Engineered TNPB nuclease AG-h11 and use thereof

Abstract

Provided is an engineered TnpB nuclease AG-H11 and the use thereof. Provided is a nucleic acid and a nucleic acid construct encoding the nuclease, a guide RNA and a nucleic acid construct thereof, and a composition, a recombinant vector, a recombinant host cell and a kit comprising the nuclease. Provided is a method for introducing a double-strand break into a targeting gene of a host cell, a method for deleting, replacing or inserting a targeting gene of a host cell, and a method for obtaining a host cell in which a target gene is deleted, replaced or inserted. Provided is the nucleic acid and the nucleic acid construct encoding the nuclease, the guide RNA and the nucleic acid construct thereof, the composition, the recombinant vector, or the recombinant host cell for introducing a double-strand break into a targeting gene of a host cell, deleting, replacing or inserting a targeting gene of a host cell, and preparing a drug.

Description

ENGINEERED TNPB NUCLEASE AG-H11 AND USE THEREOFTECHNICAL FIELD

[0001] The present application relates to the field of molecular biology, and specifically to an engineered TnpB nuclease AG-H11 and the use thereof. The present application further specifically relates to: a nucleic acid and a nucleic acid construct encoding the nuclease, a guide RNA and a nucleic acid construct thereof, and a composition, a recombinant vector, a recombinant host cell and a kit comprising the nuclease. The present application further specifically relates to: a method for introducing a double-strand break into a targeting gene of a host cell, a method for deleting, replacing or inserting a targeting gene of a host cell, and a method for obtaining a host cell in which a targeting gene is deleted, replaced or inserted. The present application further specifically relates to the use of the nuclease, the nucleic acid and the nucleic acid construct encoding the nuclease, the guide RNA and the nucleic acid construct thereof, the composition, the recombinant vector, or the recombinant host cell for introducing a double-strand break into a targeting gene of a host cell, deleting, replacing or inserting a targeting gene of a host cell, and preparing a drug or a preparation for gene therapy, cell therapy, genome research, and stem cell induction and post-induction differentiation.BACKGROUND

[0002] With the rapid development of modern biotechnology and the advent of post-genome era, people are entering the stage of rewriting or even redesigning genetic information from the stage of reading biological genetic DNA information. The discovery of CRISPR / Cas9 technology has made a revolutionary breakthrough in gene editing technology. CRISPR / Cas9 is an RNA-mediated targeted gene editing tool, which can specifically recognize and cleave different endogenous DNA sequences through reprogramming of sgRNA. Cas9 has two nuclease domains, RuvC and HNH, which are responsible for the cleavage of either strand of DNA respectively. Mutating either of these sites can convert Cas9 into a single-strand Cas9 nickase. Important new technologies concerning Cas9, such as base editing and prime editing, are all designed based on Cas9 nickase.

[0003] However, some shortcomings of CRISPR / Cas9 limit its application: First, the CDS sequence of SpCas9 has a length exceeding 4.1 Kb, which exceeds the maximum effective packaging capacity of adenovirus (AAV) , and therefore it is difficult for the adenovirus-mediated gene delivery; although lentivirus has a stronger packaging capacity than AAV (with an upper loading limit of about 9 kb) , the proportion of proteins in SpCas9 is still too high, limiting the potential for subsequent engineering. These shortcomings seriously restrict the application of SpCas9 in clinical medicine. Subsequently, CRISPR / Cas12 or 12f system with a smaller molecular weight appears, but the editing efficiency of proteins such as Cas12 is not superior to that of SpCas9. Therefore, SpCas9 is still widely accepted and used at present. Second, the PAM sequence of SpCas9, which is the NGG sequence, is relatively simple and has a higher occurrence rate in the genome. Its advantage lies in the flexibility in reprograming sgRNA to complete the recognition and cleavage of different DNA sequences. However, this flexibility also leads to the off-target effects of suboptimal genome editing outcomes.

[0004] Therefore, gene editing technologies realized using RNA-mediated endonuclease, i.e., insertion sequences IscB and TnpB from IS200 / IS605 family, appear subsequently. They are widely distributed in microorganisms and have a more compact protein structure, with a size of about 400 aa that is less than 1 / 3 of SpCas9, so they have greater potential for engineering in terms of the application of enzymes. TnpB cleaves DNA next to the 5’ TTGAT transposon-associated motif (TAM) through reRNA (right element RNA, derived from RE element in ISDra2 transposon) mediation, thereby breaking and mutating the DNA sequence in the genome. The DNA cleavage function of TnpB needs to meet two conditions at the same time: (1) TAM sequence; (2) a sequence located at the 3’ end of reRNA that matches with a targeting gene. Different nucleases can recognize different TAM, and therefore the excavation of more highly active nuclease tools and the verification and detection of their functions can provide more, better and flexible choices for the development of gene editing strategies.

[0005] It should be noted that methods described in this section are not necessarily methods that have been previously conceived or employed. It should not be assumed that any of the methods described in this section is considered to be the prior art just because they are included in this section, unless otherwise indicated expressly. Similarly, the problem mentioned in this section should not be considered to be universally recognized in any prior art, unless otherwise indicated expressly.SUMMARY

[0006] In order to solve the above problems, the present application is intended to find RNA-mediated endonucleases having a suitable protein molecular weight and good gene editing effects and provide more diverse and specific tools for gene editing.

[0007] The present application provides an isolated nuclease, wherein the nuclease comprises one amino acid sequence obtained by performing substitution, deletion, and / or insertion of at least 1, 2, 3, 4, 5, or 6 amino acids on the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1, wherein the position of the substitution, deletion, and / or insertion includes 313, 318, 29, 220, 251, 218, 207, 97, 100, 213, 300, 5, 314, 119, 104, 206, 214, 166, 297, 250, 283, 45, 158, 27, 279, 267, 101, 89, 149, 236, 303, 307, 334, 193, 342, 126, 335, 253, 339, 69, 255, 120, 59, 3, 332, 174, 259, 223, 362, 312, 125, 216, 229, 160, 88, 111, 105, 159, 194, 4, 56, 258, 34, 247, 145, 311, 26, 182, 16, 183, 9, 181, 96, 210, 106, 57, 321, 333, 330, 44, 367, 257, 231, 328, 239, 215, 2, 137, 54, 268, 127, 240, 124, 308, 70, 200, 15, 71, 52, 175, 28, 348, 36, 140, 366, 237, 201, 6, 363, 154, 202, 128, 108, 33, 73, 17, or any combination thereof, with numbering relative to SEQ ID NO: 1.

[0008] According to an embodiment of the present application, a nucleic acid can be provided, wherein, the nucleic acid encodes the nuclease described in the present application.

[0009] According to an embodiment of the present application, a nucleic acid construct can be provided, comprising the nucleic acid described in the present application, wherein the nucleic acid construct further comprises a promoter.

[0010] According to an embodiment of the present application, a composition can be provided, wherein the composition comprises: An engineered nuclease or a nucleic acid encoding the engineered nuclease described in the present application; and a guide RNA, wherein the guide RNA comprises a reRNA, the reRNA comprises a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 216 or a variant thereof, the guide RNA can bind to the nuclease described in the present application.

[0011] According to an embodiment of the present application, a recombinant vector can be provided, wherein the recombinant vector comprises the nucleic acid encoding the nuclease described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, or the composition described in the present application.

[0012] According to an embodiment of the present application, a recombinant host cell can be provided, wherein, the recombinant host cell comprises the nuclease described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, the composition described in the present application, or the recombinant vector described in the present application.

[0013] According to an embodiment of the present application, a method for introducing a double-strand break into a targeting gene of a host cell can be provided, wherein the method comprises: delivering the nuclease described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, the composition described in the present application, or the recombinant vector described in the present application into a host cell.

[0014] According to an embodiment of the present application, a method for deleting, replacing or inserting a targeting gene of a host cell can be provided, wherein the method comprises: delivering the nuclease described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, the composition described in the present application, or the recombinant vector described in the present application into a host cell.

[0015] According to an embodiment of the present application, a method for obtaining a host cell in which a targeting gene is deleted, replaced or inserted can be provided, wherein the method comprises: delivering the nuclease described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, the composition described in the present application, or the recombinant vector described in the present application into a host cell.

[0016] According to an embodiment of the present application, the use of the nuclease described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, the composition described in the present application, the recombinant vector described in the present application, or the recombinant host cell described in the present application for introducing a double-strand break into a targeting gene of a host cell can be provided.

[0017] According to an embodiment of the present application, the use of the nuclease described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, the composition described in the present application, the recombinant vector described in the present application, or the recombinant host cell described in the present application for deleting, replacing or inserting a targeting gene of a host cell can be provided.

[0018] According to an embodiment of the present application, the use of the nuclease described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, the composition described in the present application, the recombinant vector described in the present application, or the recombinant host cell described in the present application for preparing a drug or a preparation for gene therapy, cell therapy, genome research, and stem cell induction and post-induction differentiation can be provided.

[0019] According to an embodiment of the present application, a kit can be provided, wherein, the kit comprises the nuclease described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, the composition described in the present application, the recombinant vector described in the present application, or the recombinant host cell described in the present application.

[0020] The protein molecular weight of the nuclease described in the present application is far less than that of SpCas9, about less than one third of the latter, which provides more possibilities for a variety of in vivo delivery in subsequent gene therapy, and can solve the problem of having difficulty in the delivery of SpCas9 caused by the protein size; and compared with AsCas12a which also has a low protein molecular weight, the nuclease has higher gene editing efficiency, which provides the possibility of same becoming a new gene editing application tool; additionally, since different nucleases can recognize different transposon-associated motifs, the novel nuclease discovered in the present application brings more choices for subsequent application scenarios of different scales.

[0021] It should be understood that the content described in this section is not intended to identify critical or important features of the examples of the present application and is not used to limit the scope of the present application. Other features of the present application will be easily understood through the following description.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0022] The accompanying drawings exemplarily show embodiments and form a part of the specification and are used to explain exemplary implementations of the embodiments together with a written description of the specification. The embodiments shown are merely for illustrative purposes and do not limit the scope of the claims. Throughout the accompanying drawings, the same reference numerals denote similar but not necessarily same elements.

[0023] FIG. 1 shows a schematic diagram of the mutated sites in the nuclease candidates in example 1.

[0024] FIG. 2 shows the relative gene editing efficiency of the nuclease candidates including AG-H11-SDM267, AG-H11-SDM272, AG-H11-SDM25, AG-H11-SDM194, AG-H11-SDM218, AG-H11-SDM193, AG-H11-SDM184, AG-H11-SDM87, AG-H11-SDM89, AG-H11-SDM188, AG-H11-SDM256, AG-H11-SDM4, AG-H11-SDM268, AG-H11-SDM313, AG-H11-SDM93, AG-H11-SDM183, AG-H11-SDM189, AG-H11-SDM152, AG-H11-SDM254, AG-H11-SDM217, AG-H11-SDM241, AG-H11-SDM37, AG-H11-SDM144, AG-H11-SDM23, AG-H11-SDM237, AG-H11-SDM229, AG-H11-SDM90, AG-H11-SDM79, AG-H11-SDM317, AG-H11-SDM205, AG-H11-SDM258, AG-H11-SDM261, AG-H11-SDM285, AG-H11-SDM173, AG-H11-SDM292, AG-H11-SDM115, AG-H11-SDM286, AG-H11-SDM219, AG-H11-SDM290, AG-H11-SDM61, AG-H11-SDM221, AG-H11-SDM109, AG-H11-SDM51, AG-H11-SDM2, AG-H11-SDM283, AG-H11-SDM319, AG-H11-SDM108, AG-H11-SDM224, AG-H11-SDM196, AG-H11-SDM303, AG-H11-SDM266, AG-H11-SDM314, AG-H11-SDM191, AG-H11-SDM199, AG-H11-SDM146, AG-H11-SDM78, AG-H11-SDM100, AG-H11-SDM94, AG-H11-SDM145, AG-H11-SDM174, AG-H11-SDM3, AG-H11-SDM48, AG-H11-SDM223, AG-H11-SDM28, AG-H11-SDM214, AG-H11-SDM132, AG-H11-SDM265, AG-H11-SDM22, AG-H11-SDM166, AG-H11-SDM13, AG-H11-SDM167, AG-H11-SDM8, AG-H11-SDM165, AG-H11-SDM86, AG-H11-SDM186, AG-H11-SDM95, AG-H11-SDM49, AG-H11-SDM275, AG-H11-SDM284, AG-H11-SDM114, AG-H11-SDM282, AG-H11-SDM36, AG-H11-SDM307, AG-H11-SDM222, AG-H11-SDM201, AG-H11-SDM281, AG-H11-SDM207, AG-H11-SDM190, AG-H11-SDM1, AG-H11-SDM125, AG-H11-SDM46, AG-H11-SDM230, AG-H11-SDM116, AG-H11-SDM316, AG-H11-SDM208, AG-H11-SDM113, AG-H11-SDM262, AG-H11-SDM62, AG-H11-SDM178, AG-H11-SDM12, AG-H11-SDM63, AG-H11-SDM44, AG-H11-SDM159, AG-H11-SDM24, AG-H11-SDM294, AG-H11-SDM30, AG-H11-SDM128, AG-H11-SDM306, AG-H11-SDM206, AG-H11-SDM179, AG-H11-SDM158, AG-H11-SDM5, AG-H11-SDM304, AG-H11-SDM141, AG-H11-SDM180, AG-H11-SDM117, AG-H11-SDM97, AG-H11-SDM27, AG-H11-SDM315, AG-H11-SDM64, AG-H11-SDM14 in example 2.

[0025] FIG. 3 shows the relative gene editing efficiency of the nuclease candidates including AG-H11-TM18, AG-H11-TM19, AG-H11-TM4, AG-H11-TM3, AG-H11-TM27, AG-H11-TM7, AG-H11-TM17, AG-H11-TM6, AG-H11-TM14, AG-H11-TM20, AG-H11-TM9, AG-H11-TM82, AG-H11-TM83, AG-H11-TM1, AG-H11-TM21, AG-H11-TM15, AG-H11-TM11, AG-H11-TM25, AG-H11-TM54, AG-H11-TM24, AG-H11-TM36, AG-H11-TM73, AG-H11-TM30, AG-H11-TM63, AG-H11-TM85, AG-H11-TM41, AG-H11-TM37, AG-H11-TM13, AG-H11-TM10, AG-H11-TM39, AG-H11-TM81, AG-H11-TM23, AG-H11-TM26, AG-H11-TM5, AG-H11-TM29, AG-H11-TM64, AG-H11-TM48, AG-H11-TM22, AG-H11-TM88, AG-H11-TM58, AG-H11-TM76, AG-H11-TM12, AG-H11-TM69, AG-H11-TM51, AG-H11-TM31, AG-H11-TM43, AG-H11-TM65, AG-H11-TM71, AG-H11-TM68, AG-H11-TM87, AG-H11-TM49, AG-H11-TM28, AG-H11-TM50, AG-H11-TM79, AG-H11-TM52, AG-H11-TM34, AG-H11-TM57, AG-H11-TM66, AG-H11-TM70, AG-H11-TM8, AG-H11-TM84, AG-H11-TM60, AG-H11-TM35, AG-H11-TM75, AG-H11-TM67, AG-H11-TM53, AG-H11-TM40, AG-H11-TM32, AG-H11-TM59, AG-H11-TM80, AG-H11-TM42, AG-H11-TM89, AG-H11-TM33, AG-H11-TM44, AG-H11-TM38, AG-H11-TM74, AG-H11-TM77, AG-H11-TM46 in examples 3 and 4.

