Methods and systems to determine early acute ischemic stroke (ES) in acute ischemic stroke (AIS) patients

Abstract

Methods and systems to identify stroke onset time in subjects with or suspected of Acute Ischemic Stroke (AIS) by evaluating protein or metabolite biomarkers using machine learning and / or logistic regression models. Biomarkers are identified based on their different expression levels between "early acute ischaemic stroke" (ES, onset time within 4.5 hours) and "late acute ischaemic stroke" (LS, onset time exceeding 4.5 hours). The method comprises performing proteomic and metabolomic analyses, preserving significant biomarkers, conducting statistical analysis and creating models for classification. Biomarkers are refined for consistent temporal changes and validated to differentiate ES and LS accurately. The methods and systems are helpful in clinical decision¬ making for an intravenous thrombolytic treatment rapidly.

Description

METHODS AND SYSTEMS TO DETERMINE EARLY ACUTE ISCHEMIC STROKE (ES) IN ACUTE ISCHEMIC STROKE (AIS) PATIENTSCROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONSThis application claims the benefit of and priority to U.S. Provisional Application No. 63 / 673,444 filed on July 19, 2024, the contents of which is incorporated herein in its entirety.FIELD OF THE INVENTION

[0001] The present invention relates to methods and systems to determine if a patient having or suspected of having Acute Ischaemic Stroke (AIS) is eligible for an intravenous thrombolytic therapy or other time critical therapy when an onset time of stroke is unknown.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Acute Ischemic Stroke (AIS) is marked by high rates of incidence, mortality, disability, and recurrence, posing a significant threat to human well-being, reducing the overall quality of life, and placing additional burdens on society and families. In 2020, there were 68.16 million cases of AIS globally, reflecting a 2.08%increase in prevalence from 2010 to 2020. That same year, the global incidence of AIS was 7.59 million, with 3.48 million deaths. The most effective treatment for AIS is intravenous thrombolysis (IVT) within 4.5 hours of symptom onset, with earlier treatment providing greater benefits.

[0003] However, 20-25%of AIS patients cannot determine the time of symptom onset, categorized as stroke with unknown time of onset, including wake-up stroke and daytime-unwitnessed stroke. For these patients, the onset time is defined as the last known time the patient was well, which typically exceeds the 4.5-hour window, often excluding them from IVT treatment. It is worth noting that, as opposed to those with a known time of onset, these patients generally present with greater severity, a higher incidence of unfavourable outcomes, and increased dependency upon discharge. Therefore, these patients necessitate even more urgent acute treatment.

[0004] Several large-scale clinical trials have aimed to identify AIS patients with unknown onset time who could be eligible for IVT using advanced imaging techniques like perfusion-core mismatch with perfusion magnetic resonance imaging / computerized tomography (MRP / CTP) or diffusion-weighted imaging-fluid attenuated inversion recovery (DWI-FLAIR) mismatch with MRI. These studies have shown a net benefit, emphasizing the importance of identifying individuals who could benefit from IVT. However, advanced imaging has several limitations.

[0005] Many hospitals, even in developed regions, lack access to rapid MRI or MRP / CTP. Some patients have contraindications to MRI or contrast media. Post-processing software for perfusion-core mismatch is costly. A significant proportion of patients are excluded based on DWI-FLAIR mismatch criteria: two-thirds of stroke patients with unknown onset time do not meet the mismatch criteria, and 44.5%of patients within 4.5 hours of onset show no mismatch. The identification performance of DWI-FLAIR mismatch is suboptimal, with a sensitivity of 62%and specificity of 78%. Consequently, advanced imaging is not widely used in routine clinical practice for determining onset time, highlighting the need for other convenient, feasible, and efficient methods.

[0006] Following the onset of AIS, a series of pathological cascade reactions lead to temporal fluctuations in numerous blood molecules, which can serve as indicators for inferring onset time, similar to a ‘molecular clock’ . For example, an animal study used metabolomics and a machine learning model to identify a panel of five serum metabolites as biomarkers for predicting AIS onset time, with a combined area under the curve (AUC) for classifying 4.5-hours onset time of 0.87. Another study analysed the serum of AIS patients and examined 29 proteins’ ability to determine onset time, finding that Glutathione S-transferase-pi (GST-π) could serve as a time indicator, with an AUC of 0.79 in distinguishing between early (≤ 3 hours) and late AIS patients (> 3 hours) . These studies demonstrate the potential of circulating molecules for estimating AIS onset time. Existing technologies and their limitations are discussed below.

[0007] For example, US Patent Application No. 20180074038A1 describes a method to diagnose central nervous system injuries, such as acquired brain injury (ABI) or acquired spinal cord injury (ASI) , in humans or animals. This method involves: (a) collecting a biological sample from the subject and identifying metabolites in the sample using metabolomics to create a metabolite profile; and (b) using multivariate statistical analysis and machine learning to compare the subject's profile with known profiles of CNS injuries and control profiles to determine if the subject has a CNS injury. However, it has a limitation that exact onset time of a stroke in the patient cannot be identified using said invention, which risks the patient’s potential for receiving the appropriate treatment within the optimal time window. Also, none of the sample source in the said invention is derived from stroke and it lacks focus on AIS and time from symptom / stroke onset.

[0008] US Patent Application No. 20190029557A1 describes a method for determining ischemic status by using magnetic resonance diffusion tensor matrices to measure a relative decrease in diffusion magnitude. The invention also includes a method for assessing stroke onset time by using these matrices to measure a relative decrease in pure anisotropy due to the stroke. However, said invention employs MRI to evaluate ischemic status and assess stroke onset time, and MRI is expensive and labour-intensive, requiring specialized equipment and trained personnel, which may not be readily available in all healthcare settings. Furthermore, certain individuals may not be suitable for MRI scanning i.e. (1) patients with metallic implants such as pacemakers, metallic heart valves, artificial joints, recently installed internal stents, metal rods, or metal sheets; (2) patients with claustrophobia; (3) individuals who cannot be still for a prolonged period of time; (4) seriously ill patients (e.g. shock) . Therefore, there is a need for an alternative option for the patient in order to determine the onset stroke time when such information is unavailable at the time of hospitalization.

[0009] CN112305118B identifies L-octanoyl carnitine as a biomarker for diagnosing diseases, specifically focusing on atherosclerotic cerebral infarction, including acute ischemic stroke. The invention reveals that the level of L-octanoyl carnitine is significantly lower in atherosclerotic cerebral infarction compared to atherosclerosis samples, allowing for an effective distinction between atherosclerosis and atherosclerotic cerebral infarction groups. However, said invention’s limitation lies in its focus on distinguishing between atherosclerosis and atherosclerotic cerebral infarction, without addressing the identification of the exact onset time of a stroke when it is unknown.

[0010] US20200355701A1 describes methods, compositions, and kits useful for detecting, assessing, diagnosing, prognosing, and treating neurological injuries or diseases, such as traumatic brain injury (TBI) , using protein biomarkers. These methods detect changes in the levels or concentrations of protein biomarkers in a subject compared to controls. The detection of these biomarkers indicates biological and biochemical events occurring at the cellular level in the subject undergoing testing or analysis for neurological or brain injury. However, the limitation of this invention is that it focuses on identifying neurological injuries through protein biomarkers without addressing the exact onset time of AIS in order to allow the clinicians to administer treatment efficiently.

[0011] CN117747106A describes a method and system for constructing a stroke risk prediction model for individuals with hypertension. The method involves the following steps: screening to identify differentially expressed metabolite and protein data; analysing this data to determine sample data; standardizing the sample data and normalizing the standardized metabolite and protein data; conducting feature screening to identify target feature variables; and constructing multiple classification models using these target feature variables, followed by model verification to determine the final stroke risk prediction model for the hypertensive population. However, the limitation of this invention is that it focuses on predicting stroke risk in hypertensive individuals without addressing the identification of the exact onset time of AIS to patients who have already experienced a stroke in order to allow the clinicians to administer treatment efficiently.

[0012] Despite significant advancements in the detection and assessment of neurological injuries and stroke, existing technologies exhibit critical limitations. These include the inability to accurately determine the exact onset time of AIS, the high costs and complexity associated with MRI-based methods, and the focus on risk prediction without addressing immediate treatment needs. There is a clear and urgent need for a new invention that can overcome these limitations by providing a reliable, cost-effective, and timely method to identify the onset time of AIS. Such an innovation would enable healthcare providers to administer appropriate treatments within the optimal therapeutic window, significantly improving patient outcomes and reducing the burden on healthcare systems.SUMMARY OF THE INVENTION

[0013] It is an objective of the present invention to identify and to provide a method to determine if a patient having or suspected having Acute Ischemic Stroke (AIS) is eligible for a thrombolytic therapy when an onset time of stroke is unknown using protein or metabolite biomarkers or any combinations thereof.

[0014] It is also an objective of the present invention to provide a device to determine if a patient having or suspected having AIS is eligible for a thrombolytic therapy when an onset time of stroke is unknown using protein or metabolite biomarkers or any combinations thereof.

[0015] Accordingly, these objectives can be achieved by following the teachings of the present invention, which relates to a method for identifying stroke onset time of a subject having or suspected of AIS, the method comprising: obtaining a biological sample from a subject; evaluating at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker based on level of each biomarker in the biological sample; and, classifying the evaluated subject as “early acute ischemic stroke” (ES, onset time within 4.5 hours) or “late acute ischemic stroke” (LS, onset time exceeding 4.5 hours) based on blood level using a logistic regression and / or other machine learning models.

[0016] Additionally, the present invention also teaches a method for identifying at least one protein biomarker that discriminates early acute ischemic stroke (ES) from late acute ischemic stroke (LS) for subjects having or suspected of Acute Ischemic Stroke (AIS) , the method comprising: performing a proteomic analysis from blood samples obtained from a subject; preserving the potential biomarkers that demonstrate expression level of at least 50%; performing a statistical analysis to identify and select the potential biomarkers with significant expression levels between ES, LS, AIS and control groups, based on predefined significance thresholds, yielding models for a logistic regression model with performance metrics for classification; establishing a proteomic spectral database based on the identified and selected biomarkers; refining the selection by assessing the biomarkers for consistent temporal change, resulting in identification of at least one protein biomarker that indicates early stroke onset time; and, validating the identified protein biomarkers using the scoring or algorithm system to accurately differentiate ES and LS for clinical decision-making regarding a thrombolytic treatment or other time-sensitive treatment.

[0017] The present invention also teaches a method for identifying potential metabolite biomarkers to discriminate early acute ischemic stroke (ES) from late acute ischemic stroke (LS) for subjects having or suspected of Acute Ischemic Stroke (AIS) based on metabolite expression level, the method comprising: performing a metabolomic analysis from blood samples obtained from a subject, scoring and qualifying the metabolite biomarkers with a score range of 0 to 80, wherein the metabolite biomarkers having scores below 36 are eliminated; preserving the metabolite biomarkers that demonstrate expression level of at least 50%; performing a statistical analysis to identify and select the metabolite biomarkers with significant expression levels between ES and LS groups, based on predefined significance thresholds, yielding at least one machine learning model with performance metrics for classification; refining the selection by assessing the metabolite biomarkers for consistent temporal change, resulting in identification of at least one metabolite biomarker that indicates ES; and, applying the at least one machine learning model to rank the biomarker based on importance level of the identified biomarker and select the biomarker based on predefined criteria.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0018] The features of the invention will be more readily understood and appreciated from the following detailed description when read in conjunction with the accompanying drawings of the preferred embodiment of the present invention, in which:

[0019] Figures 1A-1C illustrate proteomic profiling and differential proteins in the comparisons between AIS and control (HC) groups (Figure 1A) , and ES and LS groups (Figure 1B) , basing on a significance threshold of p < 0.05 and fold change (FC) > 1.2 or < 1 / 1.2, using t-tests; Figure 1C is a Venn diagram showing the intersection of the proteins obtained from these two comparisons.

