Single domain DLL3 antibodies and uses thereof

Abstract

Provided relates to single domain anti-DLL3 antibodies and polypeptides that include the antibodies, such as bispecific antibodies and chimeric antigen receptors. The antibodies have excellent binding affinity and are effective in inducing antibody-mediated cell internalization.

Description

SINGLE DOMAIN DLL3 ANTIBODIES AND USES THEREOFBACKGROUND

[0001] Delta-like ligand 3 (DLL3) is a protein that belongs to the Delta / Serrate / LAG-2 (DSL) family of ligands, which interact with Notch receptors to activate the Notch signaling pathway. This pathway is crucial for cell differentiation, proliferation, and apoptosis, playing a significant role in the development and maintenance of various tissues. Unlike other Notch ligands, DLL3 is unique in its expression pattern and function. It is primarily found in the intracellular compartment rather than on the cell surface, and it acts as a negative regulator of Notch signaling in many contexts.

[0002] DLL3’s role in tumor development has been well studied in neuroendocrine tumors, particularly in small cell lung cancer (SCLC) , where it is overexpressed in a high percentage of tumors but has limited expression in normal adult tissues. This overexpression has been associated with the promotion of tumor growth and progression, making DLL3 an attractive target for cancer therapy. The mechanism by which DLL3 contributes to tumorigenesis is thought to be related to its ability to suppress Notch signaling, a pathway that, depending on the context, can either promote or inhibit tumor growth. In the case of SCLC and other neuroendocrine tumors, inhibition of Notch signaling by DLL3 contributes to the proliferation and survival of cancer cells.

[0003] The distinct expression pattern of DLL3 in SCLC and other neuroendocrine tumors has enabled the development of therapeutics that use DLL3 to specifically target these tumor types. Currently, multiple active clinical studies in SCLC and other neuroendocrine tumors are evaluating these DLL3-specific drugs. Several types of modalities targeting DLL3, including bispecific Ab (BsAb) , chimeric antigen receptor T cell therapy (CAR-T) and antibody drug conjugation (ADC) are currently under clinical investigation.SUMMARY

[0004] This disclosure provides single domain anti-DLL3 antibodies and polypeptides that include the antibodies, such as bispecific antibodies and chimeric antigen receptors. The newly disclosed antibodies have excellent binding affinity and are effective in inducing antibody-mediated cell internalization.

[0005] Accordingly, one embodiment of the present disclosure provides a single domain antibody or a polypeptide comprising the single domain antibody, wherein the single domain antibody has binding specificity to the human Delta-like ligand 3 (DLL3) protein and comprises a complementarity determining region 1 (CDR1) , a CDR2 and a CDR3, wherein the CDR1, CDR2 and CDR3 comprise, respectively, (a) the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, 9, and 10; (b) the amino acid sequences of SEQ ID NO: 11, 12, and 13; (c) the amino acid sequences of SEQ ID NO: 14, 15, and 16; (d) the amino acid sequences of SEQ ID NO: 17, 18, and 19; (e) the amino acid sequences of SEQ ID NO: 20, 21 and 22; (f) the amino acid sequences of SEQ ID NO: 23, 24 and 25; or (g) the amino acid sequences of SEQ ID NO: 26, 27, and 28.

[0006] In some embodiments, the CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, the CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and the CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the single domain antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

[0007] In some embodiments, the CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, the CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and the CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13. In some embodiments, the single domain antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

[0008] In some embodiments, the CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, the CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and the CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. In some embodiments, the single domain antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

[0009] In some embodiments, the CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, the CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 and the CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the single domain antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

[0010] In some embodiments, the CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, the CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and the CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In some embodiments, the single domain antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.

[0011] In some embodiments, the CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, the CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 and the CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the single domain antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.

[0012] In some embodiments, the CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, the CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and the CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28. In some embodiments, the single domain antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.

[0013] In some embodiments, the polypeptide is a chimeric antigen receptor (CAR) or a bispecific antibody having a binding specificity to an antigen different from DLL3.

[0014] Also provided are polynucleotides encoding the antibodies or polypeptides, cells comprising the polynucleotides, and antibody-drug conjugates (ADC) comprising the antibodies or polypeptides.

[0015] Methods and uses for treating cancer are also provided. In some embodiments, the cancer is selected from the group consisting of ovarian cancer, prostate cancer, cancer of the urinary tract, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, bladder cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, head and neck cancer, kidney cancer, leukemia, liver cancer, lymphoma, melanoma, and thyroid cancer. In some embodiments, the cancer is small cell lung cancer (SCLC) .BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0016] FIG. 1 presents ELISA binding results which show that the antibodies had high affinity to the human and cynomolgus DLL3 proteins.

[0017] FIG. 2 shows that the tested antibodies had high affinity to DLL3-overexpressing cell (HEK293) and DLL-3 endogenous-expressing tumor cells (SHP-77 and DMS53) ..

[0018] FIG. 3A illustrates the domains in the extracellular portion of the DLL3 protein.

[0019] FIG. 3B shows the binding between the antibodies and various fragments of the DLL3 protein.

[0020] FIG. 4 shows that the tested antibodies effectively induced cellular internalization.DETAILED DESCRIPTIONDefinitions

[0021] It is to be noted that the term “a” or “an” entity refers to one or more of that entity; for example, “an antibody, ” is understood to represent one or more antibodies. As such, the terms “a” (or “an” ) , “one or more, ” and “at least one” can be used interchangeably herein.

[0022] As used herein, an “antibody” or “antigen-binding moiety” refers to a polypeptide or a polypeptide complex that specifically recognizes and binds to an antigen. An antibody can be a whole antibody and any antigen binding fragment or a single chain thereof. Thus the term “antibody” includes any protein or peptide containing molecule that comprises at least a portion of an immunoglobulin molecule having biological activity of binding to the antigen. Examples of such include, but are not limited to a complementarity determining region (CDR) of a heavy or light chain or a ligand binding portion thereof, a heavy chain or light chain variable region, a heavy chain or light chain constant region, a framework (FR) region, or any portion thereof, or at least one portion of a binding protein.

[0023] A full-length antibody comprises two heavy chains and two light chains. The variable regions of the light and heavy chains are responsible for antigen binding. The variable domains of the heavy chain and light chain may be referred to as “VH” and “VL” , respectively. The variable regions in both chains generally contain three highly variable loops called the complementarity determining regions (CDRs) (light chain (LC) CDRs including LC-CDR1, LC-CDR2, and LC-CDR3, heavy chain (HC) CDRs including HC-CDR1, HC-CDR2, and HC-CDR3) . CDR boundaries for the antibodies and antigen-binding fragments disclosed herein may be defined or identified by the conventions of Kabat, Chothia, or Al-Lazikani (Al-Lazikani 1997; Chothia 1985; Chothia 1987; Chothia 1989; Kabat 1987; Kabat 1991) . The three CDRs of the heavy or light chains are interposed between flanking stretches known as framework regions (FRs) , which are more highly conserved than the CDRs and form a scaffold to support the hypervariable loops. The constant regions of the heavy and light chains are not involved in antigen binding, but exhibit various effector functions. Antibodies are assigned to classes based on the amino acid sequence of the constant region of their heavy chain. The five major classes or isotypes of antibodies are IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, which are characterized by the presence of α, δ, ε, γ, and μ heavy chains, respectively. Several of the major antibody classes are divided into subclasses such as lgG1 (γ1 heavy chain) , lgG2 (γ2 heavy chain) , lgG3 (γ3 heavy chain) , lgG4 (γ4 heavy chain) , lgA1 (α1 heavy chain) , or lgA2 (α2 heavy chain) .

