Production of induced mesenchymal stem cells from pluripotent stem cells

Abstract

This disclosure provides a method of producing high-purity and high-number of induced mesenchymal stem cells (iMSCs) from pluripotent stem cells (PSCs) under serum-free and xeno-free conditions, as well as the iMSCs produced. The method comprises the steps of (i) culturing pluripotent stem cells (PSCs) to form embryonic bodies (EBs); (ii) culturing the EBs by a multistage differentiation process, wherein the multistage differentiation process comprises a WNT signaling activation stage, a BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage and a growth factor activation stage in this order, wherein in the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage, the BMP signaling inhibitor is used at a concentration of at least 0.15 μM; and (iii) culturing the EBs by a maturation and expansion process, thereby obtaining a cell population comprising the iMSCs, wherein steps (i) - (iii) are carried out under serum-free and xeno-free conditions.

Description

PRODUCTION OF INDUCED MESENCHYMAL STEM CELLS FROM PLURIPOTENT STEM CELLSTECHNICAL FIELD

[0001] The present disclosure generally relates to the field of stem cell technology, in particular to a method for producing induced mesenchymal stem cells (iMSCs) from pluripotent stem cells and iMSCs produced by the method. SEQUENCE LISTING

[0002] The contents of the XML file submitted electronically herewith are incorporated herein by reference in their entirety (File name: “43705WO_SequenceListing. xml” ; Date recorded: November 14, 2024; File size: 5131 bytes) .BACKGROUND

[0003] Mesenchymal stem cells (MSCs) are mostly derived from mesoderm in the early developmental stage, and are specialized stem cells with the ability of self-renewal and the potential to differentiate into functional cells such as osteocytes, chondrocytes and adipocytes. MSCs were firstly found in bone marrow, later also found in amniotic membrane, umbilical cord, umbilical cord blood, placenta, adipose, dental pulp and other tissues in human and animal bodies. MSCs can be isolated from these different tissues and can be serially cultured and cryopreserved in vitro, having broad applications in tissue engineering, cell therapy, gene therapy and immunomodulation.

[0004] To date, the MSCs used in clinics are mainly donor-derived primary cells, either from autologous tissue sources such as bone marrow or adipose tissue, or from allogeneic tissue sources such as umbilical cord or placenta. The use of primary MSCs have several drawbacks: (1) each batch size is limited due to the shortage of tissue sources; (2) the MSCs are very heterogenous in quality, showing great variations between different donors and different tissues; (3) the number of MSCs and their expansion potential decrease with age, and in vitro expansion accelerates the aging of MSCs; and (4) the differentiation potential of MSCs from different donors decreases with age. These limitations have largely caused the inconsistency in the clinical efficacy of primary MSCs and have prevented primary MSCs from becoming a product that can be produced on a standardized and large-scale basis. Therefore, in order to promote clinical applications of MSCs, it is desirable to solve the problem of the MSC sources.

[0005] In addition to the primary tissue sources, MSCs can be derived from pluripotent stem cells (PSCs) , including both embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) . Both ESCs and iPSCs are capable of unlimited in vitro proliferation and multi-lineage differentiation. Utilizing the unlimited self-renewal and differentiation ability of PSCs, standardized and scalable in vitro preparation of MSCs can be achieved, and could solve the problems associated with primary MSCs, thus making the PSC-derived MSCs (iMSCs) ideal for clinical applications.

[0006] Currently, a number of protocols for differentiating PSCs into iMSCs have been developed to obtain MSCs. These methods involve different pathways of differentiating PSCs into iMSCs via different intermediate stages, including neural crest, neuromesoderm, mesoderm, and trophoblast origins, and the mesoderm is a major source ofiMSCs. It's worth noting that iMSCs differentiated through different intermediate stages may differ from primary MSCs in some aspects. For example, it has been reported that iMSCs derived through trophoblast intermediate stage produced less interleukin 6 (IL-6) , C-X-C motif chemokine ligand 10, and C-C motif chemokine ligand 2 but more programmed death-ligand 1 in response to IFN gamma (IFNγ) treatment as compared with primary MSCs. Many of these methods typically rely on media supplemented with various differentiation factors. However, these media typically contain a serum such as fetal bovine serum (FBS) which has significant lot-to-lot variation and may contain heterogeneous proteins carrying bacteria, viruses, and protein infectious diseases. Thus, these media may result in unstable product quality and safety issue. Further, some serum-free methods have been recently developed to produce iMSCs. However, these serum-free methods have typically used media containing a serum replacement (SR) , which typically contains one or more ingredients derived from animals, and thus are not ideal for industrial scale production of iMSC products suitable for clinical applications. Thus, there remains a need to provide an improved method for producing iMSCs. SUMMARY OF THE DISCLOSURE

[0007] This disclosure provides a method for producing induced mesenchymal stem cells (iMSCs) from pluripotent stem cells, which is very suitable for clinical applications requiring homogeneous and robust populations of cells. The method disclosed herein is carried out under serum-free and xeno-free conditions and includes a multistage differentiation process, wherein the multistage differentiation process further comprises a subsequent growth factor activation stage in addition to a WNT signaling activation stage and a BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage, and wherein in the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage, the BMP signaling inhibitor is used at a concentration of at least 0.15 μM. Therefore, the present method has circumvented the problems encountered by the existing methods that rely on media containing serum or serum replacement, including unstable product quality and safety issue and unpredictability as a result of undefined and batch-variable serum and animal-derived ingredients. Moreover, this serum-free and xeno-free method is highly efficient, resulting in a homogeneous and robust cell population with a high purity and high number of iMSCs. Further, iMSCs derived from the method described herein can be stably passaged substantially without losing the characteristics such as morphology and phenotype of the stem cells, which allows large-scale continuous production of consistent products. This disclosure also relates to, among other things, cell populations, cell lines, and / or clonal cells generated using the method described herein.

[0008] In one aspect, this disclosure provides a method of producing induced mesenchymal stem cells (iMSCs) , comprising the steps of: (i) culturing pluripotent stem cells (PSCs) to form embryonic bodies (EBs) ; (ii) culturing the EBs from step (i) by a multistage differentiation process, wherein the multistage differentiation process comprises a WNT signaling activation stage, a BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage and a growth factor activation stage in this order, wherein the WNT signaling activation stage comprises culturing the EBs in the presence of a WNT signaling activator, wherein the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage comprises culturing the EBs in the presence of a TGF-β signaling inhibitor and a BMP signaling inhibitor, wherein the growth factor activation stage comprises culturing the EBs in the presence of a growth factor, and wherein in the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage, the BMP signaling inhibitor is used at a concentration of at least 0.15 μM; and (iii) culturing the EBs from step (ii) by a maturation and expansion process, thereby obtaining a cell population comprising the iMSCs, wherein steps (i) - (iii) are carried out under serum-free and xeno-free conditions.

[0009] In some embodiments, the multistage differentiation process further comprises a first and / or a second transitional differentiation stages intervening between the BMP and TGF-βsignaling dual inhibition stage and the growth factor activation stage, and wherein the first transitional differentiation stage comprises culturing the EBs under the conditions which keep the EBs from the inhibition of TGF-β signaling, and the second transitional differentiation stage comprises culturing the EBs under the conditions which keep the EBs from the inhibition of both TGF-β signaling and BMP signaling.

[0010] In some embodiments, the WNT signaling activation stage is performed by using a first differentiation medium supplemented with the WNT signaling activator, the BMP and TGF-βsignaling dual inhibition stage is performed by using a second differentiation medium supplemented with the TGF-β signaling inhibitor and the BMP signaling inhibitor, the growth factor activation stage is performed by using a third differentiation medium supplemented with the growth factor, the first transitional differentiation stage is performed by using a first transitional culture medium obtained by removing the TGF-β signaling inhibitor from the second differentiation medium, and the second transitional differentiation stage is performed by using a second transitional culture medium obtained by removing the TGF-β signaling inhibitor and the BMP signaling inhibitor from the second differentiation medium.

[0011] In some embodiments, the first to third differentiation media and the first to second transitional culture media are serum-free, xeno-free and chemically defined culture media comprising a same culture medium as basal solution.

[0012] In some embodiments, the same culture medium in the differentiation media and the transitional culture media comprises a basal medium, transferrin, glutamine or a derivative thereof, ascorbate, an ethanolamine-based compound, a putrescine-based compound, human serum albumin (HSA) , and an insulin-based compound. In some embodiments, the same culture medium in the differentiation media and the transitional culture media further comprises selenite, monothioglycerol (MTG) , mB27, or a combination thereof.

[0013] In some embodiments, the same culture medium in the differentiation media and the transitional culture media comprises a basal medium, about 1 to about 200 μg / mL of transferrin, about 0.1%to about 5%by volume of glutamine or a derivative thereof, about 1 to about 30 ng / mL of selenite, about 1 to about 200 μg / mL of an ascorbic compound, about 1 to about 30 μM of an ethanolamine-based compound, about 1 to about 30 μM of a putrescine-based compound, 1 to 200 μM of MTG, about 1 to about 20 mg / mL of HSA, and about 1 to about 15 μg / mL of an insulin-based compound.

[0014] In some embodiments, the same culture medium in the differentiation media and the transitional culture media comprises a basal medium, about 1 to about 200 μg / mL of transferrin, about 0.1%to about 5%by volume of glutamine or a derivative thereof, about 1 to about 30 ng / mL of selenite, about 1 to about 200 μg / mL of an ascorbic compound, about 1 to about 30 μM of an ethanolamine-based compound, about 1 to about 30 μM of a putrescine-based compound, about 0.1%to about 10%by volume of mB27, about 1 to about 20 mg / mL of HSA, and about 1 to about 15 μg / mL of an insulin-based compound.

[0015] In some embodiments, the WNT signaling activator comprises a glycogen synthase kinase-3 (GSK3) inhibitor, e.g., CHIR99021. In some embodiments, the WNT signaling activator is used at a concentration of about 5 μM to about 15 μM. In some embodiments, the WNT signaling activation stage is performed for about 1 to about 2 days. In some embodiments, the WNT signaling activation stage is performed from Day 0 to Day 2.

[0016] In some embodiments, the BMP signaling inhibitor is selected from Noggin, Chordin, Follostatin, Dorsomorphin, LDN193189, or a combination thereof. In some embodiments, the BMP signaling inhibitor is used at a concentration of about 0.2 μM to about 5.0 μM.

[0017] In some embodiments, the TGF-β signaling inhibitor is selected from RepSox, A83-01, SB431542, D4476, GW788388, LY364947, LY580276, SB525334, SB505124, SD208, GW6604, SJN-2511, or a combination thereof. In some embodiments, the TGF-β signaling inhibitor is used at a concentration of about 1 μM to about 30 μM.

[0018] In some embodiments, the second differentiation medium is further supplemented with a sonic hedgehog agonist. In some embodiments, the sonic hedgehog agonist is selected from SHH, SHH C24II, SHH C25II, SAG, SMO-IN-1, purmorphamine, an analog thereof, or a combination thereof. In some embodiments, the sonic hedgehog agonist is used at a concentration of about 1 ng / mL to about 1000ng / mL.

[0019] In some embodiments, the second differentiation medium is further supplemented with a retinoic acid receptor (RAR) agonist. In some embodiments, the RAR agonist is selected from retinoic acid (RA) , EC23, EC19, AC55649, Ch55, TTNPB, an analog thereof, or a combination thereof. In some embodiments, the RAR agonist is used at a concentration of about 0.1 μM to about 10 μM.

[0020] In some embodiments, the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage is performed for about 1 to about 2 days. In some embodiments, the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage is performed from Day 2 to Day 3.

[0021] In some embodiments, the growth factor is selected from FGF, TGF-β or a combination thereof. In some embodiments, the growth factor is selected from FGF, or TGF-β. In some embodiments, the growth factor is used at a concentration of about 0.5 ng / mL to about 20 ng / mL. In some embodiments, the growth factor activation stage is performed for about 2 to about 7 days. In some embodiments, the growth factor activation stage is performed from Day 6 to Day 10, or from Day 8 to Day 10.

[0022] In some embodiments, the first and / or second transitional differentiation stages are performed for about 1 to about 5 days. In some embodiments, the first and / or second transitional differentiation stages are performed from Day 3 to Day 6, or from Day 3 to Day 8.

[0023] In some embodiments, the maturation and expansion process is performed entirely under 2D culture condition. In some embodiments, the maturation and expansion process comprises expanding cells for one or more passages such as 4 passages with the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the cells substantially maintained.

[0024] In some embodiments, the cells in the EBs are expanded by using a serum-free and xeno-free maturation and expansion medium comprising a basal medium, about 1 to about 30 μM of an ethanolamine-based compound, about 1 to about 30 μM of a putrescine-based compound, and about 0.1%to about 20%by volume of a human platelet lysate (HPLT) . In some embodiments, the maturation and expansion medium further comprises about 1 to about 150 μg / mL of transferrin, about 0.5%to about 5%by volume of glutamine or a derivative thereof, about 1 to about 150 μg / mL of an ascorbic compound, and about 1 to about 10 μg / mL of an insulin-based compound.

[0025] In some embodiments, the maturation and expansion medium comprises a basal medium, about 5 to about 30 μM of ethanolamine, about 1 to about 20 μM of putrescine dihydrochloride, about 0.1%to about 10%by volume of HPLT, about 1 to about 150 μg / mL oftransferrin, about 1 to about 10 μg / mL of insulin, about 1 to about 150 μg / mL of ascorbate, and about 0.5%to about 5%by volume of glutamine.

[0026] In some embodiments, the method is carried out under serum replacement-free conditions.

[0027] In some embodiments, at least about 90%and preferably at least about 95%of cells in the cell population obtained without any enrichment or sorting are iMSCs identifiable as expressing CD90, CD73 and CD105.

[0028] In another aspect, this disclosure provides a substantially homogeneous population of iMSCs prepared by the method described herein.

[0029] Various objects and advantages of the reagents, compositions and methods as provided herein will become apparent from the following description taken in conjunction with the accompanying drawings wherein are set forth, by way of illustration and example, certain embodiments of the present disclosure.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0030] FIG. 1: An exemplary schematic diagram of an example of the method for producing iMSCs from PSCs according to this disclosure.

[0031] FIG. 2: Flow cytometric analysis results of the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the population of iMSCs of Passage 1 (P1) obtained by the preliminary experiment with TGF-β1 added throughout D3-D10, and FGF2 added throughout D2-D10, D4-D10, D6-D10, or D8-D10, or not added at all.

[0032] FIG. 3: Flow cytometric analysis results of the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the population of iMSCs of P1 obtained by the preliminary experiment with FGF2 added throughout Day 2-10, and TGF-β1 added throughout D3-D10, D6-D10, or D8-D10.

[0033] FIG. 4: Left panel compares the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the population of iMSCs of P1 obtained under two different differentiation conditions (FGF2 being added throughout Day 8-10 of the differentiation with or without TGF-β1 added throughout Day 3-10 of the differentiation) ; and right panel shows the expression of CD105 in the population of iMSCs of P2 obtained under the differentiation condition without TGF-β1 added.

[0034] FIG. 5: Flow cytometric analysis results of the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the population of iMSCs of P1 obtained by culturing cells in the EBs after directed differentiation according to D 10 Plating or D 12 Plating protocol.

[0035] FIG. 6: Flow cytometric analysis results of the expression of CD105 in the population of iMSCs of P1 obtained by adding different concentrations of LDN193189 in different time windows.

[0036] FIG. 7: Flow cytometric analysis results of the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the population of iMSCs of P4 obtained by adding 0.2 μM of LDN 193189 in different time windows.

[0037] FIG. 8: Flow cytometric analysis results of the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the population of iMSCs of P4 obtained by adding 0.5 μM of LDN 193189 in different time windows.

[0038] FIG. 9: Flow cytometric analysis results of the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the population of iMSCs of P1 obtained at different concentrations of SB431542 (0μM, 5μM, 10μM) using M5 as the basal medium.

[0039] FIG. 10: Flow cytometric analysis results of the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the population of iMSCs of P2 obtained at different concentrations of SB431542 (0μM, 5μM, 10μM, and 20μM) using M7 as the basal medium.

[0040] FIG. 11: Flow cytometric analysis results of the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the population of iMSCs of P1-P4 obtained at 5μM SB431542 using M7 as the basal medium.

[0041] FIG. 12: Flow cytometric analysis results of the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the population of iMSCs of P3 obtained at two different concentrations (8μM and 10μM) of CHIR99021 using M7 as the basal medium.

[0042] FIG. 13: Flow cytometric analysis results of the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the population of iMSCs of P3 obtained at two different concentrations (8μM and 10μM) of CHIR99021 using M5 as the basal medium.

[0043] FIG. 14: Flow cytometric analysis results of the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the population of iMSCs of P3 obtained at different concentrations (0 ng / ml, 100 ng / ml, 350 ng / ml, 500 ng / ml) of SHH using M7 as the basal medium.

[0044] FIG. 15: Flow cytometric analysis results of the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the population of iMSCs of P4 obtained at different concentrations (0 ng / ml and 350 ng / ml) of SHH using M5 as the basal medium.

[0045] FIG. 16: Flow cytometric analysis results of the expressions of CD90 and CD105 in the population of iMSCs of P2 obtained at different concentrations (0μM, 0.1 μM, 1 μM, 2μM) of Retinoic Acid (RA) using M7 as the basal medium.

[0046] FIG. 17: Flow cytometric analysis results of the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the population of iMSCs of P2 obtained at different concentrations (0μM, 0.1 μM, and 1 μM) of RA using M5 as the basal medium.

[0047] FIG. 18: Morphology of cells in different stages of an example of the method of the present disclosure.

[0048] FIG. 19: Flow cytometric analysis results of the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the population of iMSCs of P1 and P4 obtained by an example of the method of the present disclosure.DETAILED DESCRIPTION

[0049] It is to be appreciated that certain aspects, modes, embodiments, variations, and features of the present disclosure are described below in various levels of detail in order to provide a substantial understanding of the present technology.

[0050] Reference throughout this specification to “first, ” “second, ” “third, ” “fourth, ” “fifth, ” “sixth, ” “seventh, ” “eighth, ” or “ninth” does not mean the order or sequence of the feature, structure (e.g., medium or composition) or characteristic described in connection with the reference and can be used only for the purpose of distinction.

[0051] Reference throughout this specification to “a first aspect, ” “a second aspect, ” “a third aspect, ” “a fourth aspect, ” “a fifth aspect, ” “a sixth aspect, ” “a seventh aspect, ” “an eighth aspect, ” or “a ninth aspect” means that a particular feature, structure or characteristic described in connection with the aspect is included in at least one or more aspects of the present disclosure. Also, the particular feature (s) , structure (s) , characteristic (s) or embodiment (s) in one aspect may be combined with those in one or more other aspects in any suitable manner.

[0052] Reference throughout this specification to “one embodiment, ” “some embodiments, ” “a preferred embodiment (s) , ” “certain embodiments” or “a certain embodiment (s) ” means that a particular feature, structure or characteristic described in connection with the embodiment (s) is included in at least one or more embodiments of the present disclosure. Also, the particular feature (s) , structure (s) , or characteristic (s) in one embodiment may be combined with those in one or more other embodiments in any suitable manner.

[0053] It is to be understood that the present disclosure is not limited to particular uses, methods, reagents, compounds, compositions or biological systems, which can, of course, vary. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to be limiting. Definitions

[0054] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the meaning commonly understood by a person skilled in the art to which this disclosure belongs. The following references provide one of skill with a general definition of many of the terms used in the present disclosure. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed.1994) ; The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988) ; The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds. ) , Springer Verlag (1991) ; and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991) . As used herein, the following terms have the meanings ascribed to them below, unless specified otherwise. The terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to be limiting of the disclosure.

[0055] Unless otherwise specified, “a” or “an” means “one or more. ”

[0056] As used herein, the term “about” in connection with a specified number means plus or minus 10%, or plus or minus 5%, or plus or minus 4%, or plus or minus 3%, or plus or minus 2%, or plus or minus 1%, of the specified number, as well as the specified number itself.

[0057] As used herein, the term “comprising” is intended to mean that the compositions and methods include the recited elements, but not excluding others. “Consisting essentially of” when used to define compositions and methods, shall mean excluding other elements of any essential significance to the composition or method. “Consisting of” shall mean excluding more than trace elements of other ingredients for claimed compositions and substantial method steps. Embodiments defined by each of these transition terms are within the scope of this disclosure. Accordingly, it is intended that the methods and compositions can include additional steps and components (comprising) or alternatively including steps and compositions of no significance (consisting essentially of) or alternatively, intending only the stated method steps or compositions (consisting of) . Further, in each instance herein any of the terms “comprising, ” “consisting essentially of, ” and “consisting of' may be replaced with either of the other two terms.

[0058] As used herein, the term “pluripotent stem cell” (PSC) refers to cells that have the capability to self-renew in an undifferentiated state and to differentiate into almost any cell type in the body. Pluripotent stem cells can be pluripotent and give rise during development to all derivatives of the three primary germ layers: ectoderm, endoderm and mesoderm. Pluripotent stem cells can be of human origin (e.g., human PSC or hPSC) . Pluripotent stems cells can be induced pluripotent stem cells (iPSCs) or embryonic stem cells (ESCs) . In some embodiments, the pluripotent stem cells are human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) . ESCs (e.g., hESCs) and iPSCs (e.g., hiPSCs) are known in the art and can be readily obtained using conventional methods, for example, those described in the existing technologies, or commercially available products. PSCs obtained following various types of genetic engineering, such as transgene knock-in can also be used herein.

[0059] As used herein, the term “embryonic stem cells, ” or “ESCs” refers to naturally occurring pluripotent stem cells of the inner cell mass of the embryonic blastocyst. Embryonic stem cells are pluripotent and give rise during development to all derivatives of the three primary germ layers: ectoderm, endoderm and mesoderm. They do not contribute to the extraembryonic membranes or the placenta, i.e., are not totipotent. When used in the present disclosure, the embryonic stem cells or ESCs are sourced from commercially established human embryonic stem cell lines or human embryonic stem cells isolated or acquired from early embryos that have developed in vitro for not more than 14 days from fertilization.