[0020] Figure 2 illustrates a flow diagram of selection process of potential protein biomarker.

[0021] Figures 3A-3F are box plots and scatter plots of the three variable proteins from example model V2+V9+V13. Figures 3A and 3B show the relative expression level and temporal change of PEBP1 in the ES and LS groups represented in a box plot and a fitted line plot for nonlinear regression (quadratic) , respectively; Figures 3C and 3D show the relative expression level and temporal change of RNASE3 in the ES and LS groups represented in a box plot and a fitted line plot, respectively; Figures 3E and 3F show the relative expression level and temporal change of SMPDL3A in the ES and LS groups represented in a box plot and a fitted line plot, respectively.

[0022] Figures 4A-4B illustrates scoring of the ES risk stratification using a histogram (Figure 4A) and using a graph showing probability of ES versus transformed values using a logistic regression model derived from example model V2+V9+V13 in predicting probability of early acute ischaemic stroke. Probability of early stroke based on model V2+V9+V13 algorithm: (p (ES) = 1  /  (1 + exp (77.241 -0.739*V2 -2.447*V9 -1.838*V13) ) .

[0023] Figures 5A-5F illustrate results of metabolomics analysis. Figure 5A is a pie chart showing the classification of a total of 4, 559 named metabolites; Figure 5B is a plot showing differences between two groups (circled) after using supervised orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) ; Figure 5C is a clustering heatmap illustrating the expression differences of the 85 metabolites among different samples and groups; Figure 5D is a volcano plot illustrating the differences in p values, VIP, and fold change (FC) ; Figures 5E and 5F are enriched metabolic pathways showing those associated with upregulated metabolites (Figure 5E) and those associated with downregulated metabolites (Figure 5F) .

[0024] Figure 6 illustrates a flow diagram of selection process of potential metabolite biomarkers.

[0025] Figures 7A-7F illustrates the ranking of metabolites based on random forest variable importance analysis and the final identification of the panel of the two metabolites. Figure 7A is a graph ranking the importance of 17 metabolites in classifying ES and LS based on random forest variable importance analysis; Figure 7B is a graph showing specificity versus sensitivity of top two metabolites achieved the highest AUC (0.964, 95%CI 0.9-1) ; Figures 7C and 7D are bar graphs showing abundance of Biliverdin and Nicotinamide N-oxide (NAMO) in the ES and LS groups; Figures 7D and 7E are graphs showing temporal change (fitted line plot for nonlinear regression (quadratic) ) of Biliverdin and Nicotinamide N-oxide after AIS onset over time.

[0026] Figures 8A-8H illustrates of the association between Biliverdin / Nicotinamide N-oxide and infarct volume, National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS) Score at admission, Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment (TOAST) Classification, and 3-month modified Rankin Score (mRS) . Figures 8A and 8B are graphs showing the abundance of Biliverdin and Nicotinamide N-oxide with the enlargement of infarct volume in the ES and LS groups. Figures 8C and 8D are plots showing the abundance of Biliverdin and Nicotinamide N-oxide with NIHSS scores in the ES and LS groups. Figures 8E and 8F are box plots showing the abundance of Biliverdin and Nicotinamide N-oxide among the TOAST classification groups. Figures 8E and 8F are box plots showing Biliverdin and Nicotinamide N-oxide in groups according to 3-month mRS. DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENT

[0027] For the purposes of promoting and understanding the principles of the invention, reference will now be made to the embodiments illustrated in the drawings and described in the following written specification. It is understood that the present invention includes any alterations and modifications to the illustrated embodiments and includes further applications of the principles of the invention as would normally occur to one skilled in the art to which the invention pertains.

[0028] The present invention teaches a method for identifying stroke onset time of a subject having or suspected of Acute Ischemic Stroke (AIS) , the method comprising: obtaining a biological sample from a subject; evaluating at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker based on level of each biomarker in the biological sample; and, classifying the evaluated subject as “early acute ischemic stroke” (ES, onset time within 4 / 5 hours) or “late acute ischemic stroke” (LS, onset time exceeding 4.5 hours) based on blood level using a logistic regression and / or at least one machine learning model.

[0029] In one embodiment of the present invention, the classifying as ES or LS further comprising discriminating the eligibility of a subject for a time-sensitive treatment which includes but not limited to an intravenous thrombolysis (IVT) .

[0030] In some embodiments, the step of obtaining a biological sample from a subject includes acquiring a liquid biopsy, such as a sample of bodily fluid, for example blood, from the patient is first performed prior to any analysis. In further embodiments, the expression level of one or more proteins and / or one or more metabolites is evaluated using a point of care test in the ward or bedside. In preferred embodiments, the expression levels of one or more proteins and / or one or more metabolites are compared to their baseline thresholds. If the threshold level is reached, a score is assigned to each protein or metabolite. The aggregate score from each protein / metabolite will then be used to determine the probability of early versus late stroke. This will then guide clinical judgement on whether to treat the patient, for example with an intravenous thrombolysis.

[0031] In one embodiment of the present invention, the biological sample is selected from a group consisting of blood plasma and saliva.

[0032] In one embodiment of the present invention, the step of evaluating of the at least one protein biomarker based on its level in the biological sample further comprising: establishing a reference database by extracting raw protein data from a database comprising of known whole human plasma protein sequences using a data-dependent acquisition (DDA) technique; establishing a protein profile by collecting raw data from the biological sample using data-independent acquisition (DIA) technique; enabling data matching of the established protein profile with the established reference database ; pre-processing the matched data for a statistical analysis; and, applying the statistical analysis to the matched data to yield logistic regression and / or the at least one machine learning model to aid in a timely diagnosis and treatment decision-making process for a clinician.

[0033] In one embodiment of the present invention, the step of evaluating of the at least one metabolite biomarker based on its level in the biological sample further comprising: establishing a metabolite profile by collecting raw metabolite data from the biological sample; enabling data matching of the established metabolite profile with at least one omics database comprising of known whole metabolite sequences; pre-processing the matched data for a statistical analysis; and, applying the statistical analysis to the matched data to yield logistic regression and / or at least one machine learning model to aid in a timely diagnosis and treatment decision-making process for a clinician.

[0034] In one embodiment of the present invention, the raw data are collected using a mass spectrometry.

[0035] In one embodiment of the present invention, the at least one protein biomarker is selected from a group consisting of Protein 4.2 (EPB42) , Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 (PEBP1) , Triokinase / FMN cyclase (TKFC) , Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein 1 (PIK3IP1) , Platelet glycoprotein 4 (CD36) , Epithelial discoidin domain-containing receptor 1 (DDR1) , Interleukin-1 receptor type 2 (IL1R2) , Alpha-hemoglobin-stabilizing protein (AHSP) , Eosinophil cationic protein (RNASE3) , Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 15 (ADAM15) , Beta-hexosaminidase subunit alpha (HEXA) , Xaa-Pro aminopeptidase 2 (XPNPEP2) , Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3a (SMPDL3A) , Programmed cell death 6-interacting protein (PDCD6IP) , Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 (PTPN6) , Tropomyosin beta chain (TPM2) , Farnesyl pyrophosphate synthase (FDPS) , Tubulin beta chain (TUBB) , Immunoglobulin heavy constant epsilon (IGHE) , Ras-related protein Rab-7a (RAB7A) and Importin subunit beta-1 (KPNB1) .

[0036] In one embodiment of the present invention, the at least one metabolite biomarker is selected from a group consisting of Nicotinamide N-oxide, Biliverdin, Kuguacin E, Allitridin, Azelaic acid, 1, 5-Naphthalenediamine, 2-Acetamido-2, 6-dideoxygalactose, 3 (4-Iodophenyl) -2-mercapto- (Z) -2-propenoic acid, PA (18: 0 / 6 keto-PGF1alpha) , Tryptophol, 10, 11-dihydro-leukotriene B4, 5-Hydroxy-2-imino-1-methylimidazolidin-4-one, Bicyclo Prostaglandin E2, (9S, 10S) -9, 10-dihydroxyoctadecanoate, lysine phosphoester, Indole and 3, 4-Bis (carboxymethyl) -3, 4-dihydroxyhexanedioic acid.

[0037] In one embodiment of the present invention, the step of discriminating the evaluated subject as the ES or the LS based on the biomarker level using a logistic regression and / or the at least one machine learning model further comprising initiating the IVT or other time-sensitive treatment for the subject having ES.

[0038] Additionally, the present invention also teaches a method for identifying at least one protein biomarker that discriminates early acute ischemic stroke (ES) from late acute ischemic stroke (LS) for subjects having or suspected of Acute Ischemic Stroke (AIS) , the method comprising: performing a proteomic analysis from blood samples obtained from a subject; preserving the potential biomarkers that demonstrate expression level of at least 50%; performing a statistical analysis to identify and select the potential biomarkers with significant expression levels between ES, LS, AIS and control groups, based on predefined significance thresholds, yielding models for a logistic regression model with performance metrics for classification; establishing a proteomic spectral database based on the identified and selected biomarkers; refining the selection by assessing the biomarkers for consistent temporal change, resulting in identification of at least one protein biomarker that indicates early stroke onset time; and, validating the identified protein biomarkers using a scoring or algorithm system to accurately differentiate ES and LS for clinical decision-making regarding a time-sensitive treatment.

[0039] In one embodiment of the present invention, the proteomic analysis is conducted using a liquid chromatography coupled to a hybrid ion mobility spectrometry with nano-electrospray ion source.

[0040] In one embodiment of the present invention, the step of performing the statistical analysis to identify and select the potential biomarkers with significant expression levels between ES, LS, AIS and control groups, based on the predefined significance thresholds, yielding models with performance metrics for classification further comprising: generating statistical values for each biomarker and selecting biomarkers having a fold change (FC) > 1.2 or < 1 / 1.2 with a P-value of < 0.05 and an AUC ≥ 0.80 with a P-value of < 0.05 and to discriminate ES from LS.

[0041] In one embodiment of the present invention, the step of refining the selection by assessing the biomarkers for consistent temporal change, resulting in the identification of at least one protein biomarker that indicates early stroke onset time further comprising: eliminating biomarkers with inconsistent or no change in expression level over time and selecting those with a consistent unidirectional increase or decrease in protein expression.

[0042] In furtherance to the above, the present invention also teaches a method for identifying potential metabolite biomarkers to discriminate early acute ischemic stroke (ES) from late acute ischemic stroke (LS) for subjects having or suspected of Acute Ischemic Stroke (AIS) based on metabolite level, the method comprising: performing a metabolomic analysis from blood samples obtained from a subject, scoring and qualifying the metabolite biomarkers with a score range of 0 to 80, wherein the metabolite biomarkers having scores below 36 are eliminated; preserving the metabolite biomarkers that demonstrate expression level of at least 50%; performing a statistical analysis to identify and select the metabolite biomarkers with significant levels between ES and LS groups, based on predefined significance thresholds, yielding at least one machine learning model with performance metrics for classification; refining the selection by assessing the metabolite biomarkers for consistent temporal change, resulting in identification of at least one metabolite biomarker that indicates early ES; and, applying the at least one machine learning model to rank the biomarker based on importance level of the identified biomarker and select the biomarker based on predefined criteria.

