A reaction process and biocatalyst for preparing enantiopure (s) -4-phenyl-2-oxazolidinone

Abstract

Provided are improved engineered halohydrin dehalogenases that can tolerate high substrate concentrations and has high substrate specificity and activity. The engineered halohydrin dehalogenase is capable of converting (R) -styrene oxide from racemic styrene oxide to (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone; and resolving racemic styrene oxide to obtain (S)-styrene oxide in high purity.

Description

A reaction process and biocatalyst for preparing enantiopure (S) -4-phenyl-2-oxazolidinoneTechnical Field

[0001] The present invention is in the field of industrial biotechnology and relates to a reaction process for the engineered halohydrin dehalogenase-catalyzed synthesis of enantiopure (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone and (S) -styrene oxide.

[0002] Background Technology

[0003] (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone is a common EVANS additive, which is widely used in the chemical industry for synthesizing asymmetric lactams, serving as a key intermediate in the synthesis of the hypolipidemic agents Ezetimibe and Hybutimibe (Figure 1) .

[0004] Oxazolidinone-based auxiliaries, promoted by David A. Evans, have been applied in numerous stereoselective conversion reactions, including hydroxyaldol condensation reactions, alkylation reactions, and the Diels-Alder reaction (also known as bis-alkene addition reactions) . Oxazolidinones utilize steric hindrance to direct the substitution of various groups, after which the auxiliary is removed.

[0005] Ezetimibe is a small molecule drug and its API is (3R, 4S) -1- (4-fluorophenyl) -3- [ (3S) -3- (4-fluorophenyl) -3-hydroxypropyl] -4- [4-hydro xyphenyl] -2-azetidinone (CAS No.: 163222-33-1) . This drug was developed by Schering-Plough in collaboration with Merck Sharp &Dohme, and it is an NPC1L1 inhibitor and selective Cholesterol absorption inhibitor. The Hybutimibe (CAS No.: 1266548-74-6) , an innovative lipid-lowering drug marketed in recent years, is another NPC1L1 inhibitor and cholesterol uptake inhibitor, which has been identified as a class I chemical drug in China. Both Ezetimibe and hybutimibe use EVANS additive (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone in the process of constructing chiral lactams.

[0006] Most of the current EVANS auxiliaries are obtained by amino acid reduction and ring closure, among which (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone are mostly chemically synthesized using the non-natural amino acid L-phenylglycine as the starting material,  and are prepared through a three-step reaction of methylation, reduction, and cyclization, as shown in Figure 2. The final cyclization step uses cyclization reagents, which can be selected from dimethyl carbonate, diethyl carbonate and triphosgene. However, this process has significant drawbacks, including high costs and environmental pollution.

[0007] ENZYMASTER (NINGBO) BIO-ENGINEERING CO., LTD developed a halohydrin dehalogenase (HHDH) in 2022, which can selectively catalyze the formation of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone from (R) -styrene oxide (CN202211627336.1) , and lays the foundation for the industrial application of enzymatic synthesis of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone with high chiral purity. In order to further enhance the competitiveness of this enzymatic route for industrial production, the present invention develops an enzyme-catalyzed reaction process for the one-step generation of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone of high chiral purity in high time space yields using racemic styrene oxide as substrate, and develops enzyme catalysts with better performance.

[0008] Content of the Invention

[0009] The inventors of the present application have engineered a halohydrin dehalogenase to obtain an improved engineered enzyme catalyst that can tolerate high substrate concentrations and has high selectivity and activity. The engineered enzyme was capable of converting (R) -styrene oxide from racemic styrene oxide to (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone; and resolving racemic styrene oxide to obtain (S) -styrene oxide in high chiral purity.

[0010] In order to obtain a biocatalyst capable of catalyzing the reaction shown in Figure 3 and to meet the needs of industrial production, the inventors developed a series of higher-performance halohydrin dehalogenase mutants through a creative process of directed enzyme evolution , using the enzyme variant SEQ ID NO: 4 in Patent Application No. CN202211627336.1 as a backbone.