[0024] The expression “single domain antibodies” (sdAbs) or “single variable domain (SVD) antibodies” generally refers to antibodies in which a single variable domain (VH or VL) can confer antigen binding. In other words, the single variable domain does not need to interact with another variable domain in order to recognize the target antigen. Examples of single domain antibodies include those derived from camelids (lamas and camels) and cartilaginous fish (e.g., nurse sharks) and those derived from recombinant methods from humans and mouse antibodies (Nature (1989) 341: 544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30: 43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26: 230-235; Trends Biotechnol (2003) : 21: 484-490; WO 2005 / 035572; WO 03 / 035694; Febs Lett (1994) 339: 285-290; WO00 / 29004; WO 02 / 051870) . When the sdAb contains only a heavy chain, it can be exchangeably used with “VHH” or “single heavy chain variable domain antibody” or “nanobody” .

[0025] Both the light (if any) and heavy chains are divided into regions of structural and functional homology. The terms “constant” and “variable” are used functionally. In this regard, it will be appreciated that the variable domains of both the light (VK) and heavy (VH) chain portions determine antigen recognition and specificity. Conversely, the constant domains of the light chain (CK) and the heavy chain (CH1, CH2 or CH3) confer important biological properties such as secretion, transplacental mobility, Fc receptor binding, complement binding, and the like. By convention the numbering of the constant region domains increases as they become more distal from the antigen-binding site or amino-terminus of the antibody. The N-terminal portion is a variable region and at the C-terminal portion is a constant region; the CH3 and CK domains actually comprise the carboxy-terminus of the heavy and light chain, respectively.

[0026] As indicated above, the variable region allows the antibody to selectively recognize and specifically bind epitopes on antigens. That is, the VK domain and VH domain, or subset of the complementarity determining regions (CDRs) , of an antibody combine to form the variable region that defines a three-dimensional antigen-binding site. This quaternary antibody structure forms the antigen-binding site present at the end of each arm of the Y. More specifically, the antigen-binding site is defined by three CDRs on each of the VH and VK chains (i.e. CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3) . In some instances, e.g., certain immunoglobulin molecules derived from camelid species or engineered based on camelid immunoglobulins, a complete immunoglobulin molecule may consist of heavy chains only, with no light chains. See, e.g., Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993) .

[0027] The term “complementarity determining region” ( “CDR” ) is used to describe the non-contiguous antigen combining sites found within the variable region of both heavy and light chain polypeptides. This particular region has been described by Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) and by Chothia et al., J. MoI. Biol. 196: 901-917 (1987) , which are incorporated herein by reference in their entireties. The CDR definitions according to Kabat and Chothia include overlapping or subsets of amino acid residues when compared against each other. Nevertheless, application of either definition to refer to a CDR of an antibody or variants thereof is intended to be within the scope of the term as defined and used herein. The appropriate amino acid residues which encompass the CDRs as defined by each of the above cited references are set forth in the table below as a comparison. The exact residue numbers which encompass a particular CDR will vary depending on the sequence and size of the CDR. Those skilled in the art can routinely determine which residues comprise a particular CDR given the variable region amino acid sequence of the antibody.

[0028] Kabat et al. also defined a numbering system for variable domain sequences that is applicable to any antibody. One of ordinary skill in the art can unambiguously assign this system of “Kabat numbering” to any variable domain sequence, without reliance on any experimental data beyond the sequence itself. As used herein, “Kabat numbering” refers to the numbering system set forth by Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983) .

[0029] A single domain antibody can be fused to other protein fragments such as a Fc region. The term “Fc region” , “Fc domain” or “fragment crystallizable region” herein is used to define a C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain, including native-sequence Fc regions and variant Fc regions. Although the boundaries of the Fc region of an immunoglobulin heavy chain might vary, the human IgG heavy-chain Fc region is usually defined to stretch from an amino acid residue at position Cys226, or from Pro230, to the carboxyl-terminus thereof. The C-terminal lysine (residue 447 according to the EU numbering system) of the Fc region may be removed, for example, during production or purification of the antibody, or by recombinantly engineering the nucleic acid encoding a heavy chain of the antibody. Accordingly, a composition of intact antibodies may comprise antibody populations with all K447 residues removed, antibody populations with no K447 residues removed, and antibody populations having a mixture of antibodies with and without the K447 residue. Suitable native-sequence Fc regions for use in the antibodies described herein include human IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B) , IgG3 and IgG4.

[0030] The term “epitope” as used herein refers to the specific group of atoms or amino acids on an antigen to which an antibody or antibody moiety binds. Two antibodies or antibody moieties may bind the same epitope within an antigen if they exhibit competitive binding for the antigen.

[0031] By “specifically binds” or “has specificity to, ” it is generally meant that an antibody binds to an epitope via its antigen-binding domain, and that the binding entails some complementarity between the antigen-binding domain and the epitope. According to this definition, an antibody is said to “specifically bind” to an epitope when it binds to that epitope, via its antigen-binding domain more readily than it would bind to a random, unrelated epitope. The term “specificity” is used herein to qualify the relative affinity by which a certain antibody binds to a certain epitope. For example, antibody “A” may be deemed to have a higher specificity for a given epitope than antibody “B, ” or antibody “A” may be said to bind to epitope “C” with a higher specificity than it has for related epitope “D. ”

[0032] As used herein, the terms “treat” or “treatment” refer to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures, wherein the object is to prevent or slow down (lessen) an undesired physiological change or disorder, such as the progression of cancer. Beneficial or desired clinical results include, but are not limited to, alleviation of symptoms, diminishment of extent of disease, stabilized (i.e., not worsening) state of disease, delay or slowing of disease progression, amelioration or palliation of the disease state, and remission (whether partial or total) , whether detectable or undetectable. “Treatment” can also mean prolonging survival as compared to expected survival if not receiving treatment. Those in need of treatment include those already with the condition or disorder as well as those prone to have the condition or disorder or those in which the condition or disorder is to be prevented.

[0033] By “subject” or “individual” or “animal” or “patient” or “mammal, ” is meant any subject, particularly a mammalian subject, for whom diagnosis, prognosis, or therapy is desired. Mammalian subjects include humans, domestic animals, farm animals, and zoo, sport, or pet animals such as dogs, cats, guinea pigs, rabbits, rats, mice, horses, cattle, cows, and so on.

[0034] As used herein, phrases such as “to a patient in need of treatment” or “asubject in need of treatment” includes subjects, such as mammalian subjects, that would benefit from administration of an antibody or composition of the present disclosure used, e.g., for detection, for a diagnostic procedure and / or for treatment. Anti-DLL3 Antibodies

[0035] As demonstrated in the appended experimental examples, the instant inventors were able to generate anti-DLL3 single domain antibodies C4650HJ260-11, C4650HJ260-13, C491BHJ270-1, C491BHJ270-3, C491BHJ270-14, C1764IB240-4 and C1764IB240-8 (Table 1) all of which have high binding affinity to the human DLL3 protein. Domain mapping showed that some of these antibodies bound to the N-terminus of the DLL3 protein, and some bound to the EGF3 domain (Table 4) . In addition, these antibodies induced efficient cellular internalization upon binding to the DLL3 protein expressed on the cells and thus are suitable for preparing antibody-drug conjugates.

[0036] Accordingly, one embodiment of the present disclosure provides a single domain antibody having specificity to the DLL3 protein, or a polypeptide that includes the single domain antibody. In some embodiments, the single domain antibody includes a CDR1, a CDR2 and a CDR3.

[0037] In one embodiment, with reference to antibody C4650HJ260-11, the CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, the CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and the CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.

[0038] In one embodiment, the single domain antibody includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or a peptide having at least 70%, or 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to SEQ ID NO: 1, while retaining the recited CDR sequences unchanged. In one embodiment, the single domain antibody includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Also provided, in one embodiment, is an anti-DLL3 antibody that competes in binding to DLL3 with SEQ ID NO: 1.

[0039] In one embodiment, with reference to antibody C4650HJ260-13, the CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, the CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and the CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.

[0040] In one embodiment, the single domain antibody includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a peptide having at least 70%, or 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to SEQ ID NO: 2, while retaining the recited CDR sequences unchanged. In one embodiment, the single domain antibody includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Also provided, in one embodiment, is an anti-DLL3 antibody that competes in binding to DLL3 with SEQ ID NO: 2.

[0041] In one embodiment, with reference to antibody C491BHJ270-1, the CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, the CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and the CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.

