Combination treatment targeting sirpa and claudin 18.2

Abstract

Provided are compositions and methods for treating diseases such as cancer that combine the inhibition of SIRPα / CD47 signaling and targeting of Claudin 18.2-expressing cells.

Description

COMBINATION TREATMENT TARGETING SIRPΑ AND CLAUDIN 18.2BACKGROUND

[0001] Signal regulatory protein alpha (SIRPα) is a transmembrane protein expressed on all myeloid cells, including monocytes, macrophages, and neutrophils. SIRPα was found to participate in signal transduction mediated by various growth factor receptors. CD47 has been demonstrated to be a ligand. SIRPα shares very high similarity with several other members of the SIRP family. SIRPα is expressed mainly by myeloid cells and also by stem cells or neurons.

[0002] SIRPα acts as inhibitory receptor and interacts with a broadly expressed transmembrane protein CD47 also called the “don’t eat me” signal. This interaction negatively controls effector function of innate immune cells such as host cell phagocytosis. SIRPα diffuses laterally on the macrophage membrane and accumulates at a phagocytic synapse to bind CD47 and signal ‘self’ , which inhibits the cytoskeleton-intensive process of phagocytosis by the macrophage.

[0003] Cancer cells highly express CD47 that activates SIRPα and inhibits macrophage-mediated destruction. It has been shown that high-affinity variants of SIRPα that antagonized CD47 on cancer cells increased phagocytosis of cancer cells. Anti-SIRPα antibodies have also been shown to help macrophages to reduce cancer growth and metastasis, alone and in synergy with other cancer treatments. Targeting the CD47 / SIRPα axis has become a promising strategy to promote tumor elimination through innate immunity.

[0004] However, hematotoxicity, especially anemia, has become a common adverse effect of the CD47 monoclonal antibody. Meanwhile, anti-SIRPα antibodies have been shown to induce weak or no phagocytic activity.SUMMARY

[0005] The instant disclosure provides compositions and methods that combine the therapeutic effects of inhibiting the CD47 / SIRPα axis and targeting tumor associated antigen Claudin 18.2. In some embodiments, inhibition of the CD47 / SIRPα axis can be achieved with an anti-SIRPα antibody, an anti-CD47 antibody, a soluble SIRPα, and a SIRPα decoy.  Targeting the Claudin 18.2, on the other hand, can be with an anti-Claudin 18.2 antibody or antibody-drug conjugate, without limitation.

[0006] Also provided are new anti-SIRPα antibodies. In one embodiment, an anti-SIRPαantibody comprises a heavy chain variable region (VH) comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0007] FIG. 1 shows body weight changes of the tumor-bearing mice in different groups. Data points represent group mean body weights. Error bars represent standard error of the mean (SEM) .

[0008] FIG. 2 shows relative change of body weight of the tumor-bearing mice in different groups. Data points represent group mean relative change body weights. Error bars represent standard error of the mean (SEM) .

[0009] FIG. 3 show tumor growth curves of MKN45 / 10D2. #14 tumor-bearing mice post administration of testing articles. Data points represent group mean, error bars represent standard error of the mean (SEM) .

[0010] FIG. 4 shows binding of antibodies LM-001a and LM-101 to CHO-expressed human and cynomolgus SIRPα.DETAILED DESCRIPTION

[0011] Definitions

[0012] It is to be noted that the term “a” or “an” entity refers to one or more of that entity; for example, “an antibody, ” is understood to represent one or more antibodies. As such, the terms “a” (or “an” ) , “one or more, ” and “at least one” can be used interchangeably herein.

[0013] As used herein, the term “polypeptide” is intended to encompass a singular “polypeptide” as well as plural “polypeptides, ” and refers to a molecule composed of monomers (amino acids) linearly linked by amide bonds (also known as peptide bonds) . The term “polypeptide” refers to any chain or chains of two or more amino acids, and does not refer to a specific length of the product. Thus, peptides, dipeptides, tripeptides, oligopeptides, “protein, ” “amino acid chain, ” or any other term used to refer to a chain or chains of two or more amino acids, are included within the definition of “polypeptide, ” and the term “polypeptide” may be used instead of, or interchangeably with any of these terms. The term “polypeptide” is also intended to refer to the products of post-expression modifications of the polypeptide, including without limitation glycosylation, acetylation, phosphorylation, amidation, derivatization by known protecting / blocking groups, proteolytic cleavage, or modification by non-naturally occurring amino acids. A polypeptide may be derived from a natural biological source or produced by recombinant technology, but is not necessarily translated from a designated nucleic acid sequence. It may be generated in any manner, including by chemical synthesis.

[0014] “Homology” or “identity” or “similarity” refers to sequence similarity between two peptides or between two nucleic acid molecules. Homology can be determined by comparing a position in each sequence which may be aligned for purposes of comparison. When a position in the compared sequence is occupied by the same base or amino acid, then the molecules are homologous at that position. A degree of homology between sequences is a function of the number of matching or homologous positions shared by the sequences. An “unrelated” or “non-homologous” sequence shares less than 40%identity, though preferably less than 25%identity, with one of the sequences of the present disclosure.

[0015] A polynucleotide or polynucleotide region (or a polypeptide or polypeptide region) has a certain percentage (for example, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %or 99 %) of “sequence identity” to another sequence means that, when aligned, that percentage of bases (or amino acids) are the same in comparing the two sequences.

[0016] The term “an equivalent nucleic acid or polynucleotide” refers to a nucleic acid having a nucleotide sequence having a certain degree of homology, or sequence identity, with the nucleotide sequence of the nucleic acid or complement thereof. A homolog of a double stranded nucleic acid is intended to include nucleic acids having a nucleotide sequence which has a certain degree of homology with or with the complement thereof. In one aspect,  homologs of nucleic acids are capable of hybridizing to the nucleic acid or complement thereof. Likewise, “an equivalent polypeptide” refers to a polypeptide having a certain degree of homology, or sequence identity, with the amino acid sequence of a reference polypeptide. In some aspects, the sequence identity is at least about 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%. In some aspects, the equivalent polypeptide or polynucleotide has one, two, three, four or five addition, deletion, substitution and their combinations thereof as compared to the reference polypeptide or polynucleotide. In some aspects, the equivalent sequence retains the activity (e.g., epitope-binding) or structure (e.g., salt-bridge) of the reference sequence.

[0017] As used herein, an “antibody” or “antigen-binding polypeptide” refers to a polypeptide or a polypeptide complex that specifically recognizes and binds to an antigen. An antibody can be a whole antibody and any antigen binding fragment or a single chain thereof. Thus the term “antibody” includes any protein or peptide containing molecule that comprises at least a portion of an immunoglobulin molecule having biological activity of binding to the antigen. Examples of such include, but are not limited to a complementarity determining region (CDR) of a heavy or light chain or a ligand binding portion thereof, a heavy chain or light chain variable region, a heavy chain or light chain constant region, a framework (FR) region, or any portion thereof, or at least one portion of a binding protein.

[0018] The terms “antibody fragment” or “antigen-binding fragment” , as used herein, is a portion of an antibody such as F (ab') 2, F (ab) 2, Fab', Fab, Fv, scFv and the like. Regardless of structure, an antibody fragment binds with the same antigen that is recognized by the intact antibody. The term “antibody fragment” includes aptamers, spiegelmers, and diabodies. The term “antibody fragment” also includes any synthetic or genetically engineered protein that acts like an antibody by binding to a specific antigen to form a complex.

[0019] A “single-chain variable fragment” or “scFv” refers to a fusion protein of the variable regions of the heavy (VH) and light chains (VL) of immunoglobulins. In some aspects, the regions are connected with a short linker peptide of ten to about 25 amino acids. The linker can be rich in glycine for flexibility, as well as serine or threonine for solubility, and can either connect the N-terminus of the VH with the C-terminus of the VL, or vice versa. This protein retains the specificity of the original immunoglobulin, despite removal of the constant regions and the introduction of the linker. ScFv molecules are known in the art and are described, e.g., in US patent 5,892,019.

[0020] The term antibody encompasses various broad classes of polypeptides that can be distinguished biochemically. Those skilled in the art will appreciate that heavy chains are classified as gamma, mu, alpha, delta, or epsilon (γ, μ, α, δ, ε) with some subclasses among them (e.g., γ l-γ4) . It is the nature of this chain that determines the “class” of the antibody as IgG, IgM, IgA IgG, or IgE, respectively. The immunoglobulin subclasses (isotypes) e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, etc. are well characterized and are known to confer functional specialization. Modified versions of each of these classes and isotypes are readily discernable to the skilled artisan in view of the instant disclosure and, accordingly, are within the scope of the instant disclosure. All immunoglobulin classes are clearly within the scope of the present disclosure, the following discussion will generally be directed to the IgG class of immunoglobulin molecules. With regard to IgG, a standard immunoglobulin molecule comprises two identical light chain polypeptides of molecular weight approximately 23,000 Daltons, and two identical heavy chain polypeptides of molecular weight 53,000-70,000. The four chains are typically joined by disulfide bonds in a “Y” configuration wherein the light chains bracket the heavy chains starting at the mouth of the “Y” and continuing through the variable region.

[0021] Antibodies, antigen-binding polypeptides, variants, or derivatives thereof of the disclosure include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, multispecific, human, humanized, primatized, or chimeric antibodies, single chain antibodies, epitope-binding fragments, e.g., Fab, Fab'a nd F (ab') 2, Fd, Fvs, single-chain Fvs (scFv) , single-chain antibodies, disulfide-linked Fvs (sdFv) , fragments comprising either a VK or VH domain, fragments produced by a Fab expression library, and anti-idiotypic (anti-Id) antibodies (including, e.g., anti-Id antibodies to LIGHT antibodies disclosed herein) . Immunoglobulin or antibody molecules of the disclosure can be of any type (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY) , class (e.g., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl and IgA2) or subclass of immunoglobulin molecule.

[0022] Light chains are classified as either kappa or lambda (K, λ) . Each heavy chain class may be bound with either a kappa or lambda light chain. In general, the light and heavy chains are covalently bonded to each other, and the “tail” portions of the two heavy chains are bonded to each other by covalent disulfide linkages or non-covalent linkages when the immunoglobulins are generated either by hybridomas, B cells or genetically engineered host  cells. In the heavy chain, the amino acid sequences run from an N-terminus at the forked ends of the Y configuration to the C-terminus at the bottom of each chain.