[0011] The present application provides variants of halohydrin dehalogenases and methods for catalyzing the synthesis of the EVANS additive  (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone, and halohydrin dehalogenases of the present application are capable of selectively catalyzing the synthesis of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone from (R) -styrene oxide. Under conditions where a racemic mixture of styrene oxide is loaded at 100-300 g / L and wet cells expressing a variant of halohydrin dehalogenase are used at a loading of 5 g / L-50 g / L, the molar conversion of (R) -styrene oxide in the racemic substrate was >99%, and the ee of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone remained after the reaction was >99%. In the reaction, 99%of the (R) -styrene oxide was converted to the product, enabling the efficient recovery of the (S) -styrene oxide substrate with a purity of >99%and an enantiomeric excess (ee) of >99%. As a significant chiral intermediate, (S) -styrene oxide holds substantial economic value for the synthesis of levamisole hydrochloride. Utilizing (S) -styrene oxide as a starting material for levamisole synthesis not only avoids resolution and material loss but also enables precise chiral construction. The present invention not only makes innovative improvement in enzyme engineering, but also pioneers a unique reaction and post-treatment process for the industrial application at kg-scale processes.

[0012] "Polypeptide" and "peptide" are used interchangeably herein to refer to a polymer of at least two amino acids covalently linked by an amide bond, regardless of length or post-translational modifications (e.g., glycosylation, phosphorylation, lipidation, myristoylation, ubiquitination, etc. ) . "Halohydrin dehalogenase mutant" , "engineered halohydrin dehalogenase" , "engineered halohydrin dehalogenase polypeptide" , "improved halohydrin dehalogenase polypeptide" and "engineered peptide" are used interchangeably herein. "Polynucleotide" and "nucleic acid" are used interchangeably herein. "Coding sequence" refers to the nucleic acid portion (e.g., a gene) that encodes an amino acid sequence of a protein. "Naturally occurring" or "wild-type" refers to the form found in nature. For example, a naturally occurring or wild-type polypeptide or polynucleotide sequence is a sequence that exists in an organism that is isolable from a natural source and has not been intentionally modified by artificial manipulation. "Engineered" or "non-naturally occurring" when used in refer to, for example, a cell, nucleic acid or polypeptide, refers to a material  that is, or corresponds to, the natural or inherent form of the material, that has been altered in a manner not found in nature, or is identical to it but is produced or obtained from synthetic material and / or by manipulation using recombinant technology. "Amino acid difference" or "residue difference" refers to a difference in an amino acid residue at a position of a polypeptide sequence relative to an amino acid residue at a corresponding position in a reference sequence.

[0013] The halohydrin dehalogenase polypeptides developed in the present application may comprise an amino acid sequence selected from those having at least 97%sequence identity to SEQ ID NO: 2 and having one or more residue differences compared to SEQ ID NO: 2 at residue positions selected from: X15, X16, X32, X48, X49, X50, X58, X73, X92, X94, X99 , X118, X150, X173, X174, X185, X186, X193, X199, X201, X202, X207; in some embodiments, the amino acid residue difference compared to SEQ ID NO: 2 is selected from the following: A15D, A15H, A15T, A16G, A16P, H32R, H32D, R48M. R48S, S49G, S49R, R50P, R50S, T58S, T58Y, H73W, H73P, H73A, I92F, I92Y, I92W, I92L, I92H, I94F, I94G, E99V, H118K, H118T, V150W, V150Y, K173S, K173C, H174D, H174V, F185N, M186L, K193D, K193T, K193Q, D199P, D199T, D199A, E201I, E201S, E201D, R202P, R202T, E207L, E207G, E207Y. More specifically, in some embodiments, the engineered polypeptide improved over SEQ ID NO: 2 comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence shown by the even-numbered identifiers in SEQ ID NO: 4-124. In some embodiments, after 24 hours of reaction under the conditions of 100 g / L-300 g / L racemic styrene oxide, 10 g / L-50 g / L wet cells expressing SEQ ID NO: 4-124, a ratio of ethyl acetate to aqueous phase of 1: 5-1: 1 (v / v) , and a temperature of 30℃, the molar conversion of (R) -styrene oxide reached >99%and the ee value of product was >99%, as detected by GC.