[0042] In one embodiment, the single domain antibody includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or a peptide having at least 70%, or 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to SEQ ID NO: 3, while retaining the recited CDR sequences unchanged. In one embodiment, the single domain antibody includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. Also provided, in one embodiment, is an anti-DLL3 antibody that competes in binding to DLL3 with SEQ ID NO: 3.

[0043] In one embodiment, with reference to antibody C491BHJ270-3, the CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, the CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 and the CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19.

[0044] In one embodiment, the single domain antibody includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or a peptide having at least 70%, or 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to SEQ ID NO: 4, while retaining the recited CDR sequences unchanged. In one embodiment, the single domain antibody includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Also provided, in one embodiment, is an anti-DLL3 antibody that competes in binding to DLL3 with SEQ ID NO: 4.

[0045] In one embodiment, with reference to antibody C491BHJ270-14, the CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, the CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and the CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.

[0046] In one embodiment, the single domain antibody includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, or a peptide having at least 70%, or 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to SEQ ID NO: 5, while retaining the recited CDR sequences unchanged. In one embodiment, the single domain antibody includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. Also provided, in one embodiment, is an anti-DLL3 antibody that competes in binding to DLL3 with SEQ ID NO: 5.

[0047] In one embodiment, with reference to antibody C1764IB240-4, the CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, the CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 and the CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.

[0048] In one embodiment, the single domain antibody includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or a peptide having at least 70%, or 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to SEQ ID NO: 6, while retaining the recited CDR sequences unchanged. In one embodiment, the single domain antibody includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. Also provided, in one embodiment, is an anti-DLL3 antibody that competes in binding to DLL3 with SEQ ID NO: 6.

[0049] In one embodiment, with reference to antibody C1764IB240-8, the CDR1 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, the CDR2 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and the CDR3 includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.

[0050] In one embodiment, the single domain antibody includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or a peptide having at least 70%, or 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to SEQ ID NO: 7, while retaining the recited CDR sequences unchanged. In one embodiment, the single domain antibody includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. Also provided, in one embodiment, is an anti-DLL3 antibody that competes in binding to DLL3 with SEQ ID NO: 7.

[0051] Also provided, in some embodiments, are antibodies that include CDR sequences derived from the presently disclosed CDR sequences, with one, two or three amino acid substitutions, deletions, and / or additions. Multi-functional Molecules

[0052] Multi-functional molecules that include an antibody or antigen-binding fragment specific to DLL3, such as those disclosed herein, and one or more antibody or antigen-binding fragment having specificity to a second antigen, or a different epitope on DLL3.

[0053] In some embodiments, the second antigen is a protein expressed on an immune cell, such as a T cell, a B cell, a monocyte, a macrophage, a neutrophil, a dendritic cell, a phagocyte, a natural killer cell, an eosinophil, a basophil, and a mast cell.

[0054] In some embodiments, the second antigen is CD3, CD47, PD1, PD-L1, LAG3, TIM3, CTLA4, VISTA, CSFR1, A2AR, CD73, CD39, CD40, CEA, HER2, CMET, 4-1BB, OX40, SIRPA, CD28, ICOS, CTLA4, BTLA, TIGIT, HVEM, CD27, VEGFR, or VEGF.

[0055] Different formats of bispecific antibodies are also provided. In some embodiments, the second fragment is selected from a Fab fragment, a single-chain variable fragment (scFv) , or a single-domain antibody. In some embodiments, the bispecific antibody further includes a Fc fragment.

[0056] Bifunctional molecules that include not just antibody or antigen binding fragment are also provided. As a tumor antigen targeting molecule, an antibody or antigen-binding fragment specific to DLL3, such as those described here, can be combined with an immune cytokine or ligand optionally through a peptide linker. The linked immune cytokines or ligands include, but not limited to, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, GM-CSF, TNF-a, CD40L, OX40L, CD27L, CD30L, 4-1BBL, LIGHT and GITRL. Such bi-functional molecules can combine the immune checkpoint blocking effect with tumor site local immune modulation. Chimeric Antigen Receptors

[0057] Also provided, in one embodiment, is a chimeric antigen receptor (CAR) that includes the antibody of the present disclosure as a targeting unit. In some embodiments, the CAR includes a single domain antibody of the present disclosure, a transmembrane domain, a costimulatory domain, and a CD3e intracellular domain.

[0058] A transmembrane domain can be designed to be fused to the extracellular domain which includes the antibody or fragment, optionally through a hinge domain. It can similarly be fused to an intracellular domain, such as a costimulatory domain. In some embodiments, the transmembrane domain can include the natural transmembrane region of a costimulatory domain (e.g., the TM region of a CD28 or 4-1BB employed as a costimulatory domain) or the natural transmembrane domain of a hinge region (e.g., the TM region of a CD8 alpha or CD28 employed as a hinge domain) .

[0059] In some embodiments, the transmembrane domain can include a sequence that spans a cell membrane, but extends into the cytoplasm of a cell and / or into the extracellular space. For example, a transmembrane can include a membrane-spanning sequence which itself can further include 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more amino acids that extend into the cytoplasm of a cell, and / or the extracellular space. Thus, a transmembrane domain includes a membrane-spanning region, yet can further comprise an amino acid (s) that extend beyond the internal or external surface of the membrane itself; such sequences can still be considered to be a “transmembrane domain” .

[0060] In some embodiments, the transmembrane domain is fused to the cytoplasmic domain through a short linker. Optionally, the short peptide or polypeptide linker, preferably between 2 and 10 amino acids in length can form the linkage between the transmembrane domain and a proximal cytoplasmic signaling domain of the chimeric receptor. A glycine-serine doublet (GS) , glycine-serine-glycine triplet (GSG) , or alanine-alanine-alanine triplet (AAA) provides a suitable linker.

[0061] In some embodiments, the CAR further includes a costimulatory domain. In some embodiments, the costimulatory domain is positioned between the transmembrane domain and an activating domain. Example costimulatory domains include, but are not limited to, CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8 , CD11a (ITGAL) , CD11b (ITGAM) , CD11c (ITGAX) , CD11d (ITGAD) , CD18 (ITGB2) , CD19 (B4) , CD27 (T FRSF7) , CD28, CD28T, CD29 (ITGB1) , CD30 (TNFRSF8) , CD40 (TNFRSF5) , CD48 (SLAMF2) , CD49a (ITGA1) , CD49d (ITGA4) , CD49f (ITGA6) , CD66a (CEACAM1) , CD66b (CEACAM8) , CD66c (CEACAM6) , CD66d (CEACAM3) , CD66e (CEACAM5) , CD69 (CLEC2) , CD79A (B-cell antigen receptor complex-associated alpha chain) , CD79B (B-cell antigen receptor complex-associated beta chain) , CD84 (SLAMF5) , CD96 (Tactile) , CD 100 (SEMA4D) , CD 103 (ITGAE) , CD134 (OX40) , CD137 (4-1BB) , CD150 (SLAMF1) , CD158A (KIR2DL1) , CD158B1 (KIR2DL2) , CD158B2 (KIR2DL3) , CD158C (KIR3DP1) , CD158D (KIRDL4) , CD158F1 (KIR2DL5A) , CD158F2 (KIR2DL5B) , CD158K (KTR3DL2) , CD160 (BY55) , CD162 (SELPLG) , CD226 (DNAM1) , CD229 (SLAMF3) , CD244 (SLAMF4) , CD247 (CD3-zeta) , CD258 (LIGHT) , CD268 (BAFFR) , CD270 (TFSF14) , CD272 (BTLA) , CD276 (B7-H3) , CD279 (PD-1) , CD314 (KG2D) , CD319 (SLAMF7) , CD335 (K-p46) , CD336 (K-p44) , CD337 (K-p30) , CD352 (SLAMF6) , CD353 (SLAMF8) , CD355 (CRTAM) , CD357 (TNFRSF 18) , inducible T cell co-stimulator (ICOS) , LFA-1 (CD11a / CD18) , KG2C, DAP-10, ICAM-1, Kp80 (KLRF1) , IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL) , SLP-76 (LCP2) , PAG1 / CBP, a CD83 ligand, Fc gamma receptor, MHC class 1 molecule, MHC class 2 molecule, a TNF receptor protein, an immunoglobulin protein, a cytokine receptor, an integrin, activating NK cell receptors, a Toll ligand receptor, and fragments or combinations thereof.

