ARIH1-modified immune cells and uses thereof

Abstract

Provided relates to immune cells (e.g., T cells such as γδ T cells) modified to have no or reduced expression and / or function of Ariadne homolog 1 (ARIH1) and further optionally BCL11B, uses thereof (e.g., for treating glioblastoma), and methods of generating thereof. Also provided are methods of modifying γδ T cells using pseudotyped lentiviruses (e.g., BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein pseudotyped lentiviruses).

Description

ARIH1-MODIFIED IMMUNE CELLS AND USES THEREOFCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0001] This application claims priority benefit of International Application No. PCT / CN2024 / 106941 filed on July 23, 2024, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety. REFERENCE TO AN ELECTRONIC SEQUENCE LISTING

[0002] The content of the electronic sequence listing (165392002441seqlist. xml; Size: 34,763 bytes; and Date of Creation: July 22, 2025) is herein incorporated by reference in its entirety. FIELD OF THE PRESENT APPLICATION

[0003] The present application relates to immune cells (e.g., T cells, such as γδ T cells, for example CAR-γδ T cells) modified to have no or reduced expression and / or function of Ariadne homolog 1 (ARIH1) and optionally no or reduced expression and / or function of BCL11B (such as immune cells modified to have no or reduced expression and / or function of ARIH1 and BCL11B proteins) , uses thereof (e.g., for treating glioblastoma) , and methods of generating thereof. Also provided are methods of modifying γδ T cells using a recombinant lentivirus that is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein, and uses thereof. BACKGROUND OF THE PRESENT APPLICATION

[0004] Immunotherapeutic approaches, including adoptive immune cell therapy (e.g., CAR-T therapy, CAR-NK therapy) , are playing an increasingly important role in the treatment of cancer, viral infections, and other pathophysiological autoimmune conditions. Compared to autologous immune cell therapy, which often requires a long and expensive customized manufacturing process and is not suitable for all patients, allogeneic immune cell therapy (e.g., universal CAR-T or CAR-NK therapy) utilizes immune cells that are derived from healthy donors and can provide off-the-shelf products suitable for many patients instead of only a single person.

[0005] Poor persistence of modified immune cells (e.g., allogeneic CAR-T or CAR-NK cells) can limit their therapeutic effectiveness (L. Jafarzadeh et al., Front Immunol. 2020; 11: 702) , and remains one of the biggest challenges for their applications. First, the patient’s immune system (e.g., host T cells, NK cells) will recognize infused non-HLA matched allogeneic immune cells as foreign and reject them, namely, host-versus-graft (HvG) responses. To overcome this issue, researchers have knocked out beta-2 microglobulin (B2M) required for human leucocyte antigen (HLA) class I expression in CAR-T cells using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)  / Cas9 (CRISPR-associated protein 9) (CRISPR / Cas9) system, to prevent host TCRαβ cells from recognizing donor CAR-T cells as foreign via HLA class I (Ren et al., Clin. Cancer Res. 2017; 23: 2255–2266) . However, T cells with reduced HLA class I expression are also targeted by host natural killer (NK) cells, representing a hurdle to prevent allogeneic T cell rejection (Liu et al. Curr. Res. Transl. Med. 2018; 66: 39–42; Ludigs et al., Nat Commun. 2016; 7: 10554) . Second, in addition to targeting T cells with reduced HLA class I expression, host NK cells can kill activated T cells (e.g., allogeneic CAR-T cells) due to the expression of ligands on the activated T cells, such as those that can be recognized by NKG2D or NKp46 expressed on NK cells (Waggoner et al., Nature. 2011; 481 (7381) : 394-398; Cerboni et al., Blood. 2007; 110 (2) : 606-15) . Third, allogeneic immune cells (e.g., CAR-T or CAR-NK cells) can experience activation-induced cell death (AICD) , which is a programmed cell death process due to the interaction of Fas receptor (Fas, CD95) and Fas ligands (FasL, CD95 ligand) . All above mechanisms contribute to the poor persistence of allogeneic immune cells in vivo.

[0006] Adoptive immunotherapy can also have limited application due to graft-versus-host-disease (GvHD) in patients. For example, CAR-T cells expressing endogenous T cell receptors (TCRs) may recognize major and minor histocompatibility antigens following administration to an allogeneic patient, leading to non-specific effects and development of GvHD in patients.

[0007] Unconventional T cells, such as γδ T cells, offer several advantages as they can respond to diverse microbial stimuli and transformed cells independently of the major histocompatibility complex (MHC) . The presence of γδ T cells in the tumor microenvironment strongly correlates with positive clinical outcomes, and they exhibit minimal GvHD in allogeneic settings. This makes γδ T cells an attractive option for engineered cell therapy, complementing αβ T cell-based therapies, which rely on specific TCR and / or CAR systems and face challenges in targeting tumors lacking well-defined therapeutic molecules (e.g., tumor-associated antigens or tumor-specific antigens) , such as acute myeloid leukemia (AML) . However, the genes that limit the function (s) of γδ T cells are largely unknown, and the effects of repetitive stimulation (such as occurs within the tumor microenvironment or in chronic infections) remain poorly understood, thereby limiting therapeutic applicability.

[0008] The disclosures of all publications, patents, patent applications and published patent applications referred to herein are hereby incorporated herein by reference in their entirety. BRIEF SUMMARY OF THE PRESENT APPLICATION

[0009] The present invention in one aspect provides a modified immune cell, wherein the modified immune cell has no or reduced expression and / or function of an ARIH1 protein. In some embodiments, the expression of the ARIH1 protein is reduced or inhibited by an antisense RNA, an siRNA, or an shRNA specifically recognizing an RNA encoding the ARIH1 protein. In some embodiments, the modified immune cell expresses a dominant negative ARIH1 protein variant or dominant negative fragment thereof. In some embodiments, the modified immune cell is genetically modified at the ARIH1 locus or at ARIH1 RNA. In some embodiments, the ARIH1 locus is modified by gene editing, or wherein the ARIH1 RNA is modified by RNA editing. In some embodiments, the gene editing comprises gene knockout (KO) .

[0010] In some embodiments according to any of the modified immune cell described above, the modified immune cell has or is further modified to have no or reduced expression and / or function of one or more other proteins selected from the group consisting of: PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3. In some embodiments, the other protein is a BCL11B protein. In some embodiments, the modified immune cell is genetically modified at the BCL11B locus or at BCL11B RNA. In some embodiments, the BCL11B locus is modified by gene editing, or wherein the BCL11B RNA is modified by RNA editing. In some embodiments, the gene editing comprises gene knockout (KO) .

[0011] In some embodiments according to any of the modified immune cells described above, the modified immune cell further expresses an engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor is a chimeric antigen receptor (CAR) , an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric TCR (cTCR) , a T cell antigen coupler (TAC) , or a TAC-like engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor is a CAR comprising: (i) an extracellular antigen binding domain specifically recognizing a target antigen; (ii) a transmembrane domain; and (iii) an intracellular signaling domain.

[0012] In some embodiments according to any of the modified immune cells described above, the modified immune cell is selected from the group consisting of a monocyte, a dendritic cell, a macrophage, a B cell, a T cell, a natural killer (NK) cell, or a combination thereof. In some embodiments, the modified immune cell is a T cell. In some embodiments, the T cell is selected from the group consisting of a helper CD4+ T cell, a cytotoxic CD8+ T cell, a memory T cell, a regulatory CD4+ T cell, a natural killer T (NKT) cell, a mucosal associated invariant T (MAIT) cell, a double negative T (DNT) cell, and a γδ T cell. In some embodiments, the T cell is a γδ T cell. In some embodiments the γδ T cell is selected from the group consisting of Vδ1 T cell, Vδ2 T cell, Vδ3 T cell, Vδ4 T cell, Vδ5 T cell, Vδ6 T cell, Vδ7 T cell, γδT1 cell, γδT2 cell, γδT17 cell, γδTreg cell, and γδTAPC cell. In some embodiments, the γδ T cell is Vγ9Vδ2 T cell.

[0013] In some embodiments according to any of the modified immune cells described above, compared to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein (and optionally further the BCL11B protein) , the modified immune cell: (i) has at least about 10%reduced expression and / or function of one or more of: IL13, IL5, IL17RB, TNFSF11, TNFSF10, TNFRSF11A, BATF3, CCR4, CCR8, IKZF3, CSF1, WNT5B, CD86, S1PR1, SELL, IL7R, CCR3, and ZBTB32; (ii) has at least about 10%higher expression and / or function of one or more of: NCAM1 (CD56) , KIT, CD3D, IL2RB, FCGR3A (CD16) , BACH2, NCR1 (NKp46) , NCR2 (NKp44) , NCR3 (NKp30) , KLRK1 (NKG2D) , CD244 (2B4) , KLRD1, KLRG1, CD27, GZMB, CSF2, SPRY2, PTPN6, CD300A, IL18RAP, TBX21, and CCL3; (iii) has at least about 10%higher degranulation; (iv) has at least about 10%higher cytotoxicity; and / or (v) has at least about 10%higher persistence.

[0014] In some embodiments according to any of the modified immune cells described above, the modified immune cell is autologous or allogeneic.

[0015] The present invention in another aspect provides a method of producing a modified immune cell, comprising modifying a precursor cell to reduce or eliminate expression and / or function of an ARIH1 protein (optionally further modifying the precursor cell to reduce or eliminate expression and / or function of BCL11B protein) .

[0016] In another aspect, the present invention provides a method of enhancing degranulation, cytotoxicity, and / or persistence of a modified immune cell, comprising modifying a precursor cell to reduce or eliminate expression and / or function of an ARIH1 protein (optionally further modifying the precursor cell to reduce or eliminate expression and / or function of BCL11B protein) .

[0017] In another aspect, the present invention provides a method of reprogramming a precursor cell into a modified immune cell, wherein the modified immune cell has an NK-like characteristic, and wherein the method comprises modifying the precursor cell to reduce or eliminate expression and / or function of an ARIH1 protein (optionally further modifying the precursor cell to reduce or eliminate expression and / or function of BCL11B protein) . In some embodiments, compared to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein (and optionally further the BCL11B protein) , the NK-like characteristic comprises at least about 10%higher expression and / or function of one or more of: NCAM1 (CD56) , KIT, CD3D, IL2RB, FCGR3A (CD16) , BACH2, NCR1 (NKp46) , NCR2 (NKp44) , NCR3 (NKp30) , KLRK1 (NKG2D) , CD244 (2B4) , KLRD1, KLRG1, CD27, GZMB, CSF2, SPRY2, PTPN6, CD300A, IL18RAP, TBX21 and CCL3.

[0018] In some embodiments according to any of the methods described above, the expression of the ARIH1 protein is reduced or inhibited by an antisense RNA, an siRNA, or an shRNA specifically recognizing an RNA encoding the ARIH1 protein. In some embodiments, the modifying comprises expressing a dominant negative ARIH1 protein variant or dominant negative fragment thereof. In some embodiments, the modifying comprises genetically modifying at the ARIH1 locus or at ARIH1 RNA. In some embodiments, the ARIH1 locus is modified by gene editing, or wherein the ARIH1 RNA is modified by RNA editing. In some embodiments, the gene editing or RNA editing is mediated by non-homologous end-joining (NHEJ) , homology directed repair (HDR) , zinc-finger nuclease (ZFN) , transcription activator-like effector nuclease (TALEN) , or CRISPR / Cas. In some embodiments, the gene editing comprises gene knockout (KO) . In some embodiments, the gene editing or RNA editing comprises base editing. In some embodiments, the gene editing or RNA editing is mediated by CRISPR / Cas. In some embodiments, the gene editing or RNA editing comprises contacting the precursor cell with i) a first guide RNA (gRNA) construct, wherein the first gRNA construct comprises or encodes a first gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the ARIH1 locus or ARIH1 RNA; and optionally ii) a first Cas component comprising a first Cas protein or a nucleic acid encoding the first Cas protein, under a condition that allows introduction of the first gRNA construct and the optional first Cas component into the precursor cell. In some embodiments, the precursor cell expresses the first Cas protein. In some embodiments, the first Cas component is an mRNA encoding the first Cas protein. In some embodiments, the mRNA encoding the first Cas protein is introduced into the precursor cell via electroporation. In some embodiments, the first Cas protein has endonuclease activity. In some embodiments, the first Cas protein is a fusion protein comprising i) a dCas, and ii) an ADA or a CDA, or a functional fragment thereof. In some embodiments, the first Cas protein is Cas9.

[0019] In some embodiments according to any of the methods described above, the method further comprises modifying the modified immune cell or the precursor cell to reduce or eliminate expression and / or function of one or more other proteins selected from the group consisting of: PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3. In some embodiments, the other protein is a BCL11B protein. In some embodiments, the modifying comprises genetically modifying at the BCL11B locus or at BCL11B RNA. In some embodiments, the BCL11B locus is modified by gene editing, or wherein the BCL11B RNA is modified by RNA editing. In some embodiments, the gene editing comprises gene knockout (KO) . In some embodiments, the gene editing or RNA editing is mediated by CRISPR / Cas. In some embodiments, the gene editing or RNA editing comprises contacting the modified immune cell or the precursor cell with i) a second gRNA construct, wherein the second gRNA construct comprises or encodes a second gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the BCL11B locus or BCL11B RNA ; and optionally ii) a second Cas component comprising a second Cas protein or a nucleic acid encoding the second Cas protein, under a condition that allows introduction of the second gRNA construct and the optional second Cas component into the modified immune cell or the precursor cell. In some embodiments, the second Cas protein is Cas9. In some embodiments, the first gRNA construct and the second gRNA construct are contacted with the precursor cell simultaneously.

[0020] In some embodiments according to any of the methods described above, the method comprises contacting the first gRNA construct and / or the second gRNA construct with the precursor cell via viral transfection. In some embodiments, the viral transfection is by a recombinant virus selected from the group consisting of adeno-associated virus (AAV) , adenovirus, retrovirus, herpes simplex virus (HSV) , murine stem cell virus (MSCV) , Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV) , human immunodeficiency virus (HIV) , bovine papilloma virus, lentivirus (LV) , vaccinia virus, and polyoma virus. In some embodiments, the viral transfection is by a recombinant lentivirus. In some embodiments, the recombinant lentivirus is pseudotyped with a viral glycoprotein selected from the group consisting of vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) , baboon endogenous virus (BaEV) -WT glycoprotein, BaEV-Rless glycoprotein, BaEV-TR glycoprotein, BaEV-TRless glycoprotein, and RD114 glycoprotein. In some embodiments, the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein. In some embodiments, the first gRNA construct encoding the first gRNA is comprised within a first recombinant virus and / or the second gRNA construct encoding the second gRNA is comprised within a second recombinant virus. In some embodiments, the method further comprises producing the recombinant virus.

[0021] In some embodiments according to any of the methods described above, the modified immune cell or the precursor cell expresses an engineered receptor. In some embodiments, the method further comprises introducing into the modified immune cell or the precursor cell a nucleic acid encoding an engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor is a CAR, an engineered TCR, a cTCR, a TAC, or a TAC-like engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor is a CAR comprising: (i) an extracellular antigen binding domain specifically recognizing a target antigen; (ii) a transmembrane domain; and (iii) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the nucleic acid encoding the engineered receptor is introduced into the modified immune cell or the precursor cell via viral transfection. In some embodiments, the nucleic acid encoding the engineered receptor is comprised within a third recombinant virus.

[0022] In some embodiments according to any of the methods described above, the modified immune cell and / or the precursor cell is selected from the group consisting of a monocyte, a dendritic cell, a macrophage, a B cell, a T cell, a natural killer (NK) cell, an induced pluripotent stem cell (iPSC) , an embryonic stem cell (ESC) , a hematopoietic stem cell (HSC) , or a combination thereof. In some embodiments, the modified immune cell is a T cell. In some embodiments, the T cell is selected from the group consisting of a helper CD4+ T cell, a cytotoxic CD8+ T cell, a memory T cell, a regulatory CD4+ T cell, a natural killer T (NKT) cell, a mucosal associated invariant T (MAIT) cell, a double negative T (DNT) cell, and a γδ T cell. In some embodiments, the T cell is a γδ T cell. In some embodiments, the γδ T cell is selected from the group consisting of Vδ1 T cell, Vδ2 T cell, Vδ3 T cell, Vδ4 T cell, Vδ5 T cell, Vδ6 T cell, Vδ7 T cell, γδT1 cell, γδT2 cell, γδT17 cell, γδTreg cell, and γδTAPC cell. In some embodiments, the γδ T cell is Vγ9Vδ2 T cell.

[0023] In some embodiments according to any of the methods described above, the modified immune cell is autologous or allogeneic.

[0024] Also provided are modified immune cells produced by of the methods described above.

[0025] Also provided are pharmaceutical compositions comprising any of the modified immune cells described above, and optionally a pharmaceutically acceptable excipient.

[0026] Also provided are methods of treating a disease or condition in an individual (e.g., human) , comprising administering to the individual an effective amount of any of the pharmaceutical compositions described above.

[0027] Also provided are methods of treating a disease or condition in an individual (e.g., human) , comprising modifying an immune cell of the individual using any of the methods of producing modified immune cells described above.

[0028] In some embodiments according to any of the methods of treatment described above, the disease or condition is a cancer, an infectious disease, an inflammatory disease, an immune-related disease characterized by effector cell exhaustion, or an autoimmune disease.

[0029] In some embodiments according to any of the methods of treatment described above, the disease or condition is associated with the expression of a target antigen, and wherein the modified immune cell expresses an engineered receptor specifically recognizing the target antigen. In some embodiments, the engineered receptor is a CAR.

[0030] In some embodiments according to any of the methods of treatment described above, the disease or condition is a cancer. In some embodiments, the cancer is selected from the group consisting of: acute myeloid leukemia (AML) , chronic myelogenous leukemia (CML) , ovarian cancer, multiple myeloma (MM) , non-Hodgkin’s lymphoma (NHL) , Hodgkin’s lymphoma, acute lymphoblastic leukemia (ALL) , gastric cancer, hepatocellular carcinoma (HCC) , small cell lung cancer (SCLC) , non-small cell lung cancer (NSCLC) , colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, and neuroblastoma.

[0031] In some embodiments according to any of the methods of treatment described above, the disease or condition is an infectious disease, such as tuberculosis, malaria, cytomegalovirus (CMV) , hepatitis B virus (HBV) , or HIV / AIDS.

[0032] In some embodiments according to any of the methods of treatment described above, further comprising administering to the individual an effective amount of an antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) -inducing agent. In some embodiments, the ADCC-inducing agent is an antibody, an antigen-binding fragment comprising an Fc domain, or an Fc-fusion protein. In some embodiments, the ADCC-inducing agent is an anti-HER2 antibody, and wherein the disease or condition is ovarian cancer.

[0033] In some embodiments according to any of the methods of treatment described above, further comprising administering to the individual an effective amount an immune cell agonist selected from the group consisting of: an aminobisphosphonate (NBP) , an isopentenyl pyrophosphate (IPP) , an (E) -4-Hydroxy-3-Methyl-But-2-enyl Pyrophosphate (HMBPP) , a Bromohydrin Pyrophosphate (BrHPP) , a risedronate, and a BTN3A1 modulator. In some embodiments, the immune cell agonist is aminobisphosphonate, and the aminobisphosphonate is selected from the group consisting of zoledronic acid (Zol) , alendronate, ibandronate, and pamidronate. In some embodiments, the aminobisphosphonate is Zol. In some embodiments, the Zol is conjugated to an antibody or antigen-binding fragment.

[0034] In some embodiments according to any of the methods of treatment described above, further comprising administering to the individual an effective amount of IL-2.

[0035] In some embodiments according to any of the methods of treatment described above, the individual is a human.

[0036] The present invention in another aspect provides a method of identifying an individual as a suitable donor of an immune cell with enhanced degranulation, cytotoxicity, and / or persistence, comprising examining the expression and / or function of an ARIH1 protein in an immune cell of the individual, wherein the identification of reduced or abolished expression and / or function of the ARIH1 protein in the immune cell compared to a reference identifies the individual as the suitable donor of the immune cell. In some embodiments, the method further comprises examining the expression and / or function of one or more other proteins selected from the group consisting of: PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3, and wherein the identification of reduced or abolished expression and / or function of the one or more other proteins in the immune cell compared to a reference further identifies the individual as the suitable donor of the immune cell. In some embodiments, the other protein is BCL11B. In some embodiments, the reference is an average or median expression and / or function of the ARIH1 protein or the one or more other proteins in an immune cell in a population of individuals. In some embodiments, the examining comprises examining the sequence of the nucleic acid encoding the ARIH1 protein or the one or more other proteins in the individual, and wherein the identification of an aberration in the nucleic acid that reduces expression and / or function of the ARIH1 protein or the one or more other proteins identifies the individual as the suitable donor of the immune cell. In some embodiments, the immune cell is Vγ9Vδ2 T cell.

[0037] The present invention in another aspect provides a method of excluding an individual as a suitable donor of an immune cell with enhanced degranulation, cytotoxicity, and / or persistence, comprising examining the expression and / or function of an ARIH1 protein in an immune cell of the individual, wherein the individual is excluded as the suitable donor of the immune cell if no reduced or abolished expression and / or function of the ARIH1 protein in the immune cell compared to a reference is identified. In some embodiments, the reference is an average or median expression and / or function of the ARIH1 protein in an immune cell in a population of individuals. In some embodiments, the examining comprises examining the sequence of the nucleic acid encoding the ARIH1 protein in the individual, and wherein the individual is excluded as the suitable donor of the immune cell if no aberration in the nucleic acid that reduces expression and / or function of the ARIH1 protein is identified. In some embodiments, the immune cell is Vγ9Vδ2 T cell.

[0038] The present invention in another aspect provides a method of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell, comprising contacting the γδ T cell with a recombinant lentivirus comprising the heterologous nucleic acid, wherein the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein. In some embodiments, the BaEV-Rless glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and / or wherein the BaEV-TR glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the heterologous nucleic acid encodes a heterologous molecule.

[0039] In some embodiments according to any of the methods of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell described above, the heterologous molecule is a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA. In some embodiments the heterologous molecule is a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a locus or an RNA encoding one or more other proteins selected from the group consisting of: PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3. In some embodiments, the heterologous molecule is a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an BCL11B locus or an BCL11B RNA. In some embodiments, the method further comprises contacting the γδ T cell with a Cas component comprising a Cas protein or a nucleic acid encoding the Cas protein. In some embodiments, the Cas component is an mRNA encoding the Cas protein. In some embodiments, the mRNA encoding the Cas protein is introduced into the γδT cell via electroporation. In some embodiments, the nucleic acid encoding the Cas protein is comprised within a recombinant lentivirus pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is different from the recombinant lentivirus encoding the gRNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is the recombinant lentivirus encoding the gRNA. In some embodiments, the heterologous molecule is a Cas protein. In some embodiments, the Cas protein has endonuclease activity. In some embodiments, the Cas protein is a fusion protein comprising i) a dCas, and ii) an ADA or a CDA, or a functional fragment thereof. In some embodiments, the Cas protein is Cas9.

[0040] In some embodiments according to any of the methods of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell described above, the heterologous molecule is an engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor is a CAR, an engineered TCR, a cTCR, a TAC, or a TAC-like engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor is a CAR comprising: (i) an extracellular antigen binding domain specifically recognizing a target antigen; (ii) a transmembrane domain; and (iii) an intracellular signaling domain.

[0041] In some embodiments according to any of the methods of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell described above, the recombinant lentivirus comprises two or more heterologous nucleic acids encoding two or more heterologous molecules. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are on the same vector. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are under the control of a same promoter. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are connected via one or more linking sequences. In some embodiments, the linking sequence is IRES or a nucleic acid encoding a cleavable linker. In some embodiments, the cleavable linker is a 2A peptide, such as T2A, P2A, E2A, or F2A. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are on different vectors. In some embodiments, the recombinant lentivirus comprises a first nucleic acid encoding a gRNA, and a second nucleic acid encoding a Cas protein, and wherein the gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus comprises a first nucleic acid encoding a gRNA, and a second nucleic acid encoding a Cas protein, and wherein the gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an BCL11B locus or an BCL11B RNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus comprises a first nucleic acid encoding a first gRNA and a second nucleic acid encoding a second gRNA; wherein the first gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA; and wherein the second gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an BCL11B locus or an BCL11B RNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus comprises a first nucleic acid encoding a first gRNA and a second nucleic acid encoding an engineered receptor; and wherein the first gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA and / or a guide sequence that is complementary to a target site in an BCL11B locus or an BCL11B RNA. In some embodiments, the engineered receptor is a CAR. In some embodiments, the recombinant lentivirus further comprises a third nucleic acid encoding a Cas protein. In some embodiments, the method further comprises contacting the γδ T cell with a Cas component comprising a Cas protein or a nucleic acid encoding the Cas protein. In some embodiments, the Cas component is an mRNA encoding the Cas protein. In some embodiments, the mRNA encoding the Cas protein is introduced into the γδ T cell via electroporation. In some embodiments, the Cas protein is Cas9.

[0042] In some embodiments according to any of the methods of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell described above, the method comprises contacting the γδ T cell with a first recombinant lentivirus comprising a first heterologous nucleic acid, and a second recombinant lentivirus comprising a second heterologous nucleic acid. In some embodiments, the first recombinant lentivirus and the second recombinant lentivirus are contacted with the γδ T cell simultaneously or sequentially. In some embodiments, the first heterologous nucleic acid encodes a first gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA, and wherein the second heterologous nucleic acid encodes a second gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an BCL11B locus or an BCL11B RNA. In some embodiments, the method further comprises contacting the γδ T cell with a third recombinant lentivirus comprising a third heterologous nucleic acid, wherein the third heterologous nucleic acid encodes an engineered receptor. In some embodiments, the first heterologous nucleic acid encodes a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA and / or a guide sequence that is complementary to a target site in an BCL11B locus or an BCL11B RNA, and wherein the second heterologous nucleic acid encodes an engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor is a CAR. In some embodiments, the method further comprises contacting the γδ T cell with a Cas component comprising a Cas protein or a nucleic acid encoding the Cas protein. In some embodiments, the Cas component is an mRNA encoding the Cas protein. In some embodiments, the mRNA encoding the Cas protein is introduced into the γδ T cell via electroporation. In some embodiments, the nucleic acid encoding the Cas protein is comprised within a recombinant lentivirus pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is different from the recombinant lentivirus encoding the gRNA and / or the recombinant lentivirus encoding the engineered receptor. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is the recombinant lentivirus encoding the gRNA or the recombinant lentivirus encoding the engineered receptor. In some embodiments, the Cas protein is Cas9.

[0043] In some embodiments according to any of the methods of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell described above, the γδ T cell is Vγ9Vδ2 T cell.

[0044] In some embodiments according to any of the methods of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell described above, further comprising producing the recombinant lentivirus comprising the heterologous nucleic acid. In some embodiments, the method comprises introducing (i) the heterologous nucleic acid, (ii) a nucleic acid encoding the BaEV-Rless glycoprotein or the BaEV-TR glycoprotein, and (iii) a packaging vector comprising one or more nucleic acids encoding one or more packaging proteins into a producer cell, thereby producing the recombinant lentivirus. In some embodiments, the one or more packaging proteins comprise Gag, Pol, Tat, and Rev. In some embodiments, the heterologous nucleic acid is comprised within a lentiviral transfer vector. In some embodiments, the producer cell is an HEK293T cell.

[0045] Also provided are pharmaceutical compositions comprising the modified γδ T cells produced by any of the methods of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell described above, and optionally a pharmaceutically acceptable excipient.

[0046] Also provided are methods of treating a disease or condition in an individual (e.g., human) , comprising administering to the individual an effective amount of any of the pharmaceutical compositions comprising modified γδ T cells described above.

[0047] Also provided are methods of treating a disease or condition in an individual (e.g., human) , comprising modifying a γδ T cell of the individual using any of the methods of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell described above.

[0048] In some embodiments according to any of the methods of treatment described above, the disease or condition is a cancer, an infectious disease, an inflammatory disease, an immune-related disease characterized by effector cell exhaustion, or an autoimmune disease.

[0049] In some embodiments according to any of the methods of treatment described above, the disease or condition is associated with the expression of a target antigen, and wherein the modified immune cell expresses an engineered receptor specifically recognizing the target antigen. In some embodiments, the engineered receptor is a CAR.

[0050] In some embodiments according to any of the methods of treatment described above, the disease or condition is a cancer. In some embodiments, the cancer is selected from the group consisting of: acute myeloid leukemia (AML) , chronic myelogenous leukemia (CML) , ovarian cancer, multiple myeloma (MM) , non-Hodgkin’s lymphoma (NHL) , Hodgkin’s lymphoma, acute lymphoblastic leukemia (ALL) , gastric cancer, hepatocellular carcinoma (HCC) , small cell lung cancer (SCLC) , non-small cell lung cancer (NSCLC) , glioblastoma, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, and neuroblastoma.

[0051] In some embodiments according to any of the methods of treatment described above, the disease or condition is an infectious disease, such as tuberculosis, malaria, cytomegalovirus (CMV) , hepatitis B virus (HBV) , or HIV / AIDS.

[0052] In some embodiments according to any of the methods of treatment described above, further comprising administering to the individual an effective amount of an ADCC-inducing agent. In some embodiments, the ADCC-inducing agent is an antibody, an antigen-binding fragment comprising an Fc domain, or an Fc-fusion protein. In some embodiments, (i) the ADCC-inducing agent is an anti-HER2 antibody, and wherein the disease or condition is ovarian cancer; or (ii) the ADCC-inducing agent is an anti-CD20 antibody, and wherein the disease or condition is Burkitt’s lymphoma.

[0053] In some embodiments according to any of the methods of treatment described above, further comprising administering to the individual an effective amount of an immune cell agonist selected from the group consisting of: an aminobisphosphonate (NBP) , an isopentenyl pyrophosphate (IPP) , an (E) -4-Hydroxy-3-Methyl-But-2-enyl Pyrophosphate (HMBPP) , a Bromohydrin Pyrophosphate (BrHPP) , a risedronate, and a BTN3A1 modulator. In some embodiments, the immune cell agonist is aminobisphosphonate, and the aminobisphosphonate is selected from the group consisting of zoledronic acid (Zol) , alendronate, ibandronate, and pamidronate. In some embodiments, the aminobisphosphonate is Zol. In some embodiments, the Zol is conjugated to an antibody or antigen-binding fragment.

[0054] In some embodiments according to any of the methods of treatment described above, further comprising administering to the individual an effective amount of IL-2.

[0055] Also provided are methods of treating a glioblastoma in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of any of the pharmaceutical compositions described herein (e.g., comprising modified γδ T cells with no or reduced expression and / or function of an ARIH1 protein, and optionally further an BCL11B protein) . In some embodiments, the glioblastoma is relapsed glioblastoma. In some embodiments, the method comprises administering to the individual at least one dose of an effective amount of the pharmaceutical composition. In some embodiments, the method comprises administering to the individual two or more doses of the effective amount of the pharmaceutical composition. In some embodiments, the two or more doses are each separated by about 7 days. In some embodiments, each dose of the effective amount of the pharmaceutical composition comprises about 1×107 to about 1×109 modified γδ T cells. In some embodiments, the pharmaceutical composition is administered intraventricularly. In some embodiments, the method further comprises performing an Ommaya reservoir placement surgery before the administration of the first dose of the effective amount of the pharmaceutical composition. In some embodiments, the method further comprises performing a partial or maximal safe resection of the glioblastoma before the administration of the pharmaceutical composition. In some embodiments, the modified γδ T cells of the pharmaceutical composition have no or reduced expression and / or function of both ARIH1 protein and BCL11B protein. In some embodiments, the modified γδ T cells are modified Vγ9Vδ2 T cells. In some embodiments, the method further comprises selecting an individual with relapsed glioblastoma for the treatment.

