Chimeric molecules specifically binding natriuretic peptide receptor c (NPR-c), compositions, and uses thereof

Abstract

Provided are chimeric molecules, compositions, and applications thereof that specifically bind to natriuretic peptide receptor C (NPR-C). The disclosed chimera comprises an NPR-C binding domain and a target-binding domain. Through NPR-C-mediated endocytosis, the chimera enables the intracellular degradation of the target by lysosomal enzymes. The chimeric molecules can rapidly, conveniently, and precisely degrade target proteins. Their modular design permits broad applicability to proteins such as secreted proteins and membrane-associated proteins. These chimeric molecules exhibit high bioavailability and low immunogenicity, thus being broadly applicable for the treatment of diseases including cancer, neurodegenerative diseases, psychiatric disease, central nervous system diseases, inflammatory diseases, autoimmune diseases, metabolic syndrome, tissue fibrotic disease, cardiovascular diseases, respiratory diseases, digestive diseases, renal diseases, hematologic diseases, infectious diseases, rare diseases and aging-related disease.

Description

CHIMERIC MOLECULES SPECIFICALLY BINDING NATRIURETIC PEPTIDE RECEPTOR C (NPR-C) , COMPOSITIONS, AND USES THEREOFCROSS-REFERENCES TO RELATED APPLICATIONS

[0001] The present application claims priority to Chinese Application No. 2024119408730 filed December 26, 2024, the full disclosure of which is incorporated by reference in its entirety for all purposes.TECHNICAL FIELD

[0002] The present invention relates to the field of biomedicine, particularly to platform systems and their applications for lysosome-mediated targeted degradation of specific biomolecules.BACKGROUND

[0003] Targeted protein degradation (TPD) represents a rapidly evolving approach in pharmaceutical innovation, enabling the selective identification and elimination of aberrant proteins implicated in disease pathogenesis. This technology provides significant advantages over traditional small-molecule drugs, particularly in the treatment of cancers, autoimmune diseases, neurodegenerative disorders, inflammatory diseases, and infectious conditions caused by viruses and bacteria.

[0004] Mechanistically, TPD strategies operate via distinct cellular degradation pathways, primarily the proteasomal and lysosomal systems. The lysosomal pathway is capable of degrading a broad spectrum of substrates, including intracellular, extracellular, and transmembrane proteins, as well as glycosphingolipids, protein aggregates, and damaged organelles. Harnessing lysosome-mediated degradation mechanisms is therefore an important direction for therapeutic intervention targeting disease-related biomolecules.

[0005] Recent advances in TPD have led to the development of novel lysosome-targeting technologies, such as lysosome-targeting chimeras (LYTAC) , autophagy-targeting chimeras (AUTAC) , autophagosome-tethering compounds (ATTEC) , and chaperone-mediated autophagy (CMA) . Among these, LYTAC technology has garnered particular attention. LYTAC molecules represent a class of targeted protein degradation strategies that exploit cell surface receptors to mediate lysosomal degradation. Their earliest reported implementation generally comprises an oligosaccharide–peptide unit capable of binding CI‐M6PR and an antibody that binds a specific transmembrane or extracellular protein, with the antibody optionally replaced by other protein‐binding moieties. When the molecule simultaneously engages both CI‐M6PR and the target protein, the resulting complex is internalized via the cell membrane to form transport vesicles. These vesicles deliver the complex to the lysosome, where the target protein is degraded.

[0006] The natriuretic peptide (NP) family consists of peptide hormones secreted by cardiomyocytes in response to cellular stretch, which function to increase intracellular cyclic GMP (cGMP) , counteract cardiac fibrosis and hypertrophy, and exert diuretic and vasodilatory effects. In humans, three endogenous NPs exist, atrial natriuretic peptide (ANP) , B-type natriuretic peptide (BNP) , and C-type natriuretic peptide (CNP) . In particular, the typical lengths of the mature ANP, BNP, and CNP peptides are approximately 28, 32, and 22 amino acids, respectively. A common structural feature of these peptides is a cyclic segment of 17 amino acid residues formed by a disulfide bond within the amino acid sequence, and this cyclic segment is highly conserved among the different natriuretic peptides.

[0007] Three natriuretic peptide receptors have been identified in the human body: NPR-A, NPR-B, and NPR-C. NPR-A and NPR-B are guanylyl cyclase receptors signaling through cGMP, with NPR-A selectively binding ANP and BNP, while NPR-B is specific for CNP. NPR-C, also referred to as the clearance receptor, facilitates internalization and lysosomal degradation of natriuretic peptides, rapidly reducing the half-lives of BNP and ANP to approximately twenty and three minutes, respectively.

[0008] Despite substantial progress in LYTAC and related lysosome-targeting technologies, there remains a need for chimeric systems that achieve superior specificity, higher tissue selectivity, reduced immunogenicity, and improved pharmacokinetic properties for in vivo applications. Continued innovation in lysosome-mediated protein degradation is expected to enable flexible targeting of extracellular, membrane-bound, and intracellular proteins, thereby expanding therapeutic options for previously intractable diseases and driving further advancements in drug discovery and development. BRIEF SUMMARY

[0009] This summary provides a high-level overview of various aspects of the disclosure and introduces some of the concepts that are described and illustrated in the present document and the accompanying figures. The summary is not intended to identify key or essential features of the claimed subject matter, nor is it intended to be used in isolation to determine the scope of the claimed subject matter. Covered embodiments of the disclosure are defined by the claims, not this summary. The subject matter should be understood by reference to appropriate portions of the entire specification, any or all figures, and each claim. Some of the exemplary embodiments of the present disclosure are discussed below.

[0010] The present disclosure provides a platform system for the targeted degradation of specific biomolecules, such as proteins, utilizing chimeric molecules composed of a natriuretic peptide receptor C (NPR-C) binding domain and a target-binding domain connected by an engineered linker. This system employs NPR-C receptor-mediated endocytosis to direct the selective internalization and subsequent lysosomal degradation of the target molecule within the cell.

[0011] In one aspect, the invention features chimeric molecules that comprise both an NPR-C binding domain and a target-binding domain. The NPR-C binding domain is configured to specifically bind to the NPR-C receptor, while the target-binding domain selectively binds to a designated target molecule. In certain embodiments, these domains are connected by a linker to facilitate optimal spatial arrangement, stability, and functional interaction between the domains.

[0012] The NPR-C binding domain may be an atrial natriuretic peptide (ANP) protein, B-type natriuretic peptide (BNP) protein, C-type natriuretic peptide (CNP) protein, or a variant thereof, including short peptide sequences derived from these proteins. Preferably, variants are engineered to exhibit increased affinity for NPR-C and / or decreased affinity for NPR-A and NPR-B, relative to wild-type proteins. ANP, BNP, or CNP proteins as described herein include proteins from any species, especially mammalian species including humans. In specific embodiments, the NPR-C binding domain comprises an amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO. 12 (ANP) , SEQ ID NO. 16 (BNP) , or SEQ ID NO. 20 (CNP) , or a sequence with at least 80%identity, and more preferably at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity, to these reference sequences.

[0013] In some embodiments, the ANP protein variant is a truncated variant comprising amino acids 1–23, 4–23, or 6–20 of the ANP protein, numbered according to SEQ ID NO. 12, and optionally having one or more mutations at positions 4, 6, or 14. At position 4, mutations may include R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, or R4W. At position 6, mutations may be S6M or S6Q. At position 14, mutations may be R14P, R14H, or R14K.

[0014] In some embodiments, the truncated ANP variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 30, or SEQ ID NO. 32, or a sequence with at least 80%identity thereto, preferably at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity, or variants as described above.

[0015] In specific embodiments, the ANP variant comprises the sequence of SEQ ID NO. 14 and contains one or more substitutions chosen from S6M, S6Q, R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, R4W, R14P, R14H, and R14K.

[0016] In some embodiments, the variant of the ANP protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 30 and comprises one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, R4W, R14P, R14H, and R14K.

[0017] In some embodiments, the variant of the ANP protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 32 and comprises one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R14P, R14H, and R14K.

[0018] For SEQ ID NO. 30, the variant may include any substitution as listed above for SEQ ID NO. 14 and comprises one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, R4W, R14P, R14H, and R14K. For SEQ ID NO. 32, the variant may contain S6M, S6Q, R14P, R14H, and / or R14K.

[0019] BNP protein variants may be truncated forms comprising amino acids 6–22 of the BNP protein (numbered according to SEQ ID NO. 16) , with optional mutations at positions 8, 9, 16, 17, or 18. At position 8, mutations include S8N, S8T, S8A, or S8Q. At position 9, mutations include G9D, G9S, G9I, G9N, G9T, G9Q, G9C, or G9Y. Mutations at position 16 can be D16E; at position 17, R17Q; at position 18, I18A or I18V.

[0020] Certain embodiments comprise a BNP variant with the amino acid sequence of SEQ ID NO. 16 or a sequence with at least 80%identity thereto, preferably at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity, or as otherwise described above.

[0021] Variants of SEQ ID NO. 16 can include any one or more substitutions selected from S8N, S8T, S8A, S8Q, G9D, G9S, G9I, G9N, G9T, G9Q, G9C, G9Y, D16E, R17Q, I18V, and I18A.

[0022] In some embodiments, the CNP protein variant is a mutated variant at position 4 or 7 (based on SEQ ID NO. 20) . At position 4, substitutions can be K4I or K4H; at position 7, they may be F7A, F7E, F7G, F7S, F7T, F7Y, F7Q, F7R, or F7K. Such CNP protein variants may comprise the sequence of SEQ ID NO. 20 and one or two substitutions as listed.

[0023] The target-binding domain can be a protein-such as an antibody or fragment thereof, a receptor or ligand domain, polypeptide or cyclic peptide, including peptide aptamer and antibody mimetics-a nucleic acid aptamer, or a small molecule inhibitor, capable of binding to cell membrane or extracellular targets. The scope of potential targets is broad and includes, without limitation, members of the tumor necrosis factor family (e.g., TNF-α, TL1A / TNFSF15) , members of the interleukin family (e.g., IL17, IL23) , epidermal growth factor receptor (EGFR) , programmed death ligand 1 (PD-L1) , human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) , G protein-coupled receptors (GPCRs) , fibroblast growth factor receptor (FGFR) , vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) , cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4 (CTLA-4) , interleukin-5 receptorαsubunit (IL-5Rα) , immunoglobulins (IgA, IgG, IgM, IgD, IgE) , pathogenic autoantibodies, galactose-deficient IgA (Gd-IgA) , cluster of differentiation antigens (CD19, CD44, CD47) , tumor-associated calcium signal transducer 2 (TACSTD2) , mesothelin, glypican-3 (GPC3) , integrin-associated protein (IAP) , integrins, discoidin domain receptor (DDR) , cytoskeleton-associated protein 4 (CKAP4) , carbonic anhydrase IX (CAIX) , secreted phosphoprotein 1 (SPP1) , transthyretin (TTR) , misfolded transthyretin (ATTR) , Activin E (ActE) , Activin receptor like kinase 7 (ALK7) , transmembrane protein 158 (TMEM158) , carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 (CEACAM5) , proteins on extracellular vesicles (e.g., exosomal proteins) specifically targeted by proteins, nucleic acid aptamers, antibodies, and small molecule inhibitors.

[0024] In some embodiments, the target-binding domain may be any protein (such as an antibody or its fragment, a receptor or ligand domain, polypeptide, or cyclic peptide, including peptide aptamer and antibody mimetics) , nucleic acid aptamer, or small molecule inhibitor capable of binding the above targets.

[0025] In another aspect, the disclosure provides peptides that specifically bind NPR-C, selected from variants of ANP, BNP, and CNP as described above, which may be obtained by one or more amino acid substitutions, deletions (or truncations) , or additions. Further aspects provide nucleic acids encoding any of these NPR-C-specific peptides or chimeric proteins, as well as host cells containing these nucleic acids or vectors.

[0026] Suitable host cells for production and application include prokaryotic cells (e.g., Escherichia coli, Bacillus, Lactobacillus, Streptomyces) , yeast cells (e.g., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Schizosaccharomyces pombe, Candida utilis, Hansenula polymorpha, Debaryomyces hansenii, Arxula adeninivorans) , plant cells (e.g., tobacco, rice, carrot, alfalfa, lettuce, soybean) , mammalian cells (e.g., HEK293, HEK293T, HEK293F, HEK293S, HEK293H, CHO, Hela, BHK, HT-1080, PER. C6, CAP, HKB-11, HuH-7, NS0, Sp2 / 0) , and insect cells (e.g., Sf9, Mimic Sf9, Sf21, High Five) .

[0027] Pharmaceutical compositions are also disclosed, comprising the chimera or a nucleic acid encoding the chimera, together with a pharmaceutically acceptable carrier. The NPR-C binding domain (such as a peptide specifically binding NPR-C) may be employed in the preparation of a medicament or drug delivery system for lysosomal degradation of a target molecule.

[0028] The invention further contemplates the use of the disclosed chimeric molecules in treating diseases associated with target proteins. These diseases include, but are not limited to, cancer, neurodegenerative disease, psychiatric disease, central nervous system disease, inflammatory disease, autoimmune disease, metabolic syndrome, tissue fibrotic disease, cardiovascular disease, respiratory disease, digestive disease, renal disease, hematologic disease, infectious disease, rare disease, and aging related disease. Methods for treatment are provided, which comprise administering an effective amount of the chimera, its encoded nucleic acid, or a pharmaceutical composition to a subject in need.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0029] The illustrative figures below accompany the description of exemplary embodiments, highlighting the key aspects and advantages of the present invention in a clear and accessible way.

[0030] FIG. 1 presents panels A, B, and C with schematic diagrams of the constructed plasmids: 9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-ANP-pRSF, 9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-BNP-pRSF, and 9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-CNP-pRSF, respectively.

[0031] FIG. 2 illustrates the results of SDS-PAGE analysis of various recombinantly expressed chimeric proteins sGFP-Linker-ANP, sGFP-Linker-BNP, and sGFP-Linker-CNP in a prokaryotic expression system. Lanes from left to right: protein marker, ANP, BNP, and CNP.

[0032] FIG. 3 presents fluorescence microscopy images depicting Hela cells transfected with sGFP-Linker-ANP, sGFP-Linker-BNP, sGFP-Linker-CNP, and sGFP (green fluorescent protein as control) , demonstrating intracellular localization and expression.

[0033] FIG. 4 demonstrates the cellular uptake of various chimeric proteins by HeLa cells. The figure shows that sGFP, sGFP-Linker-ANP, GFP-Linker-BNP, and sGFP-Linker-CNP are internalized into HeLa cells via endocytosis. These results confirm that the recombinant chimeric proteins are capable of entering cells, which is a key functional aspect of the described platform.

[0034] FIG. 5 presents fluorescence microscopy images that illustrate the degradation of internalized recombinant proteins within HeLa cells. Specifically, the figure compares sGFP-Linker-ANP and sGFP-IgF2mut (used as a positive control) . The images show that, following endocytosis, both sGFP-Linker-ANP and sGFP-IgF2mut undergo degradation within the cells, as evidenced by a reduction in fluorescence intensity over time. This demonstrates the efficacy of the chimeric proteins in mediating intracellular degradation after cell entry.

[0035] FIG. 6 shows fluorescence microscopy images demonstrating the colocalization of recombinant protein chimeras with lysosomes in HeLa cells. Specifically, sGFP-Linker-BNP was analyzed for their subcellular localization following endocytosis.

[0036] FIG. 7 presents fluorescence images of HeLa cells transfected with sGFP-Linker-ANPmut (1–23) and sGFP-Linker-BNPmut (6–22) .

[0037] FIG. 8 provides Western blot analysis showing the degradation profiles of various recombinant proteins in HeLa cells. The figure compares the levels of sGFP, sGFP-Linker-ANPmut (1-23) , GFP-Linker-BNP, and sGFP-IgF2mut (positive control) after cellular uptake. The results indicate a progressive decrease in protein levels for the chimeric constructs over time, confirming that these recombinant proteins are internalized and subsequently degraded within the cells. This supports the functional capability of the described platform for lysosome-mediated protein degradation.

[0038] FIG. 9 shows fluorescence microscopy images demonstrating the colocalization of recombinant protein chimeras with lysosomes in HeLa cells. Specifically, sGFP, sGFP-Linker-ANPmut (1-23) , GFP-Linker-BNP, and sGFP-IgF2mut (positive control) were analyzed for their subcellular localization following endocytosis. The images reveal that, after internalization, the chimeric proteins colocalize with lysosomal markers, providing direct evidence that these recombinant constructs are trafficked to and degraded within the lysosomal compartment. This observation further validates the mechanism of lysosome-mediated degradation employed by the platform.

[0039] FIG. 10 displays fluorescence microscopy images illustrating the binding of recombinant chimeric proteins to NPR-C expressed in CHO-K1 cells. In these experiments, sGFP and sGFP-Linker-ANPmut (4-23) were incubated with CHO-K1 cells engineered to express NPR-C fused to mCherry. The images show distinct colocalization of the recombinant proteins with NPR-C-mCherry on the cell membrane, confirming the specific binding capability of the chimeric constructs to the NPR-C receptor in a cellular context.

[0040] FIG. 11 presents fluorescence microscopy images that demonstrate the internalization of recombinant chimeric proteins into CHO-K1 cells via NPR-C-mediated endocytosis. Specifically, sGFP and sGFP-Linker-ANPmut (4-23) were incubated with CHO-K1 cells expressing NPR-C-mCherry. The images show that sGFP-Linker-ANPmut (4-23) , but not sGFP alone, is efficiently internalized into the cells through a process dependent on NPR-C, providing direct evidence of receptor-mediated uptake for the engineered chimera.

[0041] FIG. 12 displays fluorescence microscopy images illustrating the binding specificity of different recombinant chimeric proteins to NPR-A in CHO-K1 cells. In these experiments, sGFP-Linker-ANP, sGFP-Linker-ANPmut (4-23) , and sGFP-Linker-ANP (4-23+S6Q) were incubated with CHO-K1 cells engineered to express NPR-A fused to mCherry. The results show that only sGFP-Linker-ANP (wild-type) demonstrates clear colocalization with NPR-A-mCherry on the cell membrane, whereas the truncated or mutated variants exhibit little to no binding. This confirms the altered binding affinities of the engineered variants and highlights the specificity of the wild-type construct for NPR-A.

[0042] FIG. 13 shows the results of affinity measurements for various recombinant chimeric proteins binding to NPR-C in CHO-K1 cells. Using flow cytometry, the binding affinities of sGFP, GFP-Linker-ANP, sGFP-Linker-ANPmut (1-23) , sGFP-Linker-ANPmut (4-23) , sGFP-Linker-ANP (4-23+S6Q) , sGFP-Linker-ANP (4-23+R4K) , sGFP-Linker-ANP (4-23+R14K) , sGFP-Linker-ANP (4-23+S6M+R4C) , and sGFP-Linker-ANP (4-23+R14K+R4V) to NPR-C-mCherry were quantitatively assessed. The data reveal differential binding strengths among the constructs, with most truncated and point-mutant variants exhibiting higher affinity for NPR-C compared to wild-type ANP. Notably, the S6M+R4C double mutant (sGFP-Linker-ANP (4-23+S6M+R4C) ) exhibited reduced binding to NPR-C relative to other variants, likely due to disruption of the cyclic structure by introduction of a cysteine at position 4. These findings validate the design strategy for enhancing NPR-C binding and demonstrate the capability of the engineered chimeras to selectively engage the NPR-C receptor in a cellular environment.

[0043] FIG. 14 presents flow cytometry–based measurements of recombinant chimeric protein binding to NPR-A in CHO-K1 cells transfected with NPRA-mCherry. Specifically, the figure compares the binding of GFP-ANP (WT) , GFP-ANPmut (1–23) , GFP-ANPmut (4–23) , GFP-ANP (4–23+S6Q) , GFP-ANP (4–23+R4K) , GFP-ANP (4–23+R14K) , GFP-ANP (4–23+S6M+R4C) , and GFP-ANP (4–23+R14K+R4V) across a concentration range, reporting the GFP median fluorescence intensity within the mCherry-positive (NPRA-expressing) population. While GFP-ANP (WT) exhibits robust, concentration-dependent binding to NPR-A, all truncated and point-mutant variants-including those with single or double amino acid substitutions-display minimal or no detectable binding over the same range. These quantitative results corroborate the fluorescence microscopy observations in FIG. 12, confirm that engineered ANP truncations and point mutations broadly diminish NPR-A engagement relative to wild-type ANP, and further support selective targeting of the NPR-C pathway by the chimeras described herein.

[0044] FIG. 15 illustrates the results of an in vivo degradation assay assessing the functional activity of the MS2-specific Nb-ANP (1–23) lysosomal targeting chimera in mice. The figure shows that co-administration of MS2 VLPs with Nb-ANP (1–23) markedly accelerates clearance of VLP-encapsulated SARS-CoV-2 RNA from the circulation, as evidenced by increasedΔCq values relative to control groups lacking the ANP lysosomal targeting domain. These findings demonstrate that the engineered chimera mediates targeted lysosomal degradation of VLP substrates in a living organism, thereby supporting its therapeutic potential and translational relevance for eliminating pathogenic molecules in vivo.

[0045] FIG. 16 presents flow cytometry analysis (FACS) results demonstrating the internalization of target proteins mediated by antibody-Linker-ANP chimeras in NPR-C-overexpressing cells. Specifically, the figure shows that tumor necrosis factor (TNF, e.g., TNF-α) labeled with Alexa-488 was pre-mixed with either a TNF-α-specific antibody-Linker-ANP chimera (Adalimumab-Linker-ANP1–23) or left uncomplexed, and then added to CHO-K1 cells engineered to overexpress NPR-C-mCherry. Additional controls included treatment with 400 nM GFP-Linker-ANP1–23 or 400 nM GFP alone. After incubation at 37℃ for 24 hours, flow cytometry was used to assess Alexa-488 fluorescence in the mCherry-positive cell population. The results show that, in cells treated with the Adalimumab-Linker-ANP1–23 chimera, the Alexa-488 fluorescence signal was significantly reduced relative to TNF-αalone, indicating effective internalization and degradation of TNF-αmediated by NPR-C engagement. Controls lacking the ANP targeting domain or NPR-C expression did not show this effect. This analysis confirms that the engineered chimeras mediate targeted uptake and lysosomal degradation of disease-associated proteins through NPR-C in a cellular context.

