Antibody drug conjugates and applications thereof

Abstract

A compound of Formula I, or an antibody drug conjugate (ADC) of Formula II, or a pharmaceutically acceptable salt, a stereoisomer, a prodrug, or a solvate thereof, its pharmaceutical composition and use in the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease. The ADC molecule prepared from the compound of Formula I has high in vivo stability and excellent pharmacodynamics.

Description

Antibody drug conjugates and applications thereofTechnical field

[0001] The invention belongs to the field of biomedicine, in particular to antibody drug conjugates, linkers and linker-payloads therefore, and applications and uses thereof.

[0002] Background Technology

[0003] Antibody drug conjugate (ADC) , as an emerging drug form combining chemotherapy and immunotherapy, has shown tremendous R &D value and market potential. To date, FDA has approved 15 ADC drugs for marketing for the treatment of hematological and solid tumors.

[0004] Generally speaking, ADC molecules are composed of antibodies, linkers, and payloads (drugs, such as, e.g., toxins) . Antibodies act as carriers of toxins for targeted delivery, and small-molecule toxins enter target cells and exert pharmacodynamic activity after effective release. In addition, some antibodies themselves have pharmacodynamic activity. At present, among many coupling techniques, conjugation by cysteine of antibody molecule itself is the most widely used.

[0005] Maleimide (MC) is widely used as a linker for Michael addition to the thiol of an antibody cysteine because of its high selectivity, rapid reaction kinetics and mild reaction conditions. However, in the presence of other sulfhydryl-containing substances (e.g. albumin or glutathione) , the conjugate of MC to the sulfhydryl group can undergo reverse Michael addition, resulting in cleavage of the conjugate of the ADC molecule and consequently leading to the emergence of pharmacodynamic, pharmacokinetic, and safety issues of the ADC molecule.

[0006] Therefore, the new linker and the new ADC thus prepared require further development and study.

[0007] Contents of the invention

[0008] In order to solve the above existing problems in the prior art, the inventors of the present application have conducted in-depth research and exploration. The inventors of the present application have found that when benzothiazole (more specifically 1, 3-benzothiazole) and its analogues (e.g. 1, 3-benzothiazole substituted with a sulfonyl group at position 2 and a carbonyl group at position 6) are used as ADC molecular linker moieties, their reaction with cysteine on the antibody can form irreversible conjugates, thereby improving the stability of the final ADC molecule, and thus improving its efficacy.

[0009] To this end, in the first aspect, the present invention provides a compound as shown in Formula I, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, or a solvate thereof, Lg-L1-L2-L3-L4-D I

[0010] Lg is a leaving group;

[0011] L1 is a linker, and L1 is selected from 9-10-membered heteroarylene;

[0012] L2 is a linker unit, preferably selected from wherein the left linkage site is linked to L1, and the right linkage site is linked to L3;

[0013] n1 is an integer selected from 1 to 10 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10, or such as 1-2, 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, or 9-10) ;

[0014] L0 is selected from a direct bond, or PEG;

[0015] L3 is an amino acid residue or a peptide residue consisting of 2-10 amino acid residues, wherein the amino terminus is linked to L2 and the carbonyl terminus is linked to L4;

[0016] L4 is a spacer unit, preferably selected from the group consisting of a direct bond,  wherein, when L4 is not a direct bond, its left linkage site is linked to L3 and its right linkage site is linked to D;

[0017] R1 is selected from the group consisting of hydrogen, C1-C6 alkyl, and deuterated C1-C6 alkyl, wherein the C1-C6 alkyl, and deuterated C1-C6 alkyl are each independently and optionally substituted with 1-3 halogens;

[0018] D is a drug molecule residue, preferably, the drug molecule is DXd or a derivative thereof.

[0019] In some embodiments, n1 is selected from the group consisting of 1, 2, 3, 4, and 5.

[0020] In some embodiments, n1 is selected from the group consisting of 3, 4, and 5.

[0021] In some embodiments, n1 is 4.

[0022] In some embodiments, L0 is selected from the group consisting of a direct bond, and  wherein, when L0 is not a direct bond, its left linkage site is linked to the carbonyl group in the remaining structure and its right linkage site is linked to L3; n2 is an integer selected from 1-20 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20, or such as 1-2, 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-11, 11-12, 12-13, 13-14, 14-15, 15-16, 16-17, 17-18, 18-19, or 19-20) .

[0023] In some embodiments, n2 is an integer selected from 1-10 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10, or such as 1-2, 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, or 9-10) .

[0024] In some embodiments, n2 is selected from 5, 6, or 7.

[0025] In some embodiments, n2 is 6.

[0026] In some embodiments, L2 is selected from wherein, the left linkage site is linked to L1 and the right linkage site is linked to L3.

[0027] In some embodiments, L4 is selected from a direct bond, or wherein, when L4 is not a direct bond, its left linkage site is linked to L3 and its right linkage site is linked to D.

[0028] In some embodiments, L4 is selected from wherein, its left linkage site is linked to L3 and its right linkage site is linked to D.

[0029] In some embodiments, R1 is selected from the group consisting of hydrogen, and C1-C6 alkyl.

[0030] In some embodiments, R1 is selected from the group consisting of hydrogen, and methyl.

[0031] In some embodiments, R1 is hydrogen.

[0032] In some embodiments, L4 is with its left linkage site linked to L3 and its right linkage site linked to D.

[0033] In some embodiments, L1 is selected from the group consisting of:

[0034] In some embodiments, L1 is selected from the group consisting of:

[0035] In some embodiments, L1 is selected from the group consisting of:

[0036] In some embodiments, L1 is selected from the group consisting of

[0037] In some embodiments, L1 is selected from the group consisting of

[0038] In some embodiments, L1 is

[0039] In some embodiments, the linkage site on the left side of L1 is linked to Lg and the linkage site on the right side of L1 is linked to L2.

[0040] In some embodiments, L3 is a peptide residue consisting of 2-4 (preferably 2) amino acid residues, wherein, its amino terminus is linked to L2 and its carbonyl terminus is linked to L4; preferably, the amino acid residue is selected from the group consisting of a glycine residue, a phenylalanine residue, a valine residue, a citrulline residue, an alanine residue, and a lysine residue; more preferably, the amino acid residue is selected from the group consisting of a valine residue, and an alanine residue.

[0041] In some embodiments, L3 is selected from the group consisting of a glycine residue-glycine residue-phenylalanine residue-glycine residue (GGFG) , a valine residue-citrulline residue (VC) , and a valine residue-alanine residue (VA) , wherein, its amino terminus is linked to L2 and its carbonyl terminus is linked to L4.

[0042] In some embodiments, L3 is selected from the group consisting of a valine residue-alanine residue (VA) (e.g.,  ) , wherein, its amino terminus is linked to L2 and its carbonyl terminus is linked to L4.

[0043] In some embodiments, Lg is selected from the group consisting of halogen, -OMs, CF3SO3-, and C1-C6 alkyl-SO2-.

[0044] In some embodiments, Lg is selected from C1-C6 alkyl-SO2-.

[0045] In some embodiments, Lg is selected from the group consisting of MeSO2-, and CH3CH2SO2-.

[0046] In some embodiments, Lg is CH3CH2SO2-.

[0047] In some embodiments, D is selected from wherein:

[0048] R2 is selected from the group consisting of hydrogen, C1-C6 alkyl, C1-C6 alkoxy, C1-C6 alkylthio, C3-C6 cycloalkyl, and deuterated C1-C6 alkyl, wherein the C1-C6 alkyl, C1-C6 alkoxy, C1-C6 alkylthio, C3-C6 cycloalkyl, and deuterated C1-C6 alkyl are each independently and optionally substituted with 1 to 3 halogens (preferably F) ;

[0049] R3 is selected from the group consisting of hydrogen, C1-C6 alkyl, C1-C6 alkoxy, C1-C6 alkylthio, C3-C6 cycloalkyl, and deuterated C1-C6 alkyl, wherein the C1-C6 alkyl, C1-C6 alkoxy, C1-C6 alkylthio, C3-C6 cycloalkyl, and deuterated C1-C6 alkyl are each independently and optionally substituted with 1 to 3 halogens (preferably F) .

[0050] In some embodiments, R2 is selected from the group consisting of hydrogen, C1-C6 alkyl, and deuterated C1-C6 alkyl, wherein the C1-C6 alkyl, and deuterated C1-C6 alkyl are each independently and optionally substituted with 1-3 halogens (preferably F) .

[0051] In some embodiments, R2 is selected from the group consisting of hydrogen, methyl, and deuterated methyl, wherein the methyl, and deuterated methyl are each independently and optionally substituted with 1-3 halogens (preferably F) .

[0052] In some embodiments, R2 is selected from the group consisting of hydrogen, -CF2D, -CFD2, -CD3, -CF2H, and -CFH2.

[0053] In some embodiments, R2 is hydrogen or -CF2D.

[0054] In some embodiments, R2 is hydrogen.

[0055] In some embodiments, R3 is selected from the group consisting of hydrogen, C1-C6 alkyl, and deuterated C1-C6 alkyl, wherein the C1-C6 alkyl, and deuterated C1-C6 alkyl are each independently and optionally substituted with 1-3 halogens (preferably F) .

[0056] In some embodiments, R3 is selected from the group consisting of hydrogen, methyl, and deuterated methyl, wherein the methyl, and deuterated methyl are each independently and optionally substituted with 1-3 halogens (preferably F) .

[0057] In some embodiments, R3 is selected from the group consisting of hydrogen, -CF2D, -CFD2, -CD3, -CF2H, and -CFH2.

[0058] In some embodiments, R3 is hydrogen.

[0059] In some embodiments, D is

[0060] In some embodiments, the compound as shown in Formula I is selected from the group consisting of:

[0061] In the second aspect, the present invention provides an antibody drug conjugate as shown in Formula II, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, or a solvate thereof, Ab- (L1-L2-L3-L4-D) p II

[0062] wherein:

[0063] Ab is an antibody or antigen-binding fragment thereof;

[0064] L1, L2, L3, L4, and D are each independently described in any of the first aspect;

[0065] p is any integer or any decimal number selected from 1 to 20 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1 to 2, 1 to 3, 1 to 4, 1 to 5, 1 to 6, 1 to 7, 1 to 8, 1 to 9, 1 to 10, 1 to 11, 1 to 12, 1 to 13, 1 to 14, 1 to 15, 1 to 16, 1 to 17, 1 to 18, 1 to 19, 1 to 20, 2 to 3, 2 to 4, 2 to 5, 2 to 6, 2 to 7, 2 to 8, 2 to 9, 2 to 10, 2 to 11, 2 to 12, 2 to 13, 2 to 14, 2 to 15, 2 to 16, 2 to 17, 2 to 18, 2 to 19, 2 to 20, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 3-11, 3-12, 3-13, 3-14, 3-15, 3-16, 3-17, 3-18, 3-19, 3-20, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 4-11, 4-12, 4-13, 4-14, 4-15, 4-16, 4-17, 4-18, 4-19, 4-20, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 5-11, 5-12, 5-13, 5-14, 5-15, 5-16, 5-17, 5-18, 5-19, 5-20, 6-7, 6-8, 6-9, 6-10, 6-11, 6-12, 6-13, 6-14, 6-15, 6-16, 6-17, 6-18, 6-19, 6-20, 7-8, 7-9, 7-10, 7-11, 7-12, 7-13, 7-14, 7-15, 7-16, 7-17, 7-18, 7-19, 7-20, 8-9, 8-10, 8-11, 8-12, 8-13, 8-14, 8-15, 8-16, 8-17, 8-18, 8-19, 8-20, 9-10, 9-11, 9-12, 9 -13, 9-14, 9-15, 9-16, 9-17, 9-18, 9-19, 9-20, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 10-16, 10-17, 10-18, 10-19, 10-20, 11-12, 11-13, 11-14, 11-15, 11-16, 11-17, 11-18, 11-19, 11-20, 12-13, 12-14, 12-15, 12-16, 12-17, 12-18, 12-19, 12-20, 13-14, 13-15, 13-16, 13-17, 13-18, 13-19, 13-20, 14-15, 14-16, 14-17, 14-18, 14-19, 14-20, 15-16, 15-17, 15-18, 15-19, 15-20, 16-17, 16-18, 16-19, 16-20, 17-18, 17-19, 17-20, 18-19, 18-20, or 19-20) .

[0066] In some embodiments, the antibody drug conjugate is selected from the group consisting of:

[0067] In some embodiments, the antibody is an anti-HER2 antibody.

[0068] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable region and a heavy chain variable region, wherein the light chain variable region comprises LCDR1 as shown in SEQ ID NO: 1, LCDR2 as shown in SEQ ID NO: 2, and LCDR3 as shown in SEQ ID NO: 3; the heavy chain variable region comprises HCDR1 as shown in SEQ ID NO: 4, HCDR2 as shown in SEQ ID NO: 5, and HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 6.

[0069] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable region and a heavy chain variable region, wherein the light chain variable region comprises a sequence as shown in SEQ ID NO: 7 and the heavy chain variable region comprises a sequence as shown in SEQ ID NO: 8.

[0070] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof further comprises a light chain constant region and a heavy chain constant region, wherein the light chain constant region is selected from a human-derived lambda constant region, a human-derived kappa constant region, or mutants of the above constant region; the heavy chain constant region is selected from a human-derived IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE constant region, or mutants of the above constant region; preferably, the IgG is selected from the group consisting of IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.

[0071] In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain as shown in SEQ ID NO: 9 and a heavy chain as shown in SEQ ID NO: 10.

[0072] In some embodiments, p is any integer or any decimal number selected from 1 to 10 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 to 2, 1 to 3, 1 to 4, 1 to 5, 1 to 6, 1 to 7, 1 to 8, 1 to 9, 1 to 10, 2 to 4, 2 to 5, 2 to 6, 2 to 7, 2 to 8, 2 to 9, 2 to 10, 3 to 4, 3 to 5, 3 to 6, 3 to 7, 3 to 8, 3 to 9, 3 to 10, 4 to 5, 4 to 6, 4 to 7, 4 to 8, 4 to 9, 4 to 10, 5 to 6, 5 to 7, 5 to 8, 5 to 9, 5 to 10, 6 to 7, 6 to 8, 6 to 9, 6 to 10, 7 to 8, 7 to 9, 7 to 10, 8 to 9, 8 to 10, or 9 to 10) .

[0073] In some embodiments, p is any integer or any decimal number selected from the group consisting of 4-8 (e.g., 4.0-4.5, 4.0-5.0, 4.0-5.5, 4.0-6.0, 4.0-6.5, 4.0-7.0, 4.0-7.5, 4.0-8.0, 4.5-5.0, 4.5-5.5, 4.5-6.0, 4.5-6.5, 4.5-7.0, 4.5-7.5, 4.5-8.0, 5.0-5.5, 5.0-6.0, 5.0-6.5, 5.0-7.0, 5.0-7.5, 5.0-8.0, 5.5-6.0, 5.5-6.5, 5.5-7.0, 5.5-7.5, 5.5-8.0, 6.0-6.5, 6.0-7.0, 6.0-7.5, 6.0-8.0, 6.5-7.0, 6.5-7.5, 6.5-8.0, 7.0-7.5, 7.0-8.0, or 7.5-8.0, specifically such as 7.9 or 8.0) .

[0074] In the third aspect, the present invention provides a composition, which comprises one or more antibody drug conjugates, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, or a solvate thereof as described in any of the technical solution of the first or the second aspects.

[0075] In some embodiments, the DAR value of the composition is any integer or any decimal number selected from 1-20 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1 to 2, 1 to 3, 1 to 4, 1 to 5, 1 to 6, 1 to 7, 1 to 8, 1 to 9, 1 to 10, 1 to 11, 1 to 12, 1 to 13, 1 to 14, 1 to 15, 1 to 16, 1 to 17, 1 to 18, 1 to 19, 1 to 20, 2 to 3, 2 to 4, 2 to 5, 2 to 6, 2 to 7, 2 to 8, 2 to 9, 2 to 10, 2 to 11, 2 to 12, 2 to 13, 2 to 14, 2 to 15, 2 to 16, 2 to 17, 2 to 18, 2 to 19, 2 to 20, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 3-11, 3-12, 3-13, 3-14, 3-15, 3-16, 3-17, 3-18, 3-19, 3-20, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 4-11, 4-12, 4-13, 4-14, 4-15, 4-16, 4-17, 4-18, 4-19, 4-20, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 5-11, 5-12, 5-13, 5-14, 5-15, 5-16, 5-17, 5-18, 5-19, 5-20, 6-7, 6-8, 6-9, 6-10, 6-11, 6-12, 6-13, 6-14, 6-15, 6-16, 6-17, 6-18, 6-19, 6-20, 7-8, 7-9, 7-10, 7-11, 7-12, 7-13, 7-14, 7-15, 7-16, 7-17, 7-18, 7-19, 7-20, 8-9, 8-10, 8-11, 8-12, 8-13, 8-14, 8-15, 8-16, 8-17, 8-18, 8-19, 8-20, 9-10, 9-11, 9-12, 9 -13, 9-14, 9-15, 9-16, 9-17, 9-18, 9-19, 9-20, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 10-16, 10-17, 10-18, 10-19, 10-20, 11-12, 11-13, 11-14, 11-15, 11-16, 11-17, 11-18, 11-19, 11-20, 12-13, 12-14, 12-15, 12-16, 12-17, 12-18, 12-19, 12-20, 13-14, 13-15, 13-16, 13-17, 13-18, 13-19, 13-20, 14-15, 14-16, 14-17, 14-18, 14-19, 14-20, 15-16, 15-17, 15-18, 15-19, 15-20, 16-17, 16-18, 16-19, 16-20, 17-18, 17-19, 17-20, 18-19, 18-20, or 19-20) .