[0062] In some embodiments, the cytoplasmic portion of the CAR also includes a signaling / activation domain. In one embodiment, the signaling / activation domain is the CD3e domain, or is an amino acid sequence having at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 98%or 99%sequence identity to the CD3e domain. Polynucleotides, mRNA, and Methods of Expressing or Preparing Antibodies

[0063] The present disclosure also provides polynucleotides or nucleic acid molecules encoding the antibodies, variants or derivatives thereof of the disclosure, or the CAR. The polynucleotides of the present disclosure may encode the entire variable regions of the antibodies, variants or derivatives thereof on the same polynucleotide molecule or on separate polynucleotide molecules. Additionally, the polynucleotides of the present disclosure may encode portions of the variable regions of the antibodies, variants or derivatives thereof on the same polynucleotide molecule or on separate polynucleotide molecules.

[0064] In some embodiments, the polynucleotide is an mRNA molecule. In some embodiments, the mRNA can be introduced into a target cell for expressing the antibody or fragment thereof.

[0065] mRNAs may be synthesized according to any of a variety of known methods. For example, the mRNAs may be synthesized via in vitro transcription (IVT) . Briefly, IVT is typically performed with a linear or circular DNA template containing a promoter, a pool of ribonucleotide triphosphates, a buffer system that may include DTT and magnesium ions, and an appropriate RNA polymerase (e.g., T3, T7 or SP6 RNA polymerase) , DNAse I, pyrophosphatase, and / or RNAse inhibitor. The exact conditions will vary according to the specific application.

[0066] In some embodiments, for the preparation of antibody-coding mRNA, a DNA template is transcribed in vitro. A suitable DNA template typically has a promoter, for example a T3, T7 or SP6 promoter, for in vitro transcription, followed by desired nucleotide sequence for desired antibody encoding (e.g., heavy chain or light chain encoding) mRNA and a termination signal.

[0067] Desired antibody encoding (e.g., heavy chain or light chain encoding) mRNA sequence may be determined and incorporated into a DNA template using standard methods. For example, starting from a desired amino acid sequence (e.g., a desired heavy chain or light chain sequence) , a virtual reverse translation is carried out based on the degenerated genetic code. Optimization algorithms may then be used for selection of suitable codons. Typically, the G / C content can be optimized to achieve the highest possible G / C content on one hand, taking into the best possible account the frequency of the tRNAs according to codon usage on the other hand. The optimized RNA sequence can be established and displayed, for example, with the aid of an appropriate display device and compared with the original (wild-type) sequence. A secondary structure can also be analyzed to calculate stabilizing and destabilizing properties or, respectively, regions of the RNA.

[0068] The mRNA may be synthesized as unmodified or modified mRNA. Typically, mRNAs are modified to enhance stability. Modifications of mRNA can include, for example, modifications of the nucleotides of the RNA. A modified mRNA can thus include, for example, backbone modifications, sugar modifications or base modifications. In some embodiments, antibody encoding mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) may be synthesized from naturally occurring nucleotides and / or nucleotide analogues (modified nucleotides) including, but not limited to, purines (adenine (A) , guanine (G) ) or pyrimidines (thymine (T) , cytosine (C) , uracil (U) ) , and as modified nucleotides analogues or derivatives of purines and pyrimidines, such as e.g. 1-methyl-adenine, 2-methyl-adenine, 2-methylthio-N-6-isopentenyl-adenine, N6-methyl-adenine, N6-isopentenyl-adenine, 2-thio-cytosine, 3-methyl-cytosine, 4-acetyl-cytosine, 5-methyl-cytosine, 2, 6-diaminopurine, 1-methyl-guanine, 2-methyl-guanine, 2, 2-dimethyl-guanine, 7-methyl-guanine, inosine, 1-methyl-inosine, pseudouracil (5-uracil) , dihydro-uracil, 2-thio-uracil, 4-thio-uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thio-uracil, 5- (carboxyhydroxymethyl) -uracil, 5-fluoro-uracil, 5-bromo-uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-uracil, 5-methyl-2-thio-uracil, 5-methyl-uracil, N-uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, 5-methylaminomethyl-uracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thio-uracil, 5’ -methoxycarbonylmethyl-uracil, 5-methoxy-uracil, uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil-5-oxyacetic acid (v) , 1-methyl-pseudouracil, queosine, 13-D-mannosyl-queosine, wybutoxosine, and phosphoramidates, phosphorothioates, peptide nucleotides, methylphosphonates, 7-deazaguanosine, 5-methylcytosine and inosine. The preparation of such analogues is known to a person skilled in the art e.g. from the U.S. Pat. Nos. 4,373,071, 4,401,796, 4,415,732, 4,458,066, 4,500,707, 4,668,777, 4,973,679, 5,047,524, 5,132,418, 5,153,319, 5,262,530 and 5,700,642, the disclosure of which is included here in its full scope by reference.

[0069] In some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) may contain RNA backbone modifications. Typically, a backbone modification is a modification in which the phosphates of the backbone of the nucleotides contained in the RNA are modified chemically. Exemplary backbone modifications typically include, but are not limited to, modifications from the group consisting of methylphosphonates, methylphosphoramidates, phosphoramidates, phosphorothioates (e.g., cytidine 5’ -O- (1-thiophosphate) ) , boranophosphates, positively charged guanidinium groups etc., which means by replacing the phosphodiester linkage by other anionic, cationic or neutral groups.

[0070] In some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) may contain sugar modifications. A typical sugar modification is a chemical modification of the sugar of the nucleotides it contains including, but not limited to, sugar modifications chosen from the group consisting of 2’ -deoxy-2’ -fluoro-oligoribonucleotide (2’ -fluoro-2’ -deoxycytidine 5’ -triphosphate, 2’ -fluoro-2’ -deoxyuridine 5’ -triphosphate) , 2’ -deoxy-2’ -deamine-oligoribonucleotide (2’ -amino-2’ -deoxycytidine 5’ -triphosphate, 2’ -amino-2’ -deoxyuridine 5’ -triphosphate) , 2’ -O-alkyloligoribonucleotide, 2’ -deoxy-2’ -C-alkyloligoribonucleotide (2’ -O-methylcytidine 5’ -triphosphate, 2’ -methyluridine 5’ -triphosphate) , 2’ -C-alkyloligoribonucleotide, and isomers thereof (2’ -aracytidine 5’ -triphosphate, 2’ -arauridine 5’ -triphosphate) , or azidotriphosphates (2’ -azido-2’ -deoxycytidine 5’ -triphosphate, 2’ -azido-2’ -deoxyuridine 5’ -triphosphate) .

[0071] In some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) may contain modifications of the bases of the nucleotides (base modifications) . A modified nucleotide which contains a base modification is also called a base-modified nucleotide. Examples of such base-modified nucleotides include, but are not limited to, 2-amino-6-chloropurine riboside 5’ -triphosphate, 2-aminoadenosine 5’ -triphosphate, 2-thiocytidine 5’ -triphosphate, 2-thiouridine 5’ -triphosphate, 4-thiouridine 5’ -triphosphate, 5-aminoallylcytidine 5’ -triphosphate, 5-aminoallyluridine 5’ -triphosphate, 5-bromocytidine 5’ -triphosphate, 5-bromouridine 5’ -triphosphate, 5-iodocytidine 5’ -triphosphate, 5-iodouridine 5’ -triphosphate, 5-methylcytidine 5’ -triphosphate, 5-methyluridine 5’ -triphosphate, 6-azacytidine 5’ -triphosphate, 6-azauridine 5’ -triphosphate, 6-chloropurine riboside 5’ -triphosphate, 7-deazaadenosine 5’ -triphosphate, 7-deazaguanosine 5’ -triphosphate, 8-azaadenosine 5’ -triphosphate, 8-azidoadenosine 5’ -triphosphate, benzimidazole riboside 5’ -triphosphate, N1-methyladenosine 5’ -triphosphate, N1-methylguanosine 5’ -triphosphate, N6-methyladenosine 5’ -triphosphate, O6-methylguanosine 5’ -triphosphate, pseudouridine 5’ -triphosphate, puromycin 5’ -triphosphate or xanthosine 5’ -triphosphate.