[0043] In a most preferred embodiment of the present invention, the identified and selected metabolite biomarkers are selected from a group consisting of Biliverdin and Nicotinamide N-oxide (NAMO) .

[0044] In one embodiment of the present invention, the metabolomic analysis is conducted using a liquid chromatography coupled to an ion mobility spectrometry with nano-electrospray ion source.

[0045] In one embodiment of the present invention, the step of performing the metabolomic analysis from blood samples obtained from the subject, scoring and qualifying the metabolite biomarkers with the score range of 0 to 80, wherein the metabolite biomarkers having scores below 36 are eliminated further comprising: matching the identified metabolite biomarker with known metabolomic databases including but not limited to Human Metabolome Database (HMDB) , Lipid Maps (V2.3) , METLIN and pre-determined databases.

[0046] In one embodiment of the present invention, the step of performing the statistical analysis to identify and select the potential biomarkers with significant expression levels between ES and LS groups, based on the predefined significance thresholds, yielding models with performance metrics for classification further comprising: generating statistical values for each biomarker and selecting the biomarker based on the predefined significance thresholds of P-value < 0.05, a variable importance of projection (VIP) value > 1, AUC-P value < 0.05 and AUC value > 0.75.

[0047] In one embodiment of the present invention, the step of refining the selection by assessing the biomarkers for consistent temporal change, resulting in the identification of at least one metabolite biomarker that indicates ES further comprising: eliminating biomarkers with inconsistent or no change in circulating level over time and selecting those with a consistent unidirectional increase or decrease in metabolite level.

[0048] In one embodiment of the present invention, the at least one machine learning model is a supervised orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) multivariate analysis which is subjected to a 7-fold cross validation and 200 iterations of response permutation testing (RPT) to prevent overfitting of data.

[0049] In one embodiment of the present invention, the step of applying the machine learning method to rank the biomarkers based on the importance level of the identified biomarker and select the biomarker based on the predefined threshold further comprising: applying a random forest variable importance analysis to rank the biomarker in descending order of importance ; and, using a random forest model to combine top-ranked metabolites and rank their combined AUC in differentiating ES and LS.

[0050] The present invention also teaches a system for determining early acute ischemic stroke (ES) in a subject, comprising: one or more databases comprising of known proteomic and metabolomic profiles; a sample collection unit for obtaining a biological sample from the subject; a biomarker unit configured to detect and quantify level of at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker or any combination thereof; a non-transitory computer-readable medium comprising instructions to determine likelihood of the stroke onset time being within or beyond intravenous thrombolysis or other time-sensitive treatment (IVT) time window; and, a user interface for displaying a result to a healthcare provider to administer IVT if the stroke onset time is within the IVT time window.

[0051] In one embodiment of the present invention, the non-transitory computer-readable medium comprises a statistical analytic module and a machine learning model to predict the likelihood of the stroke onset time being within or beyond the IVT or other time-sensitive treatment time window.

[0052] In one embodiment of the present invention, the non-transitory computer-readable medium is further configured to compare the detected level of the at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker with predefined thresholds.

[0053] In view of the above, it is devised in this present invention a prospective observational study to identify independent or panels or sets of protein or metabolite biomarkers for detecting whether AIS patients are within 4.5 hours of symptom onset. The markers will be used in situations such as: ● When patients present with acute stroke symptoms, but the exact onset time is  unknown, such as being asymptomatic before sleep and waking up with symptoms. ● When the patients are unconscious or impercipient but there is no one around  to witness the onset time.

[0054] After the patient visits the hospital and undergoes a CT scan ruling out hemorrhagic stroke (HS) , with AIS being the probable diagnosis, the question arises whether to consider thrombolytic therapy given the unclear onset time. Thus, in some embodiments, compositions and methods thereof for determining if the patient had an “early acute ischaemic stroke” (ES, onset time within 4.5 hours) or “late acute ischaemic stroke” (LS, onset time exceeding 4.5 hours) are described. In one embodiment, the patient has had a wake-up stroke or unwitnessed stroke. In preferred embodiments, the compositions and methods thereof determine that the onset time of AIS in the patient occurred within 4.5h prior, thereby providing them with an opportunity to receive IVT and improve clinical outcomes. In preferred embodiments, the compositions and methods thereof determine if the onset time of AIS in the patient exceeded 4.5h, for example between 4.5 to 24 hours, thereby refraining from giving the patient IVT.

[0055] The compositions and methods thereof for determining if the patient had an ES with onset time within 4.5 hours or LS, onset time exceeding 4.5 hours can timely identify the subgroup of stroke patients that likely benefit from thrombolytic therapy. Timely treatment with thrombolytic therapy can enhance treatment effectiveness reduce neurological damage in stroke patients, lower the incidence of sequelae, enhance recovery, and thus improve survival rate of stroke patients and their quality of life.

[0056] The compositions and methods using one or more biomarkers can alleviate the burden on the healthcare system and decrease treatment costs for patients, boost productivity by preventing the occurrence of stroke sequelae, and / or reducing recovery period. Enhancing treatment effectiveness and reducing sequelae incidence, promoting patient recovery and social integration can enhance overall social welfare.

[0057] In some embodiments, one or more algorithms are used for calculating a score indicating the likelihood of suffering from early AIS. Some exemplary algorithms are described in Example 1 and in Table 8.

[0058] In preferred embodiments, the cutoff values for all the 21 proteins are those listed in Table 1 below. For proteins with upwards trend, the concentration below the cutoff value is positive. For proteins with downwards trend, the concentration larger than the cutoff value is positive. Either below or beyond the cutoff value is positive in Table 1 for each protein.

[0059] In some embodiments, the one or more of the protein biomarkers are tested. In preferred embodiments, the one or more of the protein biomarkers are tested using ELISA, for example, using commercially available kits. Some exemplary ELISA kits suitable for use in testing one or more of the protein biomarkers are provided in Table 2. Table 2. Exemplary commercially available ELISA kits.

