Use of protease to degrade animal hairballs

Abstract

A method of preventing or reducing hairball formation or promoting hairball elimination in an animal, the method comprising administering to the animal a composition comprising a polypeptide having protease activity.

Description

USE OF PROTEASE TO DEGRADE ANIMAL HAIRBALLS

[0001] Reference to a sequence listing

[0002] This application contains a Sequence Listing in computer readable form, which is incorporated herein by reference.Field of the Invention

[0003] The present invention relates to a method of preventing or reducing hairball formation or promoting hairball elimination in an animal, the method comprising administering to the animal a composition comprising a polypeptide having protease activity, to use of a polypeptide having protease activity for preventing or reducing hairball formation or for promoting hairball elimination in an animal, and to compositions for use in the method.Background of the Invention

[0004] Cats are known for their meticulous grooming habits, during which they use their tongues to clean and maintain their fur. This process inevitably leads to the ingestion of loose hair, which typically passes harmlessly through the digestive tract. However, in many cases, the ingested hair accumulates in the stomach, forming compact masses commonly referred to as hairballs, or trichobezoars. While occasional expulsion of hairballs through vomiting is relatively common and often harmless, frequent or chronic occurrences can result in significant health issues for cats, including gastrointestinal discomfort, appetite loss, constipation, or even life-threatening obstructions that may require veterinary intervention.

[0005] Traditional approaches to managing hairballs focus on minimizing hair ingestion or facilitating its passage through the digestive system. These methods include regular grooming to reduce loose fur, dietary interventions such as high-fiber foods to promote gastrointestinal motility, and the administration of lubricants or gels designed to coat the hair and ease its movement through the intestines. While these strategies can provide some relief, they do not address the structural composition of hairballs, which consist primarily of densely packed hair strands bound together by proteinaceous material secreted during digestion. This binding matrix makes hairballs resistant to natural breakdown, contributing to their persistence in the gastrointestinal tract.

[0006] WO 2004 / 045300 discloses animal feed compositions which inhibit hairball formation and function to reduce the odor of the animal's excrement, where the composition may comprise a fungal acid protease.

[0007] US 2003 / 0147940 discloses an agent for promoting the evacuation of hair and hairballs from animals, comprising at least two sources selected from a kelp source, a protease source and a cellulose source, where the protease source preferably includes papaya.

[0008] WO 99 / 65514 discloses an animal food formulation for an animal prone to hairballs, comprising a nutrient source comprises bromelain, i.e. protease from pineapple.

[0009] In spite of certain patent disclosures pertaining to compositions comprising a protease that are said to address the problem of hairballs, no such products that are effective to actually deal with hairballs are commercially available.

[0010] The present invention addresses this challenge by introducing a novel approach that leverages the enzymatic action of a protease to specifically target and degrade the protein matrix holding hairballs together. By incorporating protease enzymes into the diet of a cat or other animal or administering them as a supplement, the protein structure binding the ingested hair can be broken down. This enzymatic degradation allows hairballs to dissolve or disintegrate more effectively, enabling their natural passage through the digestive system without causing harm. This solution not only reduces the formation and impact of hairballs but also improves the overall gastrointestinal health and quality of life for cats and other animals prone to hairballs.

[0011] This innovative method offers a safe, targeted, and non-invasive alternative to existing hairball management strategies. By addressing the root cause of hairball persistence-the protein matrix-this approach provides a more effective and sustainable solution to a common feline / animal health concern.Summary of the Invention

[0012] In one aspect, the invention provides a method of preventing or reducing hairball formation or promoting hairball elimination in an animal, the method comprising administering to the animal a composition comprising a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1.

[0013] Other aspects of the invention relate to use of a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1 for preventing or reducing hairball formation or for promoting hairball elimination in an animal, and to a composition comprising a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1 for use in preventing or reducing hairball formation or for promoting hairball elimination in an animal.

