AAV variants and uses thereof

Abstract

Provided is a variant AAV capsid protein, comprising one or more modifications. The modification comprises an insertion of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10091, and SEQ ID NOs: 20202-35556, or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10091, and SEQ ID NOs: 20202-35556. A polynucleotide, a host cell, a vector, an AAV virion and a pharmaceutical composition thereof are also provided. Further provided is a method of treating disease. The method comprises administering to a subject in need thereof an effective amount of the recombinant AAV virion.

Description

AAV VARIANTS AND USES THEREOFTECHNICAL FIELD

[0001] The present disclosure generally relates to variants of AAV capsid protein, especially refers to AAV capsid variants, and the uses thereof.BACKGROUND

[0002] Adeno-associated virus (AAV) belongs to the Parvoviridae family and Dependovirus genus, whose members require co-infection with a helper virus such as adenovirus to promote replication, and AAV establishes a latent infection in the absence of a helper. Virions are composed of a 25 nm icosahedral capsid encompassing a 4.7 kb single-stranded DNA genome with two open reading frames: rep and cap. The non-structural rep gene encodes four regulatory proteins essential for viral replication, whereas cap encodes three structural proteins (VP1-3) that assemble into a 60-mer capsid shell. This viral capsid mediates the ability of AAV vectors to overcome many of the biological barriers of viral transduction-including cell surface receptor binding, endocytosis, intracellular trafficking, and unpackaging in the nucleus. AAV-based gene therapies have the potential to become promising treatments for many diseases. However, low transduction efficiency in certain tissues is a technical hurdle to the clinical use of AAV-based gene therapy in many situations.

[0003] To date, there remains a need for developing AAV-mediated gene delivery systems that have enhanced tissue transduction.SUMMARY

[0004] The present invention provides a variant AAV capsid protein comprising one or more modificatons, the modification comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10091, and SEQ ID NOs: 20202-35556, or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10091, and SEQ ID NOs: 20202-35556.

[0005] In one specific embodiment, the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-I, VR-II, VR-III, VR-IV, VR-V, VR-VI, VR-VII, VR-VIII or VR-IX of the parental capsid protein.

[0006] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-I of the parental capsid protein.

[0007] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-II of the parental capsid protein.

[0008] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-III of the parental capsid protein.

[0009] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any twoamino acids in VR-IV of the parental capsid protein.

[0010] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-V of the parental capsid protein.

[0011] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-VI.

[0012] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-VII of the parental capsid protein.

[0013] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-VIII of the parental capsid protein.

[0014] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-IX of the parental capsid protein.

[0015] In one specific embodiment, the sequence is incorporated between any two amino acids in  (i) QISSQSGASN of the VR-I, NDGTT of the VR-II, LNNGSQAVG of the VR-III,  NTPSGTTTQSRLQFSQAGAS of the VR-IV, RVSKTSADNNNSEYSWTGA of the VR-V, SHKDDEEKFFPQSGVLI of the VR-VI, KQGSEKTNVDIEK of the VR-VII, VSTNLQRGNRQAATAD of the VR-VIII or YNKSVNVD of the VR-IX of the parental AAV2 capsid protein; (ii) QISSQSGASN of the VR-I, NDGTT of the VR-II, LNNGSQAVG of the VR-III,  QGTFSGTTNQSRLLFSQAGPQ of the VR-IV, RLSKTANDNNNSNFPWTAA of the VR-V, SHKDDEEKFFPMHGNLI of the VR-VI, KEGTTASNAELDN of the VR-VII, VANNLQSSNTAPTTRT of the VR-VIII or YNKSVNVD of the VR-IX of the parental AAV3b capsid protein; (iii) EIKSGSVDGSN of the VR-I, QDSTF of the VR-II, LNRDNTENPTE of the VR-III, NNTGGVQFNKNLAG  of the VR-IV, GWNLGSGVNRASVSAFATT of the VR-V, TNNLQGSNTYALENTMI of the VR-VI, SQPANPGTTATYLEGN of the VR-VII, MATNNQSSTTAP of the VR-VIII or YNDPQFVD of the VR-IX of the parental AAV5 capsid protein; (iv) QISSASTGASN of the VR-I, NDGVT of the VR-II, LNNGSQAVG of the VR-III,  QNQSGSAQNKDLLFSRGSPA of the VR-IV, RVSKTKTDNNNSNFTWTGA of the VR-V, SHKDDKDKFFPMSGVMI of the VR-VI, KESAGASNTALDN of the VR-VII, VAVNLQSSSTDPATGD of the VR-VIII or YAKSANVD of the VR-IX of the parental AAV6 capsid protein; (v) QISNGTSGGATN of the VR-I, NEGTK of the VR-II, LNNGSQAVG of the VR-III,  QTTGGTANTQTLGFSQGGPN of the VR-IV, RVSTTTGQNNNSNFAWTAG of the VR-V, THKDDEERFFPSNGILI of the VR-VI, KQNAARDNADYSD of the VR-VII, VADNLQQQNTAPQIGT of the VR-VIII or YYKSTSVD of the VR-IX of the parental AAV8 capsid protein; or (vi) QISNSTSGGSSN of the VR-I, NNGVK of the VR-II, LNDGSQAVG of the VR-III,  INGSGQNQQTLKFSVAGPS of the VR-IV, RVSTTVTQNNNSEFAWPGA of the VR-V, SHKEGEDRFFPLSGSLI of the VR-VI, KQGTGRDNVDADK of the VR-VII, VATNHQSAQAQAQTGW of the VR-VIII or YYKSNNVE of the VR-IX of the parental AAV9 capsid protein.

[0016] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QISSQSGASN of the VR-I of the parental AAV2 capsid protein.

[0017] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in NDGTT of the VR-I1 of the parental AAV2 capsid protein.

[0018] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in LNNGSQAVG of the VR-III of the parental AAV2 capsid protein.

[0019] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in NTPSGTTTQSRLQFSQAGAS of the VR-IV of the parental AAV2 capsid protein.

[0020] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in RVSKTSADNNNSEYSWTGA of the VR-V of the parental AAV2 capsid protein.

[0021] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in SHKDDEEKFFPQSGVLI of the VR-VI of the parental AAV2 capsid protein.

[0022] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in KQGSEKTNVDIEK of the VR-VII of the parental AAV2 capsid protein.

[0023] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VSTNLQRGNRQAATAD of the VR-VIII of the parental AAV2 capsid protein.

[0024] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in YNKSVNVD of the VR-IX of the parental AAV2 capsid protein.

[0025] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QISSQSGASN of the VR-I of the parental AAV3b capsid protein.

[0026] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in NDGTT of the VR-II of the parental AAV3b capsid protein.

[0027] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in LNNGSQAVG of the VR-III of the parental AAV3b capsid protein.

[0028] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QGTTSGTrNQSRLLFSQAGPQ of the VR-IV of the parental AAV3b capsid protein.

[0029] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in RLSKTANDNNNSNFPWTAA of the VR-V of the parental AAV3b capsid protein.

[0030] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in SHKDDEEKFFPMHGNLI of the VR-VI of the parental AAV3b capsid protein.

[0031] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in KEGTTASNAELDN of the VR-VII of the parental AAV3b capsid protein.

[0032] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VANNLQSSNTAPTTRT of the VR-VIII of the parental AAV3b capsid protein.

[0033] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in YNKSVNVD of the VR-IX of the parental AAV3b capsid protein.

[0034] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in EIKSGSVDGSN of the VR-I of the parental AAV5 capsid protein.

[0035] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QDSTT of the VR-II of the parental AAV5 capsid protein.

[0036] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in LNRDNTENPTE of the VR-III of the parental AAV5 capsid protein.

[0037] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two ammo acids in NNTGGVQFNKNLAG of the VR-IV of the parental AAV5 capsid protein.

