A novel intravitreal gene therapy for neovascular diseases

Abstract

Provided herein relates to the field of biological medicines. Provided are a recombinant AAV(rAAV) particle and use thereof in ophthalmic diseases. The recombinant AAV (rAAV) particle comprises (a) a nucleic acid encoding a polypeptide wherein the polypeptide from N-terminus to C-terminus comprises (i) a first domain that is capable of binding to an angiopoietin; (ii) a second domain derived from VEGFR-1; and (iii) a third domain derived from VEGFR-2; and (b) a capsid protein, wherein the capsid protein is a variant of an AAV2 capsid protein comprising an inserted sequence of VDNASKN at a position between the amino acid positions 587 and 588 of capsid protein VP1 of AAV2. The recombinant AAV (rAAV) particle has a wide application prospect in the treatment of ophthalmic diseases as a safe vector.

Description

A Novel Intravitreal Gene Therapy for neovascular diseasesPRIORITY

[0001] This application claims the benefit of, and priority to, PCT Application No. PCT / CN2024 / 126267, filed October 22 2024, the entire contents of which are hereby incorporated by reference.TECHNICAL FIELD

[0002] The present invention relates to the field of biomedicine, and relates to a recombinant AAV (rAAV) particle and use thereof, particularly in the prevention and / or treatment of ophthalmic diseases.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0003] Neovascular wet Age-Related Macular Degeneration (wAMD) and Diabetic Macular Edema (DME) are devastating diseases causing blindness. wAMD affects > 20 million people worldwide in 2020 and is predicted to be doubled by 2050 (Brightfocus) . DME causes vision impairment in patients with diabetes. The number of adults worldwide with clinically significant DME was estimated to be 18.8 million in 2020 and is expected to increase to 28.6 million in 2045. There are variations in the underlying causes of wAMD and DME, however they do share similar pathophysiology, such as VEGF signaling pathways. Abnormal blood vessels, promoted by VEGF, grow in choroid and penetrate into retina, leak fluid and blood, which may lead to swelling and damage of the macula.

[0004] The success of rAAV-based gene therapy for most ocular diseases depends on efficient delivery of the vector to the photoreceptors (PR) , and / or RPE. While subretinal administration provides the most direct access to the PR and RPE, it is more invasive, with a risk of damage to the retinal tissue. Intravitreal (IVT) injection is a safe, non-surgical procedure and have been widely used for delivery of protein therapeutics to treat common retinal diseases.

[0005] However, the current use of adeno-associated virus as a vector for gene therapy in ocular systems still has the disadvantages of poor tissue specificity, low infection efficiency and the like. Therefore, to achieve accurate gene therapy, an efficient and specific novel recombinant adeno-associated virus vector is required.SUMMARY

[0006] The present invention provides a recombinant AAV (rAAV) particle comprising (a) a nucleic acid encoding a polypeptide wherein the polypeptide from N-terminus to C-terminus comprises (i) a first domain that is capable of binding to an angiopoietin; (ii) a second domain derived from VEGFR-1; and (iii) athird domain derived from VEGFR-2; and (b) a capsid protein, wherein the capsid protein is a variant of a AAV2 capsid protein comprising an inserted sequence of SEQ ID NO: 1 at a position between the amino acid position 587 and 588 of capsid protein VP1 of AAV2.

[0007] In one specific embodiment, wherein the AAV2 capsid protein comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

[0008] In one specific embodiment, wherein the variant of the AAV2 capsid protein comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

[0009] In one specific embodiment, wherein the first domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 20, or the first domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 20.

[0010] In one specific embodiment, wherein the second domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, or the second domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 13.

[0011] In one specific embodiment, wherein the third domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or the third domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 14.

[0012] In one specific embodiment, wherein the polypeptide further comprises (iv) a fourth domain that is capable of binding to VEGFC, the fourth domain is at the N-terminus of the third domain.

[0013] In one specific embodiment, wherein the fourth domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23, or the fourth domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23.

[0014] In one specific embodiment, wherein the first domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, or the first domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 15; the second domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, or the second domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 13; the third domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or the third domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 14.

[0015] In one specific embodiment, wherein the first domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, or the first domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 15; the second domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, or the second domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 13; the third domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or the third domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 14; the fourth domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, or the fourth domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 23.

[0016] In one specific embodiment, wherein the polypeptide further comprises a Fc region of an antibody or a variant thereof.

[0017] In one specific embodiment, wherein the Fc region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 25.

[0018] In one specific embodiment, wherein the polypeptide further comprises a signal peptide, wherein optionally the signal peptide comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.

[0019] In one specific embodiment, wherein the polypeptide further comprises one or more linkers.

[0020] In one specific embodiment, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 or SEQ ID NO: 58, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 or SEQ ID NO: 58.

[0021] In one specific embodiment, the recombinant AAV (rAAV) particle further comprises an AAV 5’ inverted terminal repeat (ITR) , a regulatory sequence which directs expression of the polypeptide, and an AAV 3’ ITR.

[0022] The present invention provides a host cell, characterized in that the host cell is transformed with the rAAV particle as previously described.

[0023] The present invention provides a pharmaceutical composition comprising a) the rAAV particle as previously described; and b) a pharmaceutically acceptable excipient.

[0024] The present invention provides a method of treating disease, the method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the rAAV particle, the host cell, the pharmaceutical composition as previously described.

[0025] In one specific embodiment, the host cell, or the pharmaceutical composition is delivered by intravitreal injection.

[0026] The present invention provides use of the rAAV particle, the host cell, the pharmaceutical composition as previously described in the preparation of a medicament for preventing and / or treating diseases.

[0027] In one specific embodiment, wherein the disease is ophthalmic disease.

[0028] In one specific embodiment, the ophthalmic disease is selected from an RPE layer-related disease, such as dry AMD, wet AMD, or choroidal neovascularization (CNV) ; such as may be selected from age-related macular degeneration (AMD) , choroidal neovascularization (CNV) , choroidal neovascularization membrane (CNVM) , cystoid macular edema (CME) , epiretinal membrane (ERM) , and macular hole; myopia related choroidal neovascularization, vascular streak, retinal detachment, diabetic retinopathy, diabetic macular edema (DME) , atrophic lesion of retinal pigment epithelial cells (RPE) , hypertrophic lesion of retinal pigment epithelial cells (RPE) , retinal vein occlusion, choroidal retinal vein occlusion, macular edema; corneal angiogenesis due to hypoxia, pterygium conjunctiva, subretinal edema, and intraretinal edema; macular edema due to retinal vein occlusion, retinitis pigmentosa, Stargardt disease, glaucoma, inflammatory disease, cataract, refractory anomalies, keratoconus, retinopathy of prematurity, preocular angiogenesis, corneal angiogenesis after keratitis, corneal transplantation, or keratoplasty; such as Leber congenital amaurosis (LCA) , pigment retinal degeneration, and Stargardt disease caused by RPE cell related gene mutation.

[0029] In one specific embodiment, wherein the medicament is used for gene therapy of diseases.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0030] Figure 1 shows a 4-parameter fitting curve of VEGF-A, ANG2, and VEGF-C affinity. Aflibercept and EXG202 target protein were serially diluted, and then added to wells of the microplate coated with VEGF-A (A) , ANG2 (B) , and VEGF-C (C) . HRP-conjugated antibody was then added, followed by color development with TMB. A 4-parameter fitting curve was obtained with the concentrations of Aflibercept and EXG202 as abscissa and the OD450 readings as ordinate.

[0031] Figure 2 shows the expression level of target protein of EXG202 in 293T and ARPE-19 cells with a dose-dependent effect. 293T and ARPE-19 cells were infected with different doses of EXG202 (the multiplicity of infection was 1 × 103, 3.16 × 104, 1 × 104, 3.16 × 104, and 1 × 105 respectively) . After 72 hours, the cell supernatant was collected and the expression level of target protein was determined by ELISA.

[0032] Figure 3 shows a dose-related inhibitory effect of EXG202 on retinal detachment (RD) in adult Tet / opsin / VEGF double transgenic mice delivered by a single intravitreal injection. (A) Adult Tet / Opsin / VEGF double transgenic mice received a single intravitreal injection with different doses of EXG202 (1E7, 3E7, 1E8, 3E8, and 1E9 vg / eye) in the right eye (OD) , and the contralateral left eye (OS) received the negative control vector EXG202-04 (Luc / GFP) expressing luciferase (control group) . The degree of exudative retinal detachment was divided into: no detachment (ND) , partial detachment (PD) , or total detachment (TD) . (B) All dose groups of EXG202 delivered by a single intravitreal injection of EXG202 in the right eyes showed a significant inhibition of RD in mice compared to the fellow eyes received a negative control vector AAV2-Luc (*p< 0.05, ***p<0.0001) .

