Crystalline forms of a2a receptor antagonist, preparation methods, and uses thereof

Abstract

Disclosed are crystalline forms of 2- (3-cyanophenyl) -3- (2, 6-dimethylpyridin-4-yl) -N- [ (2S) -3-hydroxy-3-methylbutan-2-yl] pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxamide as an A2a receptor antagonist, and preparation methods and uses thereof. In particular, disclosed are crystalline Form A, Form C, and Form G, Form N, and the methods for preparing the above-mentioned crystalline forms and a pharmaceutical composition comprising same, and uses thereof.

Description

CRYSTALLINE FORMS OF A2A RECEPTOR ANTAGONIST, PREPARATION METHODS, AND USES THEREOFTECHNICAL FIELD

[0001] The present invention relates to the field of drugs, and specifically relates to crystalline forms of an A2a receptor antagonist, and preparation methods and uses thereof.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] A number of immunosuppressive pathways are active in the tumour microenvironment which enable tumour cells to evade elimination by cytotoxic T cells and can diminish the clinical response of patients to immunotherapy with anti-checkpoint antibodies. However, only 20-30%of patients respond to checkpoint blockade and the side effects of such treatments are significant (Sukari et al, 2016) . Consequently, other approaches to enhance the cytotoxic potential of the tumour microenvironment are actively being investigated. This includes agents that could be used as monotherapies or, more likely, used in combination with checkpoint inhibitors and cytotoxic agents to enhance their efficacy.

[0003] One approach that has attracted attention is to interfere with the production and / or action of adenosine in the tumour microenvironment (Vijayan et al, 2017) . Adenosine has immunosuppressive properties and is present in the tumour microenvironment at high concentrations. Adenosine regulates cell function via occupancy of specific GPCRs on the cell surface of the P1 purinoceptor subtypes. The P1 receptor family is further subdivided into A1, A2a, A2b and A3. A2 receptors are subdivided into A2a and A2b, based on high and low affinity for adenosine, respectively. A2a is expressed by lymphocytes and activation of A2a leads to suppression of cytokine production and other effector functions. Recent studies have prompted the development of selective A2a receptor antagonists for use in cancer immunotherapy.

[0004] International patent application publication WO2021 / 224636 disclosed a series of compounds as A2a receptor antagonists. One of the compounds described is 2- (3-cyanophenyl) -3- (2, 6-dimethylpyridin-4-yl) -N- [ (2S) -3-hydroxy-3-methylbutan-2-yl] pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxamide (hereinafter referred to as "compound of formula (I) ” ) :

[0005] The compound of formula (I) is an orally bioavailable small molecule selective A2a receptor antagonist. In vitro, it enhanced T cell activation and cytokine secretion in primary CD4+ and CD8+ T cells. In vivo, it potentiated anti-tumor response to radiation therapy in combination with anti-PD-1 in 3 different mouse tumor models (CT-26, B16F10, and EG7-OVA) resulting in enhanced tumor growth inhibition, tumor regression, and increased survival compared to monotherapy with either agent or the combination.

[0006] It is known that a crystalline form of a compound can improve the thermodynamic stability, and has the technological operation advantage of easy further purification, easy filtration, drying and so on. Therefore, it is necessary to further research and develop crystalline forms of the compound of formula (I) , which possess characteristic such as high melting point and better stability, suitable for drug formulations.

[0007] BRIEF SUMMARY

[0008] The application describes crystalline forms of an A2a receptor antagonist, preparation methods thereof, and uses thereof.

[0009] In one general aspect, provided here is crystalline Form A of a compound of formula (I)

[0010] characterized by an X-ray powder diffraction pattern, wherein the X-ray powder diffraction pattern comprises substantially the same peaks at diffraction angles (2θ) as shown in FIG. 1.

[0011] In some embodiments, the crystalline Form A is characterized by a differential scanning calorimetry curve, wherein the differential scanning calorimetry curve comprises a melting endothermic peak of from 190℃ to 200 ℃, preferably from 190℃ to 195℃, and more preferably about 193.6℃.

[0012] In certain embodiments, the differential scanning calorimetry curve is substantially similar to FIG. 2.

[0013] In some embodiments, the crystalline Form A is characterized by a thermogravimetric analysis curve, wherein the thermogravimetric analysis curve is substantially similar to FIG. 3.

[0014] In another general aspect, provided here is crystalline Form C of a compound of formula (I) characterized by an X-ray powder diffraction pattern, wherein the X-ray powder diffraction pattern comprises substantially the same peaks at diffraction angles (2θ) as shown in FIG. 5.

[0015] In some embodiments, the crystalline Form C is characterized by a differential scanning calorimetry curve, wherein the differential scanning calorimetry curve comprises a melting endothermic peak of from 190℃ to 200 ℃, preferably from 190℃ to 195℃, and more preferably about 192.6℃.

[0016] In certain embodiments, the differential scanning calorimetry curve is substantially similar to the differential scanning calorimetry curve in FIG. 7.

[0017] In some embodiments, the crystalline Form C is characterized by a thermogravimetric analysis curve, wherein the thermogravimetric analysis curve is substantially similar to the thermogravimetric analysis curve in FIG. 7.

[0018] In another general aspect, provided here is crystalline Form G of a compound of formula (I) characterized by an X-ray powder diffraction pattern, wherein the X-ray powder diffraction pattern comprises substantially the same peaks at diffraction angles (2θ) as shown in FIG. 9.

[0019] In some embodiments, the crystalline Form G is characterized by a differential scanning calorimetry curve, wherein the differential scanning calorimetry curve comprises a melting endothermic peak of from 190℃ to 200 ℃, preferably from 190℃ to 195℃, and more preferably about 194.4℃.

[0020] In certain embodiments, the differential scanning calorimetry curve is substantially similar to the differential scanning calorimetry curve in FIG. 10.

[0021] In some embodiments, the crystalline Form G is characterized by a thermogravimetric analysis curve, wherein the thermogravimetric analysis curve is substantially similar to the  thermogravimetric analysis curve in FIG. 10.

[0022] In another general aspect, provided here is crystalline Form N of a compound of formula (I) characterized by an X-ray powder diffraction pattern, wherein the X-ray powder diffraction pattern comprises substantially the same peaks at diffraction angles (2θ) as shown in FIG. 15.

[0023] In some embodiments, the crystalline Form N is characterized by a differential scanning calorimetry curve, wherein the differential scanning calorimetry curve comprises a melting endothermic peak of from 190℃ to 200 ℃, preferably from 190℃ to 195℃, and more preferably about 194.3℃.

[0024] In certain embodiments, the differential scanning calorimetry curve is substantially similar to FIG. 14.

[0025] In another general aspect, the invention presents methods of preparing the crystalline forms described herein.

[0026] In some embodiments, the method of preparing the crystalline Form A comprises dissolving the compound of formula (I) in acetonitrile or a mixture of acetonitrile and water to form a solution under heating, and then cooling the solution to obtain the crystalline Form A.

[0027] In some embodiments, the method of preparing the crystalline Form C comprises:

[0028] a) suspending the compound of formula (I) in ethyl acetate to form a suspension, optionally adding a Form C seed, and stirring the suspension at a suitable temperature for a suitable period of time to obtain the crystalline Form C; or

[0029] b) dissolving the compound of formula (I) in 2-methyltetrahydrofuran to form a solution under heating, cooling the solution to a suitable temperature, adding heptane, and obtaining the crystalline Form C.

[0030] In some embodiments, the method of preparing the crystalline Form G comprises suspending the compound of formula (I) in a mixture of acetone and water to form a suspension, optionally adding a Form G seed, and stirring the suspension at a suitable temperature for a suitable period of time to obtain the crystalline Form G.

[0031] In some embodiments, the method of preparing the crystalline Form N comprises heating crystalline Form G of the compound of formula (I) .

[0032] In another general aspect, the invention presents a pharmaceutical composition comprises an effective amount of at least one of the crystalline forms described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0033] In one another general aspect, the invention presents the uses of the described crystalline forms.

[0034] The details of one or more embodiments of the invention are set forth in the description below. Other features and advantages will be apparent from the following detailed description, and the appended claims.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0035] The foregoing and other objects, aspects, features, and advantages of exemplary embodiments will become more apparent and may be better understood by referring to the following description taken in conjunction with the accompanying drawings.

