NKG2d receptor and method of using thereof

Abstract

Provided herein are novel chimeric constructs comprising a DAP 10 transmembrane domain, an intracellular signaling domain, and optionally a co- stimulatory domain, as well as engineered immune cells comprising such chimeric constructs. Also provided are compositions comprising the engineered immune cells, and methods of making thereof.

Description

NKG2D Receptor and Method of Using ThereofCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONThis application claims priority benefits of International Application No. PCT / CN2024 / 096653, filed on May 31, 2024, the contents of which are incorporated herein by reference in its entirety.SEQUENCE STATEMENTThe content of the following submission on XML file is incorporated herein by reference in its entirety: a computer readable form (CRF) of the Sequence Listing (file name: IEC250212PCT-Seql. xml, date recorded: May 30, 2025, size: 148, 360 bytes) .FIELD OF THE INVENTION

[0001] The present disclosure relates to novel chimeric constructs comprising a DAP10 transmembrane domain and an intracellular signaling domain, as well as engineered immune cells comprising such chimeric constructs.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] In recent years, CAR T cells have achieved tremendous success in hematological malignancy therapy. However, CAR T cells still present a number of challenges in clinical applications. Most antigens expressed by tumors are not tumor-specific, and CAR-T immunotherapy with tumor-associated antigens as targets have problems such as “off-target” effects (Sterner RC, Sterner RM. Blood Cancer J. 11 (4) : 69 (2021) ) . Tumor heterogeneity and acquired resistance present two significant obstacles to the clinical success of anti-cancer treatments. Tumor cells within the same neoplasm often express heterogeneous antigens on their cell surface and selectively lose expression of a target antigen following any treatment targeting a specific molecule (Spear P, Barber A, Rynda-Apple A, Sentman CL. Immunol Cell Biol 91 (6) : 435–40 (2013) ) . Therefore, studying a broader spectrum, efficient and safe CAR-T immunotherapy method is the future development trend.

[0003] NKG2D receptor is an important activating receptor in NK cells and some T cells (Ding H, Yang X, Wei Y. Int. J. Mol. Sci. 19 (1) : 177 (2018) ) . NKG2D ligands are widely expressed among cancer cells but poorly expressed in normal healthy cells (Spear P, Wu MR, Sentman ML, Sentman CL. Cancer Immun. 13: 8 (2013) ; Vetter CS, Groh V, thor Straten P, Spies T, Brocker EB, Becker JC. J Invest Dermatol. 118 (4) : 600-605 (2002) ) and can be induced under “stress” conditions such as cellular damage, infection, oxidative or thermal stress, or malignant transformation (Jones AB, Rocco A, Lamb LS, Friedman GK, Hjelmeland AB. Cancers (Basel) . 14 (9) : 2339 (2022) ) . In humans, NKG2D receptor associates exclusively with the adaptor protein DNAX-activating protein 10 (DAP10) , which mediates co-stimulatory signaling though the presence of a YxxM motif within its intracellular domain (Wu J, Song Y, Bakker AB, Bauer S, Spies T, Lanier LL, Phillips JH. Science 285 (5428) : 730–2 (1999) ) . However, since DAP10 lacks an immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) , NKG2D receptor engagement does not lead to full T-cell activation. Several NKG2D-based CARs have been generated in which an ITAM motif (typically from CD3ζ) is fused in frame with the endodomain of NKG2D receptor, either with or without an additional co-stimulatory motif. However, activated T cells undergo stress and transiently express NKG2D ligands (NKG2DLs) , thus NKG2D-based T cells may undergo self-killing (fratricide) during cell manufacturing (Breman E, Demoulin B, Agaugué S,  S, Michaux A, Springuel L, Houssa J, Huberty F, Jacques-Hespel C, Marchand C, Marijsse J, Nguyen T, Ramelot N, Violle B, Daro D, De Waele P, Gilham DE, Steenwinckel V. Front. Immunol. 9: 2940 (2018) ) . There remains a need to weaken target-driven CAR T fratricide and more potent CARs with anti-tumor efficacy. The present disclosure provides a solution to this need and other related needs in the field.

[0004] The disclosure of all publications, patents, patent publications and published patent applications referred to herein are hereby incorporated by reference in their entirety. BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION

[0005] The present application in one aspect provides engineered immune cells comprising a chimeric construct, wherein the chimeric construct comprises a DAP10 transmembrane domain and an intracellular signaling domain.

[0006] In some embodiments, the chimeric construct further comprises a co-stimulatory domain. In some embodiments, the co-stimulatory domain is not derived from 4-1BB. In some embodiments, the co-stimulatory domain is derived from a protein selected from the group consisting of CD27, CD28, CD30, CD40, OX40, and HVEM. In some embodiments, the co-stimulatory domain is derived from CD40.

[0007] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the intracellular signaling domain is not derived from CD3ζ. In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from a protein selected from the group consisting of FcRγ, DAP12, CD3γ, CD3δ, and CD3ε. In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from FcRγ. In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from CD3γ.

[0008] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the co-stimulatory domain is derived from CD28 and the intracellular signaling domain is derived from a protein selected from the group consisting of FcRγ, CD3ζ, DAP12, CD3γ, CD3δ, and CD3ε.

[0009] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the co-stimulatory domain is derived from 4-1BB and the intracellular signaling domain is derived from a protein selected from the group consisting of FcRγ, CD3ζ, DAP12, CD3γ, CD3δ, and CD3ε.

[0010] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the co-stimulatory domain is derived from CD40 and the intracellular signaling domain is derived from a protein selected from the group consisting of FcRγ, CD3ζ, DAP12, CD3γ, CD3δ, and CD3ε.

[0011] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the intracellular signaling domain is derived from FcRγ and the co-stimulatory domain is derived from a protein selected from the group consisting of CD27, CD30, HVEM and OX40.

[0012] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the chimeric construct comprises an intracellular signaling domain but does not comprise a co-stimulatory domain. In some embodiments, the intracellular signaling domain is not a CD3ζ domain. In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from a protein selected from the group consisting of FcRγ, DAP12, CD3γ, CD3δ, and CD3ε. In some embodiments, the intracellular domain is derived from FcRγ. In some embodiments, the intracellular domain is derived from CD3γ.

[0013] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the DAP10 transmembrane domain comprises a functional variant of SEQ ID NO: 6 having one or more mutations that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises a truncated version of SEQ ID NO: 6.

[0014] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the chimeric construct is a chimeric adaptor.

[0015] In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises (or consists of) the amino acids 19-73 of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises or consists of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.

[0016] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the chimeric adaptor comprises an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 30, 32, 34, 36 and 65-81.

[0017] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the chimeric adaptor is expressed by a heterologous nucleic acid encoding the chimeric adaptor. In some embodiments, the nucleic acid is present on a vector, such as a viral vector. In some embodiments, the heterologous nucleic acid further encodes a signaling peptide N-terminal to the chimeric adaptor, such as a signaling peptide derived from CD8α.

[0018] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the engineered immune cell comprises an overexpressed NKG2D receptor. In some embodiments, the overexpressed NKG2D receptor is expressed from an endogenous nucleic acid encoding the NKG2D receptor. In some embodiments, the overexpressed NKG2D receptor is expressed from a heterologous nucleic acid encoding the NKG2D receptor. In some embodiments, the nucleic acid encoding the chimeric adaptor is linked to the nucleic acid encoding the NKG2D receptor through a 2A self-cleaving peptide, such as any of T2A, P2A, E2A, or F2A peptide. In some embodiments, the engineered immune cell comprises an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 37-47 and 61-64. In some embodiments, the engineered immune cell comprises a nucleic acid encoding a peptide having at least about 95%sequence identity to an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 37-47 and 61-64. In alternative embodiments, the engineered immune cell does not comprise an overexpressed NKG2D receptor.

[0019] In some embodiments according to any of the embodiments described above, wherein the chimeric construct is an NKG2D chimeric receptor. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises an NKG2D receptor extracellular domain. In some embodiments, the NKG2D receptor extracellular domain comprises amino acids 81-216 of SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the NKG2D receptor extracellular domain comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.

[0020] In some embodiments according to any of the embodiments described above, wherein the DAP10 transmembrane domain comprises amino acids 49-73 of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

[0021] In some embodiments according to any of the embodiments described above, wherein the NKG2D chimeric receptor further comprises a hinge links the NKG2D receptor extracellular domain and the DAP10 transmembrane domain. In some embodiments, the hinge is derived from a protein selected from the group consisting of CD8, CD28 and partial DAP10 extracellular domain. In some embodiments, the partial DAP10 extracellular domain comprises amino acids 24-48 of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the partial DAP10 extracellular domain comprises amino acids sequence of SEQ ID NO: 7.

[0022] In some embodiments according to any of the embodiments described above, wherein the NKG2D chimeric receptor comprises from N-terminus to C-terminus: a signal peptide, NKG2D receptor extracellular domain, a hinge, DAP10 transmembrane, a co-stimulatory domain and an intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 102-113. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor further comprises a signal peptide. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 82-98.

[0023] In some embodiments according to any of the embodiments described above, wherein the NKG2D chimeric receptor is expressed by a heterologous nucleic acid encoding the chimeric construct. In some embodiments, the nucleic acid is present on a vector, such as a viral vector.

[0024] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the immune cell further expresses an engineered non-NKG2D receptor, which as an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell antigen coupler (TAC) . In some embodiments, the engineered non-NKG2D receptor comprises an extracellular domain specifically recognizing any of GPC2, GPRC5D, CD7, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD70, CD123, CD228, CD138, BCMA, AFP, GPC3, CEA, Claudin 18.2, CLL1, CD33, folate receptor (FRα) , mesothelin (MSLN) , DLL3, CD276, gp100, 5T4, GD2, EGFR, MUC-1, PSMA, EpCAM, MCSP, SM5-1, MICA, MICB, NKG2D ligand, ULBP and HER-2.

[0025] In some embodiments according to any of the embodiments described above, the immune cell is selected from the group consisting of: T cell, NK cell, NKT cell, peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , hematopoietic stem cell, pluripotent stem cell, an embryonic stem cell, or any combination thereof. In some embodiments, the immune cell is an αβT or a γδT cell.

[0026] Also provided are pharmaceutical compositions comprising any of the engineered immune cells described herein.

[0027] Further provided are methods of making any of the engineered immune cells described herein, comprising introducing into a population of immune cells a nucleic acid encoding the chimeric construct.

[0028] Further provided are methods of treating cancer (such as solid tumor) in an individual (such as a human individual) , comprising administering to the individual an effective amount of any of the pharmaceutical compositions described herein.

[0029] Further provided are methods of killing a tumor cell in an individual (such as a human individual) , comprising contacting the tumor cell with an effective amount of any of the pharmaceutical compositions described herein.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0030] FIGs. 1 shows exemplary chimeric constructs of the present disclosure.

[0031] FIG. 2 shows NKG2D ligand expression in NUGC3 and KATOIII / Claudin 18.2 cell lines.

[0032] FIGs. 3A-3F show exemplary chimeric adaptors in combination with endogenous or exogenous NKG2D receptor and the producibility and efficacy of these designs in vitro. FIG. 3A shows exemplary constructs of chimeric adaptors with or without NKG2D receptor overexpression. FIG. 3B shows cell proliferation of chimeric adaptor αβT cells (i.e., αβT cells expressing the indicated chimeric adaptors) on day 5 during production. FIG. 3C shows the cell viability of chimeric adaptor αβT cells on day 5 during production. FIG. 3D shows the transduction efficiency and the percentage of CD4+ and CD8+ subsets in chimeric adaptor αβT cells. FIG. 3E shows long-term cytotoxicity of chimeric adaptor αβT cells with or without NKG2D receptor overexpression, co-cultured with KATOIII / Claudin 18.2 cells. FIG. 3F shows T cell proliferation in long-term co-cultures of chimeric adaptor αβT cells with or without NKG2D receptor overexpression, co-cultured with KATOIII / Claudin 18.2 cells.

[0033] FIGs. 4A-4G show exemplary constructs of chimeric adaptors using different co-stimulatory domains and the producibility and efficacy of these designs in vitro. FIG. 4A shows exemplary chimeric adaptor constructs using different co-stimulatory domains. FIG. 4B shows cell proliferation of chimeric adaptor γδT cells (i.e., γδT cells expressing the indicated chimeric adaptors) on day10 during production. FIG. 4C shows cell viability of chimeric adaptor γδT cells on day 10 during production. FIG. 4D shows long-term cytotoxicity of chimeric adaptor γδT cells with different co-stimulatory signaling domains co-cultured with NUGC3 cells. FIG. 4E shows T cell proliferation in long-term co-cultures of chimeric adaptor γδT cells with different co-stimulatory domains co-cultured with NUGC3 cells. FIG. 4F shows the IFN-γ release of chimeric adaptor γδT cells with different co-stimulatory signaling domains co-cultured with NUGC3 cells in vitro. FIG. 4G shows the TNF-α release of chimeric adaptor γδT cells with different co-stimulatory signaling domains co-cultured with NUGC3 cells in vitro.

[0034] FIG. 5A-5G show the chimeric adaptor using different ITAMs and the producibility and efficacy of these designs in vitro. FIG. 5A shows exemplary constructs of chimeric adaptors using different ITAMs. FIG. 5B shows cell proliferation of chimeric adaptor panT cells (i.e., on day7 during production) . FIG. 5C shows cell viability of chimeric adaptor panT cells (i.e., panT cells containing the indicated chimeric adaptors) on day7 during production. FIG. 5D shows long-term cytotoxicity of chimeric adaptor panT with different ITAMs co-cultured with NUGC3 cells. FIG. 5E shows T cell proliferation in long-term co-cultures of chimeric adaptor panT with different ITAMs co-cultured with NUGC3 cells. FIG. 5F shows the IFN-γ release of chimeric adaptor panT cells with different ITAMs co-cultured with NUGC3 cells in vitro. FIG. 5G shows the TNF-αrelease of chimeric adaptor panT cells with different ITAMS co-cultured with NUGC3 cells in vitro.

[0035] FIG. 6A-6E show the chimeric adaptor using CD40 co-stimulatory domain and different ITAMs and the producibility and efficacy of these designs in vitro. FIG. 6A shows exemplary constructs of chimeric adaptors using CD40 co-stimulatory domain and different ITAMs. FIG. 6B shows cell proliferation of chimeric adaptor panT cells (i.e., on day7 during production) . FIG. 6C shows cell viability of chimeric adaptor panT cells (i.e., panT cells containing the indicated chimeric adaptors) on day7 during production. FIG. 6D shows long-term cytotoxicity of chimeric adaptor panT using CD40 co-stimulatory with different ITAMs co-cultured with NUGC3 cells. FIG. 6E shows T cell proliferation in long-term co-cultures of chimeric adaptor panT using CD40 co-stimulatory with different ITAMs co-cultured with NUGC3 cells.

[0036] FIG. 7A-7E show the constructs of NKG2D chimeric receptors using CD40 co-stimulatory domain with different ITAMs, transmembrane domains and hinges, and the producibility and efficacy of these designs in vitro. FIG. 7A shows exemplary constructs of NKG2D chimeric receptors. FIG. 7B shows cell proliferation of NKG2D chimeric receptor panT cells (i.e., on day7 during production) . FIG. 7C shows cell viability of NKG2D chimeric receptor panT cells on day7 during production. FIG. 7D shows long-term cytotoxicity of NKG2D chimeric receptor panT co-cultured with NUGC3 cells. FIG. 7E shows T cell proliferation in long-term co-cultures of NKG2D chimeric receptor panT co-cultured with NUGC3 cells.

[0037] FIG. 8A-8F show the results of animal experiments. FIG. 8A shows the schematic of the experimental procedure. FIG. 8B shows NKG2D ligand expression in MKN45-CLDN18.2 cell lines. FIG. 8C shows effect of CAR-110105-D on tumor volume over time in a subcutaneous xenograft model of MKN45-CLDN18.2 cells. FIG. 8D shows the body weight of the mice treated with UN-T or CAR-110105-D. FIG. 8E shows %hCD3+ within the peripheral blood at each timepoint. FIG. 8F shows %hCD3+CAR+ within the peripheral blood at each timepoint.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0038] The present application provides novel chimeric constructs which, when acting in conjunction with NKG2D receptor, elicit a full cytotoxic response in immune cells. The components and structures of the chimeric constructs are specifically designed such that immune cells containing such chimeric constructs, optionally along with an expressed NKG2D receptor, show improved functional properties, including improved proliferation, viability and efficacy of immune cells relative to cells not containing a chimeric construct. Moreover, engineered immune cells containing certain chimeric constructs demonstrate excellent efficacy and safety in vitro while exhibiting minimal fratricide. The chimeric construct is a chimeric adaptor or an NKG2D chimeric receptor.

[0039] Further, upon comparing engineered immune cells expressing chimeric adaptors with or without an NKG2D receptor, it was demonstrated that engineered immune cells with NKG2D receptor overexpression exhibited enhanced cytotoxicity, proliferation and expansion capabilities as compared to immune cells with endogenous NKG2D receptor.

[0040] Thus, in one aspect, provided herein is an engineered immune cell comprising a chimeric adaptor, wherein the chimeric adaptor comprises a DAP10 transmembrane domain and an intracellular signaling domain, and optionally an expressed NKG2D receptor, as well as pharmaceutical compositions comprising the engineered immune cell disclosed herein.

[0041] In another aspect, provided herein is an engineered immune cell comprising an NKG2D chimeric receptor, wherein the NKG2D chimeric receptor comprises an NKG2D receptor extracellular domain, hinge and DAP10 transmembrane region, followed by a co-stimulatory domain and intracellular signaling domain.

[0042] In another aspect, provided herein is a method of making the engineered immune cell disclosed herein, comprising introducing into a population of immune cells a nucleic acid encoding the chimeric adaptor and / or NKG2D receptor as well as a nucleic acid encoding the NKG2D chimeric receptor.

[0043] In another aspect, provided herein is a method of treating cancer in an individual, or killing a tumor cell in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of the pharmaceutical composition disclosed herein.

[0044] Also provided are chimeric constructs and nucleic acids encoding the chimeric constructs. I. Definitions

[0045] Techniques and procedures described or referenced herein include those that are generally well understood and / or commonly employed using conventional methodology by those skilled in the art, such as, for example, the widely utilized methodologies described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3d ed. 2001) and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2003) . Unless otherwise defined herein, technical and scientific terms used in the present description have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art. For purposes of interpreting this specification, the following description of terms will apply and whenever appropriate, terms used in the singular will also include the plural and vice versa. In the event that any description of a term set forth conflicts with any document incorporated herein by reference, the description of the term set forth below shall control.

[0046] As used herein, “Percent (%) amino acid sequence identity” and “homology” with respect to a peptide, polypeptide or antibody sequence are defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical with the amino acid residues in the specific peptide or polypeptide sequence, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity, and not considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be achieved in various ways that are within the skill in the art, for instance, using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or MEGALIGNTM (DNASTAR) software. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared.

[0047] “Chimeric adaptor” as used herein refers to NKG2D homodimer associates with two homodimeric adaptor molecules via complementary charged amino acids within the plasma membrane. Adaptor molecules could be DAP10 or DAP12. This interaction is required for cell surface expression and function of NKG2D. NKG2D could be endogenous, exogenous or over-expressed. Chimeric adaptor generally includes a transmembrane domain and intracellular signaling domain, and optionally further comprises co-stimulatory domain, but specifically lacks an extracellular domain comprising a ligand-binding domain. “Chimeric adaptor T” refers to a T cell that expresses a chimeric adaptor.

[0048] “NKG2D chimeric receptor” as used herein refers to a chimeric receptor comprises an extracellular portion of the human NKG2D receptor, which linked to a hinge and transmembrane region, followed by a intracellular signaling domain, and optionally further comprises co-stimulatory domain. “NKG2D chimeric receptor T” refers to a T cell that expresses a NKG2D chimeric receptor.

[0049] “Chimeric antigen receptor” or “CAR” as used herein refers to genetically engineered receptors, which graft one or more antigen specificity onto cells, such as T cells. CARs are also known as “artificial T-cell receptors, ” “chimeric T cell receptors, ” or “chimeric immune receptors. ” The CAR may comprise an extracellular variable domain of an antibody specific for a tumor antigen, and an intracellular signaling domain of a T cell or other receptors, such as one or more co-stimulatory signaling domains. “CAR T” refers to a T cell that expresses a CAR.

[0050] As used herein, the “T cell receptor” or “TCR” refers to endogenous or recombinant T cell receptor comprising an extracellular antigen binding domain that binds to a specific antigenic peptide bound in an MHC molecule. The TCR may comprise a TCRα polypeptide chain and a TCR polypeptide chain. The TCR may specifically bind a tumor antigen. “TCR-T” refers to a T cell that expresses a recombinant TCR.

[0051] The terms “polypeptide” and “peptide” and “protein” are used interchangeably herein and refer to polymers of amino acids of any length. The polymer may be linear or branched, it may comprise modified amino acids, and it may be interrupted by non-amino acids. The terms also encompass an amino acid polymer that has been modified naturally or by intervention; for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation, or any other manipulation or modification. Also included within the definition are, for example, polypeptides containing one or more analogs of an amino acid, including but not limited to, unnatural amino acids, as well as other modifications known in the art. It is understood that, because the polypeptides of this disclosure may be based upon antibodies or other members of the immunoglobulin superfamily, a “polypeptide” can occur as a single chain or as two or more associated chains.