[0026] FIG. 4 shows the relative gene editing efficiency of the nuclease candidates including AG-H11-MM1, AG-H11-MM2, AG-H11-MM3, AG-H11-MM4, AG-H11-MM5, AG-H11-MM6, AG-H11-MM7, AG-H11-MM8, AG-H11-MM9, AG-H11-MM10, AG-H11-MM11 in examples 5, 6 and 7.

[0027] FIG. 5A and FIG. 5B show the relative gene editing efficiency of the nuclease candidates including AG-H11-TM30, AG-H11-TM54, AG-H11-TM76, AG-H11-MM1, AG-H11-MM2, AG-H11-MM3, AG-H11-MM4, AG-H11-MM5, AG-H11-MM6 in example 8.DETAILED DESCRIPTION OF EMBODIMENTS

[0028] Unless otherwise indicated or contradicts the context, the terms or expressions used herein should be read in conjunction with the entire content of the present disclosure and as understood by those of ordinary skill in the art. All technical and scientific terms used herein have the same meanings as commonly understood by those of ordinary skill in the art, unless otherwise defined.

[0029] As described in the present application, the expression “Aand / or B” includes three cases: (1) A; (2) B; and (3) A and B. The expression “A, B and / or C” includes seven cases: (1) A; (2) B; (3) C; (4) A and B; (5) A and C; (6) B and C; and (7) A, B and C. The meaning of similar expressions can be deduced in the same way.

[0030] In the present application, the terms “nucleic acid” and “polynucleotide” are used interchangeably, and refer to polymerization forms of nucleotides of any length, including deoxyribonucleotides, ribonucleotides, combinations thereof, and analogs thereof.

[0031] In the present application, the terms “polypeptide” and “peptide” are used interchangeably, and refer to polymers of amino acids of any length. Therefore, polypeptides, oligopeptides, proteins, antibodies and enzymes are all included in the definition of polypeptide.

[0032] As described in the present application, the “fragment” of a sequence refers to a portion of a sequence. For example, the fragment of a nucleic acid sequence refers to a portion of the nucleic acid sequence, and the fragment of an amino acid sequence refers to a portion of the amino acid sequence.

[0033] As described in the present application, the expression “K253R” denotes the substitution of the amino acid at position 253 from K (lysine) to R (arginine) , the expression “A218R” represents the substitution of the amino acid at position 218 from A (alanine) to R (arginine) , with numbering relative to the wild type nuclease as shown in SEQ ID NO: 1. Similar expressions can be interpreted accordingly.

[0034] As described in the present application, a “variant” of a sequence is a polynucleotide or polypeptide that differs from a reference polynucleotide or polypeptide, respectively, but retains essential properties. A typical variant of a polynucleotide differs in nucleic acid sequence from another reference polynucleotide, and the differences in nucleic acid sequence may or may not alter the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the reference polynucleotide. A typical variant of a polypeptide differs in amino acid sequence from another reference polypeptide. Generally, the differences are limited so that the sequences of the reference polypeptide and the variant are generally very similar and are identical in many regions. A variant polypeptide and a reference polypeptide may differ in amino acid sequence by one or more substitutions, additions, deletions in any combination. The substituted or inserted amino acid residue may or may not be a residue encoded by the genetic code. Variants of polynucleotides or polypeptides may be naturally occurring, such as allelic variations, or they may be unknown naturally occurring variants. Non-naturally occurring polynucleotide and polypeptide variants can be produced by mutagenesis techniques, direct synthesis, and other recombinant methods known to the skilled artisan.

[0035] Amino acids are usually classified by the properties of their side chains. For example, side chains may render amino acids weak acids (e.g., amino acids D and E) or weak bases (e.g., amino acids K, R and H) ; and if the side chains are polar, the amino acids become hydrophilic (e.g., amino acids L and I) , or if the side chains are nonpolar, the amino acids become hydrophobic (e.g., amino acids S and C) .

[0036] As described in the present application, the “aliphatic amino acid” has a side chain that is an aliphatic group. Aliphatic groups cause amino acids to be nonpolar and hydrophobic. The aliphatic group is preferably an unsubstituted branched or linear alkyl group. Non-limiting examples of the aliphatic amino acids are A (alanine) , V (valine) , L (leucine) , I (isoleucine) , M (methionine) , D (aspartic acid) , E (glutamic acid) , K (lysine) , R (arginine) , G (glycine) , S (serine) , T (threonine) , C (cysteine) , N (asparagine) , and Q (glutamine) .

[0037] As described in the present application, the “nonpolar amino acid” has a nonpolar side chain that makes the amino acid hydrophobic. Non-limiting examples of the nonpolar amino acid are A (alanine) , V (valine) , L (leucine) , I (isoleucine) , F (phenylalanine) , W (tryptophan) , M (methionine) , P (proline) , and G (glycine) .

[0038] As described in the present application, the “polar amino acid” has a polar side chain that makes the amino acid hydrophilic. Non-limiting examples of the polar amino acid are T (threonine) , S (serine) , C (cysteine) , N (asparagine) , Q (glutamine) , Y (tyrosine) , K (lysine) , R (arginine) , H (histidine) , D (aspartic acid) , and E (glutamic acid) . Polar amino acids can be divided into polar uncharged amino acids or polar charged amino acids.

[0039] As described in the present application, the “polar uncharged amino acid” has a polar side chain of uncharged residues. Non-limiting examples of the polar uncharged amino acid are T (threonine) , S (serine) , C (cysteine) , N (asparagine) , Q (glutamine) , and Y (tyrosine) .

[0040] As described in the present application, the “polar charged amino acid” has a polar side chain of at least one charged residue. Non-limiting examples of the polar charged amino acid are K (lysine) , R (arginine) , H (histidine) , D (aspartic acid) , and E (glutamic acid) . Polar charged amino acids can be divided into positively charged amino acids or negatively charged amino acids.

[0041] As described in the present application, the “positively charged amino acid” has a polar side chain of at least one positively charged residue. Non-limiting examples of the positively charged amino acid are K (lysine) , R (arginine) , and H (histidine) .

[0042] As described in the present application, the “negatively charged amino acid” has a polar side chain of at least one negatively charged residue. Non-limiting examples of the negatively charged amino acid are D (aspartic acid) , and E (glutamic acid) .

[0043] The term “family” as used in the present application refers to a group of nucleic acids or proteins having high structural similarity produced by the same ancestor by means of replication and variation, which usually have related or even the same functions.

[0044] The term “nuclease” described in the present application refers to an enzyme capable of cleaving phosphodiester bonds. Nucleases hydrolyze the phosphodiester bonds in the backbone of nucleic acids. The term “endonuclease” described in the present application refers to an enzyme capable of cleaving phosphodiester bonds between nucleotides.

[0045] The term “guide RNA” described in the present application refers to any RNA molecule that can form a complex with the nuclease described in the present application. For example, the guide RNA can be a molecule that recognizes a targeting gene. In some embodiments of the present application, the guide RNA comprises a reRNA and a targeted sequence, wherein the reRNA can bind to a particular nuclease, and the targeted sequence can be designed to be complementary to a target strand of a targeting gene.

[0046] The term “transposon-associated motif” (TAM) described in the present application refers to a short nucleotide sequence adjacent to a targeting gene, which sequence can be recognized by a complex formed by nuclease and guide RNA described in the present application. If a targeting gene is not adjacent to a transposon-associated motif, the nuclease cannot successfully recognize the targeting gene. Sequences and lengths of the transposon-associated motif in the present application can vary depending on the nuclease.

[0047] The terms “targeting gene” “targeting sequence” “targeting nucleic acid” “gene of interest” , “sequence of interest” and “nucleic acid of interest” described in the present application are used interchangeably, and refer to nucleotide sequences on chromosomal DNA, chloroplast DNA, mitochondrial DNA, plasmid DNA, or any other DNA molecule in the genome of cells, which sequences can be recognized, bound to, and selectively cleaved by a complex formed by the nuclease and guide RNA described in the present application.

[0048] The term “nucleic acid construct” as used in the present application is defined as a single-stranded or double-stranded nucleic acid molecule herein, and preferably refers to an artificially constructed nucleic acid molecule. Optionally, the nucleic acid construct further includes one or more operably linked regulatory sequences, which can direct the expression of a coding sequence in a suitable host cell under compatible conditions. The term “expression” is understood to include any step involved in the production of a protein or polypeptide, including, but not limited to, transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification and secretion. The term “regulatory sequence” includes all components necessary or advantageous for expression of the polypeptide / protein of the present application. Each regulatory sequence may be naturally present or exogenous to the nucleic acid sequence encoding the protein or polypeptide. These regulatory sequences include, but are not limited to, leader sequences, polyadenylation sequences, propeptide sequences, promoters, signal sequences, and transcription terminators. At a minimum, the regulatory sequences should include promoters and termination signals for transcription and translation. Regulatory sequences with linkers can be provided for the purpose of introduction into specific restriction sites for linking the regulatory sequences to the coding region of a nucleic acid sequence encoding a protein or polypeptide.

[0049] The term “promoter” as used in the present application refers to a polynucleotide sequence that can control the transcription of a coding sequence. Promoter sequences include specific sequences sufficient to enable RNA polymerase to recognize, bind, and initiate transcription. In addition, promoter sequences may include sequences that optionally modulate the recognition, binding and transcription initiation activities of RNA polymerase in the nucleic acid construct provided in the present application. A promoter can affect the transcription of a gene located on the same nucleic acid molecule as the promoter or a gene located on a different nucleic acid molecule from the promoter.

[0050] The term “host cell” as used in the present application include, but are not limited to, an animal cell, a plant cell, an algal cell, a fungal cell, a yeast cell, or a bacterial cell. This term includes a progeny of an original cell into which an exogenous nucleic acid fragment has been introduced. Exemplary host cell includes human embryonic kidney cell HEK293T. It is understood that, due to natural, accidental or intentional mutations, the progeny of a single parent cell may not necessarily be identical to the original parent morphologically or in terms of genome or total DNA complement.

[0051] The term “vector” as used in the present application refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid molecule connected to it. Examples of vectors include, but are not limited to, plasmids, viruses, bacteria, phages, and insertable DNA fragments. The term “plasmid” refers to a circular double-stranded DNA capable of accepting an exogenous nucleic acid fragment and replicating in prokaryotic or eukaryotic cells.

[0052] Nuclease

[0053] The present application provides an engineered nuclease, wherein the nuclease comprises one amino acid sequence obtained by performing substitution, deletion, and / or insertion of at least 1, 2, 3, 4, 5, or 6 amino acids on the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1, wherein the position of the substitution, deletion, and / or insertion includes 313, 318, 29, 220, 251, 218, 207, 97, 100, 213, 300, 5, 314, 119, 104, 206, 214, 166, 297, 250, 283, 45, 158, 27, 279, 267, 101, 89, 149, 236, 303, 307, 334, 193, 342, 126, 335, 253, 339, 69, 255, 120, 59, 3, 332, 174, 259, 223, 362, 312, 125, 216, 229, 160, 88, 111, 105, 159, 194, 4, 56, 258, 34, 247, 145, 311, 26, 182, 16, 183, 9, 181, 96, 210, 106, 57, 321, 333, 330, 44, 367, 257, 231, 328, 239, 215, 2, 137, 54, 268, 127, 240, 124, 308, 70, 200, 15, 71, 52, 175, 28, 348, 36, 140, 366, 237, 201, 6, 363, 154, 202, 128, 108, 33, 73, 17, or any combination thereof, with numbering relative to SEQ ID NO: 1.

[0054] In some embodiments, the nuclease exhibits increased efficiency of gene editing, compared to the nuclease comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

[0055] In some embodiments, the nuclease comprises one amino acid sequence obtained by substituting with aliphatic amino acid at one, two, three, four, five, six, or more positions of 313, 318, 29, 220, 251, 218, 207, 97, 100, 213, 300, 5, 314, 119, 104, 206, 214, 166, 297, 250, 283, 45, 158, 27, 279, 267, 101, 89, 149, 236, 303, 307, 334, 193, 342, 126, 335, 253, 339, 69, 255, 120, 59, 3, 332, 174, 259, 223, 362, 312, 125, 216, 229, 160, 88, 111, 105, 159, 194, 4, 56, 258, 34, 247, 145, 311, 26, 182, 16, 183, 9, 181, 96, 210, 106, 57, 321, 333, 330, 44, 367, 257, 231, 328, 239, 215, 2, 137, 54, 268, 127, 240, 124, 308, 70, 200, 15, 71, 52, 175, 28, 348, 36, 140, 366, 237, 201, 6, 363, 154, 202, 128, 108, 33, 73, 17, or any combination thereof, with numbering relative to SEQ ID NO: 1.

[0056] In some embodiments, the positively charged amino acid comprises arginine and / or glycine.

[0057] In some embodiments, the nuclease comprises one amino acid sequence obtained by performing substitution at one, two, three, four, five, six, or more positions of L313R, K318R, V29R, E220R, Q251R, A218R, P207R, G97R, A100R, A213R, T300R, N5R, I314R, N119K, F104R, Y206R, L214R, Y166R, M297R, N250R, A283R, E45R, S158R, G27R, G279R, Y267R, F101R, N89R, D149G, K236R, Q303R, E307R, V334R, N193R, L342R, D126R, S335R, K253R, S339R, F69R, F255R, G120R, F59R, K3R, V332R, D174G, N119R, T259R, V223R, K362R, K312R, E125G, K216R, K229R, T160R, Q88R, Q111R, K105R, K159R, T194R, Q4R, E56R, K258R, N34R, K247R, E145R, K311R, F26R, T182R, K16R, E183R, K9R, E181R, E96R, Y210R, S106R, Q57R, P321R, K333R, E125R, G330R, Y44R, K367R, Y257R, S231R, C328R, L239R, E215R, T2R, P137R, L54R, D268R, G127R, E145G, K240R, M124R, E308R, P70R, E200R, N15R, F71R, E52R, H175R, C28R, G348R, M36R, M140R, L366R, Q237R, G201R, D174R, K6R, K363R, S154R, K202R, H128R, K108R, Y33R, D126G, K73R, E17R, or any combination thereof, with numbering relative to SEQ ID NO: 1.

