Engineered il-2 variants and methods of use thereof

Abstract

Engineered IL-2 variants, and methods of use thereof. The engineered IL-2 variants include one or more non-native cysteines.

Description

ENGINEERED IL-2 VARIANTS AND METHODS OF USE THEREOF

[0001] CLAIM OF PRIORITY

[0002] This application claims priority to U.S. Provisional Patent Application No. 63 / 618,713 filed on January 08, 2024, and U.S. Provisional Patent Application No. 63 / 655,431, filed on June 03, 2024, the entire contents of which are hereby incorporated by reference.

[0003] SEQUENCE LISTING

[0004] This application contains a Sequence Listing that has been submitted electronically as an XML file named 52246-0021WO1_SL_ST26. xml. The XML file, created on December 06, 2024, is 108, 838 bytes in size. The material in the XML file is hereby incorporated by reference in its entirety.TECHNICAL FIELD

[0005] This disclosure relates to engineered IL-2 variants, and methods of use thereof.BACKGROUND

[0006] Autoimmune diseases are characterized by an excessive reaction of the immune system against endogenous tissue. Immune response mechanisms include an activation of specialized cells and an acquisition of effector functions. Regulatory T cells (Tregs) , previously also described as suppressor T cells, are a specialized subgroup of T cells. Tregs suppress activation of the immune system and thereby regulate the self-tolerance of the immune system. Thus, Tregs play an important role in preventing the onset of autoimmune diseases, and therapies that can enhance Treg activity may be useful in the treatment of autoimmune diseases.

[0007] Interleukin-2 (IL-2) is a member of a cytokine family, each member of which has a four-alpha helix bundle. IL-2 is essential for the maintenance of Foxp3+ regulatory T cells (Treg cells) , and in its absence, there is a profound deficiency of Treg cells and resulting autoimmunity. IL-2 promotes the generation, survival, and functional activity of Treg cells and thus has dual and opposing functions: maintaining Treg cells to control immune responses and stimulating conventional T cells to promote immune responses. Certain IL-2 conformations result in selective targeting of Treg cells by increasing reliance on CD25 binding while compromising CD122 binding. Therapeutic strategies have emerged to use IL-2, monoclonal antibodies to IL-2, or IL-2 variants to boost Treg cell numbers and function to treat autoimmune diseases while dealing with the continuing challenges to minimize the generation of effector and memory cells, natural killer cells, and other innate lymphoid populations.

[0008] Thus, there is a need to develop IL-2 variants that can selectively activate Treg cells while minimizing the activation of conventional T cells (e.g., CD8+ T cells) .SUMMARY

[0009] This disclosure relates to engineered IL-2 variants, protein constructs (e.g., fusion proteins) , and methods of use thereof. In some embodiments, the variants and protein constructs include one or more non-native cysteines. In some embodiments, the variants and protein constructs include a non-native disulfide bond formed by mutating 1, 2, 3, 4, 5, 6, or more than 6 residues (e.g., a pair of residues) of IL-2 to cysteines, without interfering the overall structure or residues critical for IL-2 receptor interaction. As a result, the variants or protein constructs can selectively activate Treg cells while minimizing the activation of Tconv cells (e.g., T effector cells, CD8+ cells) .

[0010] Also provided herein are methods for screening a cytokine (e.g., IL-2) that can selectively activate Treg cells while minimizing the activation of Tconv cells.

[0011] In one aspect, the disclosure is related to an engineered IL-2 polypeptide, wherein the engineered IL-2 polypeptide comprises a non-native cysteine.

[0012] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to SEQ ID NO: 2.

[0013] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide can bind to the trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ.

[0014] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises one or more of the following:

[0015] (a) the amino acid that corresponds to position 11 of SEQ ID NO: 2 is cysteine (C) ;

[0016] (b) the amino acid that corresponds to position 14 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0017] (c) the amino acid that corresponds to position 18 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0018] (d) the amino acid that corresponds to position 40 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0019] (e) the amino acid that corresponds to position 43 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0020] (f) the amino acid that corresponds to position 45 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0021] (g) the amino acid that corresponds to position 46 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0022] (h) the amino acid that corresponds to position 48 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0023] (i) the amino acid that corresponds to position 53 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0024] (j) the amino acid that corresponds to position 56 of SEQ ID NO: 2 is C; and

[0025] (k) the amino acid that corresponds to position 7 of SEQ ID NO: 2 is C.

[0026] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises one or more of the following:

[0027] (a) the amino acid that corresponds to position 129 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0028] (b) the amino acid that corresponds to position 113 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0029] (c) the amino acid that corresponds to position 111 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0030] (d) the amino acid that corresponds to position 108 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0031] (e) the amino acid that corresponds to position 106 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0032] (f) the amino acid that corresponds to position 96 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0033] (g) the amino acid that corresponds to position 97 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0034] (h) the amino acid that corresponds to position 129 of SEQ ID NO: 2 is C; and

[0035] (i) the amino acid that corresponds to position 132 of SEQ ID NO: 2 is C.

[0036] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises one or more of the following:

[0037] (a) the amino acid that corresponds to position 11 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 129 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0038] (b) the amino acid that corresponds to position 14 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0039] (c) the amino acid that corresponds to position 18 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0040] (d) the amino acid that corresponds to position 40 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 113 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0041] (e) the amino acid that corresponds to position 43 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 111 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0042] (f) the amino acid that corresponds to position 45 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 111 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0043] (g) the amino acid that corresponds to position 46 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 108 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0044] (h) the amino acid that corresponds to position 48 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 106 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0045] (i) the amino acid that corresponds to position 53 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 96 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0046] (j) the amino acid that corresponds to position 53 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 97 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0047] (k) the amino acid that corresponds to position 56 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 97 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0048] (l) the amino acid that corresponds to position 11 of SEQ ID NO: 2 is C, the amino acid that corresponds to position 18 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 129 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0049] (m) the amino acid that corresponds to position 7 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 132 of SEQ ID NO: 2 is C;

[0050] (n) the amino acid that corresponds to position 7 of SEQ ID NO: 2 is C, the amino acid that corresponds to position 18 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 132 of SEQ ID NO: 2 is C; and

[0051] (o) the amino acid that corresponds to position 7 of SEQ ID NO: 2 is C, the amino acid that corresponds to position 11 of SEQ ID NO: 2 is C, the amino acid that corresponds to position 129 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 132 of SEQ ID NO: 2 is C.

[0052] In some embodiments, the amino acid that corresponds to position 3 of SEQ ID NO: 2 is A, and the engineered IL-2 polypeptide comprises one or more of the following:

[0053] (a) the amino acid that corresponds to position 15 of SEQ ID NO: 2 is D;

[0054] (b) the amino acid that corresponds to position 15 of SEQ ID NO: 2 is N;

[0055] (c) the amino acid that corresponds to position 16 of SEQ ID NO: 2 is S;

[0056] (d) the amino acid that corresponds to position 16 of SEQ ID NO: 2 is T;

[0057] (e) the amino acid that corresponds to position 19 of SEQ ID NO: 2 is I;

[0058] (f) the amino acid that corresponds to position 20 of SEQ ID NO: 2 is N;

[0059] (g) the amino acid that corresponds to position 23 of SEQ ID NO: 2 is I;

[0060] (h) the amino acid that corresponds to position 23 of SEQ ID NO: 2 is L;

[0061] (i) the amino acid that corresponds to position 84 of SEQ ID NO: 2 is N;

[0062] (j) the amino acid that corresponds to position 84 of SEQ ID NO: 2 is T;

[0063] (k) the amino acid that corresponds to position 91 of SEQ ID NO: 2 is L;

[0064] (l) the amino acid that corresponds to position 92 of SEQ ID NO: 2 is V;

[0065] (m) the amino acid that corresponds to position 92 of SEQ ID NO: 2 is M;

[0066] (n) the amino acid that corresponds to position 95 of SEQ ID NO: 2 is Q; and

[0067] (o) the amino acid that corresponds to position 95 of SEQ ID NO: 2 is N.

[0068] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 3-17 and 35-51.

[0069] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 14.

[0070] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to any one of SEQ ID NOs: 39, 40, 46, 48, 50, and 51.

[0071] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 43.

[0072] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to any one of SEQ ID NOs: 39, 40, 42, 45, 46.

[0073] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 43.

[0074] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide can selectively activate Treg cells while minimizing the activation of Tconv cells.

[0075] In one aspect, the disclosure is related to an engineered IL-2 polypeptide, wherein the engineered IL-2 polypeptide comprises one or more non-native disulfide bonds.

[0076] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 80%identical to SEQ ID NO: 2.

[0077] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide can bind to the trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ.

[0078] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises one or more of the following:

[0079] (a) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 11 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 129 of SEQ ID NO: 2;

[0080] (b) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 14 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 125 of SEQ ID NO: 2;

[0081] (c) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 18 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 125 of SEQ ID NO: 2;

[0082] (d) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 40 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 113 of SEQ ID NO: 2;

[0083] (e) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 43 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 111 of SEQ ID NO: 2;

[0084] (f) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 45 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 111 of SEQ ID NO: 2;

[0085] (g) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 46 of SEQ ID NO: 2, and the amino acid that corresponds to position 108 of SEQ ID NO: 2;

[0086] (h) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 48 of SEQ ID NO: 2, and the amino acid that corresponds to position 106 of SEQ ID NO: 2;

[0087] (i) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 53 of SEQ ID NO: 2, and the amino acid that corresponds to position 96 of SEQ ID NO: 2;

[0088] (j) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 53 of SEQ ID NO: 2, and the amino acid that corresponds to position 97 of SEQ ID NO: 2;

[0089] (k) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 56 of SEQ ID NO: 2, and the amino acid that corresponds to position 97 of SEQ ID NO: 2;

[0090] (l) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 11 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 129 of SEQ ID NO: 2, and a non-native disulfide bond formed between amino acid that corresponds to position 18 of SEQ ID NO: 2, and the amino acid that corresponds to position 125 of SEQ ID NO: 2;

[0091] (m) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 7 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 132 of SEQ ID NO: 2;

[0092] (n) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 7 of SEQ ID NO: 2 the amino acid that corresponds to position 132 of SEQ ID NO: 2, and a non-native disulfide bond formed between amino acid that corresponds to position 18 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 125 of SEQ ID NO: 2; and

[0093] (o) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 7 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 132 of SEQ ID NO: 2, and a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 11 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 129 of SEQ ID NO: 2.

[0094] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 3-17 and 35-51.

[0095] In one aspect, the disclosure is related to a fusion protein comprising the engineered IL-2 polypeptide described herein.

[0096] In some embodiments, the fusion protein comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 20-34 and 52-68.

[0097] In some embodiments, the fusion protein comprises a Fc region.

[0098] In some embodiments, the Fc region comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 71.

[0099] In some embodiments, the Fc region comprises (1) a hole chain comprising an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 93 and (2) a knob chain comprising an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 95.

[0100] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide is linked to either the hole chain or the knob chain. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide is linked to the hole chain.

[0101] In some embodiments, the Fc region comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 87 or SEQ ID NO: 88.

[0102] In some embodiments, the fusion protein comprises a hinge region.

[0103] In some embodiments, the hinge region comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 70.

[0104] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide is linked to the C-terminus of the Fc region via a linker peptide. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide is linked to the N-terminus of the Fc region via a linker peptide.

[0105] In some embodiments, the linker peptide comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 72. In some embodiments, the linker peptide comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 85, 92, and 99-105.

[0106] In some embodiments, the fusion protein comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 73-84, 96, 97 and 98.

[0107] In one aspect, the disclosure is related to a fusion protein comprising, optionally from N-terminus to C-terminus:

[0108] (a) a hinge region;

[0109] (b) a Fc region;

[0110] (c) a linker peptide, and

[0111] (d) an engineered IL-2 polypeptide.

[0112] In some embodiments, the hinge region comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 70; wherein the Fc region comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 71; wherein the linker peptide comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 72; and / or wherein the engineered IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 3-17 and 35-51.

[0113] In some embodiments, the fusion protein can increase Treg activation (e.g., phosphorylation of STAT5) .

[0114] In some embodiments, the fusion protein can increase Treg-mediated immune suppression.

[0115] In one aspect, the disclosure is related to a pharmaceutical composition comprising the engineered IL-2 polypeptide described herein or the fusion protein described herein; and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0116] In one aspect, the disclosure is related to a nucleic acid encoding the engineered IL-2 polypeptide described herein or the fusion protein described herein.

[0117] In one aspect, the disclosure is related to a vector comprising the nucleic acid described herein.

[0118] In one aspect, the disclosure is related to a cell comprising the nucleic acid described herein or the vector described herein.

[0119] In some embodiments, the cell is Expi293 cell or ExpiCHO cell.

[0120] In one aspect, the disclosure is related to a method of producing an engineered IL-2 polypeptide or a fusion protein comprising the engineered IL-2 polypeptide, the method comprising culturing the cell described herein under conditions sufficient for the cell to produce the engineered IL-2 polypeptide or the fusion protein; and collecting the engineered IL-2 polypeptide or the fusion protein produced by the cell.

[0121] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a subject having an immune disease, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the engineered IL-2 polypeptide described herein or the fusion protein described herein, to the subject.

[0122] In some embodiments, the subject has an autoimmune disease.

[0123] In some embodiments, the autoimmune disease is rheumatoid arthritis, Crohn’s disease, diabetes (e.g., Type I) , graft versus host disease (GvHD) , systemic lupus erythematosus, ankylosing spondylitis, inflammatory bowel diseases (IBD) , ulcerative colitis, scleroderma, allergy, asthma, or atopic dermatitis.

[0124] In some embodiments, the fusion protein described herein further comprises a His tag.

[0125] In some embodiments, the His tag comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 18.

[0126] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide is linked to the C-terminus of the His tag.

[0127] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a subject having cancer, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the engineered IL-2 polypeptide described herein or the fusion protein described herein, to the subject.

[0128] In some embodiments, the subject has a solid tumor or a hematologic cancer.

[0129] In some embodiments, the cancer is breast cancer, ovarian cancer, glioma, colon cancer, hepatocellular carcinoma, prostate cancer, renal cell carcinoma, melanoma, lung cancer, pancreatic cancer, or hepatoma.

[0130] In one aspect, the disclosure is related to a method of decreasing the rate of tumor growth, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the engineered IL-2 polypeptide described herein or the fusion protein described herein.

[0131] In one aspect, the disclosure is related to a method of killing a tumor cell, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the engineered IL-2 polypeptide described herein or the fusion protein described herein.

[0132] In one aspect, the disclosure is related to a method of increasing regulatory T cell proliferation in a subject, the method comprising administering to the subject a pharmaceutical composition comprising the engineered IL-2 polypeptide described herein or the fusion protein described herein.

[0133] In one aspect, the disclosure is related to a method of activating regulatory T cells in a subject, the method comprising administering to the subject a pharmaceutical composition comprising the engineered IL-2 polypeptide described herein or the fusion protein described herein.

[0134] In some embodiments, the non-native cysteine and / or the one or more non-native disulfide bonds stabilize the internal core of the IL-2 polypeptide or the fusion protein described herein.

[0135] In some embodiments, the non-native cysteine and / or the one or more non-native disulfide bonds increase the thermal stability of the IL-2 polypeptide or the fusion protein described herein.

[0136] In some embodiments, the non-native cysteine and / or the one or more non-native disulfide bonds increase the serum concentration of the IL-2 polypeptide or the fusion protein. In some embodiments, the non-native cysteine and / or the one or more non-native disulfide bonds increase the pharmacokinetics of the IL-2 polypeptide or the fusion protein.

[0137] In some embodiments, the stabilization, the increase in thermal stability, the increase in serum concentration, and / or the increase in pharmacokinetics cannot be achieved by surface mutations.

[0138] In some embodiments, the non-native cysteine and / or the one or more non-native disulfide bonds increase the aggregation (Tagg) and / or onset (Tonset) temperatures by at least at least 5℃.

[0139] In some embodiments, the non-native cysteine and / or the one or more non-native disulfide bonds increase the serum concentration by at least 10 times. In some embodiments, the non-native cysteine and / or the one or more non-native disulfide bonds increase the pharmacokinetics by at least 10 times.

[0140] In one aspect, the disclosure is related to a method of improving the stability of IL-2, comprising

[0141] (a) providing a 3D structure of IL-2,

[0142] (b) measuring distance of the Calpha atoms of one or more of amino acid residues in the 3D structure; and

[0143] (c) selecting two amino acid residues from the one or more amino acid residues, wherein the Calpha atoms of the two selected amino acid residues are within 3-8 angstroms .

[0144] In some embodiments, the method comprises expressing a IL-2 variant. In some embodiments, the IL-2 variant comprises a non-native disulfide bond formed by mutating the two selected amino acid residues to cysteines.

[0145] In some embodiments, the mutating the two selected amino acid residues to cysteines does not substantially change the 3D structure of IL-2.

[0146] In one aspect, the disclosure is related to a method of screening an IL-2 variant, comprising

[0147] (a) providing a 3D structure of IL-2,

[0148] (b) measuring distance of the Calpha atoms of one or more of amino acid residues in the 3D structure; and

[0149] (c) selecting two amino acid residues from the one or more amino acid residues, wherein the Calpha atoms of the two selected amino acid residues are within 3-8 angstroms.

[0150] In some embodiments, the method further comprises:

[0151] (a) expressing an IL-2 variant, wherein the IL-2 variant comprises a non-native disulfide bond formed by mutating the two selected amino acid residues to cysteines;

[0152] (b) administering the IL-2 variant to an animal with an immune disease; and

[0153] (c) determining the effects of the IL-2 variant on the immune disease.

[0154] In some embodiments, the IL-2 is human IL-2.

[0155] In some embodiments, the method further comprises:

[0156] (a) expressing an IL-2 variant, wherein the IL-2 variant comprises a non-native disulfide bond formed by mutating the two selected amino acid residues to cysteines;

[0157] (b) administering the IL-2 variant to a tumor-bearing animal; and

[0158] (c) determining tumor growth (e.g., by measuring tumor volume) in the tumor-bearing animal.

[0159] As used herein, the term “non-native cysteine” refers to a cysteine mutation, wherein a cysteine amino acid residue substitutes a non-cysteine amino acid residue in a wildtype protein, or is inserted at a position wherein a cysteine amino acid residue does not naturally exist in that position. In some embodiments, the non-native cysteine is introduced by substitution or insertion. In some embodiments, at least one or two cysteine residues are introduced by substitution. In some embodiments, the protein or the polypeptide may have additional mutations.