[0014] Sequence overview

[0015] SEQ ID NO: 1 is a protease from Nocardiopsis prasina.

[0016] SEQ ID NO: 2 is a variant of SEQ ID NO: 1.

[0017] Drawing description

[0018] Figure 1 shows a cat hairball treated with a protease according to the invention (right) and a control cat hairball not treated with the protease (left) .

[0019] Figure 2 shows a cat hairball treated with a protease according to the invention compared to cat hairballs treated with several commercially available proteases and a control without protease.

[0020] Definitions

[0021] In accordance with this detailed description, the following definitions apply. Note that the singular forms "a, " "an, " and "the" include plural references unless the context clearly dictates otherwise.

[0022] Unless defined otherwise or clearly indicated by context, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.

[0023] Additive: The term “additive” refers to ingredients added to e.g. pet food to enhance nutritional value, shelf life, taste or appearance. Pet food additives can be categorized into nutritional, technological and sensory additives. Nutritional additives like vitamins and minerals ensure the pet receives essential nutrients, while technological additives like preservatives and antioxidants extend shelf life and maintain quality, and sensory additives, such as flavors and colors, make the food more palatable and appealing to pets and their owners.

[0024] Animal: The term “animal” refers to any kind of animal, including farm animals and pets. However, the invention is especially directed to animals kept as pets (also referred to as “companion animals” ) , including but not limited to cats, dogs, rabbits, guinea pigs and hamsters. In some preferred embodiments, the animal is a cat.

[0025] Animal food: The term “animal food” refers to a food composition designed to be fed to an animal. The animal food may in particular be a “pet food” , i.e. a food composition designed to be fed to a pet animal, for example a cat or a dog. Animal foods, including pet foods, are generally adapted to be fed to a particular animal species, for example cat foods are adapted to be fed to cats and dog foods are adapted to be fed to dogs. An animal food such as a pet food may be of different types, for example dry, wet, semi-moist, raw or freeze-dried, and will normally contain essential nutrients including protein, fat, carbohydrates, vitamins and minerals.

[0026] Protease activity: The term “protease” means an enzyme having peptidase activity (EC 3.4; also known as proteolytic activity or protease activity) that catalyzes the hydrolysis of peptide bonds. The EC 3.4 group includes several sub-groups, including EC 3.4.21 (serine endopeptidase) , which contains further sub-groups, including EC. 3.4.21.62 (subtilisin) . The terms “protease” and “polypeptide having protease activity” are used interchangeably herein. The proteases used herein are commercially available from Novonesis A / Sunder the trade name  Digest. Protease activity may be determined using assay methods known in the art in which a substrate is employed that includes peptide bonds relevant for the specificity of the protease in question. Suitable protease substrates include pNA-substrates such as Suc-AAPF-pNA (available e.g. from Sigma, S-7388) . Another example is Protazyme AK (azurine dyed crosslinked casein prepared as tablets by Megazyme T-PRAK) . A suitable protease activity assay is described in Example 2 of WO 01 / 58276 using Suc-AAPF-pNA.

[0027] Sequence identity: The relatedness between two amino acid sequences or between two nucleotide sequences is described by the parameter “sequence identity” .

[0028] For purposes of the present invention, the sequence identity between two amino acid sequences is determined as the output of “longest identity” using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) as implemented in the Needle program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) , preferably version 6.6.0 or later. The parameters used are a gap open penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 (EMBOSS version of BLOSUM62) substitution matrix. In order for the Needle program to report the longest identity, the -nobrief option must be specified in the command line. The output of Needle labeled “longest identity” is calculated as follows:

[0029] (Identical Residues x 100)  /  (Length of Alignment –Total Number of Gaps in Alignment)

[0030] Supplement: The term “supplement” refers to products designed to provide additional nutrients beyond what is typically found in e.g. a regular pet food. They can help address specific health concerns, support overall well-being, or fill nutritional gaps in a pet’s diet. Pet food supplements are available for various pets, including dogs, cats and others, and come in different forms such as powders, liquids, tablets, chews or capsules.