[0060] As used herein, the term “induced pluripotent stem cells” or, “iPSCs” , means that the stem cells are produced from differentiated adult, neonatal or fetal cells that have been induced or changed, i.e., reprogrammed into cells capable of differentiating into tissues of all three germ or dermal layers: mesoderm, endoderm, and ectoderm. The iPSCs produced do not refer to cells as they are found in nature. Suitable methods for the generation of iPSCs from somatic or multipotent stem cells are well known to those of skill in the art. For example, iPSCs may be reliably generated from somatic cells by conventional reprogramming technologies. For example, a method for reprogramming erythrocyte progenitor cells to generate hiPSCs has been described in detail in CN108373998B, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0061] As used herein, the term “pluripotency” or “pluripotent” refers to the developmental potential of a cell to differentiate into cells of all three germ layers (Ectoderm, mesoderm, and endoderm) . Pluripotency can be determined, at least in part, by assessing pluripotency characteristics of the cells. Pluripotency characteristics include, but are not limited to: (i) pluripotent stem cell morphology; (ii) the potential for unlimited self-renewal; (iii) expression of pluripotent stem cell markers including, but not limited to SSEA1 (mouse only) , SSEA3 / 4, SSEA5, TRA1-60 / 81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133 / prominin, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 and / or CD50; (iv) ability to differentiate to all three somatic lineages (ectoderm, mesoderm and endoderm) ; (v) teratoma formation consisting of the three somatic lineages; and (vi) formation of embryoid bodies consisting of cells from the three somatic lineages.

[0062] As used herein, the term “pluripotent stem cell morphology” refers to the classical morphological features of an embryonic stem cell. Normal embryonic stem cell morphology can be characterized as small and round in shape, with a high nucleus-to-cytoplasm ratio, the notable presence of nucleoli, and / or typical inter-cell spacing.

[0063] As used herein, the term “reprogramming” refers to a method of increasing the potency of a cell or dedifferentiating a cell to a less differentiated state. For example, a cell that has an increased cell potency can have more developmental plasticity (i.e., can differentiate into more cell types) compared to the same cell in the non-reprogrammed state. That is, a reprogrammed cell is one that is in a less differentiated state than the same cell in a non-reprogrammed state. “Reprogramming” can refer to de-differentiating a somatic cell, or a multipotent stem cell, into a pluripotent stem cell, also referred to as an induced pluripotent stem cell, or iPSC.

[0064] As used herein, the term “maintenance” refers to the process by which the morphology and function of cells are substantially maintained. For example, the maintenance of PSCs such as iPSCs means that the morphology and pluripotency of PSCs are substantially maintained.

[0065] As used herein, the term “embryoid body” (EB) refers to a three-dimensional cluster of cells that have been shown to mimic embryo development as it gives rise to numerous lineages within its three-dimensional area.

[0066] As used herein, the term “differentiation” refers to the process by which an unspecialized ( “uncommitted” ) or less specialized cell acquires the features of a specialized cell such as, for example, a blood cell or an immune cell. In certain embodiments, a differentiated or differentiation-induced cell is one that has taken on a more specialized ( “committed” ) position within the lineage of a cell. For example, a human Pluripotent Stem Cell (hPSCs) can be differentiated into various more differentiated cell types, for example, a neural progenitor cell (e.g., midbrain dopaminergic progenitor) , a hematopoietic progenitor cell, a lymphocyte, a cardiomyocyte, an immune cell, and other cell types, upon treatment with suitable differentiation factors in the cell culture medium. In certain embodiments, the term “committed” is applied to the process of differentiation to refer to a cell that has proceeded through a differentiation pathway to a point where, under normal circumstances, it would or will continue to differentiate into a specific cell type or subset of cell types, and cannot, under normal circumstances, differentiate into a different cell type (other than a specific cell type or subset of cell types) nor revert to a less differentiated cell type. The term “differentiation” herein is also referred to as “directed differentiation” .

[0067] As used herein, the term “expansion” refers to the process by which cells are proliferated to produce a larger number of cells of substantially same cell type.

[0068] As used herein, the term “maturation” refers to the process by which cells having immature or incomplete morphology and function are developed to produce cells having mature or complete morphology and function.

[0069] In the context of the present application, although the stages involved in the method may be divided into the processes of maintenance, differentiation, maturation and expansion, it is not intended to mean that this division may exclude the possibility where two or more processes can be carried out in the same stage.

[0070] As used herein, the term “D” stands for “Day” and refers to the time when cells are cultured. For example, D0 stands for Day 0 and represents the start of the multi-stage differentiation process. D-1 stands for Day -1 and represents the start of the maintenance process.

[0071] As used herein, the term “serum-free” refers to culture environment or condition free of human or animal serum.

[0072] As used herein, the term “xeno-free” refers to culture environment or condition free of any product or ingredient which is derived from non-human animal.

[0073] As used herein, the term “serum replacement-free” refers to culture environment or condition free of any serum replacement.

[0074] As used herein, the term “serum replacement” refers to a supplement for replacing a serum in a culture medium. Serum replacement typically contains one or more ingredients derived from non-human animals.

[0075] As used herein, the term “cell purity” or “purity” refers to the percentage of cells expressing a specified marker in the cell population. For example, the cell purity may refer to the percentage of iMSC cells identifiable as expressing CD90, CD73 and CD105.

[0076] As used herein, the term “enrichment” refers to the process by which specific cells in the population are separated or purified to increase the proportion of these cells.

[0077] As used herein, the term “sorting” refers to the process by which specific cells in the population are separated or purified according to the characteristics of the cells. Sorting includes Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) and Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) , which are known in the art.

[0078] As used herein, the term “mesenchymal stem cell” or “MSC” refers to a stem cell which can self-renew and also exhibits the capacity of trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. MSCs comprise primary MSCs and induced MSCs (also referred to as iMSCs) . Examples of the primary MSCs include, for example, bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs) , placental-derived mesenchymal stem cells (P-MSCs) , umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) , adipose-derived mesenchymal stem cells (A-MSCs) , peripheral blood-derived mesenchymal stem cells (PB-MSCs) and dental pulp-derived mesenchymal stem cells (DP-MSCs) .

[0079] As used herein, the term “induced mesenchymal stem cell” (iMSC) refers to a pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cell. iMSCs possess the morphological, structural (e.g., markers) and functional characteristics similar to the primary MSCs. For example, iMSCs have the potential to develop into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes and express typical markers such as CD73, CD90 and CD105. The iMSCs can be derived from PSC of any source. In certain embodiments, the iMSCs are ESC-derived MSCs. In certain embodiments, the iMSCs are iPSC-derived MSCs. In certain embodiments, the iMSCs are Naive PSC (NPSC) -derived MSCs. In certain embodiments, the iMSCs are Extended PSC (EPSC) -derived MSCs. In some embodiments, the iPSC is a human iPSC (hiPSC) .

[0080] As used herein, the term “culture medium” refers to a culture medium which can support the survival, growth, propagation, maintenance and / or differentiation of cells in an in vitro environment. A culture medium may comprise or have a basal medium and one or more supplements.

[0081] As used herein, the term “maintenance culture medium” refers to a culture medium which can support the survival, growth, propagation, or maintenance of cells in an in vitro environment.

[0082] As used herein, the term “differentiation culture medium” refers to a culture medium which can support the differentiation of cells in an in vitro environment. A differentiation culture medium typically comprises a basal medium supplemented with one or more components that induce and / or promote differentiation, which are also referred to as differentiation factors.

[0083] As used herein, the term “maturation / expansion culture medium” , “maturation and expansion culture medium” , or “maturation / expansion medium” refers to a culture medium which can support the maturation and expansion of cells in an in vitro environment. A maturation / expansion culture medium typically comprises a basal medium supplemented with one or more components that promote maturation and expansion of cells.

[0084] As used herein, the term “basal medium” refers to a basal component or a basal solution for a culture medium (e.g., differentiation culture medium, or maturation / expansion culture medium) of cells relative to its supplement (s) . Generally, the basal medium comprises about 95%to 99%by volume of the culture medium (e.g., differentiation culture medium, or maturation / expansion culture medium) . A basal medium of a cell maintenance culture medium acts as a source of nutrients, hormones and / or other factors helpful to propagate and / or sustain the cells. A basal medium of a cell differentiation culture medium acts as a source of nutrients, hormones and / or other factors helpful to differentiate the cells.

[0085] As used herein, the term “classical basal medium” refers to a well established basal medium which have been frequently used to culture a variety of cells in the art of cell culture. Examples of the classical medium comprises DMEM / F12 (e.g., Gibco Cat. #C11330500BT) , BME medium (e.g., Gibco Cat. #21010046, or Sigma-Aldrich Cat. #B9638) , IMDM medium (e.g., Gibco Cat. #12440053; or Sigma-Aldrich Cat. #I3390) , Eagle MEM medium (e.g., Minimum Essential Medium (MEM) , developed by Harry Eagle, Sigma-Aldrich Cat. #M2414  / M2279  / M5690) , α-MEM medium (e.g., Gibco Cat. #12561056; or, Sigma-Aldrich Cat. #M0894) , DMEM medium (e.g., Gibco Cat. #21068028) , RPMI 1640 medium (e.g., Gibco Cat. #11875093) , Ham's F12 medium (e.g., Gibco Cat. #11765054) , or a mixture thereof.

[0086] As used herein, the term “supplement (s) ” refers to an additive component (s) of a culture medium (e.g., differentiation culture medium, or maturation / expansion culture medium) relative to its basal medium.

[0087] As used herein, the term “supplemented” refers to the addition of a supplement for a culture medium (e.g., differentiation culture medium) into its basal medium. The supplement (s) may be added into a basal medium of a culture medium before or upon the use of the culture medium.

[0088] As used herein, the term “in vitro” refers generally to activities that take place outside an organism. As used herein, the term “in vivo” refers generally to activities that take place inside an organism.

[0089] As used herein, the term “ex vivo” refers generally to activities that take place outside an organism, such as experimentation or measurements done in or on living tissue in an artificial environment outside the organism, preferably with minimum alteration of the natural conditions. In particular embodiments, “ex vivo” procedures involve living cells or tissues taken from an organism and cultured in a laboratory apparatus, usually under sterile conditions, and typically for a few hours or up to about 24 hours but including up to 48 or 72 hours or longer, depending on the circumstances. In certain embodiments, such tissues or cells can be collected and frozen, and later thawed for ex vivo treatment. Tissue culture experiments or procedures lasting longer than a few days using living cells or tissue are typically considered to be “in vitro, ” though in certain embodiments this term can be used interchangeably with ex vivo.

[0090] As used herein, the term “cell population” or “population of cells” refers to a group of at least two cells expressing identical, similar or different phenotypes. In non-limiting examples, a cell population can include at least about 10, at least about 100, at least about 200, at least about 300, at least about 400, at least about 500, at least about 600, at least about 700, at least about 800, at least about 900, at least about 1000 cells, at least about 10,000 cells, at least about 100,000 cells, at least about 1 × 106 cells, at least about 1 × 107 cells, at least about 1 × 108 cells, at least about 1 × 109 cells, at least about 1 × 1010 cells, at least about 1 × 1011 cells, at least about 1 × 1012 cells, or more cells expressing identical, similar or different phenotypes.

[0091] As used herein, the term “effective amount” refers to a quantity of an agent sufficient to achieve a beneficial or desired result upon administration.

[0092] As used herein, the terms “treatment, ” “treat, ” and “treating” refer to a clinical intervention aimed to reverse, alleviate, delay the onset of, or inhibit the progress, ameliorate, reduce severity of, prevent or delay the recurrence of a disease, disorder, and / or condition or one or more symptoms thereof, and / or improve one or more symptoms of a disease, disorder, and / or condition as described herein. Treatment, e.g., in the form of iMSCs or a population of iMSCs as described herein, may be administered to a subject after one or more symptoms have developed and / or after a disease has been diagnosed. Treatment may be administered in the absence of symptoms, e.g., to prevent or delay onset of a symptom or inhibit onset or progression of a disease. For example, treatment may be administered to a susceptible individual prior to the onset of symptoms (e.g., in light of genetic or other susceptibility factors) . Treatment may also be continued after symptoms have resolved, for example to prevent or delay their recurrence. Treatment can result in improvement and / or resolution of one or more symptoms of a disease, disorder and / or condition.

[0093] As used herein, the terms “prevent, ” “preventing, ” and “prevention” refer to reducing the probability of developing a disease, disorder, or condition in a subject, who does not have, but is at risk of or susceptible to developing a disease, disorder, or condition. Production of induced mesenchymal stem cells (iMSCs) from pluripotent stem cells (PSCs)

[0094] The present disclosure provides a method of producing high purity (e.g., at least about 90%) and high number of induced mesenchymal stem cells (iMSCs) from pluripotent stem cells (PSCs) under serum-free and xeno-free conditions. iMSCs derived from the method disclosed herein can be stably passaged substantially without losing the characteristics such as morphology and phenotype of the stem cells.

[0095] In one aspect, the present method comprises the steps of: (i) culturing pluripotent stem cells (PSCs) to form embryonic bodies (EBs) ; (ii) culturing the EBs from step (i) by a multistage differentiation process, wherein the multistage differentiation process comprises a WNT signaling activation stage, a BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage and a growth factor activation stage in this order, wherein the WNT signaling activation stage comprises culturing the EBs in the presence of a WNT signaling activator, wherein the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage comprises culturing the EBs in the presence of a TGF-β signaling inhibitor and a BMP signaling inhibitor, wherein the growth factor activation stage comprises culturing the EBs in the presence of a growth factor, and wherein in the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage, the BMP signaling inhibitor is used at a concentration of at least 0.15 μM; and (iii) culturing the EBs from step (ii) by a maturation and expansion process, thereby obtaining a cell population comprising the iMSCs, wherein steps (i) - (iii) are carried out under serum-free and xeno-free conditions.

[0096] FIG. 1 shows an exemplary graphic representation of an example of the method for producing iMSCs from PSCs according to this disclosure. Each step of the method disclosed herein will be described in more details below.Step (i) -EB formation

[0097] PSCs can be cultured using a maintenance medium to form EBs. Formation of the EBs from the PSCs can be achieved by suspension maintenance culture, hanging drop EB formation, or Spin EB formation. In preferred embodiments, the EBs are formed by suspension maintenance culture. For example, PSCs can be dissociated to form a single-cell suspension and resuspended in a maintenance culture medium to form embryoid bodies (EBs) . The maintenance medium can be for example, Epic medium, ncEpic medium, E8 or mTeSR or other similar medium. In some embodiments, the maintenance medium contains a ROCK inhibitor. In some embodiments, a concentration range of ROCK inhibitor is from about 2μM to about 20μM, preferably from about 4μM to about 10μM. ROCK inhibitors

[0098] ROCK inhibitor is a compound that targets rho kinase (ROCK) and inhibit the ROCK pathway. Use of ROCK inhibitors improve survival of pluripotent stem cells (PSCs) and formation of EBs from the PSCs.

[0099] In certain embodiments, the ROCK inhibitor is selected from the group consisting of: Y-27632, Blebbistatin, HA-100, H-1152, HA-1077, and a combination thereof.

[0100] Representative structures of certain ROCK inhibitors that may be used in the maintenance medium of the present disclosure are provided below, many of which are widely commercially available with indicated Cat. No. Y-27632 (MCE Cat. #HY-10071, CAS No. : 146986-50-7) . Blebbistatin (MCE, #HY-13813 , CAS No. : 674289-55-5) . HA-100 (hydrochloride) (absin Cat. #abs47045575) . H-1152 (MCE Cat. #HY-15720, CAS No. : 451462-58-1) . HA-1077 (Fasudil / AT877) (MCE Cat. #HY-10341A, CAS No. :  103745-39-7) .

[0101] In some embodiments, the ROCK inhibitor is Blebbistatin. In some embodiments, the concentration of Blebbistatin is 10μM. In some embodiments, the ROCK inhibitor is Y-27632.

[0102] In some embodiments, the duration of the step for EB formation is about 8h to about 24h, preferably about 10h to about 16h.Step (ii) -Multistage Differentiation Process

[0103] In this disclosure, the multistage differentiation process comprises a WNT signaling activation stage, a BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage and a growth factor activation stage in this order. In other words, the multistage differentiation process further comprises a subsequent growth factor activation stage in addition to a WNT signaling activation stage, and a BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage. The population of iMSCs derived in this way have improved percentages for the expressions of CD73 and CD105 so that they have a higher purity.

[0104] In some embodiments, the duration of the multistage differentiation process is about 7 days to 11 days, preferably 8 days to 11 days, and more preferably about 11 days. Each of the stages in the multistage differentiation process is further described below. WNT Signaling Activation Stage

[0105] The first stage of the multistage differentiation process of the present method is a WNT signaling activation stage, and the culture medium used for this stage is also referred to as a “first differentiation medium” . In some embodiments, the first differentiation medium comprises a WNT signaling pathway activator. In some embodiments, the first differentiation medium is supplemented with a WNT signaling pathway activator.

[0106] WNT signaling pathway activator

[0107] The Wnt signaling pathway is an evolutionarily conserved pathway that regulates various aspects of cell fate determination, cell migration, neural patterning and organogenesis during embryonic development. The Wnts comprise a large family of secreted glycoproteins that bind to an Fz receptor to trigger signal transduction. The Wnt signaling pathway can be a canonical or Wnt / β-catenin dependent pathway, or a non-canonical or β-catenin-independent pathway which can be further divided into the Planar Cell Polarity and the Wnt / Ca2+ pathways.

[0108] The Wnt signaling pathway activators refers to agonists of the Wnt signaling pathway (e.g., agents capable of upregulating activity and / or amount of a component participating in the Wnt signaling pathway) .

[0109] Non-limiting examples of Wnt signaling pathway activators include one or more of the following: a polypeptide comprising an amino acid sequence of a Wnt polypeptide, a polypeptide comprising an amino acid sequence of an activated Wnt receptor, a small organic molecule that promotes Wnt / β-catenin signaling, a small organic molecule that inhibits the expression or activity of a Wnt antagonist, an antibody that binds to and inhibits the activity of a Wnt antagonist, a polypeptide comprising an amino acid sequence of a β-catenin polypeptide, and a polypeptide comprising an amino acid sequence of a Lef-1 polypeptide, and preferably a small organic molecule that promotes Wnt / β-catenin signaling and a small organic molecule that inhibits the expression or activity of a Wnt antagonist.

[0110] Wnt signaling pathway activators can also include GSK3 inhibitors. GSK3 inhibitors may include, for example and without limitation, polynucleotides, polypeptides, and small molecules. Exemplary GSK3 inhibitors include, for example and without limitation, Kenpaullone, 1-Azakenpaullone, CHIR99021, CHIR98014, NP031112, TWS 119, TWS 119 pyrrolopyrimidine compound, AZD2858, AZD 1080, SB415286, LY2090314, AR-A014418, CT 20026, SB216763, TDZD-8 (4-Benzyl-2-methyl-l, 2, 4-thiadiazolidine-3, 5-dione) , BIO, BIO-Acetoxime, (5-Methyl-lH-pyrazol-3-yl) - (2-phenylquinazolin-4-yl) amine, Pyridocarbazole-cyclopenadienylruthenium complex, 2-Thio (3-iodobenzyl) -5- (1 -pyridyl) [1, 3, 4] -oxadiazole, alpha-4-Dibromoacetophenone, 3- (1- (3-Hydroxypropyl) -1H-pyrrolo [2, 3-b] pyridin-3-yl] -4-pyrazin-2-yl-pyrrole-2, 5-dione, L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2 or its myristoylated form, 2-Chloro-1- (4, 5-dibromo-thiophen-2-yl) -ethanone, GF 109203X, RO318220, TIBPO, and OTDZT, preferably Kenpaullone, 1-Azakenpaullone, CHIR99021, CHIR98014, NP031112, TWS 119, AZD2858, AZD 1080, SB415286, LY2090314, AR-A014418, SB216763, BIO-Acetoxime, (5-Methyl-1H-pyrazol-3-yl) - (2-phenylquinazolin-4-yl) amine, 2-Thio (3-iodobenzyl) -5- (1-pyridyl) [1, 3, 4] -oxadiazole, alpha-4-Dibromoacetophenone, 3- (1- (3-Hydroxypropyl) -lH-pyrrolo [2, 3-b] pyridin-3-yl] -4-pyrazin-2-yl-pyrrole-2, 5-dione, 2-Chloro-1- (4, 5-dibromo-thiophen-2-yl) -ethanone, and GF 109203X.

[0111] In preferred embodiments, the Wnt signaling pathway activator suitable for use herein is selected from Kenpaullone, 1-Azakenpaullone, CHIR99021, CHIR98014, NP031112, TWS 119, AZD2858, AZD 1080, SB415286, LY2090314, AR-A014418, CT 20026, SB216763, TDZD-8 (4-Benzyl-2-methyl-l, 2, 4-thiadiazolidine-3, 5-dione) , BIO, BIO-Acetoxime, (5-Methyl-lH-pyrazol-3-yl) - (2-phenylquinazolin-4-yl) amine, Pyridocarbazole-cyclopenadienylruthenium complex, 2-Thio (3-iodobenzyl) -5- (1-pyridyl) [1, 3, 4] -oxadiazole, alpha-4-Dibromoacetophenone, 3- (1- (3-Hydroxypropyl) -1H-pyrrolo [2, 3-b] pyridin-3-yl] -4-pyrazin-2-yl-pyrrole-2, 5-dione, TWS1 19 pyrrolopyrimidine compound, L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2 or its myristoylated form, 2-Chloro-1- (4, 5-dibromo-thiophen-2-yl) -ethanone, GF 109203X, RO318220, TIBPO, or OTDZT.