[0076] In some embodiments, the DAR value of the composition is any integer or any decimal number selected from 1 to 10 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 to 2, 1 to 3, 1 to 4, 1 to 5, 1 to 6, 1 to 7, 1 to 8, 1 to 9, 1 to 10, 2 to 4, 2 to 5, 2 to 6, 2 to 7, 2 to 8, 2 to 9, 2 to 10, 3 to 4, 3 to 5, 3 to 6, 3 to 7, 3 to 8, 3 to 9, 3 to 10, 4 to 5, 4 to 6, 4 to 7, 4 to 8, 4 to 9, 4 to 10, 5 to 6, 5 to 7, 5 to 8, 5 to 9, 5 to 10, 6 to 7, 6 to 8, 6 to 9, 6 to 10, 7 to 8, 7 to 9, 7 to 10, 8 to 9, 8 to 10, or 9 to 10) .

[0077] In some embodiments, the DAR value of the composition is any integer or any decimal number selected from 4 to 8 (e.g., 4.0-4.5, 4.0-5.0, 4.0-5.5, 4.0-6.0, 4.0-6.5, 4.0-7.0, 4.0-7.5, 4.0-8.0, 4.5-5.0, 4.5-5.5, 4.5-6.0, 4.5-6.5, 4.5-7.0, 4.5-7.5, 4.5-8.0, 5.0-5.5, 5.0-6.0, 5.0-6.5, 5.0-7.0, 5.0-7.5, 5.0-8.0, 5.5-6.0, 5.5-6.5, 5.5-7.0, 5.5-7.5, 5.5-8.0, 6.0-6.5, 6.0-7.0, 6.0-7.5, 6.0-8.0, 6.5-7.0, 6.5-7.5, 6.5-8.0, 7.0-7.5, 7.0-8.0, or 7.5-8.0, specifically such as 7.9 or 8.0) .

[0078] In the fourth aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof as described in any of the technical solution of the first aspect, or an antibody drug conjugate, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof as described in any technical solution of the second aspect, or a composition described in the third aspect; optionally, further comprising one or more pharmaceutical excipients, such as carriers and / or excipients.

[0079] In the fifth aspect, the present invention provides the use of a compound, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug or a solvate thereof as described in any of the technical solution of the first aspect, or an antibody drug conjugate, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof as described in any technical solution of the second aspect, or a composition described in the third aspect or a pharmaceutical composition described in the fourth aspect in the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease.

[0080] In the sixth aspect, the present invention provides a compound, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof as described in any of the technical solution of the first aspect, or an antibody drug conjugate, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof as described in any of the technical solution of the second aspect, or a composition described in the third aspect or a pharmaceutical composition described in the fourth aspect for use in the prevention and / or treatment of a disease.

[0081] In a seventh aspect of the invention, the present invention provides a method of preventing and / or treating a disease comprising administering to a subject an effective amount of a compound, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof as described in any of the technical solution of the first aspect, or an antibody drug conjugate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof as described in any of the technical solution of the second aspect, or a composition described in the third aspect, or a pharmaceutical composition described in the fourth aspect.

[0082] In another aspect, the present invention provides use of a drug having the structure  or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof for the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease.

[0083] In another aspect, the present invention provides a drug having the structure  or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof,

[0084] for use in a method of preventing and / or treating a disease.

[0085] In another aspect, the present invention provides a method of preventing and / or treating a disease comprising administering to a subject an effective amount of a drug having the structure  or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof.

[0086] In some embodiments, the disease is selected from biliary tract cancer, carcinosarcoma, esophageal cancer, gastroesophageal junction cancer, breast cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, head and neck cancer, colorectal cancer, renal cancer, cervical cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, uterine cancer, melanoma, pharyngeal cancer, oral cancer, skin cancer, lung cancer, urethral cancer, prostate cancer, bladder cancer, gastrointestinal stromal tumor, squamous cell carcinoma, peritoneal cancer, liver cancer, uterine cancer, salivary cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, penile cancer, leukemia, malignant lymphoma, plasmacytoma, or myeloma.

[0087] In some embodiments, the disease is selected from gastric cancer, colorectal cancer, breast cancer, or melanoma.

[0088] In another aspect, the present invention provides use of a 1, 3-benzothiazole substituted at position 2 and at one or more further position (s) of the heterocycle for preparing an antibody drug conjugate.

[0089] In another aspect, the present invention provides a method for preparing an antibody drug conjugate comprising using a 1, 3-benzothiazole substituted at position 2 and at one or more further position (s) of the heterocycle.

[0090] In some embodiments, the position 2 of the 1, 3-benzothiazole is substituted with a sulfonyl group, preferably an ethylsulfonyl group.

[0091] In some embodiments, wherein position 6 of the 1, 3-benzothiazole is substituted with a carboxyl group, a carbonyl group, or an alkynyl group (e.g. an ethynyl group) .

[0092] In another aspect, the present invention provides use of a 1, 3-benzothiazole substituted at position 2 and at one or more further position (s) of the heterocycle as a linker in an antibody drug conjugate for improving the stability of the antibody drug conjugate in vitro and / or in vivo.

[0093] In another aspect, the present invention provides a method for improving the stability of a antibody drug conjugate in vitro and / or in vivo comprising using a 1, 3-benzothiazole substituted at position 2 and at one or more further position (s) of the heterocycle as a linker in the antibody drug conjugate.

[0094] In some embodiments, wherein position 6 of the 1, 3-benzothiazole is substituted with a carboxyl group, a carbonyl group, or an alkynyl group (e.g. an ethynyl group) .

[0095] In some embodiments, the stability of the antibody drug conjugate is improved compared to the stability of an antibody drug conjugate using maleimide or a derivative thereof as a linker for the conjugation of the antibody and the drug.

[0096] In some embodiments, the position 2 of the 1, 3-benzothiazole is conjugated to the antibody of the antibody drug conjugate.

[0097] Beneficial effects:

[0098] 1. For the first time in this application, benzothiazole and its analogues (e.g. 1, 3-benzothiazole substituted with a sulfonyl group (preferably an ethylsulfonyl group) at position 2 and a carbonyl group at position 6) are used as linkers in ADCs for antibody conjugation, with better safety and efficacy of the ADCs compared to ADCs that use a maleimide linker for conjugation, such as the commercial drug Enhertu. Preferred analogues of benzothiazole are selected from the group consisting of

[0099] 2. The ADCs of this application have high in vivo stability and excellent pharmacodynamics.

[0100] 3. The ADCs of this application have achieved better efficacy than the commercial drug Enhertu in an in vivo tumor model, and have a broad application prospect.

[0101] Abbreviation Meaning:

[0102] ADC: antibody drug conjugate

[0103] HATU: 2- (7-Azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate

[0104] DIPEA: N, N-Diisopropylethylamine

[0105] DMF: N, N-Dimethylformamide

[0106] HOBT: 1-Hydroxybenzotriazole

[0107] EDCI: 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide

[0108] THF: tetrahydrofuran

[0109] DBU: 1, 8-Diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene

[0110] TFA: trifluoroacetic acid

[0111] EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

[0112] TCEP: Tris (2-carboxyethyl) phosphine

[0113] NAC: Acetylcysteine

[0114] DMSO: Dimethyl sulfoxide

[0115] DAR: drug-antibody ratio

[0116] PEG: polyethylene glycol refers to homopolymers with a repeating unit of -CH2CH2O-, including single-arm polyethylene glycol, multi-arm polyethylene glycol and derivatives thereof, such as derivatives with end groups bearing reaction functions such as amino groups and / or carboxyl groups.

[0117] Definition of Terms

[0118] In the present invention, unless otherwise stated, scientific and technical terms used herein have the meanings commonly understood by those skilled in the art. Moreover, the virology, biochemistry, and immunology laboratory procedures used herein are routine procedures widely used in the corresponding fields. Meanwhile, in order to better understand the present invention, definitions and explanations of relevant terms are provided below.

[0119] Unless otherwise indicated, the definitions of groups and terms described in the description and claims of the present application, including definitions thereof as examples, exemplary definitions, preferred definitions, definitions described in tables, definitions of specific compounds in the examples, etc., may be combined with each other at will. The definitions of the groups after such combination and structures of compounds should be understood to be within the scope described in the description and / or claims of the present application.

[0120] Unless otherwise stated, the range of values described in this specification and claims corresponds to at least each of the specific integer values or decimal values thereof, if appropriate. For example, the numerical range "1-10" shall be interpreted as disclosing every integer value in the numerical range "1-10" , i.e., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, and, where applicable, any decimal value within this range. In addition, when certain numerical ranges are defined as "numbers" , it should be understood that the two endpoints of the range, each integer within the range, and each decimal within the range are described.

[0121] The term "antibody" as used herein refers to an immunoglobulin-derived molecule capable of specifically binding to a target antigen that binds to the target antigen by at least one antigen-binding site located in its variable region. When referring to the term "antibody" , it includes not only intact antibodies but also antigen-binding fragments capable of specifically binding to the target antigen, unless the context clearly indicates.

[0122] As used herein, the term "intact antibody" refers to an immunoglobulin molecule typically composed of two pairs of polypeptide chains, each pair having a light chain (LC) and a heavy chain (HC) . Antibody light chains can be classified into k (kappa) and λ (lambda) light chains. Antibody light chains can be classified into k (kappa) and X (lambda) light chains. Heavy chains can be classified as μ, δ, γ, α, or ε, and define the antibody's isotypes as IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE, respectively. Within the light and heavy chains, the variable and constant regions are connected by a "J" region of approximately 12 or more amino acids, and the heavy chain also contains a "D" region of approximately 3 or more amino acids. Each heavy chain consists of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) . The heavy chain constant region consists of 3 domains (CH1, CH2 and CH3) . Each light chain consists of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) . The light chain constant region consists of one domain, CL. The constant domain is not directly involved in the binding of antibody to antigen, but exhibits a variety of effector functions, such as mediating the binding of immunoglobulin with host tissue or factor, including various cells of the immune system (e.g., effector cells) and the first component of the classical complement system (C1q) . The VH and VL regions can also be subdivided into regions of high variability called complementarity-determining regions (CDRs) , interspersed with more conservative regions called framework regions (FRs) . Each VH or VL consists of 3 CDRs and 4 FRs arranged from the amino terminus to the carboxyl terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The variable regions (VH and VL) of each heavy chain / light chain pair respectively form an antigen-binding site.

[0123] As used herein, the term "complementarity-determining region" or "CDR" refers to those amino acid residues in a variable region of an antibody that are responsible for antigen binding. The variable regions of the heavy chain and light chain each contain three CDRs, named CDR1, CDR2 and CDR3. The precise boundaries of these CDRs can be defined according to various numbering systems known in the art, such as the Kabat numbering system (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991) , the Chothia numbering system (Chothia &Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878883) , or the IMGT numbering system (Lefranc et al. al., Dev. Comparat. Immunol. 27: 55-77, 2003) , or the AbM numbering system (Martin ACR, Cheetham JC, Rees AR (1989) Modelling antibody hypervariable loops: A combined algorithm. Proc Natl Acad Sci USA 86: 9268–9272) . For a given antibody, one skilled in the art will readily identify the CDRs defined by each numbering system. Moreover, the correspondence between different numbering systems is well known to those skilled in the art (e.g., see Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27: 55-77, 2003) .

[0124] As used herein, the term "framework region" or "FR" residues refers to those amino acid residues in an antibody variable region other than the CDR residues as defined above.

[0125] The term "antibody" is not limited to any particular method of producing the antibody. It includes, for example, recombinant antibody, monoclonal antibody, and polyclonal antibody. The antibody may be of different isotypes, e.g., IgG (e.g., IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 subtypes) , IgA1, IgA2, IgD, IgE, or IgM antibody.

[0126] As used herein, the term "specifically bind" or "specific binding" refers to a non-random binding reaction between two molecules, such as a reaction between an antibody and an antigen to which it is directed. The strength or affinity of a specific binding interaction can be expressed in term of the equilibrium dissociation constant (KD ) of the interaction. In the present invention, the term "KD " refers to the dissociation equilibrium constant of specific antibody-antigen interaction, which is used to describe the binding affinity between antibody and antigen. The lower the equilibrium dissociation constant, the tighter the antibody-antigen binding, and the higher the affinity between antibody and antigen.

[0127] The specific binding properties between two molecules can be determined using methods known in the art. One method involves measuring the formation and dissociation rates of antigen-binding site / antigen complex. Both "association rate constant" (ka or kon) and "dissociation rate constants" (kdis or koff) can be calculated from the concentration and the actual association and dissociation rates (see Malmqvist M, Nature, 1993, 361: 186-187) . The ratio of kdis / kon is equal to the dissociation constant KD (see Davies et al., Annual Rev Biochem, 1990; 59: 439-473) . Any effective method can be used to measure KD , kon and kdis values, e.g., surface plasmon resonance (SPR) can be used to measure the dissociation constant in Biacore. Bioluminescence interferometry or Kinexa can also be used to measure the dissociation constant.

[0128] As used herein, the term "antigen-binding fragment" of an antibody refers to a polypeptide comprising a fragment of a full-length antibody that retains the ability to specifically bind to the same antigen to which the full-length antibody binds, and / or compete with the full-length antibody to specifically bind to the antigen, which is also referred to as an "antigen binding portion" . See generally, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed., Raven Press, NY (1989) , which is hereby incorporated by reference in its entirety for all purposes. Antigen-binding fragments of an antibody can be produced by recombinant DNA techniques or by enzymatic or chemical cleavage of intact antibody. Non-limiting examples of antigen-binding fragments include Fab, Fab', F (ab') 2 , Fd, Fv, disulfide-linked Fv, complementarity determining region (CDR) fragments, scFv, double antibody (diabody) , single domain antibody, chimeric antibody, linear antibody, nanobody (techniques from Domantis) , probody and polypeptides comprising at least a portion of antibody that is sufficient to confer the specific antigen binding ability to the polypeptide. Engineered antibody variants are reviewed in Holliger et al., 2005; Nat Biotechnol, 23: 1126-1136.

[0129] As used herein, the term "Fd" refers to an antibody fragment consisting of VH and CH1 domains; the term "Fab fragment" refers to an antibody fragment consisting of VL, VH, CL and CH1 domains; the term "F (ab') 2 fragment" refers to an antibody fragment comprising two Fab fragments connected by a disulfide bridge on hinge region; the term "Fab' fragment" refers to a fragment obtained by reducing the disulfide bond connecting the two heavy chain fragments in the F (ab') 2 fragment, which consists of one complete light chain and Fd Fragment (composed of VH and CH1 domains) of heavy chain.

[0130] As used herein, the term "Fv" refers to an antibody fragment consisting of VL and VH domains of one arm of antibody. Fv fragment is generally considered to be the smallest antibody fragment that can form a complete antigen-binding site. It is generally believed that 6 CDRs confer antigen-binding specificity to an antibody. However, even a variable region (e.g., an Fd fragment containing only 3 antigen-specific CDRs) is able to recognize and bind an antigen, although its affinity may be lower than that of the complete binding site.