[0056] In some embodiments according to any of the methods of treatment described above, the individual is a human (e.g., an adult human) .BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0057] FIGs. 1A-1F show the transcriptional and epigenetic changes in γδ-T cells during multiple rounds of tumor stimulation. FIG. 1A demonstrates how Vγ9Vδ2 T cells recognize and kill tumor cells via T cell receptor (TCR) , natural killer cell receptors (NKRs) , or antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) . FIG. 1B provides a schematic overview illustrating RNA-seq and ATAC-seq analyses in Vγ9Vδ2 T cells after three rounds of TCR stimulation. FIGs. 1C and 1D show heatmaps displaying differentially expressed genes from bulk RNA-seq (FIG. 1C) or chromatin accessible regions from bulk ATAC-seq (FIG. 1D) in wild-type Vγ9Vδ2 T cells stimulated with Zol-treated K562 cells compared to regularly cultured cells. Red indicates upregulated genes or more open regions under stimulation, while blue indicates downregulated genes or less open regions. Adjusted P < 0.05, lfc > 1, n = 2. FIG. 1E displays the expression profiles of CD56 and NKRs (i.e., CD16, NKp44, and CD244 (2B4) ) in Vγ9Vδ2 T cells over three rounds of Zol-treated K562 stimulation. FIG. 1F displays the Vγ9Vδ2 T cell viability over three rounds of Zol-treated K562 stimulation 4: 1 and 2: 1 effector-to-target (E: T) ratios. Data in FIGs. 1E-1F are presented as mean ± SD, n = 3, unpaired t-test.

[0058] FIGs. 2A-2H show the results of genome-wide CRISPR screening in primary Vγ9Vδ2 T cells. FIG. 2A shows the efficiency of using VSVG-LVs to infect primary Vγ9Vδ2 T cells and Jurkat T cells with the same amount of virus. FIG. 2B provides a schematic overview of the packaging of lentivirus with six different viral envelopes, including VSVG. FIG. 2C shows the efficiency of BaEVRless-LVs transduction in primary Vγ9Vδ2 T cells. FIG. 2D provides a schematic overview of the procedure for whole-genome CRISPR knockout screens to identify regulators of persistence and cytotoxicity in primary Vγ9Vδ2 T cells. FIGs. 2E and 2F provide the results of gene knockout screens ranked by enrichment on Vγ9Vδ2 T cell persistence (FIG. 2E) and cytotoxicity (FIG. 2F) . FIG. 2G shows the persistence of PRDM1KO, CELF2KO, TNFRSF1AKO, and RAPGEF1KO γδ-T cells. The fold change in total cell counts after three rounds of Zol-treated K562 stimulation is shown relative to AAVS1KO γδ-T cells. FIG. 2H shows the anti-tumor capacity of BCL11BKO, CISHKO, CUL3KO, and RASA2KO γδ T cells. The percentage of tumor lysis after 24 hours of co-culture with Zol-treated K562 stimulation is shown relative to AAVS1KO γδ-T cells. Data are presented as mean ± SD, unpaired t-test, with n =2 or 4 (FIG. 2A) , and n = 3 (FIGs. 2G and 2H) . *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001. LVs, lentivirus.

[0059] FIGs. 3A-3D show the results from the Perturb-seq analysis of gene perturbations and cytotoxicity in Vγ9Vδ2 T cells. FIG. 3A provides a schematic overview of direct capture Perturb-seq in primary Vγ9Vδ2 T cells. In brief, expanded primary Vγ9Vδ2 T cells were transduced with a sub-library containing 65 genes and Cas9 mRNA, followed by single-cell RNA sequencing. FIG. 3B provides a heatmap showing correlations among sgRNAs with transcriptomic phenotypes, calculated based on the log fold change (LFC) of downstream genes compared to negative control. FIG. 3C demonstrates the LFC of sgRNAs with transcriptomic phenotypes, with red and blue indicating significantly upregulated and downregulated genes, respectively (adjusted p < 0.1) . Different colors represent the categories of hits. FIG. 3D displays the cytotoxicity of PRDM1KO, RAPGEF1KO, TNFRSF1AKO, and CELF2KO γδ-T cells, wherein the data are presented as mean ± SD, n = 3, unpaired t-test. *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001.

[0060] FIGs. 4A-4L show the reprogramming results of Vγ9Vδ2 T cells under continuous stimulation following ARIH1 depletion. FIG. 4A shows the identification of overlapping hits (i.e., ARIH1) with a screening score greater than 3 from both persistence and cytotoxicity screens. FIG. 4B shows validation of ARIH1 ablation in primary Vγ9Vδ2 T cells using Western blotting. FIGs. 4C-4E show the assessment of degranulation (FIG. 4C) , cytotoxicity (FIG. 4D) , and persistence (FIG. 4E) in ARIH1KO γδ-T cells. The percentage of CD107a-positive cells (FIG. 4C) , tumor lysis after 4 hours of co-culture with Zol-treated K562 (FIG. 4D) , and fold change in total cell counts after three rounds of Zol-treated K562 stimulation is relative to AAVS1KO γδ-T cells. FIG. 4F provides a schematic overview illustrating RNA-seq and ATAC-seq analyses in ARIH1KO or AAVS1KO γδ-T cells with or without three rounds of TCR stimulation. FIG. 4G provides a heatmap depicting differentially expressed genes in ARIH1KO γδ-T cells compared to AAVS1KO γδ-T cells before or after stimulation as analyzed by bulk RNA-seq. FIG. 4H provides a comparison of lfc (Pearson correlation = -0.5155) in RNA-seq between ARIH1KO and AAVS1KO γδ-T cells. FIG. 4I provides a PCA plot of the ATAC-seq data, with different colors representing different treatments, n = 2. FIG. 4J provides a heatmap depicting chromatin accessible regions in ARIH1KO γδ-T cells compared to AAVS1KO γδ-T cells before or after stimulation as analyzed by bulk ATAC-seq (adjusted P < 0.05, lfc > |1|, n = 2) . FIG. 4K shows a comparison of promoter region accessibility lfc (Pearson correlation = -0.8832) in ATAC-seq between the two groups. FIG. 4L displays the correlation between RNA-seq expression levels and ATAC-seq promoter region accessibility, Pearson correlation = 0.4540. Data are presented as mean ± SD, n = 3, unpaired t-test (FIGs. 4C-4E) . *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Genes with significant differences (p < 0.05) in at least one group and detectable in both groups are shown (FIGs. 4H-4I and 4K) . Red dots highlight AP1 and NK-related genes. WT, wild-type.

[0061] FIGs. 5A-5I show that ARIH1 interacts with the AP-1 transcription factor family and affects AP-1 chromatin binding. FIG. 5A shows the identification of the AP-1 complex through motif analysis of depleted peaks in ARIH1KO γδ-T cells compared to AAVS1KO γδ-T cells after three rounds of Zol-treated K562 stimulation, n = 2. FIG. 5B shows the validation of the interactions between ARIH1 and JUNB, JUND, or c-JUN using co-immunoprecipitation assays. FIG. 5C provides a schematic overview illustrating the CUT &TAG assay procedure with anti-JUNB or anti-JUND in ARIH1KO γδ-T cells compared to AAVS1KO γδ-T cells. FIG. 5E provides a Venn diagram indicating the overlap of JUNB target genes between ARIH1KO γδ-T cells and AAVS1KO γδ-T cells in the CUT &TAG assay. FIG. 5F shows the CUT &TAG signals related to JUND in ARIH1KO γδ-T cells and AAVS1KO γδ-T cells. FIG. 5G provides a Venn diagram indicating the overlap of JUND target genes between ARIH1KO γδ-T cells and AAVS1KO γδ-T cells in the CUT &TAG assay. FIG. 5H shows representative traces for NCR1, FCGR3A, and CD244 from JUNB and JUND CUT &TAG, ATAC-seq, and RNA-seq in ARIH1KO γδ-T cells and AAVS1KO γδ-T cells, n = 2. FIG. 5I shows a boxplot of ssGSEA scores for the NK pathway, calculated from bulk RNA-seq, n = 4. EV, empty vector.

[0062] FIGs. 6A-6J show the enhanced cytotoxicity and persistence of ARIH1KO / BCL11BKO Vγ9Vδ2 T cells. FIG. 6A provides a schematic overview of the knockout candidates to combine with ARIH1KO. FIGs. 6B and 6C show cell persistence (FIG. 6B) and cytotoxicity against Zol-treated K562 cells (FIG. 6C) in ARIH1KO, ARIH1KO / BCL11BKO, ARIH1KO / CISHKO, ARIH1KO / CUL3KO, ARIH1KO / RASA2KO, and control AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2 γδ-T cells. Fold change in viable cell counts analyzed via flow cytometry with counting beads after the third stimulation in culture, relative to control T cells edited at the AAVS locus (FIG. 6B) , and percent tumor lysis at different E: T ratio analyzed by flow cytometry with counting beads relative to no T cell groups (FIG. 6C) . FIG. 6D shows the protein expression levels of ARIH1 and BCL11B in AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2, ARIH1KO / AAVS1KO, BCL11BKO / AAVS1KO, and ARIH1KO / BCL11BKO γδ-T cells determined by immunoblotting. γδ-T cells were collected a week post-electroporation with Cas9. FIGs. 6E and 6F show the cell persistence (FIG. 6E) and cytotoxicity against Zol-treated K562 (FIG. 6F) of AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2, ARIH1KO / AAVS1KO, BCL11BKO / AAVS1KO, and ARIH1KO / BCL11BKO γδ-T cells isolated from two different donors. FIG. 6G provides a schematic overview of the RNA-seq workflow: different γδ-T cells were unstimulated or stimulated with Zol-treated K562 cells three times, then sorted and RNA extracted. FIG. 6H displays the principal component analysis of RNA-seq data from AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2, ARIH1KO / AAVS1KO, BCL11BKO / AAVS1KO, and ARIH1KO / BCL11BKO γδ-T cells before and after the third round of stimulation. FIGs. 4I and 4J show bubble diagrams of GO enrichment analysis for differentially expressed genes in BCL11BKO / AAVS1KO versus AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2 γδ-T cells. Seven terms were selected for upregulated genes (left) and ten terms for downregulated genes (right) . Data are presented as mean ± SD, n = 3, unpaired t-test (FIGs. 6B, 6C, 6E, and 6F) . *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. ns, non-significant.

[0063] FIGs. 7A-7G show the enhanced natural cytotoxicity receptor-mediated tumor killing capacity of ARIH1KO / BCL11BKO Vγ9Vδ2 T cells. FIG. 7A shows the surface protein expression of NK receptors in AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2, ARIH1KO / AAVS1KO, BCL11BKO / AAVS1KO, and ARIH1KO / BCL11BKO γδ-T cells as analyzed by flow cytometry before and after the third round of stimulation. FIGs. 7B and 7C demonstrate the cytotoxicity against K562-luciferase cells without Zol treatment (FIG. 7B) and against AML cell lines THP-1, U937, and MOLM-13 (FIG. 7C) of AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2, ARIH1KO / AAVS1KO, BCL11BKO / AAVS1KO, and ARIH1KO / BCL11BKO γδ-T cells. The percentage of tumor lysis at different E: T ratios was analyzed by measuring luciferase activity (FIG. 7B) or via flow cytometry with counting beads (FIG. 7C) compared to groups without T cells. FIG. 7D shows the long-term cytotoxicity against MOLM-13 by AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2, ARIH1KO / AAVS1KO, BCL11BKO / AAVS1KO, and ARIH1KO / BCL11BKO γδ-T cells. FIG. 7E shows the cytotoxicity of AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2 and ARIH1KO / BCL11BKO γδ-T cells against two primary AML cancers isolated from two different patients. Tumor lysis percentages at different E: T ratios were analyzed with counting beads and AML surface markers, compared to groups without T cells. FIG. 7F shows the ADCC capacity of AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2 and ARIH1KO / BCL11BKO γδ-T cells against OVCAR3-luciferase with different concentrations of anti-HER2 monoclonal antibody (mAb) . Tumor lysis percentages at different E:T ratios were analyzed with counting beads compared to groups without T cells. FIG. 7G shows the IL-2-dependent proliferation of AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2, ARIH1KO / AAVS1KO, BCL11BKO / AAVS1KO, and ARIH1KO / BCL11BKO γδ-T cells cultured with or without 1000 IU / ml IL-2 and analyzed for cell count via flow cytometry with counting beads every 3 days. Data are presented as mean ± SD, n = 3, unpaired t-test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. ns, non-significant.

[0064] FIGs. 8A-8D show the phenotype of wild-type Vγ9Vδ2 T cells during Zol-treated K562 stimulation. FIG. 8A shows the Principal Component Analysis (PCA) results based on RNA-seq data. FIG. 8B and 8C show the gene ontology (GO) term analyses depicting any significantly upregulated and downregulated processes in wild-type Vγ9Vδ2 T cells following stimulation with Zol-treated K562 compared to cells cultured under regular conditions. LFC < -0.5 or LFC > 0.5, adjusted p-value < 0.001. FIG. 8D provides a schematic overview of the experimental identification of cytotoxicity and persistence in wild type Vγ9Vδ2 T cells.

[0065] FIGs. 9A-9F show the elevation of LVs transduction and analysis of screen hits in primary Vγ9Vδ2 T cells. FIG. 9A provides representative FACS plots of VSVG-enveloped lentivirus infection in primary Vγ9Vδ2 T cells. FIG. 9B show the efficiencies of various envelope lentivirus infections at gradient concentrations in primary Vγ9Vδ2 T cells. Data are presented as mean ± SD, n = 3. FIGs. 9C and 9E show the distribution of LFC values for non-targeting controls (NTC) and hits identified in persistence (FIG. 9C) and cytotoxicity (FIG. 9E) screens. FIGs. 9D and 9F show the KEGG term analysis of hits from persistence (FIG. 9D) and cytotoxicity (FIG. 9F) screens (screening score > 3) . ns, non-significant.

[0066] FIGs. 10A-10F show quality control (QC) details of Perturb-seq. FIG. 10A provides the distribution of sgRNA counts. FIG. 10B provides the distribution of nFeature_RNA, nCount_RNA, and percentage of mitochondrial reads of sequenced cells. Samples 1-8 refer to eight reactions of the 10x single-cell kit from the same batch. FIG. 10C provides the distribution of the number of sgRNAs per cell. Red indicates selected cells. FIG. 10D provides a UMAP plos showing the cell cycle. FIG. 10E provides UMAP plots showing the expression level of several γδ-T cell markers. FIG. 10F provides a volcano plot for sgRNA2 targeting PRDM1, compared with non-targeting control.

[0067] FIGs. 11A-11H show the validation of cytotoxicity and persistence gene targets in Vγ9Vδ2 T cells. FIG. 11A provides a schematic overview of the validation process. FIGs. 11B and 11C demonstrate the verification of the impact on cytotoxicity (FIG. 11B) and persistence (FIG. 11C) from targeting ARIH1 in Vγ9Vδ2 T cells from donor 2 as analyzed by unpaired t-test. FIGs. 11D and 11E provide volcano plots for unstimulated (FIG. 11D) and stimulated (FIG. 11E) ARIH1KO cells in bulk RNA-seq. Red dots and blue dots represent upregulated and downregulated genes, respectively. Black dots indicate non-significant but notable genes. FIG. 11F provides a heatmap of ssGSEA scores of TISIDB immune pathways from bulk RNA-seq. FIG. 11G provides a heatmap of the gene expression of various NK markers in TISIDB immune pathways. FIG. 11H provides a pie chart of the differential peaks in ATAC-seq for stimulated ARIH1KO cells, with different colors representing various regulatory directions. Data are mean ±SD, n = 3. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. ns, non-significant.

[0068] FIGs. 12A-12F show the synergistic effect of ARIH1KO / BCL11BKO on persistence and cytotoxicity in Vγ9Vδ2 T cells. FIG. 12A shows the validation of persistence in cytotoxicity candidates, including BCL11BKO, CISHKO, CUL3KO, RASA2KO, and control AAVS1KO γδ-T cells. Fold change in viable cell counts was analyzed via flow cytometry with counting beads after the third Zol-treated K562 stimulation in culture relative to control T cells edited at the AAVS1 locus and analyzed for statistical significance using an unpaired t-test. FIG. 12B provides the in vitro cytotoxicity as measured for AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2, ARIH1KO / AAVS1KO, BCL11BKO / AAVS1KO, and ARIH1KO / BCL11BKO γδ-T cells after the third round of Zol-treated K562 stimulation. The percentage of tumor viability at an E: T ratio of 4: 1 against Zol-treated K562 was analyzed by flow cytometry with counting beads relative to groups without T cells and analyzed for statistical significance using an unpaired t-test. FIGs. 12C-12F provide the functional annotation of differentially expressed genes (q value < 0.5) in each of ARIH1KO / AAVS1KO versus AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2 γδ-T cells (FIGs. 12C and 12D) and BCL11BKO / AAVS1KO versus AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2 γδ-T cells (FIGs. 12E and 12F) . Data are mean ± SD, n = 3. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. ns, non-significant.

[0069] FIGs. 13A-13C show the cancer cell-killing capacity of ARIH1KO / BCL11BKO γδ-T cells. FIG. 13A shows the detection of NK receptors expression in donor 2. Surface expression of NK receptors in AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2, ARIH1KO / AAVS1KO, BCL11BKO / AAVS1KO, and ARIH1KO / BCL11BKO γδ-T cells before or after the third round of stimulation was analyzed via flow cytometry. FIG. 13B shows the change of surface expression of NK receptors in AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2, ARIH1KO / AAVS1KO, BCL11BKO / AAVS1KO, and ARIH1KO / BCL11BKO γδ-T cells upon stimulation with U937, THP1, and MOLM-13 tumor cells as analyzed via flow cytometry. FIG. 13C shows the results of an IL-2 dependency assay using cells from donor 2. AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2, ARIH1KO / AAVS1KO, BCL11BKO / AAVS1KO, and ARIH1KO / BCL11BKO γδ-T cells were cultured with or without 1000 IU / ml IL-2, and viable cell counts were analyzed by flow cytometry with counting beads every 3 days. Data are mean ± SD, n = 3, unpaired t-test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. ns, non-significant.

[0070] FIGs. 14A-14D show that ARIH1 and BCL11B double knockout confers a competitive survival advantage to Vγ9Vδ2 T cells in vivo. FIG. 14A shows a schematic of the in vivo competition assay. Equal numbers of GFP-labeled ARIH1KO / BCL11BKO Vγ9Vδ2 T cells and mCherry-labeled control cells (AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2) were pre-mixed at a 1: 1 ratio and intravenously injected into NPG mice after injection of THP-1 tumor cells. Peripheral blood was collected on Day 4 (D4) and Day 7 (D7) , and tissues were harvested on Day 10 (D10) for flow cytometric analysis. FIG. 14B shows a representative flow cytometry plot of the initial 1: 1 ratio of GFP+ ARIH1KO / BCL11BKO (upper left quadrant) and mCherry+ control cells (lower right quadrant) prior to injection (D0) . FIG. 14C shows the proportion of ARIH1KO / BCL11BKO (circle) versus AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2 (square) Vγ9Vδ2 T cells in peripheral blood at D4 and D7 post-injection. Data from individual mice are shown; lines connect paired samples. Statistical significance was determined using a two-tailed paired t-test, n = 9. FIG. 14D shows the proportion of GFP+ ARIH1KO / BCL11BKO versus mCherry+ AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2 Vγ9Vδ2 T cells in the bone marrow (BM) , spleen, and liver at D10 post-injection.

[0071] FIGs. 15A-15B show that ARIH1 and BCL11B double knockout enhances antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) in Vγ9Vδ2 T cells. FIG. 15A shows the ADCC activity of ARIH1KO / BCL11BKO versus AAVS1KO-1 / AAVS1KO-2 control Vγ9Vδ2 T cells against CD20+Raji cells at an E: T ratio of 0.5: 1. Tumor lysis was measured in the presence of increasing concentrations of rituximab (anti-CD20 antibody) . FIG. 15B shows ADCC activity against HER2+ SKOV3 cells at an E: T ratio of 8: 1, using trastuzumab (anti-HER2 antibody) at indicated concentrations. Significance was assessed using two-tailed unpaired t-tests; p < 0.05, p < 0.01, *p < 0.001.

[0072] FIG. 16 shows a genome-wide mapping of on-target (circle dots) and off-target (square dots) editing sites across all chromosomes following CRISPR-based knockout of ARIH1 (left) and BCL11B (right) .

[0073] FIG. 17 shows representative hematoxylin and eosin (H&E) staining of major organs and tissues from recipient NPG mice 30 days after intravenous infusion of ARIH1KO / BCL11BKO Vγ9Vδ2 T cells. Tissues analyzed included lung, liver, testis, brain, skin, spleen, kidney, heart, ileum, jejunum, duodenum, and femur.

[0074] FIGs. 18A-18C show flow cytometry analysis of ligand expression on U87MG glioblastoma cells compared to isotype control (NC) . FIG. 18A shows U87MG cells express the CD112 (Nectin-2) ligand for the activating receptor DNAM-1 (CD226) . FIG. 18B shows U87MG cells express the CD155 (PVR) ligand for the activating receptor DNAM-1 (CD226) . FIG. 18C shows U87MG cells also express MICA / MICB, ligands for the activating receptor NKG2D.

[0075] FIGs. 19A-19C show ARIH1 and BCL11B double knockout enhances the cytotoxicity of Vγ9Vδ2 T cells against glioblastoma. FIG. 19A shows a luciferase-based cytotoxicity assay using the human glioblastoma cell line U87MG-luc as the target. ARIH1KO / BCL11BKO and wild-type Vγ9Vδ2 T cells were co-cultured with tumor cells at indicated effector-to-target (E: T) ratios. Tumor cell viability was measured by luminescence and normalized to the signal from tumor-only controls (E: T = 0) . FIG. 19B shows a serial tumor re-challenge assay assessing sustained cytotoxicity against U87MG-luc cells. Vγ9Vδ2 T cells were repeatedly exposed to fresh tumor targets for three consecutive rounds at a fixed E: T ratio of 8: 1. FIG. 19C shows the percentage of cytotoxicity against patient-derived glioblastoma (GBM) tumor cells. ARIH1KO / BCL11BKO and wild-type Vγ9Vδ2 T cells were co-cultured with tumor cells isolated from GBM patients, and cytotoxicity was measured by flow cytometry.

[0076] FIG. 20 shows a study schema for using ARIH1KO / BCL11BKO Vγ9Vδ2 T cells to treating recurrent GBM.

[0077] FIGs. 21A-21E show the clinical trial design and results of using ARIH1KO / BCL11BKO γδT cells to treat GBM in Patient 1. FIG. 21A shows the clinical trial design for Patient 1. Magnetic resonance imaging (MRI) scans of Patient 1 showed a second relapse at D-27 (27 days before the first dose of ARIH1KO / BCL11BKO γδT cells was administered) . Patient 1 underwent Ommaya reservoir placement surgery without tumor resection at D-7 (7 days before the first dose of ARIH1KO / BCL11BKO γδT cells was administered) . The first dose of ARIH1KO / BCL11BKO γδT cells was locally administrated through the Ommaya reservoir 7 days after surgery (labeled as “D0” ) . The second dosing was performed at D7 (7 days after the first dosing) . Imaging responses were assessed by MRI scans of the brain at D-10 (10 days before the first dose of ARIH1KO / BCL11BKO γδT cells was administered) , D3 (3 days after the first dosing) , and D60 (60 days after the first dosing) . Patient 1 was discharged at D37. FIG. 21B shows MRI scans of Patient 1 at D-27 (second relapse) , D-10, D3, and D60. The white arrows point to the tumor lesion. FIG. 21C shows the persistence of CD3+ TCRVδ2+ T cells in cerebrospinal fluid (CSF) from D-7 to D84. The first arrow at D0 shows the first dosing of ARIH1KO / BCL11BKO γδT cells. The second arrow at D7 shows the second dosing of ARIH1KO / BCL11BKO γδT cells. FIG. 21D shows the level of cytokine interferon-gamma (IFNγ) (pg / ml) in Patient 1’s CSF from D-7 to D20. FIG. 21E shows the level of tumor necrosis factor alpha (TNFα) (pg / ml) in Patient 1’s CSF from D-7 to D20.

[0078] FIGs. 22A-22B show the clinical trial design and results of using ARIH1KO / BCL11BKO γδT cells to treat GBM in Patient 2. FIG. 22A shows the clinical trial design for Patient 2. MRI scans of Patient 2 showed a second relapse at D-37 (37 days before the first dose of ARIH1KO / BCL11BKO γδT cells was administered) . A second MRI was performed at D-13 (13 days before the first dose of ARIH1KO / BCL11BKO γδT cells was administered) . Patient 2 underwent maximal safe resection of the radiographically progressive tumor during the Ommaya placement surgery at D-11 (11 days before the ARIH1KO / BCL11BKO γδT cells was administered) . A dose of ARIH1KO / BCL11BKO γδT cells was locally administrated through the Ommaya reservoir 11 days after surgery (labeled as “D0” ) . Imaging responses were assessed by MRI scans of the brain at D-2 (2 days before a dose of ARIH1KO / BCL11BKO γδT cells was administered) , D8 (8 days after the dosing) , and D48 (48 days after the dosing) . Patient 2 was discharged at D18. FIG. 22B shows MRI scans of Patient 2 at D-37 (second relapse) , D-13, D-2, D8, and D48. The white arrows point to the tumor lesion. DETAILED DESCRIPTION OF THE PRESENT APPLICATION

[0079] Poor persistence of modified immune cells (e.g., modified αβ T cells or modified γδ T cells) is one of the biggest challenges for their effective applications in immunotherapy (e.g., cancer immunotherapy) . The present invention provides immune cells (e.g., allogeneic γδ T cells) with improved persistence (e.g., in vivo) , enhanced degranulation, and improved cytotoxicity (e.g., anti-tumor cytotoxicity) , and wherein the immune cells display reduced risk of inducing graft-versus-host (GvH) responses or GvHD. Also provided are methods of treating an individual by administering these immune cells, wherein the immune cells have been modified at specific target gene (s) that modulate immune cell effector function (e.g., persistence, degranulation, and / or cytotoxicity) , as well as methods of preparing such immune cells.

[0080] Inventors of the present application discovered that immune cells (e.g., T cells such as γδ T cells) modified to have no or reduced (e.g., reducing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) expression (RNA and / or protein expression) and / or function of ARIH1 protein (and optionally further BCL11B proteins) have one or more following characteristics: i) have at least about 10% (e.g., at least about any of 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more) increased cell persistence (including in vivo persistence) ; ii) have at least about 10% (e.g., at least about any of 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more) increase in cell degranulation, iii) have at least about 10% (e.g., at least about any of 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more) increased cytotoxicity (e.g., anti-tumor cytotoxicity) ; iv) do not have down-regulated (e.g., down-regulated by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) or eliminated expression (RNA and / or protein) and / or function (e.g., mediating cytotoxicity) of engineered receptors (e.g., CAR) that may be expressed in the immune cells, or have at most about 30% (e.g., at most about any of 25%, 20%, 10%, 5%, 3% 1%, or less) down-regulated expression (RNA and / or protein) and / or function of the engineered receptors, compared to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of ARIH1 proteins (and optionally further BCL11B proteins) vi) confers stronger anti-tumor activity through reducing tumor size in an animal provided a modified immune cell by at least about 10% (e.g., at least about any of 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 100%) , relative to an animal provided a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of ARIH1 protein (and optionally further BCL11B protein) ; vii) confers stronger anti-tumor activity through increasing animal survival of those provided with a modified immune cell by at least about 10% (e.g., by at least about any of 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, or 150%) , relative to an animal provided a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of ARIH1 proteins (and optionally further BCL11B proteins) ; viii) confers improved survival of the modified immune cell in an allogeneic immune environment by at least about 10% (e.g., by at least about any of 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more) , relative to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of ARIH1 protein (and optionally further BCL11B protein) ; ix) confers enhanced expansion of the immune cells having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of ARIH1 protein (and optionally further BCL11B protein) upon repetitive stimulations by target cells of the immune cells by at least about 10% (e.g., by at least about any of 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more) , relative to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of ARIH1 protein (and optionally further BCL11B protein) ; x) have sustained cytotoxicity against cancer cells (e.g., GBM cells) in repeated exposure (e.g., at least three rounds) to tumor targets, relative to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of ARIH1 protein (and optionally further BCL11B protein) ; xi) has no or less than 20% (e.g., less than about any of 15%, 10%, 5%, or less) off-target effect; xii) is not a source of tumorigenicity; xiii) does not cause tissue abnormalities; and xiv) has superior resistance to exhaustion or functional decline, relative to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of ARIH1 protein (and optionally further BCL11B protein) ; (xv) have at least about 5% (e.g., at least about any of 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more) increased ADCC activity following administration of an ADCC-inducing agent (e.g., Fc-containing protein, such as Fc-containing antibody) , relative to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of ARIH1 protein (and optionally further BCL11B protein) ; and (xvi) depend on interleukin-2 (IL-2) for growth. Inventors of the present application additionally discovered that immune cells (e.g., T cells such as γδ T cells) modified to have no or reduced (e.g., reducing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) expression (RNA and / or protein expression) and / or function of ARIH1 protein (and optionally further BCL11B proteins) have one or more following characteristics in treating a glioblastoma (e.g., a relapsed glioblastoma) : i) reduce the size of tumor lesions by at least about 10%(e.g., by at least about any of 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 100%) ; ii) have at least about 10% (e.g., at least about any of 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more) increased CD3+ TCRVδ2+ T cells persistence in the cerebrospinal fluid (CSF) after administration of the modified immune cells; iii) have at least about 10% (e.g., at least about any of 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more) increased IFNγ levels in the CSF after administration of the modified immune cells; and iv) have at least about 10% (e.g., at least about any of 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more) increased TNFα levels in the CSF after administration of the modified immune cells; wherein the one or more characteristics are compared to that of administration of a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of ARIH1 protein (and optionally further BCL11B protein) . The treatment of glioblastoma (e.g., a relapsed glioblastoma) was observed to be effective and safe even in senior-adult patients (e.g., 75 years old or above) . These characteristics contribute to the persistence of the modified immune cells while retaining or enhancing their therapeutic functions, e.g., mediated by engineered receptors (e.g., CAR) expressed on the modified immune cells, or mediated by ADCC.

