A novel AAV variant

Abstract

Provided is a variant AAV capsid protein, comprising one or more modifications, the modification comprises an insertion of 7 amino acids at a position between the amino acid position 587 and 588 of the capsid protein of AAV, and the polynucleotide, host cells, vectors, AAV virion or the pharmaceutical composition thereof. Further provided is a method of treating disease, the method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the recombinant AAV virion.

Description

A NOVEL AAV VARIANTPRIORITY

[0001] This application claims the benefit of, and priority to, PCT Application No. PCT / CN2024 / 086887, filed April 9, 2024, the entire contents of which are hereby incorporated by reference.TECHNICAL FIELD

[0002] The present invention relates to a variant AAV capsid protein, especially refers to a AAV2 Capsid Variants for Intravitreal Gene Therapy.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0003] Adeno-associated virus (AAV) belongs to the Parvoviridae family and Dependovirus genus, whose members require co-infection with a helper virus such as adenovirus to promote replication, and AAV establishes a latent infection in the absence of a helper. Virions are composed of a 25 nm icosahedral capsid encompassing a 4.7 kb single-stranded DNA genome with two open reading frames: rep and cap. The non-structural rep gene encodes four regulatory proteins essential for viral replication, whereas cap encodes three structural proteins (VP1-3) that assemble into a 60-mer capsid shell. This viral capsid mediates the ability of AAV vectors to overcome many of the biological barriers of viral transduction-including cell surface receptor binding, endocytosis, intracellular trafficking, and unpackaging in the nucleus. AAV-based gene therapies have the potential to become promising treatments for many diseases. However, low transduction efficiency in certain tissues is a technical hurdle to the clinical use of AAV-based gene therapy in many situations.

[0004] To date, there remains a need for developing AAV-mediated gene delivery systems that have enhanced tissue transduction.SUMMARY

[0005] The present invention provides a variant AAV capsid protein comprising one or more modifications, the modification comprises an inserted sequence shown as formular I at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, YX1X2X3X4X5X6X7Z (formular I) , wherein X is any amino acid, Y is absent, LA (n) , or A (n) , Z is A (n) , n is any integer from 1 to 5.

[0006] In one embodiment, the variant AAV capsid protein comprising an inserted sequence shown as formular II at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, X1X2X3X4X5X6X7 (formular II) , wherein X is any amino acid.

[0007] In one embodiment, the variant AAV capsid protein comprising an inserted sequence at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, the inserted sequence is shown as X1X2X3X4X5X6X7 (formular II) , X1-7 is any amino acid; preferably, the inserted sequence is shown as X1X2X3PX5RN, X5 is D or E, X1-3 is any amino acid, preferably, the inserted sequence is shown as X1X2X3X4RPX7, X1-4 is any amino acid, X7 is E, Q, G, or S, preferably, the inserted sequence is shown as X1X2DX4RPQ, X1-2 is any amino acid, X4 is H, or T, preferably, the inserted sequence is shown as X1TEX4RP X7, X1 or X4 is any amino acid, X7 is Q, or S, or preferably, the inserted sequence is shown as X1X2X3X4KPE, X1-4 is any amino acid.

[0008] In one embodiment, the variant AAV capsid protein comprising an inserted sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-467; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-467.

[0009] In one embodiment, the variant AAV capsid protein comprising an inserted sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 524-558; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 524-558.

[0010] In one embodiment, the variant AAV capsid protein comprising an inserted sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 23, 33, 36, 45, 57-67; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 23, 33, 36, 45, 57-67.

[0011] In one embodiment, the AAV is selected from the group consisting of: serotype 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, as well as any one of the AAV serotype isolated from human and nonhuman mammalians or variant thereof.

[0012] In one embodiment, the capsid protein further comprises a modification of any one of flanking substitutions and point mutations.

[0013] In one embodiment, the capsid protein comprises a combination of modification comprising flanking substitutions at the amino acid position 585 to 587 and the inserted sequence at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, the flanking substitution is selected from the substitution of RAA, KGG, RAP, RGM, RGP, KAG, RCN, KAG, RGV, RGL, KGS, RAT, RAN, KSG, RDM, RGI, KAV, TAG, RAG, RSF, KVG, IAG, RCM, RGT, RGC, RAD, RSG, NAG, RGG, RPS, KGS, RVN, RPA, KCS, or RGG.

[0014] In one embodiment, the capsid protein comprises a combination of modification comprising flanking substitutions at the amino acid position 585 to 587 and the inserted sequence at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, the flanking substitution is selected from the substitution of GPR, QQN, KAA, GIP, RTP, RDP, WAP, TAA, GPS, LAP, QQK, RDN, GRP, RSP, SGN, RGY, QQT, QAP, or SSD.

[0015] In one embodiment, the capsid protein comprises flanking substitutions at the amino acid position 585 to 587 and the inserted sequence at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, wherein the flanking substitutions is selected from the substitution of RAA, KGG, RAP, RGM, RGP, KAG, RCN, RGT, KAG, RGV, RGL, KGS, RAT, RAN, KSG, RDM, RGI, KAV, TAG, RAG, RSF, KVG, IAG, RCM, RGC, RAD, RSG, NAG, RGG, RPS, KGS, RVN, RPA, KCS, or RGG, the inserted sequence is SEQ ID NO: 33.