[0052] “Polynucleotide” or “nucleic acid, ” as used interchangeably herein, refers to polymers of nucleotides of any length and includes DNA and RNA. The nucleotides can be deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or bases, and / or their analogs, or any substrate that can be incorporated into a polymer by DNA or RNA polymerase or by a synthetic reaction. A polynucleotide may comprise modified nucleotides, such as methylated nucleotides and their analogs. “Oligonucleotide, ” as used herein, refers to short, generally single-stranded, synthetic polynucleotides that are generally, but not necessarily, fewer than about 200 nucleotides in length. The terms “oligonucleotide” and “polynucleotide” are not mutually exclusive. The description above for polynucleotides is equally and fully applicable to oligonucleotides. A cell that produces a binding molecule of the present disclosure may include a parent hybridoma cell, as well as bacterial and eukaryotic host cells into which nucleic acids encoding the antibodies have been introduced. Unless specified otherwise, the left-hand end of any single-stranded polynucleotide sequence disclosed herein is the 5’ end; the left-hand direction of double-stranded polynucleotide sequences is referred to as the 5’ direction. The direction of 5’ to 3’ addition of nascent RNA transcripts is referred to as the transcription direction; sequence regions on the DNA strand having the same sequence as the RNA transcript that are 5’ to the 5’ end of the RNA transcript are referred to as “upstream sequences” ; sequence regions on the DNA strand having the same sequence as the RNA transcript that are 3’ to the 3’ end of the RNA transcript are referred to as “downstream sequences. ”

[0053] An “isolated nucleic acid” is a nucleic acid, for example, an RNA, DNA, or a mixed nucleic acids, which is substantially separated from other genome DNA sequences as well as proteins or complexes such as ribosomes and polymerases, which naturally accompany a native sequence. An “isolated” nucleic acid molecule is one which is separated from other nucleic acid molecules which are present in the natural source of the nucleic acid molecule. Moreover, an “isolated” nucleic acid molecule, such as a cDNA molecule, can be substantially free of other cellular material, or culture medium when produced by recombinant techniques, or substantially free of chemical precursors or other chemicals when chemically synthesized. One or more nucleic acid molecules encoding a chimeric construct as described herein may be isolated or purified. The term embraces nucleic acid sequences that have been removed from their naturally occurring environment, and includes recombinant or cloned DNA isolates and chemically synthesized analogues or analogues biologically synthesized by heterologous systems. A substantially pure molecule may include isolated forms of the molecule. Specifically, an “isolated” nucleic acid molecule encoding a chimeric construct described herein is a nucleic acid molecule that is identified and separated from at least one contaminant nucleic acid molecule with which it is ordinarily associated in the environment in which it was produced.

[0054] Unless otherwise specified, a “nucleotide sequence encoding an amino acid sequence” includes all nucleotide sequences that are degenerate versions of each other and that encode the same amino acid sequence. The phrase nucleotide sequence that encodes a protein or an RNA may also include introns to the extent that the nucleotide sequence encoding the protein may in some versions contain an intron (s) .

[0055] As used herein, the term “control sequences” refers to DNA sequences necessary for the expression of an operably linked coding sequence in a particular host organism. The control sequences that are suitable for prokaryotes, for example, include a promoter, optionally an operator sequence, and a ribosome binding site. Eukaryotic cells are known to utilize promoters, polyadenylation signals, and enhancers.

[0056] As used herein, the term “operatively linked, ” and similar phrases (e.g., genetically fused) , when used in reference to nucleic acids or amino acids, refer to the operational linkage of nucleic acid sequences or amino acid sequence, respectively, placed in functional relationships with each other. For example, an operatively linked promoter, enhancer elements, open reading frame, 5’ and 3’ UTR, and terminator sequences result in the accurate production of a nucleic acid molecule (e.g., RNA) . Operatively linked nucleic acid elements can result in the transcription of an open reading frame and ultimately the production of a polypeptide (i.e., expression of the open reading frame) . As another example, an operatively linked peptide is one in which the functional domains are placed with appropriate distance from each other to impart the intended function of each domain.

[0057] As used herein, the term “vector” refers to a substance that is used to carry or include a nucleic acid sequence, including for example, a nucleic acid sequence encoding a binding molecule (e.g., an antibody) as described herein, in order to introduce a nucleic acid sequence into a host cell. Vectors applicable for use include, for example, expression vectors, plasmids, phage vectors, viral vectors, episomes, and artificial chromosomes, which can include selection sequences or markers operable for stable integration into a host cell’s chromosome. Additionally, the vectors can include one or more selectable marker genes and appropriate expression control sequences. Selectable marker genes that can be included, for example, provide resistance to antibiotics or toxins, complement auxotrophic deficiencies, or supply critical nutrients not in the culture media. Expression control sequences can include constitutive and inducible promoters, transcription enhancers, transcription terminators, and the like, which are well known in the art. When two or more nucleic acid molecules are to be co-expressed (e.g., both an antibody heavy and light chain or an antibody VH and VL) , both nucleic acid molecules can be inserted, for example, into a single expression vector or in separate expression vectors. For single vector expression, the encoding nucleic acids can be operationally linked to one common expression control sequence or linked to different expression control sequences, such as one inducible promoter and one constitutive promoter. The introduction of nucleic acid molecules into a host cell can be confirmed using methods well known in the art. Such methods include, for example, nucleic acid analysis such as Northern blots or polymerase chain reaction (PCR) amplification of mRNA, immunoblotting for expression of gene products, or other suitable analytical methods to test the expression of an introduced nucleic acid sequence or its corresponding gene product. It is understood by those skilled in the art that the nucleic acid molecules are expressed in a sufficient amount to produce a desired product and it is further understood that expression levels can be optimized to obtain sufficient expression using methods well known in the art.

[0058] As used herein, the term “host” refers to an animal, such as a mammal (e.g., a human) .

[0059] As used herein, the term “host cell” refers to a particular subject cell that may be transfected with a nucleic acid molecule and the progeny or potential progeny of such a cell. Progeny of such a cell may not be identical to the parent cell transfected with the nucleic acid molecule due to mutations or environmental influences that may occur in succeeding generations or integration of the nucleic acid molecule into the host cell genome.

[0060] As used herein, the term “autologous” is meant to refer to any material derived from the same individual to whom it is later to be re-introduced into the individual.

[0061] As used herein, the term “allogeneic” refers to a graft derived from a different individual of the same species.

[0062] As used herein, the term “transfected” or “transformed” or “transduced” refers to a process by which exogenous nucleic acid is transferred or introduced into the host cell. A “transfected” or “transformed” or “transduced” cell is one which has been transfected, transformed or transduced with exogenous nucleic acid. The cell includes the primary subject cell and its progeny.

[0063] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable” means being approved by a regulatory agency of the Federal or a state government, or listed in United States Pharmacopeia, European Pharmacopeia, or other generally recognized Pharmacopeia for use in animals, and more particularly in humans.

[0064] As used herein, the term “effective amount” or “therapeutically effective amount” refers to the amount of an antibody or a therapeutic molecule comprising an agent and the antibody or pharmaceutical composition provided herein which is sufficient to result in the desired outcome.

[0065] As used herein, the terms “subject, ” “individual, ” and “patient” may be used interchangeably. As used herein, in certain embodiments, a subject or an individual is a mammal, such as a non-primate or a primate (e.g., human) . In specific embodiments, the individual is a human. In one embodiment, the individual is a mammal, e.g., a human, diagnosed with a disease or disorder, or at risk of developing a disease or disorder.

[0066] As used herein, the terms “treat, ” “treatment” and “treating” refer to the reduction or amelioration of the progression, severity, and / or duration of a disease or condition resulting from the administration of one or more therapies. Treating may be determined by assessing whether there has been a decrease, alleviation and / or mitigation of one or more symptoms associated with the underlying disorder such that an improvement is observed with the patient, despite that the patient may still be afflicted with the underlying disorder. The term “treating” includes both managing and ameliorating the disease. The terms “manage, ” “managing, ” and “management” refer to the beneficial effects that a subject derives from a therapy which does not necessarily result in a cure of the disease.

[0067] As used herein, the terms “prevent, ” “preventing, ” and “prevention” refer to reducing the likelihood of the onset (or recurrence) of a disease, disorder, condition, or associated symptom (s) (e.g., diabetes or a cancer) .

[0068] As used herein, the terms “about” and “approximately” mean within 20%, within 15%, within 10%, within 9%, within 8%, within 7%, within 6%, within 5%, within 4%, within 3%, within 2%, within 1%, or less of a given value or range.

[0069] As used in the present disclosure and claims, the singular forms “a” , “an” and “the” include plural forms unless the context clearly dictates otherwise.

[0070] It is understood that wherever embodiments are described herein with the term “comprising” otherwise analogous embodiments described in terms of “consisting of” and / or “consisting essentially of” are also provided. It is also understood that wherever embodiments are described herein with the phrase “consisting essentially of” otherwise analogous embodiments described in terms of “consisting of” are also provided.

[0071] As used herein, the term “between” as used in a phrase as such “between A and B” or “between A-B” refers to a range including both A and B.

[0072] As used herein, the term “and / or” as used in a phrase such as “A and / or B” herein is intended to include both A and B; A or B; A (alone) ; and B (alone) . Likewise, the term “and / or” as used in a phrase such as “A, B, and / or C” is intended to encompass each of the following embodiments: A, B, and C; A, B, or C; A or C; A or B; B or C; A and C; A and B; B and C; A (alone) ; B (alone) ; and C (alone) . II. Engineered Immune Cells

[0073] The present application in one aspect provides an engineered immune cell comprising a chimeric construct, wherein the chimeric construct comprises a DAP10 (DNAX-activating protein 10) transmembrane domain and an intracellular signaling domain.

[0074] In some embodiments, the chimeric construct further comprises a co-stimulatory domain. Thus, for example, in some embodiments, there is provided an engineered immune cell comprising a chimeric construct, wherein the chimeric construct comprises a DAP10 transmembrane domain, a co-stimulatory domain, and an intracellular signaling domain, wherein the co-stimulatory domain is not derived from 4-1BB. In some embodiments, the co-stimulatory domain is derived from a protein selected from the group consisting of CD27, CD28, CD30, CD40, OX40, and HVEM.

[0075] In some embodiments, the co-stimulatory domain and the intracellular signaling domain are fused to each other via optional peptide linkers. The intracellular signaling domain and the co-stimulatory domain may be arranged in any suitable order. In some embodiments, the co-stimulatory domain is located between the DAP10 transmembrane domain and the intracellular signaling domain. In some embodiments, the co-stimulatory domain is located at the C-terminus of the intracellular signaling domain.

[0076] In some embodiments, there is provided an engineered immune cell (such as an αβT cell, a γδT cell, or an αβT / γδT cell present in a panT population) , or an comprising a chimeric construct, wherein the chimeric construct comprises a DAP10 transmembrane domain, a co-stimulatory domain, and an intracellular signaling domain, wherein the intracellular signaling domain is not derived from CD3ζ. In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from a protein selected from the group consisting of FcRγ, DAP12, CD3γ, CD3δ, and CD3ε. In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from FcRγ or CD3γ.

[0077] In some embodiments, the chimeric construct is a chimeric adaptor. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor or a variant thereof, for example an NKG2D receptor or variant thereof expressed from a heterologous nucleic acid encoding the NKG2D receptor or variant thereof. In some embodiments, the engineered immune cell does not comprise an overexpressed NKG2D receptor or variant thereof.

[0078] In some embodiments, there is provided an engineered immune cell (such as an αβT cell, a γδT cell, or an αβT / γδT cell present in a panT population) comprising a chimeric adaptor, wherein the chimeric adaptor comprises a DAP10 transmembrane domain, a co-stimulatory domain derived from CD28 (also referred to herein as “CD28 co-stimulatory domain” ) , and an intracellular signaling domain.

[0079] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD28 co-stimulatory domain, and an intracellular signaling domain is derived from FcRγ (also referred to herein as “FcRγ intracellular signaling domain” ) . In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 65. In some embodiments, the chimeric adaptor with a peptide signal comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33.

[0080] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD28 co-stimulatory domain, and an intracellular signaling domain is derived from CD3ζ (also referred to herein as “CD3ζ intracellular signaling domain” ) . In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37.

[0081] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD28 co-stimulatory domain, and an intracellular signaling domain is derived from DAP12 (also referred to herein as “DAP12 intracellular signaling domain” ) . In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38.

[0082] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD28 co-stimulatory domain, and an intracellular signaling domain is derived from CD3γ (also referred to herein as “CD3γ intracellular signaling domain” ) . In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 68. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45.

[0083] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD28 co-stimulatory domain, and an intracellular signaling domain is derived from CD3ε (also referred to herein as “CD3ε intracellular signaling domain” ) . In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 69. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.

[0084] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD28 co-stimulatory domain, and an intracellular signaling domain is derived from CD3δ (also referred to herein as “CD3δ intracellular signaling domain” ) . In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 70. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47.

[0085] In some embodiments, there is provided an engineered immune cell (such as an αβT cell, a γδT cell, or an αβT / γδT cell present in a panT population) comprising a chimeric adaptor, wherein the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a co-stimulatory domain derived from 4-1BB (also referred to herein as “4-1BB co-stimulatory domain” ) , and an intracellular signaling domain.

[0086] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a 4-1BB co-stimulatory domain, and an FcRγ intracellular signaling domain. In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39.

[0087] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a 4-1BB co-stimulatory domain, and a CD3ζ intracellular signaling domain.

[0088] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a 4-1BB co-stimulatory domain, and a DAP12 intracellular signaling domain. In some embodiments, the chimeric construct comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72. In some embodiments, the chimeric adaptor with a signal peptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35.

[0089] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a 4-1BB co-stimulatory domain, and CD3γ intracellular signaling domain.

[0090] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a 4-1BB co-stimulatory domain, and a CD3δ intracellular signaling domain.

[0091] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a 4-1BB co-stimulatory domain, and a CD3ε intracellular signaling domain.

[0092] In some embodiments, there is provided an engineered immune cell (such as an αβT cell, a γδT cell, or an αβT / γδT cell present in a panT population) comprising a chimeric adaptor, wherein the chimeric adaptor comprises a DAP10 transmembrane domain, a co-stimulatory domain derived from CD40 (also referred to herein as “CD40 co-stimulatory domain” ) , and an intracellular signaling domain.

[0093] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an FcRγ intracellular signaling domain. In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41.

[0094] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and a CD3ζ intracellular signaling domain.

[0095] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and a DAP12 intracellular signaling domain. In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 74. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61.

[0096] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and CD3γ intracellular signaling domain. In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 63.

[0097] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and a CD3δ intracellular signaling domain. In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64.

[0098] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and a CD3ε intracellular signaling domain. In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62.

[0099] In some embodiments, there is provided an engineered immune cell (such as an αβT cell, a γδT cell, or an αβT / γδT cell present in a panT population) comprising a chimeric adaptor, wherein the chimeric adaptor comprises a DAP10 transmembrane domain, a co-stimulatory domain derived from CD27 (also referred to herein as “CD27 co-stimulatory domain” ) , and an intracellular signaling domain.

[0100] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD27 co-stimulatory domain, and an FcRγ intracellular signaling domain. In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40.

[0101] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD27 co-stimulatory domain, and a CD3ζ intracellular signaling domain.

[0102] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD27 co-stimulatory domain, and a DAP12 intracellular signaling domain.

[0103] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD27 co-stimulatory domain, and CD3γ intracellular signaling domain.

[0104] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD27 co-stimulatory domain, and a CD3δ intracellular signaling domain.

[0105] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD27 co-stimulatory domain, and a CD3ε intracellular signaling domain.

[0106] In some embodiments, there is provided an engineered immune cell (such as an αβT cell, a γδT cell, or an αβT / γδT cell present in a panT population) comprising a chimeric adaptor, wherein the chimeric adaptor comprises a DAP10 transmembrane domain, a co-stimulatory domain derived from CD30 (also referred to herein as “CD30 co-stimulatory domain” ) , and an intracellular signaling domain.

[0107] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD30 co-stimulatory domain, and an FcRγ intracellular signaling domain. In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42.

[0108] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD30 co-stimulatory domain, and a CD3ζ intracellular signaling domain.

[0109] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD30 co-stimulatory domain, and a DAP12 intracellular signaling domain.

[0110] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD30 co-stimulatory domain, and CD3γ intracellular signaling domain.

[0111] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD30 co-stimulatory domain, and a CD3δ intracellular signaling domain.

[0112] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a CD30 co-stimulatory domain, and a CD3ε intracellular signaling domain.

[0113] In some embodiments, there is provided an engineered immune cell (such as an αβT cell, a γδT cell, or an αβT / γδT cell present in a panT population) comprising a chimeric adaptor, wherein the chimeric adaptor comprises a DAP10 transmembrane domain, a co-stimulatory domain derived from HEVM (also referred to herein as “HVEM co-stimulatory domain” ) , and an intracellular signaling domain.

[0114] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a HVEM co-stimulatory domain, and an FcRγ intracellular signaling domain. In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43.

[0115] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a HVEM co-stimulatory domain, and a CD3ζ intracellular signaling domain.

[0116] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a HVEM co-stimulatory domain, and a DAP12 intracellular signaling domain.

[0117] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a HVEM co-stimulatory domain, and CD3γ intracellular signaling domain.

[0118] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a HVEM co-stimulatory domain, and a CD3δ intracellular signaling domain.

[0119] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, a HVEM co-stimulatory domain, and a CD3ε intracellular signaling domain.

[0120] In some embodiments, there is provided an engineered immune cell (such as an αβT cell, a γδT cell, or an αβT / γδT cell present in a panT population) comprising a chimeric adaptor, wherein the chimeric adaptor comprises a DAP10 transmembrane domain, a co-stimulatory domain derived from OX40 (also referred to herein as “OX40 co-stimulatory domain” ) , and an intracellular signaling domain.

[0121] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, an OX40 co-stimulatory domain, and an FcRγ intracellular signaling domain. In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor that comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44.

[0122] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, an OX40 co-stimulatory domain, and a CD3ζ intracellular signaling domain.

[0123] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, an OX40 co-stimulatory domain, and a DAP12 intracellular signaling domain.

[0124] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, an OX40 co-stimulatory domain, and CD3γ intracellular signaling domain.

[0125] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, an OX40 co-stimulatory domain, and a CD3δ intracellular signaling domain.

[0126] In some embodiments, the chimeric adaptor comprises (for example comprises in this order) a DAP10 transmembrane domain, an OX40 co-stimulatory domain, and a CD3ε intracellular signaling domain.

[0127] In another aspect, the chimeric adaptor does not comprises a co-stimulatory domain. For example, in some embodiments, there is provided an engineered immune cell (such as an αβT cell, a γδT cell, or an αβT / γδT cell present in a panT population) comprising a chimeric adaptor (such as a chimeric adaptor not comprising a co-stimulatory domain) , wherein the chimeric adaptor comprises a DAP10 transmembrane domain and an intracellular signaling domain, wherein the intracellular signaling domain is not derived from CD3ζ. In some embodiments, there is provided an engineered immune cell (such as an αβT cell, a γδT cell, or an αβT / γδT cell present in a panT population) comprising a chimeric adaptor (such as a chimeric adaptor not comprising a co-stimulatory domain) , wherein the chimeric adaptor comprises a DAP10 transmembrane domain and an intracellular signaling domain derived from a protein selected from the group consisting of FcRγ, DAP12, CD3γ, CD3δ, and CD3ε. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor or a variant thereof, for example an NKG2D receptor or variant thereof expressed from a heterologous nucleic acid encoding the NKG2D receptor or variant thereof. In some embodiments, the engineered immune cell does not comprise an overexpressed NKG2D receptor or variant thereof.

[0128] In some embodiments, there is provided an engineered immune cell (such as an αβT cell, a γδT cell, or an αβT / γδT cell present in a panT population) comprising a chimeric adaptor (such as a chimeric adaptor not comprising a co-stimulatory domain) , wherein the chimeric adaptor comprises a DAP10 transmembrane domain and an FcRγ intracellular signaling domain. In some embodiments, the chimeric adaptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 or 32.

[0129] In some embodiments, the chimeric construct is a NKG2D chimeric receptor. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises a NKG2D receptor extracellular domain. In some embodiments, the NKG2D receptor extracellular domain comprises amino acids 81-216 of SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the NKG2D receptor extracellular domain is a functional variant of wildtype NKG2D receptor having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the NKG2D receptor extracellular domain comprises one or more mutations (e.g., any of 1, 2, 3, 4, or 5 mutations) that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the NKG2D receptor comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 10, or a variant thereof having at least 85% (e.g., at least about any of 90%. 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the NKG2D receptor is truncated. In some embodiments, the NKG2D receptor extracellular domain comprises amino acids of SEQ ID NO: 11.

[0130] In some embodiments, there is provided an engineered immune cell (such as an αβT cell, a γδT cell, or an αβT / γδT cell present in a panT population) comprising a NKG2D chimeric receptor, wherein the NKG2D chimeric receptor comprises a NKG2D receptor extracellular domain, a hinge, a DAP10 transmembrane domain, a co-stimulatory domain derived from CD40 (also referred to herein as “CD40 co-stimulatory domain” ) , and an intracellular signaling domain. In some embodiments, the hinge is derived from a protein selected from the group consisting of CD8, CD28 and partial DAP10 extracellular domain. In some embodiments, the partial DAP10 extracellular domain comprises amino acids 24-48 of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the partial DAP10 extracellular domain comprises amino acids sequence of SEQ ID NO: 7.

[0131] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises (for example comprises in this order) a NKG2D receptor extracellular domain, a hinge, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an FcRγ intracellular signaling domain.

[0132] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, a partial DAP10 extracellular domain, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an FcRγ intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 102. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor further comprises a signal peptide. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87.

[0133] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, CD28 hinge, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an FcRγ intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor further comprises a signal peptide. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92.

[0134] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, CD8 hinge, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an FcRγ intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor further comprises a signal peptide. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 96.

[0135] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises (for example comprises in this order) a NKG2D receptor extracellular domain, a hinge, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an CD3γ intracellular signaling domain.

[0136] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, a partial DAP10 extracellular domain, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an CD3γ intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor further comprises a signal peptide. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 88.

[0137] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, CD28 hinge, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an CD3γ intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 108. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor further comprises a signal peptide. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93.

[0138] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, CD8 hinge, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an CD3γ intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor further comprises a signal peptide. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 97.

[0139] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises (for example comprises in this order) a NKG2D receptor extracellular domain, a hinge, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an CD3ζ intracellular signaling domain.

[0140] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, a partial DAP10 extracellular domain, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an CD3ζ intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor further comprises a signal peptide. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 89.

[0141] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, a CD28 hinge, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an CD3ζ intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 109. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor further comprises a signal peptide. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94.

[0142] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, a CD8 hinge, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an CD3ζ intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 113. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor further comprises a signal peptide. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98.

[0143] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises (for example comprises in this order) a NKG2D receptor extracellular domain, a hinge, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an CD3δ intracellular signaling domain.

[0144] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, a partial DAP10 extracellular domain, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an CD3δ intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor further comprises a signal peptide. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 90.

[0145] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises (for example comprises in this order) a NKG2D receptor extracellular domain, a hinge, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an DAP12 intracellular signaling domain.

[0146] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, a partial DAP10 extracellular domain, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an DAP12 intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 106. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor further comprises a signal peptide. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91.

[0147] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, CD28 hinge, a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an DAP12 intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 110. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor further comprises a signal peptide. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 95.

[0148] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, CD28 hinge, a CD28 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and an FcRγ intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82.

[0149] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, CD28 hinge, a CD28 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and a CD3γ intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 83.

[0150] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, CD28 hinge, a CD28 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and a CD3ζ intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84.