[0160] As used herein, the term “non-native disulfide bond” refers to a disulfide bond that does not naturally exist in a wild-type protein. In some embodiments, the non-native disulfide bond is formed by two cysteine residues, wherein at least one of them is a mutation. In some embodiments, two of them are mutations. In some embodiments, at least one or two cysteine residues are introduced by insertion. In some embodiments, a deletion changes the distance between two existing cysteine residues, which then forms a disulfide bond that does not exist in a wild-type protein.

[0161] As used herein, the term “engineered IL-2 polypeptide” refers to a polypeptide derived from a wild-type IL-2 polypeptide or a portion thereof, optionally with one or more mutations (e.g., insertions, deletions, or substitutions) . In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises or consists of an amino acid sequence corresponding to amino acids 21-153 of human IL-2 (SEQ ID NO: 1) . In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide has one or more (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or more than 10) mutations (e.g., amino acids are substituted by cysteine) . In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide has no more than 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 mutations.

[0162] As used herein, the term “protein construct” refers to a complex having one or more polypeptides. In some embodiments, the protein construct is a fusion protein, e.g., a fusion protein including a Fc region and an engineered IL-2 polypeptide (e.g., any of the engineered IL-2 polypeptides described herein) . In some embodiments, the protein construct has two or more polypeptides, wherein the polypeptides can associate with each other, forming a dimer or a multimer (e.g., a trimer) .

[0163] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human, to whom treatment according to the methods of the present invention is provided. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated in the present disclosure. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals.

[0164] As used herein, the terms “polypeptide, ” “peptide, ” and “protein” are used interchangeably to refer to polymers of amino acids of any length of at least two amino acids.

[0165] As used herein, the terms “polynucleotide, ” “nucleic acid molecule, ” and “nucleic acid sequence” are used interchangeably herein to refer to polymers of nucleotides of any length of at least two nucleotides, and include, without limitation, DNA, RNA, DNA / RNA hybrids, and modifications thereof.

[0166] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Methods and materials are described herein for use in the present invention; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0167] Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and figures, and from the claims.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0168] FIG. 1A shows a summary of the production and purification of proteins H8-IL-2_C01, H8-IL-2_C02, H8-IL-2_C03, H8-IL-2_C04, H8-IL-2_C05, H8-IL-2_C06, H8-IL-2_C07, H8-IL-2_C08, H8-IL-2_C09, H8-IL-2_C10, and H8-IL-2_C11 in ExpiCHO cells.

[0169] FIG. 1B shows a summary of production, purification and analysis of proteins H8-IL-2_C01, H8-IL-2_C02, H8-IL-2_C03, H8-IL-2_C04, H8-IL-2_C05, H8-IL-2_C06, H8-IL-2_C07, H8-IL-2_C08, H8-IL-2_C09, H8-IL-2_C10, and H8-IL-2_C11 in Expi293 cells.

[0170] FIG. 1C shows a summary of production, purification and analysis of proteins H8-IL-2_C21, H8-IL-2_C22, H8-IL-2_C23, and H8-IL-2_C24 in Expi293 cells.

[0171] FIGS. 2A-2B show IL-2-pSTAT5 reporter signaling activities induced by H8-IL-2_WT and its variants H8-IL-2_C01, H8-IL-2_C03, and H8-IL-2_C05 in HEK-BlueTM IL-2 Cells (FIG. 2A) and HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells (FIG. 2B) , respectively.

[0172] FIGS. 2C-2D show IL-2-pSTAT5 reporter signaling activities induced by H8-IL-2_WT and its variants H8-IL-2_C21, H8-IL-2_C22, H8-IL-2_C23 and H8-IL-2_C24 in HEK-BlueTM IL-2 Cells (FIG. 2C) and HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells (FIG. 2D) , respectively.

[0173] FIG. 3 shows a summary of production, purification and analysis of H8-IL-2_C01_T3A-derived variants in Expi293 cells.

[0174] FIGS. 4A-4B show IL-2-pSTAT5 reporter signaling activities induced by H8-IL-2_WT_T3A, H8-IL-2_C01_T3A, H8-IL-2_C01#1, and H8-IL-2_C01#2 in HEK-BlueTM IL-2 Cells (FIG. 4A) and HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells (FIG. 4B) , respectively.

[0175] FIGS. 4C-4D show IL-2-pSTAT5 reporter signaling activities induced by H8-IL-2_C01_T3A, H8-IL-2_C01#3, H8-IL-2_C01#4, H8-IL-2_C01#5, H8-IL-2_C01#6, and H8-IL-2_C01#7 in HEK-BlueTM IL-2 Cells (FIG. 4C) and HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells (FIG. 4D) , respectively.

[0176] FIGS. 4E-4F show IL-2-pSTAT5 reporter signaling activities induced by H8-IL-2_C01_T3A, H8-IL-2_C01#8, H8-IL-2_C01#9, H8-IL-2_C01#10, H8-IL-2_C01#11, and H8-IL-2_C01#12 in HEK-BlueTM IL-2 Cells (FIG. 4E) and HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells (FIG. 4F) , respectively.

[0177] FIGS. 4G-4H show IL-2-pSTAT5 reporter signaling activities induced by H8-IL-2_C01_T3A, H8-IL-2_C01#13, H8-IL-2_C01#14, and H8-IL-2_C01#15 in HEK-BlueTM IL-2 Cells (FIG. 4G) and HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells (FIG. 4H) , respectively.

[0178] FIG. 5 shows a summary of IL-2-pSTAT5 reporter signaling activities induced by H8-IL-2_C01_T3A-derived variants in HEK-BlueTM IL-2 Cells and HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells, respectively.

[0179] FIGS. 6A-6B show STAT5 phosphorylation induced by H8-IL-2_WT_T3A, H8-IL-2_C01_T3A, H8-IL-2_C01#1, H8-IL-2_C01#6, H8-IL-2_C01#7, and H8-IL-2_C01#9 in Treg cells (FIG. 6A) and Tconv cells (FIG. 6B) , respectively.

[0180] FIGS. 6C-6D show STAT5 phosphorylation induced by H8-IL-2_WT_T3A, H8-IL-2_C01_T3A, H8-IL-2_C01#3, H8-IL-2_C01#4, H8-IL-2_C01#10, H8-IL-2_C01#12, H8-IL-2_C01#14, and H8-IL-2_C01#15 in Treg cells (FIG. 6C) and Tconv cells (FIG. 6D) , respectively.

[0181] FIGS. 6E-6F show STAT5 phosphorylation induced by H8-IL-2_WT_T3A, H8-IL-2_C01_T3A, H8-IL-2_C01#2, H8-IL-2_C01#5, H8-IL-2_C01#8, H8-IL-2_C01#11, and H8-IL-2_C01#13 in Treg cells (FIG. 6E) and Tconv cells (FIG. 6F) , respectively.

[0182] FIG. 7 shows a summary of IL-2-pSTAT5 reporter signaling and STAT5 phosphorylation induced by H8-IL-2_C01_T3A and H8-IL-2_C01_T3A-derived variants.

[0183] FIG. 8 shows a summary of production, purification and analysis of G1LALAFc-IL-2_WT_T3A, G1LALAFc-IL-2_C01_T3A, and G1LALAFc-IL-2_C01_T3A-derived variants in Expi293 cells.

[0184] FIGS. 9A-9B show IL-2-pSTAT5 reporter signaling activities induced by G1LALAFc-IL-2_WT_T3A, G1LALAFc-IL-2_C01_T3A, G1LALAFc-IL-2_C01#1, G1LALAFc-IL-2_C01#3 and G1LALAFc-IL-2_C01#4 in HEK-BlueTM IL-2 Cells (FIG. 9A) and HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells (FIG. 9B) , respectively.

[0185] FIGS. 9C-9D show IL-2-pSTAT5 reporter signaling activities induced by G1LALAFc-IL-2_WT_T3A, G1LALAFc-IL-2_C01_T3A, G1LALAFc-IL-2_C01#6, G1LALAFc-IL-2_C01#7, G1LALAFc-IL-2_C01#9, and G1LALAFc-IL-2_C01#10 in HEK-BlueTM IL-2 Cells (FIG. 9C) and HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells (FIG. 9D) , respectively.

[0186] FIGS. 9E-9F show IL-2-pSTAT5 reporter signaling activities induced by G1LALAFc-IL-2_WT_T3A, G1LALAFc-IL-2_C01_T3A, G1LALAFc-IL-2_C01#12, G1LALAFc-IL-2_C01#14, and G1LALAFc-IL-2_C01#15 in HEK-BlueTM IL-2 Cells (FIG. 9E) and HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells (FIG. 9F) , respectively.

[0187] FIG. 10 shows a summary of IL-2-pSTAT5 reporter signaling induced by IL-2_C01_T3A and its variants (in H8 format and G1LALAFc format) .

[0188] FIGS. 11A-11B show STAT5 phosphorylation induced by G1LALAFc-IL-2_WT_T3A, G1LALAFc-IL-2_C01_T3A, G1LALAFc-IL-2_C01#1, G1LALAFc-IL-2_C01#6, G1LALAFc-IL-2_C01#7, and G1LALAFc-IL-2_C01#9 in Treg cells (FIG. 11A) and Tconv cells (FIG. 11B) , respectively.

[0189] FIGS. 11C-11D show STAT5 phosphorylation induced by G1LALAFc-IL-2_WT_T3A, G1LALAFc-IL-2_C01_T3A, G1LALAFc-IL-2_C01#3, G1LALAFc-IL-2_C01#4, G1LALAFc-IL-2_C01#10, G1LALAFc-IL-2_C01#12, G1LALAFc-IL-2_C01#14, and G1LALAFc-IL-2_C01#15 in Treg cells (FIG. 11C) and Tconv cells (FIG. 11D) , respectively.

[0190] FIGS. 12A-12C show the stress stability of the engineered IL-2 variants and protein constructs thereof as determined by SEC-HPLC.

[0191] FIG. 13 shows the thermal stability of the engineered IL-2 variants and protein constructs thereof as determined by Dynamic Light Scattering (DLS) analysis.

[0192] FIG. 14 shows the thermal stability of the engineered IL-2 variants and protein constructs thereof as determined by Differential Scanning Fluorimetry (DSF) analysis.

[0193] FIGS. 15A-15B show the treatment plan and dosing schedule (FIG. 15A) and the results (FIG. 15B) of the autoimmune efficacy of the engineered IL-2 variants and protein constructs thereof as determined by an NPG expansion model.

[0194] FIG. 16A is a table showing treatment plan and dosing schedule of the engineered IL-2 variants and protein constructs thereof in a C57BL / 6 mice model.

[0195] FIG. 16B shows average body weight change of C57BL / 6 mice that were treated with engineered IL-2 variants and protein constructs thereof.

[0196] FIGS. 16C-16L show the pharmacokinetics of the engineered IL-2 variants and protein constructs thereof as determined by ELISA.

[0197] FIGS. 17A-17B show the liver damage of the engineered IL-2 variants and protein constructs thereof as determined by AST (FIG. 17A) and the ALT (FIG. 17B) .

[0198] FIGS. 18A-18D show the percentages of different T cell populations induced by the engineered IL-2 variants and protein constructs thereof, as determined by flow cytometry.

[0199] FIG. 19 lists relevant amino acid sequences.DETAILED DESCRIPTION

[0200] Human Interleukin 2 (IL-2) is an interleukin, a type of cytokine signaling molecule in the immune system. It is a 15.5-16 kDa protein that regulates the activities of white blood cells (leukocytes, often lymphocytes) that are responsible for immunity. IL-2 is part of the body's natural response to microbial infection, and in discriminating between foreign ( "non-self" ) and "self. ” Human IL-2 (NCBI reference sequence: NP_000577.2; UniProt ID: Q0GK43; SEQ ID NO: 1) is a 153 amino acid protein that includes, from N-terminus to C-terminus, a signal peptide (corresponding to amino acids 1-20 of SEQ ID NO: 1) , and a soluble chain (corresponding to amino acids 21-153 of SEQ ID NO: 1) .

[0201] IL-2 is a member of a cytokine family, each member of which has a four-alpha helix bundle. The family also includes IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 and IL-21. IL-2 signals through the IL-2 receptor, a complex having three chains, i.e., interleukin-2 receptor alpha chain (or IL-2RA, CD25) , Interleukin-2 receptor subunit beta (or IL-2RB, CD122) and interleukin-2 receptor subunit gamma (or IL-2RG, common gamma chain, CD132) . The gamma chain is shared by all family members. IL-2 has essential roles in key functions of the immune system, tolerance and immunity, primarily via its direct effects on T cells. For example, in the thymus, where T cells mature, it prevents autoimmune diseases by promoting the differentiation of certain immature T cells into regulatory T cells, which suppress other T cells that are otherwise primed to attack normal healthy cells in the body. IL-2 also promotes the differentiation of T cells into effector T cells and into memory T cells when the initial T cell is also stimulated by an antigen, thus helping the body fight off infections. Interestingly, IL-2 can stimulate immune response by regulating effector T cells (primarily expressing IL-2RB and IL-2RG) , and dampen immune response by regulating regulatory T cells (primarily expressing IL-2RA, IL-2RB, and IL-2RG) .

[0202] A detailed description of IL-2 and its function can be found, e.g., in Abbas, Abul K., et al. "Revisiting IL-2: Biology and therapeutic prospects. " Science immunology 3.25 (2018) : eaat1482; Spolski, Rosanne, Peng Li, and Warren J. Leonard. "Biology and regulation of IL-2: from molecular mechanisms to human therapy. " Nature Reviews Immunology 18.10 (2018) : 648-659; Arenas-Ramirez, Natalia, Janine Woytschak, and Onur Boyman. "Interleukin-2: biology, design and application. " Trends in immunology 36.12 (2015) : 763-777, each of which is incorporated by reference in its entirety.

[0203] The trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ comprises three subunits: α (CD25) , β (CD122) , and γ (γcommon) . The dimeric IL-2Rβγ comprises two subunits: β (CD122) , and γ (γcommon) . The trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ is typically expressed at high levels by Treg cells, whereas the dimeric IL-2Rβγ is expressed mostly on activated CD8+ T cells and NK cells. Low-dose IL-2 therapy preferentially activates Treg cells because of the constitutive high expression of IL-2Rα.

[0204] The present disclosure provides engineered IL-2 variants having at least one non-native cysteine. In some embodiments, one or two amino acid residues in a wild-type human IL-2 (e.g., SEQ ID NO: 2) are selectively mutated to cysteines. In some embodiments, the mutations do not substantially change the overall structure of IL-2, e.g., the relative position of the four alpha helices of IL-2. In some embodiments, the engineered IL-2 variants described herein can bind to the IL-2 receptor, and induce downstream signaling (e.g., STAT5 phosphorylation) . In some embodiments, the engineered IL-2 variants can selectively activate Treg cells while minimizing the activation of effector T cells. In some embodiments, the engineered IL-2 variants comprise or consist of any of the engineered IL-2 polypeptides described herein.

[0205] In some embodiments, the engineered IL-2 variants further comprise a fragment crystallizable region (Fc region) . In some embodiments, the Fc region is human IgG1, human IgG2, human IgG3, or human IgG4. In some embodiments, effector function of a Fc region is antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) . In some embodiments, effector function of a Fc region is phagocytosis. In some embodiments, the engineered IL-2 variants as described herein have an Fc region without effector function. In some embodiments, the Fc is a human IgG1 Fc. In some embodiments, the Fc does not have a functional Fc region. For example, the Fc region has LALA mutations (L234A and L235A mutations in EU numbering) , or LALA-PG mutations (L234A, L235A, P329G mutations in EU numbering) . In some embodiments, the LALA mutation can reduce binding to the IgG Fc receptors FcγRI, FcγRII and FcγRIII as well as to complement component C1q. In some embodiments, the engineered IL-2 variants comprise G1LALAFc (e.g., SEQ ID NO: 71) , an IgG1 Fc containing the LALA mutation.

[0206] In some embodiments, the Fc region can have knobs-into-holes (KIH) mutations, which can promote heterodimerization and avoid mispairing between two peptide chains. This involves engineering CH3 domains to create either a “knob” or a “hole” to promote heterodimerization. The KIH technique is described e.g., in Xu, Yiren, et al. "Production of bispecific antibodies in ‘knobs-into-holes’ using a cell-free expression system. " MAbs. Vol. 7. No. 1. Taylor & Francis, 2015, which is incorporated by reference in its entirety. In some embodiments, the Fc region comprises a hole chain comprising G1LA-HoleFc (e.g., SEQ ID NO: 93) and a knob chain comprising G1LA-KnobFc (e.g., SEQ ID NO: 95) . In some embodiments, either the hole chain or the knob chain can be linked to the IL-2 variant described herein to create a heterodimer structure. In some embodiments, the IL-2 variant described herein is linked to the hole chain. In some embodiments, the IL-2 variant described herein is linked to the knob chain. An example of such a heterodimer structure is G1LA-KIHFc-IL-2_WT, which contains a hole chain comprising G1LA-HoleFc-IL-2_WT (e.g., SEQ ID NO: 97) and a knob chain comprising G1LA-KnobFc (e.g., SEQ ID NO: 95) . Another example of such a heterodimer structure is G1LA-KIHFc-IL-2_C01#6, which contains a hole chain comprising G1LA-HoleFc-IL-2_C01#6 (e.g., SEQ ID NO: 98) and a knob chain comprising G1LA-KnobFc (e.g., SEQ ID NO: 95) .

[0207] In some embodiments, the Fc region can be further linked to a hinge region (e.g., SEQ ID NO: 70) . In some embodiments, the Fc region comprises a hole chain comprising G1LA-HoleFc (e.g., SEQ ID NO: 93) and a hinge region (e.g., SEQ ID NO: 70) . In some embodiments, the Fc region comprises an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 94. In some embodiments, the Fc region comprises a knob chain comprising G1LA-KnobFc (e.g., SEQ ID NO: 95) and a hinge region (e.g., SEQ ID NO: 70) . In some embodiments, the Fc region comprises an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 96.