[0016] In one embodiment, the capsid protein comprises flanking substitutions at the amino acid position 585 to 587 and the inserted sequence at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, wherein the flanking substitutions is selected from the substitution of RAA, KGG, RAP, RGM, RGP, KAG, RCN, RGT, KAG, RGV, RGL, KGS, RAT, RAN, KSG, RDM, RGI, KAV, TAG, RAG, RSF, KVG, IAG, RCM, RGC, RAD, RSG, NAG, RGG, RPS, KGS, RVN, RPA, KCS, RGG, the inserted sequence is SEQ ID NO: 23.

[0017] In one embodiment, the capsid protein comprises flanking substitutions at the amino acid position 585 to 587 and the inserted sequence at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, wherein the flanking substitutions is selected from the substitution of RAA, KGG, RAP, RGM, RGP, KAG, RCN, RGT, KAG, RGV, RGL, KGS, RAT, RAN, KSG, RDM, RGI, KAV, TAG, RAG, RSF, KVG, IAG, RCM, RGC, RAD, RSG, NAG, RGG, RPS, KGS, RVN, RPA, KCS, RGG, the inserted sequence is SEQ ID NO: 36.

[0018] In one embodiment, the capsid protein comprises flanking substitutions at the amino acid position 585 to 587 and the inserted sequence at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, wherein the flanking substitutions is selected from the substitution of KGG, the inserted sequence is selected from SEQ ID NO: 57-67.

[0019] In one embodiment, the capsid protein comprises flanking substitutions at the amino acid position 585 to 587 and the inserted sequence at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, wherein the flanking substitutions is selected from the substitution of RCN, the inserted sequence is selected from SEQ ID NO: 57-67.

[0020] In one embodiment, the capsid protein further comprises point mutations, wherein the point mutation comprises one or more amino acid substitutions corresponding to the amino acid sequence of parental AAV, wherein the one or more amino acid substitutions is selected from Y737F, Y444F, Y500F, K556E, R595L, R595M, A597V, A597S, and Q596H.

[0021] In one embodiment, the point mutation comprises one of the following substitution or substitution combinations: (i) Y737F; (ii) Y444F, Y500F, Y737F; (iii) K556E.

[0022] In one embodiment, the capsid protein comprises a combination of modification comprising flanking substitutions of RAA at the amino acid position 585 to 587, an amino acid substitution Y737F, and an insertion of the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 33 between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein.

[0023] In one embodiment, the capsid protein comprises a combination of modification comprising flanking substitutions of RAA at the amino acid position 585 to 587, amino acid substitutions Y444F, Y500F and Y737F, and an insertion of the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 33 between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein.

[0024] In one embodiment, the capsid protein comprises a combination of modification comprising flanking substitutions of RAA at the amino acid position 585 to 587, an amino acid substitution K556E, and an insertion of the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 33 between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein.

[0025] In one embodiment, the capsid protein comprises a combination of modification comprising an amino acid substitution Y737F and an insertion of the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 23 between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein.

[0026] In one embodiment, the capsid protein comprises a combination of modification comprising amino acid substitution Y444F, Y500F, Y737F, and an insertion of the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 23 between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein.

[0027] In one embodiment, the capsid protein comprises a combination of modification comprising an amino acid substitutions Y737F, and an insertion of the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 36 between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein.

[0028] In one embodiment, the capsid protein comprises a combination of modification comprising amino acid substitution Y444F, Y500F, Y737F, and an insertion of the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 36 between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein.

[0029] The present invention provides an isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence that encodes above variant AAV capsid protein or vectors comprising the above polynucleotides.

[0030] The present invention provides an isolated, genetically modified host cell comprising the above polynucleotide.

[0031] The present invention provides a recombinant AAV virion comprising above variant AAV capsid protein.

[0032] In one specific embodiment, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising: a) a recombinant adeno-associated virus virion disclosed in the present invention; and b) a pharmaceutically acceptable excipient.

[0033] In another aspect, the present invention provides a recombinant AAV vector, comprising polynucleotide encoding a variant AAV capsid protein of invention, and an AAV 5’ inverted terminal repeat (ITR) , an engineered nucleic acid sequence encoding a functional gene product, a regulatory sequence which directs expression of the gene product in a target cell, and an AAV 3’ ITR.

[0034] In another aspect, the present invention also provides a method of delivering a nucleic acid vector encoding a functional gene product to cells and / or tissues with a recombinant AAV virion or recombinant AAV vector of the present invention.

[0035] In one specific embodiment, the present invention also provides the use of a recombinant AAV virion or recombinant AAV vector of the present invention in the preparation of product for delivering a nucleic acid vector encoding a functional gene product to cells and / or tissues.

[0036] In another aspect, the present invention also provides a method of treating disease, the method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a recombinant AAV virion of present invention, the recombinant AAV virion comprises functional gene product.

[0037] In one specific embodiment, the present invention also provides the use of a recombinant AAV virion or recombinant AAV vector of the present invention in the preparation of product for treating disease to a subject in need thereof; preferably, the disease is selected from the group consisting of liver disease, central nervous system diseases, and other diseases.

[0038] In one specific embodiment, the gene product is a polypeptide.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0039] Figure 1 shows AAV2 library screening workflow.