[0023] Both the light and heavy chains are divided into regions of structural and functional homology. The terms “constant” and “variable” are used functionally. In this regard, it will be appreciated that the variable domains of both the light (VK) and heavy (VH) chain portions determine antigen recognition and specificity. Conversely, the constant domains of the light chain (CK) and the heavy chain (CH1, CH2 or CH3) confer important biological properties such as secretion, transplacental mobility, Fc receptor binding, complement binding, and the like. By convention the numbering of the constant region domains increases as they become more distal from the antigen-binding site or amino-terminus of the antibody. The N-terminal portion is a variable region and at the C-terminal portion is a constant region; the CH3 and CK domains actually comprise the carboxy-terminus of the heavy and light chain, respectively.

[0024] As indicated above, the variable region allows the antibody to selectively recognize and specifically bind epitopes on antigens. That is, the VK domain and VH domain, or subset of the complementarity determining regions (CDRs) , of an antibody combine to form the variable region that defines a three dimensional antigen-binding site. This quaternary antibody structure forms the antigen-binding site present at the end of each arm of the Y. More specifically, the antigen-binding site is defined by three CDRs on each of the VH and VK chains (i.e. CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3) . In some instances, e.g., certain immunoglobulin molecules derived from camelid species or engineered based on camelid immunoglobulins, a complete immunoglobulin molecule may consist of heavy chains only, with no light chains. See, e.g., Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993) .

[0025] In naturally occurring antibodies, the six “complementarity determining regions” or “CDRs” present in each antigen-binding domain are short, non-contiguous sequences of amino acids that are specifically positioned to form the antigen-binding domain as the antibody assumes its three dimensional configuration in an aqueous environment. The remainder of the amino acids in the antigen-binding domains, referred to as “framework” regions, show less inter-molecular variability. The framework regions largely adopt a β-sheet conformation and the CDRs form loops which connect, and in some cases form part of, the β-sheet structure. Thus, framework regions act to form a scaffold that provides for positioning  the CDRs in correct orientation by inter-chain, non-covalent interactions. The antigen-binding domain formed by the positioned CDRs defines a surface complementary to the epitope on the immunoreactive antigen. This complementary surface promotes the non-covalent binding of the antibody to its cognate epitope. The amino acids comprising the CDRs and the framework regions, respectively, can be readily identified for any given heavy or light chain variable region by one of ordinary skill in the art, since they have been precisely defined (see “Sequences of Proteins of Immunological Interest, ” Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983) ; and Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196: 901-917 (1987) ) .

[0026] In the case where there are two or more definitions of a term which is used and / or accepted within the art, the definition of the term as used herein is intended to include all such meanings unless explicitly stated to the contrary. A specific example is the use of the term “complementarity determining region” ( “CDR” ) to describe the non-contiguous antigen combining sites found within the variable region of both heavy and light chain polypeptides. This particular region has been described by Kabat et al., U. S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) and by Chothia et al., J. MoI. Biol. 196: 901-917 (1987) , which are incorporated herein by reference in their entireties. The CDR definitions according to Kabat and Chothia include overlapping or subsets of amino acid residues when compared against each other. Nevertheless, application of either definition to refer to a CDR of an antibody or variants thereof is intended to be within the scope of the term as defined and used herein. The appropriate amino acid residues which encompass the CDRs as defined by each of the above cited references are set forth in the table below as a comparison. The exact residue numbers which encompass a particular CDR will vary depending on the sequence and size of the CDR. Those skilled in the art can routinely determine which residues comprise a particular CDR given the variable region amino acid sequence of the antibody.

[0027] Kabat et al. also defined a numbering system for variable domain sequences that is applicable to any antibody. One of ordinary skill in the art can unambiguously assign this system of “Kabat numbering” to any variable domain sequence, without reliance on any experimental data beyond the sequence itself. As used herein, “Kabat numbering” refers to the numbering system set forth by Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983) .

[0028] In addition to table above, the Kabat number system describes the CDR regions as follows: CDR-H1 begins at approximately amino acid 31 (i.e., approximately 9 residues after the first cysteine residue) , includes approximately 5-7 amino acids, and ends at the next tryptophan residue. CDR-H2 begins at the fifteenth residue after the end of CDR-H1, includes approximately 16-19 amino acids, and ends at the next arginine or lysine residue. CDR-H3 begins at approximately the thirty third amino acid residue after the end of CDR-H2; includes 3-25 amino acids; and ends at the sequence W-G-X-G, where X is any amino acid. CDR-L1 begins at approximately residue 24 (i.e., following a cysteine residue) ; includes approximately 10-17 residues; and ends at the next tryptophan residue. CDR-L2 begins at approximately the sixteenth residue after the end of CDR-L1 and includes approximately 7 residues. CDR-L3 begins at approximately the thirty third residue after the end of CDR-L2 (i.e., following a cysteine residue) ; includes approximately 7-11 residues and ends at the sequence F or W-G-X-G, where X is any amino acid.

[0029] Antibodies disclosed herein may be from any animal origin including birds and mammals. Preferably, the antibodies are human, murine, donkey, rabbit, goat, guinea pig, camel, llama, horse, or chicken antibodies. In another embodiment, the variable region may be condricthoid in origin (e.g., from sharks) .

[0030] As used herein, the term “heavy chain constant region” includes amino acid sequences derived from an immunoglobulin heavy chain. A polypeptide comprising a heavy chain constant region comprises at least one of: a CH1 domain, a hinge (e.g., upper, middle, and / or lower hinge region) domain, a CH2 domain, a CH3 domain, or a variant or fragment thereof. For example, an antigen-binding polypeptide for use in the disclosure may comprise a polypeptide chain comprising a CH1 domain; a polypeptide chain comprising a CH1 domain, at least a portion of a hinge domain, and a CH2 domain; a polypeptide chain comprising a CH1 domain and a CH3 domain; a polypeptide chain comprising a CH1 domain, at least a portion of a hinge domain, and a CH3 domain, or a polypeptide chain  comprising a CH1 domain, at least a portion of a hinge domain, a CH2 domain, and a CH3 domain. In another embodiment, a polypeptide of the disclosure comprises a polypeptide chain comprising a CH3 domain. Further, an antibody for use in the disclosure may lack at least a portion of a CH2 domain (e.g., all or part of a CH2 domain) . As set forth above, it will be understood by one of ordinary skill in the art that the heavy chain constant region may be modified such that they vary in amino acid sequence from the naturally occurring immunoglobulin molecule.

[0031] The heavy chain constant region of an antibody disclosed herein may be derived from different immunoglobulin molecules. For example, a heavy chain constant region of a polypeptide may comprise a CH1 domain derived from an IgGl molecule and a hinge region derived from an IgG3 molecule. In another example, a heavy chain constant region can comprise a hinge region derived, in part, from an IgGl molecule and, in part, from an IgG3 molecule. In another example, a heavy chain portion can comprise a chimeric hinge derived, in part, from an IgGl molecule and, in part, from an IgG4 molecule.

[0032] As used herein, the term “light chain constant region” includes amino acid sequences derived from antibody light chain. Preferably, the light chain constant region comprises at least one of a constant kappa domain or constant lambda domain.

[0033] A “light chain-heavy chain pair” refers to the collection of a light chain and heavy chain that can form a dimer through a disulfide bond between the CL domain of the light chain and the CH1 domain of the heavy chain.

[0034] As previously indicated, the subunit structures and three dimensional configuration of the constant regions of the various immunoglobulin classes are well known. As used herein, the term “VH domain” includes the amino terminal variable domain of an immunoglobulin heavy chain and the term “CH1 domain” includes the first (most amino terminal) constant region domain of an immunoglobulin heavy chain. The CH1 domain is adjacent to the VH domain and is amino terminal to the hinge region of an immunoglobulin heavy chain molecule.

[0035] As used herein the term “CH2 domain” includes the portion of a heavy chain molecule that extends, e.g., from about residue 244 to residue 360 of an antibody using conventional numbering schemes (residues 244 to 360, Kabat numbering system; and residues 231-340, EU numbering system; see Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human  Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) . The CH2 domain is unique in that it is not closely paired with another domain. Rather, two N-linked branched carbohydrate chains are interposed between the two CH2 domains of an intact native IgG molecule. It is also well documented that the CH3 domain extends from the CH2 domain to the C-terminal of the IgG molecule and comprises approximately 108 residues.

[0036] As used herein, the term “hinge region” includes the portion of a heavy chain molecule that joins the CH1 domain to the CH2 domain. This hinge region comprises approximately 25 residues and is flexible, thus allowing the two N-terminal antigen-binding regions to move independently. Hinge regions can be subdivided into three distinct domains: upper, middle, and lower hinge domains (Roux et al., J. Immunol 161: 4083 (1998) ) .

[0037] As used herein the term “disulfide bond” includes the covalent bond formed between two sulfur atoms. The amino acid cysteine comprises a thiol group that can form a disulfide bond or bridge with a second thiol group. In most naturally occurring IgG molecules, the CH1 and CK regions are linked by a disulfide bond and the two heavy chains are linked by two disulfide bonds at positions corresponding to 239 and 242 using the Kabat numbering system (position 226 or 229, EU numbering system) .

[0038] As used herein, the term “chimeric antibody” will be held to mean any antibody wherein the immunoreactive region or site is obtained or derived from a first species and the constant region (which may be intact, partial or modified in accordance with the instant disclosure) is obtained from a second species. In certain embodiments the target binding region or site will be from a non-human source (e.g. mouse or primate) and the constant region is human.

[0039] As used herein, “percent humanization” is calculated by determining the number of framework amino acid differences (i.e., non-CDR difference) between the humanized domain and the germline domain, subtracting that number from the total number of amino acids, and then dividing that by the total number of amino acids and multiplying by 100.