[0060] The disclosed compositions and methods can be further understood through the following numbered paragraphs. 1. A method comprising: (a) measuring at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker in a  biological sample from a subject; (b) comparing the level of the at least one protein biomarker or at least one  metabolite biomarker in the biological sample to a control; and (c) classifying the evaluated subject as “early acute ischaemic stroke” (ES, onset time  within 4.5 hours) or “late acute ischaemic stroke” (LS, onset time exceeding 4.5 hours) . 2. The method of paragraph 1, wherein the subject is a patient with one or more  stroke symptoms. 3. The method of paragraph 1 or 2, wherein the biological sample is one or more  selected from a group consisting of blood, plasma, and saliva. 4. The method of any one of paragraphs 1-3, wherein the control comprises one or  more reference levels of the at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker in subjects established as ES and LS. 5. The method of any one of paragraphs 1-4, wherein the control comprises  proteomic or metabolic profiles of the at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker in subjects established as ES and LS. 6. The method of any one of paragraphs 1-5, wherein the at least one protein  biomarker is selected from a group consisting of Protein 4.2 (EPB42) , Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 (PEBP1) , Triokinase / FMN cyclase (TKFC) , Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein 1 (PIK3IP1) , Platelet glycoprotein 4 (CD36) , Epithelial discoidin domain-containing receptor 1 (DDR1) , Interleukin-1 receptor type 2 (IL1R2) , Alpha-hemoglobin-stabilizing protein (AHSP) , Eosinophil cationic protein (RNASE3) , Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 15 (ADAM15) , Beta-hexosaminidase subunit alpha (HEXA) , Xaa-Pro aminopeptidase 2 (XPNPEP2) , Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3a (SMPDL3A) , Programmed cell death 6-interacting protein (PDCD6IP) , Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 (PTPN6) , Tropomyosin beta chain (TPM2) , Farnesyl pyrophosphate synthase (FDPS) , Tubulin beta chain (TUBB) , Immunoglobulin heavy constant epsilon (IGHE) , Ras-related protein Rab-7a (RAB7A) and Importin subunit beta-1 (KPNB1) , and combinations thereof. 7. The method of any one of paragraphs 1-6, wherein the at least one metabolite  biomarker is selected from a group consisting of Nicotinamide N-oxide, Biliverdin, Kuguacin E, Allitridin, Azelaic acid, 1, 5-Naphthalenediamine, 2-Acetamido-2, 6-dideoxygalactose, 3 (4-Iodophenyl) -2-mercapto- (Z) -2-propenoic acid, PA (18: 0 / 6 keto-PGF1alpha) , Tryptophol, 10, 11-dihydro-leukotriene B4, 5-Hydroxy-2-imino-1-methylimidazolidin-4-one, Bicyclo Prostaglandin E2, (9S, 10S) -9, 10-dihydroxyoctadecanoate, lysine phosphoester, Indole and 3, 4-Bis (carboxymethyl) -3, 4-dihydroxyhexanedioic acid, and combinations thereof. 8. The method of any one of paragraphs 1-7, wherein the measuring at least one  protein biomarker or at least one metabolite biomarker is carried out using one or more of mass spectrometry, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, and enzymatic assays. 9. The method of any one of paragraphs 1-8, wherein the measuring at least one  protein biomarker or at least one metabolite biomarker is carried out using an ELISA. 10. The method of any one of paragraphs 1-9, wherein the subject is determined as  having ES if the level of the at least one protein biomarker is below the cutoff value the as shown in Table 1 if the protein biomarker shows an upward trend in its temporal expression after AIS onset, or if the level of the at least one protein biomarker is above the cutoff value the as shown in Table 1 if the protein biomarker shows an downward trend in its temporal expression after AIS onset. 11. The method of any one of paragraphs 1-9, wherein the at least one protein  biomarker is a combination of two or three protein biomarkers. 12. The method of paragraph 11, wherein the protein biomarkers are PEBP1 (V2) ,  RNASE3 (V9) , and SMPDL3A (V13) . 13. The method of paragraph 11, wherein the probability of the subject having ES is  determined based on the following equation: p(ES) = 1  /  (1 + exp (77.241 -0.739*V2 -2.447*V9 -1.838*V13) . 14. The method of paragraph 13, wherein the subject is determined as having ES if  the probability is more than 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 95%. 15. The method of any one of paragraphs 1-14, further comprising the step of  administering an intravenous thrombolysis (IVT) , if the subject is determined as ES. 16. A method for identifying potential metabolite biomarkers to discriminate early  acute ischemic stroke (ES) from late acute ischemic stroke (LS) for subjects having or suspected of Acute Ischemic Stroke (AIS) based on metabolite expression level, the method comprising: performing a metabolomic analysis from blood samples obtained from a subject,  scoring and qualifying the metabolite biomarkers with a score range of 0 to 80, wherein the metabolite biomarkers having scores below 36 are eliminated; preserving the metabolite biomarkers that demonstrate the level of at least 50%;  performing a statistical analysis to identify and select the metabolite biomarkers with significant expression levels between ES and LS groups, based on predefined significance thresholds, yielding at least one machine learning model with performance metrics for classification; refining the selection by assessing the metabolite biomarker for consistent temporal  change, resulting in identification of at least one metabolite biomarker that indicates ES; and, applying the at least one machine learning model to rank the biomarker based on  importance level of the identified biomarker and select the biomarker based on predefined criteria. 17. The method according to paragraph 16, wherein the identified and selected  metabolite biomarkers are selected from a group consisting of Biliverdin and Nicotinamide N-oxide (NAMO) . 18. The method according to paragraph 16, wherein, the metabolomic analysis is  conducted using a liquid chromatography coupled to an ion mobility spectrometry with nano-electrospray ion source. 19. The method according to paragraph 16, wherein the step of performing the  metabolomic analysis from blood samples obtained from the subject, scoring and qualifying the metabolite biomarkers with the score range of 0 to 80, wherein the metabolite biomarkers having scores below 36 are eliminated further comprising: comparing the identified metabolite biomarker with known metabolomic databases  including but not limited to Human Metabolome Database (HMDB) , Lipid Maps (V2.3) , METLIN and pre-determined databases. 20. The method according to paragraph 16, wherein, the step of performing the  statistical analysis to identify and select the potential biomarkers with significant expression levels between ES and LS control groups, based on the predefined significance thresholds, yielding models with performance metrics for classification further comprising: generating statistical values for each biomarker and selecting the biomarker based on the predefined significance thresholds of P-value < 0.05, a variable importance of projection (VIP) value > 1, AUC-P value < 0.05 and AUC value > 0.75. 21. The method according to paragraph 16, wherein, the step of refining the selection  by assessing the biomarkers for consistent temporal change, resulting in the identification of at least one metabolite biomarker that indicates ES further comprising: eliminating biomarkers with inconsistent or no change in circulating level over time and selecting those with a consistent unidirectional increase or decrease in metabolite level. 22. The method according to paragraph 16, wherein the at least one machine learning  model is a supervised orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) model which is subjected a 7-fold cross validation and 200 iterations of response permutation testing (RPT) to prevent overfitting of data. 23. The method according to paragraph 16, wherein the step of applying the machine  learning model to rank the biomarker based on the importance level of the identified biomarker and select the biomarker based on the predefined threshold further comprising: applying a random forest variable importance analysis to rank the biomarkers in  descending order of importance; and, using a random forest model to combine top-ranked metabolites and rank their  combined AUC in differentiating ES and LS. 24. A system for determining early acute ischemic stroke (ES) onset time in a  subject, comprising: one or more databases comprising known proteomic and metabolomic profiles; a sample collection unit for obtaining a biological sample from the subject; a biomarker unit configured to detect and quantify level of at least one protein  biomarker or at least one metabolite biomarker or any combination thereof; a non-transitory computer-readable medium comprising instructions to determine  likelihood of the stroke onset time being within or beyond intravenous thrombolysis (IVT) or other time-sensitive treatment time window; and, a user interface for displaying a result to a healthcare provider to administer IVT if the  stroke onset time is within the IVT time window. 25. The system according to paragraph 24, wherein the non-transitory computer  readable medium further comprises a statistical analytic module and a machine learning model to predict the likelihood of the stroke onset time being within or beyond the IVT or other time-sensitive treatment time window. 26. The system according to paragraph 24, wherein the non-transitory computer  readable medium is further configured to compare the detected level of the at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker with predefined thresholds. 27. A method for identifying stroke onset time of a subject having or suspected of  Acute Ischemic Stroke (AIS) , the method comprising: obtaining a biological sample from the subject; evaluating at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker based  on level of each biomarker in the biological sample; and, classifying the evaluated subject as “early acute ischaemic stroke” (ES, onset time  within 4.5 hours) or “late acute ischaemic stroke” (LS, onset time exceeding 4.5 hours) based on the blood level using a logistic regression model and / or at least one machine learning model. 28. The method according to paragraph 27, wherein the classifying as ES or LS  further comprising discriminating the eligibility of a subject for a time-sensitive treatment which includes but not limited to an intravenous thrombolysis (IVT) . 29. The method according to paragraph 27, wherein the biological sample is selected  from a group consisting of blood, plasma and saliva. 30. The method according to paragraph 27, wherein the step of evaluating of the at  least one protein biomarker based on its level in the biological sample further comprising: establishing a reference database by extracting raw protein data from a database  comprising of known whole human plasma protein sequences using a data-dependent acquisition (DDA) technique; establishing a protein profile by collecting raw protein data from the biological  sample for data matching using data-independent acquisition (DIA) technique; enabling data matching of the established protein profile with the established  reference database; pre-processing the matched data for a statistical analysis; and, applying the statistical analysis to the matched data to yield logistic regression and / or  at least one machine learning model to aid in a timely diagnosis and treatment decision-making process for a clinician. 31. The method according to paragraph 27, wherein the step of evaluating of the at  least one metabolite biomarker based on its level in the biological sample further comprising: establishing a metabolite profile by collecting raw metabolite data from the biological  sample; enabling data matching of the established metabolite profile with at least one omics  database comprising of known whole metabolite sequences; pre-processing the matched data for a statistical analysis; and, applying the statistical analysis to the matched data to yield logistic regression and / or  at least one machine learning model to aid in a timely diagnosis and treatment decision-making process for a clinician. 32. The method according to paragraph 30 or 31, wherein, the raw data are collected  using a mass spectrometry. 33. The method according to paragraph 27, wherein the at least one protein  biomarker is selected from a group consisting of Protein 4.2 (EPB42) , Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 (PEBP1) , Triokinase / FMN cyclase (TKFC) , Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein 1 (PIK3IP1) , Platelet glycoprotein 4 (CD36) , Epithelial discoidin domain-containing receptor 1 (DDR1) , Interleukin-1 receptor type 2 (IL1R2) , Alpha-hemoglobin-stabilizing protein (AHSP) , Eosinophil cationic protein (RNASE3) , Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 15 (ADAM15) , Beta-hexosaminidase subunit alpha (HEXA) , Xaa-Pro aminopeptidase 2 (XPNPEP2) , Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3a (SMPDL3A) , Programmed cell death 6-interacting protein (PDCD6IP) , Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 (PTPN6) , Tropomyosin beta chain (TPM2) , Farnesyl pyrophosphate synthase (FDPS) , Tubulin beta chain (TUBB) , Immunoglobulin heavy constant epsilon (IGHE) , Ras-related protein Rab-7a (RAB7A) and Importin subunit beta-1 (KPNB1) . 34. The method according to paragraph 27, wherein the at least one metabolite  biomarker is selected from a group consisting of Nicotinamide N-oxide, Biliverdin, Kuguacin E, Allitridin, Azelaic acid, 1, 5-Naphthalenediamine, 2-Acetamido-2, 6-dideoxygalactose, 3 (4-Iodophenyl) -2-mercapto- (Z) -2-propenoic acid, PA (18: 0 / 6 keto-PGF1alpha) , Tryptophol, 10, 11-dihydro-leukotriene B4, 5-Hydroxy-2-imino-1-methylimidazolidin-4-one, Bicyclo Prostaglandin E2, (9S, 10S) -9, 10-dihydroxyoctadecanoate, lysine phosphoester, Indole and 3, 4-Bis (carboxymethyl) -3, 4-dihydroxyhexanedioic acid. 35. The method according to paragraph 28, wherein, the step of discriminating the  evaluated subject as the ES or the LS based on the biomarker level using the logistic regression model and / or the at least one machine learning model further comprising initiating the IVT for the subject having ES. 36. A method for identifying at least one protein biomarker that discriminates ES  from LS for subjects having or suspected of AIS, the method comprising: performing a proteomic analysis from blood samples obtained from a subject; preserving the potential biomarkers that demonstrate expression level of at least 50%; performing a statistical analysis to identify and select the potential biomarkers with  significant expression levels between ES, LS, AIS and control groups, based on predefined significance thresholds, yielding models for a logistic regression model with performance metrics for classification; establishing a proteomic spectral database based on the identified and selected  biomarkers; refining the selection by assessing the biomarkers for consistent temporal change, resulting in  identification of at least one protein biomarker that indicates early stroke onset time; and validating the identified protein biomarkers using a scoring or algorithm system to  accurately differentiate ES and LS for clinical decision-making regarding a thrombolytic treatment or other time-sensitive treatment. 37. The method according to paragraph 36, wherein the proteomic analysis is  conducted using a liquid chromatography coupled to a hybrid mobility spectrometry with nano-electrospray ion source. 38. The method according to paragraph 36, the step of performing the statistical  analysis to identify and select the potential biomarkers with significant expression levels between ES, LS, AIS and control groups, based on the predefined significance thresholds, yielding models with performance metrics for classification further comprising: generating statistical values for each biomarker and selecting biomarkers having a fold change (FC) > 1.2 or < 1 / 1.2 with a P-value < 0.05 and an AUC ≥ 0.80 with a P-value < 0.05 and to discriminate ES from LS. 39. The method according to paragraph 36, wherein, the step of refining the selection  by assessing the biomarkers for consistent temporal change, resulting in the identification of at least one protein biomarker that indicates early stroke onset time further comprising: eliminating biomarkers with inconsistent or no change in expression level over time  and selecting those with a consistent unidirectional increase or decrease in protein expression.

[0061] Further embodiments of the present invention are further illustrated by way of working examples below.

[0062] Example 1

[0063] Profiling of blood proteome to identify acute ischaemic stroke patients within 4.5 hours from 4.5-24 hours onset

[0064] Participants

[0065] The enrolment of participants of this prospective observational study was performed between January 2020 to February 2021 in Ningbo No. 2 Hospital. The inclusion criteria were: 1) AIS patients within 24h from symptom onset; 2) control participants with no stroke symptoms and neurological diseases; 3) age ≥ 18 years; 4) informed consent form. The exclusion criteria were: 1) history of stroke; 2) disability caused by other diseases; 3) noncompliance with neurological examination and follow-up; 4) AIS patients not compliant with completing brain CT / MRI examination; 5) no consent form.

[0066] The following clinical data were obtained at admission: demographic information, medical history and medications. Stroke severity was assessed at admission and discharge using the NIHSS. The TOAST classification was utilized to assess the etiology of stroke. The mRS was employed to evaluate the outcome at 3 months following the occurrence of stroke. An mRS score of 3-6 points was deemed indicative of a poor outcome. The diagnosis of AIS was confirmed by the presence of a diffusion-weighted imaging (DWI) positive lesion on MRI or the identification of a new lesion on CT image. The infarct volume (mm3) was calculated based on MRI-DWI or CT image (when MRI is not available) by use of the (a×b×c)  / 2 method. Researchers were blind to biomarker data at the time of clinical diagnosis. The study protocol was endorsed by the ethics committee of Ningbo No. 2 Hospital (Approval number: YJ-NBEY-KY-2023-099-01) , with all participants providing written informed consent.

[0067] Blood sampling

[0068] Blood was collected upon hospital admission using a potassium ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Vacutainer tube. The blood tubes were transferred on ice to the laboratory facility of the hospital and centrifuged at 3500rpm for 10 min at 4 ℃. The plasma samples were promptly frozen and stored at -80 ℃ until the measurement of biomarkers. The duration between stroke onset and blood sampling was documented.

