Checkpoint-blocking recombinant phage for cancer treatment

Abstract

Provided is the use of a genetically engineered phage expressing a first peptide targeting a Programmed Cell Death protein 1 (PD-1) or Programmed Cell Death-Ligand 1 (PD-L1) and a second peptide targeting a cancer-related antigen for enhanced efficacy in cancer treatment. Thus, provided are methods for improved anti-cancer therapy, especially in the treatment of solid tumors, by using a recombinant phage that is capable of specifically targeting the PD-1 / PD-L1 pathway and specifically targeting a cancer antigen, as well as compositions and kits useful for such treatment methods.

Description

CHECKPOINT-BLOCKING RECOMBINANT PHAGE FOR CANCER TREATMENTRELATED APPLICATIONS

[0001] This application claims priority to U.S. Provisional Application No. 63 / 666,996, filed July 2, 2024, and U.S. Provisional Application No. 63 / 678,868, filed August 2, 2024, the contents of which are hereby incorporated by reference in the entirety for all purposes.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Cancer-related causes are among the top reasons of death in developed nations. In the US alone, the number of new cases of cancer of any site averages about 450 per 100,000 men and women per year, and the number of deaths averages about 170 per 100,000 men and women per year. Cancer is a disease with a high mortality rate: while about 1,700,000 newly diagnosed cancer cases are expected each year, over 600,000 deaths annually are attributable to various types of cancer. Based on the available data from recent years, it is estimated that over 38%of men and women will be diagnosed with cancer at some point during their lifetime.

[0003] Because of the prevalence of cancer and its enormous social and economical impact globally, there exists an urgent need for new and more effective methods for treating cancer. This invention fulfills this and other related needs. BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION

[0004] The application provides the first disclosure of a genetically modified phage that expresses a first peptide capable of specifically targeting both a Programmed Cell Death Protein 1 (PD-1) or a Programmed Cell Death-Ligand 1 (PD-L1) and a second peptide capable of specifically targeting a cancer-related antigen, thus capable of blocking the PD-1 / PD-L1 pathway while directing this checkpoint-blocking effect specifically to disease-affected cells and tissues. Related compositions and kits useful for the corresponding therapeutic methods of this invention are also devised from this discovery.

[0005] As such, in a first aspect, this invention provides a recombinant phage, which has been genetically engineered to express on its surface on its surface (1) a checkpoint-blocking peptide that specifically binds a Programmed Cell Death Protein 1 (PD-1) or Programmed Cell Death-Ligand 1 (PD-L1) , and (2) a homing peptide, capable of specifically binding a cancer-related antigen. In some embodiments, the checkpoint-blocking peptide specifically binds a PD-L1 protein, for example, the extracellular domain of the PD-L1 protein. In some embodiments, the checkpoint-loading peptide comprises any one, potentially more, of the amino acid sequences set forth in Table 1, especially the HH peptide (HWFHRHH, SEQ ID NO: 1) , the LN peptide (LPLITFN, SEQ ID NO: 2) , or the WG peptide (WSLGYTG, SEQ ID NO: 3) . In some embodiments, the homing peptide comprises any one, possibly two or more, of the amino acid sequences set forth in Table 4, e.g., the IP peptide (INQDARTMVMVP, SEQ ID NO: 4) , the SY peptide (SNTALPSKFYGY, SEQ ID NO: 5) , the DG peptide (DHAQRYGAGHSG, SEQ ID NO: 6) , or the AR peptide (ASVASGGWNPHR, SEQ ID NO: 7) . In some embodiments, the recombinant phage is an Ff bacteriophage, for example, an fd, fl, or M13 bacteriophage. In some embodiments, the recombinant phage expresses the checkpoint-blocking peptide on the side wall, e.g., after the loading peptide is fused to the pVIII protein, and expresses the homing peptide on one tip or end of the phage, e.g., after the homing peptide is fused to the pIII protein. In some embodiments, the recombinant phage expresses on its sidewall a checkpoint-loading peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (the HH peptide) and expresses on its tip a homing peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 (the IP peptide) .

[0006] In a second aspect, the present invention provides a composition comprising the recombinant phage described above and herein plus one or more pharmaceutically acceptable excipients. In some embodiments, the composition further comprises another anti-cancer therapeutic agent, for instance, a chemotherapeutic or immunotherapeutic agent. In some embodiments, the composition is specifically formulated for administration by injection, e.g., subcutaneous, transdermal, intramuscular, intravenous, intraperitoneal, intracranial, or intratumoral injection. In some embodiments, the composition is formulated for local delivery, such as by topical application, or by inhalation or intranasal delivery, for example, in the form of a powder, aerosol, solution, suspension, paste, cream, or ointment.

[0007] In a third aspect, the present invention provides a method for inhibiting cancer cell proliferation including the step of contacting cancer cells with a composition comprising an effective amount of the recombinant phage of this invention as described above and herein so as to cause damage and death to the targeted cancer cells. In some embodiments, the recombinant phage expresses the checkpoint-blocking peptide on the side wall and the homing peptide on the rod of the phage. In some embodiments, the checkpoint-blocking peptide has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (the HH peptide) . In some embodiments, the homing peptide has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 (the IP peptide) . In some embodiments, the composition used in the method further comprises another anti-cancer therapeutic agent, for example, a chemotherapeutic or immunotherapeutic agent. In some embodiments, the method is used to target cancer cells located within a patient’s body, and the contacting comprises administering the composition to the patient by injection, e.g., by subcutaneous, transdermal, intramuscular, intravenous, intraperitoneal, intracranial, or intratumoral injection. In some embodiments, the cancer being treated is a solid tumor, such as melanoma, breast cancer, colon cancer, lung cancer, renal cancer, or urothelial cancer. In some embodiments, the composition is administered by local delivery, including by topical application, or by inhalation or intranasal delivery, for example, in the form of a powder, aerosol, solution, suspension, paste, cream, or ointment.

[0008] In a fourth aspect, the present invention provides a kit for treating cancer in accordance with the method disclosed above and herein. The kit includes a first container containing a first composition comprising an effective amount of the recombinant phage of this invention as described above and herein, and a second container containing a second composition comprising an effective amount of another anti-cancer therapeutic agent, such as a chemotherapeutic agent or an immunotherapeutic agent. In some embodiments, the first composition and / or the second composition of the kit is / are formulated for injection, e.g., subcutaneous, transdermal, intramuscular, intravenous, intraperitoneal, intracranial, or intratumoral injection. In some embodiments, the kit is intended for treating a solid tumor, e.g., such as melanoma, breast cancer, colon cancer, lung cancer, renal cancer, or urothelial cancer, and the second container contains a therapeutic agent effective for treating the same type of cancer (for example, melanoma) . In some embodiments, the kit also includes an instruction manual for using the kit.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0009] Figure 1. Schematic of dual-functional filamentous phages displaying a PD-L1-affinity peptide (HH) and a melanoma-targeting peptide (IP) to suppress tumor growth in melanoma-bearing mice. (A) In vitro biopanning method to obtain PD-L1 affinity phages using a Ph. D. -7 phage library, leading to the discovery of the PD-L1-affinity peptide (HH) . (B) In vivo biopanning method to obtain melanoma-homing phages using a Ph. D. -12 phage library, resulting in identifying a melanoma-targeting peptide (IP) . (C) The engineered phage fd-HH-IP with IP fused to pIII (5 copies) at the tip and HH fused to pVIII (about 3900 copies) on the sidewall. (D) Schematic of using the phage fd-HH-IP, capable of targeting melanoma and binding to PD-L1 protein on tumor cells, to inhibit tumor growth. After intravenous injection of the dual-functional phage into melanoma-bearing mice through tail vein, the phage homes to tumor cells and binds to the PD-L1 protein on tumor cells. The binding event inhibits the PD-1 / PD-L1 recognition, avoiding immune escape and activating T cell responses. Eventually tumor growth is suppressed.

[0010] Figure 2. Discovery of PD-L1-affinity sequence from a phage display random peptide library. (A) Scheme showing the site-specific strategy to obtain peptides, which compete with PD-1 for binding to PD-L1 (not drawn to scale) . (a) The phage library is diluted with PBS at a concentration of 2 × 1012 pfu mL-1. (b) PD-L1 protein is coated on the cell culture plate, to which PD-1 protein is added to form a PD-1 / PD-L1 complex. After blocking with the BSA, 2 × 1011 pfu of phage library is added into the well to incubate with the complex. (c) Phages, which do not bind to the complex but can potentially bind to the PD-1 / PD-L1 recognition sites, are collected, amplified by infecting bacteria, and added to the plate pre-coated with PD-L1 protein as a sub-library. (d) After the phages that do not bind PD-L1 are discarded by washing, the phages that can bind the PD-1-recognizing epitope of the PD-L1 stay on the PD-L1. (e) The PD-L1 epitope-binding phages are removed from the PD-L1 proteins by using the acidic elution buffer. (f) The eluted phages are amplified, purified, and then applied as a sub-library for the next round of biopanning. (g) After each round of biopanning, the blue plaques are formed from the PD-L1 binding phages in the Petri dish. (h) Blue plaques are picked up and sequenced to identify DNA sequence of PD-L1 epitope-binding peptides at the end of round three. (B) The phage outputs of the three biopanning rounds. The increase of phage output shows the successful enrichment of the eluted PD-L1 epitope-binding phages. (C) The interaction of three high-frequency phages (Ph-HH, Ph-LN, Ph-WG) , one unselected sequence (Ph-WF) , one control phage (WT) and one control PBS group with PD-L1 measured by ELISA. Ph-HH shows significantly greater affinity to PD-L1 protein than other two high-frequency groups (Ph-LN and Ph-WG) . The phages displayed with selected high-frequency sequences (Ph-HH, Ph-LN, and Ph-WG) show a significantly greater affinity against PD-L1 protein than the other three groups (Ph-WF, WT, and PBS) . (D) The model of PD-1 (green) protein binding to PD-L1 (light blue) protein (PDB ID: 3bik) (i) and peptide HH (rainbow) binding to PD-L1 (light blue) protein (PDB file of PD-L1 derived from 3bik) (ii) by molecular dynamics (MD) simulation. (E-F) The cell viability of B16-F10 cells incubated with peptides (E) and phages (F) at different concentrations by CCK-8 assay. (G) The immunofluorescent cell imaging of rhodamine B labeled peptides (HH, LN, WG) bound with the surface of tumor cells in vitro (red =rhodamine B stained peptide, green = immunostained PD-L1, blue = DAPI stained nuclei) . The red fluorescence of the HH peptide is stronger than that of the other groups. (H) TR-FRET assay of the inhibition of the PD-1 / PD-L1 by phages. Since the inhibitory strength is inversely proportional to the FRET signal, the results show that Ph-HH phage exhibits a greater inhibition than the two low-affinity phages (Ph-LN and Ph-WG) and WT phage. The standard is the PD-L1 antibody in the TR-FRET kit.

[0011] Figure 3. The in situ immunotherapy of melanoma tumor by intratumoral injection of PD-L1 epitope-binding phages. (A) Dosing regimen of intratumoral immunotherapy in B16-F10 model by affinity peptides and phages. 100 μL of the peptide (HH, WG, or LN, 5 mg kg-1) , the PD-L1 antibody (a-PDL1, 5 mg kg-1) , the phage (fd-HH, Ph-HH, Ph-LN or Ph-WG, 1 × 1012 pfu kg-1) , or PBS was given intratumorally every day. The mice are randomly divided into 10 groups. (B-D) The tumor weight (B) , the tumor volume change (C) , and the picture (D) of melanoma of the treatment and control groups on the 14th day post treatment. (E-H) The serum levels of GZMB (E) , IL-2 (F) , IFN-γ (G) , TNF-α (H) cytokines in each group (n = 3) . The serum levels of these four cytokines in the fd-HH group are significantly higher than that in the control groups. (I) The H&E staining of the tumor tissues treated with different groups. A large area of necrosis exists in group i -iii and a local necrosis area occurs in group iv -ix. For the PBS group, the tumor cells are normal. (J) Immunofluorescence image of tumors labeled with the dye-tagged antibody of CD8 (red) and CD4 (green) . The helper T cell is described as Th (CD4+ CD8-) and the cytotoxic T cell is described as CTL (CD4-CD8+) . The results show that more CD4-CD8+T cells exist in group i-ii, indicating a better immune effect of fd-HH and a-PDL1. Group codes in I-J: i) a-PDL1, ii) fd-HH, iii) Ph-HH iv) Ph-LN, v) Ph-WG, vi) HH peptide, vii) LN peptide, viii) WT, ix) WG peptide and x) PBS.

[0012] Figure 4. Discovery of melanoma-targeting peptides from a phage library and construction of dual-functional phages. (A) Scheme of biopanning of melanoma-targeting phages from the Ph. D. -12 phage library combining in vivo and in vitro biopanning method (not drawn to scale) . (a) The phage library is given to melanoma-bearing mice through intravenous injection. (b) After circulation of the library in the mouse for 3 h, 0.9%saline is injected into the left ventricular for cardiac perfusion to wash away the phages in the blood. (c) The tumor is picked up and then grinded into homogenates. (d) The melanoma-homing phages are purified, amplified, and then applied as a sub-library for biopanning against B16-F10 cells to identify cell-binding melanoma-homing phages. (e-f) The sub-library is incubated with B16-F10 cancer cells and the cell surface-unbound phages are washed away (e) , leaving cell surface-bound phages on the plate (f) . (g) The cell surface-bound phages are eluted using an elution buffer, amplified, purified, and used as a new input for the next round of biopanning to discover cell-binding melanoma-homing phages. (h-i) At the end of each round of biopanning, the phages are plated with E. coli to the blue plaques are formed in the Petri dish (h) , and the plaques are picked up randomly to identify the cell-binding melanoma-targeting sequences by DNA sequencing (i) . (B) The output / input (O / I) ratio after interaction with tumors (tumor-1) and cells (cell-1) in round one as well as with tumors (tumor-2) and cells (cell-2) in round two. The increase in phage outputs from tumor-1 to tumor-2 as well as from cell-1 to cell-2 shows an expected enrichment of cell-binding melanoma-homing phages. (C) The distribution curve of information content of sub-library calculated by RELIC / INFO (red: the sub-library; black: the original library) . The information content distribution of the sub-library shifts right and up, which shows a successful biopanning based on the melanoma affinity compared to the phage growth characteristics. (D) TEM imaging of WT phage (i) and the dual-displayed phage (ii) . (E) Bio-distribution of dual-displayed phages in the melanoma-bearing C57BL / 6 mice (n = 3) . The phage quantity normalized to the control is calculated by the quantity of affinity phages per gram of each tissue or organ (pfu g-1) in each group normalized to that in the WT phage group. The data indicate that the greatest enrichment in tumors is observed in the fd-HH-IP and fd-GG-IP phage group. The accumulation of fd-HH-NL in various organs is greater than that of fd-HH-IP and fd-GG-IP. (F) Cell viability under different phage concentrations (i) and cell proliferation under different incubation times (ii) of the B16-F10 cells incubated with dual-displayed and WT phages (n = 3) . There exists no significant difference under different phage concentrations, and the cell proliferation can be observed over time. (G) Hemolysis assay of the dual-displayed phage (n = 3) . The image (i) and statistical hemolysis results (ii) of the blood incubated with phages (WT, fd-GG-IP, fd-HH-NL, fd-HH-IP) , PBS and H2O. The hemolysis assay showed none of the phage groups exhibited visible erythrocyte lysis, indicating that the dual-functional phages were blood-compatible and not significantly toxic in the tumor-bearing mice model (Figure 4G) . The dual-functional phages and WT phages have good biocompatibility.