[0040] Figure 2 shows dissection of the eyes of the cynomolgus macaque. The retina was split into 5 parts with 3 layers. Materials for NGS are S1, S2, N1, N2, I1, I2, T1, T2, M1, M2, RPE. Materials for 2nd round library packaging are RPE, PR. S: superior; N: Nasal; I: inferior; T: temporal; M: macula.

[0041] Figure 3 shows motifs with high retina tropism and penetration ability.

[0042] Figure 4 shows AVT225 achieve panretinal transduction in mice retina. Vector mediated GFP expression after intravitreal injection of novel capsid variants compared with controls in 6-week-old mice. A: AVT225; B: AAV7m8; C: AAVGL; D: AAV2.

[0043] Figure 5 shows first round of NHP validation design.

[0044] Figure 6 shows in vivo fundus GFP fluorescence following intravitreal delivery of rAAV. Sc-CB-GFP vector. In vivo fundus autofluorescence examinations of the NHP retina at 3 weeks post-intravitreal injection of 4E10 total vg for each capsid packaged with sc-CB-GFP.

[0045] Figure 7 shows Immunofluorescence of retinal cross sections and flat mount after 3 WPI.

[0046] Figure 8 shows comparation of AVT capsids with AAV2 and AV2.7m8 in cynomolgus.DETAILED DESCRIPTION

[0047] The following description of the disclosure is merely intended to illustrate various embodiments of the disclosure. As such, the specific modifications discussed are not to be construed as limitations on the scope of the disclosure. It will be apparent to one skilled in the art that various equivalents, changes, and modifications may be made without departing from the scope of the disclosure, and it is understood that such equivalent embodiments are to be included herein. All references cited herein, including publications, patents and patent applications are incorporated herein by reference in their entirety.

[0048] The articles “a” , “an” , and “the” are used herein to refer to one or to more than one (i.e., to at least one) of the grammatical object of the article.

[0049] As used herein, the term “about” or “approximately” refers to a quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length that varies by as much as 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1%to a reference quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length. In particular embodiments, the terms “about” or “approximately” when preceding a numerical value indicates the value plus or minus a range of 15%, 10%, 5%, or 1%.

[0050] Throughout this disclosure, unless the context requires otherwise, the words “comprise” , “comprises” and “comprising” will be understood to imply the inclusion of a stated step or element or group of steps or elements but not the exclusion of any other step or element or group of steps or elements. By “consisting of” is meant including, and limited to, whatever follows the phrase “consisting of” . Thus, the phrase “consisting of” indicates that the listed elements are required or mandatory, and that no other elements may be present. By “consisting essentially of” is meant including any elements listed after the phrase, and limited to other elements that do not interfere with or contribute to the activity or action specified in the disclosure for the listed elements. Thus, the phrase “consisting essentially of” indicates that the listed elements are required or mandatory, but that other elements are optional and may or may not be present depending upon whether or not they affect the activity or action of the listed elements.

[0051] As used herein, the term "subject" includes any human or nonhuman animal. The term "nonhuman animal" includes all vertebrates, e.g., mammals and non-mammals, such as cynomolgus, nonhuman primates, sheep, dogs, cats, horses, cows, chickens, amphibians, reptiles, etc. Except when noted, the terms "patient" or "subject" are used interchangeably.

[0052] The terms "treatment" and "therapeutic method" refer to both therapeutic treatment and prophylactic / preventative measures. Those in need of treatment may include individuals already having a particular medical disorder as well as those who may ultimately acquire the disorder.

[0053] "AAV" is an abbreviation for adeno-associated virus, and may be used to refer to the virus itself or derivatives thereof. The term covers all subtypes and both naturally occurring and recombinant forms, except where required otherwise. The abbreviation "rAAV" refers to recombinant adeno-associated virus, also referred to as a recombinant AAV vector (or "rAAV vector" ) . The term “AAV"includes AAV type 1 (AAV-1) , AAV type 2 (AAV-2) , AAV type 3 (AAV-3) , AAV type 4 (AAV-4) , AAV type 5 (AAV-5) , AAV type 6 (AAV-6) , AAV type 7 (AAV-7) , AAV type 8 (AAV-8) , AAV type 9 (AAV-9) , AAV type 10 (AAV-10) , AAV type 11 (AAV-11) , AAV type 12 (AAV-12) , AAV type 13 (AAV-13) avian AAV, bovine AAV, canine AAV, equine AAV, primate AAV, non-primate AAV, and ovine AAV. See, e.g., Mori et al. (2004) Virology 330: 375. The term “AAV” also includes chimeric AAV. “Primate AAV" refers to AAV isolated from a primate, "non-primate AAV" refers to AAV isolated from a non-primate mammal, "bovine AAV" refers to AAV isolated from a bovine mammal (e.g., a cow) , etc.