[0014] The kinetic resolution of the racemic compounds can be characterized by the E-value. When an enzyme is used as a catalyst for the kinetic resolution of a racemic substrate containing two isomers, ideally, the enzyme, if it has an extremely stringent selectivity, catalyzes the reaction of the two isomers with extremely different rates,  such that the enzyme consumes only one of the isomers and automatically terminates the reaction after complete consumption of that corresponding isomer, without catalyzing the reaction of the other isomer. However, in general, if the selectivity of the enzyme is not stringent enough, it will catalyze the reaction of the other isomer at the same time. In this case, the kinetic resolution of the enzyme to catalyze the reaction of the racemic substrate cannot be accurately described by the conversion rate or the enantiomeric excess (ee) value of product alone, and the relationship between the conversion rate and the ee value of the product, i.e., the "E value" , can be calculated to describe this property. The E-value is calculated as follows:

[0015] c = molar conversion, e.e·P = ee value of product. As a rule of thumb, reactions with E ≥ 200 are excellent kinetic-resolution reactions, and the enzyme-catalyzed reaction process developed in the present application for the one-step generation of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone using racemic styrene oxides as substrate can achieve E ＞ 200.

[0016] In another aspect, the present invention also provides polynucleotide sequences encoding the above-described polypeptides, the polynucleotide may be a portion of an expression vector having one or more control sequences for expressing the engineered polypeptide, and the polynucleotide may comprise polynucleotide sequences corresponding to sequences shown by the odd sequence identifiers of SEQ ID NO: 3-123.

[0017] In order to develop enzyme catalysts with higher substrate tolerance for the reaction shown in Figure 3, directed evolution starting with SEQ ID NO: 2 has been performed in the present application. Some exemplary engineered polypeptides obtained through this process and the results of their screening reactions are listed in Table 1.

[0018] Table 1

[0019] *The screening reaction conditions used to calculate the fold of catalytic performance in Table 1 were: substrate loading of 150 g / L (substrate loading of 36 g / L was used for SEQ ID NO: 2, as SEQ ID NO: 2 was inhibited when the substrate loading was 150 g / L) , wet cells loading of 5 g / L, a 1: 5 ratio of ethyl acetate to aqueous phase (v / v) , and a temperature of 30℃, with product ee values all exceeding 99%.

[0020] Under the conditions of the preparative process (illustrated, for example, in Examples 3-9) , the engineered polypeptides listed in Table 1 (i.e., the sequences shown by the even numbered identifiers of SEQ ID NO: 4-124) had >99%molar conversion of (R) -styrene oxide, and the ee of the resulting (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone was >99%, and the E value of the reaction process was >200.

[0021] In another aspect, the present application also provides applications of engineered halohydrin dehalogenase polypeptides, wherein the halohydrin dehalogenase mutants disclosed herein are capable of converting (R) -styrene oxide to (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone under suitable reaction conditions; and capable of resolving racemic styrene oxides to obtain (S) -styrene oxide with high molar purity under suitable reaction conditions. The reaction can be carried out in a two-phase system formed with an aqueous phase and an organic phase, at a reaction temperature  in the range of 25-40℃, preferably at a temperature of 30-35℃, and at a pH in the range of 7-12, preferably at pH 10.8.

[0022] The present application provides a production process for enzyme-catalyzed synthesis of enantiopure (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone, with the reaction process having an E ＞200, and the time space yield of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone can reach >8 g·L-1h-1. The engineered halohydrin dehalogenases can tolerate high substrate concentration and have high substrate selectivity, and under the reaction process conditions, the enzymatic reaction stops after the complete conversion of (R) -styrene oxide and has no catalytic activity on (S) -styrene oxide, which avoids the requirement of kinetic control in the process. The amount of ethyl acetate used in the reaction process is further reduced, lowering the production cost. Under suitable reaction conditions, the enzyme is also capable of catalyzing the synthesis of other EVANS additives such as phenylene oxide propane, propylene oxide, 1, 2-epoxy-3-methylbutane and other epoxy compounds. The method disclosed in the present application is of great application value for the green and asymmetric synthesis of EVANS additives at industrial setting.

