Metallo-complex compounds and methods of making and using thereof

Abstract

Metallo-complex compounds and pharmaceutical compositions thereof are described herein. The metallo-complex compounds and pharmaceutical compositions can be use in treating infections in a subject in need thereof. The infections can be bacterial infections, such as multidrug resistant (MDR) bacterial infections.

Description

METALLO-COMPLEX COMPOUNDS AND METHODS OF MAKING AND USING THEREOFFIELD OF THE INVENTION

[0001] This invention is generally in the field of metallo-complex compounds and methods of use thereof for treating infections.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Multidrug resistant (MDR) bacterial infections are becoming a serious threat to human health worldwide. The lack of new clinically approved antibiotics in recent decades and the overuse / misuse of known antibiotics have accelerated the development of drug resistance in bacteria. 1, 2 In particular, Gram-negative bacterial infections are particularly prevalent and difficult to treat due to their complicated structures compared to Gram-positive bacteria, and their highly active efflux pump systems, which both interfere with antibiotic enrichment in bacterial cells. 3 For example, P. aeruginosa, one of the ESKAPE pathogens highlighted by the Infectious Disease Society of America (IDSA) 4, is now a major threat in burned patients5 and immunocompromised patients. 6 The high level of intrinsic resistance of P. aeruginosa to known antibiotics is partially due to their outer membrane (OM) permeability and the expression of efflux pumps, both of which can prevent the accumulation of antibiotics at the bacterial target sites. 7, 8

[0003] Thus, the emergence and spread of such antimicrobial resistance in Gram-negative bacteria remain on-going global threats, resulting in limited therapeutic options for severe infections. To-date, inspired by the discovery of natural sideromycins, albomycin and salmycin, against Gram-negative bacterial infections9, scientists have designed and synthesized libraries of sideromycins, using a Trojan Horse strategy to deliver antibiotics into bacterial cells via siderophore-mediated pathways. 16 Amongst known sideromycins, however, the acquisition of resistance has been reported. 21, 44 For instance, a case study showed the in vivo development of resistance within 3 weeks after the therapy was initiated in a critically ill-patient with bloodstream and intro-abdominal infection caused by carbapenem-resistance Enterobacter. 45

[0004] Therefore, there remains a need to improve the efficacy of known antibiotics, as well as to extend the life-span of such antibiotics.

[0005] Therefore, it is the object of the present invention to provide antibiotic compounds with improved efficacy / potency against infections.

[0006] It is a further object of the present invention to provide antibiotic compounds which demonstrate reduced susceptibility to infection resistance.

[0007] It is yet another further object of the present invention to provide pharmaceutical compositions including such antibiotic compounds.

[0008] It is still a further object of the present invention to provide methods of using the antibiotic compounds to treat infections.SUMMARY OF THE INVENTION

[0009] Described herein are metallo-complex compounds with antimicrobial properties, as well as pharmaceutical compositions thereof. In one non-limiting instance, a metallo-complex compound can include:

[0010] a sideromycin complexed to a metal cation;

[0011] wherein the sideromycin includes a catechol moiety; and

[0012] wherein the metal cation is associated to the catechol moiety.

[0013] In some instances, the catechol moiety can be an analog of a catechol moiety.

[0014] The metallo-complex compounds, and compositions thereof, may include combinations of metal cations or a single type of metal cation. In some instances, the metal cation can be a bismuth 3+ cation or a gallium 3+ cation. In some particular instances, the metallo-complex compound has a chemical structure of Formula II as follows:

[0015] where Mn+ is a bismuth 3+ cation or a gallium 3+ cation.

[0016] In some other instances, the metallo-complex compound has a chemical structure of Formula III as follows:

[0017] where Mn+ is a bismuth 3+ cation or a gallium 3+ cation.

[0018] In some particular instances, the metallo-complex compound is a chemical compound having the following structure:

[0019] In some instances, one or more metallo-complex compounds as described herein form part of a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition includes an effective amount of the one or more metallo-complex compounds and optionally one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients.

[0020] The disclosed metallo-complex compounds, pharmaceutical compositions thereof, are suitable for use in treating infections in a subject in need thereof. In particular, the  metallo-complex compounds exhibit high and / or enhanced potency against infections, such as bacterial infections, as compared to the sideromycin forming part of the metallo-complex compound alone (absent the presence of the metal cation complexed thereto) .

[0021] In certain instances, a non-limiting method for treating an infection includes:

[0022] (i) administering a pharmaceutical composition, including one or more metallo-complex compounds as described herein, to a subject in need thereof.

[0023] Such methods can be used to treat an infection which is a bacterial infection.

[0024] In some instances, the bacterial infection is a Gram-negative bacterial infection. In some cases, the infection is a multidrug resistant (MDR) bacterial infection. In some particular instances, the infection is a bacterial infection caused by a bacterial strain selected from Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepecia, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Salmonella enterica, Enterobacter aerogenes, Aeromonas hydrophila, Vibrio cholerae and Proteus mirabilis. In some other instances, the infection is a multidrug resistant (MDR) bacterial infection caused by a bacterial strain selected from Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepecia, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Salmonella enterica, Enterobacter aerogenes, Aeromonas hydrophila, Vibrio cholerae and Proteus mirabilis. In some instances, the metallo-complex compounds, and pharmaceutical compositions thereof, exhibit the ability to re-sensitize clinically isolated resistant bacterial strains of the aforementioned bacteria to the sideromycin contained in the metallo-complex compound, as compared to the sideromycin alone.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0025] Non-limiting embodiments are described by way of example with reference to the accompanying Figures.

[0026] Figure 1A shows a non-limiting representation of the chemical structure of a metallo-sideromycin using cefiderocol (CEF, S-649266) , where the antibiotic (ceftazidime) , a linker, and a siderophore (3-chlorocatechol) moiety are shown.

[0027] Figure 1B is a graph of the time killing curves for colloidal bismuth citrate (CBS) and cefiderocol (CEF) individually and in combination against PAO1 during a 24 hour incubation. The concentration of CBS and CEF are 16 μM and 0.5 μM respectively. CTRL-control.

[0028] Figure 1C is a bar chart showing bacterial loads exposed to the colloidal bismuth citrate (CBS) and cefiderocol (CEF) in combination or individually. The concentration of  CEF is 0.5 μM. n=3 biologically independent samples. Mean value of three replicates are shown and error bars indicate ±SEM. CTRL-control.

[0029] Figure 1D is a graph of the time killing curves for cefiderocol (CEF) and gallium nitrate (GaNit) individually and in combination against PAO1 during 18 h incubation. The concentration of CEF and GaNit are 0.125 and 4 μM, respectively.

[0030] Figure 1E is a bar chart showing bacterial loads exposed to the cefiderocol (CEF) and gallium nitrate (GaNit) combination or individually. The concentration of CEF is 0.25 μM. n=3 biologically independent samples. Mean value of three replicates are shown and error bars indicate ±SEM. CTRL-control.

[0031] Figure 1F shows isobolograms of the combination of colloidal bismuth citrate (CBS) and cefiderocol (CEF) against different P. aeruginosa strains. The straight line represents the ideal isobole at which drugs are additive and independent. Data points below this line can be considered synergistic. FIC -fractional inhibitory concentration.

[0032] Figure 2A is a bar graph of the crystal violet assay for antibiofilm activity against PAO1 biofilm formation during 48 hour incubation. n=4 biologically independent samples. Mean value of four replicates are shown and error bars indicates ±SEM. p-values were determined by One-way ANOVA test. ***p=0.0009, ****p<0.0001 means significant difference compared with control or single treated group. Bi -colloidal bismuth citrate, CEF –cefiderocol, and CTRL -control.

[0033] Figure 2B is a graph of the plate counting of colony forming units (CFU) for antibiofilm activity against PAO1 biofilm formation during 48 hour incubation. n=4 biologically independent samples. Mean value of four replicates are shown and error bars indicates ±SEM. p-values were determined by One-way ANOVA test. ***p=0.0009, ****p<0.0001 means significant difference compared with control or single treated group. Bi -colloidal bismuth citrate, CEF –cefiderocol, and CTRL -control.

[0034] Figure 2C is a graph of the serial passage of PAO1 at sub-inhibitory concentration of cefiderocol (CEF) or the combination of CEF and colloidal bismuth citrate (CBS) . The MIC test was performed every passage.

[0035] Figure 2D shows isobolograms of the combination of colloidal bismuth citrate (CBS) and cefiderocol (CEF) against laboratory-cultured CEF-resistant P. aeruginosa strains. The straight line represents the ideal isobole at which drugs are additive and independent. Data points below this line can be considered synergistic. FIC -fractional inhibitory concentration.

[0036] Figure 2E is a bar graph of the crystal violet assay for antibiofilm activity against PAO1 biofilm formation during 48 hour incubation. n=4 biologically independent samples. Mean value of four replicates are shown and error bars indicates ±SEM. p-values were determined by One-way ANOVA test. *p < 0.05, ****p < 0.0001 means significant difference compared with control and single treated group. GaN –Gallium Nitrate, CEF –cefiderocol.

[0037] Figure 2F is a graph of the plate counting of colony forming units (CFU) for antibiofilm activity against PAO1 biofilm formation during 48 hour incubation. n=4 biologically independent samples. Mean value of four replicates are shown and error bars indicates ±SEM. p-values were determined by One-way ANOVA test. *p < 0.05, ****p < 0.0001 means significant difference compared with control and single treated group. GaN –Gallium Nitrate, CEF –cefiderocol.

[0038] Figure 3A is a graph of the difference UV-vis spectra of cefiderocol (CEF) upon addition of 0.1-1.0 molar equivalents of colloidal bismuth citrate (CBS) . HEPES buffer at pH 7.4 was used.

[0039] Figure 3B is a graph of the iron uptake by PAO1 detected by calcein-AM fluorescence intensity in bacterial cells. During 300 seconds of monitoring, cefiderocol (CEF) at 50 μg mL-1 was added at 60 seconds after the initiation of the monitoring. Calcein-AM coordinates with iron in bacterial cells, resulting in fluorescence to be quenched. The concentration of bismuth and iron compounds were 50 μM and 3 μM, respectively. Bi -colloidal bismuth citrate, CEF –cefiderocol, Fe –iron citrate.

[0040] Figure 3C is a bar graph of the final intensity of fluorescence in PAO1 after 1 hour treatment. Mean value of three replicates are shown and error bars indicates ±SEM. p-values were determined by One-way ANOVA test. ***p=0.0002, ns p>0.99. Bi -colloidal bismuth citrate, CEF –cefiderocol, Fe –iron citrate.

[0041] Figure 3D is a bar graph of the bismuth concentration per protein in cell lysates in the presence of different concentration of cefiderocol (CEF) determined by ICP-MS. Colloidal bismuth citrate (CBS) at 16 μM was supplemented to the bacterial cells for 30 min. n=3 biologically independent samples. Error bars indicates mean ±SEM. p-values were determined by two-tailed one sample t test, **p=0.0019, ***p<0.001.

[0042] Figure 3E is a bar graph of the uptake of bismuth and iron in bacterial cells treated with different concentration of colloidal bismuth citrate (CBS) and 0.5 μM of cefiderocol (CEF) . Bismuth concentration was determined by ICP-MS and Fe concentration was determined by calcein-AM and normalized as percentage. n=3 biologically independent  samples. Mean value of three replicates are shown and error bars indicates ±SEM. Bi -colloidal bismuth citrate and Fe –iron citrate.

[0043] Figure 3F is a bar graph of the gallium concentration per protein in cell lysates in the presence of cefiderocol (CEF) determined by ICP-MS. GaN at 2 or 4 μM and CEF at 1 μM were supplemented to the bacterial cells for 30 min. *p = 0.0237, 0.0271

[0044] Figure 3G is a graph of the difference UV-vis spectra of cefiderocol (CEF) upon addition of 0.1-1.0 molar equivalents of gallium nitrate (GaN) .

[0045] Figure 4A is a graph of the survival curves showing efficacies in a murine acute pneumonia model (n = 8) . BALB / c mice were infected by a lethal dose of P. aeruginosa via intranasal inoculation. Four groups of mice were treated with a PBS, monotherapy of cefiderocol (CEF; 0.25 mg kg-1) , colloidal bismuth citrate (CBS; 5 mg kg-1) , or combination therapy of CEF and CBS. Increased survival rates of mice over 7 days challenging were seen in the combination group.

[0046] Figure 4B is a graph of the bacterial load in a mouse lung infection model. p-values were determined by two-tailed unpaired t-test. *, p=0.0118; **, p=0.0059, which means significant difference compared with control or single treated group. n=6 biologically independent animals. The data is presented as means ±SEM. CBS -colloidal bismuth citrate, CEF –cefiderocol, and CFU –colony forming unit.

[0047] Figure 4C is a graph of the survival curves showing efficacies in a murine acute pneumonia model (n = 8) . BALB / c mice were infected by a lethal dose of P. aeruginosa via intranasal inoculation. Four groups of mice were treated with CEF (12 mg / kg) and GaN (12mg / kg) alone or combination therapy.