[0151] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, CD28 hinge, a CD28 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and a CD3δ intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 85.

[0152] In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises from the N-terminus to the C-terminus as following: a NKG2D receptor extracellular domain, CD28 hinge, a CD28 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and DAP12 intracellular signaling domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86. A. DAP10 Transmembrane Domain

[0153] The chimeric constructs described herein comprise a transmembrane domain derived from DAP10 (also referred to as “DAP10 transmembrane domain” ) . DAP10 (DNAX-activating protein 10) is a 10 kDa adaptor protein that noncovalently interacts with the activating receptor NKG2D (natural killer group 2D) (Duan S, Guo W, Xu Z, He Y, Liang C, Mo Y, Wang Y, Xiong F, Guo C, Li Y, Li X, Li G, Zeng Z, Xiong W, Wang F. Mol Cancer 18: 29 (2019) ) . DAP10 is encoded by the hematopoietic cell signal transducer gene (HCST) on chromosome 19 in humans (Lanier LL. Nat Immunol. 9 (5) : 495-502 (2008) ) . DAP10 is also expressed in other mammals, amphibians and fish (Lanier LL. Immunol Rev. 227 (1) : 150-60 (2009) ) . Wildtype DAP10 is composed of an extracellular domain, a transmembrane domain, and a cytoplasmic domain. The small extracellular domain comprises a conserved cysteine that allows for disulfide-bonded homodimer formation between DAP10 proteins (Wu J, Cherwinski H, Spies T, Phillips JH, Lanier LL. J Exp Med. 192 (7) : 1059-68 (2000) ) . DAP10 is a Type I transmembrane protein consisting of a single-pass transmembrane domain. The transmembrane domain is responsible for conferring binding specificity to NKG2D (Wu J, Cherwinski H, Spies T, Phillips JH, Lanier LL. J Exp Med. 192 (7) : 1059-68 (2000) ) . Specifically, a conserved aspartic acid in the DAP10 transmembrane domain interacts with an arginine residue in the NKG2D receptor transmembrane domain. The stoichiometry of this complex is two DAP10 homodimers per NKG2D homodimer (Garrity D, Call ME, Feng J, Wucherpfennig KW. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (21) : 7641-6 (2005) ) . While DAP10 lacks an ITAM, the short cytoplasmic domain comprises a YINM signaling motif. Upon tyrosine phosphorylation, DAP10 can recruit phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and growth factor receptor bound protein 2 (Grb2) -Vav1 to activate downstream signaling pathways (Lanier LL. Nat Immunol. 9 (5) : 495-502 (2008) ; Prajapati K, Perez C, Rojas LBP, Burke B, Guevara-Patino JA. Cell Mol Immunol. 15 (5) : 470-479 (2018) ) .

[0154] The DAP10 transmembrane domain in the chimeric adaptor described herein can comprise amino acids 19-73 of DAP10 or a variant thereof, wherein the position is in reference to SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises one or more substitutions selected from the group consisting of K84R and Y86F, wherein the position is in reference to SEQ ID NO: 6.

[0155] The DAP10 transmembrane domain in the NKG2D chimeric receptor described herein can comprise amino acids 49-73 of DAP10 or a variant thereof, wherein the position is in reference to SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

[0156] In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises (or consists of or consists essentially of) a functional variant of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises one or more mutations (e.g., any of 1, 2, 3, 4, or 5 mutations) that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 6, or a variant thereof having at least 85% (e.g., at least about any of 90%. 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 6.

[0157] In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises a truncated version of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises (or consists of or consists essentially of) amino acids 19-73 of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises (or consists of or consists essentially of) the sequence set forth in SEQ ID NO: 5. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises (or consists of or consists essentially of) amino acids 19-93 of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises (or consists of or consists essentially of) the sequence set forth in SEQ ID NO: 4. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises (or consists of or consists essentially of) amino acids 49-73 of SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises (or consists of or consists essentially of) the sequence set forth in SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises (or consists of or consists essentially of) amino acids 1-93 of SEQ ID NO: 6, with one or more substitutions selected from the group consisting of K84R and Y86F. In some embodiments, the DAP10 transmembrane domain comprises (or consists of or consists essentially of) the sequence set forth in SEQ ID NO: 3.

[0158] The DAP10 transmembrane domain provided herein may comprise a transmembrane region and a cytoplasmic region located at the C-terminal side of the transmembrane domain. The cytoplasmic region of the transmembrane domain may comprise three or more amino acids which, in some embodiments, helps to orient the transmembrane domain in the lipid bilayer. In some embodiments, one or more cysteine residues are present in the transmembrane region of the transmembrane domain. In some embodiments, one or more cysteine residues are present in the cytoplasmic region of the transmembrane domain. In some embodiments, the cytoplasmic region of the transmembrane domain comprises positively charged amino acids. In some embodiments, the cytoplasmic region of the transmembrane domain comprises the amino acids arginine, serine, and lysine. B. Intracellular Signaling Domain

[0159] The chimeric constructs described herein comprise an intracellular signaling domain. The intracellular signaling domain is responsible for activation of at least one of the normal effector functions of the engineered immune cell expressing the chimeric constructs. The term “effector function” refers to a specialized function of a cell, such as in the killing of diseased cells such as tumor cells, or in the inhibition of tumor growth and / or inhibition of tumor development, including inhibition of tumor dissemination and metastasis. Effector function of a T cell, for example, may be cytolytic activity or helper activity including the secretion of cytokines. Thus the term “intracellular signaling domain” refers to the portion of a protein which transduces the effector function signal and directs the cell to perform a specialized function. While usually the entire intracellular signaling domain can be employed, in many cases it is not necessary to use the entire chain. To the extent that a truncated portion of the intracellular signaling domain is used, such truncated portion may be used in place of the intact chain as long as it transduces the effector function signal. The term intracellular signaling domain is thus meant to include any truncated portion of the intracellular signaling domain sufficient to transduce the effector function signal.

[0160] The chimeric construct described herein (with or without a co-stimulatory domain) comprises an intracellular signaling domain. In some embodiments, the intracellular signaling domain comprises (or consists essentially of, or consists of) a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell. In some embodiments, the chimeric construct comprises an intracellular signaling domain consisting essentially of a primary intracellular signaling domain of an immune effector cell. “Primary intracellular signaling domain” refers to intracellular signaling sequence that acts in a stimulatory manner to induce immune effector functions.

[0161] In some embodiments, the primary intracellular signaling domain contains a signaling motif known as immunoreceptor tyrosine-based activation motif, or ITAM. An “ITAM, ” as used herein, is a conserved protein motif that is generally present in the tail portion of signaling molecules expressed in many immune cells. The motif may comprise two repeats of the amino acid sequence YxxL / I separated by 6-8 amino acids, wherein each x is independently any amino acid, producing the conserved motif YxxL / I-x6-8-YxxL / I. In some embodiments, the ITAM contains a negatively charged amino acid (D / E) in the +2 position relative to the first ITAM tyrosine (Y) , resulting a consensus sequence of D / E-x0-2-YxxL / I-x6-8-YxxL / I. ITAMs within signaling molecules are important for signal transduction within the cell, which is mediated at least in part by phosphorylation of tyrosine residues in the ITAM following activation of the signaling molecule. ITAMs may also function as docking sites for other proteins involved in signaling pathways. Exemplary ITAM-containing primary intracellular signaling sequences include those derived from FcεRIβ, FcεRIγ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, DAP12, CNAIP / NFAM1, STAM-1, STAM-2, Moesin, CD5, CD22, CD79a, CD79b, and CD66d (CEACAM3) .

[0162] A “functional” primary intracellular signaling domain is a sequence that is capable of transducing an immune cell activation signal when operably coupled to an appropriate receptor.

[0163] In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from a protein selected from the group consisting of FcRγ, CD3ζ, DAP12, CD3γ, CD3δ, and CD3ε.

[0164] In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from FcRγ. FcRγ is a homodimer made of two disulfide bond-linked polypeptides highly conserved in mice and humans. Each polypeptide consists of a 5-amino-acid extracellular domain, a transmembrane domain, and a 42-amino-acid intracytoplasmic domain. FcRγ contains ITAM. Upon receptor aggregation, ITAM are phosphorylated by src family tyrosine kinases (Pribluda et al., 1994) , which initiates the constitution of dynamic intracellular signalosomes (Kent et al., 1994) in which activation signals are dominant over inhibition signals.

[0165] In some embodiments, the FcRγ intracellular signaling domain comprises amino acids 45-86 of FcRγ or a variant thereof, wherein the position is in reference to SEQ ID NO: 48. In some embodiments, the FcRγ intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the sequence set forth in SEQ ID NO: 20 or a portion thereof. In some embodiments, the FcRγ intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In some embodiments, the FcRγ intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) a functional variant of SEQ ID NO: 20. In some embodiments, the FcRγ intracellular signaling domain comprises one or more mutations (e.g., any of 1, 2, 3, 4, or 5 mutations) that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 20. In some embodiments, the FcRγ intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 20, or a variant thereof having at least 85% (e.g., at least about any of 90%. 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 20.

[0166] In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from CD3ζ. CD3ζplays an important role in coupling antigen recognition to several intracellular signal-transduction pathways.

[0167] In some embodiments, the CD3ζ intracellular signaling domain comprises amino acids 52-164 of CD3ζ or a variant thereof, wherein the position is in reference to SEQ ID NO: 49. In some embodiments, the CD3ζ intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the sequence set forth in SEQ ID NO: 16 or a portion thereof. In some embodiments, the CD3ζ intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. In some embodiments, the CD3ζ intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) a functional variant of SEQ ID NO: 16. In some embodiments, the CD3ζ intracellular signaling domain comprises one or more mutations (e.g., any of 1, 2, 3, 4, or 5 mutations) that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 16. In some embodiments, the CD3ζ intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 16, or a variant thereof having at least 85% (e.g., at least about any of 90%. 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 16.

[0168] In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from DAP12. DAP12 contains a single ITAM, which after tyrosine phosphorylation recruits and activates Syk in myeloid cells and Syk and ZAP70 in NK cells. In some embodiments, the DAP12 intracellular signaling domain comprises amino acids 62-113 of DAP12 or a variant thereof, wherein the position is in reference to SEQ ID NO: 9 In some embodiments, the DAP12 intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the sequence set forth in SEQ ID NO: 15 or a portion thereof. In some embodiments, the DAP12 intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. In some embodiments, the DAP12 intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) a functional variant of SEQ ID NO: 15. In some embodiments, the DAP12 intracellular signaling domain comprises one or more mutations (e.g., any of 1, 2, 3, 4, or 5 mutations) that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 15. In some embodiments, the DAP12 intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 15, or a variant thereof having at least 85% (e.g., at least about any of 90%. 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 15.

[0169] In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from CD3γ. In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from CD3δ. In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from CD3ε. In mammals, a CD3γ chain, a CD3δ chain, and two CD3ε chains make up the CD3 (cluster of differentiation 3) protein complex, which is involved in activating both the cytotoxic T cell (CD8+ naive T cells) and T helper cells (CD4+naive T cells) .

[0170] In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from CD3γ. In some embodiments, the CD3γ intracellular signaling domain comprises amino acids 138-182 of CD3γor a variant thereof, wherein the position is in reference to SEQ ID NO: 50. In some embodiments, the CD3γ intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the sequence set forth in SEQ ID NO: 17 or a portion thereof. In some embodiments, the CD3γintracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. In some embodiments, the CD3γ intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) a functional variant of SEQ ID NO: 17. In some embodiments, the CD3γ intracellular signaling domain comprises one or more mutations (e.g., any of 1, 2, 3, 4, or 5 mutations) that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 17. In some embodiments, the CD3γ intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 17, or a variant thereof having at least 85% (e.g., at least about any of 90%. 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 17.

[0171] In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from CD3δ. In some embodiments, the CD3δ intracellular signaling domain comprises amino acids 127-171 of CD3δor a variant thereof, wherein the position is in reference to SEQ ID NO: 51. In some embodiments, the CD3δ intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or a portion thereof. In some embodiments, the CD3δintracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the CD3δ intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) a functional variant of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the CD3δ intracellular signaling domain comprises one or more mutations (e.g., any of 1, 2, 3, 4, or 5 mutations) that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the CD3δ intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 19, or a variant thereof having at least 85% (e.g., at least about any of 90%. 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 19.

[0172] In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from CD3ε. In some embodiments, the CD3ε intracellular signaling domain comprises amino acids 153-207 of CD3εor a variant thereof, wherein the position is in reference to SEQ ID NO: 52. In some embodiments, the CD3ε intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the sequence set forth in SEQ ID NO: 18 or a portion thereof. In some embodiments, the CD3εintracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the CD3ε intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) a functional variant of SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the CD3ε intracellular signaling domain comprises one or more mutations (e.g., any of 1, 2, 3, 4, or 5 mutations) that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the CD3ε intracellular signaling domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 18, or a variant thereof having at least 85% (e.g., at least about any of 90%. 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 18. C. Co-stimulatory Domain

[0173] The chimeric constructs described herein may further comprise a co-stimulatory domain. The term “co-stimulatory signaling domain, ” as used herein, refers to at least a portion of a protein that mediates a secondary or co-stimulatory signal transduction within a cell to induce an immune response such as an effector function. The intracellular co-stimulatory signaling domain can act in an antigen-independent manner to provide a secondary or co-stimulatory signal to immune cells. The co-stimulatory signaling domain of the chimeric constructs described herein can be an intracellular signaling domain from a co-stimulatory protein, which transduces a secondary or co-stimulatory signal and modulates responses mediated by immune cells, such as T cells, NK cells, macrophages, neutrophils, or eosinophils. The term “co-stimulatory molecule” refers to a cognate binding partner on an immune cell (such as a T cell) that specifically binds with a co-stimulatory ligand, thereby mediating a co-stimulatory response by the immune cell, such as, but not limited to, proliferation and survival.

[0174] Also within the scope of the present disclosure are variants of any of the intracellular co-stimulatory signaling domains described herein, such that the variant intracellular co-stimulatory signaling domain is capable of modulating the immune response of the immune cell. The co-stimulatory domain may comprise up to 10 amino acid residue variations (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, or 8) as compared to a wild-type counterpart. Mutation of amino acid residues of the co-stimulatory domain may result in i) an increase in signaling transduction and enhanced stimulation of immune responses relative to intracellular co-stimulatory signaling domains that do not comprise the mutation; or ii) a decrease in signaling transduction and reduced stimulation of immune responses relative to intracellular co-stimulatory signaling domains that do not comprise the mutation.

[0175] In some embodiments, the chimeric construct comprises (or consists essentially of, or consists of) a single intracellular co-stimulatory signaling domain. In some embodiments, the chimeric construct comprises (or consists essentially of, or consists of) two or more (such as about any of 2, 3, 4, or more) intracellular co-stimulatory signaling domains. In some embodiments, the chimeric construct comprises two or more of the same co-stimulatory signaling domains. In some embodiments, the chimeric construct comprises two or more co-stimulatory signaling domains from different co-stimulatory proteins, such as any two or more co-stimulatory proteins described herein.

[0176] Activation of an intracellular co-stimulatory signaling domain in a host cell (e.g., an immune cell) may induce the cell to increase or decrease the production and secretion of cytokines, phagocytic properties, proliferation, differentiation, survival, and / or cytotoxicity. The intracellular co-stimulatory signaling domain of any co-stimulatory molecule may be compatible for use in the chimeric constructs described herein. The type (s) of intracellular co-stimulatory signaling domain is selected based on factors such as the type of the immune effector cells in which the chimeric constructs would be expressed (e.g., T cells, NK cells, macrophages, neutrophils, or eosinophils) and the desired immune effector function (e.g., ADCC effect) . Examples of intracellular co-stimulatory signaling domains for use in the chimeric constructs can be the cytoplasmic signaling domain of co-stimulatory proteins, including, without limitation, members of the B7 / CD28 family (e.g., B7-1 / CD80, B7-2 / CD86, B7-H1 / PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA / CD272, CD28, CTLA-4, Gi24 / VISTA / B7-H5, ICOS / CD278, PD-1, PD-L2 / B7-DC, and PDCD6) ; members of the TNF superfamily (e.g., 4-1BB / TNFSF9 / CD137, 4-1BB Ligand / TNFSf9, BAFF / BLyS / TNFSF13B, BAFF R / TNFRSF13C, CD27 / TNFRSF7, CD27 Ligand / TNFSF7, CD30 / TNFRSF8, CD30 Ligand / TNFSF8, CD40 / TNFRSF5, CD40 / TNFSF5, CD40 Ligand / TNFSF5, DR3 / TNFRSF25, GITR / TNFRSF18, GITR Ligand / TNFSF18, HVEM / TNFRSF14, LIGHT / TNFSF14, Lymphotoxin-alpha / TNF-beta, OX40 / TNFRSF4, OX40 Ligand / TNFSF4, RELT / TNFRSF19L, TACI / TNFRSF13B, TL1A / TNFSF15, TNF-alpha, and TNF RII / TNFRSF1B) ; members of the SLAM family (e.g., 2B4 / CD244 / SLAMF4, BLAME / SLAMF8, CD2, CD2F-10 / SLAMF9, CD48 / SLAMF2, CD58 / LFA-3, CD84 / SLAMF5, CD229 / SLAMF3, CRACC / SLAMF7, NTB-A / SLAMF6, and SLAM / CD150) ; and any other co-stimulatory molecules, such as CD2, CD7, CD53, CD82 / Kai-1, CD90 / Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a / LMIR1, HLA Class I, HLA-DR, Ikaros, Integrin alpha 4 / CD49d, Integrin alpha 4 beta 1, Integrin alpha 4 beta 7 / LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, Dectin-1 / CLEC7A, DPPIV / CD26, EphB6, TIM-1 / KIM-1 / HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, lymphocyte function associated antigen-1 (LFA-1) , and NKG2C. In some embodiments, the one or more intracellular co-stimulatory signaling domains are derived from a co-stimulatory molecule selected from the group consisting of CD27, CD28, CD137, OX40, CD40, PD-1, LFA-1, ICOS, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, TNFRSF9, TNFRSF4, TNFRSF8, CD40LG, ITGB2, KLRC2, TNFRSF18, TNFRSF14, HAVCR1, LGALS9, DAP10, DAP12, CD83, ligands of CD83, and variants or combinations thereof.

[0177] In some embodiments, the co-stimulatory domain comprised in the chimeric constructs described herein is not derived from 4-1BB. In some embodiments, the co-stimulatory domain is derived from a protein selected from the group consisting of CD27, CD28, CD30, CD40, OX40, and HVEM.

[0178] In some embodiments, the co-stimulatory domain is derived from CD28. CD28 is part of the Immunoglobulin superfamily, wherein the cytoplasmic tail includes a YMNM and proline-rich motif which are involved in initiating downstream signaling events (Esensten JH, Helou YA, Chopra G, Weiss A, Bluestone JA. Immunity. 44 (5) : 973-88 (2016) ) . CD28 is considered the prototypical T cell costimulatory receptor and competes with its co‐inhibitory receptor counterpart CTLA4 for binding to the B7 molecules CD80 and CD86 on antigen‐presenting cells (APCs) . While some costimulatory molecules are expressed only upon T cell activation, CD28 is expressed by both resting and recently activated T cells.

[0179] In some embodiments, the co-stimulatory domain described herein is derived from CD28. In some embodiments, the CD28 co-stimulatory domain comprises amino acids 180-220 of CD28 or a variant thereof, wherein the position is in reference to SEQ ID NO: 53. In some embodiments, the CD28 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the sequence set forth in SEQ ID NO: 21 or a portion thereof. In some embodiments, the CD28 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21. In some embodiments, the CD28 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) a functional variant of SEQ ID NO: 21. In some embodiments, the CD28 co-stimulatory domain comprises one or more mutations (e.g., any of 1, 2, 3, 4, or 5 mutations) that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 21. In some embodiments, the CD28 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 21, or a variant thereof having at least 85%(e.g., at least about any of 90%. 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 21.

[0180] CD27, CD30, CD40, OX40 and HVEM are members of the tumor necrosis factor receptor (TNFR) superfamily. These proteins contain TNR receptor-associated factor (TRAF) binding motifs in their cytoplasmic domains which mediate signal transduction (Singh R, Kim YH, Lee SJ, Eom HS, Choi BK. Exp Mol Med. 56 (1) : 32-39 (2024) ; Croft M, So T, Duan W, Soroosh P. Immunol Rev. 229 (1) : 173-91 (2009) ; Xie P, Kraus ZJ, Stunz LL, Bishop GA. Cytokine Growth Factor Rev. 19 (3-4) : 199-207 (2008) ; Murphy KM, Nelson CA,  JR. Nat Rev Immunol. 6 (9) : 671-81 (2006) ; Xie P. J Mol Signal. 2013 Jun 13; 8 (1) : 7 (2013) ) . TNFR superfamily members preferentially recruit and activate TNF receptor‐associated factors (TRAFs) to potentiate NF‐κB activation.

[0181] In some embodiments, the co-stimulatory domain described herein is derived from CD27. CD27 (TNFRSF7) is constitutively expressed on CD4+ and CD8+ T cells and on a subset of NK cells. Unlike the other TNFR family members, CD27 is present at the cell surface as a disulphide‐linked homodimer and its expression is upregulated upon T cell activation. In some embodiments, the CD27 co-stimulatory domain comprises amino acids 213-260 of CD27 or a variant thereof, wherein the position is in reference to SEQ ID NO: 54. In some embodiments, the CD27 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the sequence set forth in SEQ ID NO: 23 or a portion thereof. In some embodiments, the CD27 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the CD27 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) a functional variant of SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the CD27 co-stimulatory domain comprises one or more mutations (e.g., any of 1, 2, 3, 4, or 5 mutations) that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 23. In some embodiments, the CD27 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 23, or a variant thereof having at least 85%(e.g., at least about any of 90%. 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 23.

[0182] In some embodiments, the co-stimulatory domain is derived from CD30. TRAF2 and TRAF5 can interact with this receptor, and mediate the signal transduction that leads to the activation of NFκB. In some embodiments, the CD30 co-stimulatory domain comprises amino acids 407-595 of CD30 or a variant thereof, wherein the position is in reference to SEQ ID NO: 55. In some embodiments, the CD30 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the sequence set forth in SEQ ID NO: 25 or a portion thereof. In some embodiments, the CD30 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the CD30 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) a functional variant of SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the CD30 co-stimulatory domain comprises one or more mutations (e.g., any of 1, 2, 3, 4, or 5 mutations) that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the CD30 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 25, or a variant thereof having at least 85% (e.g., at least about any of 90%. 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 25.