[0036] FIG. 1 is the X-ray powder diffraction (XRPD) curve of crystalline Form A of the compound of formula (I) .

[0037] FIG. 2 is the differential scanning calorimetry (DSC) curve of crystalline Form A of the compound of formula (I) ; the endothermic peak is downward, and the exothermic peak is upward.

[0038] FIG. 3 is the thermogravimetric analysis (TGA) curve of crystalline Form A of the compound of formula (I) .

[0039] FIG. 4 is the 1H-NMR of crystalline Form A of the compound of formula (I) .

[0040] FIG. 5 is the X-ray powder diffraction pattern of crystalline Form C of the compound of formula (I) .

[0041] FIG. 6 depicts the unit cell of crystalline Form C of the compound of formula (I) .

[0042] FIG. 7 is the DSC / TGA overlay of crystalline Form C of the compound of formula (I) ; the endothermic peak is downward, and the exothermic peak is upward.

[0043] FIG. 8 is the sorption isotherm of the crystalline Form C of the compound of formula (I) .

[0044] FIG. 9 is the X-ray powder diffraction curve of crystalline Form G of the compound of formula (I) .

[0045] FIG. 10 is the DSC / TGA overlao of crystalline Form G of the compound of formula (I) ; the endothermic peak is downward, and the exothermic peak is upward.

[0046] FIG. 11 is the sorption isotherm of the crystalline Form G of the compound of formula (I) .

[0047] FIG. 12 depicts the crystal structure of crystalline Form G of the compound of formula (I) ; water molecules are depicted in spacefilled style for better visibility.

[0048] FIG. 13 is the XRPD overlay of the samples obtained from VT-XRPD experiments on crystalline Form G of the compound of formula (I) .

[0049] FIG. 14 is the differential scanning calorimetry (DSC) curve of crystalline Form N of  the compound of formula (I) ; the endothermic peak is downward, and the exothermic peak is upward.

[0050] FIG. 15 is the X-ray powder diffraction pattern of crystalline Form N of the compound of formula (I) .

[0051] FIG. 16 is the PLM image of Form C crystallized from the crystallization process in 2-methyltetrahydrofuran  / heptane.DETAILED DESCRIPTION

[0052] The disclosed pharmaceutical compositions and methods may be understood more readily by reference to the following detailed description, which form a part of this disclosure. It is to be understood that the disclosed methods are not limited to the specific methods described and / or shown herein, and that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments by way of example only and is not intended to be limiting of the claimed methods.

[0053] Various publications, articles and patents are cited or described in the background and throughout the specification; each of these references is herein incorporated by reference in its entirety. Discussion of documents, acts, materials, devices, articles or the like which has been included in the present specification is for the purpose of providing context for the invention. Such discussion is not an admission that any or all of these matters form part of the prior art with respect to any inventions disclosed or claimed.

[0054] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood to one of ordinary skill in the art to which this invention pertains. Otherwise, certain terms used herein have the meanings as set forth in the specification. All patents, published patent applications and publications cited herein are incorporated by reference as if set forth fully herein.

[0055] Definitions

[0056] It must be noted that as used herein and in the appended claims, the singular forms “a, ” “an, ” and “the” include plural reference unless the context clearly dictates otherwise.

[0057] When a list is presented, unless stated otherwise, it is to be understood that each individual element of that list, and every combination of that list, is a separate embodiment. For example, a list of embodiments presented as “A, B, or C” is to be interpreted as including the embodiments, “A, ” “B, ” “C, ” “Aor B, ” “Aor C, ” “B or C, ” or “A, B, or C. ”

[0058] As used herein, the term “about” preceding a numerical value or a series of numerical values means ±10%of the numerical value unless otherwise indicated. For example, “about  100 mg” means 90 to 110 mg.

[0059] Unless otherwise indicated, the term “at least” preceding a series of elements is to be understood to refer to every element in the series. Those skilled in the art will recognize or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific embodiments of the invention described herein. Such equivalents are intended to be encompassed by the invention.

[0060] Throughout this specification and the claims which follow, unless the context requires otherwise, the word “comprise” , and variations such as “comprises” and “comprising” , will be understood to imply the inclusion of a stated integer or step or group of integers or steps but not the exclusion of any other integer or step or group of integer or step. When used herein the term “comprising” can be substituted with the term “containing” or “including” or sometimes when used herein with the term “having” .

[0061] When used herein “consisting of” excludes any element, step, or ingredient not specified in the claim element. When used herein, “consisting essentially of” does not exclude materials or steps that do not materially affect the basic and novel characteristics of the claim. Any of the aforementioned terms of “comprising” , “containing” , “including” , and “having” , whenever used herein in the context of an aspect or embodiment of the invention can be replaced with the term “consisting of” or “consisting essentially of” to vary scopes of the disclosure.

[0062] As used herein, the conjunctive term “and / or” between multiple recited elements is understood as encompassing both individual and combined options. For instance, where two elements are conjoined by “and / or” , a first option refers to the applicability of the first element without the second. A second option refers to the applicability of the second element without the first. A third option refers to the applicability of the first and second elements together. Any one of these options is understood to fall within the meaning, and therefore satisfy the requirement of the term “and / or” as used herein. Concurrent applicability of more than one of the options is also understood to fall within the meaning, and therefore satisfy the requirement of the term “and / or. ”

[0063] As used herein, “treatment” or “treat” refers to the treatment of a disease, disorder, or medical condition (such as a gastrointestinal inflammatory disease) , in a patient, such as a mammal (particularly a human) which includes one or more of the following:

[0064] (a) preventing the disease, disorder, or medical condition from occurring, i.e., preventing the reoccurrence of the disease or medical condition or prophylactic treatment of a patient that is pre-disposed to the disease or medical condition;

[0065] (b) ameliorating the disease, disorder, or medical condition, i.e., eliminating or causing regression of the disease, disorder, or medical condition in a patient, including counteracting the effects of other therapeutic agents;

[0066] (c) suppressing the disease, disorder, or medical condition, i.e., slowing or arresting the development of the disease, disorder, or medical condition in a patient; or

[0067] (d) alleviating the symptoms of the disease, disorder, or medical condition in a patient.

[0068] The terms “efficacy” and “effective” as used herein in the context of a dose, dosage regimen, treatment or method refer to the effectiveness of a particular dose, dosage or treatment regimen. Efficacy can be measured based on change in the course of the disease in response to an agent of the present invention. For example, the compound of formula (I) can be administered to a subject in an amount and for a time sufficient to induce an improvement, preferably a sustained improvement, in at least one indicator that reflects the severity of the disorder that is being treated. Various indicators that reflect the extent of the subject's illness, disease or condition can be assessed for determining whether the amount and time of the treatment is sufficient. Such indicators include, for example, clinically recognized indicators of disease severity, symptoms, or manifestations of the disorder in question. The degree of improvement generally is determined by a physician, who can make this determination based on signs, symptoms, biopsies, or other test results, and who can also employ questionnaires that are administered to the subject, such as quality-of-life questionnaires developed for a given disease.

[0069] The term “an effective amount” means an amount sufficient to affect treatment when administered to a patient in need of treatment.

[0070] The term “subject” includes any human or nonhuman animal. “non-human animal” includes all vertebrates, e.g., mammals and non-mammals, such as nonhuman primates, sheep, dogs, cats, horses, cows, chickens, amphibians, reptiles, etc. The terms “subject” and “patient” can be used interchangeably herein.

[0071] The term “X-ray powder diffraction” or “XRPD” used in the present invention refers to an X-ray powder diffraction pattern that is obtained according to the Bragg formula: 2d sin θ = nλ (where λ is the wavelength of the X-ray,  the order of diffraction n is any positive integer, generally taking the first-order diffraction peak, n=1) , when the X-ray is incident on a certain atomic plane of a crystal or a partial crystal sample having a d-lattice plane spacing at a glancing angle θ (the complementary angle of incidence angle, also called the Bragg angle) , the Bragg equation can be satisfied.

[0072] For crystalline forms described herein, the peaks of the XRPD pattern can be obtained from the pattern by conventional methods, which are known to those skilled in the field.

[0073] The term “2θ or 2θ angle” used in the present invention refers to the diffraction angle, θ is the Bragg angle, and the unit of which is ° or degree. The error range of 2θ is from ±0.1 to ±0.5, preferably from ±0.1 to ±0.3, and more preferably ±0.2.

