Compositions and methods for Antigen-presenting cell-specific delivery of nucleic acids

Abstract

A lipid nanoparticle composition targeting to antigen-presenting cells (APCs), comprising: at least a therapeutic agent, at least a cationic or ionizable cationic lipid, at least a neutral lipid, at least a steroid or steroid analogue, at least a PEGylated lipid, and atleast a phosphatidylglycerol.

Description

Compositions and methods for Antigen-presenting cell-specific delivery of nucleic acidsFIELD OF THE INVENTION

[0001] The disclosure belongs to the field of drug delivery. Specifically, the present application relates to a lipid nanoparticle composition targeting to antigen-presenting cells (APCs) .BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Over the past decade, mRNA-based cancer vaccines have emerged as a promising approach in cancer immunotherapy. These vaccines leverage the ability of mRNA to encode tumor antigens, initiating targeted immune responses. Lipid nanoparticles (LNPs) have proven to be excellent delivery vectors for mRNA and are increasingly entering into routine clinical practice. However, current lipid nanoparticle (LNP) delivery systems have limitations, particularly concerning side effects and non-specific expression. Intravenous or intramuscular administration often results in high mRNA expression in hepatocytes, causing reversible liver damage and immune-mediated hepatitis. This is due to the liver's perfusion and the formation of a protein corona around LNPs in blood circulation.

[0003] To address these issues, targeted delivery strategies that enhance mRNA specificity to desired cell types, especially antigen-presenting cells (APCs) like dendritic cells and macrophages, are crucial. APC-targeted LNPs can optimize tumor antigen presentation, amplify immune responses, and reduce off-target effects, improving the safety and efficacy of mRNA cancer vaccines. For example, selective antigen presentation by APCs enhances the specificity of the immune response against tumor-associated antigens particularly through the MHC Class I pathway which is crucial for activating cytotoxic CD8+ T cells. This targeted approach not only amplifies the activation of specific CD8+ T cells, thereby enhancing anti-tumor immune responses, but also results in more robust activation of other immune cells, including DCs, macrophages, T cells, B cells, and NK cells. Notably, APC-specific targeting mitigates liver-related side effects by avoiding non-specific expression in hepatocytes, thereby improving the safety profile of mRNA cancer vaccines.

[0004] Active targeting approaches have been devised to enhance tissue-or cell-specific delivery beyond the liver, by grafting targeting moieties onto the nanoparticle surface. This includes the use of antibodies, aptamers, and other ligands. For example, Mikyung Kang reported that intravenously injected mannose-modified macrophage-targeting nanocarriers, PEI / pCAR-IFN-γ nanocomplex with CAR-encoding mRNA, can induce CAR-M1 macrophages capable of CAR-mediated cancer phagocytosis, anti-tumor immunomodulation, and inhibition of solid tumor growth. Passive targeting, on the other hand, leverages endogenous trafficking systems to reach target cells, with the type of proteins binding to nanoparticles in the bloodstream being influenced by factors such as delivery vehicle size, composition, charge, and hydrophobicity.

[0005] Comparing to active targeting approaches, which need a complex process of graft targeting moieties onto the nanoparticle surface, the preparing method of passive target approach is simpler. However, current passive targeting approaches by modulating lipid composition, often lead to organ-specific rather than cell-specific targeting. Thus, there is a need in the art for improved compositions and methods for targeted delivery of RNA and other nucleic acid cargo to APCs. The present invention satisfies this unmet need.SUMMARY OF THE INVENTION

[0006] The present inventors developed an APC-specific targeting LNP (APC-LNP) formulation. Through an iterative process of in vitro and in vivo screening, we have endeavored to tailor the LNP design to selectively engage APCs, minimizing non-specific expression in the liver and mitigating associated side effects. This novel APC-LNP formulation holds the promise of revolutionizing mRNA cancer vaccines by achieving an optimized efficacy-safety balance and higher activation of specific CD8+ T cells, leading to improved tumor control.

[0007] In an aspect, the present disclosure provides a lipid nanoparticle composition targeting to antigen-presenting cells (APCs) , comprising: 1) at least a cationic or ionizable cationic lipid, 2) at least a neutral lipid, 3) at least a steroid or steroid analogue, 4) at least a PEGylated lipid, and 5) at least a negative lipid which is phosphatidylglycerol.

[0008] In some embodiments, said phosphatidylglycerol has formula: wherein R1 and R2 are each independently C8-C24 alkyl, C8-C24 alkenyl, substituted C8-C24 alkyl  or substituted C8-C24 alkenyl; X+ is a monovalent cation.

[0009] In some embodiments, said R1 and R2 are both the same.

[0010] In some embodiments, said phosphatidylglycerol consists of a L-glycerol 3-phosphate backbone ester-bonded to saturated or unsaturated fatty acids.

[0011] In some embodiments, said phosphatidylglycerol is 1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) , 1, 2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphorylglycerol (DLPG) , 1, 2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DMPG) , 1, 2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DPPG) , or 1, 2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG) .

[0012] In some embodiments, said R1 and R2 are different.

[0013] In some embodiments, said phosphatidylglycerol consists of a L-glycerol 3-phosphate backbone ester-bonded to saturated or unsaturated fatty acids.

[0014] In some embodiments, said phosphatidylglycerol is 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (POPG, 16: 0-18: 1 PG) or 1-octadecanoyl-2- (9Z-octadecenoyl) -sn-glycero-3-phosphoglycerol (SOPG, 18: 0-18: 1 PG) .

[0015] In some embodiments, said phosphatidylglycerol is present in a molar percentage of the composition from about 5%to about 30%.

[0016] In some embodiments, said phosphatidylglycerol is present in a molar percentage of the composition from about 10%to about 25%.

[0017] In some embodiments, said phosphatidylglycerol is present in a molar percentage of the composition from about 10%to about 20%.

[0018] In some embodiments, said phosphatidylglycerol is present in a molar percentage of the composition from about 11%to about 20%.

[0019] In some embodiments, said phosphatidylglycerol is present in a molar percentage of the composition from about 12%to about 20%.

[0020] In some embodiments, said phosphatidylglycerol is present in a molar percentage of the composition from about 12%to about 19%.

[0021] In some embodiments, said phosphatidylglycerol is present in a molar percentage of the composition from about 12%to about 18%.

[0022] In some embodiments, said phosphatidylglycerol is present in a molar percentage of the composition from about 13%to about 17%.

[0023] In some embodiments, said phosphatidylglycerol is present in a molar percentage of the composition from about 14%to about 16%.

[0024] In some embodiments, said phosphatidylglycerol is present in a molar percentage of the composition from about 14.5%to about 15.5%.

[0025] In some embodiments, said phosphatidylglycerol is present in a molar percentage of the composition of about 10%, about 11%, about 12%, about 13%, about 14%, about 14.5%, about 15%, about 15.5%, about 16%, about 17%, about 18%, about 19%, about 20%, about 21%, about 22%, about 23%, about 24%, or about 25%.

[0026] In preferable embodiments, said phosphatidylglycerol is present in a molar percentage of the composition of about 15%.

[0027] In some embodiments, said ionizable cationic lipid has formula (I) , or a salt, tautomer, or stereoisomer thereof, wherein: 1) m and p are independently selected from any integer ranging from 3 to 8; 2) n is  selected from any integer ranging from 2 to 4; 3) X is a bond, -C (O) O-, or a biodegradable group; 4) R1 is a hydrogen bond donor-containing group or hydrogen bond acceptor-containing group; 5) both of R2 are same and selected from C1-C12 alkyl, substituted C1-C12 alkyl, C2-C12 alkenyl, substituted C2-C12 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl and substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof; 6) R3 is selected from C4-C22 alkyl, substituted C4-C22 alkyl, C4-C22 alkenyl, substituted C4-C22 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof; or R3 is an acetal group of wherein both of R4 are same and selected from C1-C16 alkyl, substituted C1-C16 alkyl, C2-C16 alkenyl, substituted C2-C16 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof.

[0028] In some embodiments, said ionizable cationic lipid has formula (II) , or a salt, tautomer, or stereoisomer thereof, wherein q is selected from any integer ranging from 2 to 4.

[0029] In some embodiments, R2 is C7-C12 alkyl.

[0030] In some embodiments, each R2 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains.

[0031] In some embodiments, R2 of said formula (I) is selected from C6-C12 alkyl, substituted C6-C12 alkyl, C6-C12 cycloalkyl, substituted C6-C12 cycloalkyl, C6-C12 alkenyl, substituted C6-C12 alkenyl and combinations of thereof.

[0032] In some embodiments, R3 is C7-C12 alkyl.

[0033] In some embodiments, R3 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains.

[0034] In some embodiments, R3 is the same with R2.

[0035] In some embodiments, R4 of said formula (II) are independently selected from C2-C12 alkyl, substituted C2-C12 alkyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl, C2-C12 alkenyl, substituted C2-C12 alkenyl and combinations of thereof.

[0036] In some embodiments, R4 is C7-C12 alkyl.

[0037] In some embodiments, each R4 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains.

[0038] In some embodiments, R4 is the same with R2.

[0039] In some embodiments, said carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains is the second or more distant carbon atom counting from the junction.

[0040] In some embodiments, said one or two side chains are C1-C4 alkyls.

[0041] In some embodiments, each R2, R3 and / or each R4 is independently selected from one of the following formulas:

[0042] In some embodiments, R1 is selected from hydroxyalkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or optionally substituted amino alkylenyl group having 1 to 6 carbon atoms.

[0043] In some embodiments, R1 is selected from one of the following formulae: wherein o is selected from 1, 2, 3, 4, and 5.

[0044] In some embodiments, said ionizable cationic lipid is selected from a group consisting of Compound No: 01-52 as shown in Table 1. Table 1. Chemical Structures of Representative Compounds

[0045] In other embodiments, said ionizable cationic lipid could be any ionizable lipid in the art. For example, said ionizable cationic lipid could be KC3, UO1, MC3, DLin-MC3-DMA, SM-102, L-319, ALC-0315, DODMA, DLinDMA, 306-O12B, NT1-O14B, 113-O12B, and / or Nε-lauroyl lysine methyl ester.

[0046] In some embodiments, said ionizable cationic lipid is present in a molar percentage of the composition from about 30%to about 48%. In some preferred embodiments, said ionizable cationic lipid is present in a molar percentage of the composition from ahout 40%to 45%.

[0047] In some embodiments, the molar ratio of said ionizable cationic lipid to said phosphatidylglycerol ranges from about 10: 1 to about 1: 1.

[0048] In some embodiments, the molar ratio of said ionizable cationic lipid to said phosphatidylglycerol ranges from about 2.8: 1 to 2: 1.

[0049] In some embodiments, the neutral lipid is disteroylphosphatidylcholine (DSPC) or dioleoyl-phosphatidylethanolamine (DOPE) .

[0050] In some embodiments, said neutral lipid is present in a molar percentage of the composition from about 4%to about 14%.

[0051] In some embodiments, the molar ratio of said ionizable cationic lipid to said neutral lipid ranges from about 2: 1 to about 8: 1.

[0052] In some embodiments, the molar ratio of said ionizable cationic lipid to said neutral lipid ranges from about 5: 1.

[0053] In some embodiments, said steroid is cholesterol, sitosterol or stigmasterol.

[0054] In some embodiments, said steroid or steroid analogue is present in a molar percentage of the composition from about 25%to about 47%.

[0055] In some embodiments, the molar ratio of said ionizable cationic lipid to said steroid or steroid analogue ranges from about 2: 1 to 1: 2.

[0056] In some embodiments, the molar ratio of said ionizable cationic lipid to said steroid or steroid analogue ranges from about 1.2: 1 to 1: 1.2.

[0057] In some embodiments, said PEGylated lipid is 1- (monomethoxy-polyethyleneglycol) -2,3-dimyristoylglycerol (PEG-DMG) .

[0058] In some embodiments, said PEGylated lipid is present in a molar percentage of the composition from about 1%to about 3%.

[0059] In some embodiments, the molar ratio of said ionizable cationic lipid to said PEGylated lipid ranges from about 100: 1 to about 20: 1.

[0060] In some embodiments, said composition further comprises 6) at least a therapeutic agent.

[0061] In some embodiments, said therapeutic agent is a nucleic acid molecule.

[0062] In some embodiments, said nucleic acid molecule is DNA or RNA.

[0063] In some embodiments, said nucleic acid molecule is plasmid DNA or closed-ended DNA (ceDNA) .

[0064] In some embodiments, said nucleic acid molecule is selected from a group consisting of messenger RNA (mRNA) , guide RNA (gRNA) , a short interfering RNA (siRNA) , an RNA interference (RNAi) molecule, a microRNA (miRNA) , an antagomir, an antisense RNA, a ribozyme, a small hairpin RNA (shRNA) , or a mixture thereof.

[0065] In some embodiments, said nucleic acid molecule encodes at least one pharmaceutically active peptide or protein.

[0066] In some embodiments, said nucleic acid molecule comprises RNA encoding at least one antigen.

[0067] In some embodiments, said antigen is a disease-associated antigen or elicits an immune response against a disease-associated antigen or cells expressing a disease-associated antigen.

[0068] In some embodiments, said antigen is a tumor-associated antigen or elicits an immune response against cancer, tumor or an infectious disease.

[0069] In some embodiments, said antigen is a tumor neoantigen.

[0070] In some embodiments, said nucleic acid molecule further comprises RNA encoding at least one immunologically active compound.

[0071] In some embodiments, said immunologically active compound does not encode an antigen.

[0072] In a second aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the composition described herein (in the first aspect) , and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0073] In a third aspect, the present disclosure provides a method of delivering a nucleic acid molecule to an APC cell in vivo or in vitro, comprising subjecting the composition described herein (in the first aspect) or the pharmaceutical composition described herein (in the second aspect) to said APC cell.

[0074] In a fourth aspect, the present disclosure provides a method of treating or preventing a disease in a subject in need thereof, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of the composition described herein (in the first aspect) or the pharmaceutical composition described herein (in the second aspect) , wherein said composition comprising a nucleic acid molecule having therapeutic activity.

[0075] In some embodiments, said composition is administered by injection.

[0076] Additional aspects and advantages of the present disclosure will become readily apparent to those skilled in this art from the following detailed description, wherein only illustrative embodiments of the present disclosure are shown and described. As will be realized, the present disclosure is capable of other and different embodiments, and its several details are capable of modifications in various obvious respects, all without departing from the disclosure. Accordingly, the drawings and description are to be regarded as illustrative in nature, and not as restrictive. INCORPORATION BY REFERENCE

[0077] All publications, patents, and patent applications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication, patent, or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWING

[0078] The novel features of the invention are set forth with particularity in the appended claims. A better understanding of the features and advantages of the present invention will be obtained by reference to the following detailed description that sets forth illustrative embodiments, in which the principles of the invention are employed, and the accompanying drawings (also “figure” and “FIG. ” herein) , of which:

[0079] FIG. 1 illustrates the results of in vitro transfection of LNPs containing different negative lipids in PBMCs.

[0080] FIG. 2 illustrates the results of in vitro transfection of LNP containing phosphatidylglycerol with different ionizable lipids in PBMCs.

[0081] FIGs. 3A-3B illustrate the results of in vitro transfection of LNP containing phosphatidylglycerol with different lipid formulations in PBMCs and THP-1 macrophage.

[0082] FIG. 4 illustrates the luminesce in different organs following IV administration of luciferase mRNA containing LNPs with different formulations using In Vivo Imaging System (IVIS) in mouse.

[0083] FIGs. 5A-5B illustrate the results of in vivo mRNA expression in antigen-presenting cells (DCs and microphages) in spleen and peripheral blood following IV administration of LNPs with different negative phospholipid in mice.

[0084] FIGs. 6A-6B illustrate the results of in vivo mRNA expression in antigen-presenting cells in spleen and peripheral blood following IV administration of LNPs with four v. s. five lipid components in mice.

[0085] FIGs. 7A-7B illustrate the results of in vivo mRNA expression in antigen-presenting cells in spleen and peripheral blood following IV administration of LNPs containing phosphatidylglycerol with different lipid composition ratios.

[0086] FIG. 8 illustrates the results of in vivo delivery efficiency in APC and hepatocyte of APC-specific LNP formulations and classic liver targeting LNP formulations.

[0087] FIGs. 9A-9E illustrate the results of in vivo delivery efficiency of various cell subsets in different organs following IV injection of the APC-specific LNP formulations.

[0088] FIGs. 10A-10B illustrate the results of in vitro transfection of APC-specific LNP formulation with different cationic lipids in PBMC and THP-1 Macrophages.

[0089] FIG. 11 illustrates the results of in vivo delivery efficiency in APC cells following IV administration of APC-specific formulation with different ionizable lipids.

[0090] FIGs. 12A-12F illustrate the results of immune cell activation following IV administration of APC-specific LNP loaded with mRNA expressing tumor-associated antigen Trp1.

[0091] FIGs. 13A-13D illustrate the cytokine release results following IV administration of APC-specific LNP loaded with mRNA expressing tumor-associated antigen Trp1.

[0092] FIGs. 14A-14B illustrate the result of mRNA expression in the DC and monocyte cells induced by LPX and APC-LNPs. FIGs. 14C-14D illustrate the result of mRNA expression in NK and T cells induced by APC-LNP and LPX.

[0093] FIG. 15A illustrates the flow cytometric analysis of OT1+ / CD8+%in mouse peripheral blood following IV administration of APC-specific LNP or LPX. FIG. 15B illustrates plasma levels of IFN-α.