[0081] In one aspect, the present invention provides modified immune cells (e.g., γδ T cells) modified to have no or reduced (e.g., reduced by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) expression (RNA and / or protein expression) and / or function of ARIH1 protein, such as knock-out (KO) ARIH1, e.g., mediated by CRISPR / Cas. In some embodiments, there is provided modified immune cells (e.g., γδ T cells) that are further modified to have no or reduced (e.g., reduced by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) expression (RNA and / or protein expression) and / or function of BCL11B protein, such as knock-out (KO) BCL11B, e.g., mediated by CRISPR / Cas. Also provided are pharmaceutical compositions comprising the modified immune cells described herein, and optionally a pharmaceutically acceptable excipient.

[0082] In another aspect, the present invention provides methods of treating a disease (e.g., cancer) in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of any of the modified immune cells described herein (e.g., modified γδ T cells) , or pharmaceutical compositions thereof.

[0083] In another aspect, the present invention provides methods of: i) prolonging persistence, ii) enhancing degranulation, iii) enhancing cytotoxicity, and / or iv) reducing graft-versus-host disease (GvHD) or host-versus-graft (HvG) responses of the modified immune cell (s) disclosed herein or against the modified immune cell (s) disclosed herein, comprising modifying a precursor cell or an immune cell to reduce (e.g., reduce by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) or eliminate expression (RNA and / or protein expression) and / or function of ARIH1 protein, e.g., KO of ARIH1 as mediated by CRISPR / Cas; optionally further modifying the precursor cell or immune cell to reduce or eliminate expression and / or function of BCL11B protein, e.g., KO of BCL11B as mediated by CRISPR / Cas.

[0084] Also provided are methods of generating any of the modified immune cells described herein, comprising reducing (e.g., reducing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) or eliminating the expression (RNA and / or protein expression) and / or function of ARIH1 protein, and optionally further modifying the immune cells to reduce (e.g., reducing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) or eliminate the expression (RNA and / or protein expression) and / or function of BCL11B protein, such as genetically modifying the DNA locus / loci encoding ARIH1 and optionally BCL11B proteins, e.g., by NHEJ, HDR, zinc-finger nuclease (ZFN) , transcription activator-like effector nuclease (TALEN) , or CRISPR / Cas, or modifying the one or more RNAs encoding ARIH1 and optionally BCL11B proteins, e.g., by using antisense RNA, siRNA, shRNA, leveraging endogenous ADAR for programmable editing of RNA ( “LEAPER” ; see, e.g., WO2020074001 and Qu et al. (Nat Biotechnol. 2019; 37 (9) : 1059-1069) , or RNA Editing for Programmable A to I Replacement ( “REPAIR” ; see, e.g., Cox et al., “RNA editing with CRISPR-Cas13, ” Science. 2017; 358 (6366) : 1019-1027) , etc., the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

[0085] Also provided by modified immune cells obtained by any of the methods described herein. I. Definitions

[0086] The present invention will be described with respect to particular embodiments and with reference to certain drawings, but the invention is not limited thereto. Any reference signs in the claims shall not be construed as limiting the scope. In the drawings, the size of some of the elements may be exaggerated and not drawn to scale for illustrative purposes. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. In case of conflict, the present document, including definitions, will control. Preferred methods and materials are described below, although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in practice or testing of the present invention. All publications, patent applications, patents and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. The materials, methods, and examples disclosed herein are illustrative only and not intended to be limiting.

[0087] As used herein, “internal barcode” or “iBAR” refers to an index inserted into or appended to a molecule, which is useful for tracing the identity and performance of the molecule. The iBAR can be, for example, a short nucleotide sequence inserted in or appended to a guide RNA for a CRISPR / Cas system, as exemplified by the present invention. Multiple iBARs can be used to trace the performance of a single guide RNA sequence within one experiment, thereby providing replicate data for statistical analysis without having to repeat the experiment.

[0088] “CRISPR system” or “CRISPR / Cas system” refers collectively to transcripts and other elements involved in the expression and / or directing the activity of CRISPR-associated ( “Cas” ) genes. For example, a CRISPR / Cas system may include sequences encoding a Cas gene, a tracr (trans-activating CRISPR) sequence (e.g., tracrRNA or an active partial tracrRNA) , a tracr-mate sequence (e.g., encompassing a “direct repeat” and a tracrRNA-processed partial direct repeat in an endogenous CRISPR system) , a guide sequence (also referred to as a “spacer” in an endogenous CRISPR system) , and other sequences and transcripts derived from a CRISPR locus.

[0089] In the context of formation of a CRISPR complex, “target sequence” refers to a sequence to which a guide sequence is designed to have complementarity, where hybridization between a target sequence and a guide sequence promotes the formation of a CRISPR complex. Full complementarity is not necessarily required, provided there is sufficient complementarity to cause hybridization and promote formation of a CRISPR complex. A target sequence may comprise any polynucleotide, such as DNA or RNA polynucleotides. A CRISPR complex may comprise a guide sequence hybridized to a target sequence and complexed with one or more Cas proteins.

[0090] The term “guide sequence” refers to a contiguous sequence of nucleotides in a guide RNA which has partial or complete complementarity to a target sequence in a target polynucleotide and can hybridize to the target sequence by base pairing facilitated by a Cas protein. In a CRISPR / Cas9 system, a target sequence is adjacent to a PAM site. The PAM sequence, and its complementary sequence on the other strand, together constitutes a PAM site.

[0091] The term “guide RNA” is used herein interchangeably with gRNA, and refers to nucleic acid-based molecules, including but not limited to, capable of forming protein-RNA complexes with Cas proteins and comprising sequences (e.g., guide sequence or spacer) that are sufficiently complementary to the target sequence to hybridize to the target sequence and direct the specific binding of the Cas protein-RNA complexes to the target sequence. In some embodiments, the gRNA comprises or is an crRNA. In some embodiments, the gRNA comprises two RNA strands, wherein the spacer sequence and the direct repeat (DR) sequence are in different RNA strands, e.g., an crRNA strand and a tracrRNA strand. In some embodiments, the gRNA is one RNA strand, e.g., an sgRNA.

[0092] The terms “single guide RNA, ” “synthetic guide RNA” and “sgRNA” are used interchangeably and refer to a polynucleotide sequence comprising a guide sequence and any other sequence necessary for the function of the sgRNA and / or interaction of the sgRNA with one or more Cas proteins to form a CRISPR complex. In some embodiments, an sgRNA comprises a guide sequence fused to a second sequence comprising a tracr sequence derived from a tracr RNA and a tracr mate sequence derived from a crRNA. A tracr sequence may contain all or part of the sequence from the tracrRNA of a naturally-occurring CRISPR / Cas system. The term “guide sequence” refers to the nucleotide sequence within the guide RNA that specifies the target site and may be used interchangeably with the terms “guide” or “spacer. ” The term “tracr mate sequence” may also be used interchangeably with the term “direct repeat (s) . ” “sgRNAiBAR” as used herein refers to a single-guide RNA having an iBAR sequence.

[0093] The term “operable with a Cas protein” means that a guide RNA can interact with the Cas protein to form a CRISPR complex.

[0094] As used herein, the term “wild type” or “wild-type” is a term of the art understood by skilled persons and means the typical form of an organism, strain, gene or characteristic as it occurs in nature as distinguished from mutant or variant forms.

[0095] As used herein, the term “variant” should be taken to mean the exhibition of qualities that have a pattern that deviates from what occurs in nature.

[0096] “Complementarity” refers to the ability of a nucleic acid to form hydrogen bond (s) with another nucleic acid sequence by either traditional Watson-Crick base pairing or other non-traditional types. A percent complementarity indicates the percentage of residues in a nucleic acid molecule which can form hydrogen bonds (e.g., Watson-Crick base pairing) with a second nucleic acid sequence (e.g., 5, 6, 7, 8, 9, 10 out of 10 being 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, and 100%complementary) . “Perfectly complementary” means that all the contiguous residues of a nucleic acid sequence will hydrogen bond with the same number of contiguous residues in a second nucleic acid sequence. “Substantially complementary” as used herein refers to a degree of complementarity that is at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, or 100%over a region of 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, or more nucleotides, or refers to two nucleic acids that hybridize under stringent conditions.

[0097] “Hybridization” refers to a reaction in which one or more polynucleotides react to form a complex that is stabilized via hydrogen bonding between the bases of the nucleotide residues. The hydrogen bonding may occur by Watson Crick base pairing, Hoogstein binding, or in any other sequence specific manner. The complex may comprise two strands forming a duplex structure, three or more strands forming a multi stranded complex, a single self-hybridizing strand, or any combination of these. A hybridization reaction may constitute a step in a more extensive process, such as the initiation of PCR, or the cleavage of a polynucleotide by an enzyme. A sequence capable of hybridizing with a given sequence is referred to as the “complement” of the given sequence.

[0098] “Doubling time” or “population doubling time” (PDT) herein refers to the time it takes for a cell population to double in size. Cell doubling time = ln (2)  /  (growth rate) . Growth rate (gr) refers to the amount of doubling in one unit of time.  in which N (t) is the number of cells at time t, N (0) is the number of cells at time 0, t is time (usually in hours) . When a cell population is an exponentially growing population, i.e., every individual cell doubles with every cell cycle, the growth rate only depends on the length of the cell cycle,

[0099] “Construct” as used herein refers to a nucleic acid molecule (e.g., DNA or RNA) , or a vehicle capable of delivering such nucleic acid molecule. For example, when used in the context of a gRNA or an sgRNA, a construct refers to the gRNA or sgRNA molecule, a nucleic acid molecule (e.g., isolated DNA, or viral vector) encoding the gRNA or sgRNA, or a vehicle capable of delivering a nucleic acid molecule encoding the gRNA or sgRNA, such as a lentivirus carrying a nucleic acid molecule encoding the gRNA or sgRNA. When used in the context of a protein, a construct refers to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence that can be transcribed to an RNA or expressed as a protein. A construct may contain necessary regulatory elements operably linked to the nucleotide sequence that allow transcription or expression of the nucleotide sequence when the construct is present in a host cell.

[0100] “Operably linked” as used herein means that expression of a gene is under the control of a regulatory element (e.g., a promoter) with which it is spatially connected. A regulatory element may be positioned 5' (upstream) or 3' (downstream) to a gene under its control. The distance between the regulatory element (e.g., promoter) and a gene may be approximately the same as the distance between that regulatory element (e.g., promoter) and a gene it naturally controls and from which the regulatory element is derived. As it is known in the art, variation in this distance may be accommodated without loss of function in the regulatory element (e.g., promoter) .

[0101] The term “vector” is used to describe a nucleic acid molecule that may be engineered to contain a cloned polynucleotide or polynucleotides that may be propagated in a host cell. Vectors include, but are not limited to, nucleic acid molecules that are single-stranded, double-stranded, or partially double-stranded; nucleic acid molecules that comprise one or more free ends, no free ends (e.g. circular) ; nucleic acid molecules that comprise DNA, RNA, or both; and other varieties of polynucleotides known in the art. One type of vector is a “plasmid, ” which refers to a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be inserted, such as by standard molecular cloning techniques. Certain vectors are capable of autonomous replication in a host cell into which they are introduced (e.g., bacterial vectors having a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors) . Other vectors (e.g., non-episomal mammalian vectors) are integrated into the genome of a host cell upon introduction into the host cell, and thereby are replicated along with the host genome. Moreover, certain vectors are capable of directing the expression of genes to which they are operably linked. Such vectors are referred to herein as “expression vectors. ” Recombinant expression vectors can comprise a nucleic acid of the invention in a form suitable for expression of the nucleic acid in a host cell, which means that the recombinant expression vectors include one or more regulatory elements, which may be selected on basis of the host cells to be used for expression, that is operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed.

[0102] A “host cell” refers to a cell that may be or has been a recipient of a vector or isolated polynucleotide. Host cells may be prokaryotic cells or eukaryotic cells. In some embodiments, the host cell is a eukaryotic cell that can be cultured in vitro and modified using the methods described herein. The term “cell” includes the primary subject cell and its progeny.

[0103] As used herein, the term “autologous” is meant to refer to any material derived from the same individual to whom it is later to be re-introduced.

[0104] “Allogeneic” is meant to refer to any material (e.g., a graft) derived from a different individual of the same species. “Allogeneic T cell” refers to a T cell from a donor having a tissue human leukocyte antigen (HLA) type that matches the recipient. Typically, matching is performed on the basis of variability at three or more loci of the HLA gene, and a perfect match at these loci is preferred. In some instances, allogeneic transplant donors may be related (usually a closely HLA matched sibling) , syngeneic (amonozygotic “identical” twin of the patient) or unrelated (donor who is not related and found to have very close degree of HLA matching) . The HLA genes fall in two categories (Type I and Type II) . In general, mismatches of the Type-I genes (i.e., HLA-A, HLA-B, or HLA-C) increase the risk of graft rejection. A mismatch of an HLA Type II gene (i.e., HLA-DR, or HLA-DQB1) increases the risk of graft-versus-host disease (GvHD) .

[0105] The term “donor subject” or “donor” refers to a subject whose cells are being obtained for further in vitro engineering. The donor subject can be a patient that is to be treated with a population of cells generated by the methods described herein (i.e., an autologous donor) , or can be an individual who donates a blood sample (e.g., lymphocyte sample) that, upon generation of the population of cells generated by the methods described herein, will be used to treat a different individual or patient (i.e., an allogeneic donor) . Those subjects who receive the modified cells (e.g., modified immune cells described herein or prepared by the present methods) can be referred to as “recipient” or “recipient subject. ”

[0106] “Multiplicity of infection” or “MOI” are used interchangeably herein to refer to a ratio of agents (e.g., phage, virus, or bacteria) to their infection targets (e.g., cell or organism) . For example, when referring to a group of cells inoculated with viral particles, the multiplicity of infection or MOI is the ratio between the number of viral particles (e.g., viral particles comprising an sgRNA library) and the number of target cells present in a mixture during viral transduction.

[0107] A “phenotype” of a cell as used herein refers to an observable characteristic or trait of a cell, such as its morphology, development (e.g., growth, proliferation, differentiation, or death) , homeostasis, biochemical or physiological property, phenology, or behavior. A phenotype may result from expression of genes in a cell, influence from environmental factors, or interactions between the two. In some embodiments, the phenotype is growth, differentiation, and / or maturation. In some embodiments, the phenotype is inhibition of growth or proliferation. In some embodiments, the phenotype is persistence in vivo. In some embodiments, the phenotype is effector function (e.g., cytokine release and / or cytotoxic killing) of an immune cell or reduced or absent effector function. In some embodiments, the phenotype is immune cell (e.g., T cell) exhaustion or reduced immune cell exhaustion.

[0108] “Immune cell exhaustion” refers to a decrease of immune cell function, e.g., reduced proliferative capacity, reduced effector function, and upregulation of immunosuppressive molecules. “T cell exhaustion” refers to the decrease of T cell function; “NK cell exhaustion” refers to decrease of NK cell function. Either may occur as a result of an infection (e.g., a chronic infection) or a disease (e.g., cancer) . T cell exhaustion is associated with increased expression of PD-1, TIM-3, TIGIT, and / or LAG-3, apoptosis, reduced cytotoxicity, and / or reduced cytokine secretion. Accordingly, the terms “ameliorate T cell exhaustion, ” “inhibit T cell exhaustion, ” “reduce T cell exhaustion” and the like refer to a condition of restored functionality of T cells characterized by one or more of the following: decreased expression and / or level of one or more of PD-1, TIM-3, TIGIT, and / or LAG-3; increased memory cell formation and / or maintenance of memory markers (e.g., CD62L) ; prevention of apoptosis; increased antigen-induced cytokine (e.g., IFN-γ, IL-2, and / or TNF-α) production and / or secretion; enhanced cytotoxicity / killing capacity; increased recognition of tumor targets with low surface antigen; enhanced proliferation in response to antigen. NK cell exhaustion is associated with increased expression of PD-1, TIGIT, TIM-3, LAG-3, and / or NKG2A, downregulated expression of activating receptors (e.g., NKG2D, CD16, NCRs (NKp30, NKp44, and NKp46) , CD226, 2B4) , apoptosis, reduced cytotoxicity, and / or reduced cytokine (e.g., IFN-γ, and / or TNF-α) secretion. Accordingly, the terms “ameliorate NK cell exhaustion, ” “inhibit NK cell exhaustion, ” “reduce NK cell exhaustion” and the like refer to a condition of restored functionality of NK cells characterized by one or more of the following: decreased expression and / or level of one or more of PD-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, and / or NKG2A; prevention of apoptosis; increased cytokine (e.g., IFN-γ, and / or TNF-α) production and / or secretion; enhanced cytotoxicity / killing capacity; increased recognition of tumor targets with low surface antigen; enhanced proliferation in response to antigen (e.g., MHC class I molecule) ; enhanced expression of one or more activating receptors (e.g., NKG2D, CD16, NCRs (NKp30, NKp44, and NKp46) , CD226, 2B4) .

[0109] The term “stimulation, ” as used herein, refers to a primary response induced by ligation of a cell surface moiety. For example, in the context of receptors, such stimulation entails the ligation of a receptor and a subsequent signal transduction event. With respect to stimulation of a T cell, such stimulation refers to the ligation of a T cell surface moiety that in one embodiment subsequently induces a signal transduction event, such as binding the TCR / CD3 complex. Further, the stimulation event may activate a cell and upregulate or downregulate expression or secretion of a molecule, such as downregulation of TGF-β. Thus, ligation of cell surface moieties, even in the absence of a direct signal transduction event, may result in the reorganization of cytoskeletal structures, or in the coalescing of cell surface moieties, each of which could serve to enhance, modify, or alter subsequent cellular responses.

[0110] The term “activation, ” as used herein, refers to the state of a cell following sufficient cell surface moiety ligation to induce a noticeable biochemical or morphological change. Within the context of T cells, such activation refers to the state of a T cell that has been sufficiently stimulated to induce cellular proliferation. Activation of a T cell may also induce cytokine production and performance of regulatory or cytolytic effector functions. Within the context of other cells, this term infers either up or down regulation of a particular physico-chemical process. The term “activated T cells” indicates T cells that are currently undergoing cell division, cytokine production, performance of regulatory or cytolytic effector functions, and / or has recently undergone the process of “activation. ”

[0111] A “dominant negative” gene product or protein is one that interferes with the function of another gene product or protein. The other gene product affected can be the same or different from the dominant negative protein. Dominant negative gene products can be of many forms, including truncations, full length proteins with point mutations or fragments thereof, or fusions of full-length wild type or mutant proteins or fragments thereof with other proteins.

[0112] An “isolated” nucleic acid molecule described herein is a nucleic acid molecule that is identified and separated from at least one contaminant nucleic acid molecule with which it is ordinarily associated in the environment in which it was produced. Preferably, the isolated nucleic acid is free of association with all components associated with the production environment. The isolated nucleic acid molecules encoding the polypeptides herein is in a form other than in the form or setting in which it is found in nature. Isolated nucleic acid molecules therefore are distinguished from nucleic acid encoding the polypeptides herein existing naturally in cells.

[0113] Unless otherwise specified, a “nucleotide sequence encoding an amino acid sequence” includes all nucleotide sequences that are degenerate versions of each other and that encode the same amino acid sequence. The phrase nucleotide sequence that encodes a protein or an RNA may also include introns to the extent that the nucleotide sequence encoding the protein may in some versions contain an intron (s) .

[0114] The term “transfected” or “transformed” or “transduced” as used herein refers to a process by which exogenous nucleic acid is transferred or introduced into the host cell (e.g., immune cell) . A “transfected” or “transformed” or “transduced” cell is one which has been transfected, transformed or transduced with exogenous nucleic acid. The cell includes the primary subject cell and its progeny.

[0115] As used herein, “treatment” or “treating” is an approach for obtaining beneficial or desired results including clinical results. For purposes of this invention, beneficial or desired clinical results include, but are not limited to, one or more of the following: alleviating one or more symptoms resulting from the disease, diminishing the extent of the disease, stabilizing the disease (e.g., preventing or delaying the worsening of the disease) , preventing or delaying the spread (e.g., metastasis) of the disease, preventing or delaying the recurrence of the disease, delay or slowing the progression of the disease, ameliorating the disease state, providing a remission (partial or total) of the disease, decreasing the dose of one or more other medications required to treat the disease, delaying the progression of the disease, increasing the quality of life, and / or prolonging survival. Also encompassed by “treatment” is a reduction of pathological consequence (s) of cancer or immune diseases.

[0116] The term “effective amount” used herein refers to an amount of an agent, such as modified immune cells described herein, or a pharmaceutical composition thereof, sufficient to treat a specified disorder, condition or disease, such as ameliorate, palliate, lessen, and / or delay one or more of its symptoms (e.g., cancer, infectious disease, GvHD, transplantation rejection, autoimmune disorders, or radiation sickness) . In reference to cancer, an effective amount comprises an amount sufficient to cause a tumor to shrink and / or to decrease the growth rate of the tumor (such as to suppress tumor growth) or to prevent or delay other unwanted cell proliferation. In some embodiments, an effective amount is an amount sufficient to delay development. In some embodiments, an effective amount is an amount sufficient to prevent or delay recurrence. An effective amount can be administered in one or more administrations. The effective amount of the agent (e.g., modified immune cells) or composition may: (i) reduce the number of cancer cells; (ii) reduce tumor size; (iii) inhibit, retard, slow to some extent and preferably stop cancer cell infiltration into peripheral organs; (iv) inhibit (i.e., slow to some extent and preferably stop) tumor metastasis; (v) inhibit tumor growth; (vi) prevent or delay occurrence and / or recurrence of tumor; and / or (vii) relieve to some extent one or more of the symptoms associated with the cancer. In the case of infectious disease, such as viral infection, the therapeutically effective amount of modified immune cells described herein or compositions thereof can reduce the number of cells infected by the pathogen; reduce the production or release of pathogen-derived antigens; inhibit (i.e., slow to some extent and preferably stop) spread of the pathogen to uninfected cells; and / or relieve to some extent one or more symptoms associated with the infection. In some embodiments, the therapeutically effective amount is an amount that extends the survival of a patient.

[0117] As used herein, an “individual” or a “subject” refers to a mammal, including, but not limited to, human, bovine, horse, feline, canine, rodent, or primate. In some embodiments, the individual is a human.

[0118] A “patient” as used herein includes any human who is afflicted with a disease (e.g., cancer) . The terms “subject, ” “individual, ” and “patient” are used interchangeably herein.

[0119] Where the term “comprising” is used in the present description and claims, it does not exclude other elements or steps.

[0120] It is understood that embodiments of the present application described herein include “consisting of” and / or “consisting essentially of” embodiments.

[0121] Reference to “about” a value or parameter herein includes (and describes) variations that are directed to that value or parameter per se. For example, description referring to “about X” includes description of “X” .

[0122] As used herein, reference to “not” a value or parameter generally means and describes “other than” a value or parameter. For example, the method is not used to treat cancer of type X means the method is used to treat cancer of types other than X.

[0123] The term “about X-Y” as used herein has the same meaning as “about X to about Y. ”

[0124] For the recitation of numeric ranges of nucleotides herein, each intervening number therebetween, is explicitly contemplated. For example, for the range of 19-21nt, the number 20nt is contemplated in addition to 19nt and 21nt, and for the range of MOI, each intervening number therebetween, whether it is integral or decimal, is explicitly contemplated.

[0125] As used herein and in the appended claims, the singular forms “a, ” “or, ” and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise.

[0126] It will be understood by one of ordinary skill in the art that uracil and thymine can both be represented by ‘t’ , instead of ‘u’ for uracil and ‘t’ for thymine; in the context of a ribonucleic acid, it will be understood that ‘t’ is used to represent uracil unless otherwise indicated. II. Modified immune cells

[0127] In some embodiments, there is provided a modified immune cell, wherein the modified immune cell has no or reduced expression (e.g., RNA and / or protein) and / or function of an ARIH1 protein. In some embodiments, the expression of the ARIH1 protein is reduced or inhibited by an antisense RNA, an siRNA, or an shRNA specifically recognizing an RNA encoding the ARIH1 protein. In some embodiments, the modified immune cell expresses a dominant negative ARIH1 protein variant or dominant negative fragment thereof. In some embodiments, the modified immune cell is genetically modified at the ARIH1 locus or at ARIH1 RNA. In some embodiments, the ARIH1 locus is modified by gene editing (e.g., CRISPR / Cas) , or the ARIH1 RNA is modified by RNA editing. In some embodiments, the modified immune cell has or is further modified to have no or reduced expression and / or function of one or more other proteins selected from the group consisting of: PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3; optionally wherein the one or more other proteins is BCL11B. In some embodiments, the gene editing comprises gene knockout (KO) . In some embodiments, there is provided a modified immune cell (e.g., a T cell such as a γδ T cell) with ARIH1 gene knock-out (KO) ( “ARIH1KO” ) . In some embodiments, there is provided a modified immune cell (e.g., T cell such as a γδ T cell) with ARIH1 gene KO and BCL11B gene KO ( “ARIH1KO / BCL11BKO” ) . In some embodiments, the modified immune cell is a T cell, such as a γδ T cell (e.g., Vγ9Vδ2 T cell) .

[0128] In some embodiments, the expression of ARIH1 is reduced (e.g., reducing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) or inhibited by an antisense RNA, an siRNA, or an shRNA specifically recognizing an RNA encoding ARIH1 protein.

[0129] In some embodiments, the function of the ARIH1 protein is reduced (e.g., reducing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) or inhibited by a chemically modified mRNA, such as a chemically modified mRNA encoding a dominant negative inhibitor (e.g., dominant negative variant or fragment thereof, or dominant negative binding partner) of the ARIH1 protein. In some embodiments, the modified immune cell expresses a dominant negative ARIH1 protein variant or dominant negative fragment thereof. In some embodiments, the modified immune cell expresses a dominant negative binding partner of ARIH1 protein.

[0130] In some embodiments, the expression (RNA and / or protein expression) and / or function of the ARIH1 protein is reduced (e.g., reducing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) or inhibited by a small molecule compound, a nucleic acid (or vector comprising thereof) , a lipid, and / or a protein molecule.

[0131] In some embodiments, the modified immune cell is genetically modified at the DNA locus encoding the ARIH1 protein. In some embodiments, the DNA locus (i.e., ARIH1 locus) is modified by a mutagenic agent. Mutagenic agents can be classified into three categories: physical (e.g., gamma rays, ultraviolet (UV) radiations) , chemical (e.g., ethyl methane sulphonate (EMS) ) and transposable elements (such as transposons, retrotransposons, T-DNA, retroviruses) . In some embodiments, the mutagenic agent or condition is any of ionizing radiation (IR) , UV radiation, an alkylating agent (e.g., nitrogen mustard gas, methyl methanesulfonate (MMS) , EMS, N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) ) , an aromatic amine (e.g., 2-aminofluorene) , an polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH; e.g., dibenzo [a, l] pyrene, naphthalene, anthracene, pyrene) , crosslinking, insertional mutagenesis (e.g., mediated by transposons or viruses) , or other toxins (e.g., aflatoxin, N-nitrosamines) . In some embodiments, the DNA locus (i.e., ARIH1 locus) is modified by gene editing. In some embodiments, the gene editing is mediated by site-directed mutagenesis (SDM) . In some embodiments, the gene editing is mediated by random-and-extensive mutagenesis (REM) . In some embodiments, the gene editing is accomplished by PCR method (s) . In some embodiments, the gene editing is accomplished by non-PCR method (s) . Any known gene editing methods can be used herein, including but not limited to, non-homologous end-joining (NHEJ) -mediated, homology directed repair (HDR) -mediated, zinc-finger nuclease (ZFN) -mediated, transcription activator-like effector nuclease (TALEN) -mediated, or CRISPR / Cas mediated gene editing. HDR can occur either non-conservatively or conservatively. In some embodiments, HDR is mediated through single-strand annealing (SSA) pathway. In some embodiments, HDR is mediated through classical double-strand break repair (DSBR) pathway, synthesis-dependent strand-annealing (SDSA) pathway, or break-induced repair (BIR) pathway. In some embodiments, the cell modification method described herein further comprises introducing a nucleic acid template (e.g., contains a desired mutation) , such as to be inserted at a double-strand break (DSB) to modify a target genomic sequence (e.g., via HDR) . Gene editing can introduce one or more mutations in the DNA locus encoding the ARIH1 protein, including but not limited to, insertion, deletion, substitution (e.g., nonsynonymous substitution) , truncation, translocation, point mutation, etc. In some embodiments, the mutation is a frameshift mutation, a loss-of-function (LOF) mutation, a dominant negative mutation, a missense mutation, or a nonsense mutation. In some embodiments, the gene editing comprises gene knockout (KO) . In some embodiments, the gene editing comprises base editing (e.g., introducing nonsynonymous substitution) . In some embodiments, base editing introduces a stop codon which may reduce the expression of functional RNA and / or protein. In some embodiments, base editing introduces a mutation that affects the function of the RNA and / or protein. In some embodiments, the gene editing is mediated by CRISPR / Cas. In some embodiments, the Cas protein has endonuclease activity. In some embodiments, the Cas protein is fusion protein comprising i) a dead Cas protein (dCas) and ii) an adenine base editor (ABE) or adenine deaminase (ADA) , or a cytidine base editor (CBE) or cytidine deaminase (CDA) , or functional fragment thereof. Cytidine base editors can convert target C: G base pairs to T: Abase pairs, and adenine base editors can convert A: T base pairs to G:C base pairs, collectively, these two classes of base editors enable the targeted installation of all possible transition mutations (C-to-T, G-to-A, A-to-G, T-to-C, C-to-U, and A-to-U) .

[0132] In some embodiments, the modified immune cell is genetically modified at ARIH1 RNA. In some embodiments, the RNA encoding the ARIH1 protein is modified by RNA editing. RNA editing can introduce one or more mutations in the RNA encoding the ARIH1 protein, including but not limited to, insertion, deletion, substitution (e.g., nonsynonymous substitution) , truncation, point mutation, etc. In some embodiments, the mutation is a frameshift mutation, an LOF mutation, a dominant negative mutation, a missense mutation, or a nonsense mutation. In some embodiments, the RNA editing comprises base editing (e.g., introducing nonsynonymous substitution, such as C to U, A to I) . Any known RNA editing methods can be used herein (see, e.g., Guillermo Aquino-Jarquin, “Novel Engineered Programmable Systems for ADAR-Mediated RNA Editing, ” Mol Ther Nucleic Acids. 2020; 19: 1065-1072; the content of which is incorporated herein by reference in its entirety) , including but not limited to, leveraging endogenous ADAR for programmable editing of RNA ( “LEAPER” ; see, e.g., WO2020074001 and Qu et al. (Nat Biotechnol. 2019; 37 (9) : 1059-1069) , or RNA Editing for Programmable A to I Replacement ( “REPAIR” ; see, e.g., Cox et al., “RNA editing with CRISPR-Cas13, ” Science. 2017; 358 (6366) : 1019-1027) , recruiting endogenous ADAR to specific transcripts for oligonucleotide-mediated RNA editing ( “RESTORE” ; see, e.g., Merkle et al., “Precise RNA editing by recruiting endogenous ADARs with antisense oligonucleotides, ” Methods Mol Biol. 2021; 2181: 331-349) , CRISPR-Cas-Inspired RNA Targeting System ( “CIRTS” ; see, e.g., Rauch et al., “Programmable RNA-Guided RNA Effector Proteins Built from Human Parts, ” Cell. 2019; 178 (1) : 122-134. e12) , RNA Editing for Specific C to U Exchange ( “RESCUE” ; see, e.g., Abudayyeh et al., “A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing, ” Science. 2019; 365 (6451) : 382-386) , or CLUSTER (see, e.g., P. Reautschnig et al., “CLUSTER guide RNAs enable precise and efficient RNA editing with endogenous ADAR enzymes in vivo, ” Nat Biotechnol. 2022 May; 40 (5) : 759-768) , the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety. In some embodiments, the RNA editing is mediated by LEAPER. In some embodiments, the RNA editing is mediated by CRISPR / Cas, such as by fusing an adenine base editor (ABE) or adenine deaminase (ADA) , or a cytidine base editor (CBE) or cytidine deaminase (CDA) , or functional fragment thereof to a dead Cas (dCas, e.g., dCas13) protein.

