Electrophile-containing catechol-o-methyltransferase (COMT) inhibitors for targeting the KEAP1 / NRF2 pathway

Abstract

Provided herein is a method for treating or preventing a disease or disorder associated with a deregulated NRF2 / KEAP1 pathway, comprising administering a subject in need thereof a therapeutically effective amount of entacapone or nitecapone or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and entacapone or nitecapone can reversibly bind to KEAP1, those compounds activated NRF2 in vitro and in vivo by reversibly modifying C151 on KEAP1, and both drugs can enhance the expression of growth differentiation factor 15 (GDF15) and NRF2 downstream antioxidant response elements (ARE) genes.

Description

Electrophile-containing Catechol-O-methyltransferase (COMT) inhibitors for targeting the KEAP1 / NRF2 pathwayField of the Invention

[0001] Provided herein is a method for treating or preventing a disease or disorder associated with a deregulated NRF2 / KEAP1 pathway, comprising administering a subject in need thereof a therapeutically effective amount of entacapone or nitecapone or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and entacapone or nitecapone can reversibly bind to KEAP1, those compounds activated NRF2 in vitro and in vivo by reversibly modifying C151 on KEAP1, and both drugs can enhance the expression of growth differentiation factor 15 (GDF15) and NRF2 downstream antioxidant response elements (ARE) genes.Background of the Invention

[0002] Entacapone is a Catechol-O-methyl transferase (COMT) inhibitor that has been used safely for over 20 years to treat Parkinson's disease in combination with L-DOPA. It also inhibits fat mass and obesity-associated protein (FTO) , as identified recently by a structure-based virtual screening approach. Entacapone binds to both targets non-covalently, as evidenced by crystallographic studies. However, entacapone has a well-known Michael acceptor, an electrophilic cyanoacrylamide group (Figure 1) , which can reversibly modify cysteine residues. No covalent binding targets of entacapone at the cellular level have been reported so far. Entacapone has been reported to protect against acute kidney injury by inhibiting ferroptosis (Yang, J., et., al, The FASEB Journal 2022, 36 (7) , e22399) . Nitecapone has been reported to protect against diabetic nephropathy (Lal, M.A., et. al., Diabetes 2000, 49 (8) , 1381–1389; and Pertovaara, A., et. al., Experimental Neurology 2001, 167 (2) , 425–434) .

[0003] In order to treat these diseases with enhanced safety, reversible covalent drugs, which covalently bind but not permanently with protein targets, are a promising and innovative strategy in drug development. They may interact stably with the target and have lower immunogenicity and off-target effects than irreversible covalent inhibitors. Cyanoacrylamide-based reversible covalent inhibitors have been developed for kinases including Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) , Ribosomal S6 Kinase 2 (RSK2) , Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) , and Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) . PRN1008, a BTK reversible covalent inhibitor, is in phase II / III clinical trials and shows potent and durable target inhibition. In addition, the reversible covalent strategy has also been applied in Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) technology to target specific proteins for degradation.

[0004] Kelch-like ECH-associated protein 1 (KEAP1) , which has many reactive cysteine residues, is an intracellular sensor for oxidative and electrophilic stress. It negatively regulates the transcription factor nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2) , which protects cells from oxidative stress. When oxidizing agents or electrophiles covalently bind to the cysteine residues of KEAP1, they release NRF2 and allow it to translocate into the nucleus, and to activate genes containing antioxidant response elements (AREs) . Therefore, activating NRF2 by modulating KEAP1 could be beneficial for various diseases such as chronic lung and liver disorders, autoimmune diseases, neurodegenerative disorders, and metabolic disorders. Small-molecule activators of NRF2, such as CDDO, DMF, and sulforaphane, have been studied extensively. Only two drugs that target KEAP1 to activate NRF2, DMF and RTA-408, have been approved by the FDA for multiple sclerosis and Friedreich's ataxia, respectively.

[0005] However, there is a need for more drug-like activators that target the KEAP1 / NRF2 pathway for other diseases.Summary of the Invention

[0006] Unexpectedly and surprisingly, the inventors of the instant invention found that entacapone and nitecapone, which were previously reported as COMT or FTO inhibitors, can covalently and reversibly bind to KEAP1, those compounds activated NRF2 in vitro and in vivo by reversibly modifying C151 on KEAP1, and both drugs can enhance the expression of growth differentiation factor 15 (GDF15) and NRF2 downstream antioxidant response elements (ARE) genes, both in vitro and in vivo, and both drugs exhibit anti-inflammatory effects in an NRF2 dependent acute gout model, suggesting that they are a new class of oral and effective KEAP1 reversible covalent binders.

[0007] Provided herein is a method for treating or preventing a disease or disorder associated with a deregulated NRF2 / KEAP1 pathway, comprising administering a subject in need thereof a therapeutically effective amount of entacapone or nitecapone or a pharmaceutically acceptable salt thereof; a use of entacapone or nitecapone or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the manufacture of a medicament for treating or preventing a disease or disorder associated with a deregulated NRF2 / KEAP1 pathway; or entacapone or nitecapone or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in treating or preventing a disease or disorder associated with a deregulated NRF2 / KEAP1 pathway.

[0008] In some embodiments, entacapone or nitecapone covalently and reversibly binds to the cysteine residues of KEAP1 so as to release NRF2.

[0009] In some embodiments, entacapone or nitecapone covalently and reversibly binds to C151 of KEAP1.

[0010] In some embodiments, entacapone covalently and reversibly binds to C151 of KEAP1 via the electrophilic cyanoacrylamide group of entacapone.

[0011] In some embodiments, nitecapone covalently and reversibly binds to C151 of KEAP1 via the reactive 3-methylene-acetylacetone group of nitecapone.

[0012] In some embodiments, the disease or disorder associated with a deregulated NRF2 / KEAP1 pathway include inflammatory diseases including inflammatory arthritis, gout, acute gout, chronic gout, or inflammatory kidney diseases, autoimmune diseases (multiple sclerosis, psoriasis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, scleroderma, ulcerative colitis, etc. ) , central nervous system diseases (Friedreich ataxia, mitochondrial myopathy, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, Huntington's disease, etc. ) , respiratory diseases (chronic occlusive pulmonary disease, etc. ) , malignant tumors (melanoma, lung cancer including non-small cell lung cancer (NSCLC) , medulloblastoma, neuroblastoma, etc. ) , eye diseases (ocular inflammation, ocular pain, age-related macular degeneration, corneal endothelial disorder, etc. ) , skin diseases (dermatitis, radiation skin disorders, epidermolysis bullosa, etc. ) , circulatory diseases (pulmonary arterial hypertension, etc. ) , liver diseases (hepatitis, liver cirrhosis, etc. ) , traumatic brain injury, aging, and the like.

[0013] In some embodiments, the disease or disorder associated with a deregulated NRF2 / KEAP1 pathway includes inflammatory arthritis, multiple sclerosis, or Friedreich ataxia.

[0014] In some embodiments, the disease or disorder associated with a deregulated NRF2 / KEAP1 pathway includes gout.

[0015] In some embodiments, the NRF2 / KEAP1 pathway is deregulated because of post-translational modification of KEAP1 cysteine residues.

[0016] In some embodiments, the inflammatory disease is caused by inflammation and oxidative stress. In some embodiments, inflammatory disease is caused by chronic inflammation and oxidative stress.

[0017] In some embodiments, the NRF2 / KEAP1 pathway is deregulated because of a somatic mutation in KEAP1 or the KEAP1 binding domain of NRF2.

[0018] In some embodiments, the subject has an increase in the intracellular concentration of glutathione (GSH) , which is caused by: (a) deregulated NRF2 activity; and / or (b) increased expression of GSH-related enzymes; and / or (c) increased expression or activity of amino acid transporters.

