Multivalent linkers for high loading antibody-drug conjugates, and compositions and methods thereof

Abstract

Provided herein are novel multivalent linkers, antibody-drug conjugates, and pharmaceutical compositions and methods of treatment thereof for certain diseases or conditions.

Description

MULTIVALENT LINKERS FOR HIGH LOADING ANTIBODY-DRUG CONJUGATES, AND COMPOSITIONS AND METHODS THEREOFTechnical Field of the Invention

[0001] The invention generally relates to novel compounds and therapeutic uses thereof. More particularly, the invention provides novel multivalent linkers with increased drug loading capabilities, antibody-drug conjugates thereof, and pharmaceutical compositions and methods of treatment for certain diseases or conditions.Background of the Invention

[0002] Antibody-drug conjugates (ADCs) , a fast-growing class of drugs designed as targeted therapy with long plasma half-lives, represent a promising therapeutic modality in cancer treatment. To date, thirteen ADCs have received market approval by the US FDA. ADCs are an important class of highly potent biopharmaceutical drugs designed as a targeted therapy for the treatment of people with cancer or other diseases. Unlike the nonspecific killing properties of chemotherapy, ADCs are designed to target and kill the cancer cells only and spare healthy cells. The focus of ADC development has increasingly been placed on reduction of systemic toxicity while increasing the therapeutic benefit. (Ducry, et al. 2010 Bioconjugate Chemistry 21 (1) : 5–13; Kovtun, et al. 2006 Cancer Research 66 (6) : 3214–21; Kovtun, et al. 2007 Cancer Letters 255 (2) : 232–40; Dijoseph, et al. 2004 Blood 103 (5) : 1807–14; Mullard 2013 Nature Reviews Drug Discovery 12 (5) : 329–32. )

[0003] Synthesis of ADCs is achieved typically by coupling the therapeutic agent to the antibody using amino or thiol specific linkers on the antibody surface. () . The preferred drug-to-antibody ratio (DAR) for ADCs tend to be in the range of 2 to 8 drugs / antibody. With improved in vitro potency, high DARs are highly desirable due to their increased potency especially for biological targets that have low expression level. Conventional conjugation methods, however, are not suited for making ADCs with high DARs, as such methods are frequently prone to  aggregation, poor solubility, and / or instability that led to a poor therapeutic window. (Sun, et al. 2005 Bioconjugate Chemistry 16, 1282-90; Hamblett, et al. 2004 Cancer Research 10, 7063-70. )

[0004] Besides novel technologies that allow high DARs, another pressing need is to develop ADCs with dual cytotoxic agents based on distinct MOAs with synergistic effects. Additionally, hydrophilic linkers with low molecular weight (CMC friendly) would benefit ADCs with improved properties of drug-likeness, such as reduced aggregation, improved solubility, improved ADC plasma clearance and pharmacokinetics, reduced immunogenicity, and improved therapeutic window.

[0005] There is an ongoing and urgent need for novel linker strategies and conjugation methodologies that improve drug loading of ADCs while addressing the many shortcomings of existing linkers.Summary of the Invention

[0006] The invention is based in part on the novel carbohydrate-based multivalent linkers disclosed herein that are capable of increased drug loading, for example, up to 8 units of therapeutic agents per linker unit. In addition to providing the ability to increase and fine-tune drug loadings for ADCs (e.g., with DARs ranging from 4 to 32) , these novel linkers are also designed to allow loading of two or more different therapeutic agents at different DARs in a given ADC.

[0007] The invention additionally provides pharmaceutical compositions and methods of therapeutic treatment for certain diseases or conditions using ADCs built on the multivalent linker platform disclosed herein. Furthermore, the invention provides methods of making such multivalent linkers, linker-drug conjugates, and ADCs, as well as methods for modifying or fine-tuning DARs thereof.

[0008] These novel linkers are hydrophilic by design and can help improve properties of ADCs to be more suitable drug, for example with reduced aggregation, improved solubility, improved ADC plasma clearance and pharmacokinetics, improved efficacy, reduced immunogenicity, and finally improved therapeutic windows.

[0009] In one aspect, the invention generally relates to an antibody-drug conjugate having the structural formula (I) :

[0010] or a pharmaceutically acceptable salt thereof,

[0011] wherein

[0012] Ab is an antigen binding moiety;

[0013] each of D1, D2, D3 and D4 is independently a drug moiety or absent;

[0014] each of L1D, L2D, L3D and L4D is independently a linker group covalently attached to D1, D2, D3 and D4, respectively, wherein optionally each of L1D, L2D, L3D and L4D independently comprises a hydrophilic group;

[0015] L5Ab is a linker group attached to Ab, wherein L5Ab optionally comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 hydrophilic groups; and

[0016] Z is O or N, wherein when Z is N, D2 is absent and L2D represents L2DA and L2DB, each is independently a hydrophilic group covalently bound to said N;

[0017] m is an integer selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8,

[0018] wherein

[0019] 0, 1, 2 or 3 of L1D-D1, L2D-D2, L3D-D3 and L4D-D4 is optionally H, a C1-3 alkyl or a hydrophilic group.

[0020] In yet another aspect, the invention generally relates to a compound having the structural formula (VI) :

[0021] wherein

[0022] each of L1, L2, L3 and L4 is independently selected from: H, C1-3 alkyl, or (CH2) k-S-RLA, wherein RLA is a linker group comprising a reactive functional group and optionally comprises a hydrophilic group;

[0023] L5 is selected from: N3 or RLB, wherein RLB is a linker group comprising a reactive functional group and optionally comprises a hydrophilic group; and

[0024] Z is O or N, wherein when Z is N, L2 represents L2A and L2B, each is independently a hydrophilic group covalently bound to said N.

[0025] wherein

[0026] 0, 1, 2 or 3 of L1D, L2D, L3D and L4D optionally comprises a hydrophilic group.

[0027] In yet another aspect, the invention generally relates to a linker-drug conjugate having the structural formula (VIII) :

[0028] wherein

[0029] each of D1, D2, D3 and D4 is independently a drug moiety or absent;

[0030] each of L1D, L2D, L3D and L4D is independently a linker group;

[0031] L5 is selected from: N3 or RLB, wherein RLB is a linker group comprising a reactive functional group and optionally comprises a hydrophilic group; and

[0032] Z is O or N, wherein when Z is N, D2 is absent and L2D represents L2DA and L2DB, each is independently a hydrophilic group covalently bound to said N.

[0033] In yet another aspect, the invention generally relates to an antibody-drug conjugate having the structural formula (X) :

[0034] or a pharmaceutically acceptable salt thereof,

[0035] wherein

[0036] Ab is an antigen binding moiety;

[0037] each of D1, D3, D4, D6, D7, D8 and D9 is independently a drug moiety or absent;

[0038] each of L1D, L3D, L4D, L6D, L7D, L8D and L9D is independently a linker group covalently attached to D1, D3, D4, D6, D7, D8 and D9, respectively, wherein optionally each of L1D, L2D, L3D and L4D independently comprises a hydrophilic group;

[0039] L5Ab is a linker group attached to Ab, wherein L5Ab optionally comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 hydrophilic groups; and

[0040] each of X and Z is independently a triazole group;

[0041] Y is a hydrophilic spacer group;

[0042] m is an integer selected from 1-8,

[0043] wherein

[0044] 0, 1, 2 or 3 of L1D-D1, L3D-D3, L4D-D4, L6D-D6, L7D-D7, L8D-D8 and L9D-D9 is optionally H, a C1-3 alkyl or a hydrophilic group.

[0045] In yet another aspect, the invention generally relates to linker-drug conjugate having the structural formula (XI) :

[0046] wherein

[0047] each of D1, D3, D4, D6, D7, D8 and D9 is independently a drug moiety or absent;

[0048] each of L1D, L3D, L4D, L6D, L7D, L8D and L9D is independently a linker group covalently attached to D1, D3, D4, D6, D7, D8 and D9, respectively, wherein optionally each of L1D, L2D, L3D and L4D independently comprises a hydrophilic group;

[0049] L5 is selected from: N3 or RLB, wherein RLB is a linker group comprising a reactive functional group and optionally comprises a hydrophilic group; and

[0050] each of X and Z is independently a triazole group; and

[0051] Y is a hydrophilic spacer group,

[0052] wherein

[0053] 0, 1, 2 or 3 of L1D-D1, L3D-D3, L4D-D4, L6D-D6, L7D-D7, L8D-D8 and L9D-D9 is optionally H, a C1-3 alkyl or a hydrophilic group.

[0054] In yet another aspect, the invention generally relates to a pharmaceutical composition comprising an antibody-drug conjugate disclosed herein.

[0055] In yet another aspect, the invention generally relates to a unit dosage form comprising a pharmaceutical composition of the invention.

[0056] In yet another aspect, the invention generally relates to a method for treating, reducing, or preventing a disease or disorder, comprising administering to a subject in need thereof an antibody-drug conjugate disclosed herein.

[0057] In yet another aspect, the invention generally relates to a method for modulating immune response, comprising administering to a subject in need thereof an antibody-drug conjugate disclosed herein.

[0058] In yet another aspect, the invention generally relates to use of an antibody-drug conjugate disclosed herein for treating or reducing a disease or disorder.

[0059] In yet another aspect, the invention generally relates to use of an antibody-drug conjugate disclosed herein, and a pharmaceutically acceptable excipient, carrier, or diluent, in preparation of a medicament for treating or reducing a disease or disorder.

[0060] In yet another aspect, the invention generally relates to a method for making a compound, a linker-drug conjugate or an antibody-drug conjugate disclosed herein.Brief Description of the Drawings

[0061] FIG. 1 shows exemplary HIC and SEC-HPLC chromatogram of ADC-10.

[0062] FIG. 2 shows exemplary HIC and SEC-HPLC chromatogram of ADC-11.

[0063] FIG. 3 shows exemplary HIC and SEC-HPLC chromatogram of ADC-3.

[0064] FIG. 4 shows exemplary HIC and SEC-HPLC chromatogram of ADC-12.

[0065] FIG. 5 shows exemplary HIC and SEC-HPLC chromatogram of ADC-13.

[0066] FIG. 6 shows exemplary HIC and SEC-HPLC chromatogram of ADC-14.

[0067] FIG. 7 shows exemplary HIC and SEC-HPLC chromatogram of ADC-17

[0068] FIG. 8 shows exemplary HIC and SEC-HPLC chromatogram of ADC-18.

[0069] FIG. 9 shows exemplary HIC and SEC-HPLC chromatogram of ADC-19.

[0070] FIG. 10 shows exemplary HIC and SEC-HPLC chromatogram of ADC-20.

[0071] FIG. 11 shows exemplary HIC and SEC-HPLC chromatogram of ADC-22.

[0072] FIG. 12 shows exemplary Mouse PK profile of ADC-7.

[0073] FIG. 13 shows exemplary Mouse PK profile of ADC-12.

[0074] FIG. 14 shows exemplary Mouse PK profile of ADC-13.

[0075] FIG. 15 shows exemplary Mouse PK profile of ADC-16.

[0076] FIG. 16 shows exemplary Mouse PK profile of ADC-17.

[0077] Definitions

[0078] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. General principles of organic chemistry, as well as specific functional moieties and reactivity, are described in “Organic Chemistry” , Thomas Sorrell, University Science Books,  Sausalito: 1999, and “March’s Advanced Organic Chemistry” , 5th Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley &Sons, New York: 2001, the entire contents of which are hereby incorporated by reference.

[0079] As used herein, “at least” a specific value is understood to be that value and all values greater than that value.

[0080] The term “comprising” , when used to define compositions and methods, is intended to mean that the compositions and methods include the recited elements, but do not exclude other elements. The term “consisting essentially of” , when used to define compositions and methods, shall mean that the compositions and methods include the recited elements and exclude other elements of any essential significance to the compositions and methods. For example, “consisting essentially of” refers to administration of the pharmacologically active agents expressly recited and excludes pharmacologically active agents not expressly recited. The term consisting essentially of does not exclude pharmacologically inactive or inert agents, e.g., pharmaceutically acceptable excipients, carriers or diluents. The term “consisting of” , when used to define compositions and methods, shall mean excluding trace elements of other ingredients and substantial method steps. Embodiments defined by each of these transition terms are within the scope of this invention.

[0081] Certain compounds of the present invention may exist in particular geometric or stereoisomeric forms. The present invention contemplates all such compounds, including cis-and trans-isomers, R-and S-enantiomers, diastereomers, (D) -isomers, (L) -isomers, the racemic mixtures thereof, and other mixtures thereof, as falling within the scope of the invention. Additional asymmetric carbon atoms may be present in a substituent such as an alkyl group. All such isomers, as well as mixtures thereof, are intended to be included in this invention.

[0082] Isomeric mixtures containing any of a variety of isomer ratios may be utilized in accordance with the present invention. For example, where only two isomers are combined, mixtures containing 50: 50, 60: 40, 70: 30, 80: 20, 90: 10, 95: 5, 96: 4, 97: 3, 98: 2, 99: 1, or 100: 0 isomer ratios are contemplated by the present invention. Those of ordinary skill in the art will readily appreciate that analogous ratios are contemplated for more complex isomer mixtures.

[0083] If, for instance, a particular enantiomer of a compound of the present invention is desired, it may be prepared by asymmetric synthesis, or by derivation with a chiral auxiliary, where the resulting diastereomeric mixture is separated and the auxiliary group cleaved to  provide the pure desired enantiomers. Alternatively, where the molecule contains a basic functional group, such as amino, or an acidic functional group, such as carboxyl, diastereomeric salts are formed with an appropriate optically-active acid or base, followed by resolution of the diastereomers thus formed by fractional crystallization or chromatographic methods well known in the art, and subsequent recovery of the pure enantiomers.

[0084] Solvates and polymorphs of the compounds of the invention are also contemplated herein. Solvates of the compounds of the present invention include, for example, hydrates.

[0085] Definitions of specific functional groups and chemical terms are described in more detail below. When a range of values is listed, it is intended to encompass each value and sub-range within the range. For example, "C1-6 alkyl" is intended to encompass, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5, and C5-6 alkyl.

[0086] As used herein, the term "alkyl" refers to a straight, branched or cyclic hydrocarbon radical consisting solely of carbon and hydrogen atoms, containing no unsaturation, having from one to ten carbon atoms (e.g., C1-10 alkyl) . Whenever it appears herein, a numerical range such as "1 to 10" refers to each integer in the given range; e.g., "1 to 10 carbon atoms" means that the alkyl group can consist of 1 carbon atom, 2 carbon atoms, 3 carbon atoms, etc., up to and including 10 carbon atoms, although the present definition also covers the occurrence of the term "alkyl" where no numerical range is designated. In some embodiments, “alkyl” can be a C1-6 alkyl group. In some embodiments, alkyl groups have 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, or 1 to 3 carbon atoms.

[0087] Representative saturated straight chain alkyls include, but are not limited to, -methyl, -ethyl, -n-propyl, -n-butyl, -n-pentyl, and -n-hexyl; while saturated branched alkyls include, but are not limited to, -isopropyl, -sec-butyl, -isobutyl, -tert-butyl, -isopentyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, 4-methylpentyl, 2-methylhexyl, 3-methylhexyl, 4-methylhexyl, 5-methylhexyl, 2, 3-dimethylbutyl, and the like. The alkyl is attached to the parent molecule by a single bond.

[0088] Unless stated otherwise in the specification, an alkyl group is optionally substituted by one or more of substituents which independently include: acyl, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, alkylaryl, cycloalkyl, aralkyl, aryl, aryloxy, amino, amido, amidino, imino, azide, carbonate, carbamate, carbonyl, heteroalkyl, heteroaryl, heteroarylalkyl, heterocycloalkyl, hydroxy, cyano, halo (F, Cl, Br, I) , haloalkoxy, haloalkyl, ester, ether, mercapto, thio, alkylthio,  arylthio, thiocarbonyl, nitro, oxo, phosphate, phosphonate, phosphinate, silyl, sulfinyl, sulfonyl, sulfonamidyl, sulfoxyl, sulfonate, urea, -Si (Ra) 3 , -ORa, -SRa, -OC (O) -Ra, -N (Ra) 2, -C (O) Ra, -C (O) ORa, -OC (O) N (Ra) 2, -C (O) N (Ra) 2, -N (Ra) C (O) ORa, -N (Ra) C (O) Ra, -N (Ra) C (O) N (Ra) 2, -N (Ra) C (NRa) N (Ra) 2, -N (Ra) S (O) tN (Ra) 2 (where t is 1 or 2) , -P (=O) (Ra) (Ra) , or -O-P (=O) (ORa) 2 where each Ra is independently hydrogen, alkyl, haloalkyl, carbocyclyl, carbocyclylalkyl, aryl, aralkyl, heterocycloalkyl, heterocycloalkylalkyl, heteroaryl or heteroarylalkyl, and each of these moieties can be optionally substituted as defined herein. In a non-limiting embodiment, a substituted alkyl can be selected from fluoromethyl, difluoromethyl, trifluoromethyl, 2-fluoroethyl, 3-fluoropropyl, hydroxymethyl, 2-hydroxyethyl, 3-hydroxypropyl, benzyl, and phenethyl.

[0089] As used herein, the term “heteroatom” means one or more of oxygen, sulfur, nitrogen, or phosphorus (including, any oxidized form of nitrogen, sulfur, or phosphorus; the quaternized form of any basic nitrogen or; a substitutable nitrogen of a heterocyclic ring, for example N (as in 3, 4-dihydro-2H-pyrrolyl) , NH (as in pyrrolidinyl) or NR+ (as in N-substituted pyrrolidinyl) ) .

[0090] As used herein, the term “halogen” refers to fluorine (F) , chlorine (Cl) , bromine (Br) , or iodine (I) . As used herein, the term "halide" or "halo" , means fluoro, chloro, bromo or iodo. The terms "haloalkyl, " "haloalkenyl, " "haloalkynyl" and "haloalkoxy" include alkyl, alkenyl, alkynyl and alkoxy structures that are substituted with one or more halo groups or with combinations thereof. For example, the terms "fluoroalkyl" and "fluoroalkoxy" include haloalkyl and haloalkoxy groups, respectively, in which the halo is fluorine, such as, but not limited to, trifluoromethyl, difluoromethyl, 2, 2, 2-trifluoroethyl, 1-fluoromethyl-2-fluoroethyl, and the like. Each of the alkyl, alkenyl, alkynyl and alkoxy groups are as defined herein and can be optionally further substituted as defined herein.

[0091] As used herein, the terms "aromatic" or "aryl" refer to a radical with 6 to 14 ring atoms (e.g., C6-14 aromatic or C6-14 aryl) that has at least one ring having a conjugated pi electron system which is carbocyclic (e.g., phenyl, fluorenyl, and naphthyl) . In some embodiments, the aryl is a C6-10 aryl group. For example, bivalent radicals formed from substituted benzene derivatives and having the free valences at ring atoms are named as substituted phenylene radicals. In other embodiments, bivalent radicals derived from univalent polycyclic hydrocarbon radicals whose names end in"-yl" by removal of one hydrogen atom from the carbon atom with the free valence are named by adding "-idene" to the name of the corresponding univalent  radical, e.g., a naphthyl group with two points of attachment is termed naphthylidene. Whenever it appears herein, a numerical range such as "6 to 14 aryl" refers to each integer in the given range; e.g., "6 to 14 ring atoms" means that the aryl group can consist of 6 ring atoms, 7 ring atoms, etc., up to and including 14 ring atoms. The term includes monocyclic or fused-ring polycyclic (i.e., rings which share adjacent pairs of ring atoms) groups. Polycyclic aryl groups include bicycles, tricycles, tetracycles, and the like. In a multi-ring group, only one ring is required to be aromatic, so groups such as indanyl are encompassed by the aryl definition. Non-limiting examples of aryl groups include phenyl, phenalenyl, naphthalenyl, tetrahydronaphthyl, phenanthrenyl, anthracenyl, fluorenyl, indolyl, indanyl, and the like. Unless stated otherwise in the specification, an aryl moiety can be optionally substituted by one or more substituents which independently include: acyl, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, alkylaryl, cycloalkyl, aralkyl, aryl, aryloxy, amino, amido, amidino, imino, azide, carbonate, carbamate, carbonyl, heteroalkyl, heteroaryl, heteroarylalkyl, heterocycloalkyl, hydroxy, cyano, halo, haloalkoxy, haloalkyl, ester, ether, mercapto, thio, alkylthio, arylthio, thiocarbonyl, nitro, oxo, phosphate, phosphonate, phosphinate, silyl, sulfinyl, sulfonyl, sulfonamidyl, sulfoxyl, sulfonate, urea, -Si (Ra) 3 , -ORa, -SRa, -OC (O) -Ra, -N (Ra) 2, -C (O) Ra, -C (O) ORa, -OC (O) N (Ra) 2, -C (O) N (Ra) 2, -N (Ra) C (O) ORa, -N (Ra) C (O) Ra, -N (Ra) C (O) N (Ra) 2, -N (Ra) C (NRa) N (Ra) 2, -N (Ra) S (O) tN (Ra) 2 (where t is 1 or 2) , -P (=O) (Ra) (Ra) , or -O-P (=O) (ORa) 2 where each Ra is independently hydrogen, alkyl, haloalkyl, carbocyclyl, carbocyclylalkyl, aryl, aralkyl, heterocycloalkyl, heterocycloalkylalkyl, heteroaryl or heteroarylalkyl, and each of these moieties can be optionally substituted as defined herein.

[0092] As used herein, the terms "TLR7 and / or TLR8 ligand, " "ligand for TLR7 and / or TLR8, " and "TLR7 and / or signaling agonist" refer to a molecule, other than a compound disclosed herein, that interacts directly or indirectly with TLR7 and / or TLR8 through a TLR7 and / or TLR8 domain other than a TLR8 domain, and induces TLR7-and / or TLR8-mediated signaling. In certain embodiments, a TLR7 and / or TLR8 ligand is a natural ligand, i.e., a TLR7 and / or TLR8 ligand that is found in nature. In certain embodiments, a TLR7 and / or TLR8 ligand refers to a molecule other than a natural ligand of TLR7 and / or TLR8, e.g., a molecule prepared by human activity.

[0093] As used herein, the term “modulator” is defined as a compound that binds to and  / or activates or inhibits the target with measurable affinity, or directly or indirectly affecting the normal regulation of the receptor activity. In certain embodiments, a modulator has an EC50  and / or binding constant of less about 50 μM, less than about 1 μM, less than about 500 nM, less than about 100 nM, or less than about 10 nM.

[0094] As used herein, the term "agonist" refers to a compound that, in combination with a receptor (e.g., a TLR) , can produce a cellular response. An agonist may be a ligand that directly binds to the receptor. Alternatively, an agonist may combine with a receptor indirectly by, for example, (a) forming a complex with another molecule that directly binds to the receptor, or (b) otherwise resulting in the modification of another compound so that the other compound directly binds to the receptor. An agonist may be referred to as an agonist of a particular TLR (e.g., a TLR7 and / or TLR8 agonist) .

[0095] As used herein, the term "antagonist" refers to a compound that competes with an agonist or inverse agonist for binding to a receptor, thereby blocking the action of an agonist or inverse agonist on the receptor. However, an antagonist has no effect on constitutive receptor activity. More specifically, an antagonist is a compound that inhibits the activity of TLR7 or TLR8 at the TLR7 or TLR8 receptor, respectively.

[0096] As used herein, the term "inhibit" refers to any measurable reduction of biological activity. Thus, as used herein, "inhibit" or "inhibition" may be referred to as a percentage of a normal level of activity.

[0097] As used herein, the term “antigen” as used herein is meant any substance that causes the immune system to produce antibodies or specific cell-mediated immune responses against it. A disease associated antigen is any substance that is associated with any disease that causes the immune system to produce antibodies or a specific-cell mediated response against it. An antigen is capable of being recognized by the immune system and / or being capable of inducing a humoral immune response and / or cellular immune response leading to the activation of B-and / or T-lymphocytes. An antigen can have one or more epitopes (B-and / or T-cell epitopes) . An antigen will preferably react, typically in a highly selective manner, with its corresponding antibody or TCR and not with the multitude of other antibodies or TCRs which may be evoked by other antigens. Antigens as used herein may also be mixtures of several individual antigens.

[0098] As used herein, the term “antibody” refers to molecules that are capable of binding an epitope or antigenic determinant. The term is meant to include whole antibodies and antigen-binding fragments thereof. The term encompasses a monoclonal antibody, polyclonal antibody, antibody fragment, Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab') 2, Fv, single chain Fv ( "scFv" ) , diabody, linear  antibody, bispecific antibody, multi-specific antibody, chimeric antibody, humanized antibody, human antibody, or fusion protein comprising the antigen-binding portion of an antibody. Antibodies can be from any animal origin. Preferably, the antibodies are mammalian, e.g., human, murine, rabbit, goat, guinea pig, camel, horse and the like, or other suitable animals. Antibodies may recognize polypeptide or polynucleotide antigens. The term includes active fragments, including for example, an antigen binding fragment of an immunoglobulin, a variable and / or constant region of a heavy chain, a variable and / or constant region of a light chain, a complementarity determining region (cdr) , and a framework region. The terms include polyclonal and monoclonal antibody preparations, as well as preparations including hybrid antibodies, altered antibodies, chimeric antibodies, hybrid antibody molecules, F (ab) 2 and F (ab) fragments; Fv molecules (for example, noncovalent heterodimers) , dimeric and trimeric antibody fragment constructs; minibodies, humanized antibody molecules, and any functional fragments obtained from such molecules, wherein such fragments retain specific binding.

[0099] As used herein, the term “antigen binding fragment” refers to one or more portions of an antibody that retain the ability to specifically interact with, e.g., by binding, steric hindrance, stabilizing / destabilizing, spatial distribution, an epitope of an antigen.

[0100] Examples of binding fragments include, but are not limited to, single-chain Fvs (scFv) , disulfide-linked Fvs (sdFv) , Fab fragments, F (ab') fragments, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH1 domains; a F (ab) 2 fragment, a bivalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; a Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; a Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of an antibody; a dAb fragment (Ward et al. 1989 Nature 341: 544-546, ) , which consists of a VH domain; and an isolated complementarity determining region (CDR) , or other epitope-binding fragments of an antibody.

[0101] Additionally, the two domains of the Fv fragment, VL and VH can be joined using recombinant methods by a synthetic linker that enables them to be made as a single protein chain in which the VL and VH regions pair to form monovalent molecules. (known as single chain Fv ( "scFv" ) ; see, e.g., Bird et al., 1988 Science 242: 423-426; and Huston et al. 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879-5883. ) Such single chain antibodies are also intended to be encompassed within the term “antigen binding fragment. ” These antigen binding fragments are obtained using  conventional techniques known to those of skill in the art, and the fragments are screened for utility in the same manner as are intact antibodies.

[0102] Antigen binding fragments can also be incorporated into single domain antibodies, maxibodies, minibodies, nanobodies, intrabodies, diabodies, triabodies, tetrabodies, v-NAR and bis-scFv. (See, e.g., Hollinger and Hudson, 2005 Nature Biotechnology 23: 1 126-1136. ) Antigen binding fragments can be grafted into scaffolds based on polypeptides such as fibronectin type III (Fn3) . (See, e.g., U.S. Pat. No. 6,703,199, which describes fibronectin polypeptide monobodies. ) Antigen binding fragments can be incorporated into single chain molecules comprising a pair of tandem Fv segments (VH-CH1-VH-CH1) which, together with complementary light chain polypeptides, form a pair of antigen binding regions. (Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8: 1057-1062; U.S. Pat. No. 5,641,870. )

[0103] As used herein, the term “bispecific antibody” or “bispecific” refers to an antibody, typically a monoclonal antibody, having binding specificities for at least two different antigenic epitopes. The epitopes can be from the same antigen or from two different antigens. Methods for making bispecific antibodies are known in the art. For example, bispecific antibodies can be produced recombinantly using the co-expression of two immunoglobulin heavy chain / light chain pairs. Alternatively, bispecific antibodies can be prepared using chemical linkage. Bispecific antibodies include bispecific antibody fragments. (See, e.g., Milstein et al. 1983 Nature 305: 537-39; Brennan et al. 1985 Science 229: 81; Hollinger et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-48; Gruber et al. 1994 J. Immunol. 152: 5368-74. )

[0104] As used herein, the term “chimeric antibody” or “chimeric” refers to antibodies in which a portion of the heavy and / or light chain is identical with or homologous to corresponding sequences in antibodies derived from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, while the remainder of the chain (s) is identical with or homologous to corresponding sequences in antibodies derived from another species or belonging to another antibody class or subclass, as well as fragments of such antibodies, so long as they specifically bind the target antigen and / or exhibit the desired biological activity.

[0105] As used herein, the term “human antibody” refers to antibodies having variable regions in which both the framework and CDR regions are derived from sequences of human origin. Furthermore, if the antibody contains a constant region, the constant region also is derived from such human sequences, e.g., human germline sequences, or mutated versions of  human germline sequences or antibody containing consensus framework sequences derived from human framework sequences analysis, for example, as described in Knappik et al. 2000 J. Mol. Biol. 296: 57-86) . Human antibodies may include amino acid residues not encoded by human sequences, e.g., mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro or by somatic mutation in vivo, or a substitution to promote stability or manufacturing.

[0106] As used herein, the term “humanized antibody” refers to antibodies that contain sequences from non-human (e.g., murine) antibodies as well as human antibodies. Such antibodies are chimeric antibodies which contain minimal sequence derived from non-human immunoglobulin. In general, humanized antibodies comprise substantially all of at least one, and typically two, variable domains, in which all or substantially all of the hypervariable loops correspond to those of a non-human immunoglobulin and all or substantially all of the FR regions are those of a human immunoglobulin sequence. The humanized antibody optionally also comprises at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc) , typically that of a human immunoglobulin. (See e.g., Cabilly U.S. Pat. No. 4,816,567; Queen et al. 1989 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033; ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH, Oxford University Press 1996. )

[0107] As used herein, the term “monoclonal antibody” , refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies comprising the population are identical except for possible naturally occurring mutations that may be present in minor amounts. Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic epitope. In contrast, conventional (polyclonal) antibody preparations typically include a multitude of antibodies directed against (or specific for) different epitopes. “Monoclonal” indicates the character of the antibody as being obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and is not to be construed as requiring production of the antibody by any particular method. For example, the monoclonal antibodies to be used in accordance with the present invention may be made by various methods known in the art, including the hybridoma method first described by Kohler et al. 1975 Nature 256: 495, or may be made by recombinant DNA methods (see, e.g., U.S. Pat. No. 4,816,567) . “Monoclonal antibodies” may also be isolated from phage antibody libraries using the techniques described in Clackson et al. 1991 Nature 352: 624-628 and Marks et al. 1991 J. Mol. Biol. 222: 581-597, for example. These monoclonal  antibodies will usually bind with at least a Kd of about 1 μM, more usually at least about 300 nM, typically at least about 30 nM, preferably at least about 10 nM.