[0069] Proteomic Analyses

[0070] Untargeted proteomics measurement was conducted at Shanghai Lu-Ming Biotech Co., Ltd. The experimental principle is as follows: After the extracted protein is enzymatically hydrolyzed into peptide fragments, the peptides are subjected to mass spectrometry (MS) analysis. By comparing the signal intensities of the corresponding peptides in different samples, relative quantification detection of the corresponding proteins is achieved. Specifically, plasma samples were subjected to proteomic profiling using liquid chromatography coupled to a hybrid trapped ion mobility spectrometry (TIMS) quadrupole and time-of-flight (TOF) mass spectrometry via a nano-electrospray ion source (LC-MS / MS) . The process consisted of two main steps. In the first step, the traditional data-dependent acquisition (DDA) method was used to establish a protein spectral library. During this process, the spectral output from mass spectrometry is matched against theoretical spectra generated from the fasta database. The LC-MS / MS raw files were imported into Spectronaut Pulsar 16.2.220903.53000 software for database searching and library building. In the second step, data-independent acquisition (DIA) technology was employed to collect mass spectrometry data for each sample, enabling spectrum matching, extraction of quantitative information, and subsequent statistical analysis based on the DDA database. Spectronaut Pulsar software was utilized for the processing of DIA raw data, with the database searching sequence file as ‘uniprot-Homo sapiens-9606-2023.2.1. fasta’ . Upon obtaining the raw data through database retrieval, proteins are qualified and quantified and that demonstrated expression in over 50%of samples within any group were preserved. Any missing protein expression values in groups with a valid value proportion equal to or greater than 50%were filled using the mean expression value of the respective protein within the same group. Any missing protein expression values in groups with a valid value proportion less than 50%were filled using the minimum expression value of the respective protein in samples. Following this, the protein expression values underwent median normalisation and log2 conversion, ultimately resulting in the generation of credible protein with relative quantification value.

[0071] Statistical analysis

[0072] Comparative analysis of proteomic differences involved both multivariate and univariate statistical methods. Univariate analysis mainly included Student's t-test and fold change analysis to compare the proteins between two groups. Classification performance was presented as AUC, sensitivity and specificity. Logistic regression was used to develop different models in predicting AIS within 4.5h. The time-dependent changes of metabolites were modelled using nonlinear curve fitting. P values < 0.05 was considered to indicate statistically significant differences. Statistical analyses were performed in R software. A graph software was employed to generate box plots and time-dependent curves.

[0073] Results

[0074] Participants

[0075] A total of 30 patients with AIS and 12 controls were included. According to the onset time, AIS patients were divided into two groups: the early AIS group (ES) , with onset time within 0-4.5h (n=16) , and the late AIS group (LS) , with onset time within 4.5-24h (n=14) . The demographic and clinical characteristics of the participants were shown in Table 3. Age, gender, and risk factors (such as diabetes, hypertension, hyperlipidaemia) did not significantly differ between the AIS and control groups. There were no significant differences between ES and LS groups in terms of age, gender, risk factors (smoking, alcohol consumption, diabetes, hypertension, hyperlipidaemia, atrial fibrillation) , infarction volume, and TOAST classification. But significant difference existed in admission NIHSS score, indicating higher severity in LS group. The average time from onset to sampling was 1.5h in ES group and 15h in LS group. Table 3 IQR, interquartile range; NIHSS, National Institute of Health Stroke Scale; TOAST, Trial of  Org 10172 in Acute Stroke Treatment; AIS, acute ischaemic stroke; ES, early acute ischaemic stroke with onset time within 4.5h; LS, late acute ischaemic stroke with onset time >4.5h.

[0076] Differential proteins between ES and LS groups

[0077] After MS-based proteomic profiling, quality control and data preprocessing, a total of 910 proteins were identified. To identify differential proteins, the present invention conducted comparisons using t-tests between AIS and control groups and ES and LS groups, basing on a significance threshold of p<0.05 and fold change (FC) > 1.2 or < 1 / 1.2. The results demonstrated that, compared to the control group, the AIS group exhibited 142 proteins downregulated and 137 proteins upregulated (Figure 1A) , with a total of 279 differential proteins. Subsequently, the ES group had 93 proteins with lower level than the LS group, and 129 proteins with higher level (Figure 1B) , resulting in a total of 222 differential proteins. The present invention removed several differential proteins that lacked corresponding gene names. Then, the present invention took the intersection of the proteins obtained from these two comparisons (Figure 1C) , yielding 69 overlapping proteins. These 69 differentially expressed proteins are the target list for exploring potential biomarkers for identification of ES.

[0078] Stepwise identification of potential biomarkers for discriminating ES and LS

[0079] To discover the most promising protein biomarkers, progressive screening was performed (Figure 2) . Initially, 910 proteins were identified through untargeted mass spectrometry analysis. Of these, 69 proteins were filtered out based on Figure 1C, meeting the criteria of significant differences (P < 0.05) and FC > 1.2 or < 1 / 1.2 in both the AIS vs. HC comparison and the ES vs. LS comparison. Subsequently, additional filtering criteria were applied. First, the proteins were evaluated based on their ability to differentiate the ES and LS groups using the AUC, resulting in 59 proteins with corresponding p-values <0.05. Next, the selection criteria were refined to require an AUC ≥ 0.8 for differentiation, leading to 23 proteins meeting the criteria. Finally, the proteins were assessed for their unidirectional increase or decrease temporal change, resulting in the final selection of 21 proteins.

[0080] The 21 proteins and their individual performance to differentiate between ES and LS are displayed in Table 4, ranking in descending order based on AUC values. They were also assigned the variable numbers V1 to V21. These 21 proteins are the selection of promising biomarkers for identifying AIS within 4.5h. Table 4 FC, fold change; p-value, comparison between early and late acute ischaemic stroke groups;  AUC, area under the curve; EPB42, Protein 4.2; PEBP1, Phosphatidylethanolamine-binding protein 1; TKFC, Triokinase / FMN cyclase; PIK3IP1, Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein 1; CD36, Platelet glycoprotein 4; DDR1, Epithelial discoidin domain-containing receptor 1; IL1R2, Interleukin-1 receptor type 2; AHSP, Alpha-hemoglobin-stabilizing protein; RNASE3, Eosinophil cationic protein; ADAM15, Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 15; HEXA, Beta-hexosaminidase subunit alpha; XPNPEP2, Xaa-Pro aminopeptidase 2; SMPDL3A, Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3a; PDCD6IP, Programmed cell death 6-interacting protein; PTPN6, Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6; TPM2, Tropomyosin beta chain; FDPS, Farnesyl pyrophosphate synthase; TUBB, Tubulin beta chain; IGHE, Immunoglobulin heavy constant epsilon; RAB7A, Ras-related protein Rab-7a; KPNB1, Importin subunit beta-1.

[0081] Logistic regression was utilised to determine the various combinations of these proteins and analyse their capacity to differentiate between ES and LS. The present invention found a substantial number of logistic regression models derived from these 21 proteins that exhibited an AUC exceeding 0.95 (the highest AUC value among individual proteins) . The present invention has listed the models with the highest AUC and their differentiation performance in Table 5. Table 5 AUC, area under the curve; PPV, positive predictive value; NPV, negative predicted value  Variable numbers are taken from Table 4.

[0082] Next, the present invention randomly selected one model from this list, namely V2+V9+V13 (i.e., PEBP1 + RNASE3 + SMPDL3A, See Table 4) , as an illustrative example for showcasing the subsequent application approach. To show more details of the 3 protein variables in this model, their relative expression levels in the ES and LS groups are depicted in box plots (Figures 3A, 3C and 3E) . Their temporal profiles are exhibited in Figures 3B, 3D and 3F derived from example model V2+V9+V13 in predicting probability of ES and their clinical application.

[0083] In the initial step, the present invention assigned a point value to each variable in the logistic regression V2+V9+V13 model based on their coefficients, approximating them round up to the nearest integer (Table 6) . As an example, the point value can be matched to the variable by: 1. Adding all the variable coefficients up to give a total. Which, in the case of Table 6  data, is 5.02) ; 2. Dividing the total by each variable coefficient. Which, in the case of Table 6 data, is: PEBP1 becomes 0.74 / 5.02 = 15%; RNASE become 2.44 / 5.02 = 50%; SMPDL3A becomes 1.84 / 5.02 = 37%. 3. Simplifying these percentages to ratio numbers results in the Table 6 point values: PEBP1 translates into “1” ; RNASE translates into “3” (i.e. 50%is three times 15%after rounding) ; SMPDL3A translates into “2” (i.e. 37%is two times 15%after rounding) . Table 6. Point value of each variable in example model V2+V9+V13 for predicting  early ischemic stroke

[0084] During the clinical application process, when the detected value of the corresponding protein surpasses the predetermined threshold, the assigned point value is obtained; otherwise, a score of 0 is assigned. The point values of the three proteins are summed, resulting in a maximum score of 6 and a minimum score of 0. Thus, the total score will range between 0 and 6. Based on the study population, 5 individuals scored between 0-2, none of whom had ES (0%) , indicating a low-risk stratification of ES. Among the 10 individuals who scored between 3-5, two had ES (20%) , indicating a moderate risk stratification of ES. Among the 15 individuals who scored 6, 14 individuals had ES (93.3%) , indicating a high stratification of ES (Table 7) . Table 7. Total score and risk stratification of early stroke basing on model V2+V9+V13

[0085] To provide a more visual representation of the relationship between the probability of ES and the ES risk stratification, the present invention constructed a histogram (Figure 4A) . Additionally, the present invention transformed this logistic regression model into an algorithm, where the expression values of the three proteins are substituted into the equation, yielding the probability ES (Figure 4B) .

[0086] In the case of V2+V9+V13, the following algorithm was used:

[0087] p (ES) = 1  /  (1 + exp (77.241 -0.739*V2 -2.447*V9 -1.838*V13) .

[0088] Clinicians can determine the probability of a stroke patient, with an unknown onset time, having an onset within 4.5h either using scoring method (Tables 6 and 7, and Figure 4A) or computer-based algorithmic method (Figure 4B) . If the probability is high, following the exclusion of other contraindications, thrombolytic therapy can be administered. If the probability is moderate or low, the possibility of the patient exceeding the thrombolytic time window is considered, and thrombolytic therapy will not be administered.

[0089] In some cases, the above algorithm for model V2+V9+V13 does not apply. Each combination is an independent logistic regression model and has its own algorithm. Model V2+V9+V13 was used as an example, showcasing how the 21 proteins could be used to identify early AIS within 4.5h of onset time. Some additional exemplary algorithms are also provided:

[0090] In the case of V2+V8+V13, the following algorithm can be used:

[0091] p (ES) = 1  /  (1 + exp (44.3144 -0.973*V2 -1.077*V8 -0.934*V13) .

[0092] In the case of V1+V5+V8, the following algorithm can be used:

[0093] p (ES) = 1  /  (1 + exp (39.906 -0.868*V1 -0.834*V5 -0.940*V8) ) .

[0094] Additionally, a list of algorithms used for calculating a score indicating the likelihood of suffering from early AIS for other models (for other combinations of proteins) is shown in Table 8. Table 8. Algorithms for other models.