[0094] FIGs. 16 illustrate potent antitumor immunity and rejection of advanced aggressively growing tumors in mice conferred by APC-LNP. FIG. 16A illustrates the tumor size change of mice loaded MC38-OVA tumor after IV administration of PBS, control APC-LNP and OVA-APC-LNP. FIG. 16B illustrates the weight change of mice loaded MC38-OVA tumor after IV administration of PBS, control APC-LNP and OVA-APC-LNP.DETAILED DESCRIPTION

[0095] While various embodiments of the invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. Numerous variations, changes, and substitutions may occur to those skilled in the art without departing from the invention. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed. I. Definition

[0096] As used herein, the term “antigen presenting cell” (APC) is a cell of a variety of cells capable of displaying, acquiring, and / or presenting at least one antigen or antigenic fragment on (or at) its cell surface. Antigen-presenting cells can be distinguished in professional antigen presenting cells and non-professional antigen presenting cells. The term “professional antigen presenting cells” relates to antigen presenting cells which constitutively express the Major Histocompatibility Complex class II (MHC class II) molecules required for interaction with naive T cells. If a T cell interacts with the MHC class II molecule complex on the membrane of the antigen presenting cell, the antigen presenting cell produces a co-stimulatory molecule inducing activation of the T cell. Professional antigen presenting cells comprise dendritic cells and macrophages. The term “non-professional antigen presenting cells” relates to antigen presenting cells which do not constitutively express MHC class II molecules, but upon stimulation by certain cytokines such as interferon-gamma. Exemplary, non-professional antigen presenting cells include fibroblasts, thymic epithelial cells, thyroid epithelial cells, glial cells, pancreatic beta cells or vascular endothelial cells.

[0097] As used herein, the term “lipid nanoparticle” or its abbreviation “LNP” used herein refers to a drug carrier on the order of nanometers and composed of one layer of lipids. In the context of the present application, the term “lipid nanoparticle” also contemplates “lipid-polymer hybrid nanoparticle” which include both lipid portions and hydrophobic polymer portions.

[0098] As used herein, the term “lipid” refers to a group of organic compounds that are poorly soluble in water, while soluble in nonpolar solvents. Lipids include, but are not limited to, esters of fatty acids.

[0099] As used herein, the term “cationic lipid” as used herein refers to positively charged amphiphiles consisting of a hydrophilic head group connected to a hydrophobic tail via a linker. Cationic lipid is positively charged so that it can bind to negatively charged molecules or entities such as membrane, preferably the cell membrane.

[0100] As used herein, the term “polymer conjugated lipid” refers to a molecule comprising a lipid portion and a polymer portion.

[0101] As used herein, the term “PEG conjugated lipid” refers to a molecule comprising a lipid portion and a polyethylene glycol portion.

[0102] As used herein, the term “neutral lipid” or “helper lipid” in the context of LNP is interchangeable and refers to lipids that are uncharged or stay in a neutral zwitterionic form at a selected pH.

[0103] As used herein, the term “negative lipid” refers to phospholipids that are negatively charged phospholipids molecules.

[0104] As used herein, the term “alkyl” as used herein refers to a straight or branched hydrocarbon chain radical consisting solely of carbon and hydrogen atoms, which is saturated.

[0105] As used herein, the term “alkenyl” as used herein refers to a straight or branched hydrocarbon chain radical consisting solely of carbon and hydrogen atoms, which contains one or more double bonds.

[0106] As used herein, the term “stereoisomers” refer to compounds consisting of the same atoms bonded by the same bonds but having different three-dimensional structures.

[0107] As used herein, the term “tautomers” refer to structural isomers in which a proton shifts from one atom of a molecule to another atom of the same molecule.

[0108] As used herein, the term “nucleotide” , “oligonucleotide” and “nucleic acid” can be used interchangeable herein to refer to the base-sugar-phosphate unit consisting a nucleic acid sequence, e.g., a deoxyribonucleic acid (DNA) sequence or a ribonucleic acid (RNA) sequence.

[0109] As used herein, the term “peptide” , “polypeptide” and “protein” are used interchangeably herein to refer to a polymer of at least two amino acid residues linked by one or more peptide bonds.

[0110] As used herein, the term “pharmaceutically active peptide or protein” has a positive or advantageous effect on the condition or disease state of a subject when administered to the subject in a therapeutically effective amount. Preferably, a pharmaceutically active peptide or protein has curative or palliative properties and may be administered to ameliorate, relieve, alleviate, reverse, delay onset of or lessen the severity of one or more symptoms of a disease or disorder. A pharmaceutically active peptide or protein may have prophylactic properties and may be used to delay the onset of a disease or to lessen the severity of such disease or pathological condition. The term “pharmaceutically active peptide or protein” includes entire proteins or polypeptides, and can also refer to pharmaceutically active fragments thereof. It can also include pharmaceutically active analogs of a peptide or protein. The term “pharmaceutically active peptide or protein” includes peptides and proteins that are antigens, i.e., administration of the peptide or protein to a subject elicits an immune response in a subject which may be therapeutic or partially or fully protective.

[0111] As used herein, the term “RNA encoding” means that the RNA, if present in the appropriate environment, preferably within a cell, can direct the assembly of amino acids to produce the protein or peptide encodes during the process of translation. Preferably, RNA according to the invention is able to interact with the cellular translation machinery allowing translation of the protein or peptide.

[0112] As used herein, the term “antigen” relates to an agent comprising an epitope against which an immune response is to be generated. The term “antigen” includes in particular proteins, peptides, polysaccharides, nucleic acids, especially RNA and DNA, and nucleotides. The term “antigen” also includes agents, which become antigenic-and sensitizing-only through transformation (e.g. intermediately in the molecule or by completion with body protein) . An antigen is preferably presentable by cells of the immune system such as antigen presenting cells like dendritic cells or macrophages. In addition, an antigen or a processing product thereof is preferably recognizable by a T or B cell receptor, or by an immunoglobulin molecule such as an antibody. In a preferred embodiment, the antigen is a disease-associated antigen, such as a tumor antigen, a viral antigen, or a bacterial antigen.

[0113] As used herein, the term “disease-associated antigen” is used in its broadest sense to refer to any antigen associated with a disease. A disease-associated antigen is a molecule which contains epitopes that will stimulate a host's immune system to make a cellular antigen-specific immune response and / or a humoral antibody response against the disease. The disease-associated antigen may therefore be used for therapeutic purposes. Disease-associated antigens are preferably associated with infection by microbes, typically microbial antigens, or associated with cancer, typically tumors.

[0114] As used herein, the term “disease” refers to an abnormal condition that affects the body of an individual. A disease is often construed as a medical condition associated with specific symptoms and signs. A disease may be caused by factors originally from an external source, such as infectious disease, or it may be caused by internal dysfunctions, such as autoimmune diseases. In humans, “disease” is often used more broadly to refer to any condition that causes pain, dysfunction, distress, social problems, or death to the individual afflicted, or similar problems for those in contact with the individual. In this broader sense, it sometimes includes injuries, disabilities, disorders, syndromes, infections, isolated symptoms, deviant behaviors, and atypical variations of structure and function, while in other contexts and for other purposes these may be considered distinguishable categories. Diseases usually affect individuals not only physically, but also emotionally, as contracting and living with many diseases can alter one's perspective on life, and one's personality.

[0115] As used herein, the term “immune response” relates to a reaction of the immune system such as to immunogenic organisms, such as bacteria or viruses, cells or substances. The term “immune response” includes the innate immune response and the adaptive immune response. Preferably, the immune response is related to an activation of immune cells, an induction of cytokine biosynthesis and / or antibody production.

[0116] As used herein, the terms “cancer disease” or “cancer” refer to or describe the physiological condition in an individual that is typically characterized by unregulated cell growth. Examples of cancers include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia. More particularly, examples of such cancers include bone cancer, blood cancer lung cancer, liver cancer, pancreatic cancer, skin cancer, cancer of the head or neck, cutaneous or intraocular melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, cancer of the anal region, stomach cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, uterine cancer, carcinoma of the sexual and reproductive organs, Hodgkin's Disease, cancer of the esophagus, cancer of the small intestine, cancer of the endocrine system, cancer of the thyroid gland, cancer of the parathyroid gland, cancer of the adrenal gland, sarcoma of soft tissue, cancer of the bladder, cancer of the kidney, renal cell carcinoma, carcinoma of the renal pelvis, neoplasms of the central nervous system (CNS) , neuroectodermal cancer, spinal axis tumors, glioma, meningioma, and pituitary adenoma. The term “cancer” according to the invention also comprises cancer metastases.

[0117] As used herein, the term “tumor antigen” or “tumor-associated antigen” refers to a constituent of cancer cells which may be derived from the cytoplasm, the cell surface and the cell nucleus. In particular, it refers to those antigens which are produced, preferably in large quantity, intracellularly or as surface antigens on tumor cells.

[0118] As used herein, the term “infectious disease” refers to any disease which can be transmitted from individual to individual or from organism to organism, and is caused by a microbial agent (e.g. common cold) . Infectious diseases are known in the art and include, for example, a viral disease, a bacterial disease, or a parasitic disease, which diseases are caused by a virus, a bacterium, and a parasite, respectively. In this regard, the infectious disease can be, for example, hepatitis, sexually transmitted diseases (e.g. chlamydia or gonorrhea) , tuberculosis, HIV / acquired immune deficiency syndrome (AIDS) , diphtheria, hepatitis B, hepatitis C, cholera, severe acute respiratory syndrome (SARS) , the bird flu, and influenza.

[0119] As used herein, the term “neoantigen” is an antigen that has at least one alteration that makes it distinct from the corresponding wild-type, parental antigen, e.g., via mutation in a tumor cell or post-translational modification specific to a tumor cell. A neoantigen can include a polypeptide sequence or a nucleotide sequence. A mutation can include a frameshift or nonframeshift indel, missense or nonsense substitution, splice site alteration, genomic rearrangement or gene fusion, or any genomic or expression alteration giving rise to a neoORF. A mutations can also include a splice variant. Post-translational modifications specific to a tumor cell can include aberrant phosphorylation. Post-translational modifications specific to a tumor cell can also include a proteasome-generated spliced antigen. See Liepe et al., A large fraction of HLA class I ligands are proteasome-generated spliced peptides; Science. 2016 Oct. 21; 354 (6310) : 354-358.

[0120] As used herein the term “tumor neoantigen” is a neoantigen present in a subject's tumor cell or tissue but not in the subject's corresponding normal cell or tissue.

[0121] As used herein, the term “immunologically active compound” relates to any compound altering an immune response, preferably by inducing and / or suppressing maturation of immune cells, inducing and / or suppressing cytokine biosynthesis, and / or altering humoral immunity by stimulating antibody production by B cells. Immunologically active compounds possess potent immunostimulating activity including, but not limited to, antiviral and antitumor activity, and can also down-regulate other aspects of the immune response, for example shifting the immune response away from a TH2 immune response, which is useful for treating a wide range of TH2 mediated diseases. Immunologically active compounds can be useful as vaccine adjuvants.

[0122] As used herein, the term “subject” as used herein refers to an individual, preferably a vertebrate, more preferably a non-human mammal or human. The non-human mammal can be rodents such as murines, or non-human primates such as simians. The term “subject” may also encompass cells, tissues and progenies of a biological entity obtained in vivo or culture in vitro.

[0123] As used herein, the term “effective amount” or “therapeutically effective amount” refers to the quantity of a composition, e.g., a composition comprising the LNP that is sufficient to result in a desired activity when being delivered to a subject in need thereof. Said desired activity may encompass delaying the manifestation of a disorder, arresting or delaying the progression of a disorder, or alleviating at least one symptom of a disorder. II. Ionizable cationic lipids

[0124] The present disclosure provides a group of ionizable cationic lipids, which are suitable for preparing lipid nanoparticles described herein.

[0125] Ionizable cationic lipids are essential components in lipid nanoparticle formulations. Typical structure of cationic lipids includes one or more amine group (s) which bear the positive charge. The ionizable cationic lipids can exist in a positively charged or neutral form depending on pH. The ionization of the cationic lipid affects the surface charge of the lipid nanoparticle under different pH conditions. This charge state can influence plasma protein absorption, blood clearance, and tissue distribution (Semple, S.C., et al., Adv. Drug Deliv Rev 32: 3-17 (1998) ) as well as the ability to form endosomolytic non-bilayer structures (Hafez, I.M., et al., Gene Ther 8: 1188-1196 (2001) ) critical to the intracellular delivery of nucleic acids.

[0126] The present disclosure provides a lipid compound, comprising an amino head group, and two fatty acid or fatty alkyl tails, wherein at least one tail is a branched tail comprising an acetal group, wherein the carbon atom of the acetal group serves as the branching point of the branched tail and the two ether oxygens of the acetal group are connected to two hydrocarbyl chains.

[0127] In some embodiments, the ionizable lipid could be DLin-MC3-DMA ( (6Z, 9Z, 28Z, 31Z) -heptatriacont-6, 9, 28, 3 l-tetraene-19-yl 4- (dimethylamino) butanoate) , SM-102, ALC-0315, or others (see Chem. Rev. 2021, 121, 20, 12181-12277) .

[0128] In some embodiments, the ionizable cationic lipids of the present application is a compound having formula (I) , or a salt, tautomer, or stereoisomer thereof, wherein: 1) m and p are independently selected from any integer ranging from 3 to 8; 2) n is  selected from any integer ranging from 2 to 4; 3) X is a bond, -C (O) O-, -OC (O) -, -OC (O) O-, or a biodegradable group; 4) R1 is a hydrogen bond donor-containing group or hydrogen bond acceptor-containing group; 5) both of R2 are same and selected from C1-C12 alkyl, substituted C1-C12 alkyl, C2-C12 alkenyl, substituted C2-C12 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl and substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof; 6) R3 is selected from C4-C22 alkyl, substituted C4-C22 alkyl, C4-C22 alkenyl, substituted C4-C22 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof; or R3 is an acetal group of wherein both of R4 are same and selected from C1-C16 alkyl, substituted C1-C16 alkyl, C2-C16 alkenyl, substituted C2-C16 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof.

[0129] In some embodiments, the lipid compound of the first aspect is a compound having formula (II) , or a salt, tautomer, or stereoisomer thereof, wherein q is selected from any integer ranging from 2 to 4.

[0130] In the structure as shown by Formula (I) and Formula (II) , R1 and the central nitrogen atom (N) constitutes the head group of the lipid compound of the present application. Head group of a cationic lipid is positively charged at acidic environment and is essential for the delivery of nucleic acid payloads, as it interacts with the negatively charged phosphate groups of nucleic acids. Unlike double-stranded DNA or siRNA, in which only the phosphate backbone is exposed while the nucleobases are facing inward, mRNA has a more complex secondary structure, comprising single-and double-stranded regions with some nucleosides exposed to the surrounding environment, such as the solvent. Therefore, other interactions, such as hydrogen bonding, of the head group with the riboses and nucleobases of mRNA could contribute to an improved LNP expression. In the structure as shown by Formula (I) and Formula (II) , R1 serves to provide a set of hydrogen bond donors and / or acceptors with varying hydrogen-bonding ability in the head group.

[0131] H-bond donor-or acceptor-containing groups can be those comprising nitrogen (N) , oxygen (O) , carbon (C) or fluorine (F) atoms serving as H-bond donor or H-bond acceptor. Exemplary H-bond donor-or acceptor-containing groups may include but not limited to hydroxyl-containing group, carboxyl-containing group, carbonyl-containing group, amide, imide, sulfoxide, and sulfonamide.

[0132] In preferred embodiments of the present application, R1 is selected from a group consisting of following formulae: wherein o is selected from 1, 2, 3, 4, and 5.

[0133] In specific embodiments, R1 is and o is selected from 2, 3, or 4, preferably 2.

[0134] In specific embodiments, R1 is and o is selected from 2, 3, or 4, preferably 2.

[0135] In specific embodiments, R1 is and o is selected from 2, 3, or 4, preferably 2.

[0136] Aside from the headgroup, the ionizable cationic lipid of the present application comprises two hydrophobic tails. At least one of the two tails is a branched tail, which comprises an acetal group connecting two identical branching chains, resulting in a “symmetric acetal” .

[0137] In the compound of formula (II) , both tails are symmetric acetals and are represented by R2 and R4 groups, respectively. R2 and R4 are each independently selected from C1-C12 alkyl, substituted C1-C12 alkyl, C2-C12 alkenyl, substituted C2-C12 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl and substituted C3-C12 cycloalkyl. For each of substituted alkyl and substituted alkenyl, it can comprise one or more substituents selected from deuterium (–D) , cyano (–CN) , halo, imino (=NH) , nitro (–NO2) , oxo (=O) . In preferred embodiments, R2 and R3 are independently selected from C2-C12 alkyl, C3-C12 cycloalkyl and C2-C12 alkenyl, preferably C3-C10 alkyl, unbranched or branched. R2 and R4 can be same or different. In certain embodiments, R2 and / or R4 is linear alkyl. In preferred embodiments, at least one of R2 and / or R4 is branched. As a hyperbranched structure may augment the cone-shaped morphology, and therefore increase intracellular delivery efficiency, it is preferred in the present application. Accordingly, both R2 and R4 are preferably branched. For example, R2 and / or R4 may have one or more side chains. In specific embodiments, R2 and R4 are independently selected from 2-methylhexyl or 2, 6-dimethyloctyl.

[0138] In the compound of formula (I) , only one tail is a symmetric acetal and is represented by R2 group. R2 is selected from C2-C12 alkyl, C3-C12 cycloalkyl and C2-C12 alkenyl, preferably C3-C10 alkyl, unbranched or branched. As a hyperbranched structure is preferred in the present application, R2 preferably is a branched chain. For example, R2 may have one or more side chains. In specific embodiments, R2 is selected from 2, 6-dimethyloctyl or 5-butylheptyl. For the other tail, it is preferred that R3 is also a branched chain, more preferably having two identical branching tails. In specific embodiments, R3 is selected from 5-butylheptyl or 4-propylhexyl.

[0139] The branched tail containing acetal group could easily been synthesized by conjugate R2-OH or R4-OH to the acetal group. In specific embodiments, the intermediate structure containing acetal group were synthesized using the following reactions:

[0140] In specific embodiments, R2-OH or R4-OH are branched alcohols, and the ionizable cationic lipid contains an hyperbranched structure. In specific embodiments, R2-OH or R4-OH are one of the following structures:

[0141] In specific embodiments, R2-OH or R4-OH are unsaturated alcohols, and the ionizable cationic lipid contains an unsaturated tail.