[0133] Methods for making CRISPRs that recognize pre-determined DNA or RNA sites are known in the art. Any known CRISPR / Cas systems suitable for gene editing or RNA editing can be used herein. To date, two classes (class 1 and class 2) , six types (I-VI) of CRISPR-Cas systems have been characterized based on the outstanding functional and evolutionary modularity of the system. See, e.g., Nidhi et el., “Novel CRISPR–Cas Systems: An Updated Review of the Current Achievements, Applications, and Future Research Perspectives, ” Int J Mol Sci. 2021; 22 (7) : 3327, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety. Among class 2 CRISPR-Cas systems, the type II Cas9 system and the type V-A / B / E / J Cas12a / Cas12b / Cas12e / Cas12j systems have been utilized for genome editing and provided broad prospects for biomedical research. Cas13a (C2c2) is a type VI-ARNA-guided RNA-targeting CRISPR effector, which can be used in RNA editing described herein. The CRISPR / Cas system used herein can create double-strand break (DSB) or single-strand break at the pre-determined nucleic acid site. In some embodiments, CRISPR / Cas system used herein is a CRISPR / Cas9 system.

[0134] In some embodiments, the gene editing or RNA editing comprises contacting a precursor cell (e.g., precursor T cell) with i) a guide RNA (gRNA) construct, wherein the gRNA construct comprises or encodes a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the ARIH1 locus or ARIH1 RNA; and optionally ii) a Cas component comprising a Cas protein or a nucleic acid encoding the Cas protein (e.g., Cas9) , under a condition that allows introduction of the gRNA construct and the optional Cas component into the precursor cell. In some embodiments, the precursor cell already expresses a Cas protein before introducing the gRNA construct. In some embodiments, the precursor cell does not express a Cas protein before introducing the gRNA construct and the Cas component. In some embodiments, the precursor cell expresses an engineered receptor (e.g., CAR, engineered TCR, or TAC) before introducing the gRNA construct and / or the Cas component. In some embodiments, the Cas protein has endonuclease activity. In some embodiments, the Cas protein is fusion protein, such as a fusion protein comprising i) a dCas (e.g., dCas13a, dCas9) and ii) an ADA (e.g., TadA, such as TadA8e) or a CDA or functional fragment thereof. In some embodiments, the Cas protein is Cas9, such as dCas9. In some embodiments, the gRNA is an sgRNA. In some embodiments, the gRNA comprises (or consists essentially of, or consists of) a crRNA. In some embodiments, the gRNA comprises (or consists essentially of, or consists of) a crRNA and a tracrRNA.

[0135] As described herein, a “precursor cell” can be a reference cell (e.g., a reference immune cell, such as a T cell, as in a γδ T cell) before the genetic modification (s) described herein, or can be a stem cell (e.g., induced pluripotent stem cell (iPSC) , embryonic stem cell (ESC) , or hematopoietic stem cell (HSC) ) that can be differentiated into an immune cell. Hence, when referring to modifying a “precursor cell, ” this can refer to modifying an immune cell (e.g., reference immune cell) directly, or can refer to modifying a stem cell and then allowing said stem cell to differentiate into an immune cell. Thus, in some embodiments, the precursor cell is an iPSC. In some embodiments, the modified immune cell is a mature immune cell differentiated from an iPSC, wherein the iPSC is modified to: (i) have no or reduced expression (RNA and / or protein) and / or function of an ARIH1 protein; (ii) have no or reduced expression (RNA and / or protein) and / or function of one or more other proteins (e.g., BCL11B) ; and / or (iii) express an engineered receptor (e.g., CAR) . In some embodiments, the method of producing a modified immune cell comprises modifying an iPSC to: (i) reduce or eliminate expression (RNA and / or protein) and / or function of an ARIH1 protein; (ii) reduce or eliminate expression (RNA and / or protein) and / or function of one or more other proteins (e.g., BCL11B) ; and / or (iii) express an engineered receptor (e.g., CAR) . In some embodiments, the method further comprises differentiating the modified iPSC into a modified immune cell.

[0136] In some embodiments, the modified immune cell (e.g., T cell, such as Vγ9Vδ2 T cell) that has no or reduced (e.g., reducing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) expression (RNA and / or protein expression) and / or function of ARIH1 protein has or is further modified to have no or reduced (e.g., reducing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) expression (RNA and / or protein expression) and / or function of one or more other proteins selected from the group consisting of PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3. In some embodiments, the modified immune cell that has no or reduced (e.g., reducing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) expression (RNA and / or protein expression) and / or function of ARIH1 protein has or is further modified to have no or reduced (e.g., reducing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) expression (RNA and / or protein expression) and / or function of BCL11B protein. In some embodiments, the expression of the BCL11B protein is reduced or inhibited by an antisense RNA, an siRNA, or an shRNA specifically recognizing an RNA encoding the BCL11B protein. In some embodiments, the modified immune cell expresses a dominant negative BCL11B protein variant or dominant negative fragment thereof. In some embodiment, the modified immune cell is genetically modified at the BCL11B locus or at BCL11B RNA. In some embodiments, the BCL11B locus is modified by gene editing, or wherein the BCL11B RNA is modified by RNA editing. In some embodiments, the gene editing comprises gene knockout (KO) . In some embodiments, the modified immune cell further expresses an engineered receptor.

[0137] In some embodiments, the modified immune cell (e.g., T cell) expresses or is further modified to express an engineered receptor. In some embodiments, the modified immune cell already expresses an engineered receptor before being modified to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein (and optionally further the BCL11B protein) . In some embodiments, the modified immune cell has reduced or eliminated expression and / or function of the ARIH1 protein, and further has been modified to express an engineered receptor. In some embodiments, the modifications to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein (and optionally further the BCL11B protein) and to express an engineered receptor occur simultaneously. In some embodiments, the modifications to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein (and optionally further the BCL11B protein) and to express an engineered receptor occur sequentially. Any engineered receptor that can transduce signal to the immune cell (e.g., inducing cellular proliferation, cytokine production, and / or performance of regulatory or cytolytic effector functions) and / or recognize a target antigen can be used herein. In some embodiments, the engineered receptor is a chimeric antigen receptor (CAR) , an engineered TCR, or a T cell antigen coupler (TAC) . In some embodiments, the engineered receptor is monovalent. In some embodiments, the engineered receptor is multivalent. In some embodiments, the engineered receptor is monospecific, e.g., monovalent and monospecific, or multivalent and monospecific. In some embodiments, the engineered receptor is multispecific (e.g., bispecific) . Any CAR, engineered TCR, or TAC can be used herein.

[0138] In some embodiments, the CAR comprises: i) an extracellular antigen binding domain specifically recognizing one or more target antigens (e.g., tumor antigens) or target epitopes (e.g., tumor epitopes) ; ii) a transmembrane domain; and iii) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the extracellular antigen binding domain is selected from the group consisting of an extracellular domain of a ligand, a single-domain antibody (sdAb) , a single chain Fv (scFv) , and a Fab. In some embodiments, the transmembrane domain is derived from a molecule selected from the group consisting of TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD47, CD52, CD64, CD80, CD86, CD134, 4-1BB, CD152, CD154, CISH, and PD-1. In some embodiments, the transmembrane domain is derived from CD8α. In some embodiments, the intracellular signaling domain comprises a primary intracellular signaling domain derived from a molecule selected from the group consisting of CD3ζ, CD3γ, CD3ε, CD3δ, FcRγ, FcRβ, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, FcγRIIa, DAP10, and DAP12. In some embodiments, the primary intracellular signaling domain is derived from CD3ζ. In some embodiments, the intracellular signaling domain further comprises a co-stimulatory signaling domain derived from a co-stimulatory molecule selected from the group consisting of CARD11, CD2, CD4, CD7, CD19, CD27, CD28, CD30, CD40, CD160, ICAM-1, OX40, 4-1BB, SELPLG, LIGHT, HVEM, B7-H3, ICOS, PD-1, SLAMF7, LFA-1, NKG2C, CDS, GITR, BAFFR, NKp80, IPO-3, SLAMF8, LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG / Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, CD83, SLAMF1, CTLA-4, LAG-3, PD-L2, PD-L1, DAP10, TRIM, ZAP70, a ligand that specifically binds with CD83, and any combination thereof. In some embodiments, the co-stimulatory signaling domain is derived from 4-1BB. In some embodiments, the CAR further comprises a hinge domain located between the C-terminus of the extracellular antigen binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain. In some embodiments, the hinge domain is derived from CD8α or CD28. In some embodiments, the CAR comprises from N’ to C’ : extracellular antigen binding domain (e.g., scFv) –optional hinge domain -transmembrane domain -primary intracellular signaling domain. In some embodiments, the CAR comprises from N’ to C’ : extracellular antigen binding domain (e.g., scFv) –optional hinge domain -transmembrane domain –co-stimulatory signaling domain –primary intracellular signaling domain.

[0139] In some embodiments, there is provided a modified T cell that has no or reduced (e.g., reducing at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) expression (RNA and / or protein expression) and / or function of ARIH1 protein, wherein the modified T cell expresses a CAR or is further modified to express a CAR. In some embodiments, there is provided a modified CAR-T cell that has no or reduced (e.g., reducing at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) expression (RNA and / or protein expression) and / or function of ARIH1 protein. In some embodiments, there is provided a modified T cell that has no or reduced (e.g., reducing at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) expression (RNA and / or protein expression) and / or function of ARIH1 protein and BCL11B protein, wherein the modified T cell expresses a CAR or is further modified to express a CAR. In some embodiments, there is provided a modified CAR-T cell that has no or reduced (e.g., reducing at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) expression (RNA and / or protein expression) and / or function of ARIH1 protein and BCL11B protein. In some embodiments, the modified T cell (e.g., γδ T cell, such as CAR-γδ T cell) is genetically modified at the ARIH1 locus by gene editing (e.g., by CRISPR / Cas) . In some embodiments, the modified T cell (e.g., CAR-T cell) is further genetically modified at the BCL11B locus by gene editing (e.g., by CRISPR / Cas) . In some embodiments, the modified T cell (e.g., CAR-T cell) is genetically modified at the ARIH1 locus and at the BCL11B locus both by gene editing (e.g., by CRISPR / Cas) . In some embodiments, the gene editing of the modified T cell (e.g., CAR-T cell) comprises contacting a precursor T cell with i) a gRNA construct, wherein the gRNA construct comprises or encodes a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the ARIH1 locus; and optionally ii) a Cas component comprising a Cas protein (e.g., Cas9) or a nucleic acid encoding the Cas protein, under a condition that allows introduction of the gRNA construct and the optional Cas component into the precursor T cell. In some embodiments, the guide sequence that is complementary to a target site in the ARIH1 locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24. In some embodiments, the precursor T cell expresses a Cas protein. In some embodiments, the CAR comprises: i) an extracellular antigen binding domain specifically recognizing one or more target antigens (e.g., tumor antigens) or target epitopes (e.g., tumor epitopes) ; ii) a transmembrane domain (e.g., CD8α transmembrane domain) ; and iii) an intracellular signaling domain (e.g., CD3ζ primary intracellular signaling domain) .

[0140] In some embodiments, the engineered TCR comprises: (a) an extracellular ligand binding domain comprising an antigen-binding fragment (e.g., sdAb, scFv, Fab, DARPin) that specifically recognizes one or more target antigens (e.g., tumor antigens) or target epitopes (e.g., tumor epitopes) ; (b) an optional first linker; (c) an optional extracellular domain of a first TCR subunit (e.g., Cα, Cβ, Cδ, Cγ, CD3ε) or a portion thereof; (d) a transmembrane domain of a second TCR subunit (e.g., TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ) ; and (e) an intracellular signaling domain comprising an intracellular signaling domain of a third TCR subunit (e.g., TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ) ; wherein the first, the second, and the third TCR subunits are independently selected from the group consisting of TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, and CD3ζ. In some embodiments, the first, the second, and the third TCR subunits are the same (e.g., all CD3ε, all TCRα, all TCRβ, all TCRγ, or all TCRδ) . In some embodiments, the first, the second, and the third TCR subunits are different. In some embodiments, the engineered TCR further comprises a hinge domain located between the C-terminus of the extracellular ligand binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain. In some embodiments, the hinge domain is derived from CD8α.

[0141] Typically, a TAC comprises (i) an antigen-binding domain, (ii) a TCR binding domain (e.g., scFv) , and (iii) a co-receptor domain (e.g., hinge, transmembrane, and / or cytosolic region) . See, e.g., Helsen et al. Nat Commun. 2018; 9 (1) : 3049. In some embodiments, the TAC comprises: (a) an extracellular ligand binding domain comprising an antigen-binding fragment (e.g., sdAb, scFv, Fab, DARPin) that specifically recognizes one or more target antigens (e.g., tumor antigens) or target epitopes (e.g., tumor epitopes) ; (b) an optional first linker; (c) an extracellular TCR binding domain (e.g., sdAb, scFv, Fab, DARPin) that specifically recognizes the extracellular domain of a TCR subunit (e.g., CD3ε) ; (d) an optional second linker; (e) an optional extracellular domain of a first TCR co-receptor (e.g., CD4, CD8) or portion thereof; (f) a transmembrane domain comprising a transmembrane domain of a second TCR co-receptor (e.g., CD4, CD8) ; and (g) an optional intracellular signaling domain comprising an intracellular signaling domain of a third TCR co-receptor (e.g., CD4, CD8) ; wherein the TCR subunit is selected from the group consisting of CD3ε, CD3δ, CD3γ, TCRα, TCRβ, TCRγ, and TCRδ; and wherein the first, the second, and the third TCR co-receptors are each independently selected from the group consisting of CD4, CD8, and CD28. In some embodiments, the first, the second, and the third TCR co-receptors are the same. In some embodiments, the first, the second, and the third TCR co-receptors are different. In some embodiments, the TAC further comprises a hinge domain (e.g., derived from CD8α) located between the C-terminus of the extracellular ligand binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain.

[0142] In some embodiments, the modification to reduce or eliminate expression (RNA and / or protein expression) and / or function of the ARIH1 protein (and optionally the BCL11B protein) does not down-regulate or eliminate expression (RNA and / or protein expression) and / or function of the engineered receptor (e.g., CAR) . In some embodiments, the modification to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein (and optionally the BCL11B protein) down-regulates expression (RNA and / or protein expression) and / or function of the engineered receptor by at most about 30% (e.g., at most about any of 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, or less) .

[0143] In some embodiments, the modified immune cell is a T cell, such as selected from the group consisting of a helper CD4+ T cell, a cytotoxic CD8+ T cell, a memory T cell, a regulatory CD4+ T cell, an NKT cell, an MAIT cell, a DNT cell, and a γδ T cell. In some embodiments, the modification to reduce or eliminate expression (RNA and / or protein expression) and / or function of the ARIH1 protein and optionally the BCL11B protein: i) reduces by at least about 10% (e.g., reducing by at least about any of 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 100%) the expression and / or function of one or more of: IL13, IL5, IL17RB, TNFSF11, TNFSF10, TNFRSF11A, BATF3, CCR4, CCR8, IKZF3, CSF1, WNT5B, CD86, S1PR1, SELL, IL7R, CCR3, and ZBTB32; (ii) has at least about 10%higher expression and / or function of one or more of: NCAM1 (CD56) , KIT, CD3D, IL2RB, FCGR3A (CD16) , BACH2, NCR1 (NKp46) , NCR2 (NKp44) , NCR3 (NKp30) , KLRK1 (NKG2D) , CD244 (2B4) , KLRD1, KLRG1, CD27, GZMB, CSF2, SPRY2, PTPN6, CD300A, IL18RAP, TBX21, and CCL3; (iii) has at least about 10%higher degranulation; (iv) has at least about 10%higher cytotoxicity; and / or (v) has at least about 10%higher persistence when compared to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein (and optionally further the BCL11B protein) . In some embodiments, the modified immune cell comprising the modification to reduce or eliminate expression (RNA and / or protein expression) and / or function of the ARIH1 protein, and optionally the BCL11B protein, has an NK-like characteristic comprising at least about 10%higher expression and / or function of one or more of: NCAM1 (CD56) , KIT, CD3D, IL2RB, FCGR3A (CD16) , BACH2, NCR1 (NKp46) , NCR2 (NKp44) , NCR3 (NKp30) , KLRK1 (NKG2D) , CD244 (2B4) , KLRD1, KLRG1, CD27, GZMB, CSF2, SPRY2, PTPN6, CD300A, IL18RAP, TBX21 and CCL3 when compared to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein (and optionally further the BCL11B protein) .

[0144] In some embodiments, the modified immune cell has at least about 10% (e.g., at least about any of 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1-fold, 1.5-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, 50-fold, or more) longer persistence (e.g., in vivo persistence) compared to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression (RNA and / or protein expression) and / or function of the ARIH1 protein (and optionally further the BCL11B protein) .

[0145] The modified immune cells having reduced or eliminated expression (RNA and / or protein expression) and / or function of the ARIH1 protein and / or other proteins (e.g., BCL11B protein) and / or modified to express an engineered receptor (e.g., CAR) can be autologous or allogeneic. Immune cells

[0146] The term “immune cell” as referred to herein includes cells that are of hematopoietic origin and that play a role in the immune response. “Immune cells” used herein include unmodified immune cells (e.g., parental immune cells such as primary immune cells, immune cells from cell lines) , reference immune cells, and modified immune cells, such as immune cells modified to reduce or eliminate expression (RNA and / or protein expression) and / or function of the one or more target proteins (e.g., ARIH1 and / or BCL11B protein) and / or other proteins (e.g., TCR) and / or modified to express an engineered receptor (e.g., CAR) . Immune cells include lymphocytes, such as B cells and T cells; natural killer (NK) cells; myeloid cells, such as monocytes, macrophages, dendritic cells, eosinophils, mast cells, basophils, and granulocytes. In one embodiment, the immune cell is an immune effector cell. The term “immune effector cell, ” as that term is used herein, refers to a cell that is involved in an immune response, e.g., in the promotion of an immune effector response. Examples of immune effector cells include T cells, B cells, NK cells, natural killer T (NKT) cells, mast cells, and myeloid-derived phagocytes, etc. Immune cells described herein can be autologous or allogeneic.

[0147] “Immune effector function” or “immune effector response, ” as that term is used herein, refers to function or response, e.g., of an immune effector cell, that enhances or promotes an immune attack of a target cell. For example, an immune effector function or response refers a property of a T or NK cell that promotes killing or the inhibition of growth or proliferation of a target cell (e.g., tumor cell) . In the case of a T cell, primary stimulation and co-stimulation are examples of immune effector function or response.

[0148] The term “stimulation, ” refers to a primary response induced by binding of a stimulatory molecule (e.g., a TCR / CD3 complex or CAR) with its cognate ligand (or tumor antigen in the case of a CAR) , thereby mediating a signal transduction event, such as, but not limited to, signal transduction via the TCR / CD3 complex, signal transduction via the appropriate NK receptor, or signaling domains of the CAR. Stimulation can mediate altered expression of certain molecules.

[0149] In some embodiments, the immune cell is a recombinant or modified immune cell. The term “recombinant” includes reference to a cell that has been modified by the introduction of a heterologous nucleic acid, or a cell derived from a cell that has been modified in such a manner but does not encompass the alteration of the cell by naturally occurring events (e.g., spontaneous mutation, natural transformation, natural transduction, natural transposition) such as those occurring without deliberate human intervention. The recombinant immune cell may be a non-naturally occurring cell. The recombinant immune cell may also be an engineered cell. In one embodiment, the recombinant immune cell is an engineered immune cell such as an engineered T cell (e.g., γδ T cell, such as a CAR-γδ T cell) or engineered NK cell (e.g., CAR-NK cell) . In some embodiments, the recombinant immune cell is an isolated immune cell.

[0150] In some embodiments, the immune cell is a hematopoietic stem cell or a pluripotent stem cell. In some embodiments, the immune cell is a T cell, a B cell, or an NK cell. In some embodiments, the immune cell is a modified T cell (e.g., ARIH1-KO or ARIH1-KO / BCL11B-KO T cell, CAR-T, or ARIH1-KO or ARIH1-KO / BCL11B-KO CAR-T) , a modified B cell (e.g., ARIH1-KO or ARIH1-KO / BCL11B-KO B cell) , or a modified NK cell (e.g., ARIH1-KO or ARIH1-KO / BCL11B-KO NK cell, CAR-NK, or ARIH1-KO or ARIH1-KO / BCL11B-KO CAR-NK) .

[0151] In some embodiments, the immune cell is a T cell, such as a modified T cell, e.g., γδ T cell such as a CAR-γδ T cell. In some embodiments, the T cell is selected from the group consisting of a helper CD4+ T cell, a cytotoxic CD8+ T cell, a memory T cell, a regulatory CD4+ T cell, an NKT cell, a mucosal associated invariant T (MAIT) cell, a double negative T (DNT) cell, and a γδ T cell. In some embodiments, the T cell is a T cell, a memory stem T cell, a central memory T cell, an effector memory T cell, an effector T cell, a Th1 cell, a Tc1 cell, a Th2 cell, a Tc2 cell, a Th3 cell, a Th9 cell, a Th17 cell, a Th22 cell, or a T regulatory (Treg) cell.

[0152] DNT cells, also known as CD3+CD4-CD8-T cells, or TCRαβ+CD4-CD8-T cells, which also lack iNKT cell markers (e.g., CD56) , are a subset of mature T lymphocytes. DNT cells in tumor tissues were found to have lower expression of Fas compared to CD4+ or CD8+ T cells, while FasL expression in DNT cells was found to be higher compared to other T cell populations (K. Okamura et al. “The potential target of double negative T cells in cancer immunotherapy, ” Meeting Abstract e15180 | 2020 ASCO Annual Meeting I) .

[0153] γδ T cells are usually double negative (CD4-CD8-) . γδ T cells do not require antigen processing or major-histocompatibility-complex (MHC) molecules for epitope presentation. Some γδ T cells recognize MHC class Ib molecules or butyrophilin molecules. Because of non-MHC-restricted antigen recognition and high cytokine (e.g., IL-17, IFN-γ) secretion, γδ T cells are suitable for effective cancer treatment. Subsets or subpopulations of γδ T cells can include Vδ1 T cell, Vδ2 T cell, Vδ3 T cell, Vδ4 T cell, Vδ5 T cell, Vδ6 T cell, Vδ7 T cell, γδT1 cell, γδT2 cell, γδT17 cell, γδTreg cell, and γδTAPC cell. In some embodiments, the γδ T cell is a Vγ9Vδ2 T cell.

[0154] Also see “isolation and culture of immune cells” subsection below for examples and sources of immune cells. Pharmaceutical compositions

[0155] Also provided are pharmaceutical compositions comprising any of the modified immune cells described herein (e.g., ARIH1-KO or ARIH1-KO / BCL11B-KO immune cells) , and optionally a pharmaceutically acceptable excipient. Pharmaceutical compositions can be prepared by mixing any modified immune cells described herein with suitable pharmaceutically acceptable carriers, excipients or stabilizers (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) ) , in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions.

[0156] Acceptable carriers, excipients, or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include buffers, antioxidants including ascorbic acid, methionine, Vitamin E, sodium metabisulfite; preservatives, isotonicifiers, stabilizers, metal complexes (e.g. Zn-protein complexes) ; chelating agents such as EDTA and / or non-ionic surfactants.

[0157] Buffers are used to control the pH in a range which optimizes the therapeutic effectiveness, especially if stability is pH dependent. Suitable buffering agents for use with the present invention include both organic and inorganic acids and salts thereof. For example, citrate, phosphate, succinate, tartrate, fumarate, gluconate, oxalate, lactate, acetate. Additionally, buffers may comprise histidine and trimethylamine salts such as Tris.

[0158] Preservatives are added to retard microbial growth, and are typically present in a range from 0.2%-1.0% (w / v) . Suitable preservatives for use with the present invention include octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium halides (e.g., chloride, bromide, iodide) , benzethonium chloride; thimerosal, phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexanol, 3-pentanol, and m-cresol.

[0159] Tonicity agents, sometimes known as “stabilizers” are present to adjust or maintain the tonicity of liquid in a composition. Tonicity agents can be present in any amount between 0.1%to 25%by weight, preferably 1 to 5%, taking into account the relative amounts of the other ingredients. Preferred tonicity agents include polyhydric sugar alcohols, preferably trihydric or higher sugar alcohols, such as glycerin, erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol and mannitol.

[0160] Suitable non-ionic surfactants include polysorbates (20, 40, 60, 65, 80, etc. ) , polyoxamers (184, 188, etc. ) ,  polyols,  polyoxyethylene sorbitan monoethers ( etc. ) , lauromacrogol 400, polyoxyl 40 stearate, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 10, 50 and 60, glycerol monostearate, sucrose fatty acid ester, methyl cellulose and carboxymethyl cellulose. Anionic detergents that can be used include sodium lauryl sulfate, dioctyle sodium sulfosuccinate and dioctyl sodium sulfonate. Cationic detergents include benzalkonium chloride or benzethonium chloride.

[0161] In order for the pharmaceutical compositions to be used for in vivo administration, they must be sterile. The pharmaceutical compositions herein generally are placed into a container having a sterile access port, for example, an intravenous solution bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle. Characteristics of modified immune cells

[0162] Characteristics that are indicative of functional activation in immune cells (e.g., T cells) , such as those described herein, include but are not limited to: expression of one or more biomarkers, cell morphology, persistence, cell degranulation, cytotoxicity, and cytokine release. In some embodiments, T cell (i.e., αβ T cell) biomarkers can include, but are not limited to, CD69, CD25, HLA-DR, CD27, CD28, CD30, CD71, CD40L, CD134, and CD137, which can be assessed by immunofluorescence staining and any other suitable method. In some embodiments, γδ T cells biomarkers can include, but are not limited to, NK group 2D (NKG2D) , NK protein 30 (NKp30) , and NK protein 44 (NKp44) . In some embodiments, the modified immune cells (e.g., T cells, such as γδ T cells) express one or more biomarkers at a similar level to an unmodified immune cell that has been stimulated one time. In some embodiments, cytotoxicity can be assessed by methods such as lactate dehydrogenase (LDH) release assay. In some embodiments, cytotoxicity can be assessed in vitro using effector / target co-cultures followed by analytical methods such as flow cytometry or luciferase assay. In some embodiments, cytotoxicity can be assessed by methods such as RTCA assay. In some embodiments, activation can be assessed via the degree of cytokine release, wherein the cytokine is selected from the group consisting of IFN-γ, TNF-α, IL-2, perforin, and granzyme B (GrznB) . Cytokine release can be assessed by methods such as HTRF (Homogeneous Time Resolved Fluorescence) assay.

[0163] For example, in some embodiments, the modified immune cell described herein has at least about 10% (such as about any of 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or more) reduced expression and / or function of one or more of: IL13, IL5, IL17RB, TNFSF11, TNFSF10, TNFRSF11A, BATF3, CCR4, CCR8, IKZF3, CSF1, WNT5B, CD86, S1PR1, SELL, IL7R, CCR3, and ZBTB32 compared to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein (and optionally further the BCL11B protein) . In some embodiments, the modified immune cell has at least about 10% (such as about any of 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more) higher expression and / or function of one or more of: NCAM1 (CD56) , KIT, CD3D, IL2RB, FCGR3A (CD16) , BACH2, NCR1 (NKp46) , NCR2 (NKp44) , NCR3 (NKp30) , KLRK1 (NKG2D) , CD244 (2B4) , KLRD1, KLRG1, CD27, GZMB, CSF2, SPRY2, PTPN6, CD300A, IL18RAP, TBX21, and CCL3 compared to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein (and optionally further the BCL11B protein) . In some embodiments, the modified immune cell has at least about 10% (such as about any of 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more) higher degranulation compared to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein (and optionally further the BCL11B protein) . In some embodiments, the modified immune cell has at least about 10% (such as about any of 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more) higher cytotoxicity (such as anti-tumor cytotoxicity) compared to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein (and optionally further the BCL11B protein) . In some embodiments, the modified immune cell has at least about 10% (such as about any of 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more) higher persistence compared to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein (and optionally further the BCL11B protein) . In some embodiments, the modified immune cell has sustained cytotoxicity against cancer cells (e.g., GBM cells) in repeated exposure (e.g., at least three rounds) to tumor targets, relative to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of ARIH1 protein (and optionally further the BCL11B protein) . In some embodiments, the modified immune cell has no or less than 20% (such as less than about any of 15%, 10%, 5%, or les s) off-target effect. In some embodiments, the off-target effect, if present, is not overlapping with a proto-oncogenes or a tumor suppressor gene. In some embodiments, the modified immune cell is not a source of tumorigenicity. In some embodiments, the modified immune cell does not cause tissue abnormalities. In some embodiments, the modified immune cell has superior resistance to exhaustion or functional decline for at least 3 rounds of tumor re-challenge, relative to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of ARIH1 protein (and optionally the BCL11B protein) . In some embodiments, the modified immune cell has at least about 5% (e.g., at least about any of 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more) increased ADCC activity following administration of an ADCC-inducing agent, relative to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of ARIH1 protein (and optionally further the BCL11B protein) . ARIH1

[0164] Ariadne homolog 1 (ARIH1; also known as ARI, MOP6, and UBCH7BP) is an E3 ubiquitin ligase involved in protein degradation and modification. It has been implicated in various biological processes, including cell stress, RIG-1 signaling, cGAS activation, and PD-L1 expression. Defects in ARIH1 have been found in several individuals with thoracic aortic aneurysms and cerebrovascular disease, conditions resulting from smooth muscle cell (SMC) dysfunction (see, e.g., Tan et al. (2018) Dev Cell 45 (2) : 226-244. e8, hereby incorporated by reference in its entirety) . Treatment of tumors with cisplatin or ACY738 (aless cytotoxic treatment than cisplatin) has been recently demonstrated to upregulate ARIH1 and thereby activate STING signaling within tumor cells and sensitize tumors to antitumor immunotherapy by promoting cytotoxic T cell infiltration, inhibiting tumor growth, and potentiating PD-L1 blockade (see, e.g., Liu et al. (2023) Nat Comm. 14: 4066; and Wu et al. (2021) Nat Comm. 12: 2346, hereby both incorporated by reference in their entireties) .