[0074] The term “interplanar spacing or interplanar distance (d value) ” used in the present invention means that the space lattice selects three unit vectors a, b, c, wherein the each of the them connects two adjacent lattice dots, and the three vectors divide the lattice into juxtaposed parallel juxtagonal units, called the interplanar spacing. The space lattice is divided according to the determined parallelepiped unit lines to obtain a set of linear grids, which is called a space lattice or a lattice. The lattice reflects the periodicity of the crystal structure with geometric points and lines. Different crystal planes have different interplanar spacings (i.e., distance between two adjacent parallel crystal planes) ; the unit is or angstrom.

[0075] The term “differential scanning calorimetry” or “DSC” used in the present invention means to measure the temperature difference and heat flow difference between the sample and the reference during the heating or constant temperature process of the sample, to characterize all physical and chemical changes associated with the thermal effect, and to obtain phase change information of the sample.

[0076] The term “thermogravimetric analysis” or “TGA” used in the present invention means to measure the thermal stability of a sample, in which changes in the weight of a sample are measured while its temperature is increased. Moisture and volatile contents of a sample can be measured by TGA. This measurement provides information about physical phenomena, such as phase transitions, absorption, adsorption and desorption; as well as chemical phenomena including chemisorptions, thermal decomposition, and solid-gas reactions (e.g., oxidation or reduction) .

[0077] Crystalline Forms

[0078] In one general aspect, the invention relates to crystalline Form A of a compound of formula (I)

[0079] According to embodiments of the invention, the crystalline Form A is a non-stoichiometric channel hydrate that shows a slightly different XRPD pattern as a function of its water content.

[0080] In some embodiments, the crystalline Form A contains about 1.6%water content.

[0081] In some embodiments, Form A is characterized by an X-ray powder diffraction pattern, wherein the X-ray powder diffraction pattern comprises substantially the same peaks at diffraction angles (2θ) as shown in FIG. 1.

[0082] In some embodiments, the crystalline Form A is characterized by a differential scanning calorimetry curve, wherein the differential scanning calorimetry curve comprises a melting peak at Tonset of about 120.2℃ and a recrystallization peak at Tonset of about, 133.5℃, and a melting peak at Tonset of about 191.5℃ with an enthalpy of about 75 J / g.

[0083] In some embodiments, the crystalline Form A is characterized by a differential scanning calorimetry curve, wherein the differential scanning calorimetry curve comprises a melting endothermic peak of from 190℃ to 200 ℃, preferably from 190℃ to 195℃, and more preferably about 193.6℃.

[0084] In certain embodiments, the differential scanning calorimetry curve is substantially similar to FIG. 2.

[0085] In some embodiments, the crystalline Form A is characterized by a thermogravimetric analysis curve, wherein the thermogravimetric analysis curve is substantially similar to FIG. 3.

[0086] In certain embodiments, the thermogravimetric analysis curve shows about 0.3%weight loss at about 120.0℃.

[0087] In some embodiments, the crystalline Form A is a metastable form.

[0088] In certain embodiments, the crystalline Form A can convert to crystalline Form C in an organic solvent at 25℃ and 50℃. Examples of the organic solvent include, but not limited to, ethanol, acetone, t-butyl methyl ester, tetrahydrofuran, ethyl acetate, isopropyl acetate, toluene,  and heptane.

[0089] In one general aspect, the invention relates to crystalline Form C of a compound of formula (I)

[0090] According to embodiments of the invention, the crystalline Form C is an anhydrate.

[0091] In some embodiments, Form C is characterized by an X-ray powder diffraction pattern, wherein the X-ray powder diffraction pattern comprises substantially the same peaks at diffraction angles (2θ) as shown in FIG. 5.

[0092] In some embodiments, the crystalline Form C is a single crystal, which has a unit cell dimensions comprising alpha=90 deg., beta=94.6337 (11) deg., gamma=90 deg.

[0093] In certain embodiments, the unit cell dimensions are substantially similar to those in Table 1.

[0094] In some embodiments, the crystalline Form C is characterized by a differential scanning calorimetry curve, wherein the differential scanning calorimetry curve comprises a melting peak at Tonset of about 191.2℃ with an enthalpy of about 71 J / g.

[0095] In some embodiments, the crystalline Form C is characterized by a differential scanning calorimetry curve, wherein the differential scanning calorimetry curve comprises a melting endothermic peak of from 190℃ to 200 ℃, preferably from 190℃ to 195℃, and more preferably about 192.6℃.

[0096] In certain embodiments, the differential scanning calorimetry curve is substantially similar to the differential scanning calorimetry curve in FIG. 7.

[0097] In some embodiments, the crystalline Form C is characterized by a thermogravimetric analysis curve, wherein the thermogravimetric analysis curve is substantially similar to the thermogravimetric analysis curve in FIG. 7.

[0098] In certain embodiments, the thermogravimetric analysis curve shows about 0.6%weight loss at about 200.0℃.

[0099] In some embodiments, the crystalline Form C is a thermodynamically stable anhydrate.

[0100] In certain embodiments, the crystalline Form C is stable in a. w. ≤ 0.4 at 25℃, and it converts to crystalline Form G in a. w. ≥ 0.6 at 25℃.

[0101] In one general aspect, the invention relates to crystalline Form G of a compound of  formula (I)

[0102] According to embodiments of the invention, the crystalline Form G is a dihydrate.

[0103] In some embodiments, Form G is characterized by an X-ray powder diffraction pattern, wherein the X-ray powder diffraction pattern comprises substantially the same peaks at diffraction angles (2θ) as shown in FIG. 9.

[0104] In some embodiments, the crystalline Form G is a single crystal, which has a unit cell dimensions comprising alpha=90 deg., beta=90 deg., gamma=90 deg.

[0105] In certain embodiments, the unit cell dimensions are substantially similar to those in Table 2.

[0106] In some embodiments, the crystalline Form G is characterized by a differential scanning calorimetry curve, wherein the differential scanning calorimetry curve comprises a dehydration peak at Tonset of 33.3℃ with an enthalpy of about 206 J / g and an exothermic peak at Tonset of 168.1℃ with an enthalpy of about 23 J / g, and an endothermic peak at Tonset of 193.7℃ with an enthalpy of about 76 J / g.

[0107] In some embodiments, the crystalline Form G is characterized by a differential scanning calorimetry curve, wherein the differential scanning calorimetry curve comprises a melting endothermic peak of from 190℃ to 200 ℃, preferably from 190℃ to 195℃, and more preferably about 194.4℃.

[0108] In certain embodiments, the differential scanning calorimetry curve is substantially similar to the differential scanning calorimetry curve in FIG. 10.

[0109] In some embodiments, the crystalline Form G is characterized by a thermogravimetric analysis curve, wherein the thermogravimetric analysis curve is substantially similar to the thermogravimetric analysis curve in FIG. 10.

[0110] In certain embodiments, the thermogravimetric analysis curve shows about 6.2%weight loss at about 65℃.

[0111] In some embodiments, the crystalline Form G is stable in a. w. ≥ 0.6 at 25℃.

[0112] In one general aspect, the invention relates to crystalline Form N of a compound of formula (I)

[0113] According to embodiments of the invention, the crystalline Form N is an anhydrate.

[0114] In some embodiments, Form N is characterized by an X-ray powder diffraction pattern, wherein the X-ray powder diffraction pattern comprises substantially the same peaks at diffraction angles (2θ) as shown in FIG. 15.

[0115] In some embodiments, the crystalline Form N is characterized by a differential scanning calorimetry curve, wherein the differential scanning calorimetry curve comprises an exothermic peak at Tonset of 164.1℃ with an enthalpy of about 23 J / g and an endothermic peak at Tonset of 193.8℃ with an enthalpy of about 83 J / g.

[0116] In some embodiments, the crystalline Form N is characterized by a differential scanning calorimetry curve, wherein the differential scanning calorimetry curve comprises a melting endothermic peak of from 190℃ to 200 ℃, preferably from 190℃ to 195℃, and more preferably about 194.3℃.

[0117] In certain embodiments, the differential scanning calorimetry curve is substantially similar to FIG. 14.

[0118] In some embodiments, the crystalline Form N is metastable.

[0119] In certain embodiments, the crystalline Form N is not stable at ambient condition.