[0023] Drawings

[0024] Figure 1 EVANS additives and their applications

[0025] Figure 2 Conventional chemical synthesis route of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone

[0026] Figure 3 One-step enzymatic synthesis of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone from styrene oxide

[0027] Figure 4 SDS gel image of supernatant (1) and pellets (2) of homogenized wet cells expressing SEQ ID NO: 4

[0028] Figure 5 GC chromatography

[0029] Figure 6 Single crystal structure figure of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinoneExamples

[0030] The following embodiments are used to further illustrate the present invention  and to provide a clear and complete description of the technical solution of the present invention, but the present invention is not limited thereto, and the described embodiments are only a part of the embodiments of the present invention and not all of the embodiments. Based on the embodiments in the present invention, all other embodiments obtained by a person of ordinary skill in the art without making creative labor fall within the scope of protection of the present invention. In addition, the experimental methods involved in the following embodiments but not indicated with specific conditions are generally in accordance with the conditions routinely used in the field of biochemical technology or recommended by the manufacturer, and the reagents and equipment involved but not specifically indicated are commercially available.

[0031] Example 1: Gene cloning and construction of expression vectors

[0032] The nucleic acid corresponding to the amino acid sequence of halohydrin dehalogenase was synthesized by common techniques in this field. and cloned into the expression vector pET28a. The recombinant expression plasmid was transformed into E.coil BL21 (DE3) competent cells under the transformation conditions of 42℃ and thermal shock for 90s and ice bath for 5min, then added to LB culture based on 37℃shaker incubator for recovery for 1h, and finally coated onto LB plates containing kanamycin and inverted at 37℃ for overnight incubation, i.e. the recombinant transformants were obtained.

[0033] Example 2: Expression of halohydrin dehalogenase

[0034] The recombinant E. coli BL21 (DE3) containing a halohydrin dehalogenase (SEQ ID NO: 4) expression plasmid was inoculated into 50mL of LB medium (containing 30 μg / mL of kanamycin) in a 250 mL Erlenmeyer flask, which was then cultured in a shaking incubator at 30℃ overnight. When the OD600 of the overnight culture reached 2, it was sub-cultured at the inoculum of 5% (v / v) into a 1000 mL flask containing 250 mL of TB medium, and IPTG at a final concentration of 0.1 mM was added to induce the expression of halohydrin dehalogenase, and this  expression culture was placed in a shaking incubator at 28℃ for 20 h. After 20h, the expression culture was centrifuged at 8000rpm for 10min, the supernatant was discarded, and the cells were collected to obtain wet cells. The wet cells successfully expressed soluble protein halohydrin dehalogenase 26 kDa (Figure 4) . The wet cells were used directly in the enzyme-catalyzed reaction or stored frozen at -20℃ until use.

[0035] Example 3: Synthesis of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone catalyzed by halohydrin dehalogenase variants

[0036] 67.5 mg of wet cells expressing SEQ ID NO: 8 was weighed into a 25 mL glass vial, 5 mL of water and 390 mg of sodium cyanate were added, 1 mL of ethyl acetate was added under stirring, 720 mg of racemic styrene oxide was added, and the temperature of the reaction was set at 35℃ and the stirring speed at 400 rpm. GC analysis was performed after the reaction was completed, and the conversion, yield and ee of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone were calculated.

[0037] The molar conversion of (R) -styrene oxide in the above reaction reached >99%and the product ee >99%. 1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ = 7.42 -7.37 (m, 2H) , 7.36 -7.31 (m, 3H) , 6.31 (s, 1H) , 4.95 (t, J = 7.9 Hz, 1H) , 4.72 (t, J = 8.7 Hz. 1H) , 4.17 (dd, J = 8.6, 7.0 Hz, 1H) . 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ 159.96, 139.55, 129.21, 128.80, 72.55, 58.39, 56.40, 18.40. The product monocrystals were confirmed to be the target material by x-ray single crystal diffraction. The monocrystal structure is shown in Figure 6 and the crystallographic data are shown in Table 2.

[0038] Table 2 Crystallographic data

[0039] Under the similar reaction conditions, 2.0 g of racemic styrene oxide, 600 mg of wet cells expressing halohydrin dehalogenase, 1.1 g of sodium cyanate were added into the reaction. GC analysis was carried out after the completion of the reaction, and the yield with respect to (R) -styrene oxide and ee of the resulting (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone were calculated, as shown in Table 3.

[0040] Table 3

[0041] The GC chromatography of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone catalyzed by SEQ ID NO: 8 is shown in Figure 5.