[0019] In some embodiments, the subject has an increase in the intracellular concentration of glutathione (GSH) , which is caused by: (a) deregulated NRF2 activity; or (b) increased expression of GSH-related enzymes; or (c) increased expression or activity of amino acid transporters.

[0020] In some embodiments, entacapone or nitecapone is administered in an amount of 0.1-8, 0.1-4, 0.1-2.5, 0.2-8, 0.2-4, 0.2-2.5, 0.3-8, 0.3-4, 0.3-2.5, 0.4-8, 0.4-4, 0.4-2.5, 0.6-8, 0.6-4, 0.6-2.5g / day, in unit dosage forms of 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.6g.

[0021] Provided herein is a cysteine adduct, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, having the following structure (I) or (II)

[0022] wherein each R1 is H or an acid terminal of a first amino acid; each R2 is OH or an amine terminal of a second amino acid.

[0023] In some embodiments, the first amino acid and the second amino acid are either the same or different.

[0024] In some embodiments, the cysteine is a cysteine of a target protein.

[0025] In some embodiments, the cysteine is C151 of KEAP1.

[0026] In some embodiments, the carbon atom to which the cysteine is attached is in a (R) -or (S) -configuration.Brief Description of the Drawings

[0027] Figure 1 shows the reversible modification of the cyanoacrylamide group of entacapone to a cysteine residue.

[0028] Figure 2 shows the binding interactions between entacapone and wild-type (WT) or C151 mutant (C151S) KEAP1-BTB domain measured using the Thermal Shift Assay.

[0029] Figure 3 shows deconvoluted ESI-MS analysis of BTB WT and BTB-C151S mutant after incubation with entacapone. BTB exhibited a mass shift of 305.8 Da (left) , while no adduct was detected for BTB-C151S under identical conditions (right) .

[0030] Figure 4 shows deconvoluted ESI-MS was employed to analyze the reversibility of entacapone and KEAP1-BTB. The protein: entacapone ratio was maintained at 1: 1.5 for all three samples. In the middle and right samples, the reaction was pre-incubated and then exposed to a 2-fold or 10-fold concentration of DMF relative to entacapone.

[0031] Figure 5 shows deconvoluted ESI-MS analysis was conducted to verify the formation of adducts between Cpd-1 and KEAP1-BTB WT after incubation.

[0032] Figure 6 shows the calculated Kd values of entacapone for reaction with GSH using a UV-visible spectroscopy assay.

[0033] Figure 7 shows the observed absorbance between 300 nm and 550 nm of entacapone.

[0034] Figure 8 shows the chemical structures of Cpd-1, Cpd-2, Cpd-3, and Cpd-4, as well as the absorbance results for their reactions with GSH, were recorded.

[0035] Figure 9 shows the TSA results of compounds with KEAP1-BTB protein.

[0036] Figure 10 shows the binding model of entacapone with KEAP1 (docking pose based on structure PDB ID: 5DAD) , COMT (PDB ID: 4XUD) , and FTO (PDB ID: 6AK4) .

[0037] Figure 11 confirms the activation of KEAP1 / NRF2 pathway by entacapone.

[0038] Figure 12 shows stabilization of NRF2 protein in HEK293T cells by entacapone, in which Figure 12A shows co-transfection of wild-type (WT) Flag-tagged KEAP1 and Flag-tagged NRF2 in HEK293T cells treated with DMSO and multiple doses of entacapone for evaluating NRF2 protein stability via western blot, and Figure 12B shows HEK293T cells co-expressed with Flag-tagged KEAP1 and Flag-tagged NRF2 were treated with DMSO, entacapone (50 μM) , Cpd-1 (50 μM) , DMF (100 μM) , and CDDO-Me (1 μM) .

[0039] Figure 13 shows electrophilic COMT inhibitor Nitecapone exhibits KEAP1 / NRF2 activation.

[0040] Figure 14 shows the performance of electrophile-containing COMT inhibitor nitecapone in the UV-vis spectrometry assay and its effect on NRF2 stabilization.

[0041] Figure 15 shows Entacapone and Nitecapone effectively reduce inflammation in MSU-induced gouty arthritis model.

[0042] Figure 16 shows the activation of the KEAP1 / NRF2 pathway in tissues following treatment with entacapone or nitecapone.Detailed Description of the Invention

[0043] Unless specifically defined elsewhere in this document, all other technical and scientific terms used herein have the meaning commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.

[0044] Definition

[0045] The term “aderegulated NRF2 / KEAP1 pathway” refers to an abnormal or dysregulated state of the NRF2 / KEAP1 signaling pathway in which there is a disruption in the normal balance and regulation of NRF2 activity. This can occur due to various mechanisms, including genetic mutations or alterations in the expression or function of NRF2 or KEAP1. In the context of cancer, deregulation of the NRF2 / KEAP1 pathway is often associated with the accumulation of NRF2 and increased expression of its target genes, leading to enhanced antioxidant capacity and cellular protection against oxidative stress. This deregulation can confer a survival advantage on cancer cells by promoting their ability to resist oxidative damage and other stresses. In the context of inflammation, the NRF2 / KEAP1 pathway can become deregulated, leading to abnormal NRF2 activation and dysregulated antioxidant response. This deregulation can occur through various mechanisms, including genetic mutations, epigenetic modifications, or alterations in the cellular microenvironment. The deregulated NRF2 / KEAP1 pathway in the context of inflammation refers to an imbalance or dysregulation in the normal functioning of NRF2 and KEAP1 proteins, leading to increased oxidative stress, altered immune response, and impaired resolution of inflammation.

[0046] The term “disease” is used interchangeably with, the terms “disorder, ” “syndrome, ” and “condition” (as in medical condition) , in that all reflect an abnormal condition of the human or animal body or of one of its parts that impairs normal functioning, is typically manifested by distinguishing signs and symptoms, and causes the human or animal to have a reduced duration or quality of life.

[0047] The term “therapeutically effective” refers to the amount of active ingredients used in the treatment of a disease or disorder or on the effecting of a clinical endpoint.

[0048] The term “therapeutically acceptable” refers to those compounds (or salts, prodrugs, tautomers, zwitterionic forms, etc. ) that are suitable for use in contact with the tissues of patients without undue toxicity, irritation, and allergic response, are commensurate with a reasonable benefit / risk ratio, and are effective for their intended use.

[0049] The terms “administration” , “administering” , “treating” and “treatment” herein, when applied to an animal, human, experimental subject, cell, tissue, organ, or biological fluid, mean contact of an exogenous pharmaceutical, therapeutic, diagnostic agent, or composition to the animal, human, subject, cell, tissue, organ, or biological fluid. Treatment of a cell encompasses contact of a reagent to the cell, as well as contact of a reagent to a fluid, where the fluid is in contact with the cell. The terms “administration” and “treatment” also refer to in vitro and ex vivo treatments, e.g., of a cell, by a reagent, diagnostic, binding compound, or by another cell. The term “subject” herein includes any organism, preferably an animal, more preferably a mammal (e.g., rat, mouse, dog, cat, and rabbit) , and most preferably a human.

[0050] The terms “subject” or “patient” are used interchangeably herein to mean all mammals including humans. Examples of subjects include, but are not limited to, humans, monkeys, dogs, cats, horses, cows, goats, sheep, pigs, and rabbits. In one embodiment, the patient is a human.

[0051] The compounds disclosed herein can exist as therapeutically acceptable salts. The present disclosure includes compounds listed above in the form of salts, including acid addition salts. Suitable salts include those formed with both organic and inorganic acids. Such acid addition salts will normally be pharmaceutically acceptable. However, salts of non-pharmaceutically acceptable salts may be of utility in the preparation and purification of the compound in question. Basic addition salts may also be formed and be pharmaceutically acceptable. For a more complete discussion of the preparation and selection of salts, refer to Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (Stahl, P. Heinrich. Wiley-VCHA, Zurich, Switzerland, 2002) .