[0120] Methods of Preparing Crystalline Forms

[0121] In one another general aspect, the invention presents methods of preparing the crystalline forms described herein.

[0122] According to embodiments of the invention, the crystalline forms can be prepared by recrystallization or equilibration with a solvent or a solvent mixture.

[0123] The recrystallization method is not particularly limited, and can be carried out by a conventional recrystallization process. For example, the material, i.e., the compound of formula (I) , can be dissolved in a solvent or a solvent mixture under heating, and then the solution is cooled slowly to precipitate a crystal. After the completion of crystallization, the desired crystal can be obtained via filtering and drying. The crystallization method of the present invention includes room temperature crystallization, cooling crystallization and the like.

[0124] The equilibration method can be carried out in a solvent or a solvent mixture at a room temperature (about 20 -30 ℃) or at an elevated temperature (such as 50-80 ℃) . The compound of formula (I) and the solvent or solvent mixture are mixed to forma a suspension, and the suspension is allowed to stir for a suitable amount of time to obtain the desired crystalline form.

[0125] Examples of the solvent that can be used in the recrystallization or the equilibration include, but not limited to, water, methanol, ethanol, isopropyl acetate, acetone, t-butyl methyl ether, tetrahydrofuran, acetonitrile, dichloromethane, ethyl acetate, methyl ethyl ketone, toluene, 2-propanol, heptane, heptane, 1, 4-dioxnae, or any combinations thereof.

[0126] The starting material used in the methods for preparing the crystalline forms of the present invention can be the compound of formula (I) in any form, and the specific forms include, but are not limited to, amorphous form, arbitrary crystal forms and the like.

[0127] In some embodiments, the invention presents a method of preparing the crystalline Form A.

[0128] In some embodiments, the method of preparing the crystalline Form A comprises recrystallizing the compound of formula (I) .

[0129] In certain embodiments, the method comprises dissolving the compound of formula (I) in acetonitrile or a mixture of acetonitrile and water to form a solution under heating, preferably under refluxing, and then cooling the solution to obtain the crystalline Form A.

[0130] In some embodiments, the invention presents a method of preparing the crystalline Form C.

[0131] In some embodiments, the method of preparing the crystalline Form C comprises suspending the compound of formula (I) in ethyl acetate to form a suspension, optionally adding a Form C seed, and stirring the suspension at a suitable temperature for a suitable period of time to obtain the crystalline Form C.

[0132] In certain embodiments, the ratio of the volume (ml) of ethyl acetate to the weight (gram) of the compound of formula (I) is about 2 to 10, preferably about 4-6, more preferably about 5.

[0133] In certain embodiments, the suitable temperature is about 30-70 ℃, preferably about 40-60 ℃, more preferably about 50 ℃.

[0134] In certain embodiments, the suitable period of time is about 1-5 days, preferably about 2-4 days, more preferably about 3 days.

[0135] In some embodiments, the method of preparing the crystalline Form C comprises dissolving the compound of formula (I) in 2-methyltetrahydrofuran to form a solution under heating, cooling the solution to a suitable temperature, adding heptane, and obtaining the crystalline Form C.

[0136] In certain embodiments, the ratio of the volume (ml) of the 2-methyltetrahydrofuran to the weight (gram) of the compound of formula (I) is about 3 to 11, preferably about 5 to 9, more preferably about 7.

[0137] In certain embodiments, the solution is formed at a temperature of about 45-85 ℃, preferably about 55-75 ℃, more preferably about 65 ℃.

[0138] In certain embodiments, the suitable temperature is about 10 to 30 ℃, preferably about 15 to 25 ℃, more preferably about 20 ℃.

[0139] In certain embodiments, the ratio of the volume (ml) of the added heptane to the weight (gram) of the compound of formula (I) is about 4 to 12, preferably about 6 to 10, more preferably about 8.

[0140] In certain embodiments, the method comprises optionally adding a Form C seed when the solution is cooled to a temperature of about 50 to 60 ℃, preferably about 55 ℃.

[0141] In some embodiments, the invention presents a method of preparing the crystalline Form G.

[0142] In some embodiments, the method of preparing the crystalline Form G comprises suspending the compound of formula (I) in a mixture of acetone and water to form a suspension, optionally adding a Form G seed, and stirring the suspension at a suitable temperature for a suitable period of time to obtain the crystalline Form G.

[0143] In certain embodiments, the volume ratio of acetone to water is about 0.5 to 2, preferably about 1.

[0144] In certain embodiments, the ratio of the volume (ml) of the mixture of acetone and water to the weight (gram) of the compound of formula (I) is about 2 to 10, preferably about 4-6, more preferably about 5.

[0145] In certain embodiments, the suitable temperature is about 20-40 ℃, preferably about 20-30 ℃, more preferably about 25 ℃.

[0146] In certain embodiments, the suitable period of time is about 2-10 days, preferably about 4-6 days, more preferably about 5 days.

[0147] In some embodiments, the invention presents a method of preparing the crystalline Form N.

[0148] In some embodiments, the method of preparing the crystalline Form N comprises heating crystalline Form G of the compound of formula (I) .

[0149] Pharmaceutical Compositions

[0150] In one another general aspect, the invention presents a pharmaceutical composition comprising an effective amount of, in particular a therapeutically effective amount of, at least one of the crystalline forms described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0151] As used herein, the term “carrier” refers to any excipient, diluent, buffer, stabilizer, or other material well known in the art for pharmaceutical formulations. Pharmaceutically acceptable carriers in particular are non-toxic and should not interfere with the efficacy of the active ingredient. The pharmaceutically acceptable carriers include excipients and / or additives suitable for use in the pharmaceutical compositions known in the art, e.g., as listed  in “Remington: The Science &Practice of Pharmacy” , 19th ed., Williams &Williams, (1995) , and in the “Physician's Desk Reference” , 52nd ed., Medical Economics, Montvale, N. J. (1998) , the disclosures of which are entirely incorporated herein by reference. Any conventional carrier or excipient may be used in the pharmaceutical compositions of the invention.

[0152] The choice of a particular carrier or excipient, or combinations of carriers or excipients, will depend on the mode of administration being used to treat a particular patient or type of medical condition or disease state. In this regard, the preparation of a suitable pharmaceutical composition for a particular mode of administration is well within the scope of those skilled in the pharmaceutical arts. Additionally, the carriers or excipients used in the pharmaceutical compositions of this invention are commercially-available. By way of further illustration, conventional formulation techniques are described in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Lippincott Williams &White, Baltimore, Maryland (2000) ; and H. C. Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Edition, Lippincott Williams &White, Baltimore, Maryland (1999) .

[0153] Representative examples of materials which can serve as pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, the following: sugars, such as lactose, glucose and sucrose; starches, such as corn starch and potato starch; cellulose, such as microcrystalline cellulose, and its derivatives, such as sodium carboxymethyl cellulose, ethyl cellulose and cellulose acetate; powdered tragacanth; malt; gelatin; talc; excipients, such as cocoa butter and suppository waxes; oils, such as peanut oil, cottonseed oil, safflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil and soybean oil; glycols, such as propylene glycol; polyols, such as glycerin, sorbitol, mannitol and polyethylene glycol; esters, such as ethyl oleate and ethyl laurate; agar; buffering agents, such as magnesium hydroxide and aluminum hydroxide; alginic acid; pyrogen-free water; isotonic saline; Ringer's solution; ethyl alcohol; phosphate buffer solutions; and other non-toxic compatible substances employed in pharmaceutical compositions.

[0154] The pharmaceutical compositions of the disclosure are preferably packaged in a unit dosage form. The term "unit dosage form" refers to a physically discrete unit suitable for dosing a patient, i.e., each unit containing a predetermined quantity of active agent calculated to produce the desired therapeutic effect either alone or in combination with one or more additional units. For example, such unit dosage forms may be capsules, tablets, pills, and the like, or unit packages suitable for parenteral administration.

[0155] The pharmaceutical composition disclosed herein can be administrated via oral,  inhalation, rectal, parenteral or topical administration to a subject in need thereof. For oral administration, the pharmaceutical composition may be a regular solid formulation such as tablets, powder, granule, capsules and the like, a liquid formulation such as water or oil suspension or other liquid formulation such as syrup, solution, suspension or the like; for parenteral administration, the pharmaceutical composition may be solution, water solution, oil suspension concentrate, lyophilized powder or the like. Preferably, the formulation of the pharmaceutical composition is selected from tablet, coated tablet, capsule, suppository, nasal spray or injection, more preferably tablet or capsule. The pharmaceutical composition can be a single unit administration with an accurate dosage. In addition, the pharmaceutical composition may further comprise additional active ingredients.