[0013] Figure 5. The targeted immunotherapy of melanoma tumors by dual-displayed phages. (A) Dose regimen of the targeting-immunotherapy in B16-F10 model by dual-displayed phages. 100 μL of the phage (2.5 × 1013 pfu kg-1) , PD-L1 antibody (10 mg kg-1) or PBS was given every other day. Independent mice of n = 5 for a-PDL1 control group and n = 6 for other 5 groups. (B) The photographs of mice of the PBS, WT and fd-GG-IP groups on day 17 (tumors were collected 2 days earlier than the other groups to ensure tumor volumes meeting the animal ethical standards) and fd-HH-NL, fd-HH-IP and a-PDL1 groups on day 19. The red circles point to the visible tumors. (C-D) The photographs of the mice tumors (C) and the tumor weight (D) in the group of PBS, WT, and fd-GG-IP on day 17 and in the group of fd-HH-NL, fd-HH-IP, and a-PD-L1 on day 19. (E) The growth curve of tumor volumes in different treatment groups. The tumor growth rate of the fd-HH-IP group is significantly slower than that of the PBS and fd-HH-NL groups. (F) The change of the melanoma-bearing mice weight in different groups over the treatment time. No significant difference is found among different treatments, which indicates no side effects. (G-I) The serum levels of TNF-α (G) , IFN-γ (H) , IL-2 (I) cytokines in each group. The serum levels of these cytokines in the fd-HH-IP group are significantly higher than those in the group of WT, fd-HH-NL, fd-GG-IP and PBS. No significant difference is seen between the fd-HH-IP group and a-PD-L1 group. (J) The H&E staining of the tumor tissue. A large area of necrosis could be observed in group i-iii in the tumor tissue. The B16-F10 cells in these groups are destroyed, and immune cells are aggregated; in group iv and v, a local necrosis area is visible, and some immune cells are aggregated. The tumor cells are normal in the PBS group. (K) Immunofluorescence image of tumor stained with the dye-tagged antibody of CD8 (red) and CD4 (green) . Group codes in J-K: i) PBS, ii) wild-type phage, iii) fd-GG-IP, iv) fd-HH-NL, v) fd-HH-IP, vi) a-PDL1 groups.

[0014] Figure 6. Weight of the melanoma-bearing mice treated with different groups. No significant difference is observed between the experimental and control groups.

[0015] Figure 7. Tumor volume and mouse body weight changes. Fig. 7 (a) : tumor volume change in mice of the treatment and control groups during the 27-day treatment. Fig. 7 (b) : change in body weight of mice of the treatment and control groups during the 27-day treatment.

[0016] Figure 8. The in situ immunotherapy of MC38 tumor by intratumoral injection of PD-L1 epitope-binding phages. Fig. 8 (a) : picture of MC38 tumor of the treatment and control groups on the 14th day post treatment. Fig. 8 (b) : weight of mice of the treatment and control groups on the 14th day post treatment. Fig. 8 (c) : volume change of MC38 tumor of the treatment and control groups on the 14th day post treatment. Fig. 8 (d) : weight change of MC38 tumor of the treatment and control groups on the 14th day post treatment. They collectively confirm that the PD-L1-targeting fd-HH phages can significantly inhibit tumor growth compared to the non-targeting wild-type (WT) phage without causing side effects (as evidenced by insignificant differences in animal weight over time between different groups) .

[0017] Figure 9. Bio-distribution of cell-binding melanoma-homing phages in the melanoma-bearing C57BL / 6 mice (n = 3) . The phage quantity is normalized to the control. It is calculated by the quantity of affinity phages per gram of tissue or organ (pfu g-1) normalized to that of WT phage. The data indicate that the greatest enrichment in tumors is observed in the Ph-IP phage group.

[0018] Figure 10. Time course of phage and peptide elimination from blood (n=3) . 20, 40, 60, 80, and 100 min after the i. v. injection of 100 μL of 1 mg / mL FITC-modified HH peptide into mice, serum was collected at each time point. Fluorescence emission at 530 nm was detected under excitation at 485 nm. The peptide concentration in serum was quantified, expressed as a percentage of the observed maximal efficacy, and plotted against post-injection time. Similarly, 40, 80, 120, 160, 200, 240, 280, and 320 min after i. v. injection of 100 μL of 2×1012 pfu / mL phage (WT or fd-HH-IP) into mice, serum was collected at each time point. Phage concentration was calculated by titer. The phage concentration in the blood was expressed as a percentage of the observed maximum efficacy, plotted against post-injection time. Pharmacokinetic parameters (half-life, t1 / 2) were estimated through nonlinear regression analysis. For HH peptide, t1 / 2 = 18.84 min, for wild-type phage (WT) , t1 / 2 = 99.21 min, and for fd-HH-IP phage, t1 / 2 = 114.7 min. Thus, peptides are more readily cleared from the bloodstream. DEFINITIONS

[0019] The term "bacteriophage" or "phage" refers to a filamentous bacteriophage within the genus Inovirus, for example, the filamentous bacteriophage is an fd, f1, or M13 bacteriophage, typically grouped together and referred to as a "Ff" bacteriophage. Ff bacteriophage are human-friendly viruses that exclusively infect bacteria, often used to serve as a natural and non-toxic bionanofiber utilized in various biomedical applications in research and clinical context. The phage particle comprises a single-stranded DNA enclosed within a tubular capsid composed of five genetically modifiable coat proteins (including pIII and pVI at one end, pVII and pIX at the other end, and pVIII along the sidewall) . The sequences of the coat proteins of the filamentous bacteriophages are well known to one of ordinary skill in the art (see, e.g., Kay, B.K., Winter, J. &McCafferty, J., eds. (1996) . Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual. Academic Press, Inc., San Diego) . The coat proteins of Ff phage offer a versatile platform for modifying their genetic codes for the display of specific peptides for the purpose of, e.g., tumor targeting and nanozyme binding.

[0020] The term "surface of a phage" or "surface of a phage particle" refers to the part of a phage particle in contact with the medium in which the particle is contained. The surface of the phage particle is determined by the coat protein assembly (the assembled members of the protein coat of the particle) , including the side walls and rods of the phage particle.

[0021] As used herein, the term “cancer” encompasses various malignant neoplasms characterized by the proliferation of anaplastic cells that tend to invade surrounding tissue and metastasize to new body sites. Non-limiting examples of different types of cancer suitable for treatment using the compositions and methods of the present invention include colorectal cancer, colon cancer, anal cancer, liver cancer, ovarian cancer, breast cancer, lung cancer, bladder cancer, thyroid cancer, pleural cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, prostate cancer, testicular cancer, bile duct cancer, gastrointestinal carcinoid tumors, esophageal cancer, gall bladder cancer, rectal cancer, appendix cancer, small intestine cancer, stomach (gastric) cancer, renal cancer (e.g., renal cell carcinoma) , cancer of the central nervous system, skin cancer, oral squamous cell carcinoma, choriocarcinomas, head and neck cancers, bone cancer, osteogenic sarcomas, fibrosarcoma, neuroblastoma, glioma, melanoma, leukemia (e.g., acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, acute myelogenous leukemia, chronic myelogenous leukemia, or hairy cell leukemia) , lymphoma (e.g., non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, B-cell lymphoma, or Burkitt's lymphoma) , and multiple myeloma.

[0022] The term “nucleic acid” or “polynucleotide” refers to deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids (RNA) and polymers thereof in either single-or double-stranded form. Unless specifically limited, the term encompasses nucleic acids containing known analogues of natural nucleotides that have similar binding properties as the reference nucleic acid and are metabolized in a manner similar to naturally occurring nucleotides. Unless otherwise indicated, a particular nucleic acid sequence also implicitly encompasses conservatively modified variants thereof (e.g., degenerate codon substitutions) , alleles, orthologs, SNPs, and complementary sequences as well as the sequence explicitly indicated. Specifically, degenerate codon substitutions may be achieved by generating sequences in which the third position of one or more selected (or all) codons is substituted with mixed-base and / or deoxyinosine residues (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991) ; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985) ; and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994) ) . The term nucleic acid is used interchangeably with gene, cDNA, and mRNA encoded by a gene.

[0023] The term “gene” means the segment of DNA involved in producing a polypeptide chain. It may include regions preceding and following the coding region (leader and trailer) as well as intervening sequences (introns) between individual coding segments (exons) .

[0024] The term “amino acid” refers to naturally occurring and synthetic amino acids, as well as amino acid analogs and amino acid mimetics that function in a manner similar to the naturally occurring amino acids. Naturally occurring amino acids are those encoded by the genetic code, as well as those amino acids that are later modified, e.g., hydroxyproline, γ-carboxyglutamate, and O-phosphoserine. Amino acid analogs refer to compounds that have the same basic chemical structure as a naturally occurring amino acid, i.e., an α carbon that is bound to a hydrogen, a carboxyl group, an amino group, and an R group, e.g., homoserine, norleucine, methionine sulfoxide, methionine methyl sulfonium. Such analogs have modified R groups (e.g., norleucine) or modified peptide backbones, but retain the same basic chemical structure as a naturally occurring amino acid. “Amino acid mimetics” refers to chemical compounds that have a structure that is different from the general chemical structure of an amino acid, but that functions in a manner similar to a naturally occurring amino acid.

[0025] Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one-letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides, likewise, may be referred to by their commonly accepted single-letter codes.

[0026] “Polypeptide, ” “peptide, ” and “protein” are used interchangeably herein to refer to a polymer of amino acid residues. All three terms apply to amino acid polymers in which one or more amino acid residue is an artificial chemical mimetic of a corresponding naturally occurring amino acid, as well as to naturally occurring amino acid polymers and non-naturally occurring amino acid polymers. As used herein, the terms encompass amino acid chains of any length, including full-length proteins, wherein the amino acid residues are linked by covalent peptide bonds.

[0027] The phrase "specifically binds, " when used in the context of describing a binding relationship of a particular molecule to a protein or peptide, refers to a binding reaction that is determinative of the presence of the protein in a heterogeneous population of proteins and other biologics. Thus, under designated binding assay conditions, the specified binding agent (e.g., an antibody) binds to a particular protein at least two times the background and does not substantially bind in a significant amount to other proteins present in the sample. Specific binding of an antibody under such conditions may require an antibody that is selected for its specificity for a particular protein or a protein but not its similar "sister" proteins. A variety of immunoassay formats may be used to select antibodies specifically immunoreactive with a particular protein or in a particular form. For example, solid-phase ELISA immunoassays are routinely used to select antibodies specifically immunoreactive with a protein (see, e.g., Harlow &Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) for a description of immunoassay formats and conditions that can be used to determine specific immunoreactivity) . Typically, a specific or selective binding reaction will be at least twice background signal or noise and more typically more than 10, 20, 50, or up to 100 times background. On the other hand, the term “specifically bind” when used in the context of referring to a polynucleotide sequence forming a double-stranded complex with another polynucleotide sequence describes “polynucleotide hybridization” based on the Watson-Crick base-pairing, as provided in the definition for the term “polynucleotide hybridization method. ”

[0028] A “checkpoint-blocking peptide” is a peptide that is capable of specifically recognizing and binding to, with high affinity, a checkpoint protein or its corresponding ligand so as to prevent the binding between the checkpoint protein and its ligand, thus blocking the checkpoint pathway and its effects. Immune checkpoint pathways are a normal part of the immune system and play an important role in regulating immune response-when they engage, the checkpoint pathways typically inhibit an immune response. In the example of the Programmed Cell Death Protein 1 (PD-1) and Programmed Cell Death-Ligand 1 (PD-L1) pathway, when PD-1 (expressed on T cells) binds to PD-L1 (expressed on certain tumor cells) , the T cells are suppressed from killing the tumor cells. Conversely, an inhibitor of the PD-1 / PD-L1 binding or a checkpoint blocker, can effectively remove the suppression and allow the T cells to kill the tumor cells. A “checkpoint-blocking peptide, ” for example, capable of specifically binding a PD-1 or PD-L1 protein and therefore interfering with, inhibiting, or preventing PD-1 / PD-L1 binding, thus can serve as an immunotherapeutic agent in cancer treatment.

[0029] As used herein, a “homing peptide” describes a peptide that is capable of specifically recognizing and binding to a tumor-associated antigen or tumor-associated protein, typically expressed on a tumor cell membrane. In particular embodiments, the tumor is malignant, while in other embodiments, the tumor is benign. In certain embodiments, the tumor is a breast cancer, a prostate cancer, a lung cancer, a brain cancer, a kidney cancer, a liver cancer, or a skin cancer; however, all types of cancers can be targeted and treated according to this invention. Moreover, a “homing peptide” also encompasses a peptide that is able to specifically recognize and bind to an antigen expressed on any component within the tumor microenvironment including tumor-associated extracellular matrix component (ECM) or tumor-associated non-tumor cells, i.e., cancer-associated fibroblasts (CAFs) . The tumor ECM typically varies from normal ECM in the amount, composition, organization, and post-translational modification of the various structural components. For example, in invasive ductal breast carcinomas, collagen production is shifted toward Col I and Col III compared to benign mammary lesions, with the increased expression mainly observed in the stromal part of the tumor, whereas in the desmoplastic stroma of breast carcinomas, up to 15%of the collagenous matrix consists of Col V, a collagen isoform of low abundance in normal breast tissue. A homing peptide is therefore able to target tumor cells by its specific binding to a tumor-related antigen, i.e., either to a tumor cell surface antigen or to an antigen that is present in a tumor microenvironment including tumor-associated ECM or tumor-associated non-tumor cells but absent or present to a significantly less extent (e.g., no more than 1 / 10 or 1 / 20 or less) in a normal, non-tumor microenvironment.

[0030] A "label, " "detectable label, " or "detectable moiety" is a composition detectable by radiological, spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, chemical, or other physical means. For example, useful labels include radioisotopes such as 32P, fluorescent dyes, electron-dense reagents, enzymes (e.g., as commonly used in an ELISA) , biotin, digoxigenin, or haptens and proteins that can be made detectable, e.g., by incorporating a radioactive component into a polypeptide or used to detect antibodies specifically reactive with the polypeptide. Typically, a detectable label is a heterologous moiety attached to a probe or a molecule (e.g., a protein or nucleic acid) with defined binding characteristics (e.g., a polypeptide with a known binding specificity or a polynucleotide) , so as to allow the presence of the probe / molecule (and therefore its binding target) to be readily detectable. The heterologous nature of the label ensures that it has an origin different from that of the probe or molecule that it labels, such that the probe / molecule attached with the detectable label does not constitute a naturally occurring composition (e.g., a naturally occurring polynucleotide or polypeptide sequence) .

[0031] The term “recombinant” when used with reference, e.g., to a cell, or a nucleic acid, protein, or vector, indicates that the cell, nucleic acid, protein or vector, has been modified by the introduction of a heterologous nucleic acid or protein or the alteration of a native nucleic acid or protein, or that the cell is derived from a cell so modified. Thus, for example, recombinant cells express genes that are not found within the native (non-recombinant) form of the cell or express native genes that are otherwise abnormally expressed, under expressed or not expressed at all.

