Fusion proteins and uses thereof

Abstract

Provided herein are engineered T cell receptors (TCRs), specifically to TCR-based bispecific / multispecific fusion proteins comprising one or more additional antigen-binding domains, the compositions thereof, and methods of using the same.

Description

FUSION PROTEINS AND USES THEREOF

[0001] Cross-reference to related applications

[0002] This application is based on the PCT application with Application No. PCT / CN2023 / 143381, filed on December 29, 2023, and PCT / CN2024 / 140003 filed on December 17, 2024, and claims priority to the aforementioned applications, the entire contents of which are hereby incorporated by reference into this application.Technical Field

[0003] The present disclosure relates to engineered T cell receptors (TCRs) , specifically to TCR-based bispecific / multispecific fusion proteins comprising one or more additional antigen-binding domains, the compositions thereof, and methods of using the same.Background

[0004] T cell receptors (TCRs) are the adaptive immune system’s tool for recognizing and eliminating “non-self” intracellular antigens. One TCR is composed of two different protein chains. In humans, the majority T cells express TCRs consisting of alpha (α) chain and beta (β) chain (encoded by TRA and TRB, respectively) , whereas a small population of T cells express TCRs consisting of gamma (γ) and delta (δ) chains (encoded by TRG and TRD, respectively) . α / β TCRs are expressed on both CD8+ and CD4+ T cells and recognize peptide antigens displayed on cell surfaces when complexed with human leukocyte antigens (HLA)  / major histocompatibility complex (MHC) and this interaction induces T cell activation and elimination of tumor cells displaying the specific MHC / peptide complexes.

[0005] It is widely established that tumor immune-rejection is T cell mediated and the antitumor T cell response is antigen-specific1. Approaches of TCR-engineered adoptive cell transfer (ACT) treatment showed objective tumor regressions in the clinic2 3 4. Alternatively, the use of the soluble extracellular region of the TCR fused to an antibody fragment that recognizes an activating TCR subunit, commonly CD3ε, has been used to redirect endogenous T cells to target tumor cells5 6 7. The first TCR / anti-CD3 bispecific fusion protein Tebentafusp showed clinical benefits in uveal melanoma patients8 and was approved by FDA recently.

[0006] However, TCR assembly and expression remains challenging. α / β TCRs express poorly with less reliable assembly than antibodies5. Tebentafusp molecule is constructed with “ImmTac” technology which fuses an anti-CD3 scFv to the c-terminus of an optimized heterodimeric α / β TCR. But the molecule is expressed in a complex Escherichia coli (E. coli) expression system. Instead of heterodimeric α / β TCRs, some researchers have tried using only the variable domain regions of TCRs in a single chain format or scTv, like an antibody single chain Fv (scFv) , for targeting specific HLA / peptide complexes. While scFvs have shown a propensity for instability, aggregation, and low solubility, scTvs have generally shown even worse expression and stability issues. Great efforts have been made to engineer scTvs for therapeutic and diagnostic use. Unfortunately, the high diversity of Vα / Vβ germlines (higher than antibody VH / VL germlines) , renders each set of stabilizing designs within scTvs to be unique to the individual Vα / Vβ subunit and unlikely to find general use.

[0007] Considering the expression challenges of TCR-based fusion proteins and its significance in treatment of cancers, there is still need in the art to develop alternative TCR-based fusion protein modalities which are not only potent in targeting antigen specific tumor cells but also suitable for industrial scale production in mammalian expression system.Summary of Invention

[0008] Provided herein is a TCR-Fab in tandem (T-FIT) fusion protein.

[0009] In some embodiments, the fusion protein comprises a T cell receptor (TCR) moiety and an immunoglobulin (Ig) moiety, wherein the TCR moiety comprises an antigen binding variable (V) region of a TCR, and the immunoglobulin moiety comprises an antigen binding portion (ABP) comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region of an immunoglobulin.

[0010] In a further embodiment, the present disclosure provides a TCR-based fusion protein named TCR-Fab in tandem (T-FIT) , which comprises three polypeptide chains, wherein:

[0011] (1) the first polypeptide chain comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, Vα-Cα-VHB-CH1-Fc, the second polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, Vβ-Cβ, and the third polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, VLB-CL; or

[0012] (2) the first polypeptide chain comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, Vβ-Cβ-VHB-CH1-Fc, the second polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, Vα-Cα, and the third polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, VLB-CL;

[0013] wherein Vα is a variable domain of a TCR α chain, and Cα is a constant domain of a TCR α chain, Vβ is a variable region of a TCR β chain and Cβ is a constant domain of a TCR β chain;

[0014] VL is a light chain variable domain of immunoglobulin, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain, Fc is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ;

[0015] wherein Vα-Cα pairs with Vβ-Cβ to form a TCR moiety that specifically binds a peptide-MHC complex, and VLB-CL pairs with VHB-CH1 to form a Fab that specifically binds an antigen;

[0016] wherein two of the first polypeptide chains, two of the second polypeptide chains, and two of the third polypeptide chains are associated to form a TCR-Fab in tandem (T-FIT) .

[0017] Provided herein also refers to a composition comprising the T-FIT fusion proteins.

[0018] Provided herein also refers to use of the T-FIT fusion proteins, or the method of using the same.

[0019] Provided herein also refers to the nucleic acid encoding the T-FIT fusion proteins and the vector comprising said nuclei acid.

[0020] Provided herein also refers to a preparation method for the T-FIT fusion proteins.Brief Description of Drawings

[0021] FIG. 1 exhibits TCR alpha chain-linked TCR-Fab in tandem (T-FIT) fusion protein.

[0022] FIG. 2 depicts TCR beta chain-linked T-FIT fusion protein.

[0023] FIG. 3 and FIG. 4 show TCR Vα / Vβ domain-linked T-FIT fusion proteins.

[0024] FIG. 5 and FIG. 6 display fusion proteins with TCR alpha / beta chain directly linked to Immunoglobulin.

[0025] FIG. 7, FIG. 8, and FIG. 9 display the diagrams of asymmetric TCR-Fab fusion proteins.

[0026] FIG. 10 shows the results of a cocultured reporter gene assay measuring redirected CD3 activation by targeting the MHC / peptide complex of HLA-C*08: 02 / KRAS (G12D) .

[0027] FIG. 11 shows the dose dependent and target specific activation of human T-cells in a cocultured reporter gene assay by targeting the MHC / peptide complex of HLA-C*08: 02 / KRAS (G12D) .

[0028] FIG. 12 shows the binding activity of FIT2022-29a to NY-ESO-1 peptide (SLLMWITQC) pulsed T2 cells.

[0029] FIG. 13 illustrates the dose dependent and target specific activation of human T-cells in a cocultured reporter gene assay by targeting the MHC / peptide complex of HLA-A*02: 01 / NY-ESO-1.

[0030] FIG. 14 exhibits that FIT2022-29a had potent redirected T-cell cytotoxicity agains target cells.

[0031] FIG. 15 exhibits the dose dependent and target specific activation of human T-cells in a cocultured reporter gene assay by targeting the MHC / peptide complex of HLA-A*01 / MAGE-A3.

[0032] FIG. 16 shows that FIT2022-30a had potent redirected T-cell cytotoxicity agains target cells.

[0033] FIG. 17 illustrates potent in vivo tumor growth inhibition by FIT2022-30a in a xenograft mouse model with human melanoma cell line A375.

[0034] FIG. 18 shows dose-dependent T-cell lysis of OCI-AML2 cells in the presence of T-FIT fusion proteins.

[0035] FIG. 19 exhibits the average tumor volumes of FIT2022-130a / ABBV-184-treated groups at different time points.Detailed Description

[0036] Definitions

[0037] Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in connection with the present disclosure shall have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art. In the event of any latent ambiguity between the present disclosure and any dictionary or extrinsic definition, definitions provided herein shall prevail. Further, unless otherwise required by context, singular terms shall include pluralities and plural terms shall include the singular. In this application, the use of "or" means "and / or" unless stated otherwise. Furthermore, the use of the term "including" , as well as other forms, such as "includes" and "included" , is not limiting. Also, terms such as "element" or "component" encompass both elements and components comprising one unit and elements and components that comprise more than one subunit unless specifically stated otherwise.

[0038] As used herein, the terms "disorder" and "disease" are synonymous and refer to a pathophysiological condition.

[0039] As used herein, the term "a disorder (or disease) in which specific target cells that express a disorder-associated antigen and are detrimental to a human subject” is intended to include a disorder in which the presence of the cell in a human subject suffering from the disorder has been shown to be or is suspected of being either responsible for the pathophysiology of the disorder or a has been shown to be or is suspected of being a factor that contributes to a worsening of the disorder, and such cells may express a disorder-associated antigen that can be bound by the fusion protein of the present disclosure. Accordingly, a disorder in which a cell is detrimental is a disorder in which reduction or elimination of the population of the cells is expected to alleviate one or more symptoms of the disorder or progression of the disorder. Such disorders may be evidenced, for example, by an existence of the antigen or an elevated antigen in a nucleic acid or amino acid level, or an elevated activity of the antigen on the surface of the cells that are detrimental .

[0040] The terms "tumor" and "cancer" are synonymous, unless indicated otherwise. A cancer or tumor may be a blood cancer or tumor (including lymphoid cells) , or solid cancer or tumor.

[0041] The terms "individual" and "subject" refer to a mammal, For example a human subject.

[0042] As used herein, the terms “Fab” , “Fab fragment” , or “Fab binding unit” are synonymous and refer to an immunoglobulin epitope (of an antigen) binding unit that is formed by the association of a polypeptide chain comprising an immunoglobulin light chain variable domain (VL domain) linked to an immunoglobulin light chain constant domain (CL domain) and a polypeptide chain comprising an immunoglobulin heavy chain variable domain (VH domain) linked to an immunoglobulin heavy chain constant domain (CH1 domain) , wherein a VL domain pairs with a VH domain to form the epitope (antigen) binding site and a CL domain pairs with a CH1 domain. Thus, as used herein, the terms “Fab” , “Fab fragment” , and “Fab binding unit” encompass natural Fab fragments produced by papain digestion of a naturally occurring immunoglobulin, such as IgG, wherein the papain digestion yields two Fab fragments that comprise a heavy chain fragment comprising VH-CH1 and a light chain fragment comprising VL-CL. As used herein, the terms also encompass recombinant Fabs in which a selected VL domain is linked to a selected CL domain and a selected VH domain is linked with a selected CH1 domain. The VH-CH1 in the present disclosure is called “Fab heavy chain” and the “VL-CL” is called “Fab light chain” .

[0043] A composition or method described herein as “comprising” one or more named elements or steps is open-ended, meaning that the named elements or steps are essential, but other elements or steps may be added within the scope of the composition or method. To avoid prolixity, it is also understood that any composition or method described as “comprising” (or “which comprises” ) one or more named elements or steps also describes the corresponding, more limited, composition or method “consisting essentially of” (or “which consists essentially of” ) the same named elements or steps, meaning that the composition or method includes the named essential elements or steps and may also include additional elements or steps that do not materially affect the basic and novel characteristic (s) of the composition or method. It is also understood that any composition or method described herein as “comprising” or “consisting essentially of” one or more named elements or steps also describes the corresponding, more limited, and closed-ended composition or method “consisting of” (or “which consists of” ) the named elements or steps to the exclusion of any other unnamed element or step. In any composition or method disclosed herein, known, or disclosed equivalents of any named essential element or step may be substituted for that element or step.

[0044] An element or step "selected from the group consisting of" or “selected from” followed by a list of elements or steps refers to one or more of the elements or steps in the list that follows, including combinations of two or more of the listed elements or steps.

[0045] The term “specific binding” or “specifically binding” in reference to the interaction of an antibody, a binding protein, a fusion protein or a peptide with a second chemical species, means that the interaction is dependent upon the presence of a particular structure (e.g., an antigenic determinant or epitope) on the second chemical species. For example, an antibody recognizes and binds to a specific protein structure rather than to proteins generally. If an antibody is specific for epitope “A” , the presence of a molecule containing epitope A (or free, unlabeled A) , in a reaction containing labeled “A” and the antibody, will reduce the amount of labeled A bound to the antibody.

[0046] The term "antibody" broadly refers to any Immunoglobulin (Ig) molecule comprised of four polypeptide chains, two heavy (H) chains and two light (L) chains, or any functional fragment, mutant, variant, or derivation thereof, which retains the essential epitope binding features of an Ig molecule. Such mutant, variant, or derivative antibody formats are known in the art. Nonlimiting embodiments of which are discussed below.

[0047] In a full-length antibody, each heavy chain is comprised of a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region is comprised of three domains: CH1, CH2, and CH3. Each light chain is comprised of a light chain variable region (abbreviated herein as VL) and a light chain constant region. The light chain constant region is comprised of one domain, CL. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, termed complementarity determining regions (CDRs) , interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FRs) . Each VH and VL is comprised of three CDRs and four FRs, arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. First, second and third CDRs of a VH domain are commonly enumerated as CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3; likewise, first, second and third CDRs of a VL domain are commonly enumerated as CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3. Immunoglobulin molecules can be of any type (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA and IgY) , class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) or subclass.

[0048] The term “Fc region” is used to define the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain, which may be generated by papain digestion of an intact antibody. The Fc region may be a native sequence Fc region or a variant Fc region. The Fc region of an immunoglobulin generally comprises two constant domains, i.e., a CH2 domain and a CH3 domain, and optionally comprises a CH4 domain, for example, as in the case of the Fc regions of IgM and IgE antibodies. The Fc region of IgG, IgA, and IgD antibodies comprises a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain. In contrast, the Fc region of IgM and IgE antibodies lacks a hinge region but comprises a CH2 domain, a CH3 domain and a CH4 domain. Variant Fc regions having replacements of amino acid residues in the Fc portion to alter antibody effector function are known in the art (see, e.g., Winter et al., US Patent Nos. 5,648,260 and 5,624,821) . The Fc portion of an antibody mediates several important effector functions, for example, cytokine induction, ADCC, phagocytosis, complement dependent cytotoxicity (CDC) , and half-life / clearance rate of antibody and antigen-antibody complexes. In some cases, these effector functions are desirable for therapeutic antibody but in other cases might be unnecessary or even deleterious, depending on the therapeutic objectives. Certain human IgG isotypes, particularly IgG1 and IgG3, mediate ADCC and CDC via binding to FcγRs and complement C1q, respectively. In still another embodiment at least one amino acid residue is replaced in the constant region of the antibody, for example the Fc region of the antibody, such that effector functions of the antibody are altered. The dimerization of two identical heavy chains of an immunoglobulin is mediated by the dimerization of CH3 domains and is stabilized by the disulfide bonds within the hinge region that connects CH1 constant domains to the Fc constant domains (e.g., CH2 and CH3) . The anti-inflammatory activity of IgG is completely dependent on sialylation of the N-linked glycan of the IgG Fc fragment. The precise glycan requirements for anti-inflammatory activity have been determined, such that an appropriate IgG1 Fc fragment can be created, thereby generating a fully recombinant, sialylated IgG1 Fc with greatly enhanced potency (see, Anthony et al., Science, 320: 373-376 (2008) ) .