[0038] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in GWNLGSGVNRASVSAFATT of the VR-V of the parental AAV5 capsid protein.

[0039] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in TNNLQGSNTYALENTMI of the VR-VI of the parental AAV5 capsid protein.

[0040] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in SQPANPGTTATYLEGN of the VR-VII of the parental AAV5 capsid protein.

[0041] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in MATNNQSSTTAP of the VR-VIII of the parental AAV5 capsid protein.

[0042] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in YNDPQFVD of the VR-IX of the parental AAV5 capsid protein.

[0043] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QISSASTGASN of the VR-I of the parental AAV6 capsid protein.

[0044] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in NDGVT of the VR-II of the parental AAV6 capsid protein.

[0045] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in LNNGSQAVG of the VR-III of the parental AAV6 capsid protein.

[0046] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QNQSGSAQNKDLLFSRGSPA of the VR-IV of the parental AAV6 capsid protein.

[0047] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in RVSKTKTDNNNSNFTWTGA of the VR-V of the parental AAV6 capsid protein.

[0048] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in SHKDDKDKFFPMSGVMI of the VR-VI of the parental AAV6 capsid protein.

[0049] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in KESAGASNTALDN of the VR-VII of the parental AAV6 capsid protein.

[0050] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VAVNLQSSSTDPATGD of the VR-VIII of the parental AAV6 capsid protein.

[0051] In one specific embodiment the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in YAKSANVD of the VR-IX of the parental AAV6 capsid protein.

[0052] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QISNGTSGGATN of the VR-I of the parental AAV8 capsid protein.

[0053] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in NEGTK of the VR-II of the parental AAV8 capsid protein.

[0054] In one specific embodiment, the variant AAV capsid, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in LNNGSQAVG of the VR-III of the parental AAV8 capsid protein.

[0055] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QTTGGTANTQTLGFSQGGPN of the VR-IV of the parental AAV8 capsid protein.

[0056] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in RVSTTTGQNNNSNFAWTAG of the VR-V of the parental AAV8 capsid protein.

[0057] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in THKDDEERFFPSNGILI of the VR-VI of the parental AAV8 capsid protein.

[0058] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in KQNAARDNADYSD of the VR-VII of the parental AAV8 capsid protein.

[0059] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VADNLQQQNTAPQIGT of the VR-VIII of the parental AAV8 capsid protein.

[0060] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in YYKSTSVD of the VR-IX of the parental AAV8 capsid protein.

[0061] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QISNSTSGGSSN of the VR-I of the parental AAV9 capsid protein.

[0062] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in NNGVK of the VR-II of the parental AAV9 capsid protein.

[0063] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in LNDGSQAVG of the VR-III of the parental AAV9 capsid protein.

[0064] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in INGSGQNQQTLKFSVAGPS of the VR-IV of the parental AAV9 capsid protein.

[0065] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in RVSTTVTQNNNSEFAWPGA of the VR-V of the parental AAV9 capsid protein.

[0066] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in SHKEGEDRFFPLSGSLI of the VR-VI of the parental AAV9 capsid protein.

[0067] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in KQGTGRDNVDADK of the VR-VII of the parental AAV9 capsid protein.

[0068] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VATNHQSAQAQAQTGW of the VR-VIII of the parental AAV9 capsid protein.

[0069] In one specific embodiment, the variant AAV capsid protein, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in YYKSNNVE of the VR-IX of the parental AAV9 capsid protein.

[0070] The present invention provides a variant AAV2 capsid protein comprising one or more modificatons, the modification comprises a first sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10091; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10091.

[0071] In one specific embodiment, RGNRQA of the parental AAV capsid protein is substituted with the first sequence.

[0072] In one specific embodiment, the parental AAV capsid protein comprises SEQ ID NO: 20186.

[0073] In another aspect, the present invention provides a variant adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) capsid protein comprising a second sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20202-35556; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20202-35556.

[0074] In one specific embodiment, the amino acid sequence at position 586-588 of the parental AAV capsid protein is substituted with the second sequence.

[0075] In one specific embodiment, the parental AAV capsid protein comprises SEQ ID NO: 50921.

[0076] In another aspect, the present invention provides an isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence that encodes above variant AAV2 capsid protein or variant AAV9 capsid protein.

[0077] In one specific embodiment, the present invention provides an isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 10092-20182 and SEQ ID NOs: 35557-50911; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 10092-20182 and SEQ ID NOs: 35557-50911.

[0078] In another aspect, the present invention provides an isolated, genetically modified host cell comprising the above polynucleotide.

[0079] In another aspect, the present invention provides a recombinant AAV virion comprising above variant AAV2 capsid protein or variant AAV9 capsid protein.

[0080] In one specific embodiment, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising: a) a recombinant AAVvirion disclosed in the present invention; and b) a pharmaceutically acceptable excipient.

[0081] In another aspect, the present invention provides a recombinant AAV vector, comprising polynucleotide encoding a variant AAV2 capsid protein or variant AAV9 capsid protein of invention, and an AAV 5’ inverted terminal repeat (ITR) , an engineered nucleic acid sequence encoding a functional gene product, a regulatory sequence which directs expression of the gene product in a target cell, and an AAV 3’ ITR.

[0082] In another aspect, the present invention also provides a method of delivering a nucleic acid vector encoding a functional gene product to cells and / or tissues with a recombinant AAV virion or recombinant AAV vector of the present invention.

[0083] In one specific embodiment, the present invention also provides the use of a recombinant AAV virion or recombinant AAV vector of the present invention in the preparation of product for delivering a nucleic acid vector encoding a functional gene product to cells and / or tissues.

[0084] In another aspect, the present invention also provides a method of treating disease, the method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a recombinant AAV virion of present invention, the recombinant AAV virion comprises functional gene product.

[0085] In one specific embodiment, the present invention also provides the use of a recombinant AAV virion or recombinant AAV vector of the present invention in the preparation of product for treating disease to a subject in need thereof; preferably, the disease is selected from the group consisting of liver disease, central nervous system diseases, and other diseases.

[0086] In one specific embodiment, the gene product is a polypeptide. INCORPORATION BY REFERENCE:

[0087] All publications, literature, patents, and patent applications mentioned in this disclosure, including in all tables and figures, are herein incorporated by reference as if each individual publication, patent, or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference.

[0088] For illustrative purposes, the principles of the present invention are described by referencing various exemplary embodiments. Although certain embodiments of the invention are specifically described herein, one of ordinary skill in the art will readily recognize that the same principles are equally applicable to, and can be employed in other systems and methods. Before explaining the disclosed embodiments of the present invention in detail, it is to be understood that the invention is not limited in its application to the details of any particular embodiment shown. Additionally, the terminology used herein is for the purpose of description and not of limitation. Furthermore, although certain methods are described with reference to steps that are presented herein in a certain order, in many instances, these steps may be performed in any order as may be appreciated by one skilled in the art; the novel method is therefore not limited to the particular arrangement of steps disclosed herein.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0089] FIG. 1. shows AAV2 library screening workflow.

[0090] FIG. 2. 2A-2D. AAV library design. FIG. 2A: Library #1. FIG. 2B: Library #2. FIG. 2C: Library #3. FIG. 2D: Library#4. ITR: inverted terminal repeat; p41: AAV5 p41 promoter; X: any amino acid; pA: poly A signal.

[0091] FIG. 3. AAV9 library screening workflow.DETAILED DESCRIPTION

[0092] The present disclosure provides variant adeno-associated virus serotype 2 (AAV2) capsid proteins and recombinant AAV2 particles comprising the variant AAV2 capsid proteins. The present disclosure describes that various variant AAV2 capsid proteins and recombinant AAV2 particles comprising these variant AAV2 capsid proteins have an increased tropism for eye tissue (s) relative to the wild-type counterpart.