[0031] Variant: The term “variant” refers to a polypeptide having protease activity comprising at least one substitution, insertion (including extension) and / or deletion (e.g., truncation) at one or more positions compared to the protease of SEQ ID NO: 1. A substitution means replacement of the amino acid occupying a position with a different amino acid; a deletion means removal of the amino acid occupying a position; and an insertion means adding 1-5 amino acids (e.g., 1-3 amino acids, in particular one amino acid) adjacent to and immediately following the amino acid occupying a given position.Detailed Description of the Invention

[0032] As mentioned above, the invention provides a method of preventing or reducing hairball formation or promoting hairball elimination in an animal, the method comprising administering to the animal a composition comprising a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1. In one embodiment, the method of the invention is for preventing hairball formation in an animal. In a related embodiment, the method of the invention is for reducing hairball formation in an animal. In another embodiment, the invention is for promoting hairball elimination in an animal. It will be apparent, however, that these embodiments are not independent of each other, and that the ultimate aim of the invention is to address the problem of hairballs in animals by preventing and / or reducing their formation and / or promoting their elimination.

[0033] The polypeptide having protease activity for any of the uses, methods or compositions disclosed herein preferably has at least 75%sequence identity to SEQ ID NO: 1. More preferably, the polypeptide has at least 80%sequence identity to SEQ ID NO: 1, such as at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%or at least 99%sequence identity. In a particular embodiment, the polypeptide having protease activity has 100%sequence identity to SEQ ID NO: 1. In a particular embodiment, the polypeptide having protease activity has at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 1 and comprises, or consists of, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

[0034] A polypeptide having protease activity and at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1 for use in the present invention may be a wildtype protease polypeptide, e.g. derived from a species of Nocardiopsis or from a different bacterial species. Alternatively, it may be a variant, e.g. a genetically engineered variant, of the polypeptide of SEQ ID NO: 1 having one or more substitutions, insertions and / or deletions compared to SEQ ID NO: 1, where the variant may e.g. have improved stability or improved efficacy compared to a parent protease having SEQ ID NO: 1. Such variants will typically comprise one or more substitutions, for example 1-20 substitutions, e.g. 1-15 or 1-10 substitutions. In a particular embodiment, the variant has a single amino acid substitution relative to SEQ ID NO: 1 and comprises, or consists of, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

[0035] The amount of polypeptide having protease activity in compositions for use in the method of the invention may be determined by persons skilled in the art, e.g. based on the type of animal in which the composition is to be used and the nature of the composition (e.g. animal food, or supplement or additive) . In the case of a pet food, the composition may comprise the polypeptide in an amount of about 0.01-2%by weight, typically about 0.05-1%by weight, for example about 0.1-0.5%by weight, such as about 0.1-0.2%by weight, based on the total weight of the composition. In the case of a supplement or an additive, the amount of polypeptide in the composition will be higher, for example up to about 12%by weight, typically up to about 10%by weight, such as about 1-10%, more typically about 2-10%by weight, such as about 4-8%by weight.

[0036] The method of the invention is contemplated to be suitable for use in any animal in which hairballs may be a problem, but is especially contemplated for use in pets (companion animals) . The invention is in particular suitable for use in cats, both due to their widespread prevalence as pets around the world and due to the fact that hairballs are a common problem in cats. The invention is further contemplated to be useful in other pets in which hairballs may be a problem, for example rabbits, dogs, guinea pigs or hamsters.

[0037] The composition comprising a polypeptide having protease activity for use in the invention may be any composition that is suitable for ingestion by the animal in question, and will typically be a pet food or a pet food supplement or additive. In one preferred embodiment, the composition is a pet food.