[0108] As used herein, the term “cleavable” linker refers to a linker or linker component that connects two moieties by covalent connections, but breaks down to sever the covalent connection between the moieties under physiologically relevant conditions. Typically, a cleavable linker is severed in vivo more rapidly in an intracellular environment than when outside a cell, causing release of a payload to preferentially occur inside the targeted cell. Cleavage may be enzymatic or non-enzymatic. A payload is typically released from an antibody without degrading the antibody. Cleavage may leave some portion of a linker or linker component attached to the payload, or it may release the payload without any residual part or component of the linker (i.e., traceless release) .

[0109] As used herein, the term “non-cleavable” linker refers to a linker or linker component that is not especially susceptible to breaking down under physiological conditions, i.e., it is at least as stable as the antibody or antigen binding fragment portion of the immunoconjugate. Such linkers are sometimes referred to as “stable, ” meaning they are sufficiently resistant to degradation to keep the payload connected to the antigen binding moiety until the antigen binding moiety is itself at least partially degraded. In such a case, the degradation of Ab precedes cleavage of the linker in vivo. Degradation of the antibody portion of an immunoconjugate having a stable or non-cleavable linker may leave some or all of the linker, and one or more amino acid groups from an antibody, attached to the payload or drug moiety that is delivered in vivo.

[0110] As used herein, the terms “disease” , “condition” or “disorder” are used interchangeably herein and refer to a pathological condition, for example, one that can be identified by symptoms or other identifying factors as diverging from a healthy or a normal state. The term “disease” includes disorders, syndromes, conditions, and injuries. Diseases include, but are not limited to, proliferative, inflammatory, immune, metabolic, infectious, and ischemic diseases.

[0111] As used herein, the term “in need of” a treatment refers to a subject that would benefit biologically, medically or in quality of life from such a treatment.

[0112] As used herein, the term “effective amount” of an active agent refers to an amount sufficient to elicit the desired biological response. As will be appreciated by those of ordinary  skill in this art, the effective amount of a compound of the invention may vary depending on such factors as the desired biological endpoint, the pharmacokinetics of the compound, the disease being treated, the mode of administration, and the patient.

[0113] As used herein, the terms “treatment” or “treating” a disease or disorder refers to a method of reducing, delaying or ameliorating such a condition before or after it has occurred. Treatment may be directed at one or more effects or symptoms of a disease and / or the underlying pathology. The treatment can be any reduction and can be, but is not limited to, the complete ablation of the disease or the symptoms of the disease. As compared with an equivalent untreated control, such reduction or degree of prevention is at least 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 95%, or 100%as measured by any standard technique.

[0114] As used herein, the terms “prevent” , “preventing” , or “prevention” refer to a method for precluding, delaying, averting, or stopping the onset, incidence, severity, or recurrence of a disease or condition. For example, a method is considered to be a prevention if there is a reduction or delay in onset, incidence, severity, or recurrence of a disease or condition or one or more symptoms thereof in a subject susceptible to the disease or condition as compared to a subject not receiving the method. The disclosed method is also considered to be a prevention if there is a reduction or delay in onset, incidence, severity, or recurrence of osteoporosis or one or more symptoms of a disease or condition in a subject susceptible to the disease or condition after receiving the method as compared to the subject's progression prior to receiving treatment. Thus, the reduction or delay in onset, incidence, severity, or recurrence of osteoporosis can be about a 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%, or any amount of reduction in between.

[0115] As used herein, a "pharmaceutically acceptable form" of a disclosed compound includes, but is not limited to, pharmaceutically acceptable salts, esters, hydrates, solvates, polymorphs, isomers, prodrugs, and isotopically labeled derivatives thereof. In one embodiment, a "pharmaceutically acceptable form" includes, but is not limited to, pharmaceutically acceptable salts, esters, prodrugs and isotopically labeled derivatives thereof. In some embodiments, a "pharmaceutically acceptable form" includes, but is not limited to, pharmaceutically acceptable isomers and stereoisomers, prodrugs and isotopically labeled derivatives thereof.

[0116] In certain embodiments, the pharmaceutically acceptable form is a pharmaceutically acceptable salt. As used herein, the term "pharmaceutically acceptable salt" refers to those salts which are, within the scope of sound medical judgment, suitable for use in contact with the  tissues of subjects without undue toxicity, irritation, allergic response and the like, and are commensurate with a reasonable benefit / risk ratio. Pharmaceutically acceptable salts are well known in the art. For example, Berge et al. describes pharmaceutically acceptable salts in detail in J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66: 1-19. Pharmaceutically acceptable salts of the compounds provided herein include those derived from suitable inorganic and organic acids and bases. Examples of pharmaceutically acceptable, nontoxic acid addition salts are salts of an amino group formed with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid, sulfuric acid and perchioric acid or with organic acids such as acetic acid, oxalic acid, maleic acid, tartaric acid, citric acid, succinic acid or malonic acid or by using other methods used in the art such as ion exchange. Other pharmaceutically acceptable salts include adipate, alginate, ascorbate, aspartate, benzenesulfonate, besylate, benzoate, bisulfate, borate, butyrate, camphorate, camphorsulfonate, citrate, cyclopentanepropionate, digluconate, dodecylsulfate, ethanesulfonate, formate, fumarate, glucoheptonate, glycerophosphate, gluconate, hemisulfate, heptanoate, hexanoate, hydroiodide, 2-hydroxy-ethanesulfonate, lactobionate, lactate, laurate, lauryl sulfate, malate, maleate, malonate, methanesulfonate, 2-naphthalenesulfonate, nicotinate, nitrate, oleate, oxalate, palmitate, pamoate, pectinate, persulfate, 3-phenylpropionate, phosphate, picrate, pivalate, propionate, stearate, succinate, sulfate, tartrate, thiocyanate, p-toluenesulfonate, undecanoate, valerate salts, and the like. In some embodiments, organic acids from which salts can be derived include, for example, acetic acid, propionic acid, glycolic acid, pyruvic acid, oxalic acid, lactic acid, trifluoracetic acid, maleic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, salicylic acid, and the like.

[0117] The salts can be prepared in situ during the isolation and purification of the disclosed compounds, or separately, such as by reacting the free base or free acid of a parent compound with a suitable base or acid, respectively. Pharmaceutically acceptable salts derived from appropriate bases include alkali metal, alkaline earth metal, ammonium and N+ (C1-4alkyl) 4 salts. Representative alkali or alkaline earth metal salts include sodium, lithium, potassium, calcium, magnesium, iron, zinc, copper, manganese, aluminum, and the like. Further pharmaceutically acceptable salts include, when appropriate, nontoxic ammonium, quaternary ammonium, and amine cations formed using counterions such as halide, hydroxide, carboxylate, sulfate,  phosphate, nitrate, lower alkyl sulfonate and aryl sulfonate. Organic bases from which salts can be derived include, for example, primary, secondary, and tertiary amines, substituted amines, including naturally occurring substituted amines, cyclic amines, basic ion exchange resins, and the like, such as isopropylamine, trimethylamine, diethylamine, triethylamine, tripropylamine, and ethanolamine. In some embodiments, the pharmaceutically acceptable base addition salt can be chosen from ammonium, potassium, sodium, calcium, and magnesium salts.

[0118] In certain embodiments, the pharmaceutically acceptable form is a "solvate" (e.g., a hydrate) . As used herein, the term "solvate" refers to compounds that further include a stoichiometric or non-stoichiometric amount of solvent bound by non-covalent intermolecular forces. The solvate can be of a disclosed compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Where the solvent is water, the solvate is a "hydrate" . Pharmaceutically acceptable solvates and hydrates are complexes that, for example, can include 1 to about 100, or 1 to about 10, or 1 to about 2, about 3 or about 4, solvent or water molecules. It will be understood that the term "compound" as used herein encompasses the compound and solvates of the compound, as well as mixtures thereof.

[0119] In certain embodiments, the pharmaceutically acceptable form is a prodrug. As used herein, the term "prodrug" (or “pro-drug” ) refers to compounds that are transformed in vivo to yield a disclosed compound or a pharmaceutically acceptable form of the compound. A prodrug can be inactive when administered to a subject, but is converted in vivo to an active compound, for example, by hydrolysis (e.g., hydrolysis in blood) . In certain cases, a prodrug has improved physical and / or delivery properties over the parent compound. Prodrugs can increase the bioavailability of the compound when administered to a subject (e.g., by permitting enhanced absorption into the blood following oral administration) or which enhance delivery to a biological compartment of interest (e.g., the brain or lymphatic system) relative to the parent compound. Exemplary prodrugs include derivatives of a disclosed compound with enhanced aqueous solubility or active transport through the gut membrane, relative to the parent compound.

[0120] The prodrug compound often offers advantages of solubility, tissue compatibility or delayed release in a mammalian organism (see, e.g., Bundgard, H., Design of Prodrugs (1985) , pp. 7-9, 21-24 (Elsevier, Amsterdam) . A discussion of prodrugs is provided in Higuchi, T., et al., "Pro-drugs as Novel Delivery Systems, " A.C.S. Symposium Series, Vol. 14, and in  Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, both of which are incorporated in full by reference herein. Exemplary advantages of a prodrug can include, but are not limited to, its physical properties, such as enhanced water solubility for parenteral administration at physiological pH compared to the parent compound, or it can enhance absorption from the digestive tract, or it can enhance drug stability for long-term storage.

[0121] Prodrugs commonly known in the art include well-known acid derivatives, such as, for example, esters prepared by reaction of the parent acids with a suitable alcohol, amides prepared by reaction of the parent acid compound with an amine, basic groups reacted to form an acylated base derivative, etc. Of course, other prodrug derivatives may be combined with other features disclosed herein to enhance bioavailability. As such, those of skill in the art will appreciate that certain of the presently disclosed compounds having free amino, arnido, hydroxy or carboxylic groups can be converted into prodrugs. Prodrugs include compounds having an amino acid residue, or a polypeptide chain of two or more (e.g., two, three or four) amino acid residues which are covalently joined through peptide bonds to free amino, hydroxy or carboxylic acid groups of the presently disclosed compounds. The amino acid residues include the 20 naturally occurring amino acids commonly designated by three letter symbols and also include 4-hydroxyproline, hydroxylysine, demosine, isodemosine, 3-methylhistidine, norvalin, beta-alanine, gamma-aminobutyric acid, citrulline homocysteine, homoserine, ornithine and methionine sulfone. Prodrugs also include compounds having a carbonate, carbamate, amide or alkyl ester moiety covalently bonded to any of the above substituents disclosed herein.

[0122] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable” excipient, carrier, or diluent refers to a pharmaceutically acceptable material, composition or vehicle, such as a liquid or solid filler, diluent, excipient, solvent or encapsulating material, involved in carrying or transporting the subject pharmaceutical agent from one organ, or portion of the body, to another organ, or portion of the body. Each carrier must be "acceptable" in the sense of being compatible with the other ingredients of the formulation and not injurious to the patient. Some examples of materials which can serve as pharmaceutically-acceptable carriers include: sugars, such as lactose, glucose and sucrose; starches, such as corn starch and potato starch; cellulose, and its derivatives, such as sodium carboxymethyl cellulose, ethyl cellulose and cellulose acetate; powdered tragacanth; malt; gelatin; talc; excipients, such as cocoa butter and suppository waxes;  oils, such as peanut oil, cottonseed oil, safflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil and soybean oil; glycols, such as propylene glycol; polyols, such as glycerin, sorbitol, mannitol and polyethylene glycol; esters, such as ethyl oleate and ethyl laurate; agar; buffering agents, such as magnesium hydroxide and aluminum hydroxide; alginic acid; pyrogen-free water; isotonic saline; Ringer's solution; ethyl alcohol; phosphate buffer solutions; and other non-toxic compatible substances employed in pharmaceutical formulations. Wetting agents, emulsifiers and lubricants, such as sodium lauryl sulfate, magnesium stearate, and polyethylene oxide-polypropylene oxide copolymer as well as coloring agents, release agents, coating agents, sweetening, flavoring and perfuming agents, preservatives and antioxidants can also be present in the compositions.

[0123] As used herein, the terms “isolated” or “purified” refer to a material that is substantially or essentially free from components that normally accompany it in its native state. Purity and homogeneity are typically determined using analytical chemistry techniques such as polyacrylamide gel electrophoresis or high-performance liquid chromatography.

[0124] As used herein, the term “subject” refers to any animal (e.g., a mammal) , including, but not limited to humans, non-human primates, rodents, and the like, which is to be the recipient of a particular treatment. Typically, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably herein in reference to a human subject.

[0125] As used herein, the term “low dosage” refers to at least 5%less (e.g., at least 10%, 20%, 50%, 80%, 90%, or even 95%) than the lowest standard recommended dosage of a particular compound formulated for a given route of administration for treatment of any human disease or condition. For example, a low dosage of an agent that is formulated for administration by inhalation will differ from a low dosage of the same agent formulated for oral administration.

[0126] As used herein, the term “high dosage” is meant at least 5% (e.g., at least 10%, 20%, 50%, 100%, 200%, or even 300%) more than the highest standard recommended dosage of a particular compound for treatment of any human disease or condition.

[0127] Isotopically-labeled compounds are also within the scope of the present disclosure. As used herein, an "isotopically-labeled compound" or "isotope derivative" refers to a presently disclosed compound including pharmaceutical salts and prodrugs thereof, each as described herein, in which one or more atoms are replaced by an atom having an atomic mass or mass number different from the atomic mass or mass number usually found in nature. Examples of  isotopes that can be incorporated into compounds presently disclosed include isotopes of hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, phosphorous, fluorine and chlorine, such as 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F, and 36Cl, respectively.

[0128] By isotopically-labeling the presently disclosed compounds, the compounds may be useful in drug and / or substrate tissue distribution assays. Tritiated (3H) and carbon-14 (14C) labeled compounds are particularly preferred for their ease of preparation and detectability. Further, substitution with heavier isotopes such as deuterium (2H) can afford certain therapeutic advantages resulting from greater metabolic stability, for example increased in vivo half-life or reduced dosage requirements and, hence, may be preferred in some circumstances. Isotopically labeled compounds presently disclosed, including pharmaceutical salts, esters, and prodrugs thereof, can be prepared by any means known in the art. Benefits may also be obtained from replacement of normally abundant 12C with 13C. (See, WO 2007 / 005643, WO 2007 / 005644, WO 2007 / 016361, and WO 2007 / 016431. )

[0129] For example, deuterium (2H) can be incorporated into a compound disclosed herein for the purpose in order to manipulate the oxidative metabolism of the compound by way of the primary kinetic isotope effect. The primary kinetic isotope effect is a change of the rate for a chemical reaction that results from exchange of isotopic nuclei, which in turn is caused by the change in ground state energies necessary for covalent bond formation after this isotopic exchange. Exchange of a heavier isotope usually results in a lowering of the ground state energy for a chemical bond and thus causes a reduction in the rate in rate-limiting bond breakage. If the bond breakage occurs in or in the vicinity of a saddle-point region along the coordinate of a multi-product reaction, the product distribution ratios can be altered substantially. For explanation: if deuterium is bonded to a carbon atom at a non-exchangeable position, rate differences of kM / kD = 2-7 are typical. If this rate difference is successfully applied to a compound disclosed herein that is susceptible to oxidation, the profile of this compound in vivo can be drastically modified and result in improved pharmacokinetic properties.

[0130] When discovering and developing therapeutic agents, the person skilled in the art is able to optimize pharmacokinetic parameters while retaining desirable in vitro properties. It is reasonable to assume that many compounds with poor pharmacokinetic profiles are susceptible to oxidative metabolism. In vitro liver microsomal assays currently available provide valuable information on the course of oxidative metabolism of this type, which in turn permits the rational  design of deuterated compounds of those disclosed herein with improved stability through resistance to such oxidative metabolism. Significant improvements in the pharmacokinetic profiles of compounds disclosed herein are thereby obtained, and can be expressed quantitatively in terms of increases in the in vivo half-life (t / 2) , concen-tra-tion at maximum therapeutic effect (Cmax) , area under the dose response curve (AUC) , and F; and in terms of reduced clearance, dose and materials costs.

[0131] The following is intended to illustrate the above: a compound which has multiple potential sites of attack for oxidative metabolism, for example benzylic hydrogen atoms and hydrogen atoms bonded to a nitrogen atom, is prepared as a series of analogues in which various combinations of hydrogen atoms are replaced by deuterium atoms, so that some, most or all of these hydrogen atoms have been replaced by deuterium atoms. Half-life determinations enable favorable and accurate determination of the extent of the extent to which the improvement in resistance to oxidative metabolism has improved. In this way, it is determined that the half-life of the parent compound can be extended by up to 100%as the result of deuterium-hydrogen exchange of this type.

[0132] Deuterium-hydrogen exchange in a compound disclosed herein can also be used to achieve a favorable modification of the metabolite spectrum of the starting compound in order to diminish or eliminate undesired toxic metabolites. For example, if a toxic metabolite arises through oxidative carbon-hydrogen (C-H) bond cleavage, it can reasonably be assumed that the deuterated analogue will greatly diminish or eliminate production of the unwanted metabolite, even if the particular oxidation is not a rate-determining step. Further information on the state of the art with respect to deuterium-hydrogen exchange may be found, for example in Hanzlik et al., J. Org. Chem. 55, 3992-3997, 1990, Reider et al., J. Org. Chem. 52, 3326-3334, 1987, Foster, Adv. Drug Res. 14, 1-40, 1985, Gillette et al, Biochemistry 33 (10) 2927-2937, 1994, and Jarman et al. Carcinogenesis 16 (4) , 683-688, 1993.

[0133] Compounds of the present invention are, subsequent to their preparation, preferably isolated and purified to obtain a composition containing an amount by weight equal to or greater than 95% ( “substantially pure” ) , which is then used or formulated as described herein. In certain embodiments, the compounds of the present invention are more than 99%pure.

[0134] Combinations of substituents and variables envisioned by this invention are only those that result in the formation of stable compounds. The term “stable” , as used herein, refers  to compounds which possess stability sufficient to allow manufacture and which maintains the integrity of the compound for a sufficient period of time to be useful for the purposes detailed herein (e.g., therapeutic or prophylactic administration to a subject) .

[0135] The recitation of a listing of chemical groups in any definition of a variable herein includes definitions of that variable as any single group or combination of listed groups. The recitation of an embodiment for a variable herein includes that embodiment as any single embodiment or in combination with any other embodiments or portions thereof.Detailed Description of the Invention

[0136] The invention provides novel multivalent linkers that allow improved drug loading and fine-tune drug of DAR and multiplexed loading of two or more distinct bioactive agents in an ADC. The invention additionally provides pharmaceutical compositions and methods of therapeutic treatment for certain diseases or conditions using ADCs built on the multivalent linker platform disclosed herein. The invention further provides methods of making such multivalent linkers, linker-drug conjugates, and ADCs, as well as methods for modifying or fine-tuning DARs thereof.

[0137] By way of an example to illustrate the invention, 2-azido-2-deoxy-D-glucose was utilized as a scaffold, the 1-, 3-, 4-, 6-OH’s were derivatized and each arm attached to a spacer. At the other end of the spacer, a drug (payload) was linked. For example, SN-38 was used as payload as a proof of concept. At a middle point of each spacer, a polyethylene glycol (PEG) (n=0 to 24) was branched out by a trivalent atom such as nitrogen. The branching points can be varied depending on the spacer design and chemistry. The PEG group is introduced to mask the hydrophobic payloads and increase solubility. From an azido group attached to the 2-azido-2-deoxy-D-glucose, a click chemistry was performed to attach a functionalized arm with variable length, where at the end of the arm, a maleimide group was placed for further conjugation chemistry to an antibody. Depending on the number of linkers an antibody is attached to and the number of drug molecules per linker unit, an ADC can be fine-tuned to have 4 to 32 drugs per antibody.

[0138] In addition to improving drug loadings, the linkers of the invention are hydrophilic by design and can help improve ADC properties such that they exhibit reduced aggregation,  improved solubility, improved ADC plasma clearance and pharmacokinetics, improved efficacy, reduced immunogenicity, and finally improved therapeutic windows.

[0139] In one aspect, the invention generally relates to an antibody-drug conjugate having the structural formula (I) :

[0140] or a pharmaceutically acceptable salt thereof,

[0141] wherein

[0142] Ab is an antigen binding moiety;

[0143] each of D1, D2, D3 and D4 is independently a drug moiety or absent;

[0144] each of L1D, L2D, L3D and L4D is independently a linker group covalently attached to D1, D2, D3 and D4, respectively, wherein optionally each of L1D, L2D, L3D and L4D independently comprises a hydrophilic group;

[0145] L5Ab is a linker group attached to Ab, wherein L5Ab optionally comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 hydrophilic groups; and

[0146] Z is O or N, wherein when Z is N, D2 is absent and L2D represents L2DA and L2DB, each is independently a hydrophilic group covalently bound to said N;

[0147] m is an integer selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8,

[0148] wherein

[0149] 0, 1, 2 or 3 of L1D-D1, L2D-D2, L3D-D3 and L4D-D4 is optionally H, a C1-3 alkyl or a hydrophilic group.

[0150] In certain embodiments of (I) , Z is O and the antibody-drug conjugate has the structural formula (IA) :

[0151] In certain embodiments of (I) and (IA) , none of L1D-D1, L2D-D2, L3D-D3 and L4D-D4 is optionally H or a C1-3 alkyl.

[0152] In certain embodiments of (I) and (IA) , L1D-D1 is R, wherein R is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IB) :

[0153] In certain embodiments of (IB) , L4D-D4 is R’ , wherein R’ is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IC) :

[0154] In certain embodiments of (IB) , wherein L2D-D2 is R” , wherein R” is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (ID) :

[0155] In certain embodiments of (I) and (IA) , each of L1D, L2D, L3D and L4D comprises a branching point and, respectively, a hydrophilic group R1h, R2h, R3h or R4h, having the structural formula (II) :

[0156] wherein L1d, L2d, L3d and L4d represents the remaining portion of L1D, L2D, L3D and L4D, respectively.

[0157] In certain embodiments of (II) , L1D-D1 is R, wherein R is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IIA) :

[0158] In certain embodiments of (IIA) , L4D-D4 is R’ , wherein R’ is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IIB) :

[0159] In certain embodiments of (IIA) , L2D-D2 is R” , wherein R” is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IIC) :

[0160] In certain embodiments of (II) - (IIC) , each of R1h, R2h, R3h and R4h, if present, comprises a polyethylene glycol group having i units of ethylene glycol, wherein i is an integer in the range of about 2 to about 16.

[0161] In certain embodiments of (II) - (IIC) , one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently comprises a di-, tri-or tetra-peptide linker.

[0162] In certain embodiments of (II) - (IIC) , one or more of L1d, L2d, L3d and L4d is independently:

[0163] wherein

[0164] k is an integer selected from 1 and 4; and

[0165] x is 1, 2, 3 or 4.

[0166] In certain embodiments of (II) - (IIC) , one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently comprises a lysine unit.

[0167] In certain embodiments of (II) - (IIC) , one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently is:

[0168] wherein

[0169] k is an integer selected from 1 and 4; and

[0170] x is 1, 2, 3 or 4.

[0171] In certain embodiments of (I) - (ID) , one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises:

[0172] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0173] In certain embodiments of (I) - (ID) , one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises:

[0174] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0175] In certain embodiments of (I) - (ID) , one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises:

[0176] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0177] In certain embodiments of (I) - (IIC) , each of D1, D2, D3 and D4, if present, is covalently attached respectively to L1d, L2d, L3d and L4d via a carbonate linkage, a carbamate linkage, or an amide linkage.

[0178] In certain embodiments of (I) , Z is N, D2 is absent and L2D represents L2DA and L2DB, having the structural formula (III) :

[0179] In certain embodiments of (I) and (III) , none of L1D-D1, L3D-D3 and L4D-D4 is optionally H or a C1-3 alkyl.

[0180] In certain embodiments of (I) and (III) , L1D-D1 is R, wherein R is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IIIA) :

[0181] In certain embodiments of (IIIA) , L4D-D4 is R’ , wherein R’ is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IB) :

[0182] In certain embodiments of (I) and (III) , each of L1D, L3D and L4D comprises a branching point and, respectively, a hydrophilic group R1h, R2h, R3h or R4h, having the structural formula (IV) :

[0183] wherein L1d, L3d and L4d represents the remaining portion of L1D, L3D and L4D, respectively.

[0184] In certain embodiments of (IV) , L1D-D1 is R, wherein R is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IVA) :

[0185] In certain embodiments of (IVA) , L4D-D4 is R’ , wherein R’ is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IVB) :

[0186] In certain embodiments of (IV) - (IVB) , each of R1h, R2h, R3h and R4h, if present, comprises a polyethylene glycol group having i units of ethylene glycol, wherein i is an integer in the range of about 2 to about 16.

[0187] In certain embodiments of (IV) - (IVB) , one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently comprises a di-, tri-or tetra-peptide linker.

[0188] In certain embodiments of (IV) - (IVB) , one or more of L1d, L3d and L4d is independently:

[0189] wherein

[0190] k is an integer selected from 1 and 4; and

[0191] x is 1, 2, 3 or 4.

[0192] In certain embodiments of (IV) - (IVB) , one or more of L1d, L3d and L4d independently comprises a lysine unit.

[0193] In certain embodiments of (IV) - (IVB) , one or more of L1d, L3d and L4d independently is:

[0194] wherein

[0195] k is an integer selected from 1 and 4; and

[0196] x is 1, 2, 3 or 4.

[0197] In certain embodiments of (III) - (IIIB) , one or more of L1D, L3D and L4D, if present, comprises:

[0198] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0199] In certain embodiments of (III) - (IIIB) , one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises:

[0200] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0201] In certain embodiments of (III) - (IIIB) , one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises:

[0202] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0203] In certain embodiments of (III) - (IVB) , each of D1, D3 and D4, if present, is covalently attached respectively to L1d, L3d and L4d via a carbonate linkage, a carbamate linkage, or an amide linkage.

[0204] In certain embodiments of (I) - (IVB) , L5Ab comprises a group selected from:

[0205] wherein *represents the attachment point to the central sugar ring of Formula (I) .

[0206] In certain embodiments of (I) - (IVB) , L5Ab is covalently attached to Ab via a thioether linkage. In certain embodiments of (I) - (IVB) , the thioether linkage comprises maleimide thioether.

[0207] In certain embodiments of (I) - (IVB) , L5Ab comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 hydrophilic groups.

[0208] In certain embodiments, L5Ab is:

[0209] wherein q is an integer selected from 1 to 6.

[0210] In certain embodiments of (I) - (IVB) , D1, D2, D3 and D4, if present, are the same.

[0211] In certain embodiments of (I) - (IVB) , D1, D2, D3 and D4, if present, are not the same.

[0212] In certain embodiments of (I) - (IVB) , D1, D2, D3 and D4, if present, represent two distinct drug moieties.

[0213] In certain embodiments of (I) - (IVB) , R1h, R2h, R3h and R4h, if present, are the same.

[0214] In certain embodiments of (I) - (IVB) , R1h, R2h, R3h and R4h, if present, are not the same.

[0215] In certain embodiments of (I) - (IVB) , each of R1h, R2h, R3h and R4h, if present, is independently (CH2-CH2O) pCH3, wherein p is an integer selected from about 4 to about 12.

[0216] In certain embodiments of (I) - (IVB) , Ab is an antibody.

[0217] In certain embodiments, Ab is a monoclonal antibody.

[0218] In certain embodiments, Ab is a chimeric antibody.

[0219] In certain embodiments, Ab is a humanized antibody.

[0220] In certain embodiments, Ab is an antibody fragment.

[0221] In certain embodiments, Ab is a peptide.

[0222] In certain embodiments of (I) - (IVB) , each of D1, D2, D3 and D4, if present, is independently selected from: chemotherapeutic agents and toxins.

[0223] In certain embodiments of (I) - (IVB) , the antibody-drug conjugate has the stereochemistry shown in Formula (V) :

[0224] Non-limiting examples of antibody-drug conjugates are provided below:

[0225] Table A

[0226] In yet another aspect, the invention generally relates to a method for making an antibody-drug conjugate of (I) - (IVB) .

[0227] In another aspect, the invention generally relates to a pharmaceutical composition comprising an antibody-drug conjugate disclosed herein.

[0228] In certain embodiments, the pharmaceutical composition is effective to treat, prevent, or reduce autoimmune disease, or a related disease or disorder. In certain embodiments, the pharmaceutical composition is effective to treat, prevent, or reduce graft rejection, or a related disease or disorder. In certain embodiments, the pharmaceutical composition is effective to treat, prevent, or reduce an allergy, or a related disease or disorder. In certain embodiments, the pharmaceutical composition is effective to treat, prevent, or reduce immunodeficiency, or a related disease or disorder. In certain embodiments, the pharmaceutical composition is effective to treat, prevent, or reduce infection, sepsis, or a related disease or disorder. In certain embodiments, the pharmaceutical composition is effective to treat, prevent, or reduce cancer, or a related disease or disorder.

[0229] In yet another aspect, the invention generally relates to a unit dosage form comprising a pharmaceutical composition of the invention.

[0230] In yet another aspect, the invention generally relates to a method for treating, reducing, or preventing a disease or disorder, comprising administering to a subject in need thereof an antibody-drug conjugate disclosed herein.

[0231] In yet another aspect, the invention generally relates to a method for modulating immune response, comprising administering to a subject in need thereof an antibody-drug conjugate disclosed herein.

[0232] In yet another aspect, the invention generally relates to use of an antibody-drug conjugate disclosed herein for treating or reducing a disease or disorder.