[0112] In some embodiments, the WNT signaling pathway activator comprise a glycogen synthase kinase-3 (GSK3) inhibitor. In some embodiments, the glycogen synthase kinase-3 (GSK3) inhibitor is CHIR99021.

[0113] Representative structures of certain Wnt signaling pathway activators that may be used in the culture medium of the present disclosure are provided below, many of which are widely commercially available with indicated Cat. No. Azakenpaullone: MCE, #HY-59090; APExBio, #B3690;  Sigma-Aldrich, #A3734; CAS No. : 676586-65-9. CHIR99021: APExBio, #A3011. CHIR98014: Sigma-Aldrich, #SML1094; CAS  No. : 252935-94-7. NP031112 (Tideglusib) : Sigma-Aldrich, #SML0339; APExBio,  #B1539; MCE, #HY-14872; CAS No. : 865854-05-3. TWS 119: Sigma-Aldrich, #SML1271; APExBio, #B 1540;  MCE, #HY-10590; CAS No. : 601514-19-6. AZD2858: APExBio, #B1537; MCE, #HY- 15761; CAS No. : 486424-20-8. AZD1080: APExBio, #B1536; MCE, #HY-13862,  CAS No. : 612487-72-6. SB415286: Sigma-Aldrich, #S3567; APExBio, #A8241; MCE,  #HY-15438; CAS No. : 280744-09-4. LY2090314: Sigma-Aldrich, #SML1438; APExBio,  #A3570; MCE, #HY-16294; CAS No. : 603288-22-8. AR-A014418: Sigma-Aldrich, #A3230;  APExBio, #A3184; MCE, #HY-10512; CAS No. : 487021-53-3. SB216763: Sigma-Aldrich, #S3442; APExBio, #A8240;  MCE, #HY-12012; CAS No. : 280744-09-4. TDZD-8: Sigma-Aldrich, #T8325; APExBio, #B1249; MCE, # HY-11012; CAS No. : 327036-89-5. BIO (GSK 3 Inhibitor IX) : Sigma-Aldrich, #B1686;  APExBio, #B1538; MCE, #HY-10580; CAS No. : 667463-62-9. BIO-Acetoxime; Sigma-Aldrich, #SML0531; APExBio,  #B5488; MCE, #HY-15356; CAS No. : 667463-85-6.  (5-Methyl-1H-pyrazol-3-yl) - (2-phenylquinazolin-4-yl) amine (GSK-3  Inhibitor XIII) : MCE, #HY-112392; absin, #abs819580; aladdin, #G338805; CAS No. : 404828-08-6. Pyridocarbazole-cyclopenadienylruthenium  complex (GSK-3 Inhibitor XV) : Sigma-Aldrich, #361558, CAS No. : 936112-69-5. 2-Thio (3-iodobenzyl) -5- (1-pyridyl) [1, 3, 4] -oxadiazole  (GSK3 Inhibitor II) : APExBio, #C4599; CAS No. : 478482-75-6. alpha-4-Dibromoacetophenone (2, 4′- Dibromoacetophenone / 4′-Bromophenacyl bromide) : Sigma-Aldrich, #D38308; CAS No. : 99-73-0. OTDZT (2, 4-dibenzyl-5-oxo thiadiazolidine-3- thione) : CAS No. : 373357-10-9. 3- (1- (3-Hydroxypropyl) -lH- pyrrolo [2, 3-b] pyridin-3-yl] -4-pyrazin-2-yl-pyrrole-2, 5-dione (GSK-3β inhibitor XI) : Sigma-Aldrich, #361553; aladdin, #G338716-1mg; CAS No. : 626604-39-5. GF 109203X (Bisindolylmaleimide I) : Sigma-Aldrich,  #G2911; APExBio, #A8342; MCE, #HY-13867; CAS No. : 133052-90-1. RO318220: MCE, #HY-13866A; CAS  No. : 125314-64-9.

[0114] In some embodiments, the first differentiation medium is supplemented with a WNT signaling activator at a concentration in the range of about 5μM to about 15 μM. In some embodiments, the first differentiation medium is supplemented with a WNT signaling activator at a concentration in the range of about 5μM to about 12 μM. In some embodiments, the first differentiation medium is supplemented with a WNT signaling activator at a concentration in the range of about 8 μM to about 10 μM, e.g., at about 8 μM, at about 9 μM, or at about 10μM.

[0115] In some embodiments, the first differentiation medium is supplemented with CHIR99021 as a WNT signaling activator at a concentration in the range of about 8 μM to about 10 μM, e.g., at about 8 μM, at about 9 μM, or at about 10μM.

[0116] In some embodiments, the duration for the WNT signaling activation stage is about 1 to 2 days. For example, the time window for the WNT signaling activation stage is from D0 to D1 or from D0 to D2. BMP and TGF-β Signaling Dual Inhibition Stage

[0117] Following the WNT signaling activation stage, the EBs are subjected to a dual inhibition stage, i.e., inhibition of both BMP signaling and TGF-β signaling. The culture medium used for this dual inhibition stage is also referred to as a “second differentiation medium” . In some embodiments, the second differentiation medium comprises a BMP signaling inhibitor and a TGF-β signaling inhibitor. In some embodiments, the second differentiation medium is supplemented with a BMP signaling inhibitor and a TGF-β signaling inhibitor.

[0118] BMP signaling inhibitor

[0119] The BMP family inhibitor is a substance that inhibits BMP signaling through binding between BMP (bone morphogenetic protein) and a BMP receptor (type I or type II) . A BMP signaling inhibitor suitable for use herein includes proteinaceous inhibitors and small molecule inhibitors. Examples of such proteinaceous inhibitors include Noggin, chordin and follostatin. Examples of such small molecule inhibitors include Dorsomorphin and its derivatives, LDN193189 and its derivatives. These compounds are commercially available and are readily available. Preferably, LDN 193189 is used. In certain embodiments, the BMP inhibitor comprises Dorsomorphin, LDN193189 or a combination thereof.

[0120] Representative structures of certain BMP inhibitors that may be used in the culture medium of the present disclosure are provided below, many of which are widely commercially available with indicated Cat. No. LDN193189 (MCE Cat. #HY-12071A, CAS No. : 1062368-24-4) . Dorsomorphin (Sigma-Aldrich Cat. #P5499;  APExBio Cat. #B3252; MCE Cat. #HY-13418A; CAS No. : 866405-64-3) .

[0121] It has been demonstrated in this application that the concentration of the BMP signaling inhibitor in the second differentiation medium has a significant impact on effective differentiation of the cells towards iMSCs. According to this disclosure, the BMP signaling inhibitor is used at a concentration of at least 0.15 μM for the dual inhibition stage. In some embodiments, the concentration of the BMP signaling inhibitor in the second differentiation medium is in the range of about 0.15μM to about 5.0μM. In some embodiments, the concentration of the BMP signaling inhibitor in the second differentiation medium is in the range of about 0.2μM to about 5.0μM. In some embodiments, the concentration of the BMP signaling inhibitor in the second differentiation medium is in the range of about 0.2μM to about 2.0μM. In some embodiments, the concentration of the BMP signaling inhibitor in the second differentiation medium is in the range of about 0.2μM to about 1.0μM. In some embodiments, the concentration of the BMP signaling inhibitor in the second differentiation medium is in the range of about 0.2μM to about 0.5μM, e.g., about 0.2μM, about 0.3μM, about 0.4μM, or about 0.5μM.

[0122] In some embodiments, the second differentiation medium is supplemented with LDN193189 as a BMP signaling inhibitor at a concentration of about 0.2μM to about 0.5μM, e.g., about 0.2μM, about 0.3μM, about 0.4μM, or about 0.5μM.

[0123] TGF-β signaling inhibitor

[0124] TGF-β signaling typically begins with binding of a TGF-β superfamily ligand to a Type II receptor, which recruits and phosphorylates a Type I receptor. The Type I receptor then phosphorylates SMADs, which act as transcription factors in the nucleus and regulate target gene expression. Alternatively, TGF-β signaling can activate MAP kinase signaling pathways, for example, via p38 MAP kinase.

[0125] The TGF-β signaling inhibitor as used herein include an agent that reduces the activity of the TGF-β signaling pathway. There are many different ways of disrupting the TGF-βsignaling pathway. For example, TGF-β signaling may be disrupted by: inhibition of TGF-βexpression by a small-interfering RNA strategy; inhibition of furin (aTGF-β activating protease) ; inhibition of the pathway by physiological inhibitors, such as inhibition of BMP by Noggin, DAN or DAN-like proteins; neutralization of TGF-β with a monoclonal antibody; inhibition with small-molecule inhibitors of TGF-β receptor kinase 1 (also known as activin receptor-like kinase, ALK5) , ALK4, ALK6, ALK7 or other TGF-β-related receptor kinases; inhibition of Smad 2 and Smad 3 signaling by overexpression of their physiological inhibitor, Smad 7, or by using thioredoxin as an Smad anchor disabling Smad from activation.

[0126] For example, a TGF-β signaling inhibitor may target a serine / threonine protein kinase selected from: TGF-β receptor kinase 1, ALK4, ALK5, ALK7, or p38. ALK4, ALK5 and ALK7 are all closely related receptors of the TGF-β superfamily. An inhibitor of any one of these kinases is one that effects a reduction in the enzymatic activity of any one (or more) of these kinases.

[0127] In certain embodiments, a TGF-β signaling inhibitor may bind to and inhibit the activity of a Smad protein, such as R-SMAD or SMAD 1-5 (i.e., SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD4 or SMAD5) .

[0128] In certain embodiments, a TGF-β signaling inhibitor may bind to and reduce the activity of Ser / Thr protein kinase selected from: TGF-β receptor kinase 1, ALK4, ALK5, ALK7, or p38.

[0129] A TGF-β signaling inhibitor suitable for use herein may be a protein, a peptide, a small-molecule, a small-interfering RNA, an antisense oligonucleotide, an aptamer, an antibody or an antigen-binding portion thereof. The inhibitor may be naturally occurring or synthetic. Examples of small-molecule TGF-β inhibitors that can be used in the context of the present disclosure include, but are not limited to, RepSox (2- [5- (6-methylpyridin-2-yl) -1H-pyrazol-4-yl] -1,5-naphthyridine) , SB431542, SB505124, LY36494, SJN-2511, A83-01, D4476, GW788388, LY364947, LY580276, SB525334, SD208, GW6604, and a combination thereof. Preferably, SB431542 is used.

[0130] In certain embodiments, the TGF-β signaling inhibitor is selected from the group consisting of RepSox, A83-01, SB431542, D4476, GW788388, LY364947, SB525334, SB505124, SD208, GW6604, and a combination thereof.

[0131] Representative structures of certain TGF-β inhibitors suitable for use herein are provided below, many of which are widely commercially available with indicated Cat. No. RepSox (2- [5- (6-methylpyridin-2-yl) -1H-pyrazol-4- yl] -1, 5-naphthyridine) (Sigma-Aldrich Cat. #R0158; APExBio Cat. #A3754; MCE Cat. #HY-13012; CAS No. : 446859-33-2) . A83-01 (Sigma-Aldrich Cat. #SML0788; APExBio  Cat. #A3133; MCE Cat. #HY-10432; CAS No. : 909910-43-6) . SB431542 (APExBio Cat. #A8249,  CAS No. : 301836-41-9) . D4476 (Sigma-Aldrich Cat. #D 1944;  APExBio Cat. #A3342; MCE Cat. #HY-10324; CAS No. : 301836-43-1) . GW788388 (APExBio Cat. #A8301; MCE Cat. # HY-10326; CAS No. : 452342-67-5) . LY364947 (Sigma-Aldrich Cat. #L6293; APExBio Cat.  #B2287; MCE Cat. #HY-31462; CAS No. : 396129-53-6) . SB525334 (Sigma-Aldrich Cat. #S8822; APExBio  Cat. #A5602; MCE Cat. #HY-12043; CAS No. : 356559-20-1) . SB505124 (APExBio Cat. #B2289; MCE Cat. #HY-13521;  CAS No. : 694433-59-5) . SD208 (Sigma-Aldrich Cat. #S7071; APExBio Cat. #A3808; MCE Cat. #HY-10324; CAS No. : 627536-09-8) . GW6604 (absin Cat. #abs814099; CAS No. : 452342-37-9) .

[0132] It has been demonstrated in this application that inhibition of TGF-β signaling was crucial for effective differentiation of cells towards iMSCs. In some embodiments, the concentration of the TGF-β signaling inhibitor in the second differentiation medium is in the range of about 1 μM to about 30 μM. In some embodiments, the concentration of the TGF-βsignaling inhibitor in the second differentiation medium is in the range of about 2 μM to about 25μM. In some embodiments, the concentration of the TGF-β signaling inhibitor in the second differentiation medium is in the range of about 5μM to about 25μM. In some embodiments, the concentration of the TGF-β signaling inhibitor in the second differentiation medium is about 5μM, about 10μM, about 15μM, or about 20μM.

[0133] In some embodiments, the second differentiation medium is supplemented with SB431542 as a TGF-β signaling inhibitor at a concentration of about 5μM to about 25μM, e.g., at about 5μM, about 10μM, about 15μ M, or about 20μM.

[0134] Sonic hedgehog (SHH) agonist

[0135] In some embodiments, in the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage, the EBs are cultured also in the presence of a sonic hedgehog (SHH) agonist. In some embodiments, the second differentiation medium further comprises a sonic hedgehog agonist. In some embodiments, the second differentiation medium is further supplemented with a sonic hedgehog agonist.

[0136] The sonic hedgehog (SHH) agonist, also referred to as SHH signal-stimulating agent, used in the present disclosure is a substance that causes disinhibition of Smoothened (Smo) due to binding of SHH to its receptor, Patched (Ptch1) , and also causes activation of Gli2, which follows the disinhibition. The SHH agonist may be of a small organic molecule and a polypeptide. Examples of SHH agonists include SHH, SHH C24II, SHH C25II, SAG, SMO-IN-1, purmorphamine, and analogues thereof.

[0137] Representative structures of certain SHH agonists suitable for use herein are provided below, many of which are widely commercially available with indicated Cat. No. SHH: Pepprotech, #100-45, with an amino acid sequence of: SHH C24II: Nuwacell; Procell, #PCK216; MCE, #HY-P7407, with an amino acid sequence of: SHH C25II: Nuwacell; Procell, #PCK216; MCE, #HY-P7407, with an amino acid sequence of: Purmorphamine: CAS No. : 483367-10-8 SAG: APExBio, #B5837, CAS No. : 912545-86-9 SMO-IN-I: MCE, #HY-147743, CAS No. : 1126365-66-9

[0138] In some embodiments, the sonic hedgehog agonist is used at a concentration of about 1 ng / mL to about 1000ng / mL. In some embodiments, the sonic hedgehog agonist is used at a concentration of about 50ng / mL to about 500ng / mL. In some embodiments, the sonic hedgehog agonist is used at a concentration of about 100ng / mL to about 500ng / mL, e.g., about 100ng / mL, about 150ng / mL, about 200ng / mL, about 250ng / mL, about 300ng / mL, about 350ng / mL, about 400ng / mL, about 450 ng / mL, or about 500 ng / mL.

[0139] In some embodiments, the second differentiation medium is supplemented with SHH as a sonic hedgehog agonist at a concentration of about 100ng / mL to about 500ng / mL, e.g., about 100ng / mL, about 150ng / mL, about 200ng / mL, about 250ng / mL, about 300ng / mL, about 350ng / mL, about 400ng / mL, about 450ng / mL, or about 500 ng / mL.

[0140] RAR Agonist

[0141] In some embodiments, in the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage, the EBs are cultured also in the presence of a retinoic acid receptor (RAR) agonist. In some embodiments, the second differentiation medium further comprises a RAR agonist. In some embodiments, the second differentiation medium further comprises a retinoic acid receptor (RAR) agonist. In some embodiments, the second differentiation medium is further supplemented with a retinoic acid receptor (RAR) agonist. It has been surprisingly found in this application that supplementation of the second differentiation medium with a retinoic acid receptor (RAR) agonist such as retinoic acid can improve the expression strength of CD90 in the iMSC cells. As a result, iMSCs derived therefrom can be stably passaged for more times substantially without losing the characteristics such as morphology and phenotype of the stem cells.

[0142] RARs are nuclear hormone receptors of the NR1B class, which can function as heterodimers with retinoid X receptors (RXRs) . A RAR agonist is a compound that binds to retinoic acid receptors, leading to the activation of certain gene expression. A variety of RAR agonists have been previously described (see, e.g., Chisholm and Whiting, Methods in Enzymology (2020) , Vol 637, pages 453-491, Chapter 17, Design of synthetic retinoids) and also commercially available (e.g., through R&D Systems) .

[0143] In some embodiments, the retinoic acid receptor (RAR) agonist is selected from retinoic acid (RA) or an analog of RA. Examples of the analog of retinoic acid include EC23, WYC-209, AC-55649, Ch 55, TTNPB, and the like.

[0144] Representative structures of certain RAR agonists that may be used in the culture medium of the present disclosure are provided below, many of which are widely commercially available with indicated Cat. No.

[0145] RA: MCE, HY-146495.

[0146] EC23: MCE, HY-12309.

[0147] WYC-209: MCE, HY-124136.

[0148] TTNPB: MCE, HY-15682.

[0149] Ch55: MCE, HY-107397.

[0150] AC-55649: MCE, HY-108526.

[0151] In some embodiments, the RAR agonist is used at a concentration of about 0.1 μM to about 10 μM. In some embodiments, the RAR agonist is used at a concentration of about 0.1 μM to about 5 μM. In some embodiments, the RAR agonist is used at a concentration of about 0.1 μM to about 2 μM, e.g., about 0.1 μM, about 0.5 μM, about 1.0 μM, about 1.5 μM, or about 2.0 μM.

[0152] In some embodiments, the second differentiation medium is supplemented with RA as a RAR agonist at a concentration of about 0.1 μM to about 2 μM, e.g., about 0.1 μM, about 0.5 μM, about 1.0 μM, about 1.5 μM, or about 2.0 μM.

[0153] In some embodiments, the duration for the dual inhibition stage is about 1 to 2 days. In some embodiments, the duration for the dual inhibition stage is about 1 day. For example, the time window for the dual inhibition stage is from D2 to D4, and preferably D2 to D3. Growth Factor Activation Stage

[0154] Following the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage, the EBs are subjected to the growth factor activation stage. In some embodiments, in the growth factor activation stage, the EBs are cultured in a third differentiation medium comprising or supplemented with a growth factor. It has been demonstrated herein that more effective derivation of iMSCs can be achieved when adding a growth factor activation stage performed after the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage.

[0155] Growth factors are molecules capable of stimulating a variety of cellular processes, including, for example, cell proliferation, cell migration, differentiation, and multicellular morphogenesis during development and tissue healing. Examples of growth factors include, without limitation, Epidermal Growth Factors (EGFs) , Fibroblast Growth Factors (FGFs) , Insulin-like Growth Factors (IGFs) , Platelet-derived Growth Factors (PDGFs) , transforming growth factor beta (TGFβ) , and Vascular Endothelial Growth Factors (VEGFs) .

[0156] Epidermal growth factor (EGF) refers to any polypeptide of the epidermal growth factor (EGF) family of proteins, or variant thereof, that stimulates cell growth and differentiation. Typically EGF exerts its activity by binding to the epidermal growth factor receptor. Accordingly, any variant of the EGF molecules that maintains their biological activity, for example, C-terminal truncated molecules, or molecules truncated at the N-terminal may be used in line with the present disclosure. The EGF used in the culture medium of some embodiments of this disclosure can be a purified, a synthetic or a recombinantly expressed EGF protein. EGF can be obtained from various commercial sources.

[0157] Insulin-like growth factors (IGFs) are proteins with high sequence similarity to insulin. IGFs are part of a complex system that cells use to communicate with their physiologic environment. Insulin-like growth factor 1 (commonly referred to as IGF-1, at times IGF-I) is mainly secreted by the liver as a result of stimulation by growth hormone (GH) . IGF-1 is important for both the regulation of normal physiology, as well as a number of pathological states, including cancer. Insulin-like growth factor 2 (IGF-2, at times IGF-II) is thought to be a primary growth factor required for early development while IGF-1 expression is required for achieving maximal growth. The IGF used in the culture medium of some embodiments of this disclosure can be a purified, a synthetic or a recombinantly expressed IGF protein. IGF can be obtained from various commercial sources.

[0158] Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a signaling protein produced by many cells that stimulate the formation of blood vessels. VEGFs are important signaling proteins involved in both vasculogenesis (the de novo formation of the embryonic circulatory system) and angiogenesis (the growth of blood vessels from pre-existing vasculature) . The VEGF used in the culture medium of some embodiments of this disclosure can be a purified, a synthetic or a recombinantly expressed VEGF protein. VEGF can be obtained from various commercial sources.

[0159] Platelet-derived growth factor (PDGF) refers to any of four different isoforms of PDGF that activate cellular responses through two different receptors. Those isoforms include A (observed as a homodimer designated PDGF-AA and as part of a heterodimer with the B isoform designated PDGF-AB) , B (observed as a homodimer designated PDGF-BB and as part of a heterodimer with the A isoform designated PDGF-AB) , C (observed as a homodimer designated PDGF-CC) and D (observed as a homodimer designated PDGF-DD) . Thus, the term “PDGF” as used herein refers generally to the known PDGF homo-and heterodimers (e.g., PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, and PDGF-DD) . According to some embodiments, PDGF used in the culture medium of some embodiments of this disclosure is PDGF-BB. The PDGF used in the culture medium of some embodiments of this disclosure can be a purified, a synthetic or a recombinantly expressed PDGF protein. PDGF can be obtained from various commercial sources.