[0049] Herein, a "heterodimeric Fc scaffold" refers to a scaffold comprising or formed from two different Fc regions by dimerization, which can be linked at its N-terminus or C-terminus to an antigen-binding domain (e.g., heavy and / or light chain variable regions of an antibody or antigen-binding fragment of an antibody that can bind to a target molecule, or soluble portions of a ligand or receptor that can bind to a target molecule) for use in constructing fusion proteins or multispecific antibodies, e.g., bispecific antibodies.

[0050] Typically, as used herein, the term "CH1 region" or “CH1 domain” refers to the portion of an antibody heavy chain polypeptide and extends from about EU position 118 to about EU position 220 (EU numbering system) ; as used herein, the term “CH1 region / domain” includes wildtype human CH1 domain, and variants thereof. In a specific embodiment, the CH1 region provided herein is of human IgG type such ashuman IgG1. In some embodiments, CH1 region comprises part of a hinge region, e.g., when CH1 region is comprised in a Fab.

[0051] The term “CL region” or “CL domain” refers to the constant region adjacent to the VL domain in the antibody light chain; the CL domain may extend from about EU position 108 to about EU position 216 (EU numbering system) in the light chain. In a specific embodiment, the CL region herein is a human CL kappa region or a human lambda region, particularly a kappa region.

[0052] A "knob-into-hole" mutation or "KIH" mutation (Ridgway et al, Protein Eng., 9: 617–621 (1996) ) is used herein to refer to the introduction of mutations in the first Fc-polypeptide and the second Fc-polypeptide, respectively, using the "KIH" technique to form a bulge ( "knob" ) and a complementary hole ( "hole" ) at the interface of the first Fc-polypeptide and at the interface of the second Fc-polypeptide. It is known in the art that "knob-into-hole" techniques can engineer the interface between different chains of an antibody molecule to facilitate proper association of the individual chains of the antibody molecule. Generally, this technique involves introducing a "bulge / knob" at the interface of one strand and a corresponding "hole" at the interface of the other strand to be paired with, so that the bulge can be placed in the hole. One preferred interface comprises the CH3 domain of the heavy chain constant domain of one chain and the CH3 domain of the heavy chain constant domain of the other chain to be paired with. The bulge may be constructed by replacing the small amino acid side chain from the interface of the CH3 domain of the heavy chain constant domain of one chain with a larger side chain (e.g., tyrosine or tryptophan) . Compensatory cavities of the same or similar size to the bulge are created at the interface of the CH3 domains of the heavy chain constant domains of the other chain to be paired by replacing large amino acid side chains with smaller side chains (e.g., alanine or threonine) .

[0053] The terms “antigen-binding portion (ABP) ” , “antigen-binding fragment” , “antigen-binding domain” or “functional fragment” of an antibody are used interchangeably and refer to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen, i.e., the same antigen (e.g., CD3) as the full-length antibody from which the portion or fragment is derived. It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody. Such antibody embodiments may also be bispecific, dual specific, or multi-specific formats; specifically binding to two or more different antigens (e.g., CD3) . Examples of binding fragments encompassed within the term “antigen-binding portion (ABP) ” of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL, and CH1 domains; (ii) a F (ab’) 2 fragment, a bivalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; (iii) a Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (iv) a Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of an antibody, (v) a dAb fragment (Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989) ; PCT Publication No. WO 90 / 05144) , which comprises a single variable domain; and (vi) an isolated complementarity determining region (CDR) . Furthermore, although the two domains of the Fv fragment, VL and VH, are coded for by separate genes, they can be joined, using recombinant methods, by a synthetic linker that enables them to be made as a single protein chain in which the VL and VH regions pair to form monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv) ; see, for example, Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988) ; and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988) ) . Such single chain antibodies are also intended to be encompassed within the term “antigen-binding portion (ABP) ” of an antibody and equivalent terms given above. Other forms of single chain antibodies, such as diabodies are also encompassed. Diabodies are bivalent, bispecific antibodies in which VH and VL domains are expressed on a single polypeptide chain, but using a linker that is too short to allow for pairing between the two domains on the same chain, thereby forcing the domains to pair with complementary domains of another chain and creating two antigen binding sites (see, for example, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) . Such antibody binding portions are known in the art (Kontermann and Dübel eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag, New York, 2001) , p. 790 (ISBN 3-540-41354-5) ) . In addition, single chain antibodies also include “linear antibodies” comprising a pair of tandem Fv segments (VH-CH1-VH-CH1) which, together with complementary light chain polypeptides, form a pair of antigen binding regions (Zapata et al., Protein Eng., 8 (10) : 1057-1062 (1995) ; and US Patent No. 5,641,870) ) .

[0054] An immunoglobulin constant (C) domain refers to a heavy (CH) or light (CL) chain constant domain. Murine and human IgG heavy chain and light chain constant domain amino acid sequences are known in the art.

[0055] The term "monoclonal antibody" or "mAb" refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies comprising the population are identical except for possible naturally occurring mutations that may be present in minor amounts. Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic determinant (epitope) . Furthermore, in contrast to polyclonal antibody preparations that typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes) , each mAb is directed against a single determinant on the antigen. The modifier "monoclonal" is not to be construed as requiring production of the antibody by any particular method.

[0056] The term "human antibody" includes antibodies having variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. The human antibodies of the present disclosure may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro or by somatic mutation in vivo) , for example in the CDRs and in particular CDR3. However, the term "human antibody" does not include antibodies in which CDR sequences derived from the germline of another mammalian species, such as a mouse, have been grafted onto human framework sequences.

[0057] The term "recombinant human antibody" includes all human antibodies that are prepared, expressed, created, or isolated by recombinant means, such as antibodies expressed using a recombinant expression vector transfected into a host cell, antibodies isolated from a recombinant, combinatorial human antibody library (Hoogenboom, H.R., Trends Biotechnol., 15: 62-70 (1997) ; Azzazy and Highsmith, Clin. Biochem., 35: 425-445 (2002) ; Gavilondo and Larrick, BioTechniques, 29: 128-145 (2000) ; Hoogenboom and Chames, Immunol. Today, 21: 371-378 (2000) ) , antibodies isolated from an animal (e.g., a mouse) that is transgenic for human immunoglobulin genes (see, e.g., Taylor et al., Nucl. Acids Res., 20: 6287-6295 (1992) ; Kellermann and Green, Curr. Opin. Biotechnol., 13: 593-597 (2002) ; Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000) ) ; or antibodies prepared, expressed, created or isolated by any other means that involves splicing of human immunoglobulin gene sequences to other DNA sequences. Such recombinant human antibodies have variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. In certain embodiments, however, such recombinant human antibodies are subjected to in vitro mutagenesis (or, when an animal transgenic for human Ig sequences is used, in vivo somatic mutagenesis) and thus the amino acid sequences of the VH and VL regions of the recombinant antibodies are sequences that, while derived from and related to human germline VH and VL sequences, may not naturally exist within the human antibody germline repertoire in vivo.

[0058] The term "chimeric antibody" refers to antibodies that comprise heavy and light chain variable region sequences from one species and constant region sequences from another species, such as antibodies having murine heavy and light chain variable regions linked to human constant regions.

[0059] The term "CDR-grafted antibody" refers to antibodies that comprise heavy and light chain variable region sequences from one species but in which the sequences of one or more of the CDR regions of VH and / or VL are replaced with CDR sequences of another species, such as antibodies having human heavy and light chain variable regions in which one or more of the human CDRs has been replaced with murine CDR sequences.

[0060] The term "humanized antibody" refers to antibodies that comprise heavy and light chain variable region sequences from a non-human species (e.g., a mouse) but in which at least a portion of the VH and / or VL sequence has been altered to be more "human-like" , i.e., more similar to human germline variable sequences. One type of humanized antibody is a CDR-grafted antibody, in which CDR sequences from a non-human species (e.g., mouse) are introduced into human VH and VL framework sequences. A humanized antibody is an antibody or a variant, derivative, analog or fragment thereof which immunospecifically binds to an antigen of interest and which comprises framework regions and constant regions having substantially the amino acid sequence of a human antibody but complementarity determining regions (CDRs) having substantially the amino acid sequence of a non-human antibody. As used herein, the term "substantially" in the context of a CDR refers to a CDR having an amino acid sequence at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%or at least 99%identical to the amino acid sequence of a non-human antibody CDR. A humanized antibody comprises substantially all of at least one, and typically two, variable domains (Fab, ‘Fab’ , F (ab’) 2, Fv) in which all or substantially all of the CDR regions correspond to those of a non-human immunoglobulin (i.e., donor antibody) and all or substantially all of the framework regions are those of a human immunoglobulin consensus sequence. In an embodiment, a humanized antibody also comprises at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc) , typically that of a human immunoglobulin. In some embodiments, a humanized antibody contains both the light chain as well as at least the variable domain of a heavy chain. The antibody also may include the CH1, hinge, CH2, CH3, and CH4 regions of the heavy chain. In some embodiments, a humanized antibody only contains a humanized light chain. In some embodiments, a humanized antibody only contains a humanized heavy chain. In specific embodiments, a humanized antibody only contains a humanized variable domain of a light chain and / or humanized heavy chain.

[0061] A humanized antibody may be selected from any class of immunoglobulins, including IgM, IgG, IgD, IgA and IgE, and any isotype, including without limitation IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4. The humanized antibody may comprise sequences from more than one class or isotype, and particular constant domains may be selected to optimize desired effector functions using techniques well known in the art.

[0062] The framework (FR) and CDR regions of a humanized antibody need not correspond precisely to the parental sequences, e.g., the donor antibody CDR or the acceptor framework may be mutagenized by substitution, insertion and / or deletion of at least one amino acid residue so that the CDR or framework residue at that site does not correspond to either the donor antibody or the consensus framework. In an exemplary embodiment, such mutations, however, will not be extensive. Usually, at least 80%, for instance, at least 85%, at least 90%, or at least 95%of the humanized antibody residues will correspond to those of the parental FR and CDR sequences. Back mutation at a particular framework position to restore the same amino acid that appears at that position in the donor antibody is often utilized to preserve a particular loop structure or to correctly orient the CDR sequences for contact with target antigen.

[0063] The term "CDR" refers to the complementarity determining regions within antibody variable domain sequences. There are three CDRs in each of the variable regions of the heavy chain and the light chain, which are designated CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3. The term "CDR set" as used herein refers to a group of three CDRs that occur in a single variable region capable of binding the antigen. The exact boundaries of these CDRs have been defined differently according to different systems. The system described by Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1987) and (1991) ) not only provides an unambiguous residue numbering system applicable to any variable region of an antibody, but also provides precise residue boundaries defining the three CDRs.

[0064] The term "Kabat numbering" , which is recognized in the art, refers to a system of numbering amino acid residues which are more variable (i.e., hypervariable) than other amino acid residues in the heavy and light chain variable regions of an antibody or an antigen-binding portion thereof. See, Kabat et al., Ann. NY Acad. Sci., 190: 382-391 (1971) ; and Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991) .

[0065] As used herein, the term "fused directly" , "directly fused" , “linked directly” or “directly linked” , when referring to the linear connection of two domains in a polypeptide structure, means that the domains are joined directly by a peptide bond, without the use of an artificial polypeptide linker or connector.

[0066] The term "activity" includes properties such as the ability to bind a target antigen with specificity, the affinity of a fusion protein for an antigen, the ability to neutralize the biological activity of a target antigen, the ability to inhibit interaction of a target antigen with its natural receptor (s) , and the like.

[0067] The term "isolated nucleic acid" shall mean a polynucleotide (e.g., of genomic, cDNA, or synthetic origin, or some combination thereof) that, by human intervention, is not associated with all or a portion of the polynucleotides with which it is found in nature; is operably linked to a polynucleotide that it is not linked to in nature; or does not occur in nature as part of a larger sequence.

[0068] The term "vector" , as used herein, is intended to refer to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it has been linked. One type of vector is a "plasmid" , which refers to a circular double stranded DNA loop into which additional DNA segments may be ligated. Another type of vector is a viral vector, wherein additional DNA segments may be ligated into the viral genome. Certain vectors are capable of autonomous replication in a host cell into which they are introduced (e.g., bacterial vectors having a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors) . Other vectors (e.g., non-episomal mammalian vectors) can be integrated into the genome of a host cell upon introduction into the host cell, and thereby are replicated along with the host genome. Moreover, certain vectors are capable of directing the expression of genes to which they are operatively linked. Such vectors are referred to herein as "recombinant expression vectors" (or simply, "expression vectors" ) . In general, expression vectors of utility in recombinant DNA techniques are often in the form of plasmids. In the present specification, "plasmid" and "vector" may be used interchangeably as the plasmid is the most commonly used form of vector. However, the present disclosure is intended to include such other forms of expression vectors, such as viral vectors (e.g., replication defective retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses) , which serve equivalent functions.

[0069] As used herein, the term “expression construct” refers to a vector designed for gene expression, e.g., in a host cell. An expression vector promotes the expression (i.e., transcription / translation) of an encoded polypeptide (e.g., fusion polypeptide) . Typically, the vector is a plasmid, although other suitable vectors, including viral and non-viral vectors are also encompassed by the term “expression construct. ”

[0070] "Transformation" , as defined herein, refers to any process by which exogenous DNA enters a host cell. Transformation may occur under natural or artificial conditions using various methods well known in the art. Transformation may rely on any known method for the insertion of foreign nucleic acid sequences into a prokaryotic or eukaryotic host cell. The method is selected based on the host cell being transformed and may include, but is not limited to, transfection, viral infection, electroporation, lipofection, and particle bombardment. Such "transformed" cells include stably transformed cells in which the inserted DNA is capable of replication either as an autonomously replicating plasmid or as part of the host chromosome. They also include cells which transiently express the inserted DNA or RNA for limited periods of time.