[0046] FIG. 17 presents Western blot analyses from a pulse-chase experiment demonstrating NPR-C-mediated internalization and subsequent degradation of target proteins by antibody-Linker-ANP chimeras in NPR-C-overexpressing cells. Specifically, CHO-K1 cells engineered to express NPR-C were incubated for 24 hours with tumor necrosis factor (TNF, e.g., TNF-α) in the presence of a TNF-α-specific antibody-Linker-ANP chimera to permit ternary complex formation and cellular uptake. Following removal of extracellular TNF-αand chimera, cell lysates collected over defined chase intervals exhibited a time-dependent decrease in intracellular TNF-αsignal by Western blot analysis, indicating rapid lysosomal degradation of the internalized target. These results corroborate the internalization findings in FIG. 16 and confirm that the engineered chimeras mediate targeted uptake and degradation of disease-associated proteins through NPR-C engagement in a cellular context.DETAILED DESCRIPTIONI. INTRODUCTION

[0047] This disclosure generally relates to compositions and methods for the selective degradation of biomolecules using engineered chimeric constructs. More specifically, the invention provides materials and strategies for mediating targeted lysosomal degradation of disease-associated proteins and other biomolecules in a highly modular and programmable manner.

[0048] Effective therapeutic intervention against pathological proteins-particularly those present on the cell surface, secreted into the extracellular environment, or otherwise resistant to traditional inhibition-would benefit from systems that combine high specificity, rapid and efficient cellular uptake, minimal immunogenicity, and broad applicability to diverse molecular targets. Ideally, such systems would also permit fine-tuning of pharmacokinetic properties and provide a platform adaptable to a wide array of disease contexts, including cancer, neurodegeneration, autoimmunity, metabolic syndromes, and infectious diseases.

[0049] Achieving this combination of characteristics has proven challenging for existing approaches. Many modalities, such as conventional small-molecule inhibitors or antibody therapies, are limited by incomplete selectivity, inability to address non-enzymatic or scaffold proteins, or poor cellular internalization. Proteasome-based degradation technologies are typically restricted to intracellular targets and are not readily adaptable to extracellular or membrane-associated proteins. Lysosome-targeting strategies, while conceptually promising, often suffer from limited specificity for endocytic receptors, rapid clearance, suboptimal engagement of the desired degradation pathway, or undesirable immune responses.

[0050] Surprisingly, the chimeric molecules provided herein-comprising an NPR-C binding domain linked to a target-binding domain-overcome these longstanding obstacles. By exploiting the endogenous trafficking and recycling features of the natriuretic peptide receptor C (NPR-C) pathway, these constructs enable the efficient internalization and lysosomal processing of a wide range of targets, including those previously considered “undruggable. ” The modular design allows for the selection of NPR-C-binding variants with enhanced specificity and reduced off-target effects, as well as the incorporation of diverse target-binding domains tailored to virtually any extracellular or membrane-associated molecule of interest.

[0051] This dual-targeting mechanism not only increases the efficiency and selectivity of biomolecule clearance, but also reduces immunogenicity and preserves the physiological functions of endogenous natriuretic peptides. The platform’s flexibility and performance represent a significant advance over existing technologies, offering new opportunities for the development of next-generation therapeutics and research tools. II. DEFINITIONS

[0052] Unless specifically indicated otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by those of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs. In addition, any method or material similar or equivalent to a method or material described herein can be used in the practice of the present disclosure. For purposes of the present disclosure, the following terms are defined.

[0053] As used herein, the singular forms “a, ” “an, ” and “the” include plural referents unless the content clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “a phospholipid” optionally includes a combination of two or more phospholipids, and the like. Furthermore, references herein to a plurality (i.e., two or more) of a material or a population of a material can indicate that multiple units of the material are present, where the multiple units are copies (e.g., identical or essentially identical copies) of one another. Alternatively, references to a plurality (i.e., two or more) of a material or a population of a material can indicate that multiple species of the material are present, where the multiple species can themselves each independently be represented by a single unit or by multiple units. Thus, for example, reference to two or more phospholipids can indicate that multiple molecules of the same phospholipid compound are present, or can indicate that multiple different types of phospholipid compounds are present, each independently in the form of one or more individual molecules.

[0054] As used herein, the term “and / or” refers to and encompasses any and all possible combinations of one or more of the associated listed items, as well as the lack of combinations when interpreted in the alternative ( “or” ) .

[0055] As used herein, the terms “including, ” “comprising, ” “having, ” “containing, ” and variations thereof, are inclusive and open-ended and do not exclude additional, unrecited elements or method steps beyond those explicitly recited. As used herein, the phrase “consisting of”is closed and excludes any element, step, or ingredient not explicitly specified. As used herein, the phrase “consisting essentially of” limits the scope of the described feature to the specified materials or steps and those that do not materially affect the basic and novel characteristics of the disclosed feature.

[0056] As used herein, the term “optional” or “optionally” means that the subsequently described event, circumstance or substituent may or may not occur, and that the description includes instances where the event or circumstance occurs and instances where it does not.

[0057] As used herein, the term “chimeric molecule” refers to a synthetic or recombinant molecular entity that comprises at least two distinct segments, domains, moieties, or polypeptides, which are covalently or otherwise joined to form a single, contiguous structure. As used herein, a “chimeric molecule” includes, but is not limited to, a “fusion protein” (i.e., a single polypeptide in which two or more functional domains, peptides, or proteins are joined in-frame, whether derived from the same or different origins, sequences, or species) , as well as molecules in which the joined segments may be from the same or different proteins, genes, or species, or may be synthetic or engineered. The terms “chimeric molecule, ” “fusion molecule, ” “fusion protein, ” and “fusion polypeptide” are used interchangeably throughout this specification and claims, except where context otherwise requires. The constituent segments of the chimeric molecule retain at least a portion of the functional, structural, or antigenic characteristics of their respective original sources, and the resulting chimeric molecule exhibits properties, activities, or functionalities that are not naturally found in any single native molecule. Such chimeric molecules may include, but are not limited to, polypeptides, nucleic acids, small molecules, or other biologically relevant compounds, and may be designed to confer novel or enhanced biological, therapeutic, diagnostic, or research utilities as compared to their individual, non-chimeric counterparts.

[0058] As used herein, the term “binding domain” refers to any functional unit, segment, moiety, or module of a molecule that specifically binds a target (for example, a receptor or ligand) , and may be a discrete portion of a larger protein or peptide, a full-length protein or peptide, a fusion segment, or a multimerized unit. A binding domain may comprise, consist essentially of, or consist of a polypeptide sequence, including native sequences, truncations, variants, orthologs, analogs, or engineered sequences, so long as the unit confers the intended binding function. Accordingly, a binding domain can be, by way of example, a natriuretic peptide protein (ANP, BNP, CNP) , a fragment thereof, or a variant thereof that retains NPR-C binding.

[0059] As used herein, the term “linker” refers to a molecular segment, spacer, or chemical moiety that covalently or non-covalently connects two or more distinct molecular entities, domains, or functional groups within a single compound, thereby facilitating their spatial orientation, structural integrity, or cooperative function. The linker may be composed of natural or synthetic materials, including but not limited to, amino acids, nucleotides, polyethylene glycol, alkyl chains, aromatic groups, or other suitable chemical structures. The length, composition, and flexibility of the linker can be tailored to achieve desired physical, chemical, or biological properties, such as optimizing the distance, conformational dynamics, or interaction between the joined entities. Linkers are commonly employed in the design of chimeric molecules, conjugates, fusion proteins, antibody-drug conjugates, or other multifunctional constructs to enhance stability, bioavailability, activity, or specificity relative to the unlinked components.

[0060] As used herein, the terms “sequence identity, ” “percent identity, ” “percent alignment, ” and the like refer to the degree of sequence similarity between two nucleic acid or amino acid sequences, expressed as a percentage, and determined by comparing the sequences after optimal alignment. Percent identity is calculated by aligning a candidate sequence and a reference sequence, and determining the proportion of identical residues (nucleotides or amino acids) at corresponding positions within the alignment, typically over the entire length of the reference sequence or over a defined region thereof. Optimal alignment of sequences for comparison may be performed by any method known in the art, including, without limitation, computerized sequence alignment algorithms such as the local homology algorithm of Smith and Waterman (Add. Appl. Math. 2 (1981) : 482) , the global alignment algorithm of Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48 (1970) : 443) , the similarity search method of Pearson and Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) : 2444) , or by implementations of these or similar algorithms in software tools such as BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) , BLAST 2.0, or other commercially available or publicly accessible sequence analysis platforms. Percent identity may also be calculated by manual alignment and visual inspection, provided the alignment is performed according to accepted principles in the art. When using alignment algorithms, default parameters may be employed unless otherwise specified, including gap penalties, scoring matrices, word size, and statistical thresholds as commonly utilized for nucleotide or protein sequence comparison. For example, BLASTN (for nucleotide sequences) commonly uses a word size of 28, expectation value of 10, and scoring parameters of match reward (M) of 1 and mismatch penalty (N) of-2, but alternative parameters may be used as appropriate for the specific comparison. Percent identity may be reported for any specified level, including, but not limited to, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or greater sequence identity to a given sequence. As used herein, “percent identity, ” “sequence identity, ” and “homology” may be used interchangeably, unless context clearly indicates otherwise. Unless otherwise indicated, percent identity is intended to encompass any method or algorithm for sequence comparison recognized in the art, and includes both local and global alignments, statistical analyses of similarity (such as smallest sum probability or expectation value) , and any acceptable measure of the proportion of identical residues between aligned sequences.

[0061] As used herein, the term “variant, ” when referring to a protein, polypeptide, or peptide, refers to a molecule that differs from a reference or wild-type sequence by one or more amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or modifications, whether naturally occurring or introduced by recombinant, chemical, or synthetic methods, provided that the resulting molecule retains at least a portion of the functional, biological, or structural properties characteristic of the reference sequence. Variants may include molecules with conservative or non-conservative amino acid changes, altered glycosylation or other post-translational modifications, fusion to other protein domains, conjugation to polymers or other chemical groups, or incorporation of non-natural amino acids, so long as the variant preserves a relevant activity, such as binding affinity, enzymatic activity, receptor activation, or other biological function as described in the specification and claims. The term “variant” further encompasses orthologs and homologs from other species, as well as engineered forms designed for improved stability, expression, pharmacokinetics, or other desirable properties, provided such forms retain the core functional attributes of the reference protein or peptide. A variant may share at least about 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%sequence identity with the reference sequence, or demonstrate at least about 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%of the reference molecule’s activity in appropriate in vitro or in vivo assays. In all cases, a variant is understood to preserve the essential functional or structural features necessary for its intended use in the context of the materials and methods disclosed herein.

[0062] As used herein, the term “fragment, ” when referring to a protein, polypeptide, or peptide, refers to any molecule including a portion of the full-length reference sequence, which may be contiguous or non-contiguous, and which is shorter than the full-length molecule yet retains at least one functional, biological, or structural property characteristic of the reference sequence. A fragment may include, for example, a functional domain, a binding region, an active site, an epitope, or any segment of the protein or peptide that confers a relevant activity, such as receptor binding, enzymatic activity, signal transduction, or interaction with other molecules as required by the materials and methods disclosed herein. Fragments may result from natural proteolytic processing, engineered truncation, deletion, or chemical synthesis, and may include modified or conjugated forms so long as the fragment preserves at least about 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%of the reference molecule’s desired property or activity. The term “fragment” encompasses molecules that retain the essential function for the intended application, such as binding to a target, triggering a biological response, or facilitating detection, and includes, without limitation, truncated forms, internal deletions, or fusion constructs that preserve the necessary activity as demonstrated by standard assays or functional tests recognized in the art.

[0063] As used herein, the term “truncated variant” refers to a polypeptide that is shorter than a full-length reference sequence (for example, a natriuretic peptide) , with or without additional amino acid substitutions, insertions, or deletions relative to the reference sequence. A truncated variant may be contiguous or non-contiguous and may overlap with what is termed a “fragment, ” provided that it retains at least one functional property of interest (for example, NPR-C binding) . As used in the claims and specification, “truncated variant” encompasses both pure truncations and truncations that further include one or more amino acid changes.

[0064] As used herein, the terms “nucleic acid” and “polypeptide” refer to deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids (RNA) and polymers thereof in either single-or double-stranded form. Unless specifically limited, the term encompasses nucleic acids containing nucleotide analogs or modified backbone residues or linkages, which are synthetic, naturally occurring, and non-naturally occurring, that have similar binding properties as the reference nucleotide and are metabolized in a manner similar to reference nucleotides. Non-limiting examples of nucleotide analogs are described in, e.g., International Patent Application No. WO 2007 / 024708. Examples of nucleic acids having such nucleotide analogs, modified backbone residues, or linkages include, without limitation, those containing phosphorothioates, phosphoramidates, methyl phosphonates, chiral-methyl phosphonates, 2′-O-methyl ribonucleotides, and peptide nucleic acids (PNAs) . Unless otherwise indicated, a particular nucleic acid sequence also implicitly encompasses conservatively modified variants thereof (e.g., degenerate codon substitutions) , alleles, orthologs, single nucleotide polymorphisms (SNPs) , and complementary sequences, as well as the sequence explicitly indicated. Specifically, degenerate codon substitutions may be achieved by generating sequences in which the third position of one or more selected (or all) codons is substituted with mixed-base and / or deoxyinosine (Batzer et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260: 2605; and Rossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8: 91) .

[0065] Non-limiting examples of polynucleotides or nucleic acids include DNA, RNA, coding or noncoding regions of a gene or gene fragment, intergenic DNA, loci (locus) defined from linkage analysis, exons, introns, messenger RNA (mRNA) , transfer RNA (tRNA) , ribosomal RNA (rRNA) , short interfering RNA (siRNA) , short-hairpin RNA (shRNA) , micro-RNA (miRNA) , small nucleolar RNA (snoRNA) , ribozymes, deoxynucleotides (dNTPs) , or dideoxynucleotides (ddNTPs) . Polynucleotides can also include complementary DNA (cDNA) , which is a DNA representation of mRNA, usually obtained by reverse transcription of messenger RNA(mRNA) or by amplification. Polynucleotides can also include DNA molecules produced synthetically or by amplification, genomic DNA (gDNA) , recombinant polynucleotides, branched polynucleotides, plasmids, vectors, isolated DNA of any sequence, isolated RNA of any sequence, nucleic acid probes, or primers. A polynucleotide can comprise modified nucleotides, such as methylated nucleotides, nucleotide analogs, and / or nucleosides suitable for reducing the immunogenicity of RNA, such as those described in International Patent Application No. WO 2007 / 024708. If present, modifications to the nucleotide structure can be imparted before or after assembly of the polymer. The sequence of nucleotides can be interrupted by non-nucleotide components. A polynucleotide can be further modified after polymerization, such as by conjugation with a labeling component. Polynucleotide sequences, when provided, are listed in the 5′to 3′direction, unless stated otherwise.

[0066] Nucleic acids or polynucleotides can be double-or triple-stranded nucleic acids, as well as single-stranded molecules. In double-or triple-stranded nucleic acids, the nucleic acid strands need not be coextensive, for example, a double-stranded nucleic acid need not be double-stranded along the entire length of both strands.

[0067] Nucleic acid modifications can include addition of chemical groups that incorporate additional charge, polarizability, hydrogen bonding, electrostatic interaction, and functionality to the individual nucleic acid bases or to the nucleic acid as a whole. Such modifications include base modifications such as 2′-position sugar modifications, 5-position pyrimidine modifications, 8-position purine modifications, modifications at cytosine exocyclic amines, substitutions of S-bromo-uracil, backbone modifications, unusual base pairing combinations such as the isobases isocytidine and isoguanidine, and the like.

[0068] Nucleic acid (s) can be derived from a completely chemical synthesis process, such as a solid phase-mediated chemical synthesis, from a biological source, such as through isolation from any species that produces nucleic acid, or from processes that involve the manipulation of nucleic acids by molecular biology tools, such as DNA replication, PCR amplification, reverse transcription, in vitro transcription such as described in, e.g., International Patent Application Publication No. WO 2007 / 024708, or from a combination of those processes.

[0069] As used herein, the term “vector” refers to any engineered or naturally occurring carrier, vehicle, or delivery system-including, but not limited to, nucleic acid molecules, viral particles, nanoparticles, liposomes, micelles, virosomes, or nucleic acid complexes-that is adapted or designed to facilitate the transfer, delivery, introduction, maintenance, or expression of one or more heterologous, exogenous, or otherwise non-native nucleic acid sequences, proteins, or other biologically active agents into a target biological system (such as a cell, tissue, organism, or in vitro environment) . A vector as defined herein may be designed for transient or stable delivery, episomal maintenance, or chromosomal integration, and may be configured for expression, silencing, editing, or other modification of genetic material in the target system. Vectors may further include targeting ligands, surface modifications, affinity tags, or other functional moieties to enhance specificity, cellular uptake, subcellular localization, or biological activity.

[0070] As used herein in the context of chimeric molecules and their associated target, the term “contacting” refers to either the direct or indirect in vitro or in vivo delivering of chimeric molecule to the target, e.g., by providing chimeric molecules at or proximate to a location of the target to be contacted. The in vitro contacting may involve, for example, cells in a cell culture or tissue culture. The cell culture or tissue culture may include cells in a suspension and / or adherent cells. The contacted cells may be of same cell type or of two or more different cell types. In some example, different cell types are cultured together before and / or during the contacting with chimeric molecules. In other examples, different cell types are cultured separately. In further examples, one cell type of two or more cell types to be contacted is specifically cultured in the absence of any other cell types of the two or more cell types. The in vivo contacting of a target typically involves administering the chimeric molecules to a subject, where the target is within the body of the subject. In some examples, the administering is proximate to the location of the target within the subject’s body. In other examples, the administering is distal to the location of the target, and the chimeric molecules migrate to the target location.

[0071] As used herein, the term “subject” refers to a vertebrate, and preferably to a mammal. Mammalian subjects for which the provided composition is suitable include, but are not limited to, mice, rats, simians, humans, farm animals, sport animals, and pets. In some embodiments, the subject is human. In some embodiments, the subject is male. In some embodiments, the subject is female. In some embodiments, the subject is an adult. In some embodiments, the subject is an adolescent. In some embodiments, the subject is a child. In some embodiments, the subject is above 10 years of age, e.g., above 20 years of age, above 30 years of age, above 40 years of age, above 50 years of age, above 60 years of age, above 70 years of age, or above 80 years of age. In some embodiments, the subject is less than 80 years of age, e.g., less than 70 years of age, less than 60 years of age, less than 50 years of age, less than 40 years of age, less than 30 years of age, less than 20 years of age, or less than 10 years of age.

[0072] As used herein, the terms “pharmaceutically acceptable excipient” and “pharmaceutically acceptable carrier” refer to a substance that aids the administration of an active agent to and absorption by a subject and may be included in the compositions of the present disclosure without causing a significant adverse toxicological effect on the subject. Non-limiting examples of pharmaceutically acceptable excipients and carriers include water, NaCl, normal saline solutions, normal sucrose, normal glucose, binders, fillers, disintegrants, lubricants, coatings, and the like. One of skill in the art will recognize that other pharmaceutically acceptable excipients and carriers are useful in the present disclosure.

[0073] As used herein, the term “administering” refers to oral administration, administration as a suppository, topical contact, parenteral, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intranasal, subcutaneous, intrathecal, intracerebroventricular, intraparenchymal, subretinal, or intravitreal administration, or the implantation of a slow-release device e.g., a mini-osmotic pump, to the subject.

[0074] As used herein, the term “therapeutically effective amount” refers to an amount or dose of a compound, composition, or formulation that produces therapeutic effects for which it is administered. The exact amount or dose will depend on the purpose of the treatment, and will be ascertainable by one skilled in the art using known techniques (see, e.g., Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1–3, 1992) ; Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999) ; Pickar, Dosage Calculations (1999) ; and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 23rd Edition (2020) , Gennaro, Ed., Lippincott, Williams&Wilkins) .

[0075] As used here, the terms “treat” , “treating” and “treatment” refers to a procedure resulting in any indicia of success in the elimination or amelioration of an injury, pathology, condition, or symptom (e.g., pain) , including any objective or subjective parameter such as abatement; remission; diminishing of symptoms or making the symptom, injury, pathology or condition more tolerable to the patient; decreasing the frequency or duration of the symptom or condition; or, in some situations, preventing the onset of one or more symptoms. The treatment or amelioration of symptoms can be based on any objective or subjective parameter; including, e.g., the result of a physical examination or laboratory test. III. CHIMERIC MOLECULES

[0076] Extensive research has led to the development of platform systems and related compositions for mediating lysosome-dependent degradation of target biomolecules. These systems utilize a chimeric molecule that includes at least one natriuretic peptide receptor C (NPR-C) binding domain and at least one target-binding domain. The NPR-C binding domain is configured to specifically interact with NPR-C, facilitating cell-internal lysosomal processing of the target molecule bound by the target-binding domain. This approach enables rapid, selective, and efficient degradation of a broad range of target molecules, including secreted proteins and membrane-associated proteins. The modular design of these chimeric molecules allows for adaptability to different types of targets and binding modalities. Suitable chimeric molecules can achieve desirable properties such as increased bioavailability and reduced immunogenicity, thereby supporting applications in a variety of disease settings including, but not limited to, cancer, autoimmune disorders, neurodegenerative diseases, metabolic syndromes, and infections caused by pathogens. In certain embodiments, engineered modifications may be incorporated to minimize interference with the physiological functions of endogenous natriuretic peptides, further enhancing the safety and applicability of these materials for research and therapeutic use.

[0077] For illustrative purposes, examples include the design, synthesis, and cellular delivery of chimeric constructs such as sGFP-Linker-ANP, sGFP-Linker-BNP, sGFP-Linker-CNP, and antibody-Linker-ANP, each configured to bind specific targets. In these systems, the NPR-C binding domain-such as a variant of ANP, BNP, or CNP-enables rapid and selective engagement with the NPR-C receptor, promoting efficient endocytosis and subsequent lysosomal processing of the associated target molecule. Upon internalization, the chimeric construct mediates degradation of the linked reporter or target protein, resulting in attenuation or removal of the target’s biological function. Compared to certain existing lysosome-mediated protein degradation strategies, including LYTAC-based approaches, these chimeric molecules may offer advantages such as simplified molecular design, faster degradation kinetics, increased bioavailability, and reduced immunogenicity. In some embodiments, modifications are incorporated to minimize any effect on the physiological roles of endogenous natriuretic peptides. The modularity of this platform supports adaptation to a wide variety of target proteins and binding modalities, enabling the efficient and accurate removal of aberrant proteins implicated in disease. These features collectively facilitate applications in research, biotechnology, and therapeutic settings, where precise and effective clearance of pathogenic biomolecules is desired. A. NPR-C BINDING DOMAIN

[0078] The NPR-C-binding domain refers to the functional unit, segment, or module within a chimera that is capable of specifically binding to the natriuretic peptide receptor C (NPR-C) . This domain may be a discrete portion of a larger protein, a full-length peptide or protein, a fusion segment, or a multimerized unit, and demonstrates preferential and strong affinity for NPR-C while displaying relatively weak binding to other natriuretic peptide receptors, NPR-Aand NPR-B.

