM Na2HPO4, 62mM NaH2PO4, pH 6.

[0207] Yeast culture and protein expression

[0208] a single yeast colony was inoculated with 2 ml of liquid SD-SCAA medium and incubated in a shaker at 30℃ until it reached a density of 2.5-5.0×107 per mL (OD600 was 2.5-5.0) . To induce  protein expression promoted by GAL1-10, 107 cells were collected by centrifugation and transferred to 2mL SG-SCAA medium (glucose was replaced by galactose) . After inducing expression at 30℃for 16-18 hours, 106 cells were harvested in each sample by centrifugation for immunofluorescent labeling.

[0209] Fluorescent labeling

[0210] Before labeling, the cells were centrifuged and precipitated, and washed at least once with cold PBS+1%BSA. Cell pellets were re-suspended in PBS + 1%BSA containing one or two of anti-human LC monoclonal antibodies (such as mouse-anti-human λ or κ MAb, Biogene) , anti-human β2m monoclonal antibodies (such as Mouse-anti-human β2m mAb, Biolegend) , anti anti-V5 labeled monoclonal antibodies (such as Mouse-anti-V5 mAb Santa Cruz) , and anti-HA labeled monoclonal antibodies (such as Rabbit-anti-HA mAb, Cell signaling) , incubated at room temperature for 30 minutes, and then incubated on ice for 30 minutes. After centrifugation to remove the incubation solution, the cells were washed again with cold PBS+1%BSA at least twice. If direct immunofluorescent labeling is used, two colors of Alexa FLuor 488 and Alexa FLuor 647 or their equivalent fluorophores can be selected as labeling reagents for direct coupling. If indirect immunofluorescent labeling is used, the primary antibody can be selected from mouse and / or rabbit antibodies, while the secondary antibody needs to be correspondingly selected from non-cross-reactive antibodies with high cross-adsorption identification fluorescence (such as Alexa Fluor 647 goat anti mouse IgG (H+L) and Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG (H+L) , Thermo Fisher) for dual color fluorescence labeling, and incubated on ice for 40-60 minutes. Finally, cells were washed with cold PBS+1%BSA, and resuspended in 500-700 μL of PBS+1%BSA for flow cytometric analysis.

[0211] Flow cytometric analysis

[0212] At least 20000 cell events were collected for each sample, and gated through forward and side scattering. The flow cytometers used include FACSCAlibur and FACSAriaII. Corresponding fluorescence channels were selected for Alexa FLuor 488 and Alexa FLuor 647, respectively, for detection and analysis. The analysis software can use Flowjo (BD) .

[0213] Example 3:

[0214] Firstly, we electrotransformed the vector used for yeast displaying IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 trimer into the EBY100 parental yeast strain. The IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 fusion protein linked to  the Aga2p yeast surface protein can be induced for protein expression and displayed on the yeast surface. Compared with EBY100, the negative control (Figure 2) , we successfully detected the strong positive signal of the human β2m on the surface of the daughter yeast strain that received the vector and expressed pHLA protein by induction (Figure 3) . Similarly, we further detected a substantially higher positive signal of V5 epitope tag on the surface of the daughter yeast strain, as compared to the negative signal from the background (Figure 3) . Because the V5 tag is fused to the C-terminus of the IDH2R140Q-β2m-HLA-B*07: 02 single chain trimer, the successful detection of high expression of V5 directly proves that the entire polypeptide chain of the IDH2R140Q-β2m-HLA-B*07: 02 single chain trimer can be successfully transcribed, translated, and displayed on the yeast surface by the daughter yeast.

[0215] Next, we used gene editing and molecular cloning techniques to cut off the connection between IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 trimer and Aga2p, so that the redesigned vector received by the second type of the daughter yeast can only be used for yeast secreting IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 trimer. It was evident that compared to the first type of the daughter yeast used to display the IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 vector (Figure 3) , the flow cytometric results confirmed that there was almost no fluorescence signal of the human β2m or V5 tag on the surface of the second type of the daughter yeast (Figure 4) . This result indicated that the observation of IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 trimer related signals on the surface of yeast required certain binding relationship between the IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 trimer and the yeast surface protein, including Aga2p.