[0165] In some embodiments, the ARIH1 protein is a human ARIH1 protein. In some embodiments, the human ARIH1 protein comprises the sequence of SEQ ID NO: 16. SEQ ID NO: 16

[0166] In some embodiments, the guide sequence that is complementary to a target site in the ARIH1 locus or ARIH1 RNA is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24. BCL11B

[0167] B-cell lymphoma / leukemia 11B (BCL11B; also known as CTIP2 or RIT1) is a tumor-suppressor that represses transcription through direct binding to GC-rich response elements. BCL11B is essential for T-lineage commitment, particularly the repression of NK and myeloid potentials, and the induction of T-lineage genes, during the initial stages of human T-cell differentiation (see, e.g., Ha et al. (2017) Leukemia 31: 2503-2514, hereby incorporated by reference in its entirety) . BCL11B expression is initiated in a Notch1-and TCF-1-dependent manner at the double-negative 2 (DN2) stage of T cell development and is maintained in mature T lymphocytes, including iNKT and regulatory T (Treg) cells. It is expressed at lower levels in NK cells, but not in B cells, myeloid cells, or dendritic cells. BCL11B is necessary for several developmental checkpoints, including but not limited to the development of Treg cells and iNKT cells, and to the development of a subpopulation of γδ T cells. In mature T cells, BCL11B was shown to control expansion and effector function of cytotoxic T cells (CTLs) , and to control the suppression function of Treg cells (see, e.g., Avram &Califano (2014) J Immunol. 193 (5) : 2059–2065, hereby incorporated by reference in its entirety) .

[0168] In some embodiments, the BCL11B protein is a human BCL11B protein. In some embodiments, the human BCL11B protein comprises the sequence of SEQ ID NO: 17 or 18. SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18

[0169] In some embodiments, the guide sequence that is complementary to a target site in the BCLL11B locus or BCLL11B RNA is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33. Engineered Receptors

[0170] In some embodiments, the modified immune cell further expresses an engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor is a chimeric antigen receptor (CAR) , an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric TCR (cTCR) , a T cell antigen coupler (TAC) , or a TAC-like engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor is a CAR comprising: (i) an extracellular antigen binding domain specifically recognizing a target antigen; (ii) a transmembrane domain; and (iii) an intracellular signaling domain.Chimeric Antigen Receptor (CAR)

[0171] In some embodiments, the engineered receptor is a CAR, such as any CAR known in the art or described herein. In some embodiments, the CAR comprises i) an extracellular antigen binding domain specifically recognizing a target antigen, ii) a transmembrane domain, and iii) an intracellular signaling domain (e.g., derived from CD3ζ) . In some embodiments, the CAR comprises from N-terminus to C-terminus: (a) an extracellular antigen binding domain; (b) an optional hinge domain; (c) a transmembrane domain; (d) an optional intracellular co-stimulatory signaling domain; and (e) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the CAR comprises from N-terminus to C-terminus: (a) an extracellular antigen binding domain; (b) an optional hinge domain; (c) a transmembrane domain; (d) an intracellular signaling domain; and (e) an optional intracellular co-stimulatory signaling domain. The extracellular antigen binding domain of the CAR may be selected from the group consisting of a Fab, a Fab’ , a (Fab’ ) 2, an Fv, an scFv, an sdAb, and a peptide ligand specifically binding to the target antigen, or a combination thereof. The extracellular antigen binding domain can be monospecific or multispecific.

[0172] Many CARs targeting different tumor antigens known in the field can be used herein, such as CAR targeting CD19 and CD20. CARs that can be used herein include, but are not limited to, those described in WO2013123061, WO2016100232, WO2019028051, and WO2019126724, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety. Extracellular antigen binding domain

[0173] In some embodiments, the extracellular antigen binding domain comprises an antibody moiety specifically recognizing a target epitope or antigen. In some embodiments, the extracellular antigen binding domain comprises two or more antibody moieties specifically recognizing one or more target epitopes or antigens, such as connected in tandem. The two or more antibody moieties can be the same or different. The two or more antibody moieties can recognize the same epitope or different epitopes. In some embodiments, the extracellular antigen binding domain recognizes a pathogen-specific antigen, such as a viral antigen, a bacterial antigen, or a parasitic antigen. In some embodiments, the extracellular antigen binding domain recognizes an antigen associated with an autoimmune or inflammatory disease. In some embodiments, the extracellular antigen binding domain recognizes a tumor associated antigen, including but not limited to HER-2, GPC2, GPRC5D, CD7, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD70, CD123, CD228, CD138, BCMA, AFP, GPC3, CEA, Claudin 18.2, CLL1, CD33, folate receptor (FRα) , mesothelin (MSLN) , DLL3, CD276, gp100, 5T4, GD2, EGFR, MUC-1, PSMA, EpCAM, MCSP, SM5-1, MICA, MICB, NKG2D ligand, and ULBP. In some embodiments, the extracellular antigen binding domain specifically recognizes HER-2, CD19, and / or CD20.

[0174] Anti-CD19 antibody moieties can be derived from any anti-CD19 antibody clone, including not limited to, HIB19 (e.g., Invitrogen) , 6OMP31 (e.g., Invitrogen) , SJ25C1 (e.g., Invitrogen) , LC1 (e.g., Invitrogen) , 4G7 (e.g., Invitrogen) , LE-CD19 (e.g., Invitrogen) , SP110 (e.g., Invitrogen) , 1C10A1 (e.g., Proteintech) , OTI2F6 (e.g., OriGene) , 2E2B6B10 (e.g., Invitrogen) , LT19 (e.g., Invitrogen) , 2E2 (e.g., Invitrogen) , HD37 (e.g., Invitrogen) , UMAB103 (e.g., OriGene) , OTI2B11 (e.g., OriGene) , CD19 / 3116 (e.g., NeoBiotechnologies) , OTI3G7 (e.g., OriGene) , OTI2G7 (e.g., OriGene) , OTI1F2 (e.g., OriGene) , OTI1F9 (e.g., OriGene) , OTI1E9 (e.g., OriGene) , OTI2D3 (e.g., OriGene) , A3-A8 (e.g., Huabio) , CVID3 / 155 (e.g., NeoBiotechnologies) , CVID3 / 429 (e.g., NeoBiotechnologies) , CD19 / 3117 (e.g., NeoBiotechnologies) , C19 / 366 (e.g., NeoBiotechnologies) , PDR134 (e.g., NeoBiotechnologies) , 1G3 (e.g., Abnova) , 1G9 (e.g., Invitrogen) , 1C9 (e.g., Abnova) , 1E8 (e.g., Abnova) , ZM179 (e.g., Zeta) , OTI3B10 (e.g., OriGene) , and CB19 (e.g., Invitrogen) .

[0175] Anti-CD20 antibody moieties can be derived from any anti-CD20 antibody clone, including not limited to, 2H7 (e.g., Invitrogen) , L26 (e.g., Invitrogen) , SP32 (e.g., Invitrogen) , B9E9 (e.g., Invitrogen) , HI47 (e.g., Invitrogen) , LT20 (e.g., Invitrogen) , 4A7G3 (e.g., Proteintech) , OTI4B4 (e.g., OriGene) , UMAB37 (e.g., OriGene) , UMAB38 (e.g., OriGene) , UMAB39 (e.g., OriGene) , 3E9D3C1G3 (e.g., Invitrogen) , MEM-97 (e.g., Invitrogen) , FMC7 (e.g., Invitrogen) , MS4A1 / 3409 (e.g., NeoBiotechnologies) , MS4A1 / 3410 (e.g., NeoBiotechnologies) , MS4A1 / 3411 (e.g., NeoBiotechnologies) , MS4A1 / 4655 (e.g., NeoBiotechnologies) , IGEL / 773 (e.g., NeoBiotechnologies) , SPM618 (e.g., NeoBiotechnologies) , OTI11F7 (e.g., OriGene) , OTI1H4 (e.g., OriGene) , OTI3C4 (e.g., OriGene) , OTI2D3 (e.g., OriGene) , OTI10A5 (e.g., OriGene) , OTI2C11 (e.g., OriGene) , OTI1C12 (e.g., OriGene) , 743X69 (e.g., OriGene) , 743X78 (e.g., OriGene) , 743AB30 (e.g., OriGene) , 743Y4 (e.g., OriGene) , 743X56 (e.g., OriGene) , 743X65 (e.g., OriGene) , 743X45 (e.g., OriGene) , 743AB71 (e.g., OriGene) , 13.6E12 (e.g., AbboMax) , ZY492 (e.g., AbboMax) , ZY459 (e.g., AbboMax) , C273 (e.g., AbboMax) , 109-3C2 (e.g., NeoBiotechnologies) , ICO-180 (e.g., Invitrogen) , 93-1B3 (e.g., NeoBiotechnologies) , rMSA1 / 7280 (e.g., NeoBiotechnologies) , B9E9 (e.g., NeoBiotechnologies) , 4F11 (e.g., Abnova) , and 5C11 (e.g., Abnova) . Transmembrane domain

[0176] The transmembrane domain that can be directly or indirectly fused to the extracellular antigen binding domain. Any protein structure that is thermodynamically stable in a cell membrane, such as a eukaryotic cell membrane, can be used as the transmembrane domain herein. The transmembrane domain may be derived either from a natural or from a synthetic source. In some embodiments, the transmembrane domain of the CAR is derived from a molecule selected from the group consisting of: an α, β or ζ chain of a TCR, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, 4-1BB (CD137) , CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18) , ICOS (CD278) , 4-1BB (CD137) , GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , CD160, Claudin-6, IL-2Rβ, IL-2Rγ, IL-7Ra, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CDIOO (SEMA4D) , SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, PAG / Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, and NKG2C. In some embodiments, the transmembrane domain of the CAR is derived from CD8α or CD28. Hinge

[0177] The CAR of the present disclosure may comprise a hinge domain that is located between the extracellular antigen binding domain and the transmembrane domain. A hinge domain is an amino acid segment that is generally found between two domains of a protein and may allow for flexibility of the protein and movement of one or both of the domains relative to one another. Any amino acid sequence that provides such flexibility and movement of the extracellular antigen binding domain relative to the transmembrane domain of the effector molecule can be used. The hinge domain can be a peptide linker, or a hinge domain of antibodies, such as an IgG, IgA, IgM, IgE, or IgD. The hinge domain can be a hinge domain of a naturally occurring protein (e.g., derived from CD8α) , or a non-naturally occurring peptide. In some embodiments, the hinge domain between the C-terminus of the extracellular antigen binding domain and the N-terminus of the transmembrane domain is a peptide linker, for example a glycine-rich peptide linker. Intracellular signaling domain

[0178] In some embodiments, the CAR comprises an intracellular signaling domain consisting essentially of (or consisting of) a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell. “Primary intracellular signaling domain” refers to an intracellular signaling sequence that acts in a stimulatory manner to induce immune effector functions. In some embodiments, the primary intracellular signaling domain contains a signaling motif known as immunoreceptor tyrosine-based activation motif, or ITAM. An “ITAM, ” as used herein, is a conserved protein motif that is generally present in the tail portion of signaling molecules expressed in many immune cells. ITAMs within signaling molecules are important for signal transduction within the cell, which is mediated at least in part by phosphorylation of tyrosine residues in the ITAM following activation of the signaling molecule. ITAMs may also function as docking sites for other proteins involved in signaling pathways. Exemplary ITAM-containing primary intracellular signaling sequences include those derived from CD3ζ, FcεRIβ, FcεRIγ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, DAP12, CNAIP / NFAM1, STAM-1, STAM-2, Moesin, CD5, CD22, CD79a, CD79b, and CD66d (CEACAM3) . In some embodiments, the intracellular signaling domain of the CAR comprises (or consists essentially of, or consists of) an CD3ζ intracellular signaling domain. Intracellular co-stimulatory signaling domain

[0179] Co-stimulation, in addition to stimulation of an antigen-specific signal (e.g., the primary signal) , can help to promote cell proliferation, differentiation, and survival, as well as to activate effector functions of the cell. In some embodiments, the CAR comprises at least one intracellular co-stimulatory signaling domain. The term “intracellular co-stimulatory signaling domain, ” as used herein, refers to at least a portion of a protein that mediates a secondary or co-stimulatory signal transduction within a cell to induce an immune response such as an effector function. The intracellular co-stimulatory signaling domain can act in an antigen-independent manner to provide a secondary or co-stimulatory signal to immune cells. The intracellular co-stimulatory signaling domain of the CAR can be an intracellular signaling domain from a co-stimulatory protein, which transduces a secondary or co-stimulatory signal and modulates responses mediated by immune cells, such as T cells, NK cells, macrophages, neutrophils, or eosinophils. The term "co-stimulatory molecule" refers to a cognate binding partner on an immune cell (such as T cell) that specifically binds with a co-stimulatory ligand, thereby mediating a co-stimulatory response by the immune cell, such as, but not limited to, proliferation and survival. Activation of an intracellular co-stimulatory signaling domain in an immune cell may induce the cell to increase or decrease the production and secretion of cytokines, phagocytic properties, proliferation, differentiation, survival, and / or cytotoxicity. The intracellular co-stimulatory signaling domain of any co-stimulatory molecule may be compatible for use in the CAR described herein. The type (s) of intracellular co-stimulatory signaling domain is selected based on factors such as the type of the immune effector cells in which the CAR would be expressed (e.g., T cells, NK cells, macrophages, neutrophils, or eosinophils) and the desired immune effector function (e.g., ADCC effect) . In some embodiments, the co-stimulatory molecule is selected from the group consisting of CD27, CD28, CD137, OX40, CD40, PD-1, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, TNFRSF9, TNFRSF4, TNFRSF8, CD40LG, ITGB2, KLRC2, TNFRSF18, TNFRSF14, HAVCR1, LGALS9, DAP10, DAP12, CD83, and ligands of CD83. In some embodiments, the CAR comprises an intracellular co-stimulatory signaling domain derived from 4-1BB. Signal peptide

[0180] The CAR of the present disclosure may further comprise a signal peptide (also known as a signal sequence) at the N-terminus of the polypeptide. In general, signal peptides are peptide sequences that target a polypeptide to the desired site in a cell. In some embodiments, the signal peptide targets the engineered receptor to the secretory pathway of the cell and will allow for integration and anchoring of the CAR into the lipid bilayer. During or following translocation of the polypeptide to the cell membrane, the signal peptide may be cleaved. Signal peptides including signal sequences of naturally occurring proteins or synthetic, non-naturally occurring signal sequences, which are compatible for use in the engineered receptors described herein, will be evident to one of skill in the art. In some embodiments, the signal peptide is derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, GM-CSF receptor α, and IgG1 heavy chain. In some embodiments, the signal peptide is derived from a CD8α propeptide, e.g., human CD8α. Peptide linker (s)

[0181] The CAR may comprise one or more peptide linkers, such as between different components of the engineered receptor (e.g., between two or more intracellular co-stimulatory signaling domains, between intracellular co-stimulatory signaling domain and primary intracellular signaling domain, or between the extracellular antigen binding domain and the transmembrane domain) , and / or within one engineered receptor component (e.g., extracellular antigen binding domain, such as within an scFv, or for connecting two or more antibody moieties in tandem) .

[0182] Each peptide linker in a CAR may have the same or different length and / or sequence depending on the structural and / or functional features of the antibody moieties and / or the various domains. Each peptide linker may be selected and optimized independently. The length, the degree of flexibility and / or other properties of the peptide linker (s) used in the engineered receptors may have some influence on properties, including but not limited to the affinity, specificity or avidity for one or more particular antigens or epitopes. The peptide linker may have a naturally occurring sequence, or a non-naturally occurring sequence. For example, a sequence derived from the hinge region of heavy chain only antibodies may be used as the linker. See, for example, WO1996 / 34103. In some embodiments, the peptide linker is a flexible linker. Exemplary flexible linkers include but not limited to glycine polymers (G) n, glycine-serine polymers, glycine-alanine polymers, alanine-serine polymers, threonine-serine, and other flexible linkers known in the art. Other linkers known in the art, for example, as described in WO2016014789, WO2015158671, WO2016102965, US20150299317, WO2018067992, US7741465, Colcher et al., J. Nat. Cancer Inst. 82: 1191-1197 (1990) , and Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) may also be included in the chimeric receptors provided herein, the disclosure of each of which is incorporated herein by reference in their entirety.Engineered T cell receptor (TCR)

[0183] In some embodiments, the engineered receptor is an engineered TCR. The engineered TCR may comprise i) an extracellular antigen binding domain that comprises a Vα and a Vβ (or a Vδ and a Vγ) derived from a wildtype TCR together specifically recognizing a target antigen, wherein the Vα, the Vβ, or both (or the Vδ, the Vγ, or both) , comprise one or more mutations (e.g., insertions, deletions, or substitutions, such as conservative substitutions) in one or more CDRs relative to the wild type TCR; and ii) a transmembrane domain derived from a TCR molecule (e.g., TCRα / TCRβ, or TCRδ / TCRγ) . The engineered TCR can be a single chain TCR (scTCR) or a dimeric TCR (dTCR) . The engineered TCR may bind to the same cognate peptide-MHC bound by the wildtype TCR. The engineered TCR may bind to the same cognate peptide-MHC with higher affinity compared to that bound by the wildtype TCR. The engineered TCR may bind to the same cognate peptide-MHC with lower affinity compared to that bound by the wildtype TCR. The engineered TCR may bind to a non-cognate peptide-MHC not bound by the wildtype TCR. The engineered TCR may not comprise an intracellular signaling domain (e.g., the cytoplasmic domain of TCRα, TCRβ, TCRδ, or TCRγ) . The engineered TCR may further comprise a hinge domain (or a connecting domain) between the TCR Ig-like constant domain and the TCR transmembrane domain, such as a hinge domain derived from TCRα / TCRβ or TCRδ / TCRγ.Chimeric TCR (cTCR)

[0184] In some embodiments, the engineered receptor is a chimeric T cell receptor (cTCR) . The cTCR may comprise: i) an extracellular antigen binding domain comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof (e.g., scFv, Fab, or sdAb) that specifically recognizes a target antigen, and ii) a full-length TCR subunit, wherein the TCR subunit is selected from the group consisting of TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3γ, CD3ε, and CD3δ; wherein the extracellular antigen binding domain is fused (directly or indirectly) to the N-terminus of the full-length TCR subunit. The cTCR may comprise an optional extracellular domain (ECD) or portion thereof derived from a TCR subunit. The cTCR can be incorporated into a functional TCR complex along with other endogenous TCR subunits and confer antigen specificity to the TCR complex. The extracellular antigen binding domain of the cTCR may be selected from the group consisting of a Fab, a Fab’ , a (Fab’ ) 2, an Fv, an scFv, and an sdAb. The cTCR extracellular antigen binding domain may be fused to the N-terminus of the full-length or a portion thereof of CD3ε, CD3γ, or CD3δ. The cTCR extracellular antigen binding domain may be fused to the N-terminus of a TCRα molecule (with or without the Vα domain) , and / or the N-terminus of a TCRβ molecule (with or without the Vβ domain) . The cTCR extracellular antigen binding domain may be fused to the N-terminus of a TCRγ molecule (with or without the Vγ domain) , and / or the N-terminus of a TCRδ molecule (with or without the Vδ domain) . The cTCR may or may not comprise an intracellular signaling domain. The cTCR may comprise an intracellular signaling domain, such as the intracellular signaling domain of CD3γ, CD3ε, or CD3δ. The cTCR intracellular signaling domain and the cTCR transmembrane domain can be derived from the same TCR subunit, e.g., both from CD3ε, both from CD3ε, or both from CD3δ. The cTCR extracellular antigen binding domain and the TCR subunit (full-length or an ECD portion thereof) can be fused via a linker (such as a GS linker) . In some embodiments, the extracellular antigen binding domain is fused to the N-terminus of the transmembrane domain via an optional linker or hinge domain. The cTCR may further comprise a hinge domain between the ECD portion derived from a first TCR subunit and a transmembrane domain derived from a second TCR subunit. In some embodiments, the cTCR comprises from N-terminus to C-terminus: (a) an extracellular antigen binding domain comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof (e.g., scFv, Fab, or sdAb) that specifically recognizes a target antigen; (b) an optional linker, (c) an optional extracellular domain of a first TCR subunit or a portion thereof, (d) an optional hinge domain, (e) a transmembrane domain derived from a second TCR subunit, and (f) an optional cytoplasmic domain (e.g., optional intracellular signaling domain) ; wherein the first and second TCR subunits are independently selected from the group consisting of TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, and CD3δ. The first and second TCR subunits can be the same or different.T cell antigen coupler (TAC)

[0185] In some embodiments, the engineered receptor is a T cell antigen coupler (TAC) comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising an antigen-binding fragment (e.g., scFv, sdAb) that specifically recognizes a target antigen; (b) an optional first linker; (c) an extracellular TCR binding domain that specifically recognizes the extracellular domain of a TCR subunit (e.g., CD3ε) ; (d) an optional second linker; (e) an optional extracellular domain derived from a first TCR co-receptor (such as CD4, CD28, or CD8) ; (f) a transmembrane comprising a transmembrane derived from a second TCR co-receptor (such as CD4, CD28, or CD8) ; and (g) an optional intracellular signaling domain comprising an intracellular signaling domain derived from a third TCR co-receptor (such as CD4, CD28, or CD8) . In some embodiments, the first, second, and third TCR co-receptors are the same (e.g., all CD4) . In some embodiments, the first, second, and third TCR co-receptors are different. For example, in some embodiments, the TAC comprises: (a) an extracellular antigen binding domain comprising an antigen-binding fragment (e.g., scFv, sdAb) that specifically recognizes one or more epitopes of a tumor antigen; (b) an optional first linker; (c) an extracellular TCR binding domain that specifically recognizes the extracellular domain of a TCR subunit (e.g., CD3ε) ; (d) an optional second linker; and (e) a full length TCR co-receptor (e.g., CD4, CD8, or CD28) .TAC-like engineered receptor

[0186] In some embodiments, the engineered receptor is a TAC-like engineered receptor comprising: (a) an extracellular antigen binding domain comprising an antigen-binding fragment (e.g., scFv, sdAb) that specifically recognizes one or more epitopes of a target antigen; (b) an optional first linker; (c) an extracellular TCR binding domain that specifically recognizes the extracellular domain of a first TCR subunit; (d) an optional second linker; (e) an optional extracellular domain derived from a second TCR subunit or a portion thereof; (f) a transmembrane domain comprising a transmembrane domain derived from a third TCR subunit; and (g) an optional intracellular signaling domain comprising an intracellular signaling domain derived from a fourth TCR subunit; wherein the first, second, third, and fourth TCR subunits are all selected from the group consisting of TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, and CD3δ. In some embodiments, the first, second, third, and fourth TCR subunits are the same. In some embodiments, the second, third, and fourth TCR subunits are the same. In some embodiments, the first, second, third, and fourth TCR subunits are different. In some embodiments, the second, third, and fourth TCR subunits are the same but different from the first TCR subunit. In some embodiments, the TAC-like chimeric receptor comprises: (a) an extracellular antigen binding domain comprising an antigen-binding fragment (e.g., scFv, sdAb) that specifically recognizes one or more epitopes of a target antigen; (b) an optional first linker; (c) an extracellular TCR binding domain that specifically recognizes the extracellular domain of a first TCR subunit; (d) an optional second linker; and (e) a full length second TCR subunit; wherein the first and second TCR subunits are both selected from the group consisting of TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, and CD3δ. In some embodiments, the first and second TCR subunits are the same. In some embodiments, the first and second TCR subunits are different.

[0187] These examples are merely illustrative in nature and are not limiting to the present embodiments, as any engineered receptors can be delivered into the modified immune cells described herein. These are non-limiting examples of engineered receptors (e.g., CAR, TCR, cTCR, TAC, and TAC-like engineered receptors) and any other engineered receptor construct could be encoded for by a heterologous nucleic acid as disclosed herein. III. Methods of producing modified immune cells

[0188] One aspect of the present invention provides a method of producing a modified immune cell, comprising modifying a precursor cell to reduce or eliminate expression and / or function of an ARIH1 protein (and optionally further a BCL11B protein) . A “precursor cell” can be a reference cell (e.g., a reference immune cell, such as a T cell, such as a γδ T cell) before being used in the method of producing a modified immune cell comprising the genetic modification (s) described herein; or the precursor cell can be a stem cell (e.g., induced pluripotent stem cell (iPSC) , embryonic stem cell (ESC) , or hematopoietic stem cell (HSC) ) that can be differentiated into an immune cell for use in the method of producing a modified immune cell comprising the genetic modification (s) described herein. Hence, when referring to modifying a “precursor cell, ” an immune cell (e.g., reference immune cell) can be modified directly as part of the method of producing the modified immune; or a stem cell can be modified and then differentiated into an immune cell using standard methods in the art as part of the method of producing the modified immune. Thus, in some embodiments, the precursor cell is an iPSC. In some embodiments, the method of producing a modified immune comprises modifying an iPSC to (i) reduce or eliminate expression and / or function of an ARIH1 protein; (ii) reduce or eliminate expression and / or function of one or more other proteins (e.g., BCL11B) ; and / or (iii) express an engineered receptor (e.g., CAR) . In some embodiments, the method further comprises differentiating the modified iPSC into a modified immune cell.

[0189] In some embodiments, the reference immune cell and / or the modified immune cell is a T cell, a B cell, or an NK cell. In some embodiments, the reference immune cell and / or the modified immune cell is a T cell, such as selected from the group consisting of a helper CD4+ T cell, a cytotoxic CD8+ T cell, a memory T cell, a regulatory CD4+ T cell, an NKT cell, an MAIT cell, a DNT cell, and a γδ T cell (e.g., Vγ9Vδ2 T cell) . In some embodiments, the expression of the ARIH1 protein is reduced or inhibited by an antisense RNA, an siRNA, or an shRNA specifically recognizing an RNA encoding the ARIH1 protein. In some embodiments, the modifying comprises expressing a dominant negative ARIH1 protein variant or dominant negative fragment thereof. In some embodiments, the modifying comprises genetically modifying at the ARIH1 locus or at ARIH1 RNA. In some embodiments, the ARIH1 locus is modified by gene editing, or wherein the ARIH1 RNA is modified by RNA editing. In some embodiments, the gene editing or RNA editing is mediated by non-homologous end-joining (NHEJ) , homology directed repair (HDR) , zinc-finger nuclease (ZFN) , transcription activator-like effector nuclease (TALEN) , or CRISPR / Cas. In some embodiments, the gene editing comprises gene knockout (KO) . In some embodiments, the gene editing or RNA editing comprises base editing. In some embodiments, the reference immune cell and / or the modified immune cell further comprises reduced or eliminated expression and / or function of a BCL11B protein. In some embodiments, the precursor cell expresses an engineered receptor (e.g., CAR, TAC, engineered TCR) . In some embodiments, the method further comprises introducing into the precursor cell a nucleic acid encoding an engineered receptor (e.g., CAR, TAC, engineered TCR) . In some embodiments, the engineered receptor is a CAR.

[0190] In some embodiments, there is provided a method of enhancing degranulation, cytotoxicity, antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) mediated by an ADCC-inducing agent, and / or persistence of a modified immune cell, comprising modifying a precursor cell to reduce or eliminate expression and / or function of an ARIH1 protein. In some embodiments, the immune cell is a T cell, a B cell, or an NK cell. In some embodiments, the immune cell is a T cell, such as selected from the group consisting of a helper CD4+ T cell, a cytotoxic CD8+ T cell, a memory T cell, a regulatory CD4+ T cell, an NKT cell, an MAIT cell, a DNT cell, and a γδ T cell (e.g., Vγ9Vδ2 T cell) . In some embodiments, the expression of the ARIH1 protein is reduced or inhibited by an antisense RNA, an siRNA, or an shRNA specifically recognizing an RNA encoding the ARIH1 protein. In some embodiments, the modifying comprises expressing a dominant negative ARIH1 protein variant or dominant negative fragment thereof. In some embodiments, the modifying comprises genetically modifying at the ARIH1 locus or at ARIH1 RNA. In some embodiments, the ARIH1 locus is modified by gene editing, or wherein the ARIH1 RNA is modified by RNA editing. In some embodiments, the gene editing or RNA editing is mediated by non-homologous end-joining (NHEJ) , homology directed repair (HDR) , zinc-finger nuclease (ZFN) , transcription activator-like effector nuclease (TALEN) , or CRISPR / Cas. In some embodiments, the gene editing comprises gene knockout (KO) . In some embodiments, the gene editing or RNA editing comprises base editing. In some embodiments, the precursor cell expresses an engineered receptor (e.g., CAR, TAC, engineered TCR) . In some embodiments, the method further comprises modifying the modified precursor cell or the modified immune cell to reduce or eliminate expression and / or function of a BCL11B protein. In some embodiments, the method further comprises introducing into the precursor cell a nucleic acid encoding an engineered receptor (e.g., CAR, TAC, engineered TCR) . In some embodiments, the engineered receptor is a CAR.

[0191] In some embodiments, there is provided a method of reprogramming a precursor cell into a modified immune cell, wherein the modified immune cell has an NK-like characteristic, and wherein the method comprises modifying the precursor cell to reduce or eliminate expression and / or function of an ARIH1 protein (and optionally further a BCL11B protein) . In some embodiments, compared to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein (and optionally further the BCL11B protein) , the NK-like characteristic comprises at least about 10%higher expression and / or function of one or more of: NCAM1 (CD56) , KIT, CD3D, IL2RB, FCGR3A (CD16) , BACH2, NCR1 (NKp46) , NCR2 (NKp44) , NCR3 (NKp30) , KLRK1 (NKG2D) , CD244 (2B4) , KLRD1, KLRG1, CD27, GZMB, CSF2, SPRY2, PTPN6, CD300A, IL18RAP, TBX21 and CCL3. In some embodiments, the immune cell is a T cell, a B cell, or an NK cell. In some embodiments, the immune cell is a T cell, such as selected from the group consisting of a helper CD4+ T cell, a cytotoxic CD8+ T cell, a memory T cell, a regulatory CD4+ T cell, an NKT cell, an MAIT cell, a DNT cell, and a γδ T cell (e.g., Vγ9Vδ2 T cell) . In some embodiments, the expression of the ARIH1 protein is reduced or inhibited by an antisense RNA, an siRNA, or an shRNA specifically recognizing an RNA encoding the ARIH1 protein. In some embodiments, the modifying comprises expressing a dominant negative ARIH1 protein variant or dominant negative fragment thereof. In some embodiments, the modifying comprises genetically modifying at the ARIH1 locus or at ARIH1 RNA. In some embodiments, the ARIH1 locus is modified by gene editing, or wherein the ARIH1 RNA is modified by RNA editing. In some embodiments, the precursor cell expresses an engineered receptor (e.g., CAR, TAC, engineered TCR) . In some embodiments, the method further comprises introducing into the precursor cell a nucleic acid encoding an engineered receptor (e.g., CAR, TAC, engineered TCR) . In some embodiments, the engineered receptor is a CAR.

[0192] In some embodiments, the method of producing a modified immune cell comprises creating one or more mutations (e.g., inactivating mutations) in the ARIH1 locus. In some embodiments, the method comprises creating one or more mutations (e.g., inactivating mutations) in the ARIH1 locus, in a precursor cell (e.g., γδ T cells, such as Vγ9Vδ2 T cells) by gene editing, such as any gene editing methods known in the art or described herein. For example, non-homologous end joining (NHEJ) -or HDR (e.g., homologous recombination) -mediated gene modification or disruption, or ZFN-, TALEN-, or CRISPR / Cas-mediated gene modification or disruption. Methods of detecting such mutations are well known in the art, such as by PCR. In some embodiments, the method comprises creating one or more mutations (e.g., inactivating mutations) at the ARIH1 gene products, such as one or more RNAs encoding ARIH1 in a precursor cell by RNA editing (e.g., LEAPER, REPAIR) or protein editing.