[0071] The term "recombinant host cell" (or simply "host cell" ) , is intended to refer to a cell into which exogenous DNA has been introduced. In an embodiment, the host cell comprises two or more (e.g., multiple) nucleic acids encoding antibodies, such as the host cells described in US Patent No. 7, 262, 028, for example. Such terms are intended to refer not only to the particular subject cell, but also to the progeny of such a cell. Because certain modifications may occur in succeeding generations due to either mutation or environmental influences, such progeny may not, in fact, be identical to the parent cell, but are still included within the scope of the term "host cell" as used herein. In an embodiment, host cells include prokaryotic and eukaryotic cells selected from any of the Kingdoms of life. In another embodiment, eukaryotic cells include protist, fungal, plant and animal cells. In another embodiment, host cells include but are not limited to the prokaryotic cell line Escherichia coli; mammalian cell lines CHO, HEK 293, COS, NS0, SP2 and PER. C6; the insect cell line Sf9; and the fungal cell Saccharomyces cerevisiae.

[0072] Standard techniques may be used for recombinant DNA, oligonucleotide synthesis, and tissue culture and transformation (e.g., electroporation, lipofection) . Enzymatic reactions and purification techniques may be performed according to manufacturer's specifications or as commonly accomplished in the art or as described herein. The foregoing techniques and procedures may be generally performed according to conventional methods well known in the art and as described in various general and more specific references that are cited and discussed throughout the present specification. See e.g., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) .

[0073] The term "agonist" , as used herein, refers to a modulator that, when contacted with a molecule of interest, causes an increase in the magnitude of a certain activity or function of the molecule compared to the magnitude of the activity or function observed in the absence of the agonist. The terms "antagonist" and "inhibitor" , as used herein, refer to a modulator that, when contacted with a molecule of interest causes a decrease in the magnitude of a certain activity or function of the molecule compared to the magnitude of the activity or function observed in the absence of the antagonist.

[0074] As used herein, the terms “antigen-presenting cell” or “APC” refer to a cell that mediate a cellular immune response by displaying an epitope on its outer surface, presented by a protein or protein complex such as, a major histocompatibility complex (MHC) , or MHC-related protein such as CD1, that can present lipids to T cells, for recognition by an immune cell such as a T cell. APCs include professional APCs, such as dendritic cells, macrophages, Langerhans cells, and B cells, that express both class I and class II MHCs, and non-professional APCs (e.g., nucleated cells) that express only class I MHCs. APCs also include artificial APCs, such as cells (e.g., drosophila cells) engineered to express an MHC that presents a T cell epitope.

[0075] As used herein, "effective amount” or “therapeutically effective amount" refers to the amount of an active agent (e.g., a TCR-based fusion protein as provided herein) sufficient to effect beneficial or desired results. An effective amount can be administered in one or more administrations, applications or dosages and is not intended to be limited to a particular formulation or administration route.

[0076] The term “major histocompatibility complex" or "MHC” refers to a genomic locus containing a group of genes that encode the polymorphic cell-membrane-bound glycoproteins known as MHC class I and class II molecules, which regulate the immune response by presenting peptides of fragmented proteins to CD8+ (e.g., cytotoxic) and CD4+ (e.g., helper) T lymphocytes respectively, for possible recognition by T cell receptors (TCRs) . In humans, this group of genes is also called "human leukocyte antigen" or “HLA” . An HLA includes the Class I region (e.g., Class I genes HLA-A, HLA-B and HLA-C) , and Class II region (e.g., Class II genes HLA-DP, HLA-DQ and HLA-DR) , which can be selected from multiple serotypes (e.g., HLA-A*01, HLA-A*02, HLA-C*08, and HLA-DPA1*02) including multiple alleles (e.g., HLA-A*02: 01, HLA-C*08: 02, and HLA-DPA1*02: 02) . Nucleotide sequences and a gene map of human MHC are publicly available (e.g., The MHC sequencing consortium, (1999) NATURE, 401: 921-923) .

[0077] The terms “major histocompatibility complex” and “MHC” , as described herein, are used interchangeably in the context of the present disclosure, and also refer to the polymorphic glycoproteins encoded by the MHC class I or class II genes. Such proteins are also referred to as “MHC molecule” or “MHC protein” herein and are meant to be full-length MHCs as well as peptide-binding fragments thereof.

[0078] As used herein, the term “peptide-MHC complex” or “pMHC complex" refers to a complex of an MHC molecule loaded with an antigen peptide, which is bound in the peptide binding pocket of the MHC. The term “peptide-HLA complex” or “pHLA complex” as used herein refers to a complex of an HLA molecule and an antigen peptide, preferably an HLA-A, HLA-B or HLA-C molecule.

[0079] As used herein, the term “TCR moiety” refers to a portion of a TCR-based fusion protein of the present disclosure that includes the variable domains of the TCR alpha (α)  / beta (β) chains or gamma (γ)  / delta (δ) chains, including alleles, variants, and modifications thereof that retain the functional properties of the TCR V regions, as described further herein. In some embodiments, the TCR moiety also comprises the constant domain of the TCR alpha (α)  / beta (β) chains or gamma (γ)  / delta (δ) chains.

[0080] Fusion Proteins

[0081] TCR-Fab in tandem (T-FIT)

[0082] The present disclosure provides a TCR-based fusion protein comprising a TCR moiety and an immunoglobulin moiety, wherein the TCR moiety comprises an antigen binding variable (V) region of a TCR, and the immunoglobulin moiety comprises an antigen binding portion (ABP) comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region of an immunoglobulin.

[0083] In some embodiments, the TCR variable (V) region comprise one or more of α, β, γ, or δ variable regions. For example, in certain embodiments, the TCR variable region comprises an α chain V region (Vα) and a β chain V region (Vβ) .

[0084] In some further embodiments, the TCR moiety further comprises a constant (C) region linked to the variable (V) region. In some embodiments, the constant (C) region comprises an α chain constant region (Cα) and / or a β chain constant region (Cβ) of a TCR. In some embodiments, the TCR moiety comprises an α chain V region (Vα) linked to an α chain constant region (Cα) and / or a β chain V region (Vβ) linked to a βchain constant region (Cβ) .

[0085] In some embodiments, the constant (C) region in the TCR moiety can be an immunoglobulin light chain constant region (CL) and / or an immunoglobulin heavy chain constant (CH1) . In some further embodiments, the TCR moiety further comprises an immunoglobulin light chain constant region (CL) linked to a TCR variable (V) region, and / or an immunoglobulin heavy chain constant (CH1) linked to another TCR variable (V) region. In some embodiments, the TCR moiety comprises an α chain V region (Vα) linked to CH1 and / or a β chain V region (Vβ) linked to CL. In a further embodiment, the TCR moiety comprises an α chain V region (Vα) linked to CL and / or a β chain V region (Vβ) linked to CH1.

[0086] In specific embodiments, as used herein, the variable regions and constant regions in the TCR moiety are fused directly without a linker or connector.

[0087] In some embodiments, the antigen binding portion (ABP) is a Fab of an antibody. In some embodiments, the immunoglobulin moiety further comprises Fc region. In some embodiments, the Fc region is linked to the Fab heavy chain. In some embodiments, the immunoglobulin comprises two Fabs linked to the Fc region. In some embodiments, the two Fabs are the same or different.

[0088] In some embodiments, the fusion protein comprises one or two TCR moieties. In some embodiments, the two TCR moieties are the same or different.

[0089] In certain embodiments, the TCR moiety of the fusion protein is linked to the immunoglobulin moiety through the TCR α chain or the TCR β chain.

[0090] In certain embodiments, the TCR moiety of the fusion protein directly linked to the immunoglobulin moiety without a linker or connector.

[0091] In a certain embodiment, the TCR moiety of the fusion protein is linked to the Fab heavy chain of the immunoglobulin moiety through the TCR α chain or the TCR β chain, e.g., the constant region of the TCR α chain or the TCR β chain (e.g., its C-terminus) is linked to the Fab heavy chain (e.g., its N-terminus) . In another embodiment, the constant regions of the TCR α chain and the TCR β chain (e.g., their C-terminus) are linked to the Fab heavy chain and Fab light chain (e.g., their N-terminus) , respectively.

[0092] In some embodiments, the constant region of the TCR α chain or the TCR β chain (e.g., its C-terminus) is linked to the Fc region (e.g., its N-terminus) .

[0093] In certain embodiments, each element of the fusion protein is linked with each other directly without any linker or connector.

[0094] In a further embodiment, the present disclosure provides a TCR-based fusion protein named TCR-Fab in tandem (T-FIT) , which comprises:

[0095] (1) a first polypeptide chain comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, Vα-Cα-VHB-CH1-Fc; a second polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, Vβ-Cβ; and a third polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, VLB-CL; or

[0096] (2) a first polypeptide chain comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, Vβ-Cβ-VHB-CH1-Fc; a second polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, Vα-Cα; and a third polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, VLB-CL;

[0097] wherein Vα is a variable domain of a TCR α chain, and Cα is a constant domain of a TCR α chain, Vβ is a variable region of a TCR β chain and Cβ is a constant domain of a TCR β chain;

[0098] wherein VL is an immunoglobulin light chain variable domain, CL is an immunoglobulin light chain constant domain, VH is an immunoglobulin heavy chain variable domain, CH1 is an immunoglobulin heavy chain constant domain, Fc is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ;

[0099] wherein Vα-Cα pairs with Vβ-Cβ to form a TCR moiety that specifically binds a peptide-MHC complex, and VLB-CL pairs with VHB-CH1 to form a Fab that specifically binds an antigen or epitope;

[0100] wherein two of the first polypeptide chains, two of the second polypeptide chains, and two of the third polypeptide chains are associated to form a TCR-Fab in tandem (T-FIT) fusion protein.

[0101] In some embodiments, the T-FIT fusion protein, as described herein, is in the configuration as illustrated in Fig. 1 or 2.

[0102] In a further embodiment, the present disclosure provides a TCR based fusion protein named TCR-Fab in tandem (T-FIT) , which comprises:

[0103] (1) a first polypeptide chain comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, Vα-CL-VHB-CH1-Fc; a second polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, Vβ-CH1; and a third polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, VLB-CL; or

[0104] (2) a first polypeptide chain comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, Vβ-CL-VHB-CH1-Fc; a second polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, Vα-CH1; and a third polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, VLB-CL;

[0105] wherein Vα is a variable domain of a TCR α chain, and Vβ is a variable region of a TCR β chain;

[0106] whererin VL is an immunoglobulin light chain variable domain, CL is an immunoglobulin light chain constant domain, VH is an immunoglobulin heavy chain variable domain, CH1 is an immunoglobulin heavy chain constant domain, Fc is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ;

[0107] wherein Vα-CL pairs with Vβ-CH1, or Vα-CH1 pairs with Vβ-CL to form a TCR moiety that specifically binds a peptide-MHC complex, and VLB-CL pairs with VHB-CH1 to form a Fab that specifically binds an antigen or epitope;

[0108] wherein two of the first polypeptide chains, two of the second polypeptide chains, and two of the third polypeptide chains are associated to form a TCR-Fab in tandem (T-FIT) fusion protein.

[0109] In some embodiments, the T-FIT provided herein is in the configuration as illustrated in Fig. 3 or 4.

[0110] In a further embodiment, the present disclosure provides a TCR-based fusion protein named TCR-Fab in tandem (T-FIT) , which comprises:

[0111] (1) a first polypeptide chain comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, Vα-Cα-VHB-CH1-Fc; and a second polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, Vβ-Cβ-VLB-CL; or

[0112] (2) a first polypeptide chain comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, Vβ-Cβ-VHB-CH1-Fc; and a second polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, Vα-Cα-VLB-CL;

[0113] wherein Vα is a variable domain of a TCR α chain, and Cα is a constant domain of a TCR α chain, Vβ is a variable region of a TCR β chain and Cβ is a constant domain of a TCR β chain;

[0114] wherein VL is an immunoglobulin light chain variable domain, CL is an immunoglobulin light chain constant domain, VH is an immunoglobulin heavy chain variable domain, CH1 is an immunoglobulin heavy chain constant domain, Fc is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ;

[0115] wherein Vα-Cα pairs with Vβ-Cβ to form a TCR moiety that specifically binds a peptide-MHC complex, and VLB-CL pairs with VHB-CH1 to form a Fab that specifically binds an antigen or epitope;

[0116] wherein two of the first polypeptide chains, and two of the second polypeptide chains, are associated to form a TCR-Fab in tandem (T-FIT) fusion protein.

[0117] In some embodiments, the T-FIT provided herein is in the configuration as illustrated in Fig. 5 or 6.

[0118] In a further embodiment, the present disclosure provides a TCR-based fusion protein named TCR-Fab in tandem (T-FIT) , which comprises:

[0119] a first polypeptide chain comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, VHB-CH1-Fc,

[0120] a second polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, VLB-CL; a third polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, Vα-Cα-Fc; and

[0121] a fourth polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, Vβ-Cβ;

[0122] wherein Vα is a variable domain of a TCR α chain, and Cα is a constant domain of a TCR α chain, Vβ is a variable region of a TCR β chain and Cβ is a constant domain of a TCR β chain;

[0123] wherein VL is a light chain variable domain, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain, Fc is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ;

[0124] wherein Vα-Cα pairs with Vβ-Cβ to form a TCR moiety that specifically binds a peptide-MHC complex, and VLB-CL pairs with VHB-CH1 to form a Fab that specifically binds an antigen or epitope;

[0125] wherein one of the first polypeptide chains, one of the second polypeptide chains, and one of the third polypeptide chains and one of the fourth polypeptide chains are associated to form a TCR-Fab in tandem (T-FIT) fusion protein;

[0126] optionally, the Fc region in the first chain and the Fc region in the third chain comprises Knob-into-hole mutation to form a heterodimeric Fc.

[0127] In some embodiments, the T-FIT provided herein is in the configuration as illustrated in Fig. 7.