[0032] The term "inhibiting" or "inhibition, " as used herein, refers to any detectable negative effect on a target biological process, such as RNA / protein expression of a target gene, the biological activity of a target protein, protein-protein specific binding or interaction, cellular signal transduction, cell proliferation, and the like. Typically, an inhibition is reflected in a decrease of at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%or greater in the target process (e.g., a target cell proliferation rate) , or any one of the downstream parameters mentioned above, when compared to a control. “Inhibition” further includes a 100%reduction, i.e., a complete elimination, prevention, or abolition of a target biological process or signal or disease / symptom. The other relative terms such as “suppressing, ” “suppression, ” “reducing, ” and “reduction” are used in a similar fashion in this disclosure to refer to decreases to different levels (e.g., at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%or greater decrease compared to a control level) up to complete elimination of a target biological process or signal or disease / symptom. On the other hand, terms such as “activate, ” “activating, ” “activation, ” “increase, ” “increasing, ” “promote, ” “promoting, ” “enhance, ” “enhancing, ” or “enhancement” are used in this disclosure to encompass positive changes at different levels (e.g., at least about 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, or greater such as 3, 5, 8, 10, 20-fold increase compared to a control level in a target process, signal, or symptom / disease incidence.

[0033] As used in this application, an "increase" or a "decrease" refers to a detectable positive or negative change in quantity from a comparison control, e.g., an established standard control (such as an average level of cancer cell proliferation rate) . An increase is a positive change that is typically at least 10%, or at least 20%, or 50%, or 100%, and can be as high as at least 2-fold or at least 5-fold or even 10-fold of the control value. Similarly, a decrease is a negative change that is typically at least 10%, or at least 20%, 30%, or 50%, or even as high as at least 80%or 90%of the control value. Other terms indicating quantitative changes or differences from a comparative basis, such as "more, " "less, " "higher, " and "lower, " as well as terms indicating an action to cause such changes or differences, such as "increase, " "promote, " "enhance, " "decrease, " "inhibit, " and "suppress, " are used in this application in the same fashion as described above. In contrast, the term "substantially the same" or "substantially lack of change" indicates little to no change in quantity from the standard control value, typically within ± 10%of the standard control, or within ± 5%, 2%, or even less variation from the standard control.

[0034] As used herein, the term "treatment" or "treating" includes both therapeutic and preventative measures taken to address the presence of a disease or condition or the risk of developing such disease or condition at a later time. It encompasses therapeutic or preventive measures for alleviating ongoing symptoms, inhibiting or slowing disease progression, delaying of onset of symptoms, or eliminating or reducing side-effects caused by such disease or condition. A preventive measure in this context and its variations do not require 100%elimination of the occurrence of an event; rather, they refer to a suppression or reduction in the likelihood or severity of such occurrence or a delay in such occurrence.

[0035] A “subject, ” or "subject in need of treatment, " as used herein, refers to an individual who seeks medical attention due to risk of, or actual sufferance from, a condition involving an undesirable or abnormal, excessive cellular proliferation, for example, solid tumor such as breast cancer. The term subject can include both animals, especially mammals or primates, and humans. Subjects or individuals in need of treatment include those that demonstrate symptoms of undesirable or inappropriate cell proliferation such as tumor and especially malignant tumor / cancer or are at risk of later developing these conditions and / or related symptoms.

[0036] The term “effective amount, ” as used herein, refers to an amount that is sufficient to produce an intended effect for which a substance is administered. The effect may include a desirable change in a biological process (e.g., suppressed cancer cell proliferation) as well as the prevention, correction, or inhibition of progression of the symptoms of a disease or condition and related complications to any detectable extent. The exact amount “effective” for achieving a desired effect will depend on the nature of the therapeutic agent, the manner of administration, and the purpose of the treatment, and will be ascertainable by one skilled in the art using known techniques (see, e.g., Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992) ; Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999) ; and Pickar, Dosage Calculations (1999) ) .

[0037] The term “about” denotes a range of + / -10%of a pre-determined value. For example, “about 10” sets a range of 90%to 110%of 10, i.e., 9 to 11.

[0038] A "pharmaceutically acceptable" or "physiologically acceptable" excipient is a substance that is not biologically harmful or otherwise undesirable, i.e., the excipient may be administered to an individual along with a bioactive agent without causing any undesirable biological effects. Neither would the excipient interact in a deleterious manner with any of the components of the composition in which it is contained.

[0039] The term "excipient" refers to any essentially accessory substance that may be present in the finished dosage form of the composition of this invention. For example, the term "excipient" includes vehicles, binders, disintegrants, fillers (diluents) , lubricants, glidants (flow enhancers) , compression aids, colors, sweeteners, preservatives, suspending / dispersing agents, film formers / coatings, flavors and printing inks.

[0040] The term “consisting essentially of, ” when used in the context of describing a composition containing an active ingredient or multiple active ingredients, refer to the fact that the composition does not contain other ingredients possessing any similar or relevant biological activity of the active ingredient (s) or capable of enhancing or suppressing the activity, whereas one or more inactive ingredients such as physiological or pharmaceutically acceptable excipients may be present in the composition. For example, a composition consisting essentially of active agents (for instance, the recombinant phage of this invention) effective for treating cancer in a subject is a composition that does not contain any other agents that may have any detectable positive or negative effect on the same target process (e.g., anti-cancer efficacy) or that may increase or decrease to any measurable extent of the disease severity or outcome among the receiving subjects.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTIONI. Introduction

[0041] Filamentous phage as a bionanofiber has rarely been employed directly for cancer immunotherapy. This study demonstrates that phage can be genetically engineered into a tumor-targeting immunotherapeutic agent to tackle one significant challenge, the lack of tumor-homing capability of PD-L1 (programmed cell death-ligand 1) blockers that causes side effects. Specifically, the present inventor improved biopanning to discover one peptide binding the extracellular domain of PD-L1 and another peptide targeting both melanoma tissues and cancer cells. The two peptides were genetically fused to the sidewall protein and tip protein of fd phage, respectively. The intravenously injected phage homed to tumors and bound PD-L1 on cancer cells, effectively blocking PD-1 / PD-L1 recognition to trigger targeted immunotherapy (outperforming free peptides and comparable to PD-L1-neutralizing antibodies) without bodyweight loss, normal organ abnormalities, and hematological aberrations. The phages, cost-effectively replicated by bacteria, are cancer-targeting immunotherapeutic nanofibers with peptides switchable to target other cancer types and immune checkpoints.

[0042] Cancer immunotherapy relies on blocking the immune escape and reconstructing immune responses. One of the most studied immune checkpoints is the programmed cell death protein 1 (PD-1)  / programmed cell death-ligand 1 (PD-L1) axis. PD-1 / PD-L1 blockers used in clinical trials are mostly monoclonal antibodies with several undesired problems such as high costs (e.g., $10, 380.12 for 1.2 g of atezolizumab as a PD-L1 blocker, website: drugs. com / price-guide / tecentriq; $7, 436.55 for 0.24 g of Nivolumab as a PD-1 blocker, website: drugs. com / price-guide / opdivo) and low tumor targeting abilities. PD-L1 is not only existing on the surface of tumor cells but also present on normal cells such as hematopoietic cells and non-hematopoietic healthy tissue cells. Consequently, PD-L1 blockers that lack tumor-targeting capabilities can cause side effects such as fever, fatigue, generalized muscle aches, immune pneumonia, immune enteritis, immune hepatitis, immune myocarditis, etc. To avoid the side effects, it is important to ensure that the PD-L1 blockers can home to the tumor and target the tumor cells. Hence, there is a pressing need for the development of a new PD-1 / PD-L1 blocker that is of low cost and can target tumors.

[0043] The present inventor successfully determined that the newly constructed tumor-homing PD-L1-binding phage is biocompatible. Similar to the anti-PDL1 antibody, the dual-functional phage, intravenously injected into melanoma-bearing mice, could target melanoma tumors and block PD-1 / PD-L1 axis to inhibit the immune escape of tumor cells, significantly suppressing tumor growth. The successful immunotherapy has been verified by way of detecting a high level of cytokine biomarkers in serum and an increased level of necrosis and activity of CTL in tumor tissues. The dual-functional phage did not show toxicity to normal cells and incompatibility with blood, nor did it cause damage to major tissues or organs other than tumors during the treatment. Moreover, phages are known to be naturally present in the body of healthy people (Manrique et al. Healthy human gut phageome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2016, 113, 10400-10405) and do not cause obvious side effects after intravenously injected into the human body (Dedrick et al., Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus. Nat Med 2019, 25 (5) , 730-733) . This study represents a novel therapeutic strategy for utilizing the body’s natural nanostructures for fighting deadly cancer.

[0044] In sharp contrast to commercial neutralizing antibodies that are clinically used for immunotherapy, phages are cost-effective. Phages can infect bacteria to get amplified overnight. For example, infection of bacteria by one parent phage particle can lead to the production of 1014 progeny identical phage particles overnight. Such an amplification process allows the phages to be mass-produced by just using a copy machine to produce millions of copies in a short time, making the cost and time of phage production significantly lower than those of antibody production. It is estimated that by using a fermenter to amplify phages, the cost of phages can be maintained at a low cost (500 US dollars for 1 gram) . Moreover, each phage nanofiber can display about 4000 copies of the PD-L1-binding peptide, equivalent to about 4000 copies of the neutralizing PD-L1-binding agent. This also explains why we found that the PD-L1 phage outperformed free PD-L1-binding peptide and was comparable with the neutralizing antibodies in suppressing tumors through immunotherapy. Hence, the phage nanomedicine developed in this study represents a cost-effective tumor-targeting immunotherapeutic agent.

[0045] The immunotherapy strategy described in this study can be potentially employed to treat other types of cancer since the melanoma-targeting peptides could be replaced by peptides homing to the tumors of other types that overexpress PD-L1 (e.g., non-small-cell lung cancer, urothelial carcinoma, colorectal adenocarcinoma, breast carcinomas, and non-clear cell renal cell carcinoma) . Moreover, the peptides, which can target other immune checkpoints for immunotherapy, inflammatory targets for treating inflammatory diseases, or receptors on the virus for blocking virus infection, can be obtained by biopanning. These peptides can be genetically dual-displayed on the phage nanofibers in the same manner. Hence, this strategy can be expanded to treat other diseases by displaying multiple targeting peptides on a single phage. II. Genetic Engineering of Phage

[0046] The present invention relates to genetically engineering a phage so that the resultant phage will express on its surface both a checkpoint-blocking peptide intended for “blocking” a checkpoint pathway and therefore acting as an anti-cancer immunotherapeutic agent, and a homing peptide intended for “homing” of the recombinant phage particle to a target cell or tissue type, e.g., a solid tumor such as melanoma, breast cancer, or colon cancer. The engineered phage is to be used in a therapeutic application for improved specificity and efficacy.

[0047] Phages are well studied and can be readily modified via genetic manipulation to display functional peptides or proteins on five distinct phage coat proteins (p3, p6, p7, p8, and p9) on the phage surface, including on its side wall or its rod structures. Using well-established techniques and methods, phage may be genetically engineered such that the phage particles are transformed into optimized targeted delivery vehicles suitable for their intended purpose, e.g., delivery of therapeutic agents or delivery of imaging reagents to a cancer cell.

[0048] In some embodiments, the bacteriophage is an Ff phage, and the modified coat protein is a pIII, pVI, pVII, pVIII, or pIX coat protein. In other embodiments, the bacteriophage an fd bacteriophage, and the modified coat protein is an fd pIII, fd pVI, fd pVII, fd pVIII, or fd pIX coat protein. In further embodiments, the bacteriophage is an f1 bacteriophage, and the modified phage coat protein is a f1 pIII, f1 pVI, f1 pVII, f1 pVIII, or f1 pIX coat protein. In additional embodiments, the bacteriophage is an M13 bacteriophage, and the modified bacteriophage coat protein is a M13 p3, M13 p6, M13 p7, M13 p8, or M13 p9 coat protein.

[0049] While the checkpoint-blocking peptide and the homing peptide may be engineered to be displayed on any chosen surface location of a recombinant phage of this invention, in some embodiments, the checkpoint-blocking peptide is displayed on the phage’s side wall in order to maximize its exposure and blocking capacity for a checkpoint pathway (e.g., for interfering with, inhibiting, or abolishing the binding between PD-1 and PD-L1) , thus optimizing the immunotherapeutic potential, whereas the homing peptide is displayed on the rod structure at either or both ends of the phage in order to minimize any possible sterical interference between the binding of a cancer-specific antigen (e.g., on the surface of a cancer cell or cancer microenvironment ECM) and the binding of a checkpoint protein or its ligand (e.g., PD-1 or PD-L1) .

[0050] In other embodiments, the recombinant phage may instead express the checkpoint-blocking peptide on the rod and the homing peptide on the side wall. In some embodiments, the recombinant phage may express more than one homing peptide in order to achieve enhanced targeting effects, for targeting two or three cancer cell surface antigens. Also, the recombinant phage may be further modified on its surface protein or proteins, for example, at a cysteine or lysine residue, to effectuate chemical conjugation of a detection or imaging agent on the phage surface. Such detection / imaging agent may be used to specific targeting a pre-determined cell or tissue type, for either imaging or therapeutic purposes. A variety of imaging reagents are known and available in the art. Illustrative imaging reagents include, e.g., metals, radioisotopes, fluorescent molecules, e.g., fluorophores, and fluorescent proteins. In some embodiments, the imaging agent is a fluorophore, including a fluorescent dye such as a fluorescein-, boron (III) dipyrromethenates (BODIPY) -, rhodamine-, or cyanine-derivative. In one example, the cyanine-derivative is indocyanine green (ICG) . In some embodiments, the fluorophore is a fluorescent nano-crystal. In particular embodiments, the fluorescent nano-crystal is a quantum dot (Qdot) . In some embodiments, the fluorophore is a genetically encoded fluorescent protein. In additional embodiments, the genetically encoded fluorescent protein is green fluorescent protein (GFP) , yellow fluorescent protein (YFP) , or red fluorescent protein (RFP) . III. Anti-Cancer Therapeutic Agents

[0051] In connection with the use of treatment methods of this invention as disclosed herein, one or more of these previously known effective anti-cancer therapeutic agents, including those named in this application, can be administered to subjects in need of anti-cancer treatment. Optionally, the agent (s) may be used in combination with the active agent of the present invention (e.g., a genetically modified recombinant phage loaded with a checkpoint-blocking peptide such as a PD-1 binding peptide) to suppress cancer growth, inhibit cancer metastasis, and facilitate remission from the disease. In the case of combination therapy, the active agents may be administered concurrently each in an effective amount, either together in a single composition or separately in two or more different compositions.

[0052] For example, various chemotherapeutic agents are known to be effective for use to treat various cancers. As used herein, a “chemotherapeutic agent” encompasses any chemical compound exhibiting suppressive effect against cancer cells, thus useful in the treatment of cancer. Classes of chemotherapeutic agents include, but are not limited to: alkylating agents, antimetabolites, kinase inhibitors, spindle poison plant alkaloids, cytoxic / antitumor antibiotics, topisomerase inhibitors, photosensitizers, anti-estrogens and selective estrogen receptor modulators (SERMs) , anti-progesterones, estrogen receptor down-regulators (ERDs) , estrogen receptor antagonists, leutinizing hormone-releasing hormone agonists, anti-androgens, aromatase inhibitors, EGFR inhibitors, VEGF inhibitors, and anti-sense oligonucleotides that inhibit expression of genes implicated in abnormal cell proliferation or tumor growth. Chemotherapeutic agents useful in the treatment methods disclosed herein also include cytostatic and / or cytotoxic agents.