[0079] In certain embodiments, the NPR-C-binding domain comprises, consists essentially of, or consists of a polypeptide sequence that specifically recognizes and interacts with NPR-C, including a natriuretic peptide (for example, atrial natriuretic peptide (ANP) , B-type natriuretic peptide (BNP) , or C-type natriuretic peptide (CNP) ) , a fragment thereof, or a variant thereof. Variants can be formed by substituting, deleting (or truncating) , or inserting one or more amino acid residues. Such modifications can enhance the selectivity of binding for NPR-C relative to NPR-A and NPR-B. The chimera may contain one or multiple copies of the NPR-C-binding domain. For example, embodiments may include chimeras bearing 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 copies of the NPR-C-binding domain, tailored to achieve desired binding avidity and function.

[0080] It is understood by those skilled in the art that one or more amino acids may be removed from the N-terminus or C-terminus of a biologically active peptide or protein, or segments of the sequence may be altered, without significantly impacting biological function. Such N-and / or C-terminal deletions or sequence alterations are encompassed within the scope of described variants. These variants include, according to the established principles of the field, deletions, insertions, inversions, duplications, and substitutions, as long as such changes do not adversely affect the activity of the molecule. In this disclosure, ANP, BNP, and CNP proteins refer to all forms of ANP, BNP, and CNP proteins or polypeptides, with preference given to those derived from mammals such as mouse, rabbit, cat, dog, cow, pig, sheep, horse, or human, including analogs, orthologs, homologs, and derivatives.

[0081] ANP, BNP, or CNP protein analogs are ANP, BNP, or CNP proteins from different and unrelated organisms that perform the same function but do not originate from a common ancestral structure. These analogs have evolved independently to perform the same or similar biological activities, meaning that while their amino acid sequences may differ, they achieve the same biological effect.

[0082] Orthologs of ANP, BNP, or CNP proteins refer to sequences that are related through a common ancestral gene in an ancestral species and have since evolved into distinct ANP, BNP, or CNP proteins in different species; these retain functional similarity despite sequence divergence.

[0083] Homologs are ANP, BNP, or CNP proteins from different organisms that fulfill the same function and originate from a shared ancestral structure. Homologous ANP, BNP, or CNP polypeptides typically have highly similar amino acid sequences and execute the same biological activity.

[0084] In certain embodiments, ANP, BNP, or CNP polypeptide homologs may be described as polypeptides that, when compared to reference ANP, BNP, or CNP polypeptides-preferably those provided as SEQ ID NO. 12, 16, or 20-show at least 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity.

[0085] It is preferred that the NPR-C binding domain exhibits greater affinity for NPR-C receptors than for NPR-A or NPR-B receptors. More preferably, compared to naturally occurring ANP, BNP, or CNP proteins, the variants discussed here demonstrate enhanced binding affinity for NPR-C. The ANP protein variant in some embodiments is a truncated form, for example, a sequence corresponding to residues 1–23, 4–23, or 6–20 of SEQ ID NO. 12. One or more positions, such as 4, 6, or 14, may be mutated, including but not limited to: position 4 substitutions of R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, or R4W; position 6 substitutions of S6M or S6Q; and position 14 substitutions of R14P, R14H, or R14K. Some BNP protein variants may be truncated forms, for instance, amino acids 6–22 based on SEQ ID NO. 16, with possible mutations at positions 8, 9, 16, 17, or 18, such as S8N, S8T, S8A, or S8Q at position 8; G9D, G9S, G9I, G9N, G9T, G9Q, G9C, or G9Y at position 9; D16E at position 16; R17Q at position 17;and I18A or I18V at position 18. In some cases, the CNP protein variant is a mutant with one or more substitutions at positions 4 or 7, as referenced to SEQ ID NO. 20, with position 4 substitutions including K4I or K4H, and position 7 substitutions including F7A, F7E, F7G, F7S, F7T, F7Y, F7Q, F7R, or F7K. Unless expressly stated otherwise, references herein to a “truncated variant” include both a sequence that is shortened relative to a full-length reference without additional amino acid changes, and a sequence that is shortened and further includes one or more amino acid substitutions, insertions, or deletions, provided the variant retains the intended functional property (for example, NPR-C binding) .

[0086] In certain embodiments, the ANP protein, BNP protein, or CNP protein may be wild-type proteins, for example those derived from mammals such as mouse, rabbit, cat, dog, cow, pig, sheep, horse, or human.

[0087] In certain embodiments, the ANP protein, BNP protein, or CNP protein may respectively comprise the amino acid sequences indicated as SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 16, and SEQ ID NO. 20, or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto, and preferably at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity.

[0088] In certain embodiments, the ANP protein, BNP protein, or CNP protein may be encoded by nucleotide sequences comprising SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 15, and SEQ ID NO. 19, respectively, or by nucleotide sequences having at least 80%sequence identity thereto, and preferably at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity.

[0089] In certain embodiments, variants of the ANP or BNP protein may be truncated variants. For example, a truncated variant of ANP protein may comprise the amino acid sequence of positions 1–23, 4–23, or 6–20, with numbering based on the human ANP amino acid sequence (for example, as set forth in SEQ ID NO. 12) . A truncated variant of BNP protein may comprise the amino acid sequence of positions 6–22, numbered according to the human BNP amino acid sequence (for example, as set forth in SEQ ID NO. 16) .

[0090] In certain embodiments, the truncated ANP variant may comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 14 (i.e., ANPmut (1–23) ) and, optionally, include one or more substitutions selected from R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, R4W, S6M, S6Q, R14P, R14H, and R14K. These substitutions may be present at one, two, or all three positions (positions 4, 6, and 14) , with numbering based on the amino acid sequence of SEQ ID NO. 12. As merely illustrative examples, the truncated ANP variant may contain substitutions such as S6M, S6Q, R4C, R14P, R14H, S6M+R4C, S6M+R14P, S6M+R14H, S6Q+R4C, S6Q+R14P, S6Q+R14H, R4C+R14H, R4C+R14P, S6M+R4C+R14H, S6Q+R4C+R14H, S6M+R4C+R14P, S6Q+R4C+R14P, or any other combination of substitutions among these three positions.

[0091] In certain embodiments, the truncated ANP variant may comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 30 (i.e., ANPmut (4–23) ) and optionally include one or more of the following substitutions: R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, R4W, S6M, S6Q, R14P, R14H, and R14K, with residue numbering based on SEQ ID NO. 12. For example, the truncated variant may contain any of the above individual substitutions or any combination of substitutions at the three positions (positions 4, 6, and 14) , including two or all three of these sites.

[0092] In certain embodiments, the truncated ANP variant may comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 32 (i.e., ANPmut (6–20) ) and optionally include one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R14P, R14H, and R14K. Such substitutions may occur at position 6, position 14, or both, for example, S6M, S6Q, R14P, R14H, R14K, S6M+R14P, S6M+R14H, S6M+R14K, S6Q+R14P, S6Q+R14H, or S6Q+R14K, with numbering based on SEQ ID NO. 12.

[0093] In certain embodiments, the truncated BNP variant may comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 18 (i.e., BNPmut (6–22) ) and optionally include one or more substitutions selected from S8N, S8T, S8A, S8Q, G9D, G9S, G9I, G9N, G9T, G9Q, G9C, G9Y, D16E, R17Q, I18V, and I18A. These may be present individually or in any combination among positions 8, 9, 16, 17, and 18. Possible combinations include, for example: G9C+I18V, G9C+D16E, G9Y+I18V, G9Y+D16E, D16E+I18V, G9C+R17Q, G9Y+R17Q, R17Q+I18V, D16E+R17Q, G9C+D16E+I18V, G9Y+D16E+I18V, G9C+R17Q+I18V, D16E+R17Q+I18V, G9C+D16E+R17Q, G9Y+D16E+R17Q, G9Y+D16E+R17Q+I18V, or G9C+D16E+R17Q+I18V, with residue numbering based on SEQ ID NO. 16.

[0094] In certain embodiments, the CNP variant may comprise the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 20 and optionally include one or two substitutions from K4I, K4H, F7A, F7E, F7G, F7S, F7T, F7Y, F7Q, F7R, and F7K. Examples include any individual substitution among these, or any combination of two substitutions, such as K4I+F7A, K4I+F7E, K4I+F7G, K4I+F7S, K4I+F7T, K4I+F7Y, K4I+F7R, K4I+F7K, K4H+F7A, K4H+F7E, K4H+F7G, K4H+F7S, K4H+F7T, K4H+F7Y, K4H+F7R, K4H+F7K, K4I+F7Q, or K4H+F7Q, with numbering based on SEQ ID NO. 20.

[0095] The NPR-C binding domain in the chimera provided herein specifically binds to the NPR-C receptor.

[0096] In certain embodiments, the NPR-C binding domain binds to the NPR-C receptor with weaker binding to NPR-A and NPR-B receptors. In some embodiments, the NPR-C binding domain exhibits increased affinity for NPR-C and reduced affinity for NPR-A and NPR-B receptors. In certain embodiments, the NPR-C binding domain binds to NPR-C but does not bind to NPR-A and NPR-B receptors.

[0097] It is known in the field that there are established methods for determining the affinity between ANP protein, BNP protein, or CNP protein and their receptors (such as NPR-A, NPR-B, and NPR-C) .

[0098] Affinity can be measured using surface plasmon resonance technology. This is a real-time, label-free detection method that can dynamically monitor the entire process of biomolecular interactions. Using a nanoscale thin film to adsorb the "bait protein, " when the analyte protein binds the bait, the resonance property of the film changes, and the binding can be detected.

[0099] Affinity can also be measured using biolayer interferometry technology. This is a real-time, label-free detection method that can be used to analyze interactions between molecules, including affinity and kinetic parameters.

[0100] Other methods for measuring affinity include pull-down assays, co-immunoprecipitation, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) , flow cytometry, temperature-dependent intensity variation, isothermal titration calorimetry (ITC) , and time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET) , among others.

[0101] Additionally, for NPR-C receptor affinity, one can determine activity toward NPR-A / NPR-B by measuring cGMP levels. When NPR-A / NPR-B binds with ANP / BNP / CNP, downstream cGMP levels increase. By monitoring changes in cGMP concentration, affinity toward NPR-C can be inferred indirectly.

[0102] Comparing the relative affinity of ANP, BNP, CNP, or their variants for different receptors (e.g., NPR-A, NPR-B, and NPR-C) , it is preferable to enhance affinity for NPR-C and decrease affinity for NPR-A or NPR-B.

[0103] NPR-C-binding domains, target-binding domains, and chimeric polypeptides described herein are not limited to human or mammalian sequences, but may be derived from, or adapted for, any vertebrate or invertebrate species. Homologs, orthologs, and synthetic analogs from non-human primates, rodents, livestock, companion animals, or other species may be employed, particularly for veterinary applications or for use in preclinical models. In some embodiments, chimeric molecules are designed to be compatible with the NPR-C receptor of a particular species or to possess cross-reactivity among NPR-C orthologs from multiple species. B. TARGET

[0104] In this disclosure, the term “target” refers to any substance that can be degraded by the lysosomal pathway, such as proteins, lipids, saccharides, or their resulting complexes and modifications. In certain embodiments, the target can be an extracellular, cell membrane-bound, or intracellular molecule, including proteins such as secreted proteins, soluble proteins, transmembrane proteins (for example, carrier proteins) , exosome, or components derived from pathogens such as bacteria, viruses, fungi, protozoa, and others. In some embodiments, the cell may be a mammalian cell, for example, a cell from mouse, rabbit, cat, dog, cow, pig, sheep, horse, or human. In some embodiments, the cell may be a tumor cell, immune cell, stem cell, neuronal cell, muscle cell, endothelial cell, epithelial cell, adipocyte, glial cell, fibroblast, islet cell, osteocyte, or chondrocyte.

[0105] In certain embodiments, the target may be a cell surface receptor protein such as a receptor tyrosine kinase, G protein coupled receptor (GPCR) , ion channel, soluble cytokine receptor, immune checkpoint receptor, lectin, complement, lipoprotein, transport protein, MHC class I or class II molecule, cytokine, growth factor, signaling protein, transcription factor, chemokine and / or its receptor, hormone, toxin, enzyme, antigen, viral protein, glycoprotein, or any fragment or subunit of the foregoing.

[0106] In certain embodiments, the target may be any substance that causes disease, such as proteins, lipids, saccharides, or the complexes and modifications they form. In some embodiments, the target may be a molecule, for example a protein, that is involved in the pathogenesis of cancer, neurodegenerative diseases, inflammatory diseases, autoimmune diseases, metabolic syndrome, cardiovascular diseases, respiratory diseases, digestive diseases, renal diseases, hematological diseases, infectious diseases, or rare diseases.

[0107] In certain embodiments, the target includes, but is not limited to, tumor necrosis factor (TNF proteins, e.g., TNF-α) , members of the tumor necrosis factor family including tumor necrosis factor-like ligand 1A (TL1A / TNFSF15) ; members of the interleukin family including interleukin 17 (IL17) and interleukin 23 (IL23) ; epidermal growth factor receptor (EGFR) ; programmed death ligand 1 (PD-L1) ; human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) ; G protein-coupled receptors (GPCRs) ; fibroblast growth factor receptor (FGFR) ; vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) ; cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4 (CTLA-4) ; interleukin-5 receptor α subunit (IL-5Rα) ; immunoglobulin A (IgA) ; immunoglobulin G (IgG) ; immunoglobulin M (IgM) ; immunoglobulin D (IgD) ; immunoglobulin E (IgE) ; pathogenic autoantibodies; galactose-deficient IgA (Gd-IgA) ; cluster of differentiation 19(CD19) ; cluster of differentiation 44 (CD44) ; cluster of differentiation 47 (CD47) ; tumor-associated calcium signal transducer 2 (TACSTD2) ; mesothelin; glypican-3 (GPC3) ; integrin-associated protein (IAP) ; integrin; discoidin domain receptor (DDR) ; cytoskeleton-associated protein 4 (CKAP4) ; carbonic anhydrase IX (CAIX) ; secreted phosphoprotein 1 (SPP1) ; transthyretin (TTR) and misfolded transthyretin (ATTR) ; Activin E (ActE) , Activin receptor like kinase 7 (ALK7) , transmembrane protein 158 (TMEM158) ; carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 (CEACAM5) , or a combination thereof. C. TARGET-BINDING DOMAIN

[0108] In this disclosure, the target-binding domain refers to the molecule or segment within the chimera that can specifically bind to the target, such as a protein or a small molecule etc., capable of binding the target; for example, a small molecule inhibitor, antagonist, ligand, antibody, polypeptide, or nucleic acid aptamer that binds the target molecule. The target, upon binding to the target-binding domain, is delivered to the lysosome, where it is then degraded.

[0109] The chimeras described herein may comprise one or more copies of the target-binding domain, for example, containing 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 copies of the target-binding domain.

[0110] In certain embodiments, the small molecule that binds the target may be an enzyme inhibitor, receptor agonist / antagonist, ion channel modulator, tyrosine kinase inhibitor, VEGF inhibitor, mTOR inhibitor, or MEK inhibitor.

[0111] In certain embodiments, the target-binding domain may be a small molecule inhibitor or antagonist of VEGF, a small molecule inhibitor or antagonist of EGFR protein, VEGFR protein, FGFR2 protein, or FGFR3 protein, a small molecule inhibitor or antagonist of TNF protein (for example, TNF-α) , or a small molecule inhibitor or antagonist of PD-L1.

[0112] In certain embodiments, the target-binding domain may be an antibody or an antigen-binding fragment thereof that targets the target molecule.

[0113] In certain embodiments, the antibody may be IgG (such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4) , IgM, IgA (such as IgA1 and IgA2) , IgD, or IgE antibodies. In certain embodiments, the antibody may be a monoclonal or polyclonal antibody. In certain embodiments, the antibody may be a genetically engineered antibody that does not exist in nature. In certain embodiments, the antibody may be a single-chain antibody, humanized antibody, chimeric antibody, CDR-grafted antibody, human antibody, bispecific antibody, trispecific antibody, nanobody, and the like.

[0114] In certain embodiments, the antigen-binding fragment may be any antigen-binding fragment of the antibody described herein. The antigen-binding fragment may be any portion of the antibody comprising at least one antigen-binding site, including but not limited to Fab, F (ab') 2, scFv, dsFv, scFv Fc, . VHH, or HH-Fc D. LINKER

[0115] In certain embodiments, the NPR-C binding domain and the target-binding domain are connected via a linker. Multiple copies of the NPR-C binding domain and the target-binding domain may also be connected by linkers. As described herein, the linker is a stable linker that can confer stability to the chimera of the present invention. For example, the linker is not degraded and thus can effectively connect the NPR-C binding domain and the target-binding domain.

[0116] In some embodiments, the linker is a GS linker. In certain embodiments, the GS linker has a (GxS) n structure, where x refers to a number of consecutive glycines, with x being any integer from 1 to 10; n refers to the number of repeats of the GxS sequence, with n being any integer from 1 to 10.

[0117] In some embodiments, the linker can be an Fc domain of an antibody (for example, IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE, including subclasses such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, as well as IgA1 and IgA2) ; for example, the linker may comprise the hinge-CH2-CH3 Fc domain derived from a human IgG4 antibody or a human IgG1 antibody.

[0118] In certain embodiments, the linker is functional. For example, but not limited to, the linker can serve to improve folding and / or stability, enhance expression, improve pharmacokinetics, and / or enhance the biological activity of the chimera of the invention. In some embodiments, the linker may function to direct the chimera to the lysosomal degradation pathway.

[0119] In certain embodiments, the linker is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO. 10. E. PRODUCTION OF CHIMERAS

[0120] It is understood by those skilled in the art that chimeras may be produced by any method capable of generating proteins, polypeptides, or compounds, including biological methods, chemical methods, or physical methods.

[0121] In certain embodiments, a chimera can be produced by recombinant protein expression using genetic engineering techniques. The gene encoding the target chimera is inserted into an appropriate expression vector, which is then introduced into a host cell for expression. The expressed chimera can be separated and purified from the host cells using a variety of biochemical techniques.

[0122] In some embodiments, the host cell may be a prokaryotic cell (for example, Escherichia coli, Bacillus, Lactobacillus, Streptomyces) , a yeast cell (for example, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Schizosaccharomyces pombe, Candida utilis, Hansenula polymorpha, Debaryomyces hansenii, Arxula adeninivorans) , a plant cell (for example, tobacco, rice, carrot, alfalfa, lettuce, soybean) , a eukaryotic mammalian cell (for example, HEK293, HEK293T, HEK293F, HEK293S, HEK293H, CHO, Hela, BHK, HT-1080, PER. C6, CAP, HKB-11, HuH-7, NS0, Sp2 / 0) , or an insect cell (for example, Sf9, Mimic Sf9, Sf21, High Five) .

[0123] In certain embodiments, a chimera may be produced by chemical synthesis. Different amino acids are assembled in a specific sequence through steps such as esterification, acidolysis, and deprotection, thus enabling the incorporation of unnatural amino acids or various types of complex post-translational modifications. Common synthesis methods include solid-phase synthesis, liquid-phase synthesis, hybrid methods, photochemical methods, microwave methods, enzymatic methods, among others.

[0124] In some embodiments, the production of a chimera may involve a chemo-enzymatic or semi-synthetic approach. One or more peptide segments are first synthesized chemically. Then, genetic engineering in host cells is used to express part or all of the desired chimera. Finally, the chemically synthesized short peptide is joined with the recombinantly expressed protein by specific chemical or enzymatic reactions to form the complete chimera. This method allows precise control over the sequence and function of the chimera while taking advantage of genetic engineering to enhance yield and reduce cost.

[0125] In certain embodiments, a chimera may be indirectly produced by transfection with messenger RNA (mRNA) . mRNA encoding the chimera is delivered in vivo, and the recipient’s own cells translate the mRNA into the desired chimeric protein directly within the cytoplasm, enabling rapid expression of the chimera. The chimera is subsequently released outside the cell, where it can target NPR-C and the target molecule, thereby achieving degradation of the target protein.

[0126] In some embodiments, a chimera may also be produced indirectly by direct in vivo delivery of coding sequences. This approach involves a variety of delivery systems, including naked plasmid DNA delivery, viral vector delivery (adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus) , non-viral vector delivery (lipids, polymers, inorganic materials) , and physical delivery methods (needle-free injection, microneedles, gene gun, electroporation, ultrasound) , among others. F. MODULAR AND COMBINATORIAL ADAPTATIONS

[0127] The described platform is highly modular and can be adapted to incorporate a wide variety of NPR-C-binding domains, target-binding domains, linkers, and additional functional elements. Any NPR-C-binding peptide, whether derived from naturally occurring or synthetic sequences, and any target-binding domain, including but not limited to antibodies (of any isotype or subclass) , nanobodies, aptamers, affibodies, DARPins, scFv, Fab fragments, single-domain antibodies, or ligand mimetics, may be used in any combination. In certain embodiments, the chimeric molecule may comprise more than one NPR-C-binding domain and / or more than one target-binding domain to enhance avidity, multivalency, or target cross-linking.

[0128] The linker component may be selected from flexible, semi-rigid, or rigid linkers; may include protease-sensitive, pH-sensitive, or redox-sensitive cleavage sites; and may be of variable length to optimize spatial orientation and function. In some embodiments, the linker may comprise sequences that are cleaved in the endosomal or lysosomal compartment, thereby releasing the target-binding domain or enabling additional biological effects. Linkers may further contain sequence motifs or chemical modifications conferring improved stability, solubility, or resistance to proteolysis.

[0129] In certain embodiments, additional functional domains may be incorporated into the chimeric molecule, such as tags for purification or detection (e.g., His-tag, FLAG-tag, Strep-tag, HA-tag, Myc-tag) , half-life extension elements (e.g., Fc, albumin-binding domain, XTEN, PAS) , or domains imparting immunomodulatory, catalytic, or signaling functions. The order and composition of domains may be varied, and domains may be arranged in tandem, alternating, or branched architectures. IV. NUCLEIC ACIDS AND VECTORS

[0130] In another aspect, the disclosure provides nucleic acids that encode any of the NPR-C-binding peptides, target-binding domains, linkers, and single-chain chimeric polypeptides described throughout this document, including chimeras comprising an NPR-C-binding domain operably linked to a target-binding domain. In certain embodiments, a DNA or RNA construct comprises a heterologous promoter operably linked to a polynucleotide encoding a polypeptide selected from: an NPR-C-binding peptide (for example, a variant of ANP, BNP, or CNP as set forth herein) , a target-binding domain (for example, an antibody or fragment, aptamer, ligand, or small-molecule binding polypeptide) , a linker (for example, SEQ ID NO. 10) , or a fusion polypeptide that includes any combination of these components in a single open reading frame. In some embodiments, the nucleic acid encodes a chimeric polypeptide comprising an NPR-C-binding domain, a linker, and a target-binding domain arranged in any order that preserves function, such as NPR-C-binding domain–linker–target-binding domain or target-binding domain–linker–NPR-C-binding domain.