[0160] Fibroblast Growth Factors (FGFs) are a class of proteins which can stimulate or maintain the functions required for the metabolism, tissue homeostasis and development of cells via signaling axis mediated with fibroblast growth factor receptors. In certain embodiments, the fibroblast growth factor comprises FGF2 (e.g., Nuwacell) , and FGF1 (e.g., MCE Cat. #HY-P7001) . FGF2, also generally known as basic fibroblast growth factor (FGF basic, bFGF or FGF-β) , is a member of the fibroblast growth factor family. The FGF2 used in the culture medium of some embodiments of this disclosure can be a purified, a synthetic or a recombinantly expressed FGF2 protein.

[0161] Transforming growth factor beta (TGFβ or TGF-β) refers to any isoform of the transforming growth factor beta (β) , which functions through the same receptor signaling system in the control of proliferation, differentiation, and other functions in many cell types. TGFβ acts in inducing transformation and also acts as a negative autocrine growth factor. According to some embodiments of this disclosure, the TGFβ comprises TGFβ1, TGFβ2 and / or TGFβ3. Transforming growth factor beta-1 (TGFβ1) is a polypeptide member of the transforming growth factor beta superfamily of cytokines. The TGFβ1 used in the culture medium of some embodiments of this disclosure can be a purified, a synthetic or a recombinantly expressed TGFβ1 protein. TGFβ1 can be obtained from various commercial sources. Transforming growth factor beta-2 (TGFβ2) is a polypeptide member of the transforming growth factor beta superfamily of cytokines. TGFβ2 has a vital role during embryonic development. The TGFβ2 used in the culture medium of some embodiments of this disclosure can be a purified, a synthetic or a recombinantly expressed TGFβ2 protein. TGFβ2 can be obtained from various commercial sources. Transforming growth factor beta-3 (TGFβ3) is a polypeptide member of the transforming growth factor beta superfamily of cytokines. The TGFβ3 used in the culture medium of some embodiments of this disclosure can be a purified, a synthetic or a recombinantly expressed TGFβ3 protein. TGFβ3 can be obtained from various commercial sources.

[0162] According to some embodiments, the growth factor is selected from the group consisting of EGF, IGF, VEGF, PDGF, FGF, TGFβ and a combination thereof. In some embodiments, the growth factor is selected from EGF, IGF, VEGF, PDGF, FGF, or TGFβ. In some embodiments, the growth factor is selected from FGF2, TGFβ (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3) , or a combination thereof. In some embodiments, the growth factor is FGF2, TGFβ1 or a combination thereof.

[0163] In some embodiments, the growth factor is selected from FGF, or TGFβ. In some embodiments, the growth factor is selected from FGF2, or TGFβ1. In accordance with this disclosure, adding TGFβ or FGF alone is beneficial to derive higher purity of iMSCs at lower cost in contrast to addition of both TGFβ and FGF.

[0164] According to the present disclosure, the concentration of the growth factor is not particularly limited as long as it can promote the differentiation of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of the growth factor is 0.5 to 20 ng / ml, e.g., 0.5 to 15 ng / ml, 0.5 to 10 ng / ml, 1 to 5 ng / ml, 1 to 10 ng / ml, 1 to 15 ng / ml, 1 to 20 ng / ml, 2 to 5 ng / ml, 2 to 10 ng / ml, 2 to 15 ng / ml, 2 to 20 ng / ml, 3 to 5 ng / ml, 3 to 10 ng / ml, 3 to 15 ng / ml, 3 to 20 ng / ml, 4 to 5 ng / ml, 4 to 10 ng / ml, 4 to 15 ng / ml, 4 to 20 ng / ml, 5 to 10 ng / ml, 5 to 15 ng / ml or 5 to 20 ng / ml. According to some embodiments, the concentration of the growth factor is 1 ng / ml, 2 ng / ml, 3 ng / ml, 4 ng / ml, 5 ng / ml, 6 ng / ml, 7 ng / ml, 8 ng / ml, 9 ng / ml, 10 ng / ml, 11 ng / ml, 12 ng / ml, 13 ng / ml, 14 ng / ml, 15 ng / ml, 16 ng / ml, 17 ng / ml, 18 ng / ml, 19 ng / ml or 20 ng / ml. According to preferred embodiments, the concentration of the growth factor is 1 to 15 ng / ml.

[0165] In some embodiments, the third differentiation medium is supplemented with FGF2 and TGF-β1. In some embodiments, the third differentiation medium is supplemented with FGF2 or TGF-β1.

[0166] In some embodiments, the growth factor activation stage is performed for about 2 to about 7 days. In some embodiments, the growth factor activation stage is performed from Day 6 to Day 10. In some embodiments, the growth factor activation stage is performed from Day 8 to Day 10. Transitional Differentiation Stage

[0167] In some embodiments, the multistage differentiation process further comprises a first and / or a second transitional differentiation stage intervening between the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage and the growth factor activation stage, wherein the first transitional differentiation stage comprises culturing the EBs under the conditions which keep the EBs from the inhibition of TGF-β signaling, and the second transitional differentiation stage comprises culturing the EBs under the conditions which keep the EBs from the inhibition of both TGF-β signaling and BMP signaling. Due to the presence of the first and / or second transitional differentiation stages between the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage and the growth factor activation stage, the interference between the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage and the growth factor activation stage on the differentiation of iMSCs can be reduced so as to further improve the purity of iMSCs. The population of iMSCs derived in this way can have a high purity of at least about 95%. As a result, the population of iMSCs having such high purity can be directly used for clinical applications without any enrichment or sorting, thereby greatly simplifying the production process so as to save the time and cost.

[0168] In more preferable embodiments, the multistage differentiation process further comprises first and second transitional differentiation stages between the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage and the growth factor activation stage, wherein the first transitional differentiation stage comprises culturing the EBs under the conditions which keep the EBs from the inhibition of TGF-β signaling, and the second transitional differentiation stage comprises culturing the EBs under the conditions which keep the EBs from the inhibition of both TGF-β signaling and BMP signaling. In most preferable embodiments, the multistage differentiation process further comprises a transitional differentiation stage between the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage and the growth factor activation stage, wherein this transitional differentiation stage comprises culturing the EBs under the conditions which keep the EBs from the inhibition of both TGF-β signaling and BMP signaling. In such way, the interference between the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage and the growth factor activation stage on the differentiation of iMSCs can be minimized so as to provide optimal purity for iMSCs.

[0169] In some embodiments, the first transitional differentiation stage comprises culturing the EBs under the conditions which do not inhibit the TGF-β signaling but do inhibit the BMP signaling of the EBs. This is also referred to as BMP signaling singular inhibition. BMP signaling singular inhibition can be performed using any one or more of the BMP signaling inhibitors described above at a concentration described above for the dual inhibition stage.

[0170] In some embodiments, the first transitional differentiation stage is performed by using a first transitional culture medium obtained by removing the TGF-β signaling inhibitor from the second differentiation medium, and the second transitional differentiation stage is performed by using a second transitional culture medium obtained by removing the TGF-β signaling inhibitor and the BMP signaling inhibitor from the second differentiation medium.

[0171] In some embodiments, the first transitional culture medium is supplemented with the BMP signaling inhibitor, the sonic hedgehog agonist and the RAR agonist. In preferable embodiments, the first transitional culture medium is supplemented with the BMP signaling inhibitor and one or two of the sonic hedgehog agonist and the RAR agonist. In more preferable embodiments, the first transitional culture medium is supplemented with the BMP signaling inhibitor. In some embodiments, the second transitional culture medium is supplemented with one or two of the sonic hedgehog agonist and the RAR agonist. In preferable embodiments, the second transitional culture medium is supplemented without any differentiation factor. In more preferable embodiments, the second transitional culture medium is a basal medium. In most preferable embodiments, the second transitional culture medium is a basal medium same as that comprised in the second differentiation medium.

[0172] In some embodiments, the first and / or second transitional differentiation stages are performed for about 1 to about 5 days. In some embodiments, the first and / or second transitional differentiation stages are performed from Day 3 to Day 6, or from Day 3 to Day 8.

[0173] In some embodiments, the dual inhibition stage is performed from Day 2 to Day 3, and the first and / or second transitional differentiation stages areperformed from Day 3 to Day 6, or from Day 3 to Day 8.Step (iii) -maturation and expansion

[0174] After the multistage differentiation process, the EBs are further cultured to permit maturation and expansion of cells in the EBs. In some embodiments, the maturation and expansion step is performed entirely under a two dimensional ( “2D” ) culture condition. In some embodiments, the maturation and expansion step comprises initially culturing the EBs in a 3D suspension culture, followed by a 2D culture. In accordance with this disclosure, the former culture mode is better than the latter culture mode in view of providing better purity for iMSCs.

[0175] In some embodiments, the duration of the maturation and expansion step is about 4 days to 6 days, preferably about 4 days. In some embodiments, the maturation and expansion step comprises initially culturing the EBs in a 3D suspension culture for about 1-3 days, followed by a 2D culture for 3-5 days. In some embodiments, the maturation and expansion step is performed by culturing the EBs entirely in a 2D culture for 4-6 days.

[0176] In some embodiments, the maturation and expansion process comprises expanding cells in the EBs for one or more passages with the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the cells substantially maintained. In some embodiments, the maturation and expansion process comprises expanding cells in the EBs for at least four passages such as 4 passages with the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the cells substantially maintained.

[0177] The 2D culture and the 3D culture can be carried out using known technologies in the art of cell culture. In the 2D culture, cells are plated directly onto a culture substrate and the cells experience adherent growth along a surface of the substrate. In the 3D culture, cells are suspended in a culture medium and grown in a three-dimensional space. Culture Media Employed in the Method

[0178] The present method is carried out under serum-free and xeno-free conditions and utilizes serum-free, and xeno-free media for each of the method steps. In other words, each of the maintenance medium, the differentiation media, and the maturation and expansion medium is a serum-free, and xeno-free culture medium. In some embodiments, each of the differentiation media is a serum-free, xeno-free and chemically defined culture medium. In some embodiments, each of the maintenance medium, the differentiation media, and the maturation and expansion medium is a serum-free, xeno-free and chemically defined culture medium. The maintenance medium for the step (i) have been described above. The differentiation media for the step (ii) and the maturation and expansion medium for the step (iii) will be described below.

[0179] Differentiation Media

[0180] The multi-stage differentiation process of the method utilizes first to third differentiation media and first and second transitional culture media to perform the WNT signaling activation stage, the BMP and TGF-β dual inhibition stage, the growth factor activation stage, and the first and second transitional differentiation stages, respectively. In some embodiments, each of the first to third differentiation media and the first to second transitional culture media is a serum-free, xeno-free and chemically defined culture medium comprising respective differentiation factor (s) or supplement (s) described herein above to achieve the objective for each stage. In some embodiments, the first to third differentiation media and the first to second transitional culture media are serum-free, xeno-free and chemically defined culture media comprising a same culture medium as basal solution. Alternatively, the basal solutions for the first to third differentiation media and the first to second transitional culture media may be also different from each other.

[0181] In some embodiments, the same culture medium in the differentiation media and the transitional culture media comprises a basal medium, transferrin, glutamine or a derivative thereof, an ascorbic compound, an ethanolamine-based compound, a putrescine-based compound, human serum albumin (HSA) , and an insulin-based compound. It is construed that the basal medium comprised in the same culture medium in the differentiation media and the transitional culture media is a well-established basal medium in the art of cell culture, which may be also referred herein to as a classical basal medium. In some embodiments, the same culture medium in the differentiation media and the transitional culture media further comprises selenite, monothioglycerol (MTG) , mB27, or a combination thereof.

[0182] Basal solution

[0183] Basal solution for the differentiation media used in the multistage differentiation process is a basal component of the media. The basal solutions of the differentiation media may be also referred herein to as basal media or modified basal media for the differentiation media. Generally, the basal solution comprises about 95%to 99%by volume of a differentiation medium. The basal solution for the differentiation media according to this disclosure may be obtained by modifying a classical basal medium, for example, adding one or more suitable components thereto.

[0184] Examples of the classical basal medium include DMEM / F12 (e.g., Gibco Cat. #C11330500BT) , BME medium (e.g., Gibco Cat. #21010046, or Sigma-Aldrich Cat. #B9638) , IMDM medium (e.g., Gibco Cat. #12440053; or Sigma-Aldrich Cat. #I3390) , Eagle MEM medium (e.g., Minimum Essential Medium (MEM) , developed by Harry Eagle, Sigma-Aldrich Cat. #M2414  / M2279  / M5690) , α-MEM medium (e.g., Gibco Cat. #12561056; or Sigma-Aldrich Cat. #M0894) , DMEM medium (e.g., Gibco Cat. #21068028) , RPMI 1640 medium (e.g., Gibco Cat. #1 1875093) , Ham's Fl2 medium (e.g., Gibco Cat. #11765054) , or a mixture thereof. When the culture medium comprises the mixture of two or more classical basal media, the relative ratios of these classical basal media may be arbitrary.

[0185] Some suitable components which can be added into the classical basal medium will be described below.

[0186] Ethanolamine-based compound

[0187] As used herein, “ethanolamine-based compound” refers to ethanolamine, its derivatives, salts thereof, or mixtures thereof.

[0188] Ethanolamine (also referred to as 2-aminoethanol, monoethanolamine, ETA, or MEA) is an organic chemical compound with the formula HOCH2CH2NH2 or C2H7NO. The molecule is bifunctional, containing both a primary amine and a primary alcohol. Ethanolamine is commonly called monoethanolamine or MEA in order to be distinguished from diethanolamine (DEA) and triethanolamine (TEA) .

[0189] Examples of the derivatives of ethanolamine include, but are not limited to, substituted ethanolamines such as phosphatidylethanolamine. Examples of the salts of ethanolamine and its derivatives include, but are not limited to, ethanolamine hydrochloride, and ethanolamine hydrobromide as well as hydrochloride or hydrobromide of substituted ethanolamines.

[0190] In some embodiments, the ethanolamine-based compound used in a culture medium may be ethanolamine. In some embodiments, the ethanolamine-based compound used in a culture medium may be ethanolamine hydrochloride.

[0191] According to the present disclosure, the concentration of the ethanolamine-based compound is not particularly limited as long as it does not impede the differentiation of iMSCs. In some embodiments, the concentration of an ethanolamine-based compound is in the range of 1 to 30 μM, e.g., 1 to 5 μM, 1 to 10 μM, 1 to 15 μM, 1 to 20 μM, 1 to 25 μM, 1 to 30 μM, 2 to 5 μM, 2 to 10 μM, 2 to 15 μM, 2 to 20 μM, 2 to 25 μM, 2 to 30 μM, 3 to 5 μM, 3 to 10 μM, 3 to 15 μM, 3 to 20 μM, 3 to 25 μM, 3 to 30 μM, 4 to 5 μM, 4 to 10 μM, 4 to 15 μM, 4 to 20 μM, 4 to 25 μM, 4 to 30 μM, 5 to 10 μM, 5 to 15 μM, 5 to 20 μM, 5 to 25 μM, or 5 to 30 μM. In some embodiments, the concentration of the ethanolamine-based compound is 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 16 μM, 17 μM, 18 μM, 19 μM, 20 μM, 21 μM, 22 μM, 23 μM, 24 μM, 25 μM, 26 μM, 27 μM, 28 μM, 29 μM, or 30 μM. In preferred embodiments, the concentration of the ethanolamine-based compound is 5 to 30 μM.

[0192] Putrescine-based compound

[0193] As used herein, “putrescine-based compound” refers to putrescine and its derivatives, salts thereof, or mixtures thereof.

[0194] Putrescine is an organic compound with the formula (CH2) 4 (NH2) 2. Putrescine is commonly called 1, 4-butanediamine, and produced on an industrial scale by the hydrogenation of succinonitrile.

[0195] Examples of the derivatives of putrescine include, but are not limited to, substituted putrescines such as N-acetylputrescine. Examples of the salts of putrescine and its derivatives include, but are not limited to, putrescine hydrochloride, putrescine dihydrochloride, putrescine dihydrobromide, and dihydrochloride or dihydrobromide of substituted putrescines such as N-acetylputrescine.

[0196] In some embodiments, the putrescine-based compound used in the basal medium may be putrescine. In some embodiments, the putrescine-based compound used in a culture medium may be putrescine dihydrochloride.

[0197] According to the present disclosure, the concentration of the putrescine-based compound is not particularly limited as long as it does not impede the differentiation of iMSCs. In some embodiments, the concentration of the putrescine-based compound is in the range of 1 to 30 μM, e.g., 1 to 5 μM, 1 to 10 μM, 1 to 15 μM, 1 to 20 μM, 1 to 25 μM, 1 to 30 μM, 2 to 5 μM, 2 to 10 μM, 2 to 15 μM, 2 to 20 μM, 2 to 25 μM, 2 to 30 μM, 3 to 5 μM, 3 to 10 μM, 3 to 15 μM, 3 to 20 μM, 3 to 25 μM, 3 to 30 μM, 4 to 5 μM, 4 to 10 μM, 4 to 15 μM, 4 to 20 μM, 4 to 25 μM, 4 to 30 μM, 5 to 10 μM, 5 to 15 μM, 5 to 20 μM, 5 to 25 μM, or 5 to 30 μM. In some embodiments, the concentration of the putrescine-based compound is 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 16 μM, 17 μM, 18 μM, 19 μM, 20 μM, 21 μM, 22 μM, 23 μM, 24 μM, 25 μM, 26 μM, 27 μM, 28 μM, 29 μM, or 30 μM. In preferred embodiments, the concentration of the putrescine-based compound is 1 to 20 μM.

[0198] Transferrin

[0199] According to some embodiments, the culture medium (e.g., a basal solution) of this disclosure may comprise a transferrin. According to some embodiments, the transferrin may be holo-transferrin, partially saturated transferrin, or recombinant transferrin.

[0200] According to the present disclosure, the concentration of the transferrin is not particularly limited as long as it doe not impede the differentiation of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of the transferrin is 1 to 200 μg / ml, e.g., 1 to 5 μg / ml, 1 to 10 μg / ml, 1 to 15 μg / ml, 1 to 20 μg / ml, 1 to 25 μg / ml, 1 to 30 μg / ml, 1 to 35 μg / ml, 1 to 40 μg / ml, 1 to 45 μg / ml, 1 to 50 μg / ml, 1 to 60 μg / ml, 1 to 70 μg / ml, 1 to 80 μg / ml, 1 to 90 μg / ml, 1 to 100 μg / ml, 1 to 110 μg / ml, 1 to 120 μg / ml, 1 to 130 μg / ml, 1 to 140 μg / ml, 1 to 150 μg / ml, 1 to 160 μg / ml, 1 to 170 μg / ml, 1 to 180 μg / ml, 1 to 190 μg / ml, 1 to 200 μg / ml, 3 to 5 μg / ml, 3 to 10 μg / ml, 3 to 15 μg / ml, 3 to 20 μg / ml, 3 to 25 μg / ml, 3 to 30 μg / ml, 3 to 35 μg / ml, 3 to 40 μg / ml, 3 to 45 μg / ml, 3 to 50 μg / ml, 3 to 60 μg / ml, 3 to 70 μg / ml, 3 to 80 μg / ml, 3 to 90 μg / ml, 3 to 100 μg / ml, 3 to 110 μg / ml, 3 to 120 μg / ml, 3 to 130 μg / ml, 3 to 140 μg / ml, 3 to 150 μg / ml, 3 to 160 μg / ml, 3 to 170 μg / ml, 3 to 180 μg / ml, 3 to 190 μg / ml, 3 to 200 μg / ml, 5 to 10 μg / ml, 5 to 15 μg / ml, 5 to 20 μg / ml, 5 to 25 μg / ml, 5 to 30 μg / ml, 5 to 35 μg / ml, 5 to 40 μg / ml, 5 to 45 μg / ml, 5 to 50 μg / ml, 5 to 60 μg / ml, 5 to 70 μg / ml, 5 to 80 μg / ml, 5 to 90 μg / ml, 5 to 100 μg / ml, 5 to 110 μg / ml, 5 to 120 μg / ml, 5 to 130 μg / ml, 5 to 140 μg / ml, 5 to 150 μg / ml, 5 to 160 μg / ml, 5 to 170 μg / ml, 5 to 180 μg / ml, 5 to 190 μg / ml, 5 to 200 μg / ml, 7 to 10 μg / ml, 7 to 15 μg / ml, 7 to 20 μg / ml, 7 to 25 μg / ml, 7 to 30 μg / ml, 7 to 35 μg / ml, 7 to 40 μg / ml, 7 to 45 μg / ml, 7 to 50 μg / ml, 7 to 60 μg / ml, 7 to 70 μg / ml, 7 to 80 μg / ml, 7 to 90 μg / ml, 7 to 100 μg / ml, 7 to 110 μg / ml, 7 to 120 μg / ml, 7 to 130 μg / ml, 7 to 140 μg / ml, 7 to 150 μg / ml, 7 to 160 μg / ml, 7 to 170 μg / ml, 7 to 180 μg / ml, 7 to 190 μg / ml, 7 to 200 μg / ml, 9 to 10 μg / ml, 9 to 15 μg / ml, 9 to 20 μg / ml, 9 to 25 g / ml, 9 to 30 μg / ml, 9 to 35 μg / ml, 9 to 40 μg / ml, 9 to 45 μg / ml, 9 to 50 μg / ml, 9 to 60 μg / ml, 9 to 70 μg / ml, 9 to 80 μg / ml, 9 to 90 μg / ml, 9 to 100 μg / ml, 9 to 110 μg / ml, 9 to 120 μg / ml, 9 to 130 μg / ml, 9 to 140 μg / ml, 9 to 150 μg / ml, 9 to 160 μg / ml, 9 to 170 μg / ml, 9 to 180 μg / ml, 9 to 190 μg / ml or 9 to 200 μg / ml. According to some embodiments, the concentration of the transferrin is 1 g / ml, 2 μg / ml, 3 μg / ml, 4 μg / ml, 5 μg / ml, 6 μg / ml, 7 μg / ml, 8 μg / ml, 9 μg / ml, 10 μg / ml, 15 μg / ml, 20 μg / ml, 25 μg / ml, 30 μg / ml, 35 μg / ml, 40 μg / ml, 45 μg / ml, 50 μg / ml, 60 μg / ml, 70 μg / ml, 80 μg / ml, 90 μg / ml, 100 μg / ml, 110 μg / ml, 120 μg / ml, 130 μg / ml, 140 μg / ml, 150 μg / ml, 160 μg / ml, 170 μg / ml, 180 μg / ml, 190 μg / ml or 200 μg / ml. According to preferred embodiments, the concentration of the transferrin is 1 to 150 μg / m.