[0208] In some embodiments, either the hole chain or the knob chain can be linked to the IL-2 variant described herein to create a heterodimer structure. In some embodiments, the IL-2 variant described herein is linked to the hole chain. In some embodiments, the IL-2 variant described herein is linked to the knob chain. An example of such a heterodimer structure is G1LA-KIHFc-IL-2_WT, which contains a hole chain comprising G1LA-HoleFc-IL-2_WT (e.g., SEQ ID NO: 97) and a knob chain comprising G1 Hinge + G1LA-KnobFc (e.g., SEQ ID NO: 96) . Another example of such a heterodimer structure is G1LA-KIHFc-IL-2_C01#6, which contains a hole chain comprising G1LA-HoleFc-IL-2_C01#6 (e.g., SEQ ID NO: 98) and a knob chain comprising G1 Hinge + G1LA-KnobFc (e.g., SEQ ID NO: 96) . In some embodiments, the engineered IL-2 variant further comprises a His tag (e.g., SEQ ID NO: 18) .

[0209] The disclosure also provides methods of screening cytokine (e.g., IL-2) variants that can selectively activate Treg cells while minimizing the activation of Tconv cells.

[0210] Engineered IL-2 variants

[0211] IL-2 is a typical four–α helix cytokine, tightly regulated at the mRNA level by signals from the T cell receptor and CD28. IL-2 binds to and signals through a receptor complex consisting of three distinct subunits designated IL-2Rα (CD25) , IL-2Rβ (CD122) , and common γ chain (γc; CD132) . The crystallization of IL-2 bound to the external domains of the three receptor chains in a quaternary complex revealed that the sites on IL-2 that interact with the three chains of the IL-2R do not overlap, and the α chain itself does not contact either the β or γc to be consistent chains. The high affinity of the IL-2 / IL-2Rα / β trimeric complex clearly indicates that the complex is more stable than IL-2 bound to either the αchain alone or to the β chain alone. During engagement of IL-2R, the IL-2 / α / β trimer recruits the γ chain into a quaternary complex, leading to intracellular signaling. Because only a few residues of IL-2 interact with both β and γc chains, binding of IL-2 may induce conformational changes in the β chain that would further promote recruitment of the γc chain. Moreover, it was also found that the α chain does not participate in signaling, whereas both the β and γc chains are necessary for signaling. In the absence of IL-2Rα expression, IL-2Rβand γc can form an intermediate affinity receptor that is fully competent to signal. The high-affinity receptor is the most physiologically relevant form of the IL-2R because CD25-deficient mice (which express only the intermediate-affinity IL-2R) are phenotypically indistinguishable from IL-2-deficient mice, as noted above. Thus, the structure of IL-2 and its receptor is flexible and can naturally exist in different conformations that appear to favor either the high-affinity trimeric IL-2R or the intermediate-affinity dimeric IL-2R, respectively, resulting in the activation of different immune cells.

[0212] Based on the 3D structure of human IL-2, distance of one or more amino acid residues (e.g., those in close proximity) in the 3D structure can be determined. In some embodiments, two amino acid residues whose distance is within 3.0-8.0 angstroms can be selected. In some embodiments, the two selected amino acid residues have a distance of to each other. In some embodiments, neither of the two selected amino acid residues is a cysteine, and the two selected amino acid residues can be mutated to cysteines without interfering the overall structure (e.g., the core structure formed by the four-helical bundle) of IL-2. Without being bound by theory, it is contemplated that the newly introduced cysteines can form a disulfide bond non-native to the wild-type IL-2, which can stabilize IL-2 and / or improve the functional potencies of IL-2. In some embodiments, only one of the two selected amino acid residues is a cysteine, and the other selected amino acid residue (the non-cysteine amino acid residue) can be mutated to a cysteine without interfering the overall structure (e.g., the core structure formed by the four-helical bundle) of IL-2. Without being bound by theory, it is contemplated that the newly introduced cysteine can form a disulfide bond non-native to the wild-type IL-2, which can stabilize IL-2 and / or improve the functional potencies of IL-2.

[0213] In one aspect, the engineered IL-2 variant (e.g., engineered IL-2 polypeptide) includes a first cysteine mutation and a second cysteine mutation. In some embodiments, the first cysteine mutation occurs at an amino acid residue that corresponds to position 7, 11, 40, 43, 45, 46, 48, 53, or 56 of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the second cysteine mutation occurs at an amino acid residue that corresponds to position 129, 113, 111, 108, 106, 96, 97, or 132 of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the distance of the two selected amino acid residues are within In some embodiments, any of the first cysteine mutations can be paired with any of the second cysteine mutations described herein, when distance of the two selected amino acid residues is within the range described above. In some embodiments, the one or more non-native cysteines can further stabilize the overall structure of IL-2, e.g., the relative position and angles of the four-helical bundle in IL-2 are maintained.

[0214] In one aspect, the engineered IL-2 variant (e.g., engineered IL-2 polypeptide) includes a third cysteine mutation, such that the third introduced cysteine can form a disulfide bond with either an introduced cysteine or a naturally existing cysteine. In some embodiments, the third cysteine mutation occurs at an amino acid residue that corresponds to position 11, 18, 129, 7, or 132 of SEQ ID NO: 2.

[0215] In one aspect, the engineered IL-2 variant (e.g., engineered IL-2 polypeptide) includes a fourth cysteine mutation, such that the fourth introduced cysteine can form a disulfide bond with either an introduced cysteine or a naturally existing cysteine. In some embodiments, the fourth cysteine mutation occurs at an amino acid residue that corresponds to position 11, 129, 7, or 132 of SEQ ID NO: 2.

[0216] In one aspect, the engineered IL-2 variant (e.g., engineered IL-2 polypeptide) includes one cysteine mutation, such that the one introduced cysteine can form a disulfide bond with a naturally existing cysteine. In some embodiments, the one cysteine mutation occurs at an amino acid residue that corresponds to position 14 or 18 of SEQ ID NO: 2.

[0217] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide (e.g., IL-2_C01) , which includes a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (I129) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the two cysteine residues form a disulfide bond. The sequence of IL-2_C01 is set forth in SEQ ID NO: 3.

[0218] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide (e.g., IL-2_C02) , which includes a cysteine residue at a position corresponding to position 14 (e.g., L14) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the cysteine residue forms a disulfide bond with a cysteine at a position corresponding to position 125 of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C02 is set forth in SEQ ID NO: 4.

[0219] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide (e.g., IL-2_C03) , which includes a cysteine residue at a position corresponding to position 18 (e.g., L18) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the cysteine residue forms a disulfide bond with a cysteine at a position corresponding to position 125 of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C03 is set forth in SEQ ID NO: 5.

[0220] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide (e.g., IL-2_C04) , which includes a first cysteine residue at a position corresponding to position 40 (e.g., L40) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 113 (e.g., T113) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the two cysteine residues form a disulfide bond. The sequence of IL-2_C04 is set forth in SEQ ID NO: 6.

[0221] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide (e.g., IL-2_C05) , which includes a first cysteine residue at a position corresponding to position 43 (e.g., K43) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 111 (e.g., T111) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the two cysteine residues form a disulfide bond. The sequence of IL-2_C05 is set forth in SEQ ID NO: 7.

[0222] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide (e.g., IL-2_C06) , which includes a first cysteine residue at a position corresponding to position 45 (e.g., Y45) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 111 (e.g., T111) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the two cysteine residues form a disulfide bond. The sequence of IL-2_C06 is set forth in SEQ ID NO: 8.

[0223] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide (e.g., IL-2_C07) , which includes a first cysteine residue at a position corresponding to position 46 (e.g., M46) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 108 (e.g., A108) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the two cysteine residues form a disulfide bond. The sequence of IL-2_C07 is set forth in SEQ ID NO: 9.

[0224] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide (e.g., IL-2_C08) , which includes a first cysteine residue at a position corresponding to position 48 (e.g., K48) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 106 (e.g., E106) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the two cysteine residues form a disulfide bond. The sequence of IL-2_C08 is set forth in SEQ ID NO: 10.

[0225] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide (e.g., IL-2_C09) , which includes a first cysteine residue at a position corresponding to position 53 (e.g., L53) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 96 (e.g., L96) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the two cysteine residues form a disulfide bond. The sequence of IL-2_C09 is set forth in SEQ ID NO: 11.

[0226] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide (e.g., IL-2_C10) , which includes a first cysteine residue at a position corresponding to position 53 (e.g., L53) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 97 (e.g., K97) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the two cysteine residues form a disulfide bond. The sequence of IL-2_C10 is set forth in SEQ ID NO: 12.

[0227] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide (e.g., IL-2_C11) , which includes a first cysteine residue at a position corresponding to position 56 (e.g., L56) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 97 (e.g., K97) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the two cysteine residues form a disulfide bond. The sequence of IL-2_C11 is set forth in SEQ ID NO: 13.

[0228] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide (e.g., IL-2_C21) , which includes a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 18 (e.g., L18) of SEQ ID NO: 2, and a third cysteine residue at a position corresponding to position 129 (e.g., I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C21 is set forth in SEQ ID NO: 14. In some embodiments, the second cysteine residue forms a disulfide bond with a cysteine at a position corresponding to position 125 of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the first cysteine residue and the third cysteine residue form a disulfide bond.

[0229] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide (e.g., IL-2_C22) , which includes a first cysteine residue at a position corresponding to position 7 (e.g., T7) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 132 (e.g., L132) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C22 is set forth in SEQ ID NO: 15. In some embodiments, the two cysteine residues form a disulfide bond.

[0230] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide (e.g., IL-2_C23) , which includes a first cysteine residue at a position corresponding to position 7 (e.g., T7) of SEQ ID NO: 2, a second cysteine residue at a position corresponding to position 18 (e.g., L18) of SEQ ID NO: 2, and a third cysteine residue at a position corresponding to position 132 (e.g., L132) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C23 is set forth in SEQ ID NO:16. In some embodiments, the second cysteine residue forms a disulfide bond with a cysteine at a position corresponding to position 125 of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the first cysteine residue and the third cysteine residue form a disulfide bond.

[0231] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide (e.g., IL-2_C24) , which includes a first cysteine residue at a position corresponding to position 7 (e.g., T7) of SEQ ID NO: 2, a second cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a third cysteine residue at a position corresponding to position 129 (e.g., I129) of SEQ ID NO: 2, and a fourth cysteine residue at a position corresponding to position 132 (e.g., L132) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C24 is set forth in SEQ ID NO: 17. In some embodiments, the first cysteine residue and the fourth cysteine residue form a disulfide bond. In some embodiments, the second cysteine residue and the third cysteine residue form a disulfide bond.

[0232] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide comprising one or more of the following: (a) the amino acid that corresponds to Q11 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to I129 of SEQ ID NO: 2 is C; (b) the amino acid that corresponds to L14 of SEQ ID NO: 2 is C; (c) the amino acid that corresponds to L18 of SEQ ID NO: 2 is C; (d) the amino acid that corresponds to L40 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to T113 of SEQ ID NO: 2 is C; (e) the amino acid that corresponds to K43 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to T111 of SEQ ID NO: 2 is C; (f) the amino acid that corresponds to Y45 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to T111 of SEQ ID NO: 2 is C; (g) the amino acid that corresponds to M46 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to A108 of SEQ ID NO: 2 is C; (h) the amino acid that corresponds to K48 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to E106 of SEQ ID NO: 2 is C; (i) the amino acid that corresponds to L53 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to L96 of SEQ ID NO: 2 is C; (j) the amino acid that corresponds to L53 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to K97 of SEQ ID NO: 2 is C; (k) the amino acid that corresponds to L56 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to K97 of SEQ ID NO: 2 is C.

[0233] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, or 17. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide described herein comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 2, wherein the amino acid sequence comprises one or more of the mutations described herein. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide described herein includes at least 1, at least 2, at least 3, or at least 4 of the cysteine mutations described in Table 1.

[0234] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide can have at least or about 1 (e.g., at least or about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40) amino acid insertions, deletions, or substitutions as compared to any one of SEQ ID NOs: 3-17.

[0235] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO:2. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a T3A mutation.

[0236] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a mutation at a position corresponding to position 15 (e.g., E15) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a E15D or E15N mutation.

[0237] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a mutation at a position corresponding to position 16 (e.g., H16) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a H16S or H16T mutation.

[0238] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a mutation at a position corresponding to position 19 (e.g., L19) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a L19I mutation.

[0239] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a mutation at a position corresponding to position 20 (e.g., D20) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a D20N mutation.

[0240] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a mutation at a position corresponding to position 23 (e.g., M23) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a M23I or M23L mutation.

[0241] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a mutation at a position corresponding to position 84 (e.g., D84) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a D84N or D84T mutation.

[0242] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a mutation at a position corresponding to position 91 (e.g., V91) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a V91L mutation.

[0243] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a mutation at a position corresponding to position 92 (e.g., I92) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a I92V or I92M mutation.

[0244] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a mutation at a position corresponding to position 95 (e.g., E95) of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptides described herein can also include a E95Q or E95N mutation.

[0245] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide IL-2_C01_T3A, which includes an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO: 2, a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (e.g., I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C01_T3A is set forth in SEQ ID NO: 36.

[0246] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide IL-2_C01#1, which includes an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO: 2, an E15D mutation with respect to SEQ ID NO: 2, a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C01#1 is set forth in SEQ ID NO: 37.

[0247] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide IL-2_C01#2, which includes an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO: 2, an E15N mutation with respect to SEQ ID NO: 2, a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C01#2 is set forth in SEQ ID NO: 38.

[0248] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide IL-2_C01#3, which includes an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO: 2, an H16S mutation with respect to SEQ ID NO: 2, a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C01#3 is set forth in SEQ ID NO: 39.

[0249] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide IL-2_C01#4, which includes an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO: 2, an H16T mutation with respect to SEQ ID NO: 2, a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C01#4 is set forth in SEQ ID NO: 40.

[0250] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide IL-2_C01#5, which includes an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO: 2, an L19I mutation with respect to SEQ ID NO: 2, a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C01#5 is set forth in SEQ ID NO: 41.

[0251] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide IL-2_C01#6, which includes an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO: 2, an D20N mutation with respect to SEQ ID NO: 2, a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C01#6 is set forth in SEQ ID NO: 42.

[0252] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide IL-2_C01#7, which includes an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO: 2, an M23I mutation with respect to SEQ ID NO: 2, a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C01#7 is set forth in SEQ ID NO: 43.

[0253] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide IL-2_C01#8, which includes an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO: 2, an M23L mutation with respect to SEQ ID NO: 2, a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C01#8 is set forth in SEQ ID NO: 44.

[0254] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide IL-2_C01#9, which includes an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO: 2, an D84N mutation with respect to SEQ ID NO: 2, a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C01#9 is set forth in SEQ ID NO: 45.

[0255] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide IL-2_C01#10, which includes an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO: 2, an D84T mutation with respect to SEQ ID NO: 2, a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C01#10 is set forth in SEQ ID NO: 46.

[0256] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide IL-2_C01#11, which includes an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO: 2, an V91L mutation with respect to SEQ ID NO: 2, a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C01#11 is set forth in SEQ ID NO: 47.

[0257] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide IL-2_C01#12, which includes an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO: 2, an I92V mutation with respect to SEQ ID NO: 2, a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C01#12 is set forth in SEQ ID NO: 48.

[0258] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide IL-2_C01#13, which includes an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO: 2, an I92M mutation with respect to SEQ ID NO: 2, a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C01#13 is set forth in SEQ ID NO: 49.

[0259] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide IL-2_C01#14, which includes an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO: 2, an E95Q mutation with respect to SEQ ID NO: 2, a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C01#14 is set forth in SEQ ID NO: 50.

[0260] In some embodiments, provided herein is an engineered IL-2 polypeptide IL-2_C01#15, which includes an alanine mutation at a position corresponding to position 3 (e.g., T3) of SEQ ID NO: 2, an E95N mutation with respect to SEQ ID NO: 2, a first cysteine residue at a position corresponding to position 11 (e.g., Q11) of SEQ ID NO: 2, and a second cysteine residue at a position corresponding to position 129 (I129) of SEQ ID NO: 2. The sequence of IL-2_C01#15 is set forth in SEQ ID NO: 51.

[0261] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 35-51. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide described herein comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 35, wherein the amino acid sequence comprises one or more of the mutations described herein. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide described herein includes at least 1, at least 2, at least 3, or at least 4 of the mutations described in Table 2.

[0262] In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide can have at least or about 1 (e.g., at least or about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40) amino acid insertions, deletions, or substitutions as compared to any one of SEQ ID NOs: 35-51.

[0263] IL-2 protein constructs

[0264] The disclosure provides protein constructs comprising the engineered IL-2 variants described herein (e.g., any of the engineered IL-2 polypeptides described herein) . In some embodiments, the protein constructs described herein have a N-terminal His-tag. In some embodiments, the protein constructs described herein have a C-terminal His-tag.

[0265] In some embodiments, the protein construct described herein includes, from N-terminus to C-terminus: (a) a His-tag; and (b) an engineered IL-2 polypeptide (e.g., any of the engineered IL-2 polypeptides described herein) . In some embodiments, the His-tag includes at least 6, at least 7, or at least 8 contiguous His residues. In some embodiments, the His-tag comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%to SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, or 17. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide described herein includes at least 1, at least 2, at least 3, or at least 4 of the cysteine mutations described in Table 1.

[0266] In some embodiments, the engineered IL-2 protein constructs can comprise any engineered IL-2 variant as described herein. In some embodiments, the protein construct described herein comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 20-34 and 52-68.

[0267] To determine the percent identity of two amino acid sequences, or of two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . The amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. For example, the comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extend penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

[0268] The engineered IL-2 variants (e.g., any of the engineered IL-2 polypeptides described herein) and protein constructs can further comprise an Fc region of an antibody. These antibodies can be of any type (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY) , class or subclass (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE1, IgE2) . In some embodiments, the Fc region is derived from human IgG (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4) . In some embodiments, the Fc region is an IgG1 Fc region (e.g., human IgG1 Fc region) .

[0269] In some embodiments, the Fc region is linked to an antibody hinge region (e.g., IgG, IgE hinge region) . In addition, the Fc region can be modified to provide desired effector functions or serum half-life.