[0193] In some embodiments, the method of generating a modified immune cell further comprises modifying the immune cell (e.g., target protein-modified immune cell, such as target protein-modified γδ T cells (e.g., Vγ9Vδ2 T cells) ) to reduce (e.g., reducing at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) or eliminate expression (RNA and / or protein expression) and / or function of one or more other proteins selected from the group consisting of: PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3. In some embodiments, the method further comprises modifying the immune cell to reduce or eliminate expression and / or function of BCL11B. In some embodiments, the modifying comprises genetically modifying at the BCL11B locus or at BCL11B RNA. In some embodiments, the expression of BCL11B is reduced or inhibited by an antisense RNA, an siRNA, or an shRNA specifically recognizing an RNA encoding the BCL11B protein. In some embodiments, the modifying comprises expressing a dominant negative BCL11B protein variant or dominant negative fragment thereof. In some embodiments, the modifying comprises genetically modifying at the BCL11B locus or at BCL11B RNA. In some embodiments, the BCL11B locus is modified by gene editing, or wherein the BCL11B RNA is modified by RNA editing. In some embodiments, the gene editing or RNA editing is mediated by non-homologous end-joining (NHEJ) , homology directed repair (HDR) , zinc-finger nuclease (ZFN) , transcription activator-like effector nuclease (TALEN) , or CRISPR / Cas. In some embodiments, the gene editing comprises gene knockout (KO) . In some embodiments, the gene editing or RNA editing comprises base editing.

[0194] In some embodiments, the expression of ARIH1 is reduced or inhibited by an antisense RNA, an siRNA, or an shRNA specifically recognizing an RNA encoding ARIH1. In some embodiments, the method of producing a modified immune cell comprises introducing into a precursor cell (e.g., γδ T cell, such as Vγ9Vδ2 T cell) a nucleic acid (e.g., vector, such as viral vector) encoding an antisense RNA, an siRNA, or an shRNA specifically recognizing an RNA encoding ARIH1. In some embodiments, the method comprises introducing into the immune cell (e.g., γδ T cell) an antisense RNA, an siRNA, or an shRNA specifically recognizing an RNA encoding ARIH1.

[0195] In some embodiments, the expression of ARIH1 is reduced or inhibited by a small molecule compound, a nucleic acid (or vector comprising thereof) , a lipid, and / or a protein molecule (e.g., a dominant negative binding partner of ARIH1) . In some embodiments, the method of producing a modified immune cell comprises introducing into, or contacting, a precursor cell (e.g., γδ T cell, such as Vγ9Vδ2 T cell) ) with the nucleic acid (or vector comprising thereof) , the lipid, and / or the protein molecule (or a nucleic acid encoding the protein molecule) . In some embodiments, the method comprises contacting a precursor cell (e.g., γδ T cell) with the small molecule compound. In some embodiments, the contacting is in vivo, in vitro, or ex vivo. In some embodiments, the in vivo contacting of the immune cell is by administration of the small molecule compound, nucleic acid (or vector comprising thereof) , lipid, and / or protein molecule to an individual (e.g., human) having the immune cell. Any suitable administration route can be used herein, including but not limited to, intravenous, subcutaneous, intratumoral, intramuscular, intraventricular, or oral administration.

[0196] In some embodiments, the function of ARIH1 is reduced or inhibited by a chemically modified mRNA, such as a chemically modified mRNA encoding a dominant negative inhibitor (e.g., dominant negative variant or fragment thereof, or dominant negative binding partner thereof) of ARIH1 and optionally other proteins (e.g., BCL11B) . In some embodiments, the method of producing a modified immune cell comprises introducing into a precursor cell (e.g., γδT cell, such as Vγ9Vδ2 T cell) the chemically modified mRNA.

[0197] In some embodiments, the immune cell is modified to express a dominant negative variant (e.g., catalytically inactive, binding inactive, activation deficient or inactive) or dominant negative fragment thereof of ARIH1. In some embodiments, the immune cell is modified to express a dominant negative binding partner or fragment thereof of ARIH1. In some embodiments, the method of producing a modified immune cell comprises introducing into a precursor cell (e.g., γδ T cell, such as Vγ9Vδ2 T cell) a nucleic acid (e.g., vector such as viral vector, or RNA) encoding the dominant negative variant or fragment thereof, or the dominant negative binding partner or fragment thereof, of ARIH1 and optionally other proteins (e.g., BCL11B) . In some embodiments, the DNA locus or RNA encoding ARIH1 and optionally other proteins (e.g., BCL11B) in the immune cell is modified (e.g., via gene editing or RNA editing, or mutagenic agent) to express a dominant negative variant or dominant negative fragment thereof.

[0198] In some embodiments, the immune cell is genetically modified at the ARIH1 locus. In some embodiments, the DNA locus (e.g., ARIH1 locus) is modified by a mutagenic agent. Mutagenic agents can be classified into three categories: physical (e.g., gamma rays, ultraviolet radiations) , chemical (e.g., ethyl methane sulphonate or EMS) and transposable elements (such as transposons, retrotransposons, T-DNA, retroviruses) . In some embodiments, the method of producing a modified immune cell comprises contacting a precursor cell (e.g., γδT cell) with a mutagenic agent to reduce or eliminate the expression (RNA and / or protein expression) and / or function of ARIH1. In some embodiments, the DNA locus encoding ARIH1 is modified by gene editing, including but not limited to, NHEJ, HDR, ZFN, TALEN, or CRISPR / Cas mediated gene editing. In some embodiments, the gene editing comprises gene KO. In some embodiments, the gene editing comprises base editing (e.g., introducing nonsynonymous substitution) . In some embodiments, the base editing is mediated by CRISPR / Cas, such as by fusing an ADE or adenine deaminase (ADA) , or a CBE or cytidine deaminase (CDA) , or functional fragment thereof, to a dead Cas (e.g., dCas9) protein. In some embodiments, the method comprises introducing into a precursor cell (e.g., γδ T cell, such as Vγ9Vδ2 T cell) one or more nucleic acids (e.g., vector, such as a viral vector, or RNA) encoding the ZFN, TALEN, or CRISPR / Cas system specifically recognizing a target sequence of a gene encoding the ARIH1 protein. In some embodiments, two or more nucleic acids encoding different components of the ZFN, TALEN, or CRISPR / Cas system are introduced into the immune cell simultaneously. In some embodiments, two or more nucleic acids encoding different components of the ZFN, TALEN, or CRISPR / Cas system are introduced into the immune cell sequentially. In some embodiments, a nucleic acid template (e.g., with a desired modification and homologous arms for HDR) is further introduced into the immune cell, either sequentially or simultaneously with the ZFN, TALEN, or CRISPR / Cas system. In some embodiments, the method of producing a modified immune cell further comprises genetically modifying (i.e., inactivating) the BCL11B locus. In some embodiments, the method of producing a modified immune cell further comprises introducing into the precursor cell or the modified immune cell (e.g., ARIH1 modified) one or more nucleic acids encoding a CAR.

[0199] In some embodiments, the modified immune cell and / or the precursor cell is genetically modified at the RNA encoding the ARIH1 protein, such as by RNA editing (e.g., LEAPER, REPAIR, RESTORE, CIRTS, RESCUE, CLUSTER) . In some embodiments, the RNA editing comprises base editing (e.g., introducing nonsynonymous substitution) . In some embodiments, the RNA editing is mediated by CRISPR / Cas, such as by fusing an adenine deaminase (ADA) or a cytidine deaminase (CDA) or functional fragment thereof to a dead Cas (e.g., dCas13a) protein. In some embodiments, the method of producing a modified immune cell comprises introducing into a precursor cell (e.g., γδ T cell, such as Vγ9Vδ2 T cell) one or more nucleic acids (e.g., vector or RNA) encoding the CRISPR / Cas system specifically recognizing a target sequence of an RNA encoding the ARIH1 protein. In some embodiments, two or more nucleic acids encoding different components of the CRISPR / Cas system are introduced into the immune cell simultaneously. In some embodiments, two or more nucleic acids encoding different components of the CRISPR / Cas system are introduced into the immune cell sequentially. In some embodiments, the method of producing a modified immune cell further comprises genetically modifying (i.e., inactivating) the BCL11B locus. In some embodiments, the method of producing a modified immune cell further comprises introducing into the precursor cell or the modified immune cell (e.g., ARIH1 modified) one or more nucleic acids encoding a CAR.

[0200] In some embodiments, there is provided a method of producing a modified immune cell (e.g., γδ T cell, such as Vγ9Vδ2 T cell) , comprising modifying a precursor cell to reduce (e.g., reducing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) or eliminate expression (RNA and / or protein expression) and / or function of an ARIH1 protein, comprising contacting a precursor cell (e.g., precursor T cell) with i) a first guide RNA (gRNA) construct (e.g., a gRNA, or a vector (e.g., viral vector such as lentiviral vector) , wherein the first gRNA construct comprises or encodes a first gRNA comprising a guide sequence that is complementary (e.g., at least about any of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%complementary) to a target site in the ARIH1 locus or ARIH1 RNA; and optionally ii) a first Cas component comprising a first Cas protein or a nucleic acid encoding the first Cas protein, under a condition that allows introduction of the first gRNA construct and the optional first Cas component into the precursor cell. In some embodiments, there is provided a method of i) enhancing (e.g., enhancing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, 50-fold, 100-fold, or more) persistence (e.g., in vivo persistence) , ii) enhancing (e.g., enhancing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more) degranulation, and / or iii) enhancing (e.g., enhancing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more) cytotoxicity, comprising contacting a precursor cell (e.g., precursor T cell) with: i) a first guide RNA (gRNA) construct (e.g., a gRNA, or a vector (e.g., viral vector such as lentiviral vector) , wherein the first gRNA construct comprises or encodes a first gRNA comprising a guide sequence that is complementary (e.g., at least about any of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%complementary) to a target site in the ARIH1 locus or ARIH1 RNA; and optionally ii) a first Cas component comprising a first Cas protein or a nucleic acid encoding the first Cas protein, under a condition that allows introduction of the gRNA construct and the optional Cas component into the precursor cell, thereby reducing or eliminating expression (RNA and / or protein expression) and / or function of the ARIH1 protein. In some embodiments, there is provided a method of reprogramming a precursor cell into a modified immune cell, wherein the modified immune cell has an NK-like characteristic, wherein, compared to a reference immune cell not having a modification to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein, the NK-like characteristic comprises at least about 10%higher (e.g., at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 1-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 20-fold, or more, higher) expression and / or function of one or more of NCAM1 (CD56) , KIT, CD3D, IL2RB, FCGR3A (CD16) , BACH2, NCR1 (NKp46) , NCR2 (NKp44) , NCR3 (NKp30) , KLRK1 (NKG2D) , CD244 (2B4) , KLRD1, KLRG1, CD27, GZMB, CSF2, SPRY2, PTPN6, CD300A, IL18RAP, TBX21 and CCL3, comprising contacting a precursor cell (e.g., precursor T cell) with: i) a first guide RNA (gRNA) construct (e.g., a gRNA, or a vector (e.g., viral vector such as lentiviral vector) , wherein the first gRNA construct comprises or encodes a first gRNA comprising a guide sequence that is complementary (e.g., at least about any of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%complementary) to a target site in the ARIH1 locus or ARIH1 RNA; and optionally ii) a first Cas component comprising a first Cas protein or a nucleic acid encoding the first Cas protein, under a condition that allows introduction of the gRNA construct and the optional Cas component into the precursor cell, thereby reducing or eliminating expression (RNA and / or protein expression) and / or function of the ARIH1 protein. In some embodiments, the guide sequence that is complementary to a target site in the ARIH1 locus or ARIH1 RNA is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24. In some embodiments, the precursor cell already expresses a Cas protein before introducing the gRNA construct. In some embodiments, the precursor cell does not express a Cas protein before introducing the gRNA construct and the Cas component. In some embodiments, the method further comprises: (i) introducing a vector (e.g., viral vector such as lentiviral vector) carrying a nucleic acid encoding a Cas protein (e.g., Cas9) , or a Cas (e.g., Cas9) mRNA, into the precursor cell or the precursor cell comprising said gRNA construct; or (ii) introducing a nucleic acid encoding a Cas protein (e.g., Cas9) , or a Cas (e.g., Cas9) mRNA via electroporation, into the precursor cell or the precursor cell comprising said gRNA construct. In some embodiments, the method further comprises introducing into the immune cell a nucleic acid template (e.g., comprising a mutation) for modifying the target site of the ARIH1 locus via HDR. In some embodiments, the Cas protein has endonuclease activity. In some embodiments, the Cas protein is fusion protein, such as a fusion protein comprising i) a dCas (e.g., dCas13, dCas9) and ii) an adenine base editor (ABE) or ADA (e.g., TadA, such as TadA8e) , or a cytidine base editor (CBE) or CDA, or functional fragment thereof. In some embodiments, the Cas protein is a dCas13-ADAR fusion protein, such as dCas13a-ADAR1, dCas13a-ADAR2, dCas13b-ADAR1, dCas13b-ADAR2, and functional variants thereof that are capable of performing targeted RNA editing (e.g., C to U, A to I) . In some embodiments, the Cas protein is Cas9, such as dCas9. In some embodiments, the Cas protein is a dCas9-ADA (e.g., TadA) or dCas9-CDA fusion protein. In some embodiments, the method further comprises modifying the modified immune cell or the precursor cell to reduce (e.g., reducing by at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) or eliminate expression (RNA and / or protein expression) and / or function of one or more other proteins selected from the group consisting of: PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3. In some embodiments, the modified immune cell or the precursor cell is further modified to reduce or eliminate expression and / or function of BCL11B, such as genetically modified at the BCL11B locus or RNA encoding the BCL11B protein, comprising contacting the modified immune cell or the precursor cell with: i) a second gRNA construct, wherein the second gRNA construct comprises or encodes a second gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the BCL11B locus or BCL11B RNA; and optionally ii) a second Cas component comprising a second Cas protein (e.g., Cas9) or a nucleic acid encoding the second Cas protein (e.g., Cas9) , under a condition that allows introduction of the second gRNA construct and the optional second Cas component into the modified immune cell or the precursor cell, thereby reducing or eliminating expression (RNA and / or protein expression) and / or function of the BCL11B protein. In some embodiments, the guide sequence that is complementary to a target site in the BCL11B locus or BCL11B RNA is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33. In some embodiments, the precursor cell (e.g., target protein-modified immune cell) already has the Cas component, and only the gRNA construct targeting the one or more other proteins is further introduced. In some embodiments, the first gRNA construct and the second gRNA construct are contacted with the precursor cell simultaneously. In some embodiments, the first gRNA construct and the second gRNA construct are contacted with the precursor cell sequentially. In some embodiments, the first gRNA construct, the second gRNA construct, the first Cas protein, and optionally the second Cas protein are introduced into the precursor cell via electroporation, viral vector (e.g., lentivirus) , lipid nanoparticles (LNP) , and / or liposomes. In some embodiments, the method comprises contacting the first gRNA construct and / or the second gRNA construct with the precursor cell via viral transfection. In some embodiments, the viral transfection is by (e.g., occurs via) a recombinant virus selected from the group consisting of adeno-associated virus (AAV) , adenovirus, retrovirus, herpes simplex virus (HSV) , murine stem cell virus (MSCV) , Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV) , human immunodeficiency virus (HIV) , bovine papilloma virus, lentivirus (LV) , vaccinia virus, and polyoma virus; optionally wherein the recombinant virus is a recombinant lentivirus. In some embodiments, the recombinant lentivirus is pseudotyped with a viral glycoprotein selected from the group consisting of vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) , baboon endogenous virus (BaEV) -WT glycoprotein, BaEV-Rless glycoprotein, BaEV-TR glycoprotein, BaEV-TRless glycoprotein, and RD114 glycoprotein; optionally wherein the viral glycoprotein is BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein. In some embodiments, the nucleic acid encoding the Cas protein and the gRNA construct (s) encoding the gRNA are on the same vector. In some embodiments, the nucleic acid encoding the Cas protein and the gRNA construct (s) encoding the gRNA are on different vectors. In some embodiments, the vectors encoding the Cas component and the gRNA construct (s) are introduced into the precursor cell simultaneously. In some embodiments, the vectors encoding the Cas component and the gRNA construct (s) are introduced into the precursor cell sequentially. In some embodiments, the modified immune cell or the precursor cell expresses an engineered receptor (e.g., CAR, engineered TCR, or TAC) before introducing the gRNA construct and / or the Cas component, or the arRNA construct. In some embodiments, the method further comprises introducing into the modified immune cell or the precursor cell a nucleic acid encoding an engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor is a CAR comprising: i) an extracellular antigen binding domain (e.g., sdAb, scFv, Fab) specifically recognizing one or more target antigens (e.g., tumor antigen) or target epitopes, ii) a transmembrane domain; and iii) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the modified immune cell and / or the precursor cell is selected from the group consisting of a monocyte, a dendritic cell, a macrophage, a B cell, a T cell, a natural killer (NK) cell, an induced pluripotent stem cell (iPSC) , an embryonic stem cell (ESC) , a hematopoietic stem cell (HSC) , or a combination thereof. In some embodiments, the immune cell is a T cell, such as selected from the group consisting of a helper CD4+ T cell, a cytotoxic CD8+ T cell, a memory T cell, a regulatory CD4+ T cell, a natural killer T (NKT) cell, a mucosal associated invariant T (MAIT) cell, a double negative T (DNT) cell, and a γδ T cell. In some embodiments, the T cell is a γδ T cell such as selected from the group consisting of Vδ1 T cell, Vδ2 T cell, Vδ3 T cell, Vδ4 T cell, Vδ5 T cell, Vδ6 T cell, Vδ7 T cell, γδT1 cell, γδT2 cell, γδT17 cell, γδTreg cell, and γδTAPC cell; optionally wherein the γδ T cell is Vγ9Vδ2 T cell. In some embodiments, the first gRNA sequence comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the ARIH1 locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24, and the second gRNA sequence comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the BCL11B locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33.

[0201] In some embodiments, when a population of precursor cells (e.g., γδ T cells) are used for the production of modified immune cells described herein, the method also includes one or more isolation and / or enrichment steps, for example, isolating and / or enriching immune cells that comprise one or more mutations (e.g., inactivating mutations) in the target gene or target RNA, the gRNA construct or arRNA construct, the Cas component, and / or the engineered receptor (e.g., CAR) , from the population of immune cells contacted with any of the modifying agents described herein. Such isolation and / or enrichment steps can be performed using any known techniques in the art and described herein, such as FACS or magnetic-activated cell sorting (MACS) , or based on target gene reporter (e.g., by expressing or not expressing a reporter of the target gene) . Also see methods described in “optional enrichment step” subsection below.

[0202] In some embodiments, the method further comprises selecting from the population of modified immune cells those (i) with reduced (e.g., reducing at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) or no expression and / or function of ARIH1; and optionally (ii) with reduced (e.g., reducing at least about any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or more) or no expression and / or function of BCL11B.

[0203] In some embodiments, the gRNA construct (s) or arRNA construct (s) , and / or the Cas component, and optionally the engineered receptor (e.g., CAR) , are introduced into the precursor cells by transducing / transfecting the nucleic acid (DNA or RNA) or vector encoding thereof (e.g., non-viral vector, or viral vector such as lentiviral vector) , or a virus (e.g., lentivirus) comprising a nucleic acid encoding thereof. In some embodiments, the Cas component (e.g., Cas9 protein) is introduced into the precursor cells by inserting proteins into the cell membrane while passing cells through a microfluidic system, such as CELL  (see, for example, U.S. Patent Application Publication No. 20140287509) .

[0204] Methods of introducing vectors (e.g., viral vectors) or isolated nucleic acids into a mammalian cell are known in the art. The nucleic acids or vectors described herein can be transferred into an immune cell by physical, chemical, or biological methods.

[0205] Physical methods for introducing a vector (e.g., viral vector) into a cell include calcium phosphate precipitation, lipofection, particle bombardment, microinjection, electroporation, and the like. Methods for producing cells comprising vectors and / or exogenous nucleic acids are well-known in the art. See, for example, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. In some embodiments, the vector (e.g., viral vector) is introduced into the cell by electroporation.

[0206] Biological methods for introducing a vector into a cell include the use of DNA and RNA vectors. Viral vectors have become the most widely used method for inserting genes into mammalian, e.g., human cells.

[0207] Chemical means for introducing a vector (e.g., viral vector) into a cell include colloidal dispersion systems, such as macromolecule complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and lipid-based systems including oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, and liposomes. An exemplary colloidal system for use as a delivery vehicle in vitro is a liposome (e.g., an artificial membrane vesicle) .

[0208] In some embodiments, RNA molecules (e.g., gRNA, arRNA, or mRNA encoding Cas) may be prepared by a conventional method (e.g., in vitro transcription) and then introduced into the immune cell via known methods such as mRNA electroporation. See, e.g., Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17: 1027-1035.

[0209] In some embodiments, viral vectors (lentiviral vector) or viruses (e.g., lentiviruses) comprising the gRNA construct (s) or arRNA construct (s) , and / or the Cas component, and optionally the engineered receptor (e.g., CAR) described herein are contacted with the precursor cell at an MOI of at least about 1, such as at least about any of 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 8, 9, or 10, such as at an MOI of about 3.

[0210] In some embodiments, the method of producing a modified immune cell comprises contacting the first gRNA construct and / or the second gRNA construct with the precursor cell via viral transfection. In some embodiments, the viral transfection occurs via a recombinant virus selected from the group consisting of adeno-associated virus (AAV) , adenovirus, retrovirus, herpes simplex virus (HSV) , murine stem cell virus (MSCV) , Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV) , human immunodeficiency virus (HIV) , bovine papilloma virus, lentivirus (LV) , vaccinia virus, and polyoma virus. In some embodiments, the first gRNA construct encoding the first gRNA is comprised within a first recombinant virus and / or the second gRNA construct encoding the second gRNA is comprised within a second recombinant virus. In some embodiments, the recombinant virus is a recombinant lentivirus. In some embodiments, the recombinant lentivirus is pseudotyped with a viral glycoprotein selected from the group consisting of vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) , baboon endogenous virus (BaEV) -WT glycoprotein, BaEV-Rless glycoprotein, BaEV-TR glycoprotein, BaEV-TRless glycoprotein, and RD114 glycoprotein. In some embodiments, the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein.

[0211] In some embodiments, the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein. In some embodiments, the BaEV-Rless glycoprotein comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence comprising at least about 90%amino acid sequence homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1

[0212] In some embodiments, the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-TR glycoprotein. In some embodiments, the BaEV-TR glycoprotein comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence comprising at least about 90%amino acid sequence homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2

[0213] In some embodiments, the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-WT glycoprotein. In some embodiments, the BaEV-WT glycoprotein comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 3, or an amino acid sequence comprising at least about 90%amino acid sequence homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 3

[0214] In some embodiments, the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-TRless glycoprotein. In some embodiments, the BaEV-TRless glycoprotein comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 4, or an amino acid sequence comprising at least about 90%amino acid sequence homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 4

[0215] In some embodiments, the recombinant lentivirus is pseudotyped with RD114 glycoprotein. In some embodiments, the RD114 glycoprotein comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence comprising at least about 90%amino acid sequence homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 5

[0216] In some embodiments, the transduced / transfected immune cell is propagated ex vivo after introduction of the vector or isolated nucleic acid. In some embodiments, the transduced / transfected immune cell is cultured to propagate for at least about any of 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 10 days, 12 days, or 14 days, such as 7 days. In some embodiments, the transduced / transfected immune cell is further evaluated or screened to select desired modified immune cells described herein.

[0217] Reporter genes may be used for identifying potentially transfected / transduced cells and for evaluating the functionality of regulatory sequences. In general, a reporter gene is a gene that is not present in or expressed by the recipient organism or tissue and that encodes a polypeptide whose expression is manifested by some easily detectable property, e.g., enzymatic activity. Expression of the reporter gene is assayed at a suitable time after the DNA / RNA has been introduced into the recipient cells. Suitable reporter genes may include genes encoding luciferase, beta-galactosidase, chloramphenicol acetyl transferase, secreted alkaline phosphatase, or the green fluorescent protein (GFP) gene (e.g., Ui-Tei et al. FEBS Letters 479: 79-82 (2000) ) . Suitable expression systems are well known and may be prepared using known techniques or obtained commercially. Antibiotic selection markers can also be used to identifying potentially transfected / transduced cells.

[0218] Other methods to confirm the presence of any of the nucleic acids described herein (e.g., gRNA construct or arRNA construct) or the presence of a mutation (e.g., inactivating mutation) in a target gene (i.e., ARIH1, and optionally BCL11B) in a modified immune cell, include, for example, molecular biological assays well known to those of skill in the art, such as Southern and Northern blotting, RT-PCR, PCR, DNA-seq, or RNA-seq; biochemical assays, such as detecting the presence or absence of a particular peptide, e.g., by immunological methods (such as ELISAs and Western blots) , Fluorescence-activated cell sorting (FACS) , or Magnetic-activated cell sorting (MACS) .

[0219] Also provided are modified immune cells generated by any of the immune cell generation / modification methods described herein. In some embodiments, the modified immune cell is autologous. In some embodiments, the modified immune cell is allogeneic.Source and culture of immune cells

[0220] Immune cells described herein (e.g., T cells, NK cells, B cells) can be obtained from a number of sources, including peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) , bone marrow, lymph node tissue, cord blood, thymus tissue, tissue from a site of infection, ascites, pleural effusion, spleen tissue, and tumors. In some embodiments, any number of immune cell lines available in the art, may be used. In some embodiments, immune cells can be obtained from a unit of blood collected from a subject using any number of techniques known to the skilled artisan, such as FICOLLTM separation. In some embodiments, cells from the circulating blood of an individual are obtained by apheresis. The apheresis product typically contains lymphocytes, including T cells, monocytes, granulocytes, B cells, other nucleated white blood cells, red blood cells, and platelets. In some embodiments, the cells collected by apheresis may be washed to remove the plasma fraction and to place the cells in an appropriate buffer or media for subsequent processing steps. In some embodiments, the cells are washed with phosphate buffered saline (PBS) . In some embodiments, the wash solution lacks calcium and may lack magnesium or may lack many if not all divalent cations. After washing, the cells may be resuspended in a variety of biocompatible buffers, such as, for example, Ca2+-free, Mg2+-free PBS, PlasmaLyte A, or other saline solution with or without buffer. Alternatively, the undesirable components of the apheresis sample may be removed, and the cells directly resuspended in culture media.

[0221] In some embodiments, the immune cell is provided from an umbilical cord blood bank, a peripheral blood bank, or derived from an induced pluripotent stem cell (iPSC) , multipotent and pluripotent stem cell, or a human embryonic stem cell. In some embodiments, the immune cells are derived from cell lines. The immune cells in some embodiments are obtained from a xenogeneic source, for example, from mouse, rat, non-human primate, and pig. In some embodiments, the immune cells are human cells. In some aspects, the immune cells are primary cells, such as those isolated directly from a subject and / or isolated from a subject and frozen. In some embodiments, after blood collection, PBMCs are separated from the donor blood samples, then T cells, B cells, or NK cells are isolated from the PBMCs, e.g., using the immunomagnetic bead method. In some embodiments, the cells include one or more subsets of immune cells. The skilled artisan would recognize that multiple rounds of selection (e.g., positive or negative) can also be used. For example, for T cells, these populations can be whole T cell populations, CD4+cells, CD8+ cells, and subpopulations thereof, such as those defined by function, activation state, maturity, potential for differentiation, expansion, recirculation, localization, and / or persistence capacities, antigen-specificity, type of antigen receptor, presence in a particular organ or compartment, marker or cytokine secretion profile, and / or degree of differentiation. With reference to the subject to be treated, the cells may be allogeneic and / or autologous. In some cases, the immune cell is allogeneic in reference to one or more intended recipients. In some cases, the immune cell is suitable for transplantation, such as without inducing GvHD in the recipient. In some embodiments, the immune cell is an allogeneic γδ T cell. In some embodiments, the T cell (e.g., allogeneic T cell) is modified to knock-out endogenous ARIH1. In some embodiments, the T cell (e.g., allogeneic T cell) is further modified to knock-out endogenous BCL11B. In some embodiments, the immune cell (e.g., allogeneic T cell) is further modified to express an engineered receptor, such as CAR or engineered TCR.

[0222] Among the sub-types and subpopulations of T cells and / or of CD4+ and / or of CD8+ T cells are naive T (TN) cells, effector T cells (TEFF) , memory T cells and sub-types thereof, such as stem cell memory T (TSCM) , central memory T (TCM) , effector memory T (TEM) , or terminally differentiated effector memory T cells, tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) , immature T cells, mature T cells, helper T cells, cytotoxic T cells (CTLs) , mucosa-associated invariant T (MAIT) cells, naturally occurring and adaptive regulatory T (Treg) cells, helper T cells, such as TH1 cells, TH2 cells, TH3 cells, TH17 cells, TH9 cells, TH22 cells, follicular helper T cells, alpha / beta T cells, and gamma / delta T cells.

[0223] Immune cells for stimulation can also be frozen after a washing step. Without being bound by theory, the freeze and subsequent thaw step provides a more uniform product by removing granulocytes and to some extent monocytes in the cell population. After the washing step that removes plasma and platelets, the cells may be suspended in a freezing solution. Many freezing solutions and parameters are known in the art and will be useful in this context. Any methods of controlled freezing may be used as well as uncontrolled freezing immediately at -20℃ or in liquid nitrogen.

[0224] In some embodiments, cryopreserved cells are thawed and washed as described herein and allowed to rest for one hour at room temperature prior to activation.

[0225] Also contemplated in the present application is the collection of blood samples or apheresis product from a subject at a time period prior to when the expanded cells as described herein might be needed. In one embodiment a blood sample or an apheresis is taken from a generally healthy subject. In certain embodiments, a blood sample or an apheresis is taken from a generally healthy subject who is at risk of developing a disease, but who has not yet developed a disease, and the cells of interest are isolated and frozen for later use. In certain embodiments, the immune cells may be expanded, frozen, and used at a later time. In certain embodiments, samples are collected from a patient shortly after diagnosis of a particular disease as described herein but prior to any treatments. In a further embodiment, the cells are isolated from a blood sample or an apheresis from a subject prior to any number of relevant treatment modalities.