[0033] Figure 4 shows target protein distribution of EXG202 and AAV2.7m8 in NHP eyes. 50 μL of EXG202 / AAV2.7m8 were administrated into NHP eyes via IVT injection. Aqueous humor, vitreous humor and ocular tissues was collected at week 8 after injection. Levels of target protein expression of EXG202 (A)  / AAV2.7m8 (B) dosed group were determined by ELISA.

[0034] Figure 5 shows target protein expression kinetics of EXG202 and AAV2.7m8 in NHP eyes. 50 μL of EXG202 / AAV2.7m8 were administrated into NHP eyes via IVT injection. Aqueous humor was collected at week 2, 4, 6 and 8 after injection. Levels of target protein expression were determined by ELISA.

[0035] Figure 6 shows an expression box of EXG202.DETAILED DESCRIPTION

[0036] The following description of the disclosure is merely intended to illustrate various embodiments of the disclosure. As such, the specific modifications discussed are not to be construed as limitations on the scope of the disclosure. It will be apparent to one skilled in the art that various equivalents, changes, and modifications may be made without departing from the scope of the disclosure, and it is understood that such equivalent embodiments are to be included herein. All references cited herein, including publications, patents and patent applications are incorporated herein by reference in their entirety.

[0037] The articles “a” , “an” , and “the” are used herein to refer to one or to more than one (i.e., to at least one) of the grammatical object of the article.

[0038] As used herein, the term “about” or “approximately” refers to a quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length that varies by as much as 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1%to a reference quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length. In particular embodiments, the terms “about” or “approximately” when preceding a numerical value indicates the value plus or minus a range of 15%, 10%, 5%, or 1%.

[0039] Throughout this disclosure, unless the context requires otherwise, the words “comprise” , “comprises” and “comprising” will be understood to imply the inclusion of a stated step or element or group of steps or elements but not the exclusion of any other step or element or group of steps or elements. By “consisting of” is meant including, and limited to, whatever follows the phrase “consisting of” . Thus, the phrase “consisting of” indicates that the listed elements are required or mandatory, and that no other elements may be present. By “consisting essentially of” is meant including any elements listed after the phrase, and limited to other elements that do not interfere with or contribute to the activity or action specified in the disclosure for the listed elements. Thus, the phrase “consisting essentially of” indicates that the listed elements are required or mandatory, but that other elements are optional and may or may not be present depending upon whether or not they affect the activity or action of the listed elements.

[0040] Each peptide linker in a polypeptide provided herein may have the same or different length and / or sequence. Each peptide linker may be selected and optimized independently. The length, the degree of flexibility and / or other properties of the peptide linker (s) used in the present fusion proteins may have some influence on properties, including but not limited to the affinity, specificity or avidity for one or more particular target molecules. In some embodiment, a peptide linker comprises flexible residues (such as glycine and serine) so that the adjacent domains are free to move relative to each other. For example, a glycine-serine doublet can be a suitable peptide linker.

[0041] The peptide linker can be of any suitable length. In some embodiments, the peptide linker is at least about any of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, or more amino acids long. In some embodiments, the peptide linker is no more than about any of 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 or fewer amino acids long. In some embodiments, the length of the peptide linker is any of about 1 amino acid to about 10 amino acids, about 1 amino acids to about 20 amino acids, about 1 amino acid to about 30 amino acids, about 5 amino acids to about 15 amino acids, about 10 amino acids to about 25 amino acids, about 5 amino acids to about 30 amino acids, about 10 amino acids to about 30 amino acids long, or about 30 amino acids to about 50 amino acids.

[0042] The peptide linker may have a naturally occurring sequence, or a non-naturally occurring sequence. For example, a sequence derived from the hinge region of heavy chain only antibodies may be used as the linker. See, for example, WO1996 / 34103. In some embodiments, the peptide linker is a flexible linker. In some embodiments, a peptide linker provided herein is a (GxS) n linker, wherein x and n, independently can be an integer between 3 and 12, including 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, or more. Exemplary flexible linkers include but not limited to glycine polymers (G) n, glycine-serine polymers (including, for example, (GS) n, (GSGGS) n, (GGGS) n, and (GGGGS) n, where n is an integer of at least one) , glycinealanine polymers, alanine-serine polymers, and other flexible linkers known in the art. Exemplary peptide linkers are listed in the Table 2.

[0043] In certain embodiments, the fusion proteins described herein comprises amino acid sequences with certain percent identity relative to any one of polypeptides described in below.

[0044] The determination of percent identity between two sequences (e.g., amino acid sequences or nucleic acid sequences) can be accomplished using a mathematical algorithm. A preferred, non-limiting example of a mathematical algorithm utilized for the comparison of two sequences is the algorithm of Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2264 2268 (1990) , modified as in Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873 5877 (1993) . Such an algorithm is incorporated into the NBLAST and XBLAST programs of Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990) . BLAST nucleotide searches can be performed with the NBLAST nucleotide program parameters set, e.g., for score=100, word length=12 to obtain nucleotide sequences homologous to a nucleic acid molecules described herein. BLAST protein searches can be performed with the XBLAST program parameters set, e.g., to score 50, word length=3 to obtain amino acid sequences homologous to a protein molecule described herein. To obtain gapped alignments for comparison purposes, Gapped BLAST can be utilized as described in Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389 3402 (1997) . Alternatively, PSI BLAST can be used to perform an iterated search which detects distant relationships between molecules (Id. ) . When utilizing BLAST, Gapped BLAST, and PSI Blast programs, the default parameters of the respective programs (e.g., of XBLAST and NBLAST) can be used (see, e.g., National Center for Biotechnology Information (NCBI) on the worldwide web, ncbi. nlm. nih. gov) . Another non-limiting example of a mathematical algorithm utilized for the comparison of sequences is the algorithm of Myers and Miller, CABIOS 4: 11-17 (1998) . Such an algorithm is incorporated in the ALIGN program (version 2.0) which is part of the GCG sequence alignment software package. When utilizing the ALIGN program for comparing amino acid sequences, a PAM120 weight residue table, a gap length penalty of 12, and a gap penalty of 4 can be used.

[0045] The percent identity between two sequences can be determined using techniques similar to those described above, with or without allowing gaps. In calculating percent identity, typically only exact matches are counted.

[0046] In some embodiments, amino acid sequence modification (s) of the fusion proteins described herein are contemplated. For example, it may be desirable to optimize the binding affinity and / or other biological properties of the fusion protein, including but not limited to specificity, thermostability, expression level, glycosylation, reduced immunogenicity, or solubility. Thus, in addition to the fusion protein described herein, it is contemplated that variants of the fusion protein described herein can be prepared. For example, peptide variants can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the encoding DNA, and / or by synthesis of the desired polypeptide. Those skilled in the art who appreciate that amino acid changes may alter post-translational processes of the peptide.

[0047] Variations may be a substitution, deletion, or insertion of one or more codons encoding the polypeptide that results in a change in the amino acid sequence as compared with the original polypeptide.

[0048] Amino acid substitutions can be the result of replacing one amino acid with another amino acid having similar structural and / or chemical properties, such as the replacement of a leucine with a serine, e.g., conservative amino acid replacements. Standard techniques known to those of skill in the art can be used to introduce mutations in the nucleotide sequence encoding a molecule provided herein, including, for example, sitedirected mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis which results in amino acid substitutions. Insertions or deletions may optionally be in the range of about 1 to 5 amino acids. In certain embodiments, the substitution, deletion, or insertion includes fewer than 25 amino acid substitutions, fewer than 20 amino acid substitutions, fewer than 15 amino acid substitutions, fewer than 10 amino acid substitutions, fewer than 5 amino acid substitutions, fewer than 4 amino acid substitutions, fewer than 3 amino acid substitutions, or fewer than 2 amino acid substitutions relative to the original molecule. In a specific embodiment, the substitution is a conservative amino acid substitution made at one or more predicted nonessential amino acid residues. The variation allowed may be determined by systematically making insertions, deletions, or substitutions of amino acids in the sequence and testing the resulting variants for activity exhibited by the parental peptides.

[0049] Amino acid sequence insertions include amino-and / or carboxyl-terminal fusions ranging in length from one residue to polypeptides containing multiple residues, as well as intrasequence insertions of single or multiple amino acid residues. Examples of terminal insertions include a polypeptide with an N-terminal methionyl residue.