[0270] In some embodiments, the protein constructs as described herein include a Fc region. In some embodiments, the Fc region is human IgG1, human IgG2, human IgG3, or human IgG4. In some embodiments, effector function of a Fc region is antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) . In some embodiments, effector function of a Fc region is phagocytosis. In some embodiments, effector function of a Fc region is ADCC and phagocytosis. In some embodiments, the protein constructs as described herein have an Fc region without effector function. In some embodiments, the Fc is a human IgG1 Fc. In some embodiments, the Fc does not have a functional Fc region. For example, the Fc region has LALA mutations (L234A and L235A mutations in EU numbering) , or LALA-PG mutations (L234A, L235A, P329G mutations in EU numbering) .

[0271] In some embodiments, the Fc region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 72. In some embodiments, the Fc region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 87. In some embodiments, the Fc region comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 88.

[0272] In some embodiments, the engineered IL-2 variant (e.g., any of the engineered IL-2 variants described herein) is linked to the N-terminus or C-terminus of the Fc region (e.g., SEQ ID NO: 71) . In some embodiments, the engineered IL-2 variant is linked to the N-terminus of the Fc region. In some embodiments, the engineered IL-2 variant is linked to the C-terminus of the Fc region. In some embodiments, the Fc region is linked to a hinge region (e.g., SEQ ID NO: 70) . In some embodiments, the engineered IL-2 variant is linked to the Fc region via a linker peptide (e.g., SEQ ID NO: 72) . In some embodiments, the linker peptide is a flexible linker. Details of flexible linkers can be found, e.g., Chen, X., et al. “Fusion protein linkers: property, design and functionality. ” Advanced Drug Delivery Reviews 65.10 (2013) : 1357-1369, which is incorporated herein by reference in its entirety. In some embodiments, the linker peptide comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 72. In some embodiments, the linker peptide comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 92. Various linker sequences can be used, including, without limitation, glycine serine (GS) linkers such as (GS) n, (SG) n, (GGS) n, (GSG) n, (GSGGS) n and (GGGS) n, where n represents an integer of at least 1. In some embodiments, n is 5-8. In some embodiments, n is 3-5. Exemplary linker sequences can comprise an amino acid sequence that is at least 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 85, 92, and 99-105.

[0273] In some embodiments, provided herein are protein constructs that include, from N-terminus to C-terminus, a human IgG1 hinge region and Fc region (e.g., SEQ ID NO: 69) , a linker peptide (e.g., any of the linker peptides described herein) , and an engineered IL-2 polypeptide (e.g., any of the engineered IL-2 polypeptides described herein) . In some embodiments, the protein construct described herein comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NOs: 73-84.

[0274] Some other modifications to the Fc region can be made. For example, a cysteine residue (s) can be introduced into the Fc region, thereby allowing interchain disulfide bond formation in this region. The homodimeric fusion protein thus generated may have any increased half-life in vitro and / or in vivo. In some embodiments, the IgG4 has S228P mutation (EU numbering) . The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange.

[0275] In some embodiments, Fc regions are provided having a carbohydrate structure that lacks fucose attached (directly or indirectly) to an Fc region. For example, the amount of fucose in such Fc region composition may be from 1%to 80%, from 1%to 65%, from 5%to 65%or from 20%to 40%. The amount of fucose is determined by calculating the average amount of fucose within the sugar chain at Asn297, relative to the sum of all glycostructures attached to Asn297 (e.g. complex, hybrid and high mannose structures) as measured by MALDI-TOF mass spectrometry, as described in WO 2008 / 077546, for example. Asn297 refers to the asparagine residue located at about position 297 in the Fc region (EU numbering of Fc region residues; or position 314 in Kabat numbering) ; however, Asn297 may also be located about ±3 amino acids upstream or downstream of position 297, i.e., between positions 294 and 300, due to minor sequence variations in Fc region sequences. Such fucosylation variants may have improved ADCC function. In some embodiments, to reduce glycan heterogeneity, the Fc region can be further engineered to replace the Asparagine at position 297 with Alanine (N297A) .

[0276] In some embodiments, the disclosure is related to a protein construct comprising the engineered IL-2 polypeptide described herein. In some embodiments, the protein construct comprises two or more engineered IL-2 polypeptides. In some embodiments, at least two of the engineered IL-2 polypeptides are identical. In some embodiments, at least two of the engineered IL-2 polypeptides are different. In some embodiments, the protein construct further comprises an Fc region. In some embodiments, the Fc region is an IgG4 Fc region. In some embodiments, the Fc region is an IgG1 Fc region. In some embodiments, the Fc region is an IgG1 Fc region (e.g., with LALA mutations or LALA-PG mutations) . In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide is linked to the C-terminus of the Fc region. In some embodiments, the engineered IL-2 polypeptide is linked to the C-terminus of the Fc region via a linker peptide (e.g., any of the linker peptides described herein) . In some embodiments, the linker peptide comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 72. In some embodiments, the linker peptide comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 92. In some embodiments, the linker peptide comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOS: 85, 92, and 99-105.

[0277] Characterization of the engineered IL-2 variants or protein constructs

[0278] In some embodiments, the engineered IL-2 variants (e.g., any of the engineered IL-2 polypeptides described herein) or protein constructs thereof described herein can bind to the trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ. In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein can induce strong downstream signaling (e.g., STAT5 phosphorylation) in Treg cells (e.g., by binding to the trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ) . In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein have no or minimal binding to the dimeric IL-2 receptor complex IL-2Rβγ. In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein induce no or minimal downstream signaling (e.g., STAT5 phosphorylation) in Tconv cells (e.g., by binding to the dimeric IL-2 receptor complex IL-2Rβγ) .

[0279] In some embodiments, introduction of the mutations (e.g., any of the cysteine mutations described herein) can lead to protein conformational change with a RMSD (root-mean-square deviation of atomic positions) value of less than  less than less than less than less than less than less than less than less than or less than In some embodiments, the RMSD value is calculated by structurally align the wild-type protein and the protein variants. In some embodiments, only Calpha atoms are used for determining the conformational change.

[0280] In some embodiments, the engineered IL-2 variants (e.g., any of the engineered IL-2 polypeptides described herein) or protein constructs thereof described herein (e.g., any of the G1LALAFc-fused IL-2 variants described herein) can induce STAT5 signaling (e.g., STAT5 phosphorylation) in immune cells (e.g., Treg cells) . In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can induce STAT5 phosphorylation with a potency that is less than about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 100%, about 110%, about 120%, about 130%, or about 140%as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof. In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can induce STAT5 phosphorylation with a potency that is higher than about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 100%, about 110%, about 120%, about 130%, or about 140%as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof.

[0281] In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can preferentially induce STAT5 phosphorylation in Treg cells as compared to Tconv cells. In some embodiments, in Treg cells, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can induce STAT5 phosphorylation with a potency that is higher than about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 100%, about 110%, about 120%, about 130%, or about 140%as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof. In some embodiments, in Tconv cells, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can induce STAT5 phosphorylation with a potency that is less than about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, or about 80%as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof.

[0282] In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can induce proliferation of immune cells (e.g., Treg cells) with a potency that is about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 100%, about 110%, about 120%, about 130%, or about 140%as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof.

[0283] In some embodiments, the potency to induce STAT5 signaling (e.g., STAT5 phosphorylation) can be determined using an IL-2 reporter assay (e.g., the one described in Example 3) . In some embodiments, HEK-BlueTM IL-2 Cells (cells overexpressing CD25, CD122, and CD132) and HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells (cells overexpressing CD122 and CD132) are used to determine the potency to induce STAT5 signaling (e.g., STAT5 phosphorylation) . In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can preferentially induce STAT5 phosphorylation in HEK-BlueTM IL-2 Cells (cells overexpressing CD25, CD122, and CD132) as compared to HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells (cells overexpressing CD122 and CD132) . In some embodiments, in HEK-BlueTM IL-2 Cells, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can induce STAT5 phosphorylation with a potency that is higher than about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 100%, about 110%, about 120%, about 130%, or about 140%as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof. In some embodiments, in HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can induce STAT5 phosphorylation with a potency that is less than about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, or about 80%as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof.

[0284] In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein can induce proliferation of Treg cells (e.g., HEK-BlueTM IL-2 Cells) with a potency that is higher than about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 100%, about 110%, about 120%, about 130%, or about 140%as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof. In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein can induce activation of Treg cells (e.g., HEK-BlueTM IL-2 Cells) with a potency that is higher than about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 100%, about 110%, about 120%, about 130%, or about 140%as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof.

[0285] In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof as described herein can suppress immune response, activity or number of immune cells (e.g., T cells or NK cells) by at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 folds, 3 folds, 5 folds, 10 folds, or 20 folds.

[0286] In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can bind to the trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is less than 0.1 s-1, less than 0.01 s-1, less than 0.001 s-1, less than 0.0001 s-1, or less than 0.00001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s-1, greater than 0.001 s-1, greater than 0.0001 s-1, greater than 0.00001 s-1, or greater than 0.000001 s-1. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is greater than 1 × 102 / Ms, greater than 1 × 103 / Ms, greater than 1 × 104 / Ms, greater than 1 × 105 / Ms, or greater than 1 ×106 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is less than 1 × 105 / Ms, less than 1 × 106 / Ms, or less than 1 × 107 / Ms. Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some embodiments, KD is less than 1 × 10-6 M, less than 1 × 10-7 M, less than 1 × 10-8 M, less than 1 × 10-9 M, or less than 1 × 10-10 M. In some embodiments, the KD is less than 300 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, or 10 pM. In some embodiments, KD is greater than 1 × 10-7 M, greater than 1 × 10-8 M, greater than 1 × 10-9 M, greater than 1 × 10-10 M, greater than 1 × 10-11 M, or greater than 1 × 10-12 M.

[0287] In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can bind to the dimeric IL-2 receptor complex IL-2Rβγ. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is less than 0.1 s-1, less than 0.01 s-1, less than 0.001 s-1, less than 0.0001 s-1, or less than 0.00001 s-1. In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s-1, greater than 0.001 s-1, greater than 0.0001 s-1, greater than 0.00001 s-1, or greater than 0.000001 s-1. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is greater than 1 × 102 / Ms, greater than 1 × 103 / Ms, greater than 1 × 104 / Ms, greater than 1 × 105 / Ms, or greater than 1 ×106 / Ms. In some embodiments, kinetic association rates (kon) is less than 1 × 105 / Ms, less than 1 × 106 / Ms, or less than 1 × 107 / Ms. Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some embodiments, KD is less than 1 × 10-6 M, less than 1 × 10-7 M, less than 1 × 10-8 M, less than 1 × 10-9 M, or less than 1 × 10-10 M. In some embodiments, the KD is less than 300 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, or 10 pM. In some embodiments, KD is greater than 1 × 10-7 M, greater than 1 × 10-8 M, greater than 1 × 10-9 M, greater than 1 × 10-10 M, greater than 1 × 10-11 M, or greater than 1 × 10-12 M.

[0288] In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can preferentially bind to the trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ, as compared to the dimeric IL-2 receptor complex IL-2Rβγ. In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can bind to the trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ with a first KD, and the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can bind to the dimeric IL-2 receptor complex IL-2Rβγ with a second KD. In some embodiments, the second KD is at least 1-fold, at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 10-fold, at least 20-fold, or at least 100-fold of the first KD. In some embodiments, the first KD is less than 100%, less than 50%, less than 20%, less than 10%, less than 5%, less than 2%, or less than 1%of the second KD. In some embodiments, the first KD is higher than 100%, higher than 50%, higher than 20%, higher than 10%, higher than 5%, higher than 2%, or higher than 1%of the second KD.

[0289] In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can bind to the trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ with a stronger affinity than the wildtype IL-2. In some embodiments, the binding affinity between the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof and the trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ is at least about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 100%, about 200%, about 300%, about 400%, about 500%, or about 1000%higher than the binding affinity between the wild type IL-2 and the trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ.

[0290] In some embodiments, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can bind to the dimeric IL-2 receptor complex IL-2Rβγ with a lower affinity than the wildtype IL-2. In some embodiments, the binding affinity between the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof and the dimeric IL-2 receptor complex IL-2Rβγ is at least about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 100%, about 200%, about 300%, about 400%, about 500%, or about 1000%lower than the binding affinity between the wild type IL-2 and the trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ.

[0291] General techniques for measuring the affinity include, e.g., ELISA, radioimmunoassay (RIA) , and surface plasmon resonance (SPR) . In some embodiments, the affinity is determined by cell-based assays.

[0292] In some embodiments, the engineered IL-2 protein constructs thereof described herein can be expressed and purified by methods commonly used in the art, e.g., affinity chromatography. In some cases, the protein constructs can be purified by size-exclusive chromatography (SEC) coupled with HPLC. In some embodiments, the percentage of the main peak in the SEC-HPLC analysis result is at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%. In some embodiments, the percentage of high molecular weight peak (HMW%) and / or low molecular weight peak (LMW%) is less than 5%, less than 4%, less than 3%, less than 2%, or less than 1%.

[0293] In some embodiments, thermal stabilities of the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein can be determined. The engineered IL-2 variants and protein constructs thereof described herein can have a Tm greater than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. In some embodiments, Tm is less than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, or 95 ℃. In some embodiments, the aggregation (Tagg) and onset (Tonset) temperatures of the engineered IL-2 variants and protein constructs thereof described herein can be measured by application on a heat ramp (e.g., from 25-85℃) based on DLS / SLS. DLS / SLS are well-known techniques for determining sample interactions, particle size, and aggregation of molecules dispersed or dissolved in solution. The temperatures that experience the onset of unfolding (Tonset) and aggregation (Tagg) are considered key predictors of stability. In some embodiments, the Tagg of the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein is at least 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, or 65 ℃. In some embodiments, the Tonset of the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein is at least 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, or 66 ℃.

[0294] In some embodiments, the cysteine mutations (e.g., any of the cysteine mutations or a combination thereof described herein) can increase the aggregation (Tagg) and / or onset (Tonset) temperatures by at least 0.5℃, at least 1℃, at least 1.5℃, at least 2℃, at least 2.5℃, at least 3℃, at least 3.5℃, at least 4℃, at least 4.5℃, at least 5℃, at least 5.5℃, at least 6℃, at least 6.5℃, at least 7℃, at least 7.5℃, at least 8℃, at least 8.5℃, or at least 9℃.

[0295] In some embodiments, the half-life of the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein can be increased by at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 1-fold, at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 10-fold, at least 20-fold, or at least 100-fold, as compared to that of a wild-type IL-2 or protein construct thereof. In some embodiments, the half-life is determined by measuring the in vivo concentration of the molecule over time, after administration into a subject.

[0296] In some embodiments, after being administered in vivo, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein can have a higher serum concentration (for example, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 1-fold, at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 10-fold, or at least 20-fold, at least 50-fold, or at least 100-fold higher) , after 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 days.

[0297] In some embodiments, after being administered in vivo, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein can reduce the GvHD of the subject, by at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 1-fold, at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 10-fold, at least 20-fold, at least 50-fold, or at least 100-fold.

[0298] In some embodiments, after being administered in vivo, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein do not cause significant toxicity.

[0299] Methods of making engineered IL-2 variants and protein constructs

[0300] The engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the DNA encoding an IL-2 peptide or a part thereof or by peptide synthesis. Such variants include, for example, deletions, insertions, or substitutions of residues within the amino acids sequences.

[0301] Screening can be performed. The engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein can be expressed and purified using methods known in the art. Their expression and purification profiles can be compared by various analytical methods (e.g., SDS-PAGE, and HPLC-SEC) . In addition, the potency of the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein on T cell response can be determined by STAT-5 phosphorylation and / or IL-2 reporter assays (e.g., the one described in Example 3) . Based on the experimental results, engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein with a good expression / purification profile and desirable T cell response potency can be selected, potentially to further evaluate their immune suppression efficacy and in vivo toxicity (e.g., in a mouse model) .

[0302] Engineered IL-2 variants can be derived from any species of animal, including mammals. Non-limiting examples of IL-2 variants include IL-2 variants derived from humans, primates, e.g., monkeys and apes, cows, pigs, horses, sheep, camelids (e.g., camels and llamas) , chicken, goats, and rodents (e.g., rats, mice, hamsters and rabbits) .

[0303] The present disclosure also provides recombinant vectors (e.g., an expression vectors) that include an isolated polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein) , host cells into which are introduced the recombinant vectors (i.e., such that the host cells contain the polynucleotide and / or a vector comprising the polynucleotide) , and the production of recombinant polypeptides or fragments thereof by recombinant techniques.

[0304] As used herein, a “vector” is any construct capable of delivering one or more polynucleotide (s) of interest to a host cell when the vector is introduced to the host cell. An “expression vector” is capable of delivering and expressing the one or more polynucleotide (s) of interest as an encoded polypeptide in a host cell into which the expression vector has been introduced. Thus, in an expression vector, the polynucleotide of interest is positioned for expression in the vector by being operably linked with regulatory elements such as a promoter, enhancer, and / or a poly-Atail, either within the vector or in the genome of the host cell at or near or flanking the integration site of the polynucleotide of interest such that the polynucleotide of interest will be translated in the host cell introduced with the expression vector.

[0305] A vector can be introduced into the host cell by methods known in the art, e.g., electroporation, chemical transfection (e.g., DEAE-dextran) , transformation, transfection, and infection and / or transduction (e.g., with recombinant virus) . Thus, non-limiting examples of vectors include viral vectors (which can be used to generate recombinant virus) , naked DNA or RNA, plasmids, cosmids, phage vectors, and DNA or RNA expression vectors associated with cationic condensing agents.

[0306] In some implementations, a polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein) is introduced using a viral expression system (e.g., vaccinia or other pox virus, retrovirus, or adenovirus) , which may involve the use of a non-pathogenic (defective) , replication competent virus, or may use a replication defective virus. Techniques for incorporating DNA into such expression systems are well known to those of ordinary skill in the art. The DNA may also be “naked. ” The uptake of naked DNA may be increased by coating the DNA onto biodegradable beads that are efficiently transported into the cells.