[0040] By “specifically binds” or “has specificity to, ” it is generally meant that an antibody binds to an epitope via its antigen-binding domain, and that the binding entails some complementarity between the antigen-binding domain and the epitope. According to this definition, an antibody is said to “specifically bind” to an epitope when it binds to that epitope, via its antigen-binding domain more readily than it would bind to a random,  unrelated epitope. The term “specificity” is used herein to qualify the relative affinity by which a certain antibody binds to a certain epitope. For example, antibody “A” may be deemed to have a higher specificity for a given epitope than antibody “B, ” or antibody “A” may be said to bind to epitope “C” with a higher specificity than it has for related epitope “D. ”

[0041] As used herein, the terms “treat” or “treatment” refer to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures, wherein the object is to prevent or slow down (lessen) an undesired physiological change or disorder, such as the progression of cancer. Beneficial or desired clinical results include, but are not limited to, alleviation of symptoms, diminishment of extent of disease, stabilized (i.e., not worsening) state of disease, delay or slowing of disease progression, amelioration or palliation of the disease state, and remission (whether partial or total) , whether detectable or undetectable. “Treatment” can also mean prolonging survival as compared to expected survival if not receiving treatment. Those in need of treatment include those already with the condition or disorder as well as those prone to have the condition or disorder or those in which the condition or disorder is to be prevented.

[0042] By “subject” or “individual” or “animal” or “patient” or “mammal, ” is meant any subject, particularly a mammalian subject, for whom diagnosis, prognosis, or therapy is desired. Mammalian subjects include humans, domestic animals, farm animals, and zoo, sport, or pet animals such as dogs, cats, guinea pigs, rabbits, rats, mice, horses, cattle, cows, and so on.

[0043] As used herein, phrases such as “to a patient in need of treatment” or “asubject in need of treatment” includes subjects, such as mammalian subjects, that would benefit from administration of an antibody or composition of the present disclosure used, e.g., for detection, for a diagnostic procedure and / or for treatment.

[0044] Combination Treatments

[0045] An important component of the innate immune system is macrophages. Macrophages inhibit tumor growth through phagocytosis of tumor cells. Tumor cells can evade surveillance by macrophages by upregulating a “don’t eat me” signal, CD47, on their cell surface. CD47 is ubiquitously expressed but is upregulated in various tumor types. By interacting with  various ligands, CD47 has roles in the regulation of cell motility, adhesion, migration, and platelet activation. SIRPα is another member of the immunoglobulin superfamily and is primarily expressed on the surface of neurons and myeloid cells, including macrophages, granulocytes, monocytes, and dendritic cells. The CD47 / SIRPα axis is a known major pathway for immune evasion by tumor cells.

[0046] Agents that target CD47 may initiate antibody opsonization, and activate antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) or antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) which aids tumor cell destruction. However, due to the ubiquitous expression of CD47 may lead to RBC toxicity and other hematological adverse effects due to the presence of the antigen on the blood cells. Molecules targeting either SIRPα or bispecific agents that target both SIRPα and CD47 can be designed to elicit the ADCC and ADCP effect by possessing functional Fc domains.

[0047] Since SIRPα is more restricted in its expression compared to CD47, these molecules should not have as many hematological events as those targeting only CD47. Therefore, anti-SIRPα antibodies can be safer than anti-CD47 antibodies.

[0048] As shown in FIG. 3, however, treatment with an anti-SIRPα antibody (LM-001) alone did not appear to have observable in vivo anti-tumor efficacy (first curve on the top) . Interestingly, when an anti-Claudin 18.2 ADC (LM-002 ADC) was used, the anti-tumor effect was also limited. Their combination (LM-001 &LM-002 ADC) , surprisingly, led to significantly enhanced anti-tumor efficacy (P value < 0.05 on day 9 and thereafter) .

[0049] According to one embodiment of the present disclosure, therefore, the instant disclosure provides a method for treating cancer in a patient in need thereof, which entails administering to the patient (A) a first agent that inhibits CD47 signaling, and (B) a second agent comprising an anti-Claudin 18.2 antibody or an antibody-drug conjugate (ADC) thereof. Likewise, provided is a combination of (A) a first agent that inhibits CD47 signaling, and (B) a second agent comprising an anti-Claudin 18.2 antibody or an antibody-drug conjugate (ADC) thereof for use in treating cancer. Also provided is the use of (A) a first agent that inhibits CD47 signaling, and (B) a second agent comprising an anti-Claudin 18.2 antibody or an antibody-drug conjugate (ADC) thereof for the manufacture of a medicament for use in treating cancer.

[0050] Another embodiment provides a method for treating cancer in a patient in need thereof wherein the patient undergoes a treatment with a first agent that inhibits CD47 signaling, which method entails administering to the patient a second agent comprising an anti-Claudin 18.2 antibody or an antibody-drug conjugate (ADC) thereof. Likewise, also provided is a second agent comprising an anti-Claudin 18.2 antibody or an antibody-drug conjugate (ADC) thereof for use in treating cancer is a patient that undergoes a treatment with a first agent that inhibits CD47 signaling. Also provided is the use of a second agent comprising an anti-Claudin 18.2 antibody or an antibody-drug conjugate (ADC) thereof for the manufacture of a medicament for use in treating cancer is a patient that undergoes a treatment with a first agent that inhibits CD47 signaling.

[0051] In yet another embodiment, provided is a method for treating cancer in a patient in need thereof wherein the patient undergoes a treatment with a second agent comprising an anti-Claudin 18.2 antibody or an antibody-drug conjugate (ADC) thereof, which method entails administering to the patient a first agent that inhibits CD47 signaling. Likewise, one embodiment provides a first agent that inhibits CD47 signaling for use in treating cancer in a patient in need thereof wherein the patient undergoes a treatment with a second agent comprising an anti-Claudin 18.2 antibody or an antibody-drug conjugate (ADC) thereof. In another embodiment, provided is the use of a first agent that inhibits CD47 signaling for the manufacture of a medicament for treating cancer in a patient in need thereof wherein the patient undergoes a treatment with a second agent comprising an anti-Claudin 18.2 antibody or an antibody-drug conjugate (ADC) thereof.

[0052] In some embodiments, the patient has a tumor cell that expresses or overexpresses Claudin 18.2. In some embodiments, the patient has an immune or tumor cell that expresses or overexpresses SIRPα and / or CD47.

[0053] In some embodiments, the first agent (e.g., anti-SIRPα antibody LM-001) and the second agent (e.g., LM-002 ADC) are administered at a dose ratio of 5: 1 to 50: 1, or 10: 1 to 40: 1, or 15: 1 to 30: 1. In some embodiments, the first agent (e.g., anti-SIRPα antibody LM-001) is administered once, twice, three times or four times per week. In some embodiments, the second agent (e.g., LM-002 ADC) is administered once every weeks, or once or twice a week.

[0054] Agents Inhibiting CD47 Signaling

[0055] Various known and new agents are capable of inhibiting CD47 signaling. Non-limiting examples include inhibitory RNAs, anti-CD47 antibodies, anti-SIRPα antibodies, soluble SIRPα proteins, and SIRPα decoys.

[0056] In some embodiments, the agent is a protein, such as an antibody. In some embodiments, the agent is a polynucleotide encoding the protein. In some embodiment, the agent is a cell that encloses the polynucleotide or the protein, such as a chimeric antigen receptor (CAR) cell.

[0057] Non-limiting examples of anti-CD47 antibodies include magrolimab (Hu5F9-G4; Forty-Seven / Gilead Science) , ligufalimab (AK117, Akesobio Biopharma) , lemzoparlimab (TJC4, I-Mab Biopharma) , AO-176 (Arch Oncology) , CC-90002 (Celgene / BMS) , SGN-CD47M (Seagen Inc. ) , IBI188 (Innovent Biologics, Inc. ) , SHR-1603 (Hengrui Medicine) , SRF231 (Surface Oncology) , ZL-1201 (ZAI Lab) , and IMC-002 (ImmuneOncia Therapeutics) . In some embodiments, the anti-CD47 antibody is an antigen-binding fragment. In some embodiments, the antigen-binding fragment is provided in a CAR expressed in a cell.

[0058] Non-limiting examples of anti-SIRPα antibodies include OSE-172 (BI 765063, OSE Immuno therapeutics &Boehringer Ingelheim) , CC-95251 (Celgene) , FSI-189 (Gilead Sciences) , HSIRPB (Arch Oncology) , H21 (ALX Oncology) , ES004 (ElpiScience) , AL008 (Alector / Innovent) , ADU-1805 (Aduro Biotech) and Abx701 (Apexigen) . In some embodiments, the anti-SIRPα antibody is an antigen-binding fragment. In some embodiments, the antigen-binding fragment is provided in a CAR expressed in a cell.

[0059] In some embodiments, the anti-SIRPα antibody comprises a heavy chain variable region (VH) comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

[0060] In some embodiments, the anti-SIRPα antibody further comprises a human Fc fragment. In some embodiments, the Fc fragment does not have or has reduced effector  function. In some embodiments, the Fc fragment is a human IgG1 Fc fragment with a N297A mutation (EU numbering) .

[0061] Soluble SIRPα proteins or fragment, and the variants and mutants thereof (SIRPαdecoy) can also serve as an inhibitor to CD47 / SIRPα signaling. Soluble SIRPα binding to CD47 on tumor cells could block inhibitory signals and enhance phagocytic activity. Six SIRPα-fusion proteins are currently in phase I or phase II clinical trials. For instance, Evorpacept (ALX148, Alex Therapeutics) is comprised of SIRPα variant 1 domain 1 (V1D1) and inactive human IgG1-Fc.

[0062] TTI-621 and TTI-622 (Trillium Therapeutics) are constructed from the wild type SIRPα variant 2 domain 1 (V2D1) fused to human IgG-Fc with IgG1 and IgG4 backbones, respectively. Preclinical data demonstrated binding of TTI-621 / TTI-622 to cancer cells but only minimal binding to RBCs.

[0063] IMM01 (ImmuneOnco Biopharma) is V2D1 with an N80A mutation and IMM0306 (ImmuneOnco Biopharma) is IMM01-fused to an IgG1 anti-CD20 antibody (rituximab) . Both IMM01 and IMM0306 are based on wild type IgG1-Fc. IMM01 does not bind to human erythrocytes, avoiding “antigenic sink. ”

[0064] HX009 (HanX Biopharmaceuticals) is wild type SIRPα V2D1 fused to the C terminal of an IgG4 anti-PD1 antibody.

[0065] Anti-Claudin 18.2 Antibodies and ADC

[0066] Various known and new anti-Claudin 18.2 antibodies and their associated antibody-drug conjugates are suitable for practicing the instant technology. One example is zolbetuximab (IMAB362, Ganymed Pharmaceuticals AG) . Other examples are LM-002, LM-003 and LM-004, those sequences are provided in Tables A and 2.