[0042] The GC instrument used to detect the above reaction was a commercially available Agilent 6890 chromatograph

[0043] The column was an Agilent CP-Chirasil Dex CB (CP7502) 25 m*0.25 mm*0.25 μm, the carrier gas was N2, the detector was FID, the inlet temperature was 300 ℃, the split ratio was 10: 1, the detector temperature was 300 ℃, the flow rate was 1.2 mL / min, and the column temperature was 90 ℃ and increased to 180 ℃ at 6 ℃ / min, maintained for 13 mins, and the total running time is 31.6min. The solvent was ethyl acetate and the injection volume was 2 μL..

[0044] 1.5g racemic styrene oxide, 0.81g sodium cyanate and 225mg of wet cells  expressing halohydrin dehalogenase were loaded under the similar reaction conditions. The molar conversion of (R) -styrene oxide by SEQ ID NO: 8 was >99%, and the product ee was >99%.

[0045] 2.55g racemic styrene oxide, 1.38g sodium cyanate and 660mg of wet cells expressing halohydrin dehalogenase were loaded under the similar reaction conditions. The molar conversion of (R) -styrene oxide by SEQ ID NO: 8 was >99%, and the product ee was >99%.

[0046] Example 4: Production process for the synthesis of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone catalyzed by SEQ ID NO: 8

[0047] In a 1000L reactor, 115 kg of racemic styrene oxide, 64 kg of sodium cyanate, 8 kg of wet cells expressing halohydrin dehalogenase, 160-256 kg of ethyl acetate, and 400 kg of water were added, and the reaction was carried out for 24 hours at 35℃ under mechanical stirring until the conversion of (R) -styrene oxide was >99%. After the reaction, the organic phase of the ethyl acetate was removed, and n-heptane was added for beating, and centrifugation was carried out to remove the (S) -styrene oxide solution to obtain the crude product of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone.

[0048] The crude product was solubilized by ethyl acetate and then filtered, and the product obtained by filtration was precipitated at low temperature. The product had a dry weight of 69 kg, ee >99.5%and total impurities <0.5%.

[0049] Example 5: The preparation of (S) -styrene oxide

[0050] A n-heptane solution of (S) -styrene oxide obtained under the same reaction conditions of Example 4 described above was distilled at 33-55℃ to remove the solvent. It was then distilled under reduced pressure at 50-75℃ to obtain 52 kg of (S) -styrene oxide. The mass yield of (S) -styrene oxide was 45%; both ee and purity were >99%.

[0051] Example 6: Production process for the synthesis of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone catalyzed by SEQ ID NO: 24

[0052] 90 mg of wet cells expressing halohydrin dehalogenase was weighed into a 25 mL glass vial, 5 mL of water and 885 mg of sodium cyanate were added, 1 mL of ethyl acetate was added under stirring, 1.635 g of racemic styrene oxide was added, and the reaction temperature was set at 30 ℃, pH 8-11, and stirring speed was 400 rpm. GC analysis was carried out after the reaction, the molar conversion of (R) -styrene oxide was >99%, and the ee of the product was > 99%.

[0053] Example 7: Production process for the synthesis of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone catalyzed by SEQ ID NO: 100

[0054] 100 mg of wet cells expressing halohydrin dehalogenase was weighed into a 25 mL glass vial, 5 mL of water and 640 mg of sodium cyanate were added, 1 mL of ethyl acetate was added under stirring, 1.18 g of racemic styrene oxide was added, and the temperature of the reaction was set at 35 ℃, pH at 8-11, and stirring speed at 400 rpm. GC analysis was carried out after the reaction, and the molar conversion of (R) -styrene oxide was >99%, and the ee of the product was > 99%.

[0055] Example 8: Production process for the synthesis of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone catalyzed by SEQ ID NO: 34

[0056] 150 mg of wet cells expressing halohydrin dehalogenase was weighed into a 25 mL glass vial, 5 mL of water and 1.1 g of sodium cyanate were added, 1 mL of ethyl acetate was added under stirring, 2.0 g of racemic styrene oxide was added, and the reaction temperature was set to 35 ℃, pH 8-11, and stirring speed to 400 rpm. GC analysis was carried out after the reaction, and the molar conversion of (R) -styrene oxide was >99%, and the ee of the product was > 99%.