[0058] In some embodiments, the nuclease comprises one amino acid sequence obtained by performing substitution selected from at least one of the following groups (1) - (210) , with numbering relative to SEQ ID NO: 1: (1) L313R; (2) K318R; (3) V29R, E56R; (4) E220R; (5) Q251R; (6) A218R; (7) P207R; (8) G97R; (9) A100R; (10) A213R; (11) T300R; (12) N5R; (13) I314R; (14) N119K (15) F104R; (16) Y206R; (17) L214R; (18) Y166R; (19) M297R; (20) N250R; (21) A283R; (22) E45R; (23) S158R; (24) G27R; (25) G279R; (26) Y267R; (27) F101R; (28) N89R; (29) D149G (30) K236R; (31) Q303R; (32) E307R; (33) V334R; (34) N193R; (35) L342R; (36) D126R; (37) S335R; (38) K253R; (39) S339R; (40) F69R; (41) F255R; (42) G120R; (43) F59R; (44) K3R; (45) V332R; (46) D174G (47) N119R; (48) T259R; (49) V223R; (50) K362R; (51) K312R; (52) E125G (53) K216R; (54) K229R; (55) T160R; (56) Q88R; (57) Q111R; (58) K105R; (59) K159R; (60) T194R; (61) Q4R; (62) E56R; (63) K258R; (64) N34R; (65) K247R; (66) E145R; (67) K311R; (68) F26R; (69) T182R; (70) K16R; (71) E183R; (72) K9R; (73) E181R; (74) E96R; (75) Y210R; (76) S106R; (77) Q57R; (78) P321R; (79) K333R; (80) E125R; (81) G330R; (82) Y44R; (83) K367R; (84) Y257R; (85) S231R; (86) C328R; (87) L239R; (88) E215R; (89) T2R; (90) P137R; (91) L54R; (92) D268R; (93) G127R; (94) E145G (95) K240R; (96) M124R; (97) E308R; (98) P70R; (99) E200R; (100) N15R; (101) F71R; (102) E52R; (103) H175R; (104) C28R; (105) G348R; (106) M36R; (107) M140R; (108) L366R; (109) Q237R; (110) G201R; (111) D174R; (112) K6R; (113) K363R; (114) S154R; (115) K202R; (116) H128R; (117) K108R; (118) Y33R; (119) D126G (120) K73R; (121) E17R; . (122) G97R, L313R, K318R; (123) A100R, A213R, T300R; (124) V29R, E56R, A100R, E220R; (125) V29R, E56R, G97R, E220R; (126) A218R, L313R, K318R; (127) V29R, E56R, A218R, L313R; (128) G97R, A218R, Q251R; (129) V29R, E56R, A218R, E220R; (130) G97R, A100R, P207R; (131) A100R, A218R, Q251R; (132) V29R, E56R, E220R, L313R; (133) Y166R, A213R, T300R; (134) Y166R, E220R, Q251R; (135) N5R, A213R, T300R; (136) A100R, L313R, K318R; (137) G97R, P207R, A213R; (138) V29R, E56R, Q251R, L313R; (139) A213R, L313R, K318R; (140) Q111R, K258R, E125G; (141) P207R, L313R, K318R; (142) F26R, T300R, V334R; (143) E56R, E220R, Q251R; (144) T300R, L313R, K318R; (145) G27R, F101R, F104R; (146) Y206R, A283R, I314R; (147) E45R, K159R, Q303R; (148) G27R, E145G, K312R; (149) V29R, E56R, L313R, K318R; (150) V29R, E56R, E220R, K318R; (151) N34R, L214R, E307R; (152) S158R, Y166R, V334R; (153) P207R, E220R, Q251R; (154) A218R, E220R, Q251R; (155) V29R, E56R, P207R, E220R; (156) Q251R, L313R, K318R; (157) G27R, F101R, L342R; (158) G97R, E145R, P207R; (159) P207R, A218R, Q251R; (160) G279R, L313R, K318R; (161) Y166R, L313R, S339R; (162) F69R, L313R, K318R; (163) V29R, E56R, Q251R, K318R; (164) E45R, A100R, F104R; (165) F104R, E181R, A213R; (166) K3R, Q251R, G330R; (167) Q57R, S158R, T259R; (168) V29R, E56R, G97R, F104R; (169) E56R, P207R, A218R; (170) V29R, E56R, S158R, Y166R; (171) G279R, A283R, K318R; (172) A100R, D126R, Y267R; (173) E220R, L313R, K318R; (174) F101R, T182R, K216R; (175) D126R, D149G, E307R; (176) K105R, E183R, E220R; (177) K9R, F59R, N193R; (178) E125R, V223R, I314R; (179) V29R, E56R, G97R, L342R; (180) E45R, A100R, L342R; (181) V29R, E56R, E220R, Q251R; (182) E181R, T182R, Y267R; (183) D149G, A218R, V332R; (184) K16R, D174G, G279R; (185) F69R, Y206R, I314R; (186) V29R, E56R, F104R, N119R; (187) S106R, M297R, C328R; (188) Y44R, T160R, T194R; (189) Q4R, K229R, F255R; (190) N119K, N250R, K318R; (191) D126R, D149G, V334R; (192) E56R, L239R, Y257R; (193) K318R, V334R, L342R; (194) N5R, Y206R, S231R; (195) F69R, K253R, K362R; (196) V29R, E56R, D174R, K333R; (197) F69R, E181R, T182R; (198) F69R, V334R, L342R; (199) N89R, K236R, K311R; (200) Q111R, E125G, K258R, L313R, K318R; (201) Q111R, E125G, K258R, T300R; (202) Q111R, E125G, Y166R, K258R; (203) Q111R, E125G, K258R, T300R, L313R, K318R; (204) F69R, Q111R, E125G, K258R; (205) G97R, Q111R, E125G, K258R; (206) F69R, G97R, L313R, K318R; (207) F69R, T300R, L313R, K318R; (208) G97R, T300R, L313R, K318R; (209) F69R, G97R, T300R, L313R, K318R; and / or (210) Y166R, A213R, T300R, L313R, K318R.

[0059] In some embodiments, the nuclease has an amino acid sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 2-122, 125-202, and 205-215.

[0060] In some embodiments, the nuclease belongs to the IS200 / IS605 family. In some embodiments, the nuclease belongs to the IS605, or IS1341 subfamily.

[0061] Guide RNA

[0062] According to an embodiment of the present application, a guide RNA can be provided, wherein the guide RNA comprises a reRNA, the reRNA comprises a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 216 or a variant thereof, the guide RNA can bind to the nuclease described in the present application. In some embodiments, the reRNA comprises a nucleotide sequence having at least 70%, 80%, 90%, 95%or 99%identity to the nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 216. In some embodiments, the reRNA comprises a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 216.

[0063] In some embodiments, the guide RNA further comprises a targeted sequence that can recognize a targeting gene adjacent to a transposon-associated motif. In some embodiments, the targeted sequence is of at least one of 10-50, 10-40, 10-30, or 15-25 nucleotides in length.

[0064] Sequences and lengths of the transposon-associated motif in the present application can vary depending on the nuclease, and the transposon-associated motif can be recognized by a complex formed by the nuclease and guide RNA described in the present application. In some embodiments, the transposon-associated motif comprises a nucleotide sequence of TTTAA.

[0065] Nucleic acid, nucleic acid construct

[0066] According to an embodiment of the present application, a nucleic acid can be provided, wherein, the nucleic acid encodes the nuclease described in the present application.

[0067] According to an embodiment of the present application, a nucleic acid construct can be provided, comprising the nucleic acid described in the present application. In some embodiments, the nucleic acid construct further comprising a promoter. The promoter can be any suitable promoter sequence, that is, a nucleic acid sequence that can be recognized by a host cell expressing the nucleic acid sequence. The promoter sequence contains a transcriptional regulatory sequence that mediates the expression of the protein or polypeptide. The promoter can be any nucleic acid sequence having transcriptional activity in a selected host cell, including mutant, truncated and heterozygous promoters, and can be derived from genes encoding extracellular or intracellular proteins or polypeptides homologous or heterologous to the host cell. In some embodiments, the promoter includes CMV, EF1a, SV40, PGK, UbC, human beta actin, CAG, TRE, UAS, Ac5, GFAP, Polyhedrin promotor, TBG, ALB, ApoEHCR-hAAT, CaMKIIa, GAL1, TEF1, GDS, ADH1, CaMV35S, Ubi, H1, U6, T7, T7lac, Sp6, araBAD, trp, lac, Ptac, or pL.

[0068] In some embodiments, the nucleic acid construct is modified by 5’ -end capping and / or 3’ -end polyadenylating, and the nucleic acid construct retains the activity of nuclease and / or guide RNA. In some embodiments, the nucleic acid construct is modified by thiophosphate bond modification, 2’ -MOE (2-O- (2-methoxyethyl) ) , PNA (peptide nucleic acid) , GNA (glycerol nucleic acid) , LNA (locked nucleic acid) , GalNAc (N-acetylgalactosamine) LNP (lipid nano particle) PNP (peptide nanoparticles) . The modification methods of nucleic acid are known in the art, the entire contents of which are hereby incorporated by reference.

[0069] In some embodiments, the nucleic acid construct further comprises a polyA sequence. PolyA tailing signal sequences well known in the art, as well as various truncated forms of polyA tailing signals, can be used in the present application.

[0070] In some embodiments, the nucleic acid construct further includes any transcription termination sequence, i.e., a sequence that is recognized by the host cell to terminate transcription. The termination sequence is operably linked to the 3’ -terminus of the nucleic acid sequence encoding the protein or polypeptide. Any terminator that is functional in the host cell of choice can be used in the present invention.

[0071] Optionally, the nucleic acid construct may further include a suitable leader sequence, that is, an untranslated region in the mRNA that is important for translation in the host cell. The leader sequence is operably linked to the 5’ -terminus of the nucleic acid sequence encoding the polypeptide. Any leader sequence that is functional in the host cell of choice can be used in the present invention.

[0072] Optionally, the nucleic acid construct may further include a propeptide coding region, which encodes an amino acid sequence located at the amino terminus of the polypeptide. The resulting polypeptide is called a zymogen or a propolypeptide. The propolypeptide is usually inactive and can be converted into a mature active polypeptide by catalytic or autocatalytic cleavage of the propeptide from the propolypeptide.

[0073] Optionally, the nucleic acid construct may further include a regulatory sequence that can regulate the expression of the polypeptide according to the growth conditions of the host cell. Examples of the regulatory sequence are systems that turn gene expression on or off in response to chemical or physical stimuli, including in the presence of regulatory compounds. Other examples of the regulatory sequence are those that enable gene amplification. In these instances, the nucleic acid sequence encoding the protein or polypeptide should be operably linked to the regulatory sequence.

[0074] Composition

[0075] According to an embodiment of the present application, a composition can be provided, the composition comprises: an engineered nuclease or a nucleic acid encoding the engineered nuclease described in the present application; and a guide RNA, wherein the guide RNA comprises a reRNA, the reRNA comprises a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 216 or a variant thereof, the guide RNA can bind to the nuclease described in the present application.

[0076] In some embodiments, the composition is selected from at least one of the following groups (1) - (210) , and any one of the following groups (1) - (210) comprises: a nuclease-related sequence and a guide RNA-related sequence,

[0077] (1) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 2 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0078] (2) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 3 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0079] (3) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 4 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0080] (4) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 5 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0081] (5) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 6 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0082] (6) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 7 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0083] (7) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 8 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0084] (8) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 9 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0085] (9) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 10 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0086] (10) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 11 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0087] (11) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 12 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0088] (12) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 13 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0089] (13) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 14 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0090] (14) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 15 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0091] (15) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 16 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0092] (16) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 17 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0093] (17) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 18 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0094] (18) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 19 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0095] (19) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 20 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0096] (20) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 21 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0097] (21) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 22 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0098] (22) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 23 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0099] (23) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 24 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0100] (24) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 25 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0101] (25) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 26 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0102] (26) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 27 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0103] (27) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 28 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0104] (28) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 29 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0105] (29) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 30 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0106] (30) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 31 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0107] (31) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 32 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0108] (32) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 33 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0109] (33) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 34 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0110] (34) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 35 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0111] (35) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 36 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0112] (36) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0113] (37) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 38 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0114] (38) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 39 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0115] (39) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 40 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0116] (40) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 41 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0117] (41) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 42 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0118] (42) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 43 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0119] (43) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 44 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0120] (44) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 45 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0121] (45) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 46 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0122] (46) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 47 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0123] (47) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 48 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0124] (48) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 49 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0125] (49) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 50 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0126] (50) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 51 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0127] (51) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 52 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0128] (52) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 53 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0129] (53) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 54 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0130] (54) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 55 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0131] (55) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 56 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0132] (56) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 57 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0133] (57) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 58 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0134] (58) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 59 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0135] (59) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 60 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0136] (60) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 61 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0137] (61) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 62 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0138] (62) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 63 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0139] (63) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 64 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0140] (64) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 65 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0141] (65) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 66 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0142] (66) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 67 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0143] (67) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 68 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0144] (68) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 69 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0145] (69) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 70 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0146] (70) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 71 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0147] (71) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 72 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0148] (72) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 73 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0149] (73) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 74 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0150] (74) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 75 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0151] (75) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 76 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0152] (76) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 77 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0153] (77) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 78 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0154] (78) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 79 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0155] (79) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 80 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0156] (80) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 81 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0157] (81) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 82 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0158] (82) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 83 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0159] (83) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 84 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0160] (84) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 85 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0161] (85) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 86 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0162] (86) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 87 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0163] (87) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 88 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0164] (88) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 89 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0165] (89) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 90 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0166] (90) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 91 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0167] (91) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 92 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0168] (92) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 93 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0169] (93) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 94 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0170] (94) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 95 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0171] (95) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 96 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0172] (96) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 97 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0173] (97) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 98 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0174] (98) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 99 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0175] (99) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 100 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0176] (100) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 101 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0177] (101) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 102 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0178] (102) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 103 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0179] (103) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 104 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0180] (104) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 105 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0181] (105) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 106 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0182] (106) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 107 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0183] (107) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 108 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0184] (108) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 109 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0185] (109) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 110 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0186] (110)the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 111 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0187] (111) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 112 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0188] (112) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 113 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0189] (113) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 114 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0190] (114) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 115 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0191] (115) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 116 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0192] (116) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 117 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0193] (117) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 118 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0194] (118) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 119 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0195] (119) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 120 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0196] (120) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 121 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0197] (121) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 122 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0198] (122) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 125 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0199] (123) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 126 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0200] (124) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 127 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0201] (125) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 128 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0202] (126) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 129 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0203] (127) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 130 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0204] (128) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 131 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0205] (129) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 132 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0206] (130) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 133 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0207] (131) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 134 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0208] (132) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 135 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0209] (133) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 136 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0210] (134) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 137 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0211] (135) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 138 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0212] (136) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 139 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0213] (137) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 140 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0214] (138) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 141 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0215] (139) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 142 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0216] (140) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 143 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0217] (141) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 144 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0218] (142) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 145 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0219] (143) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 146 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0220] (144) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 147 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0221] (145) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 148 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0222] (146) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 149 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0223] (147) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 150 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0224] (148) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 151 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0225] (149) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 152 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0226] (150) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 153 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0227] (151) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 154 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0228] (152) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 155 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0229] (153) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 156 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0230] (154) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 157 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0231] (155) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 158 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0232] (156) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 159 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0233] (157) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 160 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0234] (158) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 161 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0235] (159) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 162 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0236] (160) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 163 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0237] (161) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 164 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0238] (162) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 165 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0239] (163) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 166 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0240] (164) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 167 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0241] (165) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 168 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0242] (166) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 169 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0243] (167) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 170 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0244] (168) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 171 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0245] (169) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 172 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0246] (170) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 173 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0247] (171) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 174 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0248] (172) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 175 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0249] (173) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 176 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0250] (174) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 177 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0251] (175) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 178 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0252] (176) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 179 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0253] (177) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 180 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0254] (178) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 181 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0255] (179) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 182 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0256] (180) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 183 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0257] (181) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 184 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0258] (182) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 185 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0259] (183) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 186 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0260] (184) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 187 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0261] (185) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 188 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0262] (186) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 189 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0263] (187) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 190 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0264] (188) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 191 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0265] (189) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 192 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0266] (190) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 193 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0267] (191) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 194 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0268] (192) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 195 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0269] (193) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 196 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0270] (194) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 197 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0271] (195) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 198 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0272] (196) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 199 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0273] (197) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 200 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0274] (198) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 201 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0275] (199) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 202 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0276] (200) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 205 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0277] (201) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 206 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0278] (202) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 207 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0279] (203) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 208 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0280] (204) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 209 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0281] (205) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 210 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0282] (206) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 211 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0283] (207) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 212 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0284] (208) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 213 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0285] (209) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 214 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;

[0286] (210) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 215 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216.