[0131] Expression cassettes are also provided for expression in prokaryotic or eukaryotic cells and in vivo. An expression cassette can include, in 5′ to 3′ order, a transcriptional promoter, a translational initiation region, a coding sequence for any polypeptide described herein, and a transcriptional and translational termination region. Regulatory elements may include promoters, enhancers, introns, polyadenylation signals, transcriptional terminators, mRNA stability elements (for example, WPRE) , 5′ and 3′ untranslated regions (UTRs) , internal ribosome entry sites (IRES) , and self-cleaving peptide elements (for example, 2A sequences) to enable bicistronic or multicistronic expression. In certain embodiments, expression cassettes include sequences configured to reduce innate immune recognition of delivered RNA or DNA (for example, sequences that reduce activation of TLR7, TLR8, TLR9, RIG-I, MDA5, or DAI) , sequences enabling episomal maintenance, or elements that support targeted genomic integration.

[0132] A wide range of promoters can be used to direct expression of the coding sequences described. Promoters can be constitutive, tissue-selective, cell state–selective, developmentally regulated, or inducible. Examples include ubiquitous promoters such as CMV, EF1α, PGK, CAG, and RSV; liver-selective promoters such as albumin and transthyretin; muscle-selective promoters such as MCK and desmin; hematopoietic or myeloid promoters such as CD68 and M-CSFR; endothelial promoters such as VE-cadherin and Tie2; neuronal or glial promoters such as synapsin and GFAP; and inducible promoters such as tetracycline-or rapamycin-responsive systems. Enhancers, insulators, or scaffold / matrix attachment regions can be included to modulate expression.

[0133] Translation efficiency and RNA stability elements can be incorporated to improve expression of the encoded polypeptide. Representative elements include optimized Kozak sequences, leader peptides to support secretion, tailored 5′ UTRs and 3′ UTRs, RNA stabilizing elements (for example, WPRE) , and selected polyadenylation signals (for example, SV40, bGH) . In some embodiments, an expression cassette comprises multicistronic configurations using IRES elements or 2A peptides to co-express, for example, an NPR-C-binding peptide with a target-binding domain subunit, a reporter, or a selection marker for manufacturing or analytical purposes.

[0134] Coding sequences can be arranged to express the NPR-C-binding domain and the target-binding domain as a single open reading frame separated by a peptide linker, or as multiple polypeptides co-expressed from a single vector. The order of domains can be varied, and linkers can be flexible, rigid, enzymatically cleavable, pH-responsive, or otherwise functional to facilitate folding, stability, receptor engagement, or intracellular processing. Optional affinity or detection tags (for example, His, FLAG, HA, Myc) can be included for manufacturing or analytical purposes and removed or masked by proteolysis or formulation, if desired.

[0135] Signal peptides, targeting sequences, multimerization domains, and half-life extension motifs can be encoded to tailor distribution, activity, and pharmacokinetics. In certain embodiments, the nucleic acid encodes a secretory signal peptide (for example, an Igκ-chain leader or other mammalian leader sequence) to drive secretion of the chimeric polypeptide. In other embodiments, the nucleic acid encodes an Fc region, an albumin-binding domain, an XTEN or PAS sequence, or other half-life extension module. In further embodiments, transmembrane domains, GPI anchors, or trafficking motifs are encoded to display or retain the chimera at the cell surface or to modulate endocytic routing.

[0136] Coding sequences can be designed and optimized for the intended host. In certain embodiments, codon optimization is performed for the selected host species, taking into account GC content, RNA secondary structure, removal of cryptic splice sites and unwanted restriction sites, avoidance of immunostimulatory motifs where appropriate, and incorporation of sequence features facilitating cloning or recombination. Silent substitutions can be introduced to improve manufacturability or genetic stability without altering the amino acid sequence.

[0137] RNA formats are contemplated for transient or durable expression. In some embodiments, a capped and polyadenylated mRNA comprises modified nucleotides (for example, N1-methyl-pseudouridine, 5-methylcytidine) and optimized UTRs to enhance translation and reduce innate immune activation. Self-amplifying RNA (saRNA) or circular RNA (circRNA) formats can be used to extend expression. Cap structures (for example, Cap 0 or Cap 1) , poly (A) tail lengths, and sequence or chemical modifications can be selected to balance stability and translational efficiency. Such RNA can be formulated, for example, in lipid nanoparticles or other carriers for in vivo delivery.

[0138] The disclosure also provides various vectors including any of the nucleic acids or expression cassettes described herein. Non-viral DNA vectors include plasmids, minicircle DNA, and mini-intronic plasmids configured for high-level and persistent expression. Plasmid backbones can include bacterial origins of replication (for example, pUC or pBR322) and bacterial selection markers (for example, ampicillin, kanamycin) . For production of stable mammalian producer cell lines, mammalian selection markers such as neomycin, hygromycin, or puromycin can be included. Minicircle or other minimal-backbone constructs can be used to reduce vector-associated sequences for in vivo applications.

[0139] Viral vectors suitable for delivery include adeno-associated virus (AAV) , lentivirus, adenovirus, herpes simplex virus, and other recombinant viral systems. Any of these vectors can be configured to carry an expression cassette encoding an NPR-C-binding peptide, a target-binding domain, and any desired linker or multimerization modules, or to co-express multiple polypeptides using IRES or 2A elements. Vector choice can be tailored based on payload size, desired duration of expression, cellular tropism, and manufacturing considerations.

[0140] AAV vectors can be single-stranded (ssAAV) or self-complementary (scAAV) . In some embodiments, the AAV genome comprises 5′ and 3′ inverted terminal repeats (ITRs) that flank the expression cassette encoding a chimeric NPR-C-binding polypeptide or an NPR-C-binding peptide alone. The ITRs can be derived from any AAV serotype or engineered variants thereof. Capsids can be selected from naturally occurring or engineered serotypes, including AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, and variants, to match the desired tissue tropism. In certain embodiments, pseudotyped vectors are used where ITRs from one serotype are packaged in a different capsid serotype. Payload and expression cassette design can be adapted to AAV genome size constraints, and scAAV can be used to accelerate onset of expression.

[0141] Lentiviral vectors can be configured as self-inactivating (SIN) vectors with internal promoters to drive expression of the encoded polypeptide. In some embodiments, lentiviral vectors include central polypurine tract / central termination sequence (cPPT / CTS) , WPRE, and other elements to enhance transduction and expression. Integration-competent vectors can be used to achieve stable expression in producer cells or for ex vivo modification of cells, while integration-defective vectors can be used when transient expression is preferred.

[0142] Adenoviral and herpes simplex viral vectors are suitable for high-level, typically transient, expression with large payload capacity. In some embodiments, gutted or helper-dependent adenoviral vectors are used to reduce vector-encoded proteins and extend expression duration. Selection among these vectors can be based on the desired expression kinetics, payload size, and tissue targeting strategies.

[0143] Non-viral delivery systems can be used for in vivo or ex vivo administration of nucleic acids encoding the chimeric polypeptides. Suitable systems include lipid nanoparticles, polymeric nanoparticles, liposomes, micelles, virosomes, virus-like particles, cationic polymers (for example, PEI) , and cell-derived vesicles. Delivery can further be enhanced using physical methods such as electroporation, hydrodynamic injection, ultrasound, or microneedles. Targeting ligands, including NPR-C-binding peptides or other targeting moieties, can be displayed on carrier surfaces to influence biodistribution.

[0144] Vector payloads can be configured to express single-chain chimeras or multiple polypeptides. In certain embodiments, a single vector expresses an antibody-derived target-binding domain alongside an NPR-C-binding peptide using an IRES or 2A element. In other embodiments, multimeric or multivalent NPR-C-binding modules are encoded to enhance avidity, or protease-cleavable motifs are included to modulate activity in endosomal or lysosomal compartments. For analytical or manufacturing purposes, co-expression of reporters or selectable markers may be used in production cells, and miRNA target sites can be included to reduce ectopic expression in non-target tissues.

[0145] Viruses and nanoparticles comprising a nucleic acid encoding any of the NPR-C-binding peptides, target-binding domains, linkers, or chimeric polypeptides described herein are contemplated. In certain embodiments, an AAV, lentivirus, adenovirus, or other viral particle comprises a genome that includes the expression cassette described above. In other embodiments, nanoparticles such as lipid nanoparticles, gold nanoparticles, silica nanoparticles, or polyethylene glycol / polyethyleneimine particles are formulated to deliver an mRNA or DNA encoding the chimera. These delivery forms can be combined with pharmaceutically acceptable carriers for administration, and parameters such as dose, route, and dosing interval can be selected by those of ordinary skill according to the intended use and target profile.

[0146] Nucleic acids encoding the NPR-C-binding domain, target-binding domain, or chimeric polypeptide may be provided in any suitable format, including linear DNA, circular DNA, plasmids, minicircle DNA, viral genomes, synthetic oligonucleotides, or chemically modified nucleic acids. Expression cassettes may be delivered as naked DNA or complexed with carriers such as polycations, dendrimers, nanoparticles, cell-penetrating peptides, or exosomes.

[0147] In certain embodiments, vectors may comprise regulatory elements such as inducible promoters, tissue-specific promoters, insulator sequences, locus control regions, or microRNA target sites for post-transcriptional regulation. Expression may be transient, stable, or conditional, and vectors may be tailored for episomal maintenance or chromosomal integration as appropriate for the application.

[0148] In further embodiments, nucleic acids may be engineered to include sequence elements that enable targeted integration (e.g., recombinase recognition sites, transposon elements, or homology arms for homologous recombination) or to support gene editing using CRISPR / Cas, zinc finger nucleases, TALENs, or other genome engineering tools. V. HOST CELLS

[0149] In another aspect, the disclosure provides cells that comprise any of the nucleic acids or vectors described herein and are configured to express, secrete, display, or otherwise present an NPR-C-binding peptide, a target-binding domain, a linker, or a chimeric polypeptide comprising these components. Populations of such cells are contemplated for research, manufacturing, analytics, screening, and therapeutic use. Suitable cells include prokaryotic, eukaryotic, and mammalian systems, for example human cells. Representative mammalian cell types include cardiomyocytes, stem cells such as human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) , fibroblasts, immune cells, endothelial cells, epithelial cells, neuronal cells, glial cells, and tumor cells. Primary cells and continuous cell lines are suitable, and in some embodiments the cell is a HEK293T cell, a Chinese hamster ovary (CHO) cell, a COS-7 cell, a HeLa cell, an avian cell, a myeloma cell, a Pichia cell, or an insect cell.

[0150] Methods for the culture and production of cells comprising the nucleic acids or vectors provided herein are well established in the art. Cells may be grown in adherent or suspension formats, in serum-containing or serum-free media, and in flasks, bioreactors, or other scalable systems. Standard protocols for bacterial, yeast, mammalian, and archaeal cell culture can be used to establish and expand cell populations for expression and analysis of NPR-C-binding peptides and chimeric constructs. See, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology; Berger et al., Methods in Enzymology; Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique; Doyle and Griffiths, Mammalian Cell Culture: Essential Techniques; Humason, Animal Tissue Techniques; and Ricciardelli et al., In vitro Cell Dev. Biol. 25: 1016.

[0151] Host cells can be engineered to express the encoded sequences in configurations suited to the intended use. In some embodiments, the chimera is secreted into the culture medium to facilitate purification or conditioned-media applications. In other embodiments, the chimera is displayed at the cell surface by inclusion of a transmembrane domain or a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor to enable binding, endocytosis, and lysosomal trafficking assays. Cells may optionally be engineered to package the chimera into extracellular vesicles or exosomes. Co-expression of auxiliary components, such as leader peptides for secretion, multimerization domains, detection tags, or reporter proteins, can be used for manufacturing or analytical purposes. The choice of host cell type can be used to impart desired post-translational modifications, glycosylation patterns, folding environments, or processing, which may be advantageous for stability, activity, or pharmacokinetics when evaluated in vitro or in vivo.

[0152] Vectors containing the described nucleic acids can be introduced into host cells using methods appropriate to the cell type and application. Suitable approaches include electroporation, nanoparticle-mediated delivery, viral transduction (for example, AAV, lentiviral, adenoviral, or herpesviral vectors as described above) , receptor-mediated internalization, translocation via cell-penetrating peptides, liposome-mediated translocation, DEAE-dextran, lipofectamine, and calcium phosphate precipitation. In some embodiments, targeted nuclease systems are used to introduce or integrate coding sequences into a safe harbor locus to achieve durable expression, including RNA-guided nucleases such as CRISPR / Cas systems, transcription activator-like effector nucleases (TALENs) , zinc finger nucleases (ZFNs) , or megaTALs. Transient expression, episomal maintenance, or stable integration can be selected based on intended use.

[0153] Producer cell lines are contemplated for scalable manufacturing of NPR-C-binding peptides, target-binding domains, and chimeric polypeptides. Cells may include selectable markers for the establishment of stable clones, and master and working cell banks can be prepared under research or cGMP conditions. In some embodiments, cells are engineered for controlled expression using inducible systems to facilitate process development or functional studies. Cells can also be adapted for analytical applications, for example by overexpressing NPR-C to quantify receptor engagement, by displaying target antigens to evaluate ternary complex formation, or by using lysosomal markers to assess endocytic routing and degradation. These configurations support binding measurements, internalization assays, lysosomal colocalization, and biochemical analyses aligned with the claims.

[0154] Autologous or allogeneic cells engineered ex vivo to express the described nucleic acids or vectors are suitable for therapeutic or research use, including localized delivery of secreted chimeras, evaluation of target clearance, or cell-based screening. Representative primary cell sources include patient-derived immune cells, stromal cells, endothelial cells, epithelial cells, neuronal cells, or tumor cells, and cell lines such as HEK293T, CHO, COS-7, HeLa, Pichia, and insect cells remain suitable for discovery, characterization, and production. Introduction methods described above can be combined with flow cytometry, ELISA, Western blotting, and microscopy to characterize expression, binding, internalization, and lysosomal degradation in the selected host cell type.

[0155] Host cells may be derived from any origin, including primary cells, established cell lines, stem cells (e.g., embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells) , progenitor cells, or immortalized cells. Cells may be genetically modified using viral, non-viral, or physical transfection methods, and may be further engineered to express auxiliary proteins that facilitate folding, secretion, or post-translational modification of chimeric proteins (e.g., molecular chaperones, glycosyltransferases, sulfotransferases, kinases, or proteases) .

[0156] In certain embodiments, host cells may be used for ex vivo gene or cell therapy, in which autologous or allogeneic cells are engineered to express the chimeric molecule and then administered to a subject. Cell types suitable for such applications include, but are not limited to, T cells, B cells, NK cells, macrophages, dendritic cells, mesenchymal stromal cells, or other immune or stromal cells. Cells may be further engineered for enhanced trafficking, persistence, safety, or immunogenicity profiles. VI. PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS

[0157] In another aspect, the disclosure provides pharmaceutical compositions comprising the chimera described in this document or a nucleotide encoding the chimera, together with a pharmaceutically acceptable carrier. In certain embodiments, pharmaceutical compositions include any of the NPR-C-binding peptides, target-binding domains, linkers, and single-chain chimeric polypeptides described herein, as well as nucleic acids, vectors, or host cells configured to express such chimeras. Compositions can be formulated to deliver a polypeptide chimera directly, or to deliver a genetic construct or cell that produces and releases the chimera or presents the chimera on a cell surface. In some embodiments, compositions are configured for immediate-release or controlled-release profiles and may be designed for systemic or localized administration depending on target distribution and intended clinical use.

[0158] In certain embodiments, the pharmaceutically acceptable carrier may be an agent that reduces the expression of efflux genes or an agent that promotes ubiquitin-like modification. Additional functional excipients can be incorporated to enhance delivery, stability, and performance of the chimera or its encoding nucleic acid. For example, permeation enhancers, protease inhibitors, antioxidant systems, chelating agents, and buffering systems may be included to support bioavailability, maintain structural integrity, and reduce oxidative or metal-catalyzed degradation during manufacturing, storage, and use. In some instances, carriers and excipients are selected to reduce immunogenicity or infusion-related reactions while preserving the functional activity of the NPR-C-binding domain and target-binding domain.

[0159] In some embodiments, the pharmaceutically acceptable carrier includes, but is not limited to: soluble fillers such as mannitol, low molecular weight dextran, sorbitol, polyethylene glycol, glucose, lactose, and galactose; pH adjusters including non-volatile acids, physiologically acceptable organic acids, inorganic acids, bases, and their salts, such as citric acid, phosphoric acid, lactic acid, tartaric acid, hydrochloric acid, potassium hydroxide, sodium hydroxide, etc. ; stabilizers such as EDTA-2Na, sodium thiosulfate, sodium metabisulfite, sodium sulfite, dipotassium hydrogen phosphate, sodium bicarbonate, sodium carbonate, arginine, glutamic acid, polyethylene glycol 6000, polyethylene glycol 4000, sodium dodecyl sulfate, and tris (hydroxymethyl) aminomethane. In certain formulations, buffers and tonicity agents such as sodium chloride, potassium chloride, trehalose, sucrose, acetate, citrate, histidine, or phosphate systems are used to maintain pH and osmolality suitable for the route of administration. Surfactants and stabilizers, for example polysorbates (e.g., polysorbate 20, polysorbate 80) , poloxamers (e.g., Pluronic F68) , and amino acid stabilizers (e.g., glycine, proline) , may be included to reduce interfacial stress and aggregation of protein-based chimeras or to stabilize vector preparations. For multi-dose liquid products, preservatives such as benzyl alcohol, phenol, m-cresol, benzalkonium chloride, chlorobutanol, or parabens may be used when compatible. Cryoprotectants and lyoprotectants such as trehalose, sucrose, mannitol, and dextran can be employed for lyophilized presentations. Co-solvents and solubilizers including ethanol, propylene glycol, glycerol, and cyclodextrins may be incorporated to enhance solubility of particular components where appropriate.

[0160] The pharmaceutical composition described herein may be formulated in different dosage forms depending on the specific use. Possible dosage forms include, but are not limited to: oral dosage forms such as tablets, capsules, granules, oral solutions, and syrups; injectable dosage forms such as injections, lyophilized powders, and aqueous injections; topical dosage forms such as ointments, creams, gels, patches, and lotions; inhalation dosage forms such as aerosols, dry powder inhalers, and nebulized inhalers; rectal and vaginal dosage forms such as suppositories and enemas; ophthalmic medications such as eye drops and eye ointments; otic and nasal dosage forms such as ear drops and nasal sprays; oral cavity dosage forms such as lozenges and oral sprays. In certain embodiments, parenteral dosage forms include intravenous, intramuscular, subcutaneous, intralesional, intra-arterial, intrathecal, or intracerebroventricular injections or infusions prepared as solutions or lyophilized products with appropriate reconstitution protocols. Controlled-release and depot systems, such as biodegradable microspheres, in situ forming gels, implants, and subcutaneous depots, can be employed to provide sustained exposure. Transdermal patches and microneedle arrays can be adapted for localized or systemic delivery, and pulmonary or nasal devices can be used to administer polypeptide chimeras or nucleic acids formulated for respiratory tract deposition. For ocular indications, intravitreal injections, ocular inserts, or sustained-release implants can be used.

[0161] Polypeptide chimera formulations may include buffered aqueous solutions (for example, histidine, citrate, or phosphate buffers) at pH values suitable for stability and compatibility, such as pH 5.0 to 7.5, with tonicity agents and surfactants to minimize aggregation and adsorption. Lyophilized presentations may include disaccharides and bulking agents to preserve secondary and tertiary structure during freeze-drying, with reconstitution in sterile water, saline, or buffered solutions prior to administration. In certain embodiments, half-life extension modules (for example, Fc domains, albumin-binding domains, XTEN or PAS sequences, or PEGylation) are formulated to tailor pharmacokinetics and dosing intervals. Where desired, protease-sensitive or pH-responsive linkers included in the chimera can be formulated to facilitate endosomal routing or lysosomal processing after uptake.

[0162] Nucleic acid formulations comprising DNA, mRNA, self-amplifying RNA, or circular RNA encoding the chimera can be presented in sterile buffered solutions or formulated in carriers such as lipid nanoparticles. In some embodiments, lipid nanoparticles comprise ionizable lipids, cholesterol, helper phospholipids, and PEG-lipids selected to optimize encapsulation efficiency, particle size, and in vivo performance. Representative buffer systems, osmolality ranges, and excipient ratios are selected to support particle integrity and translation. Modified nucleotides (for example, N1-methyl-pseudouridine, 5-methylcytidine) , Cap 0 or Cap 1 structures, optimized 5′ and 3′ UTRs, and tailored poly (A) lengths may be included to enhance translation and reduce innate immune activation in vivo.

[0163] Viral vector formulations, including adeno-associated virus, lentivirus, adenovirus, or herpes simplex virus vectors carrying an expression cassette encoding the chimera, can be formulated in buffered, isotonic solutions (for example, PBS, Ringer’s solution, or balanced salt solutions) with stabilizers such as sugars or polysorbates and stored under conditions that preserve infectivity. In some embodiments, dose units are expressed as viral genomes, transducing units, plaque-forming units, or infectious units, with titers determined by standard assays. Cryostorage and thaw protocols may be specified to maintain vector integrity, and where applicable, premedication regimens may be used to manage vector-associated reactions.

[0164] Cell-based compositions comprising autologous or allogeneic cells engineered ex vivo to express and secrete the chimera, or to display the chimera on the cell surface, can be formulated in infusion media suitable for clinical administration. In certain embodiments, cryopreservation solutions or short-term storage solutions are used to maintain viability and function. Cell dose can be expressed as viable cells per kilogram or per administration, and lot release may include viability, purity, identity, and potency metrics relevant to chimera expression and NPR-C engagement. These compositions can enable localized delivery of secreted chimeras, evaluation of target clearance, or cell-based screening and may be combined with tracking or reporter elements to facilitate monitoring.