[0095] Discussion

[0096] This invention aims to identify potential protein biomarkers for distinguishing AIS patients on whether their onset time was within or exceeded 4.5h. Through high-throughput proteomic profiling and logistic regression model development, the present invention identified 21 candidate proteins and a serial of logistic regression models, with AUC up to 0.996 (0.983-1) , sensitivity 93.8%, and specificity 100%. The present invention has developed two approaches, scoring method and computer-based algorithm, to enable physicians to evaluate the probability of stroke onset within 4.5h, allowing them to make decisions regarding the eligibility of thrombolytic therapy for the patient.

[0097] The meaning, clinical relevance, and application of the findings

[0098] According to current clinical practice, when a patient with stroke symptoms is admitted to the hospital and a CT scan shows no HS, AIS would be strongly considered. If the symptom onset is within 4.5h, after ruling out any other contraindications, IVT will be administered. However, if the onset time is unclear and the time gap between the last known well and symptom recognition exceeds 4.5h, IVT will not be performed. Research indicated that up to 30%of these patients were candidates for IVT. Regrettably, these patients were deprived this opportunity. The significance of the research lies precisely in here, utilizing biomarkers to identify this specific subgroup of patients and provide them with the chance of IVT. Moreover, biomarker measurement possesses multiple advantages. Compared to advanced neuroimaging techniques (MRP / CTP, DWI-FLAIR) , biomarker detection serves as a simpler and more affordable approach. If converted to a point-of-care test (POCT) , the results can be obtained within approximately 10-15 minutes, providing a rapid and efficient solution that compensates for the limitations of advanced imaging. It can be broadly applied in emergency, pre-hospital, and outpatient settings. Therefore, this study explored a tailored management strategy for AIS patients with unknown onset time and would bring about a range of benefits, including promoting patients’ recovery of neurological function, enhancing quality of life, shortening duration of hospitalization and rehabilitation, reducing patients’ reliance on family and society, alleviating burdens of healthcare system, diminishing expenses of long-term care, conserving medical and social resources. Furthermore, patients and their family members can reintegrate into social and economic activities, fostering economic development.

[0099] Explanation of the findings and the biological plausibility of the potential proteins

[0100] The identified 21 proteins are closely connected to the pathophysiological responses occurring in the body after AIS, including maintaining the stability and deformability of red blood cells, participating in platelet aggregation process, cellular energy supply, apoptosis, inflammation, immune response, cell migration, proliferation, and differentiation. The pathophysiological function of these proteins is displayed in Table 9. Table 9 EPB42, Protein 4.2; PEBP1, Phosphatidylethanolamine-binding protein 1; TKFC,  Triokinase / FMN cyclase; PIK3IP1, Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein 1; CD36, Platelet glycoprotein 4; DDR1, Epithelial discoidin domain-containing receptor 1; IL1R2, Interleukin-1 receptor type 2; AHSP, Alpha-hemoglobin-stabilizing protein; RNASE3, Eosinophil cationic protein; ADAM15, Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 15; HEXA, Beta-hexosaminidase subunit alpha; XPNPEP2, Xaa-Pro aminopeptidase 2;SMPDL3A, Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3a; PDCD6IP, Programmed cell death 6-interacting protein; PTPN6, Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6; TPM2, Tropomyosin beta chain; FDPS, Farnesyl pyrophosphate synthase; TUBB, Tubulin beta chain; IGHE, Immunoglobulin heavy constant epsilon; RAB7A, Ras-related protein Rab-7a; KPNB1, Importin subunit beta-1.

[0101] For example, PEBP1 (Phosphatidylethanolamine-binding protein 1) , also known as Hippocampal cholinergic neuro-stimulating peptide precursor protein (HCNP-pp) and Raf kinase inhibitor protein (RKIP) , is a versatile protein involved in various biological processes and signalling pathways. HCNP-pp expression level exerts control over the differentiation process of neural progenitor cells in the hippocampus. RKIP modulates apoptosis in PC12 cells, a widely used cell model in neurobiology research, under conditions of oxygen-glucose deprivation via the NF-κB and ERK signalling pathways. RKIP also plays a significant role in the protection against cerebral ischaemic injury by inhibiting the excessive activation of microglia, reducing their motility, and promoting neuronal survival. Another study indicated that the inhibitory effect of RKIP on the inflammatory response might contribute to its protective effect on cerebral ischaemic injury. Therefore, PEBP / RKIP / HCNP-pp is a multifunctional protein involved in diverse brain related pathophysiological processes and may serve as a potential biomarker for ES.

[0102] RNASE3 (Ribonuclease 3) or RNS3, also named Eosinophil cationic protein (ECP) , is one member of the RNase superfamily found in humans, which possesses neurotoxicity and could kill Purkinje cells. ECP was reported to induce dose-dependent apoptosis on cultured cerebellar granule cells and astrocyte. In addition, ECP has also been linked to atherosclerosis and cardiovascular disease and a higher level of ECP is associated with an increased occurrence of AIS. The results demonstrate an elevation of RNASE3 following AIS, which may exacerbate neuronal cell death according to the above.

[0103] Another example is SMPDL3A (Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3a) , a secreted enzyme, also known as acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3a (ASML3A) , is the primary nucleotide phosphodiesterase secreted by human THP-1 macrophages following liver X receptor stimulation. It could potentially have a role in the pathobiology of atherosclerosis. The results demonstrate a decrease of SMPDL3A levels in the peripheral circulation following AIS, while the specific mechanism behind this requires further exploration.

[0104] DDR1 (Discoidin domain receptor 1) , a member of the discoidin domain receptor family of tyrosine kinases, primarily controls the synthesis and breakdown of collagen, and monitors the formation of extracellular matrix components. In rats, the expression of DDR1 was upregulated after focal cerebral ischaemia. The suppression of DDR1 expression contributed to the attenuation of blood-brain barrier (BBB) disruption and cerebral damage through the downregulation of MMP-9. Another study demonstrated that down-regulating DDR1 had protection effect against cerebral ischaemic injury. The results also display an elevation of DDR1 levels following AIS, which may be associated with BBB disruption.

[0105] Added evidence substantiating the ‘molecular clock’ strategy

[0106] Apart from the aforementioned research on advanced neuroimaging techniques, the ‘molecular clock’ method is an emerging avenue in predicting the onset time of AIS. The present invention found two studies in this direction have been published to date. One study employed ELISA to analyze 29 proteins in the serum of AIS patients. The results showed that GST-π had an AUC of 0.79 in distinguishing AIS patients within and beyond 3h of onset. The sensitivity and specificity were 91% / 50% (cut-off: 17.7ug / ml) or 50% / 91% (cut-off: 65.2ug / ml) , and it demonstrated an AUC of 0.83 in recognizing IVT-eligible patients. The study shares similarities with this research as both directly utilize clinical samples and data, providing a closer approximation to future application scenarios. The difference lies in the implementation of high-throughput proteomic method to thoroughly screen the potential proteins.

[0107] Another study performed serum metabolomics analysis using the rat middle cerebral artery occlusion (MCAO) model and employed machine learning methods to screen 5 metabolites out of 1124 candidates as predictive biomarkers for the onset time of AIS. The difference is that the present invention utilised human samples, which provide a more direct perspective than animal models. Moreover, during the biomarker screening process, the present invention referred the temporal profiles of proteomics and eliminated those exhibiting U-shaped or parabolic patterns. The present invention retained only the proteins with unidirectional upward or downward trends, representing a methodological refinement.

[0108] Conclusions

[0109] The present invention identified 21 potential protein biomarkers and a serial of models with high performance in discriminating onset time of AIS within 4.5h. The present invention also developed two methods, scoring and computer-based algorithm, to assess the probability of onset time within 4.5h for clinical decision making. Example 2

[0110] Investigation of blood metabolites to identify acute ischaemic stroke patients ≤ 4.5h from 4.5-24h onset

[0111] Methods

[0112] Participants

[0113] The enrolment of participants to this prospective observational study was performed between January 2020 to February 2021 in Ningbo No. 2 Hospital. The inclusion criteria were: 1) AIS patients within 24h from symptom onset; 2) age ≥ 18; 3) informed consent form. The exclusion criteria were: 1) history of stroke; 2) disability caused by other diseases; 3) non compliance with neurological examination and follow-up; 4) non compliance with completing brain CT / MRI examination; 5) no consent form. The following clinical data were obtained at admission: demographic information, medical history and medications. Stroke severity was assessed at admission and discharge using the NIHSS.

[0114] The TOAST classification was utilized to assess the etiology of stroke. The mRS was employed to evaluate the outcome at 3 months following the occurrence of stroke. An mRS score of 3-6 points was deemed indicative of a poor outcome. The diagnosis of AIS was confirmed by the presence of a DWI positive lesion on MRI or the identification of a new lesion on CT image. The infarct volume (mm3) was calculated based on MRI-DWI or CT image (when MRI is not available) by use of the (a×b×c)  / 2 method. Researchers were blind to biomarker data at the time of clinical diagnosis. The study protocol was endorsed by the ethics committee of Ningbo No. 2 Hospital (Approval number: YJ-NBEY-KY-2023-099-01) , with all participants providing written informed consent.

[0115] Blood sampling

[0116] Blood was collected upon hospital admission using a potassium EDTA Vacutainer tube. The blood tubes were transferred on ice to the laboratory facility of the hospitals and centrifuged at 3500g for 10 min at 4 ℃. The plasma samples were promptly frozen and stored at -80 ℃ until the measurement of biomarkers. The duration between stroke onset and blood sampling was documented.

[0117] Metabolomic Analyses

[0118] Untargeted metabolomics measurement was conducted by experimenters blinded to the diagnosis and grouping information of participants at Shanghai Lu-Ming Biotech Co., Ltd. Plasma samples were subjected to metabolic profiling analysis using liquid chromatography coupled with a mass spectrometer that equipped with an electrospray ionization (ESI) source. The identification of metabolites relied on precise mass-to-charge ratio (m / z) , secondary fragments, and isotopic distribution using a software through searching in Human Metabolome Database (HMDB) , Lipid Maps (V2.3) , METLIN and pre-determined databases. The identified metabolites underwent scoring and qualifying, with a score range of 0 to 80. Metabolites scoring below 36 were deemed inaccurately identified and were subsequently eliminated. Metabolites were included if they were detectable in at least 50%of the samples. Missing values were defined as 50%of the lowest value within the group.

[0119] Statistical analysis

[0120] Comparative analysis of metabolic differences involved both multivariate and univariate statistical methods. The multivariate analysis began with supervised orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) , which was employed to highlight the differences between different groups within the model and distinguish the metabolites that differ between groups. Variable importance of projection (VIP) values was calculated from the OPLS-DA model, with VIP>1 indicating potential biomarkers. To prevent overfitting, the model was subjected to 7-fold cross-validation and 200 iterations of response permutation testing (RPT) to assess its robustness. Univariate analysis mainly included Student's t-test and fold change analysis to compare the metabolites between two groups. Differential metabolites were selected with VIP values greater than 1.0 and p-values less than 0.05. Comparisons among three or more groups were conducted using ANOVA, followed by post-hoc analysis using Duncan's test. Correlation analysis was performed using Pearson's correlation. The time-dependent changes of metabolites were modelled using nonlinear regression curve fitting. P values < 0.05 was considered to indicate statistically significant differences. Statistical analyses were performed using R software. A graph software was employed to generate box plots, time-dependent curves, and correlation analysis graphs.