[0048] Figure 5 is a bar graph of the bismuth concentration per protein in cell lysates in the presence of cefiderocol (CEF) determined by ICP-MS. Error bars indicates mean ±SEM.

[0049] Figure 6 is a graph of the growth curves of PAO1 exposed to different concentration of colloidal bismuth citrate (CBS) and cefiderocol (CEF) and their combination.

[0050] Figure 7 shows box plot showing the minimum inhibitory concentration (MIC) of cefiderocol (CEF) against clinical P. aeruginosa strains with or without colloidal bismuth citrate (CBS) . The concentration of CBS was 16 μM.

[0051] Figure 8 is a graph of the MPC (Mutant Prevention Concentration) values of cefiderocol against PAO1 strain in the presence of different concentration of colloidal bismuth citrate (CBS) ranging from 0 to 128 μg mL-1.

[0052] Figure 9A shows cytotoxicity of combinatory colloidal bismuth citrate (CBS) with cefiderocol (CEF) on the viability of human lung tissue A549 cells treated with different concentrations of CEF and 100 μM CBS by MTT assay.

[0053] Figure 9B shows cytotoxicity of combinatory colloidal bismuth citrate (CBS) with cefiderocol (CEF) on the viability of embryonic kidney HEK293T cells treated with different concentrations of CEF and 100 μM CBS by MTT assay.

[0054] Figure 9C shows a bar graph of mammalian cell toxicity of the combination of cefiderocol (CEF) and gallium nitrate (GaN) . The viability of A549 cell treated with different concentrations of CEF and 50 μM GaN. Mean value of three replicates are shown and error bars indicate ±SEM.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0055] Metallo-complex compounds and pharmaceutical compositions thereof, for use in treating infections in a subject in need thereof, are described herein.

[0056] I. Definitions

[0057] It is to be understood that the disclosed compounds, compositions, and methods are not limited to specific synthetic methods, specific analytical techniques, or to particular reagents unless otherwise specified, and, as such, may vary. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular forms and embodiments only and is not intended to be limiting.

[0058] The term “subject, ” as used herein, refers to a mammal, such as a human.

[0059] The term “effective amount” or “therapeutically effective amount” refers to the amount of a compound or agent which is able to treat one or more symptoms of a disease or disorder, reverse the progression of one or more symptoms of a disease or disorder, halt the progression of one or more symptoms of a disease or disorder, or prevent the occurrence of one or more symptoms of a disease or disorder in a subject to whom the formulation is administered, for example, as compared to a matched subject not receiving the compound. The actual effective amounts of a compound can vary according to the specific compound or combination thereof being utilized, the particular composition formulated, the mode of administration, and the age, weight, condition of the individual, and severity of the symptoms or condition being treated.

[0060] The term “pharmaceutically acceptable” refers to compositions or other materials and / or dosage forms which are, within the scope of sound medical judgment, suitable for use in contact with the tissues of human beings and animals without excessive toxicity,  irritation, allergic response, or other problem or complication, commensurate with a reasonable benefit / risk ratio. The phrase “pharmaceutically acceptable carrier” refers to pharmaceutically acceptable materials, compositions or vehicles, such as a liquid or solid filler, diluent, solvent or encapsulating material involved in carrying or transporting any subject composition, from one organ, or portion of the body, to another organ, or portion of the body. Each carrier must be “acceptable” in the sense of being compatible with the other ingredients of a subject composition and not injurious to the subject to which it is administered.

[0061] The terms “inhibit” or “reduce” in the context of inhibition, mean to reduce or decrease in activity and quantity. This can be a complete inhibition or reduction in activity or quantity, or a partial inhibition or reduction. Inhibition or reduction can be compared to a control or to a standard level. Inhibition can be measured as a %value, e.g., from 1%up to 100%, such as 5%, 10, 25, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 99, or 100%. For example, pharmaceutical compositions including one or more types of active agents may inhibit or reduce one or more markers of a disease or disorder, such as a bacterial infection, in a subject by about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95%, or 99%from the activity and / or quantity of the same marker in subjects that did not receive or were not treated with the compositions.

[0062] The terms “treating” in the context of a disease or disorder means to ameliorate, reduce or otherwise stop a disease, disorder, or condition from occurring or progressing in an animal which may be predisposed to the disease, disorder and / or condition but has not yet been diagnosed as having it; inhibiting the disease, disorder or condition, e.g., impeding its progress; and relieving the disease, disorder, or condition, e.g., causing regression of the disease, disorder and / or condition. Treating the disease or condition includes ameliorating at least one symptom of the particular disease or condition, even if the underlying pathophysiology is not affected, such as treating the pain of a subject by administration of an analgesic agent even though such agent does not treat the cause of the pain. Desirable effects of treatment include decreasing the rate of disease progression, ameliorating, or palliating the disease state, and remission or improved prognosis. For example, a subject is successfully “treated” if one or more symptoms associated with a bacterial infection are mitigated or eliminated, including, but are not limited to, increasing the quality of life of those suffering from the disease, decreasing the dose of other medications required to treat the disease, delaying the progression of the disease, and / or prolonging survival of individuals.

[0063] The numerical ranges disclose individually each possible number that such a range could reasonably encompass, as well as any sub-ranges and combinations of sub-ranges encompassed therein. For example, in a given range concentration range of 10 μM to 500 μM, the range also discloses 20, 33, 350, and 499 μM, as well as any subrange between these numbers (for example, 50 μM to 250 μM) , and any possible combination of ranges possible between these values.

[0064] Use of the term "about" is intended to describe values either above or below the stated value, which the term “about” modifies, to be within a range of approximately + / -10%. When the term "about" is used before a range of numbers (i.e., about 1-5) or before a series of numbers (i.e., about 1, 2, 3, 4, etc. ) it is intended to modify both ends of the range of numbers and / or each of the numbers recited in the entire series, unless specified otherwise.

[0065] II. Metallo-Complex Compounds and Pharmaceutical Compositions Thereof

[0066] Described herein are metallo-complex compounds with antimicrobial properties, as well as pharmaceutical compositions thereof. Such metallo-complex compounds can demonstrate increased antibacterial activity by way of the Trojan Horse strategy, by which drugs can be delivered into the bacterial cells through nutrient uptake pathways to bypass the membrane barrier. For instance, the sideromycin, cefiderocol (S-649266,  ) is formed of a parenteral cephalosporin named ceftazidime and contains a chlorocatechol moiety as a mimic of the natural bis-catechol components of natural siderophore at the third-position in the side chain (see Figure 1A) . 19 Cefiderocol was approved for medical use in 2019 in the United States to treat complicated urinary tract infections. The indications were subsequently broadened to hospital-acquired bacterial pneumonia and ventilator-associated bacterial pneumonia. However, the emergence of cefiderocol-resistant P. aeruginosa and other Gram-negative bacterial strains has recently been reported by various mechanisms including mutations of siderophore receptors and increased expression of efflux pumps. 20, 21 Therefore, the metallo-complex compounds described herein were developed to prolong the life-span of this type of antibiotics.

[0067] In one non-limiting instance, a metallo-complex compound can include:

[0068] a sideromycin complexed to a metal cation;

[0069] wherein the sideromycin includes a catechol moiety; and

[0070] wherein the metal cation is associated to the catechol moiety.

[0071] In some instances, there is a covalent linker group between the sideromycin and the catechol moiety. In some instances, the catechol moiety contains a halogen substituent thereon and can be, for example, a chlorocatechol moiety.

[0072] In still other instances, the catechol moiety is an analog of a catechol, which are known to the skilled person. In such instances, the metallo-complex compound can include:

[0073] a sideromycin complexed to a metal cation;

[0074] wherein the sideromycin includes an analog of a catechol moiety; and

[0075] wherein the metal cation is associated to the analog of the catechol moiety.

[0076] In some instances, the sideromycin is formed of cefiderocol ( (6R, 7R) -7- [ [ (2Z) -2- (2-Amino-1, 3-thiazol-4-yl) -2- (2-carboxypropan-2-yloxyimino) acetyl] amino] -3- [ [1- [2- [ (2-chloro-3, 4-dihydroxybenzoyl) amino] ethyl] pyrrolidin-1-ium-1-yl] methyl] -8-oxo-5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] oct-2-ene-2-carboxylate) or ionized forms thereof. In some instances, the sideromycin is formed of a cefiderocol analogue. Exemplary analogues can have a structure of Formula I, as shown below:

[0077] Structures of Formula I are described in T. Aoki, et al., European Journal of Medicinal Chemistry 155 (2018) 847-868. In some instances, the sideromycin can be selected from a chemical structure shown below:

[0078] The above catechol-containing sideromycin structures are described in Negash, et al., Molecules, 2019, 24, 3314. It is understood that combinations of more than one type of metallo-complex compound, each having different sideromycins, is possible for the pharmaceutical compositions described.

[0079] Metallo-complex compounds, and compositions thereof, may include combinations of metal cations or a single type of metal cation. In some instances, the metal cation can be a bismuth 3+ cation or a gallium 3+ cation. In some particular instances, the metallo-complex compound has a chemical structure of Formula II, as follows:

[0080] where Mn+ is a bismuth 3+ cation or a gallium 3+ cation.

[0081] In some other instances, the metallo-complex compound has a chemical structure of Formula III as follows:

[0082] where Mn+ is a bismuth 3+ cation or a gallium 3+ cation.

[0083] In some particular instances, the metallo-complex compound is a chemical compound having the following structure:

[0084] For Formula III and Compounds I &II, as shown above, the arrow is understood to represent a coordinate or dative bond in which the sulfur atom provides both electrons to the bond represented by the arrow.

[0085] For the metallo-complex compounds described above, these can be synthesized by the person of ordinary skill in the art using known synthetic methods and conditions (i.e.,  choice of solvent (s) , temperatures (such as to achieve refluxing) , atmospheres, work-up conditions, purification conditions, etc. ) which can be varied or modified, as appropriate, by the person of ordinary skill in the art. The synthetic methods may include steps that may be involved in the syntheses which include, but are not limited to, precipitation of a product, washing the reaction mixture, extracting the reaction mixture, separation of the product from a mixture (e.g. by filtration) , drying the product, and combinations thereof. Further processing steps that may be involved include stirring, heating and / or cooling the reaction mixture. Intermediate, crude, and purified products can be characterized using any suitable characterization method known to the skilled person. In some instances, such methods include, but are not limited to, 1H and 13C NMR, mass spectrometry, elemental analysis, or other techniques.

[0086] Without being bound by any particular theory, it is believed that the simultaneous delivery of sideromycins and metals, such as Bi3+ / Ga3+ via a dual Trojan Horse strategy through metallo-sideromycins can effectively kill bacteria and also inhibit or reduce (slow down) the development of resistance in bacteria to the sideromycin of the metallo-complex compound. In certain instances, the sideromycin may be chosen to have a single catechol moiety thereon.

[0087] In some instances, where the metallo-complex compound sideromycin is cefiderocol and the metal cation, such as bismuth 3+ or a gallium 3+, as shown in the structure above, the metallo-complex compound can be said to display a synergism in treating a bacterial infection, as compared to the use of the metal ions and cefiderocol individually to treat such a bacterial infection (see Example data) . In other instances, a metallo-complex formed of a sideromycin containing a catechol moiety having a metal cation bound thereto may exhibit synergism, as compared to the sideromycin containing a catechol moiety alone (without a metal cation complexed thereto) and the metal cation separately. The metal cations of bismuth 3+ or a gallium 3+, for example, can be from a metal salt, such as colloidal bismuth citrate or gallium nitrate, respectively. In some instances, synergism may be shown based on the fractional inhibitory concentration index (FICI) calculated using the equation below:

[0088] where the sideromycin includes a catechol moiety, “combination” refers to the sideromycin and a metal salt cation being associated (such as ionically associated) , “alone” refers to the sideromycin and metal salt individually. The FICI is determined by testing the aforementioned on a bacterial cell culture. Synergism is defined as having an FICI < 0.5, an FICI < 0.4, an FICI < 0.3, an FICI < 0.2, or an FICI < 0.1. In some instances, synergism is defined as having an FICI in range of about 0.01 to about 0.5, as well as sub-ranges or individual values contained within the range.

[0089] For the metallo-complex compounds, these can also cause a reduced uptake of Fe3+owing to the competition of the metal cation (such as Bi3+ or Ga3+) via ionic binding to the sideromycin (such as cefiderocol) , where enhanced uptake of the metal cation is believed to be attributable to the observed phenomena. The observed phenomena may be due to competitive binding of the metal cation (such as Bi3+ or Ga3+) to the sideromycin (such as cefiderocol) versus Fe3+, leading to enhanced uptake of the metal cation and reduced levels of Fe3+ in cells.