[0052] The term “therapeutically acceptable salt, ” as used herein, represents salts or zwitterionic forms of the compounds disclosed herein which are water or oil-soluble or dispersible and therapeutically acceptable as defined herein. The salts can be prepared during the final isolation and purification of the compounds or separately by reacting the appropriate compound in the form of the free base with a suitable acid. Representative acid addition salts include acetate, adipate, alginate, L-ascorbate, aspartate, benzoate, benzenesulfonate (besylate) , bisulfate, butyrate, camphorate, camphor sulfonate, citrate, digluconate, formate, fumarate, gentisate, glutarate, glycerophosphate, glycolate, hemisulfate, heptanoate, hexanoate, hippurate, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, 2-hydroxyethansulfonate (isethionate) , lactate, maleate, malonate, DL-mandelate, mesitylene sulfonate, methanesulfonate, naphthylenesulfonate, nicotinate, 2-naphthalenesulfonate, oxalate, pamoate, pectinate, persulfate, 3-phenylproprionate, phosphonate, picrate, pivalate, propionate, pyroglutamate, succinate, sulfonate, tartrate, L-tartrate, trichloroacetate, trifluoroacetate, phosphate, glutamate, bicarbonate, para-toluenesulfonate (p-tosylate) , and undecanoate. Also, basic groups in the compounds disclosed herein can be quaternized with methyl, ethyl, propyl, and butyl chlorides, bromides, and iodides; dimethyl, diethyl, dibutyl, and diamyl sulfates; decyl, lauryl, myristyl, and steryl chlorides, bromides, and iodides; and benzyl and phenethyl bromides. Examples of acids which can be employed to form therapeutically acceptable addition salts include inorganic acids such as hydrochloric, hydrobromic, sulfuric, and phosphoric, and organic acids such as oxalic, maleic, succinic, and citric. Salts can also be formed by the coordination of the compounds with an alkali metal or alkaline earth ion. Hence, the present disclosure contemplates sodium, potassium, magnesium, and calcium salts of the compounds disclosed herein, and the like.

[0053] Basic addition salts can be prepared during the final isolation and purification of the compounds by reacting a carboxy group with a suitable base such as the hydroxide, carbonate, or bicarbonate of a metal cation or with ammonia or an organic primary, secondary, or tertiary amine. The cations of therapeutically acceptable salts include lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium, and aluminum, as well as nontoxic quaternary amine cations such as ammonium, tetramethylammonium, tetraethylammonium, methylamine, dimethylamine, trimethylamine, triethylamine, diethylamine, ethylamine, tributylamine, pyridine, N, N-dimethylaniline, N-methylpiperidine, N-methylmorpholine, dicyclohexylamine, procaine, dibenzylamine, N, N-dibenzylphenethylamine, 1-ephenamine, and N, N′-dibenzylethylenediamine. Other representative organic amines useful for the formation of base addition salts include ethylenediamine, ethanolamine, diethanolamine, piperidine, and piperazine.

[0054] The term “reversible covalent bonds” refers to reversible or labile bonds which may be selected from the group comprising: physiologically labile bonds, cellular physiologically labile bonds, pH labile bonds, very pH labile bonds, and extremely pH labile bonds.

[0055] The compositions for administration can take the form of bulk liquid solutions or suspensions, or bulk powders. More commonly, however, the compositions are presented in unit dosage forms to facilitate accurate dosing. The term “unit dosage forms” refers to physically discrete units suitable as unitary dosages for human subjects and other mammals, each unit containing a predetermined quantity of active material calculated to produce the desired therapeutic effect, in association with a suitable pharmaceutical excipient. Typical unit dosage forms include prefilled, premeasured ampules or syringes of the liquid compositions or pills, tablets, capsules, lozenges or the like in the case of solid compositions.

[0056] A wide variety of suitable formulations and delivery systems, including suitable excipients or carriers and methods for preparing administrable compositions, are known or apparent to those skilled in the art and are described in more detail in such publications as Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Pharmaceutical Press (2012) . For example, in particular embodiments the compositions are formulated or delivered in extended or controlled delivery systems, such as diffusion systems (e.g. reservoir devices, matrix devices, diffusion-controlled implants and transdermal patches) and encapsulated and matrix dissolution systems, erosion products, osmotic pump systems, ion exchange resins, etc.

[0057] The compounds can be administered by a variety of methods including, but not limited to, parenteral, topical, oral, or local administration, such as by aerosol or transdermally, for prophylactic and / or therapeutic treatment. Also, in accordance with the knowledge of the skilled clinician, the therapeutic protocols (e.g., dosage amounts and times of administration) can be varied in view of the observed effects of the administered therapeutic agents on the patient, and in view of the observed responses of the disease to the administered therapeutic agents.

[0058] Examples

[0059] The following descriptions of particular embodiments and examples are provided by way of illustration and not by way of limitation. Those skilled in the art will readily recognize a variety of noncritical parameters that could be changed or modified to yield essentially similar results.

[0060] Example 1: Synthesis

[0061] Synthesis of Cpd-1. Cpd-1 was prepared in two synthetic steps from 3, 4-dihydroxy-5-nitrobenzaldehyde, according to the following procedure:

[0062] Synthesis of (E) -3- (3, 4-dihydroxy-5-nitrophenyl) acrylic acid (2) . A mixture of 3, 4-dihydroxy-5-nitrobenzaldehyde (500 mg, 2.73 mmol) and malonic acid (570 mg, 5.46 mmol) in anhydrous pyridine (15 mL) and piperidine (0.2 mL) was stirred at 60 ℃ under an argon atmosphere for 48 hours. The reaction mixture was then cooled to room temperature (rt) and diluted with H2O (30 mL) . Then the mixture was neutralized with 1M HCl and extracted with ethyl acetate (100 mL x 3) . The combined organic phases were washed with brine, dried by anhydrous Na2SO4. Concentrated under vacuum, purified by column chromatography (dichloromethane / methanol = 9: 1) to yield the product (490 mg, 81%) . MS [M+H] + calcd for C9H7NO6 226.1, found 226.1.

[0063] Synthesis of (E) -3- (3, 4-dihydroxy-5-nitrophenyl) -N, N-diethylacrylamide (Cpd-1) . A solution of compound 2 (100 mg, 0.44 mmol) in SOCl2 (10 mL) was stirred at 80 ℃ for 2 hours. Then the reaction mixture was concentrated under vacuum to give the crude intermediate which was added to a solution of diethylamine (33 mg, 0.44 mmol) in THF (10 mL) at 0 ℃, and the mixture was stirred at rt for 4 h. Then quenched by 1M HCl and extracted with DCM (50 mL x 3) . The combined organic phases were dried over Na2SO4 and concentrated under vacuum. The residue was purified by Prep-HPLC (H2O / MeCN = 44 / 56, 0.1%TFA, twice) to obtain the product (9.6 mg, 0.6%) . MS [M-H] -calcd for C13H16N2O5 279.1, found 279.1. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 10.38 (s, 1H) , 7.67 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 7.33 (dd, J = 8.7, 6.6 Hz, 2H) , 6.92 (d, J = 15.3 Hz, 1H) , 3.47 (m, 2H) , 3.34 (m, 2H) , 1.11 (t, J =7.0 Hz, 3H) , 1.02 (t, J = 7.0 Hz, 3H) .