[0067] Table A. Anti-Claudin 18.2 Antibodies

[0068] In some embodiments, the anti-Claudin 18.2 antibody includes a heavy chain variable region (VH) comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 and the VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.

[0069] In some embodiments, the antibodies or fragments are conjugated to therapeutic agents, prodrugs, peptides, proteins, enzymes, viruses, lipids, biological response modifiers, pharmaceutical agents, or PEG.

[0070] In one embodiment, the antibodies or fragments of the disclosure are covalently attached to a drug moiety. The drug moiety may be, or be modified to include, a group reactive with a conjugation point on the antibody. For example, a drug moiety can be attached by alkylation (e.g., at the epsilon-amino group lysines or the N-terminus of antibodies) , reductive amination of oxidized carbohydrate, transesterification between hydroxyl and carboxyl groups, amidation at amino groups or carboxyl groups, and conjugation to thiols.

[0071] In some embodiments, the number of drug moieties, p, conjugated per antibody molecule ranges from an average of 1 to 8; 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2. In some embodiments, p ranges from an average of 2 to 8, 2 to 7, 2 to 6, 2 to 5, 2 to 4 or 2 to 3. In other embodiments, p is an average of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8. In some embodiments, p ranges from an average of about 1 to about 20, about 1 to about 10, about 2 to about 10, about 2 to about 9, about 1 to about 8, about 1 to about 7, about 1 to about 6, about 1 to about 5, about 1 to about 4, about 1 to about 3, or about 1 to about 2. In some embodiments, p ranges from about 2 to about 8, about 2 to about 7, about 2 to about 6, about 2 to about 5, about 2 to about 4 or about 2 to about 3.

[0072] For example, when chemical activation of the protein results in formation of free thiol groups, the protein may be conjugated with a sulfhydryl reactive agent. In one aspect, the agent is one which is substantially specific for free thiol groups. Such agents include, for example, malemide, haloacetamides (e.g., iodo, bromo or chloro) , haloesters (e.g., iodo, bromo or chloro) , halomethyl ketones (e.g., iodo, bromo or chloro) , benzylic halides (e.g., iodide, bromide or chloride) , vinyl sulfone and pyridylthio.

[0073] The drug can be linked to the antibody or fragment by a linker. Suitable linkers include, for example, cleavable and non-cleavable linkers. A cleavable linker is typically susceptible to cleavage under intracellular conditions. Suitable cleavable linkers include, for example, a peptide linker cleavable by an intracellular protease, such as lysosomal protease or an endosomal protease. In exemplary embodiments, the linker can be a dipeptide linker, such as a valine-citrulline (val-cit) , a phenylalanine-lysine (phe-lys) linker, or maleimidocapronic-valine-citruline-p-aminobenzyloxycarbonyl (mc-Val-Cit-PABA) linker. Another linker is Sulfosuccinimidyl-4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (smcc) . Sulfo-smcc conjugation occurs via a maleimide group which reacts with sulfhydryls (thiols, -SH) , while its Sulfo-NHS ester is reactive toward primary amines (as found in Lysine and the protein or peptide N-terminus) . Yet another linker is maleimidocaproyl (mc) . Other suitable linkers include linkers hydrolyzable at a specific pH or a pH range, such as a hydrazone linker. Additional suitable cleavable linkers include disulfide linkers. The linker may be covalently bound to the antibody to such an extent that the antibody must be degraded intracellularly in order for the drug to be released e.g. the mc linker and the like.

[0074] A linker can include a group for linkage to the antibody. For example, linker can include an amino, hydroxyl, carboxyl or sulfhydryl reactive groups (e.g., malemide, haloacetamides (e.g., iodo, bromo or chloro) , haloesters (e.g., iodo, bromo or chloro) , halomethyl ketones (e.g., iodo, bromo or chloro) , benzylic halides (e.g., iodide, bromide or chloride) , vinyl sulfone and pyridylthio) .

[0075] In some embodiments, the drug moiety is a cytotoxic or cytostatic agent, an immunosuppressive agent, a radioisotope, a toxin, or the like. The conjugate can be used for inhibiting the multiplication of a tumor cell or cancer cell, causing apoptosis in a tumor or cancer cell, or for treating cancer in a patient. The conjugate can be used accordingly in a variety of settings for the treatment of animal cancers. The conjugate can be used to deliver a drug to a tumor cell or cancer cell. Without being bound by theory, in some embodiments, the  conjugate binds to or associates with a cancer cell expressing Claudin 18.2, and the conjugate and / or drug can be taken up inside a tumor cell or cancer cell through receptor-mediated endocytosis.

[0076] In some embodiments, the drug moiety is a maytansinoid or an auristatin. In some embodiments, the drug moiety is a macrocyclic ketone analogue such as eribulin. In some embodiments, the drug moiety is a topoisomerase inhibitor, such as exatecan and exatecan derivatives.

[0077] Once inside the cell, one or more specific peptide sequences within the conjugate (e.g., in a linker) are hydrolytically cleaved by one or more tumor-cell or cancer-cell-associated proteases, resulting in release of the drug. The released drug is then free to migrate within the cell and induce cytotoxic or cytostatic or other activities. In some embodiments, the drug is cleaved from the antibody outside the tumor cell or cancer cell, and the drug subsequently penetrates the cell, or acts at the cell surface.

[0078] Examples of drug moieties or payloads are selected from the group consisting of eribulin (2- (3-Amino-2-hydroxypropyl) hexacosahydro-3-methoxy-26-methyl-20, 27-bis (methylene) 11, 15-18, 21-24, 28-triepoxy-7, 9-ethano-12, 15-methano-9H, 15H-furo (3, 2-i) furo (2', 3'-5, 6) pyrano (4, 3-b) (1, 4) dioxacyclopentacosin-5- (4H) -one) , DM1 (maytansine, N2’-deacetyl-N2’ - (3-mercapto-1-oxopropyl) -or N2’ -deacetyl-N2’ - (3-mercapto-1-oxopropyl) -maytansine) , mc-MMAD (6-maleimidocaproyl-monomethylauristatin-D or N-methyl-L-valyl-N- [ (1S, 2R) -2-methoxy-4- [ (2S) -2- [ (1R, 2R) -1-methoxy-2-methyl-3-oxo-3- [ [ (1S) -2-phenyl-1- (2-thiazolyl) ethyl] amino] propyl] -1-pyr rolidinyl] -1- [ (1S) -1-methylpropyl] -4-oxobutyl] -N-methyl- (9Cl) -L-valinamide) , mc-MMAF (maleimidocaproyl-monomethylauristatin F or N- [6- (2, 5-dihydro-2, 5-dioxo-1H-pyrrol-1-yl) -1-oxohexyl] -N-methyl-L-valyl-L-valyl- (3R, 4S, 5S) -3-methoxy-5-methyl-4- (methylamino) heptanoyl- (αR, βR, 2S) -β-methoxy-α-methyl-2-pyrrolidinepropanoyl-L-phenylalanine) and mc-Val-Cit-PABA-MMAE (6-maleimidocaproyl-ValcCit- (p-aminobenzyloxycarbonyl) -monomethylauristatin E or N- [ [ [4- [ [N- [6- (2, 5-dihydro-2, 5-dioxo-1H-pyrrol-1-yl) -1-oxohexyl] -L-valyl-N5- (aminocarbonyl) -L-ornithyl] amino] phenyl] methoxy] carbonyl] -N-meth yl-L-valyl-N- [ (1S, 2R) -4- [ (2S) -2- [ (1R, 2R) -3- [ [ (1R, 2S) -2-hydroxy-1-methyl-2-phenylethyl] amino] -1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl] -1-pyrrolidinyl] -2-methoxy-1- [ (1S) -1-methylpropyl] -4-oxobutyl] -N-methyl-L-valinamide) . DM1 is a derivative of the tubulin inhibitor maytansine while MMAD, MMAE, and MMAF are auristatin derivatives. In some  embodiments, the drug moiety is selected from the group consisting of mc-MMAF and mc-Val-Cit-PABA-MMAE.

[0079] The antibodies or fragments may be conjugated or fused to a therapeutic agent, which may include detectable labels such as radioactive labels, an immunomodulator, a hormone, an enzyme, an oligonucleotide, a photoactive therapeutic or diagnostic agent, a cytotoxic agent, which may be a drug or a toxin, an ultrasound enhancing agent, a non-radioactive label, a combination thereof and other such agents known in the art.

[0080] In some embodiments, the anti-Claudin 18.2 antibody is conjugated to MMAE through a vc linker (valine–citrulline (Val–Cit) ) . In some embodiments, the anti-Claudin 18.2 antibody in the ADC is LM-002.

[0081] Anti-SIRPα Antibodies

[0082] New anti-SIRPα antibodies and fragments are also provided, in some embodiments. LM-001, as described in Example 2, was derived from parental antibody LM-000 with two amino acid substitutions, which led to improved properties.

[0083] In one embodiment, provided is an anti-SIRPα antibody that includes a heavy chain variable region (VH) comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

[0084] In some embodiments, the VH includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the VL includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, anti-SIRPα antibody further includes a human Fc fragment. In some embodiments, the Fc fragment does not have or has reduced effector function. In some embodiments, the Fc fragment is a human IgG1 Fc fragment with a N297A mutation (EU numbering) .

[0085] Multi-functional Molecules

[0086] The combination, in some embodiments, is embodied in bi-or multi-functional molecules. An example is an anti-SIRPα / anti-Claudin 18.2 bispecific antibody, optionally conjugated to a drug such as MMAE.

[0087] Accordingly, one embodiment provides a multi-functional molecule or multi-specific antibody that includes a first unit that binds CD47 or SIRPα, and a second unit that binds Claudin 18.2.

[0088] In some embodiments, the first unit includes an antibody or antigen-binding fragment of magrolimab (Hu5F9-G4; Forty-Seven / Gilead Science) , ligufalimab (AK117, Akesobio Biopharma) , lemzoparlimab (TJC4, I-Mab Biopharma) , AO-176 (Arch Oncology) , CC-90002 (Celgene / BMS) , SGN-CD47M (Seagen Inc. ) , IBI188 (Innovent Biologics, Inc. ) , SHR-1603 (Hengrui Medicine) , SRF231 (Surface Oncology) , ZL-1201 (ZAI Lab) , and IMC-002 (ImmuneOncia Therapeutics) .