[0053] Exemplary anti-cancer therapeutic agents include alkylating agents such as altretamine, bendamustine, busulfan, carboquone, carmustine, chlorambucil, chlormethine, chlorozotocin, cyclophosphamide, dacarbazine, fotemustine, ifosfamide, lomustine, melphalan, melphalan flufenamide, mitobronitol, nimustine, nitrosoureas, pipobroman, ranimustine, semustine, streptozotocin, temozolomide, thiotepa, treosulfan, triaziquone, triethylenemelamine, trofosfamide, and uramustine; anthracyclines such as aclarubicin, daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, idarubicin, mitoxantrone, pirarubicin, valrubicin, and zorubicin; cytoskeletal disruptors (taxanes) such as abraxane, cabazitaxel, docetaxel, larotaxel, paclitaxel, taxotere, and tesetaxel; epothilones such as ixabepilone; histone deacetylase inhibitors such as vorinostat, romidepsin, and inhibitors of topoisomerase I such as belotecan, camptothecin, exatecan, gimatecan, irinotecan, and topotecan; inhibitors of topoisomerase II such as etoposide, teniposide, and tafluposide; kinase inhibitors such as bortezomib, erlotinib, gefitinib, imatinib, vemurafenib, and vismodegib; nucleotide analogs and precursor analogs such as azacitidine, azathioprine, capecitabine, cytarabine, doxifluridine, fluorouracil, gemcitabine, hydroxyurea, mercaptopurine, methotrexate, and tioguanine (formerly thioguanine) ; peptide antibiotics such as actinomycin and bleomycin; platinum-based agents such as carboplatin, cisplatin, dicycloplatin, oxaliplatin, nedaplatin, and satraplatin; retinoids such as alitretinoin, bexarotene, and tretinoin; and vinca alkaloids and derivatives such as vinblastine, vincristine, vindesine, and vinorelbine.

[0054] Immunotherapeutic approaches useful for cancer treatment include (1) active immunotherapy, which directs the immune system to specifically target the cancer cells, e.g., targeted antibody therapy and cell-based immunotherapy such as CAR T cell therapy; and (2) passive immunotherapy, e.g., using checkpoint inhibitors and cytokines to stimulate the immune system without specifically targeting cancer cells. Various monoclonal antibodies are used in targeted antibody therapy. Examples of such antibodies and their conjugates include adotrastuzumab (HER2) , alemtuzumab (CD52) , bevaclzumab (VEGF) , brentuximab (CD30) , capromab (PSMA) , cetuximab (EGFR) , elotuzumab (SLAMF7) , ibritumomab (CD20) , necitumumab (EGFR) , obinutumab (CD20) , ofatumumab (CD20) , olaratumab (PDGFRA) , panitumumab (EGFR) , pertuzumab (HER2) , ramucirumab (VEGFR2) , rituximab (CD-20) , trastuzumab (HER-2) , inotuzumab-ozogamicin (CD22) , gemtuzumab-ozogamicin (CD33) , and bevacizumab-awwb (VEGF) . Currently approved checkpoint inhibitors target molecules CTLA4, PD-1, and PD-L1, including ipilimumab (CTLA4) , nivolumab, pembrolizumab, cemiplimab, spartalizumab (PD-1) , atezolizumab, avelumab, and durvalumab (PD-L1) . Cytokines for use in the treatment of cancer and associated conditions include granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) , granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) , interleukin-2 (IL-2) , and interleukin-11 (IL-11) . IV. Pharmaceutical Compositions and Administration

[0055] The present invention also provides pharmaceutical compositions or physiological compositions comprising an effective amount of a recombinant phage of the present invention as described above and herein and therefore inhibit cancer cell proliferation in both prophylactic and therapeutic applications. Such pharmaceutical or physiological compositions also include one or more pharmaceutically or physiologically acceptable excipients or carriers. Pharmaceutical compositions of the invention are suitable for use in a variety of drug delivery systems. Suitable formulations for use in the present invention are found in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985) . For a brief review of methods for drug delivery, see, Langer, Science 249: 1527-1533 (1990) .

[0056] The pharmaceutical compositions of the present invention can be administered by various routes, e.g., subcutaneous, transdermal, intramuscular, intravenous, intraperitoneal, intracranial, or intratumoral injection or local delivery, e.g., topical application. The preferred routes of administering the pharmaceutical compositions are through injection, including systemic or local delivery by injection (e.g., intravenous injection or intratumoral injection) to a relevant organ or tissue in a patient suffering from a solid tumor involving excessive and undesirable cellular proliferation at daily doses of about 10-1,000,000 x 107, about 100-100,000 x 107, or about 1,000-10,000 x 107 of the recombinantly modified phage particles of this invention for a 70 kg adult human per day. The appropriate dose may be administered in a single daily dose or as divided doses presented at appropriate intervals, for example as two, three, four, or more subdoses per day.

[0057] For preparing pharmaceutical compositions containing the recombinant phage of the present invention, one or more inert and pharmaceutically acceptable carriers are used. The pharmaceutical carrier (s) can be in any form, although liquid form is preferred for formulations intended for injection. Suitable carriers include, for example, magnesium carbonate, magnesium stearate, talc, lactose, sugar, pectin, dextrin, starch, tragacanth, methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, a low-melting wax, cocoa butter, and the like.

[0058] Liquid pharmaceutical compositions include, for example, solutions, suspensions, and emulsions suitable for injection. Sterile buffer solutions of the active component (e.g., genetically modified recombinant phage of this invention as described above and herein) or sterile solutions of the active component in solvents comprising water, buffered water, saline, PBS, ethanol, or propylene glycol are examples of liquid compositions suitable for parenteral administration. The compositions may contain pharmaceutically acceptable auxiliary substances as required to approximate physiological conditions, such as pH adjusting and buffering agents, tonicity adjusting agents, wetting agents, detergents, and the like. The pH of the preparations typically will be between 3 and 11, more preferably from 5 to 9, and most preferably from 7 to 8.

[0059] The pharmaceutical compositions of modified phage of this invention can be administered for prophylactic and / or therapeutic purposes. In therapeutic applications, compositions are administered to a patient already suffering from a condition that involves excessive and undesirable cellular proliferation (e.g., a solid tumor such as melanoma or breast cancer) in an amount sufficient to prevent, cure, reverse, or at least partially slow or arrest the symptoms of the condition and its complications, such as the onset, progression, duration, and severity of the disease. An amount adequate to accomplish this is defined as a "therapeutically effective dose. " Amounts effective for this use will depend on the severity of the disease or condition and the weight and general state of the patient, but generally range from about 10-1,000,000 x 107, about 100-100,000 x 107, or about 1,000-10,000 x 107 of the modified phage of this invention per day for a 70 kg patient, with dosages from about 1-10,000 x 107 to about 100-1,000 x 107 of the modified phage per day per kg for a patient being more commonly used.

[0060] In prophylactic applications, pharmaceutical compositions containing an adequate amount of the genetically modified phage of this invention as described above and herein are administered to a patient susceptible to or otherwise at heightened risk of developing a disease or condition caused or exacerbated by undesirable and excessive cellular proliferation, in an amount sufficient to delay or prevent the onset of the symptoms. Such an amount is defined to be a "prophylactically effective dose. " In this use, the precise amounts of the inhibitor again depend on the patient's state of health and weight, but generally range from about 10-1,000,000 x 107, about 100-100,000 x 107, or about 1,000-10,000 x 107 of the modified phage per day for a 70 kg patient, with dosages from about 1-10,000 x 107 to about 100-1,000 x 107 of the modified phage per day per kg for a patient.

[0061] Single or multiple administrations of the compositions can be carried out with dose levels and pattern being selected by the treating physician. In any event, the pharmaceutical formulations should provide a quantity of the genetically modified phage sufficient to effectively inhibit cellular proliferation in the patient, especially in therapeutic applications for the treatment of solid tumor such as breast cancer. V. Kits

[0062] The invention provides compositions and kits for practicing the methods described herein to treat cancer, especially solid tumors, in a subject. Kits for therapeutic use of the recombinant phage of this invention typically include one container containing a composition comprising the genetically modified phage that expresses both the checkpoint-blocking peptide, capable of blocking a checkpoint pathway (such as the PD-1 / PD-L1 pathway) and a homing peptide, capable of targeting tumor cells or tissue to be treated. Typically, such composition is formulated for delivering the recombinant phage, e.g., by injection such as subcutaneous, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, or intratumoral. Optionally, the kit includes at least one, possibly two or more, additional anti-cancer therapeutic agents, known for their effectiveness in treating cancer, for example, any one or more of the therapeutic agents known / used in the medical field or described herein, or which might belong to any of the following 3 categories: (A) chemotherapeutic drugs, e.g., drugs capable of killing or suppressing cells that are actively undergoing proliferation; (B) immunotherapeutic agents, e.g., monoclonal antibodies for targeted antibody therapy, checkpoint inhibitors, and cytokines; and (C) cell-based therapeutic agents, e.g., those used in CAR T cell therapy or other immune cell therapy.

[0063] Further, the kits of this invention may provide instruction manuals to guide users in the proper administration of the composition comprising the genetically modified phage as described above and herein, optionally in combination with one or more anti-cancer therapeutic agents, to a subject deemed in need of such treatment by a physician (e.g., a person suffering from a condition involving undesirable / uncontrolled cellular proliferation such as any type of malignancy, especially solid tumor, such as breast cancer) , the schedule (e.g., dose and frequency of administration) and route of administration, and the like. EXAMPLES

[0064] The following examples are provided by way of illustration only and not by way of limitation. Those of skill in the art will readily recognize a variety of non-critical parameters that could be changed or modified to yield essentially similar results.

[0065] Filamentous phage as a bionanofiber has rarely been employed directly for cancer immunotherapy. This study shows it can be genetically engineered into a tumor-targeting immunotherapeutic agent to tackle one significant challenge, the lack of tumor-homing capability of PD-L1 (programmed cell death-ligand 1) blockers that causes side effects. Specifically, using improved biopanning two peptides are discovered: one peptide binding the extracellular domain of PD-L1 and another peptide targeting both melanoma tissues and cancer cells. The two peptides were genetically fused to the sidewall protein and tip protein of fd phage, respectively. The intravenously injected phage homed to tumors and bound PD-L1 on cancer cells, effectively blocking PD-1 / PD-L1 recognition to trigger targeted immunotherapy (outperforming free peptides and comparable to PD-L1-neutralizing antibodies) without bodyweight loss, normal organ abnormalities, and hematological aberrations. The phages, cost-effectively replicated by bacteria, are cancer-targeting immunotherapeutic nanofibers with peptides switchable to target other cancer types and immune checkpoints. INTRODUCTION

[0066] Traditional cancer treatment modalities include chemotherapy, radiation therapy, and targeted therapy. The development and metastasis of malignant tumors are related to immune escape. 1 Due to the high tumor inhibition efficiency and low side effects, immunotherapy has emerged as a promising treatment with reported breakthrough achievements. 2 Cancer immunotherapy relies on blocking the immune escape and reconstructing immune responses. Its strategies include immunomodulatory therapy, molecular therapy (therapeutic antibodies, peptides, and cytokines) , and cell therapy using dendritic cell (DC) -based vaccines, chimeric antigen receptor (CAR) T cells, and cancer cell membrane (CCM) -based vaccines.

[0067] Although several immune checkpoint targets have been discovered, currently FDA-approved drugs target programmed cell death protein 1 (PD-1)  / programmed cell death-ligand 1 (PD-L1) axis, cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) or Lymphocyte-activation gene 3 (LAG-3) . 3 So far, immunotherapeutic drugs blocking PD-1 or PD-L1 to suppress PD-1 / PD-L1 axis, with lower adverse effects than those targeting CTLA-4, 4 are clinically used in treating prostate cancer, 5 colorectal cancer, 6 non-small-cell lung cancer, 7 melanoma, 8 and glioblastoma. 9 Mechanistically, after the binding of PD-1 to PD-L1, the PD-1 / PD-L1 axis exerts a negative immunomodulatory role through multiple mechanisms, including the inhibition of lymphocyte proliferation, suppression of the production of cytokines such as IFN-γ, and induction of regulatory T cell (Treg) activation. 10 These processes collectively contribute to the maintenance of immune tolerance of tumors within the organism. Hence, the blockade of the PD-1 / PD-L1 axis can activate the immune response to treat cancer. Some PD-1 blockers (e.g., nivolumab, 11 pembrolizumab12) and PD-L1 blockers (e.g., atezolizumab, 13 avelumab, 14 and durvalumab15) have received FDA approval for clinical use, and some newly discovered blockers are in clinical testing. However, PD-1 / PD-L1 blockers used in clinical trials are mostly monoclonal antibodies with several undesired problems, such as high costs and low tumor targeting abilities leading to adverse effects. For example, PD-L1 exists on the surface of tumor cells. It is also present on normal cells such as hematopoietic cells (e.g., DCs, macrophages) and non-hematopoietic healthy tissue cells (e.g., keratinocytes, vascular endothelial cells, and pancreatic islet cells) . Consequently, PD-L1 blockers that lack tumor-targeting capabilities can cause side effects such as fever, fatigue, generalized muscle aches, immune pneumonia, immune enteritis, immune hepatitis, immune myocarditis, etc. 16 To avoid side effects, it is important to ensure that the PD-L1 blockers can selectively home to the tumor and target the tumor cells. Hence, there is a pressing need to develop a new PD-1 / PD-L1 blocker that is low-cost and can target tumors.

[0068] With the discoveries that phages naturally exist in healthy human17 and can treat diseases without significant side effects in human patients, 18, 19, 20, 21 we were encouraged to develop filamentous fd phage into the PD-1 / PD-L1 blocker, which is more cost-effective than the conventional neutralizing molecules such as peptides or monoclonal antibodies that cannot target cancer cells and tumor tissues, 4, 9, 22, 23, 24, 25 for cancer immunotherapy using melanoma as a cancer model. The fd phage is a non-toxic nanofiber-shaped virus that only infects bacteria. It has perfect structural symmetry with ssDNA encapsulated in the core, which codes a major protein (pVIII, in 3900 copies) on the side wall and four minor proteins (pIII, pVI, pVII, and pIX, each in 5 copies) at the two tips. The fd phage is cost-effective because it can be mass-produced by simply allowing it to infect bacteria E. coli in a fermenter and get amplified in hours. Moreover, we can identify a PD-L1 binding peptide, which can be fused to pVIII, constituting the sidewall of phage. Thus, a single fd phage can display up to ～3900 copies of the PD-L1 blocker, further reducing the cost of the therapy and potentially increasing the immunotherapeutic efficacy. In addition, it is widely known that filamentous phages are biocompatible and do not harm mammalian cells. 26, 27

[0069] To generate fd phage that can serve as the tumor-targeting PD-L1 blocker for effective immunotherapy, we screened a PD-L1 binding peptide and a melanoma-targeting peptide from a phage library. Then we displayed them on the sidewall and at the tip of fd phage, respectively (Figure 1) . To discover the PD-L1 binding peptide that recognizes the PD-1 targeting epitope on PD-L1, we modified the traditional biopanning (Figure 2A) . First, before round 1, we allowed the phage library to interact with the PD-1 / PD-L1 binding complex and obtained the phages that could potentially bind the PD-1 / PD-L1 recognition sites (Figure 2A a-c) . Then we used the resultant phages as an actual input library to interact with PD-L1 in round one. The PD-L1 binding phages from the previous rounds were used as a new input to screen the PD-L1 binding peptides (Figure 2A c-f) , leading to the discovery of a best PD-L1 binding peptide with a sequence of HWFHRHH (SEQ ID NO: 1, termed HH) in three rounds.