[0064] Synthesis of Cpd-2. Cpd-2 was prepared in one synthetic step from 3, 4-dihydroxy-5-nitrobenzaldehyde, according to the following procedure:

[0065] Synthesis of (E) -2- (3, 4-dihydroxy-5-nitrobenzylidene) -N, N-diethyl-3-oxobutanamide (Cpd-2) . To a solution of 3, 4-dihydroxy-5-nitrobenzaldehyde (500 mg, 2.73 mmol) and N, N-diethyl-3-oxobutanamide (557 mg, 3.55 mmol) in toluene (10 mL) were added piperidine (23 mg, 0.27 mmol) , acetic acid (16 mg, 0.27 mmol) and molecular sieves (600 mg) . The reaction mixture was stirred at 110 ℃ for 16 h. The mixture was then quenched by water, extracted by EtOAc (50 mL *3) , dried over anhydrous Na2SO4, concentrated under vacuum, purified by column chromatography and Prep-HPLC to obtain a white solid as the target product (14.5 mg, 1.6%) . MS [M+H] + 323, 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.67 (d, J = 2.1 Hz, 1H) , 7.56 (s, 1H) , 7.31 (d, J = 2.1 Hz, 1H) , 3.43 (m, 2H) , 3.05 (m, 2H) , 2.40 (s, 3H) , 1.10 (t, J = 7.1 Hz, 3H) , 0.80 (t, J = 7.1 Hz, 3H) .

[0066] Synthesis of Cpd-3. Cpd-3 was prepared in five synthetic steps from 3, 4-dimethoxybenzaldehyde, according to the following procedure:

[0067] Synthesis of 3, 4-dimethoxy-5-nitrobenzaldehyde (2) . To a solution of 3, 4-dimethoxybenzaldehyde (2 g, 12 mmol) in acetic acid (20 mL) was added nitric acid (12 mL, 120 mmol) . The reaction mixture was stirred at rt for 16 h. The mixture was quenched by water, extracted by DCM (50 mL *3) , dried over anhydrous Na2SO4, concentrated under vacuum, and purified by column chromatography to obtain a white solid as the target product (1.4 g, 55.1%) . MS [M+H] + 212.

[0068] Synsthesis of ethyl (Z) -3- (3, 4-dimethoxy-5-nitrophenyl) -2-fluoroacrylate (3) . To a solution of ethyl 2- (diethoxy phosphoryl) -2-fluoroacetate (1.6 g, 6.6 mmol) in dry THF (30 mL) was added Et3N (1.34 g, 13.2 mmol) , followed by magnesium bromide (1.23 g, 6.6 mmol) . The reaction mixture was heated to 50 ℃ and 3, 4-dimethoxy-5-nitrobenzaldehyde (1.4 g, 6.6 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at 50 ℃ for 16 h. The mixture was concentrated under vacuum and purified by column chromatography to obtain the target product (1.6 g, 80.6%) . MS [M+H] + 300.

[0069] Synthesis of (Z) -3- (3, 4-dimethoxy-5-nitrophenyl) -2-fluoroacrylic acid (4) . To a solution of ethyl (Z) -3- (3, 4-dimethoxy-5-nitrophenyl) -2-fluoroacrylate (1.6 g, 5.5 mmol) in EtOH / H2O (50 mL / 10 mL) was added lithium hydroxide (0.7 g, 16.5 mmol) . The reaction was stirred at rt for 16 h. The mixture was quenched by water, adjusted pH to 3, extracted by EtOAc (50 mL *3) , dried overanhydrous Na2SO4, concentrated under vacuum, and purified by column chromatography to obtain the target product (1 g, 66.6%) . MS [M+H] + 272.

[0070] Synthesis of (Z) -3- (3, 4-dimethoxy-5-nitrophenyl) -N, N-diethyl-2-fluoroacrylamide (5) . A solution of (Z) -3- (3, 4-dimethoxy-5-nitrophenyl) -2-fluoroacrylic acid (1 g, 3.67 mmol) , Et3N (0.4 g, 5.51 mmol) and DIEA (1.43 g, 11.01 mmol) in DMF (15 mL) was stirred at 0 ℃ for 3 h. Then HATU (2.1 g, 5.51 mmol) was added. The reaction was stirred at rt for 16 h. The mixture was concentrated under vacuum and purified by column chromatography to obtain the target product (1 g, 83.4%) . MS [M+H] + 327.

[0071] Synthesis of (Z) -3- (3, 4-dihydroxy-5-nitrophenyl) -N, N-diethyl-2-fluoroacrylamide Cpd-3. To a solution of (Z) -3- (3, 4-dimethoxy-5-nitrophenyl) -N, N-diethyl-2-fluoroacrylamide (200 mg, 0.61 mmol) in DCM (2 mL) was added BBr3 (0.6 mL, 6.1 mmol) slowly at 0 ℃. The reaction mixture was stirred at rt for 16 h. Then the mixture was quenched by water, adjusted pH to 7, extracted by EtOAc (50 mL *3) , dried over anhydrous Na2SO4, concentrated under vacuum, and purified by prep-HPLC to obtain the target product (42.7 mg, 23.3 %) . MS [M+H] + 299, 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ10.62 (s, 1H) , 10.28 (s, 1H) , 8.02 (s, 1H) , 7.52 (s, 1H) , 6.77 (d, J = 37.3 Hz, 1H) , 3.38 (d, J = 4.4 Hz, 4H) , 1.11 (s, 6H) .

[0072] Synthesis of Cpd-4. Cpd-4 was prepared in two synthetic steps from 3, 4-dihydroxy-5-nitrobenzaldehyde, according to the following procedure:

[0073] Synthesis of (E) -2-cyano-3- (3, 4-dihydroxy-5-nitrophenyl) -N, N-diethylacrylamide (3) . To a solution of 3, 4-dihydroxy-5-nitrobenzaldehyde (1 g, 5.5 mmol) in isopropyl alcohol (10 mL) was added 2-cyano-N, N-diethylacetamide (0.9 g, 6.5 mmol) , followed by piperidine (0.23 g, 2.7 mmol) . The reaction mixture was stirred at 85 ℃ for 16 h. The mixture was then concentrated under vacuum and purified by column chromatography to obtain the target product (1g, 62.5%) . MS [M+H] + 306.

[0074] Synthesis of 2-cyano-3- (3, 4-dihydroxy-5-nitrophenyl) -N, N-diethylpropanamide (Cpd-4) . To a solution of 3 (300 mg, 0.98 mmol) in MeOH (5 mL) was added NaBH4 (37 mg, 0.98 mmol) . The reaction mixture was stirred at rt for 16 h. The mixture was concentrated under vacuum and purified by prep-HPLC to obtain the target product (101.2 mg, 33.5 %) . MS [M+H] + 308. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.12 (d, J = 37.5 Hz, 2H) , 7.26 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 6.99 (d, J = 2.1 Hz, 1H) , 4.40 (t, J =7.6 Hz, 1H) , 3.30 -3.23 (m, 2H) , 3.19 -3.08 (m, 2H) , 2.99 (dd, J = 12.5, 7.6 Hz, 2H) , 0.99 (t, J = 7.1 Hz, 3H) , 0.93 (t, J = 7.1 Hz, 3H) .

[0075] Synthesis of Cpd-5. Cpd-5 was prepared in two synthetic steps from 3, 4-dihydroxy-5-nitrobenzaldehyde, according to the following procedure:

[0076] Synthesis of 3- (3, 4-dihydroxy-5-nitrobenzylidene) pentane-2, 4-dione (3) . To a solution of 3, 4-dihydroxy-5-nitrobenzaldehyde (1 g, 5.5 mmol) in isopropyl alcohol (10 mL) was added acetylacetone (0.65 g, 6.5 mmol) , followed by piperidine (0.23 g, 2.7 mmol) . The reaction mixture was stirred at 85 ℃ for 16 h. The mixture was concentrated under vacuum and purified by column chromatography to obtain the target product (400 mg, 28.5%) . MS [M+H] + 266.