[0233] In yet another aspect, the invention generally relates to use of an antibody-drug conjugate disclosed herein, and a pharmaceutically acceptable excipient, carrier, or diluent, in preparation of a medicament for treating or reducing a disease or disorder.

[0234] In certain embodiments, the disease or disorder is selected from autoimmune diseases, graft rejection, allergies, immunodeficiency, infection, sepsis, cancer, or a related disease or disorder thereof. In certain embodiments, the use is to treat or reduce an autoimmune disease, or a related disease or disorder. In certain embodiments, the use is to treat or reduce graft rejection, or a related disease or disorder. In certain embodiments, the use is to treat or reduce allergy, or a related disease or disorder. In certain embodiments, the use is to treat or reduce immunodeficiency, or a related disease or disorder. In certain embodiments, the use is to treat or reduce infection and / or sepsis, or a related disease or disorder. In certain embodiments, the use is to treat or reduce cancer, or a related disease or disorder. In certain embodiments, the use is as a vaccine adjuvant.

[0235] In yet another aspect, the invention generally relates to a compound having the structural formula (VI) :

[0236] wherein

[0237] each of L1, L2, L3 and L4 is independently selected from: H, C1-3 alkyl, or (CH2) k-S-RLA, wherein RLA is a linker group comprising a reactive functional group and optionally comprises a hydrophilic group;

[0238] L5 is selected from: N3 or RLB, wherein RLB is a linker group comprising a reactive functional group and optionally comprises a hydrophilic group; and

[0239] Z is O or N, wherein when Z is N, L2 represents L2A and L2B, each is independently a hydrophilic group covalently bound to said N.

[0240] wherein

[0241] 0, 1, 2 or 3 of L1D, L2D, L3D and L4D optionally comprises a hydrophilic group.

[0242] In certain embodiments of (VI) , Z is O, having the structural formula (VIA) :

[0243] In certain embodiments of (VI) and (VIA) , L1 is R, wherein R is H or C1-3 alkyl, having the structural formula (VIB) :

[0244] In certain embodiments of (VIB) , L4 is R’ , wherein R’ is H or C1-3 alkyl, , having the structural formula (VIC) :

[0245] In certain embodiments of (VIB) , L2 is R” , wherein R” is H or C1-3 alkyl, , having the structural formula (VID) :

[0246] In certain embodiments of (VI) - (VID) , L4 is N3.

[0247] In certain embodiments of (VI) - (VID) , one or more of L1, L2, L3 and L4 if present independently comprises a di-, tri-or tetra-peptide linker.

[0248] In certain embodiments of (VI) - (VID) , one or more of L1, L2, L3 and L4 if present independently comprise:

[0249] wherein

[0250] k is an integer selected from 1 and 4; and

[0251] x is 1, 2, 3 or 4.

[0252] In certain embodiments of (VI) - (VID) , one or more of L1, L2, L3 and L4 if present independently comprises a lysine unit.

[0253] In certain embodiments of (VI) - (VID) , one or more of L1, L2, L3 and L4 independently comprises:

[0254] wherein

[0255] k is an integer selected from 1 and 4; and

[0256] x is 1, 2, 3 or 4.

[0257] In certain embodiments of (VI) - (VID) , one or more of L1, L2, L3 and L4, if present, comprises:

[0258] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0259] In certain embodiments of (VI) - (VID) , one or more of L1, L2, L3 and L4, if present, comprises:

[0260] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0261] In certain embodiments of (VI) - (VID) , one or more of L1, L2, L3 and L4, if present, comprises:

[0262] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0263] In certain embodiments of (VI) , Z is N, D2 is absent and L2 represents L2A and L2B, having the structural formula (VII) :

[0264] In certain embodiments of (VII) , L1 is R, wherein R is H or C1-3 alkyl, having the structural formula (VIIA) :

[0265] In certain embodiments of (VIIA) , L4 is R’ , wherein R’ is H or C1-3 alkyl, having the structural formula (VIIB) :

[0266] In certain embodiments of (VII) - (VIIB) , L4 is N3.

[0267] In certain embodiments of (VII) - (VIIB) , one or more of L1, L3 and L4 if present independently comprises a di-, tri-or tetra-peptide linker.

[0268] In certain embodiments of (VII) - (VIIB) , one or more of L1, L3 and L4 if present independently comprise:

[0269] wherein

[0270] k is an integer selected from 1 and 4; and

[0271] x is 1, 2, 3 or 4.

[0272] In certain embodiments of (VII) - (VIIB) , one or more of L1, L3 and L4 if present independently comprises a lysine unit.

[0273] In certain embodiments of (VII) - (VIIB) , one or more of L1, L3 and L4 independently comprises:

[0274] wherein

[0275] k is an integer selected from 1 and 4; and

[0276] x is 1, 2, 3 or 4.

[0277] In certain embodiments of (VII) - (VIIB) , one or more of L1, L3 and L4, if present, comprises:

[0278] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0279] In certain embodiments of (VII) - (VIIB) , one or more of L1, L3 and L4, if present, comprises:

[0280] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0281] In certain embodiments of (VII) - (VIIB) , one or more of L1, L3 and L4, if present, comprises:

[0282] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0283] In certain embodiments of (VII) - (VIIB) , if present each of L1, L2, L3 and L4 comprises a functional group capable of forming a carbonate linkage, a carbamate linkage, or an amide linkage.

[0284] In certain embodiments of (VI) - (VIIB) , the compound has the stereochemistry shown in Formula (V) :

[0285] Non-limiting examples of compounds include:

[0286] Table B

[0287] In yet another aspect, the invention generally relates to a method for making a compound of any (VI) - (VIIB) .

[0288] In yet another aspect, the invention generally relates to a linker-drug conjugate having the structural formula (VIII) :

[0289] wherein

[0290] each of D1, D2, D3 and D4 is independently a drug moiety or absent;

[0291] each of L1D, L2D, L3D and L4D is independently a linker group;

[0292] L5 is selected from: N3 or RLB, wherein RLB is a linker group comprising a reactive functional group and optionally comprises a hydrophilic group; and

[0293] Z is O or N, wherein when Z is N, D2 is absent and L2D represents L2DA and L2DB, each is independently a hydrophilic group covalently bound to said N.

[0294] In certain embodiments of (VIII) , Z is O, having the structural formula (VIIIA) :

[0295] In certain embodiments of (VIII) or (VIIIA) , L1D-D1 is R, wherein R is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (VIIIB) :

[0296] In certain embodiments of (VIIIB) , L4D-D4 is R’ , wherein R’ is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (VIIIC) :

[0297] In certain embodiments of (VIIIB) , wherein L2D-D2 is R” , wherein R” is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (VIIID) :

[0298] In certain embodiments of (VIII) or (VIIIA) , each of L1D, L2D, L3D and L4D comprises a branching point and, respectively, a hydrophilic group R1h, R2h, R3h or R4h, having the structural formula (IX) :

[0299] In certain embodiments of (IX) , L1D-D1 is R, wherein R is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IXA) :

[0300] In certain embodiments of (IXA) , L4D-D4 is R’ , R’ is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IXB) :

[0301] In certain embodiments of (IXA) , L2D-D2 is R” , R” is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IXC) :

[0302] In certain embodiments of (IX) - (IXC) , each of R1h, R2h, R3h and R4h, if present, comprises a polyethylene glycol group having i units of ethylene glycol, wherein i is an integer in the range of about 2 to about 16.

[0303] In certain embodiments of (IX) - (IXC) , one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently comprises a di-, tri-or tetra-peptide linker.

[0304] In certain embodiments of (IX) - (IXC) , one or more of L1d, L2d, L3d and L4d if present independently is:

[0305] wherein

[0306] k is an integer selected from 1 and 4; and

[0307] x is 1, 2, 3 or 4.

[0308] In certain embodiments of (IX) - (IXC) , one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently comprises a lysine unit.

[0309] In certain embodiments of (IX) - (IXC) , one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently is:

[0310] wherein

[0311] k is an integer selected from 1 and 4; and

[0312] x is 1, 2, 3 or 4.

[0313] In certain embodiments of (IX) - (IXC) , one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises:

[0314] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0315] In certain embodiments of (IX) - (IXC) , one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises:

[0316] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0317] In certain embodiments of (IX) - (IXC) , one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises:

[0318] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0319] In certain embodiments of (VIII) , Z is N, D2 is absent and L2D represents L2DA and L2DB, each is independently a hydrophilic group covalently bound to said N, having the structural formula (X) :

[0320] In certain embodiments of (X) , L1D-D1 is R, wherein R is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (XA) :

[0321] In certain embodiments of (XA) , L4D-D4 is R’ , wherein R’ is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (XB) :

[0322] In certain embodiments of (X) , each of L1D, L3D and L4D comprises a branching point and, respectively, a hydrophilic group R1h, R3h or R4h, having the structural formula (XI) :

[0323] In certain embodiments of (XI) , L1D-D1 is R, wherein R is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (XIA) :

[0324] In certain embodiments of (XIA) , L4D-D4 is R’ , wherein R’ is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (XIB) :

[0325] In certain embodiments of (XI) - (XIB) , each of R1h, R2h, R3h and R4h, if present, comprises a polyethylene glycol group having i units of ethylene glycol, wherein i is an integer in the range of about 2 to about 16.

[0326] In certain embodiments of (XI) - (XIB) , one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently comprises a di-, tri-or tetra-peptide linker.

[0327] In certain embodiments of (XI) - (XIB) , one or more of L1d, L3d and L4d if present independently is:

[0328] wherein

[0329] k is an integer selected from 1 and 4; and

[0330] x is 1, 2, 3 or 4.

[0331] In certain embodiments of (XI) - (XIB) , one or more of L1d, L3d and L4d independently comprises a lysine unit.

[0332] In certain embodiments of (XI) - (XIB) , one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently is:

[0333] wherein

[0334] k is an integer selected from 1 and 4; and

[0335] x is 1, 2, 3 or 4.

[0336] In certain embodiments of (XI) - (XIB) , one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises:

[0337] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0338] In certain embodiments of (XI) - (XIB) , one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises:

[0339] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0340] In certain embodiments of (XI) - (XIB) , one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises:

[0341] wherein k is an integer selected from 1 and 4.

[0342] In certain embodiments of (XI) - (XIB) , if present each of D1, D2, D3 and D4 is covalently attached respectively to L1d, L2d, L3d and L4d via a carbonate linkage, a carbamate linkage, or an amide linkage.

[0343] In certain embodiments of (X) - (XIB) , L5 comprises a group selected from:

[0344] wherein *represents the attachment point to the central sugar ring of Formula (X) .

[0345] In certain embodiments of (X) - (XIB) , L5 comprises a group selected from:

[0346] In certain embodiments of (XI) - (XIB) , L5 comprises 1-4 hydrophilic groups.

[0347] In certain embodiments of (VIII) - (XIB) , the compound has the stereochemistry shown in Formula (V) :

[0348] Non-limiting examples of linker-drug conjugates include:

[0349] Table C

[0350] In yet another aspect, the invention generally relates to an antibody-drug conjugate having the structural formula (X) :

[0351] or a pharmaceutically acceptable salt thereof,

[0352] wherein

[0353] Ab is an antigen binding moiety;

[0354] each of D1, D3, D4, D6, D7, D8 and D9 is independently a drug moiety or absent;

[0355] each of L1D, L3D, L4D, L6D, L7D, L8D and L9D is independently a linker group covalently attached to D1, D3, D4, D6, D7, D8 and D9, respectively, wherein optionally each of L1D, L2D, L3D and L4D independently comprises a hydrophilic group;

[0356] L5Ab is a linker group attached to Ab, wherein L5Ab optionally comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 hydrophilic groups; and

[0357] each of X and Z is independently a triazole group;

[0358] Y is a hydrophilic spacer group;

[0359] m is an integer selected from 1-8,

[0360] wherein

[0361] 0, 1, 2 or 3 of L1D-D1, L3D-D3, L4D-D4, L6D-D6, L7D-D7, L8D-D8 and L9D-D9 is optionally H, a C1-3 alkyl or a hydrophilic group.

[0362] In another aspect, the invention generally relates to a pharmaceutical composition comprising an antibody-drug conjugate of formula (XII) .

[0363] In yet another aspect, the invention generally relates to a method for treating, reducing, or preventing a disease or disorder, comprising administering to a subject in need thereof an antibody-drug conjugate of formula (XII) .

[0364] In yet another aspect, the invention generally relates to linker-drug conjugate having the structural formula (XI) :

[0365] wherein

[0366] each of D1, D3, D4, D6, D7, D8 and D9 is independently a drug moiety or absent;

[0367] each of L1D, L3D, L4D, L6D, L7D, L8D and L9D is independently a linker group covalently attached to D1, D3, D4, D6, D7, D8 and D9, respectively, wherein optionally each of L1D, L2D, L3D and L4D independently comprises a hydrophilic group;

[0368] L5 is selected from: N3 or RLB, wherein RLB is a linker group comprising a reactive functional group and optionally comprises a hydrophilic group; and

[0369] each of X and Z is independently a triazole group; and

[0370] Y is a hydrophilic spacer group,

[0371] wherein

[0372] 0, 1, 2 or 3 of L1D-D1, L3D-D3, L4D-D4, L6D-D6, L7D-D7, L8D-D8 and L9D-D9 is optionally H, a C1-3 alkyl or a hydrophilic group.

[0373] Suitable D1, D3, D4, D6, D7, D8 and D9 and L1D, L3D, L4D, L6D, L7D, L8D and L9D can be found in discussions herein of drug moieties and linker embodiments in connection with formula (I) . In certain embodiments, Y comprises a polyethylene glycol group having i units of ethylene glycol, wherein i is an integer in the range of about 2 to about 16.

[0374] In yet another aspect, the invention generally relates to a method for making a compound of (VIII) - (XIII) .

[0375] The term “drug” or “drug moiety” (D) , as used herein, refers to a biologically active agent and can be selected from chemotherapeutic agents and toxins. Each “drug” , “drug moiety” or “D” maybe independently selected from:

[0376] (a) “drug” of particular interest in this invention are the camptothecin derivatives and metabolites (SN-38, Deruxtecan (Dxd) , Exatecan, MMAE, etc) . Others includes diphtheria toxin, botulium toxin, tetanus toxin, dysentery toxin, cholera toxin, amanitin, o, -amanitin, amanitin derivatives, pyrrolobenzodiazepine, pyrrolobenzodiazepine derivatives, tetrodotoxin, brevetoxin, ciguatoxin, ricin, AM toxin, tubulysin, geldanamycin, maytansinoid, calicheamicin, daunomycin, doxorubicin, methotrexate, vindesine, SG2285, dolastatin, a dolastatin analog, auristatin (such as monomethylauristatin E and monomethylauristatin F) , cryptophycin, camptothecin, rhizoxin, a rhizoxin derivative, CC-1065, a CC-1065 analogue or derivative, duocarmycin, an enediyne antibiotic, esperamicin, epothilone, azonafide, aplidine, a toxoid, or a combination of any of the foregoing;

[0377] (b) erlotinib, bortezomib, fulvestrant, sutent, letrozole, imatinib mesylate, PTK787 / ZK 222584, oxaliplatin, 5-fluorouracil, leucovorin, rapamycin, lapatinib, lonafarnib, sorafenib, gefitinib, AG1478, AG1571, thiotepa, cyclophosphamide, busulfan, improsulfan, piposulfan, benzodopa, carboquone, meturedopa, uredopa, ethylenimine, altretamine, triethylenemelamine, trietylenephosphoramide, riethiylenethiophosphoramide, trimethylolomelamine, bullatacin, bullatacinone, amptothecin, topotecan, bryostatin, callystatin, CC-1065, adozelesin, carzelesin, bizelesin, cryptophycin 1, cryptophycin 8, dolastatin, duocarmycin, KW-2189, CB1-TM1, eleutherobin, pancratistatin, sarcodictyin, spongistatin, chlorambucil, chlornaphazine, cholophosphamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, melphalan, novembichin, phenesterine, prednimustine, trofosfamide, uracil mustard, carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine, ranimnustine, calicheamicin, calicheamicin gamma 1, calicheamicin omega 1, dynemicin, dynemicin A, clodronate, esperamicin, neocarzinostatin chromophore, aclacinomysins, actinomycin, antrmycin, azaserine, bleomycins, cactinomycin, carabicin, carninomycin, carzinophilin, chromomycins, dactinomycin, daunorubicin, detorubucin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, doxorubicin, morpholino-doxorubicin, cyanomorpholino-doxorubicin, 2-pyrrolinodoxorubucin, liposomal doxorubicin, deoxydoxorubicin, epirubicin, esorubicin, marcellomycin, mitomycin C, mycophenolic acid, nogalamycin, olivomycins, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin, rodorubicin, streptomigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin, 5-fluorouracil, denopterin, methotrexate, pteropterin, trimetrexate, fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamiprine, thiguanine, ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, carmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxifluridine, enocitabine, floxuridine, calusterone, dromostanolone propionate, epitiostanol, mepitiostane, testolactone, aminoglutethimide, mitotane, trilostane, folinic acid, aceglatone, aldophosphamide glycoside, aminolevulinic acid, eniluracil, amsacrine, bestrabucil, bisantrene, edatraxate, defofamine, demecolcine, diaziquone, elfornithine, elliptinium acetate, etoglucid, gallium nitrate, hydroxyurea, lentinan, lonidainine, maytansine, ansamitocins, mitoguazone, mitoxantrone, mopidanmol, nitraerine, pentostatin, phenamet, pirarubicin, losoxantrone, 2-ethylhydrazide, procarbazine, polysaccharide-k, razoxane, rhizoxin, sizofiran, spirogermanium, tenuazonic acid, triaziquone, 2, 2', 2"-trichlorotriethylamine, T-2 toxin, verracurin A, roridin A, and anguidine, urethane, vindesine, dacarbazine, mannomustine, mitobronitol, mitolactol, pipobroman, gacytosine, arabinoside, cyclophosphamide, thiotepa, paclitaxel, albumin- engineered nanoparticle formulation of paclitaxel, doxetaxel, chlorambucil, gemcitabine, 6-thioguanine, mercaptopurine, cisplatin, carboplatin, vinblastine, platinum, etoposide, ifosfamide, mitoxantrone, vincristine, vinorelbine, novantrone, teniposide, edatrexate, daunomycin, aminopterin, xeloda, ibandronate, CPT-11, topoisomerase inhibitor RFS 2000, difluoromethylornithine, retinoic acid, capecitabine, or pharmaceutically acceptable salts, solvates or acids of any of the foregoing;

[0378] (c) an affinity ligand, wherein the affinity ligand is a substrate, an inhibitor, a stimulating agent, a neurotransmitter, a radioisotope, or a combination of any of the foregoing;

[0379] (d) a radioactive label, "P, "S, a fluorescent dye, an electron dense reagent, an enzyme, biotin, streptavidin, dioxigenin, a hapten, an immunogenic protein, a nucleic acid molecule with a sequence complementary to a target, or a combination of any of the foregoing;

[0380] (e) an immunomodulatory compound, an immune-stimulating compound, such as Toll-like receptor (TLR) agonist, Stimulator of interferon genes (STING) agonists, an anti-cancer agent, an anti-viral agent, an anti-bacterial agent, an anti-fungal agent, and an anti-parasitic agent, or a combination of any of the foregoing;

[0381] (f) tamoxifen, raloxifene, droloxifene, 4-hydroxytamoxifen, trioxifene, keoxifene, LY117018, onapristone, or toremifene;

[0382] (g) 4 (5) -imidazoles, aminoglutethimide, megestrol acetate, exemestane, letrozole, or astrozole;

[0383] (h) flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide, goserelin, or troxacitabine;

[0384] (i) an aromatase inhibitor;

[0385] (j) a protein kinase inhibitor;

[0386] (k) a lipid kinase inhibitor;

[0387] (l) an antisense oligonucleotide;

[0388] (m) a ribozyme;

[0389] (n) a vaccine; and

[0390] (o) an anti-angiogenic agent.

[0391] The term “linker” , as used herein, refers to is a molecule with two or more reactive termini or a chemical moiety or group serving as a linkage between two or more other groups or chemical moieties. A linker may refer to a molecule (no open valence) that is capable of forming covalent conjugation with two or more other molecules to serve as a covalent linkage  therebetween. For example, a linker may react with a drug and / or an antibody to form a linker-drug conjugate, an antibody-linker conjugate, or an antibody-linker-drug conjugate. The term “linker” may also refer to a portion or moiety within a compound (e.g., a bivalent or trivalent group therein) that serves as a covalent linkage within said compound.

[0392] By way of example, the antibody conjugation reactive terminus of a linker molecule typically has a functional group that is capable of conjugation to the antibody through a cysteine thiol or lysine amine group on the antibody. For example, the antibody conjugation reactive terminus may have a thiol-reactive group, such as a double bond (as in maleimide) or a leaving group such as a chloro, bromo, or iodo, or an R-sulfanyl group, or an amine-reactive group such as a carboxyl group.

[0393] By way of example, the drug conjugation reactive terminus of a linker molecule typically has a functional group that is capable of conjugation to the cytotoxin through formation of an amide bond with a basic amino or carboxyl group on the cytotoxin. For example, the drug conjugation reactive terminus may have a carboxyl or basic amine group. Thus, when the term “linker” is used to describe a linkage portion or moiety within a compound, one or both of the reactive termini will be absent (such as the leaving group of the thiol-reactive group) or incomplete (such as the being only the carbonyl of the carboxylic acid) because of the formation of the bonds between the linker with an antibody and / or a drug.

[0394] The drug to antibody ratio (DAR) or drug loading may be characterized by conventional means such as UV, mass spectroscopy, ELISA assay, HIC, HPLC or electrophoresis. In exemplary embodiments, DAR ranges from about 1 to 32, 1 to 16, 1 to 12, 1 to 8, 1 to 4, 1 to 2, 2 to 32, 4 to 32, 8 to 32, 1 to 4, 4 to 8, 8 to 12, 12 to 16, 16 to 32 or about 1.

[0395] The DAR of an immunoconjugate may be controlled by various methods, including limiting the molar excess of payload-linker intermediate or linker reagent relative to the antibody; limiting the conjugation reaction time or temperature; varying reductive conditions for cysteine thiol modification; and modifying the number and positions of cysteine residues and positions of linker-payload attachments. (See, e.g., WO 2006 / 034488 A2. )

[0396] To date, numerous unique antigens have been identified and may be potentially used in antibody-based therapy as a target. Several factors are generally considered when selecting an antigen. First, the target antigen should have high expression in the tumor and no or low expression in the healthy cell. An example is the HER2 receptor, which is almost 100-fold higher  expressed in the tumor cell compared to the healthy cell. Second, the target antigen should be displayed on the surface of the tumor cell to be available to the circulated monoclonal antibody. In addition, the target antigen should possess internalization properties as it will facilitate the ADC to transport into the cell, which will in turn enhance the efficacy of cytotoxic agent. Though some studies have demonstrated that non-internalized ADC product directed against components of the tumor microenvironment can efficiently detach their drug in the extracellular space and arbitrate a potent therapeutic activity in some cases and that ADCs often induce a strong “bystander effect. ” (Strohl 2018 Protein &Cell. 9 (1) : 86-120; Damelin, et al. 2015 Pharma. Res. 32 (11) : 3494-507; Diamantis et al. 2016 British J. Cancer114 (4) : 362-7; Tipton et al. 2015 Blood 125 (12) : 1901-9; Donaghy et al. 2016 mAbs. 8 (4) : 659-71; Casi et al. 2015 Molecular Pharmaceutics 12 (6) : 1880-4. )

[0397] In general, the antibody should preferably possess target specificity and possess target binding affinity, e.g., a high binding affinity to the tumor cell-surface antigens. Additionally, the antibody should preferably possess good retention, low immunogenicity, low cross-reactivity, and appropriate linkage binding properties. (Peters, et al. 2015 Bioscience Reports 35 (4) ; Hughes B 2010 Nature Reviews Drug Discovery 9 (9) : 665-7. )

[0398] In certain embodiments, Ab is an antibody.

[0399] In certain embodiments, Ab is a monoclonal antibody.

[0400] In certain embodiments, Ab is a chimeric antibody.

[0401] In certain embodiments, Ab is a humanized antibody.

[0402] In certain embodiments, Ab is a bispecific antibody.

[0403] In certain embodiments, Ab is an antibody fragment.

[0404] In certain embodiments, Ab is a Fab fragment.

[0405] Non-limiting examples of antibodies include humanized, chimeric, or human antibody or the antigen binding fragment, which binds to one or more of receptors selected from the group consisting of: HER2, HER3, CD7, CD19, CD20, CD22, CD25, CD27, CD30, CD33, CD37, CD38, CD46, CD70, CD71, CD74, CD79b, CD123, CD138, CD142, CD166, CD205, CD228, CCR2, CA6, p-Cadherin, CEA, CEACAM5, C4.4a, DLL3, EGFR, EGFRVIII, ENPP3, PSMA, SLITRK6, STEAP1, TROP2, 5T4, SSEA4, GloboH, Gb5, STn, Tn, B7H3, BCMA, MUC1, cMet, ROR1 MSLN, FRa, CLDN18.2, CLDN6, EphA2, EphrinA, FLOR1, FGFR2, GCC, cKIT, LIV1, LY6E, MSLN, MUC16, NaPi2b, Nectin4, gpNMB, Axl and PTK7.

[0406] Antibodies and antibody fragments useful for the immunoconjugates of the invention include modified or engineered antibodies, such as an antibody modified to introduce a cysteine residue, or other reactive amino acid, including Pel, pyrrolysine, peptide tags, and non-natural amino acids, in place of at least one amino acid of the native sequence, thus providing a reactive site on the antibody or antigen binding fragment for conjugation to a cytotoxic agent.

[0407] Antibodies and antibody fragments can be readily produced by any methods known in the art, including but not limited to, recombinant expression, chemical synthesis, and enzymatic digestion of antibody tetramers, whereas full-length monoclonal antibodies can be obtained by, e.g., hybridoma or recombinant production. Recombinant expression can be from any appropriate host cells known in the art, for example, mammalian host cells, bacterial host cells, yeast host cells, insect host cells, etc. (See, e.g., Carvalho et al. 2016 “Production Processes for Monoclonal Antibodies” , DOI: 10.5772 / 64263 (https:  / / www. intechopen. com / chapters / 51512) ; Monoclonal Antibody Production, Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies, Institute for Laboratory Animal Research, National Research Council, NATIONAL ACADEMY PRESS Washington, DC 1999; Jakobovits 1998 Adv. Drug Del. Rev. 31: 33-42; Marks, et al. 1991 J. Mol. Biol. 222: 581; Cole, et al. 1985 Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy 77-96; Teng, et al. 1983 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80: 7308-7312; Kozbor, et al. 1983 Immunology Today 4: 72-79; Olsson, et al. 1982 Meth. Enzymol. 92: 3-16; U.S. Pat. No. 6,657,103 B2. )

[0408] The invention provides a method for treating, reducing, or preventing a disease or disorder, comprising administering to a subject in need thereof an antibody-drug conjugate disclosed herein.

[0409] In yet another aspect, the invention generally relates to a method for modulating immune response, comprising administering to a subject in need thereof an antibody-drug conjugate disclosed herein.

[0410] In yet another aspect, the invention generally relates to a method for modulating TLR7-and / or TLR8-mediated signaling, comprising administering to a subject in need thereof an antibody-drug conjugate disclosed herein. In yet another aspect, the invention generally relates to a method for of treating or reducing a condition or disorder treatable by modulation of TLR7-and / or TLR8-mediated cellular activities, comprising administering to a subject in need thereof an antibody-drug conjugate disclosed herein.

[0411] In certain embodiments, the disease or disorder is selected from the group consisting of:autoimmune diseases, graft rejection, allergies, immunodeficiency, infection, sepsis, cancer, and related diseases or disorders. In certain embodiments, the disease or disorder is an autoimmune disease, or a related disease or disorder. In certain embodiments, the disease or disorder is graft rejection, or a related disease or disorder. In certain embodiments, the disease or disorder is allergy, or a related disease or disorder. In certain embodiments, the disease or disorder is immunodeficiency, or a related disease or disorder. In certain embodiments, the disease or disorder is infection and / or sepsis, or a related disease or disorder. In certain embodiments, the disease or disorder is cancer, or a related disease or disorder.

[0412] Cancers of interest for treatment include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia or lymphoid malignancies. More particular examples of such cancers include squamous cell cancer (e.g., epithelial squamous cell cancer) , lung cancer including small-cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung and squamous carcinoma of the lung, cancer of the peritoneum, hepatocellular cancer, gastric orstomach cancer including gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, oral cancer, liver cancer, bladder cancer, cancer of the urinary tract, hepatoma, breast cancer including, for example, HER2 positive breast cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, endometrial or uterine carcinoma, salivary gland carcinoma, kidney or renal cancer, prostate cancer, vulval cancer, thyroid cancer, hepatic carcinoma, anal carcinoma, penile carcinoma, melanoma, multiple myeloma and B-cell lymphoma, brain cancer, head and neck cancers, and associated metastases.

[0413] Solid dosage forms for oral administration include capsules, tablets, pills, powders, and granules. In such solid dosage forms, the compounds described herein or derivatives thereof are admixed with at least one inert customary excipient (or carrier) such as sodium citrate or dicalcium phosphate or (i) fillers or extenders, as for example, starches, lactose, sucrose, glucose, mannitol, and silicic acid, (ii) binders, as for example, carboxymethylcellulose, alginates, gelatin, polyvinylpyrrolidone, sucrose, and acacia, (iii) humectants, as for example, glycerol, (iv) disintegrating agents, as for example, agar-agar, calcium carbonate, potato or tapioca starch, alginic acid, certain complex silicates, and sodium carbonate, (v) solution retarders, as for example, paraffin, (vi) absorption accelerators, as for example, quaternary ammonium  compounds, (vii) wetting agents, as for example, cetyl alcohol, and glycerol monostearate, (viii) adsorbents, as for example, kaolin and bentonite, and (ix) lubricants, as for example, talc, calcium stearate, magnesium stearate, solid polyethylene glycols, sodium lauryl sulfate, or mixtures thereof. In the case of capsules, tablets, and pills, the dosage forms may also comprise buffering agents. Solid compositions of a similar type may also be employed as fillers in soft and hard-filled gelatin capsules using such excipients as lactose or milk sugar as well as high molecular weight polyethyleneglycols, and the like. Solid dosage forms such as tablets, dragees, capsules, pills, and granules can be prepared with coatings and shells, such as enteric coatings and others known in the art.