[0090] A. Pharmaceutical Compositions

[0091] In some instances, one or more metallo-complex compounds as described herein form part of a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition includes an effective amount of the one or more metallo-complex compounds and optionally one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients. In some instances, a pharmaceutical composition includes Bi (III) and Ga (III) sideromycins-based metallo-complex compounds, such as of Formula III, which are prepared, for example, by in situ mixing from two FDA approved drugs, cefiderocol (and other possible hydroxamate, catechol and carboxylate based sideromycins and other possible cephalosporins) and colloidal bismuth subcitrate (and other Bi (III) based drugs and others Bi (III) complexes) . Exemplary Bi (III) complexes include, but are not limited to bismuth nitrate (BiNit) , bismuth N-acetyl cysteine complex (Bi (NAC) 3) , bismuth subsalicylate (BSS) , and bismuth potassium citrate (BPC) . Another exemplary non-limiting sideromycin is desferrioxamine (DFO) -antibiotic.

[0092] In some instances, the metallo-complex compound (s) is present in a concentration ranging from about 1 μM to about 1 mM, from about 10 μM to about 500 μM, from about 10 μM to about 200 μM, or from about 25 μM to about 100 μM of the pharmaceutical composition.

[0093] In some instances, depending on the route of administration, an effective amount of the one or more metallo-complex compounds can be between 0.01 to 1000 mg per  kilogram body weight of the subject per day, between 0.1 and 500 mg, such as between 1 and 250 mg, for example about 5, 10, 20, 50, 100, 150, 200 or 250 mg, per kilogram body weight of the subject per day, which can be administered as a single daily dose, divided over one or more daily doses. The amount of the metallo-complex compounds administered, the route of administration, and the further treatment regimen can be determined by the treating clinician or testing technologies, depending on factors such as the age, gender and general condition of the subject, the nature and severity of the disease / symptoms being prevented, treated, or diagnosed, and / or the samples being tested.

[0094] Pharmaceutical compositions containing a therapeutically effective amount of one or more metallo-complex compounds described, and optionally one or more additional therapeutic, prophylactic, and / or diagnostic agents are provided. Pharmaceutical compositions can be for administration by parenteral (intramuscular, intraperitoneal, intravenous (IV) , or subcutaneous injection) , enteral, or transmucosal (intranasal, vaginal, rectal, or sublingual) routes of administration or using bioerodible inserts and can be formulated in dosage forms appropriate for each route of administration.

[0095] i. Parenteral Compositions

[0096] Pharmaceutical compositions containing the metallo-complex compounds described can be administered in an aqueous solution, by parenteral injection. Such compositions may also be in the form of a suspension or emulsion. In general, pharmaceutical compositions are provided including effective amounts of the active agent (s) (i.e., metallo-complex compound (s) ) and optionally include pharmaceutically acceptable diluents, preservatives, solubilizers, emulsifiers, adjuvants and / or carriers. Such compositions include diluents sterile water, buffered saline of various buffer content (e.g., Tris-HCl, acetate, phosphate) , pH and ionic strength; and optionally, additives such as detergents and solubilizing agents (e.g.,  20,  80 also referred to as polysorbate 20 or 80) , antioxidants (e.g., ascorbic acid, sodium metabisulfite) , and preservatives (e.g., Thimersol, benzyl alcohol) and bulking substances (e.g., lactose, mannitol) . Examples of non-aqueous solvents or vehicles are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils, such as olive oil and corn oil, gelatin, and injectable organic esters such as ethyl oleate. The compositions may be lyophilized and redissolved / resuspended immediately before use. The compositions may be sterilized by, for example, filtration through a bacterium retaining filter, by incorporating sterilizing agents into the compositions, by irradiating the compositions, or by heating the compositions.

[0097] These particular aqueous solutions are especially suitable for intranasal or intratracheal administration to the primary infection site, such as the respiratory tract. These particular aqueous solutions are also suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous, and intraperitoneal administration. In this connection, sterile aqueous media which can be employed will be known to those of skill in the art in light of the present disclosure. For example, one dosage could be dissolved in 1 ml of isotonic NaCl solution and either added to variation in dosage will necessarily occur depending on the condition of the subject being treated. The person responsible for administration will, in any event, determine the appropriate dose for the individual subject.

[0098] ii. Oral Compositions

[0099] The pharmaceutical composition containing the metallo-complex compounds described may be provided in a form suitable for oral administration to a subject in need thereof, such as a mammal (i.e., an oral composition) . Oral administration may involve swallowing, so that the metallo-complex compounds and optionally additional active agent (s) enter the gastrointestinal tract, or buccal or sublingual administration may be employed by which the metallo-complex compounds enter the blood stream directly from the mouth.

[0100] Compositions suitable for oral administration include solid compositions such as tablets, capsules containing particulates, liquids, powders, lozenges (including liquid-filled lozenges) , chews, multi-and nano-particulates, gels, solid solutions, liposomes, films, ovules, sprays, and liquid compositions.

[0101] Liquid compositions for oral administration include suspensions, solutions, syrups, and elixirs. Such oral compositions may be employed as fillers in soft or hard capsules and can contain one or more suitable carriers and / or excipients, for example, water, ethanol, polyethylene glycol, propylene glycol, chitosan polymers and chitosan derivatives (e.g. N-trimethylene chloride chitosan, chitosan esters, chitosan modified with hydrophilic groups, such as amino groups, carboxyl groups, sulfate groups, etc. ) , methylcellulose, a suitable oil, one or more emulsifying agents, and / or suspending agents. Liquid compositions for oral administration may also be prepared by the reconstitution of a solid, for example, from a sachet.

[0102] For tablet or capsule dosage forms, in addition to the metallo-complex compounds described herein, tablets generally contain disintegrants, binders, diluents, surface active agents, lubricants, glidants, antioxidants, colourants, flavoring agents, preservatives, or taste masking agents, or a combination thereof.

[0103] Examples of suitable disintegrants for forming a table or capsule dosage form containing the metallo-complex compounds can include, but are not limited to, sodium starch glycolate, sodium carboxymethyl cellulose, calcium carboxymethyl cellulose, croscarmellose sodium, crospovidone, polyvinylpyrrolidone, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, lower alkyl-substituted hydroxypropyl cellulose, starch, pregelatinised starch and sodium alginate. Generally, the disintegrant can have a concentration in a range from about 1 wt%to about 25 wt%, from about 5 wt%to about 20 wt%of the tablet or capsule dosage form containing the metallo-complex compound (s) .

[0104] Binders are generally used to impart cohesive qualities to a tablet composition containing the metallo-complex compounds. Suitable binders for forming a tablet or capsule formulation can include, but are not limited to, microcrystalline cellulose, gelatin, sugars, polyethylene glycol, natural and synthetic gums, polyvinylpyrrolidone, pregelatinised starch, chitosan polymers and chitosan derivatives (e.g. N-trimethylene chloride chitosan, chitosan esters, chitosan modified with hydrophilic groups, such as amino groups, carboxyl groups, sulfate groups, etc. ) , hydroxypropyl cellulose, and hydroxypropyl methylcellulose.

[0105] Suitable diluents for forming a table or capsule composition containing the metallo-complex compounds can include, but are not limited to, lactose (as, for example, the monohydrate, spray-dried monohydrate or anhydrous form) , chitosan polymers and chitosan derivatives (e.g. N-trimethylene chloride chitosan, chitosan esters, chitosan modified with hydrophilic groups, such as amino groups, carboxyl groups, sulfate groups, etc. ) , N-sulfonated derivatives of chitosan, quaternarized derivatives of chitosan, carbosyalkylated chitosan, microcrystalline chitosan, mannitol, xylitol, dextrose, sucrose, sorbitol, microcrystalline cellulose, starch and dibasic calcium phosphate dihydrate.

[0106] Tablet or capsule composition containing the metallo-complex compounds may also contain surface active agents, such as sodium lauryl sulfate and polysorbate 80, and glidants such as silicon dioxide and talc, in the coating. When present, surface active agents can have a concentration in a range from about 0.2 wt%to 5 wt%of the tablet or capsule formulation.

[0107] Tablet or capsule compositions containing the metallo-complex compounds also generally contain lubricants, such as magnesium stearate, calcium stearate, zinc stearate, sodium stearyl fumarate, and mixtures of magnesium stearate with sodium lauryl sulphate. Lubricants can have a concentration in a range from about 0.25 wt%to 10 wt%, from about 0.5 wt%to about 3 wt%of the tablet or capsule composition.

[0108] Other possible excipients included in a tablet or capsule formulation containing the metallo-complex compounds include glidants (e.g. Talc or colloidal anhydrous silica at about 0.1 wt%to about 3 wt%of the table or capsule formulation) , antioxidants, colourants, flavouring agents, preservatives and taste-masking agents. When present, glidants can have a concentration in a range from about 0.2 wt%to 1 wt%of the tablet or capsule composition.

[0109] Tablet or capsule blends, including the metallo-complex compounds and one or more suitable excipients, may be compressed directly or by roller to form tablets. Tablet or capsule blends or portions of the blends may alternatively be wet-, dry-, or melt-granulated, melt congealed, or extruded before tableting. The final table or capsule composition may contain one or more layers and may be coated or uncoated; it may even be encapsulated in a particle, such as a polymeric particle or a liposomal particle.

[0110] Solid formulations containing the metallo-complex compounds for oral administration may be formulated to be immediate and / or modified release. Modified release formulations include delayed, sustained, pulsed, controlled, targeted and programmed release formulations.

[0111] iii. Optional Therapeutic, Prophylactic or Diagnostic Agents

[0112] In some forms, the pharmaceutical compositions can optionally include one or more additional active agents. Therefore, in some forms, the pharmaceutical composition includes one or more metallo-complex compound (s) , in addition to at least one of a therapeutic, prophylactic, and / or diagnostic agents. The additional agents can be included together with the metallo-complex compound (s) or may be a separate composition for co-administration.

[0113] Non-limiting examples of therapeutic, prophylactic, or diagnostic agents can include bronchodilators, corticosteroids, methylxanthines, phosphodiesterase-4 inhibitors, anti-angiogenesis agents, antibiotics, antioxidants, anti-viral agents, anti-fungal agents, anti-inflammatory agents, immunosuppressant agents, anti-allergic agents, and combinations thereof. The amount of any additional therapeutic, prophylactic, or diagnostic agents generally depends on the severity of the diseases and / or disorders to be treated. Specific dosages can be readily determined by those of skill in the art. See Ansel, Howard C. et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6th ed. ) Williams and Wilkins, Malvern, PA (1995) .

[0114] iv. Carriers and Excipients

[0115] The pharmaceutical compositions may be formulated with one or more excipients and / or carriers appropriate to the indicated route of administration. In some forms, the metallo-complex compound (s) are formulated in a manner amenable for the treatment of human and / or veterinary subjects. In some forms, the pharmaceutical compositions include admixing or combining metallo-complex compound (s) with one or more of the following excipients: lactose, sucrose, starch powder, cellulose esters of alkanoic acids, cellulose alkyl esters, talc, stearic acid, magnesium stearate, magnesium oxide, sodium and calcium salts of phosphoric and sulfuric acids, gelatin, acacia, sodium alginate, polyvinyl-pyrrolidone, and / or polyvinyl alcohol. In some forms, e.g., for oral administration, the pharmaceutical compositions may be tableted or encapsulated. In some forms, the metallo-complex compound (s) may be slurried in water, polyethylene glycol, propylene glycol, ethanol, corn oil, cottonseed oil, peanut oil, sesame oil, benzyl alcohol, sodium chloride, and / or various buffers. In some forms, the pharmaceutical compositions may be subjected to pharmaceutical operations, such as sterilization, and / or may contain carriers and / or excipients such as preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, encapsulating agents such as lipids, dendrimers, polymers, proteins such as albumin, nucleic acids, and buffers.

[0116] v. Dosage Forms

[0117] In some forms, it may be advantageous to formulate pharmaceutical compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. “Dosage unit form” as used herein refers to physically discrete units suited as unitary dosages for the patients to be treated; each unit containing a predetermined quantity of therapeutic agent (i.e., metallo-complex compound) calculated to produce the desired therapeutic effect in association with a pharmaceutical carrier. In some forms, the specification for the dosage unit forms dictated by and directly dependent on (a) the unique characteristics of the therapeutic agent and the particular therapeutic effect to be achieved, and (b) the limitations inherent in the art of compounding such a therapeutic agent for the treatment of a selected condition in a patient. In some forms, the metallo-complex compound (s) are administered at a therapeutically effective dosage sufficient to treat a condition, such as an infection, associated with a condition in a patient. For example, the efficacy of a pharmaceutical composition containing metallo-complex compound (s) can be evaluated in an animal model system that may be predictive of efficacy in treating the disease in a human or another animal.

[0118] In some forms, the effective dose range for the therapeutic agent can be extrapolated from effective doses determined in animal studies for a variety of different animals. Precise amounts of the pharmaceutical composition depend on the judgment of the practitioner and are specific to each individual. Other factors affecting the dose include the physical and clinical state of the subject, the route of administration, the intended goal of treatment and the potency, stability, and toxicity of the particular pharmaceutical composition.

[0119] The actual dosage amount of an antibiotic composition of the present disclosure administered to a subject may be determined by physical and physiological factors such as type of animal treated, age, sex, body weight, severity of condition, the type of condition being treated, previous or concurrent therapeutic interventions, idiopathy of the patient and on the route of administration. These factors may be determined by a skilled artisan. The practitioner responsible for administration will typically determine the concentration of active agent (s) in a composition and appropriate dose (s) for the individual subject. The dosage may be adjusted by the individual physician in the event of any complication.