[0093] The present disclosure provides variant adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) capsid proteins and recombinant AAV9 particles comprising the variant AAV9 capsid proteins. The present disclosure describes that various variant AAV9 capsid proteins and recombinant AAV9 particles comprising these variant AAV9 capsid proteins have an increased tropism for muscle tissue (s) relative to the wild-type counterpart.

[0094] The present disclosure also provides pharmaceutical compositions comprising the recombinant AAV2 or AAV9 particles, polynucleotides encoding the variant AAV2 or AAV9 capsid proteins, vectors and host cells comprising the polynucleotides, populations of cells transduced by the recombinant AAV2 or AAV9 particles, as well as various methods using the recombinant AAV2 or AAV9 particles. Definition

[0095] As used herein, the singular form ″a″ , ″an″ and ″the″ include plural references unless the context clearly dictates otherwise. For example, the term “a substitution″ or “at least one substitution ″ may include a plurality of substitutions, and the term “a domain” or “the domain” may include a plurality of domains.

[0096] As used herein, the term “about” or “approximately” refers to a quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight, or length that varies by as much as 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1%to a reference quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight, or length. In particular embodiments, the terms “about” or “approximately” when preceding a numerical value indicates the value plus or minus a range of 15%, 10%, 5%, or 1%.

[0097] As used herein, the terms ″comprise” , ″comprises” , and “comprising” , mean to imply the inclusion of a stated step or element or group of steps or elements, but not the exclusion of any other step or element or group of steps or elements. For example, “a variant comprises a substitution” may include further substitutions.

[0098] Reference throughout this disclosure to “one embodiment, ” “an embodiment, ” “some embodiment” , “a particular embodiment, ” “a related embodiment, ” “a certain embodiment, ” “an additional embodiment, ” or “a further embodiment, ” or combinations thereof means that a particular feature, structure, or characteristic described in connection with the embodiment is included in at least one embodiment of the present disclosure. Thus, the appearances of the foregoing phrases in various places throughout this specification are not necessarily all referring to the same embodiment. Furthermore, the particular features, structures, or characteristics may be combined in any suitable manner in one or more embodiments.

[0099] ″AAV″ is an abbreviation for adeno-associated virus, and may be used to refer to the virus itself or derivatives thereof. The term covers all subtypes and both naturally occurring and recombinant forms, except where required otherwise. The abbreviation ″rAAV″refers to recombinant adeno-associated virus, also referred to as a recombinant AAV vector (or ″rAAV vector″) . The term “AAV″includes AAV type 1 (AAV-1) , AAV type 2 (AAV-2) , AAV type 3 (AAV-3) , AAV type 4 (AAV-4) , AAV type 5 (AAV-5) , AAV type 6 (AAV-6) , AAV type 7 (AAV-7) , AAVtype 8 (AAV-8) , AAV type 9 (AAV-9) , AAV type 10 (AAV-10) , AAV type 11 (AAV-1 1) , AAV type 12 (AAV-12) , AAV type 13 (AAV-13) avian AAV, bovine AAV, canine AAV, equine AAV, primate AAV, non-primate AAV, and ovine AAV. See, e.g., Mori et al. (2004) Virology 7 P240764WO1 330: 375. The term “AAV” also includes chimeric AAV. “Primate AAV″refers to AAV isolated from a primate. ″non-primate AAV″refers to AAV isolated from a non-primate mammal, ″bovine AAV″refers to AAV isolated from a bovine mammal (e.g., a cow) , etc.

[0100] AAV ″rep″ and ″cap″ genes refer to polynucleotide sequences encoding replication and encapsidation proteins of adeno-associated virus. AAV rep and cap are referred to herein as AAV ″packaging genes. ″

[0101] The term ″inserted sequence″ is used below to describe a peptide that is inserted into a parental AAV capsid. In some cases, the insertion peptide has a length of from 7 amino acids to 20 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of from 7 amino acids to 18 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of from 7 amino acids to 16 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of from 7 amino acids to 10 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of from 7 amino acids to 12 amino acids. The insertion peptide has a length of 7 amino acids, 8 amino acids, 9 amino acids, 10 amino acids, 11 amino acids, 12 amino acids, 13 amino acids, 14 amino acids, 15 amino acids, 16 amino acids, 17 amino acids, 18 amino acids, 19 amino acids, or 20 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 7 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 8 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 9 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 10 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 11 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 12 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 13 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 14 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 15 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 16 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 17 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 18 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 19 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 20 amino acids.

[0102] In some cases, the insertion peptide has a length of from 4 amino acids to 20 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of from 4 amino acids to 18 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of from 4 amino acids to 16 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of from 4 amino acids to 14 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of from 4 amino acids to 12 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of from 4 amino acids to 10 amino acids. The insertion peptide has a length of 4 amino acids, 5 amino acids, 6 amino acids, 7 amino acids, 8 amino acids, 9 amino acids, 10 amino acids, 11 amino acids, 12 amino acids, 13 amino acids, 14 amino acids, 15 amino acids, 16 amino acids, 17 amino acids, 18 amino acids, 19 amino acids, or20 amino acids.

[0103] The term ″amino acid″ as used herein refers to any organic compound that contains an amino group (-NH2) and a carboxyl group (-COOH) , preferably either as free groups or altematively after condensation as part of peptide bonds. The ″twenty naturally encoded polypeptide-forming alpha-amino acids″are understood in the art and refer to: alanine (ala or A) , arginine (arg or R) , asparagine (asn or N) , aspartic acid (asp or D) , cysteine (cys or C) , gluatamic acid (glu or E) , glutamine (gin or Q) , glycine (gly or G) , histidine (his or H) , isoleucine (ile or I) , leucine (leu or L) , lysine (lys or K) , methionine (met or M) , phenylalanine (phc or F) , proline (pro or P) , serine (set or S) , threonine (thr or T) , tryptophan (tip or W) , tyrosine (tyr or Y) , and valine (val or V) .

[0104] The term “peptide” typically refers to short polypeptides. The term “protein” typically refers to longer polypeptides. The left-hand end of a polypeptide sequence is usually described as the amino-terminus (N-terminus) ; and the right-hand end of a polypeptide sequence is usually described as the carboxyl-terminus (C-terminus) .

[0105] The term “substitution” with regard to amino acid residue as used herein refers to naturally occurring or induced replacement of one or more amino acids with another in a peptide, polypeptide, or protein. Substitution in a polypeptide may result in diminishment, enhancement, or elimination of the polypeptide’s function.

[0106] The term ″binding″as used herein refers to interaction of a binding domain with an antigen with the interaction depending upon the presence of a particular structure (e.g., an antigenic determinant or epitope) on the antigen. For example, an antibody variable region or Fy recognizes and binds to a specific protein structure rather than to proteins generally. As used herein, the term ″specifically binding″ or ″binding specifically″ means that a binding domain binds to or associates with more frequently, more rapidly, with greater duration and / or with greater affinity with a particular antigen than with other proteins. For example, an antibody variable region or Fy specifically binds to its antigen with greater affinity, avidity, more readily, and / or with greater duration than it binds to other antigens. For another example, an antibody variable region or Fy binds to a cell surface protein (antigen) with materially greater affinity than it does to related proteins or other cell surface proteins or to antigens commonly recognized by polyreactive natural antibodies (i.e., by naturally occurring antibodies known to bind a variety of antigens naturally found in humans) . However, ″specifically binding″does not necessarily require exclusive binding or non-detectable binding of another antigen, this is meant by the term ″selective binding″.

[0107] The term “affinity” as used herein refers to the strength of the sum total of noncovalent interactions between a single binding site of a molecule (e.g., an antibody) and its binding partner (e.g., an antigen) . Unless indicated otherwise, as used herein, “binding affinity” refers to intrinsic binding affinity which reflects a i: 1 interaction between members of a binding pair (e.g., antibody and antigen) . The affinity of a molecule X for its partner Y can generally be represented by the dissociation constant (Kd) .