[0050] Fusion proteins generated by conservative amino acid substitutions are included in the present disclosure. In a conservative amino acid substitution, an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a side chain with a similar charge. As described above, families of amino acid residues having side chains with similar charges have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine) , acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid) , uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine) , nonpolar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan) , beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) . Alternatively, mutations can be introduced randomly along all or part of the coding sequence, such as by saturation mutagenesis, and the resultant mutants can be screened for biological activity to identify mutants that retain activity. Following mutagenesis, the encoded protein can be expressed and the activity of the protein can be determined. Conservative (e.g., within an amino acid group with similar properties and / or side chains) substitutions may be made, so as to maintain or not significantly change the properties.

[0051] Amino acids may be grouped according to similarities in the properties of their side chains (see, e.g., Lehninger, Biochemistry 73-75 (2d ed. 1975) ) : (1) non-polar: Ala (A) , Val (V), Leu (L) , Ile (I) , Pro (P) , Phe (F) , Trp (W) , Met (M) ; (2) uncharged polar: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y) , Asn (N) , Gln (Q) ; (3) acidic: Asp (D) , Glu (E) ; and (4) basic: Lys (K), Arg (R) , His (H) . Alternatively, naturally occurring residues may be divided into groups based on common side-chain properties: (1) hydrophobic: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) neutral hydrophilic: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acidic: Asp, Glu; (4) basic: His, Lys, Arg; (5) residues that influence chain orientation: Gly, Pro; and (6) aromatic: Trp, Tyr, Phe.

[0052] For example, any cysteine residue not involved in maintaining the proper conformation of the polypeptide provided herein also may be substituted, for example, with another amino acid, such as alanine or serine, to improve the oxidative stability of the molecule and to prevent aberrant crosslinking.

[0053] Non-conservative substitutions will entail exchanging a member of one of these classes for another class.

[0054] Amino acid sequence insertions include amino-and / or carboxyl-terminal fusions ranging in length from one residue to polypeptides containing a hundred or more residues, as well as intrasequence insertions of single or multiple amino acid residues. Examples of terminal insertions include a polypeptide with an N-terminal methionyl residue.

[0055] The variations can be made using methods known in the art such as oligonucleotide-mediated (site-directed) mutagenesis, alanine scanning, and PCR mutagenesis. Site-directed mutagenesis (see, e.g., Carter, Biochem J. 237: 1-7 (1986) ; and Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10: 6487-500 (1982) ) , cassette mutagenesis (see, e.g., Wells et al., Gene 34: 315-23 (1985) ) , or other known techniques can be performed on the cloned DNA to produce the polypeptide variant DNA.

[0056] Covalent modifications of the fusion proteins provided herein are included within the scope of the present disclosure. Covalent modifications include reacting targeted amino acid residues of a polypeptide provided herein with an organic derivatizing agent that is capable of reacting with selected side chains or the N-or C-terminal residues of the polypeptide. Other modifications include deamidation of glutaminyl and asparaginyl residues to the corresponding glutamyl and aspartyl residues, respectively, hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of hydroxyl groups of seryl or threonyl residues, methylation of the α-amino groups of lysine, arginine, and histidine side chains (see, e.g., Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties 79-86 (1983) ) , acetylation of the N-terminal amine, and amidation of any C-terminal carboxyl group.

[0057] In some embodiments, the fusion proteins provided herein are chemically modified, for example, by the covalent attachment of any type of molecule to the fusion protein. The polypeptide derivatives may include polypeptide that have been chemically modified, for example, by glycosylation, acetylation, pegylation, phosphorylation, amidation, derivatization by known protecting / blocking groups, proteolytic cleavage, linkage to a cellular ligand or other protein, or conjugation to one or more immunoglobulin domains (e.g., Fc or a portion of an Fc) . Any of numerous chemical modifications may be carried out by known techniques, including, but not limited to, specific chemical cleavage, acetylation, formulation, metabolic synthesis of tunicamycin, etc. Additionally, the polypeptide may contain one or more non-classical amino acids.

[0058] In some embodiments, the fusion protein provided herein is altered to increase or decrease the extent to which the fusion protein is glycosylated. Addition or deletion of glycosylation sites to a polypeptide may be conveniently accomplished by altering the amino acid sequence such that one or more glycosylation sites is created or removed.

[0059] When the fusion provided herein is fused to an Fc region, the carbohydrate attached thereto may be altered. Native antibodies produced by mammalian cells typically comprise a branched, biantennary oligosaccharide that is generally attached by an N-linkage to Asn297 of the CH2 domain of the Fc region. See, e.g., Wright et al. TIBTECH 15: 26-32 (1997) . The oligosaccharide may include various carbohydrates, e.g., mannose, N-acetyl glucosamine (GlcNAc) , galactose, and sialic acid, as well as a fucose attached to a GlcNAc in the “stem” of the biantennary oligosaccharide structure. In some embodiments, modifications of the oligosaccharide in the binding molecules provided herein may be made in order to create variants with certain improved properties.

[0060] In molecules that comprise a Fc region, one or more amino acid modifications may be introduced into the Fc region, thereby generating an Fc region variant. The Fc region variant may comprise a human Fc region sequence (e.g., a human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 Fc region) comprising an amino acid modification (e.g. a substitution) at one or more amino acid positions.

[0061] In some embodiments, the present application contemplates variants that possesses some but not all effector functions, which make it a desirable candidate for applications in which the half life of the binding molecule in vivo is important yet certain effector functions (such as complement and ADCC) are unnecessary or deleterious. In vitro and / or in vivo cytotoxicity assays can be conducted to confirm the reduction / depletion of CDC and / or ADCC activities. For example, Fc receptor (FcR) binding assays can be conducted to ensure that the binding molecule lacks FcγR binding (hence likely lacking ADCC activity) , but retains FcRn binding ability. Non-limiting examples of in vitro assays to assess ADCC activity of a molecule of interest is described in U.S. Patent No. 5,500,362 (see, e.g. Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83: 7059-7063 (1986) ) and Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985) ; 5, 821, 337 (see Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987) ) . Alternatively, non-radioactive assays methods may be employed (see, for example, ACTITM non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; and CytoTox non-radioactive cytotoxicity assay (Promega, Madison, WI) . Useful effector cells for such assays include peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and Natural Killer (NK) cells. Alternatively, or additionally, ADCC activity of the molecule of interest may be assessed in vivo, e.g., in an animal model such as that disclosed in Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95: 652-656 (1998) . C1q binding assays may also be carried out to confirm that the binding molecule is unable to bind C1q and hence lacks CDC activity. See, e.g., C1q and C3c binding ELISA in WO 2006 / 029879 and WO 2005 / 100402. To assess complement activation, a CDC assay may be performed (see, for example, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996) ; Cragg, M. S. et al., Blood 101: 1045-1052 (2003) ; and Cragg, M. S. and M.J. Glennie, Blood 103: 2738-2743 (2004) ) . FcRn binding and in vivo clearance / half life determinations can also be performed using methods known in the art (see, e.g., Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18 (12) : 1759-1769 (2006)) .

[0062] Binding molecules with reduced effector function include those with substitution of one or more of Fc region residues 238, 265, 269, 270, 297, 327 and 329 (U.S. Patent No. 6,737,056) . Such Fc mutants include Fc mutants with substitutions at two or more of amino acid positions 265, 269, 270, 297 and 327, including the so-called “DANA” Fc mutant with substitution of residues 265 and 297 to alanine (US Patent No. 7,332,581) .

[0063] Certain variants with improved or diminished binding to FcRs are described. (See, e.g., U.S. Patent No. 6,737,056; WO 2004 / 056312, and Shields et al., J. Biol. Chem. 9 (2) : 6591-6604 (2001) . )

[0064] In some embodiments, a variant comprises an Fc region with one or more amino acid substitutions which improve ADCC, e.g., substitutions at positions 298, 333, and / or 334 of the Fc region (EU numbering of residues) .

[0065] In some embodiments, alterations are made in the Fc region that result in altered (i.e., either improved or diminished) C1q binding and / or Complement Dependent Cytotoxicity (CDC) , e.g., as described in US Patent No. 6,194,551, WO 99 / 51642, and Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) .