[0414] Liquid dosage forms for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, and elixirs. In addition to the active compounds, the liquid dosage forms may contain inert diluents commonly used in the art, such as water or other solvents, solubilizing agents, and emulsifiers, such as for example, ethyl alcohol, isopropyl alcohol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propyleneglycol, 1, 3-butyleneglycol, dimethylformamide, oils, in particular, cottonseed oil, groundnut oil, corn germ oil, olive oil, castor oil, sesame oil, glycerol, tetrahydrofurfuryl alcohol, polyethyleneglycols, and fatty acid esters of sorbitan, or mixtures of these substances, and the like. Besides such inert diluents, the composition can also include additional agents, such as wetting, emulsifying, suspending, sweetening, flavoring, or perfuming agents.

[0415] Materials, compositions, and components disclosed herein can be used for, can be used in conjunction with, can be used in preparation for, or are products of the disclosed methods and compositions. It is understood that when combinations, subsets, interactions, groups, etc. of these materials are disclosed that while specific reference of each various individual and collective combinations and permutations of these compounds may not be explicitly disclosed, each is specifically contemplated and described herein. For example, if a method is disclosed and discussed and a number of modifications that can be made to a number of molecules including in the method are discussed, each and every combination and permutation of the method, and the modifications that are possible are specifically contemplated unless specifically indicated to the contrary. Likewise, any subset or combination of these is also specifically contemplated and disclosed. This concept applies to all aspects of this disclosure including, but not limited to, steps in methods using the disclosed compositions. Thus, if there are a variety of additional steps that  can be performed, it is understood that each of these additional steps can be performed with any specific method steps or combination of method steps of the disclosed methods, and that each such combination or subset of combinations is specifically contemplated and should be considered disclosed.

[0416] Compositions of the present invention are administered orally, parenterally, by inhalation spray, topically, rectally, nasally, buccally, vaginally or via an implanted reservoir. The term "parenteral" as used herein includes subcutaneous, intravenous, intramuscular, intra-articular, intra-synovial, intrasternal, intrathecal, intrahepatic, intralesional, intratumoral and intracranial injection or infusion techniques.

[0417] Pharmaceutically acceptable compositions of this invention are orally administered in any orally acceptable dosage form. Exemplary oral dosage forms are capsules, tablets, aqueous suspensions or solutions. In the case of tablets for oral use, carriers commonly used include lactose and corn starch. Lubricating agents, such as magnesium stearate, are also typically added. For oral administration in a capsule form, useful diluents include lactose and dried cornstarch. When aqueous suspensions are required for oral use, the active ingredient is combined with emulsifying and suspending agents. If desired, certain sweetening, flavoring or coloring agents are optionally also added.

[0418] Alternatively, pharmaceutically acceptable compositions of this invention are administered in the form of suppositories for rectal administration. These can be prepared by mixing the agent with a suitable non-irritating excipient that is solid at room temperature but liquid at rectal temperature and therefore will melt in the rectum to release the drug. Such materials include cocoa butter, beeswax and polyethylene glycols.

[0419] Pharmaceutically acceptable compositions of this invention are also administered topically, especially when the target of treatment includes areas or organs readily accessible by topical application, including diseases of the eye, the skin, or the lower intestinal tract. Suitable topical formulations are readily prepared for each of these areas or organs.

[0420] Topical application for the lower intestinal tract can be effected in a rectal suppository formulation (see above) or in a suitable enema formulation. Topically-transdermal patches are also used.

[0421] For topical applications, provided pharmaceutically acceptable compositions are formulated in a suitable ointment containing the active component suspended or dissolved in one  or more carriers. Exemplary carriers for topical administration of compounds of this aremineral oil, liquid petrolatum, white petrolatum, propylene glycol, polyoxyethylene, polyoxypropylene compound, emulsifying wax and water. Alternatively, provided pharmaceutically acceptable compositions can be formulated in a suitable lotion or cream containing the active components suspended or dissolved in one or more pharmaceutically acceptable carriers. Suitable carriers include, but are not limited to, mineral oil, sorbitan monostearate, polysorbate 60, cetyl esters wax, cetearyl alcohol, 2-octyldodecanol, benzyl alcohol and water.

[0422] Pharmaceutically acceptable compositions of this invention are optionally administered by nasal aerosol or inhalation. Such compositions are prepared according to techniques well-known in the art of pharmaceutical formulation and are prepared as solutions in saline, employing benzyl alcohol or other suitable preservatives, absorption promoters to enhance bioavailability, fluorocarbons, and / or other conventional solubilizing or dispersing agents.

[0423] Most preferably, pharmaceutically acceptable compositions of this invention are formulated for oral administration. Such formulations may be administered with or without food. In some embodiments, pharmaceutically acceptable compositions of this invention are administered without food. In other embodiments, pharmaceutically acceptable compositions of this invention are administered with food.

[0424] The amount of compounds of the present invention that are optionally combined with the carrier materials to produce a composition in a single dosage form will vary depending upon the host treated, the particular mode of administration. Preferably, provided compositions should be formulated so that a dosage of between 0.01 -100 mg / kg body weight / day of the compound can be administered to a patient receiving these compositions.

[0425] It should also be understood that a specific dosage and treatment regimen for any particular patient will depend upon a variety of factors, including the activity of the specific compound employed, the age, body weight, general health, sex, diet, time of administration, rate of excretion, drug combination, and the judgment of the treating physician and the severity of the particular disease being treated. The amount of a compound of the present invention in the composition will also depend upon the particular compound in the composition.

[0426] The following examples are meant to be illustrative of the practice of the invention and not limiting in any way.

[0427] Examples

[0428] As depicted in the Examples below, in certain exemplary embodiments, compounds are prepared according to the following general procedures. It will be appreciated that, although the general methods depict the synthesis of certain compounds of the present invention, the following general methods, and other methods known to one of ordinary skill in the art, can be applied to all compounds and subclasses and species of each of these compounds, as described herein.

[0429] Abbreviations

[0430] General

[0431] 1H NMR was recorded on a Bruker 400 MHz spectrometer, using residual signal of deuterated solvent as internal reference. Chemical shifts (δ) are reported in ppm relative to the residual solvent signal (δ = 2.49 ppm for 1H NMR in DMSO-d6) . 1H NMR data are reported as follows: chemical shift (multiplicity, coupling constants, and number of hydrogens) . Multiplicity is abbreviated as follows: s (singlet) , d (doublet) , t (triplet) , q (quartet) , m (multiplet) , br (broad) .

[0432] LCMS-Analysis was performed by Shimadzu LC20A and Shimadzu LCMS2020 under the following conditions:

[0433] Method: A: 0.1 %formic acid in H2O, B: ACN:

[0434] Runtime: 6.5 min

[0435] Flow Rate: 1.0 mL / min

[0436] Gradient: 5-95%B in 4.5 min, wavelength 254 and 215 nM

[0437] Mass Scan: 100 -2000 Da

[0438] Column: Waters Sunfire C18, 3.0x50mm, 3.5um, +ve mode

[0439] High performance liquid chromatography (HPLC) method:

[0440] Mobile phase A: 0.1 %formic acid in H2O, B: ACN

[0441] Runtime: 20 min

[0442] Flow Rate: 1.0 mL / min

[0443] Gradient: 20%-90%B in 6.8 min, 90%B for 8 min, back to 20%B within 0.1 min, 20%B within 5 min. wavelength 254 nM

[0444] Column: Shim-pack PREP-ODS (H) kit, 4.6x250mm, 5 um, 300 A

[0445] Oven temperature: 40 ℃

[0446] Example 1. Synthesis of 4- ( (S) -36- (4-aminobutyl) -26- (2- ( (3- ( ( (3R, 4R, 5S, 6R) -3- (4- (24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 19-dioxo-6, 9, 12, 15-tetraoxa-2, 18-diazatetracosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) -5-hydroxy-6- (hydroxymethyl) -2-methoxytetrahydro-2H-pyran-4-yl) oxy) propyl) thio) acetyl) -30, 34-dioxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 32-nonaoxa-26, 29, 35-triazaheptatriacontan-37-amido) benzyl ( (S) -4, 11-diethyl-9-hydroxy-3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) carbonate (1)

[0447] Synthetic scheme 1

[0448] Step 1: A suspension of sodium azide (4.22 g, 69.91 mmol) in acetonitrile (77 mL) was cooled to 0 ℃ in an ice-bath. Triflic anhydride (15.7 g, 55.65 mmol) was added to the mixture by a syringe during 0.5 h while stirring. After the reaction was maintained for 2 h at 0 ℃, the acetonitrile solution of trifluoromethanesulfonyl azide was filtered and used directly to next reaction. To a stirred solution of compound 1-1 (10 g, 46.37 mmol) in water (50 mL) was added CuSO4 (75 mg, 0.470 mmol) and TEA (9.4 g, 93.07 mmol) at 0 ℃. After stirring for 10 min, the acetonitrile solution of trifluoromethanesulfonyl azide was added dropwise. The resulting reaction mixture was stirred at room temperature for 16 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was purified by silica gel column (eluted  with 15%methanol in dichloromethane) to afford the title compound 1-2 (7 g, yield 73%) as a colorless oil.

[0449] Step 2: To a solution of compound 1-2 (5.5 g, 26.81 mmol) in methanol (45 mL) was added concentrated HCl (5 mL) and the reaction mixture was stirred at 90 ℃ for 20 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was re-dissolved in methanol and treated with NaHCO3 until pH was neutral. The resulting mixture was filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column (eluted with 9%methanol in dichloromethane) to afford the title compound 1-3 (3 g, yield 51%) as a colorless oil.

[0450] Step 3: A solution of compound 1-3 (3 g, 13.68 mmol) , p-TsOH (230 mg, 1.33 mmol) and dimethoxyphenylmethane (6.25 g, 41.06 mmol) in DMF (30 mL) was stirred at 40 ℃ for 16 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was purified by silica gel column (eluted with 20%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 1-4 (2.6 g, yield 61%) as a colorless oil, which was solidified after overnight.

[0451] Step 4: To a solution of compound 1-4 (3.3 g, 10.74 mmol) in anhydrous DMF (30 mL) at 0 ℃ was added NaH (60%in mineral oil, 1.28 g, 32.0 mmol) in several portions under nitrogen atmosphere. After the mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h, allyl bromide (2.6 g, 21.49 mmol) was added thereto. The resulting mixture was stirred at room temperature for 16 h. After completion of the reaction, the mixture was partitioned with EtOAc (100 mL) and water (100 mL) . The organic layer was washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column (eluted with 10%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 1-5 (1.17 g, yield 31%) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.51 –7.45 (m, 2H) , 7.42 –7.35 (m, 3H) , 6.04 –5.89 (m, 1H) , 5.57 (s, 1H) , 5.30 (dd, J = 17.2, 1.5 Hz, 1H) , 5.20 (dd, J = 10.4, 1.3 Hz, 1H) , 4.77 (d, J = 3.6 Hz, 0.54H) , 4.47 –4.38 (m, 1H) , 4.35 (dd, J = 10.5, 4.9 Hz, 0.44H) , 4.31 –4.22 (m, 2H) , 3.96 (t, J = 9.5 Hz, 0.55H) , 3.89 (dd, J = 12.7, 5.2 Hz, 0.27H) , 3.86 –3.81 (m, 0.56H) , 3.80 –3.74 (m, 0.79H) , 3.64 (td, J = 9.3, 2.7 Hz, 1H) , 3.58 (d, J = 0.9 Hz, 1H) , 3.53 –3.47 (m, 0.45H) , 3.44 (d, J = 2.6 Hz, 2H) , 3.43 –3.34 (m, 1H) .

[0452] Step 5: A solution of compound 1-5 (600 mg, 1.727 mmol) and methyl thioglycolate (1.7 mL, 17.24 mmol) in dichloromethane (6 mL) was irradiated with UV 365 nm at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue  was purified by silica gel (eluted with 15%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 1-6 (400 mg, yield 51%) as a white solid.

[0453] Step 6: A mixture of compound 1-6 (400 mg, 0.882 mmol) and 1 N LiOH solution (1.7 mL, 1.7 mmol) in THF (4 mL) was stirred at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The aqueous solution was acidized with 1 N HCl to pH = 5 and extracted with EtOAc (10 mL x 2) . The combined organic layers were washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated to give the title compound 1-7 (350 mg, yield 90%) as a white solid, which was used at next step without further purification. LCMS: m / z calculated for C19H25N3O7S: 439.5; found: 462.15 [M+Na] +.

[0454] Step 7: To a solution of compound 1-8 (1 g, 2.60 mmol) in dichloromethane (20 mL) was added dess-martin periodinane (1.43 g, 3.37 mmol) in several portions at 0 ℃. The mixture was warmed to room temperature and stirred for 16 h. After completion of the reaction, the mixture was diluted with petroleum ether (20 mL) and stirred for additional 10 min. the mixture was filtered and concentrated. The residue was re-dissolved in dichloromethane (10 mL) and petroleum ether (10 mL) , and the undissolved impurity was filtered. The filtrate was concentrated to afford the title compound 1-9 (800 mg, yield 80%) as a colorless oil, which was used at next step without further purification. LCMS: m / z calculated for C17H34O9: 382.5; found: 405.64 [M+Na] +.

[0455] Step 8: Under nitrogen atmosphere, a solution of compound 1-9 (800 mg, 2.09 mmol) and compound 1-10 (800 mg, 2.51 mmol) in methanol (15 mL) was stirred at room temperature for 2 h. Then the mixture was cooled to 0 ℃, and NaBH3CN (400 mg, 6.36 mmol) was added in three portions. The resulting mixture was warmed to room temperature and stirred for 14 h. After completion of the reaction, the mixture was quenched by addition of saturated NaHCO3 (5 mL) solution and concentrated. The residue was purified by silica gel column (eluted with 3%methanol in dichloromethane) to afford the title compound 1-11 (1.1 g, yield 80%) as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C34H52N2O10: 648.8; found: 649.63 [M+H] +.

[0456] Step 9: A mixture of compound 1-11 (300 mg, 0.462 mmol) , compound 1-7 (245 mg, 0.557 mmol) , DIPEA (120 mg, 0.930 mmol) and HATU (263 mg, 0.692 mmol) in anhydrous DMF (3 mL) was stirred at room temperature under nitrogen atmosphere for 4 h. After completion of the reaction, the mixture was partitioned with EtOAc (30 mL) and water (30 mL) . The aqueous was extracted with EtOAc (20 mL) and the combined organic layers were washed  with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column (eluted with 3%methanol in EtOAc) to afford the title compound 1-12 (400 mg, yield 80%) as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C53H75N5O16S: 1070.3; found: 1070.87 [M+H] +.

[0457] Step 10: A solution of compound 1-12 (400 mg, 0.373 mmol) and piperidine (0.4 mL) in DMF (2 mL) was stirred at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and directly purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were concentrated to give the title compound 1-13 (trifluoroacetate, 230 mg, yield 64%) as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C38H65N5O14S: 848.0; found: 848.63 [M+H] +.

[0458] Step 11: A solution of compound 1-14 (1 g, 2.13 mmol) , 4-aminobenzyl alcohol (340 mg, 2.76 mmol) and EEDQ (930 mg, 3.76 mmol) in dichloromethane (20 mL) was stirred at room temperature in the dark for 16 h. After completion of the reaction, the mixture was diluted with dichloromethane (30 mL) , washed with 1 N HCl, water and brine. The organic layer was dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The crude product was triturated with petroleum ether for 1 h, filter and dried to give the title compound 1-15 (1.1 g, yield 91%) as a white solid.

[0459] Step 12: A solution of compound 1-15 (1.1 g, 1.72 mmol) and diethylamine (5 mL) in dichloromethane (5 mL) was stirred at room temperature for 4 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated to give the title compound 1-16 (650 mg, yield 90%) , which was used at next step without further purification. LCMS: m / z calculated for C38H43N3O6: 637.8; found: 638.73 [M+H] +.

[0460] Step 13: A mixture of compound 1-16 (650 mg, 1.56 mmol) , TEA (320 mg, 3.16 mmol) and Boc2O (520 mg, 2.38 mmol) in dichloromethane was stirred at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was purified by silica gel column (eluted with 5%methanol in dichloromethane) to afford the title compound 1-17 (650 mg, yield 80%) as white foam. LCMS: m / z calculated for C28H41N3O6: 515.7; found: 538.26 [M+Na] +.

[0461] Step 14: A mixture of compound 1-18 (500 mg, 1.27 mmol) , DIPEA (650 mg, 6.43 mmol) , DMAP (15 mg, 0.123 mmol) and t-butyldimethylsilyl chloride (580 mg, 3.85 mmol) in DMF (5 mL) was stirred at room temperature for 16 h. After completion of the reaction, the  mixture was partitioned with DCM (50 mL) and water (50 mL) . The organic layer was washed with 0.5 N HCl and brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column (eluted with 5%methanol in dichloromethane) to afford the title compound 1-19 (480 mg, yield 74%) as a pale-yellow solid. LCMS: m / z calculated for C28H34N2O5Si: 506.7; found: 507.83 [M+H] +.

[0462] Step 15: Under nitrogen atmosphere, to a solution of compound 1-19 (200 mg, 0.395 mmol) in anhydrous dichloromethane (5 mL) was added triphosgene (58 mg, 0.195 mmol) and DMAP (192 mg, 1.574 mmol) at 0 ℃. After the mixture was stirred at 0 ℃ for 30 min, a solution of compound 1-17 (183 mg, 0.355 mmol) in anhydrous dichloromethane (2 mL) was added thereto. The resulting reaction was warmed to room temperature and stirred for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was diluted with dichloromethane (20 mL) and washed with 0.5 N HCl. The organic layer was washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The residue was purified by silica gel column (eluted with 80%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 1-20 (280 mg, yield 75%) as a pale-yellow foam. LCMS: m / z calculated for C57H73N5O12Si: 1048.3; found: 1071.51 [M+Na] +.

[0463] Step 16: To a solution of compound 1-20 (230 mg, 0.219 mmol) in EtOAc (3 mL) was added dropwise a solution of HCl in EtOAc (4 N, 1 mL) at room temperature. After stirring for 10 min, a yellow precipitation was formed completely. The resulting mixture was centrifuged with EtOAc for three times and dried in vacuum to afford the title compound 1-21 (hydrochloride, 150 mg, yield 69%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C52H65N5O10Si: 948.2; found: 948.78 [M+H] +.

[0464] Step 17: To a solution of compound 1-21 (hydrochloride, 150 mg, 0.158 mmol) and DIPEA (40 mg, 0.310 mmol) in dichloromethane (5 mL) was added compound 1-22 (30 mg, 0.258 mmol) at room temperature. After the reaction was stirred for 2 h, the mixture was diluted with dichloromethane (10 mL) and washed with 0.5 N HCl. The organic layer was washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated to afford the title compound 1-23 (140 mg, yield 83%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C56H69N5O14Si: 1064.3; found: 1065.45 [M+H] +.

[0465] Step 18: A mixture of compound 1-23 (138 mg, 0.129 mmol) , compound 1-13 (100 mg, 0.118 mmol) , DIPEA (30 mg, 0.232 mmol) , HOBt (16 mg, 0.118 mmol) and EDCI (45 mg, 0.235 mmol) in anhydrous dichloromethane (5 mL) was stirred at room temperature for 3 h.  After completion of the reaction, the mixture was diluted with dichloromethane (20 mL) and washed with 0.5 N HCl. The organic layer was washed with water and brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The residue was purified by pre-TLC (SiO2, dichloromethane: methanol = 20: 1) to afford the title compound 1-24 (108 mg, yield 48%) as a yellow oil. LCMS: m / z calculated for C94H132N10O27SSi: 1894.3; found: 1895.05 [M+H] +.

[0466] Step 19: A mixture of compound 1-24 (108 mg, 0.057 mmol) , TBAF (1 M in THF, 0.085 mL) and AcOH (10 mg, 0.167 mmol) in THF (2 mL) was stirred at 0 ℃ for 0.5 h. After completion of the reaction, the mixture was diluted with dichloromethane (10 mL) and washed with water. The organic was washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated to give the title compound 1-25 (82 mg, yield 78%) as a yellow oil, which was used at next step without purification. LCMS: m / z calculated for C88H118N10O27S: 1780.0; found: 1781.14 [M+H] +.

[0467] Step 20: A mixture of compound 1-25 (80 mg, 0.045 mmol) , hydroxylamine hydrochloride (31 mg, 0.446 mmol) and imidazole (30 mg, 0.440 mmol) in DMF (1 mL) was stirred at room temperature for 5 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 1-26 (trifluoroacetate, 50 mg, yield 64%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C78H106N10O25S: 1615.8; found: 1616.95 [M+H] +.

[0468] Step 21: To a solution of compound 1-27 (500 mg, 1.66 mmol) and DIPEA (540 mg, 4.18 mmol) in DCM (5 mL) was added compound 1-28 (615 mg, 1.99 mmol) at 0 ℃. The mixture was warmed to room temperature and stirred for 15 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 1-29 (730 mg, yield 95%) as a yellow oil. LCMS: m / z calculated for C21H34N2O9: 458.51; found: 459.90 [M+H] +.

[0469] Step 22: To a solution of compound 1-29 (450 mg, 0.98 mmol) and N-Hydroxysuccinimide (225 mg, 1.96 mmol) in anhydrous DCM (10 mL) was added EDCI (380 mg, 1.99 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 4 h. After completion of the reaction, the mixture was diluted with DCM (10 mL) and washed with cold water (20 mL) . The organic layer was dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated to afford the  title compound 1-30 (580 mg, crude) as a yellow oil. LCMS: m / z calculated for C25H37N3O11: 555.58; found: 556.91 [M+H] +.

[0470] Step 23: To a solution of propargylamine (70 mg, 1.27 mmol) and DIPEA (222 mg, 1.72 mmol) in DCM (5 mL) was added a solution of compound 1-30 (580 mg, crude) in DCM (5 mL) . The mixture was stirred at room temperature for 16 h. After completion of the reaction, the mixture was diluted with DCM (20 mL) and washed with water (15 mL x 2) . The organic layer was washed 0.5 N HCl, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The residue was purified by silica gel column (eluted with 9%MeOH in DCM) to afford the title compound 1-31 (335 mg, yield 70%over 2 steps) as an off-white solid. LCMS: m / z calculated for C24H37N3O8: 495.57; found: 497.09 [M+H] +.

[0471] Step 24: To a solution of compound 1-26 (30 mg, 0.018 mmol) and compound 1-31 (11 mg, 0.022 mmol) in degassed DMSO (1 mL) was added a fresh aqueous solution of ascorbic acid (1 M, 0.162 mL, 0.162 mmol) and a fresh aqueous solution of Cu2SO4 (1 M, 0.054 mL, 0.054 mmol) . The mixture was purged with nitrogen for three times and stirred at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 1-32 (trifluoroacetate, 28 mg, yield 72%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C102H143N13O33S: 2111.4; found: 1056.66 [M+2H] 2+.

[0472] Step 25: A solution of 1-32 (32 mg, 0.015 mmol) and camphor sulfonic acid (21 mg, 0.090 mmol) in methanol (1 mL) was stirred at room temperature for 48 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was purified by pre-HPLC (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 1 (trifluoroacetate, 9.6 mg, yield 31%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C95H139N13O33S: 2023.3; found: 1012.13 [M+2H] 2+.

[0473] Example 2. Synthesis of 4- ( (S) -26- (2- ( (3- ( ( (2R, 3S, 4R, 5R) -3- ( (26- (2- (2- (2- ( ( (S) -6-amino-1- ( (4- ( ( ( ( ( (S) -4, 11-diethyl-9-hydroxy-3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) oxy) carbonyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxohexan-2-yl) amino) -2-oxoethoxy) acetamido) ethyl) -27-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-29-thia-26-azadotriacontan-32-yl) oxy) -2- (26- (2- (2- (2- ( ( (S) -6-amino-1- ( (4- ( ( ( ( ( (S) -4, 11-diethyl-9-hydroxy-3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2- b] quinolin-4-yl) oxy) carbonyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxohexan-2-yl) amino) -2-oxoethoxy) acetamido) ethyl) -27-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 33-nonaoxa-29-thia-26-azatetratriacontan-34-yl) -5- (4- (24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 19-dioxo-6, 9, 12, 15-tetraoxa-2, 18-diazatetracosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) -6-methoxytetrahydro-2H-pyran-4-yl) oxy) propyl) thio) acetyl) -36- (4-aminobutyl) -30, 34-dioxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 32-nonaoxa-26, 29, 35-triazaheptatriacontan-37-amido) benzyl ( (S) -4, 11-diethyl-9-hydroxy-3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) carbonate (2)

[0474] Synthetic scheme 2

[0475] Step 1: Under nitrogen atmosphere, TBAF (1 M THF solution, 2.6 mL, 2.6 mmol) was added to a solution of compound 1-20 (1.8 g, 1.717 mmol) and acetic acid (206 mg, 3.43 mmol) in THF (18 mL) at 0 ℃. The mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h and diluted with dichloromethane (100 mL) , washed with water (100 mL x 2) and brine (100 mL x 2) . The organic layer was dried by anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The residue was redissolved in dichloromethane (20 mL) and methanol (1 mL) . 4 N HCl in ethyl acetate (20 mL) was added and the mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and the yellow solid was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 2-1 (hydrochloride, 1.27 g, yield 84%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C46H51N5O10: 833.9; found: 856.92 [M+Na] +.

[0476] Step 2: Under nitrogen atmosphere, NaH (60%in mineral oil, 730 mg, 18.25 mmol) was added in portions to a solution of compound 1-3 (800 mg, 3.65 mmol) in DMF (20 mL) at 0 ℃. The mixture was stirred at 0 ℃ for 2 h, to this was added slowly allyl bromide (2.2 g, 18.18 mmol) . The reaction was warmed slowly to room temperature and stirred for additional 16 h. After completion of the reaction, the mixture was quenched by addition of cold water (100 mL) . The mixture was extracted with ethyl acetate (50 mL x 2) and washed with brine (100 mL) . The organic layer was dried by anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column (eluted with 5%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 2-2 (900 mg, yield 72%) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 5.95 (dddt, J = 28.3, 16.8, 11.3, 5.1 Hz, 3H) , 5.35 –5.23 (m, 3H) , 5.18 (t, J = 10.5 Hz, 3H) , 4.76 (d, J  = 3.5 Hz, 0.5H) , 4.37 –4.24 (m, 3H) , 4.16 –4.05 (m, 2.5H) , 4.00 (dd, J = 12.7, 5.6 Hz, 1H) , 3.78 –3.60 (m, 3.3H) , 3.54 (s, 1H) , 3.52 –3.21 (m, 4.7H) .

[0477] Step 3: A mixture of compound 2-2 (900 mg, 2.65 mmol) and methyl thioglycolate (8 g, 75.3 mmol) was irradiated with UV 365 nm at room temperature for 2 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was purified by silica gel column (eluted with 50%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 2-3 (820 mg, yield 47%) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4.73 (d, J = 3.3 Hz, 0.63H) , 4.25 (d, J = 7.4 Hz, 0.37H) , 3.79 (dt, J = 8.9, 6.1 Hz, 1H) , 3.71 (qd, J = 7.3, 5.9, 4.2 Hz, 2H) , 3.63 (s, 9H) , 3.60 –3.42 (m, 9H) , 3.42 –3.36 (m, 5H) , 3.27 (s, 2H) , 3.20 (dq, J = 17.3, 8.8, 7.8 Hz, 2H) , 2.64 (p, J =6.9, 6.1 Hz, 6H) , 1.78 (dt, J = 15.9, 7.0 Hz, 6H) . LCMS: m / z calculated for C25H43N3O11S3: 657.8; found: 680.88 [M+Na] +.

[0478] Step 4: 2 N LiOH solution (6 mL, 12 mmol) was added at 0 ℃ to a solution of compound 2-3 (1 g, 1.52 mmol) in THF (10 mL) . The reaction was stirred at room temperature for 24 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated and adjusted pH to 3 with 1 N HCl at 0 ℃. The aqueous solution was filtered and purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 2-4 (670 mg, yield 71%) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4.73 (d, J = 3.2 Hz, 0.63H) , 4.25 (d, J = 7.7 Hz, 0.37H) , 3.83 –3.75 (m, 1H) , 3.74 –3.67 (m, 2H) , 3.62 –3.41 (m, 9H) , 3.40 –3.32 (m, 3H) , 3.27 (s, 3H) , 3.20 (s, 2H) , 3.16 (dd, J = 14.9, 5.3 Hz, 1H) , 2.64 (q, J = 10.7, 9.1 Hz, 6H) , 1.79 (dt, J =13.3, 6.9 Hz, 6H) . LCMS: m / z calculated for C22H37N3O11S3: 615.7; found: 638.52 [M+Na] +.

[0479] Step 5: A solution of compound 2-4 (350 mg, 0.568 mmol) , HOBt (460 mg, 3.41 mmol) , DIPEA (880 mg, 6.82 mmol) and EDCI (650mg, 3.40 mmol) in dichloromethane (5 mL) was stirred at room temperature under nitrogen atmosphere for 10 min, a solution of compound 1-11 (1.6 g, 2.46 mmol) in dichloromethane (5 mL) was added thereto. The resulting reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. The mixture was diluted with dichloromethane (20 mL) and washed with 0.5 N HCl (20 mL) and water (20 mL) . The organic layer was concentrated and the residue was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 2-5 (660 mg, yield 46%) as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C124H187N9O38S3: 2508.1; found: 1278.09 [M+2Na] 2+.

[0480] Step 6: To a solution of compound 2-5 (400 mg, 0.159 mmol) in THF (4 mL) was added slowly 3 N NaOH solution (0.53 mL, 1.59 mmol) at 0 ℃. The mixture was stirred at room temperature for 5 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated and the residue was acidized at 0 ℃ with 1 N HCl to pH = 3. The aqueous solution was washed with ethyl acetate (10 mL x 2) and purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 2-6 (hydrochloride, 260 mg, yield 83%) as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C79H157N9O32S3: 1841.3; found: 921.96 [M+2H] 2+.