[0128] In a further embodiment, the present disclosure provides a TCR-based fusion protein named TCR-Fab in tandem (T-FIT) , which comprises:

[0129] a first polypeptide chain comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, Vα-Cα-VHB-CH1-Fc,

[0130] a second polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, Vβ-Cβ;

[0131] a third polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, VLB-CL; and

[0132] a forth polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, Vα-Cα-Fc;

[0133] wherein Vα is a variable domain of a TCR α chain, and Cα is a constant domain of a TCR α chain, Vβ is a variable region of a TCR β chain and Cβ is a constant domain of a TCR β chain;

[0134] wherein VL is a light chain variable domain, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain, Fc is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ;

[0135] wherein Vα-Cα pairs with Vβ-Cβ to form a TCR moiety that specifically binds a peptide-MHC complex, and VLB-CL pairs with VHB-CH1 to form a Fab that specifically binds an antigen or epitope;

[0136] wherein one of the first polypeptide chains, two of the second polypeptide chains, one of the third polypeptide chains and one of the fourth polypeptide chains are associated to form a TCR-Fab in tandem (T-FIT) fusion protein;

[0137] optionally, the Fc region in the first chain and the Fc region in the third chain comprises Knob-into-hole mutation to form a heterodimeric Fc.

[0138] In some embodiments, the T-FIT provided herein is in the configuration as illustrated in Fig. 8.

[0139] In a further embodiment, the present disclosure provides a TCR based fusion protein named TCR-Fab in tandem (T-FIT) , which comprises:

[0140] a first polypeptide chain comprises, from amino terminus to carboxyl terminus, Vα-Cα-VHB-CH1-Fc,

[0141] a second polypeptide chain comprises, from amino to carboxyl terminus, Vβ-Cβ;

[0142] a third polypeptide chain comprises, from amino to carboxyl terminus, VLB-CL; and

[0143] a forth polypeptide chain comprises, from amino to carboxyl terminus, VHB-CH1-Fc;

[0144] wherein Vα is a variable domain of a TCR α chain, and Cα is a constant domain of a TCR α chain, Vβ is a variable region of a TCR β chain and Cβ is a constant domain of a TCR β chain;

[0145] wherein VL is a light chain variable domain, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain, Fc is an immunoglobulin Fc region, for example, the Fc of IgG1 (for instance, the Fc comprising, from amino terminus to carboxyl terminus, hinge-CH2-CH3) ;

[0146] wherein Vα-Cα pairs with Vβ-Cβ to form a TCR moiety that specifically binds a peptide-MHC complex, and VLB-CL pairs with VHB-CH1 to form a Fab that specifically binds an antigen or epitope;

[0147] wherein one of the first polypeptide chains, one of the second polypeptide chains, two of the third polypeptide chains and one of the fourth polypeptide chains are associated to form a TCR-Fab in tandem (T-FIT) fusion protein;

[0148] optionally, the Fc region in the first chain and the Fc region in the third chain comprises Knob-into-hole mutation to form a heterodimeric Fc.

[0149] In some embodiments, the T-FIT provided herein is in the configuration as illustrated in Fig. 9.

[0150] TCR Moiety

[0151] As used herein, the terms “T cell receptor” and “TCR” refer to a surface protein (e.g, a heterodimeric protein) of a T cell that allows the T cell to specifically recognize and bind an antigen and / or an epitope thereof, typically presented by a major histocompatibility complex (MHC) , or a fragment of such surface protein comprising at least its variable domains. In some embodiments, TCR moiety is a heterodimer comprising two different protein chains, alpha (α)  / beta (β) chains or gamma (γ)  / delta (δ) chains. In some embodiments, the TCR moiety comprises an alpha (α) chain and a beta (β) chain, which, in some embodiments, typically comprises two extracellular domains, a variable (V) domain and a constant (C) domain, the latter of which is membrane-proximal. The variable domain of α-chain (Vα) and the variable domain of β-chain (Vβ) each comprises three hypervariable regions that are also referred to as the complementarity determining regions (CDRs) such as CDR1, CDR2, and CDR3.

[0152] All numbering of the amino acid sequences and designation of protein loops and sheets of TCRs is according to the IMGT numbering scheme (the international ImMunoGeneTics information system; Lefranc et al. (2005) DEV. COMP. IMMUNOL., 29: 185-203) .

[0153] In some embodiments, “T cell receptor” and “TCR” also include an “engineered T cell receptor” or “engineered TCR” , such as a recombinantly modified protein comprising a fragment of a naturally occurring TCR that binds a T cell epitope-MHC complex, or a variant of such fragment. For example, an engineered TCR may contain a modified binding cassette (e.g., where one or more CDR sequences or other elements is modified, for example, by introducing corresponding sequences from a different TCR) . For example, the α and / or β chain CDR3 sequences of a first TCR identified herein may be introduced into a second, different TCR present in or derived from a given T cell. According, in certain embodiments, a TCR (e.g., engineered TCR) comprises corresponding Vα and Vβ domains that bind a T cell epitope-MHC complex, where the Vα and Vβ domains are derived from a naturally occurring TCR or a variant thereof. In some embodiments, the 3 CDRs of the TCR chain are the same as those of the naturally occurring TCR, and the other element (s) is modified.

[0154] In some embodiments, the TCR is a soluble TCR.

[0155] In some embodiments, the TCR moiety is derived from a T cell receptor, or is a T cell receptor.

[0156] In an embodiment, the TCR moiety of the fusion protein comprises either TCR alpha (α) and beta (β) chain V regions or TCR gamma (γ) and delta (δ) chain V regions. In certain embodiments, the TCR moiety comprises TCR alpha (α) and beta (β) chain V regions. In another embodiment, the TCR moiety further includes the TCR alpha (α) and beta (β) chain C regions as well.

[0157] In some embodiments, the TCR moiety comprises or consists of an α chain comprising or consisting of a V region and a C region and a β chain comprising or consisting of a V region and a C region.

[0158] In a further embodiment, the TCR moiety comprises or consists of a γ chain comprising or consisting of a V region and a C region and a δ chain comprising or consisting of a V region and a C region. Therefore, the α chain V region in the T-FIT can be replaced by a γ chain V region and the β chain V region in the T-FIT can be replaced by a δ chain V region.

[0159] In a further embodiment, the C region can be replaced by CH1 or CL. Therefore, the TCR moiety comprises or consists of an α chain comprising or consisting of a V region and a CL region and a β chain comprising or consisting of a V region and a CH1 region, or the TCR moiety comprises or consists of an α chain comprising or consisting of a V region and a CH1 region and a β chain comprising or consisting of a V region and a CL region.

[0160] In some embodiments, a "TCR moiety" is intended to encompass variants, mutants and otherwise modified forms of the TCR α / β or γ / δ pairs that still retain the antigenic binding specificity of the parent TCR from which the modified form is derived. For example, in some embodiments, TCR variants can be prepared to introduce modifications into a and / or β chain sequences. In some embodiments, the CDRs of the TCR variants are the same as those of the parent TCR.

[0161] In some embodiment the TCR moiety of the fusion protein mediates the antigen-specific binding of the fusion protein to peptide-MHC complexes. In some embodiments, the peptide comprises the T cell epitope. In some embodiments, the TCR moiety can bind to the T cell epitope-MHC, e.g., class I or class II epitopes.

[0162] In some embodiments, the MHC can be MHC class I or MHC class II, e.g., MHC class I HLA-A*01 or MHC Class I HLA-A*02: 01, or MHC Class I HLA-C*08: 02.

[0163] In some embodiments, the peptide that can be bound by TCR may be a disorder-associated antigen, such as the one that expressed on the surface of or in a cell that is considered detrimental to an individual and therefore is desired to be eliminated to substantially reduced in population. Cells that are or may be considered detrimental to an individual in need of treatment, include, but are not limited to, cancer cells, auto-reactive cells, and virus-infected cells.

[0164] The peptide or the T cell-epitope that can be bound by TCR can be any peptide includes but is not limited to, NY-ESO-1, MAGE-A3, gp100, Survivin or KRAS, e.g., KRAS with G12D mutation or G12V. The T cell epitope-MHC or peptide-MHC can be MHC class I or MHC class II epitopes, e.g., a T cell epitope with MHC class I HLA-A*01 or MHC Class I HLA-A*02: 01, or MHC Class I HLA-C*08: 02. Optionally, the peptide-MHC complex includes but not limited to, HLA-A*02: 01 / gp100, HLA-C*08: 02 / KRAS (G12D) , HLA-A*02: 01 / NY-ESO-1, HLA-A*01 / MAGE-A3, and HLA-A*02: 01 / Survivin.

[0165] In some embodiments, the constant region of the TCR α chain (Cα) comprises a sequence of SEQ ID NO: 55 or 63 or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identity to said amino acid sequence.

[0166] In some embodiments, the constant region of the TCR β chain (Cβ) comprises a sequence of SEQ ID NO: 56 or 64 or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identity to said amino acid sequence.

[0167] In some embodiments, the CH1 is human IgG1 CH1. In some embodiments, the CH1 region comprises a sequence of SEQ ID NO: 59 or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identity to said amino acid sequence.

[0168] In some embodiments, the CL is Kappa CL. In some embodiments, the CL region comprises a sequence of SEQ ID NO: 57 or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identity to said amino acid sequence.

[0169] In some embodiments, the TCR α chain comprises a sequence of SEQ ID NO: 14 or 29, or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identity to said amino acid sequence.

[0170] In some embodiments, the TCR β chain comprises a sequence of SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 17, 20, 23, 26, 40, 42, or 46, or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identity to said amino acid sequence.

[0171] Immunoglobulin Moiety (Ig Moiety)

[0172] In an embodiment, the Immunoglobulin (Ig) Moiety is attached to the TCR moiety. In a further embodiment, the Immunoglobulin Moiety comprises an antigen-binding portion. In a further embodiment, the antigen-binding portion comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region. In a further embodiment, the heavy chain variable region comprises 3 CDRs of heavy chain variable region. In a further embodiment, the light chain variable region comprises 3 CDRs of light chain variable region.

[0173] In some embodiments, the antigen-binding portion is a Fab.

[0174] A Fab fragment suitable for use as an antigen binding region of the bispecific antibody consists of two polypeptide chains comprising the antibody VH, CH1, VL and CL domains, wherein the VH is paired with VL and the CH1 is paired with CL to form the antigen binding region.

[0175] In some embodiments, in a Fab, one chain comprises or consists of VH and CH1 (i.e., VH-CH 1) from N-terminus to C-terminus, and the other chain comprises or consists of VL and CL (i.e., VL-CL) from N-terminus to C-terminus. In some embodiments, in the fusion protein of the present disclosure, the Fab may be linked to the N-terminus of the Fc domain of the antibody via the C-terminus of the chain comprising the VH. For example, the Fab comprises a VH-CH1 chain and a VL-CL chain and may be linked to an Fc domain via the C-terminus of CH1 of the VH-CH1 chain. In some embodiments, the linkage is a direct linkage, or through a hinge region. Herein, Fab chain comprising VH-CH1 is also referred to as a Fab heavy chain, while Fab chain comprising VL-CL is also referred to as a Fab light chain.

[0176] In some embodiments, the CH1 is a CH1 from IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4, for example a CH1 from IgG1. In some embodiments, the CH1 comprises or consists of:

[0177] (i) an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59,

[0178] (ii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59; or

[0179] (iii) an amino acid sequence having one or more (for example not more than 10, for example, not more than 5, 4, 3, 2, 1) amino acid changes (for example amino acid substitutions, for example amino acid conservative substitutions) compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59.

[0180] In some embodiments, the CL is a Kappa light chain constant region or a Lambda light chain constant region. In some embodiments, CL is a Kappa light chain constant region. In some embodiments, the CL comprises or consists of:

[0181] (i) an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57,

[0182] (ii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57; or

[0183] (iii) an amino acid sequence having one or more (for example not more than 10, for example not more than 5, 4, 3, 2, 1) amino acid changes (for example amino acid substitutions, for example amino acid conservative substitutions) compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57.

[0184] In some embodiments, the antigen-binding portion is capable of binding at least one target antigen expressed on a surface of a cell. For example, the antigen-binding portion described herein binds a cell surface antigen expressed on an effector cell of the immune system. Effector cells include T cells, NK cells, monocytes, neutrophils, or macrophages.

[0185] In yet another embodiment, the antigen-binding portion (ABP) is capable of binding a cytokine, a cytokine-related protein, or a cytokine receptor. In another embodiment, the antigen-binding portion is capable of binding a chemokine, a chemokine receptor, or a chemokine-related protein. In another embodiment, the antigen-binding portion (ABP) is also capable of binding receptors, including lymphokine receptors, monokine receptors, and polypeptide hormone receptors.

[0186] In another embodiment, the antigen-binding portion binds a surface antigen expressed on an effector cell. For example, the surface antigen is selected from the group consisting of: CD3, CD4, CD8, CD28, CD16a (also referred to as "FcγRIIIa" ) , CD64 (also referred to as "FcγRI" ) , NKG2D and NKp46, etc. For example, the fusion protein of the present disclosure binds CD3 as expressed on a T cell, CD16a as expressed on a natural killer (NK) cell, or a CD64 as expressed on a macrophage, neutrophil, or monocyte.

[0187] In another embodiment, the antigen-binding portion (ABP) binds CD3 (e.g., CD3ζ, CD3ε, CD3δ, CD3γ) on an effector cell. Examples of effector cells include, but are not limited to, T cells, natural killer (NK) cells, tumor infiltrating lymphocytes (TILs) , monocytes, neutrophils, and macrophages.