[0287] In some embodiments, the guide RNA-related sequence further comprises a targeted sequence that can recognize a targeting gene adjacent to a transposon-associated motif. In some embodiments, the targeted sequence is of at least one of 10-50, 10-40, 10-30, or 15-25 nucleotides in length.

[0288] Sequences and lengths of the transposon-associated motif in the present application can vary depending on the nuclease, and the transposon-associated motif can be recognized by a complex formed by the nuclease and guide RNA described in the present application. In some embodiments, the transposon-associated motif comprises a nucleotide sequence of TTTAA.

[0289] The targeting gene in the present application includes any gene of interest, e.g., a gene of a natural functional protein, an artificial chimeric gene, or a gene of a non-coding RNA. In some embodiments, the gene of a natural functional protein includes a fluorescein reporter gene, a luciferase gene, and a resistance gene. In some embodiments, the artificial chimeric gene includes a gene of a chimeric antigen receptor. In some embodiments, the fluorescein reporter gene includes a gene encoding a green fluorescent protein, a red fluorescent protein, a blue fluorescent protein, or a yellow fluorescent protein. In some embodiments, the luciferase gene includes a gene encoding firefly luciferase or sea kidney luciferase. In some embodiments, the resistance gene includes a gene encoding puromycin resistance, G418 resistance, kanamycin resistance, tetracycline resistance, or bleomycin resistance.

[0290] In some embodiments, the nucleic acid encoding the amino acid sequence and / or the nucleic acid encoding the guide RNA further comprises a promoter. The promoter can be any suitable promoter sequence, that is, a nucleic acid sequence that can be recognized by a host cell expressing the nucleic acid sequence. The promoter sequence contains a transcriptional regulatory sequence that mediates the expression of the protein or polypeptide. The promoter can be any nucleic acid sequence having transcriptional activity in a selected host cell, including mutant, truncated and heterozygous promoters, and can be derived from genes encoding extracellular or intracellular proteins or polypeptides homologous or heterologous to the host cell. In some embodiments, the promoter includes CMV, EF1a, SV40, PGK, UbC, human beta actin, CAG, TRE, UAS, Ac5, GFAP, Polyhedrin promotor, TBG, ALB, ApoEHCR-hAAT, CaMKIIa, GAL1, TEF1, GDS, ADH1, CaMV35S, Ubi, H1, U6, T7, T7lac, Sp6, araBAD, trp, lac, Ptac, or pL. In some embodiments, the nucleic acid encoding the amino acid sequence and / or the nucleic acid encoding the guide RNA further comprises a polyA sequence. PolyA tailing signal sequences well known in the art, as well as various truncated forms of polyA tailing signals, can be used in the present application.

[0291] In some embodiments, the nucleic acid encoding the amino acid sequence and / or the nucleic acid encoding the guide RNA further comprises any transcription termination sequence that controls the expression of the exogenous nucleic acid fragment, i.e., a sequence that is recognized by a host cell to terminate transcription. Any terminator that is functional in the host cell of choice can be used in the present invention.

[0292] In some embodiments, the nucleic acid encoding the amino acid sequence and / or the nucleic acid encoding the guide RNA further comprises any transcription termination sequence, i.e., a sequence that is recognized by a host cell to terminate transcription. The termination sequence is operably linked to the 3’ -terminus of the nucleic acid sequence encoding the protein or polypeptide. Any terminator that is functional in the host cell of choice can be used in the present invention.

[0293] Optionally, the nucleic acid encoding the amino acid sequence and / or the nucleic acid encoding the guide RNA may further comprise a suitable leader sequence, i.e., an untranslated region in the mRNA that is important for translation in the host cell. The leader sequence is operably linked to the 5’ -terminus of the nucleic acid sequence encoding the polypeptide. Any leader sequence that is functional in the host cell of choice can be used in the present invention.

[0294] Optionally, the nucleic acid encoding the amino acid sequence and / or the nucleic acid encoding the guide RNA may further comprise a propeptide coding region, which encodes an amino acid sequence located at the amino terminus of the polypeptide. The resulting polypeptide is called a zymogen or a propolypeptide. The propolypeptide is usually inactive and can be converted into a mature active polypeptide by catalytic or autocatalytic cleavage of the propeptide from the propolypeptide.

[0295] Optionally, the nucleic acid encoding the amino acid sequence and / or the nucleic acid encoding the guide RNA may further comprise a regulatory sequence that can regulate the expression of the polypeptide according to the growth conditions of the host cell. Examples of the regulatory sequence are systems that turn gene expression on or off in response to chemical or physical stimuli, including in the presence of regulatory compounds. Other examples of the regulatory sequence are those that enable gene amplification. In these instances, the nucleic acid sequence encoding the protein or polypeptide should be operably linked to the regulatory sequence.

[0296] Recombinant vector, recombinant host cell and kit

[0297] According to an embodiment of the present application, a recombinant vector can be provided, wherein, the recombinant vector comprises the nucleic acid encoding the nuclease described in the present application, the guide RNA described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, or the composition described in the present application. The recombinant vector can be any suitable vector. In some embodiments, the recombinant vector includes, but is not limited to, a recombinant cloning vector, a recombinant eukaryotic expression plasmid, or a recombinant viral vector. In some embodiments, the recombinant eukaryotic expression plasmid includes pcDNA3.1, pCMV, pUC18, pUC19, pUC57, pBAD, pET, pENTR, pGenlenti, or pAAV. In some embodiments, the recombinant virus vector includes a recombinant adenovirus vector, a recombinant adeno-associated virus vector, a recombinant retrovirus vector, a recombinant herpes simplex virus vector, or a recombinant vaccinia virus vector. The recombinant vector of the present invention can be constructed using methods well known in the art. For example, depending on the restriction sites contained in the backbone vector used, appropriate restriction sites can be added to both ends of the nucleic acid construct of the present invention, and then loaded into the backbone vector.

[0298] According to an embodiment of the present application, a recombinant host cell can be provided, wherein, the recombinant host cell comprises the nuclease described in the present application, the guide RNA described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, the composition described in the present application, or the recombinant vector described in the present application. The recombinant host cell can be any host cell in which nucleases can be used. In some embodiments, the recombinant host cell includes, but is not limited to, an animal cell, a plant cell, an algal cell, a fungal cell, a yeast cell, or a bacterial cell. In some embodiments, the animal cell includes a mammalian cell. In some embodiments, the mammalian cell includes a primary cell (e.g., a mesenchymal stem cell, an endothelial cell, an epithelial cell, a fibroblast, a keratinocyte, a melanocyte, a smooth muscle cell, and an immune cell) , an immortalized cell line (e.g., HEK293, NIH-3T3, RAW-264.7, STO, VERO, CT26, hTERT immortalized human endothelial / epithelial / fibroblast / keratinocyte / ductal / cell lines) , a cancer cell line (e.g., Hela, HepG2 / 3, HL-60, HT-1080, HT-29, A549, SW620, HCT-15, HCT116, MDA-MB-231, MCF7, SK-OV-3, PANC-1, AsPc-1, THP-1, Huh7, KG-1, RAJI, HB-CB, Jurkat, K562, CRL5826, CHO, MDCK, and Renca) , an embryonic stem cell line (e.g., H1, H9, WIBR2, WIBR3, G-Olig2, ESF158, RW. 4, R1, and D3) and differentiated cells thereof, or an induced pluripotent stem cell line and differentiated cells thereof. In some embodiments, the plant cell includes a monocot cell or a dicot cell. In some embodiments, the monocot cell or the dicot cell includes rice cell, maize cell, or soybean cell.

[0299] According to an embodiment of the present application, a kit can be provided, wherein, the kit comprises the nuclease described in the present application, the guide RNA described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, the composition described in the present application, the recombinant vector described in the present application, or the recombinant host cell described in the present application.

[0300] Method and use

[0301] The nuclease-based gene editing tools and methods provided in the present application can be applied to many fields such as gene therapy, molecular breeding in animals and plants, industrial microorganism engineering, model animal engineering, and scientific research. Particularly in the field of gene therapy, it can be applied for gene knockout based on DNA double-strand breaks in human genome.

[0302] According to an embodiment of the present application, a method for introducing a double-strand break into a targeting gene of a host cell can be provided, wherein the method comprises: delivering the nuclease described in the present application, the guide RNA described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, the composition described in the present application, or the recombinant vector described in the present application into a host cell.

[0303] According to an embodiment of the present application, a method for deleting, replacing or inserting a targeting gene of a host cell can be provided, wherein the method comprises: delivering the nuclease described in the present application, the guide RNA described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, the composition described in the present application, or the recombinant vector described in the present application into a host cell.

[0304] According to an embodiment of the present application, a method for obtaining a host cell in which a targeting gene is deleted, replaced or inserted can be provided, wherein the method comprises: delivering the nuclease described in the present application, the guide RNA described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, the composition described in the present application, or the recombinant vector described in the present application into a host cell.

[0305] The method of delivery into the host cell can be any suitable method. In some embodiments, the delivery method includes but is not limited to cationic liposome delivery, lipoid nanoparticulate delivery, cationic polymer delivery, vesicle-exosome delivery, gold nanoparticulate delivery, polypeptide and protein delivery, retrovirus delivery, lentivirus delivery, adenovirus delivery, adeno-associated virus delivery, electroporation, agrobacterium infection, or gene gun. The methods of cell transfection and culture are routine methods in the art, and appropriate transfection and culture methods can be selected according to different cell types.

[0306] The host cell can be any host cell in which nucleases can be used. In some embodiments, the host cell includes, but is not limited to, an animal cell, a plant cell, an algal cell, a fungal cell, a yeast cell, or a bacterial cell. In some embodiments, the animal cell includes a mammalian cell. In some embodiments, the mammalian cell includes a primary cell (e.g., a mesenchymal stem cell, an endothelial cell, an epithelial cell, a fibroblast, a keratinocyte, a melanocyte, a smooth muscle cell, and an immune cell) , an immortalized cell line (e.g., HEK293, NIH-3T3, RAW-264.7, STO, VERO, CT26, hTERT immortalized human endothelial / epithelial / fibroblast / keratinocyte / ductal / cell lines) , a cancer cell line (e.g., Hela, HepG2 / 3, HL-60, HT-1080, HT-29, A549, SW620, HCT-15, HCT116, MDA-MB-231, MCF7, SK-OV-3, PANC-1, AsPc-1, THP-1, Huh7, KG-1, RAJI, HB-CB, Jurkat, K562, CRL5826, CHO, MDCK, and Renca) , an embryonic stem cell line (e.g., H1, H9, WIBR2, WIBR3, G-Olig2, ESF158, RW. 4, R1, and D3) and differentiated cells thereof, or an induced pluripotent stem cell line and differentiated cells thereof. In some embodiments, the plant cell includes a monocot cell or a dicot cell. In some embodiments, the monocot cell or the dicot cell includes rice cell, maize cell, or soybean cell.

[0307] According to an embodiment of the present application, the use of the nuclease described in the present application, the guide RNA described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, the composition described in the present application, the recombinant vector described in the present application, or the recombinant host cell described in the present application for introducing a double-strand break into a targeting gene of a host cell can be provided.

[0308] According to an embodiment of the present application, the use of the nuclease described in the present application, the guide RNA described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, the composition described in the present application, the recombinant vector described in the present application, or the recombinant host cell described in the present application for deleting, replacing or inserting a targeting gene of a host cell can be provided.

[0309] The host cell can be any host cell in which nucleases can be used. In some embodiments, the host cell includes, but is not limited to, an animal cell, a plant cell, an algal cell, a fungal cell, a yeast cell, or a bacterial cell. In some embodiments, the animal cell includes a mammalian cell. In some embodiments, the mammalian cell includes a primary cell (e.g., a mesenchymal stem cell, an endothelial cell, an epithelial cell, a fibroblast, a keratinocyte, a melanocyte, a smooth muscle cell, and an immune cell) , an immortalized cell line (e.g., HEK293, NIH-3T3, RAW-264.7, STO, VERO, CT26, hTERT immortalized human endothelial / epithelial / fibroblast / keratinocyte / ductal / cell lines) , a cancer cell line (e.g., Hela, HepG2 / 3, HL-60, HT-1080, HT-29, A549, SW620, HCT-15, HCT116, MDA-MB-231, MCF7, SK-OV-3, PANC-1, AsPc-1, THP-1, Huh7, KG-1, RAJI, HB-CB, Jurkat, K562, CRL5826, CHO, MDCK, and Renca) , an embryonic stem cell line (e.g., H1, H9, WIBR2, WIBR3, G-Olig2, ESF158, RW. 4, R1, and D3) and differentiated cells thereof, or an induced pluripotent stem cell line and differentiated cells thereof. In some embodiments, the plant cell includes a monocot cell or a dicot cell. In some embodiments, the monocot cell or the dicot cell includes rice cell, maize cell, or soybean cell.

[0310] According to an embodiment of the present application, the use of the nuclease described in the present application, the guide RNA described in the present application, the nucleic acid described in the present application, the nucleic acid construct described in the present application, the composition described in the present application, the recombinant vector described in the present application, or the recombinant host cell described in the present application for preparing a drug or a preparation for gene therapy, cell therapy, genome research, and stem cell induction and post-induction differentiation can be provided.