[0165] Representative formulation and administration parameters can be selected by those of ordinary skill for the intended route and modality. For polypeptide chimeras, liquid injections may range from approximately 0.01 mg / mL to 200 mg / mL, with viscosity modifiers included for subcutaneous delivery as appropriate. Parenteral formulations may be adjusted to pH 5.0 to 7.5 and osmolality 250 to 400 mOsm / kg using pharmaceutically acceptable agents. Sterility can be ensured through aseptic processing or sterile filtration, and endotoxin limits may be set per pharmacopeial standards. Suitable container-closure systems include glass vials, prefilled syringes, autoinjector cartridges, ampoules, and polymeric syringes compatible with proteins and vectors. Device-based delivery systems such as pens, autoinjectors, infusion pumps, nebulizers, and ocular inserts can be selected to match dosing regimen and patient setting.

[0166] In certain embodiments, compositions are co-administered or co-formulated with agents intended to address disease pathways associated with the target. Examples include immunomodulators, anti-inflammatory agents, and standard-of-care biologics or small molecules relevant to the specific target, with sequential or concurrent dosing schedules. In some embodiments, agents that modulate lysosomal function or endocytic trafficking are used to enhance target clearance while maintaining acceptable safety profiles. Supportive care components such as antihistamines or antipyretics may be employed to manage infusion-or injection-related reactions associated with macromolecule, vector, or cell-based administration.

[0167] Dosing regimens may be selected according to the therapeutically effective amount principles provided herein and considering subject-specific factors such as age, weight, disease state, and concomitant therapies. For polypeptide chimeras, representative dosing may include single or multiple administrations by intravenous or subcutaneous routes on weekly, biweekly, or monthly intervals. For nucleic acid or viral vector compositions, representative regimens may include one-time or repeat dosing at intervals chosen to achieve target exposure while managing immune responses. For cell-based compositions, representative regimens may include single or repeated infusions of engineered cells, with post-infusion monitoring according to clinical practice. In some embodiments, dose titration or step-up dosing is used to balance exposure and tolerability.

[0168] Targeting strategies can be incorporated to influence biodistribution and uptake. In certain embodiments, carriers such as lipid nanoparticles or polymeric nanoparticles display NPR-C-binding peptides or other targeting ligands to enrich uptake in NPR-C–expressing tissues. In other embodiments, local delivery approaches, including intra-articular injection, intrathecal administration, or intratumoral injection, are selected to increase target access while reducing systemic exposure. Where appropriate, imaging agents or biomarkers are used to assess distribution, receptor engagement, and target clearance.

[0169] The foregoing pharmaceutical composition features can be applied across the range of actives encompassed by the claims, including a chimera comprising an NPR-C-binding domain and a target-binding domain, a peptide that specifically binds NPR-C, a nucleic acid encoding any such chimera or peptide, a vector comprising such nucleic acids, and host cells comprising the nucleic acids or vectors. Variations and modifications may be made to address the specific target, route, and clinical context, while remaining within the scope defined by the claims. In some instances, compositions are adapted to research, diagnostic, or manufacturing uses, for example to support affinity measurements, internalization assays, lysosomal colocalization, or biochemical analyses in appropriate in vitro or in vivo models.

[0170] In addition to routes and dosage forms already described, compositions may be formulated for buccal, sublingual, transdermal, transmucosal, intraosseous, intrapulmonary, intraocular, intranasal, or intralymphatic administration. Compositions may be delivered via implantable or wearable devices, infusion pumps, osmotic mini-pumps, or controlled-release matrices. Lyophilized, spray-dried, or microencapsulated formulations may be used to enhance stability, facilitate transport, or enable alternative delivery modalities.

[0171] Pharmaceutical compositions may be co-formulated or co-administered with adjuvants, immunomodulators, or targeting agents that enhance delivery to specific tissues, modulate the immune response, or improve pharmacokinetic and pharmacodynamic profiles. In some embodiments, compositions are formulated for use in combination with checkpoint inhibitors, anti-inflammatory agents, chemotherapeutics, or gene editing systems. VII. METHODS

[0172] The chimeras described herein can be used for any disease in a subject that can be prevented, alleviated, mitigated, or treated by lysosomal degradation of a target molecule. The target molecule may be a factor responsible for causing the disease. Methods include administering a therapeutically effective amount of a chimera comprising an NPR-C-binding domain and a target-binding domain, a peptide that specifically binds NPR-C, a nucleic acid encoding such constructs, a vector carrying such nucleic acids, a host cell engineered to express such constructs, or a pharmaceutical composition comprising any of the foregoing, to a subject in need.

[0173] In certain embodiments, the disease is selected from inflammatory diseases, autoimmune diseases, cancer, neurodegenerative diseases, metabolic syndrome, cardiovascular diseases, respiratory diseases, digestive diseases, tissue fibrotic diseases, aging related diseases, renal diseases, hematological diseases, infectious diseases, or rare diseases. Representative targets within these indications include soluble cytokines, receptors, ion channels, pathogenic autoantibodies, membrane proteins, and secreted factors described elsewhere, where lysosomal clearance via NPR-C engagement reduces target abundance or activity.

[0174] In certain embodiments, the subject is a mammal, including but not limited to mammals of the order Rodentia (such as mice and hamsters) ; mammals of the order Lagomorpha (such as rabbits) ; mammals of the order Carnivora, including the family Felidae (cats) and the family Canidae (dogs) ; mammals of the order Artiodactyla, including the family Bovidae (cattle) and the family Suidae (pigs) ; or mammals of the order Perissodactyla, including the family Equidae (horses) . In some embodiments, the mammal belongs to the order Primate, the suborder Ceboids or Simioids (monkeys) , or the superfamily Anthropoids (humans and apes) . In some embodiments, the mammal is a human. In some embodiments, the human subject is an adult, for example, 18 years of age or older, or an adolescent. In certain embodiments, the subject has been administered the chimera, a nucleotide sequence encoding the chimera, or a pharmaceutical composition thereof.

[0175] In some embodiments, the subject is a mammal, for example, mouse, rabbit, cat, dog, cow, pig, sheep, horse, or human. Methods can be adapted to veterinary practice by selecting species-appropriate dosage forms, excipients, and dosing regimens, and by considering species-specific NPR-C expression and target distribution.

[0176] Methods of mediating lysosomal degradation of a target in vivo comprise administering a composition that includes an NPR-C-binding domain and a target-binding domain, wherein engagement of NPR-C drives endocytosis of the ternary complex and trafficking to lysosomes. In certain embodiments, the chimera is administered systemically by intravenous or subcutaneous routes, or locally by intratumoral, intra-articular, intrathecal, or intravitreal injection, with dosing intervals selected according to target turnover and clinical response.

[0177] Methods of mediating lysosomal degradation of a target in vitro or ex vivo comprise contacting a target-containing sample with the chimera under conditions that allow binding to NPR-C and the target, followed by internalization and degradation in cells expressing NPR-C. Representative in vitro assays include incubation of target proteins with NPR-C-overexpressing cells to quantify uptake and degradation by flow cytometry, Western blotting, or fluorescence microscopy. Representative ex vivo applications include conditioning of biological fluids (for example, plasma, synovial fluid, or cerebrospinal fluid) with NPR-C-directed chimeras to reduce target levels prior to reintroduction or analysis.

[0178] Methods of administering nucleic acids or vectors encoding the chimera comprise selecting a delivery modality appropriate for tissue tropism and expression duration, such as lipid nanoparticles for mRNA, adeno-associated virus for durable expression, or lentiviral vectors for ex vivo cell modification. In certain embodiments, self-complementary AAV vectors are used to accelerate onset of expression, while integration-defective lentiviral vectors are selected for transient expression. Expression onset and duration can be monitored by reporter co-expression, quantitative PCR, ELISA, and functional assays of target clearance.

[0179] Methods of cell-based delivery comprise engineering autologous or allogeneic cells ex vivo to express and secrete the chimera or to display the chimera on the cell surface, followed by administration to the subject. In certain embodiments, producer cells are localized to the site of disease to enrich target access, or are formulated for systemic infusion to achieve circulating levels of secreted chimeras. Viability, purity, identity, and potency are confirmed prior to administration, and post-infusion monitoring evaluates expression, biodistribution, and target reduction.

[0180] Methods of determining a therapeutically effective amount comprise dose selection based on target abundance, tissue distribution, NPR-C expression, and pharmacokinetic-pharmacodynamic relationships. Representative dosing ranges for polypeptide chimeras may include approximately 0.01 to 20 mg / kg by intravenous or subcutaneous routes, administered once or on weekly, biweekly, or monthly schedules. Representative dosing ranges for viral vectors may be expressed in viral genomes per kilogram (for example, approximately 1×1011 to 1×1014μg / kg) , adjusted for serotype and target tissues. Representative dosing ranges for mRNA-lipid nanoparticle formulations may include approximately 0.01 to 2 mg / kg. These ranges are illustrative and can be adjusted according to clinical response, safety findings, and concomitant therapies.

[0181] Methods of combination therapy comprise co-administering the chimera or its encoding construct with agents relevant to the disease pathway, such as immunomodulators, anti-inflammatory drugs, or standard-of-care biologics and small molecules. In certain embodiments, premedication regimens (for example, antihistamines, antipyretics, or corticosteroids) are employed to manage injection or infusion reactions. Sequential or concurrent dosing schedules can be used to achieve additive or synergistic effects while monitoring safety and efficacy.

[0182] Methods of monitoring treatment response comprise assessing biomarkers of target reduction and pathway modulation, including circulating target levels by ELISA, receptor occupancy or ternary complex formation by flow cytometry, downstream signaling markers (for example, cytokine profiles) , and imaging modalities for tissue-specific targets. In certain embodiments, NPR-C engagement is inferred by internalization kinetics or lysosomal colocalization metrics, and cGMP measurements are used to confirm reduced NPR-A / NPR-B signaling for variants designed with decreased NPR-A / NPR-B affinity.

[0183] Methods of safety monitoring comprise evaluating clinical signs and laboratory parameters relevant to the chosen modality, including immunogenicity assessments (for example, anti-drug antibodies, neutralizing antibodies to vectors) , liver and kidney function tests, hematology, and complement activation markers. In certain embodiments, dose titration, interval adjustments, or temporary treatment holds are used to manage adverse events. For vector-based methods, strategies such as serotype selection, immunosuppression protocols, or repeat dosing intervals are considered to manage pre-existing or treatment-induced antibodies.

[0184] Methods of selecting patients comprise identifying subjects with diseases associated with target proteins described herein and, in some embodiments, confirming NPR-C expression in relevant tissues or cells by immunohistochemistry, RNA profiling, or receptor-binding assays. In certain embodiments, companion diagnostics or biomarker panels are employed to stratify subjects according to expected responsiveness, target abundance, or co-pathologies.

[0185] Methods of localized clearance comprise administering the chimera directly to compartments containing elevated target concentrations, such as joints, cerebrospinal fluid, or tumor microenvironments, to reduce systemic exposure and focus target degradation. In certain embodiments, device-assisted delivery (for example, catheter-based systems, microneedle arrays) is used to optimize local distribution and residence time.

[0186] Methods adapted to special populations comprise tailoring dosing and monitoring to pediatric, geriatric, or pregnant subjects, considering differences in pharmacokinetics, NPR-C distribution, and target biology. In certain embodiments, reduced starting doses, extended titration schedules, or enhanced monitoring are employed to address population-specific considerations.

[0187] Methods of research use comprise employing the chimeras, nucleic acids, vectors, and host cells to study endocytic routing, lysosomal degradation, and receptor-ligand biology in vitro and in vivo. Representative applications include target validation, mechanistic studies of ternary complex formation, and screening of target-binding domains for desired degradation profiles. Assays may include fluorescence microscopy, Western blotting, flow cytometry, TR-FRET, SPR, BLI, ITC, and cGMP measurements, consistent with laboratory standards.

[0188] Methods of manufacturing-support use comprise applying the chimeras and encoding constructs to generate producer cell lines, validate expression cassettes, and optimize vector design for scale-up, with analytical studies focused on stability, potency, and receptor engagement. In certain embodiments, co-expressed reporters, selection markers, and miRNA target sites are used to facilitate process development and reduce off-target expression in non-target tissues.

[0189] Methods of kit-based application comprise providing articles of manufacture containing a chimera or encoding nucleic acid / vector, diluent or buffer, and instructions for use in accordance with any of the methods described herein. In certain embodiments, kits include prefilled syringes, vials, or cartridges suitable for parenteral administration, or device components for inhalation, ocular, or intrathecal delivery, along with guidance on preparation, dosing, and monitoring.

[0190] Methods of iterative optimization comprise evaluating different NPR-C-binding variants, linkers, and target-binding domains to fine-tune specificity, internalization kinetics, and degradation efficiency for a selected target. In certain embodiments, multimeric or multivalent NPR-C-binding modules are tested for enhanced avidity, and protease-cleavable motifs are evaluated for modulation of endosomal or lysosomal release.

[0191] The described compositions and methods are broadly applicable to the prevention, treatment, or amelioration of diseases and conditions associated with aberrant or pathogenic proteins, including but not limited to monogenic, polygenic, acquired, infectious, inflammatory, neoplastic, degenerative, metabolic, cardiovascular, autoimmune, allergic, fibrotic, or rare disorders. In some embodiments, the target is a protein or complex associated with multi-drug resistance, immune evasion, or metastasis. In further embodiments, the target is a biomarker or driver of disease progression identified by high-throughput screening, proteomics, genomics, or pathway analysis.

[0192] The chimeric molecules described herein may also be used in diagnostic, prognostic, or research applications, such as target validation, biomarker detection, or analysis of protein-protein interactions, by leveraging their specificity for NPR-C and the selected target.

[0193] The foregoing methods are applicable across the modalities encompassed by the claims, including administration of chimeric polypeptides, NPR-C-binding peptides, nucleic acids, vectors, and engineered host cells. Variations and modifications may be made to address target class, tissue distribution, clinical context, and delivery constraints, while remaining within the scope defined by the claims and supported by the data and examples provided herein. VIII. EXEMPLARY EMBODIMENTS

[0194] The following embodiments are contemplated. All combinations of features and embodiments are contemplated.

[0195] Embodiment 1: A chimeric molecule comprising a natriuretic peptide receptor C (NPR-C) -binding domain and a target-binding domain.

[0196] Embodiment 2: An embodiment of embodiment 1, wherein the NPR-C-binding domain and the target-binding domain are connected via a linker.

[0197] Embodiment 3: An embodiment of embodiment 1 or 2, wherein the NPR-C-binding domain comprises an atrial natriuretic peptide (ANP) protein, B-type natriuretic peptide (BNP) protein, C-type natriuretic peptide (CNP) protein, or a variant thereof.

[0198] Embodiment 4: An embodiment of embodiment 3, wherein the ANP, BNP, or CNP protein comprises an amino acid sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 16, or SEQ ID NO. 20, respectively.

[0199] Embodiment 5: An embodiment of embodiment 4, wherein the ANP, BNP, or CNP protein comprises an amino acid sequence having at least 85%identity with SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 16, or SEQ ID NO. 20, respectively.

[0200] Embodiment 6: An embodiment of embodiment 5, wherein the ANP, BNP, or CNP protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 16, or SEQ ID NO. 20, respectively.

[0201] Embodiment 7: An embodiment of embodiment 3, wherein the ANP protein variant is a truncated variant of the ANP protein.

[0202] Embodiment 8: An embodiment of embodiment 7, wherein the ANP protein variant comprises a sequence having at least 80%identity with amino acid residues 1–23 of SEQ ID NO: 12.

[0203] Embodiment 9: An embodiment of embodiment 7 or 8, wherein the ANP protein variant comprises a sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO. 30, or SEQ ID NO. 32.

[0204] Embodiment 10: An embodiment of embodiment 9, wherein the ANP protein variant comprises a sequence having at least 85%identity with SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO. 30, or SEQ ID NO. 32.

[0205] Embodiment 11: An embodiment of any one of embodiments 7–10, wherein the ANP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 14 modified with one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, R4W, R14P, R14H, and R14K.

[0206] Embodiment 12: An embodiment of any one of embodiments 7–10, wherein the ANP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 30 modified with one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, R4W, R14P, R14H, and R14K.

[0207] Embodiment 13: An embodiment of any one of embodiments 7–10, wherein the ANP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 32 modified with one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R14P, R14H, and R14K.

[0208] Embodiment 14: An embodiment of embodiment 7, wherein the BNP protein variant is a truncated variant of the BNP protein.

[0209] Embodiment 15: An embodiment of embodiment 14, wherein the BNP protein variant comprises a sequence having at least 80%identity with amino acid residues 6–23 of SEQ ID NO: 16.

[0210] Embodiment 16: An embodiment of embodiment 14 or 15, wherein the BNP protein variant comprises a sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO: 18.

[0211] Embodiment 17: An embodiment of embodiment 16, wherein the BNP protein variant comprises a sequence having at least 85%identity with SEQ ID NO: 18.

[0212] Embodiment 18: An embodiment of any one of embodiments 14–17, wherein the BNP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 modified with one or more substitutions selected from S8N, S8T, S8A, S8Q, G9D, G9S, G9I, G9N, G9T, G9Q, G9C, G9Y, D16E, R17Q, I18A, and I18V.

[0213] Embodiment 19: An embodiment of embodiment 7, wherein the CNP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 modified with one or more substitutions selected from K4I, K4H, F7A, F7E, F7G, F7S, F7T, F7Y, F7Q, F7R, and F7K.

[0214] Embodiment 20: An embodiment of any one of embodiments 1–19, wherein the target-binding domain comprises a peptide, an aptamer, an antibody or a fragment thereof, or a small molecule inhibitor.

[0215] Embodiment 21: An embodiment of any one of embodiments 1–20, wherein the targeting domain binds a tumor necrosis factor superfamily protein, an interleukin (IL) , epidermal growth factor receptor (EGFR) , programmed death ligand 1 (PD-L1) , human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) , a G protein-coupled receptor (GPCR) , fibroblast growth factor receptor (FGFR) , vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) , cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4) , interleukin-5 receptor alpha subunit (IL-5Rα) , an immunoglobulin (Ig) , a pathogenic autoantibody, a cluster of differentiation (CD) antigen, tumor-associated calcium signal transducer 2 (TACSTD2) , mesothelin, glypican-3 (GPC3) , integrin-associated protein (IAP) , an integrin, a discoidin domain receptor (DDR) , cytoskeleton-associated protein 4 (CKAP4) , carbonic anhydrase IX (CAIX) , secreted phosphoprotein 1 (SPP1) , transthyretin (TTR) , misfolded transthyretin (ATTR) , Activin E (ActE) , Activin receptor like kinase 7 (ALK7) , transmembrane protein 158 (TMEM158) , or carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 (CEACAM5) .

[0216] Embodiment 22: An embodiment of embodiment 21, wherein the targeting domain binds to tumor necrosis factor (TNFα) , tumor necrosis factor-like ligand 1A (TL-1A) , IL-17. IL-23, IgA, IgG, IgM, IgD, IgE, galactose-deficient IgA (Gd-IgA) , CD19, CD44, or CD47.

[0217] Embodiment 23: A peptide that specifically binds to natriuretic peptide receptor C (NPR-C) , wherein the peptide is a non-naturally occurring variant of an ANP protein, BNP protein, or CNP protein.

[0218] Embodiment 24: An embodiment of embodiment 23, wherein the ANP, BNP, or CNP protein comprises an amino acid sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 16, or SEQ ID NO. 20, respectively.

[0219] Embodiment 25: An embodiment of embodiment 23, wherein the ANP protein variant is a truncated variant of the ANP protein.

[0220] Embodiment 26: An embodiment of embodiment 25, wherein the ANP protein variant comprises a sequence having at least 80%identity with amino acid residues 1–23 of SEQ ID NO: 12.

[0221] Embodiment 27: An embodiment of embodiment 25 or 26, wherein the ANP protein variant comprises a sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 30, or SEQ ID NO. 32.

[0222] Embodiment 28: An embodiment of any one of embodiments 25–27, wherein the ANP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 14 modified with one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, R4W, R14P, R14H, and R14K.

[0223] Embodiment 29: An embodiment of any one of embodiments 25–27, wherein the ANP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 30 modified with one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, R4W, R14P, R14H, and R14K.

[0224] Embodiment 30: An embodiment of any one of embodiments 25–27, wherein the ANP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 32 modified with one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R14P, R14H, and R14K.

[0225] Embodiment 31: An embodiment of embodiment 23, wherein the BNP protein variant is a truncated variant of the BNP protein.

[0226] Embodiment 32: An embodiment of embodiment 31, wherein the BNP protein variant comprises a sequence having at least 80%identity with amino acid residues 6–23 of SEQ ID NO: 16.

[0227] Embodiment 33: An embodiment of embodiment 31 or 32, wherein the BNP protein variant comprises a sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO: 18.

[0228] Embodiment 34: An embodiment of any one of embodiments 31–33, wherein the BNP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 modified with one or more substitutions selected from S8N, S8T, S8A, S8Q, G9D, G9S, G9I, G9N, G9T, G9Q, G9C, G9Y, D16E, R17Q, I18A, and I18V.

[0229] Embodiment 35: An embodiment of embodiment 23, wherein the CNP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 modified with one or more substitutions selected from K4I, K4H, F7A, F7E, F7G, F7S, F7T, F7Y, F7Q, F7R, and F7K.

[0230] Embodiment 36: A nucleic acid encoding the chimeric molecule of any one of embodiments 1–22 or the peptide of any one of embodiments 23–35.

[0231] Embodiment 37: A vector comprising the nucleic acid of embodiment 36.

[0232] Embodiment 38: A host cell comprising the nucleic acid of embodiment 36 or the vector of embodiment 37.

[0233] Embodiment 39: A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier or excipient and the chimeric molecule of any one of embodiments 1–22, the peptide of any one of embodiments 23–35, the nucleic acid of embodiment 36, the vector of embodiment 37, or the host cell of embodiment 38.

[0234] Embodiment 40: Use of the chimeric molecule of any one of embodiments 1–22, the peptide of any one of embodiments 23–35, the nucleic acid of embodiment 36, the vector of embodiment 37, the host cell of embodiment 38, or the pharmaceutical composition of embodiment 39 in preparation of a medicament for mediating lysosomal degradation of a target.

[0235] Embodiment 41: Use of the chimeric molecule of any one of embodiments 1–22, the peptide of any one of embodiments 23–35, the nucleic acid of embodiment 36, the vector of embodiment 37, the host cell of embodiment 38, or the pharmaceutical composition of embodiment 39 in preparation of a medicament for treating a disease associated with a target.

[0236] Embodiment 42: An embodiment of embodiment 41, wherein the disease comprises a cancer, a neurodegenerative disease, a psychiatric disease, a central nervous system disease, an inflammatory disease, an autoimmune disease, metabolic syndrome, an aging-related disease, a cardiovascular disease, a respiratory disease, a digestive disease, a tissue fibrotic disease, an aging-related disease, a renal disease, a hematologic disease, an infectious disease, or a rare disease.