[0481] Step 7: To a solution of compound 2-6 (hydrochloride, 260 mg, 0.133 mmol) and TEA (170 mg, 1.68 mmol) in dichloromethane (5 mL) was added diglycolic anhydride 1-22 (98 mg, 0.844 mmol) . The reaction was stirred at room temperature for 48 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 2-7 (250 mg, yield 85%) as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C91H169N9O44S3: 2189.6; found: 1096.35 [M+2H] 2+.

[0482] Step 8: To a solution of compound 2-7 (100 mg, 0.0457 mmol) , compound 2-1 (hydrochloride, 180 mg, 0.206 mmol) and DIPEA (94 mg, 0.729 mmol) in DMF (2 mL) was added T3P (50%in DMF solution, 175 mg, 0.275 mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 14 h, LC-MS showed desired product was formed but not completely converted. DIPEA (45 mg, 0.349 mmol) and T3P (50%in DMF solution, 90 mg, 0.141mmol) were added again. After stirring for additional 8 h, the resulting mixture was filtered and purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 2-8 (70 mg, yield 33%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C229H316N24O71S3: 4637.3; found: 1547.16 [M+3H] 3+.

[0483] Step 9: To a solution of compound 2-8 (105 mg, 0.0226 mmol) in DMF (1 mL) was added hydroxylamine hydrochloride (47 mg, 0.676 mmol) and imidazole (46 mg, 0.676 mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 8 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to  afford the title compound 2-9 (trifluoroacetate, 67 mg, yield 66%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C199H280N24O65S3: 4144.7; found: 1382.85 [M+3H] 3+.

[0484] Step 10: To a solution of compound 2-9 (trifluoroacetate, 53 mg, 0.0118 mmol) and compound 1-31 (13 mg, 0.0262 mmol) in degassed DMSO (2 mL) was added a fresh aqueous solution of ascorbic acid (1 M, 0.106 mL, 0.106 mmol) and a fresh aqueous solution of Cu2SO4 (1 M, 0.035 mL, 0.035 mmol) . The mixture was purged with nitrogen for three times and stirred at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the resulting mixture was filtered and purified directly by pre-HPLC (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 1 (trifluoroacetate, 26 mg, yield 44%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C223H317N27O73S3: 4640.3; found: 1547.98 [M+3H] 3+.

[0485] Example 3. Synthesis of 4- ( (S) -36- (4-aminobutyl) -26- (2- ( (3- ( ( (3R, 4R, 5S, 6R) -2, 5-bis ( (26- (2- (2- (2- ( ( (S) -6-amino-1- ( (4- ( ( ( ( ( (S) -4, 11-diethyl-9-hydroxy-3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) oxy) carbonyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxohexan-2-yl) amino) -2-oxoethoxy) acetamido) ethyl) -27-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-29-thia-26-azadotriacontan-32-yl) oxy) -6- (26- (2- (2- (2- ( ( (S) -6-amino-1- ( (4- ( ( ( ( ( (S) -4, 11-diethyl-9-hydroxy-3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) oxy) carbonyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxohexan-2-yl) amino) -2-oxoethoxy) acetamido) ethyl) -27-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 33-nonaoxa-29-thia-26-azatetratriacontan-34-yl) -3- (4- (24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 19-dioxo-6, 9, 12, 15-tetraoxa-2, 18-diazatetracosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) tetrahydro-2H-pyran-4-yl) oxy) propyl) thio) acetyl) -30, 34-dioxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 32-nonaoxa-26, 29, 35-triazaheptatriacontan-37-amido) benzyl ( (S) -4, 11-diethyl-9-hydroxy-3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) carbonate (3)

[0486] Synthetic scheme 3

[0487] Step 1: Under nitrogen atmosphere, DMSO (1.5 g, 19.20 mmol) was added dropwise to a stirred solution of oxalyl chloride (2 g, 15.76 mmol) in anhydrous dichloromethane (50 mL) at -78 ℃. After stirring for 15 min at -78 ℃, to this was added dropwise a solution of alcohol 1-8 (3 g, 7.80 mmol) in anhydrous dichloromethane (30 mL) . After stirring at -78 ℃ for 30 min, TEA (3.9 g, 38.61 mmol) was added dropwise. After stirring at that temperature for 1 h, the mixture was warmed slowly to room temperature over 1 h. Aqueous ammonium chloride solution (100 mL) was added thereto. The organic layer was separated, washed with water and  brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The crude product 1-9 (2.46 g) was used at next step without further purification.

[0488] Step 2: Under nitrogen atmosphere, a solution of compound 1-9 (2.46 g, 6.43 mmol) and compound 1-10 (1.6 g, 5.02 mmol) in MeOH (20 mL) was stirred at room temperature for 2 h.Then the mixture was cooled to 0 ℃, and NaBH3CN (1 g, 15.87 mmol) was added in three portions. The resulting mixture was warmed to room temperature and stirred for 15 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated and redissolved in dichloromethane (50 mL) . The solution was washed with water and brine. The organic layer was concentrated and the residue was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 1-11 (hydrochloride, 1.2 g, yield 22%over 2 steps) as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C34H52N2O10: 648.8; found: 649.87 [M+H] +.

[0489] Step 3: Under nitrogen atmosphere, NaH (60%in mineral oil, 1.61 g, 40.25 mmol) was added in portions to a solution of compound 1-2 (1.38 g, 6.73 mmol) in DMF (30 mL) at 0 ℃. The mixture was stirred at 0 ℃ for 2 h, to this was added slowly allyl bromide (4.88 g, 40.33mmol) . The reaction was warmed slowly to room temperature and stirred for additional 16 h. After completion of the reaction, the mixture was quenched by addition of cold water (200 mL) . The mixture was extracted with ethyl acetate (100 mL x 3) and washed with brine (100 mL x 2) . The organic layer was dried by anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column (eluted with 5%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 3-1 (1.05 g, yield 42%) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 5.93 (dddt, J = 25.9, 15.5, 10.3, 5.6 Hz, 4H) , 5.36 –5.15 (m, 8H) , 4.42 –4.36 (m, 1H) , 4.35 –4.22 (m, 4H) , 4.13 (d, J = 5.7 Hz, 1H) , 4.10 (dd, J = 6.1, 1.4 Hz, 1H) , 4.08 –3.98 (m, 2H) , 3.69 (dd, J = 10.9, 2.0 Hz, 1H) , 3.62 (dd, J = 10.9, 4.6 Hz, 1H) , 3.44 –3.28 (m, 3H) , 3.23 (t, J = 9.3 Hz, 1H) .

[0490] Step 4: A mixture of compound 3-1 (1.05 g, 2.87 mmol) and methyl thioglycolate (12 g, 113 mmol) was irradiated with UV 365 nm at room temperature for 2 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was purified by silica gel column (eluted with 50%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 3-2 (780 mg, yield 34%) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4.36 (d, J = 7.9 Hz, 1H) , 3.83 –3.78 (m, 1H) , 3.71 (tdd, J = 9.6, 5.7, 3.3 Hz, 3H) , 3.63 (s, 12H) , 3.58 –3.50 (m, 4H) , 3.50 –3.41 (m, 3H) , 3.37  (dd, J = 6.0, 3.3 Hz, 6H) , 3.26 (td, J = 7.8, 2.9 Hz, 1H) , 3.21 –3.12 (m, 2H) , 2.69 –2.56 (m, 8H) , 1.84 –1.69 (m, 8H) . LCMS: m / z calculated for C30H51N3O13S4: 790.0; found: 813.22 [M+Na] +.

[0491] Step 5: 2 N LiOH solution (7.6 mL, 15.2 mmol) was added at 0 ℃ to a solution of compound 3-2 (1 g, 1.26 mmol) in THF (10 mL) . The reaction was stirred at room temperature for 24 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated and adjusted pH to 3 with 1 N HCl at 0 ℃. The aqueous solution was filtered and purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 3-3 (720 mg, yield 77%) as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C26H43N3O13S4: 733.9; found: 756.41 [M+Na] +.

[0492] Step 6: A solution of compound 3-3 (250 mg, 0.341 mmol) , HOBt (370 mg, 2.74 mmol) , DIPEA (700 mg, 5.42 mmol) and EDCI (520 mg, 2.72 mmol) in dichloromethane (5 mL) was stirred at room temperature under nitrogen atmosphere for 10 min, a solution of compound 1-11 (hydrochloride, 1.2 g, 1.75 mmol) in dichloromethane (5 mL) was added thereto. The resulting reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. The mixture concentrated and the residue was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 3-4 (550 mg, yield 49%) as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C162H243N11O49S4: 3257.0; found: 1629.90 [M+2H] 2+.

[0493] Step 7: To a solution of compound 3-4 (550 mg, 0.169 mmol) in THF (5 mL) was added slowly 3 N NaOH solution (0.67 mL, 2.01 mmol) at 0 ℃. The mixture was stirred at room temperature for 12 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated and the residue was acidized at 0 ℃ with 1 N HCl to pH = 3. The aqueous solution was washed with ethyl acetate (10 mL x 2) and purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 3-5 (hydrochloride, 205 mg, yield 48%) as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C102H203N11O41S4: 2368.0; found: 1185.40 [M+2H] 2+.

[0494] Step 8: To a solution of compound 3-5 (hydrochloride, 86 mg, 0.0342 mmol) and TEA (56 mg, 0.554 mmol) in dichloromethane (3 mL) was added diglycolic anhydride 1-22 (32 mg, 0.275 mmol) . The reaction was stirred at room temperature for 32 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired  components were lyophilized to afford the title compound 3-6 (78 mg, yield 80%) as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C118H219N11O57S4: 2832.3; found: 1417.70 [M+2H] 2+.

[0495] Step 9: To a solution of compound 3-6 (90mg, 0.0318 mmol) , compound 2-1 (hydrochloride, 190 mg, 0.218 mmol) and DIPEA (98mg, 0.760 mmol) in DMF (2 mL) was added T3P (50%in DMF solution, 200 mg, 0.314 mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 24 h, LC-MS showed desired product was formed but not completely converted. Compound 2-1 (hydrochloride, 190 mg, 0.218 mmol) , DIPEA (98mg, 0.760 mmol) and T3P (50%in DMF solution, 200 mg, 0.314 mmol) were added again. After stirring for additional 24 h at 45 ℃, the resulting mixture was filtered and purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 3-7 (50 mg, yield 25%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C302H415N31O93S4: 6096.0; found: 1525.43 [M+4H] 4+.

[0496] Step 10: To a solution of compound 3-7 (80 mg, 0.0131 mmol) in DMF (1 mL) was added hydroxylamine hydrochloride (36 mg, 0.518 mmol) and imidazole (36 mg, 0.529mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 20 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 3-8 (trifluoroacetate, 50 mg, yield 64%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C262H367N31O85S4: 5439.2; found: 1361.10 [M+4H] 4+.

[0497] Step 11: To a solution of compound 3-8 (trifluoroacetate, 80 mg, 0.0136 mmol) and compound 1-31 (20 mg, 0.0404 mmol) in degassed DMSO (3 mL) was added a fresh aqueous solution of ascorbic acid (1 M, 0.122 mL, 0.122 mmol) and a fresh aqueous solution of Cu2SO4 (1 M, 0.041 mL, 0.041 mmol) . The mixture was purged with nitrogen for three times and stirred at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the resulting mixture was filtered and purified directly by pre-HPLC (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 3 (trifluoroacetate, 29 mg, yield 33%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C286H404N34O93S4: 5934.8; found: 1485.28 [M+4H] 4+.

[0498] Example 4. Synthesis of 4- ( (S) -26- (2- ( (3- ( ( (2R, 3S, 4R, 5R) -3- ( (26- (2- (2- (2- ( ( (S) -6-amino-1- ( (4- ( ( ( ( ( (S) -4, 11-diethyl-9-hydroxy-3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) oxy) carbonyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1- oxohexan-2-yl) amino) -2-oxoethoxy) acetamido) ethyl) -27-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-29-thia-26-azadotriacontan-32-yl) oxy) -5- (4- (24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 19-dioxo-6, 9, 12, 15-tetraoxa-2, 18-diazatetracosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) -4, 6-dimethoxytetrahydro-2H-pyran-2-yl) methoxy) propyl) thio) acetyl) -36- (4-aminobutyl) -30, 34-dioxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 32-nonaoxa-26, 29, 35-triazaheptatriacontan-37-amido) benzyl ( (S) -4, 11-diethyl-9-hydroxy-3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) carbonate (4)

[0499] Synthetic scheme 4

[0500] Step 1: Under nitrogen, to a solution of compound 1-4 (1.8 g, 5.85 mmol) in DMF (15 mL) at 0 ℃ was added NaH (60%in mineral oil, 586 mg, 14.65 mmol) in several portions. After stirring for 30 min at 0 ℃, MeI (1.66 g, 11.69 mmol) was added thereto. The mixture was warmed to room temperature and stirred for 16 h. After completion of the reaction, the mixture was quenched by adding NH4Cl solution and extracted with EtOAc (100 mL x 2) . The combined organic layer was washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column (eluted with 10%EtOAc in Petroleum ether) to afford the title compound 4-1 (1.7 g, yield 90%) as a colorless oil.

[0501] Step 2: To a solution of compound 4-1 (2.49 g, 7.72 mmol) in MeOH (20 mL) was added D- (+) -10-Camphorsulfonic Acid (5.39 g, 23.2 mmol) at room temperature. The reaction mixture was stirred for 16 h. After completion of the reaction, the resulting mixture was concentrated. The residue was purified by silica gel column (eluted with 25%EtOAc in Petroleum ether) to afford the title compound 4-2 (1.7 g, yield 94%) as a colorless oil.

[0502] Step 3: Under nitrogen, to a solution of compound 4-2 (2.4 g, 10.29 mmol) in DMF (30 mL) at 0 ℃ was added NaH (60%in mineral oil, 1.64 g, 41.0 mmol) in several portions. After stirring for 1 h at 0 ℃, allyl bromide (3.73 g, 30.83 mmol) was added dropwise thereto. The mixture was warmed to room temperature and stirred for 24 h. After completion of the  reaction, the mixture was quenched by adding water and extracted with EtOAc (100 mL x 2) . The combined organic layer was washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column (eluted with 5%EtOAc in Petroleum ether) to afford the title compound 4-3 (2.55 g, yield 79%) as a colorless oil.

[0503] Step 4: A mixture of compound 4-3 (1.9 g, 6.06 mmol) and methyl thioglycolate (6 mL, 67.1 mmol) was irradiated with UV 365 nm at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated under high vacuum. The residue was purified by silica gel (eluted with 25%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 4-4 (2.7 g, yield 80%) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 4.73 (d, J = 3.5 Hz, 0.65H) , 4.09 (d, J = 8.0 Hz, 0.35H) , 3.83 (s, 1H) , 3.73 (s, 6H) , 3.67 (t, J = 5.2 Hz, 1H) , 3.65 –3.55 (m, 8H) , 3.53 (s, 2H) , 3.38 (s, 2H) , 3.28 (s, 1H) , 3.26 (d, J = 2.6 Hz, 1H) , 3.23 (d, J = 2.9 Hz, 4H) , 2.77 –2.68 (m, 4H) , 1.90 (dp, J = 21.0, 7.5, 6.9 Hz, 4H) .

[0504] Step 5: A mixture of compound 4-4 (1.0 g, 1.90 mmol) and 1 M LiOH solution (7.6 mL, 7.6 mmol) in THF (10 mL) was stirred at room temperature for 24 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The aqueous solution was acidized with 1 N HCl to pH = 5 and filtered. The filtrate was purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were concentrated to give the title compound 4-5 (720 mg, yield 76%) as a pale-yellow oil. LCMS: m / z calculated for C18H31N3O9S2: 497.58; found: 520.82 [M+Na] +.

[0505] Step 6: A solution of compound 4-5 (350 mg, 0.703 mmol) , HOBt (190 mg, 1.41 mmol) , DIPEA (362 mg, 2.80 mmol) and EDCI (537 mg, 2.81 mmol) in anhydrous dichloromethane (5 mL) was stirred at room temperature for 10 min. To this was added a solution of compound 1-11 (hydrochloride, 1.49 g, 2.17 mmol) and DIPEA (260 mg, 2.01 mmol) in anhydrous dichloromethane (5 mL) . The resulting mixture was stirred at room temperature for 24 h. After completion of the reaction, the mixture was diluted with dichloromethane (40 mL) and washed with water and brine. The organic layers were concentrated and purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were concentrated to give the title compound 4-6 (680 mg, yield 55%) as a pale-yellow oil. LCMS: m / z calculated for C86H131N7O27S2: 1759.14; found: 1760.25 [M+H] +.

[0506] Step 7: To a solution of compound 4-6 (350 mg, 0.199 mol) in THF (4 mL) was added aqueous NaOH solution (2 N, 0.4 mL, 0.4 mmol) at room temperature. The mixture was stirred for 16 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated to get rid of the THF solvents. The aqueous residue was acidified with 1 N HCl to pH = 2, and washed with DCM (10 mL x 2) . The left aqueous solution contain compound 4-7 was used at next step without further purification. LCMS: m / z calculated for C56H111N7O23S2: 1314.65; found: 1315.68 [M+H] +.

[0507] Step 8: The aqueous solution contain compound 4-7 was treated with THF and adjusted pH = 8 with TEA. To this was added compound 1-22 (100 mg, 0.862 mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 16 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were concentrated to give the title compound 4-8 (218 mg, yield 70%, 2 steps) as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C64H119N7O31S2: 1546.79; found: 1547.98 [M+H] +.

[0508] Step 9: To a solution of compound 4-8 (110 mg, 0.0711) , compound 2-11 (hydrochloride, 210 mg, 0.241 mmol) and DIPEA (96 mg, 0.742 mmol) in anhydrous DMF (3 mL) was added dropwise T3P (50%in DMF, 200 mg, 0.314 mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 24 h. After completion of the reaction, the mixture was quenched by adding water (1 mL) and filtered. The filtrate was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were concentrated to give the title compound 4-9 (trifluoroacetate, 120 mg, yield 49%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C156H217N17O49S2: 3178.64; found: 1060.95 [M+3H] 3+.

[0509] Step 10: To a solution of compound 4-9 (120 mg, 0.0352 mmol) in DMF (2.5 mL) was added imidazole (40 mg, 0.588 mmol) and Hydroxylamine hydrochloride (0.580) . The mixture was stirred at room temperature for 16 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and diluted with water (1 mL) . The resulting mixture was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were concentrated to give the title compound 4-10 (trifluoroacetate, 90 mg, yield 83%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C136H193N17O45S2: 2850.23; found: 1426.89 [M+2H] 2+.

[0510] Step 11: To a solution of compound 4-10 (trifluoroacetate, 90 mg, 0.0292 mmol) and compound 1-31 (24 mg, 0.0484 mmol) in degassed DMSO (3 mL) was added a fresh aqueous solution of ascorbic acid (1 M, 0.285 mL, 0.285 mmol) and a fresh aqueous solution of Cu2SO4 (1 M, 0.095 mL, 0.095 mmol) . The mixture was purged with nitrogen for three times and stirred at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and diluted with water (1 mL) . The resulting mixture was purified directly by pre-HPLC (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 4 (trifluoroacetate, 50.3 mg, yield 48%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C160H230N20O53S2: 3345.8; found: 1116.87 [M+3H] 3+.

[0511] Example 5. Synthesis of N- ( (1- ( (3R, 4R, 5S, 6R) -5- ( (26- ( (S) -10-benzyl-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-3-oxa-5, 8, 11, 14-tetraazahexadecan-16-yl) -27-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-29-thia-26-azadotriacontan-32-yl) oxy) -6- (26- ( (S) -10-benzyl-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-3-oxa-5, 8, 11, 14-tetraazahexadecan-16-yl) -27-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 33-nonaoxa-29-thia-26-azatetratriacontan-34-yl) -2, 4-dimethoxytetrahydro-2H-pyran-3-yl) -1H-1, 2, 3-triazol-4-yl) methyl) -1- (6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanamido) -3, 6, 9, 12-tetraoxapentadecan-15-amide (5)

[0512] Synthetic scheme 5

[0513] Step 1: To a mixture of compound 5-1 (20.0 g, 56.4 mmol) in tetrahydrofuran (400 mL) and toluene (100 mL) was added lead tetraacetate (30.0 g, 69.2 mmol) in several portions at room temperature with stirring. The mixture was stirred at 85 ℃ for 4 h under nitrogen atmosphere. After completion of the reaction, the mixture was cooled to room temperature and the insoluble white solid was removed by filtration through diatomite. The filtrate was concentrated and the residue was re-dissolved in ethyl acetate (200 mL) , washed with water (200 mL) and brine (200 mL) . The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column chromatography (eluted with 45%ethyl acetate in petroleum ether) to afford the title compound 5-2 (10.8 g, yield 52%) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.92 (t, J = 7.2 Hz, 1H) , 7.88 (d, J = 7.5 Hz,  2H) , 7.70 (d, J = 7.4 Hz, 2H) , 7.56 (t, J = 6.3 Hz, 1H) , 7.41 (t, J = 7.4 Hz, 2H) , 7.32 (t, J = 7.4 Hz, 2H) , 5.08 (d, J = 6.9 Hz, 2H) , 4.28 (d, J = 6.9 Hz, 2H) , 4.25 –4.18 (m, 1H) , 3.64 (d, J = 6.2 Hz, 2H) , 1.98 (s, 3H) .

[0514] Step 2: A mixture of compound 5-2 (10.0 g, 27.1 mmol) , compound 5-3 (45.1 g, 271 mmol) and PPTS (680 mg, 2.71 mmol) in anhydrous dichloromethane (100 mL) was stirred at 50 ℃ for 20 h under nitrogen atmosphere. After completion of the reaction, the mixture was cooled and diluted with ethyl acetate (400 mL) , washed with water (300 mL) and brine (300 mL) . The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column chromatography (eluted with 60%ethyl acetate in petroleum ether) to afford the title compound 5-4 (6.57 g, yield 51%) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.73 (t, J = 6.7 Hz, 1H) , 7.91 –7.86 (m, 2H) , 7.70 (d, J = 7.4 Hz, 2H) , 7.57 (t, J = 5.8 Hz, 1H) , 7.40 (t, J = 7.4 Hz, 2H) , 7.32 (t, J = 7.4 Hz, 7H) , 5.13 (s, 2H) , 4.62 (d, J = 6.6 Hz, 2H) , 4.28 (d, J = 6.9 Hz, 2H) , 4.21 (dd, J = 13.3, 5.5 Hz, 1H) , 4.14 (s, 2H) , 3.62 (d, J = 5.9 Hz, 2H) .

[0515] Step 3: A mixture of compound 5-4 (6.0 g, 12.6 mmol) and 5w%Pd / C (1.2 g) in ethanol (150 mL) and ethyl acetate (150 mL) was stirred at room temperature for 3 h under hydrogen atmosphere. After completion of the reaction, the mixture was filtered over diatomite. The filtrate was concentrated and the crude product was triturated with ethyl acetate and petroleum ether (v: v = 1: 3) for 1 h to afford the title compound 5-5 (3.45 g, yield 71%) as a white solid. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.71 (t, J = 6.7 Hz, 1H) , 7.88 (d, J = 7.6 Hz, 2H) , 7.71 (d, J = 7.5 Hz, 2H) , 7.57 (t, J = 6.0 Hz, 1H) , 7.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 7.32 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 4.59 (d, J = 6.6 Hz, 2H) , 4.28 (d, J = 6.9 Hz, 2H) , 4.22 (d, J = 6.8 Hz, 1H) , 3.94 (s, 2H) , 3.61 (d, J = 5.8 Hz, 2H) .

[0516] Step 4: 2-Chorotrityl Chloride resin (0.71 mmol / g, 11.00 g, 7.81 mmol) was swollen in DCM (50 mL) with nitrogen bubbling for 30 min. After removing the DCM, the first amino acid compound 5-5 (3.00 g, 7.80 mmol) , DCM (50 mL) and DIPEA (4.03 g, 31.18 mmol) were added. The mixture was bubbled with nitrogen for 2 h, the unreacted Cl group was blocked with MeOH (5 mL) for 30 min. Next, the resin was washed with DMF and DCM. Then Fmoc was removed by 20 %piperidine in DMF for 30 min. The next amino acids were added by using the following coupling condition: For coupling conditions: Fmoc-AA-OH / HBTU / DIPEA (15.60 : 14.82 : 31.20 mmol) in DMF for 30 min. The following amino acids were coupled one by one:  Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Phe-OH and Cbz-Gly-OH. The final resin was washed with DMF and MeOH. At last, desired linear peptide was cleaved from the resin with 20%hexafluoroisopropanol in DCM for 1 h. The mixture was filtered and the filtrate was concentrated under reduced pressure at 40 ℃ to give a residue. The crude product was purified by reverse-phase flash chromatography (eluted with acetonitrile in water, neutral condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 5-6 (1.80 g, 46%) as a white solid. LCMS: m / z calculated for C24H28N4O8: 500.19; found 523.91 [M+Na] +.

[0517] Step 5: To a suspension of compound 5-7 (mesylate, 450 mg, 0.84 mmol) , HOBt (135 mg, 1.0 mmol) and DIPEA (390 mg, 3.01 mmol) in anhydrous DMF (5 mL) was added compound 5-6 (500 mg, 1.0 mmol) and EDCI (382 mg, 2.0 mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 15 h. After completion of the reaction, the mixture was extracted with EtOAc (50 mL x 5) and H2O (50 mL) . The organic layers were washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated to give a residue. The crude product was purified by silica gel column (eluted with 9%MeOH in DCM) to afford the title compound 5-8 (730 mg, yield 94%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C48H48FN7O11: 917.34; found: 918.60 [M+H] +.

[0518] Step 6: A mixture of compound 5-8 (625 mg, 0.68 mmol) , Pd (OH) 2 / C (5 w%, 150 mg) and Pd / C (5 w%, 150 mg) in MeOH (30 mL) was stirred at room temperature under hydrogen atmosphere (0.8 MPa) for 16 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered through diatomite and concentrated to afford the title compound 5-9 (460 mg, yield 86%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C40H42FN7O9: 783.30; found: 784.76 [M+H] +.

[0519] Step 7: To a solution of compound 1-8 (2.7 g, 7.02 mmol) and DMAP (170 mg, 1.39 mmol) in DCM (30 mL) was added Et3N (2.84 g, 28.06 mmol) and tosyl chloride (4.69 g, 24.60 mmol) at 0 ℃. The reaction mixture was stirred at room temperature for 14 h. After completion of the reaction, the mixture was diluted with DCM (100 mL) and washed with H2O (100 mL) , 1 N HCl (100 mL) and brine (100 mL) . The organic layer was dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated to give a residue. The crude product was purified by silica gel column (eluted with 6%MeOH in DCM) to afford the title compound 5-10 (3.45 g, yield 91%) as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C24H42O11S: 538.24; found: 539.88 [M+H] +.

[0520] Step 8: Under nitrogen atmosphere, a solution of compound 5-11 (1.6 g, 7.87 mmol) in anhydrous THF (6 mL) was stirred and cooled to -75 ℃ over 10 min. To this was added  slowly KHMDS (1 M in THF, 10 mL, 10.0 mmol) . The mixture was stirred at -75 ℃ for 1 h before a solution of compound 5-10 (3.0 g, 5.57 mmol) in anhydrous THF (8 mL) was added dropwise. The resulting mixture was stirred at -75 ℃ for 4 h and warmed to room temperature with further stirring for 12 h. After completion of the reaction, the mixture was added dropwise to a cold 1 N HCl solution (30 mL) in an ice-bath. The mixture was extracted with EtOAc (50 mL x 2) and H2O (30 mL) . The organic layers were washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated to give a residue. The crude product was purified by silica gel column (eluted with 5%MeOH in DCM) to afford the title compound 5-12 (1.6 g, yield 50%) as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C26H51NO12: 569.69; found: 593.13 [M+Na] +.

[0521] Step 9: 4 N HCl in EtOAc (1.6 mL) was added to a solution of compound 5-12 (1.6 g, 2.81 mmol) in EtOAc (3 mL) . The mixture was stirred at room temperature for 3 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated to give the title compound 5-13 (hydrochloride, 1.4 g, yield 98%) as a yellow oil. LCMS: m / z calculated for C21H43NO10: 469.57; found: 470.81 [M+H] +.

[0522] Step 10: To a solution of compound 4-5 (460 mg, 0.92 mmol) and DIPEA (716 mg, 5.53 mmol) in anhydrous DMF (5 mL) was added HATU (1.4 g, 3.68 mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 10 min before a solution of compound 5-13 (1.4 g, 2.75 mmol) and DIPEA (716 mg, 5.53 mmol) in anhydrous DMF (5 mL) was added thereto. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h, additional HATU (702 mg, 1.85 mmol) and DIPEA (240 mg, 1.86 mmol) was added. The resulting mixture was stirred at room temperature for further 12 h. The mixture was filtered and the filtrate was purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 5-14 (600 mg, yield 46%) as a light brown oil. LCMS: m / z calculated for C60H113N5O27S2: 1400.69; found: 1401.92 [M+H] +.

[0523] Step 11: 1 N LiOH (0.86 mL, 0.86 mmol) was added to a solution of compound 5-14 (300 mg, 0.21 mmol) in THF (6 mL) at 0 ℃. The reaction mixture was warmed slowly to room temperature and stirred for 18 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated and adjusted to pH = 5. The aqueous solution was purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 5-15 (220 mg, yield 76%) as a pale-yellow oil. LCMS: m / z calculated for C56H105N5O27S2: 1344.58; found: 1345.87 [M+H] +.

[0524] Step 12: To a solution of compound 5-15 (70 mg, 0.05 mmol) , compound 5-9 (120 mg, 0.15 mmol) in anhydrous DMF (3 mL) was added DIPEA (80 mg, 0.62 mmol) and T3P (50w%in DMF, 200 mg, 0.31 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 18 h. After completion of the reaction, the mixture was quenched by addition of H2O (0.5 mL) . The resulting mixture was filtered and the filtrate was purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, AcOH condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 5-16 (57 mg, yield 38%) as a pale-yellow oil. LCMS: m / z calculated for C136H185F2N19O43S2: 2876.18; found: 1440.00 [M+2H] 2+.