[0311] The above various embodiments and preferences for the present application can be combined with each other (as long as they are not inherently contradictory to each other) and are suitable for the use of the present application, and the various embodiments formed by such combinations are considered as a part of the present application.

[0312] EXAMPLES

[0313] Exemplary embodiments of the present application are described below in conjunction with the accompanying drawings, where various details of the examples of the present application are included to facilitate understanding. It should be understood that they are considered to be exemplary only and not intended to limit the protection scope of the present application. The protection scope of the present application is only defined by the claims. Therefore, those of ordinary skill in the art should be aware that various changes and modifications can be made to the examples described herein, without departing from the scope of the present application. Likewise, for clarity and conciseness, the description of well-known functions and structures is omitted in the following description.

[0314] Unless otherwise stated, the reagents and instruments used in the following examples are conventional products that are commercially available. Unless otherwise stated, experiments are performed under conventional conditions or conditions recommended by the manufacturer.

[0315] Example 1: Construction of nuclease activity detection system

[0316] A set of an endogenous editing detection system (including plasmid 1 and plasmid 2) was established to verify the activity of candidate nucleases.

[0317] 1.1 Method for constructing plasmid 1

[0318] Plasmid 1 consists of a complete set of elements capable of transcribing and expressing candidate nuclease proteins, comprising a constitutive promoter CMV (sequence as shown in SEQ ID NO: 217) that can initiate transcription in an eukaryotic cell, a candidate nuclease sequence (as shown in Table 1) , a 5’ -nuclear localization signal peptide sequence (sequence as shown in SEQ ID NO: 218) , a 3’ -nuclear localization signal peptide sequence (sequence as shown in SEQ ID NO: 219) , a polyA sequence (sequence as shown in SEQ ID NO: 220) that terminates transcription, and an ampicillin resistance gene sequence (sequence as shown in SEQ ID NO: 221) .

[0319] Detailed method for constructing plasmid 1:

[0320] 1) Construction of plasmid 1 comprising wild-type nuclease (AG-H11) : The amino acid sequence (or nucleotide sequence) of the candidate nuclease protein was synthesized through conventional gene synthesis by BGI Tech Solutions (Beijing Liuhe) Co., Ltd., with an ECoRI cleavage site inserted into the upstream 5’ end of the sequence, and a BamH1 cleavage site inserted into the downstream 3’ end. Plasmid construction was also performed by the company responsible for the gene synthesis, and the specific construction method was as follows:

[0321] a. Preparation of vector: The plasmid backbone of a pcDNA3.1 plasmid vector was subjected to a double enzymatic cleavage digestion reaction using the single restriction endonuclease cleavage sites ECoRI and BamHI on the plasmid vector, a linearized plasmid vector fragment was obtained by agarose gel electrophoresis, and the enzymatic cleavage band was excised from the gel for recovery to obtain the purified linearized plasmid vector fragment.

[0322] b. Ligation: The nucleotide sequence of the candidate nuclease protein obtained through conventional gene synthesis was ligated with the linearized pcDNA3.1 vector fragment using a T4 DNA ligase.

[0323] c. Transformation and verification: Monoclonal transformants were obtained through a LB agar plate for screening ampicillin resistance, and the correct clone identified by sequencing was used as a candidate plasmid for later use.

[0324] 2) Construction of plasmid 1 comprising mutated nucleases: We used PCR-based techniques that introduce site-directed mutation into a plasmid vector to study the resulting changes in a nuclease enzyme activity. The mutated sites in the mutated nucleases were as shown in FIG. 1, and the specific construction method was as follows:

[0325] a. Obtained the mutation fragment. To perform site-directed mutagenesis, design the paired PCR primers with a 18 bp overlap with each other at their both ends and incorporate the mutation of defined, and use a high fidelity PCR polymerase (Takara Cat. R010B) to amplify the fragment by using AG-H11 original enzyme plasmid as the template. For triple mutation, we could introduce the different site mutations by more than two round of PCR to obtain the mutation fragment.

[0326] b. Remove the templete DNA from the PCR production. To reduce the original template contamination, we use DpnI (NEB Cat. R0176) to digest the PCR production subsequently.

[0327] c. Transformation and verification. Monoclonal transformants were obtained through a LB agar plate for screening ampicillin resistance, and the correct clone identified by sequencing was used as a candidate plasmid for later use.

[0328] 1.2 Method for constructing plasmid 2

[0329] Plasmid 2 comprises a reRNA sequence (sequence as shown in SEQ ID NO: 216) , with a 20 nt targeted sequence 1 (sequence as shown in SEQ ID NO: 238) inserted at the 3’ end of the reRNA sequence, a U6 promoter (sequence as shown in SEQ ID NO: 222) , a PBR322 replication origin (sequence as shown in SEQ ID NO: 223) , a SV40 promoter (sequence as shown in SEQ ID NO: 225) , a RFP gene (sequence as shown in SEQ ID NO: 226) , and an ampicillin resistance gene sequence (sequence as shown in SEQ ID NO: 224) .

[0330] Detailed method for constructing plasmid 2:

[0331] a. Preparation of vector. A reRNA plasmid containing BbsI-BbsI fragment (pUC19-U6 -reRNA-BbsI_BbsI) was subjected to enzymatic cleavage using BbsI, a linearized plasmid vector fragment was obtained by agarose gel electrophoresis, and the enzymatic cleavage band was excised from the gel for recovery to obtain the purified linearized plasmid vector fragment.

[0332] b. Preparation of 20nt targeted sequences of endogenous genes. Firstly, the 20 bp DNA sequence adjacent to the 3’ end of the TAM sequence (TTTAA) was searched in the endogenous gene sequence, and then oligonucleotides of targeted sequences with BbsI excision end were synthesized through primer synthesis. Finally, a double-stranded oligonucleotide with sticky ends was synthesized by annealing bonding.

[0333] c. Ligation. The targeted sequence of endogenous gene was ligated with the linearized pUC19-U6 -reRNA-BbsI_BbsI vector fragment using T4 ligase.

[0334] d. Transformation and verification. Monoclonal transformants were obtained through a LB agar plate for screening ampicillin resistance, and the correct clone identified by sequencing was used as a candidate plasmid for later use.

[0335] 1.3 Method for constructing plasmid 3:

[0336] Plasmid 3, a binary vector, was made to facilitate the expression of candidate nuclease and its corresponding reRNA with BsaI-BsaI enzyme site with the purpose to incorporate spacer to perform targeted gene editing in tomato hairy root transformation, which consists of a composite promoter (sequence as shown in SEQ ID NO: 227) , tRNA (sequence as shown in SEQ ID NO: 228) , reRNA sequence (sequence as shown in SEQ ID NO: 216) , with a BsaI-BsaI enzyme site (sequence as shown in SEQ ID NO: 229) inserted at the 3’ end of the reRNA, HDV (sequence as shown in SEQ ID NO: 230) , a poly A sequence (sequence is TTTTTTTT) , a HSP terminator (sequence as shown in SEQ ID NO: 232) , a constitutive promoter EF1a (sequence as shown in SEQ ID NO: 233) , a 5’ -nuclear localization signal peptide sequence with Flag tag and linker (sequence as shown in SEQ ID NO: 234) , a candidate nuclease sequence (as shown in Table 1) , a 3’ -nuclear localization signal peptide sequence (sequence as shown in SEQ ID NO: 235) , a rbcS-E9 terminator (sequence as shown in SEQ ID NO: 236) , and a hygromycin resistance gene expression cassette sequence (sequence as shown in SEQ ID NO: 237) .

[0337] Detailed method for constructing plasmid 3:

[0338] The plasmid pHSE401 (addgene, Cat. 62201) was subjected to HindIII / SacI double enzyme digestion, then the backbone was obtained by agarose gel electrophoresis and the purpose band was purified from the gel. The pComposite-tRNA-reRNA-BsaI-BsaI-HDV-tHSP fragment was amplified from a synthesized vector of pUC57-pComposite-tRNA-reRNA-BsaI-BsaI-HDV-tHSP, which was synthesized through conventional gene synthesis by BGI Tech Solutions (Beijing Liuhe) Co., Ltd., with AscI cleavage site inserted into the upstream 5’end of the sequence, with proper homologous recombination arm. The EF1a promoter was obtained by the amplification of tomato genomic DNA with specific primers which harbored the proper homologous recombination arm. The fusion PCR was performed to obtain NLS-nuclease-NLS with proper homologous recombination arm. The abovementioned four purpose fragments were recombined together to be plasmid 3. The correct colony was verified by sanger sequencing.

[0339] Table 1 Plasmid construction related sequences

[0340] Example 2: Detection of engineered nuclease activity on the targeting gene TRAC

[0341] In this example, the nuclease activity on the endogenous targeting gene TRAC was evaluated.

[0342] 2.1 Cell treatment:

[0343] After HEK293T cells (commercially purchased) were cultured to the logarithmic growth phase, they were typsinized into single cells with 0.25%Trypsin-EDTA (Gibco Cat. 25200-072) , and added to a 48-well cell culture plate pre-coated with PDL (Sigma Cat. P6407) at a cell concentration of 1×105 cells / well, and cultured overnight at 37℃ in 5%CO2.

[0344] 2.2 Cell transfection:

[0345] The two functional plasmids described in example 1 (the plasmid 1 comprising wild-type or mutated nuclease, and the plasmid 2 comprising reRNA and targeted sequence) were co-transfected into HEK293T cells, wherein 300 ng of the nuclease plasmid and 200 ng of the reRNA-targeted sequence plasmid were added to a 48-well cell culture plate, respectively, and transfection was performed using lipofectamineTM 2000 (Invitrogen, Cat. 11668019) at a ratio of transfection reagent volume (μL) : plasmid mass (μg) of 2 : 1.

[0346] 2.3 Obtaining results of RFP+%:

[0347] After transfection, the cells were cultured for 48 h, then typsinized and collected, partial of cells would be used to detect the transfection efficiency by flow-cytometry analysis. The RFP fluorescent signal (RFP+%) will be collected and analyzed to determine the plasmid transfection efficiency.

[0348] 2.4 PCR amplification and NGS second generation sequencing

[0349] Partial of the cells from above will be used for genome DNA extraction. PCR primers (sequences of forward primer and reverse primer as shown in SEQ ID NO: 246 and SEQ ID NO: 254, respectively) were designed near the targeted sequence of endogenous gene TRAC to amplify a length of about 200bp PCR product including 20nt targeted sequence. The PCR products were sequenced by the next generation sequencing.

[0350] 2.5 Detection results of Indel%

[0351] By analyzing the sequence data generated by the next generation sequencing technology, the endogenous gene editing activity of nuclease was determined by counting the base insertions and deletions (Indel%) generated on the targeted sequence of endogenous gene TRAC.

[0352] In order to eliminate the influence of the differential transfection efficiency on gene editing activity, the values of Indel% / RFP+%was used to evaluate the endogenous gene editing activity of the nucleases.

[0353] Furthermore, since the mutated nucleases provided in this application were tested in different batches of parallel experiments, the wild-type nuclease AG-H11 was used as control in each batch, and the results of Indel% / RFP+%were recorded as “AG-H11 (batch 1) ” , “AG-H11 (batch 2) ” , “AG-H11 (batch 3) ” , etc. in Table 2. To further minimize the experimental variability across different batches, the values of “Indel% / RFP+%(Fold change relative to AG-H11 in different batches) ” was used to compare the gene editing activity obtained from different batches of experiments. The results of endogenous gene editing efficiency were as shown in FIG. 2 and Table 2.

[0354] The results showed the 121 nucleases (AG-H11-SDM267, AG-H11-SDM272, AG-H11-SDM25, AG-H11-SDM194, AG-H11-SDM218, AG-H11-SDM193, AG-H11-SDM184, AG-H11-SDM87, AG-H11-SDM89, AG-H11-SDM188, AG-H11-SDM256, AG-H11-SDM4, AG-H11-SDM268, AG-H11-SDM313, AG-H11-SDM93, AG-H11-SDM183, AG-H11-SDM189, AG-H11-SDM152, AG-H11-SDM254, AG-H11-SDM217, AG-H11-SDM241, AG-H11-SDM37, AG-H11-SDM144, AG-H11-SDM23, AG-H11-SDM237, AG-H11-SDM229, AG-H11-SDM90, AG-H11-SDM79, AG-H11-SDM317, AG-H11-SDM205, AG-H11-SDM258, AG-H11-SDM261, AG-H11-SDM285, AG-H11-SDM173, AG-H11-SDM292, AG-H11-SDM115, AG-H11-SDM286, AG-H11-SDM219, AG-H11-SDM290, AG-H11-SDM61, AG-H11-SDM221, AG-H11-SDM109, AG-H11-SDM51, AG-H11-SDM2, AG-H11-SDM283, AG-H11-SDM319, AG-H11-SDM108, AG-H11-SDM224, AG-H11-SDM196, AG-H11-SDM303, AG-H11-SDM266, AG-H11-SDM314, AG-H11-SDM191, AG-H11-SDM199, AG-H11-SDM146, AG-H11-SDM78, AG-H11-SDM100, AG-H11-SDM94, AG-H11-SDM145, AG-H11-SDM174, AG-H11-SDM3, AG-H11-SDM48, AG-H11-SDM223, AG-H11-SDM28, AG-H11-SDM214, AG-H11-SDM132, AG-H11-SDM265, AG-H11-SDM22, AG-H11-SDM166, AG-H11-SDM13, AG-H11-SDM167, AG-H11-SDM8, AG-H11-SDM165, AG-H11-SDM86, AG-H11-SDM186, AG-H11-SDM95, AG-H11-SDM49, AG-H11-SDM275, AG-H11-SDM284, AG-H11-SDM114, AG-H11-SDM282, AG-H11-SDM36, AG-H11-SDM307, AG-H11-SDM222, AG-H11-SDM201, AG-H11-SDM281, AG-H11-SDM207, AG-H11-SDM190, AG-H11-SDM1, AG-H11-SDM125, AG-H11-SDM46, AG-H11-SDM230, AG-H11-SDM116, AG-H11-SDM316, AG-H11-SDM208, AG-H11-SDM113, AG-H11-SDM262, AG-H11-SDM62, AG-H11-SDM178, AG-H11-SDM12, AG-H11-SDM63, AG-H11-SDM44, AG-H11-SDM159, AG-H11-SDM24, AG-H11-SDM294, AG-H11-SDM30, AG-H11-SDM128, AG-H11-SDM306, AG-H11-SDM206, AG-H11-SDM179, AG-H11-SDM158, AG-H11-SDM5, AG-H11-SDM304, AG-H11-SDM141, AG-H11-SDM180, AG-H11-SDM117, AG-H11-SDM97, AG-H11-SDM27, AG-H11-SDM315, AG-H11-SDM64, AG-H11-SDM14) with different mutated sites exhibits increased editing efficiency on endogenous genes, compared with the wild-type nuclease AG-H11.

[0355] Meanwhile, a large number of mutated nucleases with inactive or low cleavage activity were also found during the screening process (e.g. AG-H11-SDM251, AG-H11-SDM300 in Table 1 of this application) . Compared with these nucleases with inactive or low activity, the cleavage activity of the 121 nucleases of the present application were markedly higher.