[0131] As used herein, the term "scFv" refers to a single polypeptide chain comprising VL and VH domains, wherein the VL and VH are connected by a linker (see, for example, Bird et al., Science 242: 423 -426 (1988) ; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988) ; and Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Eds. Roseburg and Moore, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) ) . Such scFv molecules can have the general structure: NH2 -VL-linker-VH-COOH or NH 2 -VH-linker-VL-COOH. Suitable prior art linkers consist of repeated GGGGS amino acid sequences or variants thereof. For example, the used linker can be the amino acid sequence (GGGGS) 4 , but also variants thereof (Holliger et al. (1993) , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448) . Other linkers useful in the present invention are described by Alfthan et al. (1995) , Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001) , Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996) , Cancer Res. 56: 3055-3061, described by Kipriyanov et al. (1999) , J. Mol. Biol. 293: 41-56 and Roovers et al. (2001) , Cancer Immunol. In some cases, a disulfide bond may also exist between the VH and VL of the scFv. In certain embodiments of the present invention, the scFv can form a di-scFv, which refers to an antibody formed with two or more single scFvs connected in series. In certain embodiments of the present invention, the scFv can form (scFv) 2 , which refers to an antibody formed with two or more single scFvs connected in parallel.

[0132] As used herein, the term “diabody” refers to an antibody whose VH and VL domains are expressed on a single polypeptide chain, but the linker used is too short to allow pairing between the two domains on the same chain, which forces the domains to pair with the complementary domains of the other chains and generate two antigen-binding sites (see, for example, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) , and Poljak R. J. et al., Structure 2: 1121-1123 (1994) ) .

[0133] As used herein, the term “single-domain antibody (sdAb) ” has the common meaning as generally understood by those skilled in the art, and refers to an antibody fragment consisting of a single monomeric variable antibody domain (e.g., a single heavy chain variable region) , which retains the ability to specifically bind to the same antigen to which the full-length antibody binds. The single domain antibody is also called nanobody.

[0134] As used herein, the term “chimeric antibody” refers to such an antibody, in which the variable region sequence is derived from one species and the constant region sequence is derived from another species, such as the antibody in which the variable region sequence is derived from a mouse antibody and the constant region sequence is derived from a human antibody

[0135] Each of the above antibody fragments retains the ability to specifically bind to the same antigen to which the full-length antibody binds and / or competes with the full-length antibody for specific binding to the antigen.

[0136] An antigen-binding fragment of an antibody (e.g., the antibody fragment described above) can be obtained from a given antibody (e.g., an antibody provided by the present invention) using conventional techniques known to those skilled in the art (e.g., recombinant DNA technology or enzymatic or chemical fragmentation methods) and the antigen-binding fragment of the antibody are screened for specificity in the same manner as for intact antibodies.

[0137] The antigen-binding fragments of the present invention can be obtained by hydrolyzing intact antibody molecules (see Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24: 107-117 (1992) and Brennan et al., Science 229: 81 (1985) ) . Besides, these antigen-binding fragments can also be produced directly from recombinant host cells (reviewed in Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11: 548-557 (1999) ; Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000) ) . For example, Fab’ fragments can be obtained directly from host cells; Fab’ fragments can be chemically coupled to form F (ab’) 2 fragments (Carter et al., Bio / Technology, 10: 163-167 (1992) ) . In addition, Fv, Fab or F (ab’) 2 fragments can also be directly isolated from the cell culture of the recombinant host cell. Those of ordinary skill in the art are well aware of other techniques for preparing such antigen-binding fragments.

[0138] In the present invention, algorithms for determining sequence identity and percent sequence similarity are, for example, BLAST and BLAST 2.0 algorithms, respectively, described in Altschul et al. (1977) Nucl. Acid. Res. 25: 3389-3402 and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, respectively. BLAST and BLAST 2.0 can be used to determine percent of amino acid sequence identity of the present invention using, for example, those described in the literature or default parameters. Software to perform BLAST analyses is available to the public through the National Center for Biotechnology Information (NCBI) .

[0139] In the present invention, the mutant of the amino acid sequence refers to the one which has identity of more than 70%, such as more than 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%to the amino acid sequence, e.g., sequences with 3, 2 or 1 substitution, deletion or addition of amino acids. Preferably, no more than 3 amino acids are substituted, added or deleted. More preferably, no more than 2 amino acids are substituted, added or deleted. Most preferably, no more than 1 amino acid is substituted, added or deleted.

[0140] A "substitutional" mutant is one in which at least one amino acid residue in the native sequence has been removed and a different amino acid inserted in its same position. The substitutions can be single, wherein only one amino acid is substituted in the molecule, or multiple, wherein the same molecule has two or more amino acids substituted. Multiple substitutions can be made at consecutive sites. Likewise, one amino acid may be substituted by multiple residues, wherein such mutants include both substitutions and insertions. An "insertion" (or "additive" ) mutant is one in which one or more amino acids are inserted into a particular position immediately adjacent to a native sequence. Immediately adjacent to an amino acid means attachment to the alpha-carboxyl or alpha-amino functional group of the amino acid. A "deletion" mutant is one in which one or more amino acids in the native amino acid sequence have been removed. Typically, deletion mutants have one or two amino acids deleted in a specific region of their molecule.

[0141] In certain embodiments, less than the theoretical maximum of the drug moiety is conjugated to the antibody in the conjugation reaction. In general, antibodies do not contain many free and reactive cysteine thiol groups that can link drug moieties; in fact, most cysteine thiol groups in antibodies exist as disulfide bridges. In certain embodiments, the antibody can be reduced with a reducing agent such as dithiothreitol (DTT) or tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) under partially or fully reducing conditions to generate reactive cysteine thiol groups.

[0142] The twenty conventional amino acids involved herein have been written in accordance with conventional usage. See, for example, Immunology-ASynthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991) ) , which is incorporated herein by reference. In the present invention, the terms “polypeptide” and “protein” have the same meaning and are used interchangeably. And in the present invention, amino acids are generally represented by one-letter and three-letter abbreviations well known in the art. For example, alanine can be represented by A or Ala.

[0143] In the present invention, the term “amino acid residue” refers to a remaining incomplete amino acid structure that is formed after the amino group of an amino acid loses a hydrogen and the carboxyl group of the amino acid loses a hydroxyl group, and has an amino end and a carbonyl end. In the present invention, L3 is an amino acid residue or a peptide composed of 2 to 10 (preferably 2 to 4) amino acid residues, wherein the types of 2 to 10 (preferably 2 to 4) amino acids can be the same or different from each other. For example, if L3 is a peptide residue consisting of 4 amino acid residues, and the amino acids are selected from the group consisting of glycine and phenylalanine, then L3 can be the following peptide residue: glycine-glycine-phenylalanine-glycine (Gly-Gly-Phe-Gly) , specifically, it can be

[0144] In the present invention, the term "pharmaceutically acceptable salt" refers to (i) a salt of the acidic function present in the compound or conjugate provided by the present invention with a suitable inorganic or organic cation (base) , and includes, but not limited to, salts formed with alkali metal , such as salts formed with sodium, potassium, lithium , etc.; salts formed with alkaline earth metal salt, such as salts formed with calcium , magnesium , etc.; salts formed with other metal, such as salts formed with aluminum , iron, zinc, copper, nickel, cobalt, etc.; inorganic alkali salts, such as ammonium salts; organic base salts such as tert-octylamine salt, dibenzylamine salt, morpholine salt, glucosamine salt, phenylglycine alkyl ester salt, ethylenediamine salt, N-methylglucosamine salt, guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N, N '-dibenzyl ethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt, piperazine salt, tetramethylamine salt, tris (hydroxymethyl) aminomethane salt. and (ii) salts of the basic functional groups present in the compounds or conjugates provided by the present invention with suitable inorganic or organic anions (acids) , and include, but are not limited to, hydrohalogenates such as hydrofluorates, hydrochlorides, hydrobromides, hydroiodates, and the like; inorganic acid salts such as nitrate, perchlorate, sulfate, phosphate, etc.; lower alkanesulfonates, such as methanesulfonates, trifluoromethanesulfonates, ethanesulfonates, etc.; aryl sulfonates, such as benzenesulfonates, p-benzenesulfonates, etc.; organic acid salts such as acetate, malate, fumarate, succinate, citrate, tartrate, oxalate, maleate, etc.; amino acid salts such as glycine salt, trimethylglycine salt, arginine salt, ornithine salt, glutamate salt, aspartate salt, etc.

[0145] Pharmaceutically acceptable salts may be obtained using standard procedures well known in the art, for example, by reacting a sufficient amount of an alkaline substance with a suitable acid to provide a pharmaceutically acceptable anion, or by reacting a sufficient amount of an acidic substance with a suitable base providing a pharmaceutically acceptable cation.

[0146] In the present invention, solvates represent these forms of compounds or conjugates of the invention: complexes in solid or liquid form formed by coordination with solvent molecules. Hydrate is a specific form of solvate with coordinated water molecules. In the present invention, the hydrate is a preferred solvate.

[0147] The compound or conjugate of the present invention may exist in a specific geometric or stereoisomer form. In the compound or conjugate of the present invention, a chiral center may exist in the drug, in the linker structure, or in the antibody or derivative thereof. In the present invention, all such compounds include cis and trans isomers, (-) -and (+) -enantiomers, (R) -and (S) -enantiomers, diastereomer, (D) -isomer, (L) -isomer, as well as racemic mixture and other mixture thereof, such as enantiomer-or diastereomer-enriched mixture, all fall into the scope of the present invention.

[0148] The optically active (R) -and (S) -isomers as well as the D and L isomers can be prepared by chiral synthesis or chiral reagents or other conventional techniques. If it is desired to obtain an enantiomer of the compound or conjugate of the present invention, it can be prepared by asymmetric synthesis or derivatization with chiral auxiliary, in which the resulting diastereomeric mixture is separated and the auxiliary group is cleaved to provide the pure enantiomer as desired. Alternatively, when the molecule contains a basic functional group (e.g., an amino group) or an acidic functional group (e.g., a carboxyl group) , a diastereomeric salt is formed with a suitable optically active acid or base, and then diastereomeric resolution is performed by conventional methods known in the art, and pure enantiomers can be recovered and obtained. Furthermore, the separation of enantiomers and diastereomers is usually accomplished by chromatography using chiral stationary phases, optionally in combination with chemical derivatization methods (e.g., generation of carbamate from amine) .

[0149] As used herein, unless otherwise stated, the term "prodrug" refers to derivatives that can hydrolyze, oxidize, or otherwise react under biological conditions (in vitro or in vivo) to provide compounds of the present invention. Prodrugs only become active compounds through this reaction under biological conditions, or they do not have or only have low activity in their non-reactive form. Prodrugs can generally be prepared using well known methods, such as those described in Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (1995) 172-178, 949-982 (Manfred E. Wolff, 5th Edition) .

[0150] Methods of preparing various pharmaceutical compositions containing a certain amount of an active ingredient are known or will be obvious to those skilled in the art based on the disclosure of the invention. As described in REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Martin, E. W., ed., Mack Publishing Company, 19th ed. (1995) , the method of preparing the pharmaceutical composition comprises incorporating suitable pharmaceutical excipients, carriers, diluents, releasing agents, etc., which are nontoxic at the doses and concentrations employed to cells or mammals exposed thereto.

[0151] In the present invention, pharmaceutical excipients refer to excipients and additives used in the manufacture of pharmaceutical products and formulations, and refer to substances that have been reasonably assessed in terms of safety in addition to the active ingredient and are included in the pharmaceutical formulation. In addition to excipients, acting as carriers and improving stability, pharmaceutical excipients have important functions such as solubilization, solubilization, sustained and controlled release, and are important components that may affect the quality, safety and efficacy of drugs. According to their sources, they can be divided into natural, semisynthetic and total. According to their functions and uses, they can be divided into: solvents, propellants, solubilizers, cosolvents, emulsifiers, colorants, adhesives, disintegrants, fillers, lubricants, wetting agents, osmotic pressure regulators, stabilizers, glidants, flavors, preservatives, suspensions, coating materials, aromatic agents, anti-adhesives, antioxidants, chelators, penetration enhancers, pH modifying agents, buffers, plasticizers, surfactants, foaming agents, antifoamers, thickening agents, inclusion agents, moisturizers, absorbents, diluents, flocculants and counterflocculants, filter aids, release blockers, release blockers, etc.; according to the route of administration, it can be divided into oral, parenteral, mucosal, transdermal or topical administration, nasal or oral inhalation, and ocular administration, etc. The same pharmaceutical excipient can be used in pharmaceutical formulations with different routes of administration and has different effects and uses.

[0152] In the present invention, the pharmaceutical composition can be made into various suitable dosage forms according to the route of administration. Examples include tablets, capsules, granules, oral solutions, oral suspensions, oral emulsions, powders, tinctures, syrups, injections, suppositories, ointments, creams, pastes, ophthalmic preparations, pills, implants, aerosols, powders, sprays, etc. wherein the pharmaceutical composition or suitable dosage form may contain 0.01 mg to 1000 mg of the antibody drug conjugate of the invention, or a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or solvate of the salt thereof.

[0153] The terms "treatment, " "treating, " "treat, " and the like used herein refer generally to obtaining a desired pharmacological and / or physiological effect. The effect may be prophylactic in terms of completely or partially preventing a disease or symptoms thereof and / or may be therapeutic in terms of partial or complete stabilization or cure of a disease and / or adverse effects caused by the disease. "Treatment" as used herein covers any treatment of a disease in a subject, including: (a) preventing the disease or symptoms from occurring in a subject who is predisposed to the disease or symptoms but has not yet been diagnosed as having it; (b) inhibiting the symptoms of a disease, i.e., arresting its development; or (c) relieving the symptoms of a disease, i.e., causing regression of the disease or symptoms.

[0154] In the present invention, "subject" refers to a vertebrate. In certain embodiments, vertebrate refers to a mammal. Mammals include, but are not limited to, livestock (such as cattle) , pets (such as cats, dogs, and horses) , primates, mice, and rats. In certain embodiments, the mammal refers to a human.

[0155] In the present invention, "effective amount" refers to an amount effective to achieve the desired therapeutic or prophylactic effect at the necessary dose and time. The "therapeutically effective amount" of a substance / molecule of the present invention may vary depending on factors such as the disease state, age, sex and weight of the individual and the ability of the substance / molecule to elicit a desired response in the individual. A therapeutically effective amount also encompasses an amount in which any toxic or detrimental consequences of the substance / molecule are outweighed by the therapeutically beneficial effects. The "prophylactically effective amount" refers to an amount effective at the necessary dose and time to achieve the desired prophylactic effect. Usually, but not necessarily, the prophylactically effective amount will be less than the therapeutically effective amount because the prophylactic dose is administered to the subject prior to the onset of the disease or at an early stage of the disease. In the case of cancer, the therapeutically effective amount of the drug reduces the number of cancer cells; shrinks the tumor size; inhibits (i.e., slows to some extent, preferably stops) infiltration of cancer cells into surrounding organs; inhibits (i.e., slows to some extent, preferably stops) tumor metastasis; inhibits tumor growth in some degree; and / or alleviates one or more symptoms associated with cancer in some degree.

[0156] In the present invention, unless otherwise explicitly stated, the expression "... each independently selected from" used herein can mean that the specific options expressed by the same or different symbols in different groups do not affect each other, or that the specific options expressed by the same or different symbols in the same group do not affect each other.

[0157] The substituents of the compounds of the present invention are disclosed according to the group types or ranges. In particular, the present invention comprises each independent subcombination of the individual members of these group types and ranges. For example, the term "C1-C6 alkyl" specifically refers to the independently disclosed methyl, ethyl, C3 alkyl, C4 alkyl, C5 alkyl and C6 alkyl.

[0158] The term "C1-C6 alkyl" refers to an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, preferably "C1-C4 alkyl" , more preferably "C1-C3 alkyl" , most preferably "C1-C2 alkyl" . Examples of "C1-C6 alkyl" include, but are not limited to, methyl, ethyl, propyl (e.g., n-propyl, isopropyl) , butyl (e.g., n-butyl, isobutyl, tert-butyl) , pentyl (e.g., n-pentyl, isopentyl, neopentyl) , and the like. Examples of "C1-C4 alkyl" include, but are not limited to, methyl, ethyl, propyl (e.g., n-propyl, isopropyl) , butyl (e.g., n-butyl, isobutyl, tert-butyl) , and the like. Examples of "C1-C3 alkyl" include methyl, ethyl, propyl (e.g., n-propyl, isopropyl) and the like. Examples of "C1-C2 alkyl" include methyl, ethyl.

[0159] The term "C1-C6 alkoxy" refers to any of the above-mentioned C1-C6 alkyl groups connected to the remainder of the molecule through an oxygen atom (-O-) , examples including methoxy, ethoxy, isopropoxy, and the like.

[0160] The term "C1-C6 alkylthio" refers to a group obtained by replacing an oxygen atom with a sulfur atom in any of the above-mentioned C1-C6 alkoxy groups, such as a C1-C6 alkylthio group, a C1-C4 alkylthio group, a C1-C3 alkylthio group, and the like.

[0161] The term "C3-C6 cycloalkyl" refers to a saturated monocyclic or polycyclic cyclic hydrocarbon substituent comprising from 3 to 6 carbon atoms, and non-limiting examples include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, and the like.