[0142] In the acetal-based branched tail, the part between the acetal branching position and the central nitrogen is referred as a “stem” region. The stem region comprises a linear chain comprising a biodegradable group.

[0143] The biodegradable group in the “stem” region can be -OC (O) -, -C (O) O-or -OC (O) O-. The biodegradable group can be cleaved in a biological environment. When the LNP formed by the ionizable lipid comprising the biodegradable group (s) is delivered into a biological environment, such as into a living organism, the biodegradable groups facilitate the metabolism and clearance of the lipid components after the payload has been delivered.

[0144] The length of the stem region is determined by the chain length before and after the biodegradable group. In some embodiments, m and p in Formula (II) is independently 3, 4, 5, 6, 7 or 8. In preferred embodiments, m is 4, 5 or 6, p is 5, 6 or 7. In some embodiments, n and q in Formula (II) is independently 2, 3, or 4. In most preferred embodiment, m = 5, n = 2, p = 5 or 7, q = 2, and X is -C (=O) O-, and the ionizable cationic lipid have one of the following structures:

[0145] In formula (II) , only one of the two tails is acetal group containing branched tails. In some embodiments, n and q in Formula (II) is 2, 3, or 4. In most preferred embodiment, m = 5, n = 2, and X is -C (=O) O-.

[0146] The compound of formula (I) has a non-acetal tail represented by the following formula:  wherein R3 is selected from C6-C22 alkyl, C6-C22 cycloalkyl or C6-C22 alkenyl, preferably C6-C12 alkyl, C6-C12 cycloalkyl or C6-C12 alkenyl, unbranched or branched.

[0147] R3 can be linear or branched. In some specific embodiments, R3 is a branched C6-C22 alkyl or a branched C6-C22 alkenyl, preferably a branched C6-C12 alkyl or a branched C6-C12 alkenyl. In some specific embodiments, when R3 is a branched alkyl or alkenyl, R3 could be the same with R2. In some specific embodiments, R3 is a linear C6-C22 alkyl or C6-C22 alkenyl, preferably a linear C8-C20 alkyl or a linear C8-C20 alkenyl, more preferably linear C9-C18 alkyl or linear C9-C18 alkenyl.

[0148] In specific embodiments, the lipid compound is selected from any one of following Compounds as shown in Table 1, including Compounds 01-21, 38-47 and 49 which have a chemical structure of formula (I) , and Compounds 22-37, 48 and 50-52 which have a chemical structure of formula (II) . III. Other lipid components of LNP

[0149] In addition to the ionizable cationic lipid, the lipid components comprised in the LNPs of the present application comprises a neutral lipid, a negative lipid, a polymer conjugated lipid, and a steroid.

[0150] Neutral lipid

[0151] The neutral lipid such as a phospholipid helps the LNP to bind to and cross the cell membrane. Exemplary neutral lipids include, but are not limited to, distearoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine, distearoylphosphatidylcholine (DSPC) , dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) , dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) , dioleoyl-phosphatidylethanolamine (DOPE) , palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC) , palmitoyloleoylphosphatidylethanolamine (POPE) , dioleoyl-phosphatidylethanolamine 4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate (DOPE-mal) , dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine (DPPE) , dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE) , di stearoyl-phosphatidyl-ethanolamine (DSPE) , monomethyl-phosphatidylethanolamine (such as 16-O-monomethyl PE) , dimethyl-phosphatidylethanolamine (such as 16-0-dimethyl PE) , 18-1-trans PE, 1-stearoyl-2-oleoyl-phosphatidyethanolamine (SOPE) , hydrogenated soy phosphatidylcholine (HSPC) , egg phosphatidylcholine (EPC) , sphingomyelin (SM) , dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC) , dierucoylphosphatidylcholine (DEPC) , dielaidoyl-phosphatidylethanolamine (DEPE) , lecithin, phosphatidylethanolamine, lysolecithin, lysophosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, sphingomyelin, egg sphingomyelin (ESM) , cephalin, cardiolipin, phosphatidicacid, cerebrosides, dicetylphosphate, lysophosphatidylcholine, dilinoleoylphosphatidylcholine, or mixtures thereof. It is understood that other phosphatidylcholine phospholipids can also be used. The acyl groups in these lipids are preferably acyl groups derived from fatty acids having C10-C24 carbon chains, e.g., lauroyl, myristoyl, palmitoyl, stearoyl, or oleoyl. In various embodiments, the molar ratio of the ionizable cationic lipid to the neutral lipid ranges from about 2: 1 to about 8: 1, preferably 5: 1.

[0152] Negative lipid

[0153] The negative lipid helps the LNP target to the APC cells. Exemplary negative lipids include, but are not limited to dioleoylphosphatidylserine (DOPS) , dimyristoyl phosphatidylglycerol (DMPG) , di stearoylphosphatidylglycerol (DSPG) , palmitoyloleyolphosphatidylglycerol (POPG) , dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG) , dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) , 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate (DOPA) . It is understood that other phosphatidylserine, and phosphatidylglycerol phospholipids can also be used. The acyl groups in these lipids are preferably acyl groups derived from fatty acids having C10-C24 carbon chains, e.g., lauroyl, myristoyl, palmitoyl, stearoyl, or oleoyl. In various embodiments, the molar ratio of the ionizable cationic lipid to the negative lipid ranges from about 10: 1 to about 1: 1, preferably is from about 2.8: 1 to 2: 1.

[0154] In some embodiments, the composition contains phosphatidylglycerol as a secondary phospholipid. In some embodiments, the secondary phospholipid is further defined as: wherein: R1 and R2 are each independently alkyl (C8-C24) , alkenyl (C8-C24) , or a substituted  version of either group; X+ is a monovalent cation.

[0155] In some embodiments, R1 and R2 are both the same. In some embodiments, the phosphatidylglycerol consists of a L-glycerol 3-phosphate backbone ester-bonded to saturated fatty acids. In some embodiments, the phosphatidylglycerol consists of a L-glycerol 3-phosphate backbone ester-bonded to unsaturated fatty acids.

[0156] In some embodiments, the phosphatidylglycerol is 1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) ; In some embodiments, the phosphatidylglycerol is 1, 2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphorylglycerol (DLPG) ; In some embodiments, the phosphatidylglycerol is 1, 2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DMPG) ; In some embodiments, the phosphatidylglycerol is 1, 2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DPPG) ; In some embodiments, the phosphatidylglycerol is 1, 2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG) .

[0157] In some embodiments, the phosphatidylglycerol is 1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) and have the following structure:

[0158] In some embodiments, R1 and R2 are different. In some embodiments, the phosphatidylglycerol consists of a L-glycerol 3-phosphate backbone ester-bonded to saturated or unsaturated fatty acids.

[0159] In some embodiments, the phosphatidylglycerol is 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (POPG, 16: 0-18: 1 PG) ; In some embodiments, the phosphatidylglycerol is 1-octadecanoyl-2- (9Z-octadecenoyl) -sn-glycero-3-phosphoglycerol (SOPG, 18: 0-18: 1 PG) .

[0160] Steroid

[0161] The steroid or steroid analogue. In certain embodiments, the steroid or steroid analogue is cholesterol, sitosterol or stigmasterol. In certain embodiments, the steroid or steroid analogue is cholesterol. In certain embodiments, the steroid or steroid analogue is beta-Sitosterol. In certain embodiments, the steroid or steroid analogue is Stigmastanol. In some of these embodiments, the molar ratio of the ionizable cationic lipid to cholesterol ranges from about 2: 1 to 1: 2, preferably 1.2: 1 to 1: 1.2.

[0162] Polymer conjugated lipid

[0163] The polymer conjugated lipid can be a PEGylated lipid or PEG lipid. In various embodiments, the PEG lipid is a pegylated diacylglycerol (PEG-DAG) such as 1- (monomethoxy-polyethyleneglycol) -2, 3-dimyristoylglycerol (PEG-DMG) , a pegylated phosphatidylethanoloamine (PEG-PE) , a PEG succinate diacylglycerol (PEG-S-DAG) such as 4-O- (2′, 3′-di (tetradecanoyloxy) propyl-1-O- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) butanedioate (PEG-S-DMG) , a pegylated ceramide (PEG-cer) , or a PEG dialkoxypropylcarbamate such as ω-methoxy (polyethoxy) ethyl-N- (2, 3-di (tetradecanoxy) propyl) carbamate or 2, 3-di (tetradecanoxy) propyl-N- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) carbamate. In various embodiments, the molar ratio of the ionizable cationic lipid to the pegylated lipid ranges from about 100: 1 to about 20: 1.

[0164] In preferred embodiments, the nanoparticle of the present disclosure comprises the following in a mole ratio of ionizable cationic lipid: a neutral lipid: a negative lipid: a steroid: polymer conjugated lipid, 42.5: 8.5: 15: 32.7: 1.3, wherein: 1) the cationic lipid of the present disclosure, preferable selected from Table 1; 2) a neutral lipid which is DSPC; 3) a negative lipid which is DSPG; 4) a steroid which is cholesterol; 5) polymer conjugated lipid which is PEG-DMG. IV. Nucleic acid payload

[0165] The LNPs of the present application are particularly suitable for delivering nucleic acid molecules into cells.

[0166] The nucleic acid molecule can be either DNA or RNA or a mixture thereof, such as chimeric oligonucleotides. The nucleic acid molecule can comprise naturally occurring or modified polynucleotides. The nucleic acid molecule can be a coding RNA, i.e. RNA encoding a peptide or protein, said RNA may express an antigen or other immunologically active compound. The nucleic acid molecule can be a non-coding sequence too. The nucleic acid molecule can be DNA molecule such as plasmid DNA, closed-ended DNA or a mixture thereof. The nucleic acid molecule can be RNA molecule such as messenger RNA (mRNA) , guide RNA (gRNA) , a short interfering RNA (siRNA) , an RNA interference (RNAi) molecule, a microRNA (miRNA) , an antagomir, an antisense RNA, a ribozyme, a small hairpin RNA (shRNA) , or a mixture thereof.

[0167] Plasmid DNA or closed-ended DNA may have a length at a range of 500 to 500,000 base pairs. mRNA may have a length at a range of 200 to 100,000 base pairs. gRNA may have a length at a range of 30 to 1,000 base pairs. siRNA, RNAi, miRNA, or shRNA may have a length at a range of 15 to 1,000 base pairs.

[0168] The nucleic acid molecules can comprise modifications, such as one or more modifications to the backbone, one or more modifications to the base and / or one or more modifications to the sugar moiety. V. Compound Synthesis

[0169] Compounds of the present disclosure can be prepared in a variety of ways using commercially available starting materials, compounds known in the literature, or from readily prepared intermediates, by employing standard synthetic methods and procedures either known to those skilled in the art, or which will be apparent to the skilled artisan in light of the teachings herein. Standard synthetic methods and procedures for the preparation of organic molecules and functional group transformations and manipulations can be obtained from the relevant scientific literature or from standard textbooks in the field.

[0170] One of ordinary skill in the art will recognize that certain groups may require protection from the reaction conditions via the use of protecting groups. Protecting groups may also be used to differentiate similar functional groups in molecules.

[0171] Preferred protecting groups include, but are not limited to: TBS, benzyl, THP or Ac (for a hydroxyl moiety) ; benzyl ester, methyl ester, ethyl ester, or allyl ester (for carboxylic acids) ; Fmoc, Cbz, BOC, DMB, Ac, Bn, Tr, Ts, trifluoroacetyl, phthalimide, or benzylideneamine (for amines) ; and di-alkyl acetals such as dimethoxy acetal or diethyl acetyl (for aldehydes) .

[0172] In the reaction schemes described herein, multiple stereoisomers may be produced. When no particular stereoisomer is indicated, it is understood to mean all possible stereoisomers that could be produced from the reaction. A person of ordinary skill in the art will recognize that the reactions can be optimized to give one isomer preferentially, or new schemes may be devised to produce a single isomer. If mixtures are produced, techniques such as preparative thin layer chromatography, preparative HPLC, preparative chiral HPLC, or preparative SFC may be used to separate the isomers. VI. Preparation of Nanoparticles

[0173] Nanoparticles can be made with mixing processes such as microfluidics and T-tube mixing of two fluid streams, one of which contains the therapeutic and / or prophylactic and the other has the lipid components.

[0174] Lipid compositions are prepared by combining a cationic lipid, such as lipid according to Table 1, neutral lipids (such as DSPC) , negative lipid (Such as DSPG) , a steroid (such as cholesterol) , and a PEG lipid (such as 1, 2-dimyristoyl-sn-glycerol methoxypolyethylene glycol, also known as DMG-PEG2000) at concentrations of about 5 mg / mL and 25 mg / mL in ethanol. Solutions should be refrigerated for storage at, for example, -80 ℃.

[0175] Nanoparticles compositions including a therapeutic and / or prophylactic and a lipid component are prepared by combining the lipid solution with a solution including the therapeutic and / or prophylactic at lipid component to therapeutic and / or prophylactic wt: wt ratios between about 10: 1 and about 20: 1. The lipid solution is injected using a microfluidic based system at flow rates between 0.25 mL / min and 2.0 mL / min into the therapeutic and / or prophylactic solution to produce a suspension with a water to ethanol ratio at about 3: 1.

[0176] For nanoparticle compositions including RNA or pDNA, solutions of the RNA or pDNA are diluted with 50 mM sodium citrate buffer at a pH between 3 and 4 to form a stock solution at concentrations of 0.1-0.5 mg / mL.

[0177] Nanoparticle compositions can be processed by dialysis to remove ethanol and achieve buffer exchange. Formulations were dialyzed twice against Tris-HCl Solution (20 mM, pH 7.4) at volumes about 2500 times that of the primary product using Dialysis Membranes (Solarbio) with a molecular weight cutoff of 8-14 KD at 0-4 ℃ overnight. Then 40%sucrose solution was added, the final nanoparticle composition solution of 0.03 mg / mL to 0.2 mg / mL (mRNA or pDNA) are generally obtained and stored at -80 ℃. VII. Characteristics of Nanoparticle Compositions

[0178] The physical and chemical properties of the lipid nanoparticle of the present application depend on the formulation of the LNPs.

[0179] For example, it has been found by the present inventors that the choice of the ionizable cationic lipid dramatically influences the size of the formulated LNPs. For example, the lipid nanoparticles have a mean diameter of from about 100 nm to about 350 nm, preferably 150 nm to 250 nm. In specific embodiments, the lipid nanoparticles have a mean diameter of about 100 nm, 110 nm, 120 nm, 130 nm, 140 nm, 150 nm, 160 nm, 170 nm, 180 nm, 190 nm, 200 nm, 210 nm, 220 nm, 230 nm, 240 nm, 250 nm, 260 nm, 270 nm, 280 nm, 290 nm or 300 nm.

[0180] Polydispersity index (PDI) is a parameter describing the distribution of molecular weight of the particles in an LNP formulation. A lager PDI describes a broader distribution of molecular weight. For example, the PDI of the formulation can be 0.10 to 0.50, preferably 0.20 to 0.45, more preferably 0.05 to 0.30.

[0181] In some embodiments, the lipid nanoparticles are substantially non-toxic or having acceptable toxicity to the subject. For example, the lipid nanoparticles of the present application have a reduced liver toxicity as compared to nanoparticles comprising a different ionizable lipid. The liver toxicity can be measured based known method in the art.

[0182] The lipid nanoparticle of the present disclosure can provide desirable transduction efficiency, which can be measured by e.g. the amount or expression level of the payload. In preferred embodiments, the lipid nanoparticles of the present application provide a comparable or increased amount of payload or expression of payload as compared to a nanoparticle comprising a different ionizable cationic lipid. VIII. Uses

[0183] The LNP formed by the ionizable cationic lipid and loaded with nucleic acid molecules may have diverse uses, depending on the type and function of the nucleic acid molecules.

[0184] For example, the LNPs can be used for treating a disease or disorder. In some embodiments, the disease or disorder is caused by insufficiency of a protein, and the LNP comprises nucleic acid molecule encoding for the protein.

[0185] For example, the LNPs can be used for preventing a disease or disorder. For example, the LNPs can be formed as a vaccine, in which the nucleic acid molecule encodes for an antigen, such as an antigen derived from a pathogen, e.g. a bacterium, a fungus, or a virus, or an antigen derived from tumor cell, e.g. tumor associated antigen.

[0186] For example, the LNPs can be used for treating a disease or disorder by affecting expression of specific cellular proteins. In some embodiments, the LNPs comprise nucleic acids, such as siRNAs and miRNAs, which down-regulate or up-regulate intracellular levels of target mRNA associated with a disease state. For example, the target mRNA can be the mRNA of a tumor suppressor or mRNAs of infectious agents.

[0187] For example, the LNPs can be used for treating a disease or disorder by affecting expression of specific cellular proteins via genome editing. In some embodiments, to treat a disease or disorder caused by or related to a certain mutation, which for example causes loss-of-function or gain-of-toxicity of a protein, the LNPs may comprise nucleic acid molecule encoding for genome editing tool. For example, the LNPs can be used to deliver mRNA of a nuclease, e.g. Cas nuclease, and / or a guide RNA, so as to conduct nuclease-mediated gene editing.

[0188] Examples

[0189] Example 1. Synthesis of Compounds

[0190] General Considerations

[0191] All solvents and reagents used were obtained commercially and used as such unless noted otherwise. 1H NMR spectra were recorded in CDCl3, at 400 MHz instrument. Chemical shifts are reported as parts per million (ppm) relative to TMS (0.00) for 1H.

[0192] The procedures described below are useful in the synthesis of Compounds 1-52.

[0193] The following abbreviations are employed herein.