[0077] Synthesis of 3- (3, 4-dihydroxy-5-nitrobenzyl) pentane-2, 4-dione (Cpd-5) . To a solution of 3 (300 mg, 1.13 mmol) in ethanol (5 mL) was added NaBH3CN (71.13 mg, 1.13 mmol) . The reaction was stirred at rt for 16 h. The mixture was concentrated under vacuum and purified by prep-HPLC to obtain the target product (10.95 mg, 3.6%) . MS [M-H] -266. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.03 (s, 2H) , 7.17 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 6.88 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 4.21 (t, J = 7.4 Hz, 1H) , 2.87 (d, J = 7.4 Hz, 2H) , 2.10 (s, 6H) .

[0078] EXPERIMENTAL METHODS

[0079] Expression and Purification of Recombinant KEAP1. Human KEAP1-BTB domain (48-180 amino acids) purification was performed in our laboratory as previously described (Cleasby, A., et. al., PLoS ONE 2014, 9 (6) , e98896) . The cDNA was subcloned into pET28b vector to incorporate a N-terminal hexahistidine (His) tag. The S172A point mutation was introduced into the KEAP1-BTB cDNA to enhance protein stability. Wild-type (WT) KEAP1-BTB and KEAP1-BTB-C151S mutant were expressed in BL21 (DE3) cells. The cells were grown in LB medium and then induced with 0.25 mM IPTG after reaching OD600 = 0.5-0.8, and incubated overnight at 18 ℃ with shaking at 200 rpm. Cells were harvested by centrifugation at 4,000 rpm and 4 ℃ for 20 minutes and lysed by sonication with a 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) , 150 mM NaCl buffer. The lysate was then centrifuged at 12,000 rpm and 4 ℃ for 1 hour. The crude protein was purified by Ni-affinity chromatography and eluted with 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) , 150 mM NaCl, 250 mM imidazole buffer. After overnight Thrombin cleavage to remove the His tag, the purified protein was further purified using a Superdex 75 increase column with 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) , 150 mM NaCl buffer. The final purified protein was confirmed by SDS-PAGE and stored at -80 ℃.

[0080] Fluorescence-based Thermal Shift Assay. The fluorescence-based thermal shift assay was performed as previously described (Cleasby, A., et. al., PLoS ONE 2014, 9 (6) , e98896) . WT KEAP1-BTB and KEAP1-BTB-C151S mutant protein were incubated with indicated concentrations of compounds and 5 *SYPRO Orange solution in 20 μL reaction system. A Bio-Rad 96 well clear plate was used and DMSO served as the control with a content of 0.1%in all groups. The reaction was detected using a Bio-Rad PCR system, with an initial temperature of 25 ℃ for 3 minutes followed by a 0.5 ℃ increase every 8 seconds until reaching 95 ℃. Snapshots were taken at each 0.5 ℃ interval. After completion of the program, data was outputted and analyzed using the Bio-Rad software.

[0081] UV-vis Spectrometry Assay. In the reactivity assessment, entacapone and nitecapone were incubated at a concentration of 200 μM with GSH of varying millimolar concentrations. The incubation was performed at room temperature using PBS buffer as the dilution buffer. Absorbance measurements were then carried out in the wavelength range of 250-600 nm. In the investigation of the compounds' reversible properties, the reaction products were subjected to 10-fold dilution in either plain PBS buffer or PBS buffer containing different GSH concentrations. The change in absorbance was quantified using a TECAN scanning model machine, followed by subsequent data analysis.

[0082] Proton Affinity Calculation. Computational methods were used to study the reactivity of entacapone and its analogues. All geometric optimizations were performed with the Gaussian16 package. The minimum energy structure and the corresponding anion structure were optimized using the DFT method, and the proton affinity of anions in water was also calculated under the same level of calculation method. The b3lyp functional and 6-311+G*basis set were used for all DFT calculations. The Grimme dispersion scheme (D3) was applied to describe the weak dispersion interaction and the polarizable continuum model (PCM) was used to implicitly consider the solvent effect.

[0083] Cell Culture and Treatment. HT-1080 (ATCC) and HEK293T (ATCC) were maintained in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Gibco) containing 10%fetal bovine serum (Sigma) and incubated at 37 ℃ under humidified conditions and 5%CO2. To obtain BMDMs, bone marrow cells from WT and transgenic mice were cultured for 5 to 7 days in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Gibco) containing 10%FBS and conditioned media from L929 cell culture.

[0084] Cell Transfection. HEK293T cells were plated on 24-well or 12-well plate at the density of 0.7x10^5 or 1.2x10^5 cells per well. Flag-NRF2 and Flag-KEAP1 WT / C151S plasmids were transfected by Lipo8000 (Beyotime) according to the manufacturer’s instructions. 24 hours after the transfection, the cells were treated with indicated concentration of compounds for another 6 hours. The cells were then washed three times with PBS and collected for western blot.

[0085] Western Blotting. Cells were washed with DPBS to remove residual medium and then lysed in SDS lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, with 150 mM NaCl, 1.0%Igepal CA-630 (NP-40) , 0.5%sodium deoxycholate, and 0.1%sodium dodecyl sulfate) , EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) . The protein lysates were centrifuged (13,000 rpm, 10 min, 4℃) , and the concentration of the supernatants was determined using the BCA Protein Assay. 25 μg of protein from the samples was separated on a 10-12%SDS–PAGE gel and transferred to a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane with a pore size of 0.45 microns. The membranes were blocked in 5%nonfat milk TBST solution (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl and 0.05%Tween-20) for 30 to 60 min and then were sequentially incubated with the primary antibody overnight at 4 ℃ and the secondary antibody (peroxidase conjugated) at room temperature for 1 h after washing. The primary antibodies used were rabbit polyclonal anti-NRF2 (1: 2,000, Proteintech, 16396-1-AP) , rabbit polyclonal anti-NQO-1 (1: 1,000, Proteintech, 11451-1-AP) , rabbit polyclonal anti-GCLM (1: 2,000, Proteintech, 14241-1-AP) , and mouse monoclonal anti-GAPDH (1: 5,000, Proteintech, 60004-1-Ig) , and mouse monoclonal anti-Flag (1: 5000, CWBIO, CW0287) . The secondary antibody used were goat anti-mouse IgG (1: 5,000, Thermo, 31430) and goat anti-rabbit IgG (1: 5,000, Thermo, 31460) . The signals were detected using the enhanced chemiluminescence detection system (Clarity Western ECL substrate, Bio-Rad) . Western blot images were captured using an e-BLOT imager.

[0086] Electrospray Ionization Mass Spectrometer (ESI MS) . Purified KEAP1-BTB (WT or C151S) was incubated with compounds for 2 h at 37 ℃ in 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0 buffer. Covalent adduct detection between compounds and BTB proteins was performed using LC-MS. The LC-MS analysis was conducted using a Thermo Scientific Vanquish UHPLC coupled with a Thermo Q Exactive Plus Biopharm system. Chromatographic separation was achieved using an ACQUITY UPLC Protein BEH C4 column ( 1.7 μm, 2.1*100 mm) at a column temperature of 60 ℃. The mobile phases consisted of 0.1%formic acid in water and acetonitrile containing 0.1%formic acid. The gradient elution program was as follows: 0-5 min, 5%B; 5-10 min, 5%to 90%B; 10-12 min, 90%B; 12-12.1 min, 5%B; 12.1-15 min, 5%B. The sample injection volume was 2 μL, and the flow rate was maintained at 0.3 mL / min. Mass spectrometry acquisition parameters were set as follows: Sheath gas flow rate (45) , Aux gas flow rate (10) , Spray voltage (3.5 kV) , Capillary temperature (320 ℃) , S-Lens RF Level (55) , Aux gas heater temperature (310 ℃) , Scan Type (Full MS) , Microscans (5) , Resolution (17500) , AGC target (3e6) , Maximum IT (200 ms) , Number of scan ranges (1) , Scan range Spectrum (1000-2500 m / z) , Data type (Profile) . Data analysis involved the usage of the Intact Mass Analysis module of BioPharma Finder 4.1.