[0201] Insulin-based compound

[0202] As used herein, “insulin-based compound” refers to insulin, its analogs or derivatives thereof, or mixtures thereof.

[0203] According to some embodiments, the insulin-based compound comprises an insulin. According to some embodiments, the insulin-based compound may be analogs or derivatives of insulin such as Insulin Lispro, Insulin aspart, and Insulin glulisine.

[0204] According to the present disclosure, the concentration of the insulin-based compound is not particularly limited as long as it does not impede the differentiation of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of the insulin-based compound is 1 to 15 μg / ml, e.g., 1 to 5 μg / ml, 1 to 10 μg / ml, 1 to 15 μg / ml, 2 to 5 μg / ml, 2 to 10 μg / ml, 2 to 15 μg / ml, 3 to 5 μg / ml, 3 to 10 μg / ml, 3 to 15 μg / ml, 4 to 5 μg / ml, 4 to 10 μg / m, 4 to 15 μg / ml, 5 to 10 μg / ml, 5 to 15 μg / m, 6 to 10 μg / ml, 6 to 15 μg / m, 7 to 10 μg / ml, 7 to 15 μg / m, 8 to 10 μg / ml, 8 to 15 μg / m, 9 to 10 μg / ml, 9 to 15 μg / m, or 10 to 15 μg / ml. According to some embodiments, the concentration of the insulin-based compound is 1 μg / ml, 2 μg / ml, 3 μg / ml, 4 μg / ml, 5 μg / ml, 6 μg / ml, 7 μg / ml, 8 μg / ml, 9 μg / ml, 10 μg / ml, 11 μg / ml, 12 μg / ml, 13 μg / ml, 14 μg / ml or 15 μg / ml. According to preferred embodiments, the concentration of the insulin-based compound is 1 to 10 μg / ml.

[0205] Glutamine or its derivative

[0206] According to some embodiments, the culture medium (e.g., a basal solution) of this disclosure may comprise glutamine or its derivative.

[0207] According to some embodiments, glutamine or its derivative may be a glutamine such as L-glutamine or substituted glutamine such as an alanyl-glutamine. Alanyl-glutamine is a chemical compound which in the form L-alanyl-L-glutamine is used in dietary supplementation, in parenteral nutrition, and in cell culture. L-Alanyl-L-glutamine is sold under the name GlutaMAX by Thermo Fisher Scientific.

[0208] According to the present disclosure, the concentration of the glutamine or its derivative is not particularly limited as long as it does not impede the differentiation of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of the glutamine or its derivative is 0.1%to 5%by volume, e.g., 0.1%to 1%by volume, 0.1%to 2%by volume, 0.1%to 3%by volume, 0.1%to 4%by volume, 0.1%to 5%by volume, 0.2%to 1%by volume, 0.2%to 2%by volume, 0.2%to 3%by volume, 0.2%to 4%by volume, 0.2%to 5%by volume, 0.3%to 1%by volume, 0.3%to 2%by volume, 0.3%to 3%by volume, 0.3%to 4%by volume, 0.3%to 5%by volume, 0.4%to 1%by volume, 0.4%to 2%by volume, 0.4%to 3%by volume, 0.4%to 4%by volume, 0.4%to 5%by volume, 0.5%to 1%by volume, 0.5%to 2%by volume, 0.5%to 3%by volume, 0.5%to 4%by volume or 0.5%to 5%by volume. According to some embodiments, the concentration of the glutamine or its derivative is 0.1%by volume, 0.2%by volume, 0.3%by volume, 0.4%by volume, 0.5%by volume, 0.6%by volume, 0.7%by volume, 0.8%by volume, 0.9%by volume, 1%by volume, 2%by volume, 3%by volume, 4%by volume, or 5%by volume. According to preferred embodiments, the concentration of the glutamine or its derivative is 0.5%to 5%by volume.

[0209] Ascorbic Compound

[0210] According to some embodiments, the culture medium (e.g., a basal solution) of this disclosure may comprise an ascorbic compound.

[0211] As used herein, “ascorbic compound” refers to a compound that inhibits oxidation (usually occurring as autoxidation) in a cell, a chemical reaction that can produce free radicals. The ascorbic compound may be an ascorbic acid, an analog thereof, a derivative thereof, or a salt thereof.

[0212] The ascorbic compound comprises ascorbic acid, ascorbate such as magnesium salt such as L (+) -Ascorbic acid magnesium salt, sodium salt such as L (+) -Ascorbic acid sodium salt, and analogs or derivatives such as for example, Ascorbyl Glucoside, 3-ethylascorbic acid, Ascorbyl Tetraisopalmitate, Ascorbic acid phosphate salt, and ascorbyl palmitate.

[0213] According to some embodiments, the ascorbic compound is ascorbate. According to some embodiments, the ascorbic compound is Na Ascorbate or Mg Ascorbate.

[0214] According to the present disclosure, the concentration of the ascorbic compound is not particularly limited as long as it does not impede the differentiation of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of the ascorbic compound is 1 to 200 μg / ml, e.g., 1 to 5 μg / ml, 1 to 10 μg / ml, 1 to 15 μg / ml, 1 to 20 μg / ml, 1 to 25 μg / ml, 1 to 30 μg / ml, 1 to 35 μg / ml, 1 to 40 μg / ml, 1 to 45 μg / ml, 1 to 50 μg / ml, 1 to 60 μg / ml, 1 to 70 μg / ml, 1 to 80 μg / ml, 1 to 90 μg / ml, 1 to 100 μg / ml, 1 to 150 μg / ml, 1 to 200 μg / ml, 2 to 5 μg / ml, 2 to 10 μg / ml, 2 to 15 μg / ml, 2 to 20 μg / ml, 2 to 25 μg / ml, 2 to 30 μg / ml, 2 to 35 μg / ml, 2 to 40 μg / ml, 2 to 45 μg / ml, 2 to 50 μg / ml, 2 to 60 μg / ml, 2 to 70 μg / ml, 2 to 80 μg / ml, 2 to 90 μg / ml, 2 to 100 μg / ml, 2 to 150 μg / ml, 2 to 200 μg / ml, 3 to 5 μg / ml, 3 to 10 μg / ml, 3 to 15 μg / ml, 3 to 20 μg / ml, 3 to 25 μg / ml, 3 to 30 μg / ml, 3 to 35 μg / ml, 3 to 40 μg / ml, 3 to 45 μg / ml, 3 to 50 μg / ml, 3 to 60 μg / ml, 3 to 70 μg / ml, 3 to 80 μg / ml, 3 to 90 μg / ml, 3 to 100 μg / ml, 3 to 150 μg / ml, 3 to 200 μg / ml, 4 to 5 μg / ml, 4 to 10 μg / ml, 4 to 15 μg / ml, 4 to 20 μg / ml, 4 to 25 μg / ml, 4 to 30 μg / ml, 4 to 35 μg / ml, 4 to 40 μg / ml, 4 to 45 μg / ml, 4 to 50 μg / ml, 4 to 60 μg / ml, 4 to 70 μg / ml, 4 to 80 μg / ml, 4 to 90 μg / ml, 4 to 100 μg / ml, 4 to 150 μg / ml, 4 to 200 μg / ml, 5 to 10 μg / ml, 5 to 15 μg / ml, 5 to 20 μg / ml, 5 to 25 μg / ml, 5 to 30 μg / ml, 5 to 35 μg / ml, 5 to 40 μg / ml, 5 to 45 μg / ml, 5 to 50 μg / ml, 5 to 60 μg / ml, 5 to 70 μg / ml, 5 to 80 μg / ml, 5 to 90 μg / ml, 5 to 100 μg / ml, 5 to 150 μg / ml, or 5 to 200 μg / ml. According to some embodiments, the concentration of the ascorbic compound is 1 μg / ml, 2 μg / ml, 3 μg / ml, 4 μg / ml, 5 μg / ml, 6 μg / ml, 7 μg / ml, 8 μg / ml, 9 μg / ml, 10 μg / ml, 15 μg / ml, 20 μg / ml, 25 μg / ml, 30 μg / ml, 35 μg / ml, 40 μg / ml, 45 μg / ml, 50 μg / ml, 60 μg / ml, 70 μg / ml, 80 μg / ml, 90 μg / ml, 100 μg / ml, 110 μg / ml, 120 μg / ml, 130 μg / ml, 140 μg / ml, 150 μg / ml or 200 μg / ml. According to preferred embodiments, the concentration of the ascorbic compound is 1 to 150 μg / ml.

[0215] Human serum albumin (HSA)

[0216] According to some embodiments, the culture medium (e.g., a basal solution) of this disclosure may comprise a human serum albumin (HSA) . Human serum albumin is the serum albumin found in human blood. It is the most abundant protein in human blood plasma and constitutes about half of serum protein.

[0217] The HSA may comprise dialyzed HSA or un-dialyzed HSA. According to preferred embodiments, the human serum albumin (HSA) is dialyzed HSA. Dialyzed HSA may be prepared from HSA by dialysis. In detail, HSA is placed into a dialysis bag and the dialysis bag is placed in DPBS solution at 4℃ overnight to carry out the dialysis, the ratio of HSA to DPBS is 1: 50 (v: v) and the pore size of the bags is 15KD.

[0218] According to the present disclosure, the concentration of the human serum albumin is not particularly limited as long as it does not impede the differentiation of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of the human serum albumin is 1 to 20 mg / ml, e.g., 1 to 5 mg / ml, 1 to 10 mg / ml, 1 to 15 mg / ml, 1 to 20 mg / ml, 2 to 5 mg / ml, 2 to 10 mg / ml, 2 to 15 mg / ml, 2 to 20 mg / ml, 3 to 5 mg / ml, 3 to 10 mg / ml, 3 to 15 mg / ml, 3 to 20 mg / ml, 4 to 5 mg / ml, 4 to 10 mg / ml, 4 to 15 mg / ml, 4 to 20 mg / ml, 5 to 10 mg / ml, 5 to 15 mg / ml, or 5 to 20 mg / ml. According to some embodiments, the concentration of the human serum albumin is 1 mg / ml, 2 mg / ml, 3 mg / ml, 4 mg / ml, 5 mg / ml, 6 mg / ml, 7 mg / ml, 8 mg / ml, 9 mg / ml, 10 mg / ml, 11 mg / ml, 12 mg / ml, 13 mg / ml, 14 mg / ml, 15 mg / ml, 16 mg / ml, 17 mg / ml, 18 mg / ml, 19 mg / ml or 20 mg / ml. According to preferred embodiments, the concentration of the human serum albumin is 1 to 10 mg / ml.

[0219] Selenite

[0220] According to some embodiments, the culture medium (e.g., a basal solution) of this disclosure may comprise a selenite. Examples of the selenite comprise Na2SeO3 and K2SeO3. According to preferred embodiments, the selenite is Na2SeO3.

[0221] According to the present disclosure, the concentration of the selenite is not particularly limited as long as it does not impede the differentiation of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of the selenite is 1 to 30 ng / ml, e.g., 1 to 5 ng / ml, 1 to 10 ng / ml, 1 to 15 ng / ml, 1 to 20 ng / ml, 1 to 25 ng / ml, 1 to 30 ng / ml, 2 to 5 ng / ml, 2 to 10 ng / ml, 2 to 15 ng / ml, 2 to 20 ng / ml, 2 to 25 ng / ml, 2 to 30 ng / ml, 3 to 5 ng / ml, 3 to 10 ng / ml, 3 to 15 ng / ml, 3 to 20 ng / ml, 3 to 25 ng / ml, 3 to 30 ng / ml, 4 to 5 ng / ml, 4 to 10 ng / ml, 4 to 15 ng / ml, 4 to 20 ng / ml, 4 to 25 ng / ml, 4 to 30 ng / ml, 5 to 10 ng / ml, 5 to 15 ng / ml, 5 to 20 ng / ml, 5 to 25 ng / ml, or 5 to 30 ng / ml. According to some embodiments, the concentration of the selenite is 1 ng / ml, 2 ng / ml, 3 ng / ml, 4 ng / ml, 5 ng / ml, 6 ng / ml, 7 ng / ml, 8 ng / ml, 9 ng / ml, 10 ng / ml, 11 ng / ml, 12 ng / ml, 13 ng / ml, 14 ng / ml, 15 ng / ml, 16 ng / ml, 17 ng / ml, 18 ng / ml, 19 ng / ml, 20 ng / ml, 21 ng / ml, 22 ng / ml, 23 ng / ml, 24 ng / ml, 25 ng / ml, 26 ng / ml, 27 ng / ml, 28 ng / ml, 29 ng / ml, or 30 ng / ml. According to preferred embodiments, the concentration of the selenite is 5 to 20 ng / ml.

[0222] Monothioglycerol (MTG)

[0223] According to some embodiments, the culture medium (e.g., a basal solution) of this disclosure may comprise monothioglycerol (MTG) .

[0224] According to the present disclosure, the concentration of MTG is not particularly limited as long as it does not impede the differentiation of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of MTG is 1 to 200 μM, e.g., 1 to 5 μM, 1 to 10 μM, 1 to 15 μM, 1 to 20 μM, 1 to 25 μM, 1 to 30 μM, 1 to 35 μM, 1 to 40 μM, 1 to 45 μM, 1 to 50 μM, 1 to 60 μM, 1 to 70 μM, 1 to 80 μM, 1 to 90 μM, 1 to 100 μM, 1 to 150 μM, 1 to 200 μM, 2 to 5 μM, 2 to 10 μM, 2 to 15 μM, 2 to 20 μM, 2 to 25 μM, 2 to 30 μM, 2 to 35 μM, 2 to 40 μM, 2 to 45 μM, 2 to 50 μM, 2 to 60 μM, 2 to 70 μM, 2 to 80 μM, 2 to 90 μM, 2 to 100 μM, 2 to 150 μM, 2 to 200 μM, 3 to 5 μM, 3 to 10 μM, 3 to 15 μM, 3 to 20 μM, 3 to 25 μM, 3 to 30 μM, 3 to 35 μM, 3 to 40 μM, 3 to 45 μM, 3 to 50 μM, 3 to 60 μM, 3 to 70 μM, 3 to 80 μM, 3 to 90 μM, 3 to 100 μM, 3 to 150 μM, 3 to 200 μM, 4 to 5 μM, 4 to 10 μM, 4 to 15 μM, 4 to 20 μM, 4 to 25 μM, 4 to 30 μM, 4 to 35 μM, 4 to 40 μM, 4 to 45 μM, 4 to 50 μM, 4 to 60 μM, 4 to 70 μM, 4 to 80 μM, 4 to 90 μM, 4 to 100 μM, 4 to 150 μM, 4 to 200 μM, 5 to 10 μM, 5 to 15 μM, 5 to 20 μM, 5 to 25 μM, 5 to 30 μM, 5 to 35 μM, 5 to 40 μM, 5 to 45 μM, 5 to 50 μM, 5 to 60 μM, 5 to 70 μM, 5 to 80 μM, 5 to 90 μM, 5 to 100 μM, 5 to 150 μM, 5 to 200 μM, 10 to 15 μM, 10 to 20 μM, 10 to 25 μM, 10 to 30 μM, 10 to 35 μM, 10 to 40 μM, 10 to 45 μM, 10 to 50 μM, 10 to 60 μM, 10 to 70 μM, 10 to 80 μM, 10 to 90 μM, 10 to 100 μM, 10 to 150 μM or 10 to 200 μM. According to some embodiments, the concentration of MTG is 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 35 μM, 40 μM, 45 μM, 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM, 100 μM, 110 μM, 120 μM, 130 μM, 140 μM, 150 μM or 200 μM. According to preferred embodiments, the concentration of the MTG is 10 to 150 μM.

[0225] mB27

[0226] B27 supplement is a defined yet complex mixture of antioxidant enzymes, proteins, vitamins, and fatty acids that are combined in optimized ratios to support survival of cells particularly neurons in culture. The original serum-free neuronal culture supplement formula developed by Dr. Gregory Brewer and colleagues is described in Brewer et al., J Neuroscience Res 35: 567-576, 1993 and Brewer and Cotman, Brain Res 494: 65-74, 1989, incorporated herein by reference. However, B27 contains animal-sourced ingredients. mB27 is a serum-free and xeno-free product obtained by modifying B27. mB27 is commercially available from Shownin.

[0227] According to the present disclosure, the concentration of mB27 is not particularly limited as long as it does not impede the differentiation of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of mB27 is 0.1%to 10%by volume, e.g., 0.5%to 10%by volume, 0.5%to 9%by volume, 0.5%to 8%by volume, 0.5%to 8%by volume, 0.5%to 7%by volume, 0.5%to 6%by volume, 0.5%to 5%by volume, 1%to 5%by volume, 1%to 3%by volume. According to preferred embodiments, the concentration of mB27 is 0.5%to 5%by volume.

[0228] In some embodiments, the same culture medium used in the differentiation media and the transitional culture media comprises a basal medium, about 1 to about 200 μg / mL of transferrin, about 0.1%to about 5%by volume of glutamine or a derivative thereof, about 1 to about 30 ng / mL of selenite, about 1 to about 200 μg / mL of an ascorbic compound, about 1 to about 30 μM of an ethanolamine-based compound, about 1 to about 30 μM of a putrescine-based compound, 1 to 200 μM of MTG, about 1 to about 20 mg / mL of HSA, and about 1 to about 15 μg / mL of an insulin-based compound. In some embodiments, the same culture medium used in the differentiation media and the transitional culture media is a basal medium supplemented with about 1 to about 200 μg / mL oftransferrin, about 0.1%to about 5%by volume of glutamine or a derivative thereof, about 1 to about 30 ng / mL of selenite, about 1 to about 200 μg / mL of an ascorbic compound, about 1 to about 30 μM of an ethanolamine-based compound, about 1 to about 30 μM ofa putrescine-based compound, 1 to 200 μM of MTG, about 1 to about 20 mg / mL of HSA, and about 1 to about 15 μg / mL of an insulin-based compound.

[0229] In some embodiments, the same culture medium used in the differentiation media and the transitional culture media comprises a basal medium, about 1 to about 200 μg / mL of transferrin, about 0.1%to about 5%by volume ofglutamine or a derivative thereof, about 1 to about 30 ng / mL of selenite, about 1 to about 200 μg / mL of an ascorbic compound, about 1 to about 30 μM of an ethanolamine-based compound, about 1 to about 30 μM of a putrescine-based compound, about 0.1%to about 10%by volume of mB27, about 1 to about 20 mg / mL of HSA, and about 1 to about 15 μg / mL of an insulin-based compound. In some embodiments, the same culture medium used in the differentiation media and the transitional culture media is a basal medium supplemented with about 1 to about 200 μg / mL of transferrin, about 0.1%to about 5%by volume of glutamine or a derivative thereof, about 1 to about 30 ng / mL of selenite, about 1 to about 200 μg / mL of an ascorbic compound, about 1 to about 30 μM of an ethanolamine-based compound, about 1 to about 30 μM ofa putrescine-based compound, about 0.1%to about 10%by volume of mB27, about 1 to about 20 mg / mL of HSA, and about 1 to about 15 μg / mL of an insulin-based compound.

[0230] Maturation and Expansion Medium

[0231] The maturation and expansion process of the method utilizes a maturation and expansion medium that is a serum-free, and xeno-free culture medium. In some embodiments, the maturation and expansion medium is a serum-free, xeno-free and chemically defined culture medium. In some embodiments, the maturation and expansion medium comprises a basal medium, an ethanolamine-based compound, a putrescine-based compound, and a human platelet lysate (HPLT) .

[0232] Basal medium

[0233] A basal medium is a basal component or solution for the maturation and expansion medium used in the maturation and expansion process. Generally, the basal medium comprises about 95%to 99%by volume of a maturation and expansion medium. As the basal medium for the maturation and expansion medium according to this disclosure, a classical basal medium in the art of cell culture may be directly used.

[0234] Examples of the classical basal medium include DMEM / F12 (e.g., Gibco Cat. #C11330500BT) , BME medium (e.g., Gibco Cat. #21010046, or Sigma-Aldrich Cat. #B9638) , IMDM medium (e.g., Gibco Cat. #12440053; or Sigma-Aldrich Cat. #I3390) , Eagle MEM medium (e.g., Minimum Essential Medium (MEM) , developed by Harry Eagle, Sigma-Aldrich Cat. #M2414  / M2279  / M5690) , α-MEM medium (e.g., Gibco Cat. #12561056; or Sigma-Aldrich Cat. #M0894) , DMEM medium (e.g., Gibco Cat. #21068028) , RPMI 1640 medium (e.g., Gibco Cat. #1 1875093) , Ham’s F12 medium (e.g., Gibco Cat. #11765054) , or a mixture thereof. When the culture medium comprises the mixture of two or more classical basal media, the relative ratios of these classical basal media may be arbitrary.

[0235] Ethanolamine-based compound and putrescine-based compound used in the maturation and expansion medium of this disclosure and their concentrations can be same as those used in the basal solution of the differentiation media. Human platelet lysate (HPLT) used in the maturation and expansion medium will be described below.

[0236] Human platelet lysate

[0237] Human platelet lysate (HPLT) is derived from human platelets. Human platelet lysate may be derived from healthy donor human platelets and is growth factor-rich. Human platelet lysate used according to the present disclosure is commercially available, e.g., PLTGold Human Platelet Lysate (Biological Industries, #PLTGOLD500R) . However, human platelet lysate from other sources are also available and can be used in the present disclosure.