[0108] The term “identity, ” as used herein, refers to a relationship between the sequences of two or more polypeptide molecules or two or more nucleic acid molecules, as determined by aligning and comparing the sequences. “Percent identity” means the percent of identical residues between the amino acids or nucleotides in the compared molecules and is calculated based on the size of the smallest of the molecules being compared. For these calculations, gaps in alignments (if any) are preferably addressed by a particular mathematical model or computer program (i.e., an “algorithm” ) . Methods that can be used to calculate the identity of the aligned nucleic acids or polypeptides include those described in Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M., ed. ) , 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D.W., ed. ) , 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds. ) , 1994, New Jersey: Humana Press; yon Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds. ) , 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al, 1988, SIAMJ. Applied Math. 48: 1073.

[0109] The term “vector” as used herein refers to a nucleic acid molecule capable of propagating another nucleic acid to which it is linked. The term includes the vector as a self-replicating nucleic acid structure as well as the vector incorporated into the genome of a host cell into which it has been introduced. Certain vectors are capable of directing the expression of nucleic acids to which they are operatively linked. Such vectors are referred to herein as “expression vectors.”

[0110] The terms “host cell, ” “host cell line, ” and “host cell culture” as used herein are used interchangeably and refer to cells into which exogenous nucleic acid has been introduced, including the progeny of such cells.

[0111] As used herein, the term “subject” is used interchangeably with “patient” and may be a mammal who is in need of prevention or treatment of cancer, such as primates (for example, humans) , companion animals (for example, dogs and cats) , livestock (for example, cows, pigs, horses, sheep, and goats) , and laboratory animals (for example, rats, mice, and guinea pigs) . In an embodiment of the present disclosure, the subject is a human.

[0112] As used herein, the term “treatment” generally means obtaining a desired pharmacological and / or physiological effect. The effect may be therapeutic in terms of partially or completely curing a disease and / or adverse effect attributed to the disease. Desirable therapeutic effects include, but are not limited to, prevention of onset or recurrence of disease, alleviation of symptoms, diminishment of any direct or indirect pathological consequences of the disease, prevention of metastasis, decreasing the rate of disease progression, amelioration or slowing of the disease state, and remission or improved prognosis. Preferably, the “treatment” may refer to medical intervention ofa disease or disorder that has already developed.

[0113] As used herein, the term “prevention” relates to a prophylactic treatment, that is, to a measure or procedure, the purpose of which is to prevent, rather than to cure a disease. “Prevention” means that a desired pharmacological and / or physiological effect is obtained which is prophylactic in terms of completely or partially preventing a disease or symptom thereof. As used herein, “preventing or treating cancer” may include inhibiting proliferation, survival, metastasis, recurrence, or therapy resistance of cancer. Such a method may comprise a step of administering the immune cells of the present disclosure to a subject in need of prevention or treatment of cancer. Accordingly, there is provided a use of a composition that comprises the immune cells as an active ingredient, for preventing or treating cancer.

[0114] As used herein, the term “administration” means providing a substanceto a subject to achieve a prophylactic or therapeutic purpose (for example, prevention or treatment of cancer) .

[0115] As used herein, the term “cancer” refers to a physiological condition that is typically characterized by unregulated cell growth in mammals. The cancer to be prevented or treated in the present disclosure may include, depending on the site of occurrence, colorectal cancer, small intestine cancer, rectal cancer, colon cancer, thyroid cancer, endocrine adenocarcinoma, oral cancer, tongue cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, esophageal cancer, cervical cancer, uterine cancer, fallopian tube cancer, ovarian cancer, brain cancer, head and neck cancer, lung cancer, lymph gland cancer, gallbladder cancer, bladder cancer, kidney cancer, liver cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, skin cancer (or melanoma) , breast cancer, stomach cancer, bone cancer, blood cancer, and the like. However, any cancer can be included therein as long as it expresses an antigen protein on the surface of cancer cells. In an embodiment, the cancer may include at least any one selected from the group consisting of optionally colorectal cancer, rectal cancer, colon cancer, thyroid cancer, oral cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, cervical cancer, brain cancer, lung cancer, ovarian cancer, bladder cancer, kidney cancer, liver cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, skin cancer, tongue cancer, breast cancer, uterine cancer, stomach cancer, bone cancer, and blood cancer. In another embodiment, the cancer may be a solid cancer.

[0116] The term “pharmaceutically acceptable, ” as used herein, means that the vehicle, diluent, excipient and / or salts thereof, are chemically and / or physically is compatible with other ingredients in the formulation, and the physiologically compatible with the recipient.

[0117] As used herein, the term “a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient” refers to a carrier and / or excipient pharmacologically and / or physiologically compatible with a subject and an active agent, which is well known in the art (see, e.g., Remington′s Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995) , and includes, but is not limited to pH adjuster, surfactant, adjuvant and ionic strength enhancer. For example, the pH adjuster includes, but is not limited to, phosphate buffer; the surfactant includes, but is not limited to, cationic, anionic, or non-ionic surfactant, e.g., Tween-80; the ionic strength enhancer includes, but is not limited to, sodium chloride.

[0118] The term “therapeutically effective amount” of a therapeutic agent or treatment is meant a sufficient amount of the therapeutic agent or treatment to have a therapeutic effect in the subject treated, at a reasonable benefit / risk ratio applicable to any medical treatment. It will be understood, however, that the total daily usage of the therapeutic agent or treatment will be decided by the attending physician within the scope of sound medical judgment. The specific therapeutically effective dose level for any particular patient will depend upon a variety of factors including the disorder being treated and the severity of the disorder; activity of the specific antibody employed; the specific composition employed, the age, body weight, general health, sex and diet of the patient; the time of administration, route of administration, and rate of excretion of the specific antibody employed; the duration of the treatment; drugs used in combination or coincidental with the specific antibody employed; and like factors well known in the medical arts. For example, it is well known within the skill of the art to start doses of the compound at levels lower than those required to achieve the desired therapeutic effect and to gradually increase the dosage until the desired effect is achieved. EXAMPLES

[0119] The following examples are included to further describe some embodiments of the present disclosure. The examples are illustrative, but not limiting the scope of the disclosure. Other suitable modifications and adaptations of the variety of conditions and parameters normally encountered in the field, and which are obvious to those skilled in the art, are within the scope of the disclosure.

[0120] The equipments and regents

[0121] Table 1. The equipment used in the invention

[0122] Table 2. The regents and supplies used in the study Example 1. Variants generation 1.1 AAV2 library generation

[0123] The DNA fragment libraries were generated by PCR with AAV2 Rep Cap plasmid DNA template. The primer is Cap2PCR.

[0124] The purified PCR products were assembled into the inverted terminal repeat (ITR) -containing library backbone with GRK1 promoter, p41, AAV2 (Cap2) VP1 and bovine growth hormone (bGH) poly A.

[0125] The p41 promoter was used to drive capsid gene expression for AAV library production only in the presence of Ad5 helper gene products. The GRK1 promoter was aimed to recover Cap2 mRNA expressed in retina tissues. The assembled library plasmid DNA was transformed to the competent cells to amplify. The amplified cap2 library plasmids were used for AAV library production by co-transfecting pHelper and pRep2-AAP in HEK293 cells as follows:

[0126] HEK293T cells were purchased from National Collection of Authenticated Cell (SCSP-502) . HEK293 was thawed rapidly by gentle agitation in a 37℃ water bath for 2 minutes. Thawed cells were added to pre-warmed media, centrifuged at low speed to remove freeze media and subsequently resuspended in high-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) , supplemented with Fetal Bovine Serum (FBS) to a final concentration of 10%. Then the cells were grown in a humidified incubator at 37℃, supplemented with 5%CO2, growth media should be replaced every 2-3 days.