[0183] In some embodiments, the co-stimulatory domain described herein is derived from CD40. Co-stimulatory domains derived from CD40 have been shown to increase proliferation and secretion of pro‐inflammatory Th1 cytokines (Weinkove R, George P, Dasyam N, McLellan AD. Selecting costimulatory domains for chimeric antigen receptors: functional and clinical considerations. Clin Transl Immunology. 2019 May 11; 8 (5) : e1049. doi: 10.1002 / cti2.1049. PMID: 31110702; PMCID: PMC6511336) . In some embodiments, the co-stimulatory domain is derived from CD40. In some embodiments, the CD40 co-stimulatory domain comprises amino acids 216-277 of CD40 or a variant thereof, wherein the position is in reference to SEQ ID NO: 56. In some embodiments, the CD40 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the sequence set forth in SEQ ID NO: 24 or a portion thereof. In some embodiments, the CD40 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the CD40 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) a functional variant of SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the CD40 co-stimulatory domain comprises one or more mutations (e.g., any of 1, 2, 3, 4, or 5 mutations) that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 24. In some embodiments, the CD40 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 24, or a variant thereof having at least 85% (e.g., at least about any of 90%. 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 24.

[0184] In some embodiments, the co-stimulatory domain described herein is derived from OX40 (TNFRSF4, CD134) . OX40 is expressed following T cell activation and is not involved in initial T cell activation, but is essential for T cell proliferation and survival. Upon binding to its ligand OX40L (TNFSF4, CD252) on activated APCs, OX40 acts via both PI3K / Akt and TRAF pathways. In some embodiments, the OX40 co-stimulatory domain comprises amino acids 236-277 of OX40 or a variant thereof, wherein the position is in reference to SEQ ID NO: 57. In some embodiments, the OX40 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the sequence set forth in SEQ ID NO: 27 or a portion thereof. In some embodiments, the OX40 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the OX40 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) a functional variant of SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the OX40 co-stimulatory domain comprises one or more mutations (e.g., any of 1, 2, 3, 4, or 5 mutations) that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the CD28 co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 27, or a variant thereof having at least 85%(e.g., at least about any of 90%. 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 27.

[0185] In some embodiments, the co-stimulatory domain is derived from HVEM. HVEM has been shown to be involved in T-cell proliferation and memory differentiation. It is reported that HVEM can trigger a novel signaling pathway, leading to activation of STAT3. In some embodiments, the co-stimulatory domain is derived from HVEM. In some embodiments, the HVEM co-stimulatory domain comprises amino acids 224-283 of HVEM or a variant thereof, wherein the position is in reference to SEQ ID NO: 58. In some embodiments, the HVEM co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the sequence set forth in SEQ ID NO: 26 or a portion thereof. In some embodiments, the HVEM co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the HVEM co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) a functional variant of SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the HVEM co-stimulatory domain comprises one or more mutations (e.g., any of 1, 2, 3, 4, or 5 mutations) that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 26. In some embodiments, the HVEM co-stimulatory domain comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 26, or a variant thereof having at least 85% (e.g., at least about any of 90%. 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 26. E. Nucleic Acid Encoding the Chimeric Construct

[0186] In some embodiments, the chimeric construct is expressed by a heterologous nucleic acid encoding the chimeric construct. In some embodiments, the nucleic acid is present on a vector. In some embodiments, the vector is suitable for replication and integration in eukaryotic cells, such as mammalian cells. In some embodiments, the vector is a viral vector. Examples of viral vectors include, but are not limited to, adenoviral vectors, adeno-associated virus vectors, lentiviral vector, retroviral vectors, herpes simplex viral vector, and derivatives thereof. Viral vector technology is well known in the art and is described, for example, in Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) , and in other virology and molecular biology manuals.

[0187] A number of viral based systems have been developed for gene transfer into mammalian cells. For example, retroviruses provide a convenient platform for gene delivery systems. The heterologous nucleic acid can be inserted into a vector and packaged in retroviral particles using techniques known in the art. The recombinant virus can then be isolated and delivered to the engineered mammalian cell in vitro or ex vivo. A number of retroviral systems are known in the art. In some embodiments, adenovirus vectors are used. A number of adenovirus vectors are known in the art. In some embodiments, lentivirus vectors are used. In some embodiments, self-inactivating lentiviral vectors are used. The lentiviral vectors can be used to transduce a mammalian cell (such as primary human T cells) using methods known in the art. Vectors derived from retroviruses such as lentivirus are suitable tools to achieve long-term gene transfer, because they allow long-term, stable integration of a transgene and its propagation in progeny cells. Lentiviral vectors also have low immunogenicity, and can transduce non-proliferating cells. In some embodiments, the vector encoding the chimeric construct is a lentiviral vector.

[0188] In some embodiments, the vector is a non-viral vector. In some embodiments, the vector is a transposon, such as a Sleeping Beauty (SB) transposon system, or a PiggyBac transposon system. In some embodiments, the vector is a polymer-based non-viral vector, including for example, poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) and poly lactic acid (PLA) , poly (ethylene imine) (PEI) , and dendrimers. In some embodiments, the vector is a cationic-lipid based non-viral vector, such as cationic liposome, lipid nanoemulsion, and solid lipid nanoparticle (SLN) . In some embodiments, the vector is a peptide-based gene non-viral vector, such as poly-L-lysine. Any of the known non-viral vectors suitable for genome editing can be used for introducing the nucleic acid encoding the chimeric construct to the engineered immune cell (e.g., T cell) . See, for example, Yin H. et al. Nature Rev. Genetics (2014) 15: 521-555; Aronovich EL et al. “The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy. ” Hum. Mol. Genet. (2011) R1: R14-20; and Zhao S. et al. “PiggyBac transposon vectors: the tools of the human gene editing. ” Transl. Lung Cancer Res. (2016) 5 (1) : 120-125, which are incorporated herein by reference. In some embodiments, any one or more of the nucleic acids encoding the chimeric construct disclosure herein is introduced to the engineered immune effector cells (e.g., T cell) by a physical method, including, but not limited to electroporation, sonoporation, photoporation, magnetofection, hydroporation.

[0189] In some embodiments, the vector (e.g., viral vector such as lentiviral vector) comprises any one of the nucleic acids encoding the chimeric constructs described herein. The nucleic acid can be cloned into the vector using any known molecular cloning methods in the art, including, for example, using restriction endonuclease sites and one or more selectable markers.

[0190] In some embodiments, the nucleic acid encoding the chimeric construct is operably linked to a promoter. Varieties of promoters have been explored for gene expression in mammalian cells, and any of the promoters known in the art may be used in the present disclosure. Promoters may be roughly categorized as constitutive promoters or regulated promoters, such as inducible promoters.

[0191] In some embodiments, the nucleic acid encoding the chimeric constructs described herein is operably linked to a constitutive promoter. Constitutive promoters allow heterologous genes (also referred to as transgenes) to be expressed constitutively in the host cells. Exemplary promoters contemplated herein include, but are not limited to, cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV) , human elongation factors-1alpha (hEF1α) , ubiquitin C promoter (UbiC) , phosphoglycerokinase promoter (PGK) , simian virus 40 early promoter (SV40) , chicken β-Actin promoter coupled with CMV early enhancer (CAGG) , a Rous Sarcoma Virus (RSV) promoter, a polyoma enhancer / herpes simplex thymidine kinase (MC1) promoter, a beta actin (β-ACT) promoter, a “myeloproliferative sarcoma virus enhancer, negative control region deleted, d1587rev primer-binding site substituted (MND) ” promoter. The efficiencies of such constitutive promoters on driving transgene expression have been widely compared in a huge number of studies. For example, Michael C. Milone et al. compared the efficiencies of CMV, hEF1α, UbiC and PGK to drive CAR expression in primary human T cells, and concluded that hEF1α promoter not only induced the highest level of transgene expression, but was also optimally maintained in the CD4 and CD8 human T cells (Molecular Therapy, 17 (8) : 1453-1464 (2009) ) . In some embodiments, the nucleic acid encoding the chimeric construct described herein is operably linked to a hEF1αpromoter or a PGK promoter.

[0192] In some embodiments, the nucleic acid encoding the chimeric constructs described herein is operably linked to an inducible promoter. Inducible promoters belong to the category of regulated promoters. The inducible promoter can be induced by one or more conditions, such as a physical condition, microenvironment of the engineered immune cell (e.g., T cell) , or the physiological state of the engineered immune effector cell, an inducer (i.e., an inducing agent) , or a combination thereof. In some embodiments, the inducing condition does not induce the expression of endogenous genes in the engineered mammalian cell, and / or in the subject that receives the pharmaceutical composition. In some embodiments, the inducing condition is selected from the group consisting of: inducer, irradiation (such as ionizing radiation, light) , temperature (such as heat) , redox state, tumor environment, and the activation state of the engineered mammalian cell. In some embodiments, the inducible promoter can be an NFAT promoter, a  promoter, or an NFκB promoter.

[0193] In some embodiments, the inducing condition does not induce the expression of endogenous genes in the engineered immune cell, and / or in the individual that receives the pharmaceutical composition.

[0194] In some embodiments, the vector also contains a selectable marker gene or a reporter gene to select cells expressing the chimeric constructs described herein from the population of host cells transfected through vectors (e.g., lentiviral vectors) . Both selectable markers and reporter genes may be flanked by appropriate regulatory sequences to enable expression in the host cells. For example, the vector may contain transcription and translation terminators, initiation sequences, and promoters useful for regulation of the expression of the nucleic acid sequences.

[0195] In some embodiments, the heterologous nucleic acid further encodes a signal peptide (also known as a signal sequence) at the N-terminus of the chimeric construct. In general, signal peptides are peptide sequences that target a polypeptide to the desired site in a cell. In some embodiments, the signal peptide targets the chimeric construct to the secretory pathway of the cell and will allow for integration and anchoring of the chimeric construct into the lipid bilayer. Signal peptides including signal sequences of naturally occurring proteins or synthetic, non-naturally occurring signal sequences, which are compatible for use in the chimeric constructs described herein, will be evident to one of skill in the art. In some embodiments, the signal peptide is derived from a molecule selected from the group consisting of CD8α, GM-CSF receptor α, and IgG1 heavy chain. In some embodiments, the signal peptide is derived from a CD8α peptide, e.g., human CD8α. In some embodiments, the signal peptide derived from CD8α comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a portion thereof. F. Overexpressed NKG2D Receptor

[0196] In some embodiments, the engineered immune cell of the present disclosure comprises an overexpressed NKG2D receptor. In some embodiments, the overexpressed NKG2D receptor is a full-length NKG2D receptor. In some embodiments, the NKG2D receptor is a truncated NKG2D receptor. In some embodiments, the expression level of NKG2D receptor is at least about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, or more comparing to a control immune cell not overexpressing NKG2D receptor.

[0197] In some embodiments, the overexpressed NKG2D receptor is expressed from an endogenous nucleic acid encoding the NKG2D receptor. The gene that encodes NKG2D receptor is known as NKG2D or KLRK1 (Killer Cell Lectin-Like Receptor K1) . In some embodiments, the endogenous nucleic acid encoding the NKG2D receptor is a rs1049174 (C > G) variant of KLRK1, which may result in higher NKG2D receptor expression (Siemaszko, J.; Marzec-Przyszlak, A.; Bogunia-Kubik, K. NKG2D Natural Killer Cell Receptor-AShort Description and Potential Clinical Applications. Cells 2021, 10, 1420. https:  / / doi. org / 10.3390 / cells10061420) . In some embodiments, the endogenous nucleic acid encoding the NKG2D receptor is a rs2255336 (A> G) variant of KLRK1, which results in a substitution of alanine with threonine at position 72 of the NKG2D receptor protein. In some embodiments, overexpression of endogenous NKG2D receptor is accomplished by mutations in the promoter region of the gene. In some embodiments, overexpression of endogenous NKG2D receptor is accomplished by mutations in the enhancer region of the gene. Mutations can include insertions, deletions and substitutions. In some embodiments, overexpression of endogenous NKG2D receptor is accomplished by introducing an inflammatory stimulus. For example, IL-15 has been shown to upregulate NKG2D receptor expression (Ruck T, Bittner S, Afzali AM,  K, Glumm S, Kraft P, Sommer C, Kleinschnitz C, Preuβe C, Stenzel W, Wiendl H, Meuth SG. Oncotarget. 6 (41) : 43230-43 (2015) ) .

[0198] In some embodiments, overexpression of NKG2D receptor is accomplished by introducing into the immune cell a heterologous nucleic acid encoding NKG2D receptor. When the NKG2D receptor overexpression is accomplished by introducing into the immune cell a heterologous nucleic acid encoding NKG2D receptor, the NKG2D receptor can be either wildtype NKG2D receptor or a variant thereof. In some embodiments, the NKG2D receptor comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the NKG2D receptor is a functional variant of wildtype NKG2D receptor having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the NKG2D receptor comprises one or more mutations (e.g., any of 1, 2, 3, 4, or 5 mutations) that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the NKG2D receptor comprises (or consists of or consists essentially of) the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 10, or a variant thereof having at least 85%(e.g., at least about any of 90%. 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) sequence identity to SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the NKG2D receptor is truncated. In some embodiments, the truncated NKG2D receptor comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.

[0199] The heterologous nucleic acid encoding NKG2D receptor can be present on the same vector as the nucleic acid encoding the chimeric adaptor. In some embodiments, the heterologous nucleic acid encoding NKG2D receptor and the nucleic acid encoding the chimeric adaptor are on the same vector, optionally wherein the two nucleic acids are connected by a nucleic acid encoding a cleavable linker. For example, the nucleic acid encoding the chimeric adaptor may be linked to the nucleic acid encoding the NKG2D receptor through a nucleic acid encoding a 2A self-cleaving peptide, such as P2A, T2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, BmIFV 2A. In some embodiments, the 2A peptide is P2A, T2A, E2A, or F2A peptide. G. Engineered Receptors

[0200] In some embodiments, the engineered immune cells described herein may further express an engineered receptor. In some embodiments, the engineered receptor is an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) , or a T cell antigen coupler (TAC) . In some embodiments, the engineered receptor comprises an extracellular domain specifically recognizing any of GPC2, GPRC5D, CD7, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD70, CD123, CD228, CD138, BCMA, AFP, GPC3, CEA, Claudin 18.2, CLL1, CD33, folate receptor (FRα) , mesothelin (MSLN) , DLL3, CD276, gp100, 5T4, GD2, EGFR, MUC-1, PSMA, EpCAM, MCSP, SM5-1, MICA, MICB, NKG2D ligand, ULBP and HER-2.

[0201] The nucleic acid encoding the engineered receptor can be previously present in the immune cell or is introduced into the immune cell along with (e.g., simultaneously with) the nucleic acid encoding the chimeric construct and / or NKG2D receptor disclosed herein. The engineered receptor can comprise an extracellular ligand binding domain and optionally an intracellular signaling domain.

[0202] In some embodiments, the engineered receptor is an engineered TCR, such as a traditional engineered TCR comprising an extracellular ligand binding domain comprising a Vα and a Vβderived from a wildtype TCR together specifically recognizing an antigen (such as tumor antigen) , wherein the Vα, the Vβ, or both, comprise one or more mutations in one or more CDRs relative to the wildtype TCR. T cells expressing traditional engineered TCRs are referred herein as “traditional TCR-T. ” In some embodiments, the engineered receptor is a chimeric TCR (cTCR) comprising (a) an extracellular ligand binding domain comprising an antigen-binding fragment (e.g., scFv, sdAb) that specifically recognizes one or more epitopes of a tumor antigens; (b) an optional linker; (c) an optional extracellular domain of a first TCR subunit or a portion thereof; (d) a transmembrane domain comprising a transmembrane domain of a second TCR subunit; and (e) an intracellular signaling domain comprising an intracellular signaling domain of a third TCR subunit; wherein the first, second, and third TCR subunit are all selected from the group consisting of TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, and CD3δ. In some embodiments, the first, second, and third TCR subunits are the same (e.g., CD3ε) . In some embodiments, the first, second, and third TCR subunits are different. T cells expressing chimeric TCRs are referred herein as “cTCR-T. ”

[0203] In some embodiments, the engineered receptor is a T cell antigen coupler (TAC) comprising: (a) an extracellular ligand binding domain comprising an antigen-binding fragment (e.g., scFv, sdAb) that specifically recognizes one or more epitopes of a tumor antigen; (b) an optional first linker; (c) an extracellular TCR binding domain that specifically recognizes the extracellular domain of a TCR subunit (e.g., CD3ε) ; (d) an optional second linker; (e) an optional extracellular domain derived from a first TCR co-preceptor (such as CD4, CD28, or CD8, e.g., CD8α) ; (f) a transmembrane comprising a transmembrane of a second TCR co-receptor (such as CD4, CD28, or CD8, e.g., CD8α) ; and (g) an optional intracellular signaling domain comprising intracellular signaling domain of a third TCR co-receptor (such as CD4, CD28, or CD8, e.g., CD8α) . In some embodiments, the first, second, and third TCR co-receptors are the same (e.g., all CD4) . In some embodiments, the first, second, and third TCR co-receptors are different. For example, in some embodiments, the TAC comprises: (a) an extracellular ligand binding domain comprising an antigen-binding fragment (e.g., scFv, sdAb) that specifically recognizes one or more epitopes of a tumor antigen; (b) an optional first linker; (c) an extracellular TCR binding domain that specifically recognizes the extracellular domain of a TCR subunit (e.g., CD3ε) ; (d) an optional second linker; and (e) a full length TCR co-receptor (e.g., CD4, CD8 (e.g., CD8α) , or CD28) . T cells expressing TACs are referred herein as “TAC-T. ”

[0204] In some embodiments, the engineered receptor is a T cell antigen coupler (TAC) -like chimeric receptor comprising: (a) an extracellular ligand binding domain comprising an antigen-binding fragment (e.g., scFv, sdAb) that specifically recognizes one or more epitopes of a tumor antigen; (b) an optional first linker; (c) an extracellular TCR binding domain that specifically recognizes the extracellular domain of a first TCR subunit (e.g., CD3ε) ; (d) an optional second linker; (e) an optional extracellular domain of a second TCR subunit (e.g., CD3ε) or a portion thereof; (f) a transmembrane domain comprising a transmembrane domain of a third TCR subunit (e.g., CD3ε) ; and (g) an optional intracellular signaling domain comprising an intracellular signaling domain of a fourth TCR subunit (e.g., CD3ε) ; wherein the first, second, third, and fourth TCR subunits are all selected from the group consisting of TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, and CD3δ. In some embodiments, the first, second, third, and fourth TCR subunits are the same (e.g., CD3ε) . In some embodiments, the second, third, and fourth TCR subunits are the same (e.g., CD3ε) . In some embodiments, the first, second, third, and fourth TCR subunits are different. In some embodiments, the second, third, and fourth TCR subunits are the same (e.g., CD3ε) but different from the first TCR subunit (e.g., TCRα) . In some embodiments, the TAC-like chimeric receptor comprises: (a) an extracellular ligand binding domain comprising an antigen-binding fragment (e.g., scFv, sdAb) that specifically recognizes one or more epitopes of a tumor antigen; (b) an optional first linker; (c) an extracellular TCR binding domain that specifically recognizes the extracellular domain of a first TCR subunit (e.g., CD3ε) ; (d) an optional second linker; and (e) a full length second TCR subunit (e.g., CD3ε) ; wherein the first and second TCR subunits are both selected from the group consisting of TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, and CD3δ. In some embodiments, the first and second TCR subunits are the same (e.g., both CD3ε) . In some embodiments, the first (e.g., TCRα) and second (e.g., CD3ε) TCR subunits are different. T cells expressing TAC-like chimeric receptors are referred herein as “TAC-like-T. ”

[0205] In some embodiments, the engineered receptor is a non-TCR receptor. In some embodiments, the non-TCR receptor is a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular ligand binding domain comprising one or more (such as any one of 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more) binding moieties (e.g., receptor domain or antibody-based binding domain such as sdAb, scFv) specifically recognizing an antigen; (b) a transmembrane domain; (c) an optional co-stimulatory domain; and (d) an intracellular signaling domain. In some embodiments, the extracellular ligand binding domain of the CAR comprises one or more (such as any one of 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more) binding moieties comprising an antigen-binding fragments (hereinafter referred to as “anti-antigen CAR” , or “antibody-based CAR” ) , such as sdAbs or scFvs. In some embodiments, the extracellular ligand binding domain of the CAR comprises one or more binding moieties comprising at least one domain derived from a ligand or the extracellular domain of a receptor (hereinafter also referred to as “ligand / receptor-based CAR” ) , wherein the ligand or receptor is a cell surface antigen. T cells expressing CARs are referred herein as “CAR-T. ” In some embodiments, the receptor is derived from an Fc binding domain, such as an extracellular domain of an Fc receptor (e.g., FcγR) . CARs comprising an extracellular ligand binding domain comprising one or more binding moieties comprising an Fc binding domain (e.g., FcγR) is hereinafter also referred to as “antibody-coupled T cell receptor (ACTR) ” . T cells expressing ACTRs are referred herein as “ACTR-T. ” In some embodiments, when an Fc-containing protein is administered to or co-expressed in an ACTR-T cell, the Fc-containing protein confers binding specificity of the ACTR-expressing T cell to an antigen described herein. In some embodiments, the Fc-containing protein is an Fc-containing antibody (e.g., full-length antibody) or an Fc-fusion protein, such as antigen-binding fragment-Fc fusion protein (e.g., sdAb-Fc fusion protein, or HCAb) , Fc-receptor / ligand fusion protein, Fc-fusion protein comprising a variable region of a TCR fused to an Fc region of an immunoglobulin G (IgG) ( “TCR-Fc fusion protein” ) . The ACTR / Fc-containing protein system is hereinafter referred to as “anti-antigen ACTR” .

[0206] Also provided are nucleic acids (e.g., isolated nucleic acid) encoding any of the engineered receptors described herein (such as engineered TCR, TAC, or CAR) . Further provided are vectors (e.g., viral vectors such as lentiviral vectors) comprising a nucleic acid encoding any of the engineered receptors described herein (such as engineered TCR, TAC, or CAR) . H. Peptide Linkers

[0207] Different domains of the chimeric constructs and / or engineered receptors described herein may be fused to each other via peptide linkers. The chimeric construct of the present disclosure may comprise one or more peptide linkers, such as between different components of the chimeric construct (e.g., between two or more intracellular co-stimulatory signaling domains, between intracellular co-stimulatory signaling domain and primary intracellular signaling domain, or between the antigen binding domain and the transmembrane domain) , and / or within one chimeric receptor component (e.g., antigen binding domain, such as within an scFv, or for connecting two or more antibody moieties in tandem) .