[0356] Table 2 The results of nuclease activity in example 2

[0357] Example 3: Detection of engineered nuclease activity on the targeting gene KLKB1

[0358] In this example, the nuclease activity on the endogenous targeting gene KLKB1 was evaluated.

[0359] The two functional plasmids were constructed using the method described in example 1, and the 20 nt targeted sequence 1 (sequence as shown in SEQ ID NO: 238) was replaced by the 20 nt targeted sequence 2 (sequence as shown in SEQ ID NO: 239) in the plasmid 2.

[0360] The nuclease activity was detected using the method described in example 2, and the PCR primers (sequences of forward primer and reverse primer as shown in SEQ ID NO: 247 and SEQ ID NO: 255, respectively) were designed near the targeted sequence of endogenous targeting gene KLKB1 to amplify a length of about 200bp PCR product including 20nt targeted sequence.

[0361] By analyzing the sequence data generated by the next generation sequencing technology, the endogenous gene editing activity of nuclease was determined by counting the base insertions and deletions (Indel%) generated on the targeted sequence of endogenous targeting gene KLKB1.

[0362] In order to eliminate the influence of the differential transfection efficiency on gene editing activity, the values of Indel% / RFP+%was used to evaluate the endogenous gene editing activity of the nucleases.

[0363] Furthermore, since the mutated nucleases provided in this application were tested in different batches of parallel experiments, the wild-type nuclease (AG-H11) was used as control in each batch, and the results of Indel% / RFP+%were recorded as “AG-H11 (batch 1) ” , “AG-H11 (batch 2) ” , “AG-H11 (batch 3) ” , etc. in Table 3. To further minimize the experimental variability across different batches, the values of “Indel% / RFP+%(Fold change relative to AG-H11 in different batches) ” was used to compare the gene editing activity obtained from different batches of experiments. The results of endogenous gene editing efficiency were as shown in FIG. 3 and Table 3.

[0364] The results showed the 78 nucleases (AG-H11-TM18, AG-H11-TM19, AG-H11-TM4, AG-H11-TM3, AG-H11-TM27, AG-H11-TM7, AG-H11-TM17, AG-H11-TM6, AG-H11-TM14, AG-H11-TM20, AG-H11-TM9, AG-H11-TM82, AG-H11-TM83, AG-H11-TM1, AG-H11-TM21, AG-H11-TM15, AG-H11-TM11, AG-H11-TM25, AG-H11-TM54, AG-H11-TM24, AG-H11-TM36, AG-H11-TM73, AG-H11-TM30, AG-H11-TM63, AG-H11-TM85, AG-H11-TM41, AG-H11-TM37, AG-H11-TM13, AG-H11-TM10, AG-H11-TM39, AG-H11-TM81, AG-H11-TM23, AG-H11-TM26, AG-H11-TM5, AG-H11-TM29, AG-H11-TM64, AG-H11-TM48, AG-H11-TM22, AG-H11-TM88, AG-H11-TM58, AG-H11-TM76, AG-H11-TM12, AG-H11-TM69, AG-H11-TM51, AG-H11-TM31, AG-H11-TM43, AG-H11-TM65, AG-H11-TM71, AG-H11-TM68, AG-H11-TM87, AG-H11-TM49, AG-H11-TM28, AG-H11-TM50, AG-H11-TM79, AG-H11-TM52, AG-H11-TM34, AG-H11-TM57, AG-H11-TM66, AG-H11-TM70, AG-H11-TM8, AG-H11-TM84, AG-H11-TM60, AG-H11-TM35, AG-H11-TM75, AG-H11-TM67, AG-H11-TM53, AG-H11-TM40, AG-H11-TM32, AG-H11-TM59, AG-H11-TM80, AG-H11-TM42, AG-H11-TM89, AG-H11-TM33, AG-H11-TM44, AG-H11-TM38, AG-H11-TM74, AG-H11-TM77, AG-H11-TM46) with different mutated sites exhibits increased editing efficiency on endogenous genes, compared with the wild-type nuclease AG-H11.

[0365] Meanwhile, a large number of mutated nucleases with inactive or low cleavage activity were also found during the screening process (e.g. AG-H11-TM16, AG-H11-TM2 in Table 1 of this application) . Compared with these nucleases with inactive or low activity, the cleavage activity of the 78 nucleases of the present application were markedly higher.

[0366] Table 3 The results of nuclease activity in example 3

[0367] Example 4: Detection of engineered nuclease activity on the targeting gene B2M

[0368] In this example, the nuclease activity on the endogenous targeting gene B2M was evaluated.

[0369] The two functional plasmids were constructed using the method described in example 1, and the 20 nt targeted sequence 1 (sequence as shown in SEQ ID NO: 238) was replaced by the 20 nt targeted sequence 3 (sequence as shown in SEQ ID NO: 240) in the plasmid 2.

[0370] The nuclease activity was detected using the method described in example 2, and the PCR primers (sequences of forward primer and reverse primer as shown in SEQ ID NO: 248 and SEQ ID NO: 256, respectively) were designed near the targeted sequence of endogenous targeting gene B2M to amplify a length of about 200bp PCR product including 20nt targeted sequence.

[0371] By analyzing the sequence data generated by the next generation sequencing technology, the endogenous gene editing activity of nuclease was determined by counting the base insertions and deletions (Indel%) generated on the targeted sequence of endogenous targeting gene B2M.

[0372] In order to eliminate the influence of the differential transfection efficiency on gene editing activity, the values of Indel% / RFP+%was used to evaluate the endogenous gene editing activity of the nucleases.

[0373] Furthermore, since the mutated nucleases provided in this application were tested in different batches of parallel experiments, the wild-type nuclease AG-H11 was used as control in each batch, and the results of Indel% / RFP+%were recorded as “AG-H11 (batch 1) ” , “AG-H11 (batch 2) ” , “AG-H11 (batch 3) ” , etc. in Table 4. To further minimize the experimental variability across different batches, the values of “Indel% / RFP+%(Fold change relative to AG-H11 in different batches) ” was used to compare the gene editing activity obtained from different batches of experiments. The results of endogenous gene editing efficiency were as shown in FIG. 3 and Table 4.

[0374] The results showed the 78 nucleases (AG-H11-TM18, AG-H11-TM19, AG-H11-TM4, AG-H11-TM3, AG-H11-TM27, AG-H11-TM7, AG-H11-TM17, AG-H11-TM6, AG-H11-TM14, AG-H11-TM20, AG-H11-TM9, AG-H11-TM82, AG-H11-TM83, AG-H11-TM1, AG-H11-TM21, AG-H11-TM15, AG-H11-TM11, AG-H11-TM25, AG-H11-TM54, AG-H11-TM24, AG-H11-TM36, AG-H11-TM73, AG-H11-TM30, AG-H11-TM63, AG-H11-TM85, AG-H11-TM41, AG-H11-TM37, AG-H11-TM13, AG-H11-TM10, AG-H11-TM39, AG-H11-TM81, AG-H11-TM23, AG-H11-TM26, AG-H11-TM5, AG-H11-TM29, AG-H11-TM64, AG-H11-TM48, AG-H11-TM22, AG-H11-TM88, AG-H11-TM58, AG-H11-TM76, AG-H11-TM12, AG-H11-TM69, AG-H11-TM51, AG-H11-TM31, AG-H11-TM43, AG-H11-TM65, AG-H11-TM71, AG-H11-TM68, AG-H11-TM87, AG-H11-TM49, AG-H11-TM28, AG-H11-TM50, AG-H11-TM79, AG-H11-TM52, AG-H11-TM34, AG-H11-TM57, AG-H11-TM66, AG-H11-TM70, AG-H11-TM8, AG-H11-TM84, AG-H11-TM60, AG-H11-TM35, AG-H11-TM75, AG-H11-TM67, AG-H11-TM53, AG-H11-TM40, AG-H11-TM32, AG-H11-TM59, AG-H11-TM80, AG-H11-TM42, AG-H11-TM89, AG-H11-TM33, AG-H11-TM44, AG-H11-TM38, AG-H11-TM74, AG-H11-TM77, AG-H11-TM46) with different mutated sites exhibits increased editing efficiency on endogenous genes, compared with the wild-type nuclease AG-H11.

[0375] Meanwhile, a large number of mutated nucleases with inactive or low cleavage activity were also found during the screening process (e.g. AG-H11-TM16, AG-H11-TM2 in Table 1 of this application) . Compared with these nucleases with inactive or low activity, the cleavage activity of the 78 nucleases of the present application were markedly higher.

[0376] Table 4 The results of nuclease activity in example 4

[0377] Example 5: Detection of engineered nuclease activity on the targeting gene B2M

[0378] In this example, the nuclease activity on the endogenous targeting gene B2M was evaluated using the method described in example 4.

[0379] By analyzing the sequence data generated by the next generation sequencing technology, the endogenous gene editing activity of nuclease was determined by counting the base insertions and deletions (Indel%) generated on the targeted sequence of endogenous targeting gene B2M.

[0380] In order to eliminate the influence of the differential transfection efficiency on gene editing activity, the values of Indel% / RFP+%was used to evaluate the endogenous gene editing activity of the nucleases.

[0381] Furthermore, since the mutated nucleases provided in this application were tested in different batches of parallel experiments, the wild-type nuclease AG-H11 was used as control in each batch. To further minimize the experimental variability across different batches, the values of “Indel% / RFP+% (Fold change relative to AG-H11 in different batches) ” was used to compare the gene editing activity obtained from different batches of experiments. The results of endogenous gene editing efficiency were as shown in FIG. 4 and Table 5.

[0382] The results showed the 11 nucleases (AG-H11-MM1, AG-H11-MM2, AG-H11-MM3, AG-H11-MM4, AG-H11-MM5, AG-H11-MM6, AG-H11-MM7, AG-H11-MM8, AG-H11-MM9, AG-H11-MM10, AG-H11-MM11) with different mutated sites exhibits increased editing efficiency on endogenous genes, compared with the wild-type nuclease AG-H11.

[0383] Table 5 The results of nuclease activity in example 5

[0384] Example 6: Detection of engineered nuclease activity on the targeting gene CD7

[0385] In this example, the nuclease activity on the endogenous targeting gene CD7 was evaluated.

[0386] The two functional plasmids were constructed using the method described in example 1, and the 20 nt targeted sequence 1 (sequence as shown in SEQ ID NO: 238) was replaced by the 20 nt targeted sequence 4 (sequence as shown in SEQ ID NO: 241) in the plasmid 2.

[0387] The nuclease activity was detected using the method described in example 2, and the PCR primers (sequences of forward primer and reverse primer as shown in SEQ ID NO: 249 and SEQ ID NO: 257, respectively) were designed near the targeted sequence of endogenous targeting gene CD7 to amplify a length of about 200bp PCR product including 20nt targeted sequence.

[0388] By analyzing the sequence data generated by the next generation sequencing technology, the endogenous gene editing activity of nuclease was determined by counting the base insertions and deletions (Indel%) generated on the targeted sequence of endogenous targeting gene CD7.

[0389] In order to eliminate the influence of the differential transfection efficiency on gene editing activity, the values of Indel% / RFP+%was used to evaluate the endogenous gene editing activity of the nucleases.

[0390] Furthermore, since the mutated nucleases provided in this application were tested in different batches of parallel experiments, the wild-type nuclease AG-H11 was used as control in each batch. To further minimize the experimental variability across different batches, the values of “Indel% / RFP+% (Fold change relative to AG-H11 in different batches) ” was used to compare the gene editing activity obtained from different batches of experiments. The results of endogenous gene editing efficiency were as shown in FIG. 4 and Table 6.

[0391] The results showed the 11 nucleases (AG-H11-MM1, AG-H11-MM2, AG-H11-MM3, AG-H11-MM4, AG-H11-MM5, AG-H11-MM6, AG-H11-MM7, AG-H11-MM8, AG-H11-MM9, AG-H11-MM10, AG-H11-MM11) with different mutated sites exhibits increased editing efficiency on endogenous genes, compared with the wild-type nuclease AG-H11.

[0392] Table 6 The results of nuclease activity in example 6

[0393] Example 7: Detection of engineered nuclease activity on the targeting gene EGFR

[0394] In this example, the nuclease activity on the endogenous targeting gene EGFR was evaluated.

[0395] The two functional plasmids were constructed using the method described in example 1, and the 20 nt targeted sequence 1 (sequence as shown in SEQ ID NO: 238) was replaced by the 20 nt targeted sequence 5 (sequence as shown in SEQ ID NO: 242) in the plasmid 2.

[0396] The nuclease activity was detected using the method described in example 2, and the PCR primers (sequences of forward primer and reverse primer as shown in SEQ ID NO: 250 and SEQ ID NO: 258, respectively) were designed near the targeted sequence of endogenous targeting gene EGFR to amplify a length of about 200bp PCR product including 20nt targeted sequence.

[0397] By analyzing the sequence data generated by the next generation sequencing technology, the endogenous gene editing activity of nuclease was determined by counting the base insertions and deletions (Indel%) generated on the targeted sequence of endogenous targeting gene EGFR.

[0398] In order to eliminate the influence of the differential transfection efficiency on gene editing activity, the values of Indel% / RFP+%was used to evaluate the endogenous gene editing activity of the nucleases.

[0399] Furthermore, since the mutated nucleases provided in this application were tested in different batches of parallel experiments, the wild-type nuclease AG-H11 was used as control in each batch. To further minimize the experimental variability across different batches, the values of “Indel% / RFP+% (Fold change relative to AG-H11 in different batches) ” was used to compare the gene editing activity obtained from different batches of experiments. The results of endogenous gene editing efficiency were as shown in FIG. 4 and Table 7.

[0400] The results showed the 10 nucleases (AG-H11-MM1, AG-H11-MM2, AG-H11-MM3, AG-H11-MM4, AG-H11-MM5, AG-H11-MM6, AG-H11-MM7, AG-H11-MM8, AG-H11-MM9, AG-H11-MM10) with different mutated sites exhibits increased editing efficiency on endogenous genes, compared with the wild-type nuclease AG-H11.

[0401] Table 7 The results of nuclease activity in example 7

[0402] Example 8: Detection of engineered nuclease activity in the Tomato hairy root

[0403] In this example, the nuclease activity on endogenous genes MLO1 or PDS was evaluated by tomato hairy root transformation.

[0404] The three functional plasmids were constructed based on the plasmid 3 that was described in example 1. Plasmid 3 was cut by BsaI and the annealed sequence with 20 nt targeted sequence 6 of endogenous gene MLO1 (sequence as shown in SEQ ID NO: 243) was connected to linearized plasmid 3 by T4 ligation. The 20 nt targeted sequence 7 of endogenous gene PDS (sequence as shown in SEQ ID NO: 244) , or the 20 nt targeted sequence 8 of endogenous gene PDS (sequence as shown in SEQ ID NO: 245) was ligated to the BsaI linearized plasmid 3 by the same means as the abovementioned 20 nt targeted sequence 6 of endogenous gene MLO1.