[0120] Single or multiple doses of the active agent (s) , such as metallo-complex compounds, are contemplated. Desired time intervals for delivery of multiple doses can be determined by one of ordinary skill in the art employing no more than routine experimentation. As an example, patients may be administered two doses daily at approximately 12-hour intervals. In some forms, the agent is administered once a day.

[0121] The pharmaceutical composition may be administered on a routine schedule. As used herein, a routine schedule refers to a predetermined designated period of time. The routine schedule may encompass periods of time which are identical, or which differ in length, as long as the schedule is predetermined. For instance, the routine schedule may involve administration twice a day, every day, every two days, every three days, every four days, every five days, every six days, a weekly basis, a monthly basis or any set number of days or weeks there-between. Alternatively, the predetermined routine schedule may involve administration on a twice daily basis for the first week, followed by a daily basis for several months, etc. In other forms, the invention provides that the agent (s) may be taken orally and that the timing of which is or is not dependent upon food intake. Thus, for example, the agent can be taken every morning and / or every evening, regardless of when the patient has eaten or will eat.

[0122] In some forms, the pharmaceutical composition can be in a unit dosage form which can be suitably packaged, for example in a box, blister, vial, bottle, sachet, ampoule or in  any other suitable single-dose or multi-dose holder or container (which can be properly labeled) ; optionally with one or more leaflets containing product information and / or instructions for use. Generally, such unit dosages can contain between 1 and 1000 mg, or between 5 and 500 mg, of the disclosed metallo-complex compound (s) , e.g., about 10, 25, 50, 100, 200, 300 or 400 mg per unit dosage.

[0123] III. Methods of Treating Infections

[0124] The disclosed metallo-complex compounds, pharmaceutical compositions thereof, are suitable for use in treating infections in a subject in need thereof. In particular, the metallo-complex compounds exhibit high and / or enhanced potency against infections, such as bacterial infections, as compared to the sideromycin forming part of the metallo-complex compound alone (absent the presence of the metal cation complexed thereto) .

[0125] In certain instances, a non-limiting method for treating an infection includes:

[0126] (i) administering a pharmaceutical composition, including one or more metallo-complex compounds as described herein, to a subject in need thereof.

[0127] In some instances of the method, the pharmaceutical composition is administered to the subject by intranasal administration, oral administration, intramuscular administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, or a combination thereof.

[0128] In certain instances, in step (i) the dosage of the metallo-complex compound in the pharmaceutical composition administered to the subject is from about 0.1 μg to about 100 μg, from about 0.5 μg to about 50 μg, from about 1 μg to about 100 μg, from about 1 μg to about 50 μg, from about 1 μg to about 25 μg, from about 1 μg to about 10 μg, from about 1 μg to about 5 μg, from about 4 μg to about 10 μg, or from about 1 μg to about 4 μg per gram of the subject’s weight, or sub-ranges or individual values contained within these ranges.

[0129] The methods described can treat an infection, such as a bacterial infection. In some instances, the bacterial infection is a Gram-negative bacterial infection. In some cases, the infection is a multidrug resistant (MDR) bacterial infection. In some particular instances, the infection is a bacterial infection caused by a bacterial strain selected from Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepecia, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Salmonella enterica, Enterobacter aerogenes, Aeromonas hydrophila, Vibrio cholerae and Proteus mirabilis. In some other instances, the infection is a multidrug resistant (MDR) bacterial infection caused by a bacterial strain selected from Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepecia, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,  Acinetobacter baumannii, Salmonella enterica, Enterobacter aerogenes, Aeromonas hydrophila, Vibrio cholerae and Proteus mirabilis. In some instances, the metallo-complex compounds, and pharmaceutical compositions thereof, exhibit the ability to re-sensitize clinically isolated resistant bacterial strains of the aforementioned bacteria to the sideromycin contained in the metallo-complex compound, as compared to the sideromycin alone.

[0130] In some instances, the metallo-complex compounds, and pharmaceutical compositions thereof, are more effective against the bacterial strains and resist (slow down) the development of resistance by the bacterial strains, as compared to use of the sideromycins of the metallo-complex compound in the absence of the metal cation associated thereto. In some instances, the metallo-complex compounds have a prolonged lifespan which is at least about 1%to 500%, 1%to 400%, 1%to 300%, 1%to 200%, or 1%to 100%greater than the lifespan of the sideromycins of the metallo-complex compound in the absence of the metal cation associated thereto; as well as sub-ranges contained within the aforementioned ranges. The person skilled in the art is aware of methods to determine and compare the lifespan of antibiotics and compare these between two compounds.

[0131] The metallo-complex compounds, and pharmaceutical compositions thereof, can demonstrate efficacy against biofilm formation caused by bacteria. In some instances, the metallo-complex compounds reduce biofilm formation by at least about 1%to 100%, 1%to 90%, 1%to 80%, 1%to 70%, or 1%to 50%, as compared to biofilm formation observed for the sideromycin of the metallo-complex compound in the absence of the metal cation associated thereto; as well as sub-ranges contained within the aforementioned ranges.

[0132] The administration in step (i) can be performed using any suitable technique, such as oral administration, intranasal, intramuscular administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, or subcutaneous administration, or a combination thereof.

[0133] Step (i) , administration of pharmaceutical composition, may occur one or more times. When more than one administration step is performed, each administration can be performed regularly every 5 mins, every 10 mins, every 20 mins, every 30 mins, every hour, every 2 hours, every day, every two days, every 3 days, every week, every two weeks, every month, etc. ; or irregularly with a time interval of 5 mins, 10 mins, 20 mins, 30 mins, 1 hour, 2 hours, 1 day, 2 days, 3 days, 5 days, 1 week, 2 weeks, etc. The specific  number of treatment and time interval for the treatment can be determined by the treating clinician or testing technologies, depending on factors such as the age, gender and general condition of the subject, the nature and severity of the disease / symptoms being prevented, treated, or diagnosed, and / or the samples being tested.

[0134] The administration step or all of the administration steps (if repeated) , can each provide an effective amount of the metallo-complex compound (s) in the pharmaceutical composition is administered to the subject, such that bacteria of the infection are killed and / or growth or proliferation of the bacteria are reduced or prevented, and thereby ameliorate one or more symptoms associated with the infection in the subject. Optionally, the treatment effect occurs without any notable side effects to the subject.

[0135] In some instances, following step (i) , or multiple administrations of the pharmaceutical composition to the subject, the extent of the infection (i.e., bacterial loads) is reduced by at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, or at least 50%, compared to the extent of the infection before administration of the pharmaceutical composition; and / or the extent of the infection is reduced by at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 99%, as compared the extent of the infection before administration of the pharmaceutical composition, optionally without any cytotoxicity to normal cells compared to a control administered with the pharmaceutically acceptable excipient (s) only. Evaluation of the extent of the bacterial infection reduction can occur about one day, two days, three days, five days, one week, two weeks, three weeks, or one month after step (i) or multiple administrations of the pharmaceutical composition to the subject. Those skilled in the art are familiar with methods of evaluating the extent or degree of an infection in a subject and evaluating the reduction thereof.

[0136] In some instances of the method, the pharmaceutical composition can further include one or more therapeutic, prophylactic, or diagnostic agents. In some other instances of the method, the method includes co-administering one or more therapeutic, prophylactic, or diagnostic agents to the subject, either before, during, or following step (i) .

[0137] The present invention will be further understood by reference to the following non-limiting examples.

[0138] EXAMPLES

[0139] Example 1. Synthesis of Bi (III) and Ga (III) Metallo-sideromycin Complexes

[0140] Bi(III) and Ga (III) metallo-sideromycin complexes may be prepared in situ from various hydroxamate, catechol, and carboxylate based sideromycins and other carboxylate containing cephalosporins by mixing with various metal sources, such as metal salts (e.g. : bismuth / gallium nitrate) and other bismuth drugs (such as ranitidine bismuth citrate) or metallo-complexes, such as bismuth (III) (4-isopropyltropolonate) 3. Exemplary syntheses of Bi (III) and Ga (III) metallo-sideromycin complexes are given below.

[0141] Materials and Methods:

[0142] Cefiderocol (CEF) was purchased from ChemScene LLC (USA) . All other chemicals were purchased from Sigma-Aldrich. Instrumentation: UV-vis spectra were recorded on a Varian Cary 50 spectrophotometer at a rate of 360 nm / min using a 1-cm quartz cuvette. Mass Spectrometry was performed and analyzed by UHR TOF LC-MS system, Bruker Maxis II and Bruker data analysis. Calculated Mass was performed by Chemdraw 20.0. NMR experiment was performed on a Bruker 500 MHz NMR spectrometer. NMR data were analyzed by MestReNova X64 14.3.3.

[0143] Synthesis of Compound I:

[0144] Cefiderocol (10mg / ml, 0.00133mmol) and bismuth nitrate (0.00133mmol) or colloidal bismuth subcitrate (0.00133mmol) in water, following by addition of NH4OH to adjust the pH to ～7 forming active complexes I. HR-ESI-MS (+) m / z 958.1157, found for [C30H32N6O10S2ClBi] +, [Cef+Bi-H] + (calcd: 957.1187) , m / z 479.5638, found for [C30H33N6O10S2ClBi] 2+, [Cef+Bi] 2+ (calcd: 479.5606) .

[0145] Synthesis of Compound II:

[0146] Cefiderocol (10mg / ml, 0.00133mmol) and gallium nitrate nonhydrate (0.00133mmol) (0.00133mmol) in water, following by addition of NH4OH to adjust the pH to ～7 forming active complexes II. HR-ESI-MS (+) m / z 8180609, found for C30H32N6O10S2ClGa, [Cef+Ga-H] + (calcd: 818.0591) .

[0147] Example 2. Metallo-sideromycin Complexes for Combating Antimicrobial Resistance

[0148] The example detailed below complies with all relevant ethical regulations. All animal experiments were approved by and performed in accordance with the guidelines approved by Committee on the Use of Live Animals in Teaching and Research (CULATR) of the University of Hong Kong.

[0149] Materials and Methods:

[0150] Chemicals

[0151] Cefiderocol (CEF) was purchased from ChemScene LLC (USA) . Mueller-Hinton Broth (MHB) , Luria-Bertani (LB) Broth Powder, CA-MHB Broth Power, M9 Broth Powder and Agar powder were purchased from Affymetrix. Tryptone and Yeast extract were purchased from Oxoid Ltd. (UK) . dNTPs, pfu DNA polymerase, Taq DNA polymerase, and DNA marker were purchased from Thermo Fisher Scientific Ltd.  Restriction endonucleases (BamH I, Hind III, Sac I) were purchased from TAKARA. Plasmid-Mini-prep Kit and Genomic DNA Purification Kit were purchased from Thermo Fisher Scientific Ltd. All other chemicals were purchased from Sigma-Aldrich unless specified otherwise.

[0152] Bacterial Strains and Growth Conditions

[0153] Primers were purchased from BGI. Bacteria strains were cultured in lysogeny broth (LB) at 37 ℃ shaken at 250 rpm if not mentioned. E. coli DH5α and S17 were used as the cloning host and the donor bacterial for biparental matings respectively. Antibiotics were used at the following concentrations: for E. coli, kanamycin 50 μg / mL, tetracycline 10 μg / mL; for P. aeruginosa, tetracycline 50μg / mL, carbenicillin 150 μg / mL. Sucrose-resistant colonies were selected by sucrose-agar plate, which was supplemented with 5 g / L yeast extract, 10 g / L tryptone, 75 g / L sucrose, 1.5% (w / v) agar powder and deionized water.

[0154] Construction of Knockout Mutants

[0155] The construction of unmarked knockout mutants was based on the method of Tung T Hoang, et al., with slight change. 48 Briefly, the primer A1 / A2 and B1 / B2 were designed from the PAO1 genome sequence as a template, and the DNA fragments of ～1000 bp upstream and downstream of the target knockout gene were PCR-amplified based on A1 / A2 and B1 / B2 primers. The fragments were purified and cloned into the plasmid pEX18TC, followed by transferring into the E. coli S17 and then into P. aeruginosa PAO1 through biparental mating. Single crossover mutants were selected by 50 μg / mL tetracycline and 50 μg / mL kanamycin to kill the E. coli donor strains. Double crossover mutants were selected by sucrose-agar plates.

[0156] Microdilution MIC Assay

[0157] Minimal inhibitory concentration (MIC) values were assessed by the standard broth microdilution assay in accordance with Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) guidelines. 49 Bacterial cells were grown overnight on LB agar plates to obtain single colonies. Three morphologically distinct colonies were transferred to CA-MHB broth and cultured overnight at 37 ℃ shaken at 250 rpm. Then the OD600 was measured to adjust the bacterial density to about 1 × 106 CFU mL-1 and checked by colony forming unit (CFU) counting on agar plates. The flat-bottomed 96-well plates were prepared, and CEF / bismuth, or other metal compounds, were added into the first column of 96-well plates and given 2-fold dilution, followed by adding bacterial inocula prepared before. The total volume should be within 100 μL per well. The plate was then incubated at 37 ℃  overnight. The group without antibiotic / bismuth compounds served as growth control and the group without bacterial cells served as background control. The OD was measured at 600 nm with Multi-Mode Microplate Readers (SpectraMax iD3, Molecular Devices, LLC. ) , and the MIC was read as the lowest concentration of bacterial cells that had no visible growth and resulted in an OD600 < 0.04 after normalization to the untreated growth control and the background control.