[0038] It will be apparent that in the case of a pet food, the pet food will normally be designed for use in a particular animal, for example a cat food will be specially adapted to be fed to cats, a dog food will be specially adapted to be fed to dogs, a rabbit food will be specially adapted to be fed to rabbits, and a guinea pig food will be specially adapted to be fed to guinea pigs. Each of these types of animal foods, including the forms in which they are produced and sold (e.g. dry, wet, etc. ) , the ingredients they contain as well as methods used for producing them, are well-known to persons skilled in the art.

[0039] Information is provided below on cat foods as an exemplary type of animal food in which the polypeptide having protease activity may be used for degradation of hairballs. It should be kept in mind, however, that the methods and compositions of the invention will also be suitable for feeding to animals other than cats, e.g. rabbits, dogs, guinea pigs or hamsters, and that persons skilled in the art will be familiar with pet food compositions and ingredients for these or other animals.

[0040] Cat food comes in several forms, e.g. dry, wet, semi-moist, raw or freeze-dried, which can affect its composition. Dry cat food (kibble) has a low moisture content (around 6-10%) and is typically made from a combination of meat, grains, and other ingredients. Dry cat food has the advantage of being economical, convenient, and having a long shelf life.

[0041] Wet cat food (canned) has a high moisture content of about 70-85%, and is often more palatable and closer to a cat's natural diet. It is typically made with higher amounts of animal-based protein than dry cat food.

[0042] Semi-moist cat food has a moisture content of about 25-35%and is generally made with artificial flavorings and preservatives. Semi-moist cat food is less common today than previously due to health concerns over sugar content and additives.

[0043] Raw or freeze-dried cat food is made from raw ingredients, and is often freeze-dried or frozen for preservation. This mimics a cat's natural diet but must be handled carefully to avoid contamination.

[0044] In addition, there are prescription and specialized diets designed for cats with specific health issues (e.g., urinary tract problems, obesity, kidney disease) .

[0045] Cat foods are formulated to meet the dietary needs of obligate carnivores, with the main components being protein, fat, vitamins and minerals, moisture / water and additives / preservatives.

[0046] Protein, which is essential for cats and other animals including pet animals, is typically obtained from chicken, beef, fish, turkey, lamb, eggs and / or organ meats, and is typically present in an amount of about 30-50%protein on a dry matter basis in quality cat foods. Protein functions to support muscle development, energy and overall health.

[0047] Fat is typically in the form of animal fats, fish oils and / or plant oils (e.g., sunflower or flaxseed oil) , and is usually present in an amount of about 10-30%fat on a dry matter basis. Fat provides energy, supports skin and coat health, and aids in absorption of fat-soluble vitamins.

[0048] Carbohydrates are typically obtained from rice, corn, barley, sweet potatoes, peas, and / or other grains or vegetables. The carbohydrate in cat foods is preferably kept low, as cats have limited ability to digest carbohydrates effectively. Carbohydrates function as an energy source, but are not essential for cats.

[0049] Vitamins and minerals such as taurine, vitamin A, vitamin D, calcium, phosphorus, etc. are often also added to cat foods in order to support e.g. metabolic processes, bone health and immune function.

[0050] Moisture / water is important for hydration, especially for wet foods that have a higher moisture level than dry foods.

[0051] Examples of additives and preservatives that may be added to cat foods include natural preservatives such as vitamin E (tocopherols) and / or synthetic preservatives to maintain freshness, as well as flavor enhancers or additional nutrients.

[0052] While the nutrient proportions in a pet food such as a cat food may vary, a typical appropriate nutrient breakdown for cat food is as follows (approximate percentages on a dry matter basis) :

[0053] ● Protein: at least 30-50%

[0054] ● Fat: 10-30%

[0055] ● Carbohydrates: ideally less than 10%

[0056] ● Fiber: around 2-4%

[0057] In addition to the basic components protein, fat, carbohydrates and fiber, pet food supplements and additives are commonly included in commercial cat foods and other pet foods to enhance nutritional value, improve health or preserve the product. Some common supplements and additives are outlined below.