[0405] 8.1 Tomato hairy root transformation

[0406] Tomato (Solanum lycopersicum L. ) Ailsa Craig seeds (bought from Aishengwu Biotech) were surface sterilized in 70% (v / v) ethanol for 5 min followed by 50% (v / v) commercial bleach for 20 min and three washes with sterile deionized water. Seeds were plated on Murashige and Skoog (MS) plates containing 4.3 g MS medium (Phytotech; catalog no. M519) , 0.5 g MES, 30 g Sucrose, pH 5.8, and 10 g agar (Difco; catalog no.214530) in Magenta boxes and placed in a 25℃ chamber (16 h of light / 8 h of darkness) for 7 to 9 d until cotyledons were fully expanded and the true leaves were just emerged.

[0407] Agrobacterium rhizogenes transformation procedure is as follows: Competent A. rhizogenes ATCC15834 (Coolaber, Cat No. CC416) was transformed by chemical method with the desired binary vector (the functional plasmids with three different targets respectively as described above) , plated on custom-made TY medium plates (0.5%tryptone, 0.3%yeast extract, 1.5%agar, 1%CaCl2, pH7.0) with the appropriate antibiotics, and incubated for 2 d at 28℃. Using a scalpel, the cotyledons were cut from prepared tomato seedlings and immediately immersed in agrobacterial suspension at an optical density at 600 nm of 0.3 in MS liquid medium for 20 min, then blotted on sterile Whatman filter paper and transferred (adaxial side down) onto MS agar plates without antibiotics. After 2 to 3 d of incubation at 25℃ in dark, the cotyledons were transferred to MS agar plates with 100mg-L cefotaxime and antibiotics and returned to 25℃. After 3 weeks, at least three to five independent roots arise from each cotyledon. Thirty independent roots were subcloned for each construct.

[0408] Genomic DNA was extracted from the above prepared tomato root by genomic DNA extraction kit from Bioteke Corporation (catalog no. AU31111) . This genomic DNA was used as a template to PCR amplify target site with the corresponding primer set.

[0409] 8.2 Detection of engineered nuclease activity on the targeting gene MLO1

[0410] The nuclease activity was detected, and the PCR primers of endogenous gene MLO1 (sequences of forward primer and reverse primer as shown in SEQ ID NO: 251 and SEQ ID NO: 259, respectively) were designed near the targeted sequence 6 of the endogenous gene MLO1 to amplify a length of about 200bp PCR product including 20nt targeted sequence 6. The PCR products were sequenced by the next generation sequencing.

[0411] 8.3 Detection of engineered nuclease activity on the targeting gene PDS

[0412] The nuclease activity was detected, the PCR primers of endogenous gene PDS (sequences of forward primer and reverse primer as shown in SEQ ID NO: 252 and SEQ ID NO: 260, respectively) were designed near the targeted sequence 7 of the endogenous gene PDS to amplify a length of about 200bp PCR product including 20nt targeted sequence 7, and the PCR primers of endogenous gene PDS (sequences of forward primer and reverse primer as shown in SEQ ID NO: 253 and SEQ ID NO: 261, respectively) were designed near the targeted sequence 8 of the endogenous gene PDS to amplify a length of about 200bp PCR product including 20nt targeted sequence 8. The PCR products were sequenced by the next generation sequencing.

[0413] By analyzing the sequence data generated by the next generation sequencing technology in 8.2 and 8.3, the endogenous gene editing activity of nuclease was determined by counting the base insertions and deletions (Indel%) generated on the targeted sequence of endogenous targeting gene. Furthermore, the wild-type nuclease (AG-H11) was used as control.

[0414] The results of endogenous gene editing efficiency were as shown in FIG. 5A, FIG. 5B, and Table 8. The results showed that the 9 nucleases (AG-H11-TM30, AG-H11-TM54, AG-H11-TM76, AG-H11-MM1, AG-H11-MM2, AG-H11-MM3, AG-H11-MM4, AG-H11-MM5, AG-H11-MM6) with different mutated sites exhibits increased editing efficiency on endogenous genes, compared with the wild-type nuclease AG-H11. In addition, the results in FIG. 5A, FIG. 5B, and Table 8 also showed that the nucleases provided in the present application had good cleavage activity in plant cells as well.

[0415] Table 8 The results of nuclease activity in example 8

[0416] It should be stated that the above are only the preferred examples of the present application and are not intended to limit the present application. For those of ordinary skill in the art, various modifications and changes can be made to the present application. Although the specific embodiments have been described, for the applicant or a person skilled in the art, the substitutions, modifications, changes, improvements, and substantial equivalents of the above embodiments may exist or cannot be foreseen currently. Therefore, the submitted appended claims and claims that may be modified are intended to cover all such substitutions, modifications, changes, improvements, and substantial equivalents. It is important that, as the technology evolves, many elements described herein may be replaced with equivalent elements that appear after the present application.