[0087] Mice Gout Model. The mice gout model was performed as previously described (Eisenstein, A., et. al., Immunity 2022, S1074761322001868) . The eight-week-old male mice were intraperitoneal injection with Vehicle or Entacapone (100 mg / kg) or Nitecapone (100 mg / kg) twice with an interval of 12 hours. One hour after the last compound injection the left hind foot pad of mice was injected intradermally with 40 μL saline or MSU (Invivogen) . The foot was measured by calipers 24 or 48 hours after injection and all animal experiments were approved by the Ethics Committee.

[0088] Example 2A: Reversible Covalent Interaction between Entacapone and KEAP1.

[0089] A thermal shift assay (TSA) was used to verify the direct interaction between entacapone and purified BTB domain of KEAP1.

[0090] The shift in melting temperature (ΔTm) of the KEAP1-BTB protein increased with the dose of entacapone compared to the DMSO control. This effect was reduced when the C151 of KEAP1-BTB was mutated to C151S, suggesting a covalent interaction (Figure 2) . The compound-protein adduct was further anlyzed by mass spectrometry. The mass sepectrometry analysis found the entacapone-treated KEAP1-BTB protein contained a product with an extra mass of 305.71 Da, which matched the molecular weight of entacapone (305.29 Da) . No adduct formation was observed in entacapone-treated C151S protein under the same experimental conditions, indicating that C151 on KEAP1-BTB is essential for covalent bond formation (Figure 3) . In Figure 3, BTB exhibited a mass shift of 305.8 Da (left) , while no adduct was detected for BTB-C151S under identical conditions (right) .

[0091] A UV-visible spectroscopy-based method was used to test the reversibility of the interaction of entacapone with GSH. The main UV-visible band of entacapone is at 380 nm, which decreased with the dose of GSH, with a measured Kd of 3.2 mM (Figure 6) . Furthermore, the 380 nm peak reappeared after diluting the mixture with PBS, showing the reversibility of the cyanoacrylamide-containing entacapone with the thiol group of cysteine (Figure 7) . The left part of Figure 7 shows the absorbance of 200 μM ENT reacted with 50 mM GSH (left) , while the right part of Figure 7 shows the absorbance of the dilution reaction which was then diluted 10-fold with PBS buffer or 50 mM GSH solution. Additionally, the KEAP1-BTB protein was used to validate this characteristic. Upon incubation with entacapone, a mass shift of 305.7 Da was observed at a ratio of 56.6%. Subsequent incubation with a high concentration of DMF (Mw: 144 Da) , a traditional irreversible covalent KEAP1 modifier, resulted in mass shifts of 305.4 Da (reduced to 8.9%) and 144.3 Da (75%) . Importantly, higher concentrations of DMF completely abolished entacapone modification due to competitive binding with C151, leading to a mass shift of 144.2 Da (87.4%) . These findings further support the notion of reversibility of cyanoacrylamide-containing entacapone with the KEAP1-BTB protein (Figure 4) . In Figure 4, the protein: entacapone ratio was maintained at 1: 1.5 for all three samples. In the middle and right samples, the reaction was pre-incubated and then exposed to a 2-fold or 10-fold concentration of DMF relative to entacapone.

[0092] As a strong electron-withdrawing group, the nitrile group of entacapone may increase the electropositivity and reactivity of the beta-carbon atom of Michael acceptor. To study the role of the nitrile group in the reactivity of entacapone, four entacapone analogs, i.e., Cpd-1 (without the nitrile group) , Cpd-2 (acetyl in replace of nitrile) , Cpd-3 (fluorine in replace of nitrile) , and Cpd-4 (the double bond of the cyanoacrylamide group being saturated) were prepared as in Example 1 and tested. The UV-visible spectroscopy assays showed that none of the three compounds (Cpd-1, Cpd-2 and Cpd-3) reacted with GSH (Figure 8) . The TSA assay showed that all the four analogs failed to increase the Tm of KEAP1-BTB protein like entacapone (Figure 9) . The MS analysis confirmed this, as no adduct was found in Cpd-1 treated KEAP1-BTB protein (Figure 5) . Quantum mechanics (QM) approach was used to calculate the proton affinity (PA) of entacapone and its analogs and found that all nitrile-free compounds had higher PA values than entacapone, which is consistent with the GSH reactivity results (Table 1) .

[0093] Table 1 shows the GSH reactivity of entacapone analogs and their proton affinity.

[0094] Those results show that entacapone reversibly covalently binds to C151 of KEAP1 and that the cyanoacrylamide of entacapone is essential for this binding. Thus, KEAP1 is a potential covalent binding target of entacapone.

[0095] Example 2B: KEAP1-entacapone Binding Mode Analysis.

[0096] Except the covalent bond formed between the cyanoacrylamide and C151, the non-covalent interactions are also critical for entacapone binding with KEAP1 (Figure 10) . The docking pose reveals that the hydroxyl group at the meta position on the nitrocatechol ring formed a hydrogen bond with S146. The model also showed that the deprotonated ortho hydroxyl group of entacapone formed a charge-charge interaction with R135, and the nitro group interacted with K131.

[0097] It is interesting to compare how entacapone binds to KEAP1, COMT, and FTO. The COMT structure (4XUD) was used as a reference for modeling COMT-entacapone binding complex (Figure 10) . The nitrocatechol moiety of entacapone chelated with metal ion similar to the crystal ligand in the COMT complex structure. In striking contrast, in the crystal complex structure of entacapone bound with FTO, the nitrile group chelated with the binding-site metal ion, instead, and the hydroxyl group at the meta position of the nitrocatechol ring formed hydrogen bonds with R322 and Y106 (Figure 10) . This is rare as a drug molecule binds with different targets in very different binding modes, illustrating interesting binding characteristics employed by a multi-target ligand.

[0098] In Figure 10, the hydrogen bond interactions between the ligand and the protein are color-coded in pink, while the gray dashed lines represent ion chelation interactions. The graphics were generated using UCSF Chimera.

[0099] Example 2C: KEAP1 / NRF2 Pathway Activation by Entacapone.

[0100] 150ng Flag-tagged KEAP1 and 650ng Flag-tagged NRF2 were co-expressed in HEK293T cells with DMSO, entacapone, or CDDO-Me as positive control for assessing NRF2 stability via western blot and found that entacapone stabilized NRF2 in a dose-dependent way (Figure 11A and Figure 12A) . Flag-tagged KEAP1-C151S and Flag-tagged NRF2 were also co-expressed in HEK293T cells with DMSO, entacapone, or CDDO-Me as positive control for assessing NRF2 stability via western blot and found that entacapone, like CDDO-Me, could not stabilize NRF2 with C151S mutation (Figure 11A) . Consistently, Cpd-1, which did not bind to KEAP1, also failed to stabilize NRF2 (Figure 12B) . The  U2OS KEAP1–NRF2 functional assay (DiscoverX, Cat#93-0821C3) was used to check the nuclear translocation of NRF2 by entacapone. The results showed that entacapone promoted the nuclear translocation of NRF2 reporter with an EC50 of 9.9 μM (Figure 11B) . Figure 11B shows the determination of NRF2 nuclear translocation EC50 values of entacapone in U2OS cell line with reporter system using multiple doses.

[0101] Proteomics analysis in HT-1080 cells was performed to investigate the effects of entacapone on the KEAP1-NRF2 pathway.