[0188] In a specific embodiment, the antigen-binding portion is capable of binding CD3, e.g., CD3ζ, CD3ε, CD3δ, CD3γ, e.g., CD3ε on T cells; for example, the antigen-binding portion is capable of binding CD3ε. In some embodiments, the antigen-binding portion binding to CD3ε may comprise or consist of an anti-CD3 antibody or antigen binding fragment thereof (e.g. a CD3 antibody disclosed in WO2021104371 (which is incorporated herein as its entirty) , as long as it is capable of specifically binding to CD3, including, but not limited to, e.g. Fab. In some embodiments, the antigen-binding portion that specifically binds CD3 is derived from an antibody that specifically binds CD3, e.g., a CD3 antibody disclosed in WO2021104371. In some embodiments, the antigen-binding portion that specifically binds CD3 comprises 1, 2, 3, 4, 5, or 6 CDRs of a known antibody that specifically binds CD3, e.g., a CD3 antibody disclosed in WO2021104371. In some embodiments, the antigen-binding portion that specifically binds CD3 comprises 1, 2, and 3 heavy chain variable region CDRs of a known antibody that specifically binds CD3, e.g., a CD3 antibody disclosed in WO2021104371. In some embodiments, the antigen-binding portion that specifically binds CD3 comprises 1, 2, and 3 light chain variable region CDRs of a known antibody that specifically binds CD3, e.g., a CD3 antibody disclosed in WO2021104371. In some embodiments, the antigen-binding portion that specifically binds CD3 comprises 3 heavy chain variable region CDRs and 3 light chain variable region CDRs of a known antibody that specifically binds CD3, e.g., a CD3 antibody disclosed in WO2021104371. In some embodiments, the antigen-binding portion that specifically binds CD3 comprises the heavy chain variable region and the light chain variable region of a known antibody that specifically binds CD3, such as a CD3 antibody disclosed in WO2021104371. In some embodiments, the antigen-binding portion that specifically binds CD3 comprises a Fab of a known antibody that specifically binds CD3 such as a CD3 antibody disclosed in WO2021104371. In a specific embodiment, the antigen-binding portion is a Fab fragment. In a specific embodiment, the Fab binding to CD3ε is the Fab from the International Publication NO. WO2021104371. In a specific embodiment, the Fab binding to CD3ε comprises the VH and VL of the Fab from the International Publication NO. WO2021104371. In a specific embodiment, the Fab binding to CD3ε comprises the 3 CDRs of VH and 3 CDRs of VL of the Fab from the International Publication NO. WO2021104371.

[0189] In some embodiments, the antigen-binding portion binding to CD3 comprises 3 complementarity determining regions (CDR-Hs) from the heavy chain variable region, wherein the CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 are the three complementarity determining regions CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 contained in the VH shown in any one of SEQ ID NOs: 70-75, and 96.

[0190] In some embodiments, the antigen-binding portion binding to CD3 comprises 3 complementarity determining regions (CDR-Ls) from the light chain variable region, wherein the CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 are the three complementarity determining regions CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 contained in the VL shown in SEQ ID NO: 76 or 97.

[0191] In some embodiments, the antigen-binding portion binding to CD3 comprises a heavy chain variable region (VH) , wherein the VH comprises or consists of

[0192] (i) an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 70-75, and 96, or

[0193] (ii) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76, or 97.

[0194] In some embodiments, the antigen-binding portion binding to CD3 comprises a light chain variable region (VL) , wherein the VL comprises or consists of

[0195] (i) an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%or 99%identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 76 or 97; or

[0196] (ii) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76 or 97.

[0197] In some embodiments, the antigen-binding portion (ABP) binding to CD3 comprises a set of six CDRs, i.e., CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3, compriseing or consisting of the SEQ ID NOs defined as below respectively:

[0198] In some embodiments, the antigen-binding portion (ABP) binding to CD3 is a Fab comprising a set of six CDRs, i.e., CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3 as described above.

[0199] In an embodiment, the antigen-binding portion (ABP) binding to CD3 comprises VH and VL domains, wherein the two variable domains comprise amino acid sequences selected from the following VH / VL pairs, wherein the VH and VL comprises or consists of the SEQ ID NOs sets defined below respectively:

[0200] In some embodiments, the antigen-binding portion binding to CD3 is a Fab comprising the VH / VL pairs as described above.

[0201] In some embodiments, the immunoglobulin moiety further comprises Fc region (s) , e.g., Fc dimer.

[0202] Fc region fragments suitable for use in the fusion proteins of the present disclosure may be any antibody Fc region. Fc regions can include native sequence Fc regions and variant Fc regions. Native sequence Fc domains encompass various immunoglobulin Fc sequences that occur in nature, such as the Fc regions of various Ig subtypes and their allotypes (Gestur Vidarsson et al., IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions, 20 October 2014, doi: 10.3389 / fimmu. 2014.00520. ) . For example, the Fc region of an antibody of the present disclosure may comprise two or three constant domains, i.e., a CH2 domain, a CH3 domain, and an optional CH4 domain. In some embodiments, the antibody Fc region may also carry an IgG hinge region or a portion of an IgG hinge region at the N-terminus, e.g., an IgG1 hinge region or a portion of an IgG1 hinge region.

[0203] Specifically, the Fc region of the fusion protein of the present disclosure comprises from N-terminal to C-terminal: CH2-CH3, or from N-terminal to C-terminal: hinge region-CH2-CH3. In some embodiments, the Fc region is a human Fc region from IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, or IgD. In some embodiments, the Fc region suitable for use in the fusion protein of the present disclosure is a human IgG Fc, e.g., human IgGl Fc, human IgG2 Fc, or human IgG4 Fc.

[0204] In one embodiment, the Fc region comprises or consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 67 or an amino acid sequence having at least 90%identity thereto, e.g., 95%, 96%, 97%, 99%or more identity.

[0205] SEQ ID NO: 67: human IgG1 Fc region (wild type)

[0206] The Fc region of the fusion protein of the present disclosure can be further mutated for desired property by Fc engineering approaches well known in the art (for example, Wang et al., Protein and Cell, 2018; 9 (1) : 63–73) .

[0207] The Fc region of the fusion protein of the present disclosure can be mutated to obtain desired properties. Mutations to the Fc region are known in the art.

[0208] In one embodiment, the Fc region is modified for the properties of the effector function of the Fc region (e.g., the complement activation function of the Fc region) . In one embodiment, the effector function has been reduced or eliminated relative to the wild-type isotype Fc region. In one embodiment, effector function is reduced or eliminated by a method selected from using Fc isotypes that naturally have reduced or eliminated effector function, and Fc region modification.

[0209] In one embodiment, the Fc region has reduced effector function mediated by the Fc region, e.g., reduced or eliminated ADCC or ADCP or CDC effector function, e.g., comprises mutations to achieve the above functions.

[0210] As will be understood by those of skill in the art, depending on the intended use, the fusion proteins molecules of the present disclosure may also comprise modifications in the Fc domain that alter the binding affinity for one or more Fc receptors. In one embodiment, the Fc receptor is an Fcγ receptor, in particular a human Fcγ receptor. In some embodiments, the Fc region comprises a mutation that reduces binding to Fcγreceptors. For example, in some embodiments, the Fc region used in the present disclosure has one or more of the L234A / L235A mutation (LALA mutation) and / or P329A / G mutation that reduces binding to Fcγ receptors. In yet another embodiment, the Fc fragment may have a mutation that results in increased serum half-life, e.g., a mutation that improves the binding of the Fc fragment to FcRn. In some embodiments, the Fc region comprises a YTE mutation M252Y / S254T / T256E that improves the binding of the Fc fragment to FcRn. In some embodiments, the Fc region comprises a LALA mutation and a YTE mutation.

[0211] In some embodiments, the Fc region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 90%identical, e.g., 95%, 96%, 97%, 99%or more identical to SEQ ID NO: 60, and comprises L234A / L235A mutation and M252Y / S254T / T256E mutation. In some embodiments, the Fc region comprising a mutation that improves the binding of the Fc fragment to FcRn. In some embodiments, the Fc region comprises M252Y / S254T / T256E mutation.

[0212] In some embodiments, once the two chains for dimerization are different, the Fc regions can be different and are capable of dimerizing to form a heterodimeric Fc scaffold.

[0213] As understood by those skilled in the art, to facilitate formation of the two chains as heterodimers, the Fc region comprised by the two chains may comprise mutations that facilitate heterodimerization of a first Fc region with a second Fc region. In one embodiment, mutations are introduced in the CH3 regions of both Fc regions.

[0214] Methods for promoting heterodimerization of Fc regions are known in the art. For example, the CH3 region of the first Fc region and the CH3 region of the second Fc region are engineered in a complementary manner such that each CH3 region (or the heavy chain comprising it) can no longer homodimerize with itself but is forced to heterodimerize with other CH3 regions that are complementarily engineered (such that the CH3 regions of the first and second Fc regions heterodimerize and no homodimers are formed between the two first CH3 regions or the two second CH3 regions) .

[0215] For example, the respective Knob mutations and Hole mutations are introduced in the first Fc region and the second Fc region based on the Knob-in-Hole technology. See, e.g., US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al, Prot Eng 9, 617-621 (1996) and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001) .

[0216] In a particular embodiment, in the CH3 region of an Fc region, the threonine residue at position 366 is replaced with a tyrosine residue (T366Y) ; or the threonine residue at position 366 is replaced with a tryptophan residue (T366W) ; in the CH3 region of the other Fc region, the tyrosine residue at position 407 was replaced with a Threonine residue (Y407T) ; or, the threonine residue at position 366 was replaced with a serine residue (T366S) , the Leucine residue at position 368 is replaced with a alanine residue (L368A) and the tyrosine residue at position 407 was replaced with a valine residue (Y407V) (numbering according to the EU index) .

[0217] In a particular embodiment, each Fc region of the Fc scaffold further comprises mutations to form non-natural disulfide bond. For example, in one Fc region, the serine residue at position 354 is replaced with a cysteine residue (S354C) or the glutamic acid residue at position 356 is replaced with a cysteine residue (E356C) (in particular, the serine residue at position 354 is replaced with a cysteine residue) ; and in the other Fc region, the tyrosine residue at position 349 is replaced with a cysteine residue (Y349C) (numbering according to the EU index)

[0218] In yet another embodiment, in the CH3 region of an Fc region, the threonine residue at position 366 is replaced with a tryptophan residue (T366W) , and the serine residue at position 354 is replaced with a cysteine residue (S354C) or the glutamic acid residue at position 356 is replaced with a cysteine residue (E356C) (in particular, the serine residue at position 354 is replaced with a cysteine residue) ; whereas in the CH3 region of the other Fc region, the threonine residue at position 366 is replaced with a serine residue (T366S) , the leucine residue at position 368 is replaced with an alanine residue (L368A) , and the tyrosine residue at position 407 is replaced with a valine residue (Y407V) (numbering according to the EU index) , optionally the tyrosine residue at position 349 is replaced with a cysteine residue (Y349C) (numbering according to the EU index) .

[0219] In a further embodiment, the Fc heterodimer formation can be further enhanced through electrostatic steering effects. For example, in one Fc region, K392D and / or K409D were introduced and in the other Fc region, E356K and / or D399K were introduced.

[0220] In a particular embodiment, one Fc region comprises the amino acid substitutions S354C and T366W and the other Fc region comprises the amino acid substitutions Y349C, T366S, L368A and Y407V (numbering according to the EU index) .

[0221] In a particular embodiment, one Fc region comprises the amino acid substitutions S354C, T366W, E356K and D399K and the other Fc region comprises the amino acid substitutions Y349C, T366S, L368A, Y407V, K392D and K409D (numbering according to the EU index) .

[0222] In a particular embodiment, one Fc region comprises the amino acid substitutions LALA (L234A / L235A) , S354C, and T366W, optionally, further comprises the amino acid substitutions E356K and D399K; and the other Fc region comprises the amino acid substitutions LALA (L234A / L235A) , Y349C, T366S, L368A, and Y407V, optionally, further comprises the amino acid substitutions K392D and K409D (numbering according to the EU index) .

[0223] Thus, in a particular embodiment, the molecule of the present disclosure comprises two Fc regions that heterodimerize, wherein one Fc region polypeptide comprises or consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 65 or 68, while the other Fc region polypeptide comprises or consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 66 or 69.

[0224] Thus, in a particular embodiment, the molecule of the present disclosure comprise two Fc regions that heterodimerize, wherein one Fc region polypeptide comprises an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 65 or 68, while the other Fc region polypeptide comprises an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 66 or 69.

[0225] Thus, in a particular embodiment, the molecule of the present disclosure comprise two Fc regions that heterodimerize, wherein one Fc region polypeptide comprises an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 65 and comprises the mutations LALA (L234A / L235A) , Y349C, T366S, L368A, Y407V, E356K and D399K, while the other Fc region polypeptide comprises an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 66 and comprises the mutations LALA (L234A / L235A) , S354C, T366W, E356K and D399K; or wherein one Fc region polypeptide comprises an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 68 and comprises the mutations LALA (L234A / L235A) , S354C and T366W; while the other Fc region polypeptide comprises an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 69 and comprises the mutations LALA (L234A / L235A) , Y349C, T366S, L368A, and Y407V.

[0226] Properties of Fusion Proteins

[0227] In some embodiments, the T-FIT fusion protein can specifically bind to TCR target expressing cells.

[0228] In some embodiments, the T-FIT fusion protein can specifically activate T cells depending on target.

[0229] In some embodiments, the T-FIT fusion protein has potent redirected T-cell cytotoxicity to target cells.

[0230] In some embodiments, the T-FIT fusion protein has an activity with respect to in vivo tumor growth inhibition.

[0231] Pharmaceutical Compositions

[0232] The invention provides pharmaceutical compositions for use in treating a human subject comprising a T-FIT fusion protein as described herein. Such compositions are prepared using techniques and ingredients well-known in the art for preparing pharmaceutical compositions for administering a therapeutic antibody to human subjects.

[0233] A composition comprising a T-FIT fusion protein described herein may be formulated for administration by any of a variety routes or modes of administration. A composition comprising a T-FIT fusion protein may be formulated for parenteral or non-parenteral administration.

[0234] A composition comprising a T-FIT fusion protein for use in treating a cancer, autoimmune disease, or inflammatory disease may be formulated for parenteral administration, for example, but not limited to, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, or intramuscular administration. For example, a composition is formulated for intravenous administration. Such parenteral administration is for example carried out by injection or infusion of the composition.

[0235] Compositions comprising a T-FIT fusion protein for administration to a human individual may comprise an effective amount of the T-FIT fusion protein in combination with one or more pharmaceutically acceptable components such as a pharmaceutically acceptable carrier (vehicle, buffer) , excipient, or other ingredient.

[0236] By "pharmaceutically acceptable" is meant that a compound, component, or ingredient of a composition is compatible with the physiology of a human subject and also is not deleterious to the effective activity of the T-FIT fusion protein component or to a desired property or activity of any other component that may be present in a composition that is to be administered to a human subject.

[0237] Examples of pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, water, saline, phosphate buffered saline, dextrose, glycerol, ethanol and the like, as well as combinations thereof. In some cases, it may be preferable to include isotonic agents, including, but not limited to, sugars; polyalcohols, such as mannitol or sorbitol; sodium chloride; and combinations thereof. Pharmaceutically acceptable carriers may further comprise minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, preservatives, or buffers to enhance the shelf life or effectiveness of the composition. An excipient is generally any compound or combination of compounds that provides a desired feature to a composition other than a primary therapeutic activity. The pH may be adjusted in a composition as necessary, for example, to promote or maintain solubility of component ingredients, to maintain stability of one or more ingredients in the formulation, and / or to deter undesired growth of microorganisms that potentially may be introduced at some point in the procedure.