[0158] For the checkboard microdilution assay used for drug combination test, cefiderocol and bismuth compounds were both 2-fold diluted from two-dimensional orientation. The FICI was calculated using the equation below:

[0159] Synergism was defined as a fractional inhibitory concentration index FICI<0.5 and antagonism as FICI >4. All experiments were replicated in triplicate.

[0160] Time Kill Assay

[0161] To further illustrate the synergistic effect between CEF and CBS, time kill assay was performed with slight change. 29 PAO1 was cultured overnight on LB broth at 37 ℃. Then the bacterial cells were 1: 250 diluted with LB broth and cultured for 3 hours at 37 ℃ to reach log phase, followed by adjusting the bacterial density to about 1 × 106 CFU mL-1 using an OD600 reader. Then, the bacterial cells were exposed to CEF, CBS alone or their combination. The concentrations of CBS are 16 μM and 4 μM, and the concentrations of CEF are 1 μM and 0.5 μM respectively. No drug group served as a positive control. 10 μL of the suspension were aspirated from each group at different time interval from 0 to 24 h (0, 1, 2, 4, 6, 12, 24 h) for inspection of bacterial viability by agar plating. All experiments were performed in triplicate.

[0162] Resistance Study

[0163] For the mutant prevention concentration (MPC) study50, PAO1 was plated on LB agar plate with CEF and CBS at different concentrations and incubated at 37 ℃. Then, more than four colonies were picked from any plates with colonies and re-cultured to measure the MIC values. Any colony with higher MIC than the original values was determined as a higher-level resistant mutant colony. The measured concentrations that could inhibit the growth of mutant colonies was determined as MPC. For the serial passage assay, the PAO1 strains were cultured overnight and diluted to ～107 CFU mL-1 in LB broth. The bacterial suspension was added to a 96-well plate with 2-fold dilution of drugs starting from 4-folds, and 32 folds of MIC after 16 passages. All the plates were  incubated at 37 ℃ and the growth of cultures was checked at 24 hour intervals. Cultures from the second highest concentrations that allowed growth were diluted 1: 1000 into fresh medium, following addition of same concentrations of drugs. This serial passaging was repeated daily for 20 days. The MICs of CEF in the presence of CBS were determined for every passage. At the endpoint of the evolution, single colonies from each group were selected and stored in 15%glycerol at -80 ℃.

[0164] Biofilm Formation Measurement

[0165] Biofilm formation was measured by Crystal violet (CV) method. PAO1 was used as the tested strain. Three distinct colonies from LB agar plate were transferred to LB medium and cultured at 37 ℃ shaken at 220 rpm overnight. The overnight culture was then 1: 100 diluted with CA-MHB medium and 100 μL of the dilution were added per well in a 96-well plate and exposed to CEF, CBS either alone or combination. Untreated group served as positive control. The microtiter plate was incubated for 48 hours at 37℃. After incubation, biofilm was washed gently with phosphate buffered saline (PBS) and water three times to remove unattached cells, followed by adding 150 μL of a 0.1%crystal violet solution. Then, the plate was incubated at room temperature for 15 min to stain the biofilm. After incubation, each well was washed by water 3 times to completely remove the dye and turn the plate upside down to dry overnight at room temperature. To quantify the biofilm formation, 150 μL 30%acetic acid solution were used for each well to dissolve the crystal violet. After incubation for 10-15 min at room temperature, 100 μL of each well were transferred to a new flat-bottomed microplate for OD550 reading by Multi-Mode Microplate Readers (SpectraMax iD3, Molecular Devices, LLC. ) . 30%acetic acid in water served as a blank. Four replicated wells for each group were used. For the Confocal imaging, PAO1-GFP strain with carbenicillin resistance was used for fluorescent monitoring. PAO1-GFP bacterial cells were grown overnight on LB agar plate with 150 μM carbenicillin to obtain single colonies. Three distinct colonies were transferred to LB medium with 150 μM carbenicillin and cultured at 37 ℃ shaken at 220 rpm overnight. Then the bacterial cells were 1: 100 diluted with fresh LB medium in glass bottomed confocal plate. CBS and CEF were added individually or combinedly as different treated groups in triplicate and LB broth with no drugs served as a control group. After 48 hours incubation at 37 ℃, the supernatant was removed and the biofilm was washed with PBS three times for removing the suspended cells. Then, fresh LB medium was added into each well for directly imaging by confocal laser scanning microscopy (Leica TCS SP8 CLSM) . Fluorescein was excited at 488 nm.

[0166] Cellular Metal Uptake monitored by Calcein-AM

[0167] Briefly, PAO1 was cultured overnight in M9 iron-deficient medium, collected by centrifugation, and resuspended to adjust OD600 to 5 in M9 medium. Calcein-AM was added at a final concentration of 20 μM to incubate for 120 min at room temperature under light-shielded conditions. Chloramphenicol at a concentration of 97.9 μg / mL, at which the bacterium would not be killed, was also added at the same time to suppress the cell activity. The cell was then washed by PBS buffer and resuspended to adjust OD600 to 5 in M9 medium following transferred to a 96-well plate. The fluorescence intensity was monitored by a Multi-Mode Microplate Readers (SpectraMax iD3, Molecular Devices, LLC. ) with 492-nm excitation and 535-nm emission. Then, Fe3+ (as iron citrate) and Bi3+(as CBS) were added at a final concentration of 3 μM and 50 μM respectively to give rise to three groups, i.e., iron (Fe) alone, bismuth (Bi) alone and Fe+Bi. CEF was added at 60 s after the initiation of the monitoring at a final concentration of 0.5 μM.

[0168] Metal Uptake measured by ICP-MS

[0169] Three colonies were transferred to LB broth and cultured overnight at 37 ℃ shaken at 220 rpm. The bacterial cells were then collected by centrifugation and resuspended to adjust the OD600 to 2.5 in LB medium. CEF at different concentrations (0, 1, 2 and 4 μM) was added to the respective groups in triplicate followed by addition of 16 μM of CBS. LB broth with no drugs served as a control group. After 30 min incubation, bacterial suspensions for each group were collected and washed with PBS buffer for three times, followed by the resuspending by Tris buffer (pH 7) in the presence of a protease inhibitor cocktail (PIC) solution (1%) and then sonicated on ice. All the samples were centrifuged 20 min at 12470 g at 4 ℃ to remove the cell debris after sonication, then 200 μL of cell lysate from each group were taken to dissolve to 200 μL of 68%HNO3 at 60 ℃ overnight. The dissolved sample was diluted to appropriate concentration for ICP-MS (Agilent 7500a, Agilent Technologies, CA, USA) by 1%HNO3.115In served as an internal standard. Protein concentration of cell lysate was quantified by BCA quantification kit.

[0170] UV-Vis Spectroscopy

[0171] UV-vis spectra were recorded on a Varian Cary 50 spectrophotometer at a rate of 360 nm / min using a 1-cm quartz cuvette. CEF stock solution was diluted by 10 mM HEPES at pH 7.4 to a final concentration of 20 μM. CBS was stepwise titrated into cefiderocol solution and UV-vis spectra were recorded in a range of 200-800 nm. HEPES buffer (10 mM) was measured as baseline correction. CBS was titrated with a 2 μM interval from 0 to 40 μM, and the binding of bismuth to CEF was monitored by the  increase in absorption at 340 nm. Difference spectra were obtained by substracting the spectra of CEF. The UV-vis titration curve was fitted to Ryan-Weber nonlinear equation51 below:

[0172] where I represents UV-vis intensity; Imax is the maximum UV-vis intensity; Kd is the dissociation constant; Cp is the total concentration of CEF and Cm is the concentration of CBS.

[0173] SEM Imaging for Bacterial Cells

[0174] Three colonies were transferred to LB broth and cultured overnight at 37 ℃ shaken at 220 rpm. Then the bacterial cells were collected by centrifugation (1494 g, 10 min) and resuspended to LB medium to adjust OD600 to 1. CEF and CBS were added individually or combinedly at the concentration of 0.5 μM and 16 μM respectively. After 30 min incubation, bacterial suspensions for each group were collected and washed with PBS buffer three times, followed by adding 2.5%glutaraldehyde overnight at 4 ℃ to fix bacterial cells. The fixed cells were washed by PBS three times to remove glutaraldehyde. The sample dehydration was performed by different ethanol / water volumes ranging from 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, and 100%, and incubated for 10 minutes for each ethanol volume. Then the ethanol was dried at room temperature. After coating with gold, SEM imaging was performed by High Resolution Schottky FE-SEM, TESCAN MAIA3 XMN, and images were collected by Maia TC software.

[0175] NMR Study

[0176] NMR experiments were performed on a Bruker 500 MHz NMR spectrometer. CEF was dissolved in a mixed solvent of deuterated dimethyl sulfoxide (DMSO-d6) and water (H2O) at a final concentration of 1 mM. CBS was titrated into CEF solution stepwise as a 0.2 molar equiv interval and the 1H NMR was recorded after reaction for at least 5 min. Binding of bismuth ions (Bi3+) to CEF was evidenced by the appearance of the resonances at 7.15 ppm and 6.93 ppm.

[0177] Mass Spectrometry (MS)

[0178] MS samples were prepared by mixing CEF and bismuth nitrate in water, following by addition of NH4OH to adjust the pH to ～7. The mixture was incubated at room temperature for 1 hour with gentle shaking. Then the mixed solution was diluted by methanol to a final concentration of 1 μM for the MS examination. Sodium formate was  used as an internal standard. Mass Spectrometry was performed and analyzed by UHR TOF LC-MS system, Bruker Maxis II and Bruker data analysis.

[0179] Cytotoxicity Study

[0180] The cytotoxicity of CEF combined with CBS was evaluated by MTT assay in human lung adenocarcinoma Cell A549 and HEK-293T Cell in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, with 10 %FBS 1%p / s) . A549 (86012804) and HEK-293T (12022001) cells were purchased from Sigma Aldrich. Cells were seeded in a 96-well culture plates at ～3000 cells / well one day before compound addition. CEF was firstly performed by serial dilution using DMSO in a DMSO-resistant 96-well plate. A 96-well plate with 300 μL DMEM containing 1%FBS per well was prepared and 3 μL of serial-diluted CEF were added following by CBS. DMEM with no drugs served as a negative control. After washing the cells twice with PBS, 100 μL of compound-containing medium were added into the cells to get a final concentration of 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56, 0.78, 0.39 and 0.2 μM for CEF, and 100 μM per well for CBS. The cells were incubated with the compounds for 24 hrs at 37 ℃ under CO2 protection. After overnight incubation, 10 μL of MTT solutions (5 mg / mL) were added into each well and incubated for 4 hours, then 100 μL 1%SDS in 0.01 M HCl per well were added and incubated overnight. The optical density (OD) was measured at 570 / 640 nm with Multi-Mode Microplate Readers (SpectraMax iD3, Molecular Devices, LLC. ) . Cell viability was calculated using the equation below:

[0181] Animal Study

[0182] All animal experiments were approved by and performed in accordance with the guidelines approved by Committee on the Use of Live Animals in Teaching and Research (CULATR) , the University of Hong Kong. A total of 6-8 weeks-old, female BALB / c mice were used in all mouse studies. Mice rooms have 12-hour dark-light cycle, the room temperature is around 24 ℃, and the humidity is kept at 45%-65%. Murine acute pneumonia model was performed in this study. No sex-based analyses have performed in this study. Briefly, PAO1 were cultured overnight at 37 ℃ shaken at 220 rpm, following by 1: 100 dilution in fresh LB and cultured at 37℃ to OD600 of 1. The bacterial cells were collected and adjusted the concentration to 3×109 CFU mL-1 by PBS after washing. Each 6-to 8-week -old female BALB / c mouse was anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (100 mg / kg) and xylazine (10 mg / kg) , followed by an intranasal inoculation  of 20 μL of the bacterial suspension. After half-hour post-infection, the mice were administered with 20 μL aliquot of PBS, CBS, CEF, or their combination intranasally. Body weights and mouse survivals were monitored till endpoint of the experiment. For the lung colonization and histological study, each 6-to 8-week -old female BALB / c mouse was taken an intranasal inoculation of 20 μL of the bacterial suspension, resulting in 4×106 CFU mL-1 per mouse. After 24 hours post treatment, the mice were euthanized by intraperitoneal injection of 100 mg / kg pentobarbitone. The bacterial loads were counted by agar plating. For the histological study, lung samples were stored in 10%formalin for 48 hrs and rinsed by 70%EtOH. Tissues were embedded in paraffin, thin-sectioned, stained with hematoxylin and eosin (H&E) and examined by microscopy.