[0054] AAV "rep" and "cap" genes refer to polynucleotide sequences encoding replication and encapsidation proteins of adeno-associated virus. AAV rep and cap are referred to herein as AAV "packaging genes. "

[0055] The term "inserted sequence" is used below to describe a peptide that is inserted into a parental AAV capsid. In some cases, the insertion peptide has a length of from 7 amino acids to 20 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of from 7 amino acids to 16 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of from 7 amino acids to 10 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of from 7 amino acids to 12 amino acids. The insertion peptide has a length of 7 amino acids, 8 amino acids, 9 amino acids, 10 amino acids, 11 amino acids, 12 amino acids, 13 amino acids, 14 amino acids, 15 amino acids, 16 amino acids, 17 amino acids, 18 amino acids, 19 amino acids, or 20 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 7 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 8 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 9 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 10 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 11 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 12 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 13 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 14 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 15 amino acids. In some cases, the insertion peptide has a length of 16 amino acids. EXAMPLES

[0056] The equipments and regents

[0057] Table 1. The equipment used in the invention

[0058] Table 2. The regents and supplies used in the study

[0059] Table 3. The various oligos used in the study Note: M represents A or C; N represents A, C, G, or T; K represents G or T. Example 1: Variants generation 1.1 AAV library generation

[0060] The DNA fragment libraries were generated by PCR with AAV2 Rep-Cap plasmid DNA template. The primer is Cap2PCR.

[0061] The purified PCR products were assembled into the inverted terminal repeat (ITR) -containing library backbone with GRK1 promoter, p41, AAV2 (Cap2) VP1 and bovine growth hormone (bGH) poly A. AAV2 (Cap2) VP1 Amino acids sequence (SEQ ID NO: 508)

[0062] The p41 promoter was used to drive capsid gene expression for AAV library production only in the presence of Ad5 helper gene products. The GRK1 promoter was aimed to recover Cap2 mRNA expressed in retina tissues. The assembled library plasmid DNA was transformed to the competent cells to amplify. The amplified cap2 library plasmids were used for AAV library production by co-transfecting pHelper and pRep2-AAP in HEK293 cells as follows:

[0063] HEK293T cells were purchased from National Collection of Authenticated Cell (SCSP-502) . HEK293 was thawed rapidly by gentle agitation in a 37℃ water bath for 2 minutes. Thawed cells were added to pre-warmed media, centrifuged at low speed to remove freeze media and subsequently resuspended in high-glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) , supplemented with Fetal Bovine Serum (FBS) to a final concentration of 10%. Then the cells were grown in a humidified incubator at 37℃, supplemented with 5%CO2, growth media should be replaced every 2-3 days. For cell transfection: a) Inoculating cells: 24 hours before transfection, the cell plating was performed, and the  cell state was observed before transfection. When the cell density was 70%-80%and in good condition without pollution, it could be transfected; b) Configuration plasmid-PEI transfection complex: plasmid: PEI=1: 1, the Helper  plasmid, Rep-cap plasmid and GOI plasmid were added to each 150 dish at 58 μg of the total amount of plasmid, and the transfection complex was prepared and left for 15 min; c) Transfection was performed with transfection complex: medium with serum = 1: 10,  and transfection was completed by dropping the transfection complex into 150 mm dish; d) cultured for 72 hours, virus was harvested.

[0064] Table 4. sequence information 1.2 Screening in vivo

[0065] AAV preparations are purified by iodixanol gradient ultracentrifugation and concentrated to purity and titers adequate for in vivo studies. Preparations are then aliquoted and stored at -80 ℃. AAV particles are titered by droplet digital PCR (ddPCR) using primers and probes targeting the ITR elements and an internal control of known titer (protocol modified from Lock et al., 2014. ) The endotoxin levels are determined using a chromogenic endotoxin detection assay based on the amebocyte lysate method. Then the purified AAV viral libraries (First round random library and 2nd-3rd round recovery library) were intravitreal injected to 3-6 years old Cynomolgus macaque at 3E11vg / eye. Twenty-one days after injection, monkeys were euthanized and eyeballs were collected for separating retinal sublayers after necropsy to evaluate the level of transgene product. The separation followed the steps below:

[0066] Washed a sterile petri dish with chilled physiological saline twice, then placed on the wet ice. Placed the eyeball on the chilled glass petri. Removed the anterior pole of eye from the position of ciliary body, then cut the optic cup into several parts (superior, nasal, inferior, temporal and macula) , immersed the retina with sclera in a trypsin solution PH 7.2 (0.1%trypsin (1: 250) and 10 mM HEPES in a Ca2+ / Mg2+ -free Hank’s solution) for 10 minutes, at 37℃ in a CO2 incubator (95%air / 5%CO2) . After the immersion, the trypsin solution was removed quickly with a Pasteur pipette and the dish was wiped dry with sterilized filter paper.

[0067] The procedures of separation retina were followed: 1. The surface of the flatted retina was covered gently with sterilized Millipore filter. During  this step, prevented air from entering between the tissue and Millipore filter. 2. Removed the entire retina including the Millipore covering from choroid with RPE and  sclera, the retina with retina with Millipore filter and choroid with RPE and sclera was placed in two petri dishes. 3. Turned over the retina with Millipore filter so that the outer nuclear layer faced upwards,  covered the outer nuclear layer with filter paper, then separated the outer nuclear layer by gently removing the filter paper. The outer nuclear layer and remaining retinal tissue attached with the filter paper was transferred into the labeled tubes and frozen in dry ice, then stored in a freezer set to maintain ≤-60℃ until shipped. 4. Covered the choroid with RPE and sclera with Millipore filter, then separated RPE by  gently removing the filter paper. RPE with Millipore filter was transferred into the labeled tubes and frozen in dry ice, then stored in a freezer set to maintain ≤-60℃ until shipped. The total RNA was isolated and treated with Dnase I. The cap2 specific mRNA was reverse  transcribed and amplified by PCR (RT-PCR) for next-generation sequencing (NGS) . The enriched candidates were selected by customized enrichment score analysis. A total of 2035 candidates including variants predicted by artificial intelligence modeling were synthesized for the second round of screening. Meanwhile, 58 top variants were individually packaged for in vitro and in vivo characterization. These top variants were selected by NSG enrichment score. The top variant candidates selected for validation are shown in Table 5.