[0216] Further, we electrotransformed another shuttle vector into the second type of the daughter yeast that had already received the IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 vector for pHLA secretion, allowing the resultant granddaughter yeast strain to display 2Q1 TCRL Fab. Because HC of 2Q1 TCRL Fab functional domain is covalently linked to Aga2p, LC and HC of 2Q1 monoclonal antibody can be associated and displayed on yeast surface through disulfide bonds. Importantly, the IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 trimer, which was originally secreted by the daughter yeast yet undetectable on the cell surface, can be anchored on the cell surface of these granddaughter yeast cells through specific noncovalent binding with TCRL antibodies such as 2Q1. Therefore, the fluorescence signal related to the IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 trimer, such as signals coupled with anti-human β2m or anti-V5 tag antibodies, which was diminished on the second type of daughter yeast, can be rescued and detected on the surface of these granddaughter yeast cells by flow cytometry (Figure 5) .

[0217] Finally, in order to verify that these surface fluorescence signals rescued by 2Q1 TCRL Fab through specific recognition and binding to the secreted IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 trimer, were not false positive signals attributed to surface display of 2Q1 TCRL Fab, we constructed a third type of daughter yeast that only received shuttle vectors for yeast displaying 2Q1 TCRL Fab but not the vector for secreting IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 trimer. It was obvious that the fluorescence signal coupled with the anti-human β2m antibody or anti-V5 tag antibody cannot be detected on the surface of the third type of daughter yeast cell (Figure 6) .

[0218] Example 4:

[0219] To prove the general application of the DOMAINN system, we selected another representative set of TCRL peptide / HLA: MA2-MART1 / HLA-A*02: 01. We observed similar experimental results. Briefly, compared to EBY100, the negative control (Figure 2) , the first type of daughter yeast strain that received the vector for displaying MART1 / HLA-A*02: 01 single chain trimer showed substantially higher positive fluorescence signal coupled with the anti-human β2m or anti-V5 tag antibodies (Figure 7) ; in contrast, neither the second type of the daughter yeast that received vectors for secreting MART1 / HLA-A*02: 01 (Figure 8) , nor the third type of the daughter yeast that received shuttle vectors for displaying MA2 TCRL Fab (Figure 9) showed fluorescence signal related to human β2m or V5 tag on the surface; Importantly, only after receiving both shuttle vectors for displaying MA2 TCRL Fab and vectors for secreting MART1 / HLA-A*02: 01, the granddaughter yeast cell regained the fluorescence signal coupled with anti-human β2m or anti-V5 tag antibodies, despite the detachment of MART1 / HLA-A*02: 01 to Aga2p on the surface of these cells (Figure 10) .

[0220] Example 5:

[0221] In addition, we found that in vectors used for yeast displaying or yeast secreting pHLA, the order of the heavy and light chain genes of HLA within the open reading frame does not affect the display or indirect capture of pHLA on the yeast cell surface. For example, after the exchange of heavy and light chain genes of HLA-B*07: 02 or HLA-A*02: 01, the substantially high positive fluorescence signals coupled with anti-human β2m antibody remained on the surface of first type of daughter yeast that received the correspondingly redesigned vectors (Figure 11) ; whereas the negative result remained on the surface of second type of daughter yeast that received vectors for yeast secreting IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 or MART1 / HLA-A*02: 01 single chain trimer (Figure 12) ;  Consistent with the aforementioned rescuing, only after receiving both shuttle vectors for displaying 2Q1 TCRL Fab or MA2 TCRL Fab, and the vectors for yeast secreting IDH2R140Q / HLA-B*07: 02 or MART1 / HLA-A*02: 01, respectively, the granddaughter yeast cell regained anti-human β2m fluorescence signal (Figure 13) .

[0222] It is worth noticing that the recovered fluorescence signal is largely related to the affinity between TCRL and pHLA, so relatively weak β2m or V5 signal (Figure 5 vs Figure 3, or Figure 10 vs Figure 7, or Figure 13 vs Figure 11) set the groundwork for selecting high affinity TCRL using DOMAINN system in the future. Therefore, the DOMAINN system will play an important role in the development of precision immunotherapeutics targeting neoantigens.

[0223] References

[0224] Jiang, W., &Boder, E.T. (2010) . High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC. Proc Natl Acad Sci U S A, 107 (30) , 13258-13263.

[0225] Liu, R., Jiang, W., &Mellins, E.D. (2021) . Yeast display of MHC-II enables rapid identification of peptide ligands from protein antigens (RIPPA) . Cell Mol Immunol, 18 (8) , 1847-1860.