[0183] Statistical Analysis

[0184] All statistical analyses were performed on three independent experiments, or more if otherwise stated, using Prism 9.0 (GraphPad Software Inc. ) software. NMR data were analysed by MestReNova X64 14.3.3.

[0185] Results

[0186] Bismuth / gallium Compounds and CEF Inhibit P. aeruginosa Growth

[0187] A primary screening was performed to examine potential synergisms between metal compounds and CEF against Gram-negative bacterial strains including Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepecia, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Salmonella enterica, Enterobacter aerogenes, Aeromonas hydrophila, Vibrio cholerae and Proteus mirabilis. The minimum inhibitory concentrations (MICs) of CEF against these bacterial strains were examined in the presence of 50 μM of metal compounds including colloidal bismuth citrate (CBS) , Ga (NO3) 3 (GaNit) , FeCl3, Ti (IV) -citrate, Mn (OAc) 2, Co (OAc) 3 and Cr2 (SO4) 3 at different concentrations (half dilution from 2 × MIC) of CEF after inoculation in cation-adjusted Mueller–Hinton broth (CA-MHB) culture medium for 24 hours, as shown in Table 1A and Table 1B below.

[0188] Table 1A. Antibacterial Activity of CEF in the Absence and Presence of different Metal Compounds against Different Bacteria

[0189] CEF-cefiderocol; MIC-Minimum inhibitory concentration. Metal compounds used are: Bi3+-colloidal bismuth citrate (CBS) ; Ga3+-Ga (NO3) 3 (or GaNit) ; Co3+-Co (OAc) 3; Cr3+-Cr2 (SO4) 3; Fe3+-FeCl3; Mn2+-Mn (OAc) 2; Ti4+-Ti (IV) -citrate.

[0190] Table 1B. Antibacterial Activity of CEF in the Absence and Presence of different Metal Compounds against Different Bacteria

[0191] CEF-cefiderocol; MIC-Minimum inhibitory concentration. Metal compounds used are: Bi3+-colloidal bismuth citrate (CBS) ; Ga3+-Ga (NO3) 3 (or GaNit) ; Co3+-Co (OAc) 3; Cr3+-Cr2 (SO4) 3; Fe3+-FeCl3; Mn2+-Mn (OAc) 2; Ti4+-Ti (IV) -citrate.

[0192] Primary screening showed that the MICs of CEF could be reduced by 32-64 folds upon adding 50 μM CBS or GaNit against P. aeruginosa and B. cepacia strains. In contrast, the MICs of CEF remained almost unchanged upon the addition of other metal-containing compounds against all bacterial strains tested. The observed discrepancy in the effects of metal ions on CEF efficacy in different pathogens may be attributed to the fact that different bacterial strains have different iron requirements, uptake pathways, and different susceptibilities to Bi3+ / Ga3+ compounds. 34, 35 To validate this hypothesis, the intracellular bismuth concentration in E. coli (as an example) was also measured after being co-treated with CBS and CEF, and found similar bismuth concentrations in both E. coli and P. aeruginosa (see Figure 5) , indicating that similar amounts of bismuth were transported into the bacterial cells. However, CBS was shown to be more toxic to P. aeruginosa than to E. coli34, thus the selective antimicrobial activity of Bi3+ / Ga3+, which are delivered to specific bacterial cells through cefiderocol siderophore pathways, is also accountable for the selective toxicity of the combination therapy.

[0193] Given that CBS and GaNit exhibited the best performance in enhancing CEF antimicrobial efficacy, the underlying mechanism was further investigated. First the  interaction between bismuth / gallium compounds and CEF against P. aeruginosa was evaluated by the standard checkboard microdilution method using PAO1 standard strains as a showcase. CBS itself showed no, or minor, growth inhibition of PAO1 even at 64 μM. In contrast, the combination of CBS with CEF resulted in reduced MICs of CEF to 0.06 μM in the Fe3+ sufficient medium (CAMHB) ) and 0.125 μM in the iron-deficient condition (M9 broth) . This suggested that Fe3+ only has a slight effect on synergism under normal nutrient medium concentration. The fractional inhibitory concentration indexes (FICIs) were determined to be 0.125 and 0.24 for the iron-poor and iron-sufficient conditions respectively, suggesting a strong interaction (FICI<0.25) between CBS and CEF. Furthermore, compared with ceftazidime (the parent antibiotic) and 3-chlorocatechol (the siderophore mimic) , CEF showed more enhanced antibacterial activity when co-treated with CBS, indicating that the 3-chlorocatechol moiety as a siderophore mimic played a role in the dual Trojan Horse strategy. A similar effect was observed for GaNit and CEF against PAO1 with a FICI of 0.312. Given that CBS combined with CEF showed the best antibacterial activity against PAO1, CBS was selected for further study. The synergy between CBS and CEF was further confirmed by time killing assay. The population of PAO1 at the exponential phase was lowered by more than 4 logs upon exposure to the drug combination of CEF and CBS for 24 hours at concentrations of 0.5 μM and 16 μM, respectively, compared with that with CEF or CBS alone (see Figure 1B and Figure 6) . Furthermore, the bacterial loads were dropped by CBS in a dose-dependent manner when combined with CEF (see Figure 1C) . Similarly, bismuth nitrate (Bi (NO3) 3) , bismuth N-acetylcysteine (Bi (NAC) 3) , and bismuth subsalicylate (BSS) also exhibited synergistic effects with CEF against PAO1. Moreover, 60 clinical P. aeruginosa strains that are CEF sensitive were screened and 40%of them showed synergy after being co-treated with cefiderocol and CBS (see Figure 7 and Table 2 below) .

[0194] Table 2. Antibacterial Activity of CEF in the Absence and Presence with CBS against Clinical P. aeruginosa Strains

[0195] CBS and CEF Inhibit P. aeruginosa Biofilm Formation

[0196] Since biofilm formation is one of the main strategies for Pseudomonas strains to produce tolerance to antibiotics under stress conditions, it was next assessed whether bismuth compounds (e.g. CBS) could inhibit P. aeruginosa biofilm formation with CEF. First, the anti-biofilm activity of CEF was determined in the absence or presence of CBS by crystal violet (CV) method. As shown in Figure 2A, both CBS and CEF showed limited anti-biofilm formation activities individually. The relative biofilm viability remains around 80%and 70%after the treatment with CEF and CBS at concentrations of 0.25 μM and 16 μM, respectively. On the contrary, the combination of CBS with CEF at sub-inhibitory  concentrations showed distinct inhibition of biofilm formation and the relative biofilm viability decreased by more than 80%. In the meantime, the biofilm formation was also assessed by plate counting in the presence of CBS and CEF alone or in combination (see Figure 2B) , which showed the same results as crystal violet assay and the bacterial loads were decreased to 103 CFU / cm2 under the combination treatment. Moreover, the biofilm formation was also quantified by confocal laser scanning microscopy. PAO1-GFP (Green Fluorescent Protein) fluorescent bacterial strain, produced by transferring gfp containing plasmid pEX18TC-gfp into PAO1 cells, was used for confocal imaging. Treatment of PAO1-GFP with CBS and CEF in combination resulted in apparent decreases in the integrity and the thickness of biofilm compared to the untreated control group and single component groups.

[0197] In addition, the potential combination of CEF and GaN against PAO1 was also assessed. Crystal violet method was used to evaluate the biofilm formation under the treatment of cefiderocol (CEF) and gallium nitrate (GaN) alone or combination. As shown in Figure 2E, the relative biofilm viability was around 80%in the presence of 1 μM CEF, and around 50%and 90%in the presence of 8 μM and 4 μM GaN, respectively. Both CEF and GaN showed limited antibiofilm formation activities individually, but demonstrated a distinct inhibition of biofilm formation under the combination of CEF and GaN at subinhibitory concentrations. Moreover, the relative biofilm viability remained less than 25%under the combination treatment of CEF and GaN at the concentrations of 1 μM and 4 or 8 μM, demonstrating an effect against the biofilm growth. Additionally, the biofilm formation was also assessed by the plate counting under the treatment of CEF and GaN alone or in combination (see Figure 2F) . The bacterial loads were decreased to 104 CFU / cm2 under the cotreatment of CEF and GaN compared to the positive control and the single drug group.

[0198] CBS Suppresses the CEF Resistance Evolution in P. aeruginosa

[0199] Despite being used clinically for decades for the treatment of Helicobacter pylori infections, bismuth drugs are still effective and there appear no resistant bacterial strains to bismuth (III) drugs. The sustained efficacy of bismuth drugs is attributed to the multiple targeted mode of action. 23, 36 On the contrary, the resistance to CEF in P. aeruginosa and A. baumannii has been reported recently. 37 One of the mechanisms of the reported resistance to CEF is the presence of various β-lactamases, for example, the metallo-β-lactamases e.g. NDM, which caused resistance to CEF in E. coli strains in vivo. Other resistant mechanisms may include permeability defects and increased efflux, which may affect the  siderophore transportation and accumulation, thus reducing the final concentration in the bacterial cells. 21 To investigate whether bismuth (III) compounds may exhibit the resistance-proof ability when combined with CEF against PAO1, mutant prevention concentration (MPC) was determined at different concentrations of CBS. The results showed that CEF was unable to kill any high-level resistant mutants at 16-fold MIC and the MPC value was determined to be 32-fold MIC (see Figure 8) . Interestingly, CBS substantially reduced the MPC value of CEF in a concentration-dependent manner. The MPC to CEF was lowered to 2-fold MIC when co-treated with 128 μg mL-1 CBS. In addition, PAO1 strain was performed serial passages in the presence of CEF or a combination of CEF and CBS over 16 days to assess the resistance-proof ability of CBS under long-term antibiotic stress. The MIC of CEF increased to 64-fold MIC (256 μM) after 16 passages under the treatment of CEF alone. In contrast, the MIC of CEF under combination treatment with CBS only raised to 2-fold MIC (see Figure 2C) , suggesting the combination of CEF and CBS significantly suppressed the evolution of high-level resistance in PAO1.

[0200] To further assess whether the combination could potentially be used to treat infections caused by CEF-resistant P. aeruginosa, five CEF-resistant strains were first generated, including three PAO1 strains and two clinical isolates PA1882 by treatment of these bacteria with a sub-inhibitory concentration of CEF (started from 0.5 μM ) over a period of 12 consecutive passages, and the MICs after 12 passages were measured to be 16 μM, which are higher than the breakpoint of CEF (8 μM) defined by Invertigational CLSI MIC, confirming these bacteria strains are resistant to CEF38. The MICs of CEF against these resistant bacterial strains were then determined in the presence of various concentrations of CBS by the standard checkboard microdilution method. In the presence of 32 μM CBS, about 8-fold and 4-fold drops in the MICs of CEF were found for CEF-resistant clinical isolate PA1882-R1 and PAO1-R1 respectively, compared with those without CBS, indicating that the combination of CEF with CBS could re-sensitize these resistant P. aeruginosa to CEF. Moreover, the fractional inhibitory concentration indexes (FICIs) were determined to be lower than 0.5 in all resistant strains, indicative of synergies between CBS and CEF against all CEF-resistant bacterial strains (see Figure 2D) . The efficacy of the co-therapy against clinical CEF-resistant P. aeruginosa isolates PA247 and PA245 was further evaluated. Interestingly, in the presence of 32 μM CBS, the MICs of CEF against both PA247 and PA245 were reduced from 16 μM to 1 μM, suggesting that CBS could re-sensitize these resistant bacterial strains to CEF, and strong synergies were  observed between CBS and CEF against these clinical isolates, as judged by the FICIs of 0.125 and 0.188. Taken together, the combination of CEF and CBS can not only suppress the CEF resistance evolution of P. aeruginosa, but also potentially treat the infections caused by CEF-resistant strains, suggesting a potential for clinical usage of the combination therapy to prolong the life-span of CEF against antimicrobial resistance.

[0201] Binding of Bi (III) to CEF Results in Enhanced Uptake of Bi (III) and Reduced Levels of Fe (III) in PAO1

[0202] To obtain further mechanistic insight into the synergistic effect of CBS with CEF, it was first examined whether Bi3+ is bound to CEF by UV-vis spectroscopy, NMR spectroscopy and MS spectrometry. Titration of CBS to CEF, which was dissolved in a mixture of HEPES buffer and dimethyl sulfoxide (DMSO) , resulted in the appearance and increase in the absorbance at 314 nm in the UV difference spectrum, indicative of binding of Bi3+ to CEF. The absorption at 314 nm was plotted against CBS concentration (see Figure 3A) , the molar ratio of Bi3+ to CEF was found to be 0.7 (±0.2) , and the Kd was calculated to be 10.35 μM through the Ryan-Weber equation. The binding was also confirmed by 1H NMR titration (NMR spectra not shown) . Two aromatic protons at δ7.01 (1H, d) and 6.92 (1H, d) were attributed to the aromatic protons of the chlorocatechol moiety, respectively, disappeared gradually after the addition of 0-1.0 mol equivalent of CBS dissolved in D2O, indicating the coordination of bismuth ions to catechol of CEF. In addition, the single proton at δ 7.11 (1H, s) also disappeared with the addition of CBS, indicating the thiazole may also contribute to the coordination to form a metal complex. MS spectrometry (not shown) was also performed to further validate the binding. After reacting with bismuth nitrate (BiNit) under room temperature followed by adjusting the pH to around 6, new peaks showing the same isotope patterns as chlorine (17Cl) appeared at m / z of 985.1157 and 479.5638, which were assigned as (Bi-CEF+H) + (Cald. 958.1139) and (Bi-CEF+2H) 2+ (Cald. 479.5605) , respectively. Taken together, the results demonstrated that Bi3+ coordinated with CEF with a relative high affinity and form a 1: 1 ratio complex with the participation of the chlorocatechol and thiazole groups.