[0066] Binding molecules with increased half lives and improved binding to the neonatal Fc receptor (FcRn) , which is responsible for the transfer of maternal IgGs to the fetus (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994) ) , are described in US2005 / 0014934A1 (Hinton et al. ) . Those molecules comprise an Fc region with one or more substitutions therein which improve binding of the Fc region to FcRn. Such Fc variants include those with substitutions at one or more of Fc region residues: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 or 434, e.g., substitution of Fc region residue 434 (US Patent No. 7,371,826) . See also Duncan &Winter, Nature 322: 738-40 (1988) ; U.S. Patent No. 5,648,260; U.S. Patent No. 5,624,821; and WO 94 / 29351 concerning other examples of Fc region variants.

[0067] In some embodiments, it may be desirable to create cysteine engineered polypeptides, in which one or more residues of a polypeptide are substituted with cysteine residues. In some embodiments, the substituted residues occur at accessible sites of the peptide. By substituting those residues with cysteine, reactive thiol groups are thereby positioned at accessible sites of the peptide and may be used to conjugate the peptide to other moieties, such as drug moieties or linker-drug moieties, to create an immunoconjugate, as described further herein.

[0068] As used herein, the term "subject" includes any human or nonhuman animal. The term "nonhuman animal" includes all vertebrates, e.g., mammals and non-mammals, such as cynomolgus, nonhuman primates, sheep, dogs, cats, horses, cows, chickens, amphibians, reptiles, etc. Except when noted, the terms "patient" or "subject" are used interchangeably.

[0069] The terms "treatment" and "therapeutic method" refer to both therapeutic treatment and prophylactic / preventative measures. Those in need of treatment may include individuals already having a particular medical disorder as well as those who may ultimately acquire the disorder.

[0070] In another aspect, provided herein are methods for using and uses of the viral particles (rAAV) provided herein.

[0071] Such methods and uses include therapeutic methods and uses, for example, involving administration of the molecules, rAAV or compositions containing the same, to a subject having a disease or disorder. In some embodiments, the molecule, viral particle, and / or composition is administered in an effective amount to effect treatment of the disease or disorder. Uses include uses of the fusion proteins or viral particles in such methods and treatments, and in the preparation of a medicament in order to carry out such therapeutic methods. In some embodiments, the methods are carried out by administering the fusion proteins or viral particles, or compositions comprising the same, to the subject having or suspected of having the disease or condition. In some embodiments, the methods thereby treat the disease or disorder in the subject.

[0072] In some embodiments, the treatment provided herein cause complete or partial amelioration or reduction of a disease or disorder, or a symptom, adverse effect or outcome, or phenotype associated therewith. Desirable effects of treatment include, but are not limited to, preventing occurrence or recurrence of disease, alleviation of symptoms, diminishment of any direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing metastasis, decreasing the rate of disease progression, amelioration or palliation of the disease state, and remission or improved prognosis. The terms include, but do not imply, complete curing of a disease or complete elimination of any symptom or effect (s) on all symptoms or outcomes.

[0073] As used herein, in some embodiments, the treatment provided herein delay development of a disease or disorder, e.g., defer, hinder, slow, retard, stabilize, suppress and / or postpone development of the disease (such as cancer or an eye disease) . This delay can be of varying lengths of time, depending on the history of the disease and / or individual being treated. As is evident to one skilled in the art, a sufficient or significant delay can, in effect, encompass prevention, in that the individual does not develop the disease or disorder.

[0074] In other embodiments, the method or the use provided herein prevents a disease or disorder. In some embodiments, the disease or disorder is associated with VEGF and / or angiopoietin. In some embodiments, the disease or disorder is associated with angiogenesis.

[0075] The diseases or disorders herein include, but not limited to, inflammatory disease, ocular disease, autoimmune disease, or cancer. In some embodiments, the disease or disorder is selected from a group consisting of rheumatoid arthritis, inflammatory arthritis, osteoarthritis, cancer, age-related macular degeneration (AMD) (such as wet AMD or dry AMD) , ocular disease characterized by neovascularization (such as choroidal neovascularization) , uveitis (such as anterior uveitis or posterior uveitis) , retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. In some embodiments, the disease or disorder is age-related macular degeneration (AMD) (such as wet AMD or dry AMD) .

[0076] In some embodiments, treatment using the fusion protein or the rAAV comprising a nucleic acid encoding the fusion protein leads to lower level of lesion than no treatment or treatment using negative control in an CNV animal model. In some embodiments, the CNV animal model is a mouse model. In some embodiments, the lesion is a Grade 3 lesion whereas the angiograms were graded as follows: score 0, no staining; score 1, slightly stained; score 2, moderately stained; and score 3, strongly stained. In some embodiments, treatment using the fusion protein or the rAAV comprising a nucleic acid encoding the fusion protein leads to lower level of lesion than the treatment using a reference agent in an CNV animal model. In some embodiments, the reference agent is an agent treating AMD. In some embodiments, the reference agent is known drug treating AMD. In some embodiments, treatment using the fusion protein or the rAAV comprising a nucleic acid encoding the fusion protein inhibits late stage CNV lesion.

[0077] In some embodiments, the fusion protein provided herein binds to VEGF-A. In some embodiments, the fusion protein provided herein binds to Ang2. In some embodiments, the fusion protein provided herein binds to VEGF-C. In some embodiments, the fusion protein provided herein binds to any two of VEGF-A, Ang2 and VEGF-C. In some embodiments, the fusion protein provided herein binds to all three of VEGF-A, Ang2 and VEGF-C.

[0078] In some embodiments, the disease or disorder is an autoimmune disease, such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, vasculitis (inflammation of the blood vessels) , polyneuropathy, cutaneous ulceration, visceral infarction, pleuritis, interstitial fibrosis, Caplan's syndrome, pleuropulmonary nodules, pneumonitis, rheumatoid lung disease or arteritis.

[0079] In certain embodiments, the disease or disorder is an inflammatory disease, such as inflammatory arthritis, osteoarthritis, psoriasis, chronic inflammation, irritable bowel disease, lung inflammation or asthma.

[0080] In some embodiments, the disease or disorder is cancer including blood cancer and solid tumor cancer. In some embodiments, the cancer is prostate cancer, breast cancer, lung cancer, esophageal cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, urinary tract cancer (e.g., bladder cancer) , kidney cancer, lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer) , ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, thyroid cancer, skin cancer (e.g., melanoma) , hematopoietic cancers of lymphoid or myeloid lineage, head and neck cancer, nasopharyngeal carcinoma (NPC) , glioblastoma, teratocarcinoma, neuroblastoma, adenocarcinoma, cancers of mesenchymal origin such as a fibrosarcoma or rhabdomyosarcoma, soft tissue sarcoma and carcinoma, choriocarcinioma, hepatoblastoma, Karposi's sarcoma or Wilm's tumor.

[0081] Other diseases that are associated with angiogenesis can be treated with the methods and compositions disclosed herein, including but not limited to, atherosclerosis, retrolentral fibroplasia, thyroid hyperplasias (including grave's disease) , nephrotic syndrome, preclampasia, ascites, pericardial effusion (such as associated with pericarditis) and pleural effusion.

[0082] In some embodiments, the methods and compositions provided herein can be used to treat an ocular or eye disease or disorder. In some embodiments, the eye disease is uveitis, retinitis pigmentosa, neovascular glaucoma, diabetic retinopathy (DR) (including proliferative diabetic retinopathy) , ischemic retinopathy, intraocular neovascularization, age-related macular degeneration (AMD) including wet AMD and dry AMD, retinal neovascularization, diabetic macular edema (DME) , diabetic retina ischemia, diabetic retinal edema, retinal vein occlusion (including central retinal vein occlusion and branched retinal vein occlusion) , or macular edema, macular edema following retinal vein occlusion (RVO) . In some embodiments, the compositions or methods provide herein treat or prevent one or more symptoms of an eye disease including, but not limited to, formation of ocular drusen, inflammation in the eye or eye tissue and loss of vision.

[0083] In certain specific embodiments, the methods and compositions provided herein are used to treat AMD. AMD is characterized by progressive loss of central vision which occurs as a result of damage to the photoreceptor cells in an area of the retina called the macula. AMD has been broadly classified into two clinical states: a wet form and a dry form. It is generally accepted that the wet form of AMD is preceded by and arises from the dry form. Dry AMD is characterized by the formation of macular drusen, tiny yellow or white accumulations of extracellular material that builds up between Bruch's membrane and the retinal pigment epithelium of the eye. Wet AMD, which accounts for most of serious vision loss, is associated with neovascularization, wherein blood vessels grow up from the choroid beneath the retina, and with the leakage of these new vessels. The accumulation of blood and fluid can cause retinal detachment followed by rapid photoreceptor degeneration and loss of vision in either form of AMD.