[0194] Synthesis of Compound 01: 2-ethylhexyl 8- ( (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0195] Synthesis of 3-butylheptan-1-ol

[0196] Step 1: to a solution of NaH (14.1 g, 351 mmol, 60%purity, 1.0 eq) in THF (1576 mL) was added ethyl 2- (diethoxyphosphoryl) acetate (78.8 g, 352 mmol, 69.7 mL, 1.0 eq) in dropwise at 0 ℃. The reaction was warmed at 20 ℃ and stirred for 1 hour until there was no bubbles formed, and then add nonan-5-one (25.0 g, 176 mmol, 0.5 eq) . The reaction was stirred at 75 ℃for 12 hours. The reaction mixture was quenched by addition water (400 mL) and extracted with EtOAc (500 mL*2) . The combined organic layers were washed with brine (100 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=4 / 1) . ethyl 3-butylhept-2-enoate (32.0 g, crude) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 5.62 (s, 1 H) , 5.26 -5.36 (m, 1 H) , 4.10 -4.17 (m, 2 H) , 3.03 (s, 1 H) , 2.97 -2.98 (m, 1 H) , 2.57 -2.61 (m, 1 H) , 2.00 -2.16 (m, 3 H) , 1.25 -1.48 (m, 10 H) , 0.88 -0.94 (m, 6 H) .

[0197] Step 2: To a solution of Pd / C (3.20 g, 4.71 mmol, 10%purity) in EtOH (160 mL) was added ethyl 3-butylhept-2-enoate (16.0 g, 75.4 mmol, 1.0 eq) . The reaction was degassed and purged by H2 several times, stirred at 25 ℃ for 12 hours under H2 (50 psi) . 1H NMR showed the starting material was consumed completely. The two reactions were combined to work up. The reaction mixture was filtered, the filtrate cake was washed with THF (1.00 L) and concentrated under reduced pressure to give a residue. The crude product was used into the next step without further purification. Ethyl 3-butylheptanoate (29.0 g, 135 mmol, 89.8%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.10 -4.15 (m, 2 H) , 2.23 (d, J = 6.88 Hz, 2 H) , 1.82 -1.86 (m, 1 H) , 1.24 -1.32 (m, 14 H) , 0.87 -0.91 (m, 6 H) .

[0198] Step 3: To a solution of LAH (5.14 g, 135 mmol, 1.0 eq) in THF (290 mL) was added Ethyl 3-butylheptanoate (29.0 g, 135 mmol, 1.0 eq) at 0 ℃. The reaction was stirred at 20 ℃ for 2 hours. The reaction mixture was quenched by addition water (6.00 mL) at 0℃, 15%NaOH with solvent (6.00 mL) , and water (18.0 mL) . The combined organic layers were added MgSO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The crude product was used into the next step without further purification. 3-butylheptan-1-ol (23.0 g, crude) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 3.67 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 1.51 -1.56 (m, 2 H) , 1.35 -1.45 (m, 1 H) , 1.26 -1.31 (m, 13 H) , 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 6 H) .

[0199] Synthesis of 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propan-1-ol

[0200] To a solution of ethyl 3, 3-diethoxypropanoate (6.5 g, 34.2 mmol, 6.65 mL, 1.0 eq) and 3-butylheptan-1-ol (23.0 g, 133 mmol, 3.91 eq) was added KHSO4 (232 mg, 1.71 mmol, 100 uL, 0.05 eq) . The reaction was stirred at 75 ℃ for 12 hours. The residue was diluted with water (50.0 mL) and extracted with EtOAc (100 mL, 50.0 ml) . The combined organic layers were washed with brine (20.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=60 / 1 to 50 / 1) . 3-butylheptyl 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propanoate (3.6 g, 6.33 mmol, 18.5%yield) . 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.94 (d, J = 4.4 Hz, 1 H) , 4.12 -4.16 (m, 2 H) , 3.58 -3.63 (m, 2 H) , 3.48 -3.52 (m, 2 H) , 2.64 (d, J = 6.00 Hz, 2 H) , 1.50 -1.55 (m, 5 H) , 1.40 -1.43 (m, 3 H) , 1.20 -1.31 (m, 35 H) , 0.86 -0.91 (m, 18 H) .

[0201] To a solution of LAH (240 mg, 6.33 mmol, 1.0 eq) in THF (25.2 mL) was added 3-butylheptyl 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propanoate (3.60 g, 6.33 mmol, 1.0 eq) at 0 ℃. The reaction was stirred at 20 ℃ for 2 hours. The reaction mixture was quenched by addition water (0.50 mL) at 0℃, 15%NaOH with solvent (0.50 mL) , and water (1.50 mL) . The combined organic layers were added MgSO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The crude product was used into the next step without further purification. 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propan-1-ol (2.60 g, crude) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.66 (t, J = 5.2 Hz, 1 H) , 3.73 -3.76 (m, 2 H) , 3.62 -3.69 (m, 3 H) , 3.44 -3.50 (m, 2 H) , 1.87 -1.91 (m, 2 H) , 1.51 -1.57 (m, 6 H) , 1.41 -1.43 (m, 3 H) , 1.26 -1.31 (m, 35 H) , 0.85 -0.91 (m, 18 H) .

[0202] Synthesis of 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate

[0203] To a solution of 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propan-1-ol (2.00 g, 4.99 mmol, 1.0 eq) and 6-bromohexanoic acid (1.95 g, 9.98 mmol, 2.0 eq) in DCM (12.0 mL) was added EDCI (1.44 g, 7.49 mmol, 1.5 eq) and DMAP (122 mg, 998 umol, 0.2 eq) at 0 ℃. The reaction was stirred at 20 ℃ for 1.5 hours. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (10.0 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=150 / 1) . 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (1.70 g, 2.94 mmol, 57.0%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.60 (t, J = 4.4 Hz, 1 H) 4.15 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) 3.57 -3.63 (m, 2 H) 3.39 -3.48 (m, 4 H) 2.32 (t, J=7.6 Hz, 2 H) 1.86 -1.97 (m, 4 H) 1.62 -1.68 (m, 2 H) 1.41 -1.56 (m, 9 H) 1.26 -1.31 (m, 24 H) 0.90 (t, J = 6.4Hz, 12 H) .

[0204] Synthesis of 3-butylheptyl 8-bromooctanoate

[0205] A 100 mL three-necked round bottom flask equipped with magnetic stirrer, addition funnel and thermometer. To a solution of 3-butylheptan-1-ol (5.00 g, 29.0 mmol, 1.0 eq) and 8-bromooctanoic acid (9.71 g, 43.5 mmol, 1.5 eq) in DCM (30.0 mL) was added EDCI (11.1 g, 58.0 mmol, 2.0 eq) and DMAP (709.01 mg, 5.80 mmol, 0.2 eq) . The mixture was stirred at 20 ℃for 12 hours. The residue was diluted with water (25.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether: Ethyl acetate=100 / 1 to 80 / 1) . 3-butylheptyl 8-bromooctanoate (8.60 g, 22.8 mmol, 78.5%yield) was obtained as a white solid. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.09 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 3.40 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 2.29 (t, J = 7.2 Hz, 2 H) , 1.82 -1.89 (m, 2 H) , 1.51 -1.65 (m, 6 H) , 1.26 -1.45 (m, 21 H) , 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 6 H) .

[0206] Synthesis of 3-butylheptyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0207] A 100 mL three-necked round bottom flask equipped with magnetic stirrer, addition funnel and thermometer. To a solution of 3-butylheptyl 8-bromooctanoate (2.50 g, 6.62 mmol, 1.0 eq) in EtOH (50.0 mL) was added 2-aminoethanol (12.1 g, 199 mmol, 12.0 mL, 30 eq) . The mixture was stirred at 75 ℃ for 2 hours. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (5.00 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. Without purification. 3-butylheptyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate (2.30 g, 6.43 mmol, 97.1%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.08 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 3.62 -3.65 (m, 2 H) , 2.76 -2.78 (m, 2 H) , 2.59 -2.63 (t, J=7.15 Hz, 2 H) , 2.26 -2.30 (t, J=7.57 Hz, 2 H) , 1.93 -2.02 (m, 2 H) , 1.46 -1.63 (m, 6 H) , 1.39 -1.40 (m, 1 H) , 1.25 -1.32 (m, 17 H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 6 H) .

[0208] Synthesis of Compound 01

[0209] Compound 01 was synthesized using 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate and 3-butylheptyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate. Compound 01 (0.350 g, 410 μmol, 36.6%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.60 (t, J =6.0 Hz, 1 H) , 4.07 -4.16 (m, 4 H) , 3.51 -3.61 (m, 4 H) , 3.43 -3.46 (m, 2 H) , 2.57 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 2.42 -2.46 (m, 4 H) , 2.27 -2.32 (m, 4 H) , 1.93 -1.95 (m, 2 H) , 1.41 -1.65 (m, 19 H) , 1.25 -1.34 (m, 43 H) , 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 18 H) .

[0210] Synthesis of Compound 02: 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6- ( (6- ( (3-butylheptyl) oxy) -6-oxohexyl) (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0211] Synthesis of 3-butylheptyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0212] To a solution of 3-butylheptan-1-ol (2.90 g, 16.8 mmol) and 6-bromohexanoic acid (4.92 g, 25.3 mmol) in CH2Cl2 (18.0 mL) was added EDCI (4.84 g, 25.3 mmol) and DMAP (411 mg, 3.37 mmol) . The mixture was stirred at 20 ℃ for 12 hours. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate=10: 1, start material: Rf=0.18; product: Rf= 0.60) indicated the 6-bromohexanoic acid was consumed complete. The residue was diluted with water (20 mL) and extracted with CH2Cl2 (20 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (30 mL *3) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether: Ethyl acetate=80 / 1 to 60 / 1) . 3-butylheptyl 6-bromohexanoate (4.1 g, 11.7 mmol, 69.7%yield) was obtained as colorless oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.10 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.41 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.32 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.89 (m, 2H) , 1.63-1.72 (m, 2H) , 1.54-1.62 (m, 2H) , 1.45-1.53 (m, 2H) , 1.36-1.44 (m, 1H) , 1.19-1.35 (m, 12H) , 0.87-0.93 (m, 6H) .

[0213] To a solution of 3-butylheptyl 6-bromohexanoate (1.26 g, 3.61 mmol) in EtOH (25 mL) was added 2-aminoethanol (6.61 g, 108 mmol, 6.53 mL) . The mixture was stirred at 75 ℃ for 1 hour. The residue was diluted with water (20 mL) and extracted with EtOAc (20 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (20 mL *3) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. 3-butylheptyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (1.11 g, crude) was obtained as colorless oil.

[0214] Synthesis of compound 02

[0215] To a solution of 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (550 mg, 952 μmol, 1.0 eq) and 3-butylheptyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (313 mg, 952 μmol, 1.0 eq) in EtOH (5.00 mL) was added DIEA (184 mg, 1.43 mmol, 248 μL, 1.5 eq) . The mixture was stirred at 90 ℃ for 48 hours. The residue was diluted with H2O (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (20.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～4%Dichloromethane: Methanol gradient @15 mL / min) . Compound 02 (300 mg, 38.1%yield) was obtained as colorless oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.60 (t, J = 5.25 Hz, 1H) , 4.05-4.17 (m, 4H) , 3.72-3.83 (m, 1H) , 3.56-3.64 (m, 2H) , 3.39-3.49 (m, 2H) , 2.69-2.96 (m, 5H) , 2.32 (t, J = 7.19 Hz, 4H) , 1.90-1.99 (m, 2H) , 1.62-1.72 (m, 7H) , 1.50-1.60 (m, 7H) , 1.38 (dd, J = 7.32 Hz, 14.70 Hz, 8H) , 1.19-1.33 (m, 38H) , 0.90 (t, J = 6.32 Hz, 18H)

[0216] Synthesis of Compound 03: 3-butylheptyl 8- ( (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) (4-hydroxybutyl) amino) octanoate

[0217] Synthesis of 3-butylheptyl 8- ( (4-hydroxybutyl) amino) octanoate

[0218] To a solution of 3-butylheptyl 8-bromooctanoate (1.10 g, 2.91 mmol, 1.0 eq) in EtOH (10.0 mL) was added 2-aminoethanol (7.79 g, 87.4 mmol, 8.12 mL, 30 eq) . The mixture was stirred at 75 ℃ for 1 hour. The residue was diluted with H2O (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give 3-butylheptyl 8- ( (4-hydroxybutyl) amino) octanoate (990 mg, 88.0%yield) as colorless oil.

[0219] Synthesis of Compound 03

[0220] To a solution of 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (550 mg, 952 μmol, 1.0 eq) and 3-butylheptyl 8- ( (4-hydroxybutyl) amino) octanoate (367 mg, 952 μmol, 1.0 eq) in EtOH (10.0 mL) was added DIEA (184 mg, 1.43 mmol, 248 μL, 1.5 eq) . The mixture was stirred at 90 ℃ for 24 hours. The residue was diluted with H2O (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (20.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～2%Dichloromethane: Methanol gradient @15 mL / min) to give Compound 03 (280 mg, 33.3%yield) as colorless oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.60 (t, J = 5.75 Hz, 1H) , 4.06-4.18 (m, 4H) , 3.69 (s, 2H) , 3.56-3.65 (m, 2H) , 3.41-3.48 (m, 2H) , 2.70-3.00 (m, 5H) , 2.26-2.35 (m, 4H) , 1.82-1.99 (m, 4H) , 1.63-1.75 (m, 8H) , 1.50-1.60 (m, 9H) , 1.22-1.45 (m, 48H) , 0.90 (t, J = 6.69 Hz, 18H) .

[0221] Synthesis of Compound 04: 3-butylheptyl 8- ( (3- (1H-imidazol-1-yl) propyl) (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) amino) octanoate

[0222] Synthesis of 3-butylheptyl 8- ( (3- (1H-imidazol-1-yl) propyl) amino) octanoate

[0223] A mixture of compound 3-butylheptyl 8-bromooctanoate (500 mg, 1.32 mmol) in EtOH (10 mL) was added compound 3- (1H-imidazol-1-yl) propan-1-amine (1.66 g, 13.2 mmol) under N2 atmosphere. The suspension was degassed and purged with N2 for 3 times. The mixture was stirred 90 ℃ for 24 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.31) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give compound 3-butylheptyl 8- ( (3- (1H-imidazol-1-yl) propyl) amino) octanoate (438 mg, 69.2%yield) as yellow solid.

[0224] Synthesis of Compound 04

[0225] To a solution of compound 3-butylheptyl 8- ( (3- (1H-imidazol-1-yl) propyl) amino) octanoate (438 mg, 1.04 mmol) in EtOH (10 mL) was added 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (500 mg, 865 μmol) and DIEA (336 mg, 2.60 mmol, 452 μL) under N2 atmosphere. The suspension was degassed and purged with N2 for 3 times. The mixture was stirred at 90 ℃ for 24 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.45) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～10%MeOH / CH2Cl2 gradient @12 mL / min) to give compound 04 (120 mg, 13.1%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.48 (s, 1H) , 7.07 (s, 1H) , 6.94 (s, 1H) , 4.60 (t, J =5.6 Hz, 1H) , 4.15 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 4.09 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 4.06-3.94 (m, 2H) , 3.60 (dd, J =7.2 Hz, 16.4 Hz, 2H) , 3.45 (dd, J = 7.2 Hz, 16.4 Hz, 2H) , 2.47-2.34 (m, 4H) , 2.30 (dd, J = 7.2 Hz, 13.2 Hz, 4H) , 1.95 (dd, J = 6.4 Hz, 12.4 Hz, 2H) , 1.67-1.62 (m, 4H) , 1.53 (dd, J = 6.4 Hz, 13.2 Hz, 6H) , 1.41 (s, 6H) , 1.36-1.19 (m, 49H) , 0.90 (t, J = 6.4 Hz, 18H) .

[0226] Synthesis of Compound 05: 3-butylheptyl 8- ( (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) (3- (2-methyl-1H-imidazol-1-yl) propyl) amino) octanoate

[0227] Synthesis of 3-butylheptyl 8- ( (3- (2-methyl-1H-imidazol-1-yl) propyl) amino) octanoate

[0228] A mixture of compound 3-butylheptyl 8-bromooctanoate (500 mg, 1.32 mmol) in EtOH (10 mL) was added compound 3- (2-methyl-1H-imidazol-1-yl) propan-1-amine (1.84 g, 13.2 mmol) under N2 atmosphere. The suspension was degassed and purged with N2 for 3 times. The mixture was stirred 90 ℃ for 24 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.31) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give 3-butylheptyl 8- ( (3- (2-methyl-1H-imidazol-1-yl) propyl) amino) octanoate (440 mg, 76.2%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.90 (s, 1H) , 6.83 (d, J = 0.8 Hz, 1H) , 4.09 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.93 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.54-2.63 (m, 4H) , 2.39 (s, 3H) , 2.29 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.85-1.93 (m, 2H) , 1.56-1.65 (m, 4H) , 1.38-1.52 (m, 4H) , 1.32 (s, 6H) , 1.22-1.28 (m, 12H) , 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 6H) .

[0229] Synthesis of Compound 05 (15-im2-2)

[0230] To a solution of 3-butylheptyl 8- ( (3- (2-methyl-1H-imidazol-1-yl) propyl) amino) octanoate (400 mg, 918 μmol) in EtOH (10 mL) was added 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (500 mg, 865 μmol) and DIEA (197 mg, 1.53 mmol, 266 μL) under N2 atmosphere. The suspension was degassed and purged with N2 for 3 times. The mixture was stirred at 90 ℃ for 24 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.45) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～10%MeOH / CH2Cl2 gradient @12 mL / min) to give compound 05 (180 mg, 25.2%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.92 (s, 1H) , 6.83 (s, 1H) , 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.06-4.18 (m, 4H) , 3.83-3.94 (m, 2H) , 3.56-3.65 (m, 2H) , 3.41-3.50 (m, 2H) , 2.38-2.48 (m, 7H) , 2.26-2.34 (m, 4H) , 1.86-1.96 (m, 4H) , 1.51-1.69 (m, 11H) , 1.42 (s, 6H) , 1.18-1.35 (m, 46H) , 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 18H) .