[0072] Typically, mRNA synthesis includes the addition of a “cap” on the N-terminal (5’ ) end, and a “tail” on the C-terminal (3’ ) end. The presence of the cap is important in providing resistance to nucleases found in most eukaryotic cells. The presence of a “tail” serves to protect the mRNA from exonuclease degradation.

[0073] Thus, in some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) include a 5’ cap structure. A 5’ cap is typically added as follows: first, an RNA terminal phosphatase removes one of the terminal phosphate groups from the 5’ nucleotide, leaving two terminal phosphates; guanosine triphosphate (GTP) is then added to the terminal phosphates via a guanylyl transferase, producing a 5’ 5’ 5 triphosphate linkage; and the 7-nitrogen of guanine is then methylated by a methyltransferase. Examples of cap structures include, but are not limited to, m7G (5’ ) ppp (5’ (A, G (5’ ) ppp (5) A and G (5) ppp (5’ ) G.

[0074] In some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) include a 3’ poly (A) tail structure. A poly-Atail on the 3’ terminus of mRNA typically includes about 10 to 300 adenosine nucleotides (e.g., about 10 to 200 adenosine nucleotides, about 10 to 175 adenosine nucleotides, about 10 to 150 adenosine nucleotides, about 10 to 125 adenosine nucleotides, 10 to 100 adenosine nucleotides, about 10 to 75 adenosine nucleotides, about 20 to 70 adenosine nucleotides, or about 20 to 60 adenosine nucleotides) . In some embodiments, antibody encoding mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) include a 3’ poly (C) tail structure. A suitable poly-C tail on the 3’ terminus of mRNA typically include about 10 to 200 cytosine nucleotides (e.g., about 10 to 150 cytosine nucleotides, about 10 to 100 cytosine nucleotides, about 20 to 70 cytosine nucleotides, about 20 to 60 cytosine nucleotides, or about 10 to 40 cytosine nucleotides) . The poly-C tail may be added to the poly-A tail or may substitute the poly-A tail.

[0075] In some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) include a 5’ and / or 3’ untranslated region. In some embodiments, a 5’ untranslated region includes one or more elements that affect an mRNA’s stability or translation, for example, an iron responsive element. In some embodiments, a 5’ untranslated region may be between about 50 and 500 nucleotides in length (e.g., about 50 and 400 nucleotides in length, about 50 and 300 nucleotides in length, about 50 and 200 nucleotides in length, or about 50 and 100 nucleotides in length) .

[0076] In some embodiments, a 5’ region of an mRNA (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) includes a sequence encoding a signal peptide, such as those described herein. In particular embodiments, a signal peptide derived from human growth hormone (hGH) is incorporated in the 5’ region. Typically, a signal peptide encoding sequence is linked, directly or indirectly, to the heavy chain or light chain encoding sequence at the N-terminus.

[0077] The present technology may be used to deliver any antibody known in the art and antibodies that can be produced against desired antigens using standard methods. The present invention may be used to deliver monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, antibody mixtures or cocktails, human or humanized antibodies, chimeric antibodies, or bi-specific antibodies.

[0078] Methods of making antibodies are well known in the art and described herein. In certain embodiments, both the variable and constant regions of the antigen-binding polypeptides of the present disclosure are fully human. Fully human antibodies can be made using techniques described in the art and as described herein. For example, fully human antibodies against a specific antigen can be prepared by administering the antigen to a transgenic animal which has been modified to produce such antibodies in response to antigenic challenge, but whose endogenous loci have been disabled. Exemplary techniques that can be used to make such antibodies are described in U.S. patents: 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140 which are incorporated by reference in their entireties. Antibody-drug conjugates

[0079] The present disclosure provides antibody-drug conjugates (ADC) of the anti-DLL3 antibodies. The antibody-drug conjugate can include an antibody of the present disclosure conjugated to a drug (or payload) via a linker.

[0080] The drugs can be connected to the antibodies via a cysteine residue or a lysine residue on the antibodies. The ADC can be constructed via chemical approach such as stochastic conjugation on pre-existing lysine or cysteine residues via appropriate coupling reactions, such as amide coupling (of lysine) and sulfhydryl coupling (of cysteine) . An active carboxylic acid ester (when available in the linker) is used to connect payloads to lysine residues on the antibody. The primary amine in Lys easily reacts with N-hydroxysuccinimide (NHS) esters introduced into the linker, forming a stable amide. A typical IgG1 antibody molecule has roughly 90 Lys residues, of which approximately 30 can be modified for conjugation, implying that between 1 and 30 payloads can be covalently coupled to the antibody. As for cysteine, after reduction, the disulfide bond could transform to expose free cysteine residues which are accessible for coupling reactions, such as Michael additions, disulfide formation, and a-halo carbonyl alkylations.

[0081] The ADC can also be constructed via enzymatic approach such as site-specific conjugation. The site-specific conjugation includes introduction of engineered reactive cysteine residues, disulfide re-bridging, unnatural amino acids, enzyme-assisted ligation, or glycan remodeling, glycoconjugation or click chemistry. Details of the methods of conjugation can be found in the art, such as Fu et al., Signal Transduction and Targeted Therapy 7: 93 (2022) .

[0082] The drug-antibody ratio (DAR) for an ADC can be more than 2, more than 4, more than 6, more than 8, more than 10, more than 16, more than 20, or more than 30. In certain embodiments, the drug-antibody ratio (DAR) can be from 1-30, from 1-20, from 1-10, from 1-8, such as, 4-8, or 2-4. In certain embodiments, the drug-antibody ratio (DAR) can be 2, 4, 6, 8, 10, 16, 20, or 30. In certain embodiments, the DAR is homogenous.

[0083] The linker contained in the drug-linker compound can be non-cleavable linker and cleavable linker. The cleavable linker mainly includes enzyme-cleavable linkers and chemically sensitive linkers.

[0084] Non-cleavable linkers consist of stable bonds that resist proteolytic degradation and ensure greater plasma stability. The mechanism of action of non-cleavable linkers is based on the internalization of the ADC complex followed by degradation of the mAb component in the lysosome, resulting in the release of a cytotoxic drug that kills tumor cells. They do not unleash cytotoxic agents at off-target sites and thus do not harm healthy cells. Non-cleavable linkers are divided into two groups, namely thioether or maleimidocaproyl (MC) . Examples of the non-cleavable linkers include, but not limited to, 4-maleimidomethyl cyclohexane-1-carboxylate (MCC) , succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) , maleimidecaproyl (MC) , and p-carboxycyclo hexylmethylmaleimide.

[0085] Cleavable linkers mainly include chemically sensitive linkers those are usually cleaved by environmental differences (such as redox potential, pH) and enzyme-cleavable linkers which are cleaved by specific enzymes in response to extracellular and intracellular environments.

[0086] Chemically sensitive linkers include, but not limited to, types of pH-sensitive linkers, and glutathione-sensitive disulfide linkers. (Khongorzul et al., Mol Cancer Res; 18 (1) (2020) ) .

[0087] PH-sensitive linkers are a group of linkers that are sensitive to the acidic environment but are stable in the alkaline environment such as systemic circulation, such as hydrozone based linker. One successful example of ADC design using pH-sensitive linker is the IMMU-110 which is composed of a humanized anti-CD74 mAb conjugated to doxorubicin via acid-labile hydrazone.