[0068] Table 5. Top variant candidates selected for validation. 1.3 Flanking sequence optimization and point mutations

[0069] Six candidates were selected for flanking optimization at insertion position (R585G586N587) . Random primers were used for substitution of RGN to random amino acids.

[0070] Table 6. Random primers were used for substitution of RGN to random amino acids.

[0071] Library assemble, in vivo selection and NGS was the same as descripted before. After NGS, another 16 top variants were selected by NSG enrichment score and individually packaged for in vitro and in vivo characterization. Meanwhile, point mutations were performed on AVT225, AVT239 and AVT260.

[0072] Table 7. Candidates selected form flanking optimization library and point mutations. Note: “ / ” means no substitutions or mutations are at the corresponding positions of AAV variant.

[0073] Table 8. The NGS data and enrichment scores. Note: “ / ” means no substitutions or mutations are at the corresponding positions of AAV variant.

[0074] Base on the NGS data and enrichment scores, our AI team found many motifs with high retina tropism and penetration, these motifs and form different groups and families (Fig 3) . Example 2: Validation 2.1 Construction and Purification of AAV plasmids

[0075] Rep-cap plasmids construction for variants were performed by overlap PCR as follows: a, AAV2 Rep-cap plasmid was used as template, and AAV2F, overlap R was used as primers to amplify fragment 1; AAV2 Rep-cap plasmid was used as template and amplified with overlap F, AAV2R to obtain fragment 2. b, Fragment1 and fragment 2 were used as template, AAV2 F and AAV2 R were used as primers to amplify fragment 3. c, The AAV2 repcap plasmid and fragment3 were digested with BsiwI and SpeI, and fragment 3 was inserted between BsiwI and SpeI of AAV2 Rep-cap plasmid to complete the construction. After sanger sequencing, the plasmids were used for AAV production.

[0076] Three variants (AVT225, AVT226 and AVT228) plus controls (AAV2, AAV7m8 and AAVGL) were individually packaged with green fluorescent protein (GFP) transgene driven by Chicken β-actin (CB) promoter. All 6 AAVs were produced in HEK293 cells by triple plasmid transfection with PEIpro (Polyplus) . Three days after transfection, the cells were harvested for lysis, Benzonase (Sigma, E1014-25KU) treatment and proceeded to iodixanol gradient ultracentrifugation purification method. After buffer exchange using PBS with 0.001%F68, the AAV was filtered through 0.22 μm. The titer was measured by ddPCR using ITR primer and probes. The purity of AAV was assessed by SDS-PAGE.

[0077] Table 9. The titer of AAV. 2.2 Validation of novel capsids in C57BL / 6J mice.

[0078] Six-week-old C57BL / 6J mice were intravitreally injected with those 6 AAVs (1E9 vg / eye) . Animals were anesthetized by intraperitoneal injection of Zoletil (60 mg / kg) and xylazine (10 mg / kg) . The pupil was dilated with tropicamide eye drops (National Medicine Permit No. J20180051) . The injection system was a Nanofil microliter injection system equipped with a 36G bevel needle (World Precision Instrument, Nanofil-10 μL) . The whole field operation was performed under a stereomicroscope (OLYMPUS, SZ61) . For injection, the needle was beveled downward and inserted approximately 2 mm from the limbus side against the sclera, while penetrating the sclera, choroid, and retina to reach the vitreous. After microscopically confirming the correct position of the needle in the vitreous, a slow bolus of 1 μL AAV solution was administered. Special care should be taken to avoid damaging the lens during the injection.

[0079] Three weeks post injection (wpi) , animals were anesthetized, systemic blood was replaced with 4℃ precooled saline by means of cardiac perfusion. The eyes were removed and fixed in FAS fixative solution for 4 hours, then after removal of cornea and lens under stereomicroscope, transferred to 30%sucrose  / PBS solution for dehydration overnight, and finally embedded in OCT embedding agent.

[0080] Before sectioning, the embedded tissue block was equilibrated in a cryostat incubator at -20℃ for at least 30 minutes. The embedded block was then fixed to the chuck using additional OCT, and sagittal sections of the eyeball with a thickness of 10 to 20 μm were cut, and sections were collected with a positively charged adhesive slide. The slides were finally dried at room temperature for 1 h and stored at -20℃.

[0081] For staining, slides were first removed from -20℃ and dried for 20 min at room temperature. The sections were outlined on the slide using an IHC pen to create a hydrophobic ring. The slides were then washed three times with 500 μl PBS for 5 min each. The cells were incubated for 1 h with PBS blocking solution containing 0.5%Triton X-100 and 10%goat serum. After removal of the blocking solution, the primary antibody incubation solution was added and incubated overnight at 4℃. Slides were then washed five times for 5 min each with PBS solution containing 0.5%Triton X-100. After the washing solution was removed, the secondary antibody incubation solution was added and incubated for 1 h at room temperature. Finally, the plates were washed 5 times with PBS for 5 min each time and sealed with a drop of capping agent containing DAPI dye.