[0089] In some embodiments, the first unit includes an antibody or antigen-binding fragment of OSE-172 (BI 765063, OSE Immuno therapeutics &Boehringer Ingelheim) , CC-95251 (Celgene) , FSI-189 (Gilead Sciences) , HSIRPB (Arch Oncology) , H21 (ALX Oncology) , ES004 (ElpiScience) , AL008 (Alector / Innovent) , ADU-1805 (Aduro Biotech) and Abx701 (Apexigen) .

[0090] In some embodiments, the first unit includes a SIRPα soluble domain or decoy, such as evorpacept and IMM01.

[0091] In some embodiments, the second unit includes an antibody or antigen-binding fragment of zolbetuximab, LM-002, LM-003, or LM-004.

[0092] In some embodiments, the multi-functional molecule is conjugated to a drug moiety. Examples of drug moieties or payloads include eribulin (2- (3-Amino-2-hydroxypropyl) hexacosahydro-3-methoxy-26-methyl-20, 27-bis (methylene) 11, 15-18, 21-24, 28-triepoxy-7, 9-ethano-12, 15-methano-9H, 15H-furo (3, 2-i) furo (2', 3'-5, 6) pyrano (4, 3-b) (1, 4) dioxacyclopentacosin-5- (4H) -one) , DM1 (maytansine, N2’ -deacetyl-N2’ - (3-mercapto-1-oxopropyl) -or N2’ -deacetyl-N2’ - (3-mercapto-1-oxopropyl) -maytansine) , mc-MMAD (6-maleimidocaproyl-monomethylauristatin-D or N-methyl-L-valyl-N- [ (1S, 2R) -2-methoxy-4-  [ (2S) -2- [ (1R, 2R) -1-methoxy-2-methyl-3-oxo-3- [ [ (1S) -2-phenyl-1- (2-thiazolyl) ethyl] amino] propyl] -1-pyr rolidinyl] -1- [ (1S) -1-methylpropyl] -4-oxobutyl] -N-methyl- (9Cl) -L-valinamide) , mc-MMAF (maleimidocaproyl-monomethylauristatin F or N- [6- (2, 5-dihydro-2, 5-dioxo-1H-pyrrol-1-yl) -1-oxohexyl] -N-methyl-L-valyl-L-valyl- (3R, 4S, 5S) -3-methoxy-5-methyl-4- (methylamino) heptanoyl- (αR, βR, 2S) -β-methoxy-α-methyl-2-pyrrolidinepropanoyl-L-phenylalanine) and mc-Val-Cit-PABA-MMAE (6-maleimidocaproyl-ValcCit- (p-aminobenzyloxycarbonyl) -monomethylauristatin E or N- [ [ [4- [ [N- [6- (2, 5-dihydro-2, 5-dioxo-1H-pyrrol-1-yl) -1-oxohexyl] -L-valyl-N5- (aminocarbonyl) -L-ornithyl] amino] phenyl] methoxy] carbonyl] -N-meth yl-L-valyl-N- [ (1S, 2R) -4- [ (2S) -2- [ (1R, 2R) -3- [ [ (1R, 2S) -2-hydroxy-1-methyl-2-phenylethyl] amino] -1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl] -1-pyrrolidinyl] -2-methoxy-1- [ (1S) -1-methylpropyl] -4-oxobutyl] -N-methyl-L-valinamide) . DM1 is a derivative of the tubulin inhibitor maytansine while MMAD, MMAE, and MMAF are auristatin derivatives. In some embodiments, the drug moiety is selected from the group consisting of mc-MMAF and mc-Val-Cit-PABA-MMAE.

[0093] Polynucleotides, mRNA, and Chimeric Antigen Receptors

[0094] In some embodiments, the agent that inhibits CD47, SIRPα or Claudin 18.2 may be polynucleotides that encode them, or cells that enclose those polynucleotides.

[0095] The polynucleotides of the present disclosure may encode the entire heavy and light chain variable regions of the antigen-binding polypeptides, variants or derivatives thereof on the same polynucleotide molecule or on separate polynucleotide molecules. Additionally, the polynucleotides of the present disclosure may encode portions of the heavy and light chain variable regions of the antigen-binding polypeptides, variants or derivatives thereof on the same polynucleotide molecule or on separate polynucleotide molecules.

[0096] In some embodiments, the polynucleotide is an mRNA molecule. In some embodiments, the mRNA can be introduced into a target cell for expressing the antibody or fragment thereof.

[0097] mRNAs may be synthesized according to any of a variety of known methods. For example, the mRNAs may be synthesized via in vitro transcription (IVT) . Briefly, IVT is typically performed with a linear or circular DNA template containing a promoter, a pool of ribonucleotide triphosphates, a buffer system that may include DTT and magnesium ions, and  an appropriate RNA polymerase (e.g., T3, T7 or SP6 RNA polymerase) , DNAse I, pyrophosphatase, and / or RNAse inhibitor. The exact conditions will vary according to the specific application.

[0098] In some embodiments, for the preparation of antibody-coding mRNA, a DNA template is transcribed in vitro. A suitable DNA template typically has a promoter, for example a T3, T7 or SP6 promoter, for in vitro transcription, followed by desired nucleotide sequence for desired antibody encoding (e.g., heavy chain or light chain encoding) mRNA and a termination signal.

[0099] Desired antibody encoding (e.g., heavy chain or light chain encoding) mRNA sequence may be determined and incorporated into a DNA template using standard methods. For example, starting from a desired amino acid sequence (e.g., a desired heavy chain or light chain sequence) , a virtual reverse translation is carried out based on the degenerated genetic code. Optimization algorithms may then be used for selection of suitable codons. Typically, the G / C content can be optimized to achieve the highest possible G / C content on one hand, taking into the best possible account the frequency of the tRNAs according to codon usage on the other hand. The optimized RNA sequence can be established and displayed, for example, with the aid of an appropriate display device and compared with the original (wild-type) sequence. A secondary structure can also be analyzed to calculate stabilizing and destabilizing properties or, respectively, regions of the RNA.

[0100] The mRNA may be synthesized as unmodified or modified mRNA. Typically, mRNAs are modified to enhance stability. Modifications of mRNA can include, for example, modifications of the nucleotides of the RNA. A modified mRNA can thus include, for example, backbone modifications, sugar modifications or base modifications. In some embodiments, antibody encoding mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) may be synthesized from naturally occurring nucleotides and / or nucleotide analogues (modified nucleotides) including, but not limited to, purines (adenine (A) , guanine (G) ) or pyrimidines (thymine (T) , cytosine (C) , uracil (U) ) , and as modified nucleotides analogues or derivatives of purines and pyrimidines, such as e.g. 1-methyl-adenine, 2-methyl-adenine, 2-methylthio-N-6-isopentenyl-adenine, N6-methyl-adenine, N6-isopentenyl-adenine, 2-thio-cytosine, 3-methyl-cytosine, 4-acetyl-cytosine, 5-methyl-cytosine, 2, 6-diaminopurine, 1-methyl-guanine, 2-methyl-guanine, 2, 2-dimethyl-guanine, 7-methyl-guanine, inosine, 1-methyl-inosine, pseudouracil (5-uracil) , dihydro-uracil, 2-thio-uracil, 4- thio-uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thio-uracil, 5- (carboxyhydroxymethyl) -uracil, 5-fluoro-uracil, 5-bromo-uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-uracil, 5-methyl-2-thio-uracil, 5-methyl-uracil, N-uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, 5-methylaminomethyl-uracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thio-uracil, 5’ -methoxycarbonylmethyl-uracil, 5-methoxy-uracil, uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil-5-oxyacetic acid (v) , 1-methyl-pseudouracil, queosine, 13-D-mannosyl-queosine, wybutoxosine, and phosphoramidates, phosphorothioates, peptide nucleotides, methylphosphonates, 7-deazaguanosine, 5-methylcytosine and inosine. The preparation of such analogues is known to a person skilled in the art e.g. from the U.S. Pat. Nos. 4,373,071, 4,401,796, 4,415,732, 4,458,066, 4,500,707, 4,668,777, 4,973,679, 5,047,524, 5,132,418, 5,153,319, 5,262,530 and 5,700,642, the disclosure of which is included here in its full scope by reference.

[0101] In some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) may contain RNA backbone modifications. Typically, a backbone modification is a modification in which the phosphates of the backbone of the nucleotides contained in the RNA are modified chemically. Exemplary backbone modifications typically include, but are not limited to, modifications from the group consisting of methylphosphonates, methylphosphoramidates, phosphoramidates, phosphorothioates (e.g. cytidine 5’ -O- (1-thiophosphate) ) , boranophosphates, positively charged guanidinium groups etc., which means by replacing the phosphodiester linkage by other anionic, cationic or neutral groups.

[0102] In some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) may contain sugar modifications. A typical sugar modification is a chemical modification of the sugar of the nucleotides it contains including, but not limited to, sugar modifications chosen from the group consisting of 2’ -deoxy-2’ -fluoro-oligoribonucleotide (2’-fluoro-2’ -deoxycytidine 5’ -triphosphate, 2’ -fluoro-2’ -deoxyuridine 5’ -triphosphate) , 2’ -deoxy-2’ -deamine-oligoribonucleotide (2’ -amino-2’ -deoxycytidine 5’ -triphosphate, 2’ -amino-2’ -deoxyuridine 5’ -triphosphate) , 2’ -O-alkyloligoribonucleotide, 2’ -deoxy-2’ -C-alkyloligoribonucleotide (2’ -O-methylcytidine 5’ -triphosphate, 2’ -methyluridine 5’ -triphosphate) , 2’ -C-alkyloligoribonucleotide, and isomers thereof (2’ -aracytidine 5’ -triphosphate, 2’ -arauridine 5’ -triphosphate) , or azidotriphosphates (2’ -azido-2’ -deoxycytidine 5’-triphosphate, 2’ -azido-2’ -deoxyuridine 5’ -triphosphate) .