[0156] All formulations of the pharmaceutical composition disclosed herein can be produced by the conventional methods in the pharmaceutical field. For example, the active ingredient can be mixed with one or more excipients, then to make the desired formulation.

[0157] Methods of Use

[0158] In one another general aspect, the invention presents the uses of the crystalline forms or the pharmaceutical compositions of the invention, particularly the uses as A2a receptor antagonists.

[0159] In one embodiment, the invention presents a method of treating a disease or disorder in which A2a is implicated, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the crystalline form or the pharmaceutical composition described herein.

[0160] In one embodiment, the invention presents a use of the crystalline form or the pharmaceutical composition in the preparation of a medicament for the treatment of a disease or disorder.

[0161] In certain embodiments, the disease or disorder is one in which A2a receptor activity is implicated.

[0162] In certain embodiments, the disease or disorder is cancer, particularly solid tumors such as lung cancer.

[0163] In certain embodiments, the lung cancer is non-small cell lung cancer.

[0164] Examples

[0165] The following specific examples are used to further describe the particular aspects of the invention, but these examples are not intended to limit the scope of the invention in any way.

[0166] List of Abbreviations: SM           Starting Material DP           Desired Product XRPD         X-Ray Powder Diffraction DSC          Differential Scanning Calorimetry TGA          Thermogravimetric Analysis AcOH         Acetic acid DIPEA / DIEA   N, N-Diisopropylethylamine DMF          N, N-Dimethylformamide DMP          Dess-Martin periodinane EDCI         1- (3-Dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride EEDQ         2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1, 2-dihydroquinoline Et2O         Ethyl Ether EtOAc        Ethyl acetate EtOH         Ethanol HATU         O- (7-Azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N', N'-tetramethyluronium  hexafluorophosphate HOBt         1-Hydroxybenzotriazole IMS          Industrial Methylated Spirit MeCN / ACN     Acetonitrile MeOH         Methanol 2-Me-THF     2-Methyltetrahydrofuran MMAE         Monomethyl auristatin E NBS          N-Bromosuccinimide PTSA         p-Toluenesulfonic acid Prep-HPLC    Preparative high performance liquid chromatography TEA          Triethyl amine TFA          Trifluoroacetic acid THF          Tetrahydrofuran MTBE         Methyl Tert-Butyl Ether IPAc         Isopropyl Acetate

[0167] Example 1. Preparation of Compound of Formula (I)

[0168] The compound of formula (I) was prepared according to Scheme 1:

[0169] Scheme 1

[0170] Step 1 - Cyclisation

[0171] A solution of diethyl acetylenedicarboxylate (119.66 mL, 747.5mmol) in IMS (50 mL) was added drop-wise over 20 mins to a stirred solution of 3- (5-amino-1H-pyrazol-3-yl) benzonitrile (98.35 g, 533.93mmol) and acetic acid (152.82 mL, 2669.7mmol) in IMS (1475mL) , during which time there was slight warming to an internal temperature of 35 ℃ and a precipitate began to form. The resulting mixture was then stirred at room temperature for 64 hours after which time UPLCMS analysis showed complete consumption of SM (starting material) and formation of the DP (desired product) . The suspension was cooled in an ice bath, filtered and the collected solids washed with IMS (2 x 500 mL) , Et2O (3 x 500 mL) and vacuum dried to afford ethyl 2- (3-cyanophenyl) -7-hydroxy-pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxylate (131g, 424.92 mmol, 80%yield) as a cream solid.

[0172] LC-MS: m / z 309.1 = [M+H] +

[0173] 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 13.11 (br s, 1H) , 8.44 (br t, J= 1.5 Hz, 1H) , 8.35 (br dt, J= 8.0, 1.5 Hz, 1H) , 7.90 (br dt, J= 7.6, 1.5 Hz, 1H) , 7.70 (apr t, J= 7.8 Hz, 1H) , 6.85 (s, 1H) , 6.33 (s, 1H) , 4.42 (q, J= 7.1 Hz, 2H) , 1.37 (t, J= 7.1 Hz, 3H) .

[0174] Step 2 - Chlorination

[0175] Ethyl 2- (3-cyanophenyl) -7-hydroxy-pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxylate (131.0 g, 424.92mmol) was suspended in POCl3 (619.91 mL, 8498.5mmol) and the resulting mixture was stirred at gentle reflux at 110 ℃ for 5 hours after which time UPLCMS analysis showed consumption of starting material SM and formation of the DP. The mixture was allowed to  cool before being concentrated in vacuo at 45 ℃. The resulting residue was azeotroped with toluene (3 x 600 mL) to afford an orange residue. The flask was placed in an ice bath and chilled MeOH (600 mL) was added cautiously. After addition of the solvent, the mixture was stirred for 20 minutes at room temperature before the solid was collected by filtration. The solid was thoroughly washed with MeOH (4 x 400mL) before being dried to afford ethyl 7-chloro-2- (3-cyanophenyl) pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxylate (128g, 391.75mmol, 92%yield) as a yellow solid.

[0176] LC-MS : m / z 327.0  / 329.0 = [M+H] +

[0177] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.55 (t, J= 1.8 Hz, 1H) , 8.45 (td, J= 7.8, 1.8 Hz, 1H) , 7.96 (td, J= 7.8, 1.8 Hz, 1H) , 7.87 (s, 1H) , 7.84 (s, 1H) , 7.77 (t, J= 7.8 Hz, 1H) , 4.42 (q, J= 7.1 Hz, 2H) , 1.38 (t, J= 7.1 Hz, 3H) .

[0178] Step 3- Hydrogenation

[0179] Ethyl 7-chloro-2- (3-cyanophenyl) pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxylate (53.43 g, 163.52mmol) was placed in a flat-bottomed 3-neck 5L flask equipped with a triangular cross-section rod stirrer bar. Palladium on carbon (10%) (4.35 g, 4.09mmol) was then added, followed by ethyl acetate (3200mL) and triethylamine (113.96 mL, 817.62mmol) , and the necks sealed. Under vigorous stirring the flask contents were evacuated and backfilled with nitrogen (3 x cycles) , then evacuated and backfilled with hydrogen (5 x cycles) and stirred vigorously at room temperature with two hydrogen balloons fitted. After 75 mins, UPLCMS analysis showed consumption of SM and formation of the DP as an indeterminate mixture of dechlorinated and over reduced product (alongside a possible trace quantity of the bis over-reduced species) . The resulting suspension was diluted portion-wise into approx. twice the volume of chloroform (6L) to solubilize the mixture, which was then filtered through a plug of Celite, eluting with chloroform (4 x 500 mL) . The combined filtrates were concentrated in vacuo to afford the crude material as a yellow solid (69.4 g) . UPLCMS analysis of this material showed only a single peak consisting of a co-eluting mixture of the two products. NMR analysis showed a ～ 5 : 1 ratio of ethyl 2- (3-cyanophenyl) pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxylate (39.83g, 136.27 mmol, 83%yield) and ethyl 2- (3-cyanophenyl) -4, 7-dihydropyrazolo [1, 5-a]pyrimidine-5-carboxylate (8.02g, 27.255mmol, 17%yield) as well as ～ 1 equiv of Et3N. HCl. The material was taken into the subsequent oxidation without further purification.

[0180] LC-MS: m / z 293.1  / 295.1 = [M+H] +

[0181] Step 4 - Oxidation

[0182] Activated Manganese dioxide (142.18 g, 1635.4mmol) was added to the solution of a crude mixture of ethyl 2- (3-cyanophenyl) pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxylate and ethyl 2- (3- cyanophenyl) -4, 7-dihydropyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxylate (95.71 g, 327.08mmol) in chloroform (3200mL) and the resulting mixture stirred vigorously at room temperature for 3 hours, after which time UPLCMS analysis showed no visible change in the UV trace but complete consumption of the SM and formation of the desired product on manual analysis of the mass data. The mixture was filtered through a plug of Celite, eluting with chloroform (4 x 1000 mL) until the filtrates ran colorless. The combined filtrates were then concentrated in vacuo to approximately 2000 mL. The combined aqueous portions were then washed with chloroform (500 mL) and the combined organic portions were dried over Na2SO4, filtered and concentrated in vacuo to afford crude ethyl 2- (3-cyanophenyl) pyrazolo [1, 5-a]pyrimidine-5-carboxylate (92.9g, 317.84mmol, 97%yield) [N103-95-1] as a yellow solid.