[0058] Supplements are added to enrich the nutritional profile of pet food or address specific health needs. Common supplements include:

[0059] ● Essential nutrients which are vital for obligate carnivores such as cats, e.g. taurine, omega fatty acids such as omega-3 and omega-6, vitamins such as vitamin A, vitamin D, and B vitamins such as vitamin B12 and B6, and minerals such as calcium, phosphorus, magnesium, potassium, zinc, iron and selenium.

[0060] ● Digestive health supplements, including probiotics, e.g. Lactobacillus acidophilus and Enterococcus faecium, prebiotics such as chicory root, fructooligosaccharides (FOS) and inulin.

[0061] ● Fiber supplements such as beet pulp, psyllium husk or pumpkin.

[0062] ● Joint and bone supplements, useful especially for older cats, for example glucosamine, chondroitin, calcium and phosphorus.

[0063] ● Immune system boosters, including antioxidants such as vitamin C, vitamin E, beta-carotene and selenium, as well as colostrum.

[0064] ● Skin and coat health supplements such as biotin, zinc, and fish oil or krill oil.

[0065] ● Stress and anxiety management supplements such as L-theanine, tryptophan, and valerian root or chamomile.

[0066] Additives are non-nutritive ingredients added for flavor, preservation or texture. These are optional ingredients that can be added to play various important roles in pet food manufacturing.

[0067] Preservatives prevent spoilage and extend shelf life, and can be natural or synthetic. Examples of natural preservatives are vitamin E (tocopherols) , vitamin C (ascorbic acid) and rosemary extract. Examples of synthetic preservatives include BHT (butylated hydroxytoluene) , BHA (butylated hydroxyanisole) and ethoxyquin.

[0068] Flavor enhancers may be added to make the food more palatable for cats. These include natural flavors such as chicken broth, liver powder and fish meal, and artificial flavors such as synthetic meat or fish flavors.

[0069] Color additives may be added to make food more appealing to humans (not cats, as they are largely colorblind) . These include natural colors such as beet juice or turmeric, and artificial colors.

[0070] Texturizers and binders may be added to improve texture and consistency, especially in wet or semi-moist foods. These include gums and starches such as guar gum, carrageenan and xanthan gum.

[0071] In addition, the pet food compositions of the invention may include anti-hairball agents other than the protease disclosed herein. Such agents may help reduce hairball formation by aiding digestion and stool passage, and include e.g. added fiber, for example beet pulp, cellulose or psyllium, as well as fatty acids such as omega-3 or omega-6 fatty acids.

[0072] While typical forms of cat food and ingredients are described above, the methods and compositions of the invention will also be suitable for feeding to animals other than cats, in particular other pets (companion animals) , for example to rabbits, dogs, guinea pigs or hamsters. Persons skilled in the art will be familiar with pet food compositions and ingredients that are suitable for these or other animals, and will readily be able to practice the methods and prepare the compositions disclosed herein for feeding to such other pets or other animals.

[0073] As mentioned above, a further aspect of the invention relates to use of a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1 for preventing or reducing hairball formation or for promoting hairball elimination in an animal. Another aspect of the invention relates to a composition comprising a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1 for use in preventing or reducing hairball formation or for promoting hairball elimination in an animal. It will be apparent that in these aspects, the use or composition may have any of the features described above in relation to the method of the invention. In particular, the polypeptide having protease activity may have any of the features described above in relation to the method, and the composition (e.g. being a pet food such as a cat food or a pet food supplement or additive) may similarly have any of the features described above in relation to the method.

[0074] Another aspect of the invention relates to use of a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1 for reducing fecal malodor in an animal, for example in a pet animal such as a cat, a dog, a rabbit, a guinea pig or a hamster. Fecal malodor in e.g. cats or other pets may be caused by or exacerbated by undigested protein left in post-intestinal tract, which can be a source of nutrition for undesired bacteria. It is therefore contemplated that the polypeptide having protease activity can digest the undigested protein, thereby preventing or reducing fecal malodor.