[0084] The pharmaceutical compositions described herein can be administered to an individual by any route, e.g., intravascularly (e.g., intravenously (IV) or intraarterially) , directly into arteries, systemically (for example by intravenous injection) , or locally (for example by intraarterial or intraocular injection) . Non-limiting exemplary adminstartion methods include intravenous (e.g., by infusion pumps) , intraperitoneal, intraocular, intraarterial, intrapulmonary, oral, inhalation, intravesicular, intramuscular, intra-tracheal, subcutaneous, intraocular, intrathecal, transdermal, transpleural, intraarterial, topical, inhalational (e.g., as mists of sprays) , mucosal (such as via nasal mucosa) , subcutaneous, transdermal, gastrointestinal, intraarticular, intracisternal, intraventricular, intracranial, intraurethral, intrahepatic, intratumoral, intravitreal and subretinal injection.

[0085] In some embodiments, the compositions are administered directly to the eye or the eye tissue, e.g., via intravitreal or subretinal injection. In some embodiments, the compositions are administered topically to the eye, for example, in eye drops. In some embodiments, the compositions are administered by injection to the eye (intraocular injection) or to the tissues associated with the eye. The compositions can be administered, e.g., by intraocular injection, periocular injection, subretinal injection, intravitreal injection, trans-septal injection, subscleral injection, intrachoroidal injection, intracameral injection, subconjunctival injection, sub-Tenon's injection, retrobulbar injection, peribulbar injection, or posterior juxtascleral delivery.

[0086] he compositions may be administered, e.g., to the vitreous, aqueous humor, sclera, conjunctiva, the area between the sclera and conjunctiva, the retina choroids tissues, macula, or other area in or proximate to the eye of an individual. The compositions can also be 182211301FF -103-administered to the individual as an implant, such as biocompatible and / or biodegradable sustained release formulations which gradually release the compounds over a period of time. The compositions can also be administered to the individual using iontophoresis.

[0087] The effective amount of the compositions can be determined empirically by those skilled in the art and depends on the type and severity of the disease, route of administration, disease progression and health, etc. For example, when administered intraocularly, a rAAV comprising a nucleic acid encoding a fusion protein described herein can be administered to a subject at a dose of 1x108 to 1x1015 vector genomes (vg) , such as 1x109 to 1x1011 vector genomes (vg) or 1x1011 to 1x1013 vector genomes (vg) , and including, e.g., 1x1010 , 2x1010 , 3x1010 , 4x1010 , 5x1010 , 6x1010 , 7x1010 , 8x1010 , 9x1010 , 1x1011 , 2x1011 , 3x1011 , 4x1011 , 5x1011 , 6x1011 , 7x1011 , 8x1011 , 9x1011 , 1x1012 , 2x1012 , 3x1012 , 4x1012 , 5x1012 , 6x1012 , 7x1012 , 8x1012 , 9x1012 , 1x1013 , 2x1013 , 3x1013 , 4x1013 , 5x1013 , 6x1013 , 7x1013 , 8x1013, 9x1013 , 1x1014 , 2x1014 , 3x1014 , 4x1014 , 5x1014 , 6x1014 , 7x1014 , 8x1014 9x1014 vector genomes (vg) .

[0088] In some embodiments, an unit dose comprises a volume that is not more than 1 mL. In some embodiments, an unit dose comprises a volume that is not more than 0.5-1.0 mL. In some embodiments, an unit dose comprises a volume that is not more than 0.5 mL. In some embodiments, an unit dose comprises a volume that is not more than 500 μL.

[0089] Pharmaceutical compositions comprising a fusion protein may be administered in a single daily dose, or the daily dose may be administered in divided dosages of two, three, or four times daily. Compositions comprising a fusion protein can also be administered multiple times (e.g., twice, three times, four times, or five times) within a time period (e.g., 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 11 months, 1 year, 2 years, or 3 years) .

[0090] Pharmaceutical compositions comprising a rAAV comprising a nucleic acid encoding a fusion protein can be administered less frequently, e.g., once every three months, every four months, once every five months, once every six months, once every seven months, once every eight months, once every nine months, once every ten months, once every eleven months, once every year, once every two years, once every three years, once every 4 years, once every 5 years, or even less frequent. In some embodiments, a single dose of a composition comprising a rAAV comprising a nucleic acid encoding a fusion protein described herein is administered.

[0091] In some embodiments, the pharmaceutical composition provided herein is a suspension, e.g., a refrigerated suspension. In some embodiments, the method further comprises agitating the suspension to ensure even distribution of the suspension prior to the administration step. In some embodiments, the method further comprises warming the pharmaceutical composition to room temperature prior to the administration step.

[0092] The compositions may also be administered in a sustained release formulation. The sustained release devices (such as pellets, nanoparticles, microparticles, nanospheres, microspheres, and the like) may be administered by injection or surgical implanted in various locations in the eye or tissue associated with the eye, such as intraocular, intravitreal, subretinal, periocular, subconjunctival, or sub-tenons.

[0093] The fusion protein or the rAAV comprising a nucleic acid encoding the fusion protein or pharmaceutical composition comprising same can be used either alone or in combination with one or more additional therapeutic agents or other therapies. Exemplary additional therapeutic agents include complement inhibitors, anti-angiogenics, and antiVEGF agents, such as trebananib, and conbercept. In some embodiments, a combination is provided as a simultaneous administration, wherein a fusion protein or a rAAV comprising a nucleic acid encoding a fusion protein and at least one therapeutic agent is administered together in the same composition or administered simultaneously in different compositions. In some embodiments, a combination is provided as a separate administration, wherein the administration of a fusion protein or a rAAV comprising a nucleic acid encoding a fusion protein can occur prior to, simultaneously, and / or following administration of at least one therapeutic agent. EXAMPLES EXAMPLES Example 1: Constructions of EXG202 AAV Vectors Comprising the Nucleic Acid Encoding the Fusion Proteins

[0094] We constructed a recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing a fusion protein with angiopoietin-binding domain and VEGF receptor (ABD-VEGFR) . The vector contains AAV serotype 2 inverted terminal repeats and an expression cassette composed of a cytomegalovirus (CMV) enhancer / chicken beta actin promoter (CBA) , the ABD-VEGFR cDNA and a bovine growth hormone (bGH) polyadenylation sequence (see Figure 6) . The vector genome of EXG202 is packaged in a novel AAV2 variant capsid. In addition, control vectors, AAV2.7m8, EXG202-04 (Luc / GFP) (negative control) was also included in the study. AAV2.7m8 is a rAAV vector containing the same transgene expression cassette as that of EXG202 but packaged in AAV2.7m8 capsid. EXG202-04 (Luc / GFP) (negative control) is a rAAV vector containing luciferase-GFP transgene expression cassette but packaged in the capsid as that of EXG202. These sequences are provided in Table 1. All rAAV vectors used in the study were manufactured using plasmid transient transfection in HEK293 cells.

[0095] Exemplary fusion proteins according to the present disclosure were polypeptide 1 to polypeptide 13 in the Table 2 and 3. Specifically, these fusion proteins comprise three binding domains-one derived from VEGFR-1 (i.e., the IgG-like domain 2 of VEGFR-1) , one derived from VEGFR-2 (i.e., the IgG like domain 3 of VEGFR-2) , and one domain capable of binding to an angiopoietin (e.g., angiopoietin 1 and angiopoietin 2) . An Flt-1 signal domain was also included at the N-terminus in these exemplary constructs. In certain constructs, the fusion protein further comprises an Fc fragment of human IgG. Additional exemplary fusion proteins according to the present disclosure were constructed. These additional constructs comprise an additional VEGF binding domain, i.e., a VEGFC binding domain (Trap C) . These fusion proteins further comprise an Fc fragment of human IgG. An Flt-1 signal domain was also included at the N-terminus in these exemplary constructs. These sequences for these exemplary domains and exemplary fusion proteins are provided in Table 2.

[0096] Specifically, the EXG202 recombinant adeno-associated viral vector of the present disclosure comprises a fusion protein expressing polypeptide 12 (SEQ ID NO: 57) . The fusion proteins comprise four binding domains-the first domain derived from VEGFR-1 (SEQ ID NO: 13) , the second domain derived from VEGFR-2 (SEQ ID NO: 14) , the third domain domain capable of binding to an angiopoietin (SEQ ID NO: 15) , and the fourth domain derived from VEGFR-3 (Trap C (3) , SEQ ID NO: 23) . An Flt-1 signal domain (SEQ ID NO: 26) was also included at the N-terminus in the fusion protein and the fusion protein further comprises an Fc fragment of human IgG (SEQ ID NO: 24) . The various parts of the fusion protein connected by linkers.