[0082] Image acquisition was performed with the use of a light microscope (Nikon, TS2R) with 4x, 10x, and 20x objectives. For brightfield, DAPI, GFP, and Cy3 signaling pathways, images were taken using brightfield, DAPI, GFP, and Alexa Fluor 555 channels, respectively. For images that needed to be stitched into large maps, serial multichannel image shots with approximately 10%overlap were performed.

[0083] The results indicate that AVT225 showed very extensive infection and good tissue penetration compared to controls. No signal was detected for AVT226 and AVT228 (Fig 4) . This may be due to differences between species, as candidates were screened from monkeys, whereas validation was performed in mice. Example 3: Intravitreal injection of NHP

[0084] Six variants (AVT225, AVT235, AVT239, AVT248, AVT260, AVT264) plus controls (AAV2, AAV7m8 and R100) were individually packaged with green fluorescent protein (GFP) transgene or mCherry or FXN-HA tag driven by Chicken β-actin (CB) promoter. All AAVs were produced in HEK293 cells by triple plasmid transfection with PEIpro (Polyplus) .

[0085] Seven adult cynomolgus macaque (4-5 years old, ～3 kg) was intravitreally injected with 8E10 vg / eye (4E10 / eye / capsid) , each eye was injected with two capsid packaging with different marker gene as follows:

[0086] Table 10. First round of NHP validation design. Example 4: Terminal, fundus autofluorescence and tissue collection

[0087] Animals were anesthetized by intramuscular injection of Zoletil (50 mg / kg) and xylazine (10 mg / kg) , and topical application of proparacaine hydrochloride and tropicamide was used to relieve pain or mydriatic the pupil. The injection system used a 31g insulin syringe, which was inserted into the sclera (approximately 3mm behind the limbus) , and 50μL intravitreal injection was performed in two separate doses to each eye, with a total injection volume of 100 μl / eye. The needle was beveled down, and the position of the needle was confirmed under the operating microscope. The AAV solution was delivered to the middle vitreous body by slow injection. After completion of the bolus, the needle was kept stable for at least 2 min to minimize backflow of the injection solution. In addition, 40 to 80 mg of methylprednisolone was administered weekly after the injection.

[0088] Ophthalmic examination and ocular imaging were performed on all animals by a board-certified veterinary ophthalmologist before and at various time points after administration. Ophthalmic examinations included indirect ophthalmoscopy and slit-lamp biomicroscopy. Fundus imaging was performed with the use of a confocal scanning laser fundus imaging system (Spectralis HRA + OCT, Heidelberg Engineering) . The images recorded included infrared reflection (IR) , blue autofluorescence (BAF) and optical coherence tomography (OCT) . During BAF imaging, multiple regions of the central and peripheral retina were recorded to reflect the distribution of GFP expression, and the sensitivity was set to 100. OCT imaging is performed by scanning multi-line horizontal, high-resolution images from the optic nerve head (ONH) to the fovea.

[0089] Novel capsids AVT225, AVT239, AVT248, and AVT260 produced very strong and broadly distributed GFP signals in the NHP retina after 3 WPI. This signal of AVT225, AVT248, and AVT260 was significantly stronger than the positive control AAV7m8 (Fig 6) . Example 5: Retinal sections, flat mount and immunofluorescence

[0090] For staining, slides were first removed from -20℃ and dried for 20 min at room temperature. The sections were outlined on the slide using an IHC pen to create a hydrophobic ring. The slides were then washed three times with 500 μl PBS for 5 min each. The cells were incubated for 1 h with PBS blocking solution containing 0.5%Triton X-100 and 10%goat serum. After removal of the blocking solution, the primary antibody incubation solution was added and incubated overnight at 4℃. Slides were then washed five times for 5 min each with PBS solution containing 0.5%Triton X-100. After the washing solution was removed, the secondary antibody incubation solution was added and incubated for 1 h at room temperature. Finally, the plates were washed 5 times with PBS for 5 min each time and sealed with a drop of capping agent containing DAPI dye.

[0091] Retinal flat mount: after completion of the cryosections, the remaining embedded blocks were thawed at room temperature. The retina was carefully peeled off under a microscope, and the retina was washed five times repeatedly with PBS to remove residual OCT embedding agent. Retinas were then blocked in PBS solution containing 2%Triton X-100, 10%normal bovine serum for 1 h, followed by incubation with rabbit anti-mCherry primary antibody or anti-HA primary antibody at a dilution ratio of 1: 100 overnight. Retinas were washed five times and incubated with secondary antibody solution for 2h at room temperature. After washing, the samples were prepared into planar slides and sealed with mounting agent containing DAPI dye droppers.

[0092] Image acquisition was performed with the use of a light microscope (Nikon, TS2R) with 4x, 10x, and 20x objectives. For brightfield, DAPI, GFP, and Cy3 signaling pathways, images were taken using brightfield, DAPI, GFP, and Alexa Fluor 555 channels, respectively. For images that needed to be stitched into large maps, serial multichannel image shots with approximately 10%overlap were performed.