[0226] Sequence listing

Claims

1.A cell comprising a protein complex, a single chain peptide fragment, and a protein scaffold,wherein the protein complex comprises an α chain and a β chain,the single chain peptide fragment can specifically bind to a given structural region formed by the α chain and the β chain of the protein complex, thereby forming a peptide / αβ complex trimer comprising the single chain peptide fragment, the α chain and the β chain,the protein scaffold associates with the peptide / αβ complex trimer by specifically recognizing a shared binding surface of the trimer, thereby constituting a multimer of protein scaffold / peptide / αβ complex,wherein the shared binding surface of the trimer is a surface where the single chain peptide fragment binds to the α chain and the β chain of the protein complex.2.The cell according to claim 1, whereinthe single chain peptide fragment is covalently bound to the α chain or the β chain,preferably the protein scaffold is non-covalently bound to the shared binding surface, andfurther preferably the single chain peptide fragment is covalently bound to the β chain.3.The cell according to claim 1 or 2, whereinthe α chain is covalently bound to the β chain;preferably the protein scaffold is selected from the group consisting of: antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors, Darpin, or conjugates comprising any of the above structures;further preferably the antibody or antigen binding fragment is an antibody fragment, more preferably an antibody fragment lacking at least the Fc domain; particularly the fragment is or comprises (Fab') 2 fragment, Fab' fragment or Fab fragment, VhH fragment, scFv fragment, scFv Fc fragment or micro antibody, more particularly Fab fragment.4.The cell according to any one of claims 1-3, wherein the cell is a yeast cell.5.The cell according to claim 1, wherein the protein scaffold and a molecule on the surface of the cell are covalently fused and attached to the surface of the cell.6.The cell according to claim 5, wherein the peptide / αβ complex trimer attaches to the molecule on the cell surface by non-covalently binding to the protein scaffold.7.The cell according to claim 5 or 6, wherein the molecule is a protein.8.The cell according to claim 7, wherein the protein is endogenous to the cell.9.The cell according to claim 8, wherein the protein is selected from Aga2p, a-lectin, α-lectin, flocculant, Cwp1p, Cwp2p, or Tip1p.10.The cell according to claim 9, wherein the protein is Aga2p.11.The cell according to claim 9, wherein the amino acid sequence of the Aga2p is represented by SEQ ID NO: 1.12.The cell according to claim 1, wherein the single chain peptide fragment is an MHC epitope peptide, preferably a tumor related or specific antigen peptide fragment, preferably a peptide fragment of 5-100 amino acids in length, more preferably a peptide fragment of 7-50 amino acids in length, and further preferably a peptide fragment of 8-30 amino acids in length.13.The cell according to claim 12, wherein the amino acid sequence of the single chain peptide fragment is represented by any one of SEQ ID NOs: 2-6.14.The cell according to claim 1, wherein the α chain and the β chain are separate chains or domains of MHC class I molecules or MHC class II molecules, preferably the α chain and the β chain are separate chains or domains of HLA class I molecules or HLA class II molecules.15.The cell according to claim 14, whereinthe α chain is encoded by HLA-A*02 or other alleles of family HLA-A, and the β chain is encoded by B2M gene; orthe α chain is encoded by HLA-B*07 or other alleles of family HLA-B, and the β chain is encoded by B2M gene; orthe α chain is encoded by HLA-C*01 or other alleles of family HLA-C, and the β chain is encoded by B2M gene; orthe α chain is encoded by HLA-DRA*01 or other alleles of family HLA-DRA, and the β chain is encoded by HLA-DRB1*01 or other alleles of family HLA-DRB; orthe α chain is encoded by HLA-DQA1*01 or other alleles of family HLA-DQA1, and the β chain is encoded by HLA-DQB1*06 or other alleles of family HLA-DQB1; orthe α chain is encoded by HLA-DPA1*01: 03 or other alleles of family HLA-DPA1, and the β chain is encoded by HLA-DPB1*04: 01 or other alleles of family HLA-DPB1.16.A nucleic acid encoding a peptide / αβ complex trimer, wherein the peptide / αβ complex trimer comprises a protein complex and a single chain peptide fragment, and the protein complex comprises an α chain and a β chain, andthe single chain peptide fragment can specifically bind to a given structural region formed by the α chain and the β chain of the protein complex, thereby forming a peptide / αβ complex trimer comprising the single chain peptide fragment, the α chain and the β chain.17.The nucleic acid according to claim 16, wherein the peptide / αβ complex trimer encoded by the nucleic acid is the peptide / αβ complex trimer involved in any one of claims 1-15.18.A nucleic acid encoding a protein