[0307] For expression, the DNA insert comprising a polypeptide-encoding polynucleotide disclosed herein can be operatively linked to an appropriate promoter (e.g., a heterologous promoter) , such as the phage lambda PL promoter, the E. coli lac, trp and tac promoters, the SV40 early and late promoters and promoters of retroviral LTRs, to name a few. Other suitable promoters are known to the skilled artisan. In some embodiments, the promoter is a cytomegalovirus (CMV) promoter. In some embodiments, the promoter is a human promoter, e.g., uHS or HS promoter. The human promoters can improve expression of proteins derived from human. Details of such human promoters can be found, e.g., in Antoniou, M., et al. “Transgenes encompassing dual-promoter CpG islands from the human TBP and HNRPA2B1 loci are resistant to heterochromatin-mediated silencing. ” Genomics 82.3 (2003) : 269-279; and Zhang, F., et al. “Aubiquitous chromatin opening element (UCOE) confers resistance to DNA methylation–mediated silencing of lentiviral vectors. ” Molecular Therapy 18.9 (2010) : 1640-1649; each of which is incorporated herein by reference in its entirety. The expression constructs can further contain sites for transcription initiation, termination and, in the transcribed region, a ribosome binding site for translation. The coding portion of the mature transcripts expressed by the constructs may include a translation initiating at the beginning and a termination codon (UAA, UGA, or UAG) appropriately positioned at the end of the polypeptide to be translated.

[0308] As indicated, the expression vectors can include at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture and tetracycline or ampicillin resistance genes for culturing in E. coli and other bacteria. Representative examples of appropriate hosts include, but are not limited to, bacterial cells, such as E. coli, Streptomyces, and Salmonella typhimurium cells; fungal cells, such as yeast cells; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 cells; animal cells such as CHO, COS, Bowes melanoma, and HEK 293 cells; and plant cells. Appropriate culture mediums and conditions for the host cells described herein are known in the art.

[0309] Non-limiting vectors for use in bacteria include pQE70, pQE60 and pQE-9, available from Qiagen; pBS vectors, Phagescript vectors, Bluescript vectors, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, available from Stratagene; and ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 available from Pharmacia. Non-limiting eukaryotic vectors include pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG available from Stratagene; and pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL available from Pharmacia. Other suitable vectors will be readily apparent to the skilled artisan.

[0310] Non-limiting bacterial promoters suitable for use include the E. coli lacI and lacZ promoters, the T3 and T7 promoters, the gpt promoter, the lambda PR and PL promoters and the trp promoter. Suitable eukaryotic promoters include the CMV immediate early promoter, the HSV thymidine kinase promoter, the early and late SV40 promoters, the promoters of retroviral LTRs, such as those of the Rous sarcoma virus (RSV) , and metallothionein promoters, such as the mouse metallothionein-I promoter.

[0311] In the yeast Saccharomyces cerevisiae, a number of vectors containing constitutive or inducible promoters such as alpha factor, alcohol oxidase, and PGH can be used.

[0312] Introduction of the construct into the host cell can be affected by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection or other methods. Such methods are described in many standard laboratory manuals, such as Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986) , which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0313] In some embodiments, the host cell is a human cell suitable for protein expression, e.g., HEK 293 cells or CHO cells (e.g., CHO-Scells) . In some embodiments, the host cells are Expi293TM cells and ExpiCHOTM cells. The Expi293 Expression System is designed to deliver up to 6× more protein in just one week, compared with other transient 293 expression systems that can take two weeks or more. This is in part due to the fact that Expi293F cells are adapted to achieve higher pg / cell / day productivity than standard HEK 293 cells, and the ExpifectamineTM 293 Transfection Reagent and enhancers enable high-efficiency transfection and expression levels of high-density HEK 293 cultures. Additionally, the Expi293 Expression System requires less plasticware, which means less waste and more incubator space.

[0314] Transcription of DNA encoding a polypeptide of the present disclosure by higher eukaryotes may be increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers are cis-acting elements of DNA, usually about from 10 to 300 bp that act to increase transcriptional activity of a promoter in a given host cell-type. Examples of enhancers include the SV40 enhancer, which is located on the late side of the replication origin at base pairs 100 to 270, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and adenovirus enhancers.

[0315] For secretion of the translated protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space or into the extracellular environment, appropriate secretion signals may be incorporated into the expressed polypeptide. The signals may be endogenous to the polypeptide or they may be heterologous signals.

[0316] The polypeptide (e.g., engineered IL-2 variants) can be expressed in a modified form, such as a fusion protein (e.g., G1LALAFc fusion protein) or with a histidine-tag, and may include not only secretion signals, but also additional heterologous functional regions. For instance, a region of additional amino acids, particularly charged amino acids, may be added to the N-terminus of the polypeptide to improve stability and persistence in the host cell, during purification, or during subsequent handling and storage. Also, peptide moieties can be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions can be removed prior to final preparation of the polypeptide. The addition of peptide moieties to polypeptides to engender secretion or excretion, to improve stability and to facilitate purification, among others, are familiar and routine techniques in the art.

[0317] Methods of treatment

[0318] The engineered IL-2 variants and protein constructs thereof of the present disclosure can be used for various therapeutic purposes.

[0319] In one aspect, the disclosure provides methods for treating an immune disease in a subject. In some embodiments, the treatment can halt, slow, retard, or inhibit progression of an immune disease. In some embodiments, the treatment can result in the reduction of in the number, severity, and / or duration of one or more symptoms of the immune disease in a subject. In some embodiments, the immune disease is an autoimmune disease.

[0320] In one aspect, the disclosure provides methods for treating, preventing, or reducing the risk of developing disorders associated with an abnormal or unwanted immune response, e.g., an autoimmune disorder, e.g., by administering a therapeutically effective amount of engineered IL-2 variants and protein constructs disclosed herein to a subject in need thereof. These autoimmune disorders include, but are not limited to, rheumatoid arthritis, Crohn’s disease, systemic lupus erythematosus, ankylosing spondylitis, inflammatory bowel diseases (IBD) , ulcerative colitis, or scleroderma. In some embodiments, the autoimmune disorders include allergy, asthma, and / or atopic dermatitis. Thus, engineered IL-2 variants and protein constructs disclosed herein can be used to inhibit immune response. In some embodiments, the immune disorders described herein is allergy, asthma, myocarditis, nephritis, hepatitis, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, scleroderma, hyperthyroidism, idiopathic thrombocytopenic purpura, autoimmune hemolytic anemia, ulcerative colitis, autoimmune liver disease, diabetes, pain or neurological disorders.

[0321] In one aspect, the disclosure provides methods for treating, preventing, or reducing the risk of developing disorders associated with an abnormal or unwanted immune response, e.g., an autoimmune disorder, e.g., by administering a therapeutically effective amount of engineered IL-2 variants and protein constructs disclosed herein to a subject in need thereof. These autoimmune disorders include, but are not limited to, Alopecia areata, lupus, ankylosing spondylitis, Meniere’s disease, antiphospholipid syndrome, mixed connective tissue disease, autoimmune Addison’s disease, multiple sclerosis, autoimmune hemolytic anemia, myasthenia gravis, autoimmune hepatitis, pemphigus vulgaris, Behcet’s disease, pernicious anemia, bullous pemphigoid, polyarthritis nodosa, cardiomyopathy, polychondritis, celiac sprue-dermatitis, polyglandular syndromes, chronic fatigue syndrome (CFIDS) , polymyalgia rheumatica, chronic inflammatory demyelinating, polymyositis and dermatomyositis, chronic inflammatory polyneuropathy, primary agammaglobulinemia, Churg-Strauss syndrome, primary biliary cirrhosis, cicatricial pemphigoid, psoriasis, CREST syndrome, Raynaud’s phenomenon, cold agglutinin disease, Reiter’s syndrome, Crohn’s disease, Rheumatic fever, discoid lupus, rheumatoid arthritis, Cryoglobulinemia sarcoidosis, fibromyalgia, scleroderma, Grave’s disease, syndrome, Guillain-Barre, stiff-man syndrome, Hashimoto’s thyroiditis, Takayasu arteritis, idiopathic pulmonary fibrosis, temporal arteritis / giant cell arteritis, idiopathic thrombocytopenia purpura (ITP) , ulcerative colitis, IgA nephropathy, uveitis, diabetes (e.g., Type I) , vasculitis, lichen planus, and vitiligo. The engineered IL-2 variants and protein constructs disclosed herein can also be administered to a subject to treat, prevent, or reduce the risk of developing disorders associated with an abnormal or unwanted immune response associated with cell, tissue or organ transplantation, e.g., renal, hepatic, and cardiac transplantation, e.g., graft versus host disease (GvHD) , or to prevent allograft rejection. In some embodiments, the subject has dermatological disorders, liver disease (e.g., cirrhosis) , Hidradenitis, experimental autoimmune encephalomyelitis. In some embodiments, the subject has renal disease, lupus, Sjogren’s syndrome, ulcerative colitics, psoriasis, Hidradenitis suppurativa, Immune Thrombocytopenia (ITP) , or other inflammatory arthritis. In some embodiments, the subject has multiple sclerosis or myasthenia gravis. In some embodiments, the subject has Crohn’s disease, ulcerative colitis or diabetes (e.g., Type I) . In some embodiments, the subject has autoimmune thyroid disease, Grave’s disease, multiple sclerosis, psoriasis, inflammatory bowel disease (e.g., Crohn’s Disease (CD) and ulcerative colitis) , rheumatoid arthritis, syndrome, autoimmune nephritis, or systemic lupus erythematosus. In some embodiments, the methods involve administering to the subject an effective amount of a composition comprising engineered IL-2 variants and protein constructs disclosed herein.

[0322] In one aspect, the disclosure provides methods for treating a cancer in a subject, methods of reducing the rate of the increase of volume of a tumor in a subject over time, methods of reducing the risk of developing a metastasis, or methods of reducing the risk of developing an additional metastasis in a subject. In some embodiments, the treatment can halt, slow, retard, or inhibit progression of a cancer. In some embodiments, the treatment can result in the reduction of in the number, severity, and / or duration of one or more symptoms of the cancer in a subject.

[0323] In one aspect, the disclosure features methods that include administering a therapeutically effective amount of engineered IL-2 variants and protein constructs disclosed herein to a subject in need thereof (e.g., a subject having, or identified or diagnosed as having, a cancer) , e.g., breast cancer (e.g., triple-negative breast cancer) , carcinoid cancer, cervical cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, renal cancer, colorectal cancer, gastric cancer, testicular cancer, thyroid cancer, bladder cancer, urethral cancer, or hematologic malignancy. In some embodiments, the cancer is unresectable melanoma or metastatic melanoma, non-small cell lung carcinoma (NSCLC) , small cell lung cancer (SCLC) , bladder cancer, or metastatic hormone-refractory prostate cancer. In some embodiments, the subject has a solid tumor. In some embodiments, the cancer is squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN) , renal cell carcinoma (RCC) , triple-negative breast cancer (TNBC) , or colorectal carcinoma. In some embodiments, the cancer is melanoma, pancreatic carcinoma, mesothelioma, hematological malignancies, especially Non-Hodgkin's lymphoma, lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, or advanced solid tumors. In some embodiments, the cancer is breast cancer, ovarian cancer, glioma, colon cancer, hepatocellular carcinoma, prostate cancer, renal cell carcinoma, melanoma, lung cancer, pancreatic cancer, or hepatoma.

[0324] In some embodiments, the compositions and methods disclosed herein can be used for treatment of patients at risk for a cancer. Patients with cancer can be identified with various methods known in the art.

[0325] In one aspect, the disclosure features methods that include administering a therapeutically effective amount of engineered IL-2 variants and protein constructs disclosed herein to a subject in need thereof, e.g., a subject having, or identified or diagnosed as having, an immune disease, or a cancer, e.g., breast cancer (e.g., triple-negative breast cancer) , carcinoid cancer, cervical cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, renal cancer, colorectal cancer, gastric cancer, testicular cancer, thyroid cancer, bladder cancer, urethral cancer, or hematologic malignancy. In some embodiments, the cancer is unresectable melanoma or metastatic melanoma, non-small cell lung carcinoma (NSCLC) , small cell lung cancer (SCLC) , bladder cancer, or metastatic hormone-refractory prostate cancer. In some embodiments, the subject has a solid tumor. In some embodiments, the cancer is squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN) , renal cell carcinoma (RCC) , triple-negative breast cancer (TNBC) , or colorectal carcinoma. In some embodiments, the subject has Hodgkin’s lymphoma. In some embodiments, the subject has triple-negative breast cancer (TNBC) , gastric cancer, urothelial cancer, Merkel-cell carcinoma, or head and neck cancer.

[0326] In some embodiments, the cancer described herein is esophageal adenocarcinoma, lung cancer, hepatocellular carcinoma, cholangiocarcinoma, gallbladder cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, endometrial carcinoma, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, or T cell lymphoma. In some embodiments, the cancer is renal cancer.

[0327] In some embodiments, the compositions and methods disclosed herein can be used for treatment of patients at risk for a cancer. Patients with cancer can be identified with various methods known in the art.

[0328] As used herein, by an “effective amount” is meant an amount or dosage sufficient to effect beneficial or desired results including halting, slowing, retarding, or inhibiting progression of a disease, e.g., a cancer. An effective amount will vary depending upon, e.g., an age and a body weight of a subject to which the engineered IL-2 variants and protein constructs, vector comprising the polynucleotide encoding the engineered IL-2 variants and protein constructs, and / or compositions thereof is to be administered, a severity of symptoms and a route of administration, and thus administration can be determined on an individual basis.

[0329] An effective amount can be administered in one or more administrations. By way of example, an effective amount of the engineered IL-2 variants and / or protein constructs is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, inhibit, slow and / or delay progression of a cancer in a patient or is an amount sufficient to ameliorate, stop, stabilize, reverse, slow and / or delay proliferation of a cell (e.g., a biopsied cell, any of the cancer cells described herein, or cell line (e.g., a cancer cell line) ) in vitro. As is understood in the art, an effective amount may vary, depending on, inter alia, patient history as well as other factors such as the type (and / or dosage) of the engineered IL-2 variants and protein constructs used.

[0330] Effective amounts and schedules for administering the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof, the polynucleotides encoding the engineered IL-2 variants or protein constructs, and / or compositions disclosed herein may be determined empirically, and making such determinations is within the skill in the art. Those skilled in the art will understand that the dosage that must be administered will vary depending on, for example, the mammal that will receive the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof, the polynucleotides, and / or compositions disclosed herein, the route of administration, the particular type of polynucleotides, and / or compositions disclosed herein used and other drugs being administered to the mammal.

[0331] A typical daily dosage of an effective amount of the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof is 0.1 mg / kg to 200 mg / kg (mg per kg of patient weight) . In some embodiments, the dosage can be less than 150 mg / kg, 140 mg / kg, 130 mg / kg, 120 mg / kg, 110 mg / kg, 100 mg / kg, 90 mg / kg, 80 mg / kg, 70 mg / kg, 60 mg / kg, 50 mg / kg, 40 mg / kg, 30 mg / kg, 20 mg / kg, 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, or 0.1 mg / kg. In some embodiments, the dosage can be greater than 150 mg / kg, 140 mg / kg, 130 mg / kg, 120 mg / kg, 110 mg / kg, 100 mg / kg, 90 mg / kg, 80 mg / kg, 70 mg / kg, 60 mg / kg, 50 mg / kg, 40 mg / kg, 30 mg / kg, 20 mg / kg, 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, 1 mg / kg, 0.5 mg / kg, or 0.1 mg / kg. In some embodiments, the dosage is about 150 mg / kg, 140 mg / kg, 130 mg / kg, 120 mg / kg, 110 mg / kg, 100 mg / kg, 90 mg / kg, 80 mg / kg, 70 mg / kg, 60 mg / kg, 50 mg / kg, 40 mg / kg, 30 mg / kg, 20 mg / kg, 10 mg / kg, 9 mg / kg, 8 mg / kg, 7 mg / kg, 6 mg / kg, 5 mg / kg, 4 mg / kg, 3 mg / kg, 2 mg / kg, or 1 mg / kg. In some embodiments, the dosage is about 1 to 150 mg / kg, about 1 to 100 mg / kg, about 1 to 80 mg / kg, about 1 to 50 mg / kg, about 1 to 30 mg / kg, about 1 to 20 mg / kg, about 1 to 10 mg / kg, about 1 to 5 mg / kg, about 5 to 150 mg / kg, about 5 to 100 mg / kg, about 5 to 80 mg / kg, about 5 to 50 mg / kg, about 5 to 30 mg / kg, about 5 to 20 mg / kg, about 5 to 10 mg / kg, about 10 to 150 mg / kg, about 10 to 100 mg / kg, about 10 to 80 mg / kg, about 10 to 50 mg / kg, about 10 to 30 mg / kg, about 10 to 20 mg / kg, about 20 to 150 mg / kg, about 20 to 100 mg / kg, about 20 to 80 mg / kg, about 20 to 50 mg / kg, about 20 to 30 mg / kg, about 30 to 150 mg / kg, about 30 to 100 mg / kg, about 30 to 80 mg / kg, about 30 to 50 mg / kg, about 50 to 150 mg / kg, about 50 to 100 mg / kg, about 50 to 80 mg / kg, about 80 to 150 mg / kg, about 80 to 100 mg / kg, or about 100 to 150 mg / kg.

[0332] In any of the methods described herein, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can be administered to the subject at least once a week (e.g., once a week, twice a week, three times a week, four times a week, once a day, twice a day, or three times a day) .

[0333] Pharmaceutical compositions and routes of administration

[0334] Also provided herein are pharmaceutical compositions that contain the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein. The pharmaceutical compositions can be formulated in any manner known in the art.

[0335] Pharmaceutical compositions are formulated to be compatible with their intended route of administration (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) . The compositions can include a sterile diluent (e.g., sterile water or saline) , a fixed oil, polyethylene glycol, glycerine, propylene glycol or other synthetic solvents, antibacterial or antifungal agents, such as benzyl alcohol or methyl parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like, antioxidants, such as ascorbic acid or sodium bisulfite, chelating agents, such as ethylenediaminetetraacetic acid, buffers, such as acetates, citrates, or phosphates, and isotonic agents, such as sugars (e.g., dextrose) , polyalcohols (e.g., mannitol or sorbitol) , or salts (e.g., sodium chloride) , or any combination thereof. Liposomal suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. Preparations of the compositions can be formulated and enclosed in ampules, disposable syringes, or multiple dose vials. Where required (as in, for example, injectable formulations) , proper fluidity can be maintained by, for example, the use of a coating, such as lecithin, or a surfactant. Absorption of the agents can be prolonged by including an agent that delays absorption (e.g., aluminum monostearate and gelatin) . Alternatively, controlled release can be achieved by implants and microencapsulated delivery systems, which can include biodegradable, biocompatible polymers (e.g., ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid) .