[0097] Recombinant EXG202, EXG202-04 (Luc / GFP) , AAV2.7m8 vectors were produced by transient transfection in HEK293 cells. Cells were cultured in DMEM supplemented with FBS and were maintained at 37℃. in a 5%CO2 environment. Cells were triply transfected (payload, capsid, and helper plasmids) using polyethylenimine (PEI) . 72 hours post-transfection, viral particles were harvested from cells and / or supernatant. Cell lysate and / or supernatant was purified by iodixanol gradient ultracentrifugation. Purified rAAV was then formulated into DPBS with 0.005%F-68, sterile filtered, and filled to yield rAAV product.

[0098] Table 1: Vector element sequence information

[0099] Table 2: Fusion proteins sequence information

[0100] Table 3: Nucleic Acid Sequences for the Fusion Proteins Example 2. In Vitro Substrate Affinity of EXG202 target protein

[0101] The substrate affinity of the EXG202 target protein to VEGF-A, ANG2, and VEGF-C was assessed respectively.

[0102] The saturation concentration method was employed to determine the substrate affinity of EXG202 target protein. EXG202 target protein was serially diluted and added to wells of microplate coated with substrate protein (VEGF-A, ANG2, or VEGF-C) . The OD450 value corresponding to the concentration of EXG202 target protein was collected and processed (absorbance value was positively correlated with concentration) . When the OD450 value of EXG202 target protein is a half of the highest OD450, the concentration value (EC50) corresponding to the substrate is the Kd value of the substrate relative to EXG202.

[0103] Analytical method of VEGF-Aconjugated protein by ELISA: Wells of polystyrene microplate are coated with VEGF-A (capture protein) . After blocking with 5%nonfat milk, the serially diluted EXG202 target protein is added and incubated. Then the HRP-labeled secondary antibody (Goat Anti-Human IgG Fc) is added, followed by addition of the substrate TMB that changes color in the presence of HRP. Substrate affinity curve between concentration and value of Absorbance (OD450nm) was established.

[0104] Analytical method of ANG2 conjugated protein by ELISA: Wells of polystyrene microplate are coated with ANG2 (capture protein) . After blocking with 5%nonfat milk, the serially diluted EXG202 target protein is added and incubated. Then the HRP-labeled secondary antibody (Goat Anti-Human IgG Fc) is added, followed by addition of the substrate TMB that changes color in the presence of HRP. Substrate affinity curve between concentration and value of Absorbance (OD450nm) was established.

[0105] Analytical method of VEGF-C conjugated protein by ELISA: Wells of polystyrene microplate are coated with VEGF-C (capture protein) . After blocking with 5%nonfat milk, the serially diluted EXG202 target protein is added and incubated. Then the HRP-labeled secondary antibody (Goat Anti-Human IgG Fc) is added, followed by addition of the substrate TMB that changes color in the presence of HRP. Substrate affinity curve between concentration and value of Absorbance (OD450nm) was established.

[0106] The results are shown in Figure 1. EXG202 target protein has the ability to bind VEGF-A, ANG2 and VEGF-C. The affinity of EXG202 target protein to bind VEGF-A(EC50: 0.1331 nM) is comparable to that of Aflibercept (EC50: 0.09758 nM) . aflibercept showed minimal VEGF-C affinity at very high concentrations. Example 3. EXG202 protein is Expressed in a dose dependent manner in 293T and ARPE19 Cells

[0107] Protein Expression of EXG202 was assessed in transfected HEK293T and ARPE-19 cells. Using different MOI (1×103, 3.16×103, 1×104, 3.16×104, 1×105vg / cell) of EXG202 to infect 293T and ARPE-19 cells respectively, no treatment as the negative control (cells in 2 replicate wells were infected with each dose of virus simultaneously) . 72 hours post-infection, the cell supernatants of each well were collected, and the expression level of target proteins was determined by ELISA in each dose of infection group.

[0108] Table 4: Study design of in Vitro Pharmacology of EXG202

[0109] Analytical method of EXG202 target protein by ELISA: Wells of polystyrene microplate are coated with VEGF-A (capture protein) . After blocking with 5%nonfat milk, the test sample, positive control, negative control, or the reference standard are added and incubated. Then the HRP-labeled secondary antibody (Goat Anti-Human IgG Fc) is added, followed by addition of the substrate TMB that changes color in the presence of HRP. The concentration of target protein in the test samples is calculated based on the optical absorbance (OD450 nm) of test samples and the formula generated from reference standard curve.

[0110] The results are shown in Figure 2.293T and ARPE-19 cells with no treatment (NC) had no expression level of target protein, excluding the interference of background values. Both 293T and ARPE-19 cells infected with EXG202 could express the target protein. The multiplicity of infection of EXG202 was in the range of 1 × 103 to 1 × 105, and the expression level of target protein was positively correlated with the multiplicity of infection, which showed a certain dose effect. Expression level of EXG202 target protein was positively correlated with the multiplicity of infection (MOI) , which showed a certain dose-dependent effect. Example 4. Dose Range Finding Study of EXG202 in Tet / Opsin / VEGF mouse 4.1. Test System and Study Design

[0111] The test system is the Tet / opsin / VEGF double transgenic mouse model (Ohno-Matsui, K., et al., Inducible expression of vascular endothelial growth factor in adult mice causes severe proliferative retinopathy and retinal detachment. Am J Pathol, 2002. 160 (2) : p. 711-9. ) . The tetracycline-inducible promoter system (Tet / on system) was employed to generate double transgenic mice with doxycycline-inducible expression of human VEGF165 in photoreceptors (Tet / opsin / VEGF mice) . These mice are completely normal until they are given doxycycline which turns on the expression of VEGF in photoreceptors. 50 mg / kg by subcutaneous injection daily for 3 days consecutively results in high expression of VEGF in photoreceptors (at least 30-fold higher than that seen in rho / VEGF mice) and results in very severe neovascular (NV) and massive leakage causing total exudative retinal detachment in 80-90%of mice within 5 days (Ohno-Matsui, K., et al., Inducible expression of vascular endothelial growth factor in adult mice causes severe proliferative retinopathy and retinal detachment. Am J Pathol, 2002. 160 (2) : p. 711-9; Nambu, H., et al., Angiopoietin 1 inhibits ocular neovascularization and breakdown of the blood-retinal barrier. Gene Ther, 2004. 11 (10) : p. 865-73; Takahashi, K., et al., Intraocular expression of endostatin reduces VEGF-induced retinal vascular permeability, neovascularization, and retinal detachment. FASEB J, 2003. 17 (8) : p. 896-8; Dong, A., et al., Antagonism of PDGF-BB suppresses intravitreal neovascularization and enhances the effects of blocking VEGF-A. Angiogenesis, 2014. 17 (3) : p. 553-62. ) . Retinal detachment (RD) provides a great outcome measure to test efficacy in this model and the severe phenotype has proven extremely useful to distinguish between treatments that are moderately effective and those that are very effective. The phenotype and mechanism behind it are relevant to that of neovascular age-related macular degeneration (NV AMD) . This model has been widely used for efficacy evaluation for anti-NV drug candidates, including Ranibizumab (Miki, K., et al., Effects of intraocular ranibizumab and bevacizumab in transgenic mice expressing human vascular endothelial growth factor. Ophthalmology, 2009. 116 (9) : p. 1748-54. ) , Bevacizumab (Miki, K., et al., Effects of intraocular ranibizumab and bevacizumab in transgenic mice expressing human vascular endothelial growth factor. Ophthalmology, 2009. 116 (9) : p. 1748-54. ) , and AAV8-antiVEGFfab (RGX-314) (Liu, Y., et al., AAV8-antiVEGFfab Ocular Gene Transfer for Neovascular Age-Related Macular Degeneration. Mol Ther, 2018. 26 (2) : p. 542-549. ) which is now in Phase III clinical development.

[0112] Test articles, control vectors and vehicle / diluent are listed in Table 5. The vectors and vehicle / diluents were stored on ice once thawed. Test article formulations were prepared in a BSC by the investigators in the lab before animal dosage, according to the study design (Table 5) . Vials of the test articles EXG202 (Lot#L2402014, 2.81 x 1013 vg / mL) and negative control vector EXG202-04 (Luc / GFP) (Lot #L2402003, 2 x 1013 vg / mL) were obtained from a freezer (≤ -65℃) and thawed in gloved hands. Thawed test articles were placed on wet ice and then diluted with vehicle / diluent (Lot #L2403037) to the required concentrations and kept on ice and used for animal injection within 3 hours of preparation.