[0226] In some embodiments, immune cells are obtained from a patient directly following treatment. In this regard, it has been observed that following certain cancer treatments, in particular treatments with drugs that damage the immune system, shortly after treatment during the period when patients would normally be recovering from the treatment, the quality of immune cells obtained may be optimal or improved for their ability to expand ex vivo. Likewise, following ex vivo manipulation using the methods described herein, these cells may be in a preferred state for enhanced engraftment and in vivo expansion. Thus, it is contemplated within the context of the present invention to collect blood cells, including immune cells, during this recovery phase. Further, in certain embodiments, mobilization, and conditioning regimens can be used to create a condition in a subject wherein repopulation, recirculation, regeneration, and / or expansion of particular cell types is favored, especially during a defined window of time following therapy.Activationand expansion of immune cells

[0227] In some embodiments, the cells are incubated and / or cultured prior to or in connection with genetic engineering. The incubation steps can include culture, cultivation, stimulation, activation, and / or propagation or expansion. In some embodiments, the compositions or cells are incubated in the presence of stimulating conditions or a stimulatory agent. Such conditions include those designed to induce proliferation, expansion, activation, and / or survival of cells in the population, to mimic antigen exposure, and / or to prime the cells for genetic engineering. The conditions can include one or more of particular media, temperature, oxygen content, carbon dioxide content, time, agents, e.g., nutrients, amino acids, antibiotics, ions, and / or stimulatory factors, such as cytokines, chemokines, antigens, binding partners, fusion proteins, recombinant soluble receptors, and any other agents designed to activate the cells.

[0228] Whether prior to or after modification of the immune cells, the immune cells can be activated and expanded generally using methods as described, for example, in U.S. Pat. Nos. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 9,938,498; US20060121005; and Magee et al. ( “Chapter Nine -Isolation, culture and propagation of natural killer cells, ” Natural Killer Cells, Basic Science and Clinical Application, 2010, Pages 125-135) .

[0229] Generally, T cells (i.e., αβ T cells) can be expanded by contact with a surface having attached thereto an agent that stimulates a CD3 / TCR complex associated signal and a ligand that stimulates a co-stimulatory molecule on the surface of the T cells. In particular, T cell populations may be stimulated as described herein, such as by contact with an anti-CD3 antibody, or antigen-binding fragment thereof, or an anti-CD2 antibody immobilized on a surface, or by contact with a protein kinase C activator (e.g., bryostatin) in conjunction with a calcium ionophore. For co-stimulation of an accessory molecule on the surface of the T cells, a ligand that binds the accessory molecule is used. For example, a population of T cells can be contacted with an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody, under conditions appropriate for stimulating proliferation of the T cells. To stimulate proliferation of either CD4+ T cells or CD8+ T cells, an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody. Examples of an anti-CD28 antibody include 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France) can be used as can other methods commonly known in the art (Berg et al., Transplant Proc. 30 (8) : 3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190 (9) : 13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227 (1-2) : 53-63, 1999) . In some embodiments, paramagnetic beads can be used for expansion / activation, e.g.,  M-450 CD3 / CD28 T paramagnetic beads.

[0230] In some embodiments, γδ T cells in an enriched cell population can be activated and expanded by being subjected to an activation condition. The activation of γδ T cells is mediated by γδ T-cell receptor (TCR) and by activating receptors shared with NK cells (e.g., NKG2D and DNAM-1) . In some embodiments, the γδ T activation condition comprises contacting the enriched population of cells with Zoledronic acid (Zol) -treated tumor cells (e.g., K562 cells) . In some embodiments, the γδ T activation condition comprises contacting the enriched population of cells with Zol. In some embodiments, the γδ T activation condition comprises contacting the enriched population of cells with an antibody specifically recognizing γδ T cells. In some embodiments, the antibody specifically recognizing γδ T cells is an anti-γδTCR constant chain antibody. In some embodiments, the γδ T cells are activated in activation culture medium that comprises a base medium. Any suitable mammalian cell culture medium such as AIM-VTM, X-VIVOTM, TexMACS, RPMI 1640, OPTMIZER CTSTM (Gibco, Life Technologies) , X-VIVOTM-10, X-VIVOTM-15 or X-VIVOTM-20 (Lonza) may be used as the base medium. The activation culture medium may contain a base medium in an amount that is about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, or about 95%by volume. In some embodiments, the activation cell culture medium further comprises human platelet lysate (HPL) , FBS or human AB serum.

[0231] NK cells express characteristic NK cell surface receptors, and lack both TCR rearrangement and T cell, B cell, monocyte and / or macrophage cell surface markers. Human NK cells are characterized by the presence of the cell-surface markers CD16 and CD56, and the absence of the T cell receptor (CD3) . Human bone marrow-derived NK cells are further characterized by the CD2+CD16+CD56+CD3-phenotype, further containing the T-cell receptor zeta-chain [zeta (Q-TCR] , and often characterized by NKp46, NKp30 or NKp44. Inhibitory NK cell receptors include HLA-E (CD94 / NKG2A) ; HLA-C (group 1 or 2) , KIR2DL; KIR3DL (HLA-B Bw4) and HLA-A3 or A4 + peptide. Activating NK cell receptors include HLA-E (CD94 / NKG2C) ; KIR2DS (HLA-C) and KIR3DS (HLA-Bw4) . Other receptors include the NK cell receptor protein-1 (termed NK1.1 in mice) and the low affinity receptor for the Fc portion of IgG (FcγRIII; CD16) .

[0232] In some embodiments, the immune cells are expanded by adding to the culture-initiating composition feeder cells, such as non-dividing peripheral blood mononuclear cells (PBMC) , (e.g., such that the resulting population of cells contains at least about 5, 10, 20, or 40 or more PBMC feeder cells for each immune cell (e.g., T cell) in the initial population to be expanded) ; and incubating the culture (e.g. for a time sufficient to expand the numbers of immune cells (e.g., T cell) ) . In some aspects, the non-dividing feeder cells can comprise gamma-irradiated PBMC feeder cells. In some embodiments, the PBMC are irradiated with gamma rays in the range of about 3000 to 3600 rads to prevent cell division. In some aspects, the feeder cells are added to culture medium prior to the addition of the populations of immune cells (e.g., T cell) .

[0233] In some embodiments, the immune cells, are combined with agent-coated beads, the beads and the cells are subsequently separated, and then the cells are cultured. In an alternative embodiment, prior to culture, the agent-coated beads and cells are not separated but are cultured together. In a further embodiment, the beads and cells are first concentrated by application of a force, such as a magnetic force, resulting in increased ligation of cell surface markers, thereby inducing cell stimulation.

[0234] Conditions appropriate for immune cell (e.g., T cell) culture include an appropriate media (e.g., Minimal Essential Media or RPMI Media 1640 or, X-vivo 15 (Lonza) ) that may contain factors necessary for proliferation and viability, including serum (e.g., fetal bovine or human serum) , interleukin-2 (IL-2) , insulin, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, and TNF-α or any other additives for the growth of cells known to the skilled artisan. Other additives for the growth of cells include, but are not limited to, surfactant, plasmanate, and reducing agents such as N-acetyl-cysteine and 2-mercaptoethanol. Media can include RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-VIVOTM 15, and X-VIVOTM 20, Optimizer, with added amino acids, sodium pyruvate, and vitamins, either serum-free or supplemented with an appropriate amount of serum (or plasma) or a defined set of hormones, and / or an amount of cytokine (s) sufficient for the growth and expansion of T cells. Antibiotics, e.g., penicillin and streptomycin, are included only in experimental cultures, not in cultures of cells that are to be infused into a subject. The target cells are maintained under conditions necessary to support growth, for example, an appropriate temperature (e.g., 37℃) and atmosphere (e.g., air plus 5%CO2) .

[0235] In some embodiments, the methods include assessing expression of one or more markers on the surface of the modified cells or cells to be engineered. In one embodiment, the methods include assessing surface expression of TCR or CD3ε, for example, by affinity-based detection methods such as by flow cytometry. In some aspects, where the method reveals surface expression of the antigen or other marker, the gene encoding the antigen or other marker is disrupted or expression otherwise repressed for example, using the methods described herein.Isolation and enrichment of immune cells (e.g., modified immune cells)

[0236] In some embodiments, the methods described herein further comprise isolating or enriching immune cells comprising a mutation (e.g., inactivating mutation) in ARIH1, and optionally certain other traits (e.g., inactivated BCL11B and / or expressing CAR) . In some embodiments, the methods described herein further comprise isolating or enriching immune cells comprising the Cas component, the gRNA construct (s) or arRNA construct (s) , and / or the engineered receptor (e.g., CAR) described herein, or has reduced or no expression (RNA and / or protein expression) and / or function of ARIH1.

[0237] In some embodiments, the isolation methods include the separation of different cell types based on the absence or presence in the cell of one or more specific molecules, such as surface markers, e.g., surface proteins (e.g., CAR) , intracellular markers, or nucleic acid (e.g., sgRNA, arRNA, and / or nucleic acid encoding Cas) . In some embodiments, any known method for separation based on such markers may be used. In some embodiments, the separation is affinity-or immunoaffinity-based separation. For example, the isolation in some aspects includes separation of cells and cell populations based on the cells’ expression or expression level of one or more markers, typically cell surface markers, for example, by incubation with an antibody or binding partner that specifically binds to such markers, followed generally by washing steps and separation of cells having bound the antibody or binding partner, from those cells having not bound to the antibody or binding partner. In some embodiments, the isolation comprises separation of cells and cell populations based on the cells’ expression of selectable marker genes (e.g., antibiotic resistance genes such as puromycin, or fluorescent protein-encoding genes) . Such separation steps can be based on positive selection, in which the cells having bound the reagents, resistant to antibiotics, or expressing fluorescent proteins are retained for further use, and / or negative selection, in which the cells having not bound to the antibody or binding partner or not expressing fluorescent proteins are retained. In some examples, both fractions are retained for further use. In some aspects, negative selection can be particularly useful where no antibody is available that specifically identifies a cell type in a heterogeneous population, such that separation is best carried out based on markers expressed by cells other than the desired population.

[0238] The separation need not result in 100%enrichment or removal of a particular cell population or cells expressing a particular marker. For example, positive selection of or enrichment for cells of a particular type, such as those expressing a marker, refers to increasing the number or percentage of such cells, but need not result in a complete absence of cells not expressing the marker. Likewise, negative selection, removal, or depletion of cells of a particular type, such as those expressing a marker, refers to decreasing the number or percentage of such cells, but need not result in a complete removal of all such cells.

[0239] In some examples, multiple rounds of separation steps are carried out, where the positively or negatively selected fraction from one step is subjected to another separation step, such as a subsequent positive or negative selection. In some examples, a single separation step can deplete cells expressing multiple markers simultaneously, such as by incubating cells with a plurality of antibodies or binding partners, each specific for a marker targeted for negative selection. Likewise, multiple cell types can simultaneously be positively selected by incubating cells with a plurality of antibodies or binding partners expressed on the various cell types.

[0240] For example, in some aspects, specific subpopulations of T cells, such as cells positive or expressing high levels of one or more surface markers, e.g., CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, and / or CD45RO+ T cells, are isolated by positive or negative selection techniques. In some embodiments, T cells not expressing certain markers, e.g., exhaustion markers, are isolated. In some embodiments, T cells not expressing or expressing reduced markers, e.g., ARIH1 and optionally one or more of PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3, are isolated.

[0241] In some embodiments, isolation is carried out by enrichment for a particular cell population by positive selection, or depletion of a particular cell population, by negative selection. In some embodiments, positive or negative selection is accomplished by incubating cells with one or more antibodies or other binding agent that specifically bind to one or more surface markers expressed or expressed (marker+) at a relatively higher level (markerhigh) on the positively or negatively selected cells, respectively.

[0242] In some aspects, the sample or composition of cells to be separated is incubated with small, magnetizable or magnetically responsive material, such as magnetically responsive particles or microparticles, such as paramagnetic beads (e.g., such as Dynabeads or MACS beads) . The magnetically responsive material, e.g., particle, generally is directly or indirectly attached to a binding partner, e.g., an antibody, that specifically binds to a molecule, e.g., surface marker, present on the cell, cells, or population of cells that it is desired to separate, e.g., that it is desired to negatively or positively select.

[0243] The incubation generally is carried out under conditions whereby the antibodies or binding partners, or molecules, such as secondary antibodies or other reagents, which specifically bind to such antibodies or binding partners, which are attached to the magnetic particle or bead, specifically bind to cell surface molecules if present on cells within the sample.

[0244] In some embodiments, the sample is placed in a magnetic field, and those cells having magnetically responsive or magnetizable particles attached thereto will be attracted to the magnet and separated from the unlabeled cells.

[0245] In some embodiments, the magnetically responsive particles are left attached to the cells that are to be subsequently incubated, cultured and / or engineered; in some aspects, the particles are left attached to the cells for administration to a patient. In some embodiments, the magnetizable or magnetically responsive particles are removed from the cells, e.g., by using competing non-labeled antibodies, magnetizable particles or antibodies conjugated to cleavable linkers, etc.

[0246] In some embodiments, the affinity-based selection is via magnetic-activated cell sorting (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, Calif. ) . Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) systems are capable of high-purity selection of cells having magnetized particles attached thereto. In certain embodiments, MACS operates in a mode wherein the non-target and target species are sequentially eluted after the application of the external magnetic field. That is, the cells attached to magnetized particles are held in place while the unattached species are eluted. Then, after this first elution step is completed, the species that were trapped in the magnetic field and were prevented from being eluted are freed in some manner such that they can be eluted and recovered. In certain embodiments, the non-target cells are labelled and depleted from the heterogeneous population of cells.

[0247] In certain embodiments, the isolation or separation is carried out using a system, device, or apparatus that carries out one or more of the isolation, cell preparation, separation, processing, incubation, culture, and / or formulation steps of the methods. In some aspects, the system is used to carry out each of these steps in a closed or sterile environment, for example, to minimize error, user handling and / or contamination.

[0248] In some embodiments, the system or apparatus carries out one or more, e.g., all, of the isolation, processing, engineering, and formulation steps in an integrated or self-contained system, and / or in an automated or programmable fashion. In some aspects, the system or apparatus includes a computer and / or computer program in communication with the system or apparatus, which allows a user to program, control, assess the outcome of, and / or adjust various aspects of the processing, isolation, engineering, and formulation steps.

[0249] In some embodiments, a cell population described herein is collected and enriched (or depleted) via flow cytometry, in which cells stained for multiple cell surface markers are carried in a fluidic stream. In some embodiments, a cell population described herein is collected and enriched (or depleted) via preparative scale (FACS) -sorting. In certain embodiments, a cell population described herein is collected and enriched (or depleted) by use of microelectromechanical systems (MEMS) chips in combination with a FACS-based detection system (see, e.g., WO 2010 / 033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; and Godin et al. (2008) J Biophoton. 1 (5) : 355-376. IV. Methods of modifying γδ T cells

[0250] The present application in another aspect provides methods of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell (e.g., Vγ9Vδ2 T cell) , comprising contacting the γδ T cell with a recombinant lentivirus comprising the heterologous nucleic acid, wherein the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein. In some embodiments, the BaEV-Rless glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and / or wherein the BaEV-TR glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the heterologous encodes a heterologous molecule. In some embodiments, the heterologous molecule is a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to: (i) a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA, and / or (ii) a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA.

[0251] In some embodiments, there is provided a method of delivering a heterologous nucleic acid into an immune cell, comprising contacting the immune cell with a recombinant lentivirus comprising the heterologous nucleic acid, wherein the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein; wherein the heterologous nucleic acid encodes a heterologous molecule; and wherein the heterologous molecule is a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA. In some embodiments, the guide sequence that is complementary to a target site in the ARIH1 locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24. In some embodiments, the BaEV-Rless glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and / or wherein the BaEV-TR glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the method further comprises contacting the immune cell with a Cas component comprising a Cas protein (e.g., Cas9) or a nucleic acid encoding the Cas protein (e.g., Cas9) . In some embodiments, the Cas component is an mRNA encoding the Cas protein. In some embodiments, the Cas protein has endonuclease activity. In some embodiments, the Cas protein is a fusion protein comprising i) a dCas, and ii) an ADA or a CDA, or a functional fragment thereof. In some embodiments, the Cas protein is Cas9. In some embodiments, the mRNA encoding the Cas protein and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA is introduced into the immune cell via electroporation, or the nucleic acid encoding the Cas protein and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA is comprised within a recombinant lentivirus pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is different from the recombinant lentivirus encoding the gRNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is the same as the recombinant lentivirus encoding the gRNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus comprises two or more heterologous nucleic acids encoding two or more heterologous molecules. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are on the same vector. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are under the control of a same promoter. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are connected via one or more linking sequences. In some embodiments, the linking sequence is IRES or a nucleic acid encoding a cleavable linker (e.g., 2A peptide, for example P2A, T2A, E2A, or F2A) . In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are on different vectors. In some embodiments, the method comprises contacting the immune cell with a first recombinant lentivirus comprising a first heterologous nucleic acid, and a second recombinant lentivirus comprising a second heterologous nucleic acid. In some embodiments, the first recombinant lentivirus and the second recombinant lentivirus are contacted with the immune cell simultaneously. In some embodiments, the first recombinant lentivirus and the second recombinant lentivirus are contacted with the immune cell sequentially. In some embodiments, the method further comprises contacting the immune cell with a third recombinant lentivirus comprising a third heterologous nucleic acid, wherein the third heterologous nucleic acid encodes an engineered receptor (e.g., CAR) . In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is different from the recombinant lentivirus encoding the gRNA and / or the recombinant lentivirus encoding the engineered receptor. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is the recombinant lentivirus encoding the gRNA and / or the recombinant lentivirus encoding the engineered receptor. In some embodiments, the immune cell is a monocyte, a dendritic cell, a macrophage, a B cell, a T cell, an NK cell, an HSC or a combination thereof.

[0252] In some embodiments, there is provided a method of delivering a heterologous nucleic acid into an immune cell, comprising contacting the immune cell with a recombinant lentivirus comprising the heterologous nucleic acid, wherein the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein; wherein the heterologous nucleic acid encodes a heterologous molecule; wherein the heterologous molecule is a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a locus or an RNA encoding one or more other proteins selected from the group consisting of: PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3; and optionally wherein the heterologous molecule is a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA. In some embodiments, the guide sequence that is complementary to a target site in the BCL11B locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33. In some embodiments, the BaEV-Rless glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and / or wherein the BaEV-TR glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the method further comprises contacting the immune cell with a Cas component comprising a Cas protein (e.g., Cas9) or a nucleic acid encoding the Cas protein (e.g., Cas9) . In some embodiments, the Cas component is an mRNA encoding the Cas protein. In some embodiments, the Cas protein has endonuclease activity. In some embodiments, the Cas protein is a fusion protein comprising i) a dCas, and ii) an ADA or a CDA, or a functional fragment thereof. In some embodiments, the Cas protein is Cas9. In some embodiments, the mRNA encoding the Cas protein and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA is introduced into the immune cell via electroporation, or the nucleic acid encoding the Cas protein and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA is comprised within a recombinant lentivirus pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is different from the recombinant lentivirus encoding the gRNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is the same as the recombinant lentivirus encoding the gRNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus comprises two or more heterologous nucleic acids encoding two or more heterologous molecules. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are on the same vector. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are under the control of a same promoter. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are connected via one or more linking sequences. In some embodiments, the linking sequence is IRES or a nucleic acid encoding a cleavable linker (e.g., 2A peptide, for example P2A, T2A, E2A, or F2A) . In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are on different vectors. In some embodiments, the method comprises contacting the immune cell with a first recombinant lentivirus comprising a first heterologous nucleic acid, and a second recombinant lentivirus comprising a second heterologous nucleic acid. In some embodiments, the first recombinant lentivirus and the second recombinant lentivirus are contacted with the immune cell simultaneously. In some embodiments, the first recombinant lentivirus and the second recombinant lentivirus are contacted with the immune cell sequentially. In some embodiments, the method further comprises contacting the immune cell with a third recombinant lentivirus comprising a third heterologous nucleic acid, wherein the third heterologous nucleic acid encodes an engineered receptor (e.g., CAR) . In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is different from the recombinant lentivirus encoding the gRNA and / or the recombinant lentivirus encoding the engineered receptor. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is the recombinant lentivirus encoding the gRNA or the recombinant lentivirus encoding the engineered receptor. In some embodiments, the immune cell is a monocyte, a dendritic cell, a macrophage, a B cell, a T cell, an NK cell, an HSC or a combination thereof.

[0253] In some embodiments, there is provided a method of delivering two heterologous nucleic acids into an immune cell, comprising contacting the immune cell with a recombinant lentivirus comprising the heterologous nucleic acids, wherein the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein; wherein the two heterologous nucleic acids encode two heterologous molecules; and wherein the two heterologous molecules are gRNAs, wherein the first gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA, and wherein the second gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in a locus or an RNA encoding one or more other proteins selected from the group consisting of: PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3, optionally wherein the heterologous molecule is a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA. In some embodiments, the first gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the ARIH1 locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24, and the second gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the BCL11B locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33. In some embodiments, the BaEV-Rless glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and / or wherein the BaEV-TR glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the method further comprises contacting the immune cell with a Cas component comprising a Cas protein (e.g., Cas9) or a nucleic acid encoding the Cas protein (e.g., Cas9) . In some embodiments, the Cas component is an mRNA encoding the Cas protein. In some embodiments, the Cas protein has endonuclease activity. In some embodiments, the Cas protein is a fusion protein comprising i) a dCas, and ii) an ADA or a CDA, or a functional fragment thereof. In some embodiments, the Cas protein is Cas9. In some embodiments, the mRNA encoding the Cas protein and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA is introduced into the immune cell via electroporation, or the nucleic acid encoding the Cas protein and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA is comprised within a recombinant lentivirus pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is different from the recombinant lentivirus encoding the gRNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is the same as the recombinant lentivirus encoding the gRNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus comprises two or more heterologous nucleic acids encoding two or more heterologous molecules. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are on the same vector. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are under the control of a same promoter. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are connected via one or more linking sequences. In some embodiments, the linking sequence is IRES or a nucleic acid encoding a cleavable linker (e.g., 2A peptide, for example P2A, T2A, E2A, or F2A) . In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are on different vectors. In some embodiments, the method comprises contacting the immune cell with a first recombinant lentivirus comprising a first heterologous nucleic acid, and a second recombinant lentivirus comprising a second heterologous nucleic acid. In some embodiments, the first recombinant lentivirus and the second recombinant lentivirus are contacted with the immune cell simultaneously. In some embodiments, the first recombinant lentivirus and the second recombinant lentivirus are contacted with the immune cell sequentially. In some embodiments, the method further comprises contacting the immune cell with a third recombinant lentivirus comprising a third heterologous nucleic acid, wherein the third heterologous nucleic acid encodes an engineered receptor (e.g., CAR) . In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is different from the recombinant lentivirus encoding the gRNA and / or the recombinant lentivirus encoding the engineered receptor. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is the recombinant lentivirus encoding the gRNA or the recombinant lentivirus encoding the engineered receptor. In some embodiments, the immune cell is a monocyte, a dendritic cell, a macrophage, a B cell, a T cell, an NK cell, an HSC or a combination thereof.

[0254] In some embodiments, there is provided a method of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell, comprising contacting the γδ T cell with a recombinant lentivirus comprising the heterologous nucleic acid, wherein the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein; wherein the heterologous nucleic acid encodes a heterologous molecule; and wherein the heterologous molecule is a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA. In some embodiments, the guide sequence that is complementary to a target site in the ARIH1 locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24. In some embodiments, the BaEV-Rless glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and / or wherein the BaEV-TR glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the method further comprises contacting the γδ T cell with a Cas component comprising a Cas protein (e.g., Cas9) or a nucleic acid encoding the Cas protein (e.g., Cas9) . In some embodiments, the Cas component is an mRNA encoding the Cas protein. In some embodiments, the Cas protein has endonuclease activity. In some embodiments, the Cas protein is a fusion protein comprising i) a dCas, and ii) an ADA or a CDA, or a functional fragment thereof. In some embodiments, the Cas protein is Cas9. In some embodiments, the mRNA encoding the Cas protein and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA is introduced into the γδ T cell via electroporation, or the nucleic acid encoding the Cas protein and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA is comprised within a recombinant lentivirus pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is different from the recombinant lentivirus encoding the gRNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is the same as the recombinant lentivirus encoding the gRNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus comprises two or more heterologous nucleic acids encoding two or more heterologous molecules. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are on the same vector. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are under the control of a same promoter. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are connected via one or more linking sequences. In some embodiments, the linking sequence is IRES or a nucleic acid encoding a cleavable linker (e.g., 2A peptide, for example P2A, T2A, E2A, or F2A) . In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are on different vectors. In some embodiments, the method comprises contacting the γδ T cell with a first recombinant lentivirus comprising a first heterologous nucleic acid, and a second recombinant lentivirus comprising a second heterologous nucleic acid. In some embodiments, the first recombinant lentivirus and the second recombinant lentivirus are contacted with the γδ T cell simultaneously. In some embodiments, the first recombinant lentivirus and the second recombinant lentivirus are contacted with the γδ T cell sequentially. In some embodiments, the method further comprises contacting the γδ T cell with a third recombinant lentivirus comprising a third heterologous nucleic acid, wherein the third heterologous nucleic acid encodes an engineered receptor (e.g., CAR) . In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is different from the recombinant lentivirus encoding the gRNA and / or the recombinant lentivirus encoding the engineered receptor. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is the recombinant lentivirus encoding the gRNA and / or the recombinant lentivirus encoding the engineered receptor. In some embodiments, the γδ T cell is Vγ9Vδ2 T cell.

[0255] In some embodiments, there is provided a method of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell, comprising contacting the γδ T cell with a recombinant lentivirus comprising the heterologous nucleic acid, wherein the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein; wherein the heterologous nucleic acid encodes a heterologous molecule; wherein the heterologous molecule is a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a locus or an RNA encoding one or more other proteins selected from the group consisting of: PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3; and optionally wherein the heterologous molecule is a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA. In some embodiments, the guide sequence that is complementary to a target site in the BCL11B locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33. In some embodiments, the BaEV-Rless glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and / or wherein the BaEV-TR glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the method further comprises contacting the γδ T cell with a Cas component comprising a Cas protein (e.g., Cas9) or a nucleic acid encoding the Cas protein (e.g., Cas9) . In some embodiments, the Cas component is an mRNA encoding the Cas protein. In some embodiments, the Cas protein has endonuclease activity. In some embodiments, the Cas protein is a fusion protein comprising i) a dCas, and ii) an ADA or a CDA, or a functional fragment thereof. In some embodiments, the Cas protein is Cas9. In some embodiments, the mRNA encoding the Cas protein and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA is introduced into the γδ T cell via electroporation, or the nucleic acid encoding the Cas protein and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA is comprised within a recombinant lentivirus pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is different from the recombinant lentivirus encoding the gRNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is the same as the recombinant lentivirus encoding the gRNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus comprises two or more heterologous nucleic acids encoding two or more heterologous molecules. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are on the same vector. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are under the control of a same promoter. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are connected via one or more linking sequences. In some embodiments, the linking sequence is IRES or a nucleic acid encoding a cleavable linker (e.g., 2A peptide, for example P2A, T2A, E2A, or F2A) . In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are on different vectors. In some embodiments, the method comprises contacting the γδ T cell with a first recombinant lentivirus comprising a first heterologous nucleic acid, and a second recombinant lentivirus comprising a second heterologous nucleic acid. In some embodiments, the first recombinant lentivirus and the second recombinant lentivirus are contacted with the γδ T cell simultaneously. In some embodiments, the first recombinant lentivirus and the second recombinant lentivirus are contacted with the γδ T cell sequentially. In some embodiments, the method further comprises contacting the γδ T cell with a third recombinant lentivirus comprising a third heterologous nucleic acid, wherein the third heterologous nucleic acid encodes an engineered receptor (e.g., CAR) . In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is different from the recombinant lentivirus encoding the gRNA and / or the recombinant lentivirus encoding the engineered receptor. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is the recombinant lentivirus encoding the gRNA or the recombinant lentivirus encoding the engineered receptor. In some embodiments, the γδ T cell is Vγ9Vδ2 T cell.

[0256] In some embodiments, there is provided a method of delivering two heterologous nucleic acids into a γδ T cell, comprising contacting the γδ T cell with a recombinant lentivirus comprising the heterologous nucleic acids, wherein the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein; wherein the two heterologous nucleic acids encode two heterologous molecules; and wherein the two heterologous molecules are gRNAs, wherein the first gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA, and wherein the second gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in a locus or an RNA encoding one or more other proteins selected from the group consisting of: PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3, optionally wherein the heterologous molecule is a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA. In some embodiments, the first gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the ARIH1 locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24, and the second gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the BCL11B locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33. In some embodiments, the BaEV-Rless glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and / or wherein the BaEV-TR glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the method further comprises contacting the γδ T cell with a Cas component comprising a Cas protein (e.g., Cas9) or a nucleic acid encoding the Cas protein (e.g., Cas9) . In some embodiments, the Cas component is an mRNA encoding the Cas protein. In some embodiments, the Cas protein has endonuclease activity. In some embodiments, the Cas protein is a fusion protein comprising i) a dCas, and ii) an ADA or a CDA, or a functional fragment thereof. In some embodiments, the Cas protein is Cas9. In some embodiments, the mRNA encoding the Cas protein and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA is introduced into the γδ T cell via electroporation, or the nucleic acid encoding the Cas protein and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA is comprised within a recombinant lentivirus pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is different from the recombinant lentivirus encoding the gRNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is the same as the recombinant lentivirus encoding the gRNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus comprises two or more heterologous nucleic acids encoding two or more heterologous molecules. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are on the same vector. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are under the control of a same promoter. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are connected via one or more linking sequences. In some embodiments, the linking sequence is IRES or a nucleic acid encoding a cleavable linker (e.g., 2A peptide, for example P2A, T2A, E2A, or F2A) . In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are on different vectors. In some embodiments, the method comprises contacting the γδ T cell with a first recombinant lentivirus comprising a first heterologous nucleic acid, and a second recombinant lentivirus comprising a second heterologous nucleic acid. In some embodiments, the first recombinant lentivirus and the second recombinant lentivirus are contacted with the γδ T cell simultaneously. In some embodiments, the first recombinant lentivirus and the second recombinant lentivirus are contacted with the γδ T cell sequentially. In some embodiments, the method further comprises contacting the γδ T cell with a third recombinant lentivirus comprising a third heterologous nucleic acid, wherein the third heterologous nucleic acid encodes an engineered receptor (e.g., CAR) . In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is different from the recombinant lentivirus encoding the gRNA and / or the recombinant lentivirus encoding the engineered receptor. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is the recombinant lentivirus encoding the gRNA or the recombinant lentivirus encoding the engineered receptor. In some embodiments, the γδ T cell is Vγ9Vδ2 T cell.