[0183] LC-MS: m / z 293.1 = [M+H] +

[0184] 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.31 (d, J= 7.2 Hz, 1H) , 8.51 (t, J= 1.8 Hz, 1H) , 8.40 (d, J= 7.8 Hz, 1H) , 7.93 (d, J= 7.8 Hz, 1H) , 7.74 (t, J= 7.8 Hz, 1H) , 7.66 (s, 1H) , 7.55 (d, J= 7.2 Hz, 1H) , 4.40 (q, J= 7.1 Hz, 2H) , 1.37 (t, J= 7.1 Hz, 3H) .

[0185] Step 5- Bromination

[0186] NBS (67.88 g, 381.4mmol) was added in one-portion to a stirred partial suspension of ethyl 2- (3-cyanophenyl) pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxylate (92.9 g, 317.84mmol) in DMF (1590mL) after which the solids soon dissolved and the mixture was stirred at room temperature for 60 mins, after which time UPLCMS analysis showed complete consumption of SM and formation of the DP as the sole UV active species. The mixture was cooled in an ice bath before water (3200 mL) was added slowly [NB -moderate exotherm. Maximum internal temperature reached was 35 ℃] . The resulting suspension was stirred in the ice bath for 5 mins, then at room temperature for 30 mins before the solid was collected by filtration. The collected solids were washed with water (4 x 800 mL) and vacuum dried to afford ethyl 3-bromo-2- (3-cyanophenyl) pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxylate (115.2g, 310.35mmol, 98%yield) as a yellow solid.

[0187] LC-MS: m / z 373.1 = [M+H] +

[0188] 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.40 (d, J= 7.2 Hz, 1H) , 8.41 (br t, J= 1.5 Hz, 1H) , 8.37 (br dt, J= 8.0, 1.5 Hz, 1H) , 8.03 (br dt, J= 7.8, 1.5 Hz, 1H) , 7.82 (apr t, J= 7.9 Hz, 1H) , 7.67 (d, J= 7.2 Hz, 1H) , 4.44 (q, J= 7.1 Hz, 2H) , 1.39 (t, J= 7.1 Hz, 3H) .

[0189] Step 6 -Suzuki coupling

[0190] A partial suspension of sodium bicarbonate (33.38 g, 397.37mmol) in water (295mL) was added to a solution of ethyl 3-bromo-2- (3-cyanophenyl) pyrazolo  [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxylate (59. g, 158.95mmol) in 1, 4-dioxane (1180mL) , and the resulting mixture de-oxygenated via nitrogen sparging for 15 mins. Pd (tBu3P) 2 (4.06 g, 7.95mmol) and 2, 6-dimethyl-4- (4, 4, 5, 5-tetramethyl-1, 3, 2-dioxaborolan-2-yl) pyridine (44.46 g, 190.74mmol) were then added and the contents evacuated and backfilled with nitrogen (3 x cycles) . The mixture was then stirred at 50 ℃ for 3.5 hours after which time UPLCMS analysis showed complete consumption of SM and formation of the DP as the sole UV active species. The mixture was cooled to room temperature, poured into water (3000 mL) and the resulting suspension was stirred vigorously for 10 mins before the solid was collected by filtration. The solids were washed with water (2 x 1500 mL -fully homogenising the suspension each time before re-applying vacuum) and then vacuum dried on the sinter overnight to afford a spongey, pale yellow solid (67.4 g) . This material was slurried in MeCN (600 mL) and concentrated in vacuo to azeotrope out the residual water and dioxane, affording a yellow-brown solid (65.6 g) . This material was re-dissolved in chloroform (300 mL) , activated decolourising charcoal (3 g) added, and the mixture stirred at reflux for 10 mins. The mixture was then cooled to room temperature before being filtered through a plug of Celite, eluting with chloroform (3 x 200 mL) until the filtrates ran colorless. The combined filtrates were concentrated in vacuo to afford a yellow solid (64.5 g) . The solid was broken up then triturated with MeCN (200 mL) via sonication and agitation, and the resulting fine yellow suspension filtered. The collected solids were washed with MeCN (2 x 100 mL) then vacuum dried on the sinter to constant weight, affording ethyl 2- (3-cyanophenyl) -3- (2, 6-dimethyl-4-pyridyl) pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxylate (53.63g, 134.94mmol, 85%yield) as a pale yellow solid.

[0191] LC-MS: m / z 398.2 = [M+H] +

[0192] 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.50 (d, J= 7.2 Hz, 1H) , 8.11 (s, 1H) , 8.06 (d, J= 7.8 Hz, 1H) , 7.94 (d, J= 8.1 Hz, 1H) , 7.80 –7.74 (m, 2H) , 7.25 (s, 2H) , 4.49 (q, J= 7.1 Hz, 2H) , 2.50 (s, 6H) , 1.46 (t, J= 7.1 Hz, 3H) .

[0193] Step 7 - Ester hydrolysis

[0194] A solution of LiOH (3.56 g, 148.44mmol) in water (300mL) was added to a stirred partial suspension of ethyl 2- (3-cyanophenyl) -3- (2, 6-dimethyl-4-pyridyl) pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxylate (53.63 g, 134.94mmol) in THF (900mL) , after which the solids soon dissolved, and the resulting clear yellow-green solution stirred at room temperature for 45 mins, after which time UPLCMS analysis showed complete consumption of SM and formation of the DP as the sole UV active species. The mixture was diluted with  water (1200 mL) and extracted with Et2O (3 x 1500 mL) . To the resulting aqueous lithiate solution was added commercial 1M analytical grade HCl solution (147 mL) [resulting in a pH of ～ 5] , followed by re-adjustment to pH 6 via addition of 10%aqueous NaOH (30 drops) resulting in the formation of a thick yellow precipitate. The suspension was stirred at room temperature for 15 mins before being filtered. The solids were washed with water (2 x 500 mL) and vacuum dried on the sinter overnight. The solids were then mechanically broken up, placed in a wide dish and dried to constant weight in a vacuum oven at 40 ℃ (alongside a tray of KOH flakes as desiccant) to afford 2- (3-cyanophenyl) -3- (2, 6-dimethyl-4-pyridyl) pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxylic acid (49.77g, 134.74mmol, 99%yield) as a pale yellow solid.

[0195] LC-MS: m / z 370.2 = [M+H] +

[0196] 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 13.68 (br s, 1H) , 9.37 (d, J= 7.2 Hz, 1H) , 8.01 (s, 1H) , 7.96 (d, J= 7.7 Hz, 1H) , 7.84 (d, J= 7.9 Hz, 1H) , 7.67 (apr t, J= 7.8 Hz, 1H) , 7.65 (d, J= 7.2 Hz, 1H) , 7.16 (s, 2H) , 2.41 (s, 6H) .

[0197] Step 8 - T3P amide coupling

[0198] A solution of DIPEA (187.75 mL, 1077.9mmol) in anhydrous THF (1000mL) was added to 2- (3-cyanophenyl) -3- (2, 6-dimethyl-4-pyridyl) pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxylic acid (49.77 g, 134.74mmol) under nitrogen, and the resulting mixture stirred until all of the solids had dissolved. (3S) -3-amino-2-methyl-butan-2-ol hydrochloride (28.22 g, 202.11mmol) was then added and the mixture stirred for 5 mins to homogenise the suspended solids. A solution of T3P (50%in THF) (198.44 mL, 269.48mmol) was then added drop-wise via dropping funnel over 20 mins [NB -slight warming of the mixture, and the solids dissolved quickly once the T3P addition had begun. The mixture turned from clear to cloudy part way through the addition, then cleared again by the end of the addition] . The residues in the dropping funnel were washed into the reaction mixture with more anhydrous THF (10mL) , and the resulting mixture was stirred at room temperature for 45 mins, after which time basic UPLCMS analysis showed complete consumption of SM and formation of the DP as the sole UV active species. The mixture was diluted with EtOAc (500 mL) and water (500 mL) , then agitated until all of the solids had dissolved. The layers were separated and the aqueous portion extracted with EtOAc (500 mL) . The combined organic portions were washed with water (2 x 500 mL) , brine (250 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated in vacuo to afford a yellow foam (64.8 g) . This material was slurried and azeotroped with EtOAc then vacuum dried to afford crude 2- (3-cyanophenyl) -3- (2, 6-dimethyl-4-pyridyl) -N- [ (1S) -2-hydroxy-1, 2-dimethyl-propyl] pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxamide (58 g,  127.61mmol, 95%yield) as a yellow solid.