[0525] Step 13: Under nitrogen atmosphere, to a solution of compound 5-16 (57 mg, 0.02 mmol) and compound 1-31 (20 mg, 0.04 mmol) in DMSO (1 mL) was added an aqueous ascorbic acid solution (1 M, 0.18 mL, 0.18 mmol) and an aqueous CuSO4 solution (1 M, 0.06 mL, 0.06 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and the filtrate was purified directly by pre-HPLC (C18 column, eluted with acetonitrile and water, AcOH condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 5 (31.6 mg, yield 47%) as a pale-yellow solid. LCMS: m / z calculated for C160H222F2N22O51S2: 3371.76; found: 1687.39 [M+2H] 2+.

[0526] Example 6. Synthesis of N- ( (1- ( (3R, 4R, 5S, 6R) -4- ( (26- ( (S) -10-benzyl-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-3-oxa-5, 8, 11, 14-tetraazahexadecan-16-yl) -27-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-29-thia-26-azadotriacontan-32-yl) oxy) -5-hydroxy-6- (hydroxymethyl) -2-methoxytetrahydro-2H-pyran-3-yl) -1H-1, 2, 3-triazol-4-yl) methyl) -1- (6- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) hexanamido) -3, 6, 9, 12-tetraoxapentadecan-15-amide (6)

[0527] Synthetic scheme 6

[0528] Step 1: To a solution of compound 1-7 (500 mg, 1.14 mmol) in anhydrous DCM (8 mL) was added HOBt (150 mg, 1.11 mmol) and EDCI (437 mg, 2.28 mmol) . After the mixture was stirred at room temperature for 10 min, to this was added a solution of compound 5-13 (800 mg, 1.58 mmol) and DIPEA (440 mg, 3.40 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for further 1 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and the filtrate was purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 6-1 (550 mg, yield 54%) as a yellow oil. LCMS: m / z calculated for C40H66N4O16S: 891.04; found: 892.25 [M+H] +.

[0529] Step 2: A mixture of compound 6-1 (550 mg, 0.62 mmol) and 80%aqueous trifluoroacetic acid solution (1.5 mL) in DCM (6 mL) was stirred at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated to give a residue. The crude product was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 6-2 (200 mg, yield 40%) as a pale-yellow oil. LCMS: m / z calculated for C33H62N4O16S: 802.93; found: 804.23 [M+H] +.

[0530] Step 3: To a solution of compound 6-2 (200 mg, 0.25 mmol) in THF (4 mL) was added 1 N aqueous LiOH solution (0.5 mL, 0.5 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 8 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The resulting residue was adjusted to pH = 5 with 1 N aqueous HCl solution. The final aqueous solution was filtered and concentrated to afford the title compound 6-3 (200 mg crude) as a pale-yellow oil. LCMS: m / z calculated for C31H58N4O16S: 774.88; found: 776.38 [M+H] +.

[0531] Step 4: To a solution of compound 6-3 (200 mg crude) and DIPEA (88 mg, 0.68 mmol) in anhydrous DMF (5 mL) was added HATU (128 mg, 0.34 mmol) . After the mixture was stirred at room temperature for 10 min, to this was added compound 5-9 (265 mg, 0.34 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for further 6 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and the filtrate was purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, AcOH condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 6-4 (160 mg, yield 41%over 2 steps) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C71H98FN11O24S: 1540.68; found: 1541.74 [M+H] 2+.

[0532] Step 5: Under nitrogen atmosphere, to a solution of compound 6-4 (80 mg, 0.05 mmol) and compound 1-31 (51 mg, 0.10 mmol) in DMSO (1 mL) was added CuI (19 mg, 0.10 mmol) and DIPEA (53 mg, 0.41 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 4 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and the filtrate was purified directly by pre-HPLC (C18 column, eluted with acetonitrile and water, AcOH condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 6 (30 mg, yield 28%) as a white solid. LCMS: m / z calculated for C95H135FN14O32S: 2036.25; found: 1019.65 [M+2H] 2+.

[0533] Example 7. Synthesis of (2S, 3S, 4S, 5R, 6S) -6- (2- (2- (2- ( (3- ( ( (3R, 4R, 5S, 6R) -3- (4- (24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 19-dioxo-6, 9, 12, 15-tetraoxa-2, 18-diazatetracosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) -5-hydroxy-6- (hydroxymethyl) -2-methoxytetrahydro-2H-pyran-4- yl) oxy) propyl) thio) acetamido) acetamido) -4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenoxy) -3, 4, 5-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-carboxylic acid (7)

[0534] Synthetic scheme 7

[0535] Step 1: Under nitrogen atmosphere, to a solution of compound 7-1 (10.0 g, 20.60 mmol) in EtOH (200 mL) was added 5w%Pd / C (1.5 g) and ammonium formate (10.4 g, 221.00 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 4 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered over diatomite. The filtrate was concentrated to give the title compound 7-2 (9.0 mg, yield 96%) as an off-white solid. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 6.80 (d, J = 8.2 Hz, 1H) , 6.66 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 6.45 (dd, J = 8.3, 2.1 Hz, 1H) , 5.48 (t, J = 9.7 Hz, 1H) , 5.39 (d, J = 7.9 Hz, 1H) , 5.14 –5.02 (m, 2H) , 4.97 (t, J = 5.7 Hz, 1H) , 4.66 (d, J = 10.0 Hz, 1H) , 4.58 (s, 2H) , 4.31 (d, J = 5.7 Hz, 2H) , 3.65 (s, 3H) , 2.02 (d, J = 15.8 Hz, 9H) . LCMS: m / z calculated for C20H25NO11: 455.42; found: 456.88 [M+H] +.

[0536] Step 2: Under nitrogen atmosphere, to a solution of compound 7-2 (9.0 mg, 19.76 mmol) and compound 7-3 (7.75 g, 26.07 mmol) in DCM (150 mL) was added EEDQ (16.12 g,  65.19 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 16 h. After completion of the reaction, the mixture was diluted with DCM (100 mL) and washed with 1 N aqueous HCl solution (200 mL) and H2O (150 mL x 2) . The organic layers were dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The residue was purified by silica gel column (eluted with 50%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 7-4 (11.2 g, yield 77%) as a white solid. LCMS: m / z calculated for C37H38N2O14: 734.71; found: 736.04 [M+H] +.

[0537] Step 3: Under nitrogen atmosphere, to a solution of compound 7-4 (11.2 g, 15.24 mmol) in anhydrous THF (120 mL) at 0 ℃ was added DIPEA (8.8 g, 68.09 mmol) and bis (4-nitrophenyl) carbonate (10.2 g, 33.53 mmol) . The reaction mixture was warmed slowly to room temperature and stirred for 12 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was extracted with H2O (150 mL) and EtOAc (150 mL x 2) . The organic layers were dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The residue was purified by silica gel column (eluted with 40%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 7-5 (11.0 g, yield 80%) as a white solid. LCMS: m / z calculated for C44H41N3O18: 899.82; found: 900.87 [M+H] +.

[0538] Step 4: To a mixture of compound 7-5 (3.06 g, 3.40 mmol) and compound 5-7 (1.64 g, 3.08 mmol) in anhydrous DMF (20 mL) was added HOBt (416 mg, 3.08 mmol) and 4-methylmorpholine (936 mg, 9.25 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After completion of the reaction, the mixture was added dropwise to a stirring cold water (100 mL) to form a brown precipitate. The final mixture was stirred at room temperature for 30 min before filtration. The solid was redissolved in DCM (150 mL) and washed with H2O (100 mL) and brine (100 mL) . The organic layer was dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The residue was purified by silica gel column (eluted with 4%DCM in MeOH) to afford the title compound 7-6 (2.76 g, yield 74%) as a brown solid. LCMS: m / z calculated for C62H58FN5O19: 1195.37; found: 1196.20 [M+H] +.

[0539] Step 5: To a solution of compound 7-6 (1.4 g, 1.17 mmol) in THF (30 mL) was added dropwise 0.1 N aqueous LiOH solution (70 mL, 7.00 mmol) at 0 ℃. The addition of LiOH was over 1.5 h and the pH of the reaction mixture was not more than 10. The reaction mixture was stirred at 0 ℃ for 0.5 h. After completion of the reaction, the mixture was adjusted to pH = 5 with saturated citric acid solution. The resulting mixture was concentrated. The residue was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water,  TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 7-7 (659 mg, yield 53%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C55H50FN5O16: 1056.02; found: 1057.25. [M+H] +.

[0540] Step 6: To a solution of compound 7-7 (462 mg, 0.44 mmol) in DMF (7 mL) was added piperidine (112 mg, 1.31 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 4 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 7-8 (312 mg, yield 85%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C40H40FN5O14: 833.26; found: 834.21 [M+H] +.

[0541] Step 7: To a solution of compound 1-7 (80 mg, 0.18 mmol) and N-Hydroxysuccinimide (42 mg, 0.36 mmol) in anhydrous DCM (3 mL) was added EDCI (70 mg, 0.36 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 3 h. After TLC showed the completion of the reaction, the mixture was diluted with DCM (10 mL) and washed with cold 0.1 N aqueous HCl solution (20 mL) and cold water (20 mL) . The organic layer was dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated to afford the title compound 1-30 (87 mg, yield 90%) as a yellow oil.

[0542] Step 8: To a solution of compound 7-8 (80 mg, 0.096 mmol) and DIPEA (56 mg, 0.43 mmol) in DMF (2 mL) was added a solution of compound 7-9 (87 mg, 0.16 mmol) in DCM (3 mL) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 16 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 7-10 (32 mg, yield 26%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C59H63FN8O20S: 1255.25; found: 1257.57 [M+H] +.

[0543] Step 9: To a solution of compound 7-10 (40 mg, 0.032 mmol) in THF (2 mL) and DCM (1 mL) was added 80%aqueous trifluoroacetic acid solution (1 mL) at room temperature. After the reaction was stirred for 2 h, the mixture was diluted with DCM and concentrated. The crude product was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 7-11 (27 mg, yield 72%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C52H59FN8O20S: 1167.14; found: 1168.53 [M+H] +.

[0544] Step 10: Under nitrogen atmosphere, to a solution of compound 7-11 (27 mg, 0.023 mmol) and compound 1-31 (25 mg, 0.05 mmol) in DMSO (1 mL) was added CuI (8 mg, 0.04 mmol) and DIPEA (20 mg, 0.15 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and the filtrate was purified directly by pre-HPLC (C18 column, eluted with acetonitrile and water, AcOH condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 7 (8.8 mg, yield 22%) as an off-white solid. LCMS: m / z calculated for C76H96FN11O28S: 1662.71; found: 1664.06 [M+H] +.

[0545] Example 8. Synthesis of (2S, 2'S ) -2, 2'- ( (26, 26'- (2, 2'- ( ( ( ( (2R, 3S, 4R, 5R) -2- (26- ( (S) -10-benzyl-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H,12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-3-oxa-5, 8, 11, 14-tetraazahexadecan-16-yl) -27-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 33-nonaoxa-29-thia-26-azatetratriacontan-34-yl) -5- (4- (24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 19-dioxo-6, 9, 12, 15-tetraoxa-2, 18-diazatetracosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) -6-methoxytetrahydro-2H-pyran-3, 4-diyl) bis (oxy) ) bis (propane-3, 1-diyl) ) bis (sulfanediyl) ) bis (acetyl) ) bis (28-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-26, 29-diazahentriacontan-31-oyl) ) bis (azanediyl) ) bis (N- (2- ( ( (2- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -2-oxoethoxy) methyl) amino) -2-oxoethyl) -3-phenylpropanamide) (8)

[0546] Synthetic scheme 8

[0547] Step 1: To a solution of compound 2-4 (200 mg, 0.32 mmol) , 5-13 (720 mg, 1.42 mmol) and DIPEA (500 mg, 3.87 mmol) in anhydrous DMF (9 mL) was added HATU (740 mg, 1.95 mmol) in 2 portions. The reaction mixture was stirred at room temperature for 2 days. After completion of the reaction, the mixture was diluted with DCM (50 mL) and washed with H2O (50 mL) . The organic layer was filtered and concentrated. The residue was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 8-1 (325 mg, yield 51%) as a pale-yellow oil. LCMS: m / z calculated for C85H160N6O38S3: 1970.40 found: 986.86 [M+2H] 2+.

[0548] Step 2: To a solution of compound 8-1 (325 mg, 0.16 mmol) in THF (4 mL) was added 2 N LiOH aqueous solution (0.5 mL, 1 mmol) at 0 ℃. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h. After completion of the reaction, the mixture was adjusted to pH = 5 with 1 N HCl and concentrated. The aqueous solution was filtered and the filtrate was purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 8-3 (228  mg, yield 73%) as a yellow oil. LCMS: m / z calculated for C79H148N6O38S3: 1886.24; found: 1887.92 [M+H] +.

[0549] Step 3: To a solution of compound 8-2 (100 mg, 0.053 mmol) and DIPEA (42.5 mg, 0.33 mmol) in anhydrous DMF (2 mL) was added HATU (122 mg, 0.32 mmol) . After the mixture was stirred at room temperature for 10 min, a solution of compound 5-9 (196 mg, 0.25 mmol) and DIPEA (42.5 mg, 0.33 mmol) in anhydrous DMF (2 mL) was added thereto. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h and quenched by adding H2O (0.2 mL) . The resulting mixture was filtered and the filtrate was purified directly by pre-HPLC (C18 column, eluted with acetonitrile and water, AcOH condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 8-3 (30 mg, yield 13%) as an off-white solid. LCMS: m / z calculated for C199H268F3N27O62S3: 4183.64; found: 1396.84 [M+3H] 3+.

[0550] Step 4: Under nitrogen atmosphere, to a solution of compound 8-3 (30 mg, 0.007 mmol) and compound 1-31 (7.5 mg, 0.015 mmol) in DMSO (1 mL) was added CuI (6 mg, 0.03 mmol) and DIPEA (16 mg, 0.12 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and the filtrate was purified directly by pre-HPLC (C18 column, eluted with acetonitrile and water, AcOH condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 8 (7 mg, yield 21%) as an off-white solid. LCMS: m / z calculated for C223H305F3N30O70S3: 4679.21; found: 1561.91 [M+3H] 3+.

[0551] Example 9. Synthesis of (2S, 2'S ) -2, 2'- ( (26, 26'- (2, 2'- ( ( ( ( (2R, 3S, 4R, 5R) -5- (4- (24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 19-dioxo-6, 9, 12, 15-tetraoxa-2, 18-diazatetracosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) -2- (hydroxymethyl) -6-methoxytetrahydro-2H-pyran-3, 4-diyl) bis (oxy) ) bis (propane-3, 1-diyl) ) bis (sulfanediyl) ) bis (acetyl) ) bis (28-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-26, 29-diazahentriacontan-31-oyl) ) bis (azanediyl) ) bis (N- (2- ( ( (2- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -2-oxoethoxy) methyl) amino) -2-oxoethyl) -3-phenylpropanamide) (9)

[0552] Synthetic scheme 9

[0553] Step 1: To a solution of compound 1-3 (10.27 g, 46.85 mmol) in pyridine (50 mL) was added t-butyldimethylsilyl chloride (15.54 g, 103.11 mmol) at 0 ℃. The reaction mixture was warmed slowly to room temperature and stirred for 12 h. After completion of the reaction, the mixture was diluted with DCM (200 mL) and washed with 0.5 N HCl (200 mL x 2) . The organic phase was washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column chromatography (eluted with 25%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 9-1 (8.46 g, yield 54%) as a colorless oil. A few compounds of mixed configuration were purified by pre-TLC to afford the single chiral compounds 9-1 (α) and 9-1 (β) , which were used to confirm the structure. 9-1 (α) : 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 4.76 (d, J = 3.5 Hz, 1H) , 4.03 –3.96 (m, 1H) , 3.90 (dd, J = 10.4, 4.5 Hz, 1H) , 3.79 (dd, J = 10.4, 5.7 Hz, 1H) , 3.66 –3.53 (m, 2H) , 3.42 (s, 3H) , 3.33 (s, 1H) , 3.23 (dd, J = 10.3, 3.5 Hz, 1H) , 2.87 (s, 1H) , 0.91 (s, 9H) , 0.10 (s, 6H) . 9-1 (β) : 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 4.23 (d, J = 7.9 Hz, 1H) , 3.95 (dd, J = 10.4, 4.9 Hz, 1H) , 3.83 (dd, J = 10.4, 6.3 Hz, 1H) , 3.57 (d, J = 14.2 Hz, 5H) , 3.47 –3.41 (m, 1H) , 3.36 –3.30 (m, 1H) , 3.30 –3.24 (m, 1H) , 2.88 (s, 1H) , 0.90 (s, 9H) , 0.10 (s, 6H) .

[0554] Step 2: To a solution of compound 9-1 (4.23 g, 12.69 mmol) in anhydrous DMF (45 mL) at 0 ℃ was added NaH (60%in mineral oil, 2.03 g, 50.75 mmol) in several portions under nitrogen atmosphere. After the mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h, allyl bromide (4.61 g, 38.10 mmol) was added thereto. The resulting mixture was stirred at room temperature for 16 h. After  completion of the reaction, the mixture was partitioned with EtOAc (100 mL) and water (100 mL) . The organic layer was washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column (eluted with 15%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 9-2 (2.18 g, yield 41%) as a colorless oil.

[0555] Step 3: A solution of compound 9-2 (2.18 g, 5.27 mmol) and methyl thioglycolate (5.59 g, 52.66 mmol) in dichloromethane (10 mL) was irradiated with UV 365 nm at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was purified by silica gel (eluted with 15%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 9-3 (2.62 g, yield 79%) as a colorless oil.

[0556] Step 4: A mixture of compound 9-3 (1.0 g, 1.60 mmol) and 2 N LiOH solution (3.2 mL, 6.4 mmol) in THF (10 mL) was stirred at room temperature for 4 h. After completion of the reaction, the mixture was acidized with AcOH to pH = 5 before concentration. The resulting aqueous solution was filtered and purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) to give the title compound 9-4 (730 mg, yield 76%) as a pale-brown oil. LCMS: m / z calculated for C23H43N3O9S2Si: 597.81; found: 599.10 [M+H] +.

[0557] Step 5: To a solution of compound 9-4 (330 mg, 0.55 mmol) and DIPEA (568 mg, 4.39 mmol) in anhydrous DMF (4 mL) was added HATU (840 mg, 2.21 mmol) in 2 portions. After the mixture was stirred at room temperature for 10 min, a solution of 5-13 (850 mg, 1.68 mmol) and DIPEA (213 mg, 1.65 mmol) in anhydrous DMF (5 mL) was added thereto. The reaction mixture was stirred at room temperature for 18 h. After completion of the reaction, the mixture was diluted with DCM (60 mL) and washed with H2O (60 mL) . The organic layer was filtered and concentrated. The residue was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) and the desired components were lyophilized in 0.1%TFA / H2O to remove the TBS group. The title compound 9-5 (170 mg, yield 20%) was obtained as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C59H111N5O27S2: 1386.67 found: 1387.92 [M+H] +.

[0558] Step 6: To a solution of compound 9-5 (170 mg, 0.123 mmol) in THF (4 mL) was added 1 N LiOH aqueous solution (0.49 mL, 0.49 mmol) at 0 ℃. The reaction mixture was stirred at room temperature for 12 h. After completion of the reaction, the mixture was adjusted to pH = 5 with 1 N HCl and concentrated. The aqueous solution was filtered and the filtrate was  purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, HCl condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 9-6 (152 mg, yield 92%) as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C55H103N5O27S2: 1330.56; found: 1331.74 [M+H] +.

[0559] Step 7: To a solution of compound 9-6 (60 mg, 0.046 mmol) , compound 5-9 (106 mg, 0.135 mmol) and DIPEA (48 mg, 0.37 mmol) in anhydrous DMF (2 mL) was added HATU (68 mg, 0.18 mmol) in 2 portions. The reaction mixture was stirred at room temperature for 24 h and quenched by adding H2O (0.3 mL) . The resulting mixture was filtered and the filtrate was purified directly by pre-HPLC (C18 column, eluted with acetonitrile and water, AcOH condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 9-7 (38 mg, yield 28%) as a pale-yellow solid. LCMS: m / z calculated for C135H183F2N19O43S2: 2862.16; found: 1432.52 [M+2H] 2+.

[0560] Step 8: Under nitrogen atmosphere, to a solution of compound 9-7 (38 mg, 0.014 mmol) and compound 1-31 (14 mg, 0.028 mmol) in DMSO (2 mL) was added CuI (5 mg, 0.026 mmol) and DIPEA (15 mg, 0.116 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and the filtrate was purified directly by pre-HPLC (C18 column, eluted with acetonitrile and water, AcOH condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 9 (12 mg, yield 25%) as an off-white solid. LCMS: m / z calculated for C159H220F2N22O51S2: 3355.47; found: 1119.93 [M+3H] 3+.

[0561] Example 10. Synthesis of (2S, 3S, 4S, 5R, 6S) -3, 4, 5-trihydroxy-6- ( {2- [ (1- { [ (3R, 4R, 5S, 6R) -3- {4- [24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 19-dioxo-2, 18-diaza-6, 9, 12, 15-tetraoxatetracos-1-yl] -1, 2, 3-triazol-1-yl} -5-hydroxy-6- (hydroxymethyl) -4- { [3- ( {1- [ (6S, 9S) -1-amino-6- [ ( {4- [ (5S, 8S, 11S, 12R) -11- [ (2S) -but-2-yl] -12- {2- [ (2S) -2- [ (3R, 4R, 7R, 8S) -8-hydroxy-4, 7-dimethyl-5-oxo-8-phenyl-6-aza-2-oxaoct-3-yl] tetrahydro-1H-pyrrol-1-yl] -2-oxoethyl} -4, 10-dimethyl-3, 6, 9-trioxo-5, 8-di (prop-2-yl) -2, 13-dioxa-4, 7, 10-triazatetradec-1-yl] phenyl} amino) carbonyl] -1, 8, 11-trioxo-9- (prop-2-yl) -2, 7, 10-triazahexadec-16-yl] -2, 5-dioxotetrahydro-1H-pyrrol-3-yl} sulfanyl) propyl] oxy} -3, 4, 5, 6-tetrahydro-2H-pyran-2-yl] oxy} -6, 9-dioxo-7-aza-4-thianon-9-yl) amino] -4- { [ ( { [ (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 12, 15-hexahydro-1H-cyclohexa [1, 2, 3- de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl] amino} carbonyl) oxy] methyl} phenyl} oxy) tetrahydropyran-2-carboxylic acid (10)

[0562] Synthetic scheme 10

[0563] Step 1: Under nitrogen atmosphere, to a solution of compound 1-2 (20.0 g, 97.48 mmol) in allyl alcohol (80 mL) was added acetyl chloride (11.48 g, 146.24 mmol) at 0 ℃. The reaction mixture was warmed slowly to 70 ℃ and stirred for 16 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was purified by silica gel column chromatography (eluted with 80%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 10-1 (5.89 g, yield 24%) as a yellow oil.

[0564] Step 2: A solution of compound 10-1 (5.89 g, 24.02 mmol) , p-TsOH (433 mg, 2.52 mmol) and dimethoxyphenylmethane (12.79 g, 84.03 mmol) in MeCN (60 mL) was stirred at 40 ℃ for 16 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was extracted with EtOAc (100 mL x 2) and H2O (150 mL) . The organic layers were washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column (eluted with 20%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound  10-2 (6.11 g, yield 76%) as a yellow solid. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.48 (dq, J =6.2, 3.1, 2.2 Hz, 2H) , 7.38 (td, J = 4.2, 3.6, 2.0 Hz, 3H) , 5.95 (ddq, J = 16.8, 11.4, 5.9 Hz, 1H) , 5.54 (d, J = 2.9 Hz, 1H) , 5.36 (dd, J = 17.2, 2.0 Hz, 1H) , 5.26 (dt, J = 10.4, 1.5 Hz, 1H) , 4.99 –4.38 (m, 1H) , 4.37 –4.21 (m, 2H) , 4.21 –3.86 (m, 1H) , 3.81 –3.64 (m, 2H) , 3.58 –3.50 (m, 2H) , 3.46 (q, J = 7.5, 7.1 Hz, 1H) , 3.43 –3.27 (m, 1H) .

[0565] Step 3: To a solution of compound 10-2 (5.26 g, 15.78 mmol) in anhydrous DMF (55 mL) at 0 ℃ was added NaH (60%in mineral oil, 1.9 g, 47.5 mmol) in several portions under nitrogen atmosphere. After the mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h, compound 10-3 (6.0g, 23.69 mmol) was added thereto. The resulting mixture was stirred at room temperature for 3 h. After completion of the reaction, the mixture was partitioned with EtOAc (150 mL) and water (150 mL) . The organic layer was washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column (eluted with 6%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 10-4 (4.98 g, yield 62%) as a colorless oil.

[0566] Step 4: A mixture of compound 10-4 (4.73 g, 9.35 mmol) and methyl thioglycolate (19.85 g, 187.02 mmol) was irradiated with UV 365 nm at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was purified by silica gel (eluted with 20%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 10-5 (4.73 g, yield 82%) as a pale-yellow oil.

[0567] Step 5: To a solution of compound 10-5 (4.73 g, 7.73 mmol) in THF (30 mL) was added TBAF (1 M in THF, 23.2 mL, 23.2 mmol) at 0 ℃ under nitrogen atmosphere. The mixture was stirred at 0 ℃ for 3 h. After completion of the reaction, the mixture was diluted with EtOAc (100 mL) and washed with H2O and brine. The organic layer was dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The residue was purified by silica gel column chromatography (eluted with 30%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 10-6 (2.52 g, yield 65%) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.47 (dt, J = 6.8, 3.3 Hz, 2H) , 7.37 (dt, J = 4.5, 2.4 Hz, 3H) , 5.55 (d, J = 5.3 Hz, 1H) , 4.90 –4.25 (m, 1H) , 4.08 –3.92 (m, 2H) , 3.92 –3.83 (m, 2H) , 3.81 –3.67 (m, 7H) , 3.64 –3.45 (m, 2H) , 3.42 –3.25 (m, 2H) , 3.24 (d, J = 1.8 Hz, 2H) , 2.78 (q, J = 7.3 Hz, 2H) , 2.33 (t, J = 6.7 Hz, 1H) , 1.95 (q, J = 6.7 Hz, 2H) , 1.86 –1.80 (m, 2H) .

[0568] Step 6: To a solution of compound 10-6 (2.47 g, 4.96 mmol) and Et3N (1.01 g, 9.98 mmol) in anhydrous DCM (30 mL) was added slowly MsCl (1.18 g, 10.30 mmol) at 0 ℃. The reaction was stirred at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture  was diluted with EtOAc (100 mL) and washed with 0.5 N HCl aqueous solution. The organic layer was washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated to afford the title compound 10-7 (2.85 g, crude product) as a yellow oil, which was used into the next step without further purification.

[0569] Step 7: To a solution of compound 10-7 (2.85 g, 4.95 mmol) in anhydrous DMF (30 mL) was added potassium thioacetate (1.13 g, 9.89 mmol) . The reaction was stirred at room temperature for 6 h. After completion of the reaction, the mixture was extracted with EtOAc (50 mL x 2) and H2O (50 mL) . The combined organic layers were washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The residue was purified by silica gel column chromatography (eluted with 9%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 10-8 (1.63 g, yield 59%over 2 steps) as a pale-brown oil. LCMS: m / z calculated for C24H33N3O8S2: 555.66; found: 578.0 [M+Na] +.

[0570] Step 8: To a solution of compound 10-8 (500 mg, 0.90 mmol) in anhydrous MeOH (4 mL) was added dropwise sodium methoxide (0.5 M in MeOH, 3.6 mL, 1.80 mmol) at 0 ℃. The reaction mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was acidized with AcOH to pH = 5. The resulting mixture was extracted with EtOAc (20 mL x 2) and H2O (20 mL) . The combined organic layers were dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated to dryness to afford the title compound 10-9 (416 mg, yield 90%) as a colorless oil.

[0571] Step 9: Under nitrogen atmosphere, to a solution of compound 10-9 (416 mg, 0.81 mmol) in THF (5 mL) was 1 N LiOH aqueous solution (1.35 mL, 1.35 mmol) at 0 ℃. The reaction mixture was stirred at 0 ℃ for 2 h. After completion of the reaction, the mixture was acidized with 1 N HCl (1.35 mL) . The resulting mixture was concentrated to dryness to afford the title compound 10-10 (434 mg, yield 99%) as a grey-white oil. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.48 (tt, J = 6.5, 2.3 Hz, 2H) , 7.41 –7.34 (m, 3H) , 5.55 (d, J = 7.5 Hz, 1H) , 4.61 (dd, J = 207.2, 3.8 Hz, 1H) , 4.33 –4.26 (m, 1H) , 4.09 –3.95 (m, 2H) , 3.93 –3.74 (m, 4H) , 3.71 –3.53 (m, 2H) , 3.40 –3.28 (m, 2H) , 3.26 (d, J = 6.1 Hz, 2H) , 2.85 –2.77 (m, 2H) , 2.67 –2.59 (m, 2H) , 1.97 (dddd, J = 10.4, 8.8, 4.6, 1.5 Hz, 2H) , 1.92 –1.83 (m, 2H) .

[0572] Step 10: To a solution of compound 10-10 (150 mg, 0.30 mmol) in DMSO (5 mL) was added 10-11 (107 mg, 0.08 mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 4 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered. The filtrate was purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA  condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 10-12 (130 mg, yield 88%) as a white solid. LCMS: m / z calculated for C89H134N14O22S2: 1816.25; found: 909.68 [M+2H] 2+.

[0573] Step 11: To a mixture of compound 10-12 (130 mg, 0.07 mmol) and N-Hydroxysuccinimide (25 mg, 0.22 mmol) in anhydrous DCM (5mL) was added EDCI (28 mg, 0.15 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 4 h under nitrogen atmosphere. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 10-13 (108 mg, yield 79%) as a white solid. LCMS: m / z calculated for C93H137N15O24S2: 1913.32; found: 957.04 [M+2H] 2+.

[0574] Step 12: To a solution of compound 7-8 (57 mg, 0.068) and DIPEA (27 mg, 0.21 mmol) in DMF (3.5 mL) was added compound 10-13 (108 mg, 0.056 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 3 h. After completion of the reaction, the mixture was concentrated. The residue was filtered and purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 10-14 (106 mg, yield 71%) as a white solid. LCMS: m / z calculated for C129H172FN19O35S2: 2632.01; found: 1316.60 [M+2H] 2+.