[0231] Synthesis of Compound 06: 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6- ( (6- ( (3-butylheptyl) oxy) -6-oxohexyl) (3- (2-methyl-1H-imidazol-1-yl) propyl) amino) hexanoate

[0232] Synthesis of 3-butylheptyl 6- ( (3- (2-methyl-1H-imidazol-1-yl) propyl) amino) hexanoate

[0233] A mixture of compound 3-butylheptyl 8-bromooctanoate (1 g, 2.86 mmol) in EtOH (20 mL) was added 3- (2-methyl-1H-imidazol-1-yl) propan-1-amine (3.98 g, 28.62 mmol) under N2 atmosphere. The suspension was degassed and purged with N2 for 3 times. The mixture was stirred 90 ℃ for 24 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.29) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give 3-butylheptyl 6- ( (3- (2-methyl-1H-imidazol-1-yl) propyl) amino) hexanoate (1.0 g, 85.70%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ6.90 (d, J = 1.2 Hz, 1H) , 6.82 (d, J = 1.2 Hz, 1H) , 4.05-4.11 (m, 2H) , 3.93 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.59 (q, J = 6.8 Hz, 4H) , 2.38 (s, 3H) , 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.85-1.93 (m, 2H) , 1.62-1.67 (m, 2H) , 1.54-1.60 (m, 2H) , 1.45-1.53 (m, 2H) , 1.30-1.42 (m, 4H) , 1.22-1.29 (m, 12H) , 0.89 (t, J =6.8 Hz, 6H) .

[0234] Synthesis of Compound 06

[0235] To a solution of 3-butylheptyl 6- ( (3- (2-methyl-1H-imidazol-1-yl) propyl) amino) hexanoate (500 mg, 1.23 mmol) in EtOH (10 mL) was added 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (590 mg, 1.02 mmol) and DIEA (264 mg, 2.04 mmol, 356 μL) under N2 atmosphere. The suspension was degassed and purged with N2 for 3 times. The mixture was stirred at 90 ℃ for 24 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.41) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～10%MeOH / CH2Cl2 gradient @15 mL / min) to give compound 06 (130 mg, 14.06%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.92 (s, 1H) , 6.83 (s, 1H) , 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.05-4.18 (m, 4H) , 3.88 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.56-3.64 (m, 2H) , 3.40-3.50 (m, 2H) , 2.38-2.45 (m, 8H) , 2.30 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 1.84-1.97 (m, 5H) , 1.51-1.67 (m, 10H) , 1.38-1.47 (m, 7H) , 1.21-1.33 (m, 40H) , 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 18H) .

[0236] Synthesis of Compound 07: 3-butylheptyl 8- ( (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) (3- ( (2- (methylamino) -3, 4-dioxocyclobut-1-en-1-yl) amino) propyl) amino) octanoate

[0237] Synthesis of benzyl (3-aminopropyl) carbamate

[0238] A 500 mL three-necked round bottom flask equipped with magnetic stirrer, addition funnel and thermometer. To a solution of tert-butyl (3-aminopropyl) carbamate (20.0 g, 115 mmol, 20.0 mL, 1.0 eq) in THF (120 mL) and H2O (80.0 mL) was added K2CO3 (23.8 g, 172 mmol, 1.5 eq) and CbzCl (29.4 g, 172 mmol, 24.5 mL, 1.5 eq) at 0 ℃. The mixture was stirred at 0-15 ℃ for 40 minutes. The residue was diluted with water (100 mL) and extracted with EtOAc (100 mL, 50.0 mL, 25.0 mL) . The combined organic layers were washed with brine (20.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether: Ethyl acetate=20 / 1 to 10 / 1) . Benzyl tert-butyl propane-1, 3-diyldicarbamate (42.0 g, crude) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.29 -7.38 (m, 5 H) , 5.26 (s, 1 H) , 5.10 (s, 2 H) , 4.83 (s, 1 H) , 3.17 -3.27 (m, 4 H) , 1.60 -1.66 (m, 4 H) , 1.44 (s, 9 H) .

[0239] A 100 mL three-necked round bottom flask equipped with magnetic stirrer, addition funnel and thermometer. To a solution of benzyl tert-butyl propane-1, 3-diyldicarbamate (20.0 g, 64.9 mmol, 1.0 eq) in DCM (120 mL) was added TFA (92.4 g, 810.3 mmol, 60.0 mL, 12.5 eq) at 0 ℃. The mixture was stirred at 20 ℃ for 2 hours. The reaction was quenched by the slow addition of Ca. 200 mL of a saturated aqueous sodium bicarbonate solution at 0 ℃ and extracted with EtOAc / THF (2 / 1, 100 mL *5) . The organic layer was separated, washed with a saturated aqueous sodium bicarbonate solution, then the Organic phase was adjusted pH 7 to 8 by a 0.1N sodium hydroxide solution and then brine (20.0 mL) , dried, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. Without purification. Benzyl (3-aminopropyl) carbamate (11.2 g, crude) was obtained as green oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.28 -7.41 (m, 5 H) , 5.38 (s, 1 H) , 5.05 -5.13 (m, 2 H) , 3.27 -3.28 (m, 2 H) , 2.92 (s, 2 H) , 2.75 -2.81 (m, 2 H) , 1.63 -1.68 (m, 2 H) .

[0240] Synthesis of 3-butylheptyl 8- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) amino) octanoate

[0241] To a solution of benzyl (3-aminopropyl) carbamate (4.54 g, 18.5 mmol) in EtOH (30 mL) was added 3-butylheptyl 8-bromooctanoate (1.40 g, 3.71 mmol) and DIEA (2.40 g, 18.5 mmol, 3.23 mL) . Then the mixture was stirred at 75 ℃ for 12 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH =10 / 1, Rf = 0.13) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～2%MeOH: CH2Cl2 @15 mL / min) to give 3-butylheptyl 8- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) amino) octanoate (1.10 g, 58.7%yield) as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.29-7.39 (m, 5H) , 5.06-5.12 (m, 2H) , 4.09 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.30 (d, J = 4.4 Hz, 2H) , 2.69 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.52-2.61 (m, 2H) , 2.28 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.64-1.74 (m, 2H) , 1.56-1.63 (m, 4H) , 1.37-1.52 (m, 4H) , 1.22-1.34 (m, 19H) , 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 6H) .

[0242] Synthesis of 3-butylheptyl 8- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) amino) octanoate

[0243] To a solution of 3-butylheptyl 8- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) amino) octanoate (800 mg, 1.58 mmol) in EtOH (2 mL) was added 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (915 mg, 1.58 mmol) and DIEA (409 mg, 3.17 mmol, 552 μL) . Then the mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.43) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with CH2Cl2 (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g  Silica Flash Column, Eluent of 0～20%MeOH: CH2Cl2 @15 mL / min) to give 3-butylheptyl 8- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) amino) octanoate (900 mg, 56.7%yield) as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.30-7.37 (m, 5H) , 5.10 (s, 2H) , 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.06-4.16 (m, 4H) , 3.55-3.63 (m, 1H) , 3.41-3.48 (m, 1H) , 3.31 (d, J = 5.6 Hz, 2H) , 2.54-3.02 (m, 4H) , 2.25-2.33 (m, 5H) , 1.91-1.98 (m, 2H) , 1.50-1.67 (m, 15H) , 1.18-1.44 (m, 51H) , 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 18H) .

[0244] Synthesis of Compound 07

[0245] A solution of 3-butylheptyl 8- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) amino) octanoate (1.1 g, 1.10 mmol) in THF (10 mL) was added Pd / C (0.11 g, 0.13 mmol) under N2 atmosphere. The suspension was degassed and purged with H2 for 3 times. The mixture was stirred under H2 (15 Psi) at 25 ℃ for 12 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.32) showed the reaction was completed. The reaction mixture was filtered and the filter was concentrated. to give the 3-butylheptyl 8- ( (3-aminopropyl) (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) amino) octanoate (900 mg, 94.4%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.05-4.16 (m, 4H) , 3.72-3.77 (m, 1H) , 3.55-3.62 (m, 1H) , 3.38-3.48 (m, 2H) , 2.80-2.90 (m, 2H) , 2.53-2.60 (m, 2H) , 2.40-2.50 (m, 4H) , 2.26-2.34 (m, 4H) , 1.91-1.98 (m, 2H) , 1.84-1.88 (m, 2H) , 1.38-1.70 (m, 20H) , 1.19-1.35 (m, 43H) , 0.90 (t, J = 6.4 Hz, 18H) .

[0246] A mixture of 3, 4-dimethoxycyclobut-3-ene-1, 2-dione (213 mg, 1.50 mmol) and 3-butylheptyl 8- ( (3-aminopropyl) (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) amino) octanoate (0.87 g, 1.00 mmol) in THF (9 mL) was stirred at 25 ℃ for 1 hour. Then methanamine (2 M, 5.01 mL) was added, the reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 24 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.43) showed the reaction was complete. The reaction mixture was concentrated under vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～9%MeOH / CH2Cl2 gradient @15 mL / min) to give compound 07 (400 mg, 40.8%yield) as yellow oil. 1HNMR (400 MHz CDCl3) δ 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.06-4.18 (m, 5H) , 3.70 (s, 1H) , 3.56-3.63 (m, 1H) , 3.44-3.52 (m, 1H) , 3.30 (d, J = 4.8 Hz, 3H) , 2.82-2.90 (m, 1H) , 2.66-2.77 (m, 3H) , 2.26-2.37 (m, 5H) , 1.88-1.98 (m, 4H) , 1.51-1.67 (m, 14H) , 1.37-1.44 (m, 5H) , 1.21-1.35 (m, 45H) , 0.90 (t, J =6.4 Hz, 18H) .

[0247] Synthesis of Compound 08: 3-butylheptyl 8- ( (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) (4- ( (2- (methylamino) -3, 4-dioxocyclobut-1-en-1-yl) amino) butyl) amino) octanoate

[0248] Compound 08 was prepared using similar procedure as Compound 07, but using tert-butyl (4-aminobutyl) carbamate instead of tert-butyl (3-aminopropyl) carbamate. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 5.62-5.21 (m, 4H) , 4.62 (t, 1H) , 4.16-3.82 (m, 4H) , 3.72-3.41 (m, 8H) , 2.45-2.33 (m, 6H) , 2.32-2.06 (m, 8H) , 2.04-1.11 (m, 60H) , 0.91-0.82 (m, 15H) .

[0249] Synthesis of Compound 09: 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6- ( (6- ( (3-butylheptyl) oxy) -6-oxohexyl) (3- ( (2- (methylamino) -3, 4-dioxocyclobut-1-en-1-yl) amino) propyl) amino) hexanoate

[0250] Compound 09 was prepared using similar procedure as Compound 07, but using 3-butylheptyl 6-bromohexanoate instead of 3-butylheptyl 8-bromooctanoate. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.55-4.64 (m, 1H) , 4.03-4.21 (m, 4H) , 3.64-3.76 (m, 2H) , 3.55-3.64 (m, 2H) , 3.41-3.49 (m, 2H) , 3.24-3.35 (m, 3H) , 2.56-2.70 (m, 2H) , 2.51 (s, 4H) , 2.32 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 1.95 (q, J = 6.6 Hz, 2H) , 1.77-1.86 (m, 2H) , 1.49-1.67 (m, 12H) , 1.19-1.43 (m, 45H) , 0.84-0.96 (m, 18H) .

[0251] Synthesis of Compound 10: 3-propylhexyl 8- ( (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) (3- ( (2- (methylamino) -3, 4-dioxocyclobut-1-en-1-yl) amino) propyl) amino) octanoate

[0252] Compound 10 was prepared using similar procedure as Compound 07, but using 3-propylhexyl 8-bromooctanoate instead of 3-butylheptyl 8-bromooctanoate. 1H NMR (400 MHz CDCl3) 4.56-4.64 (m, 1H) , 4.05-4.19 (m, 4H) , 3.65-3.76 (m, 2H) , 3.55-3.64 (m, 2H) , 3.40-3.51 (m, 2H) , 3.25-3.34 (m, 3H) , 2.62-2.74 (m, 2H) , 2.48-2.60 (m, 3H) , 2.25-2.38 (m, 4H) , 1.92-1.98 (m, 2H) , 1.83 (s, 2H) , 1.67 (s, 12H) , 1.21-1.44 (m, 48H) , 0.86-0.94 (m, 18H) .

[0253] Synthesis of Compound 11: 3-butylheptyl 8- ( (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) (3- ( (2, 4-dioxo-1, 2, 3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl) amino) propyl) amino) octanoate

[0254] Synthesis of 3-butylheptyl 8- ( (3- ( (2, 4-dioxo-1, 2, 3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl) amino) propyl) amino) octanoate

[0255] To a solution of 5- ( (3-aminopropyl) amino) pyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (2.94 g, 4.58 mmol, TFA) in EtOH (10 mL) was added compound 3-butylheptyl 8-bromooctanoate (500 mg, 1.32 mmol) , DIEA (171 mg, 1.32 mmol, 230 μL) . Then the mixture was stirred at 90 ℃ for 24 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.11) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～12%MeOH: CH2Cl2 gradient @15 mL / min) to give 3-butylheptyl 8- ( (3- ( (2, 4-dioxo-1, 2, 3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl) amino) propyl) amino) octanoate (120 mg, 18.8%yield) as yellow oil. 1H NMR 400 MHz CDCl3 δ 11.08-11.19 (m, 1H) , 10.23 (d, J = 4.8 Hz, 1H) , 8.18-8.34 (m, 1H) , 6.35 (d, J = 5.56 Hz, 1H) , 4.02 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.84-2.95 (m, 5H) , 2.22-2.29 (m, 2H) , 1.75-1.84 (m, 2H) , 1.46-1.57 (m, 6H) , 1.32-1.39 (m, 1H) , 1.18-1.30 (m, 20H) , 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 6H) .

[0256] Synthesis of Compound 11

[0257] To a solution of 3-butylheptyl 8- ( (3- ( (2, 4-dioxo-1, 2, 3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl) amino) propyl) amino) octanoate (200 mg, 416.08 μmol) in EtOH (3 mL) was added 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (240 mg, 416 μmol) , DIEA (161 mg, 1.25 mmol, 217 μL) , then the mixture was stirred at 90 ℃ for 24 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.17) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～5%MeOH / CH2Cl2 gradient @15 mL / min) to give Compound 11 (100 mg, 22.7%yield, 92.5%purity) as yellow oil. 1H NMR 400 MHz CDCl3 δ 6.43-6.66 (m, 1H) , 4.55-4.65 (m, 1H) , 4.06-4.17 (m, 4H) , 3.55-3.65 (m, 2H) , 3.40-3.51 (m, 2H) , 3.11-3.22 (m, 2H) , 2.95-3.09 (m, 4H) , 2.24-2.39 (m, 4H) , 2.05-2.10 (m, 1H) , 1.95 (dd, J = 3.2 Hz, 6.4 Hz, 2H) , 1.62-1.73 (m, 14H) , 1.53-1.60 (m, 6H) , 1.37-1.45 (m, 6H) , 1.20-1.32 (m, 38H) , 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 18H) .

[0258] Synthesis of Compound 12: 3-butylheptyl 8- ( (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) (4- ( (2, 4-dioxo-1, 2, 3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl) amino) butyl) amino) octanoate

[0259] Synthesis of 3-butylheptyl 8- ( (4- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) butyl) amino) octanoate

[0260] To a solution of benzyl (4-aminobutyl) carbamate (3.43 g, 13.2 mmol, HCl) in EtOH (3 mL) was added 3-butylheptyl 8-bromooctanoate (1.0 g, 2.65 mmol) and DIEA (1.71 g, 13.2 mmol, 2.31 mL) . Then the mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH =10 / 1, Rf = 0.31) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～2%MeOH: CH2Cl2 @15 mL / min) to give 3-butylheptyl 8- ( (4- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) butyl) amino) octanoate (580 mg, 42.1%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.29-7.43 (m, 5H) , 5.32-5.38 (m, 1H) , 5.04-5.15 (m, 2H) , 4.08 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.21 (s, 2H) , 2.65-2.83 (m, 5H) , 2.28 (t, J = 7.6 Hz, 3H) , 1.53-1.74 (m, 10H) , 1.19-1.36 (m, 18H) , 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 6H) .

[0261] Synthesis of 3-butylheptyl 8- ( (4-aminobutyl) (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) amino) octanoate

[0262] To a solution of 3-butylheptyl 8- ( (4- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) butyl) amino) octanoate (580 mg, 1.12 mmol) in EtOH (2 mL) was added 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (645 mg, 1.12 mmol) and DIEA (22.4 mg, 5.59 mmol, 973 μL) . Then the mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.43) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with CH2Cl2 (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g  Silica Flash Column, Eluent of 0～5%MeOH: CH2Cl2 @15 mL / min) to give 3-butylheptyl 8- ( (4- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) butyl) (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) amino) octanoate (700 mg, 61.6%yield) as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.28-7.41 (m, 5H) , 5.10 (s, 2H) , 4.59 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.05-4.18 (m, 4H) , 3.56-3.64 (m, 2H) , 3.40-3.51 (m, 2H) , 3.16-3.29 (m, 2H) , 2.69-2.98 (m, 4H) , 2.27-2.36 (m, 4H) , 1.94 (dd, J = 4.0 Hz, 6.5 Hz, 2H) , 1.54-1.66 (m, 24H) , 1.21-1.35 (m, 44H) , 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 18H) .

[0263] A solution of 3-butylheptyl 8- ( (4- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) butyl) (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) amino) octanoate (700 mg, 689 μmol) in THF (10 mL) was added Pd / C (100 mg, 93.9 μmol, 10%purity) under N2 atmosphere. The suspension was degassed and purged with H2 for 3 times. The mixture was stirred under H2 (15 Psi) at 25 ℃ for 12 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.19) showed the reaction was completed. The reaction mixture was filtered and the filter was concentrated. to give the 3-butylheptyl 8- ( (4-aminobutyl) (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) amino) octanoate (500 mg, 82.3%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.59 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.05-4.17 (m, 4H) , 3.55-3.65 (m, 2H) , 3.40-3.50 (m, 2H) , 2.85 (t, J = 5.6 Hz, 2H) , 2.52-2.67 (m, 10H) , 2.26-2.37 (m, 5H) , 1.91-2.00 (m, 2H) , 1.50-1.72 (m, 17H) , 1.21-1.37 (m, 45H) , 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 18H) .