[0102] HT-1080 cells were treated with the drug for 24 hours, and cell samples were collected. After lysis, proteomics analysis was performed to compare the differences in protein expression between the drug-treated group and the DMSO control group. The focus of the study was to investigate the effects of entacapone on the KEAP1-NRF2 pathway. The results showed a significant increase in the protein levels of NRF2 targets, such as HO-1, GCLM, and NQO1 (Figure 11C) . Figure 11C shows proteomic profiling reveals the effect of 100 μM entacapone treatment on HT-1080 cells. The up-regulated targets shown in red and down-regulated targets shown in blue. Notably, arrows indicate various downstream targets of the KEAP1 / NRF2 pathway, including HO-1, GLCM, and NQO1, which exhibit differential expression levels. The NRF2 pathway was strongly enriched in changed proteins after entacapone treatment (Figure 11D) , in which the data were analyzed using DAVID according to Huang, D.W. et. Al (Systematic and Integrative Analysis of Large Gene Lists Using DAVID Bioinformatics Resources. Nat Protoc 2009, 4 (1) , 44–57) . Figure 11E shows immunoblot analysis of protein expression levels including NRF2, NQO1, and GCLM in HT-1080 cells treated with entacapone at 50 μM and 100 μM, with DMSO as a control, and these proteomic data were further validated by western blot analysis, where both NRF2 and its downstream targets exhibited higher expression after entacapone treatment. In summary, those results provide strong evidence that entacapone can stabilize NRF2 protein and activate NRF2 pathway by binding to C151 of KEAP1.

[0103] Example 3: Nitecapone as a Novel Electrophilic Ligand with Enhanced Efficiency.

[0104] Examples 2A, 2B and 2C confirm that the electrophilic cyanoacrylamide group as a Michael acceptor plays the pivotal role of the in entacapone's interaction with KEAP1, while the analog Cpd-5 does not. It is interesting to note nitecapone, another COMT inhibitor with a reactive 3-methylene-acetylacetone group could (Figure 13A) , has a very close structure to that of Cpd-5. Figure 13A shows the model of compound nitecapone with a 3-methylene-acetylacetone warhead in forming reversible covalent adducts with thiol group of cysteine residue in the protein.

[0105] Similar to the experiments done with entacapone in Examples 2A, 2B and 2C, the UV-visible spectroscopy assay was used to measure the reactivity of nitecapone with GSH. It was suprising to find nitecapone at 200 μM reacted with GSH in a dose-dependent manner with a Kd of 2.5 mM (Figure 14A) .

[0106] The thermal shift assay confirmed that nitecapone increased the ΔTm of KEAP1-BTB-WT but not KEAP1-BTB-C151S at different doses (Figure 13B) . Additionally, the saturated compound (Cpd-5) of nitecapone did not increase the ΔTm of KEAP1-BTB-WT, showing the importance of the 3-methylene-acetylacetone group and C151 for nitecapone binding to KEAP1 (Figure 14B and Figure 14C) . This interaction was further confirmed by mass spectrometry. Nitecapone-treated KEAP1-BTB protein, but not KEAP1-BTB-C151S, had an extra adduct with an extra mass of 265.89 Da, which matched the molecular weight of nitecapone (265.22 Da) (Figure 13C) . Figure 13C shows deconvoluted ESI-MS analysis of BTB WT and BTB-C151S mutant after incubation with nitecapone. BTB WT exhibited a mass shift of 265 Da (left) , while no adduct was detected for BTB-C151S under identical conditions (right) . A dilution assay between nitecapone and GSH was used to check the reversibility of 3-methylene-acetylacetone warhead of nitecapone. Figure 14D shows that the absorbance was recorded between 300 nm and 550 nm, with 200 μM nitecapone reacted with 12.5 mM GSH (left) , the reaction was then diluted 10-fold with PBS buffer or 12.5 mM GSH solution, and the absorbance of the dilution reaction was also recorded (right) , and Figure 14D found the absorbance peak of nitecapone at 380 nm recovered in a no GSH buffer after dilution. When KEAP1-BTB protein was incubated with nitecapone, a mass shift of 265.8 Da was observed at a ratio of 64.1%. Higher concentrations of DMF completely abolished the modification of nitecapone, resulting in a mass shift of 144.3 Da (86.5%) . These findings further support the reversibly covalent bond formed by the 3-methylene-acetylacetone warhead (Figure 13D) . Figure 13D shows deconvoluted ESI-MS was employed to analyze the reversibility of nitecapone and KEAP1-BTB. The protein: nitecapone ratio was maintained at 1: 0.5. In the right sample, the reaction was pre-incubated and then exposed to a 30-fold concentration of DMF relative to nitecapone.

[0107] HEK293T cells co-expressed with Flag-tagged KEAP1 and Flag-tagged NRF2 were treated with DMSO and nitecapone at different concentrations, and the co-expression assay also confirmed that nitecapone stabilized NRF2 protein in a dose-dependent manner (Figure 14E) . In the  U2OS KEAP1-NRF2 functional assay, nitecapone had an NRF2 nuclear translocation EC50 of 4.5 μM determined in U2OS cells using a reporter system at multiple doses (Figure 13E) . Again, nitecapone did not stabilize NRF2 with KEAP1-C151S protein, showing that nitecapone binding to KEAP1 depended on C151 (Figure 13F) . Figure 13F shows Western blot experiment to assess the stability of NRF2 protein co-expressed with WT or C151 mutant KEAP1 and treated with DMSO, entacapone, nitecapone, or tolcapone.

[0108] However, the co-expression of HEK293T cells with tolcapone, a COMT inhibitor without an electrophilic group, did not found that NRF2 had been activated, and ΔTm of KEAP1-BTB-WT was significantly decreased in TSA assay neither (Figure 13F and Figure 14F, Figure 14G) . Figure 14F, Figure 14G and shows chemical structures of compounds entacapone (ENT) , nitecapone (NIT) , tolcapone (TOL) with warhead highlighted in bold, and the TSA results of KEAP1-BTB WT or C151S mutant with compounds ENT, NIT, TOL at 50 μM, respectively.

[0109] Therefore, nitecapone used a novel 3-methylene-acetylacetone warhead to form a reversible covalent bond with C151 of KEAP1, and thus activate NRF2 in cells.

[0110] Example 4: Both Entacapone and Nitecapone Alleviate MSU-Induced Acute Gout Model.

[0111] Since NRF2 is needed for GDF15 induction in mouse bone marrow-derived macrophages (BMDMs) , and GDF15 induction can reduce inflammation in mice, entacapone and nitecapone were tested to determine whether they could induce GDF15 and NRF2-GDF15 signaling pathway in BMDMs. Primary mouse bone marrow-derived macrophages were obtained by stimulating bone marrow cells from the femur of mice and induced with macrophage colony-stimulating factor (M-CSF, 30ng / ml) for 5-7 days in vitro, then they were treated with 100 μM entacapone or nitecapone, and the activation of mRNA levels of Gdf15 was identified in a time-course analysis range from 1, 3, 6 to 12, 24 h. Gdf15 expression in BMDMs increased significantly after treatment with the compounds, with nitecapone being more active than entacapone (Figure 15A) . The activation of NRF2 downstream targets was also confirmed in BMDMs treated with entacapone and nitecapone. Primary mouse bone marrow-derived macrophages were treated with entacapone or nitecapone for 6 h. mRNA expression levels of KEAP1 / NRF2 downstream targets (Gdf15, Csr, Tal, Cat, Gclm, and Hmox1) were detected. Nitecapone increased the expression of NRF2 targets Gdf15, Gclm, and Hmox1 more than entacapone (Figure 15B) , consistent with the stabilization and nuclear translocation results of NRF2 (Figure 11B, Figure 13E, and Figure 13F) .