[0057] Example 9: Production process for the synthesis of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone catalyzed by SEQ ID NO: 114

[0058] 200 mg of wet cells expressing halohydrin dehalogenase was weighed into a 25 mL glass vial, 5 mL of water and 1.38 g of sodium cyanate were added, 1 mL of ethyl acetate was added under stirring, , 2.55 g of racemic styrene oxide was added, and the  reaction temperature was set to 30 ℃, pH 8-11, and stirring speed to 400 rpm. GC analysis was carried out after the reaction, and the molar conversion of (R) -styrene oxide was >99%, and the ee of the product was > 99%.

[0059] It is to be understood that after reading the foregoing of the present invention, a person skilled in the art may make various alterations or modifications to the present invention, and that these equivalent forms likewise fall within the scope defined by the claims appended to the present application.

Claims

1.An engineered halohydrin dehalogenase polypeptide, the polypeptide selectively catalyzes the generation of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone from (R) -styrene oxide, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence having a sequence identity of at least 97%to the reference sequence SEQ ID NO: 2 and at least a one-residue difference at residue position X94 compared to SEQ ID NO: 2, wherein the amino acid residue at residue position X94 is selected from F or G.2.A halohydrin dehalogenase polypeptide according to claim 1, the polypeptide further comprising one or more amino acid residue differences as follows: A15D, A15H, A15T, A16G, A16P, H32R, H32D, R48M, R48S, S49G, S49R, R50P, R50S, T58S, T58Y, H73W, H73P, H73A, I92F, I92Y, I92W, I92L, I92H, E99V, H118K, H118T, V150W, V150Y, K173S, K173C, H174D, H174V, F185N, M186L, K193D, K193T, K193Q, D199P, D199T, D199A, E201I, E201S, E201D, R202P, R202T, E207L, E207G, E207Y.3.A halohydrin dehalogenase polypeptide according to claims 1-2, the amino acid sequence of the polypeptide comprises SEQ ID No: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 , 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, and 124.4.A polynucleotide, the polynucleotide encoding the polypeptide of claim 3, wherein the polynucleotide sequence comprises a polynucleotide corresponding to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121 and 123.5.An expression vector, the expression vector comprising the polynucleotide of claim 4, and the expression vector comprises a plasmid, mucoid, phage or viral vector.6.A host cell, the host cell comprising the expression vector of claim 5, the host cell preferably being E. coli.7.A production process for the biocatalytic preparation of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone, wherein the process comprises the step of using  (R) -styrene oxide or racemic styrene oxide as a substrate and contacting the substrate with a halohydrin dehalogenase polypeptide, wherein the reaction is carried out in a two-phase system formed with an aqueous phase and an organic phase, and wherein the reaction temperature is 25-40℃, the pH is 7-12, and wherein the substrate, racemic styrene oxide was loaded with 100-300g / L, the wet cells was loaded with 5g / L-50g / L, and the ratio of ethyl acetate to water was 1: 5 ～ 1: 1.8.The production process according to claim 7, characterized in that the halohydrin dehalogenase polypeptide is the engineered halohydrin dehalogenase polypeptide of any one of claims 1-3.9.The production process of claim 7, the catalytic preparation of (S) -4-phenyl-2-oxazolidinone pilot reaction: 115 kg of the substrate racemic styrene oxide, 8 kg of wet cells expressing halohydrin dehalogenase polypeptide, 65 kg of sodium cyanate, 160-256 kg of ethyl acetate, 400 kg of water were loaded into 1000L reactor, the temperature was 30-40 ℃, pH 10-11, reaction for 24 hours under mechanical stirring.10.The production process of claim 9, preferably at a temperature of 35℃, pH 10.8, and after the reaction, n-heptane was added for beating, post-treatment comprises recrystallization using ethyl acetate .11.An application for the biocatalytic synthesis of EVANS additives, characterized in that the use of the enzyme mutant of claim 1 or 2, which is capable of catalyzing other substrates such as phenylpropylene oxide, propylene oxide, 1, 2-epoxy-3-methylbutane, and other epoxy compounds under suitable reaction conditions.

Images