[0264] Synthesis of Compound 12

[0265] A mixture of 3-butylheptyl 8- ( (4-aminobutyl) (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) amino) octanoate (500 mg, 567 μmol) , 5-bromopyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (108 mg, 567 μmol) and DIEA (293 mg, 2.27 mmol, 395 μL) in EtOH (10 mL) was stirred at 100 ℃for 24 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.31) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with CH2Cl2 (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～10%MeOH: CH2Cl2 @15 mL / min) to give Compound 12 (100 mg, 17.78%yield) as colorless oil. 1HNMR 400 MHz CDCl3 δ 7.67 (s, 1H) , 6.34 (s, 1H) , 4.49-4.53 (m, 1H) , 3.96-4.10 (m, 4H) , 3.49-3.60 (m, 2H) , 3.31-3.43 (m, 2H) , 2.85 (t, J = 6.2 Hz, 2H) , 2.64-2.78 (m, 4H) , 2.18-2.31 (m, 4H) , 1.83 (dd, J = 3.2 Hz, 6.4 Hz, 2H) , 1.39-1.66 (m, 18H) , 1.09-1.37 (m, 49H) , 0.82 (t, J = 6.7 Hz, 18H) .

[0266] Synthesis of Compound 13 : 3-butylheptyl 11- (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) -1- (1H-imidazol-4-yl) -1-oxo-5, 8-dioxa-2, 11-diazanonadecan-19-oate

[0267] Synthesis of perfluorophenyl 1H-imidazole-4-carboxylate

[0268] To a solution of 1H-imidazole-4-carboxylic acid (1 g, 8.92 mmol) , 2, 3, 4, 5, 6-pentafluorophenol (1.64 g, 8.92 mmol) , EDCI (2.57 g, 13.4 mmol) in DMF (10 mL) was degassed and purged with N2 for 3 times, and then the mixture was stirred at 25 ℃ for 1 hour under N2 atmosphere. LCMS (EB10748-60-R1B) showed 1H-imidazole-4-carboxylic acid was consumed completely and one main peak with desired m / z mass was detected. The reaction mixture extracted with EtOAc (20 mL *2) . The combined organic layers were washed with aq.NaCl (20 mL *3) , dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The crude product was triturated with MTBE at 25 ℃ for 30 minutes to give perfluorophenyl 1H-imidazole-4-carboxylate (880 mg, 34.5%yield, 97.4%purity) was obtained as white solid. 1H NMR 400 MHz CD3OD δ 8.11-8.22 (m, 1H) , 7.89-7.98 (m, 1H) .

[0269] Synthesis of benzyl (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate

[0270] To a solution of tert-butyl (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate (10.0 g, 40.3 mmol) in CH2Cl2 (100 mL) was added TEA (8.15 g, 80.5 mmol) and CbzOSu (12.0 g, 48.3 mmol) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 12 hours. TLC (CH2Cl2 / MeOH = 10: 1, Rf = 0.5) showed the reaction was completed. The reaction mixture was diluted with CH2Cl2 (100 mL) and washed with brine (100 mL *2) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, CH2Cl2 / MeOH = 100 / 0 to 95 / 5) to give the benzyl (2, 2-dimethyl-4-oxo-3, 8, 11-trioxa-5-azatridecan-13-yl) carbamate (15.0 g, 87.9%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.24-7.45 (m, 5H) , 5.09 (s, 2H) , 3.61 (s, 4H) , 3.49-3.58 (m, 4H) , 3.32-3.34 (m, 2H) , 3.21 (t, J = 5.6 Hz, 2H) , 1.45 (s, 9H) .

[0271] A solution of benzyl (2, 2-dimethyl-4-oxo-3, 8, 11-trioxa-5-azatridecan-13-yl) carbamate (14.0 g, 36.6 mmol) in CH2Cl2 (140 mL) was added TFA (28 mL) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 1.5 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10: 1, Rf = 0.30) showed the reactant was consumed completed. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give benzyl (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate (16.8 g, crude, TFA) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.24-7.41 (m, 5H) , 5.08 (s, 2H) , 3.62-3.69 (m, 6H) , 3.55 (t, J = 5.62 Hz, 2H) , 3.31-3.33 (m, 2H) , 3.08 (t, J = 4.8 Hz, 2H) .

[0272] Synthesis of 3-butylheptyl 3-oxo-1-phenyl-2, 7, 10-trioxa-4, 13-diazahenicosan-21-oate

[0273] To a solution of compound 3-butylheptyl 8-bromooctanoate (2 g, 5.30 mmol) in EtOH (20 mL) was added DIEA (3.42 g, 26.5 mmol, 4.62 mL) and compound benzyl (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate (10.50 g, 26.5 mmol, TFA) . The mixture was stirred at 75 ℃ for 24 hours. TLC (Dichloromethane: Methanol =10: 1, product: Rf = 0.26) indicated the compound 3-butylheptyl 8-bromooctanoate was consumed complete. The mixture was then filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 12 g Silica Flash Column, Eluent of 0～5%Methanol / Dichloromethane gradient @20 mL / min) to give 3-butylheptyl 3-oxo-1-phenyl-2, 7, 10-trioxa-4, 13-diazahenicosan-21-oate (1.37 g, 44.7%yield) as yellow oil. 1H NMR 400 MHz CDCl3 δ 7.28-7.41 (m, 5H) , 5.47-5.62 (m, 1H) , 5.03-5.16 (m, 2H) , 4.02-4.14 (m, 2H) , 3.48-3.72 (m, 9H) , 3.36-3.44 (m, 2H) , 2.73-2.83 (m, 2H) , 2.53-2.65 (m, 2H) , 2.28 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.54-1.64 (m, 4H) , 1.37-1.50 (m, 3H) , 1.22-1.34 (m, 18H) , 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 6H) .

[0274] Synthesis of 3-butylheptyl 13- (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) -3-oxo-1-phenyl-2, 7, 10-trioxa-4, 13-diazahenicosan-21-oate

[0275] To a solution of 3-butylheptyl 3-oxo-1-phenyl-2, 7, 10-trioxa-4, 13-diazahenicosan-21-oate (860 mg, 1.49 mmol) in EtOH (10 mL) was added 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (858 mg, 1.49 mmol) and DIEA (288 mg, 2.23 mmol) . The mixture was stirred at 90 ℃ for 24 hours. TLC (Dichloromethane: Methanol = 10: 1, start material: Rf = 0.26; product: Rf= 0.47) indicated the 3-butylheptyl 3-oxo-1-phenyl-2, 7, 10-trioxa-4, 13-diazahenicosan-21-oate was consumed complete. The mixture was then filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 12 g Silica Flash Column, Eluent of 0～5%Methanol / Dichloromethane gradient @20 mL / min) to give 3-butylheptyl 13- (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) -3-oxo-1-phenyl-2, 7, 10-trioxa-4, 13-diazahenicosan-21-oate (1.00 g, 62.6%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR 400 MHz CDCl3 δ 7.31 (s, 5H) , 5.28-5.42 (m, 1H) , 5.05-5.16 (m, 2H) , 4.56-4.63 (m, 1H) , 4.04-4.18 (m, 4H) , 3.34-3.64 (m, 14H) , 2.58-2.69 (m, 2H) , 2.42 (s, 3H) , 2.25-2.32 (m, 4H) , 1.94 (q, J = 6.3 Hz, 2H) , 1.48-1.65 (m, 11H) , 1.41 (s, 6H) , 1.18-1.35 (m, 45H) , 0.84-0.97 (m, 18H) .

[0276] Synthesis of Compound 13

[0277] To a solution of 3-butylheptyl 13- (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) -3-oxo-1-phenyl-2, 7, 10-trioxa-4, 13-diazahenicosan-21-oate (1 g, 930 μmol) in THF (10 mL) was added Pd / C (990 mg, 929 μmol, 10%purity) under N2 atmosphere. The suspension was degassed and purged with H2 for 3 times. The mixture was stirred under H2 (15 Psi) at 25 ℃for 15 hours. TLC (Dichloromethane: Methanol = 10: 1, start material: Rf = 0.47; product: Rf =0.12) indicated the 3-butylheptyl 13- (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) -3-oxo-1-phenyl-2, 7, 10-trioxa-4, 13-diazahenicosan-21-oate was consumed complete. The reaction mixture was filtered and the filter was concentrated. Without purification 3-butylheptyl 8- ( (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethyl) (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) amino) octanoate (870 mg, crude) was obtained as yellow oil. 1H NMR 400 MHz CDCl3 δ 4.56-4.62 (m, 1H) , 4.04-4.17 (m, 4H) , 3.50-3.66 (m, 10H) , 3.40-3.48 (m, 2H) , 2.84-2.92 (m, 2H) , 2.69 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.41-2.55 (m, 4H) , 2.22-2.34 (m, 4H) , 1.79-1.99 (m, 6H) , 1.40-1.68 (m, 17H) , 1.17-1.32 (m, 4 H) , 0.83-0.96 (m, 18H) .

[0278] To a solution of 3-butylheptyl 8- ( (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethyl) (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) amino) octanoate (400 mg, 425 μmol) and perfluorophenyl 1H-imidazole-4-carboxylate (177 mg, 637 μmol) in DMF (4 mL) was added DIEA (165 mg, 1.27 mmol) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 1 hour. TLC (Dichloromethane: Methanol =10: 1, start material: Rf = 0.17; product: Rf = 0.30) indicated the 3-butylheptyl 8- ( (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethyl) (6- (3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) amino) octanoate was consumed complete. The reaction mixture extracted with EtOAc (20 mL *2) . The combined organic layers were washed with aq. NaCl (20 mL *3) , dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～3%Ethyl acetate / Petroleum ethergradient @15 mL / min) . Monitored by TLC (Dichloromethane: Methanol= 10: 1, Rf = 0.29) to Compound 13 (220 mg, 212 μmol, 50.0%yield) was obtained as colorless oil. 1H NMR 400 MHz CDCl3 δ 7.74 (d, J = 3.4 Hz, 2H) , 7.67 (s, 1H) , 7.62-7.65 (m, 1H) , 4.55-4.63 (m, 1H) , 4.04-4.20 (m, 4H) , 3.87-3.91 (m, 2H) , 3.72-3.80 (m, 2H) , 3.54-3.68 (m, 10H) , 3.40-3.49 (m, 2H) , 2.95-3.04 (m, 2H) , 2.74-2.86 (m, 4H) , 2.23-2.33 (m, 4H) , 1.90 -1.99 (m, 2H) , 1.48-1.65 (m, 14H) , 1.19-1.34 (m, 45H) , 0.83-0.96 (m, 18H) .

[0279] Synthesis of Compound 14: 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) hexanoate

[0280] Synthesis of Undecyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0281] To a solution of undecan-1-ol (30.0 g, 174 mmol, 1.0 eq) and 6-bromohexanoic acid (50.9 g, 261 mmol, 1.5 eq) in DCM (180 mL) was added DMAP (4.25 g, 34.8 mmol, 0.2 eq) and EDCI (50.1 g, 261 mmol, 1.5 eq) . The reaction was stirred at 20℃ for 3 hours. The residue was diluted with saturated sodium carbonate solution (100 mL) and extracted with EtOAc (200 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (50.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=70 / 1 to 50 / 1) . The product of et49878-110 was combined to et49878-118. undecyl 6-bromohexanoate (61.0 g, 175 mmol, 85.9%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.07 (t, J = 6.4 Hz, 2 H) , 3.41 (t, J =6.4 Hz, 2 H) , 2.32 (t, J =7.6 Hz, 2 H) , 1.86 -1.90 (m, 2 H) 1.60 -1.68 (m, 4 H) , 1.44 -1.50 (m, 2 H) , 1.29 -1.31 (m, 5 H) , 1.27 -1.31 (s, 10 H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3 H) .

[0282] Synthesis of Compound 14

[0283] To a solution of undecyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (300 mg, 910 umol, 1.0 eq) and 3, 3-bis ( (3-butylheptyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (631 mg, 1.09 mmol, 1.2 eq) in EtOH (6.00 mL) was added DIEA (235 mg, 1.82 mmol, 317 uL, 2.0 eq) . The reaction was stirred at 90 ℃ for 12 hours. The residue was diluted with water (5.00 mL) and extracted with EtOAc (10.0 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH=40 / 1 to 30 / 1) . Compound 14 (200 mg, 239 umol, 26.4%yield, 99.1%purity) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.59 (t, J = 6.0 Hz, 1 H) , 4.14 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 4.06 (t, J=6.8 Hz, 2 H) , 3.57 -3.63 (m, 4 H) , 3.41 -3.47 (m, 2 H) , 2.40 -2.68 (m, 6 H) , 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4 H) , 1.92 -1.97 (m, 2 H) , 1.50 -1.68 (m, 14 H) , 1.41 (s, 2 H) , 1.26 -1.35 (m, 45 H) , 0.87 -0.91 (m, 15 H) .

[0284] Synthesis of Compound 15: 3-ethylheptyl 8- ( (6- (3, 3-bis ( (3-ethylheptyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0285] Synthesis of 3-ethylheptan-1-ol

[0286] Step 1: Triethyl phosphonoacetate (7.8 g, 34 mmol) in THF (12.5 mL) was slowly added to 60%sodium hydride, in oil, (1.4 g, 34 mmol) in dry THF (10 mL) at 0℃. The suspension was stirred for 1 hour and then 3-heptanone (3.9 g, 34 mmol) in THF (12.5 mL) was slowly added. The solution was stirred for an hour and quenched with water. The solution was extracted with diethyl ether, and the organic layer was dried and concentrated. The crude was purified by flash chromatography eluting with hexanes / diethyl ether (99: 1) to give alkene (1.1 g, 5.8 mmol) as a yellowish liquid in 17%yield.

[0287] Step 2: The alkene (1.0 g, 5.4 mmol, 1.0 eq) was hydrogenated in ethyl acetate with a 10% (w / w) of Pd / C for 3 hours using a balloon filled with hydrogen gas. The solution was filtered through celite and concentrated to give the alkane (940 mg, 5.0 mmol. ) as a clear liquid in 93%yield.

[0288] Step 3: The ester (900 mg, 4.8 mmol, 1 eq) in diethyl ether was added slowly to lithium aluminum hydride (182 mg, 4.8 mol, 1.1 eq) suspended in diethyl ether at 0℃. The suspension was stirred at room temperature for 2-3 hours and then cooled to 0℃. Water (0.2 mL) was added, followed by 15%sodium hydroxide (0.2 mL) and water (0.6 mL) . The solution was stirred for a few minutes at room temperature, filtered through a celite pad, washed with diethyl ether, dried, and concentrated to give the alcohol. Flash chromatography was used to purify the product giving a clear liquid (602 mg, 4.2 mmol) in 87%yield. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 3.68 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.53-1.55 (m, 2H) , 1.19-1.34 (m, 9H) , 0.85-0.92 (m, 6H) .

[0289] Synthesis of 3-ethylheptyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0290] 3-ethylheptyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate was prepared using similar methods to those employed for the synthesis of Undecyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate, but using 3-ethylheptan-1-ol. 3-ethylheptyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate was obtained as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 5.88-6.43 (m, 2H) , 4.08 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.97-3.99 (m, 2H) , 3.12-3.14 (m, 2H) , 2.96-2.99 (m, 2H) , 2.29 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.82-1.89 (m, 2H) , 1.55-1.63 (m, 4H) , 1.25-1.35 (m, 16H) , 0.84-0.92 (m, 6H) .

[0291] Synthesis of Compound 15

[0292] To a solution of 3, 3-bis ( (3-ethylheptyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (649 mg, 1.24 mmol, 1.0 eq) and 3-ethylheptyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate (410 mg, 1.24 mmol, 1.0 eq) in EtOH (5 mL) was added DIEA (322 mg, 2.49 mmol, 433 μL, 2.0 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 24 hours. The reaction mixture was poured into water (10 mL) and extracted with EtOAc (10 mL, 5 mL, 5 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to EtOAc / MeOH = 5 / 1) to give Compound 15 (290 mg, 376 μmol, 30.2%yield, 100%purity) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.15 (t, J =6.4 Hz, 2H) , 4.09 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.57-3.63 (m, 2H) , 3.54 (t, J = 5.6 Hz, 2H) , 3.42-3.48 (m, 2H) , 2.58 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.43-2.48 (m, 4H) , 2.27-2.32 (m, 4H) , 1.93-1.97 (m, 2H) , 1.51-1.68 (m, 11H) , 1.26-1.48 (m, 41H) , 0.85-0.91 (m, 18H) .

[0293] Synthesis of Compound 16: 3, 3-bis (octyloxy) propyl 6- ( (5- (dodecyloxy) -5-oxopentyl) (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0294] Synthesis of 3, 3-bis (octyloxy) propan-1-ol

[0295] To a solution of 3, 3-diethoxypropanenitrile (10 g, 69.8 mmol, 10.5 mL, 1.0 eq) and octan-1-ol (27.3 g, 210 mmol, 33.1 mL, 3.0 eq) in Tol. (70 mL) was added PPTS (878 mg, 3.49 mmol, 0.05 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 120℃ for 12 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 1 / 0 to 60 / 1) to give 3, 3-bis (octyloxy) propanenitrile (15.8 g, 50.7 mmol, 72.6%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.78 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 3.61-3.64 (m, 2H) , 3.49-3.53 (m, 2H) , 2.66 (d, J = 5.6 Hz, 2H) , 1.56-1.64 (m, 4H) , 1.28-1.38 (m, 21H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 6H) .