[0127] For cell transfection:

[0128] a) Inoculating cells: 24 hours before transfection, the cell plating was performed, and the cell state was observed before transfection. When the cell density was 70%-80%and in good condition without pollution, it could be transfected;

[0129] b) Configuration plasmid-PEI transfection complex: plasmid: PEI= 1: 1, the Helper plasmid, Repcap plasmid and GOI plasmid were added to each 150 dish at 58 ug of the total amount of plasmid, and the transfection complex was prepared and left for 15 min;

[0130] c) Transfection was performed with transfection complex: medium with serum = 1: 10, and transfection was completed by dropping the transfection complex into 150 mm dish;

[0131] d) cultured for 72 hours, virus was harvested.

[0132] Table 3: sequence information 1.2 Screening in vivo

[0133] AAV preparations are purified by iodixanol gradient ultracentrifugation and concentrated to purity and titers adequate for in vivo studies. Preparations are then aliquoted and stored at -80 ℃. AAV particles are titered by droplet digital PCR (ddPCR) using primers and probes targeting the ITR elements and an internal control of known titer (protocol modified from Lock et al., 2014. ) The endotoxin levels are determined using a chromogenic endotoxin detection assay based on the amebocyte lysate method. Then the purified AAV viral libraries (First round random library and 2nd-3rd round recovery library) were intravitreal injected to 3-6 years old Cynomolgus macaque at 3E1 1vg / eye. Twenty-one days after injection, monkeys were euthanized and eyeballs were collected for separating retinal sublayers after necropsy to evaluate the level of transgene product. The separation followed the steps below:

[0134] Washed a sterile petri dish with chilled physiological saline twice, then placed on the wet ice. Placed the eyeball on the chilled glass petri. Removed the anterior pole of eye from the position of ciliary body, then cut the optic cup into several parts (superior, nasal, inferior, temporal and macula) , immersed the retina with sclera in a trypsin solution PH 7.2 (0.1%trypsin (1: 250) and 10 mM HEPES in a Ca2+ / Mg2+ -free Hank's solution) for 10 minutes, at 37℃ in a CO2 incubator (95%air / 5%CO2) . After the immersion, the trypsin solution was removed quickly with a Pasteur pipette and the dish was wiped dry with sterilized filter paper.

[0135] The procedures of separation retina were followed:

[0136] The surface of the flatted retina was covered gently with sterilized Millipore filter. During this step, prevented air from entering between the tissue and Millipore filter.

[0137] Removed the entire retina including the Millipore covering from choroid with RPE and sclera, the retina with retina with Millipore filter and choroid with RPE and sclera was placed in two petri dishes.

[0138] Turned over the retina with Millipore filter so that the outer nuclear layer faced upwards, covered the outer nuclear layer with filter paper, then separated the outer nuclear layer by gently removing the filter paper. The outer nuclear layer and remaining retinal tissue attached with the filter paper was transferred into the labeled tubes and frozen in dry ice, then stored in a freezer set to maintain ≤-60℃ until shipped.

[0139] Covered the choroid with RPE and sclera with Millipore filter, then separated RPE by gently removing the filter paper. RPE with Millipore filter was transferred into the labeled tubes and frozen in dry ice, then stored in a freezer set to maintain ≤-60℃ until shipped.

[0140] The total RNA was isolated and treated with Dnase I. The cap2 specific mRNA was reverse transcribed and amplified by PCR (RT-PCR) for next-generation sequencing (NGS) . The enriched candidates were selected by customized enrichment score analysis. A total of 10091 candidates including variants predicted by artificial intelligence modeling were synthesized for the second round of screening. The variant candidates selected for validation are shown in SEQ ID NOs: 1-10091, and the nucleic acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 10092-20182. 1.3 Construction and Purification of AAV plasmids

[0141] Repcap plasmids construction for variants were performed by overlap PCR as follows: a, AAV2 repcap plasmid was used as template, and AAV2F, overlap R was used as primers to amplify fragment 1; AAV2 repcap plasmid was used as template and amplified with overlap F, AAV2R to obtain fragment 2. b, Fragmentl and fragment 2 were used as template, AAV2F and AAV2R were used as primers to amplify fragment 3. c, The AAV2 repcap plasmid and fragment3 were digested with BsiwI and SpeI, and fragment 3 was inserted between BsiwI and SpeI of AAV2 repcap plasmid to complete the construction. After sanger sequencing, the plasmids were used for AAV production.

[0142] The variants plus controls (AAV2, AAV7m8 and AAVGL) were individually packaged with green fluorescent protein (GFP) transgene driven by Chicken β-actin (CB) promoter. All AAVs were produced in HEK293 cells by triple plasmid transfection with PEIpro (Polyplus) . Three days after transfection, the cells were harvested for lysis, Benzonase (Sigma, E1014-25KU) treatment and proceeded to iodixanol gradient ultracentrifugation purification method. After buffer exchange using PBS with 0.001%F68, the AAV was filtered through 0.22 μm. The titer was measured by ddPCR using ITR primer and probes. The purity of AAV was assessed by SDS-PAGE. Example 2. Validation of novel capsids in C57BL / 6J mice

[0143] Six-week-old C57BL / 6J mice were intravitreally injected with all AAVs (1E9 vg / eye) . Animals were anesthetized by intraperitoneal injection of Zoletil (60 mg / kg) and xylazine (10 mg / kg) . The pupil was dilated with tropicamide eye drops (National Medicine Permit No. J20180051) . The injection system was a Nanofil microliter injection system equipped with a 36G bevel needle (World Precision Instrument, Nanofil-10μL) . The whole field operation was performed under a stereomicroscope (OLYMPUS, SZ61) . For injection, the needle was beveled downward and inserted approximately 2 mm from the limbus side against the sclera, while penetrating the sclera, choroid, and retina to reach the vitreous. After microscopically confirming the correct position of the needle in the vitreous, a slow bolus of 1 μL AAV solution was administered. Special care should be taken to avoid damaging the lens during the injection.

[0144] Three weeks post injection (wpi) , animals were anesthetized, systemic blood was replaced with 4℃ precooled saline by means of cardiac perfusion. The eyes were removed and fixed in FAS fixative solution for 4 hours, then after removal of cornea and lens under stereomicroscope, transferred to 30%sucrose / PBS solution for dehydration overnight, and finally embedded in OCT embedding agent.

[0145] Before sectioning, the embedded tissue block was equilibrated in a cryostat incubator at -20℃ for at least 30 minutes. The embedded block was then fixed to the chuck using additional OCT, and sagittal sections of the eyeball with a thickness of 10 to 20 μm were cut, and sections were collected with a positively charged adhesive slide. The slides were finally dried at room temperature for 1 h and stored at -20℃.

[0146] For staining, slides were first removed from -20℃ and dried for 20 min at room temperature. The sections were outlined on the slide using an IHC pen to create a hydrophobic ring. The slides were then washed three times with 500 μi PBS for 5 min each. The cells were incubated for 1 h with PBS blocking solution containing 0.5%Triton X-100 and 10%goat serum. After removal of the blocking solution, the primary antibody incubation solution was added and incubated overnight at 4℃. Slides were then washed five times for 5 min each with PBS solution containing 0.5%Triton X-100. After the washing solution was removed, the secondary antibody incubation solution was added and incubated for 1 h at room temperature. Finally, the plates were washed 5 times with PBS for 5 min each time and sealed with a drop of capping agent containing DAPI dye.