[0575] Step 13: To a solution of compound 10-14 (106 mg, 0.040 mmol) in THF (3 mL) and DCM (1.5 mL) was added 80%aqueous trifluoroacetic acid solution (1.1 mL) at 0 ℃. After the reaction was stirred at room temperature for 3 h, additional 80%aqueous trifluoroacetic acid solution (1 mL) was added thereto. The reaction was stirred at room temperature for further 6 h. After completion of the reaction, the mixture was diluted with DCM and concentrated. The crude product was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 10-15 (30 mg, yield 29%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C122H168FN19O35S2: 2543.90; found: 1273.08 [M+2H] 2+.

[0576] Step 14: Under nitrogen atmosphere, to a solution of compound 10-15 (30 mg, 0.012 mmol) and compound 1-31 (9 mg, 0.018 mmol) in DMSO (2 mL) was added CuI (5 mg, 0.026 mmol) and DIPEA (13 mg, 0.10 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and the filtrate was purified  directly by pre-HPLC (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 10 (14.8 mg, yield 41%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C146H205FN22O43S2: 3039.48; found: 1520.34 [M+2H] 2+.

[0577] Example 11. Synthesis of (2S, 2'S , 3S, 3'S , 4S, 4'S , 5R, 5'R, 6S, 6'S ) -6, 6'- ( ( ( (2, 2'- ( (2, 2'- ( ( ( ( (2R, 3S, 4R, 5R) -5- (4- (24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 19-dioxo-6, 9, 12, 15-tetraoxa-2, 18-diazatetracosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) -2- (hydroxymethyl) -6-methoxytetrahydro-2H-pyran-3, 4-diyl) bis (oxy) ) bis (propane-3, 1-diyl) ) bis (sulfanediyl) ) bis (acetyl) ) bis (azanediyl) ) bis (acetyl) ) bis (azanediyl) ) bis (4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) -2, 1-phenylene) ) bis (oxy) ) bis (3, 4, 5-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-carboxylic acid) (11)

[0578] Synthetic scheme 11

[0579] Step 1: To a mixture of compound 9-4 (200 mg, 0.33 mmol) and N-Hydroxysuccinimide (230 mg, 2.00 mmol) in anhydrous DCM (5 mL) was added DCC (210 mg, 1.02 mmol) at 0 ℃. The reaction mixture was stirred at room temperature for 16 h under nitrogen atmosphere. After completion of the reaction, the mixture was filtered and concentrated. The residue was purified by pre-TLC (SiO2, petroleum ether / EtOAc=1: 1) to afford the title compound 11-1 (136 mg, yield 52%) as a colorless oil. LCMS: m / z calculated for C31H49N5O13S2Si: 791.96; found: 793.46 [M+H] +.

[0580] Step 2: To a solution of compound 7-8 (247 mg, 0.30 mmol) and DIPEA (78 mg, 0.60 mmol) in anhydrous DMF (3 mL) was added dropwise a solution of compound 11-1 (80 mg, 0.10 mmol) in anhydrous DMF (1 mL) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 20 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and purified directly by pre-HPLC (C18 column, eluted with acetonitrile and water, AcOH condition) and the desired components were lyophilized in 0.1%TFA / H2O to remove the TBS group. The title compound 11-2 (135 mg, yield 63%) was obtained as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C97H105F2N13O35S2: 2115.08 found: 1057.8 [M+2H] 2+.

[0581] Step 3: Under nitrogen atmosphere, to a solution of compound 11-2 (30 mg, 0.014 mmol) and compound 1-31 (14 mg, 0.028 mmol) in DMSO (2 mL) was added CuI (6 mg, 0.032 mmol) and DIPEA (15 mg, 0.12 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature  for 2 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and the filtrate was purified directly by pre-HPLC (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 11 (10.6 mg, yield 28%) as a yellow solid. LCMS: m / z calculated for C121H142F2N16O43S2: 2610.65; found: 1306.24 [M+2H] 2+.

[0582] Example 12. Synthesis of 4- ( (2S) -2- ( (2S) -2- (6- (3- ( (3- ( ( (3R, 4R, 5S, 6R) -3- (4- (24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 19-dioxo-6, 9, 12, 15-tetraoxa-2, 18-diazatetracosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) -5-hydroxy-6- (hydroxymethyl) -2-methoxytetrahydro-2H-pyran-4-yl) oxy) propyl) thio) -2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl) hexanamido) -3-methylbutanamido) -5-ureidopentanamido) benzyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (3R, 4S, 5S) -1- ( (S) -2- ( (1R, 2R) -3- ( ( (1S, 2R) -1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl) amino) -1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl) pyrrolidin-1-yl) -3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl) (methyl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) (methyl) carbamate (12)

[0583] Synthetic scheme 12

[0584] Step 1: To a solution of compound 1-4 (3.80 g, 12.36 mmol) in anhydrous DMF (30 mL) was added NaH (60%in mineral oil, 1.48 g, 37.00 mmol) in several portions under nitrogen atmosphere. After the mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h, a solution of compound 10-3 (4.70 g, 15.56 mmol) in anhydrous DMF (5 mL) was added thereto. The resulting mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was partitioned with EtOAc (200 mL) and water (300 mL) . The organic layer was washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column (eluted with 9%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 12-1 (5.78 g, yield 97%) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.47 (dt, J = 5.6, 3.4 Hz, 2H) , 7.36 (dd, J = 5.3, 2.0 Hz, 3H) , 5.55 (s, 1H) , 4.76 (d, J = 3.7 Hz, 2H) , 4.01 (dq, J = 14.3, 5.5, 4.5 Hz, 1H) , 3.86 (d, J = 9.3 Hz, 1H) , 3.82 –3.75 (m, 2H) , 3.69 (dd, J = 7.5, 5.0 Hz, 3H) , 3.58 (d, J = 6.0 Hz, 2H) , 3.43 (s, 2H) , 3.41 (s, 1H) , 1.81 (q, J = 6.1 Hz, 2H) , 0.86 (d, J = 3.6 Hz, 9H) , 0.00 (d, J = 3.7 Hz, 6H) .

[0585] Step 2: To a solution of compound 12-1 (5.74 g, 11.97 mmol) in THF (60 mL) was added TBAF (1 M in THF, 17.94 mL, 17.94 mmol) at 0 ℃ under nitrogen atmosphere. The mixture was stirred at 0 ℃ for 3 h. After completion of the reaction, the mixture was extracted  with EtOAc (100 mL x 2) and H2O (100 mL) . The combined organic layers were washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The residue was purified by silica gel column chromatography (eluted with 25%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 12-2 (4.14 g, yield 94%) as a pale-yellow oil.

[0586] Step 3: Under nitrogen atmosphere, to a mixture of compound 12-2 (4.09 g, 11.20 mmol) and triphenylphosphine (3.23 g, 12.31 mmol) in anhydrous DCM (50 mL) was added N-bromosuccinimide (2.19 g, 12.30 mmol) at 0 ℃. The reaction mixture was warmed to room temperature and stirred for 14 h. After completion of the reaction, the mixture diluted with EtOAc (100 mL) and washed with water (100 mL) . The organic phase was washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The residue was purified by silica gel column chromatography (eluted with 15%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 12-3 (3.4 g, yield 70%) as a colorless oil.

[0587] Step 4: A mixture of compound 12-3 (990 mg, 2.31 mmol) and potassium thioacetate (528 mg, 4.62 mmol) in anhydrous DMF (7 mL) was stirred at room temperature for 6 h. After completion of the reaction, the mixture was extracted with EtOAc (50 mL x 2) and H2O (70 mL) . The combined organic layers were washed with brine, dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column chromatography (eluted with 15%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 12-4 (670 mg, yield 68%) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.47 (ddd, J = 6.1, 4.1, 2.0 Hz, 2H) , 7.41 –7.35 (m, 3H) , 5.56 (d, J = 2.3 Hz, 1H) , 4.78 –4.22 (m, 2H) , 3.96 (ddd, J = 13.6, 9.7, 6.8 Hz, 1H) , 3.90 –3.80 (m, 1H) , 3.79 –3.70 (m, 2H) , 3.63 –3.56 (m, 2H) , 3.43 (s, 2H) , 3.42 –3.30 (m, 2H) , 2.97 (td, J = 7.1, 3.2 Hz, 2H) , 2.26 (d, J = 5.0 Hz, 3H) , 1.90 –1.82 (m, 2H) .

[0588] Step 5: Under nitrogen atmosphere, to a solution of compound 12-4 (300 mg, 0.71 mmol) in anhydrous MeOH (3 mL) was added dropwise sodium methoxide (0.5 M in MeOH, 7 mL, 0.35 mmol) at 0 ℃. The reaction mixture was stirred at 0 ℃ for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was acidized with AcOH to pH = 5. The resulting mixture was extracted with EtOAc (30 mL x 2) and H2O (30 mL) . The combined organic layers were dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated. The crude product was purified by silica gel column chromatography (eluted with 25%EtOAc in petroleum ether) to afford the title compound 12-5 (251 mg, yield 92%) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.50 –7.45 (m, 2H) , 7.41 –7.34 (m, 3H) , 5.56 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 4.80 –4.24 (m, 2H) , 3.99  (ddt, J = 12.3, 9.8, 5.9 Hz, 1H) , 3.91 –3.80 (m, 2H) , 3.79 –3.72 (m, 1H) , 3.63 –3.55 (m, 2H) , 3.44 (s, 2H) , 3.42 –3.30 (m, 2H) , 2.68 –2.55 (m, 2H) , 1.88 (tt, J = 6.8, 4.3 Hz, 2H) .

[0589] Step 6: Step 10: To a solution of compound 12-5 (52 mg, 0.14 mmol) in DMF (5 mL) was added 10-11 (150 mg, 0.11 mmol) . The mixture was stirred at room temperature for 4 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered. The filtrate was purified directly by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 12-6 (127 mg, yield 68%) as an off-white solid. LCMS: m / z calculated for C85H128N14O20S: 1698.10; found: 1699.46 [M+H] +.

[0590] Step 7: To a solution of compound 12-6 (127 mg, 0.075 mmol) in THF (1 mL) and DCM (2 mL) was added 80%aqueous trifluoroacetic acid solution (0.5 mL) at 0 ℃. The reaction was stirred at room temperature for 5 h. After completion of the reaction, the mixture was diluted with DCM and concentrated. The crude product was purified by reverse phase flash chromatography (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 12-7 (58 mg, yield 48%) as a white solid. LCMS: m / z calculated for C78H124N14O20S: 1609.99; found: 1610.34 [M+H] +.

[0591] Step 8: Under nitrogen atmosphere, to a solution of compound 12-7 (50 mg, 0.031 mmol) and compound 1-31 (31 mg, 0.062 mmol) in DMSO (2 mL) was added CuI (6 mg, 0.031 mmol) and DIPEA (16 mg, 0.124 mmol) . The reaction mixture was stirred at room temperature for 1 h. After completion of the reaction, the mixture was filtered and the filtrate was purified directly by pre-HPLC (C18 column, eluted with acetonitrile and water, TFA condition) . The desired components were lyophilized to afford the title compound 12 (41.9 mg, yield 64%) as a white solid. LCMS: m / z calculated for C102H161N17O28S: 2105.56; found: 1053.79 [M+2H] 2+.

[0592] The below compounds were synthesized following similar procedures as shown above.

[0593] Example 13. 4- ( (2S) -2- ( (2S) -2- (6- (3- ( (3- ( ( (3R, 4R, 5S, 6R) -2- ( (26- ( (S) -10-benzyl-1- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -1, 6, 9, 12, 15-pentaoxo-3-oxa-5, 8, 11, 14-tetraazahexadecan-16-yl) -27-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-29-thia-26-azadotriacontan-32-yl) oxy) -3- (4- (24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 19-dioxo-6, 9, 12, 15-tetraoxa-2, 18-diazatetracosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) -5-hydroxy-6-  (hydroxymethyl) tetrahydro-2H-pyran-4-yl) oxy) propyl) thio) -2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl) hexanamido) -3-methylbutanamido) -5-ureidopentanamido) benzyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (3R, 4S, 5S) -1- ( (S) -2- ( (1R, 2R) -3- ( ( (1S, 2R) -1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl) amino) -1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl) pyrrolidin-1-yl) -3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl) (methyl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) (methyl) carbamate

[0594] Example 14. (2S, 3S, 4S, 5R, 6S) -6- (4- ( (5S, 8S, 11S, 12R) -11- ( (S) -sec-butyl) -12- (2- ( (S) -2- ( (1R, 2R) -3- ( ( (1S, 2R) -1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl) amino) -1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl) pyrrolidin-1-yl) -2-oxoethyl) -5, 8-diisopropyl-4, 10-dimethyl-3, 6, 9-trioxo-2, 13-dioxa-4, 7, 10-triazatetradecyl) -2- (2- (3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) propanamido) acetamido) phenoxy) -3, 4, 5-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-carboxylic acid

[0595] Example 15. (2S, 3S, 4S, 5R, 6S) -6- (2- (2- (2- ( (3- ( ( (2S, 3R, 4R, 5S, 6R) -2- (3- ( (1- (3- ( (2- ( (5- ( (5S, 8S, 11S, 12R) -11- ( (S) -sec-butyl) -12- (2- ( (S) -2- ( (1R, 2R) -3- ( ( (1S, 2R) -1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl) amino) -1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl) pyrrolidin-1-yl) -2-oxoethyl) -5, 8-diisopropyl-4, 10-dimethyl-3, 6, 9-trioxo-2, 13-dioxa-4, 7, 10-triazatetradecyl) -2- ( ( (2S, 3R, 4S, 5S, 6S) -6-carboxy-3, 4, 5-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-yl) oxy) phenyl) amino) -2-oxoethyl) amino) -3-oxopropyl) -2, 5-dioxopyrrolidin-3-yl) thio) propoxy) -3- (4- (24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 19-dioxo-6, 9, 12, 15-tetraoxa-2, 18-diazatetracosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) -5-hydroxy-6- (hydroxymethyl) tetrahydro-2H-pyran-4-yl) oxy) propyl) thio) acetamido) acetamido) -4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenoxy) -3, 4, 5-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-carboxylic acid

[0596] Example 16. (2S, 3S, 4S, 5R, 6S) -6- (2- (2- (3- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) propanamido) acetamido) -4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) phenoxy) -3, 4, 5-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-carboxylic acid

[0597] Example 17. (2S, 2'S ) -2, 2'- ( (2, 2'- ( (2, 2'- ( (2, 2'- ( ( ( ( (2R, 3R, 4R, 5R, 6R) -2- ( (4- (2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26-nonaoxaheptacosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) methyl) -6- ( (2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxapentacosan-25-yl) oxy) -5- (4- (24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 19-dioxo-6, 9, 12, 15-tetraoxa-2, 18-diazatetracosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) tetrahydro-2H-pyran-3, 4-diyl) bis (oxy) ) bis (propane-3, 1-diyl) ) bis (sulfanediyl) ) bis (acetyl) ) bis (azanediyl) ) bis (acetyl) ) bis (azanediyl) ) bis (acetyl) ) bis (aza nediyl) ) bis (N- (2- ( ( (2- ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) amino) -2-oxoethoxy) methyl) amino) -2-oxoethyl) -3-phenylpropanamide)

[0598] Example 18. (2～ {S} , 3～ {S} , 4～ {S} , 5～ {R} , 6～ {S} ) -6- [2- [ [2- [ [2- [3- [4- [3- [2- [ [2- [2- [ (2～ {S} , 3～ {R} , 4～ {S} , 5～ {S} , 6～ {S} ) -6-carboxy-3, 4, 5-trihydroxy-tetrahydropyran-2-yl] oxy-5- [ [ (10～ {S} , 23～ {S} ) -10-ethyl-18-fluoro-10-hydroxy-19-methyl-5, 9-dioxo-8-oxa-4, 15-diazahexacyclo [14.7.1.0^ {2, 14} . 0^ {4, 13} . 0^ {6, 11} . 0^ {20, 24} ] tetracosa-1, 6 (11) , 12, 14, 16, 18, 20 (24) -heptaen-23-yl] carbamoyloxymethyl] anilino] -2-oxo-ethyl] amino] -2-oxo-ethyl] sulfanylpropoxy] -5- [4- [ [3- [2- [2- [2- [2- [6- (2, 5-dioxopyrrol-1-yl) hexanoylamino] ethoxy] ethoxy] ethoxy] ethoxy] propanoylamino] methyl] triazol-1-yl] -2- (hydroxymethyl) -6- [3- [ [2- [1- [6- [ [ (1～ {S} ) -1- [ [ (1～ {S} ) -1- [ [4- [ [ [ (1～ {S} ) -1- [ [ (1～ {S} ) -1- [ [ (1～ {S} , 2～ {R} ) -4- [ (2～ {S} ) -2- [ (1～ {R} , 2～ {R} ) -3- [ [ (1～ {R} , 2～ {S} ) -2-hydroxy-1-methyl-2-phenyl-ethyl] amino] -1-methoxy-2-methyl-3-oxo-propyl] pyrrolidin-1-yl] -2-methoxy-1- [ (1～ {S} ) -1-methylpropyl] -4-oxo-butyl] -methyl-carbamoyl] -2-methyl-propyl] carbamoyl] -2-methyl-propyl] -methyl-carbamoyl] oxymethyl] phenyl] carbamoyl] -4-ureido- butyl] carbamoyl] -2-methyl-propyl] amino] -6-oxo-hexyl] -2, 5-dioxo-pyrrolidin-3-yl] sulfanylacetyl] amino] propoxy] tetrahydropyran-3-yl] oxypropylsulfanyl] acetyl] amino] acetyl] amino] -4- [ [ (10～ {S} , 23～ {S} ) -10-ethyl-18-fluoro-10-hydroxy-19-methyl-5, 9-dioxo-8-oxa-4, 15-diazahexacyclo [14.7.1.0^ {2, 14} . 0^ {4, 13} . 0^ {6, 11} . 0^ {20, 24} ] tetracosa-1, 6 (11) , 12, 14, 16, 18, 20 (24) -heptaen-23-yl] carbamoyloxymethyl] phenoxy] -3, 4, 5-trihydroxy-tetrahydropyran-2-carboxylic acid

[0599] Example 19. ( ( ( (2S, 2'S ) -2, 2'- ( (2, 2'- ( ( ( ( (2R, 3R, 4R, 5R, 6R) -2- ( (4- (2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26-nonaoxaheptacosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) methyl) -6- ( (2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxapentacosan-25-yl) oxy) -5- (4- (24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 19-dioxo-6, 9, 12, 15-tetraoxa-2, 18-diazatetracosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) tetrahydro-2H-pyran-3, 4-diyl) bis (oxy) ) bis (propane-3, 1-diyl) ) bis (sulfanediyl) ) bis (acetyl) ) bis (azanediyl) ) bis (6-aminohexanoyl) ) bis (azanediyl) ) bis (4, 1-phenylene) ) bis (methylene) bis ( (S) -4, 11-diethyl-9-hydroxy-3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) bis (carbonate)

[0600] Example 20. (2S, 2'S , 3S, 3'S , 4S, 4'S , 5R, 5'R, 6S, 6'S ) -6, 6'- ( ( ( (2, 2'- ( (2, 2'- ( ( ( ( (2R, 3R, 4R, 5R, 6R) -2- ( (4- (2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26-nonaoxaheptacosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) methyl) -6- ( (2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxapentacosan-25-yl) oxy) -5- (4- (24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 19-dioxo-6, 9, 12, 15-tetraoxa-2, 18-diazatetracosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) tetrahydro-2H-pyran-3, 4-diyl) bis (oxy) ) bis (propane-3, 1-diyl) ) bis (sulfanediyl) ) bis (acetyl) ) bis (azanediyl) ) bis (acetyl) ) bis (azanediyl) ) bis (4- ( ( ( ( (1S, 9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2, 3, 9, 10, 13, 15-hexahydro-1H, 12H-benzo [de] pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-1-yl) carbamoyl) oxy) methyl) -2, 1-phenylene) ) bis (oxy) ) bis (3, 4, 5-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-carboxylic acid)

[0601] Example 21. (2～ {S} , 3～ {S} , 4～ {S} , 5～ {R} , 6～ {S} ) -6- [2- [ [2- [ [2- [3- [4- [3- [2- [ [2- [2- [ (2～ {S} , 3～ {R} , 4～ {S} , 5～ {S} , 6～ {S} ) -6-carboxy-3, 4, 5-trihydroxy-tetrahydropyran-2-yl] oxy-5- [ [ (10～ {S} , 23～ {S} ) -10-ethyl-18-fluoro-10-hydroxy-19-methyl-5, 9-dioxo-8-oxa-4, 15-diazahexacyclo [14.7.1.0^ {2, 14} . 0^ {4, 13} . 0^ {6, 11} . 0^ {20, 24} ] tetracosa-1, 6 (11) , 12, 14, 16, 18, 20 (24) -heptaen-23-yl] carbamoyloxymethyl] anilino] -2-oxo-ethyl] amino] -2-oxo-ethyl] sulfanylpropoxy] -6- [3- [ [2- [1- [3- [ [2- [2- [ (2～ {S} , 3～ {R} , 4～ {S} , 5～ {S} , 6～ {S} ) -6-carboxy-3, 4, 5-trihydroxy-tetrahydropyran-2-yl] oxy-5- [ [ [ (1～ {S} ) -1- [ [ (1～ {S} ) -1- [ [ (1～ {S} , 2～ {R} ) -4- [ (2～ {S} ) -2- [ (1～ {R} , 2～ {R} ) -3- [ [ (1～ {R} , 2～ {S} ) -2-hydroxy-1-methyl-2-phenyl-ethyl] amino] -1-methoxy-2-methyl-3-oxo-propyl] pyrrolidin-1-yl] -2-methoxy-1- [ (1～ {S} ) -1-methylpropyl] -4-oxo-butyl] -methyl-carbamoyl] -2-methyl-propyl] carbamoyl] -2-methyl-propyl] -methyl-carbamoyl] oxymethyl] anilino] -2-oxo-ethyl] amino] -3-oxo-propyl] - 2, 5-dioxo-pyrrolidin-3-yl] sulfanylacetyl] amino] propoxy] -5- [4- [ [3- [2- [2- [2- [2- [6- (2, 5-dioxopyrrol-1-yl) hexanoylamino] ethoxy] ethoxy] ethoxy] ethoxy] propanoylamino] methyl] triazol-1-yl] -2- (hydroxymethyl) tetrahydropyran-3-yl] oxypropylsulfanyl] acetyl] amino] acetyl] amino] -4- [ [ (10～ {S} , 23～ {S} ) -10-ethyl-18-fluoro-10-hydroxy-19-methyl-5, 9-dioxo-8-oxa-4, 15-diazahexacyclo [14.7.1.0^ {2, 14} . 0^ {4, 13} . 0^ {6, 11} . 0^ {20, 24} ] tetracosa-1, 6 (11) , 12, 14, 16, 18, 20 (24) -heptaen-23-yl] carbamoyloxymethyl] phenoxy] -3, 4, 5-trihydroxy-tetrahydropyran-2-carboxylic acid

[0602] Example 22.4- ( (2S) -2- ( (2S) -2- (6- (3- ( (3- ( ( (3R, 4R, 5S, 6R) -2- ( (26- (2- (2- (2- ( ( (S) -6-amino-1- ( (4- ( ( ( ( ( (S) -4, 11-diethyl-9-hydroxy-3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) oxy) carbonyl) oxy) methyl) phenyl) amino) -1-oxohexan-2-yl) amino) -2-oxoethoxy) acetamido) ethyl) -27-oxo-2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23-octaoxa-29-thia-26-azadotriacontan-32-yl) oxy) -3- (4- (24- (2, 5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl) -3, 19-dioxo-6, 9, 12, 15-tetraoxa-2, 18-diazatetracosyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) -5-hydroxy-6-  (hydroxymethyl) tetrahydro-2H-pyran-4-yl) oxy) propyl) thio) -2, 5-dioxopyrrolidin-1-yl) hexanamido) -3-methylbutanamido) -5-ureidopentanamido) benzyl ( (S) -1- ( ( (S) -1- ( ( (3R, 4S, 5S) -1- ( (S) -2- ( (1R, 2R) -3- ( ( (1S, 2R) -1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl) amino) -1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl) pyrrolidin-1-yl) -3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl) (methyl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) amino) -3-methyl-1-oxobutan-2-yl) (methyl) carbamate

[0603] Example 23. General Conjugation procedure of SL to monoclonal Antibody

[0604] The general conjugates of SL’s and monoclonal antibodies were formed using reported conjugation condition (Doronina, et al. 2003 Nature Biotechnology 21 (7) : 778-84) . The mAbs were reduced with TCEP and then alkylated with the maleimido-containing SL’s forming the corresponding ADC conjugates (Table 1) . The hydrophobic interaction chromatography (HIC) chromatographs and size exclusion high-performance liquid chromatography (SEC-HPLC) chromatographs were shown in FIGs. 14-18.

[0605] Table 1

[0606] Example 24. Hydrophilicity measure by high-performance liquid chromatography (HPLC)

[0607] Relative hydrophilicity of SL1 comparing to its monomer SL2 was measured by HPLC (Valkó et al. 1997 Analytical Chemistry 69 (11) , 2022–2029) . As shown in FIG. 9 and FIG. 10, the retention times of both SL1 and its monomer SL2 are about the same (8.05 min vs. 8.26 min) , indicating that although there are three more lipophilic SN-38 drugs in the sugar core of SL1, the SL1 has the similar hydrophilicity properties as its monomer SL2. This property is important for reducing ADC aggregation and maintaining its native Ab’s pharmacokinetic properties (Lyon et al. 2015 Nature Biotechnology 33, 733–735) .

[0608] Example 25. In vitro serum stability assays

[0609] (1) Materials

[0610] CD-1 Mouse Serum

[0611] Human Serum

[0612] (2) Compound Information

[0613] Test Compound: 2.3 mg / mL

[0614] Propantheline bromide as Control Compound: 10.0 mM

[0615] (3) Assay Procedures

[0616] 1. On the day of experiment, thaw the serum under running cold tap water and centrifuge at 3000×g, 20℃ for 5 minutes to remove any clots, filtered aseptic membrane at biosafety cabinet.

[0617] 2. For test compound, spike aliquots of stock solution into 1x PBS to achieve the concentration (200 μg / mL) of working solution and mix thoroughly.

[0618] 3. For control compound Propantheline bromide, aliquots of stock solution into MeOH to achieve the concentration (50 μM) of working solution and mix thoroughly.

[0619] 4. Add 950 μL of blank serum (experimental group, n=2) and 980 μL of blank serum (positive control group) into the corresponding well of sample plates.

[0620] 5. Pre-incubate the sample plates at 37℃ for approximately 10 min.

[0621] 6. For T0 sample plates, firstly, add 150 μL stop solution to the corresponding wells. Secondly, add 50.0 μL (experimental group) or 20 μL (positive control group) of the compound working solution to achieve final concentration Propantheline bromide aliquots 1.00 μM (positive control group) and the testing ADC 10 μg / mL (experimental group) and shake well. Finally take aliquots of 50 μL serum samples to T0 sample plate.

[0622] 7. After 5, 15, 30, 60 and 120 minutes of reaction (37℃, 600 rpm) for positive control group, 0.5h, 1h, 4h, 8h, 24h, 2d, 4d and 7d of reaction (37℃, 600 rpm) for experimental group, take aliquots of 50 μL serum samples to the corresponding wells of the sample plate (add 150 μL stop solution) to terminate the reaction.

[0623] 8. Shake all sample plates, and centrifuge at 3000×g for 10 minutes.

[0624] 9. Add the supernatant to dilution solution and then shake for LC-MS / MS analysis.

[0625] ADCs’ serum stability data is shown in Table 2.

[0626] Table 2

[0627] Example 26. In-vivo mouse PK Procedure

[0628] Formulation Preparation

[0629] The test article lyophilized powder was redissolved with sterile water to obtain the stock solution. The stock solution was diluted into 0.2 mg / mL using the solvent PBS (pH 7.2-7.4) or Trehalose Polysorbate 80 pH 6.5 for dosing.

[0630] Animal Acquisition

[0631] Total of 9 male ICR mouse (CD-1) , 4 to 6 weeks old, approximately 18-25 g of bodyweight, were purchased from SPF (Beijing) BIOTECHNOLOGY Co., Ltd. The animals were free access to food and water.

[0632] Dosing and Dose Level

[0633] The dose level of the test article in this study was set at 2 mg / kg.

[0634] Nine mice were selected according to body weight and randomly divided into 3 groups (G1-G3) with 3 mice per group. All animals were administered by a single caudal intravenous injection. Animals do not fast and drink freely before administration. The dosage volume was 10 mL / kg.

[0635] Sample Collection, Processing and Storage

[0636] Blood collection time points of PK in G1 group were: 5 min ± 30s after administration, D1 ± 20 min a day, D4 ± 30 min a day, a total of 3 points. If it is not collected within the specified time, it should be recorded.

[0637] Blood collection time points of PK in G2 group were as follows: 2 hr ± 5 min after administration, D2 ± 30 min and D7 ± 1 hr. If it is not collected within the specified time, it should be recorded.

[0638] Blood collection time points of PK in G3 group were: 7 hr ± 10 min after administration, D3 ± 30 min and D14 ± 1 hr. If it is not collected within the specified time, it should be recorded.

[0639] PK blood collection time point before administration: Another 3 spare mice were selected for blood collection as PK samples before administration.

[0640] Blood was collected from the mice through orbital venous plexus into a coagulation stimulating tube, and about 0.12 mL whole blood was collected at each time point. After blood collection, the coagulation stimulating tube was left for at least 10 min to completely coagulate the samples, and the samples were centrifuged at 4℃ within 0.5 hr after blood collection,  rotating speed was 3000 g, and centrifuged for 5 min. Serum was taken immediately after centrifugation and each blood sample was placed into a new labeled tube. The freezing tube is placed on ice, and the serum sample is frozen to the -60 ～ -90℃ refrigerator as soon as possible within 1 hr (if the serum sample can not be stored in the -60 ～ -90℃ refrigerator in time, it can be temporarily stored in the -10 ～ -30℃ refrigerator within 1 hr, and the temporary storage time is not more than 24 h) .