[0238] Compositions comprising a T-FIT fusion protein may also include one or more other ingredients such as other medicinal agents (for example, an anti-cancer agent, an antibiotic, an anti-inflammatory compound, an anti-viral agent) , fillers, formulation adjuvants, and combinations thereof.

[0239] The compositions according to the invention may be in a variety of forms. These include, but are not limited to, liquid, semi-solid, and solid dosage forms, dispersions, suspensions, tablets, pills, powders, liposomes, and suppositories. The preferred form depends on the intended route of administration. Preferred compositions are in the form of injectable or infusible solutions, such as compositions similar to those used administration of therapeutic antibodies approved for use in humans. In a preferred embodiment, a T-FIT fusion protein described herein is administered by intravenous injection or infusion. In another embodiment, a T-FIT fusion protein is administered by intramuscular or subcutaneous injection.

[0240] Therapeutic compositions must be sterile and stable under the conditions of manufacture and storage. The composition can be formulated as a solution, microemulsion, dispersion, liposome, or other structure suitable for high drug concentration. Sterile injectable solutions may be prepared by incorporating the active compound, i.e., a T-FIT fusion protein, in the required amount in an appropriate solvent, optionally with one or a combination of ingredients that provide a beneficial feature to the composition, as required, followed by filtered sterilization. Generally, dispersions are prepared by incorporating the active ingredient into a sterile vehicle that contains a basic dispersion medium (for example, sterile water, sterile isotonic saline, and the like) and optionally one or more other ingredients that may be required for adequate dispersion. In the case of sterile, lyophilized powders for the preparation of sterile injectable solutions, preferred methods of preparation include vacuum drying and spray-drying that produces a powder of the active ingredient plus any additional desired ingredient from a previously sterile-filtered solution thereof. The proper fluidity of a solution can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersion, and by the use of surfactants. Prolonged absorption of injectable compositions can be brought about by including in the composition an agent that delays absorption, for example, a monostearate salt and / or gelatin.

[0241] A T-FIT fusion protein may be administered by a variety of methods known in the art. As will be appreciated by the skilled practitioner, the route or mode of administration will vary depending upon the desired results. In certain embodiments, a T-FIT fusion protein may be prepared with a carrier that will protect the antibody against rapid release, such as a controlled release formulation, including implants, transdermal patches, and microencapsulated delivery systems. Biodegradable, biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, a polyanhydride, a polyglycolic acid, a collagen, a polyorthoester, and a polylactic acid. A variety of methods for the preparation of such formulations are known to those skilled in the art.

[0242] A pharmaceutical composition disclosed above may be prepared for administration to an individual by at least one mode selected from the group consisting of: parenteral, subcutaneous, intramuscular, intravenous, intrarticular, intrabronchial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginous, intracavitary, intracelial, intracerebellar, intracerebroventricular, intracolic, intracervical, intragastric, intrahepatic, intramyocardial, intraosteal, intrapelvic, intrapericardiac, intraperitoneal, intrapleural, intraprostatic, intrapulmonary, intrarectal, intrarenal, intraretinal, intraspinal, intrasynovial, intrathoracic, intrauterine, intravesical, bolus, vaginal, rectal, buccal, sublingual, intranasal, and transdermal.

[0243] In some embodiments, the disclosure further provides a pharmaceutical combination or a pharmaceutical combination product, which comprises the T-FIT fusion protein of the disclosure, and one or more other therapeutic agents.

[0244] Another object of the disclosure is to provide a kit comprising the pharmaceutical combination of the invention, for example in the form of drug dose unit. Therefore, the dose unit can be provided according to the regimen or interval of the administration.

[0245] In one embodiment, the kit of the disclosure comprises:

[0246] -a first container comprising a pharmaceutical composition containing the T-FIT fusion protein of the disclosure;

[0247] -a second container comprising a pharmaceutical composition containing other therapeutic agent (s) .

[0248] Nucleic Acid, Vector, and Host Cells

[0249] The disclosure provides an isolated polynucleotide or isolated polynucleotides encoding each or all of the polypeptide chains of a T-FIT fusion protein described herein.

[0250] The disclosure also provides a vector comprising the isolated polynucleotide or polynucleotides encoding each or all of the polypeptide chains of a T-FIT fusion protein described herein. A vector may be an autonomously replicating vector or a vector that incorporates the isolated nucleic acid that is present in the vector into a host cell genome. The isolated polynucleotide or isolated polynucleotides encoding each or all of polypeptide chains of a T-FIT fusion protein may also be inserted into a vector for carrying out various genetic analyses, for expressing a T-FIT fusion protein, or for characterizing or improving one or more properties of a T-FIT fusion protein described herein.

[0251] A vector according to the disclosure may be used to replicate the isolated polynucleotide or isolated polynucleotides encoding each or all polypeptide chains of a T-FIT fusion protein described herein.

[0252] A vector according to the disclosure may be used to express the isolated polynucleotide or isolated polynucleotides encoding a T-FIT fusion protein described herein or to express the isolated polynucleotide or isolated polynucleotides encoding one or more polypeptide chains of the T-FIT fusion protein. Preferred vectors for cloning and expressing nucleic acids described herein include, but are not limited, pcDNA, pTT (Durocher et al, Nucleic Acids Res., 30 (2e9) : 1-9 (2002) ) , pTT3 (pTT with additional multiple cloning sites) , pEFBOS (Mizushima and Nagata, Nucleic Acids Res., 18 (17) : 5322 (1990) ) , pBV, pJV, pcDNA3.1, pcDNA3.1 TOPO, pEF6 TOPO and pBJ.

[0253] The disclosure also provides an isolated host cell comprising the isolated polynucleotide or polynucleotides or a vector described above. Such an isolated host cell comprising a vector described herein may be an isolated prokaryotic cell or an isolated eukaryotic cell.

[0254] An isolated prokaryotic host cell comprising a polynucleotide or vector described herein may be a bacterial host cell. The bacterial host cell may be a Gram positive, Gram negative, or Gram variable bacterial host cell. For example, a bacterial host cell comprising a polynucleotide, or a vector described herein is a Gram-negative bacterium. For example, a bacterial host cell comprising a polynucleotide (s) or a vector described herein is an Escherichia coli cell.

[0255] An isolated host cell comprising a polynucleotide, or a vector described herein may be a eukaryotic host cell. Preferred isolated eukaryotic host cells comprising a polynucleotide or a vector described herein may include, without limitation, a mammalian host cell, an insect host cell, a plant host cell, a fungal host cell, a eukaryotic algal host cell, a nematode host cell, a protozoan host cell, and a fish host cell. For example, an isolated mammalian host cell comprising a polynucleotide or a vector described herein is selected from the group consisting of: a Chinese Hamster Ovary (CHO) cell, a COS cell, a Vero cell, an SP2 / 0 cell, an NS / 0 myeloma cell, a human embryonic kidney (HEK293) cell, a baby hamster kidney (BHK) cell, a HeLa cell, a human B cell, a CV-1 / EBNA cell, an L cell, a 3T3 cell, an HEPG2 cell, a PerC6 cell, and an MDCK cell. Preferred isolated fungal host cells comprising a polynucleotide or a vector described herein are selected from the group consisting of: Aspergillus, Neurospora, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia, and Candida. For example, a Saccharomyces host cell comprising a vector described herein is a Saccharomyces cerevisiae cell.

[0256] Production of Fusion Proteins

[0257] Also provided is a method of producing a T-FIT fusion protein described herein comprising culturing an isolated host cell comprising the polynucleotide described herein or the vector that comprises nucleic acid encoding each chain of the T-FIT fusion protein under conditions sufficient to produce the T-FIT fusion protein.

[0258] For recombinant production of the antibody molecules of the disclosure, nucleic acids encoding the fusion protein (e.g., any one polypeptide chain and / or multiple polypeptide chains of the fusion proteins) are isolated and inserted into one or more vectors for further cloning and / or expression in a host cell. Such nucleic acids are readily isolated and sequenced using conventional procedures (e.g., by using oligonucleotide probes that are capable of binding specifically to genes encoding the heavy and light chains of an antibody) .

[0259] Another aspect of the disclosure is a T-FIT fusion protein produced by a method described above.

[0260] Uses of Fusion Proteins

[0261] The present disclosure provides a T-FIT fusion protein as described herein for use in a method of treating a disease or disorder in a subject.

[0262] The present disclosure also provides a method for treating a disease or disorder in a subject, comprising administering the T-FIT fusion protein as described herein to the subject.

[0263] The present disclosure also provides a use of the T-FIT fusion protein as described herein in the manufacture of a medicament for treating a disease or disorder in a subject.

[0264] The disease or disorder described herein includes a disorder (or disease) in which specific target cells that express a disorder-associated antigen and are detrimental to a human subject, wherein the disorder-associated antigen is the one that the T-FIT fusion protein (e.g., the TCR moiety) binds to.

[0265] In some embodiments, the disorder-associated antigen comprises a peptide or T cell epitope that can form a complex with MHC, and thus the complex can be recognized and bound by TCR, e.g., the TCR moiety of the fusion protein. In some embodiments, the disorder-associated antigen is specially expressed by the cells detrimental to the subject suffering from the disorder or the disease. In some embodiments, the epitope or the peptide comprised in the antigen is selected from the group consisting of NY-ESO-1, MAGE-A3, gp100, Survivin, or KRAS, e.g., KRAS with G12D mutation or G12V mutation.

[0266] In some embodiments, the disorder or disease is characterized by an existence of the antigen or an elevated antigen in a nucleic acid or amino acid level, or an elevated activity of the antigen. In some embodiments, the disease or disorder of the present disclosure is a tumor or cancer. In some embodiments, the tumor or cancer, includes solid tumor and hematological tumor, as well as metastatic lesions. In one embodiment, examples of solid tumor include, but not limited to, malignant tumor, such as melanoma, breast cancer, bladder cancer, prostate cancer, non-small cell lung cancer (NSCLC) , hepatocellular carcinoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer (CRC) , head and neck cacer and hepatocellular carcinoma. The cancer may be in an early, intermediate, or advanced stage or metastatic cancer. In some embodiments, the cancer is melanoma.

[0267] In some embodiments, the disorder or disease may be beneficial from the treatment by the T-FIT fusion protein as described herein.

[0268] A T-FIT fusion protein described herein is particularly useful in a method of treating a disease or a disorder comprising a "retargeting" (or "recruiting" ) of effector cells (such as T cells, NK cells, monocytes, neutrophils, macrophages) to attack specific target cells that express a disorder-associated antigen and that are detrimental to a human subject and, therefore, where it is desirable to eliminate or substantially reduced the population of the detrimental target cells. Preferred examples of such detrimental target cells are tumor cells (e.g., blood (including lymph) tumor cells and solid tumor cells, e.g., melanoma cells) , auto-reactive cells, and virus infected cells. In a retargeting method of the invention, a T-FIT fusion protein binds an antigen expressed on the surface of an effector cell and a peptide-MHC complex wherein the peptide is comprised in an antigen expressed on the surface of a target cell that is detrimental to a human subject, wherein binding of the T-FIT fusion protein to the antigen on the effector cell and to the detrimental cell activates the effector cell to attack the detrimental target cell.

[0269] In some embodiments, the disorder or disease may be beneficial from the activation of the effector cells (such as T cells, NK cells, monocytes, neutrophils, macrophages) .

[0270] Examples

[0271] Example 1 Design and generation of TCR-Fab in tandem (T-FIT) fusion proteins

[0272] 1.1 Design and construction of T-FIT fusion proteins

[0273] To demonstrate the T-FIT technology, a series of TCR-Fab in tandem (T-FIT) fusion proteins were designed as shown in Figs. 1 to 9.

[0274] [FIG. 1 and FIG. 2] TCR alpha or beta chain is directly fused to N-terminus of IgG heavy chain, which forms the longest Chain #1. The other TCR chain (Chain #2) can then specifically assemble to the corresponding TCR chain in Chain #1, and the IgG light chain (Chain #3) assembles to the corresponding heavy chain. There is no linker sequence between TCR and IgG heavy chain.

[0275] [FIG. 3 and FIG. 4] Variable region of TCR alpha or beta chain is directly fused to a kappa light chain constant region (CL) or a first constant Ig domain of the heavy chain (CH1) . The C-terminus of CL is directly fused to N-terminus of IgG heavy chain, which forms the longest Chain #1. The CH1 domain of Chain #2 can then specifically assemble to the CL domain on Chain #1, and the IgG light chain (Chain #3) assembles to the corresponding heavy chain.

[0276] [FIG. 5 and FIG. 6] TCR alpha or beta chain is directly fused to N-terminus of IgG heavy chain to form Chain #1, while the other TCR chain directly fusing to N-terminus of an IgG light chain, forms Chain #2.

[0277] [FIG. 7] TCR alpha chain is directly fused to N-terminus of Ig Fc fragment to form Chain #3. By introducing Knob-into-Hole mutations in Fc fragment, Chain #1 and Chain #3 form heterodimers. Chain #2 and Chain #4 assemble to their corresponding Ig heavy chain or TCR beta chain.

[0278] [FIG. 8] On the basis of [FIG 7] design, a same TCR alpha chain is directly fused to N-terminus of IgG heavy chain, which forms the longest Chain #1. The TCR beta chain (Chain #2) can then specifically assemble to the corresponding TCR chain in Chain #1 and Chain #4.

[0279] [FIG. 9] On the basis of [FIG. 8] design, Chain #4 is replaced by the Ig heavy chain, and one of the TCR beta chains is replaced by Chain #3, assembling to the corresponding Chain #4.

[0280] 1.2 Expression and purification of T-FIT fusion proteins

[0281] A collection of TCR-Fab in tandem (T-FIT) fusion proteins (as shown in Table 1) were constructed and expressed in mammalian expression system.

[0282] Briefly, parental mAbs include anti-CD3ε (International Publication NO. WO2022 / 042488, or US patent publication No. 2022 / 0306740) , anti-PD-1 (International Publication NO. WO2019 / 210848) , and anti-NKp46 (PCT application NO. PCT / CN2024 / 077127) ; all of which are herein incorporated by reference in its entirety.