[0162] The term "deuterated C1-C6 alkyl" refers to a group formed after substitution of one or more hydrogen atoms in any of the above C1-C6 alkyl groups with a deuterium atom, such as -CD3.

[0163] The term "halogen" refers to fluorine, chlorine, bromine, iodine.

[0164] The term "substituted" means that any one or more hydrogen atoms on the specified atom or group are replaced by the selection of the specified group, provided that the normal valence state of the specified atom is not exceeded.

[0165] The term "heteroaryl" refers to an aromatic monocyclic group, a bicyclic group, and a tricyclic group or more-membered cyclic group having at least one heteroatom (N, O, or S) in at least one ring, the heteroatom-containing ring optionally also having 1, 2, or 3 heteroatoms selected from N, O, or S, and is a heteroaryl group of a bicyclic or tricyclic or more rings, requiring each of the bicyclic or tricyclic or polycyclic ring to constitute an aromatic system. For example, "5-6-membered heteroaryl" means a 5-or 6-membered aromatic monocyclic group, bicyclic group and tricyclic group or more cyclic group having at least one heteroatom (N, O or S) in at least one ring, and non-limiting examples thereof are, for example, pyridyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, imidazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, thiazolyl, pyrrolyl, furyl, oxazolyl, isoxazolyl, pyrazolyl, thiophenyl. For example, the term "6-10-membered heteroaryl" refers to an aromatic monocyclic group, a bicyclic group and a tricyclic group or more cyclic group having at least one heteroatom (N, O or S) in at least one ring, and non-limiting examples thereof are, for example, pyridyl, pyrimidazinyl, pyridazinyl, indolyl, imidazolyl, phenyl-pyrrolyl, phenyl-furyl, benzofuranyl, benzothiophenyl, benzimidazolyl, indazolyl, isoquinolinyl, etc., wherein the "9-10-membered heteroaryl" is preferred.

[0166] The term "heteroarylene" has the same meaning and refers to a divalent group obtained by the removal of one hydrogen atom from the heteroaryl group described above.

[0167] The term "direct bond" means that the groups on both sides are directly connected, for example, in the compound shown in formula I, i.e., Lg-L1-L2-L3-L4-D, if L4 is a direct bond, the structure of the compound represented by formula I will become Lg-L1-L2-L3-D.

[0168] Description of Attached Figures

[0169] Figure 1: HPLC-SEC results for Trastuzumab-SD1-VA-DXd.

[0170] Figure 2: HPLC-SEC results of Trastuzumab-SD1-PEG-VA-DXd.

[0171] Figure 3: HPLC-SEC results for Trastuzumab-SD2-VA-DXd.

[0172] Figure 4-1: HPLC-SEC results of Trastuzumab-SD2-VA-iCPT.

[0173] Figure 4-2: HPLC-SEC results of Trastuzumab-SD2-VA-iCPT-iso.

[0174] Figure 5: HT29 model cell binding activity.

[0175] Figure 6: MKN45 model cell binding activity.

[0176] Figure 7: Cell binding activity of N87 model cells.

[0177] Figure 8: Inhibitory activity of A375 model cell proliferation, in which Toxin is compound DXd.

[0178] Figure 9: MKN45 model cell proliferation inhibitory activity, in which Toxin is compound DXd.

[0179] Figure 10: N87 model cell proliferation inhibition activity, in which Toxin is compound DXd.

[0180] Figure 11: Proliferation inhibitory activity of N87 model cells.

[0181] Figure 12: Effect of ADC on tumor volume in HT29 model mice.

[0182] Figure 13: Effect of ADC on body weight of HT29 model mice.

[0183] Figure 14: Effect of ADC on tumor volume in NCI-N87 model mice.

[0184] Figure 15: Effect of ADC on body weight of NCI-N87 model mice.

[0185] Figure 16: Effect of ADC on tumor volume in NCI-N87 model mice.

[0186] Figure 17: Effect of ADC on body weight in NCI-N87 model mice.

[0187] Sequence Information

[0188] The information of some of the sequences involved in the present invention is provided in the table below. Examples

[0189] Embodiments of the invention will be described in detail below in connection with the examples, but it will be appreciated by those skilled in the art that the following examples are for the sole purpose of illustrating the invention and should not be regarded as limiting the scope of the invention. Where specific conditions are not indicated in the embodiments, conventional conditions or conditions recommended by the manufacturer were followed. Where no manufacturer is indicated, the reagents or instruments used are conventional products available commercially.

[0190] Example 1: Synthesis of Compound 1g

[0191] Step 1:

[0192] To a 2 L single-necked flask, Fmoc-Alanine (1a, 100 g, 312.20 mmol) and Glycine tert-butyl ester (44.24 g, 337.36 mmol) were weighed and added. 0.6 L of DMF was added and stirred until completely dissolution was achieved. The solution was cooled to -5 to 0℃. HATU (146 g, 383.97 mmol) was weighed and added slowly to the flask. The reaction was carried out at 0℃ for 0.5 h. After half an hour, DIPEA (112 mL, 642.39 mmol) was slowly added while the temperature was controlled below 5℃. After the addition was complete, the reaction was carried out at the same temperature for 0.5 h. Then the reaction solution was transferred to room temperature and reacted for 3 h. The reaction was monitored by TLC to ensure that the raw material Fmoc-Alanine was completely consumed. Water was added to the reaction mixture to precipitate a viscous solid. The mixture was filtered to separate the aqueous phase. The solid was combined and dissolved in ethyl acetate and washed with water. The organic solution was concentrated and evaporated to dryness to obtain 1b (144 g) , which was directly used in the next step. MS [ESI] m / z: 425.21 [M+H] +.

[0193] Step 2:

[0194] 1b (144 g, 318.87 mmol) was dissolved in DMF (0.5 L) . Morpholine (0.28 L, 3.19 mol) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 2 h. The reaction mixture was evaporated to dryness under reduced pressure, and the resulting residue was directly subjected to the next step.

[0195] Step 3:

[0196] Fmoc-Valine (84 g, 247.50 mmol) was dissolved in a mixture of dichloromethane / DMF (1 L / 0.2 L) . The solution was cooled to 0 ℃. HOBT (50 g, 247.50 mmol) and EDCI (72.11 g, 376.16 mmol) were weighed, mixed, and added in batches to the reaction flask. After reacting for 0.5 h, DIPEA (130 mL, 742.51 mmol) was added dropwise to the system while the temperature was maintained within the range of -5 to 0 ℃. Upon completion of the addition, the reaction was continued at this temperature for 1 h. Compound 1c was dissolved and diluted in dichloromethane (300 mL) , then the obtained solution was added dropwise rapidly to the reaction system. The reaction was maintained at the temperature for an additional 1 h, then the reaction solution was transferred to room temperature and reacted for 5 h. The reaction was monitored by TLC to ensure that the raw material was completely consumed. The mixture was cooled directly to 0-5 ℃ to crystallize. The mixture was filtered under low temperature and rinsed with dichloromethane to afford the solid 1d (87 g, 67%yield) . MS [ESI] m / z: 524.28 [M+H] +.

[0197] Step 4:

[0198] 1d (87 g, 166.15 mmol) and anisole (35.93 g, 332.30 mmol) were added to dichloromethane (0.5 L) and stirred. Trifluoroacetic acid (124 mL) was added dropwise slowly. The mixture was stirred and reacted at room temperature for 5 h. The reaction solution was evaporated to dryness under reduced pressure. Ethyl acetate (300 mL) was added to the resulting solid, and the mixture was stirred and triturated. After cooling, the mixture was filtered under reduced pressure to afford solid 1e (70 g, 90%yield) . MS [ESI] m / z: 468.21 [M+H] +.

[0199] Step 5:

[0200] 1e (70 g, 149.73 mmol) and acetic acid (26.97 g, 449.18 mmol) were added to DMF (500 mL) and stirred to dissolve. The atmosphere was replaced with nitrogen three times. Anhydrous copper (II) acetate (2.72 g, 14.97 mmol) and lead (IV) acetate (79.66 g, 179.67 mmol) were added and stirred for 3 min. The mixture was heated to 60 ℃ and reacted for 4 h. The reaction was monitored by TLC to ensure that the raw material acetic acid was completely consumed. Ethyl acetate (4 L) was added to the reaction mixture, followed by stirring for 10 min and filtration. The filtrate was washed with water twice, dried, and concentrated to remove the majority of solvent. The residue was triturated with ethyl acetate, filtered, and the filter cake was dried to afford the product 1f (55 g, 76%yield) . MS [ESI] m / z: 482.23 [M+H] +.

[0201] Step 6:

[0202] 1f (55 g, 114.21 mmol) and pyridinium p-toluenesulfonate (2.86 g, 28.55 mmol) were dissolved in 1, 2-dichloroethane (650 mL) . Benzyl glycolate (199.29 g, 1.20 mol) was added, and the mixture was refluxed at 85 ℃. Hot water (50 ℃, 500 mL) was added to the reaction mixture. The organic layer was separated, evaporated to dryness, and purified by column chromatography (eluent: dichloromethane / methanol = 100: 1, v / v) to afford 1g (52 g, 77%yield) . MS [ESI] m / z: 588.27 [M+H] +.

[0203] Example 2: Synthesis of Compound 2c

[0204] Step 1

[0205] 1g (35 g, 59.56 mmol) was weighed and placed into a 2 L flask. THF (600 mL) and methanol (600 mL) were added. The mixture was heated to 45 ℃ and stirred until complete dissolution occurred. The solution was cooled to 25 ℃. The atmosphere was replaced with nitrogen. 10%Palladium on carbon (Pd / C) (6.8 g) was added. The flask was purged with nitrogen once, followed by two hydrogen purges. The mixture was reacted at room temperature under a hydrogen balloon. After 5 h, the reaction was monitored by TLC, confirming complete consumption of the starting material. The hydrogen atmosphere was vented. The mixture was heated to 50 ℃ to ensure complete dissolution of the product. The mixture was filtered in batches while hot through a pad of Celite, and rinsed three times with a mixture of dichloromethane / methanol (1: 1, v / v) . The rinses were monitored to ensure no significant product spot was observed. The filtrates were combined and concentrated. The residue was triturated with ethyl acetate for 0.5 h, cooled, and filtered. The filter cake was dried at 85 ℃ and weighed to afford 2a (23 g, 84%yield) . MS [ESI] m / z: 498.22 [M+H] +.

[0206] Step 2

[0207] 2a (2.2 g, 3.98 mmol) was weighed into a single-necked flask and dissolved in DMF (30 mL) . Exatecan mesylate (2.12 g, 3.98 mmol) was weighed and added, and the mixture was stirred evenly. The solution was cooled to 0-5 ℃. HATU (1.9 g, 5 mmol) was added. The mixture was maintained at this temperature to react for 0.5 h. DIPEA (2.43 mL, 13.93 mmol) was added dropwise. Upon completion of the addition, the reaction was continued at the temperature for 1 h, then the reaction solution was transferred to room temperature to react. The reaction was monitored by TLC until complete consumption of the starting material was confirmed. Water was added to the reaction mixture to precipitate a solid. The mixture was filtered, dissolved, and purified by column chromatography (eluent: dichloromethane / methanol = 40: 1, v / v) . The eluate was concentrated and dried to afford a pale yellow solid 2b (3.64 g, 48%yield) . MS [ESI] m / z: 915.37 [M+H] +.

[0208] Step 3

[0209] 2b (0.4 g, 437.16 μmol) was weighed, tetrahydrofuran (25 mL) was added and stirred to dissolve.

[0210] Diethylamine (2 mL) was added, and the mixture was stirred at 25 ℃. After 5 h, near-complete consumption of the starting material was observed. The mixture was concentrated to dryness. A portion of dichloromethane was added to dissolve the residue. n-hexane was added to slurry the mixture and precipitate the product. A portion of the dichloromethane was removed by concentration. n-hexane was added, and the mixture was filtered to obtain filter cake 2c (0.3 g, 82%yield) . MS [ESI] m / z: 693.30 [M+H] +.

[0211] Example 3: Synthesis of Compound SD1

[0212] Step 1

[0213] 2-Bromo-4-iodoaniline (3a, 30 g, 100.70 mmol) and 1, 8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU) (30.06 mL, 201.40 mmol) were weighed and added to a 1 L single-necked reaction flask. Toluene (200 mL) was added, and the mixture was stirred to dissolve. After complete dissolution, carbon disulfide (12.07 mL, 201.40 mmol) was added slowly to the flask. The atmosphere was replaced with nitrogen three times. The mixture was refluxed at 80 ℃ for 24 h. The reaction was monitored by TLC, confirming complete consumption of the starting material 2-bromo-4-iodoaniline. The mixture was cooled to room temperature and was directly subjected to the next step.

[0214] Step 2

[0215] Potassium carbonate (30.88 g, 223.45 mmol) was added to the above reaction solution, followed by 200 mL of DMF. The mixture was stirred for 10 min, and then iodoethane (16.25 mL, 203.14 mmol) was slowly added dropwise. The flask was purged with nitrogen three times, and the mixture was stirred at room temperature. The reaction was monitored by TLC until compound 3b was completely consumed. After completion, the reaction was quenched with 500 mL of water and extracted with ethyl acetate (300 mL x 3) . The combined organic phases were washed twice with saturated sodium chloride solution. After separation, the organic phase was partially concentrated. The organic phase was then purified by silica gel pad filtration. The filtrate was concentrated, and 5 volumes of n-hexane were added, followed by reflux until complete dissolution. The solution was cooled to precipitate crystals, which were collected by suction filtration. The filter cake was dried to obtain 19.7 g of white solid 3c, yield 71%.

[0216] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.30 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 7.78 (d, J = 8.6 Hz, 1H) , 7.61 (dd, J =8.6, 2.1 Hz, 1H) , 3.36 (dd, J = 14.6, 7.3 Hz, 3H) , 1.42 (t, J = 7.3 Hz, 3H) .

[0217] Step 3

[0218] Compound 3c (19.7 g, 71.85 mmol) and ammonium heptamolybdate (19.86 g, 33.77 mmol) were added to a 1 L reaction flask, followed by 200 mL of ethanol. The reaction mixture was cooled to 0-5℃ in an ice-water bath, and 85 mL of hydrogen peroxide (30%) was slowly added dropwise. After the addition was complete, the mixture was stirred in an ice-water bath for 1 h and then allowed to warm to room temperature with stirring. The reaction was monitored by TLC until compound 3c was completely consumed. A large amount of solid precipitated from the reaction solution. Workup: The mixture was directly filtered, and the filter cake was washed twice with water. The filter cake was then dissolved in ethyl acetate, washed twice with water, and separated. The organic phase was concentrated to obtain 20.2 g of white solid 3d, yield 92%.

[0219] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.66 (d, J = 2.0 Hz, 1H) , 8.23 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 7.89 (dd, J =8.8, 2.0 Hz, 1H) , 3.71 (q, J = 7.4 Hz, 2H) , 1.28 (t, J = 7.3 Hz, 3H) .

[0220] Step 4

[0221] Compound 3d (20.2 g, 65.97 mmol) and butynoic acid (12.52 mL, 98.96 mmol) were added to a 1 L reaction flask, followed by 400 mL of triethylamine. The mixture was stirred until dissolved, and then CuI (251.29 mg, 1.32 mmol) was added with stirring. The flask was purged with nitrogen three times, and then bis (triphenylphosphine) palladium (II) dichloride (463.06 mg, 659.72 μmol) was added. The flask was purged with nitrogen three times, and the mixture was heated to 95℃and refluxed for 6 h. The reaction was monitored by TLC until compound 3d was completely consumed. Workup: The triethylamine was directly evaporated to dryness, and the residue was diluted with ice water. The pH was adjusted to 5-6 while maintaining the temperature at approximately 0-5℃. The mixture was extracted with ethyl acetate, and the organic phase was separated and concentrated onto silica gel. The product was purified by column chromatography (eluent: petroleum ether: ethyl acetate = 5: 1, v / v) to obtain 10 g of pale yellow product SD1, yield 43%.

[0222] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.10 (dd, J = 8.6, 0.6 Hz, 1H) , 8.03 (d, J = 1.6 Hz, 1H) , 7.62 (dd, J = 8.6, 1.6 Hz, 1H) , 3.54 (q, J = 7.5 Hz, 2H) , 2.48 (dt, J = 20.4, 7.2 Hz, 4H) , 1.91 –1.77 (m, 2H) , 1.71 (dtd, J = 9.8, 7.1, 5.4 Hz, 2H) , 1.45 (t, J = 7.4 Hz, 3H) .