[0113] Table 5: A list of AAV vectors and diluent used in the study

[0114] The objective of this study was to evaluate the efficacy of EXG202 at different doses delivered via intravitreal injection. Tet / opsin / VEGF double transgenic mice, at ages between 2 to 6 months were randomly assigned to 5 groups (7 ～ 9 animals per group) and received EXG202 at doses of 1x109, 3 x108, 1x108, 3x107, and 1x107 in one eye (right eye, OD) at a volume of 1.0 μL, and the negative control EXG202-04 (Luc / GFP) at the same dose in the contralateral eye (left eye, OS) . Four weeks post injection, the mice were given a subcutaneous injection of Doxycycline (50 mg / kg) daily for 3 days. In-life assessment include monitoring for any signs of pain, distress or suffering in order to ensure good health. Mice were anesthetized on the Day 4 after doxycycline induction for exudative retinal detachment (RD) assessment. Assessments included fundus photography with a Micron III Retinal Imaging Microscope, retinal detachment grading (no, partial, or total exudative retinal detachment) , and histology if needed. Design of the dose range finding study of EXG202 is shown in Table 6.

[0115] Table 6: Design of the Dose Range Finding Study of EXG202 a Number of informative animals that exhibit exudative retinal detachment in the left eye received negative control vector AAV-Luc 4 days after doxycycline induction at 50 mg / kg for 3 days.b Animals were dosed in each eye via intravitreal injection on Study Day 1 at a volume of 1 μL / eye.c Doxycycline induction was done via subcutaneous injection of Doxycycline at 50 mg / kg for 3 days. 4.2. Dose Administration

[0116] Kwik-Fill Borosilicate glass capillaries (World Precision Instrument, Florida, USA) were pulled using program 0 by Flaming / Brown Micropipette Puller (Sutter Instrument, USA) . Fine tip capillaries were sharpened by around 8 μm diameter using BV-10 Micropipette Beveler Basic System. Injection volume from were calibrated by exact 1μl per injection using Model PLI-100A Pico-Injector (Harvard Apparatus, USA) .

[0117] Adult male TV / Opsin VEGF transgenic mice were anesthetized with ketamine / xylazine, and local anesthesia of the eyes were performed with one drop of proparacaine. Eyes were exposed and injections were performed about 1.5 mm behind the limbus at 45 degrees under Carl Zeiss Anatomic Microscope. After injection, eyes were dropped antibiotic ointment to avoid the corneal dry. No additional medication was applied to the animals except the Topical triple antibiotic ointment right after AAV vector injection.

[0118] Cage side observation was conducted daily for all study animals during the in-life period. Ophthalmic examination was performed on the day of dosage, before and after intravitreal injection, the day starting doxycycline induction, and at the endpoint. 4.3. Retinal detachment assessment

[0119] Four weeks after vector administration, mice were given 50 mg / kg of doxycycline by subcutaneous injection daily for 3 days. On Day 4, mice were anesthetized, pupils dilated with 1%Tropicamide (Akorm, Lake Forest, IL) and 2.5%Phenylephrine (Paragon Bio Teck, OR) , and fundus photographs were captured with a Micron III Retinal Imaging Microscope (Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA) . Images were examined by experienced investigators and the grade of retinal detachment was determined to show no, partial, or total exudative retinal detachment for each eye. In cases that sharp fundus images could not be obtained from eyes due to lack of cornea or lens clarity, mice were euthanized, eyes were removed and frozen sectioned. Sections were post-fixed in 4%paraformaldehyde, stained with Hoechst (Vector Laboratories, Burlingame, CA) and examined by light microscopy to determine the presence and extent of exudative retinal detachment. 4.4. RESULT 4.4.1 Clinical Observation and Ophthalmic Examinations

[0120] All animals of each group survived to the scheduled endpoint. Individual eye examination was conducted before injection and immediately after intravitreal injection (Day 0) , the day before doxycycline and daily starting doxycycline induction. No hemorrhage was found in eyes post-injection and no signs of ocular discomfort or ocular inflammation was found. 4.4.2 Inhibitory Effect on Retinal Detachment

[0121] On Day 4 after starting doxycycline induction, assessment for retinal detachment found significant dose related inhibitory effect of EXG202 on retinal detachment. All individual data and analysis results are shown in Figure 3. The results show that 100%inhibition of retinal detachment (RD) was found in the 1×109 vg / eye EXG202 administration group (7 / 7 eyes administered with EXG202 had no detachment; all of the 7 / 7 contralateral eyes administered with the negative control vehicle had total detachment) ; 86%inhibition of RD was found in the 3×108 vg / eye EXG202 administration group (6 / 7 eyes administered with EXG202 has no detachment, and 1 / 7 eye had total detachment; all of the contralateral 7 / 7 eyes administered with the negative control vehicle had total detachment) ; 71%inhibition of RD was found in the 1×108 vg / eye EXG202 administration group (5 / 7 eyes administered with EXG202 had no detachment, and 2 / 7 eyes had partial detachment; 5 / 7 contralateral eyes administered with the negative control vehicle had total detachment, and 2 / 7 eyes had partial detachment) ; 61%inhibition of RD was found in the 3×107 vg / eye EXG202 administration group (4 / 9 eyes administered with EXG202 had no detachment, 4 / 9 eyes had partial detachment, 1 / 9 eye had total detachment; 8 / 9 contralateral eyes administered with negative control vehicle had total detachment, 1 / 9 eye had partial detachment) ; 43%inhibition of RD was found in the 1×107 vg / eye EXG202 administration group (3 / 7 eyes administered with EXG202 had no detachment, 3 / 7 eyes had partial detachment, 1 / 7 eye had total detachment; 4 / 7 contralateral eyes administered with negative control vehicle had total detachment, 3 / 7 eyes had partial detachment ) . All dose groups showed a significant inhibition of RD in mice delivered by a single intravitreal injection of EXG202 in the right eyes (treated-eyes) compared to the fellow eyes received a negative control vector AAV-Luc (p< 0.001) (Figure 3A). Figure 3B shows a dose-related inhibitory effect of EXG202 on retinal detachment (RD) in adult Tet / opsin / VEGF double transgenic mice delivered by a single intravitreal injection.

[0122] In summary, EXG202 for all dosages ranging from 1x107 to 1x109 vg / eye resulted in significant, dose-related inhibitory effect on retinal detachment (RD) in Tet / opsin / VEGF mice induced by doxycycline (43%inhibition of RD was found in 1x107 vg / eye of EXG202; 61%inhibition of RD in 3x107 vg / eye of EXG202; 71%inhibition of RD in 1x108 vg / eye of EXG202; 86%inhibition of RD in 3x108 vg / eye of EXG202; 100%inhibition of RD in 1x109 vg / eye of EXG202) . All animals of each group survived to the scheduled endpoint. No obvious signs of inflammation or atrophy were found in ophthalmic examination at week 4 before doxycycline induction. Remarkably, as low as 1x107 vg / eye of EXG202 did show significant inhibitory effect on the retinal detachment. Therefore, the minimal efficacious dose (MED) for EXG202 in Tet / opsin / VEGF double transgenic mice is determined to be 1x107 vg / eye.

[0123] Retinal detachment (RD) provides a great outcome measure to test efficacy in this model and the severe phenotype has proven extremely useful to distinguish between treatments that are moderately effective and those that are very effective. The results from this dose range finding study demonstrated that EXG202 is a very effective drug candidate to inhibit retinal neo-vascularization and support the use of EXG202 in clinical trials in patients with neovascular age-related macular degeneration (NV AMD) . Example 5. Efficient Retinal Transduction of EXG202 5.1 Assessment of Safety, distribution and PK of EXG202 Via Intravitreal Administration in Non-Human Primates

[0124] 2 Cynomolgus monkeys (2 female) aged 3-5 years, and 4 rhesus monkeys (2 female and 2 male) aged 4-7 years were dosed with EXG202 and AAV2.7m8 (both of them package the same GOI encoding EXG202 target protein) . One eye was administrated with EXG202, the fellow eye was administrated with AAV2.7m8. Doses of 1×1011 vg / eye were evaluated via 50 μL intravitreal injection into each eye through the sclera. The animals were anesthetized with Ketamine IM and given topical ophthalmic solutions to eliminate pain. Prednisolone Acetate eye drops were administered for 4 weeks daily post-injection. Euthanasia was performed by trained veterinary staff at Week 8 post-administration.