[0283] The TCR variable domains used herein are derived from the TCRs specific to the following complexes: HLA-C*08: 02 / KRAS (G12D) (TCR 9a; Malcolm J. W. et. al., PNAS, 117 (23) , 12826-12835 (2020) ) ; HLA-A*02: 01 / NY-ESO-1 (TCR 1G4_122; US patent publication No. 2022 / 0306720) ; HLA-A*01 / MAGE-A3 (TCR MAG-IC3; US patent publication No. 2022 / 0306720) ; HLA-A*02: 01 / gp100 (TCR gp100; US patent No. 8,519,100) ; and HLA-A*02: 01 / Survivin (TCR BIRC5; US patent publication No. 2022 / 0306740) ; all of which are herein incorporated by reference in its entirety.

[0284] Reference molecule Tandem-BsAb (Tandem Fab BsAb) is derived from US patent publication No. 2022 / 0306720. Reference molecule ABBV-184 analogue is derived from publication (Chervin AS, Stone JD, Konieczna I, et al. ABBV-184: A Novel Survivin-specific TCR / CD3 Bispecific T-cell Engager is Active against Both Solid Tumor and Hematologic Malignancies. Molecular Cancer Therapeutics. 2023; 22 (8) : 903-912. doi: 10.1158 / 1535-7163. MCT-22-0770) .

[0285] For each fusion protein, DNA molecules encoding amino acid sequences of each component polypeptide chain were synthesized and cloned into pcDNA3.1 mammalian expression vectors. The three recombinant pcDNA3.1 expression vectors for expressing each of the three component polypeptide chains were co-transfected into HEK 293E cells. After six days of post-transfection cell culture, the supernatants were harvested and subjected to protein-A affinity chromatography to obtain purified proteins. Purity of eluted fusion proteins were analyzed by size-exclusion chromatography (SEC) . Molecules list and production data were summarized in Table 1, and the amino acid sequences were listed in Table 2.

[0286] Across different TCR and Fab combinations, the TCR-Fab in tandem (T-FIT) fusion protein designs of Fig. 1 and Fig. 2 resulted in higher than 90%purity after one-step protein-A affinity chromatography.

[0287] TABLE 1: List of T-FIT molecules

[0288] N / E: No Expression

[0289] TABLE 2: Amino acid sequences of T-FIT molecules

[0290] Variable regions in bold; CL regions in italics; CH1 regions underlined.

[0291] Example 2 HLA-C*08: 02 / KRAS (G12D) specific T-FIT fusion protein showed target dependent T cell activation.

[0292] As described in Example 1, FIT2022-2a and FIT2022-16a are constructed with the same TCR and IgG targeting HLA-C*08: 02 / KRAS (G12D) peptide complex and human CD3ε respectively. The TCR alpha chain is directly fused to the N-terminus of IgG heavy chain for FIT2022-2a, while the TCR beta chain is directly fused to the N-terminus of IgG heavy chain for FIT2022-16a.

[0293] To measure target dependent CD3 activation by T-FIT proteins, a co-cultured reporter gene assay was used. In this assay, Jurkat / NFAT / luc cells trigger downstream luciferase signal when cell surface CD3 is activated. To prepare MHC / peptide complex expressing target cells, 96-well plate was seeded with 10,000 COS7 cells (NANJING COBIOER, Cat#CBP60927) in 100ul assay medium (DMEM+10%FBS) per well and incubated overnight at 37℃. The next day, synthesized pcDNA3.1 plasmids encoding full length sequence of HLA-C*08: 02 followed by a T2A sequence (SEQ ID NO: 61) and human Beta-2 microglobulin (SEQ ID NO: 62) and KRAS (SEQ ID NO: 53, with G12D mutations) were co-transfected into COS7 with LipofectamineTM 3000 according to the manufacturer’s instructions. After another 48 hours of incubation at 37℃, supernatants were discarded, and plate was washed once with assay medium. 50uL of each test articles at concentration of 200nM were premixed with 30,000 Jurkat / NFAT / luc cells and added to each well. Plate was then incubated at 37℃ for 5 hours followed by adding 100ul ONE-Glo reagent (Promega, Cat#E6120) into wells. Plates were read for luminescence signals with VarioskanTM LUX microplate reader (ThermoFisher Scientific) .

[0294] The results are shown in FIG. 10. An irrelevant human IgG (hIgG) (humanized anti-Rac-hIgG1 (AA, EEM) antibody targeting small molecule Rac, comprising the constant region of human IgG1 LALA) was used as negative control. The parental COS7 cell without transfection of MHC / peptide complex was used to assess non-target dependent T-cell activation. In this assay, T-FIT molecules FIT2022-2a and FIT2022-16a showed MHC / peptide complex dependent activation of human T-cells and much less signal in target irrelevant setting.

[0295] The result was further confirmed with series diluted T-FIT molecule FIT2022-2a. A more restricted TCR target control was prepared by transfecting COS7 cells with synthesized pcDNA3.1 plasmids encoding full length sequence of HLA-C*08: 02 followed by a T2A sequence (SEQ ID NO: 61) and human Beta-2 microglobulin (SEQ ID NO: 62) and KRAS (SEQ ID NO: 54, with G12V mutations) . As shown in FIG. 11, FIT2022-2a showed dose dependent and TCR target specific activation of human T-cells, while it had minimum activation when cocultured with COS7 cells with KRAS (G12V) mutation. The result indicates that T-FIT molecules can maintain its TCR target specificity and efficiently activate T-cells when recognizing the specific MHC / peptide complexes.

[0296] Example 3 Characterization of HLA-A*02: 01 / NY-ESO-1 specific T-FIT fusion protein

[0297] 3.1 HLA-A*02: 01 / NY-ESO-1 specific T-FIT fusion protein FIT2022-29a showed specific binding to TCR target expressing cells.

[0298] The T2 cell line (Shanghai Jiya Biotechnology, XY-XB-3269) is a negative mutant for “Transporter associated with antigen processing” (TAP protein) , expressing an empty HLA-A*02: 01 allele of the MHC class I molecule on the cell surface. To confirm that MHC peptides indeed bind to HLA-A*02, T2 cell line is often used.

[0299] Briefly, T2 cells were washed once with growth medium (RPMI1640+10%FBS) , NY-ESO-1 peptide (SLLMWITQC) was added to cells at 6 ug / ml. After 3 hours of incubation in tissue culture incubator (37℃, 5%CO2) , cells were washed three times with PBS, then seeded at 300,000 cells per well into 96 well plate. After 10min of incubation with Fc blocker (Biolegend Cat#422302) at room temperature, 100ul test articles (10X serial dilution, from 30ug / ml to 0.03ug / ml) were added and gently mixed with pipette tips. After 45 minutes of incubation at 4℃, plates were washed to remove excess test articles. Fluorochrome-conjugated goat anti-human IgG antibody (Jackson Immunoresearch, Cat#109-606-098) was then added and incubated with cells at 4℃ for 20 minutes. After another round of wash, cells were resuspended in assay buffer (1X PBS containing 2%FBS) for reading on a flow-cytometer. The results shown in FIG. 12 illustrate the binding activity of FIT2022-29a to NY-ESO-1 peptide pulsed T2 cells.

[0300] 3.2 HLA-A*02: 01 / NY-ESO-1 specific T-FIT fusion protein FIT2022-29a showed target dependent T cell activation.

[0301] In this assay, NY-ESO-1 peptide pulsed T2 cells were cocultured as TCR target expressing cells. 96-well plate was seeded with 30,000 T2 cells per well in 50ul complete medium (RPMI1640 + 10%FBS) . NY-ESO-1 peptide (SLLMWITQC) was added to cells at 1 ug / ml and incubated overnight. Serial diluted test articles were pre-mixed with Jurkat / NFAT / luc cells and added into wells and incubated at 37℃ for 5 hours followed by adding 100ul ONE-Glo reagent (Promega, Cat#E6120) . Plates were read for luminescence signals with VarioskanTM plate reader. As shown in FIG. 13, FIT2022-29a can specifically activate T-cells when cocultured with NY-ESO-1 peptide (SLLMWITQC) pulsed T2 cells.

[0302] 3.3 HLA-A*02: 01 / NY-ESO-1 specific T-FIT fusion protein FIT2022-29a showed potent redirected T-cell cytotoxicity to target cells.

[0303] The cytolytic activity of human T cells was assessed with CytoTox  Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, Cat#G1780) in 96 well plates.

[0304] T2 cells were mixed with human T cells in culture medium (RPMI1640+10%FBS) at an effector: target ratio of 4: 1. Serial diluted FIT2022-29a and a published Tandem BsAb (Froning, K. et al. Nat. Commun. 11, 2020) . starting from 100nM to 0.0001nM was added to the cell mixture and NY-ESO-1 peptide (SLLMWITQC) (or not as a negative control) was added to cells at 1ug / ml. Samples of supernatant were removed and transferred into a clear-bottom 96-well plate (Corning, 3599) and measured with a plate reader. The percentage of target cell lysis was calculated according to the manufacturer’s instructions. Calculated lysis percentages were plotted against test articles concentration with GraphPad Prism software.

[0305] As shown in FIG. 14, both FIT2022-29a and Tandem bsAb induced T-cell lysis of T2 cells in the presence of NY-ESO-1 peptide, while FIT2022-29a is more potent than the published Tandem bsAb at low concentrations.

[0306] Example 4 Characterization of HLA-A*01 / MAGE-A3 specific T-FIT fusion protein

[0307] 4.1 HLA-A*01 / MAGE-A3 specific T-FIT fusion protein FIT2022-30a showed target dependent T cell activation.

[0308] MAGE-A3 and HLA-A*01 double positive human melanoma cell line A375 (ATCC, CRL-1619) was used as TCR target expressing cells. 96-well plate was seeded with 30,000 A375 cells and 30,000 Jurkat / NFAT / luc cells per well in 50ul complete medium (RPMI1640 + 10%FBS) . 50 uL of serial diluted test articles were added into wells and incubated at 37℃ for 5 hours followed by adding 100ul ONE-Glo reagent (Promega, Cat#E6120) . Plates were read for luminescence signals with VarioskanTM plate reader. As shown in FIG. 15, FIT2022-30a can dose dependently activate T-cells in the presence of target expressing A375 cells.

[0309] 4.2 HLA-A*01 / MAGE-A3 specific T-FIT fusion protein FIT2022-30a showed potent redirected T-cell cytotoxicity to target cells.

[0310] The cytolytic activity of human T cells was assessed with  Luminescent Cell Viability Assay (CTG) (Promega, Cat#G7572) in 96 well plates. A375 cells were mixed with human T-cell in culture medium (RPMI1640+10%FBS) at an effector: target ratio of 5: 1. Serial diluted test articles (100nM to 0.00001nM) were added into wells and incubated at 37℃ for 48 hours. After incubation, plate attached A375 cells were washed once with DPBS and cells viability was assessed with CTG assay kit. The luminescence was measured with a plate reader (Molecular Devices, Paradigm) . The percentage of specific lysis was determined as following:

[0311] %Lysis=100%x (1-RLU of sample wells / RLU of untreated wells)

[0312] Calculated lysis percentages were plotted against test articles concentration with GraphPad Prism software. As shown in FIG. 16, FIT2022-30a induced potent and dose dependent T-cell lysis of A375 cells.

[0313] 4.3 HLA-A*01 / MAGE-A3 specific T-FIT fusion protein FIT2022-30a showed in vivo tumor growth inhibition in xenograft mouse model.

[0314] Anti-tumor efficacy was evaluated in A375 xenograft model in PBMC engraft mice. Female NCG mice aged 8-10 weeks (Gempharmatech Co., Ltd) were used in this study. Briefly, 5x106 A375 cells suspended in 0.2ml DPBS containing 50%ABW Matrigel were subcutaneously injected into the right flank of mice. On the same day, these mice received a single intraperitoneal injection of 8x106 human PBMC. On 14 days post tumor cell inoculation, huCD45+ cells in mouse peripheral blood were detected by using FACS, indicating successful PBMC engraftment. Tumor bearing mice with tumor size of 130-200 mm3 were selected and randomly grouped (5 mice per group) . Treatment was initiated on the same day (Day 0) . Mice were administered intraperitoneally (i.p. ) with vehicle control (DPBS, Basal Media, Cat#B210KJ) or 16 mg / kg of FIT2022-30a on Day 0, Day 4 and Day 9. Tumor volumes were measured 2-3 times per week.

[0315] FIG. 17 shows the average tumor volumes of each group at different time points. The result indicates FIT2022-30a has strong tumor growth inhibition in the A375 xenograft model.

[0316] Example 5 Characterization of HLA-A*02: 01 / Survivin specific T-FIT fusion protein

[0317] 5.1 Affinity measurement of CD3 and pMHC binding arms

[0318] Binding kinetics and affinities of CD3 binding arm and pMHC binding arm were measured by grating coupled interferometry (GCI) on a WAVEsystem (Malvern Panalytical) according to the manufacturer’s instructions.

[0319] Briefly goat anti-human IgG Fc antibody was immobilized onto a PCP WAVEchip (Malvern Panalytical) to a density of ～6000 pg / mm2 by amine coupling. Antibodies were then captured onto the 4PCP WAVEchip to a density of 150-350 pg / mm2. For FIT2022-130a, recombinant human CD3ε / γ (KACTUS, Cat#CD3-HM157) was injected at concentrations of 246.9 pM, 740.7 pM, 2.2 nM, 6.7 nM and 20 nM respectively in kinetics buffer (GE, cat#BR100669) . For FIT-2022-132a and ABBV-184, human CD3ε / γ was injected at concentrations of 31.25 nM, 62.5 nM, 125 nM, 250 nM, 500 nM and 1000 nM respectively. Recombinant pMHC complex (KACTUS, cat#MHC-HM474T) was injected at concentrations of 274.3 pM, 823.0 pM, 2.5 nM, 7.4 nM, 22.2 nM, 66.7 nM and 200 nM respectively. After each round of association and dissociation, WAVEchip surface was regenerated by injection of Glycine-HCl buffer at pH 1.5 for 120s. All sensorgrams were recorded at 25 ℃ and data were analyzed with the WAVEcontrol software (Malvern Panalytical) . Data were double referenced by substracting the signals from blank injections and from the reference channel. A Langmuir 1: 1 model or a conformational change model were used for data fitting.

[0320] The measured kinetics and affinities were shown in Table 3 below.