[0237] Embodiment 43: A method of mediating lysosomal degradation of a target, the method comprising contacting the target with the chimeric molecule of any one of embodiments 1–22, the peptide of any one of embodiments 23–35, the nucleic acid of embodiment 36, the vector of embodiment 37, the host cell of embodiment 38, or the pharmaceutical composition of embodiment 39.

[0238] Embodiment 44: A method of treating a subject suffering from a disease associated with a target, the method comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the chimeric molecule of any one of embodiments 1–22, the peptide of any one of embodiment 23–35, the nucleic acid of embodiment 36, the vector of claim 37, the host cell of claim 38, or the pharmaceutical composition of claim 39.

[0239] Embodiment 45: An embodiment of embodiment 44, wherein the disease comprises a cancer, a neurodegenerative disease, a psychiatric disease, a central nervous system disease, an inflammatory disease, an autoimmune disease, metabolic syndrome, an aging-related disease, a cardiovascular disease, a respiratory disease, a digestive disease, a tissue fibrotic disease, an aging related disease, a renal disease, a hematologic disease, an infectious disease, or a rare disease.

[0240] Embodiment 46: A chimeric molecule comprising an NPR-C binding domain and a target-binding domain.

[0241] Embodiment 47: An embodiment of embodiments 46, wherein the NPR-C binding domain and the target-binding domain are connected via a linker.

[0242] Embodiment 48: An embodiment of embodiment 46 or 47, wherein the NPR-C binding domain is selected from an atrial natriuretic peptide (ANP) protein, B-type natriuretic peptide (BNP) protein, C-type natriuretic peptide (CNP) protein, or a variant thereof.

[0243] Embodiment 49: An embodiment of embodiments 48, wherein the ANP, BNP, or CNP protein comprises the amino acid sequences shown in SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 16, or SEQ ID NO. 20, respectively, or an amino acid sequence having at least 80%identity thereto, preferably at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity.

[0244] Embodiment 50: An embodiment of embodiment 48, wherein the ANP protein variant is a truncated form of ANP protein, preferably comprising amino acid residues 1-23, 4-23, or 6-20 (based on SEQ ID NO. 12) . More preferably, the ANP truncated variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 30, or SEQ ID NO. 32, or a sequence having at least 80%identity thereto, and more preferably at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity, or a variant thereof; preferably, the ANP variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 14 and includes one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, R4W, R14P, R14H, and R14K; preferably, the ANP variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 30 and includes one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, R4W, R14P, R14H, and R14K; preferably, the ANP variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 32 and includes one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R14P, R14H, and R14K.

[0245] Embodiment 51: An embodiment of embodiment 48, wherein the BNP protein variant is a truncated form comprising amino acid residues 6-22 (based on SEQ ID NO. 16) . Preferably, the variant comprises the sequence of SEQ ID NO. 18 or a sequence having at least 80%identity thereto, preferably at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity, or a variant thereof; preferably, the BNP variant comprises SEQ ID NO. 18 and includes one or more substitutions selected from S8N, S8T, S8A, S8Q, G9D, G9S, G9I, G9N, G9T, G9Q, G9C, G9Y, D16E, R17Q, I18A, and I18V.

[0246] Embodiment 52: An embodiment of any one of embodiments 46–51, wherein the CNP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 20 and includes one or more substitutions selected from K4I, K4H, F7A, F7E, F7G, F7S, F7T, F7Y, F7Q, F7R, and F7K.

[0247] Embodiment 53: An embodiment of any one of embodiments 46–52, wherein the target-binding portion comprises, but is not limited to, a protein that binds the target, , a nucleic acid aptamer, an antibody, a polypeptide, a small molecule inhibitor or an exosome.

[0248] Embodiment 54: An embodiment of any one of embodiments 46–53, wherein the chimeric molecule comprises a target-binding domain selected from a protein, nucleic acid aptamer, antibody, or small molecule inhibitor, or exosome that is directed against one or more of the following targets: tumor necrosis factor (for example, TNF-α) , and tumor necrosis factor-like ligand 1A (for example, TL1A / TNFSF15) , interleukin family members including interleukin‐17 (IL‐17) and interleukin‐23 (IL‐23) , epidermal growth factor receptor (EGFR) , programmed death ligand 1 (PD-L1) , human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) , G protein-coupled receptors (GPCRs) , fibroblast growth factor receptor (FGFR) , vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) , cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4) , interleukin-5 receptor alpha subunit (IL-5Rα) , immunoglobulins (IgA, IgG, IgM, IgD, IgE) , pathogenic autoantibodies, galactose-deficient IgA (Gd-IgA) , cluster of differentiation antigens (CD19, CD44, CD47) , tumor-associated calcium signal transducer 2 (TACSTD2) , mesothelin, glypican-3 (GPC3) , integrin-associated protein (IAP) , integrins, discoidin domain receptors (DDR) , cytoskeleton-associated protein 4 (CKAP4) , carbonic anhydrase IX (CAIX) , secreted phosphoprotein 1 (SPP1) , transthyretin (TTR) , and misfolded transthyretin (ATTR) , transmembrane protein 158 (TMEM158) , and carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 (CEACAM5) .

[0249] Embodiment 55: A peptide that specifically binds to natriuretic peptide receptor C (NPR-C) , wherein the peptide is selected from variants of atrial natriuretic peptide (ANP) protein, B-type natriuretic peptide (BNP) protein, and C-type natriuretic peptide (CNP) protein.

[0250] Embodiment 56: A nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding any of the chimeric molecules described in any one of embodiments 46–54, or the NPR-C-specific peptide described in embodiment 10.

[0251] Embodiment 57: A host cell comprising the nucleic acid as defined in embodiment 56, or comprising a vector containing said nucleic acid.

[0252] Embodiment 58: A pharmaceutical composition comprising the chimeric molecule described in any one of claims 46–54, or a nucleic acid encoding said chimeric molecule, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0253] Embodiment 59: Use of a peptide that specifically binds NPR-C, as described above, in the preparation of a medicament for mediating the lysosomal degradation of a target.

[0254] Embodiment 60: Use of any of the chimeric molecules as described in any one of embodiments 46–54 in the preparation of a medicament for treating a disease associated with the target.

[0255] Embodiment 61: A method for treating a disease, comprising administering to a subject in need thereof the chimeric molecule as described in any one or embodiments 46–54, or a nucleic acid encoding any such molecule, or the pharmaceutical composition as described in embodiment 58.

[0256] Embodiment 62: An embodiment of any one of embodiments 59–61, wherein the disease is selected from cancer, neurodegenerative disease, psychiatric and central nervous system diseases, inflammatory disease, autoimmune disease, metabolic syndrome, aging-related diseases, cardiovascular disease, respiratory disease, digestive disease, renal disease, hematologic disease, infectious disease, or rare disease. EXAMPLES

[0257] The following examples are provided to further illustrate the embodiments of the present invention. Those skilled in the art will understand that the following examples are intended merely to illustrate the invention and should not be construed as limiting the scope of the invention. Unless otherwise specified, the specific techniques or conditions used in the examples may be carried out according to the techniques or conditions described in the literature of the field, or according to product or instrument manuals. All reagents or instruments for which manufacturers are indicated are commercially available.

[0258] The functional properties of the chimeric molecules, including binding specificity, affinity, internalization, lysosomal trafficking, target degradation, and pharmacokinetics, may be assessed using a range of standard analytical techniques. These include, but are not limited to, ELISA, surface plasmon resonance (SPR) , biolayer interferometry (BLI) , flow cytometry, confocal or super-resolution fluorescence microscopy, time-resolved FRET, immunoprecipitation, immunoblotting, mass spectrometry, quantitative PCR, in vivo imaging, and functional assays in cellular or animal models. Assays may be conducted in vitro, in cellulo, ex vivo, or in vivo, and appropriate controls and statistical analyses should be employed. Example 1. Construction and amplification of recombinant plasmids

[0259] Synthesis of DNA sequences encoding the following constructs was performed using standard gene synthesis methods: 9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-ANP、9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-BNP and 9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-CNP. In this context, 9His refers to a His-tag consisting of nine histidine residues; 2Strep refers to two tandem repeats of the Strep tag, each composed of eight amino acid residues; SUMO is a small ubiquitin-like modifier protein tag; sGFP refers to green fluorescent protein; and Linker refers to the junction (peptide linker) between ANP, BNP, or CNP and sGFP.

[0260] Each synthesized DNA sequence was cloned into the pRSF vector plasmid by restriction cloning using NcoI and EcoRI restriction sites, followed by ligation. Specifically, DNA sequences encoding 9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-ANP, 9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-BNP, and 9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-CNP were inserted into pRSF after NcoI and EcoRI digestion of both insert and vector. For restriction digestion, the following reaction system (50μL total volume) was used for either the pRSF vector or the corresponding DNA insert: 30 μL of pRSF vector (1000 ng / μL) or 30μL of DNA sequence (200 ng / μL) , 5μL of 10×NEB buffer, and 15μL of nuclease-free water. Appropriate units of NcoI and EcoRI were added according to the enzyme manufacturer’s instructions. Reactions were incubated at 37℃ for 3 hours. Digested products were gel purified and dissolved in 30μL of nuclease-free water. Concentrations were measured using a NanoDrop spectrophotometer. The gel-purified vector concentration after digestion was approximately 50 ng / μL, and the gel-purified insert DNA concentrations were approximately 60 ng / μL. Ligation reactions were set up at a 1: 3 vector-to-insert molar ratio and incubated overnight at 16℃. Table 1 provides a representative ligation reaction system; if a 20μL ligation is desired, volumes can be doubled accordingly. Table 1: Ligation Reaction System Note: The table above reflects a 10μL ligation. For a 20μL ligation system as referenced in the text, double each component volume.

[0261] The ligated plasmids were transformed into E. coli and plated on selective solid medium for overnight cultivation. Specifically, commercially available competent E. coli Top10 cells were removed from a-80℃ freezer and thawed on ice. Next, 10μL of the ligation reaction mixture was added to 100μL of competent cells and gently mixed to evenly distribute the DNA. Cells were incubated on ice for 30 minutes, heat-shocked at 42℃ for 90 seconds, and immediately returned to ice for 2 minutes. Then, 1000μL of antibiotic-free LB medium was added, and cells were shaken at 37℃ for 50 minutes. After recovery, cells were briefly centrifuged at 4000 rpm for 30 seconds, the supernatant was discarded, and the pellet was spread evenly onto LB agar plates containing kanamycin. Plates were inverted and incubated overnight at 37℃.

[0262] Putative transformants were screened by colony PCR, and colonies with correctly sized bands were subjected to Sanger sequencing to confirm sequence accuracy. For colony PCR, single colonies were picked using a sterile toothpick or pipette tip and transferred to PCR tubes (or a 96-well PCR plate) . The colony PCR reaction mixture and cycling conditions are shown in Tables 2 and 3, respectively. Colonies yielding amplicons of the expected size were selected for Sanger sequencing to confirm successful construction of 9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-ANP-pRSF, 9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-BNP-pRSF, and 9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-CNP-pRSF recombinant plasmids. Table 2: Colony PCR Reaction System Table 3: Colony PCR Reaction Conditions

[0263] Colonies confirmed by sequencing were expanded, and plasmid DNA was isolated. Specifically, a single confirmed colony was inoculated into 5 mL of LB medium containing kanamycin and incubated overnight at 37℃ in a shaking incubator. Endotoxin-free plasmid DNA was extracted according to the manufacturer’s instructions for the ZOMANBIO plasmid extraction kit, and plasmid concentration was measured using a NanoDrop spectrophotometer. Plasmids were stored at-20℃. Representative plasmid maps for constructs generated in this example are shown in FIG. 1. Example 2. Prokaryotic expression of recombinant protein chimeras

[0264] Transformation of plasmids into an E. coli expression strain and overnight incubation on solid medium were performed using BL21 (DE3) competent cells. Specifically, commercially available competent BL21 (DE3) cells were taken from a-80℃ freezer and thawed on ice for 5 minutes. Then, 1μL of the successfully constructed plasmid 9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-ANP-pRSF 、9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-BNP-pRSF or 9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-CNP-pRSF was added to 10μL of the competent cells and gently mixed to evenly distribute the plasmid solution. The competent cells with plasmid were placed on ice for 30 minutes, heat-shocked at 42℃ for 60 seconds, and immediately returned to ice for 2 minutes. Next, 500μL of antibiotic-free LB medium was added, and the mixture was shaken at 37℃ for 50 minutes. The transformed competent cells were then centrifuged at 4000 rpm for 30 seconds, the supernatant was discarded, and the cell pellet was evenly spread onto LB agar plates containing kanamycin. Plates were inverted and incubated overnight at 37℃.

[0265] Single colonies were selected for expanded culture, and recombinant protein expression was induced under defined conditions. A single colony was picked from the selective LB plate and inoculated into LB liquid medium containing kanamycin, followed by overnight incubation at 37℃ and 200 r / min (rpm) . The overnight culture was then inoculated into 500 mL LB medium at a ratio of 1: 500 and grown at 37℃ and 200 r / min until the absorbance at 600 nm (A600) reached 0.4 to 0.6. IPTG was added to a final concentration of 0.5 mmol / L, and the culture was incubated overnight at 20℃ and 120 r / min to induce expression of the target protein.

[0266] Collection and purification of recombinant proteins were conducted using Ni-NTA affinity chromatography under native conditions. The induced 500 mL bacterial culture was centrifuged at 3500 rpm for 20 minutes, the supernatant was discarded, and the cell pellet was retained and resuspended in protein extraction buffer (50 mmol / L Na3PO4, pH 8.0, 500 mmol / L NaCl, 10 mmol / L imidazole) . The resuspended cells were incubated on ice for 30 minutes and then subjected to ultrasonic disruption on ice for 10 minutes. The lysate was centrifuged at 9000 rpm for 15 minutes; the supernatant was reserved and the pellet discarded. The supernatant was incubated with Ni-NTA resin at 4℃ for 1 hour and subsequently eluted with imidazole elution buffer (50 mmol / L Na3PO4, pH 8.0, 500 mmol / L NaCl, 250 mmol / L imidazole) . The eluate contained the target recombinant proteins.

[0267] SDS-PAGE analysis and Coomassie staining were performed to assess expression and approximate molecular weights. An SDS-PAGE gel was prepared with a stacking gel concentration of 4.5%and a separating gel concentration of 12.5%. Samples were loaded and electrophoresed at 90 V until the bands compressed into a straight line at the interface of the stacking and separating gels, then at 120 V until electrophoresis was complete. After electrophoresis, the gel was briefly soaked in 50 mL deionized water and heated to boiling, and the water was then discarded. Next, 25 mL Coomassie Brilliant Blue staining solution was added, the gel was boiled for 60 seconds, heating was stopped, and shaking was continued for 5 minutes. The staining solution was discarded at that point, with protein bands now visible. The gel was soaked in 50 mL deionized water, boiled for another 60 seconds, and then shaken for 5 minutes on a shaker; the water was changed to complete destaining, and the results were photographed for observation.

[0268] The protein staining results are shown in FIG. 2, revealing that the actual sizes of the recombinant protein bands for the sGFP-Linker-ANP, sGFP-Linker-BNP, and sGFP-Linker-CNP are between 35-65kDa. . The predicted molecular weights are 48.6 kDa, 248.3 kDa, and 247 kDa, respectively, indicating successful expression of the recombinant proteins. Example 3. Transfection of recombinant protein chimeras into cells

[0269] HeLa cells were seeded in advance into a 24-well plate one day prior to treatment and cultured overnight in high-glucose DMEM supplemented with 10%FBS to allow adherence and reach approximately 70%confluence by the following day. Cells were maintained under standard conditions (for example, 37℃, humidified atmosphere with 5%CO2) to support viability and reproducibility of uptake assays.

[0270] For protein treatment, the culture supernatant was removed and freshly prepared recombinant proteins were diluted in DMEM supplemented with 10%FBS. The following recombinant proteins were used: sGFP-Linker-ANP, sGFP-Linker-BNP (also referred to herein in some constructs as GFP-Linker-BNP) , and sGFP-Linker-CNP. The protein-containing medium was then added to each well to complete the non-lipid-mediated protein delivery to adherent HeLa cells, which were incubated at 37℃ for 24 hours without disturbance. After incubation, the supernatant was aspirated, cells were washed twice with PBS to remove unbound protein, fresh DMEM supplemented with 10%FBS was added, and fluorescence was observed by fluorescence microscopy. In parallel and under identical conditions, sGFP protein alone was applied as a negative control in order to benchmark nonspecific uptake and intracellular fluorescence background.

[0271] As shown in FIG. 3, fluorescence microscopy revealed readily detectable intracellular fluorescence in HeLa cells treated with sGFP-Linker-ANP, sGFP-Linker-BNP, and sGFP-Linker-CNP, whereas cells treated with sGFP alone exhibited minimal intracellular fluorescence. The comparative increase in intracellular fluorescence for the chimeric constructs relative to sGFP indicates that the recombinant proteins are internalized into HeLa cells via endocytosis under these conditions. These results are consistent with NPR-C-mediated cellular uptake of the constructs, as further corroborated by additional data provided elsewhere in this document. Example 4. Enhancement of recombinant protein chimera cellular endocytosis in HeLa cells with increasing incubation time

[0272] HeLa cells were seeded in advance into 12 wells of a 24-well plate one day prior and cultured overnight in DMEM containing 10%FBS to allow adherence and growth to approximately 70%confluence the next day. Cells were maintained under standard conditions (for example, 37℃ in a humidified atmosphere containing 5%CO2) to support viability and reproducibility across time-point groups for endocytosis assessment.

[0273] The 12 wells were divided into 4 time gradient groups corresponding to 30 min, 1 h, 2 h, and 48 h. In each time group, 3 wells were transfected with the recombinant protein sGFP-Linker-ANP, sGFP-Linker-BNP, or sGFP-Linker-CNP, and the control wells were transfected with sGFP, and the negative control wells were transfected with sGFP. For transfection (here referring to protein treatment / uptake rather than nucleic acid delivery) , the original medium was removed, and sGFP-Linker-ANP, sGFP-Linker-BNP, sGFP-Linker-CNP or sGFP proteins were mixed in advance with DMEM supplemented with 10%FBS and added to the plate to transfect the adherent HeLa cells. After incubation at 37℃ for the designated time points (30 min, 1 h, 2 h, and 24 h) , the supernatant was removed, cells were washed twice with PBS to remove unbound protein, fresh DMEM supplemented with 10%FBS was added, and fluorescence was observed under a fluorescence microscope.

[0274] The results, shown in FIG. 4, indicate that upon transfection of HeLa cells with the recombinant proteins sGFP-Linker-ANP, sGFP-Linker-BNP, and sGFP-Linker-CNP, the fluorescence intensity increased with prolonged incubation time, indicating that the amount of recombinant protein internalized into the cells via endocytosis increased over time. Example 5. Comparison of cellular internalization of recombinant chimeric proteins and positive control sGFP-IgF2mut in HeLa cells.

[0275] The plasmid transfection and observation procedures were the same as in Example 4. The positive control used was sGFP-IgF2mut, the amino acid sequence of which is set forth in SEQ ID NO: 38. The results, shown in FIG. 5, indicate that for sGFP-Linker-ANP and sGFP-IgF2mut recombinant proteins, the fluorescence intensity in HeLa cells increased progressively within 6 h following transfection, reflecting greater intracellular entry of the recombinant proteins by endocytosis as incubation time increased. After 24 h, the fluorescence intensity began to decrease, indicating that the internalized sGFP-Linker-ANP and sGFP-IgF2mut had been degraded. These findings are consistent with time-dependent uptake followed by lysosomal processing and support the use of defined incubation intervals to characterize the kinetics of NPR-C–mediated internalization and degradation. Example 6. Assay of lysosomal degradation capability against target proteins

[0276] Quantitative Analysis of Intracellular Fluorescence in Hela Cells Transfected with Recombinant Protein Chimera sGFP-Linker-BNP Using a Microplate Reader 1. After co-incubating Hela cells with the recombinant protein in a 12-well plate for 24 hours, wash twice with PBS and replace with fresh DMEM+10%FBS medium. Prepare single-cell suspensions at 0 h, 1 h, 2 h, 6 h, 12 h, and 24 h after replacing the medium. 2. Preparation of single-cell suspensions: Remove the supernatant, wash the cells twice with PBS, add 0.1 mL trypsin digestion solution, and digest at 37℃ for 2 minutes. Add 0.2 mL DMEM+10%FBS complete medium to terminate digestion. Centrifuge at 9000 rpm for 5 minutes to collect the cell pellet, wash once with 1 mL PBS, and resuspend the cells to complete the preparation of single-cell suspensions. 3. According to the operating steps for the microplate reader, detect intracellular sGFP fluorescence. Analyze experimental results using Flow Jo software. The microplate reader measured sGFP fluorescence values in the cells at different time points. As shown in Table 5, after transfection with sGFP-BNP recombinant protein, the fluorescence intensity in Hela cells decreased significantly over time, whereas in the control group with lysosomal inhibitor Leupeptin, the fluorescence intensity showed little change. This indicates that, after endocytosis, the degradation of sGFP by lysosomes increases with time. Table 5: Microplate Reader Detection of Intracellular sGFP Fluorescence Values Example 7. Colocalization of recombinant protein chimeras with lysosomes

[0277] n a 24-well plate, HeLa cells were exposed to recombinant proteins to assess lysosomal colocalization under standardized conditions. Specifically, cells were treated with sGFP-Linker-BNP, . The specific transfection steps (here referring to non-lipid-mediated protein treatment / uptake rather than nucleic acid delivery) were as previously described, with an incubation period of 24 hours at 37℃ under normal growth conditions to allow cellular uptake of the recombinant proteins prior to lysosomal labeling.

[0278] For preparation of the lysosomal labeling working solution, a1 mM LysoTracker Red DND-99 lysosomal red fluorescent probe stock solution (Yeasen) was diluted in DMEM supplemented with 10%FBS to a working concentration of 50 nM. For each condition, the appropriate recombinant protein was included at the desired concentration in the same medium, yielding a complete DMEM+10%FBS+lysosomal red fluorescent probe+recombinant protein working solution. This preparation ensured that the lysosomal probe and the recombinant protein were present simultaneously during the labeling period for each experimental and control condition.

[0279] For lysosomal fluorescent probe staining, after the initial 24-hour incubation with the recombinant protein, the culture supernatant was removed and an appropriate amount of the probe-containing working solution pre-warmed to 37℃ was added to each well. Cells were incubated under normal growth conditions for 1 hour to allow adequate probe accumulation in lysosomes. Following incubation, cells were washed twice with PBS to remove excess probe and protein, then replaced with fresh culture medium prior to observation under a fluorescence microscope. This workflow provided consistent conditions for assessing colocalization of internalized recombinant proteins with lysosomal compartments.