[0203] The binding of CBS to CEF can result in higher bismuth uptake, which simultaneously reduces intracellular Fe3+ contents. To evaluate this, the intracellular iron concentration in PAO1 was measured using the calcein-acetoxymethyl (AM) fluorescence probe39, which gave rise to a green fluorescence when transported into bacterial cells quenched by chelating with intracellular iron. The fluorescence of calcein-AM was quenched immediately after the addition of CEF (0.5 μM) under iron sufficient condition  compared to the control group, indicating the uptake of Fe3+ was distinguishably improved in the presence of external siderophore (see Figures 3B and 3C) . However, addition of Bi3+(50 μM) to the group of Fe+CEF resulted in much higher fluorescence intensity, indicating less Fe3+ was uptaken by siderophore owing to the competition by Bi3+. Other groups, i.e., Fe+Bi, Bi+CEF and Bi also exhibited comparable fluorescence intensity to both the negative control group and Fe3+ individual group, indicative of no significant changes of the intracellular iron concentration in these groups owing to either less iron available (Bi+CEF and Bi groups) or inefficient transport of iron (Fe+Bi group) . The final fluorescence intensity was also in agreement with the observation that the addition of bismuth decreased intracellular iron concentration substantially. Intracellular bismuth levels were further measured by ICP-MS. As shown in Figure 3D, when PAO1 was treated with 16 μM CBS, the addition of increasing concentration of CEF resulted in increased intracellular Bi3+ concentrations, suggesting more bismuth was transported by CEF into bacterial cells through siderophore-metal uptake pathways. Upon the treatment of PAO1 with different concentrations of CBS ranging from 0-16 μM, the Fe3+ level in the bacterial cells decreased accompanied by the increase in the Bi3+ concentration (see Figure 3E) . To further investigate the molecular mechanism of this effect, a PAO1 mutant with piuA gene deletion (PAO1ΔpiuA) was constructed. The protein piuA was considered as one of the iron transporters of P. aeruginosa, responsible for the transportation of CEF-iron complex20, 40, and the deletion of the piuA gene resulted in a higher MIC (16 μM) of CEF against PAO1 compared with that for the wide-type PAO1 (2 μM) . Moreover, only a 4-fold decrease in the MIC of CEF against PAO1ΔpiuA was observed after co-treatment with CBS up to 128 μM, and the FICI was calculated to be 0.5, indicating two drugs are additive and independent without any synergy. These results demonstrated that the synergy between CEF and CBS is abolished by the deletion of the CEF-metal complex transporter, and the Bi-CEF complex may partially be transported into the bacterial cells through one of the CEF transporters piuA. Compared with the untreated bacterial cells, P. aeruginosa cells became elongated (based on SEM imaging; not shown) upon the treatment with CBS and CEF, indicating an anaerobic and iron-deficient environment owing to the presence of Bi3+. Collectively, it was demonstrated that Bi3+ could coordinate to CEF as a 1: 1 ratio complex and compete with Fe3+ for cellular transport via the siderophore mediated pathway to disrupt the iron homeostasis as well as inhibit the bacteria growth. Bacterial membrane integrity was also disrupted, which may increase the membrane permeability of CEF. Collectively, it was demonstrated that Bi3+ could coordinate with CEF via its  chlorocatechol group and compete with Fe3+ for cellular transport via the siderophore-mediated pathway.

[0204] Binding of Ga (III) to CEF Results in Enhanced Uptake of Ga (III)

[0205] Moreover, the combination of cefiderocol (CEF) and gallium nitrate (GaN) was able to transport gallium ions into bacterial cells by siderophore uptake pathway as Ga-CEF complex, which acts synergistically against P. aeruginosa infections. To test this, the intracellular gallium concentration of PAO1 was measured by ICP-MS. As shown in Figure 3F, gallium concentration was around 9 ng per mg protein under the treatment of 2 μM GaN, and increased to 25 ng per mg protein under the treatment of GaN and CEF combined at concentrations of 2 μM and 1 μM, respectively. The addition of CEF enhanced the intracellular accumulation of gallium ions, suggesting more gallium is delivered by CEF into bacterial cells through siderophore-metal uptake pathways. Followed by releasing into the periplasm, gallium ions can function as iron homeostasis disruptor to inhibit the bacterial growth synergistically with CEF.

[0206] In addition, binding of the combination of CEF and GaN was also confirmed by 1H NMR titration (NMR spectra not shown) . Two doublets at δ 6.81 (1H, d) and 6.73 (1H, d) were assigned to the catechol moiety respectively, and a singlet at 8.54 (1H, s) was assigned to the thiazole moiety. The two doublet peaks at δ 6.81 (1H, d) and 6.73 (1H, d) decreased in their intensities gradually and disappeared with the addition of different molar equivalents of GaN, and at the same time there were two new peaks that appeared at 6.60 ppm (1H, d) and 6.46 ppm (1H, d) , demonstrating a fast exchange of free CEF and Ga-CEF on the NMR time scale. The peak at 8.54 ppm was assigned on the thiazole ring, and also showed a decreased intensity at 8.54 ppm and a new peak appeared at 8.31 ppm, which indicated the thiazole ring may also be involved in the coordination with Ga3+. To supplement the characterization of the Ga-CEF complex, mass spectrometry (not shown) was also performed. The Ga-CEF complex demonstrated a peak at 818. 0609 (Cald. 818. 0590) , assigned as (Ga-CEF+H) +. Taken together, this demonstrated that Ga3+ binds to CEF and forms a 1: 1 complex.

[0207] The Combination of CBS and CEF showed High Potency in vivo

[0208] Next the potential toxicity of the combination of CBS and CEF was examined in mammalian cells using the human lung adenocarcinoma cell A549 and embryonic kidney cell HEK293T as examples by XTT assay. With the increasing concentration of CEF combined with 100 μM CBS, there was no significant difference in cell viability between negative control and the treated cells (see Figures 9A and 9B) . Similarly, the cells treated  with CBS and CEF combination at each concentration up to 128 μM exhibited high cell viability >78%, demonstrating the low cytotoxicity of CBS-CEF combination under effective inhibitory concentration against PAO1.

[0209] Next, the efficiency of the CBS and CEF combination was evaluated in vivo. Given that P. aeruginosa is one of the most common pathogens causing respiratory infections in hospitalized patients42, a murine acute pneumonia model was selected for the study. Female 6-to 8-week BALB / c mice were infected via an intranasal inoculation of a lethal dose (6 × 107 CFU) of P. aeruginosa PAO1. The infected mice were then administrated intranasally with a PBS, CEF or CBS monotherapy, or combination therapy half-hour post infection. As shown in Figure 4A, a single dose of the combination of CBS (5 mg / kg) with CEF (0.25 mg / kg) significantly increased the survival rates of mice to 75%, as compared to CBS or CEF alone treated groups. In agreement with this, in a separate experiment, in which mice were infected with a sub-lethal dose of P. aeruginosa PAO1 (4×107 CFU) , the bacterial loads in the lungs of infected mice showed evident decreases in the group treated with the combination of CBS (5 mg / kg) and CEF (0.25 mg / kg) (see Figure 4B) but not in the groups receiving monotherapies. Furthermore, the histological sections of the lungs also demonstrated the recovery of the tissue injury after the co-therapy of CEF and CBS (not shown) . Taken together, it was demonstrated that the in vitro efficacy of the CEF-CBS combination therapy could be well translated into in vivo efficacy.

[0210] Further, the potential toxicity of the combination of cefiderocol (CEF) and gallium nitrate (GaN) was assessed in human lung adenocarcinoma cell A549 cell line by XTT assay. CEF and GaN both showed no cell toxicities according to the prior studies. After treating with serial diluted CEF combined with 50 μM GaN, there was no significant decrease in cell viability compared with untreated group. More than 75%cells remained even under the treatment of 100 μM CEF and 50 μM GaN, demonstrating the low cytotoxicity of the combination of CEF and GaN under effective inhibitory concentrations against P. aeruginosa. See Figure 9C. In addition, the antibacterial activity of the combination of CEF and GaN was preliminarily evaluated in vivo using a murine acute pneumonia model since P. aeruginosa is one of the most common pathogens of respiratory infections. 6-to 8-week-old female BALB / c mice were infected with a lethal dose (6 × 107 CFU) of PAO1 through intranasal inoculation. After 2 hours of infections, the mice were treated with intraperitoneal injections of PBS (Control group) , CEF, GaN, alone or combination. As shown in Figure 4C, all infected mice died within 24 hours without any drug administration, and a single dose of CEF (12 mg / kg) or GaN (12 mg / kg) failed to  protect any of the mice from death within 48 hours. However, the combination therapy effectively increased the survival rates of mice to 100%, demonstrating that the in vitro efficacy of the combination of CEF and GaN could be well translated into the in vivo efficacy.

[0211] Discussion

[0212] In the study described above it was shown that Bi (III) drugs and Ga (III) drugs could enhance the efficacy of CEF against P. aeruginosa and B. cepacia strains, as evidenced by a 64-fold reduction in the MIC of CEF. Using CBS as a showcase, the synergy between CBS and CEF was further demonstrated by a low FICI value (i.e., 0.125) and time kill assay (see Figure 1B) . The in vitro interaction of Bi3+ with CEF was confirmed by both UV-vis spectroscopy and MS spectrometry, which showed the formation of a 1: 1 complex of Bi3+-CEF (see Figure 3A) . With the increase in bismuth (III) concentration, more Bi3+ might bind to CEF and is likely to be transported to cell through competition with Fe3+, resulting in a much lower level of Fe3+ (see Figure 3B) . This was further validated by our PAO1ΔpiuA data, suggesting PiuA plays a role in the transport of both Bi-CEF and Fe-CEF. Given that Bi3+ was previously demonstrated to exhibit antimicrobial activity through inhibiting multiple enzymes in H. pylori46, 47, it is possible that enhanced uptake of bismuth might also bind and functionally disrupt multiple key enzymes in P. aeruginosa. Significantly, it was shown that the combined use of CBS and CEF could not only efficiently suppress the development of high-level bacterial resistant mutant to CEF, but also inhibit the growth of CEF-resistant P. aeruginosa including clinical isolates. This was probably attributable either to the reduced dosage of CEF in the combination therapy, or the suppressed levels of Fe3+ in bacterial cells caused by the competition by Bi3+, which may render the bacterium unlikely to shut down the iron transport pathways including the siderophore pathways. Significantly, the combination of a bismuth drug and CEF exhibited low toxicity to mammalian cells and high potency in a murine lung infection model compared with monotherapy (see Figures 4A and 4B) , confirming that such a co-therapy may readily be translated into clinical usage.

[0213] Similar to the Bismuth drugs and cefiderocol discussed above, gallium nitrate (GaNit) also in combination with cefiderocol (CEF) exhibited similar effects against P. aeruginosa strains. The bactericidal activities of the combination were evaluated by determining the population of PAO1 under drug treatment. As shown in the time killing curves (see Figure 1D) , the population of PAO1 at the exponential phase was lowered by 3  logs upon exposure to the drug combination of GaNit and CEF for 18 h at concentrations of 4 and 0.5 μM, respectively, demonstrating a synergistic bactericidal effect against PAO1. In contrast, the individually treated groups by CEF and GaNit showed no differences compared with positive control. Furthermore, the bacterial loads were dropped by GaNit in a dose-dependent manner when combined with CEF (see Figure 1E) .

[0214] Moreover, similar to bismuth ions, it was shown that gallium ions are also able to bind with CEF and transport into bacterial cells actively to improve the cellular concentration of gallium ions. The binding between Ga3+ and CEF was assessed through UV-vis spectroscopy, NMR spectroscopy and MS spectrometry. UV-vis spectroscopy was used to titrate gallium nitrate (GaN) into CEF in a mixture of 10 mM HEPES buffer and dimethyl sulfoxide (DMSO) . The titration difference curve demonstrated an increase at 240 nm and 311 nm in the difference spectrum, indicative of binding of Ga3+ to CEF. The absorption changes at 311 nm was plotted and the molar ratio of Ga3+ to CEF was found to be 0.7 (±0.2) , demonstrating a 1: 1 ratio coordination, as shown in Figure 3G.