[0070] We also revised the traditional biopanning to discover a peptide that can home to tumor tissue and bind to cancer cell surface (Figure 4A) . For simplicity, we term this cell-binding tumor-homing peptide the melanoma-targeting peptide. To achieve this goal, we first injected the phage library into melanoma-bearing mice (generated from B16-F10) through the tail vein to identify tumor-targeting phages (Figure 4A b-d) , which were further treated as a sub-library to interact with B16-F10 melanoma cells to identify the tumor-targeting cell-binding peptide (Figure 4A e-g) . This unique combination of in vivo and in vitro biopanning allowed us to discover the best melanoma-targeting peptide with a sequence of INQDARTMVMVP (SEQ ID NO: 4, termed IP) .

[0071] To prove the use of phage as a tumor-targeting PD-L1 blocker, we genetically fused the peptide IP and HH to pIII and pVIII of fd phage, respectively, generating a dual functional phage nanofiber, termed fd-HH-IP (Figure 1C) . We verified that the peptide HH could bind to PD-L1 through molecular dynamics simulation. When the peptide HH was displayed on the phage, the phage could bind PD-L1, which was confirmed using ELISA. When fd-HH-IP phage was intravenously injected into the B16-F10 melanoma mouse model, in vivo assays demonstrated that it could target melanoma tumor and bind PD-L1 to block PD-1 / PD-L1 recognition, significantly inhibiting tumor growth through immunotherapy. Since peptides targeting other immune checkpoints or other tumors can be screened by biopanning and genetically displayed on the phage nanofibers in the same manner, our strategy of discovering tumor-targeting immune checkpoint blockers can be expanded to treat other malignant tumors. RESULTS AND DISCUSSIONS

[0072] We used our modified biopanning procedure to obtain the peptide that bound the PD-1-binding epitope on PD-L1 (Figure 2A) . The resultant peptide was termed the PD-L1-binding peptide. At the beginning of biopanning, we collected the phages that did not bind to the PD-1 / PD-L1 complex. Since these phages potentially bound the PD-1 / PD-L1 recognition sites, we used them as a sub-library for the following three rounds of biopanning to identify the PD-L1-binding peptide. The input of phage was fixed at 2 × 1011 pfu for every round. The outputs of the eluted PD-L1 affinity phages detected by titer were 4.4 × 105, 6.82 × 105, and 7.11 × 105 pfu. Correspondingly the ratio of output and input (O / I) was 2.20 × 10-6, 3.41 × 10-6, and 3.56 × 10-6 for rounds 1-3, respectively, indicating an expected enrichment of PD-L1 affinity phages from rounds 1 to 3 (Figure 2B) . At the end of round 3, 50 blue phage plagues on the plate were picked up randomly for DNA sequencing. We obtained the most dominant peptide HWFHRHH (SEQ ID NO: 1, termed HH) with 5 repeats, a second dominant peptide WSLGYTG (SEQ ID NO: 3, termed WG) with 4 repeats, and a peptide LPLITFN (SEQ ID NO: 2, termed LN) with 2 repeats. There was only one repeat in the remaining of 39 sequences (Table 1) .

[0073] Then an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was carried out to verify whether the phage displaying HH, LN or WG bound to PD-L1 protein with a strong affinity. For better comparison, we also introduced a phage displaying an unselected sequence (WHKWPRF, SEQ ID NO: 8, termed WF) , the wild typt phage (WT) and control PBS group. ELISA results showed the HH, LN, and WG phage had significantly higher affinity towards PD-L1 protein than WF phage and WT phage (Figure 2C) . Besides, ELISA results indicated that HH had a significantly higher PD-L1-binding affinity than WG and LN. Then we tested the physical and chemical properties of the three peptides using an online tool (novopro. cn) , including the isoelectric point of the peptide, grand average of hydropathy (GRAVY) , and pH-dependent charges. The GRAVY value of peptide HH, WG and LN was -2.2, -0.1 and +1.3. Thus, HH is hydrophilic, but LN is hydrophobic, indicating LN has poor solubility in aqueous solutions, which might influence its therapeutic effect (Table 2) . Next, using an online CABS-dock server, we performed docking to understand the binding between the PD-L1-binding peptide (HH, LN or WG) and the PD-1-binding epitope on the PD-L1 (PDB file, 3bik) . We also added the unselected peptide WF and a sequence GGGGGGG (SEQ ID NO: 9, termed GG) as controls. The possible CABS-dock models of peptide WF, GG, HH, WG or LN based on the root-mean-square deviation (RMSD) and cluster density showed that only peptide HH could bind to the epitope with a high affinity among the five peptides, indicating that HH could bind to PD-1-binding sites on PD-L1 (Figure 2D; Table 3) .

[0074] To explore their use in cancer therapy, we tested the cell toxicity of peptides and the phages that display them. B16-F10 cells were incubated with the peptide (HH, LN, or WG) at different concentrations (1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, and 0 mg mL-1) . In parallel, B16-F10 cells were also incubated with the WT phage or biopanning-screened phages displaying HH, WG, or LN at the tip (termed the Ph-HH, Ph-WG, or Ph-LN phage) at two different concentrations (1011 and 1012 pfu mL-1) . Then the cell counting kit-8 (CCK-8) assay was carried out to measure cell viability. The results indicated that the peptide HH, WG and LN did not show significant toxicity against B16-F10 cells, even at the highest concentration (1 mg mL-1) (Figure 2E) . All four phage groups with the two different concentrations showed similarly high cell viability (Figure 2F) . To compare the affinity of these peptides with PD-L1 protein in vitro, the PD-L1 protein on the cells was stained by immunofluorescence by allowing the cells to be incubated with the rhodamine B (RB) -conjugated peptides or tetraethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC) labeled phages (Figure 2G) . Bright red fluorescence was observed around tumor cells incubated with the peptide HH or Ph-HH, which indicated that the peptide HH or phage Ph-HH had a strong affinity. The results were consistent with that of ELISA experiments. Then, the TR-FRET assay, a combination of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) and Time-Resolved Fluorescence (TRF) was adopted to validate the ability of the HH-displaying phage to block the PD-1 / PD-L1 binding. The inhibitory strength of a good inhibitor should be inversely proportional to the FRET signal (fluorescence intensity ratio at 665 nm for acceptor and 620 nm for donor according to the TR-FRET assay kit) . Thus, the results show that the phage Ph-HH inhibits the PD-1 / PD-L1 binding more greatly than the other selected phages (Ph-LN, Ph-WG) and the WT phage. Taken together, peptide HH shows the best affinity to the PD-L1 over-expressed on B16-F10 cells among all of the peptides.

[0075] To verify the PD-L1 blockade effect of the PD-L1-binding small peptides and peptide-displaying phages, the intratumoral therapy was conducted by directly injecting them into the tumors. We first generated a subcutaneous melanoma model on the C57BL / 6 mice with B16-F10 cells. As the average length of the tumor reached 5 mm, 100 μL of the drugs each were given intratumorally. The drug groups included the peptide (HH, WG, or LN, 5 mg kg-1) , the anti-PDL1 antibody (a-PDL1, 5 mg kg-1) , and the phage (1 × 1012 pfu kg-1) , along with PBS as a control group. Five phage groups were studied, including fd-HH (HH fused to pVIII of phage) , Ph-HH (HH fused to pIII of phage) , Ph-LN (LN fused to pIII of phage) , Ph-WG (WG fused to pIII of phage) , and WT phage. The given doses were injected every day until the end of the experiment. The mouse weight and tumor volume were measured and recorded every other day (Figure 3A) . When the average diameter of tumors in the PBS control group reached 1.5 cm, mice were euthanized, and tumors were picked up, measured, and weighed (Figure 3B-D) .

[0076] Monitoring the tumor volume during the treatment (Figure 3C) , along with measuring the final tumor weights (Figure 3B) and imaging the final tumor tissues (Figure 3D) , indicates that fd-HH was the most effective in inhibiting tumor growth among all groups of peptides / phages and was even as effective as the commercial a-PDL1. The tumor volume in fd-HH group, just like the a-PDL1 group, remained almost unchanged until day 19 during the treatment. A comparison between the free peptides (HH, LN, or WG) and the peptide-displaying phages (fd-HH, Ph-HH, Ph-LN, or Ph-WG) confirmed that HH inhibited the tumor growth most efficiently among all of the three peptides and the phage-displayed peptides were more effective than their free counterparts. A further look at the results of fd-HH and Ph-HH indicated that for the same peptide HH, its display on the sidewall of phage (fd-HH) outperformed that at the tip of phage (Ph-HH) in suppressing tumor growth. This can be explained by the fact that HH is fused to ～3900 copies of pVIII in fd-HH in comparison to the 5 copies of pIII in Ph-HH, indicating that improving the number of PD-L1-binding peptides on phage can enhance the efficacy in inhibiting PD-1 / PD-L1 recognition for immunotherapy. No significant difference appeared in the weight of melanoma-bearing mice treated with different agents, implying no toxicity of peptides and phages existed due to their biocompatibility (Figure 6) .

[0077] We analyzed the cytokines of serum and the necrosis or immune cells of tumor tissues at the endpoint of the therapy. We used ELISA to determine the serum levels of four cytokines, including granzyme B (GZMB) , IL-2, IFN-γ and TNF-α, which are reported markers of successful immunotherapy. The serum level of GZMB, IL-2, IFN-γ, and TNF-αcytokines in the fd-HH group was significantly higher than that in the groups of WT phage, HH peptide and PBS (Figure 3E-H) . The serum level of GZMB and IL-2 in the Ph-HH group was higher than that in the groups of Ph-LN and Ph-WG, which indicated that the HH peptide could induce the strongest immune reaction in the tumor-bearing mice. Hematoxylin-eosin (H&E) staining of the tumor tissues results exhibited that a big area of necrosis occurred in the a-PDL1 group and the phage groups (fd-HH and Ph-HH) , in which the tumor cell structure was destroyed, and the immune cells were aggregated (Figure 3I) . The free peptide groups and the WT group showed a local necrosis area, and some immune cells were aggregated. The tumor cells in the PBS control group exhibited a normal morphology. The immunofluorescence of red-stained CD8+ and green-stained CD4+ on T cells in the tumor tissues indicated that more CD8+CD4-T cells appeared in the PD-L1 and fd-HH groups than the other groups (Figure 3J) . We utilized ImageJ for semi-quantitative analysis of immunofluorescence images, and numerically showed that there were more CD8+ CD4-cells and CD4+ CD8-cells in the PD-L1 and fd-HH groups. Flow cytometry detected the presence of the helper T cells (termed Th, CD4+ CD8-) and the cytotoxic T cells (termed CTL, CD8+CD4-) in the blood. These results indicate that much more CTL exists in the fd-HH group, similar to the a-PDL1 group, which also confirmed its better immune effect than the other peptides / phages groups. Furthermore, we increased the dosage of the fd-HH phage group (2.5 × 1012 pfu kg-1) and PD-L1 antibody group (a-PDL1, 10 mg kg-1) , and observed that the tumor inhibition ability of fd-HH was still significant during the 27-day treatment (Figure 7) . In order to better evaluate the possible side effects in clinical use, we carried out biochemical analysis such as blood hematological assessment, liver function and kidney function tests. After the long-term administration, there existed no significant difference in all of the biochemical indicators between the fd-HH and PBS groups. However, some indicators (AST and LDH) of the PD-L1 antibody group were abnormal, indicating the liver side effects of using the PD-L1 antibody.

[0078] Furthermore, research based on PD-1 / PD-L1 has also been assessed using murine colon adenocarcinoma MC38 cell line. 28 To demonstrate the broad applicability of the fd-HH phage in immunotherapy-related tumor models, we also applied the fd-HH phage to the MC38 tumor model, confirming its effectiveness in inhibiting tumor growth. Specifically, we employed the tumor models derived from the MC38 cells to validate the immunotherapeutic efficacy of fd-HH using the dosage of 2.5 × 1012 pfu kg-1. The phage or PBS was administered by intratumoral injection every other day. We observed that the therapeutic efficacy of fd-HH in the MC38 tumor model was still significant compare to the control groups (Figure 8) .

[0079] The lack of the tumor-targeting ability of the reported PD-L1 blockers could cause off-target adverse effects in the anti-PDL1 immunotherapy. To solve this problem, we proceeded to discover a melanoma-targeting peptide from a phage library through a modified biopanning, where in vivo screening and in vitro cell screening were processed alternately (Figure 4A) , both with a phage input of 2 × 1011 pfu. The output / input ratio was increased from round 1 to 2 in the in vivo screening and from round 1 to 2 in the in vitro screening (Figure 4B) . This result indicates a good enrichment of the melanoma-targeting phages during the in vivo and in vitro screening (Figure 4B) . Then 87 blue phage plaques were randomly picked up for DNA sequencing to determine the sequence of melanoma-binding peptides at the end of biopanning. We found that two peptides (SNTALPSKFYGY, SEQ ID NO: 5, termed SY; INQDARTMVMVP, SEQ ID NO: 4, termed IP) were the most dominant with 4 repeats and two peptides (DHAQRYGAGHSG, SEQ ID NO: 6, termed DG; ASVASGGWNPHR, SEQ ID NO: 7, termed AR) were less dominant with 3 repeats (Table S4, Supporting Information) . We randomly chose one of the unselected sequence (NHWNTLLETSWL, SEQ ID NO: 10, termed NL) as the control group.

[0080] The information content distribution of the selected tumor-homing peptide library was given by a bioinformatics program named receptor-ligand contacts (r) . 29 The distribution curve of the tumor-homing subset was shifted rightward and upward compared to the normal curve of the original library, which implied that the sub-library with a higher melanoma-targeting ability was successfully discovered (Figure 4C) . We picked five peptides (IP, SY, DG, AR and NL) and labeled them with Cyanine 5 dye at their C-terminal ends for in vivo fluorescence imaging. Each labeled peptide (1 mg mL-1) was given to mice via the tail vein injection. The imaging of the mice indicated that IP and SY showed strong fluorescence and thus high melanoma affinity, while NL showed little fluorescence and thereby weak melanoma affinity. The phage titer was then carried out to verify that IP or SY had a greater melanoma-targeting ability than the other peptides (Figure 9) . After 3 h of intravenous injection of phages into the tail of the mouse, the heart was perfused, and major organs and tumors were excised and ground to release the phages. Next, the titer of phages per milligram of organs showed that the number of phages displayed with IP at pIII (termed Ph-IP) or with SY at pIII (termed Ph-SY) in tumors was about 7 times and 5 times higher than that of WT phage, respectively. Moreover, the phages displaying the unselected peptide NL (termed Ph-NL) manifested a much lower targeting ability than the phage Ph-IP and Ph-SY, and showed no significant difference compared with WT phage. These results indicate that IP is the best melanoma-targeting peptide among all peptides studied.