[0088] Glutathione-sensitive disulfide linkers utilize difference in reduction potential in the cytoplasm in contrast to plasma. A high concentration of glutathione can be found in cancer cells than normal cells. Glutathione-sensitive linkers are stable in the blood flow and particularly cleaved by the elevated intracellular concentration of glutathione in the tumor cell, releasing the active drugs at the tumor sites from the nontoxic prodrugs (see supra) .

[0089] Enzyme-cleavable linkers include, but not limited to, peptide-based linkers, β-glucuronide based linkers and phosphate based linkers.

[0090] Peptide based linkers, also known as protease-sensitive linkers, are the most commonly used ADC linkers. These linkers can be cleaved by specific proteases extracellularly and / or intracellularly. For intracellular cleavage, as tumor cells exhibit high expression of lysosomal proteases like cathepsin B compared with the normal cells, therefore, proteases–sensitive peptide linker ADCs are selectively bound to and transformed into cancerous cells through receptor mediated endocytosis. The peptide linkers are stable in the systemic circulation and only unleash the drug in the target cells (see supra) . Examples are Valine-citrulline (VC or Val-Cit) , Valine-alanine (VA) , phenylalanine-lysine (PL) , and glycine-glycine-phenylalanine-glycine (GGFG) .

[0091] β-glucuronide based linkers are recognized and hydrolyzed by β-glucuronidase or β-galactosidase for the drug release, while the β-glucuronidase and β-galactosidase are enriched in lysosomes and tumor necrotic regions. β-glucuronidase is inactive at physiologic pH (blood circulation) and active at lysosomal pH. Such selective site of action allows for the cleavage of the glycosidic linkage of the β-glucuronidase–sensitive β-glucuronide linker, thereby enabling the selective release of cytotoxic payloads (see supra) .

[0092] Phosphate based linkers are a class of enzyme-cleavable linkers expressed exclusively to target enzymes in the lysosomal compartment. These linkers target pyrophosphatase and acid phosphatase enzymes, which hydrolyze pyrophosphates and terminal monophosphates into their respective alcohols.

[0093] Moieties that can be introduced as part of the linkers to facilitate the drug-linker connection or antibody-linker connection include maleimidocaproyl, maleimide-caproyl (MC) moiety, maleimide-methylene-cyclohexyl carbonyl moiety spacer, maleimide propoyl (MP) , para-aminobenzylcarbamate (PAB) spacer, para-aminobenzyloxycarbamoyl (PABC) spacer, aminomethoxy methylenecarbonyl (-NH-CH2-O-CH2-CO-) spacer, 4- (4’ -acetylphenoxy) butanoic acid moiety, acylhydrazide (–CO–NH–NH2) and thiol (–SH) moieties, Lys-PABC, PEG chain and PEG8.

[0094] Examples of the linkers include, but not limited to succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) , sulfo-SMCC, MC-VC-PABC, CL2A, MC-GGFG, MC, MC-PEG8-GGFG, MC-PEG8-GGFG-PAB, or MP-PEG8-VA-PABC.

[0095] The drug or payload can be a cytotoxin, a therapeutic peptide or polypeptide.

[0096] The peptide or polypeptide may be any peptide or polypeptide which has therapeutic properties, for example antinociceptive, antidiabetes, antitumor or antiviral activity. Additionally, or alternatively, the drug preferably comprises an amine group, a thiol group, or a carboxylic acid group, as these types of groups provide ideal sites for conjugation of the drug with the linker of the present disclosure. Examples of biologics drug are pseudomonas aeruginosa exotoxin PE38, diphtheria toxin, staphylococcus aureus enterotoxin A / E-120, shigatoxin, ricin, and urease.

[0097] The cytotoxin are activated after release from ADC inside the cytoplasm of tumor cells and are able to destroy the tumor cells. There are two main classes of cytotoxins that can be used in the ADC designs: microtubule-disrupting agents (such as auristatins and maytansinoids) and DNA-damaging agents (such as calicheamicins, duocarmycin, and doxorubicin) . Examples included, but not limited to includes auristatins, maytansinoids, benzodiazepines, tubulysins, duocarmycin, calicheamicins, exatecans, irinotecans (SN38) , doxorubicin, anthracycline, pyrrolobenzodiazepenes (PBD) , TLR agonist, and STING agonists.

[0098] Auristatins are synthetic antineoplastic agents derived from the natural product dolastatin 10. They block the tubulin polymerization process resulting in cell-cycle arrest and apoptosis. Examples include monomethyl auristatin E (MMAE) and monomethyl auristatin F (MMAF) .

[0099] Maytansinoids are isolated from the maytansine, a benzoansamacrolide. These drugs inhibit tubulin polymerization. Examples include DM1 and DM4.

[0100] Calicheamicins are a class of enediyne antitumor antibiotics derived from the bacterium Micromonospora echinospora. Calicheamicin recognizes the minor groove of DNA and halts DNA replication resulting in mitotic arrest and cell death. One example is N-acetyl-calicheamicin, a derivative of calicheamicin.

[0101] Duocarmycin is a natural product derivative extracted from the bacteria Streptomyces strains. Duocarmycins are another class of DNA minor groove–binding alkylating agents. This class of drugs shows its action by binding to the minor groove of DNA and subsequently cause irreparable alkylation of DNA that disrupts the nucleic acid architecture and structural integrity.

[0102] Doxorubicin shows its action by intercalation of DNA that inhibits DNA synthesis. One example is IMMU-110.

[0103] Exatecans are synthetic derivatives of the natural cytotoxin, camptothecin, isolated from the Chinese tree Camptotheca acuminata. Like camptothecin, exatecan binds to the topoisomerase 1-DNA complex, preventing DNA re-ligation which results in the accumulation of DNA strand breaks and ultimately leads to cell death. Examples of exatecans are DX-8951f and DXd. 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin (SN-38) is also a derivative of camptothecin.

[0104] Further examples of the cytotoxin includes, without limitation, tublysin A, camptothecin, DGN462, Amberstatin269, anthramycin, SG3199 / SCX,  TLR7 / 8 agonist, diABZI STING agonist-2. Treatment and Uses

[0105] As described herein, the antibodies, variants, derivatives or antibody-drug conjugates of the present disclosure may be used in certain treatment and diagnostic methods.

[0106] The present disclosure is further directed to antibody-based therapies which involve administering the antibodies, fragments, or antibody-drug conjugates of the disclosure to a patient such as an animal, a mammal, and a human for treating one or more of the disorders or conditions described herein. Therapeutic compounds of the disclosure include, but are not limited to, antibodies of the disclosure (including variants and derivatives thereof as described herein) and nucleic acids or polynucleotides encoding antibodies of the disclosure (including variants and derivatives thereof as described herein) .

[0107] The antibodies of the disclosure can also be used to treat or inhibit cancer. As provided above, DLL3 can be overexpressed in tumor cells, in particular liver, gastric, pancreatic, esophageal, ovarian, and lung tumors. Inhibition of DLL3 has been shown to be useful for treating the tumors.

[0108] Accordingly, in some embodiments, provided are methods for treating a cancer in a patient in need thereof. The method, in one embodiment, entails administering to the patient an effective amount of an antibody, fragment, or antibody-drug conjugate of the present disclosure. In some embodiments, at least one of the cancer cells (e.g., stromal cells) in the patient over-express DLL3.

[0109] Cellular therapies, such as chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies, are also provided in the present disclosure. A suitable cell can be used, that is transduced with a vector that encodes, or put in contact with, an CAR that includes an anti-DLL3 antibody of the present disclosure (or alternatively engineered to express an anti-DLL3 antibody of the present disclosure) . Upon such contact or engineering, the cell can then be introduced to a cancer patient in need of a treatment. The cancer patient may have a cancer of any of the types as disclosed herein. The cell (e.g., T cell) can be, for instance, a tumor-infiltrating T lymphocyte, a CD4+ T cell, a CD8+ T cell, or the combination thereof, without limitation.

[0110] In some embodiments, the cell was isolated from the cancer patient him-or her-self. In some embodiments, the cell was provided by a donor or from a cell bank. When the cell is isolated from the cancer patient, undesired immune reactions can be minimized.