[0223] Example 4: Synthesis of Compound SD1-PEG

[0224] SD1 (0.3 g, 853.64 μmol) was weighed and dissolved in 10 mL of DMF. The solution was cooled to 0-5℃, and EDCI (212.74 mg, 1.11 mmol) and HOBT (150.00 mg, 1.11 mmol) were added. The mixture was stirred for 25 min, and then DIPEA (0.33 mL, 1.88 mmol) was added dropwise. The reaction was maintained at this temperature for 0.5 h, followed by the addition of amino-hexaethylene glycol-carboxylic acid (301.68 mg, 853.64 μmol) . The mixture was stirred for 1 h and then allowed to react at room temperature. After 1 h, a sample was taken for TLC analysis. Once the starting carboxylic acid was consumed, the reaction mixture was directly purified by reverse-phase column chromatography (C18) using a gradient of water (0.1%TFA) : acetonitrile =10%-75%over 60 min. The purified product was concentrated and lyophilized to obtain SD1-PEG (0.2g, 36%yield) . MS [ESI] m / z: 686.83 [M+H] +.

[0225] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.40 (d, J = 1.6 Hz, 1H) , 8.22 (d, J = 8.6 Hz, 1H) , 7.88 (t, J =5.6 Hz, 1H) , 7.68 (dd, J = 8.6, 1.7 Hz, 1H) , 3.70 (q, J = 7.4 Hz, 2H) , 3.60 (t, J = 6.3 Hz, 2H) , 3.50 (d, J = 2.6 Hz, 16H) , 3.41 (t, J = 5.8 Hz, 2H) , 3.25 –3.15 (m, 2H) , 2.44 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.14 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.73 –1.61 (m, 2H) , 1.56 (dq, J = 9.4, 6.8 Hz, 2H) , 1.28 (t, J = 7.4 Hz, 3H)

[0226] Example 5: Synthesis of Compound SD2

[0227] Step 1

[0228] A potassium hydroxide solution was prepared by slowly adding potassium hydroxide (78 g, 1.39 mol) to 150 mL of water. After dissolving, the solution was cooled to room temperature and added to a 1 L single-necked flask. 2-aminobenzothiazole-6-carboxylic acid 4a (15 g, 77.24 mmol) was weighed and added to the flask. The mixture was stirred to ensure even dispersion and stirred under dark conditions at 100-105℃ for 4 h, resulting in a milky yellow suspension. The reaction mixture was cooled to 0-5℃. Concentrated hydrochloric acid was added, producing fumes, and the mixture was slowly stirred until acidic (pH = 3-4) , causing the precipitation of a large amount of solid. The yellowish-brown suspension was stirred for 15 min, and then filtered to obtain a filter cake, which was washed several times with deionized water. The crude product 4b, 4-amino-3-mercaptobenzoic acid hydrochloride salt, was obtained as a slightly wet, light olive-green-gray solid. This was transferred to another single-necked flask (1 L) and subjected to the next cyclization reaction under nitrogen atmosphere (avoiding light) . The calculation was based on a 100%yield.

[0229] Step 2

[0230] Compound 4b was mixed with 50 mL of ethanol under low light conditions and stirred until homogenous. The mixture was neutralized to pH=7-8 with potassium hydroxide aqueous solution (2 M) . 100 mL of ethanol was added to the resulting light olive-green solution, followed by the addition of potassium ethyl xanthate (18.57 g, 115.82 mmol) . The mixture was stirred at 100-105℃for 3 h, resulting in a light olive-green to yellow fine suspension (adark orange solution with fine greenish-black precipitates) . The reaction mixture was concentrated to obtain a viscous dark orange residue, which was cooled to room temperature and used directly in the next step.

[0231] Step 3

[0232] The material from the previous step was added to a 1 L single-necked flask, followed by 250 mL of DMF. The mixture was stirred until dissolved, and then potassium carbonate (32.01 g, 231.62 mmol) was added. After stirring for 10 min, iodoethane was slowly added dropwise to the reaction solution. The atmosphere was replaced with nitrogen three times, and the mixture was stirred at room temperature overnight. TLC was performed to monitor the complete reaction of 4c. The reaction mixture was slowly added to 500 mL of water to quench the reaction, and extracted with ethyl acetate (300 mL × 2) . The organic phase was concentrated and loaded onto silica gel, eluting with a mobile phase of petroleum ether: ethyl acetate = 10: 1 (v / v) , to give 14 g of white solid 4d, yield 68%.

[0233] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.65 (d, J = 1.7 Hz, 1H) , 8.01 (dd, J = 8.5, 1.8 Hz, 1H) , 7.91 (d, J = 8.5 Hz, 1H) , 4.34 (q, J = 7.1 Hz, 2H) , 3.39 (q, J = 7.3 Hz, 2H) , 1.43 (t, J = 7.3 Hz, 3H) , 1.35 (t, J = 7.1 Hz, 3H) .

[0234] Step 4

[0235] Compound 4d (13 g, 48.62 mmol) was weighed and added to a 1 L reaction flask, followed by 72 mL of methanol and 48 mL of THF. The mixture was stirred until dissolved, and then lithium hydroxide (3.49 g, 145.87 mmol) dissolved in 24 mL of water was slowly added dropwise to the reaction solution. The mixture was stirred at room temperature for 3 h, and a sample was taken for TLC to monitor the complete reaction of 4d. After completion of the reaction, the pH was adjusted to 5-6 with 1 M dilute hydrochloric acid. The reaction solution was slowly added to 300 mL of water, followed by extraction with ethyl acetate (200 mL × 3) and washing with sodium chloride aqueous solution. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated to give 9 g of white solid 4e, yield 77%.

[0236] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.06 (s, 1H) , 8.64 (d, J = 1.7 Hz, 1H) , 8.01 (dd, J = 8.5, 1.8 Hz, 1H) , 7.91 (d, J = 8.5 Hz, 1H) , 3.40 (q, J = 7.3 Hz, 2H) , 1.44 (t, J = 7.3 Hz, 3H) .

[0237] Step 5

[0238] 4e (9 g, 37.81 mmol) and ammonium heptamolybdate (10.39 g, 17.68 mmol) were weighed and added to a 1 L reaction flask. Ethanol (300 mL) was added, and the mixture was stirred in an ice bath for 10 min. Hydrogen peroxide (30%, 150 mL) was added dropwise slowly to the reaction mixture while maintaining the temperature at 0-5℃. After completion of the addition, the mixture was allowed to warm to room temperature and stirred for 12 h. The reaction was monitored by TLC, confirming complete consumption of 4e. Upon completion, the reaction mixture was slowly poured into water (500 mL) to quench the reaction. The mixture was extracted with ethyl acetate (300 mL × 4) and washed with sodium chloride aqueous solution. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated to a certain volume. n-hexane was added and filtered to obtain 8 g of white solid SD2 after drying, with a yield of 78%. The product had poor thermal stability (easily degrades when dried at 80℃) , drying temperature should be at 50℃.

[0239] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.44 (s, 1H) , 9.01 (d, J = 1.6 Hz, 1H) , 8.36 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 8.22 (dd, J = 8.7, 1.7 Hz, 1H) , 3.74 (q, J = 7.3 Hz, 2H) , 1.30 (t, J = 7.3 Hz, 3H) .

[0240] Example 6: Synthesis of Compound SD1-VA-DXd

[0241] SD1 (0.2 g) and compound 2c (374.53 mg) were weighed and dissolved in DMF (16 mL) . The solution was cooled to 0-5 ℃. HATU was added, and the mixture was stirred for 25 min. DIPEA (0.3 mL, 1.71 mmol) was added dropwise. The reaction was maintained at this temperature for 0.5 h, then transferred to room temperature and continued for 1 h. A sample was analyzed by TLC, confirming complete consumption of the carboxylic acid starting material. The crude reaction mixture was directly purified by reverse-phase column chromatography (C18) , with water (0.1%TFA) : acetonitrile = 10%-75%, 60 min. The product-containing fractions were combined, concentrated, and lyophilized to afford SD1-VA-DXd (0.2 g, 34%yield) .

[0242] MS[ESI] m / z: 1026.17 [M+H] +

[0243] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.70 (t, J = 6.6 Hz, 1H) , 8.49 (d, J = 8.9 Hz, 1H) , 8.37 (d, J =1.7 Hz, 1H) , 8.20 (d, J = 8.6 Hz, 1H) , 8.05 (d, J = 7.1 Hz, 1H) , 7.84 (d, J = 8.8 Hz, 1H) , 7.78 (d, J = 10.9 Hz, 1H) , 7.66 (dd, J = 8.6, 1.7 Hz, 1H) , 7.31 (s, 1H) , 6.53 (s, 1H) , 5.50 –5.36 (m, 2H) , 5.20 (s, 2H) , 4.63 (d, J = 7.0 Hz, 2H) , 4.20 (q, J = 7.1 Hz, 1H) , 4.10 (dd, J = 8.5, 6.6 Hz, 1H) , 4.00 (s, 2H) , 3.70 (q, J = 7.3 Hz, 2H) , 3.42 –3.37 (m, 2H) , 2.39 (d, J = 1.9 Hz, 3H) , 2.22 (tt, J = 13.5, 6.9 Hz, 4H) , 1.94 –1.80 (m, 2H) , 1.65 (q, J = 7.3 Hz, 2H) , 1.59 –1.53 (m, 2H) , 1.30 –1.24 (m, 7H) , 1.19 (d, J = 7.1 Hz, 3H) , 0.88 (d, J = 7.2 Hz, 3H) , 0.79 (dd, J = 8.5, 6.8 Hz, 6H) .

[0244] Example 7: Synthesis of compound SD1-PEG-VA-DXd

[0245] SD1-PEG (0.2 g) and compound 2c (201.72 mg) were weighed and dissolved in DMF (16 mL) . The solution was cooled to 0-5 ℃. HATU was added, and the mixture was stirred for 25 min. DIPEA (0.15 mL, 873.58 μmol) was added dropwise. The reaction was maintained at this temperature for 0.5 h, then transferred to room temperature and continued for 1 h. The reaction was monitored by TLC, confirming complete consumption of the carboxylic acid starting material. The reaction solution was directly purified by reverse-phase column chromatography (C18) , with water (0.1%TFA) : acetonitrile = 10%-75%, 60 min. After concentration and lyophilization, 0.1 g of SD1-PEG-VA-DXd was obtained, yield 25%. MS [ESI] m / z: 1361.55 [M+H] +.

[0246] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.69 (t, J = 6.6 Hz, 1H) , 8.49 (d, J = 8.9 Hz, 1H) , 8.40 (dd, J =5.4, 1.7 Hz, 1H) , 8.22 (dd, J = 8.6, 4.6 Hz, 1H) , 8.05 (d, J = 7.1 Hz, 1H) , 7.87 (d, J = 5.9 Hz, 1H) , 7.68 (ddd, J = 8.6, 4.8, 1.7 Hz, 1H) , 7.32 (s, 1H) , 6.53 (s, 1H) , 5.60 (q, J = 6.9, 6.4 Hz, 1H) , 5.43 (d, J = 2.6 Hz, 2H) , 5.20 (s, 2H) , 4.62 (tt, J = 10.1, 5.1 Hz, 2H) , 4.20 (p, J = 7.0 Hz, 1H) , 4.12 (dd, J = 8.6, 6.6 Hz, 1H) , 3.99 (s, 2H) , 3.73 –3.68 (m, 2H) , 3.60 –3.55 (m, 2H) , 3.49 (q, J = 2.5 Hz, 21H) , 3.44 –3.39 (m, 2H) , 3.20 (q, J = 5.8 Hz, 3H) , 2.47 –2.32 (m, 4H) , 2.16 (dt, J = 19.3, 6.6 Hz, 4H) , 1.86 (tt, J = 14.3, 7.0 Hz, 3H) , 1.61 (ddt, J = 36.9, 9.4, 6.7 Hz, 5H) , 1.31 –1.23 (m, 7H) , 1.19 (d, J = 7.1 Hz, 3H) , 0.87 (t, J = 7.4 Hz, 3H) , 0.77 (dd, J = 9.7, 6.8 Hz, 6H) .

[0247] Example 8: Synthesis of compound SD2-VA-DXd

[0248] SD2 (0.14 g) and compound 2c (305.64 mg) were weighed and dissolved in DMF (16 mL) . The solution was cooled to 0-5 ℃. HATU was added, and the mixture was stirred for 25 min. DIPEA (0.24 mL, 1.39 mmol) was added dropwise. The reaction was maintained at this temperature for 0.5 h, transferred to room temperature, and continued for 1 h. The reaction was monitored by TLC, confirming complete consumption of the carboxylic acid starting material. The reaction solution was directly purified by reverse-phase column chromatography (C18) , with water (0.1%TFA) : acetonitrile = 10%-75%, 60 min. After concentration and lyophilization, 0.44 g of the product SD2-VA-DXd was obtained, yield 34%. MS [ESI] m / z: 946.29 [M+H] +.

[0249] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.80 (d, J = 1.7 Hz, 1H) , 8.72 (t, J = 6.6 Hz, 1H) , 8.50 (d, J =8.5 Hz, 2H) , 8.27 (dd, J = 21.7, 7.9 Hz, 2H) , 8.12 (dd, J = 8.7, 1.7 Hz, 1H) , 7.70 (d, J = 10.9 Hz, 1H) , 7.28 (s, 1H) , 6.54 (s, 1H) , 5.56 (dd, J = 9.1, 5.7 Hz, 1H) , 5.47 –5.33 (m, 2H) , 5.20 –4.99 (m, 2H) , 4.64 (d, J = 6.5 Hz, 2H) , 4.26 (dt, J = 14.1, 7.4 Hz, 2H) , 4.01 (s, 2H) , 3.71 (q, J = 7.3 Hz, 2H) , 3.23 –3.02 (m, 2H) , 2.35 –2.31 (m, 3H) , 2.16 (q, J = 6.6 Hz, 2H) , 2.13 –1.97 (m, 1H) , 1.91 –1.74 (m, 2H) , 1.28 (t, J = 7.3 Hz, 3H) , 1.22 (d, J = 6.9 Hz, 3H) , 0.92 –0.81 (m, 9H) .

[0250] Example 9-1: Synthesis of compound SD2-VA-iCPT

[0251] Synthesis of Compound 2

[0252] Anhydrous THF (750 mL) and magnesium powder (11.90 g, 0.49 mol) were added into a 2 L four-necked flask. The mixture was cooled to 0-10 ℃ in an ice-water bath. Trimethylchlorosilane (106.42 g, 0.98 mol) was added dropwise while maintaining the temperature at 0-10 ℃, followed by dropwise addition of CPd1 (50 g, 0.245 mol) under identical temperature control. The mixture was stirred and reacted at 0-10 ℃ for 30 min. Completion was confirmed by TLC (n-hexane / ethyl acetate = 25: 1; Rf: compound 1 = 0.3, product = 0.5) . The mixture was filtered to obtain a pale yellow solution as a crude product, which was used directly in the next step.

[0253] Synthesis of Compound 3

[0254] Anhydrous THF (220 mL) , tetrabutylammonium difluorotriphenylsilicate (26.45 g, 0.049 mol) , and D2O (98 g, 4.9 mol) were added to a 2 L four-necked flask. The mixture was cooled to 0-10 ℃in an ice-water bath. The crude CPd2 solution was added dropwise. After complete addition, the mixture was warmed to room temperature and stirred for 30 min. Reaction completion was monitored by TLC (n-hexane / ethyl acetate = 25: 1; Rf CPd3 = 0.3) . The mixture was concentrated under reduced pressure until no distillate was observed, yielding the crude product (100.5 g) . After purification by normal phase chromatography, 40.2 g of yellow liquid CPd3 was obtained, with a total yield of 85%over two steps.

[0255] CPd3: C9H7DF2O2

[0256] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.01 (d, J = 8.9 Hz, 2H) , 7.13 (d, J = 9.0 Hz, 2H) , 3.87 (s, 3H) .

[0257] Synthesis of Compound 4:

[0258] A 400 mL of solution of formic acid / triethylamine (5mol: 2mol) , dichloro (mesitylene) ruthenium (II) dimer (CAS 52462-31-4; 1.10 g, 2.14 mmol) , (R, R) -N- (p-toluenesulfonyl) -1, 2-diphenylethylenediamine (chloro) (p-cymene) ruthenium (II) (CAS: 192139-92-7; 4.08 g, 6.42 mmol) , and CPd3 (40.0 g, 0.214 mol) were added in a 2 L four-necked flask. The mixture was heated to 40 ℃ and stirred for 2 h. The reaction was monitored by TLC (n-heptane / ethyl acetate =3: 1; compound 3 Rf = 0.7, compound 4 Rf = 0.5) . Upon complete consumption of starting material, the mixture was recovered to room temperature and diluted with DCM. The organic layer was washed with water four times, followed by saturated aqueous NaCl solution once. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure until no distillate remains. Purification by normal phase column chromatography was performed to obtain 25.5 g of a pale yellow solution, yield 62%..