[0199] LC-MS: m / z 455.3 = [M+H] +

[0200] 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.41 (d, J= 7.1 Hz, 1H) , 8.27 (d, J= 8.9 Hz, 1H) , 8.06 (s, 1H) , 7.99 (d, J= 7.8 Hz, 1H) , 7.91 (d, J= 7.9 Hz, 1H) , 7.73 –7.67 (m, 2H) , 7.21 (s, 2H) , 4.77 (s, 1H) , 3.90 –3.82 (m, 1H) , 2.40 (s, 6H) , 1.19 (s, 3H) , 1.18 –1.14 (m, 6H) .

[0201] Step 9 - Final recrystallisation

[0202] 2-(3-cyanophenyl) -3- (2, 6-dimethyl-4-pyridyl) -N- [ (1S) -2-hydroxy-1, 2-dimethyl-propyl] pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxamide (115.9 g, 254.99mmol) was dissolved in the minimum volume of refluxing MeCN (3150mL) , then the flask left in the oil bath and the contents slowly allowed to cool to room temperature overnight. The suspension was filtered and the collected solids washed with chilled (5 ℃) MeCN (2 x 200 mL) , then vacuum dried on the sinter for 1h to afford large yellow crystals (112.8 g) . UPLCMS analysis of this material showed 100%purity, and NMR analysis showed a clean product as well as ～ 7.1 wt%residual MeCN. The crystallized solids were ground into a fine pale yellow powder with a mortar and pestle and dried in a vacuum oven at 55 ℃ until the MeCN was removed to afford the API, i.e., 2- (3-cyanophenyl) -3- (2, 6-dimethyl-4-pyridyl) -N- [ (1S) -2-hydroxy-1, 2-dimethyl-propyl] pyrazolo [1, 5-a] pyrimidine-5-carboxamide (101.36g, 220.77mmol, 87%yield) as a pale yellow powder. The powder obtained was characterized by XRPD (FIG. 1) to be crystalline Form A. Form A (1.6%water) is a non-stoichiometric channel hydrate that shows a slightly different XRPD pattern as a function of its water content. The DSC, TGA, and 1H-NMR of Form A are shown in FIGs. 2-4.

[0203] LC-MS: m / z 455.3 = [M+H] +

[0204] Chemical purity as determined: 99.3%Enantiomeric

[0205] excess as determined: > 9.9%

[0206] 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.39 (d, J = 7.1 Hz, 1H) , 8.25 (d, J = 8.9 Hz, 1H) , 8.04 (s, 1H) , 7.98 (d, J = 7.7 Hz, 1H) , 7.89 (d, J = 8.0 Hz, 1H) , 7.70 (apr t, J = 7.8 Hz, 1H) , 7.68 (d, J = 7.1 Hz, 1H) , 7.19 (s, 2H) , 4.77 (s, 1H) , 3.89 –3.82 (m, 1H) , 2.39 (s, 6H) , 1.19 (s, 3H) , 1.18 –1.13 (m, 6H) .

[0207] 13C NMR (126 MHz, DMSO) δ 161.26 (C) , 157.38 (2 x C) , 152.47 (C) , 150.28 (C) , 144.71 (C) , 138.81 (C) , 137.71 (CH) , 133.57 (CH) , 133.42 (C) , 132.96 (CH) , 132.07 (CH) , 130.11 (CH) , 119.71 (2 x CH) , 118.31 (C) , 111.94 (C) , 107.07 (CH) , 106.47 (C) , 70.36 (C) , 53.07 (CH) , 27.07 (CH3) , 26.56 (CH3) , 24.04 (2 x CH3) , 15.33 (CH3) .

[0208] Alternatively, the API was recrystallized from MeCN / water to give the product in the  Form A.

[0209] Example 2. Polymorph Screening

[0210] The polymorph screening of the compound of formula (I) was performed using the product from Example 1 as a starting material. The solid form landscape was investigated by equilibration, slow cooling, fast cooling, slow evaporation, fast evaporation and anti-solvent addition experiments.

[0211] Form A

[0212] Form A is a hygroscopic anhydrate. It was obtained from ACN or ACN / water mixture by equilibration experiments at 25℃. DSC (FIG. 2) shows a melting peak at Tonset of 120.2℃ and a recrystallization peak at Tonset of 133.5℃. Then it melts at Tonset of 191.5℃ with an enthalpy of about 75J / g. TGA (FIG. 3) shows about 0.3%weight loss at about 120.0℃. HPLC shows 98.2%chemical purity. 1HNMR shows no solvent residue. It is confirmed to be a metastable form. Competitive equilibration experiments show that the Form A converted to Form C in all of the selected solvents at 25℃ and 50℃.

[0213] Form C

[0214] Form C of the compound of formula (I) was obtained from 1) equilibration in ethanol (EtOH) , acetone, methyl tert-butyl ether (MTBE) , tetrahydrofuran (THF) , ethyl acetate (EA) , toluene, heptane; slow evaporation in acetone, MTBE, THF, isopropyl acetate (IPAc) , EA; 2) fast evaporation in EtOH, acetone, MTBE, THF, IPAc, EA; 3) slow cooling in IPAc, EA; 4) fast cooling in IPAc, EA; or 5) anti-solvent experiments in EtOH / heptane, EA / heptane.

[0215] Form C is a crystalline (FIG. 5) anhydrous form with a melting point of 192.6℃ (FIG. 7) that is slightly hygroscopic (FIG. 8) .

[0216] The crystal structure of Form C was solved at 25℃ in the monoclinic, space group P21 with the final R1= [I>2s (I) ] = 4.84 %. A summary of the structural data can be found in Table 15. The asymmetric unit contains two molecules of the compound of formula (I) (Table 1, FIG. 6) .

[0217] Table 1. Crystal structure data of Form C measured at 25℃

[0218] Form C is a thermodynamically stable anhydrate at 15℃ and at higher temperatures. Water activity experiment results show it is stable in a. w. ≤ 0.4 at 25℃, and it converts to Form G in a. w. ≥ 0.6 at 25℃.

[0219] Form G

[0220] Form G of the compound of formula (I) was obtained from equilibration experiments in water, EtOH / water, or acetone / water.

[0221] Form G is a crystalline (FIG. 9) dihydrate that desolvates upon heating (FIG. 10) and the resulting anhydrate (Form N) recrystallizes to Form C around 168℃ (FIGs. 10 and 13) . The sorption isotherm of Form G (FIG. 11) shows that Form G dehydrates below 30%RH, forming Form N, but its dehydration and rehydration is reversible, in agreement with the channel-like arrangement of water molecules in the lattice as seen in the crystal structure (FIG. 12, Table 2) . The distinct, step-like sorption curves and hysteresis between the sorption and the desorption isotherms are indicative of a phase transformation (between Form N and Form G) , typically observed for stoichiometric hydrates.

[0222] Table 2. Crystal structure data of Form G measured at 100 K

[0223] The channel-hydrate nature and reversible dehydration / hydration is also evidenced by the VT-XRD results (FIG. 13, Table 3) . Water activity experiment results showed that Form G is stable in a. w. ≥ 0.6 at 25℃.

[0224] Table 3. Variable temperature XRPD (VT-XRPD) experiment of Form G

[0225] Variable temperature XRD was applied to monitor the phase transformations of Form G (FIG. 13) . The initial XRPD analysis was carried out at ambient condition, all the other XRPD analysis was carried out in nitrogen atmosphere at each specific temperature. Cycle 1: 25℃ (initial) -80℃ (10min) -25℃ (10min) . XRPD experiment results show that Form G converted to Form N after dehydration by heating to 80℃, and the Form N converted back to Form G after exposure to ambient condition for 9 days (FIG. 13) .

[0226] Form N

[0227] Form N was an anhydrate and was obtained from heating Form G to 80℃ by hot-stage XRPD. Form N is a metastable phase (Table 3) that converts to Form C upon heating (FIG. 14) . The XRPD of Form N is shown in FIG. 15.