[0296] To a solution of 3, 3-bis (octyloxy) propanenitrile (10.8 g, 34.7 mmol, 1.0 eq) in EtOH (30 mL) was added KOH (3 M, 34.7 mL, 3.0 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 110℃for 12 hours. The pH value of the reaction was adjusted to around 4-5 with aq. HCl (1 M) at 0℃. The mixture was extracted with Petroleum ether (50 mL *4) and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 100 / 1 to 0 / 1) to give 3, 3-bis (octyloxy) propanoic acid (9.5 g, crude) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 12.2 (brs, 1H) , 4.79-4.82 (m, 1H) , 4.31 (t, J = 4.8 Hz, 1H) , 3.32-3.42 (m, 4H) , 2.51 (d, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.29-1.41 (m, 4H) , 1.25-1.28 (m, 21H) , 1.09 (t, J = 6.0 Hz, 2H) , 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 6H) .

[0297] To a solution of 3, 3-bis (octyloxy) propanoic acid (8 g, 19.4 mmol, 80%purity, 1.0 eq) in THF (55 mL) at 0℃, then LiAlH4 (882 mg, 23.2 mmol, 1.2 eq) was added the mixture and stirred at 25℃ for 3 hours. Water (0.1 mL) , 15%aq. NaOH (0.1 mL) and water (0.3 mL) was dropwise the reaction solution at 0℃, then Na2SO4 added the mixture and stirred at 25℃ for 15 minutes. The mixture was filtered and the filter cake concentrated under reduced pressure to give 3, 3-bis (octyloxy) propan-1-ol (5.1 g, 16.1 mmol, 83.2%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.66 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 3.73-3.76 (m, 2H) , 3.62-3.64 (m, 2H) , 3.44-3.46 (m, 2H) , 2.58 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 1.87-1.91 (m, 2H) , 1.56-1.60 (m, 5H) , 1.22-1.34 (m, 21H) , 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 6H) .

[0298] Synthesis of 3, 3-bis (octyloxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0299] To a solution of 3, 3-bis (octyloxy) propan-1-ol (5.5 g, 17.4 mmol, 2.14 mL, 1.0 eq) in DCM (40 mL) was added 6-bromohexanoic acid (3.39 g, 17.4 mmol, 1.0 eq) , EDCI (5.00 g, 26.1 mmol, 1.5 eq) and DMAP (425 mg, 3.48 mmol, 0.2 eq) at 0℃, then the mixture was stirred at 25℃ for 1.5 hours. The reaction mixture was poured into water (50 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 20 mL) , The combined organic layers were washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=100 / 1 to 0 / 1) to give 3, 3-bis (octyloxy) propyl 6-bromohexanoate (2.5 g, 5.08 mmol, 30%yield) as a colorless oil.

[0300] To a solution of 3, 3-bis (octyloxy) propyl 6-bromohexanoate (2 g, 4.05 mmol, 1.0 eq) and 2-aminoethanol (2.48 g, 40.5 mmol, 2.45 mL, 10 eq) in EtOH (10 mL) was added at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 0.5 hour. The reaction mixture was poured into water (10 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 20 / 1 to Ethyl acetate  / MeOH = 10 / 1) to give 3, 3-bis (octyloxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (1.2 g, 2.53 mmol, 62.5%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.59 (t, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.14 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 3.72 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 3.55-3.61 (m, 2H) , 3.40-3.45 (m, 2H) , 2.86 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.71-2.74 (m, 6H) , 2.32 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.95 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 1.53-1.69 (m, 9H) , 1.28-1.43 (m, 24H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 6H) .

[0301] Synthesis of dodecyl 5-bromopentanoate

[0302] To a solution of 5-bromopentanoic acid (10.0 g, 55.2 mmol, 1.0 eq) in DCM (70.0 mL) was added dodecan-1-ol (15.4 g, 82.9 mmol, 1.5 eq) , DMAP (1.35 g, 11.0 mmol, 0.2 eq) and EDCI (15.9 g, 82.9 mmol, 1.5 eq) at 0 ℃. The mixture was stirred at 25 ℃ for 12 hours. The reaction was added water (50.0 mL) and the reaction was extracted with EtOAc (80.0 mL, 50.0 mL) . The organic phase was separated, washed with brine 20 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=1 / 0 to 0 / 1) . Dodecyl 5-bromopentanoate (16.2 g, 46.4 mmol, 84.0%yield) was obtained as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ4.07 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 3.41 (t, J = 6.4 Hz, 2 H) , 3.34 (t, J = 7.6 Hz, 2 H) , 1.89 -1.92 (m, 2 H) , 1.78 -1.80 (m, 2 H) , 1.60 -1.62 (m, 2 H) , 1.24 -1.31 (m, 19 H) , 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3 H) .

[0303] Synthesis of Compound 16

[0304] To a solution of 3, 3-bis (octyloxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (1.2 g, 2.53 mmol, 1.0 eq) and dodecyl 5-bromopentanoate (885 mg, 2.53 mmol, 12.3 uL, 1.0 eq) in EtOH (15 mL) was added DIEA (655 mg, 5.07 mmol, 882 uL, 2.0 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 12 hours. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to Ethyl acetate  / MeOH = 5 / 1) to give compound 16 (595 mg, 801 umol, 31.6%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.14 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 3.52-3.61 (m, 4H) , 3.41-3.45 (m, 2H) , 2.57 (t, J = 5.6 Hz, 2H) , 2.43-2.49 (m, 4H) , 2.28-2.34 (m, 4H) , 1.93-1.97 (m, 2H) , 1.42-1.67 (m, 20H) , 1.26-1.33 (m, 42H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 9H) .

[0305] Synthesis of Compound 17: 2- ( (6- (3, 3-bis (heptyloxy) propoxy) -6-oxohexyl) (2- (dimethylamino) ethyl) amino) ethyl (9Z, 12Z) -octadeca-9, 12-dienoate

[0306] Synthesis of 3, 3-bis (heptyloxy) propyl 6- ( (2- (dimethylamino) ethyl) amino) hexanoate

[0307] To a solution of 3, 3-bis (heptyloxy) propyl 6-bromohexanoate (1.0 g, 2.15 mmol, 1.0 eq) in EtOH (15.0 mL) was added N1, N1-dimethylethane-1, 2-diamine (1.89 g, 21.5 mmol, 2.35 mL, 10 eq) . The mixture was stirred at 90 ℃ for 20 minutes. The residue was diluted with water (50.0 mL) and extracted with EtOAc (30.0 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (20.0 mL*3) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH=5 / 1 to 0 / 1) . 3, 3-bis (heptyloxy) propyl 6- ( (2- (dimethylamino) ethyl) amino) hexanoate (1.50 g, crude) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.59 (t, J = 6.0 Hz, 1 H) , 4.14 (t, J = 6.4 Hz, 2 H) , 3.55 -3.59 (m, 2 H) , 3.39 -3.45 (m, 2 H) , 2.63 -2.73 (m, 4 H) , 2.45 (t, J = 5.2 Hz, 2 H) , 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.24 (s, 6 H) , 1.92 -1.99 (m, 2 H) , 1.51 -1.68 (m, 8 H) , 1.28 -1.40 (m, 18 H) , 0.87 -0.90 (m, 6 H) .

[0308] Synthesis of 3, 3-bis (heptyloxy) propyl 6- ( (2- (dimethylamino) ethyl) (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0309] To a solution of 3, 3-bis (heptyloxy) propyl 6- ( (2- (dimethylamino) ethyl) amino) hexanoate (650 mg, 1.37 mmol, 1.0 eq) in DCM (3.90 mL) was added (CH3COO) 3BHNa (288 mg, 1.65 mmol, 314 uL, 1.2 eq) . The reaction was stirred at 20 ℃for 20 minutes. Then (CH3COO) 3BHNa (583 mg, 2.75 mmol, 2.0 eq) was added at 0 ℃. The mixture was stirred at 0-20 ℃ for 12 hours. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (30.0 mL *3) . The combined organic layers were adjusted pH 7～8 by saturated sodium carbonate and washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The crude product was used into the next step without further purification. Compound L7-527-8-1 (1.40 g, crude) was obtained as yellow oil.

[0310] To a solution of compound L7-527-8-1 (1.40 g, 2.22 mmol, 1.0 eq) in THF (1.00 mL) was added TBAF (1 M, 13.3 mL, 6.0 eq) . The mixture was stirred at 15 ℃ for 12 hours. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (50.0 mL *4) . The combined organic layers were washed with brine (10 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH=5 / 1 to 0 / 1) . 3, 3-bis (heptyloxy) propyl 6- ( (2- (dimethylamino) ethyl) (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (720 mg, 1.39 mmol, 62.8%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 1 H) , 4.07 -4.14 (m, 3 H) , 3.58 -3.64 (m, 4 H) , 3.42 -3.74 (m, 2 H) , 3.03 -3.06 (m, 2 H) , 2.83 -2.86 (m, 2 H) , 2.64 -2.75 (m, 9 H) , 2.35 (t, J = 7.2 Hz, 2 H) , 1.87 -1.94 (m, 2 H) , 1.50 -1.69 (m, 9 H) , 1.22 -1.37 (m, 20 H) , 0.89 -0.92 (m, 6 H) .

[0311] Synthesis of Compound 17

[0312] To a solution of 3, 3-bis (heptyloxy) propyl 6- ( (2- (dimethylamino) ethyl) (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (300 mg, 580 umol, 1.0 eq) in DCM (3.00 mL) was added EDCI (167 mg, 871 umol, 1.5 eq) and DMAP (14.2 mg, 116 umol, 0.2 eq) at 0 ℃. Then linoleic acid (195 mg, 697 umol, 195 uL, 1.2 eq) was added. The mixture was stirred at 0-20 ℃ for 12 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to remove solvent. The residue was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH=1 / 0 to 80 / 1) . Compound 17 (400 mg, 513 umol, 88.4%yield) was obtained as brown oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 5.33 -5.39 (m, 4 H) 4.59 (t, J = 6.0 Hz, 1 H) 4.12 -4.16 (m, 4 H) 3.55 -3.61 (m, 2 H) 3.35 -3.49 (m, 2 H) 2.72 -2.84 (m, 6 H) 2.45 -2.55 (m, 4 H) 2.27 -2.31 (m, 4 H) 2.03 -2.08 (m, 4 H) 1.92 -1.97 (m, 2 H) 1.53 -1.67 (m, 8 H) 1.43 -1.50 (m, 2 H) 1.29 -1.40 (m, 32 H) 0.87 -0.91 (m, 9 H) .

[0313] Synthesis of Compound 18: 3, 3-bis ( (7-methyloctyl) oxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) hexanoate

[0314] Synthesis of 7-methyloctan-1-ol

[0315] Step 1: To a solution of 2- (prop-2-yn-1-yloxy) tetrahydro-2H-pyran (20.2 g, 144 mmol, 20.3 mL, 1.0 eq) in THF (170 mL) was added HMPA (38.8 g, 216 mmol, 38.0 mL, 1.5 eq) at 25℃, then n-BuLi (2.5 M, 86.5 mL, 1.5 eq) was added the mixture at -65℃. 1 hour later, 1-bromo-4-methyl-pentane (25 g, 151 mmol, 21.4 mL, 1.05 eq) was added in the reaction and warmed to 25℃ stirred for 12 hours. The reaction mixture was poured into water (100 mL) and extracted with EtOAc (100 mL, 50 mL, 50 mL) , The combined organic layers were washed with brine (50 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give 2- ( (7-methyloct-2-yn-1-yl) oxy) tetrahydro-2H-pyran (11 g, 49.0 mmol, 33.9%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.82 (t, J = 3.2 Hz, 1H) , 4.19-4.32 (m, 2H) , 3.83-3.88 (m, 1H) , 3.52-3.55 (m, 1H) , 2.20-2.22 (m, 2H) , 1.71-1.88 (m, 2H) , 1.48-1.66 (m, 7H) , 1.23-1.29 (m, 2H) , 0.88 (d, J = 6.8 Hz, 6H) .

[0316] Step 2: To a solution of 2- ( (7-methyloct-2-yn-1-yl) oxy) tetrahydro-2H-pyran (9 g, 40.1 mmol, 1.0 eq) in EtOH (60 mL) was added Pd / C (0.9 g, 10%purity) at 25℃, then the mixture was stirred at 25℃ for 12 hours under H2 (15 psi) . The mixture was filtered and concentrated under reduced pressure to give 2- ( (7-methyloctyl) oxy) tetrahydro-2H-pyran (9 g, crude) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.57 (d, J = 4.0 Hz, 1H) , 3.86-3.90 (m, 1H) , 3.71-3.77 (m, 1H) , 3.48-3.52 (m, 1H) , 1.80-1.87 (m, 1H) , 1.70-1.75 (m, 1H) , 1.49-1.64 (m, 7H) , 1.27-1.36 (m, 6H) , 1.16-1.17 (m, 2H) , 0.86 (d, J = 6.4 Hz, 6H) .

[0317] Step 3: To a solution of 2- ( (7-methyloctyl) oxy) tetrahydro-2H-pyran (11.7 g, 51.2 mmol, 1.0 eq) in MeOH (80 mL) was added CAS (2.56 g, 10.2 mmol, 0.2 eq) at 0℃, then the mixture was stirred at 25℃ for 3 hours. The mixture was filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 1 / 0 to 5 / 1) to give 7-methyloctan-1-ol (5.9 g, 40.9 mmol, 79.8%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 3.65 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 1.49-1.61 (m, 3H) , 1.28-1.38 (m, 7H) , 1.16-1.19 (m, 2H) , 0.87 (d, J = 6.8 Hz, 6H) .

[0318] Synthesis of 3, 3-bis ( (7-methyloctyl) oxy) propan-1-ol

[0319] To a solution of 2- ( (7-methyloctyl) oxy) tetrahydro-2H-pyran (5.9 g, 40.9 mmol, 1.21 mL, 3.0 eq) in ethyl 3, 3-diethoxypropanoate (2.59 g, 13.6 mmol, 2.65 mL, 1.0 eq) was added KHSO4 (92.8 mg, 682 umol, 40.0 uL, 0.05 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 80℃ for 12 hours. The reaction mixture was poured into water (10 mL) and extracted with EtOAc (10 mL, 5 mL, 3 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 1 / 0 to 5 / 1) to give ethyl 3, 3-bis ( (7-methyloctyl) oxy) propanoate (3 g, 7.76 mmol, 56.9%yield) as a colorless oil.

[0320] To a solution of ethyl 3, 3-bis ( (7-methyloctyl) oxy) propanoate (3 g, 7.76 mmol, 1.0 eq) in EtOH (10 mL) , THF (10 mL) and H2O (10 mL) was added LiOH (186 mg, 7.76 mmol, 86.2 uL, 1.0 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 25℃ for 3 hours. The pH value of the reaction was adjusted to around 2-3 with HCl liquor (1 M) at 0 ℃. The mixture was extracted with EtOAc (5 mL *3) and concentrated under reduced pressure to give 3, 3-bis ( (7-methyloctyl) oxy) propanoic acid (1.2 g, 3.35 mmol, 43.1%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.62 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.14-4.17 (m, 2H) , 3.56-3.61 (m, 2H) , 3.40-3.45 (m, 4H) , 2.32 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.85-1.97 (m, 5H) , 1.45-1.70 (m, 12H) , 1.25-1.36 (m, 23H) , 0.89 (t, J = 6.4 Hz, 6H) .

[0321] To a solution of 3, 3-bis ( (7-methyloctyl) oxy) propanoic acid (1.2 g, 2.68 mmol, 80%purity, 1.0 eq) in THF (12 mL) at 0℃, then LiAlH4 (122 mg, 3.21 mmol, 1.2 eq) was added the mixture and stirred at 25℃ for 3 hours. The reaction was cooled to 0℃, water (0.1 mL) was dropped in the reaction solution under N2 and created a lot of bubbles, then 15%aq. NaOH (0.1 mL) was added dropwise slowly at 0℃; after 5 minutes, water (0.3 mL) was dropped to the reaction solution at 0℃, then Na2SO4 was added to the mixture and warmed to 25 ℃ and stirred 15 minutes. The mixture was filtered and the filter cake was concentrated under reduced pressure to give 3, 3-bis ( (7-methyloctyl) oxy) propan-1-ol (1.2 g, crude) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.66 (t, J = 5.2 Hz, 1H) , 3.74-3.76 (m, 2H) , 3.61-3.67 (m, 3H) , 3.43-3.48 (m, 1H) , 2.55 (brs, 1H) , 1.85-1.92 (m, 1H) , 1.47-1.62 (m, 6H) , 1.16-1.36 (m, 17H) , 0.89 (d, J = 6.4 Hz, 12H) .

[0322] Synthesis of 3, 3-bis ( (7-methyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate

[0323] To a solution of 3, 3-bis ( (7-methyloctyl) oxy) propan-1-ol (4.4 g, 12.8 mmol, 2.14 mL, 1.0 eq) in DCM (25 mL) was added 6-bromohexanoic acid (3.74 g, 19.2 mmol, 1.5 eq) , EDCI (3.67 g, 19.2 mmol, 1.5 eq) and DMAP (312 mg, 2.55 mmol, 0.2 eq) at 0℃, then the mixture was stirred at 25℃ for 1.5 hours. The reaction mixture was poured into water (50 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 20 mL) . The combined organic layers were washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 100 / 1 to 0 / 1) to give 3, 3-bis ( (7-methyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (1.3 g, 2.49 mmol, 19.5%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.60 (t, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.14-4.17 (m, 2H) , 3.56-3.61 (m, 2H) , 3.40-3.45 (m, 4H) , 2.32 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.85-1.98 (m, 4H) , 1.48-1.68 (m, 11H) , 1.25-1.36 (m, 13H) , 1.14-1.17 (m, 4H) , 0.87 (d, J = 6.8 Hz, 12H) .