[0112] Since entacapone and nitecapone are known as COMT inhibitors, and entacapone has an additional target FTO, COMT-or FTO-knockout (KO) BMDMs were obtained by stimulating bone marrow cells from the femur of mice and induced with macrophage colony-stimulating factor (M-CSF, 30ng / ml) for 5-7 days in vitro. Subsequently, they were treated with entacapone and nitecapone to see if COMT or FTO inhibition could activate NRF2. Relative mRNA expression levels of Gdf15 in BMDMs from Comt+ / + or Comt- / - (Figure 15C) or Fto+ / + or Fto- / - (Figure 15D) mice were determined after treatment with DMSO control, entacapone or nitecapone at various doses, and CDDO-Me. There were no significant differences in the mRNA expression of Gdf15 after treatment with either compound (Figure 15C and Figure 15D) . These results suggest that COMT or FTO do not affect NRF2 activation. Different from the previous study on entacapone inhibiting FTO required a much longer treatment time according to Peng, S. et, al. (Identification of Entacapone as a Chemical Inhibitor of FTO Mediating Metabolic Regulation through FOXO1. Sci. Transl. Med. 2019, 11 (488) , eaau7116) , the fast stabilization of NRF2 levels was observed after a few hours of entacapone treatment.

[0113] Next, the MSU-induced acute gout model, which relies on NRF2 activation, was used to test the pharmacological effects of entacapone and nitecapone. The experimental mice at 6-8 weeks were divided into different groups, and were given 100 mpk doses of entacapone or nitecapone to treat different time points (n=3 per group) . Changes in the expression levels of downstream target protein GDF15 were detected in mice blood by the ELISA assay kit methods (Figure 15E) . Both drugs exhibited strong anti-inflammatory activity and effectively alleviated the MSU-induced acute gout. Those in vivo results were consistent with the higher activation of GDF15 in serum and NRF2 targets with nitecapone than entacapone (Figure 15E, Figure 15F, Figure 15G and Figure 16A) . Figure 15F shows the statistics of foot diameter of mice in different groups, saline as the control group and MSU as the experimental group, were measured at 48 h. Each image is representative of at least 6 mice. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, entacapone or nitecapone vs MSU gouty model group. Data processed with Graph Prism. Figure 15G shows representative results of mice foot after treatment by vehicle, entacapone, nitecapone respectively.

[0114] Quantitative PCR to measure the transcription levels of NRF2 targets in different tissues was used to further examine the in vivo activation of the NRF2 pathway. The results showed that liver and kidney had higher transcription levels of Gdf15 and Hmox1 among the 11 tissues tested (Figure 16B and Figure 16C) . Interestingly, entacapone activated Gdf15, Hmox1, Csr, Cat, Tadol, and Gclm more in the liver (Figure 16D, Figure 16E, and Figure 16F) , while nitecapone activated Gdf15, Hmox1, Csr, Gclm, and Nqo1 more in the kidney (Figure 16G, Figure 16H, and Figure 16I) . The tissue distribution of entacapone and nitecapone was checked. Pharmacokinetic (PK) analysis showed more favorable distributions of entacapone in the liver and nitecapone in the kidney (Figure 16J and Figure 16K) . This finding may help explain the tissue-specific fashion of activating NRF2 downstream signaling by these two drug molecules. In summary, entacapone and nitecapone activated GDF15 through KEAP1 / NRF2 pathway and reduced inflammation in a gout mouse model.

[0115] CONCLUSION

[0116] Both entacapone and nitecapone activated the KEAP1 / NRF2 pathway in vitro and in vivo. They reduced inflammation in a MSU-induced foot gouty arthritis model, suggesting they could treat NRF2 related diseases. Nitecapone had strong tissue distribution and NRF2 activation in kidney, implying that nitecapone might be useful for inflammatory kidney diseases.

[0117] It is to be understood that, if any prior art publication is referred to herein; such reference does not constitute an admission that the publication forms a part of the common general knowledge in the art in any country.

[0118] Although the foregoing invention has been described in some details by way of illustration and example for purposes of clarity of understanding, it is apparent to those skilled in the art that certain minor changes and modifications will be practiced. Therefore, the description and Examples should not be construed as limiting the scope of the invention.

Claims

1.A method for treating or preventing a disease or disorder associated with a deregulated NRF2 / KEAP1 pathway, comprising administering a subject in need thereof a therapeutically effective amount of entacapone or nitecapone or a pharmaceutically acceptable salt thereof.2.The method of claim 1, wherein entacapone or nitecapone covalently and reversibly binds to the cysteine residues of KEAP1 so as to release NRF2.3.The method of claim 1 or 2, wherein entacapone or nitecapone covalently and reversibly binds to C151 of KEAP1.4.The method of claim 1, wherein entacapone covalently and reversibly binds to C151 of KEAP1 via the electrophilic cyanoacrylamide group of entacapone.5.The method of claim 1, wherein nitecapone covalently and reversibly binds to C151 of KEAP1 via the reactive 3-methylene-acetylacetone group of nitecapone.6.The method of any one of claims 1 to 5, wherein the disease or disorder associated with a deregulated NRF2 / KEAP1 pathway include inflammatory diseases including inflammatory arthritis, gout, acute gout, chronic gout, or inflammatory kidney diseases, autoimmune diseases (multiple sclerosis, psoriasis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, scleroderma, ulcerative colitis, etc. ) , central nervous system diseases (Friedreich ataxia, mitochondrial myopathy, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, Huntington's disease, etc. ) , respiratory diseases (chronic occlusive pulmonary disease, etc. ) , malignant tumors (melanoma, lung cancer including non-small cell lung cancer (NSCLC) , medulloblastoma, neuroblastoma, etc. ) , eye diseases (ocular inflammation, ocular pain, age-related macular degeneration, corneal endothelial disorder, etc. ) , skin diseases (dermatitis, radiation skin disorders, epidermolysis bullosa, etc. ) , circulatory diseases (pulmonary arterial hypertension, etc. ) , liver diseases (hepatitis, liver cirrhosis, etc. ) , traumatic brain injury, aging, and the like.7.The method of any one of claims 1 to 6, wherein the disease or disorder associated with a deregulated NRF2 / KEAP1 pathway includes inflammatory arthritis, multiple sclerosis, or Friedreich ataxia.8.The method of any one of claims 1 to 7, wherein the disease or disorder associated with a deregulated NRF2 / KEAP1 pathway includes gout.9.The method of any one of claims 1 to 8, wherein the NRF2 / KEAP1 pathway is deregulated because of post-translational modification of KEAP1 cysteine residues.10.The method of any one of claims 1 to 9, wherein the inflammatory disease is caused by inflammation and oxidative stress.11.The method of any one of claims 1 to 10, wherein the NRF2 / KEAP1 pathway is deregulated because of a somatic mutation in KEAP1 or the KEAP1 binding domain of NRF2.12.The method of any one of claims 1 to 11, wherein the subject has an increase in the intracellular concentration of glutathione (GSH) , which is caused by: (a) deregulated NRF2 activity; and / or (b) increased expression of GSH-related enzymes; and / or (c) increased expression or activity of amino acid transporters.13.The method of any one of claims 1 to 12, wherein entacapone or nitecapone is administered in an amount of 0.1-8, 0.1-4, 0.1-2.5, 0.2-8, 0.2-4, 0.2-2.5, 0.3-8, 0.3-4, 0.3-2.5, 0.4-8, 0.4-4, 0.4-2.5, 0.6-8, 0.6-4, or 0.6-2.5g / day, or in unit dosage forms of 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, or 0.6g.14.A cysteine adduct, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, having the following structure (I) or (II) wherein each R1 is H or an acid terminal of a first amino acid; each R2 is OH or an amine terminal of a second amino acid.15.The adduct of claim 14, wherein the first amino acid and the second amino acid are either the same or different.16.The adduct of claim 15, wherein the cysteine is a cysteine of a target protein.17.The adduct of claim 16, wherein the cysteine is C151 of KEAP1.18.The adduct of claim 16, wherein the carbon atom to which the cysteine is attached is in a (R) -or (S) -configuration.

Images