[0111] Non-limiting examples of cancers include bladder cancer, breast cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, head and neck cancer, kidney cancer, leukemia, liver cancer, lung cancer, lymphoma, melanoma, pancreatic cancer, prostate cancer, and thyroid cancer. In some embodiments, the cancer is one or more of gastric, pancreatic, esophageal, ovarian, lung cancers and cutaneous T cell lymphoma. In some embodiments, the cancer is small cell lung cancer (SCLC) .

[0112] Additional diseases or conditions associated with increased cell survival, that may be treated, prevented, diagnosed and / or prognosed with the antibodies or variants, or derivatives thereof of the disclosure include, but are not limited to, progression, and / or metastases of malignancies and related disorders such as leukemia (including acute leukemias (e.g., acute lymphocytic leukemia, acute myelocytic leukemia (including myeloblastic, promyelocytic, myelomonocytic, monocytic, and erythroleukemia) ) and chronic leukemias (e.g., chronic myelocytic (granulocytic) leukemia and chronic lymphocytic leukemia) ) , polycythemia vera, lymphomas (e.g., Hodgkin’s disease and non-Hodgkin’s disease) , multiple myeloma, Waldenstrom’s macroglobulinemia, heavy chain disease, and solid tumors including, but not limited to, sarcomas and carcinomas such as fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteogenic sarcoma, chordoma, angiosarcoma, endotheliosarcoma, lymphangiosarcoma, lymphangioendotheliosarcoma, synovioma, mesothelioma, Ewing’s tumor, leiomyosarcoma, rhabdomyo sarcoma, colon carcinoma, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, sebaceous gland carcinoma, papillary carcinoma, papillary adenocarcinomas, cystadenocarcinoma, medullary carcinoma, bronchogenic carcinoma, renal cell carcinoma, hepatoma, bile duct carcinoma, choriocarcinoma, seminoma, embryonal carcinoma, Wilm’s tumor, cervical cancer, testicular tumor, lung carcinoma, small cell lung carcinoma, bladder carcinoma, epithelial carcinoma, glioma, astrocytoma, medulloblastoma, craniopharyngioma, ependymoma, pinealoma, hemangioblastoma, acoustic neuroma, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma and retinoblastoma.

[0113] A specific dosage and treatment regimen for any particular patient will depend upon a variety of factors, including the particular antibodies, variant or derivative thereof used, the patient’s age, body weight, general health, sex, and diet, and the time of administration, rate of excretion, drug combination, and the severity of the particular disease being treated. Judgment of such factors by medical caregivers is within the ordinary skill in the art. The amount will also depend on the individual patient to be treated, the route of administration, the type of formulation, the characteristics of the compound used, the severity of the disease, and the desired effect. The amount used can be determined by pharmacological and pharmacokinetic principles well known in the art.

[0114] Methods of administration of the antibody, fragment, or antibody-drug conjugate or include but are not limited to intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. The antigen-binding polypeptides or compositions may be administered by any convenient route, for example by infusion or bolus injection, by absorption through epithelial or mucocutaneous linings (e.g., oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc. ) and may be administered together with other biologically active agents. Thus, pharmaceutical compositions containing the antigen-binding polypeptides of the disclosure may be administered orally, rectally, parenterally, intracisternally, intravaginally, intraperitoneally, topically (as by powders, ointments, drops or transdermal patch) , buccally, or as an oral or nasal spray.

[0115] The term “parenteral” as used herein refers to modes of administration which include intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous and intra-articular injection and infusion.

[0116] Administration can be systemic or local. In addition, it may be desirable to introduce the antibodies of the disclosure into the central nervous system by any suitable route, including intraventricular and intrathecal injection; intraventricular injection may be facilitated by an intraventricular catheter, for example, attached to a reservoir, such as an Ommaya reservoir. Pulmonary administration can also be employed, e.g., by use of an inhaler or nebulizer, and formulation with an aerosolizing agent.

[0117] It may be desirable to administer the antigen-binding polypeptides or compositions of the disclosure locally to the area in need of treatment; this may be achieved by, for example, and not by way of limitation, local infusion during surgery, topical application, e.g., in conjunction, with a wound dressing after surgery, by injection, by means of a catheter, by means of a suppository, or by means of an implant, said implant being of a porous, non-porous, or gelatinous material, including membranes, such as sialastic membranes, or fibers. Preferably, when administering a protein, including an antibody, of the disclosure, care must be taken to use materials to which the protein does not absorb.

[0118] The amount of the antibodies, fragments, or antibody-drug conjugates of the disclosure which will be effective in the treatment, inhibition and prevention of an inflammatory, immune or malignant disease, disorder or condition can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vitro assays may optionally be employed to help identify optimal dosage ranges. The precise dose to be employed in the formulation will also depend on the route of administration, and the seriousness of the disease, disorder or condition, and should be decided according to the judgment of the practitioner and each patient’s circumstances. Effective doses may be extrapolated from dose-response curves derived from in vitro or animal model test systems.

[0119] As a general proposition, the dosage administered to a patient of the antibodies, fragments, or antibody-drug conjugates of the present disclosure is typically 0.001 mg / kg to 100 mg / kg of the patient’s body weight, between 0.01 mg / kg and 20 mg / kg of the patient’s body weight, or 0.5 mg / kg to 10 mg / kg of the patient’s body weight. Generally, human antibodies have a longer half-life within the human body than antibodies from other species due to the immune response to the foreign polypeptides. Thus, lower dosages of human antibodies and less frequent administration is often possible. Further, the dosage and frequency of administration of antibodies of the disclosure may be reduced by enhancing uptake and tissue penetration (e.g., into the brain) of the antibodies by modifications such as, for example, lipidation.

[0120] In an additional embodiment, the compositions of the disclosure are administered in combination with cytokines. Cytokines that may be administered with the compositions of the disclosure include, but are not limited to, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, anti-CD40, CD40L, and TNF-a.

[0121] In additional embodiments, the compositions of the disclosure are administered in combination with other therapeutic or prophylactic regimens, such as, for example, radiation therapy. Compositions

[0122] The present disclosure also provides pharmaceutical compositions. Such compositions comprise an effective amount of an antibody, fragment, or antibody-drug conjugate, and an acceptable carrier. In some embodiments, the composition further includes a second anticancer agent (e.g., an immune checkpoint inhibitor) .

[0123] In a specific embodiment, the term “pharmaceutically acceptable” means approved by a regulatory agency of the Federal or a state government or listed in the U.S. Pharmacopeia or other generally recognized pharmacopeia for use in animals, and more particularly in humans. Further, a “pharmaceutically acceptable carrier” will generally be a non-toxic solid, semisolid or liquid filler, diluent, encapsulating material or formulation auxiliary of any type.

[0124] The term “carrier” refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic is administered. Such pharmaceutical carriers can be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. Water is a preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol and the like. The composition, if desired, can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents such as acetates, citrates or phosphates. Antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl parabens; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; and agents for the adjustment of tonicity such as sodium chloride or dextrose are also envisioned. These compositions can take the form of solutions, suspensions, emulsion, tablets, pills, capsules, powders, sustained-release formulations and the like. The composition can be formulated as a suppository, with traditional binders and carriers such as triglycerides. Oral formulation can include standard carriers such as pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharine, cellulose, magnesium carbonate, etc. Examples of suitable pharmaceutical carriers are described in Remington’s Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin, incorporated herein by reference. Such compositions will contain a therapeutically effective amount of the antigen-binding polypeptide, preferably in purified form, together with a suitable amount of carrier so as to provide the form for proper administration to the patient. The formulation should suit the mode of administration. The parental preparation can be enclosed in ampoules, disposable syringes or multiple dose vials made of glass or plastic.