[0125] Mortality, morbidity, clinical observation, body weight, ophthalmic examinations (Slit lamp and indirect ophthalmoscope) , intraocular pressure (IOP) and gross pathology were assessed regularly. Target protein expression in vitreous humor, aqueous humor and ocular tissues was measured by ELISA.

[0126] Table 7: Study design of the safety, protein distribution and PK of EXG202 in NHP 5.2 Neutralizing Antibody Assay

[0127] 293T cells were plated at a density of 1×104 cells / well 24 hours prior to infection. rAAV vectors encoding firefly luciferase driven by the CBA promoter were incubated at 37°C. for 1 hour with individual serum samples prior to infection, and cells were then infected at a genomic MOI of 100. Luciferase activity was assessed 48 hours post infection using the Bright-Glo Luciferase Assay System (Promega) and quantified using the SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Readers (Molecular Devices) and SoftMax Pro7 Data acquisition and analysis software.

[0128] Prior to enrollment in studies, non-human primates (NHP) serum was screened for the presence of neutralizing antibodies against AAV2. NHPs were enrolled in studies when samples resulted in less than 50%neutralization of AAV transduction at a 1: 10 serum dilution. 5.3 RESULT

[0129] The study show that 1×1011 vg / eye EXG202 Delivery is well tolerated and safe, with no unscheduled deaths or test article-related changes in clinical observations, weight, IOP, and gross pathology. Minimal to mild Intraocular inflammation was found in EXG202 / AAV2.7m8 dosed animals.

[0130] Minimal Keratic Precipitate (KP) was found in 1 / 6 eyes of EXG202 and 1 / 6 eyes of AAV2.7m8 (0.5+, D28) ; Minimal aqueous cells (AC) were found in 1 / 6 eyes of EXG202 and 1 / 6 eyes of AAV2.7m8 (0.5+, D28) ; mild vitreous cells (VC) were found in 2 / 6 eyes of EXG202 (0.5+, D3 in one eye; 1+, D42～D56 in another eye) and 2 / 6 eyes of AAV2.7m8 (0.5+, D3 in one eye; 2+, D28～D42, then 1+, D56 in another eye) ; mild vitreous haze (VH) was found in 2 / 6 eyes of AAV2.7m8 (1+, D42 in one eye; 1+, D42～D56 in another eye) .

[0131] Figure 4A shows that EXG202 demonstrate a better retina transduction in Cyno monkey, specifically, EXG202 showed 2-3x improvement compared to AAV2.7m8 in retinal and RPE expression, suggesting a superior transduction via IVT injection. It can be seen in Figure 4B that EXG202 showed 2-5x improvement compared to AAV2.7m8 in retinal and RPE expression, suggesting a superior penetration via IVT injection and comparing to AAV2.7m8, EXG202 showed a higher RPE / retina ratio, suggesting better penetration via IVT injection.

[0132] EXG202 (EOC024 capsid) showed 2-5x improvement compared to AAV2.7m8 in retinal and RPE expression, suggesting a superior transduction via IVT injection, comparing to AAV2.7m8, EXG202 showed a higher RPE / retina ratio, suggesting a better penetration via IVT injection.

[0133] Figure 5 shows that the expression of the target protein in the aqueous humor of NHP with 1E11vg / eye of EXG202 was significantly higher than that of the same dose control (AAV2.7m8) ; Protein expression peaked at 4 weeks and remained stable until the end of the study (8 weeks) .

[0134] It can be seen that EXG202 is well tolerated in both cynomolgus and rhesus monkeys, showing a minimal inflammatory response.

[0135] In conclusion, EXG202 demonstrated a superior retinal transduction efficiency to the benchmark control vector AAV2.7m8 in NHP delivered by intravitreal injection.

[0136] The embodiments of the present invention have been described above, but the present invention is not limited thereto, and those skilled in the art can understand that modifications and changes can be made within the scope of the purport of the present invention. The manner of modifications and changes should fall within the scope of protection of the present invention.

Claims

A recombinant AAV (rAAV) particle comprising(a) a nucleic acid encoding a polypeptide wherein the polypeptide from N-terminus to C-terminus comprises (i) a first domain that is capable of binding to an angiopoietin; (ii) a second domain derived from VEGFR-1; and (iii) athird domain derived from VEGFR-2; and(b) a capsid protein, wherein the capsid protein is a variant of a AAV2 capsid protein comprising an inserted sequence of SEQ ID NO: 1 at a position between the amino acid position 587 and 588 of capsid protein VP1 of AAV2.The rAAV particle of claim 1, wherein the AAV2 capsid protein comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 .The rAAV particle of claim 1 or 2, wherein the variant of the AAV2 capsid protein comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 .The rAAV particle of any one of claims 1-3, wherein the first domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 20, or the first domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 20.The rAAV particle of any one of claims 1-4, wherein the second domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, or the second domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 13.The rAAV particle of any one of claims 1-5, wherein the third domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or the third domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 14.The rAAV particle of any one of claims 1-6, wherein the polypeptide further comprises (iv) a fourth domain that is capable of binding to VEGFC, the fourth domain is at the N-terminus of the third domain.The rAAV particle of claim 7, wherein the fourth domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23, or the fourth domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23.The rAAV particle of claim 1, wherein the first domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, or the first domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 15; the second domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, or the second domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 13; the third domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or the third domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 14.The rAAV particle of claim 7, wherein the first domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, or the first domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 15; the second domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, or the second domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 13; the third domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, or the third domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 14; the fourth domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, or the fourth domain comprises an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 23.The rAAV particle of any one of claims 1-10, wherein the polypeptide further comprises a Fc region of an antibody or a variant thereof.The rAAV particle of any one of claims 1-11, wherein the Fc region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 or SEQ ID NO: 25.The rAAV particle of any one of claims 1-12, wherein the polypeptide further comprises a signal peptide, wherein optionally the signal peptide comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26.The rAAV particle of any one of claims 1-13, wherein the polypeptide further comprises one or more linkers.The rAAV particle of any one of claims 1-14, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 or SEQ ID NO: 58, or an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identify to SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 or SEQ ID NO: 58.The rAAV particle of any one of claims 1-15, further comprising an AAV 5’ inverted terminal repeat (ITR) , a regulatory sequence which directs expression of the polypeptide, and an AAV 3’ ITR.A host cell, characterized in that the host cell is transformed with the rAAV particle of any one of claims 1-16.A pharmaceutical composition comprising:a) the rAAV particle of any one of claims 1-16; andb) a pharmaceutically acceptable excipient.[Corrected under Rule 26, 27.01.2026]A method of treating disease, the method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the rAAV particle of any one of claims 1-16, the host cell of claim 17, the pharmaceutical composition of claim 18.[Corrected under Rule 26, 27.01.2026]The method of claim 19, wherein the rAAV particle, the host cell, or the pharmaceutical composition is delivered by intravitreal injection.[Corrected under Rule 26, 27.01.2026]Use of the rAAV particle of any one of claims 1-16, the host cell of claim 17, the pharmaceutical composition of claim 18 in the preparation of a medicament for preventing and / or treating diseases.[Corrected under Rule 26, 27.01.2026]The use of claim 21, wherein the disease is ophthalmic disease.[Corrected under Rule 26, 27.01.2026]The use of claim 22, the ophthalmic disease is selected from an RPE layer-related disease, such as dry AMD, wet AMD, or choroidal neovascularization (CNV) ; such as may be selected from age-related macular degeneration (AMD) , choroidal neovascularization (CNV) , choroidal neovascularization membrane (CNVM) , cystoid macular edema (CME) , epiretinal membrane (ERM) , and macular hole; myopia related choroidal neovascularization, vascular streak, retinal detachment, diabetic retinopathy, diabetic macular edema (DME) , atrophic lesion of retinal pigment epithelial cells (RPE) , hypertrophic lesion of retinal pigment epithelial cells (RPE) , retinal vein occlusion, choroidal retinal vein occlusion, macular edema; corneal angiogenesis due to hypoxia, pterygium conjunctiva, subretinal edema, and intraretinal edema; macular edema due to retinal vein occlusion, retinitis pigmentosa, Stargardt disease, glaucoma, inflammatory disease, cataract, refractory anomalies, keratoconus, retinopathy of prematurity, preocular angiogenesis, corneal angiogenesis after keratitis, corneal transplantation, or keratoplasty; such as Leber congenital amaurosis (LCA) , pigment retinal degeneration, and Stargardt disease caused by RPE cell related gene mutation.[Corrected under Rule 26, 27.01.2026]The use of claim 21, wherein the medicament is used for gene therapy of diseases.

Images