[0238] According to the present disclosure, the concentration of the human platelet lysate is not particularly limited as long as it can support the maturation and expansion of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of the human platelet lysate is 0.1%to 20%by volume, e.g., 0.1%to 1%by volume, 0.1%to 2%by volume, 0.1%to 3%by volume, 0.1%to 4%by volume, 0.1%to 5%by volume, 0.1%to 10%by volume, 0.1%to 15%by volume, 0.1%to 20%by volume, 0.5%to 1%by volume, 0.5%to 2%by volume, 0.5%to 3%by volume, 0.5%to 4%by volume, 0.5%to 5%by volume, 0.5%to 10%by volume, 0.5%to 15%by volume, 0.5%to 20%by volume, 1%to 2%by volume, 1%to 3%by volume, 1%to 4%by volume, 1%to 5%by volume, 1%to 10%by volume, 1%to 15%by volume, 1%to 20%by volume, 2%to 3%by volume, 2%to 4%by volume, 2%to 5%by volume, 2%to 10%by volume, 2%to 15%by volume, 2%to 20%by volume, 3%to 4%by volume, 3%to 5%by volume, 3%to 10%by volume, 3%to 15%by volume, 3%to 20%by volume, 4%to 5%by volume, 4%to 10%by volume, 4%to 15%by volume, or 4%to 20%by volume, 5%to 6%by volume, 5%to 7%by volume, 5%to 8%by volume, 5%to 9%by volume, 5%to 10%by volume, 5%to 15%by volume, or 5%to 20%by volume. According to some embodiments, the concentration of the human platelet lysate is 0.1%by volume, 0.5%by volume, 1%by volume, 2%by volume, 3%by volume, 4%by volume, 5%by volume, 6%by volume, 7%by volume, 8%by volume, 9%by volume, 10%by volume, 15%by volume, or 20%by volume. According to preferred embodiments, the concentration of the human platelet lysate is 0.1%to 10%by volume.

[0239] In some embodiments, in the maturation and expansion medium, the ethanolamine-based compound is present at a concentration of about 1 to about 30 μM, the putrescine-based compound is present at a concentration of about 1 to about 30 μM, and the HPLT is present at a concentration of about 0.1%to about 20%by volume. In some embodiments, in the maturation and expansion medium, the ethanolamine-based compound is present at a concentration of about 5 to about 30 μM, the putrescine-based compound is present at a concentration of about 1 to about 20 μM, and the HPLT is present at a concentration of about 0.1%to about 10%by volume.

[0240] In some embodiments, the maturation and expansion medium further comprise transferrin, glutamine or a derivative thereof, an ascorbic compound, and an insulin-based compound. These components used in the maturation and expansion medium and their concentrations can be same as those used in the basal solution of the differentiation media. In some embodiments, the maturation and expansion medium further comprises about 1 to about 150 μg / mL of transferrin, about 0.5%to about 5%by volume of glutamine or a derivative thereof, about 1 to about 150 μg / mL of an ascorbic compound, and about 1 to about 10 μg / mL of an insulin-based compound.

[0241] In some embodiments, the maturation and expansion medium comprises a basal medium, about 5 to about 30 μM of ethanolamine, about 1 to about 20 μM of putrescine dihydrochloride, about 0.1%to about 10%by volume of HPLT, about 1 to about 150 μg / mL of transferrin, about 1 to about 10 μg / mL of insulin, about 1 to about 150 μg / mL of ascorbate, and about 0.5%to about 5%by volume of glutamine.

[0242] In addition to the above components, the maturation and expansion medium can further comprise components described below.

[0243] Corticoid compound

[0244] According to some embodiments, the culture medium (e.g., a maturation and expansion medium) of this disclosure may comprise a corticoid compound.

[0245] Corticoids (also known as corticosteroids) are a class of steroid hormones that are produced in the adrenal cortex of vertebrates, as well as the synthetic analogues of these hormones. Two main classes of corticosteroids, glucocorticoids and mineralocorticoids, are involved in a wide range of physiological processes, including stress response, immune response, and regulation of inflammation, carbohydrate metabolism, protein catabolism, blood electrolyte levels, and behavior.

[0246] According to some embodiments, the corticoid compound is selected from the group consisting of hydrocortisone, corticosterone, dehydrocorticosterone, cortisone, and a combination thereof. According to preferred embodiments, the corticoid compound is hydrocortisone.

[0247] According to the present disclosure, the concentration of the corticoid compound is not particularly limited as long as it can support the maturation and expansion of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of the corticoid compound is 0.1 to 5 μM, e.g., 0.1 to 0.5 μM, 0.1 to 1 μM, 0.1 to 1.5 μM, 0.1 to 2 μM, 0.1 to 2.5 μM, 0.1 to 3 μM, 0.1 to 3.5 μM, 0.1 to 4 μM, 0.1 to 4.5 μM, 0.1 to 5 μM, 0.2 to 0.5 μM, 0.2 to 1 μM, 0.2 to 1.5 μM, 0.2 to 2 μM, 0.2 to 2.5 μM, 0.2 to 3 μM, 0.2 to 3.5 μM, 0.2 to 4 μM, 0.2 to 4.5 μM, 0.2 to 5 μM, 0.3 to 0.5 μM, 0.3 to 1 μM, 0.3 to 1.5 μM, 0.3 to 2 μM, 0.3 to 2.5 μM, 0.3 to 3 μM, 0.3 to 3.5 μM, 0.3 to 4 μM, 0.3 to 4.5 μM, 0.3 to 5 μM, 0.4 to 0.5 μM, 0.4 to 1 μM, 0.4 to 1.5 μM, 0.4 to 2 μM, 0.4 to 2.5 μM, 0.4 to 3 μM, 0.4 to 3.5 μM, 0.4 to 4 μM, 0.4 to 4.5 μM, 0.4 to 5 μM, 0.5 to 1 μM, 0.5 to 1.5 μM, 0.5 to 2 μM, 0.5 to 2.5 μM, 0.5 to 3 μM, 0.5 to 3.5 μM, 0.5 to 4 μM, 0.5 to 4.5 μM or 0.5 to 5 μM. According to some embodiments, the concentration of the corticoid compound is 0.1 μM, 0.2 μM, 0.3 μM, 0.4 μM, 0.5 μM, 0.6 μM, 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9 μM, 1 μM, 1.5 μM, 2 μM, 2.5 μM, 3 μM, 3.5 μM, 4 μM, 4.5 μM or 5 μM. According to preferred embodiments, the concentration of the corticoid compound is 0.5 to 5 μM.

[0248] Heparin-based compound

[0249] According to some embodiments, the culture medium (e.g., a maturation and expansion medium) of this disclosure may comprise a heparin-based compound.

[0250] As used herein, “heparin-based compound” refers to heparin, derivatives thereof, salts thereof, or mixtures thereof.

[0251] Heparin, a highly sulfated glycosaminoglycan variant produced and stored primarily by mast cells, is understood to possess the highest net negative charge density of all known biological molecules. Its negative charge binds to positively charged heparin-binding domains present in a large number of extracellular proteins. Such proteins include, for example, fibroblast growth factors (FGFs) , vascular endothelial growth factors (VEGFs) , bone morphogenetic proteins (BMPs) , and large extracellular structural molecules such as fibronectin and laminin.

[0252] Examples of the derivative of heparin include, without limitation, substituted heparin. Examples of the salt of heparin or a derivative thereof include, without limitation, heparin sodium salt and heparin lithium salt, and the salts of substituted heparin.

[0253] According to preferred embodiments, the heparin-based compound is heparin sodium.

[0254] According to the present disclosure, the concentration of the heparin-based compound is not particularly limited as long as it can support the maturation and expansion of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of the heparin-based compound is 1 to 150 μg / ml, e.g., 1 to 5 μg / ml, 1 to 10 μg / ml, 1 to 15 μg / ml, 1 to 20 μg / ml, 1 to 25 μg / ml, 1 to 30 μg / ml, 1 to 35 μg / ml, 1 to 40 μg / ml, 1 to 45 μg / ml, 1 to 50 μg / ml, 1 to 60 μg / ml, 1 to 70 μg / ml, 1 to 80 μg / ml, 1 to 90 μg / ml, 1 to 100 μg / ml, 1 to 110 μg / ml, 1 to 120 μg / ml, 1 to 130 μg / ml, 1 to 140 μg / ml, 1 to 150 μg / ml, 2 to 5 μg / ml, 2 to 10 μg / ml, 2 to 15 μg / ml, 2 to 20 μg / ml, 2 to 25 μg / ml, 2 to 30 μg / ml, 2 to 35 μg / ml, 2 to 40 μg / ml, 2 to 45 μg / ml, 2 to 50 μg / ml, 2 to 60 μg / ml, 2 to 70 μg / ml, 2 to 80 μg / ml, 2 to 90 μg / ml, 2 to 100 μg / ml, 2 to 110 μg / ml, 2 to 120 μg / ml, 2 to 130 μg / ml, 2 to 140 μg / ml, 2 to 150 μg / ml, 3 to 5 μg / ml, 3 to 10 μg / ml, 3 to 15 μg / ml, 3 to 20 μg / ml, 3 to 25 μg / ml, 3 to 30 μg / ml, 3 to 35 μg / ml, 3 to 40 μg / ml, 3 to 45 μg / ml, 3 to 50 μg / ml, 3 to 60 μg / ml, 3 to 70 μg / ml, 3 to 80 μg / ml, 3 to 90 μg / ml, 3 to 100 μg / ml, 3 to 110 μg / ml, 3 to 120 μg / ml, 3 to 130 μg / ml, 3 to 140 μg / ml, 3 to 150 μg / ml, 4 to 5 μg / ml, 4 to 10 μg / ml, 4 to 15 μg / ml, 4 to 20 μg / ml, 4 to 25 μg / ml, 4 to 30 μg / ml, 4 to 35 μg / ml, 4 to 40 μg / ml, 4 to 45 μg / ml, 4 to 50 μg / ml, 4 to 60 μg / ml, 4 to 70 μg / ml, 4 to 80 μg / ml, 4 to 90 μg / ml, 4 to 100 μg / ml, 4 to 110 μg / ml, 4 to 120 μg / ml, 4 to 130 μg / ml, 4 to 140 μg / ml, 4 to 150 μg / ml, 5 to 10 μg / ml, 5 to 15 μg / ml, 5 to 20 μg / ml, 5 to 25 μg / ml, 5 to 30 μg / ml, 5 to 35 μg / ml, 5 to 40 μg / ml, 5 to 45 μg / ml, 5 to 50 μg / ml, 5 to 60 μg / ml, 5 to 70 μg / ml, 5 to 80 μg / ml, 5 to 90 μg / ml, 5 to 100 μg / ml, 5 to 110 μg / ml, 5 to 120 μg / ml, 5 to 130 μg / ml, 5 to 140 μg / ml, 5 to 150 μg / ml, 10 to 15 μg / ml, 10 to 20 μg / ml, 10 to 25 μg / ml, 10 to 30 μg / ml, 10 to 35 μg / ml, 10 to 40 μg / ml, 10 to 45 μg / ml, 10 to 50 μg / ml, 10 to 60 μg / ml, 10 to 70 μg / ml, 10 to 80 μg / ml, 10 to 90 μg / ml, 10 to 100 μg / ml, 10 to 110 μg / ml, 10 to 120 μg / ml, 10 to 130 μg / ml, 10 to 140 μg / ml or 10 to 150 μg / ml. According to some embodiments, the concentration of the heparin-based compound is 1 μg / ml, 2 μg / ml, 3 μg / ml, 4 μg / ml, 5 μg / ml, 6 μg / ml, 7 μg / ml, 8 μg / ml, 9 μg / ml, 10 μg / ml, 15 μg / ml, 20 μg / ml, 25 μg / ml, 30 μg / ml, 35 μg / ml, 40 μg / ml, 45 μg / ml, 50 μg / ml, 60 μg / ml, 70 μg / ml, 80 μg / ml, 90 μg / ml, 100 μg / ml, 110 μg / ml, 120 μg / ml, 130 μg / ml, 140 μg / ml or 150 μg / ml. According to preferred embodiments, the concentration of the heparin-based compound is 10 to 100 μg / ml.

[0255] Lipoic acid

[0256] According to some embodiments, the culture medium (e.g., a maturation and expansion medium) of this disclosure further comprises a lipoic acid.

[0257] According to the present disclosure, the concentration of lipoic acid is not particularly limited as long as it can support the maturation and expansion of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of the lipoic acid is 1 to 20 μM, e.g., 1 to 5 μM, 1 to 10 μM, 1 to 15 μM, 1 to 20 μM, 2 to 5 μM, 2 to 10 μM, 2 to 15 μM, 2 to 20 μM, 3 to 5 μM, 3 to 10 μM, 3 to 15 μM, 3 to 20 μM, 4 to 5 μM, 4 to 10 μM, 4 to 15 μM, 4 to 20 μM, 5 to 10 μM, 5 to 15 μM, or 5 to 20 μM. According to some embodiments, the concentration of lipoic acid is 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 16 μM, 17 μM, 18 μM, 19 μM or 20 μM. According to preferred embodiments, the concentration of lipoic acid is 1 to 10 μM.

[0258] Sulfate

[0259] According to some embodiments, the culture medium (e.g., a maturation and expansion medium) of this disclosure further comprises a sulfate. Examples of the sulfate comprise FeSO4, MgSO4, CuSO4 and ZnSO4. According to preferred embodiments, the sulfate is FeSO4.

[0260] According to the present disclosure, the concentration of the sulfate is not particularly limited as long as it can support the maturation and expansion of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of the sulfate is 1 to 50 μM, e.g., 1 to 5 μM, 1 to 10 μM, 1 to 15 μM, 1 to 20 μM, 1 to 25 μM, 1 to 30 μM, 1 to 35 μM, 1 to 40 μM, 1 to 45 μM, 1 to 50 μM, 2 to 5 μM, 2 to 10 μM, 2 to 15 μM, 2 to 20 μM, 2 to 25 μM, 2 to 30 μM, 2 to 35 μM, 2 to 40 μM, 2 to 45 μM, 2 to 50 μM, 3 to 5 μM, 3 to 10 μM, 3 to 15 μM, 3 to 20 μM, 3 to 25 μM, 3 to 30 μM, 3 to 35 μM, 3 to 40 μM, 3 to 45 μM, 3 to 50 μM, 4 to 5 μM, 4 to 10 μM, 4 to 15 μM, 4 to 20 μM, 4 to 25 μM, 4 to 30 μM, 4 to 35 μM, 4 to 40 μM, 4 to 45 μM, 4 to 50 μM, 5 to 10 μM, 5 to 15 μM, 5 to 20 μM, 5 to 25 μM, 5 to 30 μM, 5 to 35 μM, 5 to 40 μM, 5 to 45 μM or 5 to 50 μM. According to some embodiments, the concentration of the sulfate is 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 16 μM, 17 μM, 18 μM, 19 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 35 μM, 40 μM, 45 μM or 50 μM. According to preferred embodiments, the concentration of the sulfate is 1 to 30 μM.

[0261] Ferric salt

[0262] According to some embodiments, the culture medium (e.g., a maturation and expansion medium) of this disclosure further comprises a ferric salt. Examples of the ferric salt comprise Fe (NO3) 3, FeCl3, and ferric citrate. According to preferred embodiments, the ferric salt is Fe (NO3) 3.

[0263] According to the present disclosure, the concentration of the ferric salt is not particularly limited as long as it can support the maturation and expansion of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of the ferric salt is 0.1 to 20 μM, e.g., 0.1 to 5 μM, 0.1 to 10 μM, 0.1 to 15 μM, 0.1 to 20 μM, 0.2 to 5 μM, 0.2 to 10 μM, 0.2 to 15 μM, 0.2 to 20 μM, 0.3 to 5 μM, 0.3 to 10 μM, 0.3 to 15 μM, 0.3 to 20 μM, 0.4 to 5 μM, 0.4 to 10 μM, 0.4 to 15 μM, 0.4 to 20 μM, 0.5 to 5 μM, 0.5 to 10 μM, 0.5 to 15 μM, 5 to 20 μM, 0.6 to 5 μM, 0.6 to 10 μM, 0.6 to 15 μM, 0.6 to 20 μM, 0.7 to 5 μM, 0.7 to 10 μM, 0.7 to 15 μM, 0.7 to 20 μM, 0.8 to 5 μM, 0.8 to 10 μM, 0.8 to 15 μM, 0.8 to 20 μM, 0.9 to 5 μM, 0.9 to 10 μM, 0.9 to 15 μM, 0.9 to 20 μM, 1 to 5 μM, 1 to 10 μM, 1 to 15 μM, 1 to 20 μM, 2 to 5 μM, 2 to 10 μM, 2 to 15 μM, 2 to 20 μM, 3 to 5 μM, 3 to 10 μM, 3 to 15 μM, 3 to 20 μM, 4 to 5 μM, 4 to 10 μM, 4 to 15 μM, 4 to 20 μM, 5 to 10 μM, 5 to 15 μM, or 5 to 20 μM. According to some embodiments, the concentration of the ferric salt is 0.1 μM, 0.2 μM, 0.3 μM, 0.4 μM, 0.5 μM, 0.6 μM, 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 16 μM, 17 μM, 18 μM, 19 μM or 20 μM. According to preferred embodiments, the concentration of the ferric salt is 0.1 to 10 μM.

[0264] Pyruvate

[0265] According to some embodiments, the culture medium (e.g., a maturation and expansion medium) of this disclosure further comprises a pyruvate. Examples of pyruvate comprise sodium pyruvate and potassium pyruvate. According to preferred embodiments, the pyruvate is sodium pyruvate.

[0266] According to the present disclosure, the concentration of the pyruvate is not particularly limited as long as it can support the maturation and expansion of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of the pyruvate is 0.01 to 10 mg / ml, e.g., 0.01 to 1 mg / ml, 0.01 to 2 mg / ml, 0.01 to 3 mg / ml, 0.01 to 4 mg / ml, 0.01 to 5 mg / ml, 0.01 to 7.5 mg / ml, 0.01 to 10 mg / ml, 0.02 to 1 mg / ml, 0.02 to 2 mg / ml, 0.02 to 3 mg / ml, 0.03 to 1 mg / ml, 0.03 to 2 mg / ml, 0.03 to 3 mg / ml, 0.03 to 4 mg / ml, 0.03 to 5 mg / ml, 0.03 to 7.5 mg / ml, 0.03 to 10 mg / ml, 0.05 to 1 mg / ml, 0.05 to 2 mg / ml, 0.05 to 3 mg / ml, 0.05 to 4 mg / ml, 0.05 to 5 mg / ml, 0.05 to 7.5 mg / ml, 0.05 to 10 mg / ml, 0.075 to 1 mg / ml, 0.075 to 2 mg / ml, 0.075 to 3 mg / ml, 0.075 to 4 mg / ml, 0.075 to 5 mg / ml, 0.075 to 7.5 mg / ml, 0.075 to 10 mg / ml, 0.1 to 1 mg / ml, 0.1 to 2 mg / ml, 0.1 to 3 mg / ml, 0.1 to 4 mg / ml, 0.1 to 5 mg / ml, 0.1 to 7.5 mg / ml, 0.1 to 10 mg / ml, 0.25 to 1 mg / ml, 0.25 to 2 mg / ml, 0.25 to 3 mg / ml, 0.25 to 4 mg / ml, 0.25 to 5 mg / ml, 0.25 to 7.5 mg / ml, 0.25 to 10 mg / ml, 0.5 to 1 mg / ml, 0.5 to 2 mg / ml, 0.5 to 3 mg / ml, 0.5 to 4 mg / ml, 0.5 to 5 mg / ml, 0.5 to 7.5 mg / ml, 0.5 to 10 mg / ml, 0.75 to 1 mg / ml, 0.75 to 2 mg / ml, 0.75 to 3 mg / ml, 0.75 to 4 mg / ml, 0.75 to 5 mg / ml, 0.75 to 7.5 mg / m, 0.75 to 10 mg / ml, 1 to 2 mg / ml, 1 to 3 mg / ml, 1 to 4 mg / ml, 1 to 5 mg / ml, 1 to 7.5 mg / m, or 1 to 10 mg / ml. According to some embodiments, the concentration of the pyruvate is 0.01 mg / ml, 0.03 mg / ml, 0.05 mg / ml, 0.07 mg / ml, 0.09 mg / ml, 0.11 mg / ml, 0.13 mg / ml, 0.15 mg / ml, 0.17 mg / ml, 0.19 mg / ml, 0.2 mg / ml, 0.3 mg / ml, 0.4 mg / ml, 0.5 mg / ml, 0.6 mg / ml, 0.7 mg / ml, 0.8 mg / ml, 0.9 mg / ml, 1 mg / ml, 2 mg / ml, 3 mg / ml, 4 mg / ml, 5 mg / ml, 6 mg / ml, 7 mg / ml, 8 mg / ml, 9 mg / ml or 10 mg / ml. According to preferred embodiments, the concentration of the pyruvate is 0.05 to 5 mg / ml.

[0267] Nicotinamide (NAM) -based compound

[0268] According to some embodiments, the culture medium (e.g., a maturation and expansion medium) of this disclosure further comprises a nicotinamide-based compound.

[0269] As used herein, “nicotinamide-based compound” refers to nicotinamide, analogs thereof, metabolites of nicotinamide or nicotinamide analogs, such as, for example, NAD, NADH and NADPH, salts thereof, or mixtures thereof.

[0270] According to embodiments of the present disclosure, the nicotinamide-based compound may be selected from the group consisting of nicotinamide, a nicotinamide analog, a nicotinamide metabolite, a nicotinamide analog metabolite, and derivatives thereof.