[0336] Compositions containing the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein can be formulated for parenteral (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) administration in dosage unit form (i.e., physically discrete units containing a predetermined quantity of active compound for ease of administration and uniformity of dosage) .

[0337] Pharmaceutical compositions for parenteral administration are preferably sterile and substantially isotonic and manufactured under Good Manufacturing Practice (GMP) conditions. Pharmaceutical compositions can be provided in unit dosage form (i.e., the dosage for a single administration) . Pharmaceutical compositions can be formulated using one or more physiologically acceptable carriers, diluents, excipients or auxiliaries. The formulation depends on the route of administration chosen. For injection, the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can be formulated in aqueous solutions, preferably in physiologically-compatible buffers to reduce discomfort at the site of injection. The solution can contain formulatory agents such as suspending, stabilizing and / or dispersing agents. Alternatively the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof can be in lyophilized form for constitution with a suitable vehicle, e.g., sterile pyrogen-free water, before use.

[0338] Toxicity and therapeutic efficacy of compositions can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals (e.g., monkeys) . One can, for example, determine the LD50 (the dose lethal to 50%of the population) and the ED50 (the dose therapeutically effective in 50%of the population) : the therapeutic index being the ratio of LD50: ED50. Agents that exhibit high therapeutic indices are preferred. Where an agent exhibits an undesirable side effect, care should be taken to minimize potential damage (i.e., reduce unwanted side effects) . Toxicity and therapeutic efficacy can be determined by other standard pharmaceutical procedures.

[0339] Exemplary doses include milligram or microgram amounts of any of the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof described herein per kilogram of the subject’s weight (e.g., about 1 μg / kg to about 500 mg / kg; about 100 μg / kg to about 500 mg / kg; about 100 μg / kg to about 50 mg / kg; about 10 μg / kg to about 5 mg / kg; about 10 μg / kg to about 0.5 mg / kg; about 1 μg / kg to about 50 μg / kg; about 1 mg / kg to about 10 mg / kg; or about 1 mg / kg to about 5 mg / kg) . While these doses cover a broad range, one of ordinary skill in the art will understand that therapeutic agents can vary in their potency, and effective amounts can be determined by methods known in the art. Typically, relatively low doses are administered at first, and the attending health care professional or veterinary professional (in the case of therapeutic application) or a researcher (when still working at the development stage) can subsequently and gradually increase the dose until an appropriate response is obtained. In addition, it is understood that the specific dose level for any particular subject will depend upon a variety of factors including the activity of the specific compound employed, the age, body weight, general health, gender, and diet of the subject, the time of administration, the route of administration, the rate of excretion, and the half-life of the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof in vivo.

[0340] The pharmaceutical compositions can be stored in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration. The disclosure also provides methods of manufacturing the engineered IL-2 variants or protein constructs thereof for various uses as described herein.

[0341] EXAMPLES

[0342] The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

[0343] Example 1. Design of IL-2 variants

[0344] Different IL-2 variant proteins (or IL-2 variants) were designed by mutating one or more amino acid residues in the soluble chain of human IL-2 (IL-2_WT; SEQ ID NO: 2) into cysteine residues. It was contemplated that the introduced cysteines can generate artificial disulfide bonds, thereby finely modulating IL-2’s function in immune response, e.g., separating the immune-stimulating function and immune-suppressing function of IL-2.

[0345] Specifically, selected amino acid residue (s) in the soluble chain of human IL-2 (IL-2_WT; SEQ ID NO: 2) can be mutated to cysteine residue (s) , and IL-2 variants were obtained, as shown in the table below.

[0346] Table 1. Cys mutations in IL-2 variants

[0347] The amino acid sequences of IL-2_WT (SEQ ID NO: 2) and its variants IL-2_C01 (SEQ ID NO: 3) , IL-2_C02 (SEQ ID NO: 4) , IL-2_C03 (SEQ ID NO: 5) , IL-2_C04 (SEQ ID NO: 6) , IL-2_C05 (SEQ ID NO: 7) , IL-2_C06 (SEQ ID NO: 8) , IL-2_C07 (SEQ ID NO: 9) , IL-2_C08 (SEQ ID NO: 10) , IL-2_C09 (SEQ ID NO: 11) , IL-2_C10 (SEQ ID NO: 12) , IL-2_C11 (SEQ ID NO: 13) , IL-2_C21 (SEQ ID NO: 14) , IL-2_C22 (SEQ ID NO: 15) , IL-2_C23 (SEQ ID NO: 16) , IL-2_C24 (SEQ ID NO: 17) are listed in FIG. 12.

[0348] To facilitate protein purification and identification, IL-2_WT and its variants were fused with a His tag (SEQ ID NO: 18) at the N-terminus to generate H8-IL-2_WT (SEQ ID NO: 19) . The amino acid sequences of the corresponding His-tagged IL-2 variants are also listed in FIG. 12.

[0349] Example 2. Production and purification of H8-IL-2 variants

[0350] The IL-2 variants fused with a His tag were expressed in both Expi293TM cells and ExpiCHOTM cells. Following expression, the proteins were purified by affinity chromatography using a HisTrapTM excel column (Cytiva, Cat. No.: 17371206) prepacked with Ni Sepharose, and size exclusion chromatography (SEC) using a SuperdexTM 75 Increase column (Cytiva, Cat. No.: 29148721) . Additionally, the purified proteins were analyzed using sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and high-performance liquid chromatography (HPLC) -SEC.

[0351] As shown in FIGS. 1A-1C, out of the 15 His-tagged IL-2 variants, only 7 variants, including H8-IL-2_C01 (SEQ ID NO: 20) , H8-IL-2_C03 (SEQ ID NO: 22) , H8-IL-2_C05 (SEQ ID NO: 24) , H8-IL-2_C21 (SEQ ID NO: 31) , H8-IL-2_C22 (SEQ ID NO: 32) , H8-IL-2_C23 (SEQ ID NO: 33) , and H8-IL-2_C24 (SEQ ID NO: 34) , were successfully produced and purified in ExpiCHOTM cells (FIG. 1A) and / or Expi293 cells (FIGS. 1B-1C) . The production titers of the other His-tagged IL-2 variants were too low to be determined. Therefore, H8-IL-2_C01, H8-IL-2_C03, H8-IL-2_C05, H8-IL-2_C21, H8-IL-2_C22, H8-IL-2_C23, H8-IL-2_C24 and H8-IL-2_WT were subjected to the subsequent in vitro tests.

[0352] Example 3. IL-2 reporter signaling detection in HEK-BlueTM IL-2 Cells and HEK-BlueTMCD122 / CD132 Cells

[0353] IL-2 reporter assays were performed to test the IL-2-phospho STAT5 (pSTAT5) -signaling activities induced by the designed IL-2 molecules that were described in Example 1.2.8 x 105 cells / mL of HEK-BlueTM IL-2 Cells (InvivoGen, Cat. No.: hkb-il2) and HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells (InvivoGen, Cat. No.: hkb-il2bg) were resuspended respectively in pre-warmed Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (CORNING, Cat. No.: 10-013-CV) , supplemented with 10% (v / v) heat-inactivated GibcoTM Fetal Bovine Serum (FBS) (Fisher Scientific, Cat. No.: A31606-01) and 100× Penicillin-Streptomycin Solution (CORNING, Cat. No.: 30-002-CI) . 180 μL of HEK-BlueTM IL-2 Cells or HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells were incubated with 20 μL of serially diluted designed IL-2 variants or corresponding control proteins in 96 well TC-treated microplates (CORNING, Cat. No.: 3599) at 37℃ for 22 hours. After incubation, 20 μL of cell culture supernatant from either the induced HEK-BlueTM IL-2 Cells or the induced HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells was combined with 180 μL of resuspended QUANTI-BlueTM Solution (InvivoGen, Cat. No.: rep-qbs2) in a flat-bottom 96-well plate (Paul Bottger, Cat. No.: 05-031-0100) and incubated at 37℃ for 2-3 hours. The activity of secreted alkaline phosphatase (SEAP) was assessed by measuring absorbance at 630 nm using a Thermo ScientificTM VarioskanTM LUK spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Type 3020) .

[0354] As shown in FIGS. 2A and 2C, the IL-2-pSTAT5 reporter signaling activities induced by the tested H8-IL-2 variants, H8-IL-2_C01, C03, C05, C21, C22, C23, and C24, was similar to activities induced by H8-IL-2_WT in HEK-BlueTM IL-2 Cells (cells overexpressing CD25, CD122, and CD132) . However, in HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells (cells overexpressing CD122 and CD132) , H8-IL-2 variants induced differential IL-2-pSTAT5 reporter signaling activities as shown in FIGS. 2B and 2D. FIG. 2B showed that H8-IL-2_C01 induced the weakest activity as compared to H8-IL-2_WT, H8-IL-2_C03, and H8-IL-2_C05. The order of reporter activity from high to low is H8-IL-2_WT, C05 >> H8-IL-2_C03 > H8-IL-2_C01 in HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells. In a separate assay shown in FIG. 2D, the order of reporter activity from high to low is H8-IL-2_WT, C22 >> H8-IL-2_C23, C24 > H8-IL-2_C21 in HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells. These results suggest that some H8-IL-2 variants, particularly H8-IL-2_C01 and H8-IL-2_C21, exhibited a greater capability to induce IL-2 signaling activities in cells overexpressing CD25, CD122, and CD132 (like Treg cells) compared to cells overexpressing only CD122 and CD132 (like Teff cells) . Therefore, IL-2_C01 and its variants may possess the potential for autoimmune treatment.

[0355] Example 4. Design of H8-IL-2_C01_T3A-derived variants

[0356] The amino acid sequences of IL-2_WT_T3A (SEQ ID NO: 35) , IL-2_C01_T3A (SEQ ID NO: 36) , and IL-2_C01_T3A-derived variants consisting of IL-2_C01#1 to #15 (SEQ ID NOs: 37-51) are listed in FIG. 12. The mutations in IL-2_C01_T3A and its variants are summarized in Table 2 as shown below. Each IL-2_C01_T3A-derived variant carries an additional mutation, along with a T3A replacement, a Q11C replacement, and an I129C replacement on the IL-2_WT backbone. To facilitate protein purification and identification, IL-2_WT_3TA, IL-2_C01_T3A, and IL-2_C01_T3A-derived variants were fused with His tags, leading to the generation of H8-IL-2_WT_T3A (SEQ ID NO: 52) , H8-IL-2_C01_T3A (SEQ ID NO: 53) , and H8-IL-2_C01_T3A-derived variants, consisting of H8-IL-2_C01#1 to #15 (SEQ ID NOs: 54-68) .

[0357] Table 2. Mutations in IL-2_C01_T3A and its variants

[0358] Example 5. Production and purification of H8-IL-2_C01_T3A-derived variants

[0359] The IL-2_C01_T3A and its variants, fused with a His tag, were expressed in Expi293 and ExpiCHO cells following the same procedure described in Example 2.

[0360] As illustrated in FIG. 3, H8-IL-2_C01_T3A and all 15 designed H8-IL-2_C01_T3A-derived variants were successfully produced and purified in Expi293 cells. These newly designed H8-IL-2_C01_T3A-derived variants were subjected to following in vitro tests.

[0361] Example 6. IL-2 reporter signaling detection in HEK-BlueTM IL-2 Cells and HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells

[0362] IL-2 reporter assay was performed following the same procedure as described in Example 3. The abundance of IL-2-pSTAT5 signaling activity was determined using the following formula: [ (Optical Density (OD) value at 630 nm (OD630) of each tested molecule at 600 pM –OD630 of the cell only control)  /  (OD630 of H8-IL-2_C01_T3A at 600 pM –OD630 of the cell only control) ] ×100%.

[0363] As shown in FIG. 5, the IL-2-pSTAT5 signaling activity induced by H8-IL-2_C01_T3A at 600 pM was used as a 100%control. The greater the value, the more potent the IL-2-pSTAT5 signaling activity. Five “+” symbols represent 81-100%of IL-2-pSTAT5 signaling activity, four “+” symbols represent 61-80%, three “+” symbols represent 41-60%, two “+” symbols represent 21-40%, and one “+” symbol represents 11-20%. The “-” symbol represents 0-10%activity.

[0364] As shown in FIGS. 4A-4H and FIG. 5, the designed H8-IL-2_C01_T3A-derived variants can be categorized into five groups based on the IL-2-pSTAT5 reporter signaling-inducing activities. Group 1, consisting of H8-IL-2_C01#1 (FIGS. 4A-4B) and H8-IL-2_C01#6 (FIGS. 4C-4D) , exhibited a reduced capability of inducing IL-2-pSTAT5 reporter signaling activities in HEK-BlueTM IL-2 Cells and lacked such effect in HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells. Group 2, consisting of H8-IL-2_C01#7 (FIGS. 4C-4D) and H8-IL-2_C01#9 (FIGS. 4E-4F) , showed a moderate capability to induce IL-2-pSTAT5 reporter signaling activity in HEK-BlueTM IL-2 Cells and lacked such effect in HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells. Group 3, including H8-IL-2_C01#2 (FIGS. 4A-4B) , exhibited a moderate capability to induce IL-2-pSTAT5 reporter signaling activity in HEK-BlueTM IL-2 Cells, but a weak effect in HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells. Group 4, consisting of H8-IL-2_C01#3 (FIGS. 4C-4D) , H8-IL-2_C01#4 (FIGS. 4C-4D) , H8-IL-2_C01#10 (FIGS. 4E-4F) , H8-IL-2_C01#12 (FIGS. 4E-4F) , H8-IL-2_C01#14 (FIGS. 4G-4H) , and H8-IL-2_C01#15 (FIGS. 4G-4H) , showed a robust induction of IL-2-pSTAT5 reporter signaling activity in HEK-BlueTM IL-2 Cells but lacked such effect in HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells. Group 5, consisting of H8-IL-2_C01#5 (FIGS. 4C-4D) , H8-IL-2_C01#8 (FIGS. 4E-4F) , H8-IL-2_C01#11 (FIGS. 4E-4F) , and H8-IL-2_C01#13 (FIGS. 4G-4H) , showed a robust induction of IL-2-pSTAT5 reporter signaling activity in HEK-BlueTM IL-2 Cells, as well as a relatively strong induction of IL-2-pSTAT5 reporter signaling activity in HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells.

[0365] Example 7. Detection of STAT5 phosphorylation in Treg and Tconv cells

[0366] STAT5 phosphorylation activity induced by designed IL-2 molecules in Treg and Tconv cells was determined as follows. Treg and Tconv cells were isolated from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) with EasySepTM Human CD4+CD127lowCD25+Regulatory T Cell Isolation kit (STEMCELLTM Technologies, Cat. No.: 18063) . Treg cells were incubated with DynabeadsTM Human T-Activator CD3 / CD28 beads (Thermo Fisher Scientific, Cat. No.: 11131D) in Treg culture medium, consisting of X-VIVOTM15 Media (Lonza, Cat. No.: 04-418Q) , 5% (v / v) human AB serum (Sigma-Aldrich, Cat. No.: H5667) , 1 nM Rapamycin (Sirolimus) (Selleck Chemicals, Cat. No.: S1039) , and 100× Penicillin-Streptomycin Solution (CORNING, Cat. No.: 30-002-CI) at 37 ℃ for 6 days. Tconv cells were cultured in a Tconv culture medium supplemented with 50 IU / mL of recombinant human IL-2 (BioLegend, Cat. No.: 589106) . The Tconv culture medium consists of RPMI-1640 Medium (Fisher Scientific, Cat. No.: 22400-089) , 10% (v / v) heat-inactivated FBS (Fisher Scientific, Cat. No.: A31606-01) , and 100×  Penicillin-Streptomycin Solution (CORNING, Cat. No.: 30-002-CI) at 37 ℃ for 6 days. Treg and Tconv cells were rested overnight and resuspended at a density of 2 x 105 cells / mL in assay medium, consisting of RPMI-1640, 10% (v / v) heat-inactivated FBS, and 100× Penicillin-Streptomycin Solution. 100 μL of Treg or Tconv cells were incubated with 100 μL of serially diluted designed H8-IL-2_C01_T3A-derived variants and corresponding control proteins in 96 well round bottom TC-treated microplates (SPL Life Sciences, Cat. No.: 34096) at 37℃ for 30 minutes. After incubation, cells were harvested and fixed with 4%paraformaldehyde (PFA) solution (Sigma-Aldrich, Cat. No.: P6148) at 37 ℃ for 15 minutes. Then, cells were washed with FACS buffer (PBS supplemented with 4%FBS) and permeabilized with BD PhosflowTM Perm Buffer III (BD Biosciences, Cat. No.: 558050) at 4 ℃ for 30 minutes. To measure the STAT5 phosphorylation level, the cells were washed with FACS buffer and then stained with Phospho-Stat5 (Tyr694) (C71E5) Rabbit mAb (Alexa 647 Conjugate, Cell Signaling Technology, Cat. No.: 9365) , BD HorizonTM BV650 Mouse Anti-Human CD25 antibody (BD Biosciences, Cat. No.: 563719) , and CD4 Monoclonal Antibody (RPA-T4) , PE-Cyanine5, eBioscienceTM (Invitrogen, Cat. No.: 15-0049-42) at 4 ℃ for 30 minutes. Flow cytometry analysis was performed using a CytoFLEX flow cytometer (Beckman Coulter Inc. ) .

[0367] As shown in FIGS. 6A-6F, the designed H8-IL-2_C01_T3A-derived variants can be categorized into five groups based on the STAT5 phosphorylation levels. Group 1, consisting of H8-IL-2_C01#6, exhibited a weaker STAT5 phosphorylation-inducing activity in Treg cells and no STAT5 phosphorylation-inducing activity in Tconv cells. Group 2, consisting of H8-IL-2_C01#1, H8-IL-2_C01#3, H8-IL-2_C01#4, H8-IL-2_C01#9, H8-IL-2_C01#10, and H8-IL-2_C01#12, showed weaker STAT5 phosphorylation-inducing activities in both Treg cells and Tconv cells. Group 3, consisting of H8-IL-2_C01#7, showed a relatively greater capability to induce STAT5 phosphorylation in Treg cells, while exhibiting a weaker effect in Tconv cells. Group 4, consisting of H8-IL-2_C01#2, H8-IL-2_C01#5, H8-IL-2_C01#8, H8-IL-2_C01#11, H8-IL-2_C01#13, H8-IL-2_C01#14, and H8-IL-2_C01#15 showed a stronger STAT5 phosphorylation-inducing activity in Treg cells and a relatively stronger effect in Tconv cells.