[0215] In summary, it was demonstrated that a bismuth drug (CBS) could enhance the potency of CEF both in vitro and in vivo against P. aeruginosa, suppress the development of high-level bacterial resistance to CEF, and restore the efficacy of CEF against resistant P. aeruginosa including clinical isolates. Such phenomena are likely attributable to the competition of Bi3+ with Fe3+ to CEF, leading to the reduced uptake of Fe3+ and enhanced uptake of antimicrobial Bi3+ / Ga3+, as well as disruption of bacterial membrane integrity, thus increasing antibiotic permeability. The metallo-sideromycin might not only improve the efficiency of sideromycin, but also prolong the effective life-span of this type of antibiotics.

[0216] References:

[0217] 1. Mitscher, L.A. Coevolution: mankind and microbes. J. Nat. Prod. 71, 497-509 (2008) .

[0218] 2. Brown, E.D. &Wright, G. D. Antibacterial drug discovery in the resistance era. Nature 529, 336-343 (2016) .

[0219] 3. Potron, A. et al. Emerging broad-spectrum resistance in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii: Mechanisms and epidemiology. Int. J. Antimicrob. Agents 45, 568-585 (2015) .

[0220] 4. Boucher, H.W. et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the infectious diseases society of America. Clin. Infect. Dis. 48, 1-12 (2009) .

[0221] 5. Pruitt, B.A. et al. Current approach to prevention and treatment of Pseudomonas aeruginosa infections in burned patients. Rev. Infect. Dis. 5 Suppl 5, S889-897 (1983) .

[0222] 6. Obritsch, M. D. et al. Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options. Pharmacotherapy 25, 1353-1364 (2005) .

[0223] 7. Lee, J.Y. et al. Preservation of acquired colistin resistance in gram-negative bacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 609-612 (2016) .

[0224] 8. Nikaido, H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 593-656 (2003) .

[0225] 9. Hider, R.C. &Kong, X. Chemistry and biology of siderophores. Nat. Prod. Rep. 27, 637-657 (2010) .

[0226] 10. Mislin, G.L. &Schalk, I.J. Siderophore-dependent iron uptake systems as gates for antibiotic Trojan horse strategies against Pseudomonas aeruginosa. Metallomics 6, 408-420 (2014) .

[0227] 11. Page, M.G.P. The role of iron and siderophores in infection, and the development of siderophore antibiotics. Clin. Infect. Dis. 69, S529-S537 (2019) .

[0228] 12. Kong, H. et al. An overview of recent progress in siderophore-antibiotic conjugates. Eur. J. Med. Chem. 182, 111615 (2019) .

[0229] 13. Gause, G. F. Recent studies on albomycin, a new antibiotic. Brit. Med. J. 2, 1177-1179 (1955) .

[0230] 14. Benz, G. et al. Constitution of the deferriform of the albomycins δ1, δ2 and ε. Angew. Chem. Int. Ed. 21, 527-528 (1982) .

[0231] 15. Braun, V. et al. Sideromycins: tools and antibiotics. BioMetals 22, 3-13 (2009) .

[0232] 16. Lin, Y.M. et al. Synthetic sideromycins (skepticism and optimism) : selective generation of either broad or narrow spectrum Gram-negative antibiotics. BioMetals 32, 425-451 (2019) .

[0233] 17. Zheng, T. et al. Siderophore-mediated cargo delivery to the cytoplasm of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa: syntheses of monofunctionalized enterobactin scaffolds and evaluation of enterobactin-cargo conjugate uptake. J. Am. Chem. Soc. 134, 18388-18400 (2012) .

[0234] 18. Zheng, T. &Nolan, E.M. Enterobactin-mediated delivery of beta-lactam antibiotics enhances antibacterial activity against pathogenic Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 136, 9677-9691 (2014) .

[0235] 19. Ito, A. et al. Siderophore cephalosporin cefiderocol utilizes ferric iron transporter systems for antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents. Chemother. 60, 7396-7401 (2016) .

[0236] 20. Karakonstantis, S. et al. Cefiderocol: Systematic review of mechanisms of resistance, heteroresistance and in vivo emergence of resistance. Antibiotics 11, 723 (2022) .

[0237] 21. Streling, A.P. et al. Evolution of cefiderocol non-susceptibility in Pseudomonas aeruginosa in a patient without previous exposure to the antibiotic. Clin. Infect. Dis. 73, e4472-e4474 (2021) .

[0238] 22. Zhou, Y. et al. Metal complexes as drugs and chemotherapeutic agents in Comprehensive Coordination Chemistry III. (eds. E.C. Constable, G. Parkin &L. Que Jr) 680-705 (Elsevier, Oxford; 2021) .

[0239] 23. Wang, H. et al. Multi-target mode of action of silver against Staphylococcus aureus endows it with capability to combat antibiotic resistance. Nat. Commun. 12, 3331 (2021) .

[0240] 24. Franz, K.J. &Metzler-Nolte, N. Introduction: metals in medicine. Chem. Rev. 119, 727-729 (2019) .

[0241] 25. Lemire, J.A. et al. Antimicrobial activity of metals: mechanisms, molecular targets and applications. Nat. Rev. Microbiol. 11, 371-384 (2013) .

[0242] 26. Zhang, Q. et al. Re-sensitization of mcr carrying multidrug resistant bacteria to colistin by silver. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 119, e2119417119 (2022) .

[0243] 27. Morones-Ramirez, J.R. et al. Silver enhances antibiotic activity against gram-negative bacteria. Sci. Transl. Med. 5, 190ra181 (2013) .

[0244] 28. Frei, A. et al. Metal complexes as a promising source for new antibiotics. Chem. Sci. 11, 2627-2639 (2020) .

[0245] 29. Wang, R. et al. Bismuth antimicrobial drugs serve as broad-spectrum metallo-β-lactamase inhibitors. Nat. Commun. 9, 439 (2018) .

[0246] 30. Griffith, D.M. et al. Medicinal chemistry and biomedical applications of bismuth-based compounds and nanoparticles. Chem. Soc. Rev. 50, 12037-12069 (2021) .

[0247] 31. Tsang, C.N. et al. Tracking bismuth antiulcer drug uptake in single Helicobacter pylori cells. J. Am. Chem. Soc. 133, 7355-7357 (2011) .

[0248] 32. Goss, C.H. et al. Gallium disrupts bacterial iron metabolism and has therapeutic effects in mice and humans with lung infections. Sci. Transl. Med. 10 (2018) .

[0249] 33. Banin, E. et al. The potential of desferrioxamine-gallium as an anti-Pseudomonas therapeutic agent. Natl. Acad. Sci. USA 105, 16761-16766 (2008) .

[0250] 34. Vega-Jiménez, A. et al. Susceptibility of E. Coli, P. Aeruginosa, S. Aureus and S. Epidermidis to different bismuth compounds. MRS Proceedings 1487 (2012) .

[0251] 35. Veloira, W.G. et al. In vitro activity and synergy of bismuth thiols and tobramycin against Burkholderia cepacia complex. J. Antimicrob. Chemother. 52, 915-919 (2003) .

[0252] 36. Li, H. &Sun, H. Recent advances in bioinorganic chemistry of bismuth. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 74-83 (2012) .

[0253] 37. Malik, S. et al. Cefiderocol resistance in Acinetobacter baumannii: roles of β-lactamases, siderophore receptors, and penicillin binding protein 3. Antimicrob. Agents. Chemother. 64, e01221-20 (2020) .

[0254] 38. Simner, P.J. &Patel, R. Cefiderocol antimicrobial susceptibility testing considerations: the Achilles'Heel of the Trojan Horse? J. Clin. Microbiol. 59, e00951-20 (2020) .

[0255] 39. Ito, A. et al. Siderophore cephalosporin cefiderocol utilizes ferric iron transporter systems for antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 7396-7401 (2016) .

[0256] 40. Luscher, A. et al. TonB-Dependent receptor repertoire of Pseudomonas aeruginosa for uptake of siderophore-drug conjugates. Antimicrob. Agents. Chemother. 62, e00097-18 (2018) .

[0257] 41. Yoon, M.Y. et at. Contribution of cell elongation to the biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa during anaerobic respiration. PLoS One 6, e16105 (2011) .

[0258] 42. Lin, Y. et al. Inhalable combination powder formulations of phage and ciprofloxacin for P. aeruginosa respiratory infections. Eur. J. Pharm. Biopharmaceu. 142, 543-552 (2019) .

[0259] 43. Aoki, T. et al. Cefiderocol (S-649266) , A new siderophore cephalosporin exhibiting potent activities against Pseudomonas aeruginosa and other gram-negative pathogens  including multi-drug resistant bacteria: Structure activity relationship. Eur. J. Med. Chem. 155, 847-868 (2018) .

[0260] 44. Wang, Q. et al. Occurrence of high levels of cefiderocol resistance in carbapenem-resistant Escherichia coli before its approval in China: a report from China CRE-network. Microbiol. Spectr. 10, e02670-02621 (2022) .

[0261] 45. Klein, S. et al. Rapid development of cefiderocol resistance in Carbapenem-resistant Enterobacter cloacae during therapy is associated with heterogeneous mutations in the catecholate siderophore receptor cirA. Clin. Infect. Dis. 74, 905-908 (2022) .

[0262] 46. Han, B. et al. Multi-omics and temporal dynamics profiling reveal disruption of central metabolism in Helicobacter pylori on bismuth treatment. Chem. Sci. 9, 7488-7497 (2018) .

[0263] 47. Wang, Y. et al. Integrative approach for the analysis of the proteome-wide response to bismuth drugs in Helicobacter pylori. Chem. Sci. 8, 4626-4633 (2017) .

[0264] 48. Hoang, T.T. et al. A broad-host-range Flp-FRT recombination system for site-specific excision of chromosomally-located DNA sequences: application for isolation of unmarked Pseudomonas aeruginosa mutants. Gene 212, 77-86 (1998) .

[0265] 49. Humphries, R. et al. Overview of changes to the clinical and laboratory standards institute performance standards for antimicrobial susceptibility testing, M100, 31st Edition. J. Clin. Microbiol. 59, e0021321 (2021) .

[0266] 50. Bogdanovich, T. et al. Antistaphylococcal activity of ceftobiprole, a new broad-spectrum cephalosporin. Antimicrob. Agents. Chemother. 49, 4210-4219 (2005) .

[0267] 51. Ryan, D.K. &Weber, J. H. Fluorescence quenching titration for determination of complexing capacities and stability constants of fulvic acid. Anal. Chem. 54, 986-990 (1982) .

[0268] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meanings as commonly understood by one of skill in the art to which the disclosed invention belongs. Publications cited herein and the materials for which they are cited are specifically incorporated by reference.

[0269] Those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific instances of the invention described herein. Such equivalents are intended to be encompassed by the following claims.

Claims

1.A metallo-complex compound comprising:a sideromycin complexed to a metal cation;wherein the sideromycin comprises a catechol moiety; andwherein the metal cation is associated to the catechol moiety.2.The metallo-complex compound of claim 1, wherein the sideromycin is cefiderocol.3.The metallo-complex compound of claim 1, wherein the metal cation is a bismuth 3+cation or a gallium 3+ cation.4.The metallo-complex compound of claim 1, wherein the catechol moiety is a chlorocatechol moiety.5.The metallo-complex compound of claim 1, wherein the metallo-complex compound has a chemical structure of Formula II or Formula II, as follows: where Mn+ is a bismuth 3+ cation or a gallium 3+ cation.6.A pharmaceutical composition comprising an effective amount of the metallo-complex compound of any one of claims 1-5, and optionally one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients.7.The pharmaceutical composition of claim 6, wherein the metallo-complex compound is in a concentration ranging from about 1 μM to about 1 mM, from about 10 μM to about 500 μM, from about 10 μM to about 200 μM, or from about 25 μM to about 100 μM of the pharmaceutical composition.8.A method for treating an infection with the pharmaceutical composition of claim 6, the method comprising:(i) administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.9.The method of claim 7, wherein the pharmaceutical composition is administered to the subject by intranasal administration, oral administration, intramuscular administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, or a combination thereof.10.The method of any one of claims 8-9, wherein in step (i) , a dosage of the metallo-complex compound in the pharmaceutical composition administered to the subject is from about 0.1 μg to about 100 μg, from about 0.5 μg to about 50 μg, from about 1 μg to about  100 μg, from about 1 μg to about 50 μg, from about 1 μg to about 25 μg, from about 1 μg to about 10 μg, from about 1 μg to about 5 μg, from about 4 μg to about 10 μg, or from about 1 μg to about 4 μg per gram of the subject.11.The method of any one of claims 8-10, wherein the infection is a bacterial infection.12.The method of claim 11, wherein the bacterial infection is a Gram-negative bacterial infection.13.The method of any one of claims 8-11, wherein the infection is a multidrug resistant (MDR) bacterial infection.14.The method of any one of claims 8-13, wherein the infection is a bacterial infection selected from the group consisting of Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepecia, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Salmonella enterica, Enterobacter aerogenes, Aeromonas hydrophila, Vibrio cholerae, Proteus mirabilis, and combinations thereof.15.The method of any one of claims 8-14, wherein the pharmaceutical composition further comprises one or more therapeutic, prophylactic, or diagnostic agents.16.The method of any one of claims 8-14, wherein the method further comprises co-administering one or more therapeutic, prophylactic, or diagnostic agents to the subject.

Images