[0259] CPd4: C9H9DF2O2

[0260] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.33 (d, J = 8.7 Hz, 2H) , 6.93 (d, J = 8.7 Hz, 2H) , 6.07 (d, J =4.2 Hz, 1H) , 4.67 (td, J = 11.7, 3.6 Hz, 1H) , 3.76 (s, 3H) .

[0261] Synthesis of Compound 5:

[0262] DCM (375 mL) , CPd4 (25.0 g, 0.132 mol) , acetic anhydride (20.25 g, 0.198 mol) , and triethylamine (14.69 g, 0.145 mol) were added into a 1 L four-necked flask. The mixture was cooled to 0-10 ℃, and DMAP (8.06 g, 0.066 mol) was added. After complete addition, the reaction was warmed to room temperature. The reaction was monitored by HPLC, indicating complete consumption of starting material after 30 min. The reaction mixture was washed with water twice, and the layers were separated. The organic phase was concentrated under reduced pressure until no distillate was observed, affording CPd5 (27.08 g, 88%yield) .

[0263] CPd5: C11H11DF2O3

[0264] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.38 (d, J = 8.7 Hz, 2H) , 6.97 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 5.89 (t, J =12.2 Hz, 1H) , 3.76 (s, 3H) , 2.13 (s, 3H) .

[0265] Synthesis of Compound 6:

[0266] Purified water (810 mL) , acetonitrile (405 mL) , carbon tetrachloride (405 mL) , CPd5 (27 g, 0.117 mol) , sodium periodate (374.65 g, 1.752 mol) , and ruthenium (III) chloride (1.213 g, 2.85 mmol) were added to a 3 L four-necked flask. The mixture was heated to 30 ℃ and stirred for 16 h. Completion was confirmed by HPLC. The reaction mixture was filtered, and the filtrate was washed with DCM. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure until no distillate was observed to obtain 15.3 g of CPd6, yield 68%.

[0267] CPd6: C5H5DF2O4

[0268] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 5.41 (dd, J = 20.5, 9.3 Hz, 1H) , 2.17 (s, 3H) .

[0269] Synthesis of Compound 8:

[0270] Methanol (150 mL) and CPd6 (15 g) were added in a 1 L four-necked flask. The mixture was cooled to 0-10 ℃ in an ice bath. Lithium hydroxide monohydrate (4.47 g, 0.106 mol) was added, and reacted at room temperature for 30 min. Completion was monitored by TLC (DCM: MeOH = 10: 1, bromocresol green showed yellow, CPd6 Rf = 0.2) . The mixture was filtered, and the filtrate was concentrated until no distillate was observed. The residue was co-evaporated with methanol (twice) , affording crude CPd7 as a black oil. To a new 1L four-necked flask, 150 mL of DMF and CPd7 were added. The solution was adjusted to pH 7-8 with 4M hydrogen chloride in DMF solution at room temperature. Anhydrous potassium carbonate (18.38 g, 0.133 mol) and benzyl bromide (30.24 g, 0.177 mol) were added. After reacting at room temperature for 16 h, completion of the reaction was confirmed by HPLC. Purified water was added, and the reaction solution was extracted with DCM. The organic phase was washed with purified water twice, dried over anhydrous sodium sulfate, and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure until no distillate was observed. Purification by reverse phase preparative chromatography was performed. The preparative solution was concentrated under reduced pressure until no distillate was observed, extracted with DCM, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated until no distillate was observed to obtain 6 g of CPd8, yield 45%..

[0271] CPd8: C10H9DF2O3

[0272] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.44 –7.27 (m, 5H) , 6.53 (d, J = 7.0 Hz, 1H) , 5.21 (s, 2H) , 4.50 (ddd, J = 18.3, 9.6, 6.8 Hz, 1H) .

[0273] Synthesis of Compound 10:

[0274] DMSO (132 mL) , CPd9 (13.31 g, 0.0276 mol) , and compound CPd8 (6 g, 0.0276 mol) were added into a 500 mL four-necked flask. BF3·Et2O (14.73 g, 0.104 mol) was added dropwise. The reaction was monitored by HPLC. After stirring at room temperature for 20 h, HPLC indicated no further increase in product ratio. After the reaction is complete, the reaction mixture was poured dropwise into purified water to precipitate crystals and filtered. The filter cake was dried to afford 18g of crude product.

[0275] CPd10: C34H36DF2N3O7

[0276] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.88 –8.80 (m, 1H) , 8.04 (d, J = 6.9 Hz, 1H) , 7.86 (d, J = 7.6 Hz, 2H) , 7.70 (t, J = 7.3 Hz, 2H) , 7.43 –7.23 (m, 9H) , 5.19 (d, J = 4.3 Hz, 2H) , 4.81 –4.72 (m, 1H) , 4.66 (dd, J = 10.6, 6.4 Hz, 1H) , 4.59 –4.49 (m, 2H) , 4.27 (d, J = 10.3 Hz, 1H) , 4.20 (d, J = 6.3 Hz, 2H) , 3.85 (t, J = 8.0 Hz, 1H) , 2.01 –1.89 (m, 2H) , 1.19 (d, J = 7.5 Hz, 3H) , 0.82 (dd, J = 11.1, 6.7 Hz, 6H) .

[0277] Synthesis of Compound 11

[0278] To a 500 mL four-necked flask was added 120 mL of DMF and CPd 10 (crude product, 18 g) . 1.8 g of 10%palladium on carbon was added. The flask was purged with nitrogen eight times, followed by hydrogen eight times, and the reaction was initiated. The mixture was stirred and reacted at room temperature for 20 hours. HPLC monitoring showed the starting material was less than 5%. The mixture was filtered, purified by reverse-phase preparative chromatography, and lyophilized to give 3.5 g of a white solid, with a two-step yield of 23%.

[0279] CPd11: C27H30DF2N3O7

[0280] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.06 (s, 1H) , 8.78 (s, 1H) , 7.86 (d, J = 7.6 Hz, 2H) , 7.71 (t, J =7.2 Hz, 2H) , 7.34 (dt, J = 36.7, 7.4 Hz, 5H) , 4.84 –4.66 (m, 2H) , 4.37 –4.09 (m, 4H) , 4.02 –3.76 (m, 2H) , 2.13 –1.88 (m, 1H) , 1.19 (d, J = 7.3 Hz, 3H) , 0.81 (dd, J = 11.9, 6.7 Hz, 6H) .

[0281] Synthesis of Compound 14

[0282] To a 100 mL four-necked flask 1 was added 15 mL of DMF, CPd 11 (3.0 g, 5.47 mmol) , and HATU (3.54 g, 9.297 mmol) . The mixture was cooled to 0-10 ℃. To a 100 mL four-necked flask 2 was added 65 mL of DMF, CPd 12 (2.97 g, 5.47 mmol) , and DIPEA (1.767 g, 13.675 mmol) . After dissolution, the solution from flask 2 was added dropwise to flask 1. The reaction was monitored by HPLC. After reacting at 0-10℃ for approximately 30 minutes, HPLC showed that the starting material CPd 11 had disappeared, indicating completion of the reaction. Piperidine (2.32 g, 27.34 mmol) was added to the mixture. The reaction was monitored by HPLC and stirred at room temperature for approximately 6 hours until no starting material remained. The mixture was washed three times with n-hexane. The DMF phase was purified by reverse-phase preparative chromatography and lyophilized to yield 2.4 g of a yellow solid, with a yield of 55%.

[0283] CPd14: C36H40DF3N6O8

[0284] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.05 (t, J = 6.7 Hz, 1H) , 8.83 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 8.57 (d, J =7.1 Hz, 1H) , 8.03 (d, J = 5.5 Hz, 3H) , 7.81 (d, J = 11.0 Hz, 1H) , 7.32 (s, 1H) , 6.55 (s, 1H) , 5.61 (dt, J = 9.3, 5.3 Hz, 1H) , 5.41 (d, J = 2.1 Hz, 2H) , 5.22 (d, J = 18.9 Hz, 1H) , 5.08 (d, J = 19.0 Hz, 1H) , 4.79 –4.64 (m, 2H) , 4.40 (dd, J = 18.7, 8.3 Hz, 1H) , 4.31 (p, J = 7.1 Hz, 1H) , 3.19 (q, J = 6.4, 5.8 Hz, 2H) , 2.40 (d, J = 1.9 Hz, 3H) , 2.20 (ddd, J = 15.3, 11.4, 5.7 Hz, 2H) , 1.97 (dt, J = 13.3, 6.7 Hz, 1H) , 1.90 –1.81 (m, 2H) , 1.23 (d, J = 7.0 Hz, 3H) , 0.88 (t, J = 7.3 Hz, 3H) , 0.81 (t, J = 6.8 Hz, 6H) .

[0285] Synthesis of SD2-VA-iCPT

[0286] To a 100 mL four-necked flask was added 19.2 mL of DMF, CPd 15 (0.876 g, 3.23 mmol) , EDCI (1.238 g, 6.46 mmol) , HOBt (0.873 g, 6.46 mmol) , and CPd 14 (2.4 g, 3.23 mmol) . The mixture was cooled to 0-10℃, and DIPEA (1.044 g, 8.075 mmol) was added. The reaction was monitored by HPLC. After reacting at 0-10 ℃ for approximately 30 minutes, HPLC analysis showed no CPd 14 remaining. The mixture was purified by reverse-phase preparative chromatography. The solution from preparative chromatography was concentrated under reduced pressure, extracted with DCM, and concentrated under reduced pressure to a volume of 6 mL. The concentrated mixture was added dropwise to a (n-heptane: methyl tert-butyl ether = 1: 1) solution to precipitate crystals. The solid was collected by suction filtration to give 1.8 g, with a yield of 54%.

[0287] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.91 (t, J = 6.8 Hz, 1H) , 8.83 –8.72 (m, 2H) , 8.44 (d, J = 8.2 Hz, 1H) , 8.26 (dd, J = 16.6, 7.7 Hz, 2H) , 8.10 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H) , 7.66 (d, J = 10.9 Hz, 1H) , 7.27 (s, 1H) , 6.50 (s, 1H) , 5.56 (dt, J = 9.6, 5.5 Hz, 1H) , 5.47 –5.32 (m, 2H) , 5.15 –4.99 (m, 2H) , 4.81 –4.66 (m, 2H) , 4.43 (dd, J = 18.3, 7.9 Hz, 1H) , 4.29 (t, J = 7.7 Hz, 1H) , 4.19 (q, J = 7.0 Hz, 1H) , 3.74 (q, J = 7.3 Hz, 2H) , 3.10 (dq, J = 17.2, 10.6, 8.6 Hz, 2H) , 2.30 (d, J = 2.0 Hz, 3H) , 2.18 (q, J = 6.6, 6.2 Hz, 2H) , 2.03 (q, J = 6.8 Hz, 1H) , 1.84 (dt, J = 10.8, 6.7 Hz, 2H) , 1.30 (t, J = 7.4 Hz, 3H) , 1.19 (d, J = 7.1 Hz, 3H) , 0.93 –0.76 (m, 9H) .

[0288] Example 9-2: Synthesis of Compound SD2-VA-iCPT-iso

[0289] Synthesis of Compound 2

[0290] To a 2L four-necked flask were added 750 mL of anhydrous tetrahydrofuran and magnesium powder (11.91 g, 0.49 mol) . The mixture was placed in an ice-water bath and stirred for 20 minutes. Trimethylchlorosilane (106.45 g, 0.98 mol) was added dropwise, followed by Compound 1 (50 g, 0.245 mol) . After 30 minutes, TLC monitoring indicated no starting material remained. The system was filtered under suction to afford a pale yellow crude solution.

[0291] Synthesis of Compound 3

[0292] To a 2L four-necked flask were added 220 ml of anhydrous tetrahydrofuran, tetrabutylammonium difluorotriphenylsilicate (26.44 g, 0.049 mol) , and heavy water (98 g, 4.9 mol) . The mixture was placed in an ice-water bath and stirred for 20 minutes. The crude solution of Compound 2 was added dropwise. After 30 minutes, TLC monitoring indicated no starting material remained. The system was concentrated under reduced pressure to constant weight to afford 96 g of crude product. Purification by normal-phase column chromatography yielded 42 g of Compound 3 as a yellow liquid.

[0293] Synthesis of Compound 4

[0294] To a 2L four-necked flask were added 400 ml of methanol and Compound 3 (40.0 g, 0.214 mol) . Sodium borohydride (11.56 g) was added. After reacting for 2 hours, TLC indicated disappearance of starting material. The system was subjected to preparative purification.

[0295] Isomer Separation and Purification Conditions:

[0296] · Preparative Column: Whelk-O 1 50*250 3.5μm

[0297] · Mobile Phase A: 0.1%Formic acid in water

[0298] · Mobile Phase B: 0.1%Formic acid in methanol

[0299] · Detection: 210 nm

[0300] · Gradient Program:

[0301] Qualified fractions identified by HPLC were combined, concentrated under reduced pressure to constant weight, and lyophilized to afford 12.30 g of product.

[0302] Synthesis of Compound 5

[0303] To a 1L four-necked flask were added 375 ml of dichloromethane (DCM) , Compound 4 (12.00 g, 0.063 mol) , acetic anhydride (9.70 g, 0.095 mol) , and triethylamine (6.98 g, 0.069 mol) . The mixture was placed in an ice-water bath and stirred for 20 minutes. DMAP (3.91 g, 0.032 mol) was added. The reaction was monitored by HPLC; the reaction was complete after approximately 30 minutes. Upon completion, the mixture was washed twice with water. The organic phase was concentrated to constant weight to afford 15.05 g.

[0304] Synthesis of Compound 6

[0305] To a 2L four-necked flask were added 450 ml of H2O, 225 ml of acetonitrile (ACN) , 225 ml of carbon tetrachloride (CCl4) , Compound 5 (15.00 g, 0.065 mol) , sodium periodate (NaIO4, 208.54 g, 0.975 mol) , and ruthenium (III) chloride (RuCl3, 0.67 g, 0.003 mmol) . The reaction mixture was heated to 30℃ and the reaction proceeded for approximately 16 hours. HPLC monitoring indicated disappearance of starting material. The system was filtered under suction and the filtrate was washed with DCM. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure to constant weight to afford 8.20 g of a black crude solution.

[0306] Synthesis of Compound 7

[0307] To a 250 ml four-necked flask were added 80 ml of methanol (MeOH) and Compound 6 (8.00 g, 0.047 mol) . The system was cooled to 0-10℃ in an ice-water bath. Lithium hydroxide monohydrate (2.35 g, 0.056 mol) was added. The reaction proceeded for approximately 30 minutes, and TLC monitoring indicated no starting material remained. The system was filtered under suction and the filtrate was concentrated under reduced pressure to constant weight. The residue was co-evaporated twice with MeOH. The resulting black crude product was used directly in the next step.

[0308] Synthesis of Compound 8

[0309] To a 250 ml four-necked flask were added 100 ml of DMF and the crude Compound 7. The pH was adjusted to 7-8 using a 4M solution of hydrogen chloride in DMF. Anhydrous potassium carbonate (9.81 g, 0.071 mol) and benzyl bromide (30.24 g, 0.177 mol) were added. The reaction was monitored by HPLC and was complete after approximately 16 hours. Upon completion, purified water was added, and the mixture was extracted with DCM. The organic phase was washed twice with purified water, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure to constant weight. The residue was purified by reverse-phase preparative chromatography. The preparative solution was concentrated under reduced pressure, extracted with DCM, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated to constant weight to afford 5.10 g of a solution.

[0310] Synthesis of Compound 10

[0311] To a 500 ml four-necked flask were added 120 ml of DMSO, Compound 9 (11.08 g, 0.023 mol) , Compound 8 (5 g, 0.023 mol) , and boron trifluoride diethyl etherate (BF3·Et2O, 12.21 g, 0.086 mol) . The reaction was monitored by HPLC, and product formation ceased after approximately 16 hours. Upon completion, the reaction mixture was added dropwise to purified water to crystallize. The filter cake was dried under air flow to afford 19.08 g of crude Compound 10.

[0312] Synthesis of Compound 11

[0313] To a 500 ml four-necked flask were added 120 ml of DMF, crude Compound 10 (19.08 g) , and 10%palladium on carbon (2 g) . The mixture was reacted under a hydrogen atmosphere for approximately 16 hours. HPLC monitoring indicated disappearance of starting material. The system was filtered, and the filtrate was purified by reverse-phase preparative chromatography and lyophilized to afford 3.10 g of a white solid.