[0368] FIG. 7 summarized the results of IL-2 reporter signaling induced by H8-IL-2_C01_T3A-derived variants in HEK-BlueTM IL-2 Cells and HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells, as well as STAT5 phosphorylation induced by H8-IL-2_C01_T3A-derived variants in Treg cells and in Tconv cells. The results of IL-2 reporter signaling induced by H8-IL-2_C01_T3A-derived variants have been described in detail in FIG. 5 and Example 6. For the results of pSTAT5 detection in FIG. 7, the greater the value, the more robust the STAT5 phosphorylation and the stronger potency of the designed H8-IL-2_C01_T3A-derived variants in inducing STAT5 phosphorylation. Five “+” symbols represent the strongest STAT5 phosphorylation induced by H8-IL-2_C01_T3A-derived variants, four “+” symbols represent stronger induction, three “+” symbols represent moderate induction, two “+” symbols represent weaker induction, and one “+” symbol represents the weakest induction. The “-” symbol represents that no STAT5 phosphorylation is induced.

[0369] According to the results of IL-2-pSTAT5 reporter activity and pSTAT5 shown in FIG. 7, the designed H8-IL-2_C01_T3A-derived variants could be categorized into different groups with varying properties. H8-IL-2_C01#2, H8-IL-2_C01#5, H8-IL-2_C01#8, H8-IL-2_C01#11, and H8-IL-2_C01#13 showed a relatively stronger IL-2-pSTAT5 signaling-inducing activity in HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells, as well as a stronger effect in Tconv cells compared to other variants. As a result, these five molecules were not subjected to further studies. The remaining 10 clones of H8-IL-2_C01_T3A-derived variants were selected for the following G1LALAFc-IL-2 construction and in vitro tests.

[0370] Example 8. Design of G1LALAFc-IL-2_C01_T3A-derived variants

[0371] The amino acid sequences of G1LALAFc-IL-2_WT_T3A (SEQ ID NO: 73) , G1LALAFc -IL-2_C01_T3A (SEQ ID NO: 74) , and G1LALAFc-IL-2_C01_T3A-derived variants including G1LALAFc-IL-2_C01#1, G1LALAFc-IL-2_C01#3, G1LALAFc-IL-2_C01#4, G1LALAFc-IL-2_C01#6, G1LALAFc-IL-2_C01#7, G1LALAFc-IL-2_C01#9, G1LALAFc-IL-2_C01#10, G1LALAFc-IL-2_C01#12, G1LALAFc-IL-2_C01#14, and G1LALAFc-IL-2_C01#15 (SEQ ID NOs: 75-84) are listed in FIG. 12. Each G1LALAFc-IL-2_C01_T3A-derived variant comprises a hinge region (SEQ ID NO: 70) , a G1LALAFc region (SEQ ID NO: 71) , and a linker region (SEQ ID NO: 72) .

[0372] Example 9. Production and purification of G1LALAFc-IL-2_C01_T3A-derived variants

[0373] The IL-2_C01_T3A-derived variants fused with a Fc domain, G1LALAFc, were expressed in Expi293 cells. The expressed proteins were purified by affinity chromatography using a column packed with MabSelect PrismATM protein A chromatography resin (Cytiva, Cat. No.: 17549803) , and size exclusive chromatography (SEC) using a 200 Increase 10 / 300 GL column (Cytiva, Cat. No.: 28990944) . The purified proteins were also analyzed by SDS-PAGE and HPLC-SEC.

[0374] As shown in FIG. 8, G1LALAFc-IL-2_WT_T3A, G1LALAFc-IL-2_C01_T3A and 10 variants of G1LALAFc-IL-2_C01_T3A were successfully produced and purified. These proteins were subjected to the following in vitro tests.

[0375] Example 10. IL-2 reporter signaling detection in HEK-BlueTM IL-2 Cells and HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells

[0376] IL-2 reporter assay was performed following the same procedure as described in Examples 3 and 6. The abundance of IL-2-pSTAT5 signaling activity is determined using the following formula: [ (Optical Density (OD) value at 630 nm (OD630) of each tested molecule at 600 pM –OD630 of the cell only control)  /  (OD630 of H8-IL-2_C01_T3A or G1LALAFc-IL-2_C01_T3A at 600 pM –OD630 of the cell only control) ] ×100%.

[0377] As shown in FIG. 10, the IL-2-pSTAT5 signaling activity induced by H8-IL-2_C01_T3A or G1LALAFc-IL-2_C01_T3A at 600 pM was used as a 100%control. The greater the value, the more potent the IL-2-pSTAT5 signaling activity. Five “+” symbols represent 81-100%of IL-2-pSTAT5 signaling activity, four “+” symbols represent 61-80%, three “+” symbols represent 41-60%, two “+” symbols represent 21-40%, and one “+” symbol represents 11-20%. The “-” symbol represents 0-10%of IL-2-pSTAT5 signaling activity.

[0378] As shown in FIGS. 9A-9F, the designed G1LALAFc-IL-2_C01_T3A-derived variants can be categorized into five groups based on the IL-2-pSTAT5 reporter signaling activities. Group 1, consisting of G1LALAFc-IL-2_C01#1, showed moderate IL-2-pSTAT5 reporter signaling-inducing activity in both HEK-BlueTM IL-2 Cells and HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells. Group 2, consisting of G1LALAFc-IL-2_C01#3, #4, #6, #9, and #10, showed a stronger IL-2-pSTAT5 reporter signaling-inducing activity in HEK-BlueTM IL-2 Cells but lacked such activity in HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells. Group 3, consisting of G1LALAFc-IL-2_C01#7 and #14, showed a stronger IL-2-pSTAT5 reporter signaling-inducing activity in HEK-BlueTM IL-2 Cells, while exhibiting moderate such activity in HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells. Group 4, consisting of G1LALAFc-IL-2_C01#15, showed a stronger IL-2-pSTAT5 reporter signaling-inducing activity in HEK-BlueTM IL-2 Cells and a relatively stronger such activity in HEK-BlueTM CD122 / CD132 Cells.

[0379] As shown in FIG. 10, G1LALAFc format-IL-2 variants exhibited a stronger potency than H8 format-IL-2 variants in inducing the IL-2-pSTAT5 reporter signaling activity. However, the relative ranking of the IL-2-pSTAT5 reporter signaling-inducing activities, shown as “+” or “-” , was similar for both IL-2 formats.

[0380] Example 11. Detection of STAT5 phosphorylation in Treg and Tconv cells

[0381] The STAT5 phosphorylation activity induced by designed IL-2 molecules in Treg and Tconv cells was determined as described in Example 7. As shown in FIGS. 11A-11D, based on the STAT5 phosphorylation levels, G1LALAFc-IL-2_WT_T3A, G1LALAFc-IL-2_C01_T3A, and G1LALAFc-IL-2_C01_T3A-derived variants, including G1LALAFc-IL-2_C01#1, G1LALAFc-IL-2_C01#3, G1LALAFc-IL-2_C01#4, G1LALAFc-IL-2_C01#7, G1LALAFc-IL-2_C01#9, G1LALAFc-IL-2_C01#10, G1LALAFc-IL-2_C01#12, G1LALAFc-IL-2_C01#14, and G1LALAFc-IL-2_C01#15, were able to induce STAT5 phosphorylation in both Treg cells and Tconv cells, but with varying activity levels. Only G1LALAFc-IL-2_C01#6 could induce STAT5 phosphorylation in Treg cells, but not in Tconv cells. Based on these preliminary results, IL-2_C01#6 exhibited the potential for treating autoimmune diseases.

[0382] Example 12. Evaluation of the stress stability of G1LALAFc-IL-2_C01#6

[0383] The stress stability of G1LALAFc-IL-2_WT, G1LALAFc-IL-2_C01#6 and a MK-6194 analog (SEQ ID NO: 91) was evaluated at 40℃ for 1, 2 and 4 weeks. The MK-6194 analog is an engineered IL-2 variant fused to a protein backbone designed to selectively activate and expand regulatory T cells (Tregs) for the potential treatment of ulcerative colitis and other autoimmune diseases. The MK-6194 analog contains a human IL-2 variant with L118I, N88D, V69A, Q74P, and C125S mutations, fused via a G4Sx4 linker (SEQ ID NO: 92) to the N-terminal of a human IgG1 Fc domain with L234A, L235A, and G237A mutations.

[0384] Specifically, each sample was placed in 150 μL protein solution in a new eppendorf and incubated in a Constant Climate Chamber HPP110eco (Memmert GmbH) with 40℃ ±2℃  / 75%±5%RH condition for 1, 2 and 4 weeks. At each timepoint, an eppendorf with 150 μL protein solution was removed from the Constant Climate Chamber and stored at 4℃refrigerator to the end of experiment. At the end of experiment, all samples were filtered by 0.2 μm filters before analysis and analyzed by ACQUITY UPLC H-Class (Waters Corporation. )

[0385] The results were shown in FIGS. 12A-12C. According to the results, after 40℃incubation for 4 weeks, the SEC-HPLC profiles of G1LALAFc-IL-2_WT (FIG. 12A) and G1LALAFc-IL-2_C01#6 (FIG. 12B) were similar. But the HMW (%) of the MK-6194 analog (FIG. 12C) increased by over 40%. The results indicated that G1LALAFc-IL-2_C01#6 showed better stress stability than the MK-6194 analog.

[0386] Example 13. Determination of the thermal stability of G1LALAFc-IL-2_C01#6 by DLS

[0387] The thermal stability of G1LALAFc-IL-2_WT, G1LALAFc-IL-2_C01#6 and a MK-6194 analog was determined by Dynamic Light Scattering (DLS) analysis. Specifically, samples were centrifuged under 12,000 rpm for 10 minutes at 8℃. 26 μL of each supernatant and 10 μL of Silicone Oil (Alfa Aesar, Cat. No.: A12728) were added into a well in a 384LV plate (AURORA, Cat. No.: P8806-38403-10) . The plate was centrifuged under 1,500 rpm for 10 minutes at 25℃ to remove bubbles and sealed with UltraClear Real Time PCR Pressured Sealing Film (SMBIO, Cat. No.: P4F51-C) . The plate was analyzed with DynaPro Plate Reader III (WYATT Technology) using Continuous Temperature Ramp Measure through Dynamic Light Scattering. Raw data were analyzed and fitted by DYNAMICS 7.10.1.21 to determine the value of Tonset.

[0388] The results were shown in FIG. 13. According to the results, the onset temperature (Tonset) of G1LALAFc-IL-2_C01#6 was approximately 62℃; the Tonset of G1LALAFc-IL-2_WT was 53℃; and the Tonset of the MK-6194 analog was 45℃. Comparing to G1LALAFc-IL-2_WT and the MK-6194 analog, the G1LALAFc-IL-2_C01#6 showed a significantly increased Tonset. The results indicated that G1LALAFc-IL-2_C01#6 showed better stability than G1LALAFc-IL-2_WT and MK-6194 analog.

[0389] Example 14. Determination of the thermal stability of G1LALAFc-IL-2_C01#6 by DSF

[0390] The thermal stability of G1LALAFc-IL-2_WT, G1LALAFc-IL-2_C01#6 and a MK-6194 analog was determined by Differential Scanning Fluorimetry (DSF) analysis. Specifically, the protein of choice was resuspended in DI water to an appropriate concentration, and a 50x stock solution of  Orange Protein Gel Stain (Sigma-Aldrich, Cat. No.: S5692) was prepared by diluting 2.5 μL of 5,000x concentrate into 250 μL of DI water. 10 μL of protein solution was aliquoted into each well of a Hard-Shell PCR Plate (Bio-Rad, Cat. No: HSP9601) . 2.5 μL of the 50x SYPRO stock solution and 12.5 μL of buffer solution was added to reach a final SYPRO concentration of 5x in each well. The assay was performed with a CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Inc. ) and the protocol was set with a temperature analysis range of 20℃ to 95℃, with 0.3℃ increments every 10 seconds. The fluorescence was recorded at the end of each increment. Raw fluorescence data were analyzed to determine the melting temperature (Tm) , from non-linear fitting of thermal denaturation data.

[0391] The results were shown in FIG. 14. According to the results, the melting temperature (Tm) of G1LALAFc-IL-2_C01#6 was approximately 65℃; the Tm of G1LALAFc-IL-2_WT was 56℃; and the Tm of the MK-6194 analog was approximately 45℃. Comparing to G1LALAFc-IL-2_WT and the MK-6194 analog, G1LALAFc-IL-2_C01#6 showed a significantly increased melting temperature. The results indicated that G1LALAFc-IL-2_C01#6 showed better stability than G1LALAFc-IL-2_WT and the MK-6194 analog.

[0392] Example 15. Evaluation of the autoimmune efficacy of G1LALAFc-IL-2_C01#6

[0393] The autoimmune efficacy of G1LALAFc-IL-2_C01#6 was evaluated in an NPG expansion model. The treatment plan and dosing schedule were shown in FIG. 15A. Specifically, 8-week old NPG mice were irradiated to remove endogenous immune cells and intravenous (i. v. ) injected with 5 × 106 human PBMCs. The treatment group mice were intraperitoneally (i. p. ) injected with 3 μg of G1LALAFc-IL-2_WT (G2) , 1 μg of G1LALAFc-IL-2_C01#6 (G3) , or 1 μg of MK-6194 analog (G4) per mouse. The control group mice (G1) were injected with 100 μL of vehicle (isotonic sodium chloride solution) per mouse. The treatment started at 7 days after the irradiation and human PBMCs transplantation, and the injections were performed once a week for a total of 3 weeks. For GvHD (Graft-versus-host disease) monitoring, the mice were individually scored based on five clinical parameters (body weight loss, posture, activity, fur, and skin) on a scale of 0 to 2 and one additional clinical parameter (diarrhea) on a scale of 0 to 1. The maximum total GvHD score is 11. A mouse was sacrificed when its total GvHD score exceeds 5 or when it has a GvHD score of 2 on a single clinical parameter (body weight loss, posture, activity, fur, or skin) .

[0394] The results were shown in FIG. 15B. As shown in the results, comparing to G1LALAFc-IL-2_WT and the MK-6194 analog, G1LALAFc-IL-2_C01#6 significantly delayed GvHD symptoms. The results indicated that G1LALAFc-IL-2_C01#6 showed outstanding efficacy for autoimmune associated diseases like GvHD.

[0395] Example 16. Evaluation of the PK, drug-related liver toxicity and T cell population inducing ability of G1LALAFc-IL-2_C01#6

[0396] Effects on body weight

[0397] The T cell population inducing ability of G1LALAFc-IL-2_C01#6 was evaluated in an C57BL / 6 model. The treatment plan and dosing schedule were shown in FIG. 16A. Specifically, 6-8 weeks old C57BL / 6 mouse were intraperitoneally (i. p. ) injected with (1) 3 mg / kg of G1LALAFc-IL-2_C01#6 (G2) , G1LALAFc-IL-2_WT (G4) , G1LA-KIHFc-IL-2_C01#6 (G6) , or G1LA-KIHFc-IL-2_WT (G8) , or (2) 0.3 mg / kg of G1LALAFc-IL-2_C01#6 (G3) , G1LALAFc-IL-2_WT (G5) , G1LA-KIHFc-IL-2_C01#6 (G7) , or G1LA-KIHFc-IL-2_WT (G9) . The control group mice (G1) were injected with 10 mL / kg of vehicle (isotonic sodium chloride solution) .

[0398] G1LA-KIHFc-IL-2_WT contains a hole chain comprising G1LA-HoleFc-IL-2_WT (e.g., SEQ ID NO: 97) and a knob chain comprising G1 Hinge + G1LA-KnobFc (e.g., SEQ ID NO: 96) . G1LA-KIHFc-IL-2_C01#6 contains a hole chain comprising G1LA-HoleFc-IL-2_C01#6 (e.g., SEQ ID NO: 98) and a knob chain comprising G1 Hinge + G1LA-KnobFc (e.g., SEQ ID NO: 96) .

[0399] The results were shown in FIG. 16B. According to the in vivo results, the body weight of C57BL / 6 mice decreased during high dose (3 mg / kg) of G1LALAFc-IL-2_WT and G1LA-KIHFc-IL-2_WT treatment (but recovered at the end of the experiment) . By comparison, G1LALAFc-IL-2_C01#6 and G1LA-KIHFc-IL-2_C01#6 did not affect the body weight of the C57BL / 6 mice.

[0400] Pharmacokinetics

[0401] The Pharmacokinetics (PK) and drug-related liver toxicity were determined. Blood was collected from submandibular (facial) vein into a TUBE (1 mL K3E K3EDTA with a lavender cap) (GreinerBio-One, Cat. No.: 450531) . Serum was collected by centrifuging at 3,000 rpm for 10 minutes. The supernatant (serum) was transferred into a new eppendorf and store at -20 ℃. For Pharmacokinetics (PK) analysis, the IL-2 serum concentration was detected by ELISA MAXTM Deluxe Set Human IL-2 ( Cat. No.: 431816) . For drug-related liver toxicity analysis, the AST (Aspartate transaminase) and ALT (Alanine transaminase) analysis of serum sample was performed by National Laboratory Animal Center (NLAC) .

[0402] The PK results were shown in FIGS. 16C-16L. The serum concentration analysis showed (1) the G1LA-KIHFc-IL-2 format exhibited better PK result than the G1LALAFc-IL-2 format and (2) IL-2_C01#6 exhibited better PK result than IL-2_WT (see FIGS. 16C-16D) . The data also indicated that high dose (3 mg / kg) of IL-2_WT showed significant decline at Day 3, but IL-2_C01#6 was more stable and still detectable at Day 7 (see FIGS. 16E-16F for the G1LALAFc-IL-2 format and FIGS. 16I-16J for the G1LA-KIHFc-IL-2 format) . The low dose (0.3 mg / kg) of IL-2_WT also showed significant decline at Day 3, but IL-2_C01#6 was more stable and still detectable at Day 7 (see FIGS. 16G-16H for the G1LALAFc-IL-2 format and FIGS. 16K-16L for the G1LA-KIHFc-IL-2 format) . The dotted line showed value of the Limit of detection (LoD) by ELISA kit and the serum concentration of tested samples below the LoD was excluded. The Limit of detection (LoD) of the ELISA kit was 7.8 pg / mL.