[0103] In some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) may contain modifications of the bases of the nucleotides (base modifications) . A  modified nucleotide which contains a base modification is also called a base-modified nucleotide. Examples of such base-modified nucleotides include, but are not limited to, 2-amino-6-chloropurine riboside 5’ -triphosphate, 2-aminoadenosine 5’ -triphosphate, 2-thiocytidine 5’ -triphosphate, 2-thiouridine 5’ -triphosphate, 4-thiouridine 5’ -triphosphate, 5-aminoallylcytidine 5’ -triphosphate, 5-aminoallyluridine 5’ -triphosphate, 5-bromocytidine 5’ -triphosphate, 5-bromouridine 5’ -triphosphate, 5-iodocytidine 5’ -triphosphate, 5-iodouridine 5’-triphosphate, 5-methylcytidine 5’ -triphosphate, 5-methyluridine 5’ -triphosphate, 6-azacytidine 5’ -triphosphate, 6-azauridine 5’ -triphosphate, 6-chloropurine riboside 5’ -triphosphate, 7-deazaadenosine 5’ -triphosphate, 7-deazaguanosine 5’ -triphosphate, 8-azaadenosine 5’ -triphosphate, 8-azidoadenosine 5’ -triphosphate, benzimidazole riboside 5’ -triphosphate, N1-methyladenosine 5’ -triphosphate, N1-methylguanosine 5’ -triphosphate, N6-methyladenosine 5’ -triphosphate, O6-methylguanosine 5’ -triphosphate, pseudouridine 5’ -triphosphate, puromycin 5’ -triphosphate or xanthosine 5’ -triphosphate.

[0104] Typically, mRNA synthesis includes the addition of a “cap” on the N-terminal (5’ ) end, and a “tail” on the C-terminal (3’ ) end. The presence of the cap is important in providing resistance to nucleases found in most eukaryotic cells. The presence of a “tail” serves to protect the mRNA from exonuclease degradation.

[0105] Thus, in some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) include a 5’ cap structure. A 5’ cap is typically added as follows: first, an RNA terminal phosphatase removes one of the terminal phosphate groups from the 5’ nucleotide, leaving two terminal phosphates; guanosine triphosphate (GTP) is then added to the terminal phosphates via a guanylyl transferase, producing a 5’ 5’ 5 triphosphate linkage; and the 7-nitrogen of guanine is then methylated by a methyltransferase. Examples of cap structures include, but are not limited to, m7G (5’ ) ppp (5’ (A, G (5’ ) ppp (5) A and G (5) ppp (5’ ) G.

[0106] In some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) include a 3’ poly (A) tail structure. A poly-A tail on the 3’ terminus of mRNA typically includes about 10 to 300 adenosine nucleotides (e.g., about 10 to 200 adenosine nucleotides, about 10 to 175 adenosine nucleotides, about 10 to 150 adenosine nucleotides, about 10 to 125 adenosine nucleotides, 10 to 100 adenosine nucleotides, about 10 to 75 adenosine nucleotides, about 20 to 70 adenosine nucleotides, or about 20 to 60 adenosine nucleotides) . In some embodiments, antibody encoding mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) include a 3’ poly (C) tail structure. A suitable poly-C tail on the 3’  terminus of mRNA typically include about 10 to 200 cytosine nucleotides (e.g., about 10 to 150 cytosine nucleotides, about 10 to 100 cytosine nucleotides, about 20 to 70 cytosine nucleotides, about 20 to 60 cytosine nucleotides, or about 10 to 40 cytosine nucleotides) . The poly-C tail may be added to the poly-A tail or may substitute the poly-A tail.

[0107] In some embodiments, the mRNAs (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) include a 5’a nd / or 3’ untranslated region. In some embodiments, a 5’ untranslated region includes one or more elements that affect an mRNA’s stability or translation, for example, an iron responsive element. In some embodiments, a 5’ untranslated region may be between about 50 and 500 nucleotides in length (e.g., about 50 and 400 nucleotides in length, about 50 and 300 nucleotides in length, about 50 and 200 nucleotides in length, or about 50 and 100 nucleotides in length) .

[0108] In some embodiments, a 5’ region of an mRNA (e.g., heavy chain and light chain encoding mRNAs) includes a sequence encoding a signal peptide, such as those described herein. In particular embodiments, a signal peptide derived from human growth hormone (hGH) is incorporated in the 5’ region. Typically, a signal peptide encoding sequence is linked, directly or indirectly, to the heavy chain or light chain encoding sequence at the N-terminus.

[0109] The present technology may be used to deliver any antibody known in the art and antibodies that can be produced against desired antigens using standard methods. The present invention may be used to deliver monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, antibody mixtures or cocktails, human or humanized antibodies, chimeric antibodies, or bi-specific antibodies.

[0110] Methods of making antibodies are well known in the art and described herein. In certain embodiments, both the variable and constant regions of the antigen-binding polypeptides of the present disclosure are fully human. Fully human antibodies can be made using techniques described in the art and as described herein. For example, fully human antibodies against a specific antigen can be prepared by administering the antigen to a transgenic animal which has been modified to produce such antibodies in response to antigenic challenge, but whose endogenous loci have been disabled. Exemplary techniques that can be used to make such antibodies are described in U.S. patents: 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140 which are incorporated by reference in their entireties.

[0111] In some embodiments, the agent (antibody, fragment, polynucleotide) is provided in a chimeric antigen receptor (CAR) that includes the antibody or fragment thereof of the present disclosure as a targeting unit. In some embodiments, the CAR includes an antibody or fragment thereof of the present disclosure, a transmembrane domain, a costimulatory domain, and a CD3ξ intracellular domain.

[0112] A transmembrane domain can be designed to be fused to the extracellular domain which includes the antibody or fragment, optionally through a hinge domain. It can similarly be fused to an intracellular domain, such as a costimulatory domain. In some embodiments, the transmembrane domain can include the natural transmembrane region of a costimulatory domain (e.g., the TM region of a CD28T or 4-1BB employed as a costimulatory domain) or the natural transmembrane domain of a hinge region (e.g., the TM region of a CD8 alpha or CD28T employed as a hinge domain) .

[0113] In some embodiments, the transmembrane domain can include a sequence that spans a cell membrane, but extends into the cytoplasm of a cell and / or into the extracellular space. For example, a transmembrane can include a membrane-spanning sequence which itself can further include 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more amino acids that extend into the cytoplasm of a cell, and / or the extracellular space. Thus, a transmembrane domain includes a membrane-spanning region, yet can further comprise an amino acid (s) that extend beyond the internal or external surface of the membrane itself; such sequences can still be considered to be a “transmembrane domain” .

[0114] In some embodiments, the transmembrane domain is fused to the cytoplasmic domain through a short linker. Optionally, the short peptide or polypeptide linker, preferably between 2 and 10 amino acids in length can form the linkage between the transmembrane domain and a proximal cytoplasmic signaling domain of the chimeric receptor. A glycine-serine doublet (GS) , glycine-serine-glycine triplet (GSG) , or alanine-alanine-alanine triplet (AAA) provides a suitable linker.

[0115] In some embodiments, the CAR further includes a costimulatory domain. In some embodiments, the costimulatory domain is positioned between the transmembrane domain and an activating domain. Example costimulatory domains include, but are not limited to, CD2, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gamma, CD4, CD7, CD8a, CD8 , CD11a (ITGAL) , CD11b (ITGAM) , CD11c (ITGAX) , CD11d (ITGAD) , CD18 (ITGB2) , CD19 (B4) , CD27 (T  FRSF7) , CD28, CD28T, CD29 (ITGB1) , CD30 (TNFRSF8) , CD40 (TNFRSF5) , CD48 (SLAMF2) , CD49a (ITGA1) , CD49d (ITGA4) , CD49f (ITGA6) , CD66a (CEACAM1) , CD66b (CEACAM8) , CD66c (CEACAM6) , CD66d (CEACAM3) , CD66e (CEACAM5) , CD69 (CLEC2) , CD79A (B-cell antigen receptor complex-associated alpha chain) , CD79B (B-cell antigen receptor complex-associated beta chain) , CD84 (SLAMF5) , CD96 (Tactile) , CD 100 (SEMA4D) , CD 103 (ITGAE) , CD134 (OX40) , CD137 (4-1BB) , CD150 (SLAMF1) , CD158A (KIR2DL1) , CD158B1 (KIR2DL2) , CD158B2 (KIR2DL3) , CD158C (KIR3DP1) , CD158D (KIRDL4) , CD158F1 (KIR2DL5A) , CD158F2 (KIR2DL5B) , CD158K (KTR3DL2) , CD160 (BY55) , CD162 (SELPLG) , CD226 (DNAM1) , CD229 (SLAMF3) , CD244 (SLAMF4) , CD247 (CD3-zeta) , CD258 (LIGHT) , CD268 (BAFFR) , CD270 (T FSF14) , CD272 (BTLA) , CD276 (B7-H3) , CD279 (PD-1) , CD314 (KG2D) , CD319 (SLAMF7) , CD335 (K-p46) , CD336 (K-p44) , CD337 (K-p30) , CD352 (SLAMF6) , CD353 (SLAMF8) , CD355 (CRTAM) , CD357 (TNFRSF 18) , inducible T cell co-stimulator (ICOS) , LFA-1 (CD 1 la / CD 18) , KG2C, DAP-10, ICAM-1, Kp80 (KLRF1) , IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, LFA-1, SLAMF9, LAT, GADS (GrpL) , SLP-76 (LCP2) , PAG1 / CBP, a CD83 ligand, Fc gamma receptor, MHC class 1 molecule, MHC class 2 molecule, a TNF receptor protein, an immunoglobulin protein, a cytokine receptor, an integrin, activating NK cell receptors, a Toll ligand receptor, and fragments or combinations thereof.

[0116] In some embodiments, the cytoplasmic portion of the CAR also includes a signaling / activation domain. In one embodiment, the signaling / activation domain is the CD3ξdomain, or is an amino acid sequence having at least about 80%, 85%, 90%, 95%, 98%or 99%sequence identity to the CD3ξ domain.

[0117] Diseases

[0118] The compositions and methods of the present disclosure can also be used to treat or inhibit cancer.

[0119] Non-limiting examples of cancers include bladder cancer, breast cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, head and neck cancer, kidney cancer, leukemia, liver cancer, lung cancer, lymphoma, melanoma, pancreatic cancer, prostate cancer, and thyroid cancer. In some embodiments, the cancer is one or more of gastric, pancreatic, esophageal, ovarian, and lung cancers.