[0314] Synthesis of Compound 13

[0315] To a 100 ml four-necked flask 1 were added 15 ml of DMF, Compound 11 (3.0 g, 5.47 mmol) , and HATU (3.54 g, 9.297 mmol) . The mixture was cooled to 0-10℃. To a 100 ml flask 2 were added 65 ml of DMF, Compound 12 (2.97 g, 5.47 mmol) , and DIPEA (1.767 g, 13.675 mmol) . The mixture was dissolved. The solution from flask 2 was added dropwise to flask 1. The reaction was monitored by HPLC and was complete (disappearance of Compound 11) after approximately 30 minutes. The reaction mixture was used directly in the next step.

[0316] Synthesis of Compound 14

[0317] Piperidine (2.32 g, 27.34 mmol) was added to the reaction mixture from the previous step. The reaction was monitored by HPLC and was complete (no starting material remained) after approximately 6 hours. The mixture was washed three times with n-hexane. The DMF phase was subjected to reverse-phase preparative purification and lyophilized to afford 2.25 g of a yellow solid.

[0318] Synthesis of Compound SD2-VA-iCPT-iso

[0319] To a 100 ml four-necked flask were added 20 ml of DMF, Compound 15 (0.80 g, 2.96 mmol) , EDCI (1.13 g, 5.92 mmol) , HOBT (0.80 g, 5.92 mmol) , and Compound 14 (2.20 g, 2.96 mmol) . The mixture was cooled to 0-10℃, and DIPEA (0.96 g, 7.40 mmol) was added. The reaction was monitored by HPLC and was complete (disappearance of Compound 14) after approximately 30 minutes. The mixture was purified by reverse-phase preparative chromatography. The preparative solution was concentrated under reduced pressure, extracted with DCM, and concentrated to a certain volume. The concentrate was added dropwise to a solution of n-heptane: methyl tert-butyl ether (1: 1) to crystallize. Filtration under suction was performed to afford 1.2 g of solid.

[0320] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.88 (t, J = 6.7 Hz, 1H) , 8.84 –8.77 (m, 2H) , 8.49 (d, J = 8.2 Hz, 1H) , 8.31 (d, J = 8.7 Hz, 1H) , 8.21 (d, J = 6.9 Hz, 1H) , 8.13 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H) , 7.76 (d, J =10.9 Hz, 1H) , 7.31 (s, 1H) , 6.53 (s, 1H) , 5.57 (q, J = 6.3 Hz, 1H) , 5.43 (s, 2H) , 5.23 (s, 2H) , 4.86 (dd, J = 10.2, 7.1 Hz, 1H) , 4.66 (dd, J = 10.3, 6.3 Hz, 1H) , 4.45 (dd, J = 18.1, 9.4 Hz, 1H) , 4.21 (dt, J = 17.9, 7.4 Hz, 2H) , 3.74 (q, J = 7.4 Hz, 2H) , 3.14 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.35 (s, 3H) , 2.26 –1.97 (m, 3H) , 1.85 (p, J = 6.7 Hz, 2H) , 1.29 (t, J = 7.3 Hz, 3H) , 1.16 (d, J = 7.1 Hz, 3H) , 0.93 –0.82 (m, 9H) .

[0321] Example 10: Preparation of Antibody-Drug Conjugate Trastuzumab-SD1-VA-DXd

[0322] Reduction: Herceptin antibody (20 mg in PBS, pH 7.4; Cytiva) was placed in a 5 mL centrifuge tube. The antibody concentration was adjusted to about 10 mg / mL (final volume about 2 mL) with PBS (pH 7.4) . EDTA (0.1 M; Thermo; 2 μL) was added, followed by TCEP (Sigma) aqueous solution (0.1 M; 27.6 μL, 20.0 equivalents relative to one molecule of antibody) . The mixture was incubated at 37 ℃ for 2 h, thereby reducing the interchain disulfide bonds of the antibody.

[0323] Conjugation: To the reduced mixture above at room temperature, Na2HPO4 aqueous solution (0.2 M, pH 8.8; 1.5 mL) was added to adjust the pH to 8.0. Dimethyl sulfoxide (Sigma; 0.273 mL) and SD1-VA-DXd DMSO solution (15 mM; 0.147 mL, 16.0 equivalents relative to one molecule of antibody) were added. The mixture was stirred and reacted at room temperature overnight (approximately 16 h) . Subsequently, N-acetylcysteine (MCE, catalog number HY-B0215 / CS-2160) aqueous solution (100 mM; 0.044 mL, 32.0 equivalents relative to one molecule of antibody) was added, and the mixture was stirred and reacted for 20 min to terminate the reaction of the drug linker.

[0324] Purification: After conjugation, the ADC mixture was subjected to buffer exchange using a 30 K Amicon Ultra-4 centrifugal filter, eventually exchanged into a solution (10 mM citric acid, 200 mM sucrose, 40 mM NaCl, 0.02 g EDTA, pH 6.0) . The monomer ratio of the buffer-exchanged ADC product was determined to be 97.8%by HPLC-SEC (Figure 1) , and the DAR value was determined to be 7.9 by LC-MS.

[0325] Example 11: Preparation of Antibody-Drug Conjugate Trastuzumab-SD1-PEG-VA-DXd

[0326] Reduction: Herceptin antibody (20 mg in PBS, pH 7.4; Cytiva) was placed in a 5 mL centrifuge tube. The antibody concentration was adjusted to about 10 mg / mL (final volume about 2 mL) with PBS (pH 7.4) . EDTA (0.1 M; Thermo; 2 μL) was added, followed by TCEP (Sigma) aqueous solution (0.1 M; 27.6 μL, 20.0 equivalents relative to one molecule of antibody) . The mixture was incubated at 37 ℃ for 2 h, thereby reducing the interchain disulfide bonds of the antibody.

[0327] Conjugation: To the reduced mixture above at room temperature, Na2HPO4 aqueous solution (0.2 M, pH 8.8; 1.5 mL) was added to adjust the pH to 8.0. Dimethyl sulfoxide (Sigma; 0.273 mL) and SD1-PEG-VA-DXd DMSO solution (15 mM; 0.147 mL, 16.0 equivalents relative to one molecule of antibody) were added. The mixture was stirred and reacted at room temperature overnight (approximately 16 h) . Subsequently, N-acetylcysteine (MCE, catalog number HY-B0215 / CS-2160) aqueous solution (100 mM; 0.044 mL, 32.0 equivalents relative to one molecule of antibody) was added, and the mixture was stirred and reacted for 20 min to terminate the reaction of the drug linker.

[0328] Purification: After conjugation, the ADC mixture was subjected to buffer exchange using a 30 K Amicon Ultra-4 centrifugal filter, eventually exchanged into a solution (10 mM citric acid, 200 mM sucrose, 40 mM NaCl, 0.02 g EDTA, pH 6.0) . The monomer ratio of the buffer-exchanged ADC product was determined to be 98.6%by HPLC-SEC (Figure 2) , and the DAR value was determined to be 8.0 by LC-MS.

[0329] Example 12: Preparation of Antibody-Drug Conjugate Trastuzumab-SD2-VA-DXd

[0330] Reduction: Herceptin antibody (20 mg in PBS, pH 7.4; Cytiva) was placed in a 5 mL centrifuge tube. The antibody concentration was adjusted to about 10 mg / mL (final volume about 2 mL) with PBS (pH 7.4) . EDTA (0.1 M; Thermo; 2 μL) was added, followed by TCEP (Sigma) aqueous solution (0.1 M; 27.6 μL, 20.0 equivalents relative to one molecule of antibody) . The mixture was incubated at 37 ℃ for 2 h, thereby reducing the interchain disulfide bonds of the antibody.

[0331] Conjugation: To the reduced mixture above at room temperature, Na2HPO4 aqueous solution (0.2 M, pH 8.8; 1.5 mL) was added to adjust the pH to 8.0. Dimethyl sulfoxide (Sigma; 0.313 mL) and SD2-VA-DXd DMSO solution (15 mM; 0.107 mL, 12.0 equivalents relative to one molecule of antibody) were added. The mixture was stirred and reacted at room temperature for 1 h. Subsequently, N-acetylcysteine (MCE, catalog number HY-B0215 / CS-2160) aqueous solution (100 mM; 0.044 mL, 32.0 equivalents relative to one molecule of antibody) was added, and the mixture was stirred and reacted for 20 min to terminate the reaction of the drug linker.

[0332] Purification: After conjugation, the ADC mixture was subjected to buffer exchange using a 30 K concentrator (Amicon Ultra-4) (buffer exchange volume was 10 times the reaction volume) , and finally exchanged into a buffer solution (10 mM citric acid, 200 mM sucrose, 40 mM NaCl, 0.02 g EDTA, pH 6.0) . The monomer ratio of the buffer-exchanged ADC sample was determined to be 97.7%by HPLC-SEC (Figure 3) , and the DAR value was determined to be 8.0 by LC-MS.

[0333] Example 13-1: Preparation of Antibody-Drug Conjugate Trastuzumab-SD2-VA-iCPT

[0334] Reduction: Herceptin antibody (20 mg in PBS, pH 7.4; Cytiva) was placed in a 50 mL centrifuge tube. TCEP (Sigma) aqueous solution (0.1 M; 13.79 μL, 10.0 equivalents relative to one molecule of antibody) was added. Then, Tris-HCl solution (1 M, pH 8.0; 0.2 mL, 10%volume) was added to adjust pH to 8.0. The antibody concentration was adjusted to about 10 mg / mL (final volume about 2 mL) with PBS (pH 7.4) . The mixture was incubated at 37 ℃ for 2 h, thereby reducing the interchain disulfide bonds of the antibody.

[0335] Conjugation: The reaction mixture above was cooled in an ice bath for 10 min. Dimethyl sulfoxide (Sigma; 0.135 mL) and SD2-VA-iCPT DMSO solution (10 mM; 0.138 mL, 10.0 equivalents relative to one molecule of antibody) were added. The mixture was stirred and reacted at room temperature for 1.5 h.

[0336] Purification: After conjugation, the ADC mixture was subjected to buffer exchange using a 30 K concentrator (Amicon Ultra-15) , and finally exchanged into a solution (10 mM citric acid, 200 mM sucrose, 40 mM NaCl, 0.02 g EDTA, pH 6.0) . The monomer ratio of the buffer-exchanged ADC product was determined to be 97.2%by HPLC-SEC (Figure 4-1) , and the DAR value was determined to be 8.0 by LC-MS.

[0337] Example 13-2: Preparation of Antibody-Drug Conjugate Trastuzumab-SD2-VA-iCPT-iso Reduction: Herceptin antibody (20 mg in PBS, pH 7.4; Cytiva) was placed in a 50 mL centrifuge tube. TCEP (Sigma) aqueous solution (0.1 M; 13.79 μL, 10.0 equivalents relative to one molecule of antibody) was added. Then, Tris-HCl solution (1 M, pH 8.0; 0.2 mL, 10%volume) was added to adjust pH to 8.0. The antibody concentration was adjusted to about 10 mg / mL (final volume about 2 mL) with PBS (pH 7.4) . The mixture was incubated at 37 ℃ for 2 h, thereby reducing the interchain disulfide bonds of the antibody.

[0338] Conjugation: The reaction mixture above was cooled in an ice bath for 10 min. Dimethyl sulfoxide (Sigma; 0.135 mL) and SD2-VA-iCPT-iso DMSO solution (10 mM; 0.138 mL, 10.0 equivalents relative to one molecule of antibody) were added. The mixture was stirred and reacted at room temperature for 1.5 h.

[0339] Purification: After conjugation, the ADC mixture was subjected to buffer exchange using a 30 K concentrator (Amicon Ultra-15) , and finally exchanged into a solution (10 mM citric acid, 200 mM sucrose, 40 mM NaCl, 0.02 g EDTA, pH 6.0) . The monomer ratio of the buffer-exchanged ADC product was determined to be 99.0%by HPLC-SEC (Figure 4-2) , and the DAR value was determined to be 8.0 by LC-MS.

[0340] Example 14: ADC Cell Binding Activity Test

[0341] In this experiment, expanded HT29, MKN45, and N87 (endogenously overexpressing HER2) cells were digested with 0.25%EDTA trypsin, followed by centrifugation to remove the supernatant. The cell pellet was resuspended in culture medium and counted. The cell density was then adjusted to 2×106 cells / mL using a 2%BSA solution. The cell suspension was added to 96-well flow cytometry plates at 100 μL / well and centrifuged for later use. Serially diluted antibodies were added to the above 96-well flow cytometry plates containing cells at 100 μL / well and incubated at 4℃ for 60 min. After washing twice with PBS, 100 μL / well of Goat anti-human IgG-Fc (PE) (Abcam, ab98596) diluted 1000-fold with 2%BSA solution was added and incubated at 4℃ for 60 min. After washing twice with PBS, the cells were finally resuspended in PBS at 100 μL / well and detected on a CytoFlex (Beckman) flow cytometer, and the corresponding mean fluorescence intensity (MFI) was calculated.

[0342] The experimental results are shown in Figures 5, 6, and 7. The ADC conjugates Trastuzumab-SD1-VA-DXd, Trastuzumab-SD1-PEG-VA-DXd, Trastuzumab-SD2-VA-DXd, Trastuzumab-SD2-VA-iCPT, and Trastuzumab-SD2-VA-iCPT-iso obtained by conjugating Trastuzumab with the corresponding compounds still maintain binding activity to the HER2 antigen, and the binding activity is comparable to or even better than that of the naked antibody and Enhertu.

[0343] Example 15: ADC Cell Proliferation Inhibition Activity Test

[0344] In this experiment, expanded cultures of A375, MKN45, and N87 (HER2 self-expressing) cells were digested with 0.25%EDTA trypsin, centrifuged, and resuspended. After washing once with culture medium, the cell density was adjusted to 6.25 × 104 cells / mL, and 80 μL / well was added to a 96-well plate for later use. Serially diluted antibodies were added to the 96-well plate containing the cells at 80 μL / well, and the plate was incubated in a cell culture incubator for 3-5 days. Finally,  Luminescent Cell Viability Assay (Promega, G7572) reagent was used for color development, and chemiluminescence signals were collected using a microplate reader.

[0345] The experimental results are shown in Figures 8-11. The Trastuzumab-ADCs of the present invention (Trastuzumab-SD1-VA-DXd, Trastuzumab-SD1-PEG-VA-DXd, Trastuzumab-SD2-VA-DXd, Trastuzumab-SD2-VA-iCPT, and Trastuzumab-SD2-VA-iCPT-iso) can significantly inhibit the growth and proliferation of tumor cells. Their proliferation inhibition effect is comparable to or even better than that of Enhertu.

[0346] Example 16: In Vivo Pharmacodynamic Study of ADC in HT29 Model

[0347] This experiment measured the anti-tumor activity of the anti-HER2-ADC of the present invention in a NOD-SCID mouse subcutaneous HT29 human colorectal cancer tumor model. Specifically, HT29 tumor-bearing mouse models were established by subcutaneously injecting 4×106 HT29 human colorectal cancer cells into NOD-SCID mice. When the average tumor volume grew to approximately 106mm3, the mice were divided into 5 groups, with 6 mice in each group. Each group was treated with the drug by intraperitoneal injection, once every two days for a total of two administrations. The tumor volume and body weight changes of each group of mice were monitored, with a monitoring frequency of 2-3 days / time, continuously monitoring for 3 weeks. The grouping information, administration regimen, and tumor growth inhibition rate (TGI) are shown in Table 1 (the starting time for TGI calculation was the injection day, i.e., Day 0) . The results are shown in Figure 12 and Figure 13. The ADC molecules of the present invention have superior anti-tumor activity compared to equivalent doses of Enhertu.

[0348] Table 1: Dosing regimen and TGI of Anti-HER2-ADC molecule HT29 model

[0349] Example 17: In vivo Pharmacodynamic Study of ADC on NCI-N87 Model

[0350] Experiment One:

[0351] This experiment was conducted to determine the anti-tumor activity of the anti-HER2-ADC of the present invention in an NCI-N87 human gastric cancer xenograft model in M-NSG mice. Specifically, NCI-N87 tumor-bearing mouse models were established by subcutaneous injection of 3×106 NCI-N87 human gastric cancer cells into M-NSG mice. When the average tumor volume reached approximately 114 mm3, the mice were divided into 5 groups of 7 mice each. Each group received a single dose of drug via intraperitoneal injection. Tumor volume and body weight changes in each group were monitored every 3-4 days for 2 weeks. Group information, dosing regimens, and tumor growth inhibition (TGI) rates are shown in Table 2. The results, shown in Figures 14 and 15, demonstrate that the ADC molecule of the present invention has superior anti-tumor activity compared to an equivalent dose of Enhertu.