[0280] The results, as shown in FIG. 6, demonstrate the colocalization of the sGFP-Linker-BNP recombinant protein chimera with lysosomes. After entering the cell via endocytosis, the chimera is transported to the lysosomes, where it is subsequently degraded. These observations support lysosome-mediated trafficking and processing of the recombinant chimeras under the stated conditions. Example 8. Construction of Mutant Recombinant Protein Chimeras

[0281] Structural prediction and truncation mutations were performed on ANP and BNP to enhance their binding with the lysosomal degradation pathway receptor NPR-C while reducing their binding with NPR-A and / or NPR-B.

[0282] Alphafold3 was applied to predict the complex structures of receptor and ligand proteins. The interface prediction template modeling (iPTM) score was used to assess the predictive accuracy of the relative positions between subunits within the complex. The iPTM score ranges from 0 to 1, with higher scores indicating greater confidence in the predicted interactions. Scores above 0.8 indicate a strong interaction between the receptor and ligand, whereas scores below 0.6 indicate a weak interaction. According to the Alphafold3 predictions of the affinities between ANP, BNP, and their receptors, the results are shown in Table 6. Based on these results, ANP and BNP were subjected to mutations. For example, the original 1-28 amino acids of ANP and BNP were mutated to 1-23 amino acids and 6-22 amino acids, named ANPmut (1-23) and BNPmut (6-22) , respectively.

[0283] As previously described, 9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-ANPmut (1-23) and 9His-2Strep-SUMO-sGFP-Linker-BNPmut (6-22) recombinant plasmids were constructed, expressed in a prokaryotic system, and tested for their ability to target the lysosomal degradation pathway in Hela cell lines. The target protein degradation ability of the optimized mutant recombinant protein chimeras was also evaluated. Figure 7 shows the results of transfecting Hela cells with the ANPmut (1-23) and BNPmut (6-22) recombinant proteins. The results indicate that recombinant proteins sGFP-Linker-ANPmut (1-23) and sGFP-Linker-BNPmut (6-22) can enter cells via endocytosis. Table 6: Affinity Scores of ANP, BNP, CNP and Their Truncated Mutants with NPR-A, NPR-B, and NPR-C Example 9. Assessment of lysosomal degradation of recombinant chimeric proteins

[0284] Lysosomal degradation of recombinant chimeric proteins was evaluated by quantitatively analyzing sGFP recombinant protein in the supernatant of HeLa cells transfected with the recombinant chimeric proteins sGFP-Linker-ANPmut (1–23) , sGFP-Linker-BNP, and sGFP-IgF2mut using Western blotting.

[0285] Western blotting was performed for quantitative analysis of sGFP recombinant proteins in the supernatant of HeLa cells transfected with recombinant protein chimeras sGFP-Linker-ANPmut (1–23) , GFP-Linker-BNP, and sGFP-IgF2mut. HeLa cells in 12-well plates were incubated with recombinant proteins (50 nM) for 0 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h, 72 h, and 96 h; all cell supernatants were collected at each time point. Supernatants were handled under standard conditions to preserve protein integrity prior to electrophoresis, and, where appropriate, clarified by brief centrifugation to remove cellular debris.

[0286] SDS-PAGE gels at the appropriate concentrations for protein molecular weights and 5%stacking gels were prepared. 1×Tris-glycine running buffer was added; sample wells were rinsed with running buffer before loading samples. Samples were quantitated in advance, mixed with equal volume of loading buffer, heated to 100℃ for 5 minutes for denaturation, and loaded. Electrophoresis began at 80 V; once the dye front reached the interface of stacking and separating gel, voltage was adjusted to 100–120 V until the dye reached the bottom. Protein standards were run in parallel to facilitate size estimation.

[0287] Three sheets of filter paper and nitrocellulose membrane were soaked in 1×transfer buffer. From anode to cathode: three sheets of Whatman 3M filter paper, nitrocellulose membrane, gel, three sheets of Whatman 3M filter paper. Bubbles were excluded during placement. Membrane transfer was performed at 10–12 V for 2 hours. Transfer efficiency was verified by brief membrane staining or Ponceau S as needed.

[0288] The nitrocellulose membrane was blocked in blocking solution (1×PBS+5%skim milk) for 1 hour at room temperature. Primary antibody was incubated for 2 hours, then washed 3 times at room temperature in PBST. Diluted secondary antibody was added to a hybridization bag and incubated at room temperature for 1 hour. Washed 3 times in PBST, 5–10 minutes each. Antibody selections were consistent with detection of GFP-tagged proteins, enabling quantitative comparison of residual GFP signal in collected supernatants across time points.

[0289] Equal volumes of solution A and B from the Western Blot Chemiluminescence Luminol Kit were mixed and applied to the membrane to completely cover it. Developed by exposure after acting at room temperature for 2 minutes. Exposure times were adjusted to remain within the linear detection range, and replicate blots or serial dilutions were used as needed to confirm quantitative trends.

[0290] As shown in FIG. 8, with increasing incubation time, the amount of GFP protein in the supernatant of HeLa cells transfected with sGFP-Linker-ANPmut (1–23) , GFP-Linker-BNP, and sGFP-IgF2mut gradually decreases. This demonstrates that, compared with sGFP, the recombinant proteins sGFP-Linker-ANPmut (1–23) , sGFP-Linker-BNP, and sGFP-IgF2mut enter the cells via endocytosis and are degraded. In this context, sGFP served as a negative control (evaluated in parallel or as established in prior control experiments) , reflecting minimal nonspecific uptake and degradation. The observed time-dependent reduction of GFP-tagged chimeras remaining in the supernatant is consistent with NPR-C–mediated internalization followed by lysosomal processing, and aligns with microscopy and colocalization data reported elsewhere in this document. Example 10. Colocalization of recombinant chimeric proteins with lysosome

[0291] In a 24-well plate, HeLa cells were transfected with the recombinant proteins sGFP-Linker-ANPmut (1–23) and GFP-Linker-BNP. Wells transfected with sGFP-IgF2mut served as positive controls, and wells transfected with sGFP served as negative controls. The specific transfection procedures were as described above, and the incubation time was 24 hours.

[0292] Preparation of working solution. A1 mM LysoTracker Red DND-99 lysosomal red fluorescent probe stock solution (Yeasen, 40739ES) was diluted with DMEM containing 10%FBS to a working concentration of50 nM. At the same time, the respective recombinant proteins were added, thereby preparing a DMEM+10%FBS+lysosomal red fluorescent probe+recombinant protein working solution.

[0293] Lysosomal probe staining. After 24 hours of incubation with the recombinant proteins, the culture supernatant was aspirated and an appropriate volume of 37℃ pre-warmed working solution containing the probe was added. The cells were incubated under normal growth conditions for 1 hour. At the end of incubation, the cells were washed twice with PBS, the staining solution was replaced with fresh culture medium, and the cells were observed under a fluorescence microscope.

[0294] As shown in Figure 9, the recombinant chimeric proteins sGFP-Linker-ANPmut (1–23) , GFP-Linker-BNP, and sGFP-IgF2mut colocalized with lysosomes, indicating that, after internalization into cells via endocytosis, the chimeric proteins were trafficked to lysosomes and subsequently degraded therein. Example 11. Validation of the binding ability between recombinant protein chimeras and NPR-C in CHO-K1 cells

[0295] To assess the binding capability of recombinant protein chimeras to natriuretic peptide receptor C (NPR-C) , CHO-K1 cells-which are naturally deficient for both NPR-C and NPR-A expression-were utilized as a model system. A pcDNA3.1 (-) -NPRC-mCherry dual-promoter driven plasmid was constructed, enabling simultaneous expression of NPR-C (SEQ ID No. 42) and mCherry (SEQ ID No. 40) in transfected cells. This dual-promoter construct facilitated both the functional expression of the receptor and the identification of transfected cells by red fluorescence.

[0296] CHO-K1 cells were seeded into 6-well plates and cultured in complete medium until reaching 60–70%confluence, which provided optimal conditions for subsequent transfection. For plasmid transfection, the culture medium was replaced with serum-free Ham’s F-12K. Two transfection mixtures were prepared separately: (a) 125μL Opti-MEM containing 2.5μg pcDNA3.1 (-) -NPRC-mCherry plasmid and 5μL P3000 reagent; and (b) 125μL Opti-MEM containing 5μL Lipofectamine 3000. After a 5-minute incubation at room temperature, mixture (a) was combined with mixture (b) and incubated for an additional 15 minutes to allow complex formation. The resulting mixture was then added dropwise to the cells. After 6 hours, the medium was replaced with complete growth medium to support cell viability and expression of the introduced genes.

[0297] Approximately 24 hours post-transfection, the cells were incubated with 500 nM sGFP-Linker-ANPmut (4–23) chimera in the culture medium for 5 minutes at 4℃. Incubation at this temperature was chosen to allow binding of the recombinant protein to cell surface-expressed NPR-C while minimizing endocytosis, thereby permitting clear visualization of membrane localization.

[0298] Following incubation with the chimera, the cells were washed twice with cold PBS to remove unbound protein, then fixed with 1 mL of paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature to preserve cellular structures and protein-protein interactions. After fixation, the cells were washed once with PBS and prepared for fluorescence microscopy by mounting with PBS as the mounting medium. Cells expressing mCherry (red fluorescence) indicated successful transfection and NPR-C expression.

[0299] As shown in FIG. 10, green fluorescence corresponding to the sGFP-tagged chimera was observed on the plasma membrane of mCherry-expressing CHO-K1 cells, indicating that the sGFP-Linker-ANPmut (4–23) chimera binds specifically to NPR-C expressed on the cell surface. The colocalization of green (sGFP) and red (mCherry) fluorescence provided direct evidence of the interaction between the recombinant chimera and NPR-C. This experimental approach and observed membrane localization confirm the specific binding capability of the engineered chimeric construct to NPR-C in a controlled cellular context. Example 12. NPR-C-mediated internalization of recombinant chimeric proteins in CHO-K1 cells

[0300] CHO-K1 cells were seeded in 6-well plates and cultured in complete medium until they reached 60–70%confluence, after which transfection was performed with the plasmid pcDNA3.1 (-) -NPR-C-mCherry. At 24 hours post-plasmid transfection, the culture medium was supplemented with 500 nM of the sGFP-Linker-ANPmut (4–23) chimeric protein, followed by incubation at 4℃ for 5 minutes or at 37℃ for 24 hours. After washing, the cells were observed under a fluorescence microscope.

[0301] As shown in Figure 11, cells exhibiting mCherry fluorescence were considered NPR-C-positive. Under the condition of incubation at 4℃ for 5 minutes, GFP-ANP (4–23) was bound to the plasma membrane of mCherry-positive cells. After incubation at 37℃ for 24 hours, GFP fluorescence was observed within the cell interior, demonstrating that the protein chimeric construct can undergo NPR-C-mediated internalization into cells. Example 13. Mutation optimization of ANP, BNP and CNP in recombinant protein chimera

[0302] To guide the rational design of NPR-C-binding domains with enhanced specificity and optimized receptor engagement, computational approaches were employed to predict the binding affinity of a series of chimeric protein variants to NPR-C, NPR-A, and NPR-B. Truncation mutations were first introduced into the native ANP and BNP sequences, such as truncating ANP from the original 1–28 amino acids to a shorter 1–23 amino acid variant, termed ANPmut (1–23) . AlphaFold3, a state-of-the-art protein structure prediction platform, was utilized to model the receptor–ligand complexes formed by wild-type and mutant ANP, BNP, and CNP peptides with their respective receptors. Interface template modeling (iPTM) scores were calculated for each predicted complex. These scores, which range from 0 to 1, provide a quantitative measure of confidence in the predicted spatial relationship between the protein subunits; higher iPTM scores indicate more reliable predicted interactions. In general, an iPTM score greater than 0.8 is interpreted as evidence of a strong receptor–ligand interaction, while a score less than 0.6 suggests weak or uncertain binding.

[0303] The predicted binding affinities of wild-type ANP, BNP, CNP, and their truncation mutants to NPR-A, NPR-B, and NPR-C are summarized in Table 4 below. The data demonstrate that truncation of ANP and BNP peptides can modulate their receptor specificity and binding strength. For example, ANPmut (4–23) achieved an iPTM score of 0.88 with NPR-C (compared to 0.69 for ANP WT) , while reducing its affinity for NPR-A. Similarly, BNPmut (6–22) showed improved binding to NPR-C (iPTM 0.80) relative to BNP WT (iPTM 0.62) . Table 4: Affinity scores of ANP, BNP, CNP, and truncation mutants with NPR-A, NPR-B, and NPR-C

[0304] Building upon these initial findings, additional point mutations were systematically introduced into the truncated mutants ANPmut (4–23) , BNPmut (6–22) , as well as into CNP, with the goal of further refining receptor specificity and affinity. The AlphaFold3 platform was again used to predict the binding affinity of each mutant for NPR-A, NPR-B, and NPR-C, allowing for the identification of variants that exhibited higher affinity for NPR-C and lower or negligible affinity for NPR-A and NPR-B. Table 5 below presents the iPTM scores for a representative subset of these point mutants, highlighting the impact of specific substitutions (e.g., S6M, S6Q, R4C, R4V, R14P, R14H for ANPmut (4–23) ; S8N, G9C, I18V for BNPmut (6–22) ; K4I, F7A, F7E for CNP) on receptor binding preferences. Table 5: Affinity scores of ANP, BNP, and CNP point mutants with NPR-A, NPR-B, and NPR-C.

[0305] Further, double-point mutants were generated by combining beneficial single mutations in ANPmut (4–23) , and their predicted affinities for NPR-A and NPR-C were assessed using the same methodology. Table 6 presents a selection of these double-point mutants, illustrating the ability to achieve high predicted affinity for NPR-C (iPTM scores up to 0.89) while maintaining reduced or moderate affinity for NPR-A, thereby achieving improved receptor selectivity.  Table 6: Affinity scores of ANPmut (4-23) double-point mutants with NPR-A and NPR-C.

[0306] These computational predictions provided a rational framework for prioritizing the design and experimental evaluation of NPR-C-binding domain variants with enhanced specificity and affinity. By systematically introducing and evaluating truncations and point mutations, the platform identified sequence modifications that improved NPR-C engagement while minimizing cross-reactivity with NPR-A and NPR-B. This in silico approach guided the construction of chimeric molecules with optimized targeting properties for use in lysosome-mediated protein degradation applications, as described elsewhere in this document. The methodology can be extended to additional variants and targets to further refine the specificity and performance of NPR-C-directed chimeras. Example 14. Validation of the binding ability of recombinant protein chimeras with NPR-Ain CHO-K1 cells

[0307] To investigate the specificity of recombinant protein chimeras for natriuretic peptide receptor A (NPR-A) as compared to NPR-C, a dual-promoter expression system was employed to ectopically express NPR-A in CHO-K1 cells. A pcDNA3.1 (-) -NPRA-mCherry dual-promoter driven plasmid was constructed, which enabled co-expression of the NPR-A receptor (SEQ ID No. 44) including its transmembrane and extracellular domains) and the mCherry (SEQ ID No. 40) fluorescent reporter in the same cell, facilitating both receptor function and identification of successfully transfected cells.

[0308] CHO-K1 cells were seeded in 6-well plates and cultured in complete growth medium until they reached approximately 60–70%confluence, providing optimal conditions for transfection. The protocol for plasmid transfection followed the same procedures described in Example 11. Briefly, two transfection mixtures were prepared separately: (a) 125μL Opti-MEM containing 2.5μg pcDNA3.1 (-) -NPRA-mCherry plasmid and 5μL P3000 reagent; and (b) 125 μL Opti-MEM containing 5μL Lipofectamine 3000. After incubation at room temperature for 5 minutes, mixture (a) was combined with mixture (b) and incubated for an additional 15 minutes to form DNA-lipid complexes. The combined mixture was added to the CHO-K1 cells. After 6 hours, the medium was replaced with complete growth medium to promote cell recovery and expression of the transfected genes.

[0309] After 24 hours of expression, the transfected CHO-K1 cells were treated with GFP-ANP(WT) , GFP-ANP (4–23) , or GFP-ANP (4–23+S6Q) recombinant proteins, each diluted in fresh culture medium to the appropriate concentration. The cells were incubated with these recombinant proteins for a defined period to enable binding to cell surface-expressed NPR-A. Following the incubation, cells were washed to remove unbound protein, fixed with paraformaldehyde to preserve protein-receptor interactions and cellular structures, and then prepared for fluorescence microscopy with PBS as the mounting medium.

[0310] The results, as presented in FIG. 12, showed that green fluorescence (indicative of the sGFP-tagged recombinant protein) was clearly observed on the plasma membrane of mCherry-expressing CHO-K1 cells treated with GFP-ANP (WT) , indicating that GFP-ANP (WT) binds specifically to NPR-A expressed on the cell surface. In contrast, no green fluorescence was detected on the plasma membrane of mCherry-expressing cells following incubation with GFP-ANP(4–23) or GFP-ANP (4–23+S6Q) , suggesting that the truncated or mutated variants do not bind, or bind only very weakly, to NPR-A. These observations confirm the altered binding affinities of the engineered variants and highlight the specificity of the wild-type construct for NPR-A, providing additional evidence for the selectivity of binding by the NPR-C-targeted chimeric constructs described herein. Example 15. Affinity detection of recombinant protein chimeras with NPR-C in CHO-K1 cells

[0311] To quantitatively evaluate the binding affinity of various recombinant protein chimeras for NPR-C, a CHO-K1 cell model was established using a pcDNA3.1 (-) -NPRC-mCherry dual-promoter plasmid. This system enables simultaneous expression of NPR-C and mCherry, allowing both receptor function and identification of transfected cells via red fluorescence. CHO-K1 cells were seeded into 10 cm dishes and cultured in complete medium until reaching 60–70%confluence, which is optimal for efficient transfection.

[0312] For transfection, the culture medium was replaced with serum-free Ham’s F-12K to facilitate uptake of DNA-lipid complexes. Two transfection mixtures were prepared: mixture (a) containing 750μL Opti-MEM, 15μg pcDNA3.1 (-) -NPRC-mCherry plasmid, and 30μL P3000 reagent; and mixture (b) containing 750μL Opti-MEM and 30μL Lipofectamine 3000. After separate incubation for 5 minutes at room temperature, mixture (a) was added to mixture (b) , and the combined mixture was incubated for an additional 15 minutes to form complexes. The entire mixture was then added to the CHO-K1 cells. After 6 hours, the medium was replaced with complete growth medium to support cell viability and receptor expression.

[0313] Twenty-four hours post-transfection, the cells were harvested using trypsinization, washed twice with PBS to remove residual medium and trypsin, counted, and resuspended to a final concentration of approximately 1×106 cells / mL in PBS supplemented with 2%FBS. This preparation ensured uniform cell density and minimized nonspecific binding.

[0314] Protein solutions of the recombinant chimeras were prepared at concentrations ranging from 1.5×10-11 M to 5 M to enable generation of a binding saturation curve. For each sample, 200μL of the protein solution was combined with 100μL of the cell suspension (final concentration: 1×105 cells per sample) and incubated at 4℃ for 5 minutes. The low temperature was used to promote receptor-ligand binding at the plasma membrane while minimizing endocytosis, thus ensuring that detected fluorescence reflected surface binding.

[0315] After incubation, the cells were rapidly washed twice (1500 rpm, 5 minutes, 4℃) to remove unbound protein, fixed with paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature, washed once more with PBS, and resuspended in 200μL cold buffer for flow cytometry analysis. These steps preserved cell surface receptor-ligand complexes and minimized loss of bound fluorescent protein.

[0316] Flow cytometry was used to quantify the median fluorescence intensity (MFI) of GFP within the mCherry-positive (transfected) population. The MFI values were plotted against the concentration of the recombinant chimera to generate binding curves for each construct. Saturation binding curves were fitted to determine the equilibrium dissociation constant (Kd) for NPR-C interaction.

[0317] Results showin in FIG. 13 indicated that all tested truncated and point-mutant constructs exhibited higher binding affinity to NPR-C compared to wild-type ANP, with the exception of sGFP-Linker-ANP (4–23+S6M+R4C) , which showed notably reduced binding. This decreased affinity is likely due to the introduction of a cysteine at position 4, which may disrupt the cyclic structure essential for NPR-C recognition. These data confirm that rational design of truncations and point mutations in the ANP sequence can significantly enhance NPR-C binding, but that certain substitutions may adversely impact receptor engagement. This information informs the selection of optimal NPR-C-binding domains for use in targeted degradation platforms. Example 16. Affinity detection of recombinant protein chimeras with NPR-A in CHO-K1 cells

[0318] To evaluate the binding affinity of recombinant protein chimeras for natriuretic peptide receptor A (NPR-A) , CHO-K1 cells were engineered to express NPR-A using a dual-promoter system. Specifically, a pcDNA3.1 (-) -NPRA-mCherry dual-promoter plasmid was constructed to enable co-expression of the NPR-A receptor (including its transmembrane and extracellular domains) and the mCherry fluorescent protein. This system allowed for both functional receptor expression and identification of transfected cells by red fluorescence.

[0319] CHO-K1 cells were seeded into 10 cm dishes and cultured in complete medium until they reached 60–70%confluence. Transfection was carried out using the same protocol as described in Example 15. Two mixtures were prepared: mixture (a) containing 750μL Opti-MEM, 15μg pcDNA3.1 (-) -NPRA-mCherry plasmid, and 30μL P3000 reagent; and mixture (b) containing 750μL Opti-MEM and 30μL Lipofectamine 3000. After 5 minutes of separate incubation at room temperature, mixture (a) was combined with mixture (b) and incubated for an additional 15 minutes. The combined mixture was then added to the CHO-K1 cells. After 6 hours, the medium was replaced with complete growth medium to allow cell recovery and receptor expression.

[0320] Twenty-four hours after transfection, the cells were harvested by trypsinization, washed twice with PBS, counted, and resuspended in PBS containing 2%FBS to a final concentration of approximately 1×106 cells / mL. The cells were then incubated with varying concentrations of recombinant protein chimeras, such as GFP-ANP (WT) , GFP-ANP (4–23) , and GFP-ANP (4–23+S6Q) , at 4℃ for 5 minutes to ensure binding to surface-expressed NPR-A and to minimize endocytosis. Following incubation, the cells were washed twice (1500 rpm, 5 minutes, 4℃) to remove unbound proteins, fixed with paraformaldehyde for 10 minutes at room temperature, washed again, and resuspended in cold buffer for flow cytometry analysis.