Claims

1.An engineered nuclease, wherein the nuclease comprises one amino acid sequence obtained by performing substitution, deletion, and / or insertion of at least 1, 2, 3, 4, 5, or 6 amino acids on the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1,wherein the position of the substitution, deletion, and / or insertion includes 313, 318, 29, 220, 251, 218, 207, 97, 100, 213, 300, 5, 314, 119, 104, 206, 214, 166, 297, 250, 283, 45, 158, 27, 279, 267, 101, 89, 149, 236, 303, 307, 334, 193, 342, 126, 335, 253, 339, 69, 255, 120, 59, 3, 332, 174, 259, 223, 362, 312, 125, 216, 229, 160, 88, 111, 105, 159, 194, 4, 56, 258, 34, 247, 145, 311, 26, 182, 16, 183, 9, 181, 96, 210, 106, 57, 321, 333, 330, 44, 367, 257, 231, 328, 239, 215, 2, 137, 54, 268, 127, 240, 124, 308, 70, 200, 15, 71, 52, 175, 28, 348, 36, 140, 366, 237, 201, 6, 363, 154, 202, 128, 108, 33, 73, 17, or any combination thereof, with numbering relative to SEQ ID NO: 1.2.The nuclease according to claim 1, wherein the nuclease exhibits increased efficiency of gene editing, compared to the nuclease comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.3.The nuclease according to claim 1 or 2, wherein the nuclease comprises one amino acid sequence obtained by substituting with aliphatic amino acid at one, two, three, four, five, six, or more positions of 313, 318, 29, 220, 251, 218, 207, 97, 100, 213, 300, 5, 314, 119, 104, 206, 214, 166, 297, 250, 283, 45, 158, 27, 279, 267, 101, 89, 149, 236, 303, 307, 334, 193, 342, 126, 335, 253, 339, 69, 255, 120, 59, 3, 332, 174, 259, 223, 362, 312, 125, 216, 229, 160, 88, 111, 105, 159, 194, 4, 56, 258, 34, 247, 145, 311, 26, 182, 16, 183, 9, 181, 96, 210, 106, 57, 321, 333, 330, 44, 367, 257, 231, 328, 239, 215, 2, 137, 54, 268, 127, 240, 124, 308, 70, 200, 15, 71, 52, 175, 28, 348, 36, 140, 366, 237, 201, 6, 363, 154, 202, 128, 108, 33, 73, 17, or any combination thereof, with numbering relative to SEQ ID NO: 1.4.The nuclease according to claim 3, wherein the aliphatic amino acid comprises arginine and / or glycine.5.The nuclease according to any one of claims 1-4, wherein the nuclease comprises one amino acid sequence obtained by performing substitution at one, two, three, four, five, six, or more positions of L313R, K318R, V29R, E220R, Q251R, A218R, P207R, G97R, A100R, A213R, T300R, N5R, I314R, N119K, F104R, Y206R, L214R, Y166R, M297R, N250R, A283R, E45R, S158R, G27R, G279R, Y267R, F101R, N89R, D149G, K236R, Q303R, E307R, V334R, N193R, L342R, D126R, S335R, K253R, S339R, F69R, F255R, G120R, F59R, K3R, V332R, D174G, N119R, T259R, V223R, K362R, K312R, E125G, K216R, K229R, T160R, Q88R, Q111R, K105R, K159R, T194R, Q4R, E56R, K258R, N34R, K247R, E145R, K311R, F26R, T182R, K16R, E183R, K9R, E181R, E96R, Y210R, S106R, Q57R, P321R, K333R, E125R, G330R, Y44R, K367R, Y257R, S231R, C328R, L239R, E215R, T2R, P137R, L54R, D268R, G127R, E145G, K240R, M124R, E308R, P70R, E200R, N15R, F71R, E52R, H175R, C28R, G348R, M36R, M140R, L366R, Q237R, G201R, D174R, K6R, K363R, S154R, K202R, H128R, K108R, Y33R, D126G, K73R, E17R, or any combination thereof, with numbering relative to SEQ ID NO: 1.6.The nuclease according to any one of claims 1-5, wherein the nuclease comprises one amino acid sequence obtained by performing substitution selected from at least one of the following groups (1) - (210) , with numbering relative to SEQ ID NO: 1:(1) L313R;(2) K318R;(3) V29R, E56R ;(4) E220R;(5) Q251R;(6) A218R;(7) P207R;(8) G97R;(9) A100R;(10) A213R;(11) T300R;(12) N5R;(13) I314R;(14) N119K(15) F104R;(16) Y206R;(17) L214R;(18) Y166R;(19) M297R;(20) N250R;(21) A283R;(22) E45R;(23) S158R;(24) G27R;(25) G279R;(26) Y267R;(27) F101R;(28) N89R;(29) D149G(30) K236R;(31) Q303R;(32) E307R;(33) V334R;(34) N193R;(35) L342R;(36) D126R;(37) S335R;(38) K253R;(39) S339R;(40) F69R;(41) F255R;(42) G120R;(43) F59R;(44) K3R;(45) V332R;(46) D174G(47) N119R;(48) T259R;(49) V223R;(50) K362R;(51) K312R;(52) E125G(53) K216R;(54) K229R;(55) T160R;(56) Q88R;(57) Q111R;(58) K105R;(59) K159R;(60) T194R;(61) Q4R;(62) E56R;(63) K258R;(64) N34R;(65) K247R;(66) E145R;(67) K311R;(68) F26R;(69) T182R;(70) K16R;(71) E183R;(72) K9R;(73) E181R;(74) E96R;(75) Y210R;(76) S106R;(77) Q57R;(78) P321R;(79) K333R;(80) E125R;(81) G330R;(82) Y44R;(83) K367R;(84) Y257R;(85) S231R;(86) C328R;(87) L239R;(88) E215R;(89) T2R;(90) P137R;(91) L54R;(92) D268R;(93) G127R;(94) E145G(95) K240R;(96) M124R;(97) E308R;(98) P70R;(99) E200R;(100) N15R;(101) F71R;(102) E52R;(103) H175R;(104) C28R;(105) G348R;(106) M36R;(107) M140R;(108) L366R;(109) Q237R;(110) G201R;(111) D174R;(112) K6R;(113) K363R;(114) S154R;(115) K202R;(116) H128R;(117) K108R;(118) Y33R;(119) D126G(120) K73R;(121) E17R; .(122) G97R, L313R, K318R;(123) A100R, A213R, T300R;(124) V29R, E56R, A100R, E220R;(125) V29R, E56R, G97R, E220R;(126) A218R, L313R, K318R;(127) V29R, E56R, A218R, L313R;(128) G97R, A218R, Q251R;(129) V29R, E56R, A218R, E220R;(130) G97R, A100R, P207R;(131) A100R, A218R, Q251R;(132) V29R, E56R, E220R, L313R;(133) Y166R, A213R, T300R;(134) Y166R, E220R, Q251R;(135) N5R, A213R, T300R;(136) A100R, L313R, K318R;(137) G97R, P207R, A213R;(138) V29R, E56R, Q251R, L313R;(139) A213R, L313R, K318R;(140) Q111R, K258R, E125G;(141) P207R, L313R, K318R;(142) F26R, T300R, V334R;(143) E56R, E220R, Q251R;(144) T300R, L313R, K318R;(145) G27R, F101R, F104R;(146) Y206R, A283R, I314R;(147) E45R, K159R, Q303R;(148) G27R, E145G, K312R;(149) V29R, E56R, L313R, K318R;(150) V29R, E56R, E220R, K318R;(151) N34R, L214R, E307R;(152) S158R, Y166R, V334R;(153) P207R, E220R, Q251R;(154) A218R, E220R, Q251R;(155) V29R, E56R, P207R, E220R;(156) Q251R, L313R, K318R;(157) G27R, F101R, L342R;(158) G97R, E145R, P207R;(159) P207R, A218R, Q251R;(160) G279R, L313R, K318R;(161) Y166R, L313R, S339R;(162) F69R, L313R, K318R;(163) V29R, E56R, Q251R, K318R;(164) E45R, A100R, F104R;(165) F104R, E181R, A213R;(166) K3R, Q251R, G330R;(167) Q57R, S158R, T259R;(168) V29R, E56R, G97R, F104R;(169) E56R, P207R, A218R;(170) V29R, E56R, S158R, Y166R;(171) G279R, A283R, K318R;(172) A100R, D126R, Y267R;(173) E220R, L313R, K318R;(174) F101R, T182R, K216R;(175) D126R, D149G, E307R;(176) K105R, E183R, E220R;(177) K9R, F59R, N193R;(178) E125R, V223R, I314R;(179) V29R, E56R, G97R, L342R;(180) E45R, A100R, L342R;(181) V29R, E56R, E220R, Q251R ;(182) E181R, T182R, Y267R;(183) D149G, A218R, V332R;(184) K16R, D174G, G279R;(185) F69R, Y206R, I314R;(186) V29R, E56R, F104R, N119R;(187) S106R, M297R, C328R;(188) Y44R, T160R, T194R;(189) Q4R, K229R, F255R;(190) N119K, N250R, K318R;(191) D126R, D149G, V334R;(192) E56R, L239R, Y257R;(193) K318R, V334R, L342R;(194) N5R, Y206R, S231R;(195) F69R, K253R, K362R;(196) V29R, E56R, D174R, K333R;(197) F69R, E181R, T182R;(198) F69R, V334R, L342R;(199) N89R, K236R, K311R;(200) Q111R, E125G, K258R, L313R, K318R;(201) Q111R, E125G, K258R, T300R;(202) Q111R, E125G, Y166R, K258R;(203) Q111R, E125G, K258R, T300R, L313R, K318R;(204) F69R, Q111R, E125G, K258R;(205) G97R, Q111R, E125G, K258R;(206) F69R, G97R, L313R, K318R;(207) F69R, T300R, L313R, K318R;(208) G97R, T300R, L313R, K318R;(209) F69R, G97R, T300R, L313R, K318R; and / or(210) Y166R, A213R, T300R, L313R, K318R.7.The nuclease according to any one of claims 1-6, wherein the nuclease has an amino acid sequence as shown in any one of SEQ ID NOs: 2-122, 125-202, and 205-215.8.The nuclease according to any one of claims 1-7, wherein the nuclease belongs to the IS200 / IS605 family.9.The nuclease according to claim 8, wherein the nuclease belongs to the IS605 or IS1341 subfamily.10.A nucleic acid, wherein, the nucleic acid encodes the nuclease according to any one of claims 1-9.11.A nucleic acid construct, comprising the nucleic acid according to claim 10, wherein the nucleic acid construct further comprises a promoter.12.The nucleic acid construct according to claim 11, wherein the promoter includes CMV, EF1a, SV40, PGK, UbC, human beta actin, CAG, TRE, UAS, Ac5, GFAP, Polyhedrin promotor, TBG, ALB, ApoEHCR-hAAT, CaMKIIa, GAL1, TEF1, GDS, ADH1, CaMV35S, Ubi, H1, U6, T7, T7lac, Sp6, araBAD, trp, lac, Ptac, or pL.13.The nucleic acid construct according to claim 11, wherein the nucleic acid construct is modified by 5’-end capping and / or 3’ -end polyadenylating, and the nucleic acid construct retains the activity of nuclease and / or guide RNA.14.The nucleic acid construct according to claim 11, wherein the nucleic acid construct is modified by thiophosphate bond modification, 2’ -MOE (2-O- (2-methoxyethyl) ) , PNA (peptide nucleic acid) , GNA (glycerol nucleic acid) , LNA (locked nucleic acid) , GalNAc (N-acetylgalactosamine) , LNP (lipid nano particle) PNP (peptide nanoparticles) .15.A composition, wherein the composition comprises:An engineered nuclease or a nucleic acid encoding the engineered nuclease according to any one of claims 1-9; anda guide RNA, wherein the guide RNA comprises a reRNA, the reRNA comprises a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 216 or a variant thereof, the guide RNA can bind to the nuclease according to any one of claims 1-9.16.The composition according to claim 15, wherein the composition is selected from at least one of the following groups (1) - (210) , and any one of the following groups (1) - (210) comprises: a nuclease-related sequence and a guide RNA-related sequence,(1) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 2 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(2) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 3 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(3) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 4 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(4) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 5 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(5) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 6 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(6) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 7 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(7) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 8 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(8) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 9 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(9) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 10 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(10) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 11 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(11) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 12 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(12) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 13 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(13) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 14 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(14) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 15 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(15) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 16 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(16) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 17 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(17) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 18 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(18) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 19 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(19) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 20 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(20) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 21 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(21) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 22 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(22) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 23 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(23) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 24 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(24) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 25 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(25) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 26 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(26) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 27 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(27) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 28 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(28) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 29 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(29) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 30 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(30) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 31 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(31) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 32 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(32) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 33 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(33) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 34 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(34) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 35 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(35) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 36 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(36) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(37) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 38 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(38) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 39 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(39) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 40 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(40) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 41 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(41) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 42 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(42) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 43 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(43) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 44 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(44) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 45 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(45) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 46 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(46) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 47 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(47) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 48 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(48) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 49 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(49) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 50 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(50) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 51 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(51) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 52 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(52) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 53 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(53) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 54 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(54) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 55 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(55) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 56 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(56) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 57 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(57) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 58 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(58) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 59 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(59) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 60 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(60) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 61 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(61) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 62 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(62) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 63 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(63) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 64 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(64) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 65 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(65) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 66 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(66) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 67 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(67) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 68 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(68) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 69 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(69) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 70 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(70) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 71 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(71) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 72 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(72) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 73 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(73) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 74 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(74) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 75 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(75) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 76 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(76) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 77 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(77) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 78 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(78) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 79 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(79) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 80 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(80) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 81 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(81) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 82 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(82) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 83 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(83) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 84 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(84) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 85 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(85) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 86 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(86) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 87 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(87) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 88 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(88) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 89 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(89) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 90 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(90) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 91 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(91) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 92 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(92) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 93 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(93) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 94 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(94) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 95 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(95) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 96 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(96) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 97 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(97) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 98 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(98) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 99 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(99) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 100 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(100) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 101 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(101) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 102 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(102) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 103 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(103) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 104 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(104) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 105 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(105) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 106 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(106) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 107 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(107) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 108 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(108) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 109 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(109) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 110 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(110) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 111 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(111) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 112 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(112) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 113 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(113) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 114 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(114) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 115 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(115) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 116 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(116) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 117 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(117) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 118 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(118) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 119 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(119) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 120 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(120) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 121 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(121) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 122 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(122) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 125 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(123) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 126 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(124) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 127 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(125) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 128 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(126) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 129 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(127) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 130 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(128) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 131 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(129) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 132 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(130) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 133 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(131) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 134 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(132) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 135 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(133) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 136 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(134) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 137 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(135) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 138 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(136) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 139 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(137) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 140 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(138) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 141 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(139) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 142 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(140) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 143 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(141) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 144 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(142) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 145 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(143) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 146 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(144) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 147 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(145) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 148 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(146) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 149 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(147) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 150 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(148) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 151 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(149) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 152 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(150) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 153 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(151) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 154 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(152) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 155 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(153) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 156 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(154) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 157 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(155) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 158 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(156) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 159 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(157) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 160 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(158) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 161 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(159) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 162 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(160) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 163 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(161) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 164 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(162) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 165 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(163) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 166 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(164) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 167 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(165) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 168 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(166) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 169 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(167) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 170 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(168) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 171 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(169) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 172 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(170) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 173 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(171) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 174 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(172) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 175 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(173) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 176 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(174) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 177 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(175) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 178 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(176) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 179 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(177) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 180 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(178) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 181 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(179) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 182 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(180) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 183 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(181) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 184 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(182) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 185 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(183) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 186 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(184) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 187 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(185) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 188 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(186) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 189 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(187) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 190 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(188) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 191 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(189) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 192 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(190) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 193 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(191) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 194 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(192) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 195 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(193) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 196 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(194) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 197 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(195) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 198 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(196) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 199 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(197) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 200 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(198) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 201 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(199) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 202 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(200) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 205 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(201) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 206 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(202) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 207 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(203) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 208 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(204) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 209 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(205) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 210 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(206) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 211 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(207) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 212 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(208) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 213 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(209) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 214 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216;(210) the nuclease-related sequence is an amino acid sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 215 or a nucleic acid encoding the amino acid sequence; and the guide RNA-related sequence is a nucleotide sequence comprising the sequence as shown in SEQ ID NO: 216.17.The composition according to claim 16, wherein the guide RNA-related sequence further comprises a targeted sequence that can recognize a targeting gene adjacent to a transposon-associated motif.18.The composition according to claim 17, wherein the targeted sequence is of at least one of 10-50, 10-40, 10-30, or 15-25 nucleotides in length.19.The composition according to claim 17, wherein the transposon-associated motif comprises a nucleotide sequence of TTTAA.20.A recombinant vector, wherein the recombinant vector comprises the nucleic acid encoding the nuclease according to any one of claims 1-9, the nucleic acid according to claim 10, the nucleic acid construct according to any one of claims 11-14, or the composition according to any one of claims 15-19.21.The recombinant vector according to claim 20, wherein the recombinant vector includes a recombinant cloning vector, a recombinant eukaryotic expression plasmid, or a recombinant viral vector.22.The recombinant vector according to claim 21, wherein the recombinant eukaryotic expression plasmid includes pcDNA3.1, pCMV, pUC18, pUC19, pUC57, pBAD, pET, pENTR, pGenlenti, or pAAV.23.The recombinant vector according to claim 21, wherein the recombinant virus vector includes a recombinant adenovirus vector, a recombinant adeno-associated virus vector, a recombinant retrovirus vector, a recombinant herpes simplex virus vector, or a recombinant vaccinia virus vector.24.A recombinant host cell, wherein, the recombinant host cell comprises the nuclease according to any one of claims 1-9, the nucleic acid according to claim 10, the nucleic acid construct according to any one of claims 11-14, the composition according to any one of claims 15-19, or the recombinant vector according to any one of claims 20-23.25.The recombinant host cell according to claim 24, wherein the recombinant host cell includes an animal cell, a plant cell, an algal cell, a fungal cell, a yeast cell, or a bacterial cell.26.The recombinant host cell according to claim 25, wherein the animal cell includes a mammalian cell; wherein the plant cell includes a monocot cell or a dicot cell.27.The recombinant host cell according to claim 26, wherein the mammalian cell includes a primary cell (e.g., a mesenchymal stem cell, an endothelial cell, an epithelial cell, a fibroblast, a keratinocyte, a melanocyte, a smooth muscle cell, and an immune cell) , an immortalized cell line (e.g., HEK293, NIH-3T3, RAW-264.7, STO, VERO, CT26, hTERT immortalized human endothelial / epithelial / fibroblast / keratinocyte / ductal / cell lines) , a cancer cell line (e.g., Hela, HepG2 / 3, HL-60, HT-1080, HT-29, A549, SW620, HCT-15, HCT110, MDA-MB-231, MCF7, SK-OV-3, PANC-1, AsPc-1, THP-1, Huh7, KG-1, RAJI, HB-CB, Jurkat, K562, CRL5826, CHO, MDCK, and Renca) , an embryonic stem cell line (e.g., H1, H9, WIBR2, WIBR3, G-Olig2, ESF158, RW. 4, R1, and D3) and differentiated cells thereof, or an induced pluripotent stem cell line and differentiated cells thereof; wherein the monocot cell or the dicot cell includes rice cell, maize cell, or soybean cell.28.A method for introducing a double-strand break into a targeting gene of a host cell, wherein the method comprises: delivering the nuclease according to any one of claims 1-9, the nucleic acid according to claim 10, the nucleic acid construct according to any one of claims 11-14, the composition according to any one of claims 15-19, or the recombinant vector according to any one of claims 20-23 into a host cell.29.A method for deleting, replacing or inserting a targeting gene of a host cell, wherein the method comprises: delivering the nuclease according to any one of claims 1-9, the nucleic acid according to claim 10, the nucleic acid construct according to any one of claims 11-14, the composition according to any one of claims 15-19, or the recombinant vector according to any one of claims 20-23 into a host cell.30.A method for obtaining a host cell in which a targeting gene is deleted, replaced or inserted, wherein the method comprises: delivering the nuclease according to any one of claims 1-9, the nucleic acid according to claim 10, the nucleic acid construct according to any one of claims 11-14, the composition according to any one of claims 15-19, or the recombinant vector according to any one of claims 20-23 into a host cell.31.The method according to any one of claims 28-30, wherein the delivery method includes cationic liposome delivery, lipoid nanoparticulate delivery, cationic polymer delivery, vesicle-exosome delivery, gold nanoparticulate delivery, polypeptide and protein delivery, retrovirus delivery, lentivirus delivery, adenovirus delivery, adeno-associated virus delivery, electroporation, agrobacterium infection, or gene gun.32.The method according to any one of claims 28-30, wherein the host cell includes an animal cell, a plant cell, an algal cell, a fungal cell, a yeast cell, or a bacterial cell.33.The method according to claim 32, wherein the animal cell includes a mammalian cell; wherein the plant cell includes a monocot cell or a dicot cell.34.The method according to claim 33, wherein the mammalian cell includes a primary cell (e.g., a mesenchymal stem cell, an endothelial cell, an epithelial cell, a fibroblast, a keratinocyte, a melanocyte, a smooth muscle cell, and an immune cell) , an immortalized cell line (e.g., HEK293, NIH-3T3, RAW-264.7, STO, VERO, CT26, hTERT immortalized human endothelial / epithelial / fibroblast / keratinocyte / ductal / cell lines) , a cancer cell line (e.g., Hela, HepG2 / 3, HL-60, HT-1080, HT-29, A549, SW620, HCT-15, HCT110, MDA-MB-231, MCF7, SK-OV-3, PANC-1, AsPc-1, THP-1, Huh7, KG-1, RAJI, HB-CB, Jurkat, K562, CRL5826, CHO, MDCK, and Renca) , an embryonic stem cell line (e.g., H1, H9, WIBR2, WIBR3, G-Olig2, ESF158, RW. 4, R1, and D3) and differentiated cells thereof, or an induced pluripotent stem cell line and differentiated cells thereof; wherein the monocot cell or the dicot cell includes rice cell, maize cell, or soybean cell.35.Use of the nuclease according to any one of claims 1-9, the nucleic acid according to claim 10, the nucleic acid construct according to any one of claims 11-14, the composition according to any one of claims 15-19, the recombinant vector according to any one of claims 20-23, or the recombinant host cell according to any one of claims 24-27 for introducing a double-strand break into a targeting gene of a host cell.36.Use of the nuclease according to any one of claims 1-9, the nucleic acid according to claim 10, the nucleic acid construct according to any one of claims 11-14, the composition according to any one of claims 15-19, the recombinant vector according to any one of claims 20-23, or the recombinant host cell according to any one of claims 24-27 for deleting, replacing or inserting a targeting gene of a host cell.37.The use according to claim 35 or 36, wherein the host cell includes an animal cell, a plant cell, an algal cell, a fungal cell, a yeast cell, or a bacterial cell.38.The use according to claim 37, wherein the animal cell includes a mammalian cell; wherein the plant cell includes a monocot cell or a dicot cell.39.The use according to claim 38, wherein the mammalian cell includes a primary cell (e.g., a mesenchymal stem cell, an endothelial cell, an epithelial cell, a fibroblast, a keratinocyte, a melanocyte, a smooth muscle cell, and an immune cell) , an immortalized cell line (e.g., HEK293, NIH-3T3, RAW-264.7, STO, VERO, CT26, hTERT immortalized human endothelial / epithelial / fibroblast / keratinocyte / ductal / cell lines) , a cancer cell line (e.g., Hela, HepG2 / 3, HL-60, HT-1080, HT-29, A549, SW620, HCT-15, HCT110, MDA-MB-231, MCF7, SK-OV-3, PANC-1, AsPc-1, THP-1, Huh7, KG-1, RAJI, HB-CB, Jurkat, K562, CRL5826, CHO, MDCK, and Renca) , an embryonic stem cell line (e.g., H1, H9, WIBR2, WIBR3, G-Olig2, ESF158, RW. 4, R1, and D3) and differentiated cells thereof, or an induced pluripotent stem cell line and differentiated cells thereof; wherein the monocot cell or the dicot cell includes rice cell, maize cell, or soybean cell.40.Use of the nuclease according to any one of claims 1-9, the nucleic acid according to claim 10, the nucleic acid construct according to any one of claims 11-14, the composition according to any one of claims 15-19, the recombinant vector according to any one of claims 20-23, or the recombinant host cell according to any one of claims 24-27 for preparing a drug or a preparation for gene therapy, cell therapy, genome research, and stem cell induction and post-induction differentiation.41.A kit, wherein, the kit comprises the nuclease according to any one of claims 1-9, the nucleic acid according to claim 10, the nucleic acid construct according to any one of claims 11-14, the composition according to any one of claims 15-19, the recombinant vector according to any one of claims 20-23, or the recombinant host cell according to any one of claims 24-27.

Images