[0075] Another aspect of the invention relates to use of a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1 for degrading antigen protein in an animal food composition, e.g. a pet food such as a cat food or a dog food, to prevent or reduce allergies; as well as to a method for degrading antigen protein in an animal food composition, e.g. a pet food such as a dog food or a cat food, the method comprising treating the composition with or adding to the composition a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1. Pet food formulations will generally include some amount of plant protein such as soybean protein. It is known that e.g. soybean protein comprises specific proteins that can trigger allergic reactions in some animals, e.g. in dogs and to a lesser extent in cats. It is thus contemplated that the polypeptide having protease activity may be used to degrade protein from e.g. soybean, thereby reducing the risk of allergic reactions in animals.

[0076] It is further contemplated that the protease polypeptide disclosed herein may be useful for degradation of meat protein in a pet food. Cats are obligate carnivores, meaning they biologically require a diet primarily consisting of meat, while dogs are facultative carnivores, meaning they can thrive on a diet that includes both meat and plant matter. However, both dog food and cat food typically contain a substantial proportion of meat protein, and it can be desirable to improve the digestibility of meat protein in e.g. cat food or dog food. A further aspect of the invention thus relates to use of a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1 for degrading meat protein in an animal food composition, in particular a meat-containing pet food such as a cat food or a dog food; as well as to a method for degrading meat protein in an animal food composition, in particular a meat-containing pet food such as a cat food or a dog food, the method comprising adding to the composition a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1.

[0077] In a further aspect, the invention relates to use of a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1 for enzymatic hydrolysis of feather protein, e.g. for use in an animal food composition, for example a pet food such as a cat food or a dog food; as well as a method for performing enzymatic hydrolysis of feather protein, e.g. for use in an animal food composition, for example a pet food such as a cat food or a dog food, the method comprising performing enzymatic hydrolysis of the feather protein using a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1. Feathers from poultry and other birds contain about 80–90%keratin, thus making them a potential protein source for animal feed such as pet food. However, this use is limited by poor digestibility of feather proteins. The protease of the invention can therefore be used as a processing aid by manufacturers of e.g. pet food to allow extraction of protein hydrolysates more efficiently.

[0078] The invention is further illustrated by the non-limiting examples below.

[0079] Examples

[0080] Example 1: Cat hairball degradation proof-of-concept study

[0081] In this example, real cat hair was collected and used to evaluate the ability of a protease enzyme (commercially available from Novonesis A / Sunder the trade name  Digest) to degrade hair in a simulated cat stomach environment.

[0082] Methods

[0083] A hydrochloric acid solution with pH 2 was prepared by adding 100 ml of water to a 250 ml beaker, followed by adding about 1 ml of 1 M HCl to adjust the pH to 2.0±0.2 and mixing.

[0084] A simulated gastric juice solution was prepared by weighing 0.1 g of 2500 IU / ml pepsin and 0.3 g sodium chloride, adding them to the hydrochloric acid solution, and dissolving them by stirring the contents of the beaker using a magnetic stirrer. The solution was then stored at room temperature.

[0085] Cat hair was collected using a brush to collect hair from a pet cat, and the hair was stored in a sealed bag.

[0086] The collected cat hair was rolled into hair balls, 0.1 g each, by hand rolling into a ball with a diameter of about 15 mm.

[0087] Hair was digested by adding a rolled hair ball to the simulated gastric juice solution (one hairball per 40 ml) , shaking ten times to ensure the hair is fully soaked. The simulated gastric juice containing a hairball was heated in a 38℃ water bath, stirring manually every 10 minutes for 2 hours to ensure that the hair is fully soaked.

[0088] After the pepsin reaction for 2 hours, the hair was rinsed in clean water, placed in a 250 ml beaker, and rinsed three times with 100 ml of water.