scaffold, wherein the protein scaffold is selected from the group consisting of: antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors, Darpin, or conjugates comprising any of the above structures;preferably the antibody or antigen binding fragment is an antibody fragment, more preferably an antibody fragment lacking at least the Fc domain; particularly the fragment is or comprises (Fab') 2 fragment, Fab' fragment or Fab fragment, VhH fragment, scFv fragment, scFv Fc fragment, or micro antibody, more particularly Fab fragment, andthe protein scaffold can specifically bind to the peptide / αβ complex trimer encoded by the nucleic acid according to claim 16 or 17 on a shared binding surface of the trimer, thereby forming a multimer of protein scaffold / peptide / αβ complex.19.A nucleic acid combination comprising:a nucleic acid encoding a peptide / αβof complex trimer; anda nucleic acid encoding a protein scaffold, whereinthe peptide / αβ complex trimer comprises a protein complex and a single chain peptide fragment, the protein complex comprises an α chain and a β chain, and the single chain peptide fragment can specifically bind to a given structural region formed by the α chain and the β chain of the protein complex, thereby forming a peptide / αβ complex trimer comprising the single chain peptide fragment, the α chain and the β chain; andthe protein scaffold can specifically bind to the peptide / αβ complex trimer on a shared binding surface of the trimer, thereby forming a multimer of protein scaffold / peptide / αβ complex.20.The nucleic acid combination according to claim 19, whereinthe peptide / αβ complex trimer encoded is the peptide / αβ complex trimer involved in any one of claims 1-15; orthe protein scaffold is selected from the group consisting of: antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors, Darpin, or conjugates comprising any of the above structures;preferably the antibody or antigen binding fragment is an antibody fragment, more preferably an antibody fragment lacking at least the Fc domain; particularly the fragment is or comprises (Fab') 2 fragment, Fab' fragment or Fab fragment, VhH fragment, scFv fragment, scFv Fc fragment, or micro antibody, more particularly Fab fragment.21.A method for preparing a peptide / αβ complex trimer, comprising:transforming cells by using the nucleic acid according to claim 16 or 17, or the nucleic acid combination according to claim 19 or 20; andculturing the cells under the condition that is optimized for expressing the peptide / αβ complex trimer involved in any one of claims 1-15.22.A method for preparing a protein scaffold, comprising:transforming cells by using the nucleic acid according to claim 18, or the nucleic acid combination according to claim 19 or 20, andculturing the cells under the condition that is optimized for expressing the protein scaffold involved in any one of claims 1-15.23.The method according to claim 21 or 22, wherein the cell is a yeast cell.24.A method for characterizing and determining a protein scaffold binding to a peptide / αβ complex trimer, comprising:i) enabling the cell according to any one of claims 1-15 to display a protein scaffold library, andii) characterizing the peptide / αβ complex trimer on the surface of single clones in a cell library displaying protein scaffold variants, thereby determining the protein scaffold binding to a peptide / αβcomplex trimer.25.The method according to claim 24, wherein the protein scaffold is selected from the group consisting of: antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors, Darpin, or conjugates comprising any of the above structures.26.The method according to claim 24 or 25, wherein the protein scaffold is non-covalently bound to the peptide / αβ complex trimer.27.A method for screening and identifying a potential target protein scaffold, comprising:i) enabling the cell according to any one of claims 1-15 to display a potential target protein scaffold library, andii) detecting the peptide / αβ complex trimer on the surface of single clones in a cell library displaying protein scaffold variants, thereby screening and identifying the protein scaffold binding to a peptide / αβ complex trimer.28.The method according to claim 27, wherein the target protein scaffold is a drug molecule or functional biomolecule, preferably the drug molecule or functional biomolecule is selected from the group consisting of: antibodies, antigen binding fragments, proteins or their functional fragments, antigens or antigenic determinants, peptides, receptors or their fragments, receptor ligands, growth factors, Darpin, or conjugates comprising any of the above structures.29.The method according to claim 27 or 28, wherein the protein scaffold is non-covalently bound to the peptide / αβ complex trimer.30.Use of the cell according to any one of claims 1-15 for characterizing, determining, screening, or identifying drug molecules or functional biomolecules.

Images