[0321] Flow cytometry was performed to measure the median fluorescence intensity (MFI) of GFP within the mCherry-positive (transfected) cell population. Binding curves were generated by plotting MFI against the concentration of each recombinant protein chimera. These curves allowed for comparison of affinity among the various constructs for NPR-A.

[0322] As shown in FIG. 14, all truncated and point-mutant variants-including those with single or double amino acid substitutions-exhibited markedly reduced or negligible binding to NPR-A compared with wild-type GFP-ANP (WT) . This result was observed across all tested concentrations and is consistent with the data in Example 8, confirming that the engineered chimeric variants broadly lose or greatly reduce their affinity for NPR-A while retaining or enhancing their affinity for NPR-C. This supports the specificity of the platform for NPR-C–mediated targeted degradation. This flow cytometry-based affinity assessment provides quantitative validation of the engineered selectivity of the chimeric constructs and demonstrates that the observed effect is generalizable across a range of truncation and mutation combinations. Example 17. Determination of the binding affinity of mutant recombinant chimeric proteins for NPR-A, NPR-B, and NPR-C

[0323] Determination of the affinity between the NPR-C-binding moiety of the chimeric proteins and members of the NPR receptor family by time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET) . NPR-A, NPR-B, or NPR-C was labeled with a donor fluorophore, and the NPR-C-binding moiety within the chimeric protein was labeled with an acceptor fluorophore. When the two components bind, the excitation energy of the donor is transferred to the acceptor, generating a detectable FRET signal. A time-resolved fluorescence plate reader was used to measure the fluorescence signal within a defined time window, thereby reducing background interference and enabling quantitative analysis of the binding affinities of the chimeric proteins for the different receptors.

[0324] Indirect evaluation of affinity by measuring changes in cyclic guanosine monophosphate (cGMP) downstream of the NPR-A and NPR-B signaling pathways. Upon binding of ANP, BNP, or CNP to NPR-A or NPR-B, the intracellular level of the second messenger cGMP is increased. Thus, changes in cGMP levels can reflect the binding of these ligands to NPR-A / B receptors. HeLa cells were treated with the mutant recombinant chimeric proteins for 24 hours, after which cell lysates were collected and cellular cGMP levels were determined by Western blot analysis. Binding of ANP / BNP / CNP to NPR-A / B receptors leads to an increase in cGMP content in the downstream signaling pathway. Example 18. Assay of degradation capability of recombinant protein chimeras in mice

[0325] To evaluate the in vivo degradation capability of recombinant protein chimeras designed to target specific substrates for lysosomal processing, a model system was established utilizing MS2 bacteriophage virus-like particles (VLPs) encapsulating SARS-CoV-2–derived nucleic acid sequences. The MS2 bacteriophage is a single-stranded RNA phage that primarily infects Escherichia coli and other Gram-negative bacteria, with a genome composed of positive-sense single-stranded RNA. This system permits packaging of exogenous nucleic acids within VLPs, enabling quantitative assessment of nucleic acid clearance from the circulation following administration of candidate chimeras.

[0326] In this experiment, a nanobody (Nb) -a single-domain antibody fragment known for its small molecular weight, high stability, and ease of engineering-was selected for its ability to bind the MS2 coat protein. The Nb (SEQ ID No. 46) was genetically fused to an atrial natriuretic peptide (ANP) variant via a linker to generate an Nb-ANP lysosomal targeting chimera. This design enabled the specific recognition of MS2 VLPs by the nanobody, while the ANP domain facilitated targeted engagement of the NPR-C receptor pathway for subsequent internalization and lysosomal degradation.

[0327] The experimental protocol involved intravenous injection of MS2 VLPs and the engineered Nb-ANP chimera into male ICR mice (8 weeks old) . Seventeen mice were randomly divided into four treatment groups: (1) NS group (negative control) receiving 10μL saline; (2) VLP group receiving 50μL VLP+100μL saline; (3) VLP+Nb group receiving 50μL VLP+100μL MS2Nb (10μg) ; and (4) VLP+Nb-ANP (1–23) group receiving 50μL VLP+100μL MS2Nb-ANP (1–23) (10μg) . The concentration of coated VLPs was approximately 5×1010 copies / mL, resulting in an administration of roughly 2.5×109 VLP copies per mouse. This dosing strategy was designed to allow for robust detection of VLP-derived nucleic acids in the circulation and to enable quantitative comparisons between groups.

[0328] Blood samples (100μL) were collected from the tail vein of each mouse at 15 minutes, 6 hours, 24 hours, and 48 hours post-injection. Total RNA was extracted from each sample using the Trizol method, ensuring efficient recovery and preservation of both exogenous and endogenous RNA species. Quantitative real-time PCR (qPCR) was performed to measure levels of the ORF-1ab region (FAM-labeled) and the N gene (ROX-labeled) from the SARS-CoV-2 sequence, providing a sensitive and specific readout of the VLP nucleic acid content remaining in the circulation over time.

[0329] The results, as shown in FIG. 15, revealed a significant increase in theΔCq value (the cycle threshold difference between 48 hours and 15 minutes) in the VLP+Nb-ANP (1–23) group relative to all other groups. This increase indicated a marked reduction in the abundance of VLP-encapsulated RNA in the blood, demonstrating that the Nb-ANP (1–23) chimera effectively promoted in vivo degradation of the MS2 VLPs. In contrast, the VLP group and the VLP+Nb group (lacking the ANP lysosomal targeting domain) showed much lowerΔCq values, indicating persistence of VLP nucleic acids in these animals.

[0330] These findings provide direct in vivo evidence that the NPR-C–engaging, target-specific chimeric molecules described in this application are capable of mediating rapid and efficient lysosomal degradation of exogenously delivered targets, such as VLPs. The use of a quantifiable nucleic acid readout, combined with the modularity of the Nb-ANP chimera, further supports the potential for this platform to be adapted to a variety of disease-relevant substrates and demonstrates translational relevance for therapeutic applications targeting pathogenic molecules for lysosomal clearance in living organisms. Example 19. Measurement of ternary complex formation and target protein endocytosis mediated by antibody-Linker-ANP1-23 chimeras

[0331] To assess the ability of antibody-Linker-ANP1–23 chimeras to mediate ternary complex formation and facilitate cellular uptake of disease-associated target proteins via NPR-C engagement, a CHO-K1 cell-based assay system was established. CHO-K1 cells were seeded into 6-well plates and cultured in complete medium until they reached approximately 60–70%confluence. At this stage, the cells were transfected with a pcDNA3.1 (-) -NPRC-mCherry dual-promoter plasmid, which enables simultaneous expression of NPR-C and mCherry fluorescence for identification of successfully transfected cells. The transfection protocol followed standard lipid-mediated procedures as described in prior examples, ensuring robust surface expression of NPR-C.

[0332] Twenty-four hours after transfection, the cells were exposed to pre-mixed protein complexes designed to evaluate the internalization of target proteins. Specifically, mixtures containing 100 nM Alexa-488-labeled human TNF-α (as a model target protein) with 100 nM TNF-α-specific antibody Adalimumab-Linker-ANP1–23 were added to the cells. These mixtures were incubated with the NPR-C–expressing CHO-K1 cells at 37℃ for 24 hours, allowing for the formation of ternary complexes (antibody-Linker-ANP1–23 chimera bound to target and NPR-C) and subsequent internalization via receptor-mediated endocytosis.

[0333] After incubation, cellular uptake of the Alexa-488-labeled target proteins was quantified by flow cytometry. Cells were washed thoroughly to remove unbound and extracellular protein, then analyzed for Alexa-488 fluorescence intensity (indicative of internalized target protein) within the mCherry-positive (NPR-C–expressing) cell population. A positive control consisting of 400 nM GFP-Linker-ANP4–23 incubated at 37℃ for 24 hours was included to validate the assay and provide a reference for successful NPR-C–mediated internalization.

[0334] The results (FIG. 16) demonstrated robust internalization of TNF-αin CHO-K1 cells expressing NPR-C when treated with their corresponding antibody-Linker-ANP1–23 chimeras, as evidenced by increased Alexa-488 fluorescence in the mCherry-positive cell population. This effect was not observed in control conditions lacking the ANP1–23 targeting domain or in non-transfected cells. These findings confirm the ability of the engineered chimeric molecules to mediate targeted endocytosis and cellular uptake of disease-associated proteins via NPR-C engagement, providing a mechanistic foundation for subsequent lysosomal degradation of the target and supporting the modular utility of the described platform for a broad range of therapeutically relevant proteins. Example 20. Measurement of endocytosis and degradation of hTNF-αmediated by TNF-α-specific antibody Adalimumab-Linker-ANP1-23

[0335] To investigate the capacity of the TNF-α-specific antibody Adalimumab-Linker-ANP1–23 chimera to facilitate the endocytosis and subsequent degradation of human tumor necrosis factor-alpha (hTNF-α) via NPR-C engagement, a cellular assay was conducted utilizing CHO-K1 cells engineered to express NPR-C. CHO-K1 cells were seeded into 6-well plates and cultured in complete growth medium until they reached approximately 60–70%confluence. At this stage, the cells were transfected with the pcDNA3.1 (-) -NPRC-mCherry plasmid using standard lipid-mediated transfection as described in prior examples, enabling both robust surface expression of NPR-C and identification of transfected cells via mCherry fluorescence.

[0336] Twenty-four hours post-transfection, the cells were treated with a pre-mixed solution containing 100 nM hTNF-αand 100 nM Adalimumab-Linker-ANP1–23 chimera, which was added directly to the culture medium. The cells were incubated at 37℃ for 24 hours to allow for the formation of ternary complexes (TNF-αbound by the antibody chimera and engaged with NPR-C) and for receptor-mediated endocytosis to occur. After the 24-hour incubation, the medium containing hTNF-αand the chimera was removed, and the cells were washed three times with PBS to ensure thorough removal of residual unbound TNF-αand chimera from the extracellular milieu.

[0337] Following the removal of extracellular protein, fresh growth medium was added, and the cells were further incubated at 37℃ for additional time intervals of0 hours, 4 hours, 8 hours or 24 hours to monitor the kinetics of internalized TNF-αdegradation. At each designated time point, the cells were lysed using appropriate lysis buffer to extract total cellular protein.

[0338] Western blot analysis was then performed on the cell lysates to detect and quantify the levels of internalized or residual hTNF-α. Proteins were resolved by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose membranes, and probed with antibodies specific for hTNF-α. Signal intensity was quantified to assess the degree of TNF-αdegradation over time.

[0339] The results demonstrated a progressive decrease in the amount of internalized hTNF-αin CHO-K1 cells expressing NPR-C following treatment with the Adalimumab-Linker-ANP1–23 chimera (FIG. 17) . The reduction in TNF-αsignal at later time points (4 hours and 24 hours post-wash) indicated efficient lysosomal degradation of the internalized target protein. These findings confirm that the NPR-C–targeted antibody chimera mediates both the cellular uptake and the subsequent lysosomal degradation of hTNF-αin a receptor-dependent manner, supporting the mechanistic basis of this platform for targeted protein clearance and therapeutic application. Example 21. Targeted degradation of the cell membrane protein epidermal growth factor receptor (EGFR) using recombinant chimeric proteins

[0340] Cetuximab (Ctx) , an anti-EGFR antibody, is used as the EGFR-targeting moiety and is linked at its Fc terminus via a linker to ANP, BNP, or CNP mutants to achieve targeted degradation of EGFR, using an ANP mutant as an example.

[0341] Preparation of the Ctx-ANP (mut) recombinant chimeric protein. A9His-2Strep-SUMO-Ctx-Linker-ANP (mut) -pRSF plasmid was constructed. The plasmid was transformed into an E. coli expression strain for protein expression, and the recombinant chimeric protein was harvested and purified.

[0342] Clearance of cell-surface EGFR by the Ctx-ANP (mut) recombinant chimeric protein. HeLa cells were treated with Ctx-ANP for 24 hours, after which EGFR levels on the cell surface were analyzed by flow cytometry.

[0343] Degradation of EGFR by the Ctx-ANP (mut) recombinant chimeric protein. HeLa cells were treated with Ctx-ANP for 24 hours, cell lysates were collected, and cellular EGFR levels were determined by Western blot analysis.

[0344] Evaluation of the dose dependence of EGFR degradation by the Ctx-ANP (mut) recombinant chimeric protein. HeLa cells were treated with different concentrations of Ctx-ANP for 24 hours, and EGFR clearance and degradation were assessed by flow cytometry and Western blot analysis, respectively. INFORMAL SEQUENCE LISTING

[0345] The above embodiments are merely provided to illustrate the technical solutions of the present invention and should not be construed as limiting it. Although the present invention has been described in detail with reference to the foregoing embodiments, those of ordinary skill in the art should understand that modifications may still be made to the technical solutions described in the above embodiments, or some or all of the technical features may be equivalently substituted. These modifications or substitutions do not depart from the essence of the corresponding technical solutions as defined by the appended claims.

[0346] It will be understood by those skilled in the art that the disclosed compositions, methods, and uses may be modified in various ways without departing from the scope of the claims. All such modifications, equivalents, and variations are intended to be included within the scope of this disclosure. The domains, sequences, linkers, or carrier systems described herein may be substituted, optimized, truncated, extended, circularized, multimerized, or otherwise altered, so long as the resulting molecule retains at least one desired property (e.g., NPR-C binding, target engagement, or lysosomal trafficking) .

[0347] The invention is not limited to the specific constructs, sequences, or exemplified targets described herein, but encompasses any variant, analog, derivative, or homolog that is functionally equivalent as determined by standard biochemical,biophysical,or cellular assays.

Claims

1.A chimeric molecule comprising a natriuretic peptide receptor C (NPR-C) -binding domain and a target-binding domain.2.The chimeric molecule of claim 1, wherein the NPR-C-binding domain andthe target-binding domain are connected via a linker.3.The chimeric molecule of claim 1 or 2, wherein the NPR-C-binding domain comprises an atrial natriuretic peptide (ANP) protein, B-type natriuretic peptide (BNP) protein, C-type natriuretic peptide (CNP) protein, or a variant thereof.4.The chimeric molecule of claim 3, wherein the ANP, BNP, or CNP protein comprises an amino acid sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 16, or SEQ ID NO. 20, respectively.5.The chimeric molecule of claim 4, wherein the ANP, BNP, or CNP protein comprises an amino acid sequence having at least 85%identity with SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 16, or SEQ ID NO. 20, respectively.6.The chimeric molecule of claim 5, wherein the ANP, BNP, or CNP protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 16, or SEQ ID NO. 20, respectively.7.The chimeric molecule of claim 3, wherein the ANP protein variant is a truncated variant of the ANP protein.8.The chimeric molecule of claim 7, wherein the ANP protein variant comprises a sequence having at least 80%identity with amino acid residues 1–23 of SEQ ID NO: 12.9.The chimeric molecule of claim 7 or 8, wherein the ANP protein variant comprises a sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 30, or SEQ ID NO. 32.10.The chimeric molecule of claim 9, wherein the ANP protein variant comprises a sequence having at least 85%identity with SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 30, or SEQ ID NO. 32.11.The chimeric molecule of any one of claims 7–10, wherein the ANP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 14 modified with one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, R4W, R14P, R14H, and R14K.12.The chimeric molecule of any one of claims 7–10, wherein the ANP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 30 modified with one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, R4W, R14P, R14H, and R14K.13.The chimeric molecule of any one of claims 7–10, wherein the ANP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 32 modified with one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R14P, R14H, and R14K.14.The chimeric molecule of claim 7, wherein the BNP protein variant is a truncated variant of the BNP protein.15.The chimeric molecule of claim 14, wherein the BNP protein variant comprises a sequence having at least 80%identity with amino acid residues 6–23 of SEQ ID NO: 16.16.The chimeric molecule ofclaim 14 or 15, wherein the BNP protein variant comprises a sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO: 18.17.The chimeric molecule of claim 16, wherein the BNP protein variant comprises a sequence having at least 85%identity with SEQ ID NO: 18.18.The chimeric molecule of any one of claims 14–17, wherein the BNP protein variant comprises the amino acid sequence ofSEQ ID NO: 18 modified with one or more substitutions selected from S8N, S8T, S8A, S8Q, G9D, G9S, G9I, G9N, G9T, G9Q, G9C, G9Y, D16E, R17Q, I18A, and I18V.19.The chimeric molecule of claim 7, wherein the CNP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 modified with one or more substitutions selected from K4I, K4H, F7A, F7E, F7G, F7S, F7T, F7Y, F7Q, F7R, and F7K.20.The chimeric molecule of any one of claims 1–19, wherein the target-binding domain comprises a protein, such as an antibody or fragment thereof, areceptor or ligand domain, or polypeptide or cyclic peptide, including peptide aptamer and antibody mimetics, , a nucleic acid aptamer, or a small molecule inhibitor.21.The chimeric molecule of any one of claims 1–20, wherein the targeting domain binds a tumor necrosis factor superfamily protein, an interleukin (IL) , epidermal growth factor receptor (EGFR) , programmed death ligand 1 (PD-L1) , human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) , aG protein-coupled receptor (GPCR) , fibroblast growth factor receptor (FGFR) , vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) , cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4) , interleukin-5 receptor alpha subunit (IL-5Rα) , an immunoglobulin (Ig) , apathogenic autoantibody, acluster of differentiation (CD) antigen, tumor-associated calcium signal transducer 2 (TACSTD2) , mesothelin, glypican-3 (GPC3) , integrin-associated protein (IAP) , an integrin, adiscoidin domain receptor (DDR) , cytoskeleton-associated protein 4 (CKAP4) , carbonic anhydrase IX (CAIX) , secreted phosphoprotein 1 (SPP1) , transthyretin (TTR) , misfolded transthyretin (ATTR) , Activin E (ActE) , Activin receptor like kinase 7 (ALK7) , transmembrane protein 158 (TMEM158) , carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 (CEACAM5) , or proteins on extracellular vesicles (e.g., exosomal proteins) .22.The chimeric molecule ofclaim 21, wherein the targeting domain binds to tumor necrosis factor (TNFα) , tumor necrosis factor-like ligand 1A (TL-1A) , IL-17. IL-23, IgA, IgG, IgM, IgD, IgE, galactose-deficient IgA (Gd-IgA) , CD19, CD44, or CD47.23.A peptide that specifically binds to natriuretic peptide receptor C (NPR-C) , wherein the peptide is a non-naturally occurring variant ofan ANP protein, BNP protein, or CNP protein.24.The peptide of claim 23, wherein the ANP, BNP, or CNP protein comprises an amino acid sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 16, or SEQ ID NO. 20, respectively.25.The peptide of claim 23, wherein the ANP protein variant is a truncated variant of the ANP protein.26.The peptide of claim 25, wherein the ANP protein variant comprises a sequence having at least 80%identity with amino acid residues 1–23 ofSEQ ID NO: 12.27.The peptide ofclaim 25 or 26, wherein the ANP protein variant comprises a sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 30 or SEQ ID NO. 32.28.The peptide ofany one ofclaims 25–27, wherein the ANP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 14 modified with one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, R4W, R14P, R14H, and R14K.29.The peptide ofany one ofclaims 25–27, wherein the ANP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 30 modified with one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R4C, R4E, R4K, R4V, R4Y, R4W, R14P, R14H, and R14K.30.The peptide of any one ofclaims 25–27, wherein the ANP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO. 32 modified with one or more substitutions selected from S6M, S6Q, R14P, R14H, and R14K.31.The peptide of claim 23, wherein the BNP protein variant is a truncated variant of the BNP protein.32.The peptide of claim 31, wherein the BNP protein variant comprises a sequence having at least 80%identity with amino acid residues 6–23 ofSEQ ID NO: 16.33.The peptide ofclaim 31 or 32, wherein the BNP protein variant comprises a sequence having at least 80%identity with SEQ ID NO: 18.34.The peptide ofany one ofclaims 31–33, wherein the BNP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 modified with one or more substitutions selected from S8N, S8T, S8A, S8Q, G9D, G9S, G9I, G9N, G9T, G9Q, G9C, G9Y, D16E, R17Q, I18A, and I18V.35.The peptide of claim 23, wherein the CNP protein variant comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 modified with one or more substitutions selected from K4I, K4H, F7A, F7E, F7G, F7S, F7T, F7Y, F7Q, F7R, and F7K.36.A nucleic acid encoding the chimeric molecule ofany one ofclaims 1–22 or the peptide ofany one ofclaims 23–35.37.A vector comprising the nucleic acid ofclaim 36.38.A host cell comprising the nucleic acid of claim 36 or the vector ofclaim 37.39.A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier or excipient and the chimeric molecule ofany one ofclaims 1–22, the peptide ofany one ofclaims 23–35, the nucleic acid ofclaim 36, the vector ofclaim 37, or the host cell ofclaim 38.40.Use of the chimeric molecule of any one of claims 1–22, the peptide of any one of claims 23–35, the nucleic acid of claim 36, the vector of claim 37, the host cell of claim 38, or the pharmaceutical composition of claim 39 in preparation of a medicament for mediating lysosomal degradation ofa target.41.Use of the chimeric molecule of any one of claims 1–22, the peptide of any one of claims 23–35, the nucleic acid of claim 36, the vector of claim 37, the host cell of claim 38, or the pharmaceutical composition of claim 39 in preparation of a medicament for treating a disease associated with a target.42.The use of claim 41, wherein the disease comprises a cancer, a neurodegenerative disease, a psychiatric disease, a central nervous system disease, an inflammatory disease, an autoimmune disease, metabolic syndrome, an aging-related disease, a cardiovascular disease, arespiratory disease, adigestive disease, atissue fibrotic disease, an aging-related disease, arenal disease, ahematologic disease, an infectious disease, or a rare disease.43.A method of mediating lysosomal degradation of a target, the method comprising contacting the target with the chimeric molecule of any one of claims 1–22, the peptide ofany one ofclaims 23–35, the nucleic acid ofclaim 36, the vector ofclaim 37, the host cell ofclaim 38, or the pharmaceutical composition ofclaim 39.44.A method of treating a subject suffering from a disease associated with a target, the method comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the chimeric molecule of any one of claims 1–22, the peptide of any one of claims 23–35, the nucleic acid of claim 36, the vector ofclaim 37, the host cell of claim 38, or the pharmaceutical composition ofclaim 39.45.The method of claim 44, wherein the disease comprises a cancer, a neurodegenerative disease, a psychiatric disease, a central nervous system disease, an inflammatory disease, an autoimmune disease, metabolic syndrome, an aging-related disease, a cardiovascular disease, arespiratory disease, adigestive disease, atissue fibrotic disease, an aging related disease, arenal disease, ahematologic disease, an infectious disease, or a rare disease.

Images