[0089] A pH 7.0 PBS buffer solution was prepared by weighing 10.90 g Na2HPO4.12H2O and 2.66g NaH2PO4.2H2O, and dissolving in 1000 ml of deionized water, which was adjusted to pH 7.0.

[0090] An enzyme solution was prepared by adding 40 ml of the PBS buffer solution to a 50 ml centrifuge tube, weighing the desired amount of the protease of SEQ ID NO: 1, and adding it to the centrifuge tube, following by shaking until the enzyme was completely dissolved. For this proof-of-concept study, enzyme concentrations of 1-4%were tested, for example adding 0.4 g of enzyme to 40 ml of buffer solution for a 1%enzyme solution.

[0091] Cat hair was added to the enzyme solution, which was then placed in a 38℃ water bath, stirring with a glass rod once every 10 minutes for up to 60 hours. In this example, one hairball was used, although in other experiments more than one hairball (up to eight) were tested.

[0092] The tubes containing cat hairballs were observed regularly for up to 60 hours. Hairball degradation was seen as a darkening of the enzyme solution. In those cases, the hairball was stirred with a glass rod to see if the hair ball breaks. If so, the enzyme solution was poured from tube into a petri dish with a diameter of 10 cm to better observe the condition of hair ball.

[0093] Control hairballs were subjected to the same treatment as described above with the simulated gastric juice solution as well as incubation in the PBS buffer solution but without the protease enzyme.

[0094] Results

[0095] The result of the study described above is shown in Figure 1, where a cat hairball treated with the protease polypeptide of SEQ ID NO: 1 is shown on the right, and a control cat hairball not treated with the protease is shown on the left.

[0096] As seen in Figure 1, treatment with the protease of SEQ ID NO: 1 resulted in complete degradation of the hairball after 46 hours (right petri dish) . In contrast, the control hairball not subjected to treatment with the protease was completely intact after this time (left petri dish) .

[0097] Example 2: Cat hairball degradation study

[0098] In this example, real cat hair was collected and used to evaluate the ability of a protease of the invention (commercially available from Novonesis A / Sunder the trade name  Digest) to degrade hair in a simulated cat gastric and intestinal environment compared to several other commercially available proteases.

[0099] Methods

[0100] A hydrochloric acid solution with a pH of 2 was prepared by adding about 5 ml of 1 M HCl to a flask with 500 ml of water to adjust the pH to 2.0±0.2, followed by mixing.

[0101] A simulated gastric juice solution was prepared by weighing 0.5 g of 2500 IU / ml pepsin and 1.5 g of NaCl, adding them to the flask with the hydrochloric acid solution, and dissolving them by stirring the contents of the flask using a magnetic stirrer. The solution was then stored at room temperature. This solution was divided into 50 ml centrifuge tubes, with 40 ml per tube.

[0102] Proteases were weighed and added to the centrifuge tubes to prepare a 2%enzyme solution, using 0.8 g protease in 40 ml of simulated gastric juice solution. The tubes were shaken until the enzyme was fully dissolved, about 5 minutes, and the pH was adjusted to 2.0±0.2 using 1 M HCl and 1 M NaOH.

[0103] Cat hair was collected from a pet cat using a cat comb. The collected cat hair was rolled into hair balls, 0.4 g each, by hand rolling into a ball with a diameter of about 30 mm. The hair balls were stored at room temperature.

[0104] Hair was digested by adding a rolled hair ball to the simulated gastric juice solution (one 0.4 g hairball per 40 ml) , shaking ten times to ensure the hair is fully soaked. Tubes containing the simulated gastric juice and a hairball were heated in a 38℃ water bath, shaking manually 10 times every 10 minutes for 1 hour to ensure that the hair remains fully soaked during the simulated gastric reaction.

[0105] After the one-hour gastric reaction, 1 M HCl and 1 M NaOH were used to adjust the pH to 7.0±0.2. The enzyme solutions were then placed in a 38℃ water bath for 45 hours for a simulated intestinal reaction, stirring with a glass rod every 30 minutes and adjusting the pH to 7.0±0.2 using 1 M HCl and 1 M NaOH.