[0228] Example 3. Preparation of Form C

[0229] Form C was prepared at 300 mg scale using the procedure below.

[0230] ● 300 mg of Pattern A (from Example 1) was weighed into an 8mL vial. 1.6mL EA was added into the vial under stirring at 50℃ with 400 rpm to form a suspension.

[0231] ● About 5mg of Pattern C seeds were added into above suspension.

[0232] ● The suspension was kept stirring at 50℃ with 400 rpm for 3 days.

[0233] ● Solids were collected by centrifugation at 4,000 rpm for 5min and dried at ambient condition for 1 day.

[0234] About 188 mg of Form C was obtained as a yellow solid in 63%yield. The characterization is listed in Table 4.

[0235] Table 4. Characterization and study of Form C

[0236] Example 4. Crystallization Process of Form C

[0237] The API of the compound of formula (I) was synthesized through an amide formation reaction between the acid and amino alcohol in the presence of T3P as shown in Example 1. The crystallization of Form C has been developed in 2-methyl tetrahydrofuran.

[0238] Crystallization procedure of Form C:

[0239] ● Suspended 5 g API in 35 mL (7X) 2-Me-THF in Easymax and heated to 65 ℃ over 1h for dissolution.

[0240] ● Cooled down to 55 ℃ over 30 min, seeded with 1%of Form C crystals and held for 2h.

[0241] ● Cooled further down to 20 ℃ over 4h and charged 35 mL heptane (7X) over 2h.

[0242] ● Then charged 5 mL heptane and aged for 2h. Total volume: 15X, 2-Me-THF: Heptane (7: 8) .

[0243] ● Filtered the solid, slurry wash (18 mL heptane) , displacement wash (18 mL heptane) , collected the solids.

[0244] ● Dried in vacuum oven at room temperature to obtain the free flowing solid.

[0245] Outcome: solid: 4.60 g, 92%IY. LCAP: 99%, 97.9 wt%, plate-like crystals (FIG. 16) .

[0246] In addition, Form C has been obtained by the above recrystallization process from 2-Me-THF / heptane in 40 gram scale and 6Kg scale.

[0247] Example 5. Preparation of Form G

[0248] Form G was prepared at 200 mg scale using the procedure below.

[0249] ● 200 mg of Pattern A (from Example 1) was weighed into an 8mL vial. 1 mL acetone / water-1 / 1 was added into the vial under stirring at 25℃ with 400 rpm to form a suspension.

[0250] ● About 5mg of Pattern G seeds were added into above suspension.

[0251] ● The suspension was kept stirring at 25℃ with 400 rpm for 5 days.

[0252] ● Solids were collected by centrifugation at 14,000 rpm for 5min.

[0253] About 160 mg of Form G was obtained as a yellow solid in 80%yield and dried at ambient condition for 1 day. The characterization is listed in Table 5.

[0254] Table 5. Characterization and study of Form G

[0255] Example 6. Stability Testing

[0256] Bulk stability of Form G was evaluated at 25℃ / 92%RH in an open container, at 40℃ / 75%RH in an open container and at 60℃ in a tight container for 1 week. Form G was chemically stable under these conditions, but it partially dehydrated at 60℃ (Table 6) .

[0257] Table 6. Bulk stability of Form G

[0258] Bulk stability of Form C was evaluated at 25℃ / 92%RH in an open container, at 40℃ / 75%RH in an open container and at 60℃ in a tight container for 4 weeks. Form C was physically and chemically stable under these conditions (Table 7) .

[0259] Table 20 -Bulk stability of Form C

[0260] It will be appreciated by those skilled in the art that changes could be made to the embodiments described above without departing from the broad inventive concept thereof. It is understood, therefore, that this invention is not limited to the particular embodiments disclosed, but it is intended to cover modifications within the spirit and scope of the present inventions as defined by the specific description.

Claims

1.Crystalline Form A of a compound of formula (I) characterized by an X-ray powder diffraction pattern, wherein the X-ray powder diffraction pattern comprises substantially the same peaks at diffraction angles (2θ) as shown in FIG. 1.2.The crystalline Form A according to claim 1, characterized by a differential scanning calorimetry curve comprising a melting endothermic peak of from 190℃ to 200 ℃, preferably from 190℃ to 195℃, and more preferably about 193.6℃.3.The crystalline Form A according to claim 1 or 2, characterized by a differential scanning calorimetry curve, wherein the differential scanning calorimetry curve is substantially similar to FIG. 2.4.The crystalline Form A according to any one of claims 1-3, characterized by a thermogravimetric analysis curve, wherein the thermogravimetric analysis curve is substantially similar to FIG. 3.5.A method of preparing the crystalline Form A according to any one of claims 1-4, comprising dissolving the compound of formula (I) in acetonitrile or a mixture of acetonitrile and water to form a solution under heating, and then cooling the solution to obtain the crystalline Form A.6.Crystalline Form C of a compound of formula (I) characterized by an X-ray powder diffraction pattern, wherein the X-ray powder diffraction pattern comprises substantially the same peaks at diffraction angles (2θ) as shown in FIG. 57.The crystalline Form C according to claim 6, characterized by a differential scanning calorimetry curve comprising a melting endothermic peak of from 190℃ to 200 ℃, preferably from 190℃ to 195℃, and more preferably about 192.6℃.8.The crystalline Form C according to claim 6 or 7, characterized by a differential scanning calorimetry curve, wherein the differential scanning calorimetry curve is substantially similar to the differential scanning calorimetry curve in FIG. 79.The crystalline Form C according to any one of claims 6-8, characterized by a thermogravimetric analysis curve, wherein the thermogravimetric analysis curve is substantially similar to the thermogravimetric analysis curve in FIG. 7.10.A method of preparing the crystalline Form C according to any one of claims 6-9, comprisinga) suspending the compound of formula (I) in ethyl acetate to form a suspension, optionally adding a Form C seed, and stirring the suspension at a suitable temperature for a suitable period of time to obtain the crystalline Form C; orb) dissolving the compound of formula (I) in 2-methyltetrahydrofuran to form a solution under heating, cooling the solution to a suitable temperature, adding heptane, and obtaining the crystalline Form C.11.Crystalline Form G of a compound of formula (I) characterized by an X-ray powder diffraction pattern, wherein the X-ray powder diffraction pattern comprises substantially the same peaks at diffraction angles (2θ) as shown in FIG. 912.The crystalline Form G according to claim 11, characterized by a differential scanning calorimetry curve comprising a melting endothermic peak of from 190℃ to 200 ℃, preferably from 190℃ to 195℃, and more preferably about 194.4℃.13.The crystalline Form G according to claim 11 or 12, characterized by a differential scanning calorimetry curve, wherein the differential scanning calorimetry curve is substantially similar to the differential scanning calorimetry curve in FIG. 10.14.The crystalline Form G according to any one of claims 11-13, characterized by a thermogravimetric analysis curve, wherein the thermogravimetric analysis curve is substantially similar to the thermogravimetric analysis curve in FIG. 10.15.A method of preparing the crystalline Form G according to any one of claims 11-14, comprising suspending the compound of formula (I) in a mixture of acetone and water to form a suspension, optionally adding a Form G seed, and stirring the suspension at a suitable temperature for a suitable period of time to obtain the crystalline Form G.16.Crystalline Form N of a compound of formula (I) characterized by an X-ray powder diffraction pattern, wherein the X-ray powder diffraction pattern comprises substantially the same peaks at diffraction angles (2θ) as shown in FIG. 1517.The crystalline Form N according to claim 16, characterized by a differential scanning calorimetry curve comprising a melting endothermic peak of from 190℃ to 200 ℃, preferably from 190℃ to 195℃, and more preferably about 194.3℃.18.The crystalline Form N according to claim 16 or 17, characterized by a differential scanning calorimetry curve, wherein the differential scanning calorimetry curve is substantially similar to FIG. 14.19.A method of preparing the crystalline Form N according to any one of claims 16-18, comprising heating crystalline Form G of the compound of formula (I) .20.A pharmaceutical composition comprising an effective amount of the crystalline form according to any one of the foregoing claims, and a pharmaceutically acceptable carrier.21.A method for treating a disease or disorder in which A2a is implicated, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the pharmaceutical composition according to claim 20.

Images