[0208] Each peptide linker in a chimeric construct may have the same or different length and / or sequence depending on the structural and / or functional features of the antibody moieties and / or the various domains. Each peptide linker may be selected and optimized independently. The length, the degree of flexibility and / or other properties of the peptide linker (s) used in the chimeric constructs may have some influence on properties, including but not limited to the affinity, specificity or avidity for one or more particular antigens or epitopes. For example, longer peptide linkers may be selected to ensure that two adjacent domains do not sterically interfere with one another. A short peptide linker may be disposed between the transmembrane domain and the primary intracellular signaling domain of a chimeric construct and / or engineered receptor (e.g., CAR) , or between the transmembrane domain and the intracellular co-stimulatory signaling domain of a chimeric construct and / or engineered receptor (e.g., CAR) . In some embodiment, the peptide linker comprises flexible residues (such as glycine and serine) so that the adjacent domains are free to move relative to each other. For example, a glycine-serine doublet can be a suitable peptide linker.

[0209] The peptide linker can be of any suitable length. The peptide linker may be at least about any of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 or more amino acids (aa) long. The peptide linker may be no more than about any of 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 or fewer aa long. In some embodiments, the length of the peptide linker is any of about 1 aa to about 10 aa, about 1 aa to about 20 aa, about 1 aa to about 30 aa, about 5 aa to about 15 aa, about 10 aa to about 25 aa, about 5 aa to about 30 aa, about 10 aa to about 30 aa, about 30 aa to about 50 aa, about 50 aa to about 100 aa, or about 1 aa to about 100 aa. In some embodiments, the peptide linker is about 10 aa to about 20 aa, such as about 15 aa.

[0210] The peptide linker may have a naturally occurring sequence, or a non-naturally occurring sequence. For example, a sequence derived from the hinge region of heavy chain only antibodies may be used as the linker. See, for example, WO1996 / 34103. In some embodiments, the peptide linker is a flexible linker. Exemplary flexible linkers include but not limited to glycine polymers (G) n, glycine-serine polymers, glycine-alanine polymers, alanine-serine polymers, threonine-serine, and other flexible linkers known in the art. Other linkers known in the art, for example, as described in WO2016014789, WO2015158671, WO2016102965, US20150299317, WO2018067992, US7741465, Colcher et al., J. Nat. Cancer Inst. 82: 1191-1197 (1990) , and Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) may also be included in the chimeric constructs and / or engineered receptors provided herein, the disclosure of each of which is incorporated herein by reference in their entirety. In some embodiments, the peptide linker is (GGGGS) n (GGGGS is set forth in SEQ ID NO: 60) , wherein n is an integer of at least 1 (e.g., 1, 2, 3, 4, or more) . In some embodiments, the peptide linker is (GxS) n, wherein x and n independently can be an integer of at least 1, such as between 3 and 12 (e.g., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12) . I. Immune Cells

[0211] The engineered immune cells described herein can be selected from the group consisting of: T cell, NK cell, NKT cell, peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , hematopoietic stem cell, pluripotent stem cell, an embryonic stem cell, or any combination thereof.

[0212] In some embodiments, the engineered immune cell is selected from the group consisting of a monocyte, a dendritic cell, a macrophage, a B cell, a killer T cell (Tc, cytotoxic T lymphocyte, or CTL) , a helper T cell (Th) , a regulatory T cell (Treg) , an αβT cell, a γδT cell, a natural killer T (NKT) cell, a natural killer (NK) cell, and a combination thereof. In some embodiments, the immune cell is an immune effector cell that can exhibit immune effector functions. For example, immune effector cells comprise T cells (cytotoxic T cells, helper T cells, tumor infiltrating T cells) , B cells, NK cells, neutrophils, macrophages, and dendritic cells. The immune effector cell may express FcγRIII and perform ADCC effector function. Examples of immune effector cells which mediate ADCC include peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) , NK cells, monocytes, cytotoxic T cells, neutrophils, and eosinophils.

[0213] In some embodiments, the engineered immune cell is made from PBMCs. In some embodiments, the engineered immune cell is a T cell. The engineered T cells may be αβT cells, or γδT cells. In some embodiments, the engineered T cells are CD4+ / CD8-, CD4- / CD8+, CD4+ / CD8+, CD4- / CD8-, or combinations thereof. In some embodiments, the engineered T cells produce IL-2, TFN, and / or TNF upon expressing the chimeric construct and binding to the target cells. In some embodiments, the CD8+ engineered T cells lyse antigen-specific target cells upon expressing the chimeric construct and binding to the target cells.

[0214] In some embodiments, the engineered immune cell is derived from a stem cell. In some embodiments, the stem cell is a hematopoietic stem cell, pluripotent stem cell, induced pluripotent stem cell, or embryonic stem cell.

[0215] In some embodiments, the engineered immune cell is an αβT or γδT cell. In other embodiments, the engineered immune cell is made from established cell lines, for example, NK-92 cells.

[0216] In some embodiments, the engineered immune cell is an αβT or γδT cell present in a mixture of αβT and γδT cells, i.e., panT cells. The present application thus provides a panT cell population comprising any of the engineered immune cells described herein.

[0217] Immune cells for making the engineered immune cells described herein can be from any sources, such as derived from related or unrelated humans, non-human animals, cell lines or cultures. In some embodiments, the engineered immune cell is allogeneic (e.g., derived from a healthy individual) . In some embodiments, the engineered immune cell is autologous.

[0218] In some embodiments, the engineered immune cell is selected from the group consisting of T cell, NK cell, B cell, monocyte, dendritic cell, and any combination thereof. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises a heterologous nucleic acid encoding a cytokine. J. Pharmaceutical Compositions

[0219] Also provided are pharmaceutical compositions comprising any of the engineered immune cells comprising the chimeric constructs, NKG2D receptor, and / or engineered receptors described herein, and optionally a pharmaceutically acceptable excipient. Any excipient suitable for the storage and administration of engineered immune cells and / or protein constructs can be used herein. The excipient may not affect the viability, bioactivity, and / or secretion of the encoded chimeric constructs or engineered receptors of the engineered immune cells.

[0220] “Excipient” means a pharmaceutically acceptable material, composition, or vehicle, such as a liquid or solid filler, diluent, solvent, or encapsulating material. Excipients include, for example, encapsulating materials or additives such as absorption accelerators, antioxidants, binders, buffers, carriers, coating agents, coloring agents, diluents, disintegrating agents, emulsifiers, extenders, fillers, flavoring agents, humectants, lubricants, perfumes, preservatives, propellants, releasing agents, sterilizing agents, sweeteners, solubilizers, wetting agents and mixtures thereof. The term “excipient” can also refer to a diluent, adjuvant (e.g., Freunds’ adjuvant (complete or incomplete) or vehicle.

[0221] Excipients may be pharmaceutically acceptable excipients. Examples of pharmaceutically acceptable excipients include buffers, such as phosphate, citrate, and other organic acids; antioxidants, including ascorbic acid; low molecular weight (e.g., fewer than about 10 amino acid residues) polypeptide; proteins, such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers, such as polyvinylpyrrolidone; amino acids, such as glycine, glutamine, asparagine, arginine, or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates, including glucose, mannose, or dextrins; chelating agents, such as EDTA; sugar alcohols, such as mannitol or sorbitol; salt-forming counterions, such as sodium; and / or nonionic surfactants, such as TWEENTM, polyethylene glycol (PEG) , and PLURONICSTM. Other examples of pharmaceutically acceptable excipients are described in Remington and Gennaro, Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1990) .

[0222] In one embodiment, each component is “pharmaceutically acceptable” in the sense of being compatible with the other ingredients of a pharmaceutical formulation, and suitable for use in contact with the tissue or organ of humans and animals without excessive toxicity, irritation, allergic response, immunogenicity, or other problems or complications, commensurate with a reasonable benefit / risk ratio. See, e.g., Lippincott Williams &Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed.; Rowe et al., Eds.; The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009; Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd ed.; Ash and Ash Eds.; Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2nd ed.; Gibson Ed.; CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2009. In some embodiments, pharmaceutically acceptable excipients are nontoxic to the cell or mammal being exposed thereto at the dosages and concentrations employed. In some embodiments, a pharmaceutically acceptable excipient is an aqueous pH buffered solution.

[0223] Excipients may be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable, or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, and the like. Water is an exemplary excipient when a composition (e.g., a pharmaceutical composition) is administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid excipients, particularly for injectable solutions. An excipient can also include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol, and the like. The composition, if desired, can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents. Compositions can take the form of solutions, suspensions, emulsion, powders (e.g., freeze-dried) , sustained-release formulations, and the like. In some embodiments, the composition can be reconstituted.

[0224] Compositions, including pharmaceutical compositions, may contain a binding molecule (e.g., an antibody) , for example, in isolated or purified form, together with a suitable amount of excipients.

[0225] In some embodiments, there is provided a pharmaceutical composition comprising: i) an engineered immune cell expressing a chimeric construct and / or engineered receptor, and ii) optionally a pharmaceutically acceptable excipient.

[0226] The choice of excipient may be determined in part by the particular cell, binding molecule, and / or antibody, and / or by the method of administration. Accordingly, there are a variety of suitable formulations.

[0227] Suitable pharmaceutically acceptable excipient for engineered immune cells may comprise buffers such as neutral buffered saline, phosphate buffered saline and the like; carbohydrates such as glucose, mannose, sucrose or dextrans, mannitol; proteins; polypeptides or amino acids such as glycine; antioxidants; chelating agents such as EDTA or glutathione; adjuvants (e.g., aluminum hydroxide) ; and preservatives. The pharmaceutically acceptable excipient may contain autologous serum, such as human serum. In some embodiments, the pharmaceutically acceptable excipient is non-toxic, biocompatible, non-immunogenic, biodegradable, and can avoid recognition by the host’s defense mechanism. The excipient may also contain adjuvants such as preserving stabilizing, wetting, emulsifying agents and the like. The pharmaceutically acceptable excipient may enhance the stability of the engineered immune cells. The final form may be sterile and may also be able to pass readily through an injection device such as a hollow needle. The proper viscosity may be achieved and maintained by the proper choice of excipients.

[0228] In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated to have a pH in the range of about 4.5 to about 9.0, including for example pH ranges of about any one of 5.0 to about 8.0, about 6.5 to about 7.5, or about 6.5 to about 7.0. The pharmaceutical composition can also be made to be isotonic with blood by the addition of a suitable tonicity modifier, such as glycerol.

[0229] Typically, acceptable carriers, excipients, or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include buffers, antioxidants including ascorbic acid, methionine, Vitamin E, sodium metabisulfite; preservatives, isotonicifiers, stabilizers, metal complexes (e.g., Zn-protein complexes) ; chelating agents such as EDTA and / or non-ionic surfactants.

[0230] Buffers may be used to control the pH in a range which optimizes the therapeutic effectiveness, especially if stability is pH dependent. Suitable buffering agents for use with the present disclosure include both organic and inorganic acids and salts thereof. For example, citrate, phosphate, succinate, tartrate, fumarate, gluconate, oxalate, lactate, acetate. Additionally, buffers may comprise histidine and trimethylamine salts such as Tris.

[0231] Preservatives may be added to retard microbial growth. Suitable preservatives for use with the present disclosure include octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium halides (e.g., chloride, bromide, iodide) , benzethonium chloride; thimerosal, phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexanol, 3-pentanol, and m-cresol.

[0232] Tonicity agents, sometimes known as “stabilizers” can be present to adjust or maintain the tonicity of liquid in a composition. When used with large, charged biomolecules such as proteins and antibodies, they are often termed “stabilizers” because they can interact with the charged groups of the amino acid side chains, thereby lessening the potential for inter and intra-molecular interactions. Exemplary tonicity agents include polyhydric sugar alcohols, trihydric or higher sugar alcohols, such as glycerin, erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol and mannitol.

[0233] Additional exemplary excipients include: (1) bulking agents, (2) solubility enhancers, (3) stabilizers and (4) agents preventing denaturation or adherence to the container wall. Such excipients include: polyhydric sugar alcohols (enumerated above) ; amino acids such as alanine, glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, lysine, ornithine, leucine, 2-phenylalanine, glutamic acid, threonine, etc.; organic sugars or sugar alcohols such as sucrose, lactose, lactitol, trehalose, stachyose, mannose, sorbose, xylose, ribose, ribitol, myoinisitose, myoinisitol, galactose, galactitol, glycerol, cyclitols (e.g., inositol) , polyethylene glycol; sulfur containing reducing agents, such as urea, glutathione, thioctic acid, sodium thioglycolate, thioglycerol, α-monothioglycerol and sodium thio sulfate; low molecular weight proteins such as human serum albumin, bovine serum albumin, gelatin or other immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; monosaccharides (e.g., xylose, mannose, fructose, glucose; disaccharides (e.g., lactose, maltose, sucrose) ; trisaccharides such as raffinose; and polysaccharides such as dextrin or dextran.

[0234] Non-ionic surfactants or detergents (also known as “wetting agents” ) may be present to help solubilize the therapeutic agent as well as to protect the therapeutic protein against agitation-induced aggregation, which also permits the formulation to be exposed to shear surface stress without causing denaturation of the active therapeutic protein. Suitable non-ionic surfactants include, e.g., polysorbates (20, 40, 60, 65, 80, etc. ) , polyoxamers (184, 188, etc. ) ,  polyols,  polyoxyethylene sorbitan monoethers ( etc. ) , lauromacrogol 400, polyoxyl 40 stearate, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 10, 50 and 60, glycerol monostearate, sucrose fatty acid ester, methyl celluose and carboxymethyl cellulose. Anionic detergents that can be used include sodium lauryl sulfate, dioctyle sodium sulfosuccinate and dioctyl sodium sulfonate. Cationic detergents include benzalkonium chloride or benzethonium chloride.

[0235] In order for the pharmaceutical compositions to be used for in vivo administration, they are sterile. The pharmaceutical composition may be rendered sterile by filtration through sterile filtration membranes. The pharmaceutical compositions herein generally can be placed into a container having a sterile access port, for example, an intravenous solution bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle.

[0236] A pharmaceutical composition can be provided as a controlled release or sustained release system. In one embodiment, a pump may be used to achieve controlled or sustained release (see, e.g., Sefton, Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201-40 (1987) ; Buchwald et al., Surgery 88: 507-16 (1980) ; and Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321: 569-74 (1989) ) . In another embodiment, polymeric materials can be used to achieve controlled or sustained release of a prophylactic or therapeutic agent (e.g., a fusion protein as described herein) or a composition provided herein (see, e.g., Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., 1974) ; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., 1984) ; Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61-126 (1983) ; Levy et al., Science 228: 190-92 (1985) ; During et al., Ann. Neurol. 25: 351-56 (1989) ; Howard et al., J. Neurosurg. 71: 105-12 (1989) ; U.S. Pat. Nos. 5,679,377; 5,916,597; 5,912,015; 5,989,463; and 5,128,326; PCT Publication Nos. WO 99 / 15154 and WO 99 / 20253) . Examples of polymers used in sustained release formulations include, but are not limited to, poly (2-hydroxy ethyl methacrylate) , poly (methyl methacrylate) , poly (acrylic acid) , poly (ethylene-co-vinyl acetate) , poly (methacrylic acid) , polyglycolides (PLG) , polyanhydrides, poly (N-vinyl pyrrolidone) , poly (vinyl alcohol) , polyacrylamide, poly (ethylene glycol) , polylactides (PLA) , poly (lactide-co-glycolides) (PLGA) , and polyorthoesters. In one embodiment, the polymer used in a sustained release formulation is inert, free of leachable impurities, stable on storage, sterile, and biodegradable. A controlled or sustained release system can be placed in proximity of a particular target tissue, for example, the nasal passages or lungs, thus requiring only a fraction of the systemic dose (see, e.g., Goodson, Medical Applications of Controlled Release Vol. 2, 115-38 (1984) ) . Controlled release systems are discussed, for example, by Langer, Science 249: 1527-33 (1990) . Any technique known to one of skill in the art can be used to produce sustained release formulations comprising one or more agents as described herein (see, e.g., U.S. Pat. No. 4,526,938, PCT publication Nos. WO 91 / 05548 and WO 96 / 20698, Ning et al., Radiotherapy &Oncology 39: 179-89 (1996) ; Song et al., PDA J. of Pharma. Sci. &Tech. 50: 372-97 (1995) ; Cleek et al., Pro. Int’ l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 853-54 (1997) ; and Lam et al., Proc. Int’ l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24: 759-60 (1997) ) .

[0237] The active ingredients may also be entrapped in microcapsules prepared, for example, by coascervation techniques or by interfacial polymerization, for example, hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly- (methylmethacylate) microcapsules, respectively, in colloidal drug delivery systems (for example, liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or in macroemulsions. Such techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition.

[0238] Various compositions and delivery systems are known and can be used with the therapeutic agents provided herein, including, but not limited to, encapsulation in liposomes, microparticles, microcapsules, recombinant cells capable of expressing the chimeric constructs and / or engineered receptors, construction of a nucleic acid as part of a retroviral or other vector, etc.

[0239] In some embodiments, the pharmaceutical composition is suitable for administration to a human. In some embodiments, the pharmaceutical composition is suitable for administration to a human by parenteral administration. Formulations suitable for parenteral administration include aqueous and non-aqueous, isotonic sterile injection solutions, which can contain antioxidants, buffers, bacteriostats, and solutes that render the formulation compatible with the blood of the intended recipient, and aqueous and non-aqueous sterile suspensions that can include suspending agents, solubilizers, thickening agents, stabilizing agents, and preservatives. The formulations can be presented in unit-dose or multi-dose sealed containers, such as ampules and vials, and can be stored in a condition requiring only the addition of the sterile liquid excipient methods of treatment, methods of administration, and dosage regimens described herein (i.e., water) for injection, immediately prior to use. In some embodiments, the pharmaceutical composition is contained in a single-use vial, such as a single-use sealed vial. In some embodiments, the pharmaceutical composition is contained in a multi-use vial. In some embodiments, the pharmaceutical composition is contained in bulk in a container. In some embodiments, the pharmaceutical composition is cryopreserved.

[0240] In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated for intravenous or subcutaneous administration. In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated for local administration to a tumor site, such as for intratumoral injection.

[0241] In some embodiments, the pharmaceutical composition must meet certain standards for administration to an individual. For example, the United States Food and Drug Administration has issued regulatory guidelines setting standards for cell-based immunotherapeutic products, including 21 CFR 610 and 21 CFR 610.13. Methods are known in the art to assess the appearance, identity, purity, safety, and / or potency of pharmaceutical compositions. In some embodiments, the pharmaceutical composition is substantially free of extraneous protein capable of producing allergenic effects, such as proteins of an animal source used in cell culture other than the engineered immune cells. In some embodiments, “substantially free” is less than about any of 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 1 ppm or less of total volume or weight of the pharmaceutical composition. In some embodiments, the pharmaceutical composition is prepared in a GMP-level workshop. In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises less than about 5 EU / kg body weight / hr of endotoxin for parenteral administration. In some embodiments, at least about 70%of the engineered immune cells in the pharmaceutical composition are alive for intravenous administration. In some embodiments, the pharmaceutical composition has a “no growth” result when assessed using a 14-day direct inoculation test method as described in the United States Pharmacopoeia (USP) . In some embodiments, prior to administration of the pharmaceutical composition, a sample including both the engineered immune cells and the pharmaceutically acceptable excipient should be taken for sterility testing approximately about 48-72 hours prior to the final harvest (or coincident with the last re-feeding of the culture) . In some embodiments, the pharmaceutical composition is free of mycoplasma contamination. In some embodiments, the pharmaceutical composition is free of detectable microbial agents. In some embodiments, the pharmaceutical composition is free of communicable disease agents, such as HIV type I, HIV type II, HBV, HCV, Human T-lymphotropic virus, type I; and Human T-lymphotropic virus, type II. In some embodiments, the pharmaceutical composition is free of viral (e.g., lentivirus) components during manufacture. III. Method of Making

[0242] In one aspect, there is provided a method of making the engineered immune cell disclosed herein, comprising introducing into a population of immune cell a nucleic acid encoding the chimeric construct, NKG2D receptor, and / or engineered receptor. For instance, the introducing may comprise introducing into a population of immune cell (e.g., a precursor T cell such as an allogeneic T cell) a vector (e.g., viral vector such as lentiviral vector) comprising any one of the nucleic acids encoding the chimeric constructs, NKG2D receptors, and / or engineered receptors described herein.

[0243] Any of the isolated nucleic acids or vectors encoding the chimeric constructs, NKG2D receptors, and / or the engineered receptors described herein can be used for making the engineered immune cell described herein. In some embodiments, when a population of precursor cells are used for the production of engineered immune cell described herein, the methods also include one or more isolation and / or enrichment steps, for example, isolating and / or enriching αβT cells and / or γδT cells. Such isolation and / or enrichment steps can be performed using any known techniques in the art, such as magnetic-activated cell sorting (MACS) . Also see Examples.

[0244] Methods of introducing vectors (e.g., viral vectors) or isolated nucleic acids into a mammalian cell are known in the art. The vectors described herein can be transferred into an immune cell (e.g., a T cell) by physical, chemical, or biological methods.

[0245] Physical methods for introducing a vector (e.g., viral vector) into an immune cell include calcium phosphate precipitation, lipofection, particle bombardment, microinjection, electroporation, and the like. Methods for producing cells comprising vectors and / or exogenous nucleic acids are well-known in the art. See, for example, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. In some embodiments, the vector (e.g., viral vector) is introduced into the cell by electroporation.

[0246] Biological methods for introducing a vector (e.g., viral vector) into an immune cell include the use of DNA and RNA vectors. Viral vectors have become the most widely used method for inserting genes into mammalian, e.g., human cells.

[0247] Chemical means for introducing a vector (e.g., viral vector) into an immune cell include colloidal dispersion systems, such as macromolecule complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and lipid-based systems including oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, and liposomes. An exemplary colloidal system for use as a delivery vehicle in vitro is a liposome (e.g., an artificial membrane vesicle) .

[0248] RNA molecules encoding the chimeric constructs, NKG2D receptors, and / or engineered receptors described herein may be prepared by a conventional method (e.g., in vitro transcription) and then introduced into the immune cells via known methods such as mRNA electroporation. See, e.g., Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17: 1027-1035 (2006) .