[0106] After 45 hours, the solutions were stirred with a glass rod to observe whether the cat hairballs break apart, and the solutions and cat hair were poured into a 10 cm diameter petri dish to observe the condition of the hair.

[0107] The following treatments were used in this study:

[0108] 1. HT300 protease from Honest

[0109] 2. Alkaline protease from VTR Biotech

[0110] 3. Pro protease from IFF

[0111] 4. Neutral protease from Longda

[0112] 5. Papain P164463 from Aladdin Scientific

[0113] 6. Bromelain B4882 from Sigma-Aldrich

[0114] 7. Control (no protease)

[0115] 8. Protease of the invention; SEQ ID NO: 1

[0116] Results

[0117] The result of the study described above is shown in Figure 2, where it is seen that treatment with the protease of the invention (commercially available from Novonesis A / Sunder the trade name Digest) (SEQ ID NO: 1; number 8) resulted in complete degradation of the hairball. In contrast, no effect is seen for the hairballs treated with the six commercially available proteases (number 1-6) or with the control (no protease; number 7) , as these hairballs are completely intact.

Claims

1.A method of preventing or reducing hairball formation or promoting hairball elimination in an animal, the method comprising administering to the animal a composition comprising a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1.2.The method of claim 1, wherein the animal is a pet animal such as a cat, a dog, a rabbit, a guinea pig or a hamster.3.The method of claim 2, wherein the animal is a cat.4.The method of any of the preceding claims, wherein the polypeptide has at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 1.5.The method of any of the preceding claims, wherein the composition is a pet food or a pet food supplement or additive.6.The method of claim 5, wherein the composition is a dry, wet, semi-moist, raw or freeze-dried pet food.7.The method of any of the preceding claims, wherein the composition is a pet food comprising the polypeptide in an amount of about 0.01-2%by weight, about 0.05-1%by weight, about 0.1-0.5%by weight, or about 0.1-0.2%by weight, based on the total weight of the composition; or wherein the composition is a pet food supplement or additive comprising the polypeptide in an amount of up to about 12%by weight, typically up to about 10%by weight, e.g. about 1-10%by weight, about 2-10%by weight, or about 4-8%by weight, based on the total weight of the composition.8.Use of a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1 for preventing or reducing hairball formation or for promoting hairball elimination in an animal.9.Use according to claim 8, wherein the animal is a pet animal such as a cat, a dog, a rabbit, a guinea pig or a hamster.10.Use according to claim 9, wherein the animal is a cat.11.Use according to any of claims 8-10, wherein the polypeptide has at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 1.12.Use according to any of claims 8-11, wherein the polypeptide is administered to the animal in a pet food or a pet food supplement or additive.13.Use according to any of claims 8-12, wherein the polypeptide is administered to the animal in a pet food composition comprising the polypeptide in an amount of about 0.01-2%by weight, about 0.05-1%by weight, about 0.1-0.5%by weight, or about 0.1-0.2%by weight, based on the total weight of the composition; or wherein the polypeptide is administered to the animal in a food supplement or additive comprising the polypeptide in an amount of up to about 12%by weight, typically up to about 10%by weight, e.g. about 1-10%by weight, about 2-10%by weight, or about 4-8%by weight, based on the total weight of the composition.14.A composition comprising a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1 for use in preventing or reducing hairball formation or for promoting hairball elimination in an animal.15.The composition of claim 14, wherein the composition is a pet food, preferably a cat food, or a pet food supplement or additive.16.Use of a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1 for reducing fecal malodor in an animal, preferably wherein the animal is a pet animal such as a cat, a dog, a rabbit, a guinea pig or a hamster.17.Use of a polypeptide having protease activity and having at least 70%sequence identity to SEQ ID NO: 1 for degrading antigen protein in a pet food composition, e.g. for preventing or reducing allergies.

Images