[0081] To construct nanofibers that could inhibit tumor growth through targeted immunotherapy, we employed a dual display system to genetically engineer fd phage by displaying two peptides, including the best melanoma-targeting peptide (IP) at the tip (pIII) and the best PD-L1-binding peptide (HH) on the sidewall (pVIII) , generating a dual displayed phage (fd-HH-IP) . We also constructed two control phages, fd-HH-NL (with IP in fd-HH-IP replaced by NL) and fd-GG-IP (GGGGGGG, SEQ ID NO: 9, termed GG, with HH in fd-HH-IP replaced by GG) , respectively. The DNA sequence results of the dual-displayed phage confirmed that peptides were successfully double-displayed. The dual-displayed and WT phages were confirmed to be nanofibers by transmission electron microscopy (TEM) (Figure 4D) . Then we tested the phage titer to verify that fd-HH-IP or fd-GG-IP had a greater melanoma-targeting ability than fd-HH-NL and WT (Figure 4E) . The accumulation of fd-HH-NL in various organs was greater than that of fd-HH-IP and fd-GG-IP, which supported the statement that PD-L1 protein is broadly distributed in various tissues. In addition, we focused on the uptake of phages by neutrophils in the blood. The phages were given into the mice via tail vein injection. After their circulation for 3 h, the neutrophils were isolated from mouse blood using a Mouse Neutrophil Enrichment kit. After cell lysis, the uptake of phages by neutrophils was verified by titering.

[0082] To test the cell toxicity of the dual-displayed phages, we incubated melanoma B16-F10 cells or human embryonic kidney 293T cells with each of the four phages (fd-HH-IP, fd-HH-NL, fd-GG-IP, WT) at different concentrations (1010, 1011 and 1012 pfu mL-1) and for different incubation times (4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h) , respectively. Then CCK-8 assay was applied to measure the cell viability and proliferation of B16-F10 and 293T cells incubated with the phages. Even at the highest concentration, all of four phages had no significant toxicity (Figure 4F) . The live / dead cell assay further demonstrated that these phages were not toxic to both B16-F10 and 293T cells. In addition, the hemolysis assay was performed by mixing the blood and each of these phages for 6 h to test their blood compatibility (Figure 4G) . None of the phage groups exhibited visible erythrocyte lysis, indicating that the dual-functional phages were blood-compatible and not significantly toxic in the tumor-bearing mice model.

[0083] To demonstrate the use of the dual-displayed PD-L1-binding melanoma-targeting phage (fd-HH-IP) in targeted immunotherapy, we intravenously injected 100 μL of each of the four phage groups (fd-HH-IP, fd-HH-NL, fd-GG-IP, WT) at 2.5 × 1013 pfu kg-1 into the melanoma-bearing mice through the tail vein every other day, starting from the third day after inoculating B16-F10 tumor cells (Figure 5A) . 100 μL of the a-PDL1 antibody (10 mg kg-1) and PBS were employed as a positive and negative control, respectively. Monitoring the tumor volume during the treatment as well as imaging and weighing the tumors at the endpoint collectively verified that the fd-HH-IP group was the most effective among all of the groups and even inhibited the tumor growth more effectively than the a-PDL1 (Figure 5B-D) . A further comparison between fd-HH-IP and fd-HH-NL revealed that the former exhibited a significantly stronger capability of inhibiting tumor growth than the latter (Figure 5E) . This indicated that the IP peptide enabled the fd-HH-IP phage to actively target melanoma while the fd-HH-NL only passively targeted the tumors through the enhanced permeability and retention (EPR) effect; in both cases, the HH peptide on the sidewall of the phage blocked the PD-1 / PD-L1 recognition for immunotherapy.

[0084] To further verify the immunotherapy by the fd-HH-IP phage, we measured the amount of immunotherapy-related cytokines in serum and detected the necrosis and immune cells in the tumor tissues at the endpoint of the treatment. We first used ELISA to determine the serum levels of three cytokines, including TNF-α, IFN-γ and IL-2. The EILSA results (Figure 5G-I) showed that the fd-HH-IP group resulted in a significantly higher level of these cytokines than the other groups (fd-HH-NL, fd-GG-IP, WT phage, and PBS) . Meanwhile, H&E images of the tumor tissues showed that the fd-HH-IP group, comparable to the a-PDL1 group, exhibited a large area of necrosis, destroyed tumor cells, and aggregated immune cells. In contrast, the control phage groups presented a small localized necrosis area, and the PBS group showed normal morphology (Figure 5J) . Through immunofluorescence-based detection of CD8+ (stained red) and CD4+ (stained green) on T cells in the tumor tissues, we found that the fd-HH-IP group, similar to a-PDL1, exhibited more CD8+CD4-T cells (CTL) than the other phage groups and the PBS group (Figure 5K) . Collectively, these results showed the dual-functional phage fd-HH-IP could efficiently target melanoma by the melanoma-targeting peptide (IP) and block the PD-L1 / PD-1 axis by the PD-L1 affinity peptide (HH) , resulting in the most efficient suppression of tumor growth through immunotherapy.

[0085] To evaluate the systemic toxicity of these dual-displayed phages, the mouse weight was measured every second day (Figure 5F) . The mouse weight dosed with fd-HH-IP grew up at a similar trend as the other groups, including the PBS group, indicating that the fd-HH-IP treatment did not cause systemic toxicity in vivo. At the endpoint, the H&E staining identified no obvious abnormalities, such as disturbed areas, inflammation or bleeding, in major organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) of the mice treated with fd-HH-IP and the other groups. Moreover, the hematological assessment confirmed the biocompatibility of the fd-HH-IP phage, similar to the PBS group. This result was consistent with the aforementioned hemolysis results, indicating that the dual-functional phage fd-HH-IP was blood-compatible and safe for cancer treatment.

[0086] In order to further verify the biological safety of phage and its possible inflammatory response, we intravenously injected 100 μL of the therapeutic phage drug (fd-HH-IP) and wild type phage (WT) (each with a concentration of 2×1012 pfu / mL in PBS) as well as PBS separately into the healthy mice. The blood samples were drawn for hematological and biochemical analysis 7 days after the injection and there existed no significant difference in indexes of the hematological assessment, liver function and kidney function between the phage (WT, fd-HH-IP) groups and the PBS group. The concentration of immunoglobulin IgG or IgM in serum was measured by ELISA on the 3rd, 5th, 7th and 9th day after injection. After the injection of the fd-HH-IP or WT, the amount of IgG and IgM in the serum varied following a trend as the PBS group; it was gradually increased until the 5th day and then was decreased to the level on day 9 at which the phage groups and the PBS group did not show significant difference. Therefore, these data indicate that the therapeutic phage can trigger a humoral immunity for a short time without causing any serious immune side effects. This observation is supported by other studies. 21, 30 We also investigated the time course of the elimination of phage and peptide from blood (Figure 10) . The half-life of HH peptide, WT phage, and fd-HH-IP phage in the blood is 18.84 min, 99.21 min, and 114.7 min, respectively, which means that the phages are cleared at a rate much slower than the peptide in the blood.

[0087] The immunotherapy strategy described in this work can be potentially employed to treat other types of cancer since the melanoma-targeting peptides could be replaced by peptides homing to the tumors of other types that overexpress PD-L1 (e.g., non-small-cell lung cancer, urothelial carcinoma, colorectal adenocarcinoma, breast carcinomas, and non-clear cell renal cell carcinoma) . Moreover, the peptides, which can target other immune checkpoints for immunotherapy, inflammatory targets for treating inflammatory diseases, or receptors on the virus for blocking virus infection, can be obtained by biopanning. These peptides can be genetically dual-displayed on the phage nanofibers in the same manner. Hence, this therapeutic strategy can be expanded to treat other diseases by displaying multiple targeting peptides on the single fd phage. CONCLUSIONS

[0088] We firstly identified a PD-L1-binding peptide HH from a phage-displayed peptide library by a site-specific biopanning strategy. Then we injected the HH-displaying phage into the melanoma-bearing mice to verify its ability to inhibit tumor growth intratumorally. Next, we identified a melanoma-targeting peptide IP from the phage-displayed peptide library by a combination of in vivo and in vitro biopanning. We then verified the melanoma-targeting ability of the IP-displaying phage in melanoma-bearing mice by the phage-tittering method. Afterward, we displayed the melanoma-targeting peptide (IP) and the PD-L1-binding peptide (HH) at the tip and on the sidewall of a single fd phage, respectively, producing the dual-functional fd-HH-IP phage. Similar to the anti-PDL1 antibody, the fd-HH-IP phage, intravenously injected into melanoma-bearing mice, could target melanoma tumors and block PD-1 / PD-L1 axis to inhibit the immune escape of tumor cells, significantly suppressing the tumor growth. We verified the successful immunotherapy by detecting a high level of cytokine biomarkers in serum and increased cancer cell necrosis and CTL activity in tumor tissues. The fd-HH-IP phage did not show toxicity to normal cells and incompatibility with blood, nor did it cause damage to major tissues or organs other than tumors during the treatment. MATERIALS AND METHODS

[0089] The site-specific affinity screening of PD-L1 affinity peptide (Fig. 2A) . The site-specific method was improved by the standard protocol of the phage affinity screening (biopanning) program. At the beginning of biopanning, 150 μL of the purchased PD-L1 extracellular domain protein (Cat. #: 10084-H02H, Sino Biological Inc. ) was added into the 24-well cell culture plate and kept in a humid box at 4 ℃ for 12 h. Then the supernatant was pipetted out, and 150 μL of the purchased PD-1 protein (Cat. #: 10377-H08H, Sino Biological Inc. ) was added and incubated with PD-L1 protein for 2 h. The solution was pipetted out, and 10 μL of Ph. D. -7 parent phage library (2 × 1011 pfu) (Cat. #: E8100S, New England BioLabs Inc. ) was added and incubated for 2 h. The supernatant was collected and used as a sub-library for the following three-round biopanning. For biopanning of round 1-3, 150 μL of PD-L1 protein solution was diluted to 50, 25, and 12.5 μg mL-1, respectively, and incubated on the 24-well plate to achieve PD-L1 immobilization. After overnight incubation, the residual PD-L1 solution was pipetted out, and 2 mL of a blocking solution (5 mg mL-1 BSA) was added and incubated at 4 ℃ for 2 h. Meanwhile, 100 μL of sub-library phages (2x1011 pfu) were added and incubated in a new well for 2 h. Then, the BSA blocking solution was pipetted out, and the phage solution was added into the PD-L1 immobilized well. Then the solution in the well was pipetted out completely, and the well was washed with PBST 6 times. 100 μL of 0.1 M elution buffer (0.1%BSA, pH = 2.2) was added into the well and kept for 10 min. Then 100 μL of 1 M Tris-HCl (pH = 9.1) was added into the well to neutralize the elution buffer. The selected solution with eluted phages was applied as the subphage library in the next round.

[0090] Titer of a phage solution. The 2 μL of elution solution was diluted 20, 200, and 2000 times by PBS. Then 10 μL of each diluted solution was added to 200 μL of mid-log phase ER2738 E. coli (OD600 = 0.5) . 15 min later, the cells were transferred onto the pre-warmed LB / IPTG / X-gal plate, which was further kept at 37 ℃ overnight. The number of blue phage plaques was counted, and the titer of the phage solution was calculated. The titer was determined by equation 1: titer = 100 × N × F pfu mL-1, where N and F are the number of phage plaques on a plate and the dilution factor, respectively.

[0091] Purification and amplification of screened phages. The elution solution was added into 20 mL of mid-log phase ER2738 (OD600 = 0.5) , which was incubated at 37 ℃for 0.5 h to allow the phages to infect the bacteria. Then the mixture was shaken at 220 rpm for 4 h to amplify the phages. After amplification, the culture mixture was centrifuged at 12,000 g for 0.5 h to remove the precipitated E. coli. The PEG / NaCl solution (20%PEG 8000, 2.5 M NaCl) was added to the supernatant at a ratio of 1: 6, and the mixture was stored at 4 ℃ overnight, resulting in the precipitation of phages. Then the mixture was centrifuged, and the precipitated phages were mixed with PBS, spun with a vortexer, and centrifuged again to remove the impurity. Next, the PEG / NaCl solution was added to the supernatant, and the mixture was stored at 4 ℃. After 4 h, the mixture was centrifuged, and the precipitated phages were re-spun after being mixed with 200 μL of PBS.

[0092] Assay of binding affinity between PD-L1 protein and selected phages. High-frequency clones identified by DNA sequencing were amplified and purified by the standard protocol. Then phage ELISA was employed to verify the affinity of the phages toward the PD-L1 protein. Firstly, 50 μL of PD-L1 solution (25 μg mL-1) was added into the 96-well microplate and stored in a humid chamber at 4 ℃ overnight to enable the immobilization of PD-L1 on the plate. The solution of the non-immobilized PD-L1 was pipetted out, and 200 μL of blocking solution (5 mg mL-1 BSA) was then added and incubated in the well for 2 h. After the well was washed with TBST 6 times, 50 μL of purified high frequency phages (2 ×108 pfu) was added and incubated with the immobilized PD-L1 protein for 1 h. The well was rinsed by TBST 5 times, added with 100 μL of anti-phage coat protein g8p antibody (Cat. #: ab9225, Abcam Inc. ) , and incubated at 37 ℃ for 2 h. Then the solution was pipetted out of the well, and the plate was washed. 100 μL of HRP-labeled goat anti-mouse secondary antibody (Cat. #: ab6789, Abcam Inc. ) was added to the well and incubated at 37 ℃ for 2 h. The residual liquid was removed from the well. Finally, 100 μL of TMB ELISA Substrate (Cat. #: ab171523, Abcam Inc. ) was added into the well, and the plate was kept at 37 ℃. When the blue reaction products were observed, 100 μL of H2SO4 (2 M) was pipetted into the well to stop the reaction promptly, turning the solution color from blue into yellow and thus allowing the absorbance of each well at 450 nm to reflect the binding of phages with PD-L1.

[0093] MD simulation of the binding model of the peptides and PD-L1 protein. The model of the peptide-protein complex was processed using the online server, CABS-docking, which performed simulation and searched for the potential binding site (s) while tolerating small fluctuations of the receptor backbone and full flexibility of the peptides. The best docking model determined from the CABS-dock results was chosen as the initial structure.

[0094] Cell culture. Two cells (B16-F10, a skin melanoma cell from mouse; 293T, a highly transfectable derivative of human embryonic kidney 293 cells) purchased from ATCC were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with 1%Penicillin-Streptomycin (P / S) and 10%fetal bovine serum (FBS) . MC38, a murine colon adenocarcinoma cell, was purchased from Cell Bank, Chinese Academy of Sciences.

[0095] Cell proliferation / toxicity assay. B16-F10 or 293T cells were inoculated in the 96-well plate (2000 cells per well) for 24 h. 100 μL of the peptide (0, 6.25, 12.5, 25, 50 or 100 μg) or the phages (109, 1010 or 1011pfu) were added into the separate wells on a plate. After the plate was incubated for 24 h, 10 μL of Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Cat. #: BA00208, Bioss Antibodies Inc. ) was added into the well without introducing air bubbles, and the plate was then kept in the incubator for 2 h. The optical density (OD) value at 450 nm of the solution in the well was recorded when the solution exhibited a significant color change. The cell survival rate was calculated by equation 2: cell survival rate (%) = [ (Ax -Ab)  /  (Ac -Ab) ] × 100, where Ax is the OD value of one test well added with CCK-8, the culture medium, the cells (B16-F10 or 293T) , and the test compound (phage or free peptide) ; Ac is that of one control well added with CCK-8, the culture medium, and the cells; Ab is that of one blank well added with CCK-8 and the culture medium.