[0257] In some embodiments, there is provided a method of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell (e.g., Vγ9Vδ2 T cell) , comprising contacting the γδ T cell with a recombinant lentivirus comprising the heterologous nucleic acid, wherein the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein; wherein the recombinant lentivirus comprises a first nucleic acid encoding a gRNA, and a second nucleic acid encoding a Cas protein, and wherein the gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA. In some embodiments, the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the ARIH1 locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24. In some embodiments, there is provided a method of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell, comprising contacting the γδ T cell with a recombinant lentivirus comprising the heterologous nucleic acid, wherein the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein; wherein the recombinant lentivirus comprises a first nucleic acid encoding a gRNA, and a second nucleic acid encoding a Cas protein, and wherein the gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in a locus or an RNA encoding one or more other proteins selected from the group consisting of: PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3, optionally wherein the second nucleic acid encodes a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA. In some embodiments, the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the BCL11B locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33. In some embodiments, the method further comprises contacting the γδ T cell with a Cas component comprising a Cas protein (e.g., Cas9) or a nucleic acid (e.g., mRNA) encoding the Cas protein (e.g., Cas9) ; optionally wherein the Cas component (e.g., the Cas protein or an mRNA encoding the Cas protein) and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA is introduced into the γδ T cell via electroporation or via viral transduction. In some embodiments, the recombinant lentivirus further comprises a third nucleic acid encoding an engineered receptor (e.g., CAR) . In some embodiments, the BaEV-Rless glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and / or wherein the BaEV-TR glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

[0258] In some embodiments, there is provided a method of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell (e.g., Vγ9Vδ2 T cell) , comprising contacting the γδ T cell with a recombinant lentivirus comprising the heterologous nucleic acid, wherein the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein; wherein the recombinant lentivirus comprises a first nucleic acid encoding a first gRNA and a second nucleic acid encoding a second gRNA; wherein the first gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA; and wherein the second gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in a locus or an RNA encoding one or more other proteins selected from the group consisting of: PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3, optionally wherein the second nucleic acid encodes a second gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA. In some embodiments, the first gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the ARIH1 locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24, and the second gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the BCL11B locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33. In some embodiments, there is provided a method of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell, comprising contacting the γδ T cell with a recombinant lentivirus comprising the heterologous nucleic acid, wherein the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein; wherein the recombinant lentivirus comprises a first nucleic acid encoding a first gRNA and a second nucleic acid encoding an engineered receptor (e.g., CAR) ; and wherein the first gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA and / or a guide sequence that is complementary to a target site in an BCL11B locus or an BCL11B RNA. In some embodiments, the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA and / or the gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA is introduced into the γδ T cell via electroporation or via viral transduction. In some embodiments, the recombinant lentivirus further comprises a third nucleic acid encoding a Cas protein (e.g., Cas9) . In some embodiments, the method further comprises contacting the γδ T cell with a Cas component comprising a Cas protein (e.g., Cas9) or a nucleic acid (e.g., mRNA) encoding the Cas protein (e.g., Cas9) ; optionally wherein the Cas component (e.g., the Cas protein or an mRNA encoding the Cas protein) is introduced into the γδT cell via electroporation or via viral transduction. In some embodiments, the recombinant lentivirus further comprises a fourth nucleic acid encoding an engineered receptor (e.g., CAR) . In some embodiments, the BaEV-Rless glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and / or wherein the BaEV-TR glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

[0259] In some embodiments, the method further comprises producing the recombinant lentivirus comprising the heterologous nucleic acid (s) , such that the method comprises introducing (i) the heterologous nucleic acid, (ii) a nucleic acid encoding the BaEV-Rless glycoprotein or the BaEV-TR glycoprotein, and (iii) a packaging vector comprising one or more nucleic acids encoding one or more packaging proteins into a producer cell, thereby producing the recombinant lentivirus. In some embodiments, the one or more packaging proteins comprise Gag, Pol, Tat, and Rev. In some embodiments, the BaEV-Rless glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and / or wherein the BaEV-TR glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the heterologous nucleic acid is comprised within a lentiviral transfer vector. In some embodiments, the producer cell is an HEK293T cell. In some embodiments, the modified γδ T cells produced by the method described above is produced into a pharmaceutical composition comprising the modified γδ T cells and a pharmaceutically acceptable excipient, such as any of those described above in Subsection II: “Pharmaceutical compositions” . Heterologous nucleic acids

[0260] In some embodiments, the recombinant virus comprises a heterologous nucleic acid (e.g., a third nucleic acid) that encodes a heterologous molecule (e.g., heterologous protein or RNA) . “Heterologous” nucleic acids or molecules encoded thereof refer to a nucleic acid or a molecule to be introduced to the target cell by the recombinant viruses described herein. The target cell may or may not have an endogenous version of this heterologous nucleic acid or molecule. For example, in some embodiments, the recombinant virus further comprises a nucleic acid (e.g., a third nucleic acid) that encodes a functional or wildtype version of an RNA or protein, which can compensate for the expression and / or function of a corresponding RNA or protein (e.g., mutant protein) in the target cell to be transduced. In some embodiments, the heterologous molecule is a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a target locus. In some embodiments, the heterologous molecule is a Cas protein. In some embodiments, the heterologous molecule is an engineered receptor.

[0261] In some embodiments, the recombinant virus (i.e., recombinant lentivirus) comprises a heterologous nucleic acid (e.g., a third nucleic acid) that encodes a heterologous molecule that is a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA. In some embodiments, the recombinant virus comprises a heterologous molecule encoding a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the ARIH1 locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24. In some embodiments, the heterologous molecule is a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a locus or an RNA encoding one or more other proteins selected from the group consisting of: PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3. In some embodiments, the heterologous molecule is a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an BCL11B locus or an BCL11B RNA. In some embodiments, the recombinant virus comprises a heterologous molecule encoding a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the BCL11B locus is encoded by the nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33.

[0262] In some embodiments, the recombinant virus (e.g., recombinant lentivirus) comprises a heterologous nucleic acid (e.g., a fourth nucleic acid) that encodes a heterologous molecule that is a Cas protein. In some embodiments, a nucleic acid encoding a Cas protein is comprised within a recombinant lentivirus pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein. In some embodiments, the Cas protein has endonuclease activity. In some embodiments, the Cas protein is a fusion protein comprising i) a dCas, and ii) an ADA or a CDA, or a functional fragment thereof. In some embodiments, the Cas protein is Cas9.

[0263] The recombinant virus (e.g., recombinant lentivirus) can comprise one or more heterologous nucleic acids described herein. For example, the recombinant virus can comprise either the heterologous nucleic acid encoding the gRNA or the heterologous nucleic acid encoding the Cas protein; or the recombinant virus can comprise both the heterologous nucleic acid encoding the gRNA and the heterologous nucleic acid encoding the Cas protein. In some embodiments, the recombinant lentivirus encoding the Cas protein is different from the recombinant virus (e.g., recombinant lentivirus) encoding the gRNA. In other embodiments, the recombinant virus (e.g., recombinant lentivirus) encoding the Cas protein is recombinant virus encoding the gRNA. When the recombinant virus (e.g., recombinant lentivirus) encoding the Cas protein is different from the recombinant virus encoding the gRNA, the recombinant viruses themselves may be different. For example, the heterologous nucleic acid encoding the Cas protein may be comprised within a recombinant lentivirus pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein whereas the heterologous nucleic acid encoding the gRNA may be comprised within a recombinant lentivirus pseudotyped with BaEV-TR glycoprotein, or vice versa.

[0264] In some embodiments, the recombinant virus (i.e., recombinant lentivirus) further comprises a heterologous nucleic acid (e.g., a fifth nucleic acid) that encodes a heterologous molecule that is an engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor is a CAR, an engineered TCR, a cTCR, a TAC, or a TAC-like engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor is a CAR comprising: (i) an extracellular antigen binding domain specifically recognizing a target antigen; (ii) a transmembrane domain; and (iii) an intracellular signaling domain. Viral vectors

[0265] In one aspect, the present disclosure provides nucleic acids and vectors for cloning, engineering, or producing any of the recombinant viruses (e.g., recombinant lentivirus) described herein. In some embodiments, the two or more components necessary for producing a recombinant virus herein is on a single vector. In some embodiments, the two or more components (including the viral glycoprotein) necessary for producing a recombinant virus herein is split across two or more vectors, such as transfer vector, packaging vector (s) , and envelope vector (s) , in order to increase the safety and avoid generation of replication-competent recombinant virus, so that viral replication can proceed only when all necessary components are co-transfected into a cell line (e.g., a producer cell) . In some embodiments, the transfer vector is replication incompetent and may contain a deletion in the 3′LTR (e.g., removing the tat gene) , rendering the recombinant virus “self-inactivating” (SIN) after integration.

[0266] In some embodiments, the recombinant lentivirus comprises two or more heterologous nucleic acids encoding two or more heterologous molecules. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are on the same vector. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are under the control of a same promoter. In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are connected via one or more linking sequences. In some embodiments, the linking sequence is IRES or a nucleic acid encoding a cleavable linker. In some embodiments, the cleavable linker is a 2A peptide (e.g., a T2A, P2A, E2A, or F2A peptide) .

[0267] In some embodiments, the two or more heterologous nucleic acids are on different vectors. In some embodiments, the recombinant lentivirus comprises a first nucleic acid encoding a gRNA, and a second nucleic acid encoding a Cas protein, and wherein the gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus further comprises a third nucleic acid encoding a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus further comprises a fourth nucleic acid encoding an engineered receptor (e.g., a chimeric antigen receptor, or “CAR” ) . In some embodiments, the two or more (e.g., three or four) heterologous nucleic acids are connected via one or more linking sequences selected from the group consisting of IRES, T2A peptide, P2A peptide, E2A peptide, and F2A peptide.

[0268] In some embodiments, the recombinant lentivirus comprises a first nucleic acid encoding a gRNA, and a second nucleic acid encoding a Cas protein, and wherein the gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus further comprises a third nucleic acid encoding a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus further comprises a fourth nucleic acid encoding an engineered receptor (e.g., a chimeric antigen receptor, or “CAR” ) . In some embodiments, the two or more (e.g., three or four) heterologous nucleic acids are connected via one or more linking sequences selected from the group consisting of IRES, T2A peptide, P2A peptide, E2A peptide, and F2A peptide.

[0269] In some embodiments, the recombinant lentivirus comprises a first nucleic acid encoding a first gRNA and a second nucleic acid encoding a second gRNA; wherein the first gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA; and wherein the second gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an BCL11B locus or an BCL11B RNA. In some embodiments, the recombinant lentivirus further comprises a third nucleic acid encoding a Cas protein. In some embodiments, the recombinant lentivirus further comprises a fourth nucleic acid encoding an engineered receptor (e.g., a chimeric antigen receptor, or “CAR” ) . In some embodiments, the two or more (e.g., three or four) heterologous nucleic acids are connected via one or more linking sequences selected from the group consisting of IRES, T2A peptide, P2A peptide, E2A peptide, and F2A peptide.

[0270] In some embodiments, the recombinant lentivirus comprises a first nucleic acid encoding a first gRNA and a second nucleic acid encoding an engineered receptor; and wherein the first gRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA and / or a guide sequence that is complementary to a target site in an BCL11B locus or an BCL11B RNA. In some embodiments, the engineered receptor is a CAR. In some embodiments, the recombinant lentivirus further comprises a third nucleic acid encoding a Cas protein. In some embodiments, the two or more (e.g., three or four) heterologous nucleic acids are connected via one or more linking sequences selected from the group consisting of IRES, T2A peptide, P2A peptide, E2A peptide, and F2A peptide.

[0271] Thus, in some embodiments, there is provided a first vector (e.g., envelope vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a promoter (e.g., CMV) ; and (b) a heterologous nucleic acid encoding a viral glycoprotein (e.g., any of the viral glycoproteins described herein, such as SEQ ID NO: 1 or 2; and a second vector (e.g., transfer vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a first promoter; (b) a first heterologous nucleic acid encoding an sgRNA, wherein the sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24) ; (c) a second promoter; and (d) a second heterologous nucleic acid encoding a Cas protein (e.g., Cas9) . In some embodiments, there is provided a first vector (e.g., envelope vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a promoter (e.g., CMV) ; and (b) a heterologous nucleic acid encoding a viral glycoprotein (e.g., any of the viral glycoproteins described herein, such as SEQ ID NO: 1 or 2; and a second vector (e.g., transfer vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a first promoter; (b) a first heterologous nucleic acid encoding a Cas protein (e.g., Cas9) ; (c) a second promoter; and (d) a second heterologous nucleic acid encoding an sgRNA, wherein the sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24) . In some embodiments, there is provided a first vector (e.g., envelope vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a promoter (e.g., CMV) ; (b) a heterologous nucleic acid encoding a viral glycoprotein (e.g., any of the viral glycoproteins described herein, such as SEQ ID NO: 1 or 2; a second vector (e.g., transfer vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a promoter; and (b) a heterologous nucleic acid encoding an sgRNA, wherein the sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24) ; and a third vector (e.g., transfer vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a first promoter (e.g., CMV) ; and (b) a heterologous nucleic acid encoding a Cas protein (e.g., Cas9) . The first promoter can be the same or different from the second promoter, and the promoters of the first vector and / or the second vector and / or the third vector can be the same or different from each other.

[0272] In some embodiments, there is provided a first vector (e.g., envelope vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a promoter (e.g., CMV) ; (b) a heterologous nucleic acid encoding a viral glycoprotein (e.g., any of the viral glycoproteins described herein, such as SEQ ID NO: 1 or 2; a second vector (e.g., transfer vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a first promoter; (b) a first heterologous nucleic acid encoding a first sgRNA, wherein the first sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24) ; (c) a second promoter; and (d) a second heterologous nucleic acid encoding a second sgRNA, wherein the second sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33) ; and a third vector (e.g., transfer vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a first promoter (e.g., CMV) ; and (b) a heterologous nucleic acid encoding a Cas protein (e.g., Cas9) . In some embodiments, there is provided a first vector (e.g., envelope vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a promoter (e.g., CMV) ; (b) a heterologous nucleic acid encoding a viral glycoprotein (e.g., any of the viral glycoproteins described herein, such as SEQ ID NO: 1 or 2; a second vector (e.g., transfer vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a first promoter; (b) a first heterologous nucleic acid encoding a first sgRNA, wherein the first sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33) ; (c) a second promoter; and (d) a second heterologous nucleic acid encoding a second sgRNA, wherein the second sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24) ; and a third vector (e.g., transfer vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a first promoter (e.g., CMV) ; and (b) a heterologous nucleic acid encoding a Cas protein (e.g., Cas9) . The first promoter can be the same or different from the second promoter, and the promoters of the first vector and / or the second vector and / or the third vector can be the same or different from each other.

[0273] In some embodiments, there is provided a first vector (e.g., envelope vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a promoter (e.g., CMV) ; (b) a heterologous nucleic acid encoding a viral glycoprotein (e.g., any of the viral glycoproteins described herein, such as SEQ ID NO: 1 or 2; and a second vector (e.g., transfer vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a first promoter; (b) a first heterologous nucleic acid encoding a first sgRNA, wherein the first sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24) ; (c) a second promoter; (d) a second heterologous nucleic acid encoding a second sgRNA, wherein the second sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33) ; (e) a third promoter; and (f) a third heterologous nucleic acid encoding a Cas protein (e.g., Cas9) . In some embodiments, there is provided a first vector (e.g., envelope vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a promoter (e.g., CMV) ; (b) a heterologous nucleic acid encoding a viral glycoprotein (e.g., any of the viral glycoproteins described herein, such as SEQ ID NO: 1 or 2; and a second vector (e.g., transfer vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a first promoter; (b) a first heterologous nucleic acid encoding a first sgRNA, wherein the first sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33) ; (c) a second promoter; (d) a second heterologous nucleic acid encoding a second sgRNA, wherein the second sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24) ; (e) a third promoter; and (f) a third heterologous nucleic acid encoding a Cas protein (e.g., Cas9) . In some embodiments, there is provided a first vector (e.g., envelope vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a promoter (e.g., CMV) ; (b) a heterologous nucleic acid encoding a viral glycoprotein (e.g., any of the viral glycoproteins described herein, such as SEQ ID NO: 1 or 2; and a second vector (e.g., transfer vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a first promoter; (b) a first heterologous nucleic acid encoding a first sgRNA, wherein the first sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24) ; (c) a second promoter; (d) a second heterologous nucleic acid encoding a Cas protein (e.g., Cas9) ; (e) a third promoter; and (f) a third heterologous nucleic acid encoding a second sgRNA, wherein the second sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33) . In some embodiments, there is provided a first vector (e.g., envelope vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a promoter (e.g., CMV) ; (b) a heterologous nucleic acid encoding a viral glycoprotein (e.g., any of the viral glycoproteins described herein, such as SEQ ID NO: 1 or 2; and a second vector (e.g., transfer vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a first promoter; (b) a first heterologous nucleic acid encoding a first sgRNA, wherein the first sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33) ; (c) a second promoter; (d) a second heterologous nucleic acid encoding a Cas protein (e.g., Cas9) ; (e) a third promoter; and (f) a third heterologous nucleic acid encoding a second sgRNA, wherein the second sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24) . In some embodiments, there is provided a first vector (e.g., envelope vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a promoter (e.g., CMV) ; (b) a heterologous nucleic acid encoding a viral glycoprotein (e.g., any of the viral glycoproteins described herein, such as SEQ ID NO: 1 or 2; and a second vector (e.g., transfer vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a first promoter; (b) a first heterologous nucleic acid encoding a Cas protein (e.g., Cas9) ; (c) a second promoter; (d) a second heterologous nucleic acid encoding a first sgRNA, wherein the first sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24) ; (e) a third promoter; and (f) a third heterologous nucleic acid encoding a second sgRNA, wherein the second sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33) . In some embodiments, there is provided a first vector (e.g., envelope vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a promoter (e.g., CMV) ; (b) a heterologous nucleic acid encoding a viral glycoprotein (e.g., any of the viral glycoproteins described herein, such as SEQ ID NO: 1 or 2; and a second vector (e.g., transfer vector) comprising, from 5′to 3′: (a) a first promoter; (b) a first heterologous nucleic acid encoding a Cas protein (e.g., Cas9) ; (c) a second promoter; (d) a second heterologous nucleic acid encoding a first sgRNA, wherein the first sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 15 and 25-33) ; (e) a third promoter; and (f) a third heterologous nucleic acid encoding a second sgRNA, wherein the second sgRNA comprises a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA (e.g., a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA encoded by any of SEQ ID NOs: 14 and 19-24) . The first promoter can be the same or different from the second and / or third promoter; the second promoter be the same or different from the third promoter; and the promoters of the first vector and / or the second vector can be the same or different from each other.(i) Envelope vector (s)

[0274] The envelope vector may encode a viral glycoprotein, such as any of the viral glycoproteins described herein (e.g., BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein) . The envelope vector may comprise a first nucleic acid encoding a viral glycoprotein or variant thereof (e.g., BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein) . The envelope vector may further comprise a second nucleic acid encoding an envelope surface-bound targeting molecule that specifically recognizes a cell surface protein on a target cell. In some embodiments, the first and second nucleic acids are under control of a single promoter, and the first and second nucleic acids are connected via a linking nucleic acid sequence, such as IRES, or a linking nucleic acid encoding a cleavable linker (e.g., 2A peptide, such as P2A, T2A, E2A, or F2A) . In some embodiments, the first and second nucleic acids are under control of different promoters. In some embodiments, the first and second nucleic acids are on separate envelope vectors.

[0275] In some embodiments, the BaEV-Rless glycoprotein comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence comprising at least about 90%amino acid sequence homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

[0276] In some embodiments, the BaEV-TR glycoprotein comprises an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence comprising at least about 90%amino acid sequence homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.(ii) Packaging vector (s)

[0277] Packaging vector (s) can encode one or more packaging proteins to produce any of the recombinant viruses described herein. In some embodiments, at least one packaging vector is used to produce the recombinant virus. The single packaging vector may contain nucleic acid encoding packaging proteins Gag, Pol, Rev, and Tat. In some embodiments, the packaging vector comprises a gag gene, a pol gene, a tat gene, and a rev gene. In some embodiments, two or more packaging vectors are used to produce Gag, Pol, and Rev. For example, one packaging vector comprises gag and pol genes, and another packaging vector comprises rev. In some embodiments, the gag gene, pol gene, and Rev response element (RRE, an RNA structural element to which Rev binds) are on one vector, and the rev gene is on another vector. One or more nucleic acids encoding the packaging proteins can be under the control of a single promoter (e.g., packaging genes on a same vector) or different promoters (e.g., packaging genes on a same vector or different vectors) . If one or more nucleic acids encoding the packaging proteins are on the same vector and under control of a single promoter, the one or more nucleic acids encoding the packaging proteins may be connected via a linking nucleic acid sequence, such as IRES, or a linking nucleic acid encoding a cleavable linker (e.g., 2A peptide, such as P2A, T2A, E2A, or F2A) .(iii) Transfer vector

[0278] The transfer vector comprises the heterologous nucleic acid to be delivered and integrated into the genome of the transduced target cell (e.g., T cell, such as γδ T cell) . The transfer ve...

Claims

1.A modified immune cell, wherein the modified immune cell has no or reduced expression and / or function of an ARIH1 protein.2.The modified immune cell of claim 1, wherein the modified immune cell is genetically modified at the ARIH1 locus by gene editing, or genetically modified at ARIH1 RNA by RNA editing.3.The modified immune cell of claim 1 or 2, wherein the modified immune cell has or is further modified to have no or reduced expression and / or function of one or more other proteins selected from the group consisting of: PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3.4.The modified immune cell of claim 3, wherein the other protein is a BCL11B protein.5.The modified immune cell of claim 4, wherein the modified immune cell is genetically modified at the BCL11B locus by gene editing, or genetically modified at BCL11B RNA by RNA editing.6.The modified immune cell of any one of claims 2-5, wherein the gene editing comprises gene knockout (KO) .7.The modified immune cell of any one of claims 1-6, wherein the modified immune cell further expresses an engineered receptor.8.The modified immune cell of claim 7, wherein the engineered receptor is a CAR comprising:(i) an extracellular antigen binding domain specifically recognizing a target antigen;(ii) a transmembrane domain; and(iii) an intracellular signaling domain.9.The modified immune cell of any one of claims 1-8, wherein the modified immune cell is selected from the group consisting of a monocyte, a dendritic cell, a macrophage, a B cell, a T cell, a natural killer (NK) cell, or a combination thereof.10.The modified immune cell of claim 9, wherein the modified immune cell is a T cell.11.The modified immune cell of claim 10, wherein the T cell is a γδ T cell.12.The modified immune cell of claim 11, wherein the γδ T cell is Vγ9Vδ2 T cell.13.The modified immune cell of any one of claims 1-12, wherein compared to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein, the modified immune cell:(i) has at least about 10%reduced expression and / or function of one or more of: IL13, IL5, IL17RB, TNFSF11, TNFSF10, TNFRSF11A, BATF3, CCR4, CCR8, IKZF3, CSF1, WNT5B, CD86, S1PR1, SELL, IL7R, CCR3, and ZBTB32;(ii) has at least about 10%higher expression and / or function of one or more of: NCAM1 (CD56) , KIT, CD3D, IL2RB, FCGR3A (CD16) , BACH2, NCR1 (NKp46) , NCR2 (NKp44) , NCR3 (NKp30) , KLRK1 (NKG2D) , CD244 (2B4) , KLRD1, KLRG1, CD27, GZMB, CSF2, SPRY2, PTPN6, CD300A, IL18RAP, TBX21, and CCL3;(iii) has at least about 10%higher degranulation;(iv) has at least about 10%higher cytotoxicity; and / or(v) has at least about 10%higher persistence.14.The modified immune cell of any one of claims 1-13, wherein the modified immune cell is allogeneic.15.A method of: (i) producing a modified immune cell; (ii) enhancing degranulation, cytotoxicity, antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) mediated by an ADCC-inducing agent, and / or persistence of a modified immune cell; or (iii) reprogramming a precursor cell into a modified immune cell, wherein the modified immune cell has an NK-like characteristic; comprising modifying a precursor cell to reduce or eliminate expression and / or function of an ARIH1 protein.16.The method of claim 15, wherein compared to a reference immune cell not having the modification to reduce or eliminate expression and / or function of the ARIH1 protein, the NK-like characteristic comprises at least about 10%higher expression and / or function of one or more of:NCAM1 (CD56) , KIT, CD3D, IL2RB, FCGR3A (CD16) , BACH2, NCR1 (NKp46) , NCR2 (NKp44) , NCR3 (NKp30) , KLRK1 (NKG2D) , CD244 (2B4) , KLRD1, KLRG1, CD27, GZMB, CSF2, SPRY2, PTPN6, CD300A, IL18RAP, TBX21 and CCL3.17.The method of claim 15 or 16, wherein the modifying comprises genetically modifying at the ARIH1 locus by gene editing, or genetically modifying at ARIH1 RNA by RNA editing.18.The method of claim 17, wherein the gene editing or RNA editing is mediated by CRISPR / Cas.19.The method of claim 18, wherein the gene editing or RNA editing comprises contacting the precursor cell with i) a first guide RNA (gRNA) construct, wherein the first gRNA construct comprises or encodes a first gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the ARIH1 locus or ARIH1 RNA; and optionally ii) a first Cas component comprising a first Cas protein or a nucleic acid encoding the first Cas protein, under a condition that allows introduction of the first gRNA construct and the optional first Cas component into the precursor cell.20.The method of any one of claims 15-19, wherein the method further comprises modifying the modified immune cell or the precursor cell to reduce or eliminate expression and / or function of one or more other proteins selected from the group consisting of: PRDM1, RAPGEF1, CELF2, ITGB2, FAS, NEDD9, PTK2B, CRKL, STAP1, FERMT3, BTLA, TLN1, FOXP3, TNFRSF1A, AP3D1, AP3B1, AP2B1, SH3GL1, LAPTM5, DNM2, VPS41, AP2M1, TMEM30A, CCDC53, BCL11B, CISH, CUL3, RASA2, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, B2M, PD-1, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, and SPPL3.21.The method of claim 20, wherein the other protein is a BCL11B protein.22.The method of claim 21, wherein the modifying comprises genetically modifying at the BCL11B locus by gene editing, or genetically modifying at BCL11B RNA by RNA editing.23.The method of claim 22, wherein the gene editing or RNA editing is mediated by CRISPR / Cas.24.The method of claim 23, wherein the gene editing or RNA editing comprises contacting the modified immune cell or the precursor cell with i) a second gRNA construct, wherein the second gRNA construct comprises or encodes a second gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in the BCL11B locus or BCL11B RNA ; and optionally ii) a second Cas component comprising a second Cas protein or a nucleic acid encoding the second Cas protein, under a condition that allows introduction of the second gRNA construct and the optional second Cas component into the modified immune cell or the precursor cell.25.The method of any one of claims 19-24, wherein the method comprises contacting the first gRNA construct and / or the second gRNA construct with the precursor cell via viral transfection.26.The method of claim 25, wherein the viral transfection is by a recombinant lentivirus.27.The method of claim 26, wherein the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein.28.The method of any one of claims 15-27,(i) wherein the modified immune cell or the precursor cell expresses an engineered receptor; or(ii) wherein the method further comprises introducing into the modified immune cell or the precursor cell a nucleic acid encoding an engineered receptor.29.The method of any one of claims 15-28, wherein the modified immune cell is a T cell.30.The method of claim 29, wherein the T cell is a γδ T cell.31.The method of claim 30, wherein the γδ T cell is Vγ9Vδ2 T cell.32.A modified immune cell produced by the method of any one of claims 15-31.33.A pharmaceutical composition comprising the modified immune cell of any one of claims 1-14 and 32, and optionally a pharmaceutically acceptable excipient.34.A method of treating a disease or condition in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 33.35.A method of treating a disease or condition in an individual, comprising modifying an immune cell of the individual using the method of any one of claims 15-31.36.A method of delivering a heterologous nucleic acid into a γδ T cell, comprising contacting the γδ T cell with a recombinant lentivirus comprising the heterologous nucleic acid, wherein the recombinant lentivirus is pseudotyped with BaEV-Rless glycoprotein or BaEV-TR glycoprotein.37.The method of claim 36, wherein the BaEV-Rless glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and / or wherein the BaEV-TR glycoprotein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.38.The method of claim 36 or 37, wherein the heterologous nucleic acid encodes (i) a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in an ARIH1 locus or an ARIH1 RNA, and / or (ii) a gRNA comprising a guide sequence that is complementary to a target site in a BCL11B locus or a BCL11B RNA.39.The method of claim 38, wherein the method further comprises contacting the γδ T cell with a Cas component comprising a Cas protein or a nucleic acid encoding the Cas protein.40.A pharmaceutical composition comprising the modified γδ T cell produced by the method of any one of claims 36-39, and optionally a pharmaceutically acceptable excipient.41.A method of treating a disease or condition in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 40.42.A method of treating a disease or condition in an individual, comprising modifying a γδ T cell of the individual using the method of any one of claims 36-39.43.The method of claim 41 or 42, wherein the disease or condition is a cancer, an infectious disease, an inflammatory disease, an immune-related disease characterized by effector cell exhaustion, or an autoimmune disease.44.The method of any one of claims 41-43, wherein the disease or condition is associated with the expression of a target antigen, and wherein the modified γδ cell expresses an engineered receptor specifically recognizing the target antigen.45.The method of claim 44, wherein the engineered receptor is a CAR.46.The method of any one of claims 41-45, wherein the disease or condition is a cancer.47.The method of claim 46, wherein the cancer is selected from the group consisting of:acute myeloid leukemia (AML) , chronic myelogenous leukemia (CML) , ovarian cancer, multiple myeloma (MM) , non-Hodgkin’s lymphoma (NHL) , Hodgkin’s lymphoma, acute lymphoblastic leukemia (ALL) , gastric cancer, hepatocellular carcinoma (HCC) , small cell lung cancer (SCLC) , non-small cell lung cancer (NSCLC) , glioblastoma, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, and neuroblastoma.48.The method of any one of claims 41-47, further comprising administering to the individual an effective amount of an ADCC-inducing agent.49.The method of claim 48, wherein the ADCC-inducing agent is an antibody, an antigen-binding fragment comprising an Fc domain, or an Fc-fusion protein.50.The method of claim 49, wherein:(i) the ADCC-inducing agent is an anti-HER2 antibody, and wherein the disease or condition is ovarian cancer; or(ii) the ADCC-inducing agent is an anti-CD20 antibody, and wherein the disease or condition is Burkitt’s lymphoma.51.A method of treating a glioblastoma in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 40.52.The method of claim 51, wherein the glioblastoma is relapsed glioblastoma.53.The method of claim 51 or 52, wherein the method comprises administering to the individual at least one dose of an effective amount of the pharmaceutical composition.54.The method of claim 53, wherein the method comprises administering to the individual two or more doses of the effective amount of the pharmaceutical composition.55.The method of claim 54, wherein the two or more doses are each separated by about 7 or more days.56.The method of any one of claims 53-55, wherein each dose of the effective amount of the pharmaceutical composition comprises about 1×107 to about 1×109 modified γδ T cells.57.The method of any one of claims 53-56, wherein the pharmaceutical composition is administered intraventricularly.58.The method of claim 57, wherein the method further comprises performing an Ommaya reservoir placement surgery before the administration of the first dose of the effective amount of the pharmaceutical composition.59.The method of any one of claims 53-58, wherein the method further comprises performing a partial or maximal safe resection of the glioblastoma before the administration of the pharmaceutical composition.60.The method of any one of claims 53-59, wherein the modified γδ T cells of the pharmaceutical composition have no or reduced expression and / or function of both ARIH1 protein and BCL11B protein.61.The method of claim 60, wherein the modified γδ T cells are modified Vγ9Vδ2 T cells.62.The method of any one of claims 51-61, further comprising selecting an individual with relapsed glioblastoma for the treatment.63.The method of any one of claims 41-62, wherein the individual is a human.

Images