[0093] Immunolabelled retinal cross sections were stained for GFP and DAPI, in fovea area AAV2 has no infection. AVT264 has weak infection which is better than AAV2 but weaker than AAV7m8, well AVT 260, AVT225 and AVT248 shows stronger infection than the positive control AAV7m8. Fovea is the thinnest part of retina, out of fovea is much harder for AAV to infect and penetrate the retina layers. AAV2 shows no infection out of fovea, well AVT260, AVT225 and AVT248 shows better infection and penetration than AAV7m8. Retina flat mount shows AVT260, AVT225 and AVT248 has wide spread infection of NPH retina (Fig 7) .

[0094] Adult cynomolus monkeys were intravitreally injected with AAV-CB-GFP at a dose of 1E12 vg / eye. Three weeks after the injection, in vivo fundus autofluorescence examinations were conducted and Immunolabelled retinal cross sections were stained for GFP and DAPI. AAV2 has no infection, AVT 260, AVT277 and AVT279 shows stronger infection than the positive control AAV7m8 (Fig 8) . Example 6: The AAV variants enhanced the ocular tropism of AAV8

[0095] The peptides selected in AAV2 library were synthesized on a chip. Subsequently, the Q588 to P593 of AAV8 were substituted by RGNRQA, and the AAV2 library were inserted after RGN to generate a AAV8 library. Then, the AAV8 library was injected into the eyes of non -human primates (NHPs) at a dose of 1E12 vg / eye. After three weeks, DNA and RNA were extracted and subjected to next-generation sequencing (NGS) . The top -ranked variant candidates enhanced the ocular tropism of both AAV2 and AAV8.

[0096] Table 11. Top variant candidates validated in AAV8

[0097] The embodiments of the present invention have been described above, but the present invention is not limited thereto, and those skilled in the art can understand that modifications and changes can be made within the scope of the purport of the present invention. The manner of modifications and changes should fall within the scope of protection of the present invention.