[0120] Additional diseases or conditions associated with increased cell survival, that may be treated, prevented, diagnosed and / or prognosed with the antibodies or variants, or derivatives thereof of the disclosure include, but are not limited to, progression, and / or metastases of malignancies and related disorders such as leukemia (including acute leukemias (e.g., acute lymphocytic leukemia, acute myelocytic leukemia (including myeloblastic, promyelocytic, myelomonocytic, monocytic, and erythroleukemia) ) and chronic leukemias (e.g., chronic myelocytic (granulocytic) leukemia and chronic lymphocytic leukemia) ) , polycythemia vera, lymphomas (e.g., Hodgkin's disease and non-Hodgkin's disease) , multiple myeloma, Waldenstrom's macroglobulinemia, heavy chain disease, and solid tumors including, but not limited to, sarcomas and carcinomas such as fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteogenic sarcoma, chordoma, angiosarcoma, endotheliosarcoma, lymphangiosarcoma, lymphangioendotheliosarcoma, synovioma, mesothelioma, Ewing's tumor, leiomyosarcoma, rhabdomyo sarcoma, colon carcinoma, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, sebaceous gland carcinoma, papillary carcinoma, papillary adenocarcinomas, cystadenocarcinoma, medullary carcinoma, bronchogenic carcinoma, renal cell carcinoma, hepatoma, bile duct carcinoma, choriocarcinoma, seminoma, embryonal carcinoma, Wilm's tumor, cervical cancer, testicular tumor, lung carcinoma, small cell lung carcinoma, bladder carcinoma, epithelial carcinoma, glioma, astrocytoma, medulloblastoma, craniopharyngioma, ependymoma, pinealoma, hemangioblastoma, acoustic neuroma, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma and retinoblastoma.

[0121] A specific dosage and treatment regimen for any particular patient will depend upon a variety of factors, including the particular antibodies, variant or derivative thereof used, the patient's age, body weight, general health, sex, and diet, and the time of administration, rate of excretion, drug combination, and the severity of the particular disease being treated. Judgment of such factors by medical caregivers is within the ordinary skill in the art. The amount will also depend on the individual patient to be treated, the route of administration, the type of formulation, the characteristics of the compound used, the severity of the disease, and the desired effect. The amount used can be determined by pharmacological and pharmacokinetic principles well known in the art.

[0122] Methods of administration of the antibodies, fragments, or antibody-drug conjugates or include but are not limited to intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. The antigen-binding polypeptides or compositions may be administered by any convenient route, for example by infusion or bolus injection, by absorption through epithelial or mucocutaneous linings (e.g., oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc. ) and may be administered together with other biologically active agents. Thus, pharmaceutical compositions containing the antigen-binding polypeptides of the disclosure may be administered orally, rectally, parenterally, intracistemally, intravaginally, intraperitoneally, topically (as by powders, ointments, drops or transdermal patch) , bucally, or as an oral or nasal spray.

[0123] The term “parenteral” as used herein refers to modes of administration which include intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous and intra-articular injection and infusion.

[0124] Administration can be systemic or local. In addition, it may be desirable to introduce the antibodies of the disclosure into the central nervous system by any suitable route, including intraventricular and intrathecal injection; intraventricular injection may be facilitated by an intraventricular catheter, for example, attached to a reservoir, such as an Ommaya reservoir. Pulmonary administration can also be employed, e.g., by use of an inhaler or nebulizer, and formulation with an aerosolizing agent.

[0125] It may be desirable to administer the antigen-binding polypeptides or compositions of the disclosure locally to the area in need of treatment; this may be achieved by, for example, and not by way of limitation, local infusion during surgery, topical application, e.g., in conjunction, with a wound dressing after surgery, by injection, by means of a catheter, by means of a suppository, or by means of an implant, said implant being of a porous, non-porous, or gelatinous material, including membranes, such as sialastic membranes, or fibers. Preferably, when administering a protein, including an antibody, of the disclosure, care must be taken to use materials to which the protein does not absorb.

[0126] The amount of the antibodies, fragments, or antibody-drug conjugates of the disclosure which will be effective in the treatment, inhibition and prevention of an inflammatory, immune or malignant disease, disorder or condition can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vitro assays may optionally be employed to help  identify optimal dosage ranges. The precise dose to be employed in the formulation will also depend on the route of administration, and the seriousness of the disease, disorder or condition, and should be decided according to the judgment of the practitioner and each patient's circumstances. Effective doses may be extrapolated from dose-response curves derived from in vitro or animal model test systems.

[0127] As a general proposition, the dosage administered to a patient of the antibodies, fragments, or antibody-drug conjugates of the present disclosure is typically 0.1 mg / kg to 100 mg / kg of the patient's body weight, between 0.1 mg / kg and 20 mg / kg of the patient's body weight, or 1 mg / kg to 10 mg / kg of the patient's body weight. Generally, human antibodies have a longer half-life within the human body than antibodies from other species due to the immune response to the foreign polypeptides. Thus, lower dosages of human antibodies and less frequent administration is often possible. Further, the dosage and frequency of administration of antibodies of the disclosure may be reduced by enhancing uptake and tissue penetration (e.g., into the brain) of the antibodies by modifications such as, for example, lipidation.

[0128] In an additional embodiment, the compositions of the disclosure are administered in combination with cytokines. Cytokines that may be administered with the compositions of the disclosure include, but are not limited to, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, anti-CD40, CD40L, and TNF-α.

[0129] In additional embodiments, the compositions of the disclosure are administered in combination with other therapeutic or prophylactic regimens, such as, for example, radiation therapy.

[0130] Compositions

[0131] The present disclosure also provides pharmaceutical compositions. Such compositions comprise (A) a first agent that inhibits CD47 signaling, and (B) a second agent comprising an anti-Claudin 18.2 antibody or an antibody-drug conjugate (ADC) thereof. In some embodiments, the composition further includes a pharmaceutically acceptable carrier.

[0132] In a specific embodiment, the term “pharmaceutically acceptable” means approved by a regulatory agency of the Federal or a state government or listed in the U.S. Pharmacopeia or other generally recognized pharmacopeia for use in animals, and more  particularly in humans. Further, a “pharmaceutically acceptable carrier” will generally be a non-toxic solid, semisolid or liquid filler, diluent, encapsulating material or formulation auxiliary of any type.

[0133] The term “carrier” refers to a diluent, adjuvant, excipient, or vehicle with which the therapeutic is administered. Such pharmaceutical carriers can be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. Water is a preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol and the like. The composition, if desired, can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents such as acetates, citrates or phosphates. Antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl parabens; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; and agents for the adjustment of tonicity such as sodium chloride or dextrose are also envisioned. These compositions can take the form of solutions, suspensions, emulsion, tablets, pills, capsules, powders, sustained-release formulations and the like. The composition can be formulated as a suppository, with traditional binders and carriers such as triglycerides. Oral formulation can include standard carriers such as pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharine, cellulose, magnesium carbonate, etc. Examples of suitable pharmaceutical carriers are described in Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin, incorporated herein by reference. Such compositions will contain a therapeutically effective amount of the antigen-binding polypeptide, preferably in purified form, together with a suitable amount of carrier so as to provide the form for proper administration to the patient. The formulation should suit the mode of administration. The parental preparation can be enclosed in ampoules, disposable syringes or multiple dose vials made of glass or plastic.

[0134] In an embodiment, the composition is formulated in accordance with routine procedures as a pharmaceutical composition adapted for intravenous administration to human beings. Typically, compositions for intravenous administration are solutions in sterile  isotonic aqueous buffer. Where necessary, the composition may also include a solubilizing agent and a local anesthetic such as lignocaine to ease pain at the site of the injection. Generally, the ingredients are supplied either separately or mixed together in unit dosage form, for example, as a dry lyophilized powder or water free concentrate in a hermetically sealed container such as an ampoule or sachette indicating the quantity of active agent. Where the composition is to be administered by infusion, it can be dispensed with an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline. Where the composition is administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline can be provided so that the ingredients may be mixed prior to administration.

[0135] The compounds of the disclosure can be formulated as neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include those formed with anions such as those derived from hydrochloric, phosphoric, acetic, oxalic, tartaric acids, etc., and those formed with cations such as those derived from sodium, potassium, ammonium, calcium, ferric hydroxides, isopropylamine, triethylamine, 2-ethylamino ethanol, histidine, procaine, etc.

[0136] EXAMPLES

[0137] Example 1. In vivo Efficacy of Anti-SIRPα Antibody and Anti-Claudin 18.2 ADC

[0138] This example evaluated the anti-tumor efficacy of the test molecules in MKN45 / 10D2. #14 model ki mice.

[0139] Materials and Methods

[0140] The test molecules included (A) an anti-SIRPα antibody LM-001, (B) an anti-Claudin 18.2 antibody-drug conjugate LM-002 ADC, and (C) their combination. Their sequences are shown in Tables 1-2. The ADC of LM-002 included vc-MMAE conjugated to the LM-002 antibody.

[0141] Table 1. LM-001 Sequences

[0142] Table 2. LM-002 Sequences

[0143] The treatment groups are provided in Table 3.

[0144] Table 3. Grouping and Treatments

[0145] a. Number of animals per group

[0146] b. Dosing volume: adjust dosing volume based on body weight 10mL / kg or 5mL / kg. Treatment schedule may be adjusted if body weight loss > 15 %.

[0147] The concentration of LM001 was 2 mg / mL, and that of LM002-ADC was 0.2 mg / mL, prepared in PBS buffer.

[0148] Cell Culture

[0149] MKN45 / 10D2. #14 tumor cells that expressed Claudin 18.2 were maintained in vitro in RPMI-1640 medium supplemented with 20%fetal bovine serum (FBS) , 100 U / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin, 1μg / mL puromycin at 37 ℃ in an atmosphere of 5%CO2 in air. The tumor cells were routinely sub-cultured twice weekly. The cells growing in an exponential growth phase were harvested and counted. Tumor cells were suspended in PBS with Matrigel for injection (the volume ratio of PBS and Matrigel was 1: 1) .