[0352] Table 2: Dosing Regimen and TGI of Anti-HER2-ADC Molecule in NCI-N87 Model

[0353] Experiment Two:

[0354] This experiment was conducted to determine the anti-tumor activity of the anti-HER2-ADC of the present invention in an NCI-N87 human gastric cancer xenograft model in M-NSG mice. Specifically, NCI-N87 tumor-bearing mouse models were established by subcutaneous injection of 2×106 NCI-N87 human gastric cancer cells into M-NSG mice. When the average tumor volume reached approximately 94 mm3, the mice were divided into 4 groups of 7 mice each. Each group received drug treatment via intraperitoneal injection. Tumor volume and body weight changes in each group were monitored every 3-4 days for 20 days. Group information, dosing regimens, and tumor growth inhibition (TGI) rates are shown in Table 3. The results, shown in Figures 16 and 17, demonstrate that the ADC molecule of the present invention has superior anti-tumor activity compared to an equivalent dose of Enhertu.

[0355] Table 3: Dosing Regimen and TGI of Anti-HER2-ADC Molecule in NCI-N87 Model

[0356] Example 18: In Vitro Plasma Stability Study of ADC

[0357] 1. Antibody Depletion from Plasma: 5 mL of Protein G magnetic beads were transferred to a 50 mL centrifuge tube. The beads were treated with 0.1 M acetic acid three times and equilibrated with equilibration buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) three times before use. 15 mL of human plasma (Shanghai Yayu Biotechnology Co., Ltd. ) was centrifuged, and the supernatant was incubated with the beads for 2 min. The tube containing the beads was placed on a magnetic stand. After the beads were adsorbed onto the magnet, the plasma was removed. The beads were regenerated with 0.1 M acetic acid three times and re-equilibrated with equilibration buffer three times. The plasma incubation process was repeated a total of five times. The used beads were regenerated and stored in 20%ethanol.

[0358] 2. Incubation of ADC Samples in Plasma: ADC samples were added to the plasma obtained in step 1 above in groups, achieving a final ADC concentration of 750 μg / mL. Plasma samples were collected after incubation at 37℃ for 3 days and 6 days for subsequent purification and ADC sample collection.

[0359] 3. Collection of ADC Samples from Plasma: The protein purification system and a 5 mL ProA SuRe LX column were flushed with equilibration buffer until a stable baseline was achieved. Samples were loaded at a flow rate of 1.5 mL / min. After loading, the column was equilibrated with equilibration buffer until the baseline returned to zero. Finally, the protein was eluted with elution buffer (0.1 M glycine-HCl, pH 2.7) , and the eluate was neutralized by adding 8%volume of neutralization buffer (1 M Tris-HCl, pH 8.0) . The used purification column was regenerated and stored in 20%ethanol.

[0360] 4. Detection of Toxin-Linker Distribution on ADC Samples: Samples were diluted to 1 mg / mL with water. 1 μL of 1 M DTT was added and the mixture was incubated at 37℃ for 30 min. Subsequently, 5 μL of aliquots were analyzed by HPLC-MS to investigate the distribution of the toxin-linker on the heavy and light chains.

[0361] Chromatography:

[0362] Column: Waters BioResolve RP mAb Polyphenyl,  2.7 μm, 2.1 mm × 150 mm.

[0363] Mobile Phase A: 0.1%Formic acid in water.

[0364] Mobile Phase B: 0.1%Formic acid in ACN.

[0365] Flow rate: 0.4 mL / min.

[0366] Column temperature: 60℃.

[0367] Gradient for Mobile Phase B: 0-2 min, 10%; 2-3 min, 24%; 3-10 min, 33%; 10-16 min, 50%; 16-16.5 min, 95%; 16.5-22 min, 95%; 22-22.5 min, 10%; 22.5-30 min, 10%.

[0368] Mass spectrometry results (Table 4) show that for Enhertu, after incubation in plasma for 3 days and 6 days, its average DAR decreases from 7.8 to 6.9 and 5.8, respectively, representing a ΔDAR of 26%in total. Toxin release primarily occurs as the intact linker-toxin, indicating the occurrence of retro-Michael addition reactions. In contrast, the ΔDAR for ADCs in the present application (such as Trastuzumab-SD2-VA-DXd) after 6 days of plasma incubation was only 4%, demonstrating the potential plasma stability advantage of ADCs in the present application (such as Trastuzumab-SD2-VA-DXd) .

[0369] Table 4: Comparison results of plasma stability in vitro of the ADCs of this application and Enhertu

Claims

1.A compound as shown in Formula I, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, or a solvate thereof, Lg-L1-L2-L3-L4-D ILg is a leaving group;L1 is a linker , and L1 is selected from 9-10-membered heteroarylene;L2 is a linker unit, preferably selected fromwherein the left linkage site is linked to L1, and the right linkage site is linked to L3;n1 is an integer selected from 1 to 10;preferably, n1 is selected from the group consisting of 1, 2, 3, 4, and 5;more preferably, n1 is selected from the group consisting of 3, 4, and 5;more preferably, n1 is 4;L0 is selected from a direct bond, or PEG;preferably, L0 is selected from a direct bond, orwherein when L0 is not a direct bond, its left linkage site is linked to the carbonyl group in the remaining structure and its right linkage site is linked to L3;n2 is an integer selected from 1 to 20;preferably, n2 is an integer selected from 1 to 10;more preferably, n2 is selected from the group consisting of 5, 6, and 7;more preferably, n2 is 6;preferably, L2 is selected from the group consisting ofwherein the left linkage site is linked to L1, and the right linkage site is linked to L3;L3 is an amino acid residue or a peptide residue consisting of 2-10 amino acid residues, wherein, its amino terminus is linked to L2 and its carbonyl terminus is linked to L4;L4 is a spacer unit, preferably selected from the group consisting of a direct bond, wherein, when L4 is not a direct bond, its left linkage site is linked to L3 and its right linkage site is linked to D;preferably, L4 is selected from a direct bond, orwherein, when L4 is not a direct bond, its left linkage site is linked to L3 and its right linkage site is linked to D;more preferably, L4 is selected fromwherein its left linkage site is linked to L3 and its right linkage site is linked to D;R1 is selected from the group consisting of hydrogen, C1-C6 alkyl, and deuterated C1-C6 alkyl, wherein the C1-C6 alkyl, and deuterated C1-C6 alkyl are each independently and optionally substituted with 1-3 halogens;preferably, R1 is selected from hydrogen, or C1-C6 alkyl;more preferably, R1 is selected from hydrogen, or methyl;most preferably, R1 is hydrogen;most preferably, L4 iswith its left linkage site linked to L3 and its right linkage site linked to D;D is a drug molecule residue, preferably, the drug molecule is DXd or a derivative thereof.2.The compound, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, or a solvate thereof according to claim 1, wherein L1 is selected from the group consisting of: preferably, L1 is selected from the group consisting of:more preferably, L1 is selected from the group consisting of:further preferably, L1 is selected from the group consisting offurther preferably, L1 is selected from the group consisting ofmost preferably, L1 iswherein, the linkage site on the left side of L1 is linked to Lg, and the linkage site on the right side of L1 is linked to L2.3.The compound, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof according to any one of claims 1-2, wherein L3 is a peptide residue consisting of 2-4 (preferably 2) amino acid residues , wherein, its amino terminus is linked to L2 and its carbonyl terminus is linked to L4; preferably, the amino acid residue is selected from the group consisting of a glycine residue, a phenylalanine residue, a valine residue, a citrulline residue, an alanine residue, and a lysine residue; more preferably, the amino acid residue is selected from the group consisting of a valine residue, and an alanine residue;preferably, L3 is selected from the group consisting of glycine residue-glycine residue-phenylalanine residue-glycine residue (GGFG) , valine residue-citrulline residue (VC) , and valine residue-alanine residue (VA) , wherein, its amino terminus is linked to L2 and its carbonyl terminus is linked to L4;more preferably, L3 is selected from the group consisting of a valine residue-alanine residue (VA) (e.g., ) , wherein its amino terminus is linked to L2 and its carbonyl terminus is linked to L4.4.The compound, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, or a solvate thereof according to any one of claims 1-3, wherein, Lg is selected from the group consisting of halogen, -OMs, CF3SO3-, and C1-C6 alkyl-SO2-;preferably, Lg is selected from C1-C6 alkyl-SO2-;more preferably, Lg is selected from MeSO2-, CH3CH2SO2-;most preferably, Lg is CH3CH2SO2-.5.The compound, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, or a solvate thereof according to any one of claims 1-4, wherein D is selected from wherein,R2 is selected from the group consisting of hydrogen, C1-C6 alkyl, C1-C6 alkoxy, C1-C6 alkylthio, C3-C6 cycloalkyl, and deuterated C1-C6 alkyl, wherein, the C1-C6 alkyl, C1-C6 alkoxy, C1-C6 alkylthio, C3-C6 cycloalkyl and deuterated C1-C6 alkyl are each independently and optionally substituted with 1-3 halogens (preferably F) ;preferably, R2 is selected from the group consisting of hydrogen, C1-C6 alkyl, and deuterated C1-C6 alkyl, wherein, the C1-C6 alkyl, and deuterated C1-C6 alkyl are each independently and optionally substituted with 1-3 halogens (preferably F) ;more preferably, R2 is selected from the group consisting of hydrogen, methyl, and deuterated methyl, wherein, the methyl, and deuterated methyl are each independently and optionally substituted with 1-3 halogens (preferably F) ;further preferably, R2 is selected from the group consisting of hydrogen, -CF2D, -CFD2, -CD3, -CF2H, and -CFH2;most preferably, R2 is hydrogen or -CF2D;R3 is selected from the group consisting of hydrogen, C1-C6 alkyl, C1-C6 alkoxy, C1-C6 alkylthio, C3-C6 cycloalkyl, and deuterated C1-C6 alkyl, wherein the C1-C6 alkyl, C1-C6 alkoxy, C1-C6 alkylthio, C3-C6 cycloalkyl, and deuterated C1-C6 alkyl are each independently and optionally substituted with 1-3 halogens (preferably F) ;preferably, R3 is selected from the group consisting of hydrogen, C1-C6 alkyl, and deuterated C1-C6 alkyl, wherein, the C1-C6 alkyl, and deuterated C1-C6 alkyl are each independently and optionally substituted with 1-3 halogens (preferably F) ;more preferably, R3 is selected from the group consisting of hydrogen, methyl, and deuterated methyl, wherein, the methyl, and deuterated methyl are each independently and optionally substituted with 1-3 halogens (preferably F) ;further preferably, R3 is selected from the group consisting of hydrogen, -CF2D, -CFD2, -CD3, -CF2H, and -CFH2;most preferably, R3 is hydrogen;preferably, D is6.The compound, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, or a solvate thereof according to any one of claims 1-5, wherein the compound as shown Formula I is selected from the group consisting of: 7.An antibody drug conjugate as shown Formula II, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, or a solvate thereof, Ab- (L1-L2-L3-L4-D) p IIwherein:Ab is an antibody or antigen-binding fragment thereof;L1, L2, L3, L4, and D are each independently defined in any one of claims 1-5;p is any integer or any decimal number selected from 1-20.8.The antibody drug conjugate, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, or a solvate thereof according to claim 7, wherein the antibody drug conjugate as shown Formula II is selected from the group consisting of: 9.The antibody drug conjugate, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, or a solvate thereof according to any one of claims 7-8, wherein the antibody is an anti-HER2 antibody;preferably, the antibody or antigen binding fragment thereof comprises a light chain variable region and a heavy chain variable region, wherein the light chain variable region comprises LCDR1 as shown in SEQ ID NO: 1, LCDR2 as shown in SEQ ID NO: 2, and LCDR3 as shown in SEQ ID NO:3; the heavy chain variable region comprises HCDR1 as shown in SEQ ID NO: 4, HCDR2 as shown in SEQ ID NO: 5, and HCDR3 as shown in SEQ ID NO: 6;more preferably, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a light chain variable region and a heavy chain variable region, wherein the light chain variable region comprises a sequence as shown in SEQ ID NO: 7 and the heavy chain variable region comprises a sequence as shown in SEQ ID NO: 8.10.The antibody drug conjugate, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, or a solvate thereof according to claim 9, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof further comprises a light chain constant region and a heavy chain constant region, wherein:the light chain constant region is selected from the group consisting of a human-derived lambda constant region, a human-derived kappa constant region, and mutants of the above constant region;the heavy chain constant region is selected from the group consisting of a human-derived IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE constant region, and mutants of the above constant region;preferably, the IgG is selected from IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4.11.The antibody drug conjugate, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, or a solvate thereof according to any one of claims 7-10, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises:light chain as shown in SEQ ID NO: 9 and heavy chain as shown in SEQ ID NO: 10.12.The antibody drug conjugate, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, or a solvate thereof according to any one of claims 7-11, wherein p is any integer or any decimal number selected from 1 to 10;preferably, p is any integer or any decimal number selected from 4-8 (e.g., 7.9 or 8.0) .13.A composition, comprising one or more antibody drug conjugates, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof, or a solvate thereof according to any one of claims 7-12;preferably, the DAR value of the composition is any integer or any decimal number selected from 1 to 20;more preferably, the DAR value of the composition is any integer or any decimal number selected from 1-10;most preferably, the DAR value of the composition is any integer or any decimal number selected from 4-8 (e.g., 7.9 or 8.0) .14.A pharmaceutical composition, comprising the compound, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof according to any one of claims 1-6, or the antibody drug conjugate, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof according to any one of claims 7-12, or the composition according to claim 13; optionally, further comprising one or more pharmaceutical excipients, such as carriers and / or excipients.15.Use of the compound, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof according to any one of claims 1-6, or the antibody drug conjugate, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof according to any one of claims 7-12, or the composition according to claim 13, or the pharmaceutical composition according to claim 14, or a drug having the structure or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof in the preparation of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease;preferably, the disease is selected from the group consisting of biliary tract cancer, carcinosarcoma, esophageal cancer, gastroesophageal junction cancer, breast cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, head and neck cancer, colorectal cancer, renal cancer, cervical cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, uterine cancer, melanoma, pharyngeal cancer, oral cancer, skin cancer, lung cancer, urethral cancer, prostate cancer, bladder cancer, gastrointestinal stromal tumor, squamous cell carcinoma, peritoneal cancer, liver cancer, uterine cancer, salivary cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, penile cancer, leukemia, malignant lymphoma, plasmacytoma or myeloma;more preferably, the disease is selected from the group consisting of gastric cancer, colorectal cancer, breast cancer, or melanoma.16.The antibody drug conjugate, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof according to any one of claims 7-12, or the composition according to claim 13, or the pharmaceutical composition according to claim 14,or a drug having the structureor a pharmaceutically acceptable salt thereof, a stereoisomer thereof, a prodrug thereof or a solvate thereof,for use in a method of preventing and / or treating a disease;preferably, the disease is selected from the group consisting of biliary tract cancer, carcinosarcoma, esophageal cancer, gastroesophageal junction cancer, breast cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, head and neck cancer, colorectal cancer, renal cancer, cervical cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, uterine cancer, melanoma, pharyngeal cancer, oral cancer, skin cancer, lung cancer, urethral cancer, prostate cancer, bladder cancer, gastrointestinal stromal tumor, squamous cell carcinoma, peritoneal cancer, liver cancer, uterine cancer, salivary cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, penile cancer, leukemia, malignant lymphoma, plasmacytoma or myeloma;more preferably, the disease is selected from the group consisting of gastric cancer, colorectal cancer, breast cancer, or melanoma.17.Use of a 1, 3-benzothiazole substituted at position 2 and at one or more further position (s) of the heterocycle for preparing an antibody drug conjugate.18.The use according to claim 17, wherein the position 2 of the 1, 3-benzothiazole is substituted with a sulfonyl group, preferably an ethylsulfonyl group.19.Use of a 1, 3-benzothiazole substituted at position 2 and at one or more further position (s) of the heterocycle as a linker in an antibody drug conjugate for improving the stability of the antibody drug conjugate in vitro and / or in vivo.20.The use according to any one of claims 17 to 19, wherein position 6 of the 1, 3-benzothiazole is substituted with a carboxyl group, a carbonyl group, or an alkynyl group (e.g. an ethynyl group) .21.The use according to claim 20, wherein the stability of the antibody drug conjugate is improved compared to the stability of an antibody drug conjugate using maleimide or a derivative thereof as a linker for the conjugation of the antibody and the drug.22.The use according to claim 20 or 21, wherein the position 2 of the 1, 3-benzothiazole is conjugated to the antibody of the antibody drug conjugate.

Images