[0641] Blood was collected from the mice through the orbital venous plexus into the EDTA-K2 anticoagulant tube, about 0.06 mL whole blood was collected at each time point, and 20 μL whole blood was immediately added into the tube containing 60 μL acetonitrile (duplicated) , vortex mixed, and within 1 hr, freeze the whole blood sample to the -60 ～ -90℃ refrigerator as soon as possible (if the whole blood sample can not be stored in the -60 ～ -90℃ refrigerator in time, it can be temporarily stored in the -10 ～ -30℃ refrigerator within 1 h, and the temporary storage time is not more than 24 h) . Samples were collected, processed and stored away from light.

[0642] Labels for whole blood and serum samples contain information such as topic number, animal number, group, substrate type, and time point.

[0643] Sample Analysis

[0644] In this study, ADC and total antibody were detected by ELISA, in which ADC was detected by anti-MMAE and / or anti-DXD and / or anti-SN-38 antibodies respectively. During sample analysis, a standard curve containing at least 6 concentration levels of the substance to be tested is prepared for each batch and accompanied by one or two sets of 3 low, medium and high concentration quality control (QC) samples. Calibration standard samples and quality control samples were measured by double and double holes, and their average values were taken, and other samples were measured by single holes.

[0645] The concentrations of free MMAE、SN-38、DXD and / or CAN3010 (MsOH) in whole blood were detected by LC-MS / MS method.

[0646] Example 27. Anti-proliferation assay in NCI-N87 cell line

[0647] Experimental Design

[0648] The plating of cells and test article treatments are shown below in the plate map.

[0649] Table 3. Plate map for cell viability assay (μM)

[0650] Blank, culture medium only. Vehicle control, cells without test articles.

[0651] Test articles with different solvents used their own vehicle control for analyses.

[0652] Cell Lines and Propagation

[0653] Table 4.

[0654] Culture Medium

[0655] Table 5.

[0656] The NCI-N87 cancer cells were maintained in culture conditions at 37℃ in an atmosphere of 5%CO2 in air. The tumor cells were routinely sub-cultured. The cells growing in an exponential growth phase were harvested and counted for plating.

[0657] Cell Plating and Compound Treatment

[0658] (1) . Count cells by hemocytometer with Trypan blue staining.

[0659] (2) . Adjust the cell concentration to proper cell density.

[0660] (3) . Plate 150 μL of cell suspension into the assay plates according to the plate map. Add 150 μL of assay medium into the Blank wells.

[0661] (4) . Incubate the plates at 37℃, 5%CO2, 95%air and 100%relative humidity overnight.

[0662] Test article stock plate preparation and Test article Treatment

[0663] ADCs:

[0664] (1) . Prepare 2x working stock of ADCs

[0665] (2) . Prepare 2x working medium by dissolving medium powder.

[0666] (3) . Remove the cell supernatant in the assay plates.

[0667] (4) . Add 75 μL of the 2x working medium and 75 μL of the 2x ADC working stock of each well into the cells in 96-well assay plate according to the plate map.

[0668] Compounds and Staurosporine:

[0669] (5) . Dissolve compounds into 10mM stock with DMSO.

[0670] (6) . Dilute CAN3019 stock into 0.1mM working stock and dilute other compounds’s tocks into 1mM working stocks with DMSO.

[0671] (7) . Add working stocks into plate with Tecan D300e Digital Dispenser. The final DMSO concentration was 0.25%.

[0672] (8) . Return the assay plates into incubator and incubate for 7 days.

[0673] CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay

[0674] The procedures were performed according to the Promega CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit (Promega-G7573) .

[0675] Data Analysis

[0676] Inhibition rate (IR) of the test articles were determined by the following formula: IR (%) = [1– (RLU test article –RLU blank)  /  (RLU control –RLU blank) ] *100%. The inhibitions of different doses of test articles were calculated in Excel file, and then were used to plot inhibition curve and evaluate related parameters, such as Bottom, Top and IC50. The data were interpreted by GraphPad Prism.

[0677] (5) . Dissolve compounds into 10mM stock with DMSO.

[0678] (6) . Dilute CAN3019 stock into 0.1mM working stock and dilute other compounds’s tocks into 1mM working stocks with DMSO.

[0679] (7) . Add working stocks into plate with Tecan D300e Digital Dispenser. The final DMSO concentration was 0.25%.

[0680] (8) . Return the assay plates into incubator and incubate for 7 days.

[0681] CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay

[0682] The procedures were performed according to the Promega CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit (Promega-G7573) .

[0683] Data analysis

[0684] Inhibition rate (IR) of the test articles were determined by the following formula: IR (%) = [1– (RLU test article –RLU blank)  /  (RLU control –RLU blank) ] *100%. The inhibitions of different doses of test articles were calculated in Excel file, and then were used to plot inhibition curve and evaluate related parameters, such as Bottom, Top and IC50. The data were interpreted by GraphPad Prism.

[0685] IC50 data of ADCs is shown in Table 6.

[0686] Table 6 A: >1000 nM; B: 50-1000 nM; C: 5-49 nM; D: <5 nM

[0687] Applicant’s disclosure is described herein in preferred embodiments with reference to the Figures, in which like numbers represent the same or similar elements. Reference throughout this specification to “one embodiment, ” “an embodiment, ” or similar language means that a particular feature, structure, or characteristic described in connection with the embodiment is included in at least one embodiment of the present invention. Thus, appearances of the phrases “in one embodiment, ” “in an embodiment, ” and similar language throughout this specification may, but do not necessarily, all refer to the same embodiment.

[0688] The described features, structures, or characteristics of Applicant’s disclosure may be combined in any suitable manner in one or more embodiments. In the description, herein, numerous specific details are recited to provide a thorough understanding of embodiments of the invention. One skilled in the relevant art will recognize, however, that Applicant’s composition and / or method may be practiced without one or more of the specific details, or with other methods, components, materials, and so forth. In other instances, well-known structures, materials, or operations are not shown or described in detail to avoid obscuring aspects of the disclosure.

[0689] In this specification and the appended claims, the singular forms "a, " "an, " and "the" include plural reference, unless the context clearly dictates otherwise.

[0690] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can also be used in the practice or testing of the present disclosure, the preferred methods and materials are now described. Methods recited herein may be carried out in any order that is logically possible, in addition to a particular order disclosed.

[0691] Incorporation by Reference

[0692] References and citations to other documents, such as patents, patent applications, patent publications, journals, books, papers, web contents, have been made in this disclosure. All such documents are hereby incorporated herein by reference in their entirety for all purposes. Any material, or portion thereof, that is said to be incorporated by reference herein, but which conflicts with existing definitions, statements, or other disclosure material explicitly set forth herein is only incorporated to the extent that no conflict arises between that incorporated material and the present disclosure material. In the event of a conflict, the conflict is to be resolved in favor of the present disclosure as the preferred disclosure.

[0693] Equivalents

[0694] The representative examples are intended to help illustrate the invention, and are not intended to, nor should they be construed to, limit the scope of the invention. Indeed, various modifications of the invention and many further embodiments thereof, in addition to those shown and described herein, will become apparent to those skilled in the art from the full contents of this document, including the examples and the references to the scientific and patent literature included herein. The examples contain important additional information, exemplification and guidance that can be adapted to the practice of this invention in its various embodiments and equivalents thereof.

Claims

1.An antibody-drug conjugate having the structural formula (I) : or a pharmaceutically acceptable salt thereof,whereinAb is an antigen binding moiety;each of D1, D2, D3 and D4 is independently a drug moiety or absent;each of L1D, L2D, L3D and L4D is independently a linker group covalently attached to D1, D2, D3 and D4, respectively, wherein optionally each of L1D, L2D, L3D and L4D independently comprises a hydrophilic group;L5Ab is a linker group attached to Ab, wherein L5Ab optionally comprises 1-8 hydrophilic groups; andZ is O or N, wherein when Z is N, D2 is absent and L2D represents L2DA and L2DB, each is independently a hydrophilic group covalently bound to said N;m is an integer selected from 1-8,wherein0, 1, 2 or 3 of L1D-D1, L2D-D2, L3D-D3 and L4D-D4 is optionally H, a C1-3 alkyl or a hydrophilic group.2.The antibody-drug conjugate of claim 1, wherein Z is O, having the structural formula (IA) : 3.The antibody-drug conjugate of claim 1 or 2, wherein none of L1D-D1, L2D-D2, L3D-D3 and L4D-D4 is optionally H or a C1-3 alkyl.4.The antibody-drug conjugate of claim 1 or 2, wherein L1D-D1 is R, wherein R is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IB) : 5.The antibody-drug conjugate of claim 4, wherein L4D-D4 is R’, wherein R’ is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IC) : 6.The antibody-drug conjugate of claim 4, wherein L2D-D2 is R”, wherein R” is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (ID) : 7.The antibody-drug conjugate of claim 1 or 2, wherein each of L1D, L2D, L3D and L4D comprises a branching point and, respectively, a hydrophilic group R1h, R2h, R3h or R4h, having the structural formula (II) : wherein L1d, L2d, L3d and L4d represents the remaining portion of L1D, L2D, L3D and L4D, respectively.8.The antibody-drug conjugate of claim 7, wherein L1D-D1 is R, wherein R is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IIA) : 9.The antibody-drug conjugate of claim 8, wherein L4D-D4 is R’, wherein R’ is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IIB) : 10.The antibody-drug conjugate of claim 8, wherein L2D-D2 is R”, wherein R” is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IIC) : 11.The antibody-drug conjugate of any one of claims 7-10, wherein each of R1h, R2h, R3h and R4h, if present, comprises a polyethylene glycol group having i units of ethylene glycol, wherein i is an integer in the range of about 2 to about 16.12.The antibody-drug conjugate of any one of claims 7-11, wherein one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently comprises a di-, tri-or tetra-peptide linker.13.The antibody-drug conjugate of claim 12, wherein one or more of L1d, L2d, L3d and L4d is independently: whereink is an integer selected from 1 and 4; andx is 1, 2, 3 or 4.14.The antibody-drug conjugate of claim 12, wherein one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently comprises a lysine unit.15.The antibody-drug conjugate of claim 14, wherein one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently is: whereink is an integer selected from 1 and 4; andx is 1, 2, 3 or 4.16.The antibody-drug conjugate of any one of claims 1-6, wherein one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.17.The antibody-drug conjugate of any one of claims 1-6, wherein one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.18.The antibody-drug conjugate of any one of claims 1-6, wherein one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.19.The antibody-drug conjugate of any one of claims 1-18, wherein each of D1, D2, D3 and D4, if present, is covalently attached respectively to L1d, L2d, L3d and L4d via a carbonate linkage, a carbamate linkage, or an amide linkage.20.The antibody-drug conjugate of claim 1, wherein Z is N, D2 is absent and L2D represents L2DA and L2DB, having the structural formula (III) : 21.The antibody-drug conjugate of claim 1 or 20, wherein none of L1D-D1, L3D-D3 and L4D-D4 is optionally H or a C1-3 alkyl.22.The antibody-drug conjugate of claim 1 or 20, wherein L1D-D1 is R, wherein R is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IIIA) : 23.The antibody-drug conjugate of claim 22, wherein L4D-D4 is R’, wherein R’ is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IB) : 24.The antibody-drug conjugate of claim 1 or 20, wherein each of L1D, L3D and L4D comprises a branching point and, respectively, a hydrophilic group R1h, R2h, R3h or R4h, having the structural formula (IV) : wherein L1d, L3d and L4d represents the remaining portion of L1D, L3D and L4D, respectively.25.The antibody-drug conjugate of claim 24, wherein L1D-D1 is R, wherein R is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IVA) : 26.The antibody-drug conjugate of claim 25, wherein L4D-D4 is R’, wherein R’ is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IVB) : 27.The antibody-drug conjugate of any one of claims 24-26, wherein each of R1h, R2h, R3h and R4h, if present, comprises a polyethylene glycol group having i units of ethylene glycol, wherein i is an integer in the range of about 2 to about 16.28.The antibody-drug conjugate of any one of claims 24-27, wherein one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently comprises a di-, tri-or tetra-peptide linker.29.The antibody-drug conjugate of claim 28, wherein one or more of L1d, L3d and L4d is independently: whereink is an integer selected from 1 and 4; andx is 1, 2, 3 or 4.30.The antibody-drug conjugate of claim 28, wherein one or more of L1d, L3d and L4d independently comprises a lysine unit.31.The antibody-drug conjugate of claim 30, wherein one or more of L1d, L3d and L4d independently is: whereink is an integer selected from 1 and 4; andx is 1, 2, 3 or 4.32.The antibody-drug conjugate of any one of claims 20-23, wherein one or more of L1D, L3D and L4D, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.33.The antibody-drug conjugate of any one of claims 20-23, wherein one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.34.The antibody-drug conjugate of any one of claims 20-23, wherein one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.35.The antibody-drug conjugate of any one of claims 20-34, wherein each of D1, D3 and D4, if present, is covalently attached respectively to L1d, L3d and L4d via a carbonate linkage, a carbamate linkage, or an amide linkage.36.The antibody-drug conjugate of any one of claims 1-35, wherein L5Ab comprises a group selected from: wherein *represents the attachment point to the central sugar ring of Formula (I) .37.The antibody-drug conjugate of any one of claims 1-36, wherein L5Ab is covalently attached to the Ab via a thioether linkage.38.The antibody-drug conjugate of claim 37, wherein L5Ab comprises 1-8 hydrophilic groups.39.The antibody-drug conjugate of claim 37 or 38, wherein the thioether linkage comprises maleimide thioether.40.The antibody-drug conjugate of claim 39, wherein L5Ab is: wherein q is an integer selected from 1 to 6.41.The antibody-drug conjugate of any one of claims 1-40, wherein D1, D2, D3 and D4, if present, are the same.42.The antibody-drug conjugate of any one of claims 1-40, wherein D1, D2, D3 and D4, if present, are not the same.43.The antibody-drug conjugate of claim 42, wherein D1, D2, D3 and D4, if present, represent two distinct drug moieties.44.The antibody-drug conjugate of any one of claims 1-43, wherein R1h, R2h, R3h and R4h, if present, are the same.45.The antibody-drug conjugate of any one of claims 1-43, wherein R1h, R2h, R3h and R4h, if present, are not the same.46.The antibody-drug conjugate of claim 44 or 45, wherein each of R1h, R2h, R3h and R4h, if present, is independently (CH2-CH2O) pCH3, wherein p is an integer selected from about 4 to about 12.47.The antibody-drug conjugate of any one of claims 1-46, wherein Ab is an antibody.48.The antibody-drug conjugate of claim 47, wherein Ab is a monoclonal antibody.49.The antibody-drug conjugate of claim 47, wherein Ab is a chimeric antibody.50.The antibody-drug conjugate of claim 47, wherein Ab is a humanized antibody.51.The antibody-drug conjugate of claim 47, wherein Ab is an antibody fragment.52.The antibody-drug conjugate of claim 47, wherein Ab is a peptide.53.The antibody-drug conjugate of claim 47, wherein Ab binds to a receptor selected from: HER2, HER3, CD7, CD19, CD20, CD22, CD25, CD27, CD30, CD33, CD37, CD38, CD46, CD70, CD71, CD74, CD79b, CD123, CD138, CD142, CD166, CD205, CD228, CCR2, CA6, p-Cadherin, CEA, CEACAM5, C4.4a, DLL3, EGFR, EGFRVIII, ENPP3, PSMA, SLITRK6, STEAP1, TROP2, 5T4, SSEA4, GloboH, Gb5, STn, Tn, B7H3, BCMA, MUC1, cMet, ROR1 MSLN, FRa, CLDN18.2, CLDN6, EphA2, EphrinA, FLOR1, FGFR2, GCC, cKIT, LIV1, LY6E, MSLN, MUC16, NaPi2b, Nectin4, gpNMB, Axl and PTK7.54.The antibody-drug conjugate of any one of claims 1-53, wherein each of D1, D2, D3 and D4, if present, is independently selected from chemotherapeutic agents and toxins.55.The antibody-drug conjugate of any one of claims 1-54, having the stereochemistry shown in Formula (V) : 56.An antibody-drug conjugate selected from Table A.57.A pharmaceutical composition comprising an antibody-drug conjugate according to any of claims 1-56.58.The pharmaceutical composition of claim 57, effective to treat, prevent, or reduce autoimmune disease, or a related disease or disorder.59.The pharmaceutical composition of claim 57 or 58, effective to treat, prevent, or reduce graft rejection, or a related disease or disorder.60.The pharmaceutical composition of claim 57 or 58, effective to treat, prevent, or reduce an allergy, or a related disease or disorder.61.The pharmaceutical composition of claim 57 or 58, effective to treat, prevent, or reduce immunodeficiency, or a related disease or disorder.62.The pharmaceutical composition of claim 57 or 58, effective to treat, prevent, or reduce infection, sepsis, or a related disease or disorder.63.The pharmaceutical composition of claim 57 or 58, effective to treat, prevent, or reduce cancer, or a related disease or disorder.64.A unit dosage form comprising a pharmaceutical composition according to any of claims 57-63.65.A method for treating, reducing, or preventing a disease or disorder, comprising administering to a subject in need thereof an antibody-drug conjugate according to any of claims 1-56.66.The method of claim 65, wherein the disease or disorder is selected from the group consisting of: autoimmune diseases, graft rejection, allergies, immunodeficiency, infection, sepsis, cancer, and related diseases or disorders.67.The method of claim 66, wherein the disease or disorder is an autoimmune disease, or a related disease or disorder.68.The method of claim 66, wherein the disease or disorder is graft rejection, or a related disease or disorder.69.The method of claim 66, wherein the disease or disorder is allergy, or a related disease or disorder.70.The method of claim 66, wherein the disease or disorder is immunodeficiency, or a related disease or disorder.71.The method of claim 66, wherein the disease or disorder is infection and / or sepsis, or a related disease or disorder.72.The method of claim 66, wherein the disease or disorder is cancer, or a related disease or disorder.73.A method for modulating immune response, comprising administering to a subject in need thereof an antibody-drug conjugate according to any of claims 1-56.74.A method for modulating TLR7-and / or TLR8-mediated signaling, comprising administering to a subject in need thereof an antibody-drug conjugate according to any of claims 1-56.75.A method for of treating or reducing a condition or disorder treatable by modulation of TLR7-and / or TLR8-mediated cellular activities, comprising administering to a subject in need thereof an antibody-drug conjugate according to any of claims 1-56.76.Use of an antibody-drug conjugate of any of claims 1-56 for treating or reducing a disease or disorder.77.Use of an antibody-drug conjugate of any of claims 1-56, and a pharmaceutically acceptable excipient, carrier, or diluent, in preparation of a medicament for treating or reducing a disease or disorder.78.The use of claim 76 or 77, wherein the disease or disorder is associated with TLR7-and / or TLR8-mediated signaling.79.The use of claim 76 or 77, wherein the disease or disorder is selected from autoimmune diseases, graft rejection, allergies, immunodeficiency, infection, sepsis, cancer, or a related disease or disorder thereof.80.The use of claim 76 or 77, to treat or reduce an autoimmune disease, or a related disease or disorder.81.The use of claim 76 or 77, to treat or reduce graft rejection, or a related disease or disorder.82.The use of claim 76 or 77, to treat or reduce allergy, or a related disease or disorder.83.The use of claim 76 or 77, to treat or reduce immunodeficiency, or a related disease or disorder.84.The use of claim 76 or 77, to treat or reduce infection and / or sepsis, or a related disease or disorder.85.The use of claim 76 or 77, to treat or reduce cancer, or a related disease or disorder.86.The use of claim 76 or 77, as a vaccine adjuvant.87.A method for making an antibody-drug conjugate of any one of claims 1-55.88.A compound having the structural formula (VI) : whereineach of L1, L2, L3 and L4 is independently selected from: H, C1-3 alkyl, or (CH2) k-S-RLA, wherein RLA is a linker group comprising a reactive functional group and optionally comprises a hydrophilic group;L5 is selected from: N3 or RLB, wherein RLB is a linker group comprising a reactive functional group and optionally comprises a hydrophilic group; andZ is O or N, wherein when Z is N, L2 represents L2A and L2B, each is independently a hydrophilic group covalently bound to said N,wherein0, 1, 2 or 3 of L1D, L2D, L3D and L4D optionally comprises a hydrophilic group.89.The compound of claim 88, wherein Z is O, having the structural formula (VIA) : 90.The compound of claim 88 or 89, wherein L1 is R, wherein R is H or C1-3 alkyl, having the structural formula (VIB) : 91.The compound of claim 90, wherein L4 is R’, wherein R’ is H or C1-3 alkyl, , having the structural formula (VIC) : 92.The compound of claim 90, wherein L2 is R”, wherein R” is H or C1-3 alkyl, , having the structural formula (VID) : 93.The compound of any one of claims 88-92, wherein L4 is N3.94.The compound of any one of claims 88-93, wherein one or more of L1, L2, L3 and L4 if present independently comprises a di-, tri-or tetra-peptide linker.95.The compound of claim 94, wherein one or more of L1, L2, L3 and L4 if present independently comprise: whereink is an integer selected from 1 and 4; andx is 1, 2, 3 or 4.96.The compound of claim 94, wherein one or more of L1, L2, L3 and L4 if present independently comprises a lysine unit.97.The compound of claim 96, wherein one or more of L1, L2, L3 and L4 independently comprises: whereink is an integer selected from 1 and 4; andx is 1, 2, 3 or 4.98.The compound of any one of claims 88-93, wherein one or more of L1, L2, L3 and L4, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.99.The compound of any one of claims 88-93, wherein one or more of L1, L2, L3 and L4, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.100.The compound of any one of claims 88-93, wherein one or more of L1, L2, L3 and L4, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.101.The compound of claim 88, wherein Z is N, D2 is absent and L2 represents L2A and L2B, having the structural formula (VII) : 102.The compound of claim 101, wherein L1 is R, wherein R is H or C1-3 alkyl, having the structural Formula (VIIA) : 103.The compound of claim 102, wherein L4 is R’, wherein R’ is H or C1-3 alkyl, having the structural Formula (VIIB) : 104.The compound of any one of claims 101-103, wherein L4 is N3.105.The compound of any one of claims 101-104, wherein one or more of L1, L3 and L4 if present independently comprises a di-, tri-or tetra-peptide linker.106.The compound of claim 105, wherein one or more of L1, L3 and L4 if present independently comprise: whereink is an integer selected from 1 and 4; andx is 1, 2, 3 or 4.107.The compound of claim 105, wherein one or more of L1, L3 and L4 if present independently comprises a lysine unit.108.The compound of claim 107, wherein one or more of L1, L3 and L4 independently comprises: whereink is an integer selected from 1 and 4; andx is 1, 2, 3 or 4.109.The compound of any one of claims 101-104, wherein one or more of L1, L3 and L4, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.110.The compound of any one of claims 101-104, wherein one or more of L1, L3 and L4, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.111.The compound of any one of claims 101-104, wherein one or more of L1, L3 and L4, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.112.The compound of any one of claims 101-111, wherein if present each of L1, L2, L3 and L4 comprises a functional group capable of forming a carbonate linkage, a carbamate linkage, or an amide linkage.113.The compound of any one of claims 88-112, having the stereochemistry shown in Formula (V) : 114.A compound selected from Table B.115.A method for making a compound of any one of claims 88-114.116.A linker-drug conjugate having the structural formula (VIII) : whereineach of D1, D2, D3 and D4 is independently a drug moiety or absent;each of L1D, L2D, L3D and L4D is independently a linker group;L5 is selected from: N3 or RLB, wherein RLB is a linker group comprising a reactive functional group and optionally comprises a hydrophilic group; andZ is O or N, wherein when Z is N, D2 is absent and L2D represents L2DA and L2DB, each is independently a hydrophilic group covalently bound to said N.117.The antibody-drug conjugate of claim 116, wherein Z is O, having the structural formula (VIIIA) : 118.The antibody-drug conjugate of claim 116 or 117, wherein L1D-D1 is R, wherein R is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (VIIIB) : 119.The antibody-drug conjugate of claim 118, wherein L4D-D4 is R’, wherein R’ is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (VIIIC) : 120.The antibody-drug conjugate of claim 118, wherein L2D-D2 is R”, wherein R” is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (VIIID) : 121.The linker-drug conjugate of claim 116 or 117, wherein each of L1D, L2D, L3D and L4D comprises a branching point and, respectively, a hydrophilic group R1h, R2h, R3h or R4h, having the structural formula (IX) : 122.The linker-drug conjugate of claim 121, wherein L1D-D1 is R, wherein R is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IXA) : 123.The linker-drug conjugate of claim 122, wherein L4D-D4 is R’, wherein R’ is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IXB) : 124.The linker-drug conjugate of claim 122, wherein L2D-D2 is R”, wherein R” is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (IXC) : 125.The linker-drug conjugate of any one of claims 121-124, wherein each of R1h, R2h, R3h and R4h, if present, comprises a polyethylene glycol group having i units of ethylene glycol, wherein i is an integer in the range of about 2 to about 16.126.The linker-drug conjugate of any one of claims 121-124, wherein one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently comprises a di-, tri-or tetra-peptide linker.127.The linker-drug conjugate of claim 126, wherein one or more of L1d, L2d, L3d and L4d if present independently is: whereink is an integer selected from 1 and 4; andx is 1, 2, 3 or 4.128.The linker-drug conjugate of claim 126, wherein one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently comprises a lysine unit.129.The linker-drug conjugate of claim 128, wherein one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently is: whereink is an integer selected from 1 and 4; andx is 1, 2, 3 or 4.130.The linker-drug conjugate of any one of claims 121-124, wherein one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.131.The linker-drug conjugate of any one of claims 121-124, wherein one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.132.The linker-drug conjugate of any one of claims 121-124, wherein one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.133.The linker-drug conjugate of claim 116, wherein Z is N, D2 is absent and L2D represents L2DA and L2DB, each is independently a hydrophilic group covalently bound to said N, having the structural formula (X) : 134.The linker-drug conjugate of claim 133, wherein L1D-D1 is R, wherein R is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (XA) : 135.The linker-drug conjugate of claim 134, wherein L4D-D4 is R’, wherein R’ is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (XB) : 136.The linker-drug conjugate of claim 133, wherein each of L1D, L3D and L4D comprises a branching point and, respectively, a hydrophilic group R1h, R3h or R4h, having the structural formula (XI) : 137.The linker-drug conjugate of claim 136, wherein L1D-D1 is R, wherein R is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (XIA) : 138.The linker-drug conjugate of claim 137, wherein L4D-D4 is R’, wherein R’ is H or a C1-3 alkyl, having the structural formula (XIB) : 139.The linker-drug conjugate of any one of claims 133-138, wherein each of R1h, R2h, R3h and R4h, if present, comprises a polyethylene glycol group having i units of ethylene glycol, wherein i is an integer in the range of about 2 to about 16.140.The linker-drug conjugate of any one of claims 133-138, wherein one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently comprises a di-, tri-or tetra-peptide linker.141.The linker-drug conjugate of claim 140, wherein one or more of L1d, L3d and L4d if present independently is: whereink is an integer selected from 1 and 4; andx is 1, 2, 3 or 4.142.The linker-drug conjugate of claim 140, wherein one or more of L1d, L3d and L4d independently comprises a lysine unit.143.The linker-drug conjugate of claim 142, wherein one or more of L1d, L2d, L3d and L4d independently is: whereink is an integer selected from 1 and 4; andx is 1, 2, 3 or 4.144.The linker-drug conjugate of any one of claims 133-138, wherein one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.145.The linker-drug conjugate of any one of claims 133-138, wherein one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.146.The linker-drug conjugate of any one of claims 133-138, wherein one or more of L1D, L2D, L3D and L4D, if present, comprises: wherein k is an integer selected from 1 and 4.147.The linker-drug conjugate of any one of claims 133-146, wherein if present each of D1, D2, D3 and D4 is covalently attached respectively to L1d, L2d, L3d and L4d via a carbonate linkage, a carbamate linkage, or an amide linkage.148.The linker-drug conjugate of any one of claims 133-147, wherein L5 comprises a group selected from: wherein *represents the attachment point to the central sugar ring of Formula (X) .149.The linker-drug conjugate of any one of claims 133-148, wherein L5 comprises a group selected from: 150.The linker-drug conjugate of any one of claims 133-149, wherein L5 comprises 1-4 hydrophilic groups.151.The linker-drug conjugate of any one of claims 116-150, having the stereochemistry shown in Formula (V) : 152.A linker-drug conjugate selected from Table C.153.An antibody-drug conjugate having the structural formula (XII) : or a pharmaceutically acceptable salt thereof,whereinAb is an antigen binding moiety;each of D1, D3, D4, D6, D7, D8 and D9 is independently a drug moiety or absent;each of L1D, L3D, L4D, L6D, L7D, L8D and L9D is independently a linker group covalently attached to D1, D3, D4, D6, D7, D8 and D9, respectively, wherein optionally each of L1D, L2D, L3D and L4D independently comprises a hydrophilic group;L5Ab is a linker group attached to Ab, wherein L5Ab optionally comprises 1-8 hydrophilic groups; andeach of X and Z is independently a triazolyl group;Y is a hydrophilic spacer group;m is an integer selected from 1-8,wherein0, 1, 2 or 3 of L1D-D1, L3D-D3, L4D-D4, L6D-D6, L7D-D7, L8D-D8 and L9D-D9 is optionally H, a C1-3 alkyl or a hydrophilic group.154.A linker-drug conjugate having the structural formula (XIII) : whereineach of D1, D3, D4, D6, D7, D8 and D9 is independently a drug moiety or absent;each of L1D, L3D, L4D, L6D, L7D, L8D and L9D is independently a linker group covalently attached to D1, D3, D4, D6, D7, D8 and D9, respectively, wherein optionally each of L1D, L2D, L3D and L4D independently comprises a hydrophilic group;L5 is selected from: N3 or RLB, wherein RLB is a linker group comprising a reactive functional group and optionally comprises a hydrophilic group; andeach of X and Z is independently a triazolyl group; andY is a hydrophilic spacer group,wherein0, 1, 2 or 3 of L1D-D1, L3D-D3, L4D-D4, L6D-D6, L7D-D7, L8D-D8 and L9D-D9 is optionally H, a C1-3 alkyl or a hydrophilic group.155.A method for making a linker-drug conjugate or antibody-drug conjugate of any one of claims 116-154.

Images