[0147] Image acquisition was performed with the use of a light microscope (Nikon, TS2R) with 4x, 10x, and 20x objectives. For brightfield, DAPI, GFP, and Cy3 signaling pathways, images were taken using brightfield, DAPI, GFP, and Alexa Fluor 555 channels, respectively. For images that needed to be stitched into large maps, serial multichannel image shots with approximately 10%overlap were performed. Example 3. Intravitreal injection of NHP

[0148] All variants plus controls (AAV2, AAV7m8 and R100) were individually packaged with green fluorescent protein (GFP) transgene or mCherry or FXN-HA tag driven by Chicken β-actin (CB) promoter. All AAVs were produced in HEK293 cells by triple plasmid transfection with PEIpro (Polyplus) .

[0149] Seven adult cynomolgus macaque (4-5 years old, ～3 kg) was intravitreally injected with 8E10 vg / eye (4E10 / eye / capsid) , each eye was injected with two capsid packaging with different marker gene. Example 4. Terminal, fundus autofluorescence and tissue collection

[0150] Animals were anesthetized by intramuscular injection of Zoletil (50 mg / kg) and xylazine (10 mg / kg) , and topical application ofproparacaine hydrochloride and tropicamide was used to relieve pain or mydriatic the pupil. The injection system used a 31 g insulin syringe, which was inserted into the sclera (approximately 3 mm behind the limbus) , and 50 μL intravitreal injection was performed in two separate doses to each eye, with a total injection volume of 100 μl / eye. The needle was beveled down, and the position of the needle was confirmed under the operating microscope. The AAV solution was delivered to the middle vitreous body by slow injection. After completion of the bolus, the needle was kept stable for at least 2 min to minimize backflow of the injection solution. In addition, 40 to 80 mg of methylprednisolone was administered weekly after the injection.

[0151] Ophthalmic examination and ocular imaging were performed on all animals by a board-certified veterinary ophthalmologist before and at various time points after administration. Ophthalmic examinations included indirect ophthalmoscopy and slit-lamp biomicroscopy. Fundus imaging was performed with the use ofa confocal scanning laser fundus imaging system (Spectralis HRA + OCT, Heidelberg Engineering) . The images recorded included infrared reflection (IR) , blue autofluorescence (BAF) and optical coherence tomography (OCT) . During BAF imaging, multiple regions of the central and peripheral retina were recorded to reflect the distribution of GFP expression, and the sensitivity was set to 100. OCT imaging is performed by scanning multi-line horizontal, high-resolution images from the optic nerve head (ONH) to the fovea. Example 5. Retinal sections, flat mount and immunofluoreseenee

[0152] For staining, slides were first removed from -20℃ and dried for 20 rain at room temperature. The sections were outlined on the slide using an IHC pen to create a hydrophobic ring. The slides were then washed three times with 500 μl PBS for 5 min each. The cells were incubated for 1 h with PBS blocking solution containing 0.5%Triton X-100 and 10%goat serum. After removal of the blocking solution, the primary antibody incubation solution was added and incubated overnight at 4℃. Slides were then washed five times for 5 min each with PBS solution containing 0.5%Triton X-100. After the washing solution was removed, the secondary antibody incubation solution was added and incubated for 1 h at room temperature. Finally, the plates were washed 5 times with PBS for 5 min each time and sealed with a drop of capping agent containing DAPI dye.

[0153] Retinal flat mount: after completion of the cryosections, the remaining embedded blocks were thawed at room temperature. The retina was carefully peeled off under a microscope, and the retina was washed five times repeatedly with PBS to remove residual OCT embedding agent. Retinas were then blocked in PBS solution containing 2%Triton X-100, 10%normal bovine serum for 1 h, followed by incubation with rabbit anti-mCherry primary antibody or anti-HA primary antibody at a dilution ratio of 1: 100 overnight. Retinas were washed five times and incubated with secondary antibody solution for 2 h at room temperature. After washing, the samples were prepared into planar slides and sealed with mounting agent containing DAPI dye droppers.

[0154] Image acquisition was performed with the use of a light microscope (Nikon, TS2R) with 4x, 10x, and 20x objectives. For brightfield, DAPI, GFP, and Cy3 signaling pathways, images were taken using brightfleld, DAPI, GFP, and Alexa Fluor 555 channels, respectively. For images that needed to be stitched into large maps, serial multichannel image shots with approximately 10%overlap were performed.

[0155] The embodiments of the present invention have been described above, but the present invention is not limited thereto, and those skilled in the art can understand that modifications and changes can be made within the scope of the purport of the present invention. The manner of modifications and changes should fall within the scope of protection of the present invention. Example 6. Engineered AAV9 Variants for Enhanced Tissue Targeting Introduction

[0156] Directed AAV capsid evolution provides rapid selection of novel capsids with improved tissue transduction. AAV9-based capsid engineering was designed in this study by peptide insertion and substitution (at variable region IV and VIII) library screening in mouse and Cynomolgus macaque using synthetic promoter driven viral mRNA recovery from specific tissues. 6.1 AAV library design

[0157] Peptide display random libraries (Lib#1-4) were designed by inserting an amino acid sequence after Q588 (VP1 position of AAV9) in the Variable Region (VR) VIII or after G453 in the VR IV of AAV9 (FIGS. 1A-1D) . The insert DNA library #1-4 were generated by PCR using the following primers.

[0158] Table 4. PCR Primers for Insert DNA Librarv#1-4. 6.2 AAV library screening workflow

[0159] The DNA fragment libraries were generated by PCR with AAV9 library backbone DNA template. The purified PCR products were assembled into the inverted terminal repeat (ITR) -containing library backbone with synthetic promoter, p41, AAV9 (Cap9) VP1 and bovine growth hormone (bGH) poly A. The p41 promoter was used to drive capsid gene expression for AAV library production only in the presence of Ad5 helper gene products. The synthetic promoter was aimed to recover Cap9 mRNA expressed in specific tissues. The assembled library plasmid DNA was transformed to the competent cells to amplify. The amplified cap9 library plasmids were used for AAV library production by co-transfecting pHelper and pRep2-AAP (SEQ ID NO. 50920) in HEK293 cells. The purified AAV viral libraries (Lib#l, Lib#2, Lib#3) were intravenously injected to 8-week-old mice (C57BL / 6J, DBA / 2J-mdx, BALB / cJ) at 4el2 vg / mouse. Twenty-one days after injection, the muscle tissue (triceps, quadriceps, gastrocnemius, abdominal, tibialis anterior, diaphragm, heart) and liver were collected for total RNA isolation. By using Cap9 specific reverse transcription primer, the viral mRNA was converted to cDNA for specific PCR amplification and the second round of library generation.

[0160] For screening in non-human primate (NHP) , viral libraries (Lib#2, Lib#4) were intravenously injected to Cynomoigus macaque and the tissues were harvested 21 days after injection. The total RNA was isolated and treated with Dnase I. The cap9 specific mRNA was reverse transcribed and amplified by PCR (RT-PCR) for next-generation sequencing (NGS) . The enriched candidates were selected by customized enrichment score analysis. A total of 15355 candidates including variants predicted by artificial intelligence modeling were synthesized for the second round of screening. Meanwhile, all variants were individually packaged for in vitro and in vivo characterization. The variants were selected by NSG enrichment score. All variants were enriched in muscle.

[0161] A schematic of the screening workflow is shown in FIG. 2. The variant candidates selected for validation are shown in SEQ ID NOs: 20202-35556, and the nucleic acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 35557-50911.

[0162] Table 5. Table of Seauences. Example 7. Characterization of AAV9-derived capsids mediated transgene expression in C57BL / 6J mice

[0163] All variants plus two controls (AAV9 and MyoAAV 1A (1A) ) were individually packaged with green fluorescent protein (GFP) transgene driven by Chicken β-actin (CB) promoter. All AAVs were produced in HEK293 cells by triple plasmid transfection with PEIpro (Polyplus) . Three days after transfection, the cells were harvested for lysis, Benzonase (Sigma, E1014-25KU) treatment and proceeded to iodixanol gradient ultracentrifugation purification method. After buffer exchange using PBS with 0.001%F68, the AAV was filtered through 0.22 μm. The titer was measured by ddPCR using ITR primer and probes. The purity of AAV was assessed by SDS-PAGE.