[0249] In some embodiments, the transduced / transfected immune cell is propagated ex vivo after introduction of the vector or isolated nucleic acid. In some embodiments, the transduced / transfected immune cell is cultured to propagate for at least about any of 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 10 days, 12 days, or 14 days. In some embodiments, the transduced / transfected immune cell is further evaluated or screened to select desired engineered mammalian cell, e.g., engineered immune cells described herein.

[0250] Reporter genes may be used for identifying potentially transfected / transduced cells and for evaluating the functionality of regulatory sequences. In general, a reporter gene is a gene that is not present in or expressed by the recipient organism or tissue and that encodes a polypeptide whose expression is manifested by some easily detectable property, e.g., enzymatic activity. Expression of the reporter gene is assayed at a suitable time after the DNA / RNA has been introduced into the recipient cells. Suitable reporter genes may include genes encoding luciferase, beta-galactosidase, chloramphenicol acetyl transferase, secreted alkaline phosphatase, or the green fluorescent protein (GFP) gene (e.g., Ui-Tei et al. FEBS Letters 479: 79-82 (2000) ) . Suitable expression systems are well known and may be prepared using known techniques or obtained commercially.

[0251] Other methods to confirm the presence of the nucleic acid encoding the chimeric constructs, NKG2D receptors, and / or engineered receptors described herein in a engineered immune cell, include, for example, molecular biological assays well known to those of skill in the art, such as Southern and Northern blotting, RT-PCR and PCR; biochemical assays, such as detecting the presence or absence of a particular peptide, e.g., by immunological methods (such as ELISAs and Western blots) , Fluorescence-activated cell sorting (FACS) , or Magnetic-activated cell sorting (MACS) (also see Example section) . A. Source of immune cells, cell preparation and culture

[0252] Any immune cells can be used herein to make the engineered immune cells. In some embodiments, the engineered immune cell is a T cell. In some embodiments, the engineered immune cell is an αβT or a γδT T cell. Immune cells for use in expansion and genetic modification can be obtained from a number of sources, including peripheral blood mononuclear cells, bone marrow, lymph node tissue, cord blood, thymus tissue, tissue from a site of infection, ascites, pleural effusion, spleen tissue, and tumors. In some embodiments, any number of T cell lines available in the art, may be used. For example, T cells can be obtained from a unit of blood collected from a subject using any number of techniques known to the skilled artisan, such as FicollTM separation. In some embodiments, cells from the circulating blood of an individual are obtained by apheresis. The apheresis product typically contains lymphocytes, including T cells, monocytes, granulocytes, B cells, other nucleated white blood cells, red blood cells, and platelets. The cells collected by apheresis may be washed to remove the plasma fraction and to place the cells in an appropriate buffer or media for subsequent processing steps. In some embodiments, the cells are washed with phosphate buffered saline (PBS) . In some embodiments, the wash solution lacks calcium and may lack magnesium or may lack many if not all divalent cations. Initial activation steps in the absence of calcium may lead to magnified activation. As those of ordinary skill in the art would readily appreciate a washing step may be accomplished by methods known to those in the art, such as by using a semi-automated “flow-through” centrifuge (for example, the Cobe 2991 cell processor, the Baxter CytoMate, or the Haemonetics Cell Saver 5) according to the manufacturer's instructions. After washing, the cells may be resuspended in a variety of biocompatible buffers, such as, for example, Ca2+-free, Mg2+-free PBS, PlasmaLyte A, or other saline solution with or without buffer. Alternatively, the undesirable components of the apheresis sample may be removed and the cells directly resuspended in culture media.

[0253] T cells can be isolated from peripheral blood lymphocytes by lysing the red blood cells and depleting the monocytes, for example, by centrifugation through a PERCOLLTM gradient or by counterflow centrifugal elutriation. A specific subpopulation of T cells, such as CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, and CD45RO+ T cells, can be further isolated by positive or negative selection techniques. For example, in some embodiments, T cells are isolated by incubation with anti-CD3 / anti-CD28 (i.e., 3×28) -conjugated beads, such as M-450 CD3 / CD28 T, for a time period sufficient for positive selection of the desired T cells. In some embodiments, the time period is about 30 minutes. In a further embodiment, the time period ranges from about 30 minutes to about 36 hours or longer and all integer values there between, such as about 10 to about 24 hours. In a further embodiment, the time period is at least about 1, 2, 3, 4, 5, or 6 hours. For isolation of T cells from patients with leukemia, use of longer incubation times, such as 24 hours, can increase cell yield. Longer incubation times may be used to isolate T cells in any situation where there are few T cells as compared to other cell types, such in isolating T cells from tumor tissue or from immune-compromised individuals. Further, use of longer incubation times can increase the efficiency of capture of CD8+ T cells. For example, by simply shortening or lengthening the time T cells are allowed to bind to the CD3 / CD28 beads and / or by increasing or decreasing the ratio of beads to T cells, subpopulations of T cells can be preferentially selected for or against at culture initiation or at other time points during the process. Additionally, by increasing or decreasing the ratio of anti-CD3 and / or anti-CD28 antibodies on the beads or other surface, subpopulations of T cells can be preferentially selected for or against at culture initiation or at other desired time points. The skilled artisan would recognize that multiple rounds of selection can also be used. It may be desirable to perform the selection procedure and use the “unselected” cells in the activation and expansion process. “Unselected” cells can also be subjected to further rounds of selection.

[0254] Enrichment of a T cell population by negative selection can be accomplished with a combination of antibodies directed to surface markers unique to the negatively selected cells. One method is cell sorting and / or selection via negative magnetic immunoadherence or flow cytometry that uses a cocktail of monoclonal antibodies directed to cell surface markers present on the cells negatively selected. For example, to enrich for CD4+ cells by negative selection, a monoclonal antibody cocktail typically includes antibodies to CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, and CD8. It may be desirable to enrich for or positively select for regulatory T cells which typically express CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, and FoxP3+. Alternatively, in certain embodiments, T regulatory cells are depleted by anti-C25 conjugated beads or other similar method of selection.

[0255] For isolation of a desired population of cells by positive or negative selection, the concentration of cells and surface (e.g., particles such as beads) can be varied. It may be desirable to significantly decrease the volume in which beads and cells are mixed together (i.e., increase the concentration of cells) , to ensure maximum contact of cells and beads. For example, in one embodiment, a concentration of 1 billion cells / ml or 2 billion cells / ml is used. In a further embodiment, greater than 100 million cells / ml is used. In a further embodiment, a concentration of cells of 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, or 150 million cells / ml is used. Using high concentrations may result in increased cell yield, cell activation, and cell expansion. Further, use of high cell concentrations may allow more efficient capture of cells that may weakly express target antigens of interest, such as CD28-negative T cells, or from samples where there are many tumor cells present (i.e., leukemic blood, tumor tissue, etc. ) . Such populations of cells may have therapeutic value and would be desirable to obtain. In some embodiments, using high concentration of cells allows more efficient selection of CD8+ T cells that normally have weaker CD28 expression.

[0256] In some embodiments, it may be desirable to use lower concentrations of cells. By significantly diluting the mixture of T cells and surface (e.g., particles such as beads) , interactions between the particles and cells is minimized. This selects for cells that express high amounts of desired antigens to be bound to the particles. For example, CD4+ T cells express higher levels of CD28 and are more efficiently captured than CD8+ T cells in dilute concentrations. In some embodiments, the concentration of cells used can be from about 1×105 / mL to about 5×106 / mL, such as from about 1×105 / mL to about 1×106 / mL.

[0257] In some embodiments, the population of immune cells are enriched for CD4+ and / or CD8+cells. In some embodiments, the population of immune cells are enriched for both CD4+ and CD8+cells, such as by using CD4 Nanobeads and CD8 Nanobeads. In some embodiments, the population of immune cells are activated before introducing the nucleic acid encoding the chimeric construct and / or the engineered receptor into the immune cells, such as by using anti-CD3 / CD28 particles. The enrichment of CD4+ and / or CD8+ cells may be performed before introducing the nucleic acid encoding the chimeric construct and / or the engineered receptor into the population of immune cells. The enrichment of CD4+ and / or CD8+ cells may be performed after introducing the nucleic acid encoding the chimeric construct and / or the engineered receptor into the population of immune cells (e.g., a mixture of PBMC) .

[0258] In some embodiments, the cells may be incubated on a rotator for varying lengths of time at varying speeds at either 2-10℃, or at room temperature.

[0259] T cells for stimulation can also be frozen after a washing step. Without being bound by theory, the freeze and subsequent thaw step may provide a more uniform product by removing granulocytes and to some extent monocytes in the cell population. After the washing step that removes plasma and platelets, the cells may be suspended in a freezing solution. While many freezing solutions and parameters are known in the art and will be useful in this context, one method involves using PBS containing 20%DMSO and 8%human serum albumin, or culture media containing 10%dextran 40 and 5%dextrose, 20%human serum albumin and 7.5%DMSO, or 31.25%plasmalyte-A, 31.25%dextrose 5%, 0.45%NaCl, 10%dextran 40 and 5%dextrose, 20%human serum albumin, and 7.5%DMSO or other suitable cell freezing media containing for example, Hespan and PlasmaLyte A. The cells then are frozen to -80℃ at a rate of 1° per minute and stored in the vapor phase of a liquid nitrogen storage tank. Other methods of controlled freezing may be used as well as uncontrolled freezing immediately at -20℃ or in liquid nitrogen.

[0260] In some embodiments, cryopreserved cells are thawed and washed as described herein and allowed to rest for one hour at room temperature prior to activation.

[0261] Also contemplated in the present disclosure is the collection of blood samples or apheresis product from a subject at a time period prior to when the expanded cells as described herein might be needed. As such, the source of the cells to be expanded can be collected at any time point necessary, and desired cells, such as T cells, isolated and frozen for later use in T cell therapy for any number of diseases or conditions that would benefit from T cell therapy, such as those described herein. In one embodiment, a blood sample or an apheresis is taken from a generally healthy subject. In certain embodiments, a blood sample or an apheresis is taken from a generally healthy subject who is at risk of developing a disease, but who has not yet developed a disease, and the cells of interest are isolated and frozen for later use. In certain embodiments, the T cells may be expanded, frozen, and used at a later time. In certain embodiments, samples are collected from a patient shortly after diagnosis of a particular disease as described herein but prior to any treatments. In a further embodiment, the cells are isolated from a blood sample or an apheresis from a subject prior to any number of relevant treatment modalities, including but not limited to treatment with agents such as natalizumab, efalizumab, antiviral agents, chemotherapy, radiation, immunosuppressive agents, such as cyclosporin, azathioprine, methotrexate, mycophenolate, and FK506, antibodies, or other immunoablative agents such as CAMPATH, anti-CD3 antibodies, cytoxan, fludarabine, cyclosporin, FK506, rapamycin, mycophenolic acid, steroids, FR901228, and irradiation. These drugs inhibit either the calcium dependent phosphatase calcineurin (cyclosporine and FK506) or inhibit the p70S6 kinase that is important for growth factor induced signaling (rapamycin) (Liu et al., Cell 66: 807-815 (1991) ; Henderson et al., Immun 73: 316-321 (1991) ; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5: 763-773 (1993) ) . In a further embodiment, the cells are isolated for a patient and frozen for later use in conjunction with (e.g., before, simultaneously or following) bone marrow or stem cell transplantation, T cell ablative therapy using either chemotherapy agents such as, fludarabine, external-beam radiation therapy (XRT) , cyclophosphamide, or antibodies such as OKT3 or CAMPATH.

[0262] In some embodiments, T cells are obtained from a patient directly following treatment. In this regard, it has been observed that following certain cancer treatments, in particular treatments with drugs that damage the immune system, shortly after treatment during the period when patients would normally be recovering from the treatment, the quality of T cells obtained may be optimal or improved for their ability to expand ex vivo. Likewise, following ex vivo manipulation using the methods described herein, these cells may be in a preferred state for enhanced engraftment and in vivo expansion. Thus, it is contemplated within the context of the present disclosure to collect blood cells, including T cells, dendritic cells, or other cells of the hematopoietic lineage, during this recovery phase. Further, in certain embodiments, mobilization (for example, mobilization with GM-CSF) and conditioning regimens can be used to create a condition in a subject wherein repopulation, recirculation, regeneration, and / or expansion of particular cell types is favored, especially during a defined window of time following therapy. Illustrative cell types include T cells, B cells, dendritic cells, and other cells of the immune system. B. Activation and expansion of T cells

[0263] In some embodiments, prior to or after genetic modification of the immune cells expressing the chimeric constructs and / or engineered receptors described herein, the αβT or γδT cells can be activated and expanded generally using methods as described, for example, in U.S. Pat. Nos. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; and U.S. Patent Application Publication No. 20060121005.

[0264] Generally, T cells can be expanded by contact with a surface having attached thereto an agent that stimulates a CD3 / TCR complex associated signal and a ligand that stimulates a co-stimulatory molecule on the surface of the T cells. In particular, T cell populations may be stimulated as described herein, such as by contact with an anti-CD3 antibody, or antigen binding fragment thereof, or an anti-CD2 antibody immobilized on a surface, or by contact with a protein kinase C activator (e.g., bryostatin) in conjunction with a calcium ionophore. For co-stimulation of an accessory molecule on the surface of the T cells, a ligand that binds the accessory molecule is used. For example, a population of T cells can be contacted with an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody, under conditions appropriate for stimulating proliferation of the T cells. To stimulate proliferation of either CD4+ T cells or CD8+ T cells, an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody can be used. Examples of an anti-CD3 antibody include UCHT1, OKT3, HIT3a (BioLegend, San Diego, US) can be used as can other methods commonly known in the art (Graves J, et al., J. Immunol. 146: 2102 (1991) ; Li B, et al., Immunology 116: 487 (2005) ; Rivollier A, et al., Blood 104: 4029 (2004) ) . Examples of an anti-CD28 antibody include 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France) can be used as can other methods commonly known in the art (Berg et al., Transplant Proc. 30 (8) : 3975-3977 (1998) ; Haanen et al., J. Exp. Med. 190 (9) : 13191328 (1999) ; Garland et al., J. Immunol Meth. 227 (1-2) : 53-63 (1999) ) .

[0265] The primary stimulatory signal and the co-stimulatory signal for the T cell may be provided by different protocols. For example, the agents providing each signal may be in solution or coupled to a surface. When coupled to a surface, the agents may be coupled to the same surface (i.e., in “cis” formation) or to separate surfaces (i.e., in “trans” formation) . Alternatively, one agent may be coupled to a surface and the other agent in solution. In one embodiment, the agent providing the co-stimulatory signal is bound to a cell surface and the agent providing the primary activation signal is in solution or coupled to a surface. Both agents can be in solution. The agents may be in soluble form, and then cross-linked to a surface, such as a cell expressing Fc receptors or an antibody or other binding agent which will bind to the agents. In this regard, see for example, U.S. Patent Application Publication Nos. 20040101519 and 20060034810 for artificial antigen presenting cells (aAPCs) that are contemplated for use in activating and expanding T cells in certain embodiments in the present disclosure.

[0266] In some embodiments, the T cells, are combined with agent-coated beads, the beads and the cells are subsequently separated, and then the cells are cultured. In an alternative embodiment, prior to culture, the agent-coated beads and cells are not separated but are cultured together. In a further embodiment, the beads and cells are first concentrated by application of a force, such as a magnetic force, resulting in increased ligation of cell surface markers, thereby inducing cell stimulation.

[0267] By way of example, cell surface proteins may be ligated by allowing paramagnetic beads to which anti-CD3 and anti-CD28 are attached (3×28 beads) to contact the T cells. In one embodiment, the cells (for example, 104 to 108 T cells) and beads (for example, anti-CD3 / CD28 MACSiBead particlesa at a recommended titer of 1: 100) are combined in a buffer, optionally PBS (without divalent cations such as, calcium and magnesium) . Those of ordinary skill in the art can readily appreciate any cell concentration may be used. For example, the target cell may be very rare in the sample and comprise only 0.01%of the sample or the entire sample (i.e., 100%) may comprise the target cell of interest. Accordingly, any cell number is within the context of the present disclosure. The mixture may be cultured for about 48 hours.

[0268] The mixture of T cells and activating agent (e.g., beads) may be cultured for several hours (about 3 hours) to about 21 days or any hourly integer value in between, such as about 8 days or about 14 days. In another embodiment, the beads and T cells are cultured together for 2-3 days. Several cycles of stimulation may also be desired such that culture time of T cells can be 60 days or more. Conditions appropriate for T cell culture include an appropriate media (e.g., Minimal Essential Media or RPMI Media 1640 or, X-vivo 15, (Lonza) ) that may contain factors necessary for proliferation and viability, including serum (e.g., fetal bovine or human serum) , interleukin-2 (IL-2) , insulin, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, and TNF-α or any other additives for the growth of cells known to the skilled artisan. Other additives for the growth of cells include, but are not limited to, surfactant, plasmanate, and reducing agents such as N-acetylcysteine and 2-mercaptoethanol. Media can include RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, and X-Vivo 20, optimizer, with added amino acids, sodium pyruvate, and vitamins, either serum-free or supplemented with an appropriate amount of serum (or plasma) or a defined set of hormones, and / or an amount of cytokine (s) sufficient for the growth and expansion of T cells. Antibiotics, e.g., penicillin and streptomycin, are included only in experimental cultures, not in cultures of cells that are to be infused into a subject. The target cells are maintained under conditions necessary to support growth, for example, an appropriate temperature (e.g., 37oC) and atmosphere (e.g., air plus 5%CO2) . T cells that have been exposed to varied stimulation times may exhibit different characteristics. For example, typical blood or apheresed peripheral blood mononuclear cell products have a helper T cell population (TH, CD4+) that is greater than the cytotoxic or suppressor T cell population (TC, CD8) . Ex vivo expansion of T cells by stimulating CD3 and CD28 receptors produces a population of T cells that prior to about days 8-9 consists predominately of TH cells, while after about days 8-9, the population of T cells comprises an increasingly greater population of TC cells. Accordingly, depending on the purpose of treatment, infusing a subject with a T cell population comprising predominately of TH cells may be advantageous. Similarly, if an antigen-specific subset of TC cells has been isolated it may be beneficial to expand this subset to a greater degree.

[0269] In addition to CD4 and CD8 markers, other phenotypic markers vary significantly, but in large part, reproducibly during the course of the cell expansion process. Thus, such reproducibility enables the ability to tailor an activated T cell product for specific purposes.

[0270] In some embodiments, the methods include assessing expression of one or more markers on the surface of the modified cells or cells to be engineered. In one embodiment, the methods include assessing surface expression of TCR, MHC I, or CD3 (e.g., CD3ε) , for example, by affinity-based detection methods such as by flow cytometry. In some aspects, where the method reveals surface expression of the antigen or other marker, the gene encoding the antigen or other marker is disrupted or expression otherwise repressed for example, using the methods described herein. C. Isolation and enrichment of modified immune cells

[0271] In some embodiments, the method described herein further comprise isolating or enriching engineered immune cells comprising the nucleic acid encoding the chimeric constructs and / or engineered receptors described herein.

[0272] In some embodiments, the isolation methods include the separation of different cell types based on the absence or presence in the cell of one or more specific molecules, such as surface markers, e.g., surface proteins, intracellular markers, or nucleic acid.

[0273] In some embodiments, any known method for separation based on such markers may be used. In some embodiments, the separation is affinity-or immunoaffinity-based separation. For example, the isolation in some aspects includes separation of cells and cell populations based on the cells'expression or expression level of one or more markers, typically cell surface markers, for example, by incubation with an antibody or binding partner that specifically binds to such markers, followed generally by washing steps and separation of cells having bound the antibody or binding partner, from those cells having not bound to the antibody or binding partner.

[0274] Such separation steps can be based on positive selection, in which the cells having bound the reagents are retained for further use, and / or negative selection, in which the cells having not bound to the antibody or binding partner are retained. In some examples, both fractions are retained for further use. In some aspects, negative selection can be particularly useful where no antibody is available that specifically identifies a cell type in a heterogeneous population, such that separation is best carried out based on markers expressed by cells other than the desired population.

[0275] The separation need not result in 100%enrichment or removal of a particular cell population or cells expressing a particular marker. For example, positive selection of or enrichment for cells of a particular type, such as those expressing a marker, refers to increasing the number or percentage of such cells, but need not result in a complete absence of cells not expressing the marker. Likewise, negative selection, removal, or depletion of cells of a particular type, such as those expressing a marker, refers to decreasing the number or percentage of such cells, but need not result in a complete removal of all such cells.

[0276] In some examples, multiple rounds of separation steps are carried out, where the positively or negatively selected fraction from one step is subjected to another separation step, such as a subsequent positive or negative selection. In some examples, a single separation step can deplete cells expressing multiple markers simultaneously, such as by incubating cells with a plurality of antibodies or binding partners, each specific for a marker targeted for negative selection. Likewise, multiple cell types can simultaneously be positively selected by incubating cells with a plurality of antibodies or binding partners expressed on the various cell types.

[0277] For example, in some aspects, specific subpopulations of T cells, such as cells positive or expressing high levels of one or more surface markers, e.g., CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, and / or CD45RO+ T cells, are isolated by positive or negative selection techniques.

[0278] For example, CD3+, CD28+ T cells can be positively selected using CD3 / CD28 conjugated magnetic beads (e.g.,  M-450 CD3 / CD28 T Cell Expander) .

[0279] In some embodiments, isolation is carried out by enrichment for a particular cell population by positive selection, or depletion of a particular cell population, by negative selection. In some embodiments, positive or negative selection is accomplished by incubating cells with one or more antibodies or other binding agent that specifically bind to one or more surface markers expressed or expressed (marker+) at a relatively higher level (markerhigh) on the positively or negatively selected cells, respectively.

[0280] In some aspects, the sample or composition of cells to be separated is incubated with small, magnetizable or magnetically responsive material, such as magnetically responsive particles or microparticles, such as paramagnetic beads (e.g., such as Dynabeads or MACS beads) . The magnetically responsive material, e.g., particle, generally is directly or indirectly attached to a binding partner, e.g., an antibody, that specifically binds to a molecule, e.g., surface marker, present on the cell, cells, or population of cells that it is desired to separate, e.g., that it is desired to negatively or positively select.

[0281] In some embodiments, the magnetic particle or bead comprises a magnetically responsive material bound to a specific binding member, such as an antibody or other binding partner. There are many well-known magnetically responsive materials used in magnetic separation methods. Suitable magnetic particles include those described in Molday, U.S. Pat. No. 4,452,773, and in European Patent Specification EP 452342 B, which are hereby incorporated by reference. Colloidal sized particles, such as those described in Owen U.S. Pat. No. 4,795,698, and Liberti et al., U.S. Pat. No. 5,200,084 are other examples.