[0321] TABLE 3: Kinetics and affinities of fusion proteins

[0322] 5.2 HLA-A*02: 01 / Survivin specific T-FIT fusion protein FIT2022-130a showed potent redirected T-cell cytotoxicity to target positive tumor cells

[0323] The in vitro redirected T-cell cytotoxicity is evaluated using a co-culture assay involving T cells and tumor cells, with the tumor cells viability as endpoint readout detected by flow cytometry. Briefly, tumor cells OCI-AML2 (Cobioer, CBP60527) were labeled with Far Red dye (Thermo Fisher Scientific, C34564) and subsequently mixed with human T cells isolated from human PBMCs (Milestone, PB100C) . Test articles were diluted to concentrations of 100, 10, 1, 0.1, 0.01, and 0.001 nM and added to the culture. Following a 24-hour incubation, the cell mixture was analyzed using a Flow Cytometer (iQue3, Sartorius) to count the number of live tumor cells. The calculated percentages of lysis were then plotted against concentrations of the test articles with GraphPad Prism software. The percentage of specific lysis was determined as following:

[0324] %Lysis=100%x (1-cell count of sample wells / cell count of untreated wells)

[0325] As shown in FIG. 18, FIT2022-130a and -132a induced potent and dose-dependent T-cell lysis of OCI-AML2 cells, which is comparable with ABBV-184 analogue.

[0326] 5.3 HLA-A*02: 01 / Survivin specific T-FIT fusion protein FIT2022-130a eradicated tumor in vivo

[0327] Anti-tumor efficacy was evaluated in OCI-AML2 xenograft model in PBMC engraft mice. Female NCG mice aged 6-8 weeks (Gempharmatech Co., Ltd) were used in this study. Briefly, mice received a single intraperitoneal injection of 8x106 human PBMC. After 7days, 5x106 OCI-AML2 cells suspended in 0.1ml DPBS containing 50%ABW Matrigel were subcutaneously injected into the right flank of mice. 10 days post tumor cell inoculation, huCD45+ cells in mouse peripheral blood were detected using FACS, indicating successful PBMC engraftment. Tumor bearing mice with tumor size of 70-200 mm3 were selected and randomly grouped (5 mice per group) . Treatment was initiated on the same day (Day 0) . Mice were administered intraperitoneally (i. p. ) with vehicle control, ABBV-184 analogue or FIT2022-130a on Day 0. Tumor volumes were measured 2-3 times per week.

[0328] List of Sequences

[0329] Equivalents

[0330] While specific embodiments of the subject disclosure have been discussed, the above specification is illustrative and not restrictive. Many variations of the disclosure will become apparent to those skilled in the art upon review of this specification and the claims below. The full scope of the present disclosure should be determined by reference to the claims, along with their full scope of equivalents, and the specification, along with such variations.

[0331] References

[0332] 1. Peri, A. et al. The landscape of T cell antigens for cancer immunotherapy. Nature Cancer at https:  / / doi. org / 10.1038 / s43018-023-00588-x (2023) .

[0333] 2. Baulu, E., Gardet, C., Chuvin, N. &Depil, S. TCR-engineered T cell therapy in solid tumors: State of the art and perspectives. Sci. Adv. 9, eadf3700 (2023) .

[0334] 3. Hong, D. S. et al. Autologous T cell therapy for MAGE-A4+ solid cancers in HLA-A*02+ patients: a phase 1 trial. Nat. Med. (2023) doi: 10.1038 / s41591-022-02128-z.

[0335] 4. Kim, S. P. et al. Adoptive Cellular Therapy with Autologous Tumor-Infiltrating Lymphocytes and T-cell Receptor-Engineered T Cells Targeting Common p53 Neoantigens in Human Solid Tumors. Cancer Immunol. Res. 10, 932–946 (2022) .

[0336] 5. Froning, K. et al. Computational stabilization of T cell receptors allows pairing with antibodies to form bispecifics. Nat. Commun. 11, (2020) .

[0337] 6. Hsiue, E. H. -C. et al. Targeting a neoantigen derived from a common TP53 mutation. Science (80-. ) . 8697, eabc8697 (2021) .

[0338] 7. Douglass, J. et al. Bispecific antibodies targeting mutant RAS neoantigens. Sci. Immunol. 6, (2021) .

[0339] 8. Nathan, P. et al. Overall Survival Benefit with Tebentafusp in Metastatic Uveal Melanoma. N. Engl. J. Med. 385, 1196–1206 (2021) .

Claims

1.A TCR-Fab in tandem (T-FIT) fusion protein, comprising a TCR moiety and an immunoglobulin moiety, wherein:the TCR moiety comprises an antigen binding variable (V) region of a TCR, wherein the variable region of TCR comprises an α chain V region (Vα) and a β chain V region (Vβ) ; andthe immunoglobulin moiety comprises an antigen-binding portion (ABP) comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region of an immunoglobulin.2.The fusion protein of claim 1, wherein the TCR moiety comprises, from N-terminus to C-terminus:Vα-Cα and Vβ-Cβ;Vα-CH1 and Vβ-CL; orVα-CL and Vβ-CH1;wherein the antigen binding portion (ABP) is a Fab comprising VH-CH1 and VL-CL;wherein Vα is a variable domain of a TCR α chain, and Cα is a constant domain of a TCR α chain, Vβ is a variable region of a TCR β chain and Cβ is a constant domain of a TCR β chain;wherein VL is a light chain variable domain, CL is a light chain constant domain, VH is a heavy chain variable domain, CH1 is a heavy chain constant domain;wherein Vα-Cα pairs with Vβ-Cβ, Vα-CH1 pairs with Vβ-CL, or Vα-CL pairs with Vβ-CH1 to form a TCR moiety that is capable of binding a peptide-MHC complex; and VL-CL pairs with VH-CH1 to form a Fab that specifically binds an antigen or epitope.3.The fusion protein of claim 2, comprising at least three polypeptide chains, wherein:(1) the first polypeptide chain comprising, from N-terminus to C-terminus, Vα-Cα-VHB-CH1-Fc, the second polypeptide chain comprising, from N-terminus to C-terminus, Vβ-Cβ, and the third polypeptide chain comprises, from N-terminus to C-terminus, VLB-CL; orthe first polypeptide chain comprises, from N-terminus to C-terminus, Vβ-Cβ-VHB-CH1-Fc, the second polypeptide chain comprises, from N-terminus to C-terminus, Vα-Cα, and the third polypeptide chain comprises, from N-terminus to C-terminus, VLB-CL;wherein Vα-Cα pairs with Vβ-Cβ to form a TCR moiety that is capable of binding a peptide-MHC complex, and VLB-CL pairs with VHB-CH1 to form a Fab that specifically binds an antigen or epitope;wherein two of the first polypeptide chains, two of the second polypeptide chains, and two of the third polypeptide chains are associated to form a TCR-Fab in tandem (T-FIT) fusion protein;(2) the first polypeptide chain comprising, from N-terminus to C-terminus, Vα-CL-VHB-CH1-Fc, the second polypeptide chain comprising, from N-terminus to C-terminus, Vβ-CH1, and the third polypeptide chain comprising, from amino to carboxyl terminus, VLB-CL; orthe first polypeptide chain comprising, from N-terminus to C-terminus, Vβ-CL-VHB-CH1-Fc, the second polypeptide chain comprising, from N-terminus to C-terminus, Vα-CH1, and the third polypeptide chain comprising, from N-terminus to C-terminus, VLB-CL;wherein Vα-CL pairs with Vβ-CH1 to form a TCR moiety that specifically binds a peptide-MHC complex or Vα-CH1 pairs with Vβ-CL to form a TCR moiety that specifically binds a peptide-MHC complex, and VLB-CL pairs with VHB-CH1 to form a Fab that specifically binds an antigen or epitope;wherein two of the first polypeptide chains, two of the second polypeptide chains, and two of the third polypeptide chains are associated to form a TCR-Fab in tandem (T-FIT) fusion protein.4.The fusion protein of claim 2, comprising at least two polypeptide chains, wherein:(i) the first polypeptide chain comprising, from N-terminus to carboxyl terminus, Vα-Cα-VHB-CH1-Fc, and the second polypeptide chain comprising, from N-terminus to C-terminus, Vβ-Cβ-VLB-CL; or(ii) the first polypeptide chain comprising, from N-terminus to C-terminus, Vβ-Cβ-VHB-CH1-Fc, and the second polypeptide chain comprising, from N-terminus to C-terminus, Vα-Cα-VLB-CL;wherein Vα-Cα pairs with Vβ-Cβ to form a TCR moiety that is capable of binding a peptide-MHC complex, and VLB-CL pairs with VHB-CH1 to form a Fab that specifically binds an antigen or epitope;wherein two of the first polypeptide chains, and two of the second polypeptide chains are associated to form a TCR-Fab in tandem (T-FIT) fusion protein.5.The fusion protein according to any one of claims 1 to 4, wherein the immunoglobulin moiety or Fab specifically binds to an antigen expressed on an effector cell of the immune system,optionally, the immunoglobulin moiety or Fab specifically binds to CD3, CD4, CD8, CD28, CD16a, CD64, NKG2D or NKp46; for instance, the immunoglobulin moiety or Fab specifically binds to CD3 on T cell, e.g., CD3ζ, CD3ε, CD3δ, CD3γ; e.g., CD3ε.6.The fusion protein of claim 5, wherein immunogolubin moiety or Fab specifically binds to CD3, and comprises a set of six CDRs, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, and CDR-L3, wherein:CDR-H1 comprises or consists of the amino acid sequence of NYYVH (SEQ ID NO: 77) ;CDR-H2 comprises or consists of the amino acid sequence of WISPGSDNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 78) ;CDR-H3 comprises or consists of the amino acid sequence of DDYGNYYFDY (SEQ ID NO: 79) ;CDR-L1 comprises or consists of the amino acid sequence of KSSQSLLNARTRKNYLA (SEQ ID NO: 80) ;CDR-L2 comprises or consists of the amino acid sequence of WASTRES (SEQ ID NO: 81) ; andCDR-L3 comprises or consists of the amino acid sequence of KQSYILRT (SEQ ID NO: 82) ;optionally, the CDRs are defined according to Kabat numbering,7.The fusion protein of claim 6, wherein the immunogolubin moiety or Fab specifically binds to CD3, and comprises:a VH domain comprising or consisting of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 70-75 and 96, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith, and / ora VL domain comprising or consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76 or 97, or a sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith.8.The fusion protein according to any one of claims 2 to 4, whereinthe CH1 region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 59, or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith;the CL region comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 57, or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith;the Cα domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 55 or 63, or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith; and / orthe Cβ domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 56 or 64, or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or more identity therewith.9.The fusion protein according any one of claims 3 to 8, wherein the Fc region is a human IgG Fc, e.g., human IgGl Fc, human IgG2 Fc, or human IgG4 Fc,optionally, the Fc region comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67, or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99%or more identity therewith.10.The fusion protein of claim 9, wherein the Fc region comprises one or more mutations selected from L234A / L235A mutation, M252Y / S254T / T256E mutations, and P329A / G mutation, e.g., the Fc region comprises L234A / L235A and M252Y / S254T / T256E mutations;optionally, the Fc region comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99%or more identity therewith.11.The fusion protein according to any one of claims 1 to 10, wherein there’s no linker inserted between each domain in said fusion protein.12.The fusion protein according to any one of claims 1 to 11, wherein the TCR moiety of the fusion protein mediates the antigen-specific binding of the fusion protein to a T cell epitope-MHC or a peptide-MHC complex,optionally, the MHC is selected from MHC class I and MHC class II, e.g., MHC class I HLA-A*01, MHC Class I HLA-A*02: 01, or MHC Class I HLA-C*08: 02;optionally, the peptide is a disorder-associated antigen, such as those expressed on the surface of or in a cell that is considered detrimental to an individual and therefore is desired to be eliminated to substantially reduced in population, e.g., NY-ESO-1, MAGE-A3, gp100, Survivin, or KRAS, e.g., KRAS with G12D mutation or G12V mutation;optionally, the peptide-MHC complex is selected from HLA-C*08: 02 / KRAS (G12D) , HLA-A*02: 01 / NY-ESO-1, HLA-A*01 / MAGE-A3, HLA-A*02: 01 / gp100, and HLA-A*02: 01 / Survivin.13.An isolated polynucleotide encoding the fusion protein of any one of claims 1 to 12.14.A vector comprising the isolated polynucleotide of claim 13.15.A host cell comprising the isolated polynucleotide of claim 13 or the vector of claim 14.16.A method of producing a T-FIT fusion protein according to any one of claims 1 to 12, comprising culturing an isolated host cell comprising the polynucleotide of claim 13 or the vector of claim 14 under conditions sufficient to produce said T-FIT fusion protein.17.A pharmaceutical composition comprising the fusion protein of any one of claims 1 to 12, and optionally one or more pharmaceutically acceptable components such as a pharmaceutically acceptable carrier (vehicle, buffer) , excipient, or other ingredient.18.The fusion protein according to any one of claims 1 to 12, for use in therapy, e.g., in the treatment of a disorder or disease.19.The fusion protein for use according to claim 18, wherein said disorder or disease is a tumor or cancer including solid tumor and hematological tumor.20.The fusion protein for use according to claim 19, wherein the tumor or cancer cells of said tumor or cancer express a peptide that can be recognized by the TCR moiety of said fusion protein;optionally, said peptide is selected from NY-ESO-1, MAGE-A3, gp100, Survivin, or KRAS, e.g., KRAS with G12D mutation and G12V mutation.21.The fusion protein for use according to claim 20, wherein said tumor or cancer is selected from melanoma, breast cancer, bladder cancer, prostate cancer, non-small cell lung cancer (NSCLC) , hepatocellular carcinoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer (CRC) , head and neck cacer and hepatocellular carcinoma.22.A method for treating a disorder or disease in a subject in need thereof, comprising administering the fusion protein of any one of claims 1 to 12 to the subject,optionally, said disorder or disease is a tumor or cancer, including solid tumor and hematological tumor;optionally, the tumor or cancer cells of said tumor or cancer express a peptide that can be recognized by the TCR moiety of the fusion protein, optionally, said peptide is selected from NY-ESO-1, MAGE-A3, gp100, Survivin, or KRAS, e.g., KRAS with G12D mutation or G12V mutation;optionally, said tumor or cancer is selected from melanoma, breast cancer, bladder cancer, prostate cancer, non-small cell lung cancer (NSCLC) , hepatocellular carcinoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer (CRC) , head and neck cacer and hepatocellular carcinoma.

Images