[0121] Results

[0122] Participants

[0123] Totally 30 patients with AIS were included in this study. According to the onset time, these patients were divided into two groups: the ES group, with onset time within 0-4.5h (n=16) , and the LS group, with onset time within 4.5-24 hours (n=14) . The demographic and clinical characteristics of the two groups were shown in Table 10. There was no significant difference between two groups in age, gender, risk factors (smoking, alcohol, diabetes, hypertension, hyperlipidaemia, atrial fibrillation) , infarction volume, TOAST classification. But significant difference existed in admission NIHSS score, indicating higher severity in LS group. As time goes on, cells in the infarction core and penumbra area gradually die, leading to a progressive worsening of symptoms in LS group. The average time from onset to sampling was 1.5 hours in ES group and 15 hours in LS group. Table 10

[0124] Differential metabolites between ES and LS groups

[0125] Following quality control and data preprocessing, a total of 4,559 named metabolites were identified. The classification of these metabolites is shown in Figure 5A, with the largest numbers belonging to benzenoids, organo-heterocyclic compounds, and organic acids and derivatives. Next, OPLS-DA was performed (Figure 5B) and showed apparent differences between two groups. Then, a comparison of metabolite abundances between the two groups was carried out using a t-test, which revealed 359 significantly different metabolites (P < 0.05) . As the larger the VIP value, the greater the contribution of the metabolite in distinguishing between two groups, 85 differential metabolites were finally selected meeting both the criteria that VIP > 1 and t-test p-value < 0.05, with 44 metabolites downregulated and 41 upregulated. Afterward, the present invention used a clustering heatmap (Figure 5C) to visually illustrate the expression differences of the 85 metabolites among different samples and groups and employed a volcano plot (Figure 5D) to visualize the differences in p values, VIP, and fold change (FC) , enabling a more intuitive representation of the degree of differences in these metabolites. To elucidate the metabolic pathways that are most significantly linked to these differentially expressed metabolites, the present invention conducted pathway enrichment analysis based on the KEGG database. The enriched metabolic pathways are presented in Figure 5E (related to upregulated metabolites) and Figure 5F (related to downregulated metabolites) .

[0126] Stepwise identification of potential biomarkers for discriminating ES and LS

[0127] To discover the most promising metabolites, progressive screening was performed (Figure 6) . The present invention obtained 85 differential metabolites (p < 0.05 and VIP > 1) above. Subsequently, AUC was calculated to see the discriminatory ability of these metabolites, yielding 68 metabolites exhibited corresponding p-values < 0.05. Following this, the present invention applied a criterion of AUC > 0.75 to select metabolites with better discriminatory performance, resulting in 38 metabolites. Next, considering the time of sample collection, the present invention plotted the temporal profiles of these metabolites after the occurrence of AIS. Based on these change patterns, the present invention can predict the time of stroke onset, and from this perspective, such molecules can be referred to as ‘molecular clocks’ . The present invention selected metabolites that exhibited a unidirectional increase or decrease pattern, excluding those with parabolic or U-shaped patterns, resulting in 17 metabolites that met the criteria. The 17 metabolites and their individual performance to differentiate between ES and LS were displayed in Table 11, ranking in descending order based on AUC values. Table 11 VIP: Variable Importance of Projection; FC: fold change; AUC: area under the curve.

[0128] Furthermore, the present invention conducted random forest variable importance analysis to rank the importance of these 17 metabolites (Figure 7A) in classifying ES and LS and generated combined ROC curves for the top-ranked metabolites. The results revealed a combined AUC value of 0.964 for the top two metabolites, 0.951 for the top three, 0.955 for the top four, and 0.95 for the top five. The top 2 metabolites achieved the highest AUC (0.964, 95%CI 0.9-1) (Figure 7B) , therefore, the present invention selected them as the most promising panel for distinguishing between the two groups. Specifically, the top two metabolites are Biliverdin and Nicotinamide N-oxide (NAMO) . Their individual and combining rule-in and rule-out performance to identify stroke patients within 4.5h from symptom onset are displayed in Table 12. When Biliverdin and NAMO were used independently, the AUCs for classifying the two groups were 0.85 (95%CI, 0.71-0.99) and 0.95 (95%CI, 0.87-1) respectively. When they were combined the AUC was 0.964 (95%CI 0.9-1) . Table 12 AUC, area under the curve; PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value;  NAMO, Nicotinamide N-oxide

[0129] By utilizing the dual threshold method, the cutoff of Biliverdin for rule-in of AIS within 4.5h was ≥ 27040, generating a specificity of 86%, a sensitivity of 63%, and a positive predictive value (PPV) of 83.3%. The cutoff for rule-out of AIS within 4.5h was < 16200, resulting in a sensitivity of 94%, a specificity of 79%, and a negative predictive value (NPV) of 91.7%. Approximately 80%of patients were optimally classified, with a ‘grey zone’ comprising 20%.

[0130] For NAMO, a cutoff of ≤ 755 provided a specificity of 100%, a sensitivity of 69%, and a PPV of 100%for ruling in AIS within 4.5h. A cutoff of > 2020 yielded a sensitivity of 100%, a specificity of 79%, and an NPV of 100%for ruling out AIS within 4.5h. The proportion in the ‘grey zone’ was 26.7%.

[0131] In a combined a panel a level of either NAMO ≤ 755 or Biliverdin ≥ 27040 indicated ruling in AIS within 4.5h. This achieved a specificity of 100%, a sensitivity of 94%, and a PPV of 100%.

[0132] A level of NAMO > 2020 or Biliverdin < 16200 for ruling out AIS within 4.5h resulted in a sensitivity of 93.8%, a specificity of 100%, and an NPV of 93.3%. Using this panel, there was no 'grey zone' in the study cohort. Figures 7C and 7D show the abundance of both metabolites in the ES and LS groups. Figures 7E-7F illustrate their temporal change after AIS onset over time.

[0133] The association between the two metabolites and various clinical measures

[0134] Pearson correlation analysis indicated that in the LS group, there was an increasing trend of Biliverdin in peripheral blood with the enlargement of infarct volume (r=0.83, p=0.01, Figure 8A) . No significant correlation was observed between both metabolites and the variation in infarct volume in the ES group (Figures 8A and 8B) . There was no significant correlation between both metabolites and NIHSS scores (Figures 8C and 8D) . The concentrations of both metabolites did not differ significantly among the TOAST classification groups (Figures 8E and 8F) . When grouped according to 3-month mRS: good prognosis with self-care ability (0-2) and poor prognosis with inability to self-care (3-6) , there was no significant difference in the concentrations of both metabolites detected within 24 hours of onset between the two prognosis groups (Figures 8G and 8H) .

[0135] Discussion

[0136] The present invention aimed to identify potential metabolite biomarkers for distinguishing AIS patients on whether their onset time was within or exceeded 4.5 hours. Through high-throughput metabolomic profiling and a machine learning approach, the present invention identified 17 metabolites and a best panel of two candidate metabolites, namely Biliverdin and NAMO, with a combined AUC of 0.964 with a specificity of 100%, a sensitivity of 94%for ruling in AIS within 4.5h. Interestingly, the levels of these two metabolites were unrelated to the severity of clinical symptoms (admission NIHSS) and TOAST subtypes and did not vary based on 3-month prognosis. These two metabolites could be potentially used for identification of AIS patients within 4.5h of onset, including those with wake-up stroke or unwitnessed stroke, thereby providing them with an opportunity to receive IVT and improve clinical outcomes.

[0137] The meaning, clinical relevance, and application of the findings

[0138] According to current clinical practice, when a patient with stroke symptoms is admitted to the hospital and a CT scan shows no HS, AIS would be strongly considered. If the symptom onset is within 4.5h, after ruling out any other contraindications, IVT will be administered. However, if the onset time is unclear and the time gap between the last known well and symptom recognition exceeds 4.5h, IVT will not be performed. Research indicated that up to 30%of these patients were candidates for IVT. Regrettably, these patients were deprived of this opportunity. The significance of the research lies precisely in here, utilizing biomarkers to identify this specific subgroup of patients and provide them with the chance of IVT. Moreover, biomarker measurement possesses multiple advantages. Compared to advanced neuroimaging techniques (MRP / CTP, DWI-FLAIR) , biomarker detection serves as a simpler and more affordable approach. If converted to point-of-care testing (POCT) , the results can be obtained within approximately 10-15 minutes, providing a rapid and efficient solution that compensates for the limitations of advanced imaging. It can be broadly applied in emergency, pre-hospital, and outpatient settings. Therefore, this study explored a tailored management strategy for AIS patients with unknown onset time and would bring about a range of benefits, including promoting patients’ recovery of neurological function, enhancing quality of life, shortening duration of hospitalization and rehabilitation, reducing patients’ reliance on family and society, alleviating burdens of healthcare system, diminishing expenses of long-term care, conserving medical and social resources. Furthermore, patients and their family members can reintegrate into social and economic activities, fostering economic development.

[0139] Explanation of the findings and the biological plausibility of the two metabolites

[0140] The panel of biliverdin and NAMO exhibits high potential with excellent differentiation performance for ES and LS, achieving a combined AUC of 0.96. Furthermore, their circulating concentrations remain unaffected by NIHSS scores and TOAST classification and NAMO is independent of the size of infarction volume, which makes them more conducive to assess whether the onset time of patients with AIS is within 4.5h or not. The underlying basis for these two metabolites to function as a ‘molecular clock’ are described as follows.

[0141] Bilirubin is one of the byproducts of mammalian heme degradation. Heme, located freely in the cytoplasm, mitochondria, and extracellular space in tissues, is converted to bilirubin, carbon monoxide, and free iron by heme oxygenase-1 (HO-1) and heme oxygenase-2 (HO-2) . Biliverdin is then rapidly converted to bilirubin by biliverdin reductase (BVR) . In the brain, HO-2 is constitutively expressed in neurons as an intrinsic protective role. However, HO-1 is induced in the presence of stress or hypoxia, and its metabolic product (bilirubin, carbon monoxide, and free iron) with moderate concentration exhibit protective effects against inflammation, oxidative stress, and apoptosis in the penumbra region of cerebral infarction. While in the core ischaemic area, excessive levels of HO-1 lead to mitochondrial damage, iron death, and blood-brain-barrier (BBB) disruption.

[0142] In the preliminary study, the present invention found a descending trend of biliverdin in blood where bilirubin should not normally appear. Therefore, the present invention hypothesized that bilirubin was released into the circulation through the leakage of the injured cells and BBB from the ischaemic core after AIS, resulting in elevated levels of bilirubin in peripheral blood. It is likely that the substantial cell lysis and death in the core region of the infarction immediately led to the release of a considerable amount of biliverdin into the bloodstream. As time progresses, the number of cells capable of inducing HO-1 and generating bilirubin decreased, resulting in a gradual decline in bilirubin level in the peripheral blood.

[0143] NAMO is one of the end products of nicotinamide which is a form of vitamin B3 in the body and serves as a precursor to Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) . NAD, an electron carrier during redox reactions, plays a critical role in numerous biological processes, especially in energy metabolism and cellular respiration. Apart from NAD synthesis, excessive nicotinamide is cleared from the body through two pathways. One pathway involves the methylation of nicotinamide to N1-methylnicotinamide (MNAM) , followed by further oxidation into two other substances for elimination from the body. Another pathway occurs within the endoplasmic reticulum of hepatocytes, where the enzyme CYP2E1 oxidizes nicotinamide to generate NAMO. This substance can be detected in both human blood and urine and is eventually excreted from the body through urine.