[0096] In vitro fluorescence imaging method. B16-F10 cells were incubated onto a cell slide in the 6-well plate overnight. Then, 1 mL of peptides modified with Rhodamine B (0.1 mg / mL) or 1 mL of phages modified with Tetramethylrhodamine isothiocyanate (1011 pfu / mL) were incubated with B16-F10 cells for 1 h. Next, 1 mL of 4%paraformaldehyde (PFA) was added to the plate and kept in the dark for 30 min. Then, 5%BSA was added into the plate and incubated for 1 h. Next, a PDL1 antibody (Cat. #BP0101, BioXcell Inc. ) was added and incubated at 37 ℃ for 1 h, followed by incubation with a FITC labled goat anti-rat secondary antibody (Cat. #E031240, EarthOx Llc Inc. ) at 37 ℃ for 1 h. Then, 100 μL of DAPI staining solution (Cat. #: C0065, Solarbio Inc. ) was added into each well, and the plate was placed in the incubator for 3-5 min. The residual liquid was removed and the plate was washed with PBS each time. Finally, the cells linked with peptides or phages were imaged under a fluorescence microscope.

[0097] TR-FRET assay. The affinity phages (Ph-HH) , the control phages (Ph-LN, Ph-WG) , the wild-type phages, and the standard control were diluted to 42, 21, 10.5, 5.25, 2.625, 1.31, 0.65, 0.32, 0.16, 0.08, or 0.04 μg / mL, respectively. Then the diluted solution was added into the wells containing the Human PD1 / PD-L1 Kit (Cat. #: DD2203, Vazyme Biotech Co. Ltd. ) for further measurement. The FRET signals of each inhibitor at those concentrations were fitted by a logistic method.

[0098] Inhibition of tumor growth in melanoma-bearing mice by PD-L1 affinity peptides and phages. B16-F10 cells (5 × 105) were injected subcutaneously into the 6-8 weeks old C57BL / 6 mice to generate melanoma-bearing mice. As the average length of the tumor reached 5 mm, 100 μL of the peptide drugs (5 mg kg-1) , the phage drugs (1 × 1012 pfu kg-1) or the a-PDL1 (Cat. #BP0101, BioXcell Inc., 5 mg kg-1) were given through intratumoral injection every day. The volume of the tumor was recorded every other day. The mice were euthanized when impaired vital signs appeared, or the average diameter of the tumor in PBS control group exceeded 1.5 cm. After the treatment, the tumors were stripped and weighed. The calculation of tumor volume was followed by equation 3: tumor volume =0.5 × a2 × b, where a is the tumor width, and b is the tumor length.

[0099] H&E staining. After treatment, all mice were euthanized, and their major organs were picked up. The organs were fixed in 4%neutral buffered formalin and then processed into paraffin sections. The sections were stained with the Hematoxylin and Eosin (H&E) Staining Kit (Cat. #SL7070, Coolaber Science &Technology Co., Ltd. ) and observed under an optical microscope.

[0100] Cytokines assay: After treatment, the mice were anesthetized and the whole blood was collected by cardiac puncture. The whole blood was placed at room temperature for 2 h and then centrifuged at 4000 rpm for 15 min. The precipitates were discarded, and the supernatant serum was taken out carefully with a pipette. The level of IL-2, TNF-α, IFN-γ, and GZMB in the serum was measured using their corresponding quantification kits (Cat. #: KE10004 for IL-2, KE10002 for TNF-α, and KE10001 for IFN-γ, from Proteintech Group Inc. ; Cat. #: EK5477 for GZMB, Signalway Antibody Inc. ) .

[0101] Multiplex immunofluorescence (mIF) of CD4 and CD8: After the section was deparaffinized, a citrate antigen retrieval solution (Cat. #: P0081, Beyotime Biotech Inc. ) was used to retrieve antigens. Then the paraffin section was covered by 50 μL of BSA for 10 min, incubated with 50 μL of CD4 primary antibody (Cat. #: 25229T, Cell Signaling Technology Inc. ) overnight at 4 ℃. After washing away the primary antibody on the paraffin section, the slide was covered again by 50 μL of a secondary antibody (Cat. #: HKI0029, HaoKe Biotechnology Co. Ltd. ) for 1 h. Then the paraffin section was washed again and covered with a tyramide signal amplification (TSA) reagent (Cat. #: HKI0014, HaoKe Biotechnology Co. Ltd. ) for 10 minutes. Then the CD8 primary antibody (Cat. #: 98941T, Cell Signaling Technology Inc. ) and the secondary antibody were incubated with the paraffin section by the same procedure. Another tyramide signal amplification (TSA) reagent (Cat. #: HKI0015, HaoKe Biotechnology Co. Ltd. ) was incubated for 10 minutes. Then the DAPI staining solution (Cat. #: C0065, Solarbio Inc. ) was added to cover every section. The section was placed at 37 ℃ for 30 s, and washed by PBS three times. After paraffinizing to xylene, the section was covered with glass and observed by an optical microscope.

[0102] Flow Cytometry: The cell suspension was adjusted to a concentration of 5 × 106 cells / mL in buffer solution. 5 μL of the FITC-labeled anti-CD4 antibody (Cat. #: 10400-M001-F, Sino Biological Inc. ) or PE-labeled anti-CD8 antibody (Cat. #: 10980-MM48-P, Sino Biological Inc. ) was added and incubated with 90 μL of cells for 30 min. After the mixture was centrifuged at 300 g three times, the precipitated cells were re-spun in 500 μL of the prepared solution and analyzed on the flow cytometer shortly. In vivo and cell screening of melanoma-targeting peptides

[0103] In vivo screening: When the tumor diameter reached 0.5 cm, 10 μL of Ph. D. -12 library (2 × 1011 pfu) (Cat. #: E8110S, New England BioLabs Inc. ) was intravenously injected through the tail vein. After the library was circulated for 3h, the mice were anesthetized. A clipper created a small incision in the right atrium, then 20 mL of saline solution was injected into its left ventricular for cardiac perfusion, washing away the phages which were unbound to any tissue. Afterward, the tumor was picked up and ground into homogenates. After the homogenates were centrifuged at 1000 rpm for 20 min, the pellet was removed, and the supernatant was collected with a pipette gently. The supernatant was added into mid-log phase ER2738 E. coli (OD600 = 0.5) to allow the phages to infect bacteria. The phages were amplified and purified as the above procedure and then applied as the sub-library for the next round.

[0104] Cell screening: B16-F10 cells were cultured on the 25 cm2 cell culture flask with DMEM / FBS / PS (10%, 1%) , and the number of cells reached 90%of the flask after 24-hour culture. Then the medium was cleared gently using a pipette and replaced with 5 mL of the culture medium without serum. Meanwhile, 10 μL of phage library (2 × 1011 pfu) was added into 2 mL of the blocking buffer (0.5%BSA) in a blank flask. The cell culture flask and the blank flask were both placed at 37 ℃ for 1 h. Then the medium without serum in the cell culture flask was discarded and substituted with the blocking solution from the blank flask with a pipette. The cell culture flask was placed in the cell incubator for 1 h. Next, the blocking solution was removed gently from the flask, which was further washed with 4 mL of cold washing buffer (0.1%Tween 20 and 0.5%BSA) 10 times to remove the unbound phages. Then 800 μL of elution buffer (1 mg mL-1 BSA, 0.1 M glycine, PH = 2.2) was added into the flask to elute the binding phages from the cells. After the flask was cooled on ice for 15 min, the solution in it was neutralized with 150 μL of Tris-HCl. Finally, the eluted cell-binding phages in the flask were allowed to infect bacteria, amplified, and purified as the procedure mentioned before.

[0105] Study of the bio-distribution of the melanoma-targeting peptides and phages. For the bio-distribution of the melanoma-targeting peptides, the selected peptide with biotin labeled was linked with Cy5-labeled streptavidin for in vivo fluorescence imaging. When the diameter of the tumor reached 0.5 cm, 100 μL of the peptide linked with Cy5 (1 mg / mL) was injected intravenously into the melanoma-bearing mice and circulated for 2 h. Then the mice were imaged using an in vivo imaging system.

[0106] For the bio-distribution of phages, 100 μL of the phage (2 × 1010 pfu) was given into melanoma-bearing mice through tail vein injection. After the circulation of the phages in vivo for 3 h, the mice were anesthetized by chloroform, and 20 mL of saline solution (0.9%NaCl) was injected into their left ventricular for cardiac perfusion, clearing the phages (unbound to any tissue) out of the animals. The tumor and major organs, such as the kidney, spleen, liver, heart, and lung, were picked up and washed with 0.9%NaCl solution. The phage titer was determined in two steps. Firstly, after the removal of the liquid by filter paper, the weight of every organ was measured and recorded. The tumor and organs were homogenized with a cell lysis buffer (1 mL) and ground. The resultant suspension was centrifuged to release the phages into the supernatant. Secondly, the supernatant was diluted in 10-fold gradients from 102 to 104, respectively. 10 μL of the diluted solution was pipetted into 90 μL of mid-log phase E. coli (ER2738) , allowing the phages to infect the bacteria for 0.5 h. Then the infected E. coli was spread onto the LB / IPTG / Xgal plate (50 μg mL-1 of IPTG in LB solid medium, 40 μg mL-1 of Xgal in LB solid medium) . As for the production of dual-functional phages, the bacteria were replaced by TG1 and the plate was replaced by the Tet plate (40 μg mL-1 of Tet in LB solid medium) . The plate was kept in the 37 ℃incubators overnight, and the number of blue (for LB / IPTG / Xgal plate) or white plaques (for Tet plate) was recorded. Finally, the quantity of phages was calculated by equation 4: quantity = 100 × N × F  / Q pfu mL-1, where N, F or Q is the number of the phage plaques on a plate, dilution factor, or the weight of the organ.

[0107] Construction of engineered dual-functional melanoma-targeting PD-L1-binding phages. The phage dual display system was used to display two types of peptides on different regions of a single phage to form dual-functional phages. One was the PD-L1 affinity peptide (HWFHRHH, SEQ ID NO: 1, termed HH) or the control nonaffinity peptide (GGGGGGG, SEQ ID NO: 9, termed GG) , fused to the sidewall of the fd phage. The other was the melanoma-targeting peptide (INQDARTMVMVP, SEQ ID NO: 4, termed IP) or the unselected peptide (NHWNTLLETSWL, SEQ ID NO: 10, termed NL) , fused to the tip of fd phage.

[0108] Display of PD-L1 affinity peptides (HH) on pVIII: To start with, we designed and purchased a pair of complementary nucleotides (SEQ ID NO: 11, 5′-AGCTTTGCCACCCATTGGTTTCATAGGCATCATCCTGCA-3′and SEQ ID NO: 12, 5’ -GGATGATGCCTATGAAACCAATGGGTGGCAA-3’ : the italic part showed the PD-L1-binding peptide “HWFHRHH, SEQ ID NO: 1” and the other parts represent the sticky end of the PstI and HindIII restriction endonucleases) from Sangon Biotech. The two complementary nucleotides (100 μM, 2 μL) were added into 16 μL of sterile water and mixed well. The solution was placed at 94 ℃ for 10 min and cooled down to 25 ℃ minute by minute, annealing the double-stranded DNA fragments. At the same time, the fd RF phage vector constructed by inserting the recombinant gene 3 of the fUSE55 vector into the f88-4 vector was doubly digested by PstI and HindIII at 37 ℃ overnight and then purified through agarose gel electrophoresis. Then the pretreated double-stranded DNA and the digested fd vector were connected by T4 DNA ligase at 16 ℃ for 16 h to realize the recombinant plasmid (fd-HH) , which enabled the HH peptide to be fused to the phage’s pVIII region. Afterward, the recombinant plasmid was transferred into the competent bacterial cells (JM109 cells) . The transfected competent cells were cultivated on the plate at 37 ℃overnight, and positive clones were selected for DNA sequence test to confirm the successful construction of the recombinant plasmid (fd-HH) . The construction of another recombinant plasmid (fd-GG) was similar to the above procedure.

[0109] Display of melanoma melanoma-targeting peptides (IP) on pIII: After the display of PD-L1 affinity peptides on pVIII, the positive clones were picked up and the DNA was extracted by Hipure Plasmid Micro Kit C (Cat. #: P1001-02, Magen Biotechnology Co., Ltd. ) . Then the DNA was doubly digested by enzyme BglI and purified by agarose gel electrophoresis. The complementary nucleotides were respectively prepared to obtain two double-stranded DNA fragments (IP and NL) , as mentioned before. Then the IP and NL fragments were connected with the previously digested fd-HH, respectively, by mixed them with T4 DNA ligase and then kept at 16 ℃ overnight, producing recombinant plasmids fd-HH-IP and fd-HH-NL, respectively. Similarly, the HH in the fd-HH-IP plasmid was replaced with GG to generate the recombinant plasmid fd-GG-IP. The three double-displayed plasmids were then transformed into the competent JM109 bacteria. Then the positive clones were collected and confirmed by DNA sequencing test.

[0110] Amplification and purification of dual-functional phages. We amplified and purified the double-displayed phages by following procedures. The JM109 cells with double-displayed plasmid were added into 5 mL of LB / Tet (20 mg L-1) , and the mixture was shaken at 220 rpm, 37 ℃ for 12-14 h. Then the bacterial solution was centrifuged at 8000 g for 20 min to remove the precipitated bacteria. The supernatant containing the phages was taken and placed into 100 mL of the mid-log phase (OD600 = 0.5) TG1 cell culture. The mixture was kept without shaking for 20 min to help with the bacterial infection by the phages and then shaken at 90 rpm for 1 h. Next, 100 μL of Tet (20 mg mL-1) and 100 μL of IPTG (0.1 M) were added into the mixture and shaken at 150 rpm for 4 h. Subsequently, the purification of the dual-functional phages was the same as mentioned in earlier sections.

[0111] Hemolysis assay. The fresh blood gathered from the mice in the amount of 4 mL was put into the 10 mL BD sodium heparin tube. The tube was manipulated upside and down 6 times. It was centrifuged at 1000 g for 15 min, followed by washing the pellet containing red blood cells (RBCs) in the tube with 20 mL of PBS. The centrifugation-washing process was repeated 10 times, producing an RBC solution. 700 μL of dual-displayed phages for 109 pfu were added into 300 μL of the RBC solution and incubated at 37 ℃ for 6 h. Next, the mixture was centrifuged at 3000 rpm. After the precipitates were thrown away, the supernatant was added to the well of a plate, and the optical density values at 545 nm were recorded. The hemolysis percentage was calculated by equation 5: hemolysis (%) = [ (Hs –Hp)  /  (Ht -Hp) ] × 100, where Hs is the value of the cells treated with the dual-functional phages; Hp is the value of the cells lysed by PBS; Ht is the value of the cells lysed by water.

[0112] Cytotoxicity and cell viability assay. 200 μL of the 293T cells and B16-F10 cells were cultured in the 48-well culture plate containing medium with 5%FBS overnight. Then the solution was discarded from the plate and replaced with 200 μL of PBS to starve the cells for 1 h. The PBS was pipetted out of the plate and substituted with 100 μL of the dual-displayed phage (5 ×1012 pfu / mL) . The solution was pipetted out of the plate. The plate was added with 100 μL of LIVE / DEAD Cell Imaging Kit (Cat. #BB-4126-1, BestBio Technical Co., Ltd. ) staining buffer and incubated at 37 ℃ for 15 min. The stained cells were observed under the fluorescence microscope.