[0125] In an embodiment, the composition is formulated in accordance with routine procedures as a pharmaceutical composition adapted for intravenous administration to human beings. Typically, compositions for intravenous administration are solutions in sterile isotonic aqueous buffer. Where necessary, the composition may also include a solubilizing agent and a local anesthetic such as lignocaine to ease pain at the site of the injection. Generally, the ingredients are supplied either separately or mixed together in unit dosage form, for example, as a dry lyophilized powder or water free concentrate in a hermetically sealed container such as an ampoule or sachet indicating the quantity of active agent. Where the composition is to be administered by infusion, it can be dispensed with an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline. Where the composition is administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline can be provided so that the ingredients may be mixed prior to administration. EXAMPLES Example 1. Generation of Single Domain Antibodies Against Human DLL3

[0126] This example shows how anti-human-DLL3 single domain antibodies were generated using immunization of alpaca followed by phage library construction and selection.

[0127] Recombinant human DLL3 / hFc fusion proteins were used as the immunogen to raise anti-human DLL3 antibodies. A fusion protein comprising the entire extracellular region of human DLL3 fused to a human immunoglobulin Fc domain was used as the immunogen.

[0128] Alpaca PBMCs were collected, and an antibody cDNA library was generated by RNA isolation and PCR amplification and cloning into a phage display vector. The libraries were then subjected for one round of liquid phase selection and one round of solid phase selection. In general, the libraries were incubated in biotinylated DLL3-coated immunotubes or beads. Unbound phages were removed by washing with PBST. For each selection, three rounds of screening were performed in total.

[0129] The binders were amplified from antigen positive phages by PCR and sequenced. Sequences of the unique antibodies and their CDR regions are provided in the tables below. Table 1. Antibody Sequences Table 2. CDR sequences Example 2. Affinity Testing

[0130] The binding affinity of these antibodies to the human and cyno DLL3 proteins was measured with ELISA. The results are shown in FIG. 1 (left: human DLL3 (hDLL3) ; right: Cyno DLL3) . All of the tested antibodies exhibited strong affinity to the human DLL3 protein, and acceptable affinity to the Cyno DLL3 protein.

[0131] The antibodies were also tested for their ability to bind to cells overexpressing DLL3. The cells tested included HEK293 engineered to express DLL3, and DLL3-expressing small cell lung cancer cells SHP-77 and DMS53. As shown in FIG. 2, most of the tested antibodies exhibited excellent affinity to cell surface DLL3 proteins. Example 3. Epitope Mapping

[0132] The extracellular portion of the human DLL3 protein includes a Delta / Serrate / LAG-2 (DSL) domain and six EGF domains (FIG. 3A) . The locations of these domains, relative to UniProt NO. Q9NYJ7, are shown in Table 3.

[0133] To determine the epitopes of these antibodies, various fragments of the extracellular portions were used for binding analysis. The fragments included the full-length extra-cellular domain (ECD) protein, DSL-EGF6 (A176 to L492) , EGF3-EGF6 (S312 to L492) , EGF4-EGF6 (R353 to L492) . The binding testing results, at two antibody concentrations (100 nM and 1 nM) are shown in FIG. 3B and Table 4. Two benchmarks of anti-DLL3 antibodies were used as references. Rova-T DLL3 mAb is the antibody moiety of an anti-DLL3 ADC developed by Abbive (Rovalpituzumab tesirine) , which binds to the DSL domain of DLL3. AMG757 DLL3 mAb is the anti-DLL3 moiety of a T cell engager developed by Amgen (Tarlatamab) , which binds to the EGF3 domain of DLL3. As shown, C491BHJ270-14’s epitope is within the EGF3 domain whereas the remainders bind to the N-terminus of the DLL3 protein. Table 3. DLL3 Domains Table 4. Epitope Mapping Based on Fragment Binding Example 4. Antibody-Mediated Internalization

[0134] This example characterized the antibody internalization rate of the DLL3 antibodies when binding to DLL3-expressing cells, using an IncucyteTM Internalization Assay. The testing was conducted following the manufacturer’s protocol, and the results are shown in FIG. 4. As shown, all of the tested antibodies induced effective internalization. ***

[0135] The present disclosure is not to be limited in scope by the specific embodiments described which are intended as single illustrations of individual aspects of the disclosure, and any compositions or methods which are functionally equivalent are within the scope of this disclosure. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the methods and compositions of the present disclosure without departing from the spirit or scope of the disclosure. Thus, it is intended that the present disclosure cover the modifications and variations of this disclosure provided they come within the scope of the appended claims and their equivalents.

[0136] All publications and patent applications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference.

Claims

1.A single domain antibody or a polypeptide comprising the single domain antibody, wherein the single domain antibody has binding specificity to the human Delta-like ligand 3 (DLL3) protein and comprises a complementarity determining region 1 (CDR1) , a CDR2 and a CDR3, wherein the CDR1, CDR2 and CDR3 comprise, respectively,(a) the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8, 9, and 10;(b) the amino acid sequences of SEQ ID NO: 11, 12, and 13;(c) the amino acid sequences of SEQ ID NO: 14, 15, and 16;(d) the amino acid sequences of SEQ ID NO: 17, 18, and 19;(e) the amino acid sequences of SEQ ID NO: 20, 21 and 22;(f) the amino acid sequences of SEQ ID NO: 23, 24 and 25; or(g) the amino acid sequences of SEQ ID NO: 26, 27, and 28.2.The antibody or polypeptide of claim 1, wherein the CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, the CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and the CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.3.The antibody or polypeptide of claim 2, wherein the single domain antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.4.The antibody or polypeptide of claim 1, wherein the CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, the CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and the CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.5.The antibody or polypeptide of claim 4, wherein the single domain antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.6.The antibody or polypeptide of claim 1, wherein the CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, the CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and the CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.7.The antibody or polypeptide of claim 6, wherein the single domain antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.8.The antibody or polypeptide of claim 1, wherein the CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, the CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 and the CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19.9.The antibody or polypeptide of claim 8, wherein the single domain antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.10.The antibody or polypeptide of claim 1, wherein the CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, the CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and the CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.11.The antibody or polypeptide of claim 10, wherein the single domain antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.12.The antibody or polypeptide of claim 1, wherein the CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, the CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 and the CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.13.The antibody or polypeptide of claim 12, wherein the single domain antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.14.The antibody or polypeptide of claim 1, wherein the CDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, the CDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and the CDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.15.The antibody or polypeptide of claim 14, wherein the single domain antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.16.The antibody or polypeptide of any one of claims 1-15, wherein the polypeptide is a chimeric antigen receptor (CAR) or a bispecific antibody having a binding specificity to an antigen different from DLL3.17.A polynucleotide encoding the antibody or polypeptide of any one of claims 1-16.18.A cell comprising the polynucleotide of claim 17.19.An antibody-drug conjugate (ADC) comprising a drug moiety conjugated to the antibody or polypeptide of any one of claims 1-16.20.The ADC of claim 19, wherein the drug moiety is a cytotoxic or cytostatic agent, an immunosuppressive agent, a radioisotope, or a toxin.21.The ADC of claim 20, wherein the drug moiety is a maytansinoid, an auristatin, a macrocyclic ketone analogue, or a topoisomerase inhibitor.22.A composition comprising the antibody or polypeptide of any one of claims 1-16, the polynucleotide of claim 17, the cell of claim 18, or the ADC of any one of claims 19-21, and a pharmaceutically acceptable carrier.23.A method for treating cancer in a patient in need thereof, comprising administering to the patient an effective amount of the antibody or polypeptide of any one of claims 1-16, the polynucleotide of claim 17, the cell of claim 18, or the ADC of any one of claims 19-21.24.Use of the antibody or polypeptide of any one of claims 1-16, the polynucleotide of claim 17, the cell of claim 18, or the ADC of any one of claims 19-21 for the preparation of a medicament for treating cancer.25.The method of claim 23 or the use of claim 24, wherein the cancer is selected from the group consisting of ovarian cancer, prostate cancer, cancer of the urinary tract, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, bladder cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, head and neck cancer, kidney cancer, leukemia, liver cancer, lymphoma, melanoma, and thyroid cancer.26.The method of claim 23 or the use of claim 24, wherein the cancer is small cell lung cancer (SCLC) .

Images