[0282] The incubation generally is carried out under conditions whereby the antibodies or binding partners, or molecules, such as secondary antibodies or other reagents, which specifically bind to such antibodies or binding partners, which are attached to the magnetic particle or bead, specifically bind to cell surface molecules if present on cells within the sample.

[0283] In some embodiments, the sample is placed in a magnetic field, and those cells having magnetically responsive or magnetizable particles attached thereto will be attracted to the magnet and separated from the unlabeled cells. For positive selection, cells that are attracted to the magnet are retained; for negative selection, cells that are not attracted (unlabeled cells) are retained. In some aspects, a combination of positive and negative selection is performed during the same selection step, where the positive and negative fractions are retained and further processed or subject to further separation steps.

[0284] In certain embodiments, the magnetically responsive particles are coated in primary antibodies or other binding partners, secondary antibodies, lectins, enzymes, or streptavidin. In certain embodiments, the magnetic particles are attached to cells via a coating of primary antibodies specific for one or more markers. In certain embodiments, the cells, rather than the beads, are labeled with a primary antibody or binding partner, and then cell-type specific secondary antibody-or other binding partner (e.g., streptavidin) -coated magnetic particles, are added. In certain embodiments, streptavidin-coated magnetic particles are used in conjunction with biotinylated primary or secondary antibodies.

[0285] In some embodiments, the magnetically responsive particles are left attached to the cells that are to be subsequently incubated, cultured and / or engineered; in some aspects, the particles are left attached to the cells for administration to a patient. In some embodiments, the magnetizable or magnetically responsive particles are removed from the cells. Methods for removing magnetizable particles from cells are known and include, e.g., the use of competing non-labeled antibodies, magnetizable particles or antibodies conjugated to cleavable linkers, etc. In some embodiments, the magnetizable particles are biodegradable.

[0286] In some embodiments, the affinity-based selection is via magnetic-activated cell sorting (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, Calif. ) . Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) systems are capable of high-purity selection of cells having magnetized particles attached thereto. In certain embodiments, MACS operates in a mode wherein the non-target and target species are sequentially eluted after the application of the external magnetic field. That is, the cells attached to magnetized particles are held in place while the unattached species are eluted. Then, after this first elution step is completed, the species that were trapped in the magnetic field and were prevented from being eluted are freed in some manner such that they can be eluted and recovered. In certain embodiments, the non-target cells are labelled and depleted from the heterogeneous population of cells.

[0287] In certain embodiments, the isolation or separation is carried out using a system, device, or apparatus that carries out one or more of the isolation, cell preparation, separation, processing, incubation, culture, and / or formulation steps of the methods. In some aspects, the system is used to carry out each of these steps in a closed or sterile environment, for example, to minimize error, user handling and / or contamination. In one example, the system is a system as described in International Patent Application, Publication Number WO2009 / 072003, or US 20110003380 A1.

[0288] In some embodiments, the system or apparatus carries out one or more, e.g., all, of the isolation, processing, engineering, and formulation steps in an integrated or self-contained system, and / or in an automated or programmable fashion. In some aspects, the system or apparatus includes a computer and / or computer program in communication with the system or apparatus, which allows a user to program, control, assess the outcome of, and / or adjust various aspects of the processing, isolation, engineering, and formulation steps.

[0289] In some embodiments, a cell population described herein is collected and enriched (or depleted) via flow cytometry, in which cells stained for multiple cell surface markers are carried in a fluidic stream. In some embodiments, a cell population described herein is collected and enriched (or depleted) via preparative scale (FACS) -sorting. In certain embodiments, a cell population described herein is collected and enriched (or depleted) by use of microelectromechanical systems (MEMS) chips in combination with a FACS-based detection system (see, e.g., WO 2010 / 033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; and Godin et al. (2008) J Biophoton. 1 (5) : 355-376. In both cases, cells can be labeled with multiple markers, allowing for the isolation of well-defined T cell subsets at high purity.

[0290] In some embodiments, the antibodies or binding partners are labeled with one or more detectable marker, to facilitate separation for positive and / or negative selection. For example, separation may be based on binding to fluorescently labeled antibodies. In some examples, separation of cells based on binding of antibodies or other binding partners specific for one or more cell surface markers are carried in a fluidic stream, such as by fluorescence-activated cell sorting (FACS) , including preparative scale (FACS) and / or microelectromechanical systems (MEMS) chips, e.g., in combination with a flow-cytometric detection system. Such methods allow for positive and negative selection based on multiple markers simultaneously.

[0291] Also see “Examples” section for isolation and / or enrichment methods. IV. Method of Treatment

[0292] The present application further provides methods of treating cancer in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of the pharmaceutical composition disclosed herein. In some embodiments, the individual, to whom the engineered immune cells or compositions thereof are administered is a primate, such as a human, monkey, gorilla, chimpanzee, etc. In some embodiments, the individual is a human. The individual can be male or female and can be any suitable age, including infant, juvenile, adolescent, adult, and geriatric individuals. In some embodiments, the individual is a mammal, including but are not limited to, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, chinchillas, cats, dogs, horses, donkeys, cows, goats, sheep, deer, monkeys, apes, etc. In some embodiments, the individual is a livestock. In some embodiments, the individual is a companion animal. In some examples, the individual is a validated animal model for disease, adoptive cell therapy, and / or for assessing toxic outcomes. In some embodiments, the individual is human. In some embodiments, the cancer is a solid tumor.

[0293] The methods are applicable to cancers of all stages, including early stage, advanced stage and metastatic cancer. The methods described herein may be used as a first therapy, second therapy, third therapy, or combination therapy with other types of cancer therapies known in the art, such as chemotherapy, surgery, radiation, gene therapy, immunotherapy, bone marrow transplantation, stem cell transplantation, targeted therapy, cryotherapy, ultrasound therapy, photodynamic therapy, radio-frequency ablation or the like, in an adjuvant setting or a neoadjuvant setting.

[0294] In some embodiments, the solid cancer is selected from the group consisting of colon cancer, rectal cancer, renal-cell carcinoma, liver cancer, non-small cell carcinoma of the lung, cancer of the small intestine, cancer of the esophagus, melanoma, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, cancer of the head or neck, cutaneous or intraocular malignant melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, cancer of the anal region, stomach cancer, testicular cancer, uterine cancer, carcinoma of the fallopian tubes, carcinoma of the endometrium, carcinoma of the cervix, carcinoma of the vagina, carcinoma of the vulva, Hodgkin's Disease, non-Hodgkin's lymphoma, cancer of the endocrine system, cancer of the thyroid gland, cancer of the parathyroid gland, cancer of the adrenal gland, sarcoma of soft tissue, cancer of the urethra, cancer of the penis, solid tumors of childhood, cancer of the bladder, cancer of the kidney or ureter, carcinoma of the renal pelvis, neoplasm of the central nervous system (CNS) , primary CNS lymphoma, tumor angiogenesis, spinal axis tumor, brain stem glioma, pituitary adenoma, Kaposi's sarcoma, epidermoid cancer, squamous cell cancer, T-cell lymphoma, environmentally induced cancers, combinations of said cancers, and metastatic lesions of said cancers.

[0295] Any suitable methods for the administration of an engineered immune cell can be used herein. The route of administration is in accordance with any known and accepted methods, such as by single or multiple bolus or infusion over a long period of time in a suitable manner, e.g., injection or infusion by subcutaneous, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intraarterial, or intralesional routes, or by sustained release or extended-release means. In some embodiments, the engineered immune cell is administered intravenously, such as by infusion. In some embodiments, the engineered immune cell is administered intratumorally.

[0296] In some embodiments, the pharmaceutical composition provided herein contains the engineered immune cells in amounts effective to treat or prevent the disease or disorder, such as a therapeutically effective or prophylactically effective amount. Therapeutic or prophylactic efficacy in some embodiments is monitored by periodic assessment of treated subjects. For repeated administrations over several days or longer, depending on the condition, the treatment is repeated until a desired suppression of disease symptoms occurs. However, other dosage regimens may be useful and can be determined.

[0297] Dosages and desired drug concentration of pharmaceutical compositions of the present disclosure may vary depending on the particular use envisioned. The determination of the appropriate dosage or route of administration is well within the skill of an ordinary artisan. Animal experiments provide reliable guidance for the determination of effective doses for human therapy. Interspecies scaling of effective doses can be performed following the principles laid down by Mordenti, J. and Chappell, W. “The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics, ” In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46. It is within the scope of the present application that different formulations will be effective for different treatments and different disorders, and that administration intended to treat a specific organ or tissue may necessitate delivery in a manner different from that to another organ or tissue.

[0298] In some embodiments, a subject may be administered the range of about ten thousand to about 100 billion cells and / or that amount of cells per kilogram of body weight. In some embodiments, the engineered immune cell or pharmaceutical composition thereof is administered at a dosage of at least about any of 104, 105, 106, 107, 108, or 109 cells / kg of body weight of the individual. Dosages may vary depending on attributes particular to the disease or disorder and / or patient and / or other treatments. The method may occur without or with the administration of one or more cytokines. The cytokine may be IL2, IL7, IL12, IL21, and / or IL15. The method may occur without or with one or more chemokines. The chemokine may be CCL19 and / or CCL21.

[0299] In some embodiments, the engineered immune cell or pharmaceutical composition thereof is administered for a single time. In some embodiments, the engineered immune cell or pharmaceutical composition thereof is administered for multiple times (such as any of 2, 3, 4, 5, 6, or more times) . In some embodiments, the engineered immune cell or pharmaceutical composition thereof is administered once or multiple times during a dosing cycle. A dosing cycle can be, e.g., 1, 2, 3, 4, 5 or more week (s) , or 1, 2, 3, 4, 5, or more month (s) . The administration frequency and duration of the engineered immune cell expressing the chimeric construct and / or engineered receptor can be the same or different. The optimal dosage and treatment regime for a particular patient can be determined by one skilled in the art of medicine by monitoring the patient for signs of disease and adjusting the treatment accordingly. In certain embodiments, once the engineered immune cells are administered to a mammal (e.g., a human) , the biological activity of the engineered immune cell populations is measured by any of a number of known methods. Parameters to assess include specific binding of an engineered immune cell or non-engineered immune cell (e.g., bystanders) to antigen, in vivo, e.g., by imaging, or ex vivo, e.g., by ELISA or flow cytometry. In certain embodiments, the ability of the engineered immune cells or non-engineered immune cells (e.g., bystanders) to destroy target cells can be measured using any suitable method known in the art, such as cytotoxicity assays described in, for example, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7) : 689-702 (2009) , and Herman et al. J. Immunological Methods, 285 (1) : 25-40 (2004) . In certain embodiments, the biological activity of the engineered immune cells or non-engineered immune cells (e.g., bystanders) also can be measured by assaying expression and / or secretion of certain cytokines, such as CD107a, IFNγ, IL-2, and TNF. In some aspects, the biological activity is measured by assessing clinical outcome, such as reduction in tumor burden or load.

[0300] Thus, in some embodiments, there is provided a method of treating a cancer in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of a pharmaceutical composition comprising an αβT cell comprising a chimeric construct, wherein the chimeric construct comprises a DAP10 transmembrane domain and an intracellular signaling domain, wherein the chimeric construct further comprises a co-stimulatory domain, wherein the co-stimulatory domain is not derived from 4-1BB. In some embodiments, the intracellular signaling domain is not derived from CD3ζ.

[0301] In some embodiments, there is provided a method of treating a cancer in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of a pharmaceutical composition comprising an engineered immune cell (such as an αβT cell, a γδT cell, or an αβT / γδT cell present in a panT population) comprising a chimeric construct, wherein the chimeric construct comprises a DAP10 transmembrane domain, a co-stimulatory domain, and an intracellular signaling domain, wherein the co-stimulatory domain is not derived from 4-1BB. In some embodiments, the co-stimulatory domain is derived from a protein selected from the group consisting of CD27, CD28, CD30, CD40, OX40, and HVEM. In some embodiments, the co-stimulatory domain is derived from CD40. In some embodiments, the intracellular signaling domain is FcRγ intracellular signaling domain. In some embodiments, the intracellular signaling domain is CD3γ intracellular signaling domain. In some embodiments, the chimeric construct is a chimeric adaptor. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor or a variant thereof, for example an NKG2D receptor or variant thereof expressed from a heterologous nucleic acid encoding the NKG2D receptor or variant thereof. In some embodiments, the engineered immune cell does not comprise an overexpressed NKG2D receptor or variant thereof. In some embodiments, the chimeric construct is a NKG2D chimeric receptor. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises a NKG2D receptor extracellular domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor is expressed by a heterologous nucleic acid encoding the NKG2D chimeric receptor.

[0302] In some embodiments, there is provided a method of treating a cancer in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of a pharmaceutical composition comprising an engineered immune cell (such as an αβT cell, a γδT cell, or an αβT / γδT cell present in a panT population) comprising a chimeric construct, wherein the chimeric construct comprises a DAP10 transmembrane domain, a co-stimulatory domain, and an intracellular signaling domain, wherein the intracellular signaling domain is not derived from CD3ζ. In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from a protein selected from the group consisting of FcRγ, DAP12, CD3γ, CD3δ, and CD3ε. In some embodiments, the intracellular signaling domain is derived from FcRγ. In some embodiments, the intracellular signaling domain is CD3γ intracellular signaling domain. In some embodiments, the co-stimulatory domain is CD40. In some embodiments, the chimeric construct is a chimeric adaptor. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor or a variant thereof, for example an NKG2D receptor or variant thereof expressed from a heterologous nucleic acid encoding the NKG2D receptor or variant thereof. In some embodiments, the engineered immune cell does not comprise an overexpressed NKG2D receptor or variant thereof. In some embodiments, the chimeric construct is a NKG2D chimeric receptor. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises a NKG2D receptor extracellular domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor is expressed by a heterologous nucleic acid encoding the NKG2D chimeric receptor.

[0303] In some embodiments, there is provided a method of treating a cancer in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of a pharmaceutical composition comprising an engineered immune cell (such as an αβT cell, a γδT cell, or an αβT / γδT cell present in a panT population) comprising a chimeric construct, wherein the chimeric construct comprises a DAP10 transmembrane domain and an intracellular signaling domain, wherein the intracellular signaling domain is not derived from CD3ζ. In some embodiments, there is provided a method of treating a cancer in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of a pharmaceutical composition comprising an engineered immune cell (such as an αβT cell, a γδT cell, or an αβT / γδT cell present in a panT population) comprising a chimeric construct, wherein the chimeric construct comprises a DAP10 transmembrane domain and an intracellular signaling domain derived from a protein selected from the group consisting of FcRγ, DAP12, CD3γ, CD3δ, and CD3ε. In some embodiments, the chimeric construct is a chimeric adaptor. In some embodiments, the engineered immune cell further comprises an overexpressed NKG2D receptor or a variant thereof, for example an NKG2D receptor or variant thereof expressed from a heterologous nucleic acid encoding the NKG2D receptor or variant thereof. In some embodiments, the engineered immune cell does not comprise an overexpressed NKG2D receptor or variant thereof. In some embodiments, the chimeric construct is a NKG2D chimeric receptor. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor comprises a NKG2D receptor extracellular domain. In some embodiments, the NKG2D chimeric receptor is expressed by a heterologous nucleic acid encoding the NKG2D chimeric receptor. EXAMPLES

[0304] The following examples are put forth so as to provide those of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the present disclosure, and are not intended to limit the scope of what the inventors regard as their disclosure nor are they intended to represent that the experiments below are all or the only experiments performed. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to numbers used (e.g., amounts, temperature, etc. ) but some experimental errors and deviations should be accounted for. The examples below are intended to be purely exemplary of the application and should therefore not be considered to limit the application in any way.

[0305] The present disclosure has been described in terms of particular embodiments found or proposed by the present inventor to comprise preferred modes for the practice of the disclosure. It will be appreciated by those of skill in the art that, in light of the present disclosure, numerous modifications and changes can be made in the particular embodiments exemplified without departing from the intended scope of the disclosure. For example, due to codon redundancy, changes can be made in the underlying DNA sequence without affecting the protein sequence. Moreover, due to biological functional equivalency considerations, changes can be made in protein structure without affecting the biological action in kind or amount. All such modifications are intended to be included within the scope of the appended claims. Example 1: Plasmid construction, virus preparation, titer evaluation

[0306] Chimeric constructs and T cells containing such chimeric constructs (and in some cases with exogenous NKG2D receptors) were designed as shown in FIG. 1, Tables 1-5 and SEQ ID NOs: 28-47, 61-64 and 82-101. To generate viral particles comprising polynucleotides encoding any of the proteins disclosed herein, lentivirus packaging plasmid mixture including pMDLg / pRRE (Addgene#11251) , pRSV-Rev (Addgene#11253) , and pMD2. G (Addgene#11259) were pre-mixed with a PLVX-EF1A (including target system) vector at a pre-optimized ratio with polyetherimide (PEI) , mixed properly, and incubated at room temperature for 5 minutes. The transfection mix was added dropwise to 293-T cells and mixed gently. Transfected 293-T cells were incubated overnight at 37℃ and 5%CO2.24 hours post-transfection, supernatants were collected and centrifuged at 4℃ at 500 g for 10 min to remove any cellular debris. Centrifuged supernatants were filtered through a 0.45 μm PES filter to concentrate the viral supernatants post ultracentrifugation. After centrifugation, the supernatants were carefully discarded and the virus pellets were rinsed with pre-chilled DPBS. The concentration of virus was measured. Virus was aliquoted and stored at -80℃. Viral titers were determined by functional transduction on a T cell line.

[0307] Briefly, the lentiviral vector was modified using pLVX-Puro (Clontech#632164) by replacing the original promoter with human elongation factor 1α promoter (hEF1α) and by removing the puromycin resistance gene with EcoRI and BamHI by GenScript. PLVX-EF1A was further subjected to the lentivirus packaging procedure as described above.

[0308] The control CAR-10.6 was designed in accordance with the teaching of WO2023076523 (the content of which is incorporated herein in its entirety) . The control CAR-UT was designed in accordance with the teaching of US20200308248 (the content of which is incorporated herein in its entirety) .  Example 2: Collection and transduction of T lymphocytes 1. αβT cell transduced with chimeric construct

[0309] PBMCs were isolated by density centrifugation (lymphoprep) from leukapheresis material and cryopreserved. T cells were isolated from resuscitated PBMCs with a Pan T cell isolation kit (Miltenyi Biotec) . T cells were activated using T cell activation-expansion kit (Miltenyi Biotec) , 25 μL magnetic beads / 1×106 cells for 48 hours. 5×105 cells were transduced with lentiviral vectors of Example 1 at a multiplicity of infection (MOI) of 5 with 5 pg / mL polybrene. Such transduction procedure was repeated the next day followed by replenishment of fresh media containing IL-2 (300 IU / mL) the second day after the transduction. Cells were cultured in AIM-V supplemented with IL-2 (300 IU / mL) in a humidified chamber with periodical change of media as determined by the pH of the culture media for further expansion. 2. γδT cell transduced with chimeric construct

[0310] γδT cells were prepared by addition of 5 μM Zoledronate and 1000 IU / mL IL-2 to PBMCs and cultured for 9 days with periodical change of media supplemented with 1000 IU / mL IL-2. Alternatively, γδT cells were isolated from PBMCs or umbilical cord blood (UCB) and then stimulated by anti-γδTCR antibody (SEQ ID NO: 59) followed by co-incubation of K562-based artificial antigen-presenting cells (aAPCs) at 1: 2 ratio for at least 10 days.

[0311] PBMCs were isolated by density centrifugation (lymphoprep) from leukapheresis material and cryopreserved. PBMCs were resuscitated and activated with zoledronic acid (5 μΜ) in cell culture media AIM-V supplemented with IL-2 (1000 IU / mL) and 5%human AB serum and kept in a humidified chamber (37℃, 5%CO2) . 48 hours post-activation, cells were transduced with lentiviral vectors of Example 1 at an MOI of 5 with 5 pg / mL polybrene. Such transduction procedure was repeated the next day followed by replenishment of fresh media containing IL-2 (1000 IU / mL) the second day after the transduction. Cells were cultured in AIM-V supplemented with IL-2 (1000 IU / mL) in a humidified chamber with periodical change of media as determined by the pH of the culture media for further expansion. Cells were harvested 10 days post-transduction and the total number, purity and transduction efficiency were determined. Cells were further enriched with a negative TCRγ / δ+ T cell isolation kit (Miltenyi Biotec) before future applications or cryopreserved. 3. panT cell transduced with chimeric construct

[0312] PBMCs were isolated by density centrifugation (lymphoprep) from leukapheresis material and cryopreserved. Thawed PBMCs were initially treated with CD56 microbeads (Miltenyi Biotec) and separated on LS columns (Miltenyi Biotec) to deplete NK cells from cultures. Unlabeled cells from CD56 depletion sorting were then stimulated by anti-γδTCR antibody (SEQ ID NO: 59) in the presence of exogenous IL-2 (50 IU / mL) and IL-21 (30 ng / mL) in complete media (AIM-V supplemented with 5%human AB serum) . 48 hours post-activation, cells were transduced with lentiviral vectors of Example 1 at an MOI of 5 with 5 pg / mL polybrene. Such transduction procedure was repeated the next day followed by replenishment of fresh media containing IL-2 (50 IU / mL) and IL-21 (30 ng / mL) the second day after the transduction. Cells were cultured in AIM-V supplemented with IL-2 (50 IU / mL) , IL-15 (70 ng / mL) and IFN-γ (30 ng / mL) in a humidified chamber with periodical change of media as determined by the pH of the culture media for further expansion. Cells were harvested 4 days post-transduction and the total number, purity, and transduction efficiency were determined. Example 3. Proliferation, viability and expression of engineered T cells

[0313] Cell number and viability were measured using a cell counter. Surface expression of chimeric construct was assessed by flow cytometry using a PE-conjugated anti-DYKDDDDK Tag antibody. T-cells were also co-stained with fluorescein isothiocyanate (FITC) -conjugated anti-human CD8 and allophycocyanin (APC) -conjugated anti-human CD4 antibodies. Cell expansion, viability and expression level are important evaluation indicators for engineered T producibility. Example 4: Long-term cytotoxicity assay of engineered T cells

[0314] To evaluate the long-term killing efficacy of engineered T cells, we performed long-term co-culture assays, which mimic the dynamic killing process in vivo. We detected the expression of NKG2D ligands (NKG2DLs) in KATOIII / Claudin 18.2 and NUGC3 cell lines by flow cytometry. As shown in FIG. 2, the KATOIII / Claudin 18.2 cell line expressed a lower level of the NKG2DLs MICA / B and ULBP-2 / 5 / 6, while the NUGC3 cell line expressed a higher level of MICA / B and ULBP-2 / 5 / 6. Transduced or non-transduced T cells (1×105  / well) were co-cultured with tumor cell lines (KATOIII / Claudin 18.2 or NUGC3 cells, 1×105  / well) at an effector: target (E: T) ratio of 1: 1 in 24-well plates, in the absence of exogenous cytokines (IL-2) . Part of the cells were harvested and stained for CD3 after 2 to 3 days of co-culturing. For serial co-culture assays, the remaining T cells were then re-challenged with fresh NUGC3 cells at the same E: T ratio. Co-cultures were carried on until tumor cells outgrew. The T cell proliferation rate at each time point was calculated by dividing the number of T cells at the time point by the number of T cells at a previous time point. In addition, the supernatant was collected for IFN-γ and TNFα using (Human IFN gamma kit (Cisbio, Cat#62HIFNGPEH) and Human TNFα kit (Cisbio, Cat#62HTNFAPEH) , respectively. The supernatant and a standard were dispensed directly into the assay plate for the cytokine detection utilizing reagents. The antibodies labeled with the HTRF donor and acceptor were pre-mixed and added in a single dispensing step. Example 5: Engineering chimeric adaptor T cells with or without NKG2D  overexpression

[0315] NKG2D receptor is a c-type lectin-like NK immunoreceptor expressed on NK cells, natural killer T (NKT) cells, CD8+ and γδT cells (Raynaud A, Desrumeaux K, Vidard L Termine E, Baty D, Chames P, Vigne E, Kerfelec B. Anti-NKG2D single domain-based antibodies for the modulation of anti-tumor immune response. Oncoimmunology. 10 (1) : 1854529 (2020) ) . To test whether it is needed to overexpress exogenous NKG2D receptor, we generated chimeric adaptor T cells with or without a full-length NKG2D receptor and evaluated the proliferation and in vitro anti-tumor activity of these chimeric adaptor T cells. The chimeric adaptor constructs are shown in FIG. 3A and Table 1. Table 1. Constructs of chimeric adaptor T cells. 1. Proliferation, viability and expression

[0316] The production of chimeric adaptor αβT cells is described in Example 2. The proliferation, viability and expression of chimeric adaptor αβT cells were evaluated as described in Example 3.