[0164] Eight-week-old C57BL / 6J mice were intravenously injected with the AAVs (1e12 vg / mouse) . Two weeks post injection (wpi) , the tissues were harvested for ex vivo imaging to detect native GFP expression. For all of the tested variants and AAV9, no visible signal was captured in the lung, spleen and kidney.

[0165] Then the total RNA was isolated from tissues using Trizol and treated with DNase I. After reverse transcription (RT) , transgene mRNA was quantified by real-time qPCR. GFP and mouse GAPDH primers / probes were used for RT-qPCR.

[0166] Genomic DNA from triceps, quadriceps, gastrocnemius, tibialis anterior, heart, spleen, kidney and liver were also isolated two weeks post injection (wpi) using DNeasy Blood &Tissue kit (Qiagen) . The AAV vector genome copies in those tissues were measured by Droplet Digital PCR (ddPCR) with GFP and mouse TFRC primers / probes. Example 8. Novel AAV9 variants mediated transgene expression in vitro

[0167] The variants and four controls (AAV9 MyoAAV 1A, MyoAAV 2A, MyoAAV 4A) were individually packaged with a transgene expressing GFP and firefly luciferase (Fluc) linked with 2A and driven by chicken β-actin (CB) promoter. The production and titer analysis were perform as described previously. C2C12 myoblast and HepG2 cells were seeded into 96-well plates and incubated (1e6 vg / cell) with indicated AAV vectors containing CB-Fluc-2A-GFP transgene. Twenty-four hours after transduction, the native GFP imaging was captured with the same conditions. Example 9. Novel AAV9 variants mediated transgene expression in Balb / c mice

[0168] The variants and four controls (AAV9 MyoAAV 1A, MyoAAV 2A, MyoAAV 4A) were individually packaged with a transgene expressing GFP and firefly luciferase (Fluc) linked with 2A and driven by chicken β-actin (CB) promoter. Eight-week-old Balb / c mice were intravenously (tail vein) injected with the AAVs (4e11 vg / mouse) . Three weeks post injection (wpi) , the mice were intraperitoneal injected with luciferin. Ten minutes later, mice were proceeded to In vivo Imaging System (IVIS) to capture firefly luciferase expression. Example 10. Validation of pooled novel capsids in NHP

[0169] The encoding sequences of the novel capsids and 5 published controls (Myo1A, Myo2A, Myo3A, Myo4A, and AAV9) were individually cloned to library backbone containing p41 promoter, AAV2 ITRs, a synthetic promoter and bGH polyA. The capsids were individually produced in HEK293 cells by co-transfecting Rep2-AAP and Ad5 helper plasmids. After purification with iodixanoi gradient ultracentrifugation method and filtration through 0.22 μm, the titer was measured by ddPCR using ITR primers / probe. The purity was analyzed by SDS-PAGE.

[0170] An adult female cynomolgus macaque (4-year-old, ～3 kg) was intravenously injected with those pooled the capsids. Three weeks post injection (wpi) , the tissues were collected for total RNA and genomic DNA isolation. The total RNA was treated with Dnase I to remove AAV genomes. The cap9 specific mRNA was reversely transcribed and amplified by PCR (RT-PCR) . The genomic DNA was used for cap9 specific PCR. The pooled (for NHP injection) AAV vector DNA was amplified by PCR with minimal cycles. All the purified PCR products were subjected to NGS (NovaSeq 6000 S4 Reagent Kit v1.5, 300 cycles) . The enrichment score (ES) was analyzed by customized pipeline.

[0171] All references cited herein are incorporated herein by reference in their entirety and for all purposes to the same extent as if each individual publication or patent or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference in its entirety for all purposes.

[0172] Many modifications and variations of this invention can be made without departing from its spirit and scope, as will be apparent to those skilled in the art. The specific embodiments described herein are offered by way of example only, and the invention is to be limited only by the terms of the appended claims, along with the full scope of equivalents to which such claims are entitled.