[0113] Testing the uptake of phages by neutrophils. 100 μL of the dual-displayed phage (2 × 1010 pfu) was injected into each mouse via tail vein. Then the blood was taken from 5 mice and the neutrophils were isolated from mouse blood using a Mouse Neutrophil Enrichment kit (Cat. #19762, StemCell Inc. ) . Then the cells were centrifuged at 300 g for 5 min and subsequently resuspended by 200 μL of lysis buffer. The titer was carried out as mentioned before. 20 μL of phages were incubated with 180 μL of bacterial. The uptake of phages by 106 neutrophils was calculated by the following equation: uptake = 10 × N  / Q ×106 pfu mL-1, where N is the number of the phage plaques on a plate, Q is the quantity of cells.

[0114] Inhibition of tumor growth in melanoma-bearing mice by dual-functional phages. Dual-displayed phage (fd-HH-IP, fd-HH-NL or fd-GG-IP; 2.5 × 1013 pfu / kg) , a-PDL1 (10 mg / kg) , and PBS were injected intravenously into 6-week old melanoma-bearing mice through the tail vein every other day. The mouse weight and tumor volume were recorded every other day. Tumor volume was calculated as mentioned above.

[0115] Testing the concentration of immunoglobulin IgG and IgM in serum. 100 μL of the therapeutic phage drug (fd-HH-IP) and wild type phage (WT) (each with a concentration of 2×1012 pfu / mL in PBS) as well as PBS were injected into the healthy mice, respectively. The concentration of immunoglobulin IgG or IgM in serum was measured by the kit (Cat. #D721095, Cat. #D721208, Sangon Biotech Co., Ltd. ) on the 3rd, 5th, 7th and 9th day after injection.

[0116] Pharmacokinetics of phage and peptide in serum. After the i. v. injection of 100 μL of 1 mg / mL FITC-modified HH peptide into mice, with circulation durations of 20, 40, 60, 80, and 100 min, serum was collected at each time point. Fluorescence emission at 530 nm was detected under excitation at 485 nm. The peptide concentration in serum was quantified, expressed as a percentage of the observed maximal efficacy, and plotted against post-injection time. Similarly, 40, 80, 120, 160, 200, 240, 280, and 320 min after the i. v. injection of 100 μL of 2×1012 pfu / mL phage into mice, serum was collected at each time point. Phage concentration was calculated by titer. The phage concentration in the blood was expressed as a percentage of the observed maximum efficacy, plotted against post-injection time. Pharmacokinetic parameters (half-life, t1 / 2) were estimated through nonlinear regression analysis by Graphpad Prism.

[0117] Statistical analysis. All data were represented in the format of mean ± standard deviation. Student’s t-test and One-Way ANOVA (with Tukey’s test to conduct the pairwise comparisons) were used to analyze the data statistically by Origin and Graphpad Prism. The p value denoted the different significance levels (***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05) . Table 1. The frequency of phage sequences that occur at the end of round 3 of biopanning  against PD-L1 epitope. 50 blue plaques on the plate are chosen randomly for DNA sequencing. Table 2. The grand average of hydropathy (GRAVY) and theoretical isoelectric point of the  selected PD-L1 epitope-binding peptides through biopanning. Table 3. Cluster density of three affinity peptides (HH, WG and LN) , unselected peptide  (WF) and control peptide (GG) binding to PD-L1 protein (PDB file of PD-L1 derived from 3bik) . The cluster density is calculated by equation 6: cluster density = N  / a-RMSD, where N is the number of elements in the cluster and a-RMSD is the average RMSD between the cluster elements. Table 4. The frequency of phage tumor-targeting sequences that occur at the end of  biopanning. In each round, the phage library (or sublibrary) is allowed to interact first with tumors in vivo and then with melanoma cells in vitro. 87 blue plaques on the plate are picked up randomly for DNA sequencing after the last round. REFERENCES 1. Shields JD, Kourtis IC, Tomei AA, Roberts JM, Swartz MA. Induction of lymphoidlike stroma  and immune escape by tumors that express the chemokine CCL21. Science 2010, 328 (5979) : 749-752. 2. Sangro B, Sarobe P, Hervas-Stubbs S, Melero I. Advances in immunotherapy for hepatocellular  carcinoma. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2021, 18 (8) : 525-543. 3. Vaddepally RK, Kharel P, Pandey R, Garje R, Chandra AB. Review of Indications of FDA- Approved Immune Checkpoint Inhibitors per NCCN Guidelines with the Level of Evidence. Cancers (Basel) 2020, 12 (3) . 4. Brahmer JR, Tykodi SS, Chow LQ, Hwu WJ, Topalian SL, Hwu P, et al. Safety and activity of anti- PD-L1 antibody in patients with advanced cancer. N Engl J Med 2012, 366 (26) : 2455-2465. 5. Hansen AR, Massard C, Ott PA, Haas NB, Lopez JS, Ejadi S, et al. Pembrolizumab for advanced  prostate adenocarcinoma: findings of the KEYNOTE-028 study. Ann Oncol 2018, 29 (8) : 1807-1813. 6. Antoniotti C, Rossini D, Pietrantonio F, Catteau A, Salvatore L, Lonardi S, et al. Upfront  FOLFOXIRI plus bevacizumab with or without atezolizumab in the treatment of patients with metastatic colorectal cancer (AtezoTRIBE) : a multicentre, open-label, randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet Oncol 2022, 23 (7) : 876-887. 7. Rittmeyer A, Barlesi F, Waterkamp D, Park K, Ciardiello F, von Pawel J, et al. Atezolizumab  versus docetaxel in patients with previously treated non-small-cell lung cancer (OAK) : a phase 3, open-label, multicentre randomised controlled trial. Lancet 2017, 389 (10066) : 255-265. 8. Sullivan RJ, Hamid O, Gonzalez R, Infante JR, Patel MR, Hodi FS, et al. Atezolizumab plus  cobimetinib and vemurafenib in BRAF-mutated melanoma patients. Nat Med 2019, 25 (6) : 929-935. 9. Lukas RV, Rodon J, Becker K, Wong ET, Shih K, Touat M, et al. Clinical activity and safety of  atezolizumab in patients with recurrent glioblastoma. J Neurooncol 2018, 140 (2) : 317-328. 10. Alsaab HO, Sau S, Alzhrani R, Tatiparti K, Bhise K, Kashaw SK, et al. PD-1 and PD-L1 Checkpoint  Signaling Inhibition for Cancer Immunotherapy: Mechanism, Combinations, and Clinical Outcome. Front Pharmacol 2017, 8: 561. 11. Larkin J, Chiarion-Sileni V, Gonzalez R, Grob JJ, Cowey CL, Lao CD, et al. Combined Nivolumab  and Ipilimumab or Monotherapy in Untreated Melanoma. New Engl J Med 2015, 373 (1) : 23-34. 12. Robert C, Schachter J, Long GV, Arance A, Grob JJ, Mortier L, et al. Pembrolizumab versus  Ipilimumab in Advanced Melanoma. New Engl J Med 2015, 372 (26) : 2521-2532. 13. Sullivan RJ, Hamid O, Gonzalez R, Infante JR, Patel MR, Hodi FS, et al. Atezolizumab plus  cobimetinib and vemurafenib in BRAF-mutated melanoma patients. Nature Medicine 2019, 25(6) : 929-+. 14. Keilholz U, Mehnert JM, Bauer S, Bourgeois H, Patel MR, Gravenor D, et al. Avelumab in  patients with previously treated metastatic melanoma: phase 1b results from the JAVELIN Solid Tumor trial. J Immunother Cancer 2019, 7. 15. Massard C, Gordon MS, Sharma S, Rafii S, Wainberg ZA, Luke J, et al. Safety and Efficacy of  Durvalumab (MEDI4736) , an Anti-Programmed Cell Death Ligand-1 Immune Checkpoint Inhibitor, in Patients With Advanced Urothelial Bladder Cancer. J Clin Oncol 2016, 34 (26) : 3119-+. 16. Wang DY, Salem JE, Cohen JV, Chandra S, Menzer C, Ye F, et al. Fatal Toxic Effects Associated  With Immune Checkpoint Inhibitors: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA Oncol 2018, 4 (12) : 1721-1728. 17. Manrique P, Bolduc B, Walk ST, van der Oost J, de Vos WM, Young MJ. Healthy human gut  phageome. Proc Natl Acad Sci U S A 2016, 113 (37) : 10400-10405. 18. Dedrick RM, Guerrero-Bustamante CA, Garlena RA, Russell DA, Ford K, Harris K, et al.  Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus. Nat Med 2019, 25 (5) : 730-733. 19. Jault P, Leclerc T, Jennes S, Pirnay JP, Que YA, Resch G, et al. Efficacy and tolerability of a  cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn) : a randomised, controlled, double-blind phase 1 / 2 trial. Lancet Infect Dis 2019, 19(1) : 35-45. 20. Van Nieuwenhuyse B, Van der Linden D, Chatzis O, Lood C, Wagemans J, Lavigne R, et al.  Bacteriophage-antibiotic combination therapy against extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa infection to allow liver transplantation in a toddler. Nat Commun 2022, 13 (1) : 5725. 21. Petrovic Fabijan A, Lin RCY, Ho J, Maddocks S, Ben Zakour NL, Iredell JR, et al. Safety of  bacteriophage therapy in severe Staphylococcus aureus infection. Nat Microbiol 2020, 5 (3) : 465-472. 22. Liu H, Zhao Z, Zhang L, Li Y, Jain A, Barve A, et al. Discovery of low-molecular weight anti-PD- L1 peptides for cancer immunotherapy. J Immunother Cancer 2019, 7 (1) : 270. 23. Gurung S, Khan F, Gunassekaran GR, Yoo JD, Poongkavithai Vadevoo SM, Permpoon U, et al.  Phage display-identified PD-L1-binding peptides reinvigorate T-cell activity and inhibit tumor progression. Biomaterials 2020, 247: 119984. 24. Chang HN, Liu BY, Qi YK, Zhou Y, Chen YP, Pan KM, et al. Blocking of the PD-1 / PD-L1 Interaction  by a D-Peptide Antagonist for Cancer Immunotherapy. Angew Chem Int Ed Engl 2015, 54 (40) : 11760-11764. 25. Li C, Zhang N, Zhou J, Ding C, Jin Y, Cui X, et al. Peptide Blocking of PD-1 / PD-L1 Interaction for  Cancer Immunotherapy. Cancer Immunol Res 2018, 6 (2) : 178-188. 26. Li Y, Qu X, Cao B, Yang T, Bao Q, Yue H, et al. Selectively Suppressing Tumor Angiogenesis for  Targeted Breast Cancer Therapy by Genetically Engineered Phage. Adv Mater 2020, 32 (29) : e2001260. 27. Asadi-Ghalehni M, Ghaemmaghami M, Klimka A, Javanmardi M, Navari M, Rasaee MJ. Cancer  immunotherapy by a recombinant phage vaccine displaying EGFR mimotope: an in vivo study. Immunopharmacol Immunotoxicol 2015, 37 (3) : 274-279. 28. Oh SA, Wu D-C, Cheung J, Navarro A, Xiong H, Cubas R, et al. PD-L1 expression by dendritic  cells is a key regulator of T-cell immunity in cancer. Nature Cancer 2020, 1 (7) : 681-691. 29. Mandava S, Makowski L, Devarapalli S, Uzubell J, Rodi DJ. RELIC -A bioinformatics server for  combinatorial peptide analysis and identification of protein-ligand interaction sites. Proteomics 2004, 4 (5) : 1439-1460. 30. Hodyra-Stefaniak K, Miernikiewicz P, Drapala J, Drab M, Jonczyk-Matysiak E, Lecion D, et al.  Mammalian Host-Versus-Phage immune response determines phage fate in vivo. Sci Rep 2015, 5: 14802.

[0118] All patents, patent applications, and other publications, including GenBank Accession Numbers or similar sequence identification numbers, cited in this application are incorporated by reference in the entirety of their contents for all purposes.

Claims

1.A recombinant phage expressing on its surface a checkpoint-blocking peptide that specifically binds a Programmed Cell Death Protein 1 (PD-1) or Programmed Cell Death-Ligand 1 (PD-L1) and a homing peptide that specifically binds a cancer-related antigen.2.The recombinant phage of claim 1, wherein the checkpoint-blocking peptide specifically binds a PD-L1 protein, preferably the extracellular domain of the PD-L1 protein.3.The recombinant phage of claim 2, the checkpoint-loading peptide comprises any one of the amino acid sequences set forth in Table 1, preferably SEQ ID NO: 1, 2, or 3.4.The recombinant phage of claim 3, wherein the checkpoint-blocking peptide comprises SEQ ID NO: 1.5.The recombinant phage of any one of claims 1-4, wherein the homing peptide comprises the amino acid sequences set forth in Table 4, preferably SEQ ID NO: 4, 5, 6, or 7.6.The recombinant phage of any one of claims 1-5, wherein the homing peptide comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.7.The recombinant phage of any one of claims 1-6, expressing the checkpoint-blocking peptide on the side wall and the homing peptide on the rod.8.The recombinant phage of any one of claims 1-7, which is an fd phage.9.A composition comprising the recombinant phage of any one of claims 1-8 and a pharmaceutically acceptable excipient.10.The composition of claim 7, further comprising an anti-cancer chemotherapeutic or immunotherapeutic agent.11.The composition of claim 9 or 10, which is formulated for injection.12.A method for inhibiting cancer cell proliferation, comprising contacting cancer cells with a composition comprising an effective amount of the recombinant phage of any one of claims 1-8.13.The method of claim 12, wherein the recombinant phage expresses the checkpoint-blocking peptide on the side wall and the homing peptide on the rod.14.The method of claim 12 or 13, wherein the checkpoint-blocking peptide comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.15.The method of any one of claims 12-14, wherein the homing peptide has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.16.The method of any one of claims 12-15, wherein the composition further comprises another anti-cancer chemotherapeutic or immunotherapeutic agent.17.The method of any one of claims 12-16, wherein the cancer cells are within a patient’s body and the contacting comprises administering the composition to the patient by injection.18.The method of claim 17, wherein the injection comprises subcutaneous, transdermal, intramuscular, intravenous, intraperitoneal, intracranial, or intratumoral injection.19.The method of any one of claims 12-18, wherein the cancer cells are melanoma, breast cancer, colon cancer, lung cancer, renal cancer, or urothelial cancer cells.20.A kit for treating cancer, comprising(1) a first container containing a first composition comprising an effective amount of the recombinant phage of any one of claims 1-8; and(2) a second container containing a second composition comprising an effective amount of another anti-cancer therapeutic agent.21.The kit of claim 20, wherein the second composition comprises an anti-cancer chemotherapeutic or immunotherapeutic agent.22.The kit of claim 20 or 21, wherein the first composition is formulated for injection.23.The kit of any one of claims 20-22, wherein the cancer is melanoma, breast cancer, colon cancer, lung cancer, renal cancer, or urothelial cancer.24.The kit of any one of claims 20-23, further comprising an instruction manual for using the kit.

Images