[0403] Liver toxicity

[0404] The drug-related liver toxicity was determined using ASL and ALT analysis. The results were shown in FIGS. 17A-17B. The normal AST level in mice is 50-100 U / L and the normal ALT level in mice is 25-60 U / L. The detected AST level (FIG. 17A) and ALT level (FIG. 17B) with IL-2_C01#6 treatment were in normal ranges. The results indicated that IL-2_C01#6 treatment does not result in liver damage.

[0405] T cell population inducing ability

[0406] The T cell population inducing ability of G1LALAFc-IL-2_C01#6 was evaluated in an C57BL / 6 model. The spleen cells were isolated from the spleen and processed with 1X RBC Lysis Buffer to remove red blood cells. The cells were stained using: Zombie AquaTMFixable Viability Kit ( Cat. No.: 423102) , PE anti-mouse CD45 Antibody ( Cat. No.: 103106) , FITC anti-mouse CD3 Antibody ( Cat. No.: 100204) , PE / DazzleTM 594 anti-mouse CD4 Antibody ( Cat. No.: 100456) , Brilliant Violet 605TM anti-mouse CD8a Antibody ( Cat. No.: 100744) , Brilliant Violet 650TM anti-mouse CD25 Antibody ( Cat. No.: 102038) , PE / Cyanine7 anti-mouse CD49b (pan-NK cells) Antibody ( Cat. No.: 108922) , Alexa 700 anti-mouse NK-1.1 Antibody ( Cat. No.: 108730) , Alexa 647 anti-mouse FOXP3 Antibody ( Cat. No.: 126408) , and eBioscienceTM Foxp3  /  Transcription Factor Staining Buffer Set (Thermo Fisher Scientific, Cat: 00-5523-00) . Flow cytometric analysis was performed using CytoFLEX (Beckman Coulter Inc. ) .

[0407] The results were shown in FIGS. 18A-18D. According to the result of T cell population in mice spleen, the percentage of CD3+ T cells (FIG. 18A) was not significantly affected by IL-2 treatment at Day 3 and Day 7 post treatment. The percentages of different T cell populations including CD8+ T cells (FIG. 18B) , Treg cells (FIG. 18C) and NK cells (FIG. 18D) returned to basal level like vehicle group at Day 7 post treatment. At Day 3 post treatment, high dose (3 mg / kg) of IL-2_C01#6 significantly induced Treg population in the spleen (FIG. 18C) and high dose (3 mg / kg) of IL-2_WT induced CD8+ T cell (FIG. 18B) and NK cell (FIG. 18D) populations in the spleen. The results indicated that IL-2_C01#6 could induce the Treg population but not CD8+ T cell or NK cell populations.

[0408] OTHER EMBODIMENTS

[0409] It is to be understood that while the invention has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the invention, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims

1.An engineered IL-2 polypeptide, wherein the engineered IL-2 polypeptide comprises a non-native cysteine.2.The engineered IL-2 polypeptide of claim 1, comprising an amino acid sequence that is at least 80%identical to SEQ ID NO: 2.3.The engineered IL-2 polypeptide of claim 1 or 2, wherein the engineered IL-2 polypeptide can bind to the trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ.4.The engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-3, wherein the engineered IL-2 polypeptide comprises one or more of the following:(a) the amino acid that corresponds to position 11 of SEQ ID NO: 2 is cysteine (C) ;(b) the amino acid that corresponds to position 14 of SEQ ID NO: 2 is C;(c) the amino acid that corresponds to position 18 of SEQ ID NO: 2 is C;(d) the amino acid that corresponds to position 40 of SEQ ID NO: 2 is C;(e) the amino acid that corresponds to position 43 of SEQ ID NO: 2 is C;(f) the amino acid that corresponds to position 45 of SEQ ID NO: 2 is C;(g) the amino acid that corresponds to position 46 of SEQ ID NO: 2 is C;(h) the amino acid that corresponds to position 48 of SEQ ID NO: 2 is C;(i) the amino acid that corresponds to position 53 of SEQ ID NO: 2 is C;(j) the amino acid that corresponds to position 56 of SEQ ID NO: 2 is C; and(k) the amino acid that corresponds to position 7 of SEQ ID NO: 2 is C.5.The engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-4, wherein the engineered IL-2 polypeptide comprises one or more of the following:(a) the amino acid that corresponds to position 129 of SEQ ID NO: 2 is C;(b) the amino acid that corresponds to position 113 of SEQ ID NO: 2 is C;(c) the amino acid that corresponds to position 111 of SEQ ID NO: 2 is C;(d) the amino acid that corresponds to position 108 of SEQ ID NO: 2 is C;(e) the amino acid that corresponds to position 106 of SEQ ID NO: 2 is C;(f) the amino acid that corresponds to position 96 of SEQ ID NO: 2 is C;(g) the amino acid that corresponds to position 97 of SEQ ID NO: 2 is C;(h) the amino acid that corresponds to position 129 of SEQ ID NO: 2 is C; and(i) the amino acid that corresponds to position 132 of SEQ ID NO: 2 is C.6.The engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-5, wherein the engineered IL-2 polypeptide comprises one or more of the following:(a) the amino acid that corresponds to position 11 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 129 of SEQ ID NO: 2 is C;(b) the amino acid that corresponds to position 14 of SEQ ID NO: 2 is C;(c) the amino acid that corresponds to position 18 of SEQ ID NO: 2 is C;(d) the amino acid that corresponds to position 40 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 113 of SEQ ID NO: 2 is C;(e) the amino acid that corresponds to position 43 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 111 of SEQ ID NO: 2 is C;(f) the amino acid that corresponds to position 45 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 111 of SEQ ID NO: 2 is C;(g) the amino acid that corresponds to position 46 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 108 of SEQ ID NO: 2 is C;(h) the amino acid that corresponds to position 48 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 106 of SEQ ID NO: 2 is C;(i) the amino acid that corresponds to position 53 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 96 of SEQ ID NO: 2 is C;(j) the amino acid that corresponds to position 53 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 97 of SEQ ID NO: 2 is C;(k) the amino acid that corresponds to position 56 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 97 of SEQ ID NO: 2 is C;(l) the amino acid that corresponds to position 11 of SEQ ID NO: 2 is C, the amino acid that corresponds to position 18 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 129 of SEQ ID NO: 2 is C;(m) the amino acid that corresponds to position 7 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 132 of SEQ ID NO: 2 is C;(n) the amino acid that corresponds to position 7 of SEQ ID NO: 2 is C, the amino acid that corresponds to position 18 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 132 of SEQ ID NO: 2 is C; and(o) the amino acid that corresponds to position 7 of SEQ ID NO: 2 is C, the amino acid that corresponds to position 11 of SEQ ID NO: 2 is C, the amino acid that corresponds to position 129 of SEQ ID NO: 2 is C, and the amino acid that corresponds to position 132 of SEQ ID NO: 2 is C.7.The engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-6, wherein the amino acid that corresponds to position 3 of SEQ ID NO: 2 is A, and the engineered IL-2 polypeptide comprises one or more of the following:(a) the amino acid that corresponds to position 15 of SEQ ID NO: 2 is D;(b) the amino acid that corresponds to position 15 of SEQ ID NO: 2 is N;(c) the amino acid that corresponds to position 16 of SEQ ID NO: 2 is S;(d) the amino acid that corresponds to position 16 of SEQ ID NO: 2 is T;(e) the amino acid that corresponds to position 19 of SEQ ID NO: 2 is I;(f) the amino acid that corresponds to position 20 of SEQ ID NO: 2 is N;(g) the amino acid that corresponds to position 23 of SEQ ID NO: 2 is I;(h) the amino acid that corresponds to position 23 of SEQ ID NO: 2 is L;(i) the amino acid that corresponds to position 84 of SEQ ID NO: 2 is N;(j) the amino acid that corresponds to position 84 of SEQ ID NO: 2 is T;(k) the amino acid that corresponds to position 91 of SEQ ID NO: 2 is L;(l) the amino acid that corresponds to position 92 of SEQ ID NO: 2 is V;(m) the amino acid that corresponds to position 92 of SEQ ID NO: 2 is M;(n) the amino acid that corresponds to position 95 of SEQ ID NO: 2 is Q; and(o) the amino acid that corresponds to position 95 of SEQ ID NO: 2 is N.8.The engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-7, comprising an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 3-17 and 35-51.9.The engineered IL-2 polypeptide of claim 8, wherein the engineered IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 14.10.The engineered IL-2 polypeptide of claim 8, wherein the engineered IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to any one of SEQ ID NOs: 39, 40, 46, 48, 50, and 51.11.The engineered IL-2 polypeptide of claim 8, wherein the engineered IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 43.12.The engineered IL-2 polypeptide of claim 8, wherein the engineered IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to any one of SEQ ID NOs: 39, 40, 42, 45, 46.13.The engineered IL-2 polypeptide of claim 8, wherein the engineered IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NO: 43.14.The engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-13, wherein the engineered IL-2 polypeptide can selectively activate Treg cells while minimizing the activation of Tconv cells.15.An engineered IL-2 polypeptide, wherein the engineered IL-2 polypeptide comprises one or more non-native disulfide bonds.16.The engineered IL-2 polypeptide of claim 15, comprising an amino acid sequence that is at least 80%identical to SEQ ID NO: 2.17.The engineered IL-2 polypeptide of claim 15 or 16, wherein the engineered IL-2 polypeptide can bind to the trimeric IL-2 receptor complex IL-2Rαβγ.18.The engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 15-17, wherein the engineered IL-2 polypeptide comprises one or more of the following:(a) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 11 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 129 of SEQ ID NO: 2;(b) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 14 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 125 of SEQ ID NO: 2;(c) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 18 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 125 of SEQ ID NO: 2;(d) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 40 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 113 of SEQ ID NO: 2;(e) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 43 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 111 of SEQ ID NO: 2;(f) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 45 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 111 of SEQ ID NO: 2;(g) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 46 of SEQ ID NO: 2, and the amino acid that corresponds to position 108 of SEQ ID NO: 2;(h) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 48 of SEQ ID NO: 2, and the amino acid that corresponds to position 106 of SEQ ID NO: 2;(i) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 53 of SEQ ID NO: 2, and the amino acid that corresponds to position 96 of SEQ ID NO: 2;(j) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 53 of SEQ ID NO: 2, and the amino acid that corresponds to position 97 of SEQ ID NO: 2;(k) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 56 of SEQ ID NO: 2, and the amino acid that corresponds to position 97 of SEQ ID NO: 2;(l) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 11 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 129 of SEQ ID NO: 2, and a non-native disulfide bond formed between amino acid that corresponds to position 18 of SEQ ID NO: 2, and the amino acid that corresponds to position 125 of SEQ ID NO: 2;(m) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 7 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 132 of SEQ ID NO: 2;(n) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 7 of SEQ ID NO: 2 the amino acid that corresponds to position 132 of SEQ ID NO: 2, and a non-native disulfide bond formed between amino acid that corresponds to position 18 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 125 of SEQ ID NO: 2; and(o) a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 7 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 132 of SEQ ID NO: 2, and a non-native disulfide bond formed between the amino acid that corresponds to position 11 of SEQ ID NO: 2 and the amino acid that corresponds to position 129 of SEQ ID NO: 2.19.The engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 15-18, comprising an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 3-17 and 35-51.20.A fusion protein comprising the engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-19.21.The fusion protein of claim 20, wherein the fusion protein comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 20-34 and 52-68.22.The fusion protein of claim 20 or claim 21, further comprising a Fc region.23.The fusion protein of claim 22, wherein the Fc region comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 71.24.The fusion protein of claim 22, wherein the Fc region comprises (1) a hole chain comprising an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 93 and (2) a knob chain comprising an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 95.25.The fusion protein of any one of claims 24, wherein the engineered IL-2 polypeptide is linked to either the hole chain or the knob chain.26.The fusion protein of claim 25, wherein the engineered IL-2 polypeptide is linked to the hole chain.27.The fusion protein of any one of claims 20-26, further comprising a hinge region.28.The fusion protein of claim 27, wherein the hinge region comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 70.29.The fusion protein of any one of claims 20-24, wherein the engineered IL-2 polypeptide is linked to the C-terminus or the N-terminus of the Fc region via a linker peptide.30.The fusion protein of claim 29, wherein the linker peptide comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 72.31.The fusion protein of any one of claims 20-30, wherein the fusion protein comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 73-84 and 96-98.32.A fusion protein comprising, optionally from N-terminus to C-terminus:(a) a hinge region;(b) a Fc region;(c) a linker peptide, and(d) an engineered IL-2 polypeptide.33.The fusion protein of claim 32, wherein the hinge region comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 70; wherein the Fc region comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 71; wherein the linker peptide comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to SEQ ID NO: 72; and / or wherein the engineered IL-2 polypeptide comprises an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%identical to any one of SEQ ID NOs: 3-17 and 35-51.34.The fusion protein of any one of claims 20-33, wherein the fusion protein can increase Treg activation (e.g., phosphorylation of STAT5) .35.The fusion protein of any one of claims 20-34, wherein the fusion protein can increase Treg-mediated immune suppression.36.A pharmaceutical composition comprising the engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-19 or the fusion protein of any one of claims 20-35; and a pharmaceutically acceptable carrier.37.A nucleic acid encoding the engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-19 or the fusion protein of any one of claims 20-35.38.A vector comprising the nucleic acid of claim 37.39.A cell comprising the nucleic acid of claim 37 or the vector of claim 38.40.The cell of claim 39, wherein the cell is a Expi293 cell or ExpiCHO cell.41.A method of producing an engineered IL-2 polypeptide or a fusion protein comprising the engineered IL-2 polypeptide, the method comprising(a) culturing the cell of claim 39 or 40 under conditions sufficient for the cell to produce the engineered IL-2 polypeptide or the fusion protein; and(b) collecting the engineered IL-2 polypeptide or the fusion protein produced by the cell.42.A method of treating a subject having an immune disease, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-19 or the fusion protein of any one of claims 20-35, to the subject.43.The method of claim 42, wherein the subject has an autoimmune disease.44.The method of claim 43, wherein the autoimmune disease is rheumatoid arthritis, Crohn’s disease, diabetes (e.g., Type I) , graft versus host disease (GvHD) , systemic lupus erythematosus, ankylosing spondylitis, inflammatory bowel diseases (IBD) , ulcerative colitis, scleroderma, allergy, asthma, or atopic dermatitis.45.A method of increasing regulatory T cell proliferation in a subject, the method comprising administering to the subject a pharmaceutical composition comprising the engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-19 or the fusion protein of any one of claims 20-35.46.A method of activating regulatory T cells in a subject, the method comprising administering to the subject a pharmaceutical composition comprising the engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-19 or the fusion protein of any one of claims 20-35.47.A method of treating a subject having cancer, the method comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-19 or the fusion protein of any one of claims 20-35, to the subject.48.The method of claim 47, wherein the subject has a solid tumor or a hematologic cancer.49.The method of claim 47, wherein the cancer is breast cancer, ovarian cancer, glioma, colon cancer, hepatocellular carcinoma, prostate cancer, renal cell carcinoma, melanoma, lung cancer, pancreatic cancer, or hepatoma.50.A method of decreasing the rate of tumor growth, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-19 or the fusion protein of any one of claims 20-35.51.A method of killing a tumor cell, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition comprising the engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-19 or the fusion protein of any one of claims 20-35.52.The engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-19 or the fusion protein of any one of claims 20-35, wherein the non-native cysteine and / or the one or more non-native disulfide bonds stabilize the internal core of the IL-2 polypeptide or the fusion protein.53.The engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-19 or the fusion protein of any one of claims 20-35, wherein the non-native cysteine and / or the one or more non-native disulfide bonds increase the thermal stability of the IL-2 polypeptide or the fusion protein.54.The engineered IL-2 polypeptide of any one of claims 1-19 or the fusion protein of any one of claims 20-35, wherein the non-native cysteine and / or the one or more non-native disulfide bonds increase the pharmacokinetics of the IL-2 polypeptide or the fusion protein.55.The engineered IL-2 polypeptide or the fusion protein of any one of claims 52-54, wherein the stabilization, the increase in thermal stability, and / or the increase in pharmacokinetics cannot be achieved by surface mutations.56.The engineered IL-2 polypeptide or the fusion protein of claim 53, wherein the non-native cysteine and / or the one or more non-native disulfide bonds increase the aggregation (Tagg) and / or onset (Tonset) temperatures by at least at least 5℃.57.The engineered IL-2 polypeptide or the fusion protein of claim 54, wherein the non-native cysteine and / or the one or more non-native disulfide bonds increase the pharmacokinetics by at least 10 times.58.A method of improving the stability of IL-2, comprising(a) providing a 3D structure of IL-2,(b) measuring distance of the Calpha atoms of one or more of amino acid residues in the 3D structure; and(c) selecting two amino acid residues from the one or more amino acid residues, wherein the Calpha atoms of the two selected amino acid residues are within 3-8 angstroms.59.The method of claim 58, further comprising expressing a IL-2 variant, wherein the IL-2 variant comprises a non-native disulfide bond formed by mutating the two selected amino acid residues to cysteines.60.The method of claim 59, wherein the mutating the two selected amino acid residues to cysteines does not substantially change the 3D structure of IL-2.61.A method of screening an IL-2 variant, comprising(a) providing a 3D structure of IL-2,(b) measuring distance of the Calpha atoms of one or more of amino acid residues in the 3D structure; and(c) selecting two amino acid residues from the one or more amino acid residues, wherein the Calpha atoms of the two selected amino acid residues are within 3-8 angstroms.62.The method of claim 61, further comprising(a) expressing an IL-2 variant, wherein the IL-2 variant comprises a non-native disulfide bond formed by mutating the two selected amino acid residues to cysteines;(b) administering the IL-2 variant to an animal with an immune disease; and(c) determining the effects of the IL-2 variant on the immune disease.63.The method of claim 61, further comprising(a) expressing an IL-2 variant, wherein the IL-2 variant comprises a non-native disulfide bond formed by mutating the two selected amino acid residues to cysteines;(b) administering the IL-2 variant to a tumor-bearing animal; and(c) determining tumor growth (e.g., by measuring tumor volume) in the tumor-bearing animal.64.The method of any one of claims 58-63, wherein the IL-2 is human IL-2.

Images