Claims

1.A variant AAV capsid protein comprising one or more modificatons, the modification comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10091, and SEQ ID NOs: 20202-35556, or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10091, and SEQ ID NOs: 20202-35556.2.The variant AAV capsid protein of claim 1, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-I, VR-II, VR-III, VR-IV, VR-V, VR-VI, VR-VII, VR-VIII or VR-IX of the parental capsid protein.3.The variant AAV capsid protein of claim 1 or 2, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-I of the parental capsid protein.4.The variant AAV capsid protein of claim 1 or 2, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-II of the parental capsid protein.5.The variant AAV capsid protein of claim 1 or 2, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-III of the parental capsid protein.6.The variant AAV capsid protein of claim 1 or 2, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-IV of the parental capsid protein.7.The variant AAV capsid protein of claim 1 or 2, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-V of the parental capsid protein.8.The variant AAV capsid protein of claim 1 or 2, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-VI.9.The variant AAV capsid protein of claim I or 2, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-VII of the parental capsid protein.10.The variant AAV capsid protein of claim 1 or 2, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-VIII of the parental capsid protein.11.The variant AAV capsid protein of claim 1 or 2, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VR-IX of the parental capsid protein.12.The variant AAV capsid protein of claim 1 or 2, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in(i) QISSQSGASN of the VR-I, NDGTT of the VR-II, LNNGSQAVG of the VR-III, NTPSGTTTQSRLQFSQAGAS of the VR-IV, RVSKTSADNNNSEYSWTGA of the VR-V, SHKDDEEKFFPQSGVLI of the VR-VI, KQGSEKTNVDIEK of the VR-VII, VSTNLQRGNRQAATAD of the VR-VIII or YNKSVNVD of the VR-IX of the parental AAV2 capsid protein;(ii) QISSQSGASN of the VR-I, NDGTT of the VR-II, LNNGSQAVG of the VR-III, QGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQ of the VR-IV, RLSKTANDNNNSNFPWTAA of the VR-V, SHKDDEEKFFPMHGNLI of the VR-VI, KEGTTASNAELDN of the VR-VII, VANNLQSSNTAPTTRT of the VR-VIII or YNKSVNVD of the VR-IX of the parental AAV3b capsid protein;(iii) EIKSGSVDGSN of the VR-I, QDSTT of the VR-II, LNRDNTENPTE of the VR-III, NNTGGVQFNKNLAG of the VR-IV, GWNLGSGVNRASVSAFATT of the VR-V, TNNLQGSNTYALENTMI of the VR-VI, SQPANPGTTATYLEGN of the VR-VII, MATNNQSSTTAP of the VR-VIII or YNDPQFVD of the VR-IX of the parental AAV5 capsid protein;(iv) QISSASTGASN of the VR-I, NDGVT of the VR-II, LNNGSQAVG of the VR-III, QNQSGSAQNKDLLFSRGSPA of the VR-IV, RVSKTKTDNNNSNFTWTGA of the VR-V, SHKDDKDKFFPMSGVMI of the VR-VI, KESAGASNTALDN of the VR-VII, VAVNLQSSSTDPATGD of the VR-VIII or YAKSANVD of the VR-IX of the parental AAV6 capsid protein;(v) QISNGTSGGATN of the VR-I, NEGTK of the VR-II, LNNGSQAVG of the VR-III, QTTGGTANTQTLGFSQGGPN of the VR-IV, RVSTTTGQNNNSNFAWTAG of the VR-V, THKDDEERFFPSNGILI of the VR-VI, KQNAARDNADYSD of the VR-VII, VADNLQQQNTAPQIGT of the VR-VIII or YYKSTSVD of the VR-IX of the parental AAV8 capsid protein;(vi) QISNSTSGGSSN of the VR-I, NNGVK of the VR-II, LNDGSQAVG of the VR-III, INGSGQNQQTLKFSVAGPS of the VR-IV, RVSTTVTQNNNSEFAWPGA of the VR-V, SHKEGEDRFFPLSGSLI of the VR-VI, KQGTGRDNVDADK of the VR-VII, VATNHQSAQAQAQTGW of the VR-VIII or YYKSNNVE of the VR-IX of the parental AAV9 capsid protein.13.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QISSQSGASN of the VR-I of the parental AAV2 capsid protein.14.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in NDGTT of the VR-II of the parental AAV2 capsid protein.15.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in LNNGSQAVG of the VR-III of the parental AAV2 eapsid protein.16.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in NTPSGTTTQSRLQFSQAGAS of the VR-IV of the parental AAV2 capsid protein.17.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in RVSKTSADNNNSEYSWTGA of the VR-V of the parental AAV2 capsid protein.18.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in SHKDDEEKFFPQSGVLI of the VR-VI of the parental AAV2 capsid protein.19.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in KQGSEKTNVDIEK of the VR-VII of the parental AAV2 capsid protein.20.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VSTNLQRGNRQAATAD of the VR-VIII of the parental AAV2 capsid protein.21.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in YNKSVNVD of the VR-IX of the parental AAV2 capsid protein.22.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QISSQSGASN of the VR-I of the parental AAV3b capsid protein.23.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in NDGTT of the VR-II of the parental AAV3b capsid protein.24.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in LNNGSQAVG of the VR-III of the parental AAV3b capsid protein.25.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQ of the VR-IV of the parental AAV3b capsid protein.26.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in RLSKTANDNNNSNFPWTAA of the VR-V of the parental AAV3b capsid protein.27.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in SHKDDEEKFFPMHGNLI of the VR-VI of the parental AAV3b capsid protein.28.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in KEGTTASNAELDN of the VR-VII of the parental AAV3b capsid protein.29.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VANNLQSSNTAPTTRT of the VR-VIII of the parental AAV3b capsid protein.30.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in YNKSVNVD of the VR-IX of the parental AAV3b capsid protein.31.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in EIKSGSVDGSN of the VR-I of the parental AAV5 capsid protein.32.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QDSTT of the VR-II of the parental AAV5 capsid protein.33.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in LNRDNTENPTE of the VR-III of the parental AAV5 capsid protein.34.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in NNTGGVQFNKNLAG of the VR-IV of the parental AAV5 capsid protein.35.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in GWNLGSGVNRASVSAFATT of the VR-V of the parental AAV5 capsid protein.36.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in TNNLQGSNTYALENTMI of the VR-VI of the parental AAV5 capsid protein.37.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in SQPANPGTTATYLEGN of the VR-VII of the parental AAV5 capsid protein.38.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in MATNNQSSTTAP of the VR-VIII of the parental AAV5 capsid protein.39.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in YNDPQFVD of the VR-IX of the parental AAV5 capsid protein.40.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QISSASTGASN of the VR-I of the parental AAV6 capsid protein.41.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in NDGVT of the VR-II of the parental AAV6 capsid protein.42.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in LNNGSQAVG of the VR-III of the parental AAV6 capsid protein.43.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QNQSGSAQNKDLLFSRGSPA of the VR-IV of the parental AAV6 capsid protein.44.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in RVSKTKTDNNNSNFTWTGA of the VR-V of the parental AAV6 capsid protein.45.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in SHKDDKDKFFPMSGVMI of the VR-VI of the parental AAV6 capsid protein.46.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in KESAGASNTALDN of the VR-VII of the parental AAV6 capsid protein.47.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VAVNLQSSSTDPATGD of the VR-VIII of the parental AAV6 capsid protein.48.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in YAKSANVD of the VR-IX of the parental AAV6 capsid protein.49.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QISNGTSGGATN of the VR-I of the parental AAV8 capsid protein.50.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in NEGTK of the VR-II of the parental AAV8 capsid protein.51.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in LNNGSQAVG of the VR-III of the parental AAV8 capsid protein.52.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QTTGGTANTQTLGFSQGGPN of the VR-IV of the parental AAV8 capsid protein.53.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in RVSTTTGQNNNSNFAWTAG of the VR-V of the parental AAV8 capsid protein.54.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in THKDDEERFFPSNGILI of the VR-VI of the parental AAV8 capsid protein.55.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in KQNAARDNADYSD of the VR-VII of the parental AAV8 capsid protein.56.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VADNLQQQNTAPQIGT of the VR-VIII of the parental AAV8 capsid protein.57.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in YYKSTSVD of the VR-IX of the parental AAV8 capsid protein.58.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in QISNSTSGGSSN of the VR-I of the parental AAV9 capsid protein.59.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in NNGVK of the VR-II of the parental AAV9 capsid protein.60.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in LNDGSQAVG of the VR-III of the parental AAV9 capsid protein.61.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in INGSGQNQQTLKFSVAGPS of the VR-IV of the parental AAV9 capsid protein.62.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in RVSTTVTQNNNSEFAWPGA of the VR-V of the parental AAV9 capsid protein.63.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in SHKEGEDRFFPLSGSLI of the VR-VI of the parental AAV9 capsid protein.64.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in KQGTGRDNVDADK of the VR-VII of the parental AAV9 capsid protein.65.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in VATNHQSAQAQAQTGW of the VR-VIII of the parental AAV9 capsid protein.66.The variant AAV capsid protein of claim 1, 2 or 12, wherein the sequence is incorporated between any two amino acids in YYKSNNVE of the VR-IX of the parental AAV9 capsid protein.67.A variant AAV2 capsid protein comprising one or more modificatons, the modification comprises a first sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10091; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-10091.68.The variant AAV2 capsid protein of claim 67, wherein RGNRQA of the parental AAV capsid protein is substituted with the first sequence, and the parental AAV capsid protein comprises SEQ ID NO: 20186.69.A variant adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) capsid protein comprising a second sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20202-35556; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20202-35556.70.The variant AAV9 capsid protein of claim 69, wherein the amino acid sequence at position 586-588 of the parental AAV capsid protein is substituted with the second sequence, and the parental AAV capsid protein comprises SEQ ID NO: 50921.71.An isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence that encodes a variant AAV capsid protein of claim 1 to 66, a variant AAV2 capsid protein of claim 67 or 68, or variant AAV9 capsid protein of claim 69 or 70.72.An isolated polynucleotide of claim 71 comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 10092-20182 and SEQ ID NOs: 35557-50911; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 10092-20182 and SEQ ID NOs: 35557-5091 1.73.A vector comprising the isolated polynucleotide of claim 71 or 72.74.An isolated, genetically modified host cell comprising the polynucleotide of claim 71 or 72.75.A recombinant AAV virion comprising a variant AAV capsid protein of claim 1 to 3, a variant AAV2 capsid protein of claim 67 or 68, or a variant AAV9 capsid protein of claim 69 or 70.76.A pharmaceutical composition comprising: a) a recombinant AAV virion of claim 75; and b) a pharmaceutically acceptable excipient.77.A recombinant AAV vector, comprising polynucleotide encoding a variant AAV capsid protein of claim 1 to 66, a variant AAV2 capsid protein of claim 67 or 68, or a variant AAV9 capsid protein of claim 69 or 70.78.A method of delivering a nucleic acid vector encoding a functional gene product to cells and / or tissues with a recombinant AAV virion of claim 75 or recombinant AAV vector of claim 7779.A method of treating disease, the method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount or a recombinant AAV virion of claim 75, the recombinant AAV virion comprises functional gene product.80.The method of anyone of claim 78 or 78, wherein the gene product is a polypeptide.