[0271] Nicotinamide is the amide form of niacin, both of which belong to the vitamin B3 family. They are the precursors of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) , which acts as a coenzyme in multiple cellular processes, including energy metabolism and DNA repair. Nicotinamide can be converted into nicotinamide mononucleotide (NMN) by nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) , which is then turned into NAD+ by nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase (NMNAT) .

[0272] As used herein, “nicotinamide analog” refers to any molecule that is known to act similarly to nicotinamide. Examples of nicotinamide analogs include, without limitation, nicotinethioamides (the thiol analog of nicotinamide) , and nicotinic acid. Examples of nicotinamide derivatives include, but are not limited to, substituted nicotinamide-based compound and nicotinethioamides, and N-substituted nicotinamide-based compound and nicotinethioamides.

[0273] Examples of the salts of nicotinamide, analogs thereof, metabolites thereof and derivatives thereof include, without limitation, nicotinamide hydrochloride, nicotinamide hydrobromide, and these salts of substituted nicotinamide.

[0274] According to preferred embodiments, the nicotinamide-based compound is nicotinamide.

[0275] According to the present disclosure, the concentration of the nicotinamide-based compound is not particularly limited as long as it can support the maturation and expansion of iMSCs. According to some embodiments, the concentration of the nicotinamide-based compound is in the range of 0.1 to 30 mM, e.g., 0.1 to 5 mM, 0.1 to 10 mM, 0.1 to 15 mM, 0.1 to 20 mM, 0.1 to 25 mM, 0.1 to 30 mM, 0.3 to 5 mM, 0.3 to 10 mM, 0.3 to 15 mM, 0.3 to 20 mM, 0.3 to 25 mM, 0.3 to 30 mM, 0.5 to 5 mM, 0.5 to 10 mM, 0.5 to 15 mM, 0.5 to 20 mM, 0.5 to 25 mM, 0.5 to 30 mM, 0.75 to 5 mM, 0.75 to 10 mM, 0.75 to 15 mM, 0.75 to 20 mM, 0.75 to 25 mM, 0.75 to 30 mM, 1 to 5 mM, 1 to 10 mM, 1 to 15 mM, 1 to 20 mM, 1 to 25 mM, 1 to 30 mM, 2 to 5 mM, 2 to 10 mM, 2 to 15 mM, 2 to 20 mM, 2 to 25 mM, 2 to 30 mM, 3 to 5 mM, 3 to 10 mM, 3 to 15 mM, 3 to 20 mM, 3 to 25 mM, 3 to 30 mM, 4 to 5 mM, 4 to 10 mM, 4 to 15 mM, 4 to 20 mM, 4 to 25 mM, 4 to 30 mM, 5 to 10 mM, 5 to 15 mM, 5 to 20 mM, 5 to 25 mM, or 5 to 30 mM. According to some embodiments, the concentration of the nicotinamide-based compound is 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM, 26 mM, 27 mM, 28 mM, 29 mM, or 30 mM. According to preferred embodiments, the concentration of the nicotinamide-based compound is 0.5 to 20 mM.

[0276] Growth factor

[0277] According to some embodiments, the culture medium (e.g., a maturation and expansion medium) of this disclosure further comprises a growth factor. The choices of growth factors and their concentrations described above for the growth factor activation stage are suitable here as well.

[0278] In some embodiments, the maturation and expansion medium further comprises HSA, MTG, selenite or a combination thereof. HSA, MTG and selenite have been described above.

[0279] In some embodiments, the maturation and expansion medium further comprises human serum albumin (HSA) , lipoic acid, sulfate, ferric salt, a growth factor, a corticoid compound, selenite, pyruvate, MTG, a nicotinamide (NAM) -based compound, a heparin-based compound, or a combination thereof.

[0280] In some embodiments, the maturation and expansion medium further comprises a growth factor, a corticoid compound, selenite, pyruvate, human serum albumin (HSA) , MTG, a nicotinamide (NAM) -based compound, and a heparin-based compound. In some embodiments, the maturation and expansion medium further comprises about 1 to about 15 ng / mL of FGF2, about 0.5 to about 5 μM of hydrocortisone, about 5 to about 20 ng / mL of Na2SeO3, about 0.05 to about 5 mg / mL of sodium pyruvate, about 1 to about 10 mg / mL of HSA, about 10 to about 150 μM of MTG, about 0.5 to about 20 mM of nicotinamide (NAM) , and about 10 to about 100 μg / mL of heparin sodium.

[0281] In some embodiments, the maturation and expansion medium further comprises a growth factor, a corticoid compound, lipoic acid, sulfate, and ferric salt. In some embodiments, the maturation and expansion medium further comprises 1 to 15 ng / ml of FGF2, 0.5 to 5 μM of hydrocortisone, 1 to 10 μM of lipoic acid, 1 to 30 μM of FeSO4, and 0.1 to 10 μM of Fe (NO3) 3.

[0282] Compositions

[0283] In another aspect of the disclosure, a substantially homogeneous population of iMSCs is provided and can be prepared by the method described herein. By “substantially homogeneous population” it is meant that a substantial number of the cells of the total population are of the same or similar type and / or have the same or similar cell morphology and function. In some embodiments, at least about 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 96%, further preferably at least 97%, still preferably at least 98%, still further preferably at least 99%, and most preferably 100%of the cells in the cell population obtained without any enrichment or sorting express CD90. In some embodiments, at least about 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 96%, further preferably at least 97%, still preferably at least 98%, still further preferably at least 99%, and most preferably 100%of the cells in the cell population obtained without any enrichment or sorting express CD73. In some embodiments, at least about 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 96%, further preferably at least 97%, still preferably at least 98%, still further preferably at least 99%, and most preferably 100%of the cells in the cell population obtained without any enrichment or sorting express CD105. In some embodiments, at least about 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 96%, further preferably at least 97%, still preferably at least 98%, still further preferably at least 99%, and most preferably 100%of the cells in the cell population obtained without any enrichment or sorting are iMSCs, which are identifiable as cells that express CD90, CD73 and CD105.

[0284] In some embodiments, the present disclosure provides a substantially homogeneous cell population comprising the iMSCs that maintain expression of markers characteristic of iMSCs, e.g., CD90, CD73 and CD105, after multiple passages (e.g., 2, 3 or 4 passages) .

[0285] In still further aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising any of the iMSCs or cell populations thereof described herein and a pharmaceutically acceptable carrier. The amount of cell population used in the pharmaceutical composition that is effective in the treatment of a particular disorder or condition can depend on the nature of the disorder or condition and can be determined by standard clinical techniques.

[0286] Pharmaceutically acceptable carriers are well known in the art. Exemplary pharmaceutically acceptable carriers are sterile aqueous solutions that contain no materials in addition to the active ingredients and water, or contain a buffer such as sodium phosphate at physiological pH value, physiological saline or both, such as phosphate-buffered saline. Still further, aqueous carriers can contain more than one buffer salt, as well as salts such as sodium and potassium chlorides, dextrose, and other solutes. Non-limiting examples of such pharmaceutically acceptable carriers comprise Multiple Electrolytes Injection, and Dextran injection. Use

[0287] The iMSCs or cell populations thereof described herein have the capability to further differentiate into functional cells such as osteocytes, chondrocytes and adipocytes in vivo or in vitro.

[0288] In a further aspect, the present disclosure also provides a use of any of the iMSCs or cell populations thereof described herein in the manufacture of a medicament for treating or preventing diseases including, e.g., knee osteoarthritis (KOA) , graft-versus-host disease (GvHD) , idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) , neurological disorders, inflammations such as endometrial injury or vascular diseases, and bone and cartilage diseases.

[0289] In a further another aspect, the present disclosure provides a method of treating or preventing a disease in a subject comprising administrating any of the iMSCs or cell populations or pharmaceutical compositions thereof described herein to the subject. In some embodiments, the disease can be selected from, e.g., knee osteoarthritis (KOA) , graft-versus-host disease (GvHD) , idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) , neurological disorders, inflammations such as endometrial injury or vascular diseases, and bone and cartilage diseases. Pharmaceutical compositions, cell compositions or populations of the present disclosure can be administered before, during, and / or after the onset of the disease, disorder, and / or condition. General Methods

[0290] In practicing the present disclosure, many conventional techniques in molecular biology, protein biochemistry, cell biology, microbiology and recombinant DNA are used. See, e.g., Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y. ) ; MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press) ; MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) ; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986) ) ; Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory) ; Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London) ; and Herzenberg et al. eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology. EXAMPLES

[0291] The present description is further illustrated by the following examples, which should not be construed as limiting in any way. The contents of all cited references (including literature references, issued patents, and published patent applications as cited throughout this application) are hereby expressly incorporated by reference.

[0292] Materials and Methods

[0293] All reagents for the culture media and apparatuses utilized throughout the Examples of the present disclosure are commercially available. The sources of these reagents and apparatuses have been also described elsewhere herein. The steps of the methods utilized throughout the Examples are described with reference to FIG. 1. The general testing methods utilized throughout the Examples are described as follows. General Methods:

[0294] iMSC subculture

[0295] After dissociation with 0.5×TrypLE for 5 min, the differentiated cells (P0 iMSCs) were collected. Following centrifugation and supernatant removal, the cells were resuspended in a fresh MSC culture medium (Shownin, SN-02-1010) and counted by Countstar (Ali Biotech) . The P0 iMSCs were then seeded in 6-well plates at 5-10×104 cells / well in the MSC culture medium. The iMSCs were passaged every 4 days. Bright-field images were taken with Nicon inverted phase contrast microscope.

[0296] Flow cytometry assay

[0297] The iMSCs (P1 to P4) were stained with CD90-APC (BD PharmingenTM, 559869) , CD73-APC (BD PharmingenTM, 560847) and CD105-APC (BioLegend, 800508) antibodies, and the expressions of CD90, CD73 and CD105 were detected by flow cytometry. In brief, the iMSCs were digested by 0.5× TrypLE for 3 min and washed with a FACS buffer (DPBS with 0.5%BSA and 0.5 mM EDTA) . 0.5-1×106 cells were stained with the CD90-APC, the CD73-APC and the CD105-APC antibodies at 4℃ for 30 min respectively, washed twice with FACS buffer and resuspended in 100μl of the FACS buffer. The stained samples were analyzed by flow cytometry (CytoFLEX, BECKMAN COULTER) . Example 1. Effect of the time window for adding FGF2 during the differentiation process.

[0298] hiPSCs (Nuwacell) were routinely cultured in ncEpic medium (Shownin, RP01001) on VTN-coated 6-well plates. On Day -1, when the hiPSCs reached near confluence, the cells were collected by treatment with 0.5mM EDTA, and resuspended in ncEpic medium (Shownin, RP01001) containing 10μM Blebbistatin. The hiPSCs were seeded into polyHEMA-coated T25 flasks, and cultured on a belly dancer overnight for EB formation.

[0299] On Day 0, the differentiation of the EBs was initiated by changing the medium to a medium containing a basal medium, M7, and 10μM CHIR99021. The M7 medium was IMDM+DMEM / F12 (1: 1) (50% / 50%) supplemented with 1-150 μg / ml (e.g., 20 μg / ml) of Transferrin, 1%by volume of Glutamax, 5-15 ng / ml (e.g., 10 ng / ml) of Na2SeO3, 20-100 μg / ml (e.g., 30 μg / ml) of Mg Ascorbate, 1 μg / ml of Ethanolamine, 16.1μg / ml of Putrescine 2HCl, 1-5 mg / ml (e.g., 2mg / ml) of HSA, and 1-10μg / ml (e.g., 5 μg / ml) of Insulin, and 50×mB27 (Shownin, SN-06-0030) . On Day 2, the medium was changed to a medium containing the same basal medium and 10μM SB431542, 1μM Retinoic Acid (RA) , 0.5μM LDN193189 and 350ng / ml SHH. On Day 3, the medium was changed to a medium containing the same basal medium and 0.5μM LDN193189. On Day 6 and 8, the medium was changed to the same basal medium. Further, 4ng / ml of FGF2 was added for different time windows during Day 2-10 of the differentiation and 2ng / ml of TGF-β1 was added throughout Day 3-10 of the differentiation. The EBs were subjected to 2D culture from Day 10 to Day 14 by plating them into 6-well plates in the maturation / expansion medium (Shownin, SN-02-1010) . The maturation / expansion medium contained IMDM and DMEM / F12 (1: 1) (50% / 50%) , 1%by volume of Glutamax, 1-150 μg / ml (e.g., 120 μg / ml) of transferrin, 5 μg / ml of insulin, 1-150 μg / ml (e.g., 110 μg / ml) of Mg Ascorbate, 20 μM of Ethanolamine, 10 μM of Putrescine 2HCl, 0.5%-3%by volume (e.g., 2%by volume) of HPLT, 4 ng / ml of FGF2, 1 μM of Hydrocortisone, 14 ng / ml of Na2SeO3, 0.11 mg / ml of Sodium pyruvate, 2 mg / ml of HSA, 50 μM of MTG, 0.5-20 mM (e.g., 20 mM) of nicotinamide and 50 μg / ml of heparin sodium. On day 14, the resulting iMSCs were collected, passaged and analyzed by flow cytometry as described in the General Methods.

[0300] FIG. 2 presents the results of flow cytometric analysis of the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of Passage 1 (P1) obtained by the preliminary experiment with TGF-β1 added throughout D3-D10, and FGF2 added throughout D2-D10, D4-D10, D6-D10, or D8-D10, or not added at all. As shown in FIG. 2, the percentage of cells expressing CD90 in the cell population was consistently high for all time windows tested; and higher percentages of cells expressing CD73 in the cell population were achieved by adding FGF2 at a later stage of the differentiation process and in particular D6-D10 or D8-D10, with the percentage being the highest (95.02%) when FGF2 was added throughout D8-D10. Higher percentages of cells expressing CD105 in the cell population were also achieved by adding FGF2 at a later stage of the differentiation process and in particular D6-D10 or D8-D10, with the percentage being the highest (93.58%) when FGF2 was added throughout D8-D10. Further, relatively high percentages of cells expressing each of CD90, CD73 and CD105 in the cell population were also achieved by adding TGF-β1 alone in contrast to addition of both TGF-β1 and FGF2. The results indicate that adding FGF2 after BMP and TGF-β signaling dual inhibition and especially after BMP signaling singular inhibition provided much better results in deriving iMSCs. Example 2. Effect of the time window for adding TGF-β1 during the differentiation  process.

[0301] iMSCs were derived from hiPSCs by the same method as Example 1 except that 4ng / ml of FGF2 was added throughout Day 2-10 of the differentiation and 2ng / ml of TGF-β1 was added for different time windows during Day 3-10 of the differentiation. The resulting iMSCs were collected on Day 14, passaged and analyzed by flow cytometry as described in the General Methods.

[0302] FIG. 3 presents the results of flow cytometric analysis of the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P1 obtained by the preliminary experiment with FGF2 added throughout Day 2-10, and TGF-β1 added throughout D3-D10, D6-D10, or D8-D10. As shown in FIG. 3, the percentage of cells expressing CD90 in the cell population was consistently high for all time windows tested; and higher percentages of cells expressing CD73 in the cell population were achieved by adding TGF-β1 at a later stage of the differentiation process and in particular D6-D10 or D8-D10, with the percentage being the highest (92.20%) when TGF-β1 was added throughout D8-D10. Higher percentages of cells expressing CD105 in the cell population were also achieved by adding TGF-β1 at a later stage of the differentiation process and in particular D6-D10 or D8-D10, with the percentage also being the highest (92.06%) when TGF-β1 was added throughout D8-D10. The results indicate that adding TGF-β1 after BMP and TGF-β signaling dual inhibition and especially after BMP signaling singular inhibition provided much better results in deriving iMSCs. Example 3. Effect of the addition of FGF2 with or without TGF-β1 during the  differentiation process

[0303] iMSCs were derived from hiPSCs by the same method as Example 1 except that 4 ng / ml of FGF2 was added throughout Day 8-10 of the differentiation with or without 2 ng / ml of TGF-β1 added throughout Day 3-10 of the differentiation. The resulting iMSCs were collected on Day 14, passaged and analyzed by flow cytometry as described in the General Methods.

[0304] The results are shown in FIG. 4. FIG. 4, left panel shows the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P1 obtained under the two different differentiation conditions, and FIG. 4, right panel shows the expression of CD105 in the cell population of P2 obtained under the differentiation condition without TGF-β1 added. As shown in FIG. 4, when adding FGF2 in combination with TGF-β1, the percentage of cells expressing CD90 in the cell population was about 99.76%, the percentage of cells expressing CD73 in the cell population was about 95.02%and the percentage of cells expressing CD105 in the cell population was slightly lower than about 95%, which was believed to be attributed to the presence of TGF-β1 during BMP signaling singular inhibition. In contrast, when adding FGF2 only, the percentage of cells expressing CD73 in the cell population and the percentage of cells expressing CD105 in the cell population were improved and very high percentages (about 95%or more) of cells expressing each of the three markers in the cell population could be achieved, and could be maintained during expansion / passaging. Again, the above results show that adding FGF2 and / or TGF-β1 and especially FGF2 or TGF-β1 after BMP and TGF-β signaling dual inhibition and especially after BMP signaling singular inhibition could provide highly pure iMSCs. Example 4. Effect of the timing for 2D culturing EBs in the maturation and expansion  process.

[0305] iMSCs were derived from hiPSCs by the same method as Example 1 except that 4ng / ml of FGF2 was added throughout Day 8-10 of the differentiation; 2 ng / ml of TGFβ1 was added throughout Day 3-10 of the differentiation; and the EBs were continuously subjected to 2D culture from Day 10 to Day 14 by plating them into 6-well plates in the maturation / expansion medium (Shownin, SN-02-1010) ( “D10 Plating” ) , or the EBs were firstly subjected to 3D culture from Day 10 to Day 12 by suspending them in the maturation / expansion medium, and then subjected to 2D culture from Day 12 to Day 16 by plating them into 6-well plates in the maturation / expansion medium ( “D12 Plating” ) . The resulting iMSCs were collected on Day 14 or 16, passaged and analyzed by flow cytometry as described in the General Methods. The percentages of cells expressing each of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P1 are shown in FIG. 5.

[0306] As shown in FIG. 5, both D10 Plating and D12 Plating produced relatively high percentages of cells expressing each of the three markers in the cell population, and D10 Plating was better than D12 Plating in deriving iMSCs. Example 5. Effect of the concentration of a BMP signaling inhibitor during the  differentiation process.

[0307] hiPSCs (Nuwacell) were routinely cultured in ncEpic medium (Shownin, RP01001) on VTN-coated 6-well plates. On Day -1, when the hiPSCs reached near confluence, the cells were collected by treatment with 0.5mM EDTA, and resuspended in ncEpic medium (Shownin, RP01001) containing 10μM Blebbistatin. The hiPSCs were seeded into polyHEMA-coated T25 flasks, and cultured on a belly dancer overnight for EB formation.

[0308] On Day 0, the differentiation of the EBs was initiated by changing the medium to a medium containing a basal medium, M5, and 8 μM CHIR99021. The M5 medium was IMDM+DMEM / F12 (1: 1) (50% / 50%) supplemented with 1-150 μg / ml (e.g., 20 μg / ml) of Transferrin, 1%by volume of Glutamax, 50 μM of MTG, 5-15 ng / ml (e.g., 10ng / ml) of Na2SeO3, 20-100 μg / ml (e.g., 30 μg / ml) of Mg Ascorbate, 1.2 μg / ml of Ethanolamine, 1.6 μg / ml of Putrescine 2HCl, 1-5 mg / ml (e.g., 2mg / ml) of HSA, and 1-10μg / ml (e.g., 5 μg / ml) of insulin. On Day 2, the medium was changed to a medium containing the same basal medium, 5 μM SB431542, and 1 μM RA. On Day 3, 4, 5, 6, and 8, the medium was changed to the same basal medium. Besides, FGF2 (4ng / mL) was added throughout Day 8-10 of the differentiation. Different concentrations of LDN193189 (0.1μM, 0.2μM, 0.5μM) was added for different time windows (Day 2-3, Day 2-4, Day 2-5 and Day 2-6) during the differentiation. The EBs were subjected to 2D culture from Day 10 to Day 14 by plating them into 6-well plates in the maturation / expansion medium (Shownin, SN-02-1010) . The resulting iMSCs were collected on Day 14, passaged and analyzed by flow cytometry as described in the General Methods. The results are shown in FIGS. 6-8.

[0309] FIG. 6 shows the expression of CD105 in the cell population of P1 obtained by adding different concentrations of LDN193189 in different time windows, indicating that LDN193189 at both 0.2μM and 0.5μM used in all time windows tested achieved high percentages (＞97%) of cells expressing CD105 in the cell population, but LDN193189 at 0.1 μM did not achieve satisfactory results for any time window tested and in particular D2-D3 and D2-D4. FIG. 7 shows the percentages of cells expressing each of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P4 obtained by adding 0.2 μM of LDN193189 in different time windows, confirming that LDN193189 at 0.2μM in all time windows tested maintained a high percentage (＞98%) of cells expressing each of the three markers, CD90, CD73, and CD105, even at P4. FIG. 8 shows the percentages of cells expressing each of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P4 obtained by adding 0.5 μM of LDN193189 in different time windows, confirming that LDN193189 at 0.5μM in all time windows tested maintained high percentages (＞99%) of cells expressing each of the three markers, CD90, CD73, and CD105, even at P4. Example 6. Effect of the concentration of a TGF-β signaling inhibitor when using the basal  medium M5.

[0310] hiP SCs (Nuwacell) were routinely cultured in ncEpic medium (Shownin, RP01001) on VTN-coated 6-well plates. On Day -1, when the hiPSCs reached near confluence, the cells were collected by treatment with 0.5mM EDTA, and resuspended in ncEpic medium (Shownin, RP01001) containing 10μM Blebbistatin. The hiPSCs were seeded into polyHEMA-coated T25 flasks, and cultured on a belly dancer overnight for EB formation.