Claims

1.A variant AAV capsid protein comprising one or more modifications, the modification comprises an inserted sequence shown as formular I at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, YX1X2X3X4X5X6X7Z   (formular I) ,wherein X is any amino acid, Y is absent, LA (n) , or A (n) , Z is A (n) , n is any integer from 1 to 5.2.The variant AAV capsid protein of claim 1, wherein the capsid protein comprises an inserted sequence at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, whereinthe inserted sequence is shown as X1X2X3X4X5X6X7 (formular II) , X1-7 is any amino acid; preferably, the inserted sequence is shown as X1X2X3PX5RN, X5 is D or E, X1-3 is any amino acid, preferably, the inserted sequence is shown as X1X2X3X4RPX7, X1-4 is any amino acid, X7 is E, Q, G, or S, preferably, the inserted sequence is shown as X1X2DX4RPQ, X1-2 is any amino acid, X4 is H, or T, preferably, the inserted sequence is shown as X1TEX4RP X7, X1 or X4 is any amino acid, X7 is Q, or S, or preferably, the inserted sequence is shown as X1X2X3X4KPE, X1-4 is any amino acid.3.The variant AAV capsid protein of any one of claim 1 to 2, wherein the inserted sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-467; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-467.4.The variant AAV capsid protein of any one of claim 1 to 2, wherein the inserted sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 524-558; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 524-558.5.The variant AAV capsid protein of claim 3, wherein the insertion peptide is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 23, 33, 36, 45, 57-67, ; or a sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9%identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 23, 33, 36, 45, 57-67.6.The variant AAV capsid protein of claim 1, wherein the AAV is selected from the group consisting of: serotype 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, as well as any one of the AAV serotype isolated from human and nonhuman mammalians or variant thereof.7.The variant AAV capsid protein of any one of claims 1 to 6, wherein the capsid protein further comprises a modification of any one of flanking substitutions and point mutations.8.The variant AAV capsid protein of claim 7, wherein the capsid protein comprises a combination of modification comprising flanking substitutions at the amino acid position 585 to 587 and the inserted sequence at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, the flanking substitution is selected from the substitution of RAA, KGG, RAP, RGM, RGP, KAG, RCN, RGT, KAG, RGV, RGL, KGS, RAT, RAN, KSG, RDM, RGI, KAV, TAG, RAG, RSF, KVG, IAG, RCM, RGC, RAD, RSG, NAG, RGG, RPS, KGS, RVN, RPA, KCS, or RGG.9.The variant AAV capsid protein of claim 7, wherein the capsid protein comprises a combination of modification comprising flanking substitutions at the amino acid position 585 to 587 and the inserted sequence at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, the flanking substitution is selected from the substitution of GPR, QQN, KAA, GIP, RTP, RDP, WAP, TAA, GPS, LAP, QQK, RDN, GRP, RSP, SGN, RGY, QQT, QAP, or SSD.10.The variant AAV capsid protein of claim 8, wherein the capsid protein comprises flanking substitutions at the amino acid position 585 to 587 and the inserted sequence at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, wherein the flanking substitutions is selected from the substitution of RAA, KGG, RAP, RGM, RGP, KAG, RCN, RGT, KAG, RGV, RGL, KGS, RAT, RAN, KSG, RDM, RGI, KAV, TAG, RAG, RSF, KVG, IAG, RCM, RGC, RAD, RSG, NAG, RGG, RPS, KGS, RVN, RPA, KCS, or RGG, the inserted sequence is SEQ ID NO: 33.11.The variant AAV capsid protein of claim 8, wherein the capsid protein comprises flanking substitutions at the amino acid position 585 to 587 and the inserted sequence at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, wherein the flanking substitutions is selected from the substitution of RAA, KGG, RAP, RGM, RGP, KAG, RCN, RGT, KAG, RGV, RGL, KGS, RAT, RAN, KSG, RDM, RGI, KAV, TAG, RAG, RSF, KVG, IAG, RCM, RGC, RAD, RSG, NAG, RGG, RPS, KGS, RVN, RPA, KCS, or RGG, the inserted sequence is SEQ ID NO: 2312.The variant AAV capsid protein of claim 8, wherein the capsid protein comprises flanking substitutions at the amino acid position 585 to 587 and the inserted sequence at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, wherein the flanking substitutions is selected from the substitution of RAA, KGG, RAP, RGM, RGP, KAG, RCN, RGT, KAG, RGV, RGL, KGS, RAT, RAN, KSG, RDM, RGI, KAV, TAG, RAG, RSF, KVG, IAG, RCM, RGC, RAD, RSG, NAG, RGG, RPS, KGS, RVN, RPA, KCS, or RGG, the inserted sequence is SEQ ID NO: 36.13.The variant AAV capsid protein of claim 8, wherein the capsid protein comprises flanking substitutions at the amino acid position 585 to 587 and the inserted sequence at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, wherein the flanking substitutions is selected from the substitution of KGG, the inserted sequence is selected from SEQ ID NO: 57-67.14.The variant AAV capsid protein of claim 8, wherein the capsid protein comprises flanking substitutions at the amino acid position 585 to 587 and the inserted sequence at a position between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein, wherein the flanking substitutions is selected from the substitution of RCN, the inserted sequence is selected from SEQ ID NO: 57-67.15.The variant AAV capsid protein of any one of claims 7-14, wherein the point mutation comprises one or more amino acid substitutions corresponding to the amino acid sequence of parental AAV, wherein the one or more amino acid substitutions is selected from Y737F, Y444F, Y500F, K556E, R595L, R595M, A597V, A597S, and Q596H.16.The variant AAV capsid protein of claim 15, wherein the point mutation comprises one of the following substitution or substitution combinations:(i) Y737F; (ii) Y444F, Y500F, Y737F; (iii) K556E.17.The variant AAV capsid protein of claim 16, wherein the capsid protein comprises a combination of modification comprising flanking substitutions of RAA at the amino acid position 585 to 587, an amino acid substitution Y737F, and an insertion of the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 33 between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein.18.The variant AAV capsid protein of claim 16, wherein the capsid protein comprises a combination of modification comprising flanking substitutions of RAA at the amino acid position 585 to 587, amino acid substitutions Y444F, Y500F and Y737F, and an insertion of the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 33 between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein.19.The variant AAV capsid protein of claim 16, wherein the capsid protein comprises a combination of modification comprising flanking substitutions of RAA at the amino acid position 585 to 587, an amino acid substitution K556E, and an insertion of the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 33 between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein.20.The variant AAV capsid protein of claim 16, wherein the capsid protein comprises a combination of modification comprising an amino acid substitution Y737F and an insertion of the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 23 between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein.21.The variant AAV capsid protein of claim 16, wherein the capsid protein comprises a combination of modification comprising amino acid substitution Y444F, Y500F, Y737F, and an insertion of the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 23 between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein.22.The variant AAV capsid protein of claim 16, wherein the capsid protein comprises a combination of modification comprising an amino acid substitutions Y737F, and an insertion of the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 36 between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein.23.The variant AAV capsid protein of claim 16, wherein the capsid protein comprises a combination of modification comprising amino acid substitution Y444F, Y500F, Y737F, and an insertion of the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 36 between the amino acid position 587 and 588 of the parental AAV capsid protein.24.An isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence that encodes a variant AAV capsid protein of any one of claims 1 to 23.25.A vector comprising the isolated polynucleotide of claim 24.26.An isolated, genetically modified host cell comprising the polynucleotide of claim 24.27.A recombinant AAV virion comprising a variant AAV capsid protein of any one of claims 1 to 23.28.A pharmaceutical composition comprising:a) a recombinant adeno-associated virus virion of claim 27; and b) a pharmaceutically acceptable excipient.29.A recombinant AAV vector, comprising polynucleotide encoding a variant AAV capsid protein of any one of claims 1 to 23, and an AAV 5’ inverted terminal repeat (ITR) , an engineered nucleic acid sequence encoding a functional gene product, a regulatory sequence which directs expression of the gene product in a target cell, and an AAV 3’ ITR.30.A method of delivering a nucleic acid vector encoding a functional gene product to cells and / or tissues with a recombinant AAV virion of claim 27 or recombinant AAV vector of claim 29.31.A method of treating disease, the method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a recombinant AAV virion of claim 27, the recombinant AAV virion comprises functional gene product.32.The method of anyone of claim 30 or 31, wherein the gene product is a polypeptide.

Images