[0317] As shown in FIG. 3B, CAR-UT, CAR-092501, CAR-092503 and CAR-092505 had a lower expansion, indicating that chimeric adaptor αβT with CD3ζ and chimeric adaptor αβT without NKG2D receptor overexpression result in low expansion capability.

[0318] Additionally, among them, CAR-UT and CAR-092501 with CD3ζ showed stronger fratricide with poor viability than other designs with FcRγ (FIG. 3C) . Without wishing to be bound by any theory, this may be due to the stronger activation of chimeric adaptor T cells by CD3ζ than by FcRγ. Furthermore, chimeric adaptor αβT cells without NKG2D receptor overexpression had a higher proportion of CD8+ subset and lower transduction compared to chimeric adaptor αβT cells with NKG2D receptor overexpression (FIG. 3D) . The results indicated that chimeric adaptor αβT overexpression of a full-length NKG2D receptor may alleviate fratricide. 2. Long-term cytotoxicity assay

[0319] CAR-092501, CAR-092503, CAR-092505 and CAR-092507 without NKG2D receptor overexpression had enhanced cytotoxicity and proliferation compared to UnT, but was inferior to that CAR-UT, CAR-092502, CAR-092504 and CAR-092506 with NKG2D receptor overexpression in vitro (FIG. 3E and FIG. 3F) . This further confirms that overexpression of a full-length NKG2D receptor plays a significant role in chimeric adaptor T cells. CAR-092504 had stronger cytotoxicity and proliferation compared to CAR-092502, which indicated that chimeric adaptor T cells with a co-stimulatory domain could further enhance cytotoxicity. Example 6: Engineering chimeric adaptors using different co-stimulatory domains

[0320] To evaluate other co-stimulatory domains’ role in chimeric adaptor T cells, we substituted the CD28 co-stimulatory domain of the CAR-092504 with 4-1BB, CD27, CD40, CD30, HVEM, or OX40. Additionally, we replaced the cytoplasmic domain to FcRγ from CD3ζ, which are usually used in CAR T cells. The chimeric adaptor constructs were shown in Table 2 and FIG. 4A. Table 2. Constructs of chimeric adaptor T cells using different co-stimulatory domains 1. Proliferation, viability and expression

[0321] The production of chimeric adaptor γδT is described in Example 2. The proliferation, viability and expression of chimeric adaptor γδT were evaluated as described in Example 3.

[0322] As shown in FIG. 4B, chimeric adaptor γδT with CD3ζ and chimeric adaptor γδT without NKG2D receptor overexpression had low expansion and poor viability, including CAR-10.6, CAR-UT, CAR-110101, which was consistent with chimeric adaptor αβT results. CAR-110101 with CD3ζ exhibited severe fratricide in chimeric adaptor γδT, which was reduced in CAR-092504 by replacing with FcRγ. Without wishing to be bound by any theory, this may be due to the weaker activation of chimeric adaptor T cells by FcRγ than by CD3ζ (FIG. 4C) . 2. Long-term cytotoxicity assay

[0323] Compared with UnT, all chimeric adaptor γδT demonstrated ability to kill NKG2DL+NUGC3 cells. Among the constructs, CAR-110105 showed the strongest potency and proliferation, followed by CAR-UT (FIG. 4D and FIG. 4E) . This revealed CD40 co-stimulatory domain can effectively enhance cytotoxicity and proliferation of chimeric adaptor γδT cells, and other co-stimulatory domains were significantly weaker than CD40. All chimeric adaptor γδT released low levels of cytokines. The IFN-γ and TNFα secreted by CAR-110105 were higher than others, which was consistent with their killing ability (FIG. 4F and FIG. 4G) . Example 7: Engineering chimeric adaptor using different ITAMs

[0324] Due to severe fratricide exhibited by chimeric adaptor γδT with CD3ζ during the production, we attempted to replace CD3ζ with CD3δ, CD3ε, CD3γ, FcRγ or Dap12, and evaluated the production cell expansion capacity and long-term killing efficacy of these designs with different ITAMs. The chimeric adaptor constructs were shown in Table 3 and FIG. 5A. Table 3. Constructs of chimeric adaptor using different ITAMs 1. Proliferation, viability and expression

[0325] The production of chimeric adaptor panT is described in Example 2. The proliferation, viability and expression of chimeric adaptor panT were evaluated as described in Example 3. As shown in FIG. 5B and FIG. 5C, chimeric adaptor panT cells with CD3ε showed lower expansion and poorer viability compared to chimeric adaptor panT cells with CD3ζ, which revealed a stronger fratricide using CD3ε. Chimeric adaptor panT cells with CD3γ, CD3δ, FcRγ or Dap12 demonstrated superior cell expansion and viability compared to chimeric adaptor panT cells with CD3ζ. 2. Long-term cytotoxicity assay

[0326] Chimeric adaptor panT using CD3δ didn’ t enhance chimeric adaptor panT cell cytotoxicity and proliferation compared to using CD3ζ, and was inferior to that using CD3γ in vitro. Among these designs, CAR-110105 still showed the strongest potency and proliferation, followed by CAR-1121-G, CAR-1121-D and CAR-110101, and the weakest being CAR-1121-E (FIG. 5D and FIG. 5E) . This further confirms the necessity of co-stimulatory domain using CD40. As shown in FIG. 5F and FIG. 5G, all constructs released cytokines at a low level; CAR-110105 released the highest levels of IFN-γ and TNF-α, which was consistent with its potency. Based on the above results, CD3γ and CD3δ are the most preferred cytoplasmic domains compared to CD3ζ. In summary, the constructs we have designed, such as CAR-110105, CAR-1121-G and CAR-1121-D, not only minimized fratricide during production but also demonstrated excellent efficacy and safety in vitro. Example 8: Engineering chimeric adaptors using CD40 co-stimulatory domain and  different ITAMs

[0327] Based on the above results, we attempted to replace FcRγ with CD3δ, CD3ε, CD3γ or DAP12 based on CAR-110105. The chimeric adaptor constructs are shown in Table 4 and FIGs. 6A. Table 4. Constructs of chimeric adaptor using different ITAMs 1. Proliferation, viability and expression

[0328] The production of chimeric adaptor panT is described in Example 2. The proliferation, viability and expression of chimeric adaptor panT were evaluated as described in Example 3.

[0329] As shown in FIG. 6B and FIG. 6C, all constructs showed lower expansion compared to UnT, but cell viability remained good and was comparable to UnT. This indicated that some fratricide during cell production, but it did not affect chimeric adaptor panT producibility. Consistent with Example 7, chimeric adaptor panT cells with a stronger fratricide using CD3ε, CAR-110105-E also had lowest expansion. However, the viability was normal. This may be due to that co-stimulatory domain using CD40 somewhat to attenuate chimeric adaptor panT fratricide. 2. Long-term cytotoxicity assay

[0330] Among these designs, CAR-110105 and CAR-110105-G showed the strongest potency and proliferation, followed by CAR-110105-D and CAR-110105-E, and the weakest being CAR-110105-D12 (FIG. 6D and FIG. 6E) . chimeric adaptor using CD40 co-stimulatory domain with FcRγ or CD3γ had comparable potency and were superior to with CD3δ, CD3ε or DAP12. Based on the above results, we screened CAR-110105 and CAR-110105-G as the optimal chimeric adaptor constructs. Example 9: Engineering NKG2D chimeric receptor using DAP10 transmembrane domain  with different ITAMs

[0331] DAP10 was the first adaptor molecules identified to associate with NKG2D. Based on the above results, we attempted to using a DAP10 transmembrane domain, a CD40 co-stimulatory domain, and with different ITAMs, including CD3γ, CD3δ, CD3ε, FcRγ or Dap12. Additionally, to evaluate hinges’ role in NKG2D chimeric receptor T cells, we substituted the DAP10 hinge domain with CD28 or CD8, which are usually used in CAR T cells. The NKG2D chimeric receptor constructs are shown in Table 5 and FIG. 7A. Table 5. Constructs of NKG2D chimeric receptor using CD40 co-stimulatory domain with  different ITAMs, transmembrane domains and hinges 1. Proliferation, viability and expression

[0332] The production of NKG2D chimeric receptor panT is described in Example 2. The proliferation, viability and expression of NKG2D chimeric receptor panT were evaluated as described in Example 3.

[0333] As shown in FIG. 7B, NKG2D chimeric receptor panT cells with CD3ζ or with DAP10 hinge and transmembrane domain showed lower expansion, including ND-0205-Z-R, ND-0205-Z-28, ND-0205-Z-8, ND-010201-10, ND-0205-G-10, ND-0205-Z-10, ND-0205-D-10, ND-0205-D12-10, CAR-28Z-R and CAR-BBZ-R. However, these constructs had good viability, except for ND-0205-Z-10 whose cell viability was slightly poorer than UnT (FIG. 7C) . This indicated that some fratricide during cell production, but it did not affect NKG2D chimeric receptor panT producibility. 2. Long-term cytotoxicity assay NKG2D chimeric receptor panT cells using DAP10 hinge and transmembrane domain showed  stronger potency and proliferation than that using CD28 or CD8 hinge and DAP10 transmembrane domain. In addition, constructs using DAP10 hinge and transmembrane were also superior to constructs using CD28 hinge and transmembrane and co-stimulatory domain with CD40. As shown in FIG. 7D and FIG. 7D, ND-0205-G-10 showed the strongest potency and proliferation, followed by ND-0205-D-10 and CAR-28Z-R, which revealed that, ITAMs using CD3γ was better than CD3δ, and also superior to others in NKG2D chimeric receptor constructs. Based on the above results, which revealed that hinge and transmembrane using DAP10 play an important role in NKG2D chimeric receptors. Example 10: Efficacy of NKG2D chimeric receptor in in vivo models of gastric cancer

[0334] To assess function of NKG2D chimeric receptor T cells to target NKG2DL+ tumor cell in vivo, anti-tumor treatment experiments of untransfected T cells (UN-T) , CAR-110105-D T cells on subcutaneous xenografts of MKN45-CLDN18.2 cells were determined (FIG. 8A) . We detected the expression of NKG2D ligands (NKG2DLs) in MKN45-CLDN18.2 cell lines by flow cytometry. As shown in FIG. 8B, the MKN45-CLDN18.2 cell line expressed a medium level of the NKG2DLs MICA / B.

[0335] NOD / ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52 / Gpt (NOD-SCID) mice were purchased from GemPharmatech Co. Ltd and 6 to 7-week-old NOD-SCID mice were inoculated subcutaneously with 1x107 MKN45-CLDN18.2 cells. Nine days after tumor inoculation, mice were randomly divided into 3 groups, 4 mice of each group. The groups were administered intravenously with a single infusion of 3x106 UNT or CAR-110105-D, respectively. Tumor volume and mice body weight were measured every three days. To test CART expansion in vivo, human CD3+ and CD3+CAR+ T cells in the peripheral blood of mice will be measured weekly.

[0336] The results of animal experiments are shown in FIG. 8A-8F. The UN-T control group had no discernable effect on tumor growth. In contrast, tumors in the CAR-110105-D group experienced a reduction in volume on day 8 after infusion, and achieved complete tumor regression on day 30, which remained tumor free until day 36 (See FIG. 8C) . No evidence of toxicity was observed when assessed by measurement of percentage change in body weight (FIG. 8D) . Percent human CD3+ and CD3+CAR+ T cells of CAR-110105-D group were highest in circulation day 14 after injection, with a steady decline in persistence up to tumor free. However, only a small number human CD3+T cells in control group (FIG. 8E and FIG. 8F) . Taken together, these data confirm the potent and sustained anti-tumor efficacy mediated by CAR-110105-D.

Claims

1.An engineered immune cell comprising a chimeric construct, wherein the chimeric construct comprises a DAP10 transmembrane domain and an intracellular signaling domain.2.The engineered immune cell of claim 1, wherein the chimeric construct further comprises a co-stimulatory domain.3.The engineered immune cell of claim 2, wherein the co-stimulatory domain is not derived from 4-1BB.4.The engineered immune cell of claim 2, wherein the co-stimulatory domain is derived from a protein selected from the group consisting of CD27, CD28, CD30, CD40, OX40, and HVEM.5.The engineered immune cell of claim 4, wherein the co-stimulatory domain is derived from CD40.6.The engineered immune cell of any one of claims 2-5, wherein the intracellular signaling domain is not derived from CD3ζ.7.The engineered immune cell of claim 6, wherein the intracellular signaling domain is derived from a protein selected from the group consisting of FcRγ, DAP12, CD3γ, CD3δ, and CD3ε.8.The engineered immune cell of claim 7, wherein the intracellular signaling domain is derived from FcRγ or CD3γ.9.The engineered immune cell of claim 2, wherein the co-stimulatory domain is derived from CD28 and the intracellular signaling domain is derived from a protein selected from the group consisting of FcRγ, CD3ζ, DAP12, CD3γ, CD3δ, and CD3ε.10.The engineered immune cell of claim 2, wherein the co-stimulatory domain is derived from 4-1BB and the intracellular signaling domain is derived from a protein selected from the group consisting of FcRγ, CD3ζ, DAP12, CD3γ, CD3δ, and CD3ε.11.The engineered immune cell of claim 2, wherein the co-stimulatory domain is derived from CD40 and the intracellular signaling domain is derived from a protein selected from the group consisting of FcRγ, CD3ζ, DAP12, CD3γ, CD3δ, and CD3ε.12.The engineered immune cell of claim 2, wherein the intracellular signaling domain is derived from FcRγ and the co-stimulatory domain is derived from a protein selected from the group consisting of CD27, CD30, HVEM and OX40.13.The engineered immune cell of claim 1, wherein the chimeric construct does not comprise a co-stimulatory domain.14.The engineered immune cell of claim 13, wherein the intracellular signaling domain is not a CD3ζ domain.15.The engineered immune cell of claim 14, wherein the intracellular signaling domain is derived from a protein selected from the group consisting of FcRγ, DAP12, CD3γ, CD3δ, and CD3ε.16.The engineered immune cell of claim 15, wherein the intracellular domain is derived from FcRγ or CD3γ.17.The engineered immune cell of any one of claims 1-16, wherein the DAP10 transmembrane domain comprises a functional variant of SEQ ID NO: 6 having one or more mutations that add, delete or substitute any of the amino acids of the polypeptide of SEQ ID NO: 6.18.The engineered immune cell of any one of claims 1-17, wherein the DAP10 transmembrane domain comprises is a truncated version of SEQ ID NO: 6.19.The engineered immune cell of any one of claims 1-18, wherein the chimeric construct is a chimeric adaptor.20.The engineered immune cell of claim 19, wherein the DAP10 transmembrane domain comprises amino acids 19-73 of SEQ ID NO: 6.21.The engineered immune cell of claim 20, wherein the DAP10 transmembrane domain comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.22.The engineered immune cell of any one of claims 19-21, wherein the chimeric adaptor comprises an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 30, 32, 34, 36 and 65-81.23.The engineered immune cell of any one of claims 19-22, wherein the chimeric adaptor is expressed by a heterologous nucleic acid encoding the chimeric adaptor.24.The engineered immune cell of claim 23, wherein the nucleic acid is present on a vector.25.The engineered immune cell of claim 24, wherein the vector is a viral vector.26.The engineered immune cell of any one of claims 23-25, wherein the heterologous nucleic acid further encodes a signaling peptide N-terminal to the chimeric adaptor.27.The method of claim 26, wherein the signaling peptide is derived from CD8α.28.The engineered immune cell of any one of claims 19-27, comprising an overexpressed NKG2D receptor.29.The engineered immune cell of claim 28, wherein the overexpressed NKG2D receptor is expressed from a heterologous nucleic acid encoding the NKG2D receptor.30.The engineered immune cell of claim 28, wherein the overexpressed NKG2D receptor is expressed from an endogenous nucleic acid encoding the NKG2D receptor.31.The engineered immune cell of any one of claims 23-30, wherein the nucleic acid encoding the chimeric adaptor is linked to the nucleic acid encoding the NKG2D receptor through a 2A self-cleaving peptide.32.The engineered immune cell of claim 31, wherein the 2A peptide is T2A, P2A, E2A, or F2A peptide.33.The engineered immune cell of any one of claims 28-32, wherein the engineered immune cell comprises an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 37-47 and 61-64.34.The engineered immune cell of any one of claims 28-32, wherein the engineered immune cell comprises a nucleic acid encoding a peptide having at least about 95%sequence identity to an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 37-47 and 61-64.35.The engineered immune cell of any one of claims 19-27, wherein the engineered immune cell does not comprise an overexpressed NKG2D receptor.36.The engineered immune cell of any one of claims 1-18, wherein the chimeric construct is a NKG2D chimeric receptor.37.The engineered immune cell of claim 36, wherein the NKG2D chimeric receptor comprises a NKG2D receptor extracellular domain.38.The engineered immune cell of claim 37, wherein the NKG2D receptor extracellular domain comprises amino acids 81-216 of SEQ ID NO: 10.39.The engineered immune cell of claim 38, wherein the NKG2D receptor extracellular domain comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.40.The engineered immune cell of any one of claims 36-39, wherein the DAP10 transmembrane domain comprises amino acids 49-73 of SEQ ID NO: 6.41.The engineered immune cell of claim 40, wherein the DAP10 transmembrane domain comprises amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.42.The engineered immune cell of any one of claims 36-41, wherein the NKG2D chimeric receptor further comprises a hinge links the NKG2D receptor extracellular domain and the DAP10 transmembrane domain.43.The engineered immune cell of claim 42, wherein the hinge is derived from a protein selected from the group consisting of CD8, CD28, and partial DAP10 extracellular domain.44.The engineered immune cell of claim 43, wherein the partial DAP10 extracellular domain comprises amino acids 24-48 of SEQ ID NO: 6.45.The engineered immune cell of claim 44, wherein the partial DAP10 extracellular domain comprises amino acids sequence of SEQ ID NO: 7.46.The engineered immune cell of any one of claims 36-45, wherein the NKG2D chimeric receptor comprises from N-terminus to C-terminus: a signal peptide, NKG2D receptor extracellular domain, a hinge, DAP10 transmembrane, a co-stimulatory domain and an intracellular signaling domain.47.The engineered immune cell of any one of claims 36-46, wherein the NKG2D chimeric receptor comprises an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 102-113.48.The engineered immune cell of any one of claims 36-47, wherein the NKG2D chimeric receptor is expressed by a heterologous nucleic acid encoding the NKG2D chimeric receptor.49.The engineered immune cell of claim 48, wherein the nucleic acid is present on a vector.50.The engineered immune cell of any one of claims 1-49, wherein the immune cell further expresses an engineered non-NKG2D receptor.51.The engineered immune cell of claim 50, wherein the engineered non-NKG2D receptor is an engineered T cell receptor (TCR) , a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell antigen coupler (TAC) .52.The engineered immune cell of claim 50 or 51, wherein the engineered receptor comprises an extracellular domain specifically recognizing any of GPC2, GPRC5D, CD7, CD19, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD70, CD123, CD228, CD138, BCMA, AFP, GPC3, CEA, Claudin 18.2, CLL1, CD33, folate receptor (FRα) , mesothelin (MSLN) , DLL3, CD276, gp100, 5T4, GD2, EGFR, MUC-1, PSMA, EpCAM, MCSP, SM5-1, MICA, MICB, NKG2D ligand, ULBP and HER-2.53.The engineered immune cell of any one of claims 1-52, wherein the immune cell is selected from the group consisting of: T cell, NK cell, NKT cell, peripheral blood mononuclear cell (PBMC) , hematopoietic stem cell, pluripotent stem cell, or an embryonic stem cell.54.The engineered immune cell of claim 53, wherein the immune cell is an αβT or a γδT cell.55.A pharmaceutical composition comprising the engineered immune cell of any one of claims 1-54.56.A method of making the engineered immune cell of any one of claims 1-54, comprising introducing into a population of immune cell a nucleic acid encoding the chimeric construct.57.A method of treating cancer in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 55.58.The method of claim 57, wherein the cancer is a solid tumor.59.A method of killing a tumor cell in an individual, comprising contacting the tumor cell with an effective amount of the pharmaceutical composition of claim 55.60.The method of any one of claims 57-59, wherein the individual is a human.

Images