[0311] On Day 0, the differentiation of the EBs was initiated by changing the medium to a medium containing the basal medium, M5, and 8 μM CHIR99021. On Day 2, the medium was changed to a medium containing the same basal medium and different concentrations of SB431542 (0μM, 5μM, 10μM) , 1μM RA, 0.5μM LDN193189, and 350ng / ml SHH. On Day 3, the medium was changed to a medium comprising the same basal medium and 0.5μM LDN193189. On day 6 and 8, the medium was changed to the same basal medium. 4ng / mL of FGF2 was added throughout Day 8-10 of the differentiation. The EBs were subjected to 2D culture from Day 10 to Day 14 by plating them into 6-well plates in the maturation / expansion medium (Shownin, SN-02-1010) . The resulting iMSCs were collected on Day 14, passaged and analyzed by flow cytometry as described in the General Methods.

[0312] The expressions of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P1 are shown in FIG. 9. As shown in FIG. 9, the percentage of cells expressing CD90 in the cell population was consistently high (over 99%) at all concentrations of SB431542 tested. Similarly, the percentage of cells expressing CD73 in the cell population was also consistently high (over 99%) at all concentrations of SB431542 tested. However, the percentage of cells expressing CD105 in the cell population was extremely low (20.81%) with SB431542 at 0μM, but increased to 98.69%with SB431542 at 5μM and to 99.47%with SB431542 at 10μM. The above results show that the presence of SB431542 was crucial in deriving highly pure iMSCs. Example 7. Effect of the concentration of a TGF-β signaling inhibitor when using the basal  medium M7.

[0313] iMSCs were derived from hiPSCs by the same method as Example 6 except that SB431542 was added at 0μM, 5μM, 10μM or 20μM, and the basal medium, M5, was replaced with M7 throughout the differentiation. The resulting iMSCs were collected on Day 14, passaged and analyzed by flow cytometry as described in the General Methods.

[0314] The expressions of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P2 obtained at different concentrations of SB431542 are shown in FIG. 10, and the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P1-P4 obtained at 5μM SB431542 is shown in FIG. 11. As shown in FIG. 10, similar to FIG. 9 when the basal medium M5 was used, SB431542 at all concentrations tested achieved best results (＞about 99%) for CD90 and CD73 in deriving iMSCs when the basal medium M7 was used, however, the percentage of cells expressing CD105 in the cell population was low (63.56%) with SB431542 at 0μM, but increased to above 98%with SB431542 at other concentrations tested. Again, the above results show that the presence of SB431542 was crucial in deriving highly pure iMSCs. The results shown in FIG. 11 indicate that the percentages of cells expressing each of CD90, CD73 and CD105 in the cell population remained high (＞about 98%) through passages of P1-P4. Example 8. Effect of the concentration of a WNT signaling activator when using the basal  medium M7.

[0315] hiPSCs (Nuwacell) were routinely cultured in ncEpic medium (Shownin, RP01001) on VTN-coated 6-well plates. On Day -1, when the hiPSCs reached near confluence, the cells were collected by treatment with 0.5mM EDTA, and resuspended in ncEpic medium (Shownin, RP01001) containing 10μM Blebbistatin. The hiPSCs were seeded into polyHEMA-coated T25 flasks, and cultured on a belly dancer overnight for EB formation.

[0316] On Day 0, the differentiation of the EBs was initiated by changing the medium to a medium containing the basal medium, M7, and different concentrations of CHIR99021 (8μM and 10μM) . On Day 2, the medium was changed to a medium containing the same basal medium and 10μM SB431542, 1μM RA, 0.5μM LDN193189, and 350ng / ml SHH. On Day 3, the medium was changed to the same basal medium and 0.5μM LDN 193189. On day 6 and 8, the medium was changed to the same basal medium. 4ng / mL of FGF2 was added throughout Day 8-10 of the differentiation. The EBs were subjected to 2D culture from Day 10 to Day 14 by plating them into 6-well plates in the maturation / expansion medium (Shownin, SN-02-1010) . The resulting iMSCs were collected on Day 14, passaged and analyzed by flow cytometry as described in the General Methods.

[0317] The percentages of cells expressing each of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P3 are shown in FIG. 12. As shown in FIG. 12, the percentages of cells expressing each of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P3 were high at both concentrations (8μM and 10μM) of CHIR99021 tested, all above 99%. Example 9. Effect of the concentration of a WNT signaling activator when using the basal  medium M5.

[0318] iMSCs were derived from hiPSCs by the same method as Example 8 except that the concentration of SB431542 was 5μM, and the basal medium, M7, was replaced with M5 throughout the differentiation. The resulting iMSCs were collected on Day 14, passaged and analyzed by flow cytometry as described in the General Methods.

[0319] The expressions of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P3 are shown in FIG. 13. As shown in FIG. 13, similar to FIG. 12 when the basal medium M7 was used, the percentages of cells expressing each of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P3 were also high at both concentrations (8μM and 10μM) of CHIR99021 tested, all above 98%, when the basal medium M5 was used. Example 10. Effect of the concentration of a sonic hedgehog agonist when using the basal  medium M7.

[0320] hiPSCs (Nuwacell) were routinely cultured in ncEpic medium (Shownin, RP01001) on VTN-coated 6-well plates. On Day -1, when the hiPSCs reached near confluence, the cells were collected by treatment with 0.5mM EDTA, and resuspended in ncEpic medium (Shownin, RP01001) containing 10μM Blebbistatin. The hiPSCs were seeded into polyHEMA-coated T25 flasks, and cultured on a belly dancer overnight for EB formation.

[0321] On Day 0, the differentiation of the EBs was initiated by changing the medium to a medium containing the basal medium, M7, and 8μM CHIR99021. On Day 2, the medium was changed to a medium containing the same basal medium and 5μM SB431542, 1μM RA, 0.5μM LDN193189, and different concentrations of SHH (0 ng / ml, 100 ng / ml, 350 ng / ml, 500 ng / ml) . On Day 3, the medium was changed to a medium comprising the same basal medium and 0.5μM LDN193189. On day 6 and 8, the medium was changed to the same basal medium. 4ng / mL of FGF2 was added throughout Day 8-10 of the differentiation. The EBs were subjected to 2D culture from Day 10 to Day 14 by plating them into 6-well plates in the maturation / expansion medium (Shownin, SN-02-1010) . The resulting iMSCs were collected on Day 14, passaged and analyzed by flow cytometry as described in the General Methods.

[0322] The expressions of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P3 are shown in FIG. 14. As shown in FIG. 14, the percentages of cells expressing each of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P3 were high at all concentrations (0 ng / ml, 100 ng / ml, 350 ng / ml, 500 ng / ml) of SHH tested, all above 99%. Example 11. Effect of the concentration of a sonic hedgehog agonist when using the basal  medium M5.

[0323] iMSCs were derived from hiPSCs by the same method as Example 10 except that the concentration of SHH was 0 or 350 ng / ml, and the basal medium, M7, was replaced with M5 throughout the differentiation. The resulting iMSCs were collected on Day 14, passaged and analyzed by flow cytometry as described in the General Methods.

[0324] The expressions of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P4 are shown in FIG. 15. As shown in FIG. 15, similar to FIG. 14 when the basal medium M7 was used, the percentages of cells expressing each of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P4 were high at both concentrations (0 ng / ml and 350 ng / ml) of SHH tested, all above 99%, when the basal medium M5 was used. At both concentrations tested, some small peaks emerged on the left side of the main peak of CD90 in the cells of P4. Example 12. Effect of the concentration of Retinoic Acid when using the basal medium M7.

[0325] hiPSCs (Nuwacell) were routinely cultured in ncEpic medium (Shownin, RP01001) on VTN-coated 6-well plates. On Day -1, when the hiPSCs reached near confluence, the cells were collected by treatment with 0.5mM EDTA, and resuspended in ncEpic medium (Shownin, RP01001) containing 10μM Blebbistatin. The hiPSCs were seeded into polyHEMA-coated T25 flasks, and cultured on a belly dancer overnight for EB formation.

[0326] On Day 0, the differentiation of the EBs was initiated by changing the medium to a medium containing the basal medium, M7, and 8μM CHIR99021. On Day 2, the medium was changed to a medium containing the same basal medium and 10μM SB431542, 0.5μM LDN193189, 350ng / ml SHH and different concentrations of RA (0μM, 0.1μM, 1μM, 2μM) . On Day 3, the medium was changed to the same basal medium and 0.5μM LDN193189. On day 6 and 8, the medium was changed to the same basal medium. 4ng / mL of FGF2 was added throughout Day 8-10 of the differentiation. The EBs were subjected to 2D culture from Day 10 to Day 14 by plating them into 6-well plates in the maturation / expansion medium (Shownin, SN-02-1010) . The resulting iMSCs were collected on Day 14, passaged and analyzed by flow cytometry as described in the General Methods.

[0327] The expressions of CD90 and CD105 in the cell population of P2 are shown in FIG. 16. As shown in FIG. 16, the percentages of cells expressing CD90 and CD105 in the cell population were high at all concentrations (0μM, 0.1μM, 1μM, 2μM) of RA tested, all above 97%. However, in the absence of RA, some small peaks emerged on the left side of the main peak for CD90, which indicates that the expression strength of CD90 in the cells were decreased. In contrast, when RA was used at concentrations of 0.1μM, 1μM, and 2μM, the small peaks substantially disappeared. These results indicate that RA could improve the expression strength of CD90 in the cells such that higher passages of iMSC cells could be provided substantially without losing the phenotype (CD90) of the stem cells. Example 13. Effect of the concentration of Retinoic Acid when using the basal medium M5.

[0328] iMSCs were derived from hiPSCs by the same method as Example 12 except that RA was added at a concentration of 0μM, 0.1μM or 1μM, and the basal medium, M7, was replaced with M5. The resulting iMSCs were collected on Day 14, passaged and analyzed by flow cytometry as described in the General Methods. The expressions of CD90, CD73 and CD105 in the cell population of P2 are shown in FIG. 17.  As shown in FIG. 17, the percentages of cells expressing each of CD90, CD73 and CD105 in the cell population were high at all concentrations (0μM, 0.1μM, and 1μM) of RA tested, all above 99%, similar to FIG. 16 when the basal medium M7 was used. However, in the absence of RA, some small peaks emerged on the left side of the main peak for CD90, which indicates that the expression strength of CD90 in the cells were decreased. In contrast, when RA was used at concentrations of 0.1μM and 1μM, the small peaks substantially disappeared. Again, these results indicate that RA could improve the expression strength of CD90 in the cells such that higher passages of iMSC cells could be provided substantially without losing the phenotype (CD90) of the stem cells. Example 14. Continuous production of high-purity MSCs at high number.

[0329] hiPSCs (Nuwacell) were routinely cultured in ncEpic medium (Shownin, RP01001) on VTN-coated 6-well plates. On Day -1, when the hiPSCs reached near confluence, the cells were collected by treatment with 0.5mM EDTA, and resuspended in ncEpic medium (Shownin, RP01001) containing 10μM Blebbistatin. The hiPSCs were seeded into polyHEMA-coated T25 flasks, and cultured on a belly dancer overnight for EB formation.

[0330] On day 0, the differentiation of the EBs was initiated by changing the medium to a medium containing the basal medium, M5, and 8μM CHIR99021. On Day 2, the medium was changed to a medium containing the same basal medium and 5μM SB431542, 1μM RA, and 0.5μM LDN193189. On day 3, 5, 6, and 8, the medium was changed to the same basal medium. Besides, FGF2 (4ng / mL) was added throughout Day 8-10 of the differentiation. The EBs were subjected to 2D culture from Day 10 to Day 14 by plating them into 6-well plates in the maturation / expansion medium (Shownin, SN-02-1010) . The resulting iMSCs were collected on Day 14, passaged, counted and analyzed by flow cytometry as described in the General Methods.

[0331] The morphology of cells in different stages is shown in FIG. 18, and the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the cell populations of P1 and P4 are shown in FIG. 19. As shown in FIG. 18, at D0, iPSCs formed round and uniform EBs and with the progress of differentiation, the EBs became gradually greater and retain round and uniform, and at P0, a large number of iMSCs crawled out of the EBs. As shown in FIG. 19, the percentages of cells expressing each of the three markers, CD90, CD73 and CD105, in the cell population of P1 were close to 100%; and the percentages of cells expressing each of the three markers, CD90, CD73 and CD105, in the cell population of P4 were well maintained. Further, the expansion folds for cells of P1 and P2 were as high as 9.81 and 13.7, respectively. The above results show that the protocol of this example could continuously produce the iMSCs at high number and high purity and the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the iMSCs could be well maintained during continuous production.

[0332] One skilled in the art would readily appreciate that the methods, compositions, and products described herein are representative of exemplary embodiments, and not intended as limitations on the scope of the disclosure. It will be readily apparent to one skilled in the art that varying substitutions and modifications may be made to the present disclosure disclosed herein without departing from the scope and spirit of the disclosure.

[0333] All patents and publications mentioned in the specification are indicative of the levels of those skilled in the art to which the present disclosure pertains. All patents and publications are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication was specifically and individually indicated as incorporated by reference.

[0334] The present disclosure is not to be limited in terms of the particular embodiments described in this application, which are intended as single illustrations of individual aspects of the disclosure. All the various embodiments of the present disclosure will not be described herein. The terms and expressions which have been employed are used as terms of description and not of limitation, and there is no intention that in the use of such terms and expressions of excluding any equivalents of the features shown and described or portions thereof, but it is recognized that various modifications are possible within the scope of the present disclosure claimed. Thus, it should be understood that although the present disclosure has been specifically disclosed by preferred embodiments and optional features, modification and variation of the concepts herein disclosed may be resorted to by those skilled in the art, and that such modifications and variations are considered to be within the scope of this disclosure as defined by the appended claims.

Claims

A method of producing induced mesenchymal stem cells (iMSCs) , comprising the steps of:(i) culturing pluripotent stem cells (PSCs) to form embryonic bodies (EBs) ;(ii) culturing the EBs from step (i) by a multistage differentiation process, wherein the multistage differentiation process comprises a WNT signaling activation stage, a BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage and a growth factor activation stage in this order, wherein the WNT signaling activation stage comprises culturing the EBs in the presence of a WNT signaling activator, wherein the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage comprises culturing the EBs in the presence of a TGF-β signaling inhibitor and a BMP signaling inhibitor, wherein the growth factor activation stage comprises culturing the EBs in the presence of a growth factor, and wherein in the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage, the BMP signaling inhibitor is used at a concentration of at least 0.15 μM; and(iii) culturing the EBs from step (ii) by a maturation and expansion process, thereby obtaining a cell population comprising the iMSCs,wherein steps (i) - (iii) are carried out under serum-free and xeno-free conditions.The method of claim 1, wherein the multistage differentiation process further comprises a first and / or a second transitional differentiation stages intervening between the BMP and TGF-βsignaling dual inhibition stage and the growth factor activation stage, and wherein the first transitional differentiation stage comprises culturing the EBs under the conditions which keep the EBs from the inhibition of TGF-β signaling, and the second transitional differentiation stage comprises culturing the EBs under the conditions which keep the EBs from the inhibition of both TGF-β signaling and BMP signaling.The method of claim 2, wherein the WNT signaling activation stage is performed by using a first differentiation medium supplemented with the WNT signaling activator, the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage is performed by using a second differentiation medium supplemented with the TGF-β signaling inhibitor and the BMP signaling inhibitor, the growth factor activation stage is performed by using a third differentiation medium supplemented with the growth factor, the first transitional differentiation stage is performed by using a first transitional culture medium obtained by removing the TGF-β signaling inhibitor from the second differentiation medium, and the second transitional differentiation stage is performed by using a second transitional culture medium obtained by removing the TGF-β signaling inhibitor and the BMP signaling inhibitor from the second differentiation medium.The method of claim 3, wherein the first to third differentiation media and the first to second transitional culture media are serum-free, xeno-free and chemically defined culture media comprising a same culture medium as basal solution.The method of claim 4, wherein the same culture medium in the differentiation media and the transitional culture media comprises a basal medium, transferrin, glutamine or a derivative thereof, an ascorbic compound, an ethanolamine-based compound, a putrescine-based compound, human serum albumin (HSA) , and an insulin-based compound.The method of claim 5, wherein the same culture medium in the differentiation media and the transitional culture media further comprises selenite, monothioglycerol (MTG) , mB27, or a combination thereof.The method of claim 6, wherein the same culture medium in the differentiation media and the transitional culture media comprises a basal medium, about 1 to about 200 μg / mL of transferrin, about 0.1%to about 5%by volume of glutamine or a derivative thereof, about 1 to about 30 ng / mL of selenite, about 1 to about 200 μg / mL of an ascorbic compound, about 1 to about 30 μM of an ethanolamine-based compound, about 1 to about 30 μM of a putrescine-based compound, 1 to 200 μM of MTG, about 1 to about 20 mg / mL of HSA, and about 1 to about 15 μg / mL of an insulin-based compound.The method of claim 6, wherein the same culture medium in the differentiation media and the transitional culture media comprises a basal medium, about 1 to about 200 μg / mL of transferrin, about 0.1%to about 5%by volume of glutamine or a derivative thereof, about 1 to about 30 ng / mL of selenite, about 1 to about 200 μg / mL of an ascorbic compound, about 1 to about 30 μM of an ethanolamine-based compound, about 1 to about 30 μM of a putrescine-based compound, about 0.1%to about 10%by volume of mB27, about 1 to about 20 mg / mL of HSA, and about 1 to about 15 μg / mL of an insulin-based compound.The method of any one of the preceding claims, wherein the WNT signaling activator comprises a glycogen synthase kinase-3 (GSK3) inhibitor.The method of any one of the preceding claims, wherein the WNT signaling activator is used at a concentration of about 5 μM to about 15 μM.The method of any one of the preceding claims, wherein the WNT signaling activation stage is performed for about 1 to about 2 days.The method of claim 11, wherein the WNT signaling activation stage is performed from Day 0 toDay2.The method of any one of the preceding claims, wherein the BMP signaling inhibitor is selected from Noggin, Chordin, Follostatin, Dorsomorphin, LDN193189, or a combination thereof.The method of any one of the preceding claims, wherein the BMP signaling inhibitor is used at a concentration of about 0.2 μM to about 5.0 μM.The method of any one of the preceding claims, wherein the TGF-β signaling inhibitor is selected from RepSox, A83-01, SB431542, D4476, GW788388, LY364947, LY580276, SB525334, SB505124, SD208, GW6604, SJN-2511, or a combination thereof.The method of any one of the preceding claims, wherein the TGF-β signaling inhibitor is used at a concentration of about 1 μM to about 30 μM.The method of any one of claims 3-16, wherein the second differentiation medium is further supplemented with a sonic hedgehog agonist.The method of claim 17, wherein the sonic hedgehog agonist is selected from SHH, SHH C24II, SHH C25II, SAG, SMO-IN-1, purmorphamine, an analog thereof, or a combination thereof.The method of claim 17 or 18, wherein the sonic hedgehog agonist is used at a concentration of about 1 ng / mL to about 1000ng / mL.The method of any one of claims 3-19, wherein the second differentiation medium is further supplemented with a retinoic acid receptor (RAR) agonist.The method of claim 20, wherein the RAR agonist is selected from retinoic acid (RA) , EC23, WYC-209, AC-55649, Ch55, TTNPB, an analog thereof, or a combination thereof.The method of claim 20 or 21, wherein the RAR agonist is used at a concentration of about 0.1 μM to about 10 μM.The method of any one of the preceding claims, wherein the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage is performed for about 1 to about 2 days.The method of claim 23, wherein the BMP and TGF-β signaling dual inhibition stage is performed from Day 2 to Day 3.The method of any one of the preceding claims, wherein the growth factor is selected from FGF, TGF-β or a combination thereof, and preferably FGF or TGF-β.The method of any one of the preceding claims, wherein the growth factor is used at a concentration of about 0.5 ng / mL to about 20 ng / mL.The method of any one of the preceding claims, wherein the growth factor activation stage is performed for about 2 to about 7 days.The method of claim 27, wherein the growth factor activation stage is performed from Day 6 to Day 10, or from Day 8 to Day 10.The method of any one of claims 3-28, wherein the first and / or second transitional differentiation stages are performed for about 1 to about 5 days.The method of claim 29, wherein the first and / or second transitional differentiation stages are performed from Day 3 to Day 6, or from Day 3 to Day 8.The method of any one of the preceding claims, wherein the maturation and expansion process is performed entirely under 2D culture condition.The method of any one of the preceding claims, wherein the maturation and expansion process comprises expanding cells in the EBs for one or more passages such as 4 passages with the expressions of CD90, CD73 and CD105 in the cells substantially maintained.The method of claim 32, wherein the cells in the EBs are expanded by using a serum-free and xeno-free maturation and expansion medium comprising a basal medium, about 1 to about 30 μM of an ethanolamine-based compound, about 1 to about 30 μM of a putrescine-based compound, and about 0.1%to about 20%by volume of a human platelet lysate (HPLT) .The method of claim 33, wherein the maturation and expansion medium further comprises about 1 to about 150 μg / mL of transferrin, about 0.5%to about 5%by volume of glutamine or a derivative thereof, about 1 to about 150 μg / mL of an ascorbic compound, and about 1 to about 10 μg / mL of an insulin-based compound.The method of claim 34, wherein the maturation and expansion medium comprises a basal medium, about 5 to about 30 μM of ethanolamine, about 1 to about 20 μM of putrescine dihydrochloride, about 0.1%to about 10%by volume of HPLT, about 1 to about 150 μg / mL of transferrin, about 1 to about 10 μg / mL of insulin, about 1 to about 150 μg / mL of ascorbate, and about 0.5%to about 5%by volume of glutamine.The method of any of the preceding claims, wherein at least about 90%and preferably at least about 95%of cells in the cell population obtained without any enrichment or sorting are iMSCs identifiable as expressing CD90, CD73 and CD105.A substantially homogeneous population of iMSCs produced by the method according to any one of claims 1-36.

Images