[0150] Tumor Inoculation

[0151] Each mouse was inoculated subcutaneously at the right axillary (lateral) with MKN45 / 10D2. #14 tumor cell (5×106) in 0.1 mL of cell suspension for tumor development. The mice were B-NDG hCD47 / hSIRPA-expressing (Biocytogen) .

[0152] Administration

[0153] On the sixth day after cell injection, the average tumor volume reached 90 mm3. The animals were then grouped according to tumor volume, followed by LM002-ADC and LM001 administration. LM-002 ADC (20μg, once a week) or LM-001 (400 μg, twice a week) was administrated intraperitoneally (N=7) . As the control, 0.1 mL PBS was administrated (N=7) . Tumor sizes were measured two times weekly in two dimensions using a caliper.

[0154] Observations

[0155] All the procedures related to animal handling, care and the treatment in the study were conducted according to guidelines approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of B&K and Medsyin following the guidance of the Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) . At the time of routine monitoring, the animals were daily checked for any effects of tumor growth and treatments on normal behavior such as mobility, food and water consumption (by looking only) , body weight gain / loss (body weights were measured every two days or twice weekly) , eye / hair matting and any other abnormal effects as stated in the protocol. Death and observed clinical signs were recorded on the basis of the numbers of animals within each subset.

[0156] Tumor Measurements and the Endpoints

[0157] The primary endpoint was to see if the tumor growth could be delayed or mice could be cured.

[0158] Tumor sizes were measured three times weekly in two dimensions using a caliper (No. 105688, sylvac Dantsin) , and the volume was expressed in mm3 using the formula: V = 0.5 × a × b2 where a and b were the long and short diameters of the tumor, respectively. The tumor sizes were then used for the calculations of T / C (%) values. T / C (%) was calculated using the formula: T / C %= (Ti-T0)  /  (Vi-V0) ×100, Ti was the average tumor volume of a treatment group on a given day, T0 was the average tumor volume of the treatment group on the first day of treatment, Vi was the average tumor volume of the vehicle control group on the same day with Ti, and V0 was the average tumor volume of the vehicle group on the first day of treatment.

[0159] TGI was calculated for each group using the formula: TGI (%) = [100-T / C] %. According to the guiding principle of anti-tumor drugs of the drug examination center, T / C%≤ 40%, it is considered that this drug is effective. According to NIH guidelines, TGI%≥ 58%, this drug is considered to be effective.

[0160] Sample collection

[0161] The study was terminated on day 23 after treatment.

[0162] Statistical Analysis

[0163] Summary statistics, including mean and the standard error of the mean (SEM) , are provided for the tumor volume of each group at each time point. Statistical analysis of difference in tumor volume among the groups were conducted on the data obtained at each time point.

[0164] T-test was performed to compare tumor volume among groups. A value of p < 0.05 was considered to be statistically significant.

[0165] Results

[0166] The study was terminated on day 23 according to the study design. Body weight and tumor volume data were showed as follows.

[0167] Body Weight

[0168] The body weight of MKN45 / 10D2. #14 tumor-bearing mice was monitored regularly as an indirect index of toxicity. On day 16 after treatment, the body weight of mice in LM002-ADC group decreased over 10%, but recovered in the next two time points. The detailed changes of body weight and relative change of body weight of MKN45 / 10D2. #14 tumor-bearing mice in each group are showed in FIG. 1 and FIG. 2 respectively. Both molecules, and their combination, were well tolerated.

[0169] Tumor Volumes

[0170] The present study ended on day 23 post treatment according to the experimental requirements. Tumor growth curves of MKN45 / 10D2. #14 tumor-bearing mice after drug administration are shown in FIG. 3. On day 23 of experiment, the average tumor volumes of vehicle group, LM002-ADC group, LM001 group and LM002-ADC+LM001 group were 825.48mm3, 730.95mm3, 996.63mm3 and 396.00mm3 respectively.

[0171] As shown in FIG. 3, LM-302+LM-101 significantly reduced the tumor size (P value < 0.05 on day 2 post the first treatment and the days later, analyzed by t test) . Compared to the LM-002 ADC monotherapy, the addition of LM-001 significantly enhanced its anti-tumor efficacy (P value < 0.05 on day 9 post the first treatment and the days later, analyzed by t test) .

[0172] Example 2. Comparison of LM-001 and LM-000

[0173] The anti-SIRPα antibody LM-001 was derived from antibody LM-000, which is a humanized version of a mouse anti-SIRPα antibody. The VH and VL sequences of LM-000 are also shown in Table 1.

[0174] During development of the LM-000 antibody, it was discovered that various mutations could improve the developability of the antibody while well maintaining its biological activities. Through thorough comparison, it was determined that when two mutations (G7=>A and N16=>Q) were introduced to the VH CDR2, the best-performing antibody LM-001 was obtained. More specifically, LM-000 included WIYPGDGDTNYNQKFNG (SEQ ID NO: 19) as the VH CDR2, a first generation optimized LM-000a included WIYPGDADTNYNQKFNG (SEQ ID NO: 20) , and LM-001 included WIYPGDADTNYNQKFQG (SEQ ID NO: 4) as the VH CDR2.

[0175] In this example, the binding affinities of LM-001a and LM-101 to human and cynomolgus SIRPα were compared with FACS. Each of human and cynomolgus SIRPα proteins was expressed on CHO-K1 cells and the cells were incubated with diluted antibodies, and the bound antibody was measured with secondary anti-hFc antibody. The results are shown in Tables 4A-B below and FIG. 4.

[0176] Table 4A. Binding to Cell Surface Human SIRPα

[0177] Table 4B. Binding to Cell Surface Cynomolgus SIRPα

[0178] As shown in this tables, despite the mutations, the optimized LM-101 antibody retained superior binding affinity to both human and cynomolgus SIRPα, underscoring the excellent developability of the LM-101 antibody.

[0179] *  *  *

[0180] The present disclosure is not to be limited in scope by the specific embodiments described which are intended as single illustrations of individual aspects of the disclosure, and any compositions or methods which are functionally equivalent are within the scope of this disclosure. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the methods and compositions of the present disclosure without departing from the spirit or scope of the disclosure. Thus, it is intended that the present disclosure cover the modifications and variations of this disclosure provided they come within the scope of the appended claims and their equivalents.

[0181] All publications and patent applications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference.

Claims

1.A method for treating cancer in a patient in need thereof, comprising administering to the patient (A) a first agent that inhibits CD47 signaling, and (B) a second agent comprising an anti-Claudin 18.2 antibody or an antibody-drug conjugate (ADC) thereof.2.A method for treating cancer in a patient in need thereof wherein the patient undergoes a treatment with a first agent that inhibits CD47 signaling, the method comprising administering to the patient a second agent comprising an anti-Claudin 18.2 antibody or an antibody-drug conjugate (ADC) thereof.3.A method for treating cancer in a patient in need thereof wherein the patient undergoes a treatment with a second agent comprising an anti-Claudin 18.2 antibody or an antibody-drug conjugate (ADC) thereof, the method comprising administering to the patient a first agent that inhibits CD47 signaling.4.The method of any preceding claim, wherein the first agent is selected from the group comprising an anti-SIRPα antibody, an anti-CD47 antibody, a soluble SIRPα, a SIRPα decoy, a polynucleotide encoding each thereof, and a cell comprising the polynucleotide.5.The method of claim 4, wherein the first agent comprises an anti-SIRPα antibody, which can be selected from the group consisting of OSE-172, CC-95251, FSI-189, HSIRPB, H21, ES004, AL008, ADU-1805 and Abx701.6.The method of claim 5, wherein the anti-SIRPα antibody comprises a heavy chain variable region (VH) comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a  VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.7.The method of claim 6, wherein the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.8.The method of any one of claims 5-7, wherein the anti-SIRPα antibody further comprises a human Fc fragment.9.The method of claim 8, wherein the Fc fragment does not have or has reduced effector function.10.The method of claim 9, wherein the Fc fragment is a human IgG1 Fc fragment with a N297A mutation (EU numbering) .11.The method of any one of claims 1-4, wherein the first agent comprises an anti-CD47 antibody.12.The method of claim 11, wherein the anti-CD47 antibody is selected from the group consisting of magrolimab, ligufalimab, lemzoparlimab, AO-176, CC-90002, SGN-CD47M, IBI188, SHR-1603, SRF231, ZL-1201, and IMC-002.13.The method of any one of claims 1-4, wherein the first agent comprises a soluble SIRPα.14.The method of claim 13, wherein the soluble SIRPα is SIRPα-Fc.15.The method of any one of claims 1-4, wherein the first agent comprises a SIRPαdecoy.16.The method of claim 15, wherein the SIRPα decoy is evorpacept or IMM01.17.The method of any preceding claim, wherein the anti-Claudin 18.2 antibody is selected from the group consisting of zolbetuximab, LM-002, LM-003, and LM-004.18.The method of any one of claims 1-17, wherein the anti-Claudin 18.2 antibody comprises a heavy chain variable region (VH) comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.19.The method of claim 18, wherein the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 and the VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.20.The method of any preceding claim, wherein the second agent is an ADC comprising the anti-Claudin 18.2 antibody.21.The method of claim 20, wherein the ADC comprises a drug moiety comprising a cytotoxic or cytostatic agent.22.The method of claim 21, wherein the drug moiety comprises monomethyl auristatin E (MMAE) or monomethyl auristatin F (MMAF) .23.A composition comprising (A) a first agent that inhibits CD47 signaling, and (B) a second agent comprising an anti-Claudin 18.2 antibody or an antibody-drug conjugate (ADC) thereof.24.A molecule comprising (A) a first portion that inhibits CD47 signaling, and (B) a second portion comprising an anti-Claudin 18.2 antibody or an antibody-drug conjugate (ADC) thereof.25.An anti-SIRPα antibody comprising a heavy chain variable region (VH) comprising a VH CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a VH CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and a VH CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a light chain variable region (VL) comprising a VL CDR1  comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a VL CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and a VL CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.26.The antibody of claim 25, wherein the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.27.The antibody of claim 25 or 26, wherein the anti-SIRPα antibody further comprises a human Fc fragment.28.The antibody of claim 27, wherein the Fc fragment does not have or has reduced effector function.29.The antibody of claim 28, wherein the Fc fragment is a human IgG1 Fc fragment with a N297A mutation (EU numbering) .

Images