[0144] In the past, it was believed that the products of the two clearance pathways had no biological activity, but current understanding suggests that MNAM from the first pathway exhibits anti-thrombotic and anti-inflammatory effects in the body. In recent years, NAMO from the second clearance pathway has been found to inhibit excessive production of pro-inflammatory cytokines by microglia in a mouse model of herpes simplex encephalitis, thereby reducing brain inflammation. Moreover, NAMO is a selective antagonist of CXCR2 receptors in human cells, effectively suppressing neutrophil chemotaxis. As a result, it has potential implications in the treatment of inflammatory and immune disorders. The findings indicate an upward trend in NAMO levels within 24 hours after the occurrence of AIS. The following hypothesis are raised: whether this trend due to an upregulation of the second pathway triggered by cerebral ischemia; whether the activity of the enzyme CYP2E1 been enhanced; whether the first pathway has been suppressed; whether the increased blood level of NAMO is a result of reduced excretion through urine; whether is it because NAMO exhibits anti-inflammatory and anti-neutrophil chemotaxis effects, thereby prompting the body to increase its production. These hypotheses all require further investigation.

[0145] Added evidence substantiating the ‘molecular clock’ strategy

[0146] Apart from the aforementioned research on advanced neuroimaging techniques, the ‘molecular clock’ method is an emerging avenue in predicting the onset time of AIS. The present invention found two studies in this direction have been published to date. One study employed ELISA to analyze 29 proteins in the serum of AIS patients. The results showed that GST-π had an AUC of 0.79 in distinguishing AIS patients within and beyond 3h of onset. The sensitivity and specificity were 91% / 50% (cut-off: 17.7ug / ml) or 50% / 91% (cut-off: 65.2ug / ml) , and it demonstrated an AUC of 0.83 in recognizing IVT-eligible patients.

[0147] The study shares similarities with this research as both directly utilize clinical samples and data, providing a closer approximation to future application scenarios. The difference lies in the implementation of high-throughput metabolomics methods to obtain two metabolites with superior performance. Metabolites are the end products of numerous biological processes in the body, effectively reflecting pathological physiological processes, and thereby possessing potential as biomarkers for diseases. Another study performed serum metabolomics analysis using the rat middle cerebral artery occlusion (MCAO) model and employed machine learning methods to screen 5 metabolites out of 1124 candidates as predictive biomarkers for the onset time of AIS. Similarly, the research also used metabolomics and machine learning methods. However, one difference is that the present invention utilized human samples, which provide a more direct perspective than animal models. Another difference is that, during the biomarker screening process, the present invention referred the temporal profiles of metabolites and eliminated those exhibiting U-shaped or parabolic patterns. The present invention retained only the metabolites with unidirectional upward or downward trends, representing a methodological refinement. To sum up, the study takes a step forward in exploring the potential of biomarkers as ‘molecular clock’ , providing new evidence to this field.

[0148] Conclusions

[0149] The present invention identified 17 individual and a panel of two metabolites, Biliverdin and NAMO, and demonstrated their significance in discriminating onset time of AIS within 4.5h.

[0150] The present invention explained above is not limited to the aforementioned embodiment and drawings, and it will be obvious to those having an ordinary skill in the art of the prevent invention that various replacements, deformations, and changes may be made without departing from the scope of the invention.

Claims

1.A method comprising:(a) measuring at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker in a biological sample from a subject;(b) comparing the level of the at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker in the biological sample to a control; and(c) classifying the evaluated subject as “early acute ischaemic stroke” (ES, onset time within 4.5 hours) or “late acute ischaemic stroke” (LS, onset time exceeding 4.5 hours) .2.The method of claim 1, wherein the subject is a patient with one or more stroke symptoms.3.The method of claim 1 or 2, wherein the biological sample is one or more selected from a group consisting of blood, plasma, and saliva.4.The method of any one of claims 1-3, wherein the control comprises one or more reference levels of the at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker in subjects established as ES and LS.5.The method of claim any one of claims 1-4, wherein the control comprises proteomic or metabolic profiles of the at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker in subjects established as ES and LS.6.The method of any one of claims 1-5, wherein the at least one protein biomarker is selected from a group consisting of Protein 4.2 (EPB42) , Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 (PEBP1) , Triokinase / FMN cyclase (TKFC) , Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein 1 (PIK3IP1) , Platelet glycoprotein 4 (CD36) , Epithelial discoidin domain-containing receptor 1 (DDR1) , Interleukin-1 receptor type 2 (IL1R2) , Alpha-hemoglobin-stabilizing protein (AHSP) , Eosinophil cationic protein (RNASE3) , Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 15 (ADAM15) , Beta-hexosaminidase subunit alpha (HEXA) , Xaa-Pro aminopeptidase 2 (XPNPEP2) , Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3a (SMPDL3A) , Programmed cell death 6-interacting protein (PDCD6IP) , Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 (PTPN6) , Tropomyosin beta chain (TPM2) , Farnesyl pyrophosphate synthase (FDPS) , Tubulin beta chain (TUBB) , Immunoglobulin heavy constant epsilon (IGHE) , Ras-related protein Rab-7a (RAB7A) and Importin subunit beta-1 (KPNB1) , and combinations thereof.7.The method of any one of claims 1-6, wherein the at least one metabolite biomarker is selected from a group consisting of Nicotinamide N-oxide, Biliverdin, Kuguacin E, Allitridin, Azelaic acid, 1, 5-Naphthalenediamine, 2-Acetamido-2, 6-dideoxygalactose, 3 (4-Iodophenyl) -2-mercapto- (Z) -2-propenoic acid, PA (18: 0 / 6 keto-PGF1alpha) , Tryptophol, 10, 11-dihydro-leukotriene B4, 5-Hydroxy-2-imino-1-methylimidazolidin-4-one, Bicyclo Prostaglandin E2, (9S, 10S) -9, 10-dihydroxyoctadecanoate, lysine phosphoester, Indole and 3, 4-Bis (carboxymethyl) -3, 4-dihydroxyhexanedioic acid, and combinations thereof.8.The method of any one of claims 1-7, wherein the measuring at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker is carried out using one or more of mass spectrometry, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, and enzymatic assays.9.The method of any one of claims 1-8, wherein the measuring at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker is carried out using an ELIZA.10.The method of any one of claims 1-9, wherein the subject is determined as having ES if the level of the at least one protein biomarker is below the cutoff value the as shown in Table 1 if the protein biomarker shows an upward trend in its temporal expression after AIS onset, or if the level of the at least one protein biomarker is above the cutoff value the as shown in Table 1 if the protein biomarker shows an downward trend in its temporal expression after AIS onset.11.The method of any one of claims 1-9, wherein the at least one protein biomarker is a combination of two or three protein biomarkers.12.The method of claim 11, wherein the protein biomarkers are PEBP1 (V2) , RNASE3 (V9) , and SMPDL3A (V13) .13.The method of claim 11, wherein the probability of the subject having ES is determined based on the following equation: p (ES) = 1  /  (1 + exp (77.241 -0.739*V2 -2.447*V9 -1.838*V13) .14.The method of claim 13, wherein the subject is determined as having ES if the probability is more than 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 95%.15.The method of any one of claims 1-14, further comprising the step of administering an intravenous thrombolysis (IVT) , if the subject is determined as ES.16.A method for identifying potential metabolite biomarkers to discriminate early acute ischemic stroke (ES) from late acute ischemic stroke (LS) for subjects having or suspected of Acute Ischemic Stroke (AIS) based on metabolite expression level, the method comprising:performing a metabolomic analysis from blood samples obtained from a subject, scoring and qualifying the metabolite biomarkers with a score range of 0 to 80, wherein the metabolite biomarkers having scores below 36 are eliminated;preserving the metabolite biomarkers that demonstrate the level of at least 50%; performing a statistical analysis to identify and select the metabolite biomarkers with significant expression levels between ES and LS groups, based on predefined significance thresholds, yielding at least one machine learning model with performance metrics for classification;refining the selection by assessing the metabolite biomarker for consistent temporal change, resulting in identification of at least one metabolite biomarker that indicates ES; and,applying the at least one machine learning model to rank the biomarker based on importance level of the identified biomarker and select the biomarker based on predefined criteria.17.The method according to claim 16, wherein the identified and selected metabolite biomarkers are selected from a group consisting of Biliverdin and Nicotinamide N-oxide (NAMO) .18.The method according to claim 16, wherein, the metabolomic analysis is conducted using a liquid chromatography coupled to an ion mobility spectrometry with nano-electrospray ion source.19.The method according to claim 16, wherein the step of performing the metabolomic analysis from blood samples obtained from the subject, scoring and qualifying the metabolite biomarkers with the score range of 0 to 80, wherein the metabolite biomarkers having scores below 36 are eliminated further comprising:comparing the identified metabolite biomarker with known metabolomic databases including but not limited to Human Metabolome Database (HMDB) , Lipid Maps (V2.3) , METLIN and pre-determined databases.20.The method according to claim 16, wherein, the step of performing the statistical analysis to identify and select the potential biomarkers with significant expression levels between ES and LS control groups, based on the predefined significance thresholds, yielding models with performance metrics for classification further comprising:generating statistical values for each biomarker and selecting the biomarker based on the predefined significance thresholds of P-value < 0.05, a variable importance of projection (VIP) value > 1, AUC-P value < 0.05 and AUC value > 0.75.21.The method according to claim 16, wherein, the step of refining the selection by assessing the biomarkers for consistent temporal change, resulting in the identification of at least one metabolite biomarker that indicates ES further comprising:eliminating biomarkers with inconsistent or no change in circulating level over time and selecting those with a consistent unidirectional increase or decrease in metabolite level.22.The method according to claim 16, wherein the at least one machine learning model is a supervised orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) model which is subjected a 7-fold cross validation and 200 iterations of response permutation testing (RPT) to prevent overfitting of data.23.The method according to claim 16, wherein the step of applying the machine learning model to rank the biomarker based on the importance level of the identified biomarker and select the biomarker based on the predefined threshold further comprising:applying a random forest variable importance analysis to rank the biomarkers in descending order of importance; and,using a random forest model to combine top-ranked metabolites and rank their combined AUC in differentiating ES and LS.24.A system for determining early acute ischemic stroke (ES) onset time in a subject, comprising:one or more databases comprising known proteomic and metabolomic profiles;a sample collection unit for obtaining a biological sample from the subject;a biomarker unit configured to detect and quantify level of at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker or any combination thereof;a non-transitory computer-readable medium comprising instructions to determine likelihood of the stroke onset time being within or beyond intravenous thrombolysis (IVT) or other time-sensitive treatment time window; and,a user interface for displaying a result to a healthcare provider to administer IVT if the stroke onset time is within the IVT time window.25.The system according to claim 24, wherein the non-transitory computer readable medium further comprises a statistical analytic module and a machine learning model to predict the likelihood of the stroke onset time being within or beyond the IVT or other time-sensitive treatment time window.26.The system according to claim 24, wherein the non-transitory computer readable medium is further configured to compare the detected level of the at least one protein biomarker or at least one metabolite biomarker with predefined thresholds.

Images