[0324] Synthesis of Compound 18

[0325] To a solution of 3, 3-bis ( (7-methyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (580 mg, 1.11 mmol, 1.0 eq) and undecyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (366 mg, 1.11 mmol, 1.0 eq) in EtOH (10 mL) was added DIEA (287 mg, 2.22 mmol, 387 uL, 2.0 eq) at 25 ℃, then the mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hours. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) . The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to EtOAc / MeOH = 5 / 1) to give compound 18 (350 mg, 454 umol, 40.8%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.15 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 3.53-3.61 (m, 4H) , 3.40-3.45 (m, 2H) , 2.58 (brs, 2H) , 2.46 (t, J =6.8 Hz, 4H) , 2.31 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 1.93-1.97 (m, 2H) , 1.47-1.67 (m, 18H) , 1.27-1.35 (m, 34H) , 1.13-1.18 (m, 4H) , 0.86-0.90 (m, 15H) .

[0326] Synthesis of Compound 19: 3, 3-bis ( (8-methylnonyl) oxy) propyl 6- ( (5- (dodecyloxy) -5-oxopentyl) (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0327] Synthesis of 8-methylnonan-1-ol.

[0328] A 500 mL three-necked round bottom flask equipped with a magnetic stirrer, addition funnel and thermometer. A mixture of Mg (10.1 g, 414 mmol, 5.0 eq) and I2 (420 mg, 1.66 mmol, 334 uL, 0.02 eq) in THF (60.0 mL) was added dropwise the solution of 1-bromo-2-methylpropane (56.7 g, 414 mmol, 45.0 mL, 5.0 eq) in THF (60.0 mL) at 30 ℃ and the reaction mixture was stirred at 30 ℃ for 30 minutes. The mixture was added to 6-bromohexan-1-ol (15.0 g, 82.8 mmol, 10.9 mL, 1.0 eq) and CuCl2LiCl2 (0.1 M, 49.7 mL, 0.06 eq) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 12 hours under N2 atmosphere. The mixture was added to the HCl (0.1 M, aq.250 mL) . The residue was diluted with H2O (160 mL) and extracted with EtOAc (300 mL, 200 mL) . The combined organic layers were washed with brine (50.0 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether: Ethyl acetate=50 / 1 to 30 / 1) . 8-methylnonan-1-ol (13.0 g, 82.1 mmol, 99.2%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.64 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 1.50 -1.59 (m, 3 H) , 1.27 -1.36 (m, 8 H) , 1.15 -1.18 (m, 2 H) , 0.87 (d, J = 6.8 Hz, 6 H) .

[0329] Synthesis of Compound 19.

[0330] Compound 19 was prepared analogously to compound 18 starting from 8-methylnonan-1-ol. Compound 19 was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.52 (t, J = 6.0 Hz, 1 H) , 4.07 (t, J = 6.4 Hz, 2 H) , 3.98 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 3.44 -3.53 (m, 4 H) , 3.31 -3.37 (m, 2 H) , 2.50 (t, J=5.2 Hz, 2 H) , 2.35 -2.41 (m, 4 H) , 2.20 -2.26 (m, 4 H) , 1.85 -1.89 (m, 2 H) , 1.34 -1.59 (m, 20 H) , 1.14 -1.24 (m, 38 H) , 1.05 -1.13 (m, 5 H) , 0.78 -0.82 (m, 15 H) .

[0331] Synthesis of Compound 20: 3, 3-bis ( (7-methyloctyl) oxy) propyl 6- ( (3- ( (2- (methylamino) -3, 4-dioxocyclobut-1-en-1-yl) amino) propyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) hexanoate

[0332] Synthesis of compound 20-2

[0333] A thumb bottle with magnetic stirrer, addition funnel and thermometer. To a solution of 3, 3-bis ( (7-methyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (2.00 g, 3.83 mmol, 1.0 eq) and benzyl (3-aminopropyl) carbamate (3.99 g, 19.2 mmol, 5.0 eq) in EtOH (14.0 mL) was stirred at 50 ℃ for 12 hours. The residue was diluted with water (10.0 mL) and extracted with EtOAc (50.0 mL, 25.0 mL) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, EtOAc: MeOH=1 / 0 to 60 / 1) . Compound 20-1 (1.00 g, 1.54 mmol, 40.2%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.42 (s, 1 H) , 7.28 -7.39 (m, 6 H) , 5.46 (s, 1 H) , 5.04 -5.10 (m, 2 H) , 4.58 (t, J = 5.6 Hz, 1 H) , 4.13 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 3.54 -3.57 (m, 2 H) , 3.22 -3.47 (m, 5 H) , 2.87 -2.95 (m, 2 H) , 2.79 -2.87 (m, 2 H) , 2.28 (t, J = 7.2 Hz, 2 H) , 1.89 -2.14 (m, 7 H) , 1.43 -1.67 (m, 11 H) , 1.24 -1.41 (m, 15 H) , 1.11 -1.21 (m, 4 H) , 0.87 (d, J = 6.8 Hz, 12 H) .

[0334] A seal tube equipped with magnetic stirrer, addition funnel and thermometer. To a solution of compound 20-1 (400 mg, 616 umol, 1.0 eq) in EtOH (4.00 mL) was added DIEA (119 mg, 924 umol, 161 uL, 1.5 eq) and undecyl 6-bromohexanoate (323 mg, 924 umol, 1.5 eq) . The mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hours. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (50.0 mL, 25.0 mL) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH=100 / 1 to 60 / 1) . Compound 20-2 (500 mg, 545 umol, 88.4%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.29 -7.42 (m, 5 H) , 5.10 (s, 2 H) , 4.59 (t, J = 5.6 Hz, 1 H) , 4.14 (t, J = 6.4 Hz, 2 H) , 4.05 (t, J = 6.75 Hz, 2 H) , 3.55 -3.60 (m, 2 H) , 3.39 -3.44 (m, 2 H) , 3.26 -3.28 (m, 2 H) , 2.25 -2.56 (m, 10 H) , 1.92 -1.97 (m, 2 H) , 1.45 -1.63 (m, 24 H) , 1.22 -1.39 (m, 35 H) , 1.15 -1.16 (m, 3 H) , 0.83 -0.92 (m, 15 H) .

[0335] Synthesis of Compound 20

[0336] A 100 mL three-necked round bottom flask equipped with magnetic stirrer, addition funnel and thermometer. To a solution of compound 20-2 (500 mg, 545 umol, 1.0 eq) in EtOH (5.00 mL) was added Pd / C (50.0 mg, 10%purity) under N2. The suspension was degassed under vacuum and purged with H2 several times. The mixture was stirred under H2 15 Psi at 20 ℃ for 72 hours. The reaction mixture was filtered and the filter cake was washed by EtOH (30.0 mL) . The residue was concentrated in reduced pressure. Without purification. Compound 20-3 (410 mg, 523 umol, 96.0%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.59 (t, J = 6.0 Hz, 2 H) , 4.14 (t, J = 7.6 Hz, 2 H) , 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 3.51 -3.65 (m, 2 H) , 3.41 -3.45 (m, 2 H) , 2.71 -2.74 (m, 2 H) , 2.28 -2.46 (m, 9 H) , 1.91 -1.99 (m, 2 H) , 1.49 -1.70 (m, 14 H) , 1.40 -1.47 (m, 3 H) , 1.25 -1.37 (m, 28 H) , 1.09 -1.23 (m, 4 H) , 0.84 -0.90 (m, 12 H) .

[0337] Compound 20-3 (410 mg, 523 umol, 1.0 eq) and 3, 4-dimethoxycyclobut-3-ene-1, 2-dione (112 mg, 785 umol, 1.5 eq) were taken up into a microwave tube in THF (4.10 mL) at 25 ℃. The mixture was stirred at 25 ℃ for 1 hour. Then methylamine (2 M, 2.62 mL, 10 eq) was added at 25 ℃. The reaction stirred at 25 ℃ for 20 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to remove solvent. The residue was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH=60 / 1 to 50 / 1) and then product was purified by prep-TLC (SiO2, DCM: MeOH = 8: 1) . Compound 20 (L7-528-4S) (130 mg, 146 umol, 27.83%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.56 -4.63 (m, 1 H) , 4.13 (t, J = 6.4 Hz, 2 H) , 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 3.57 -3.68 (m, 4 H) , 3.41 -3.49 (m, 2 H) , 3.25 (s, 3 H) , 2.68 -2.75 (m 2 H) , 2.67 -2.68 (m, 4 H) , 2.32 -2.36 (m, 4 H) , 1.84 -1.94 (m, 4 H) , 1.46 -1.71 (m, 17 H) , 1.23 -1.44 (m, 34 H) , 1.13 -1.23 (m, 4 H) , 0.82 -0.95 (m, 15 H) .

[0338] Synthesis of Compound 21: 3, 3-bis (octyloxy) propyl 6- ( (3- ( (2- (methylamino) -3, 4-dioxocyclobut-1-en-1-yl) amino) propyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) hexanoate

[0339] Compound 21 was prepared analogously to compound 20 but using octan-1-ol instead of 7-methyloctan-1-ol. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.51 -4.64 (m, 2 H) , 4.13 (t, J = 6.4 Hz, 2 H) , 4.07 (t, J = 6.4 Hz, 2 H) , 3.55 -3.70 (m, 4 H) , 3.41 -3.45 (m, 2 H) , 3.15 -3.28 (s, 3 H) , 2.68 -3.00 (m, 6 H) , 2.29 -2.40 (m, 4 H) , 1.81 -1.96 (m, 4 H) , 1.46 -1.71 (m, 15 H) , 1.23 -1.44 (m, 40 H) , 0.79 -0.95 (m, 9 H) .

[0340] Synthesis of Compound 22: bis (3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (2-hydroxyethyl) azanediyl) dihexanoate

[0341] Synthesis of 5-methylhexan-1-ol

[0342] A mixture of Mg (26.2 g, 1.08 mol, 5 eq) and I2 (1.10 g, 4.3 mmol, 869 uL, 0.02 eq) in THF (120 mL) was added the solution of 1-bromo-2-methylpropane (147 g, 1.08 mol, 117 mL, 5 eq) in THF (120 mL) at 30 ℃ and the reaction mixture was stirred at 25 ℃ for 2 hours. The mixture was added to 3-bromopropan-1-ol (30 g, 215.84 mmol, 19.4 mL, 1 eq) in THF (120 mL) and dilithium; tetrachlorocopper (2-) (0.1 M, 129.50 mL, 0.06 eq) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 12 hours under N2 atmosphere. The mixture was added to the HCl (0.1 M, aq. 500 mL) . The residue was diluted with H2O 300 mL and extracted with EtOAc (1L and 500 mL) . The combined organic layers were washed with brine 300 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=100 / 1 to 10 / 1) . 5-methylhexan-1-ol (16 g, 137 mmol, 63.7%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 3.66 (t, J =6.6 Hz, 2H) , 1.48 -1.66 (m, 3H) , 1.29 -1.43 (m, 2H) , 1.17 -1.25 (m, 2H) , 0.89 (d, J = 6.6 Hz, 6H)

[0343] Synthesis of ethyl 3, 3-diethoxypropanoate

[0344] To a solution of ethyl 3, 3-diethoxypropanoate (5 g, 26.28 mmol, 5.11 mL, 1 eq) in 5-methylhexan-1-ol (12.2 g, 105.1 mmol, 4 eq) was added KHSO4 (178 mg, 1.31 mmol, 77.1 uL, 0.05 eq) . The mixture was stirred at 75 ℃ for 12 hours. The mixture was evaporated to dryness. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=100 / 1 to 10 / 1) . Ethyl 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propanoate (5.8 g, crude) was obtained as colorless oil.

[0345] To a solution of ethyl 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propanoate (5 g, 15.13 mmol, 1 eq) in EtOH (10 mL) , H2O (10 mL) and THF (10 mL) was added NaOH (1.21 g, 30.2 mmol, 2 eq) . The mixture was stirred at 20 ℃ for 12 hours. The pH value of the reaction was acidified with aq. HCl (0.1 M) to 4～5 at 20℃. The mixture was extracted with EtOAc 50 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=100 / 1 to 50 / 1) . 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propanoic acid (3 g, 9.92 mmol, 65.5%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.92 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 3.58 -3.72 (m, 2H) , 3.45 -3.56 (m, 2H) , 2.73 (d, J = 5.5 Hz, 2H) , 1.48 -1.63 (m, 6H) , 1.34 (td, J = 7.5, 15.4 Hz, 4H) , 1.13 -1.24 (m, 4H) , 0.88 (d, J = 6.5 Hz, 12H) .

[0346] To a solution of 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propanoic acid (3 g, 9.92 mmol, 1 eq) in THF (9 mL) was added LAH (376.47 mg, 9.92 mmol, 1 eq) in THF (9 mL) at 0 ℃. The mixture was stirred at 20 ℃ for 12 hours. The mixture was added H2O (0.3mL) , NaOH (aq. 15%, 0.3 mL) and H2O (0.9 mL) at 0℃ and stirred for 0.5 hour. The mixture was filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. Without purification. 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propan-1-ol (1.3 g, 4.51 mmol, 45.4%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.67 (t, J = 5.4 Hz, 1H) , 3.75 (br t, J = 5.1 Hz, 2H) , 3.64 (td, J = 6.7, 9.4 Hz, 2H) , 3.46 (td, J = 6.7, 9.1 Hz, 2H) , 2.58 (br s, 1H) , 1.90 (q, J = 5.4 Hz, 2H) , 1.47 -1.65 (m, 6H) , 1.27 -1.43 (m, 4H) , 1.14 -1.26 (m, 4H) , 0.83 -0.95 (m, 12H) .

[0347] Synthesis of 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate

[0348] To a solution of 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propan-1-ol (1.3 g, 4.51 mmol, 1 eq) and 6-bromohexanoic acid (1.05 g, 5.41 mmol, 1.2 eq) in DCM (6 mL) was added EDCI (950.32 mg, 4.96 mmol, 1.1 eq) and DMAP (110.11 mg, 901.32 umol, 0.2 eq) . The mixture was stirred at 20 ℃ for 12 hours. The mixture was evaporated to dryness. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=100 / 1 to 10 / 1) . 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (1.7 g, 3.65 mmol, 81.0%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.61 (t, J = 5.7 Hz, 1H) , 4.16 (t, J = 6.5 Hz, 2H) , 3.55 -3.64 (m, 2H) , 3.36 -3.49 (m, 4H) , 2.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 1.80 –2.02 (m, 4H) , 1.66 (quin, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.43 -1.60 (m, 8H) , 1.26 -1.42 (m, 4H) , 1.13 -1.24 (m, 4H) , 0.88 (d, J = 6.6 Hz, 12H) .

[0349] Synthesis of 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0350] To a solution of 2-aminoethan-1-ol (50 mg, 818 umol, 49.5 uL, 1 eq) and 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (419.15 mg, 900.4 umol, 1.1 eq) in EtOH (2 mL) . The mixture was stirred at 80 ℃ for 12 hours. The reaction mixture was partitioned between EtOAc 100 mL and H2O 50 mL. The organic phase was separated, washed with NaHCO3 (aq) 100 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. Without purification. 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (364 mg, 816 umol, 99.7%yield) was obtained as yellow oil.

[0351] Synthesis of Compound 22

[0352] To a solution of 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (364 mg, 816 umol, 1 eq) and 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (380 mg, 816 umol, 1 eq) in EtOH (4 mL) was added DIEA (211 mg, 1.63 mmol, 284 uL, 2 eq) . The mixture was stirred at 80 ℃ for 12 hours. The reaction mixture was partitioned between EtOAc 100 mL and H2O 50 mL. The organic phase was separated, washed with NaHCO3 (aq) 100 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (product Rf = 0.60) (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=100 / 1 to 0 / 1) . Compound 22 (117 mg, 140 umol, 17.2%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.60 (t, J = 5.8 Hz, 2H) , 4.15 (t, J = 6.5 Hz, 4H) , 3.52 -3.64 (m, 6H) , 3.43 (td, J = 6.7, 9.2 Hz, 4H) , 2.61 (br s, 2H) , 2.49 (br s, 4H) , 2.31 (t, J = 7.4 Hz, 4H) , 1.95 (q, J = 6.4 Hz, 4H) , 1.42 -1.72 (m, 23H) , 1.41 -1.13 (m, 22H) , 0.88 (d, J = 6.6 Hz, 24H) .

[0353] Synthesis of Compound 23: bis (3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (4-hydroxybutyl) azanediyl) dihexanoate

[0354] Synthesis of 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propyl 6- ( (4-hydroxybutyl) amino) hexanoate

[0355] To a solution of 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (0.5 g, 1.07 mmol, 1.0 eq) and 4-aminobutan-1-ol (957 mg, 10.7 mmol, 997 uL, 10.0 eq) in EtOH (5 mL) was added at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 1 hour. The reaction mixture was poured into water (10 mL) and extracted with EtOAc (10 mL, 5 mL, 3 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propyl 6- ( (4-hydroxybutyl) amino) hexanoate (0.6 g, crude) as a colorless oil.

[0356] Synthesis of Compound 23

[0357] To a solution of 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propyl 6- ( (4-hydroxybutyl) amino) hexanoate (0.6 g, 1.27 mmol, 1.0 eq) and 3, 3-bis ( (5-methylhexyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (590 mg, 1.27 mmol, 1.0 eq) in EtOH (5 mL) was added DIEA (327 mg, 2.53 mmol, 441 uL, 2.0 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃for 12 hours. The reaction mixture was poured into water (10 mL) and extracted with EtOAc (10 mL, 5 mL, 5 mL) , The combined organic layers were washed with (brine 3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to EtOAc / MeOH = 5 / 1) to give compound 23 (0.2 g, 213 umol, 16.8%yield, 91.8%purity) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.61 (t, J = 5.6 Hz, 2H) , 4.15 (t, J = 6.8 Hz, 4H) , 3.55-3.62 (m, 6H) , 3.41-3.46 (m, 4H) , 2.58-2.67 (m, 3H) , 2.43-2.47 (m, 6H) , 2.29-2.34 (m, 14H) , 2.23 (d, J = 2.8 Hz, 6H) , 1.95 (q, J = 6.4 Hz, 4H) , 1.61-1.68 (m, 9H) , 1.49-1.59 (m, 16H) , 1.31-1.39 (m, 13H) , 1.18-1.26 (m, 11H) , 0.87-0.89 (m, 24H) .

[0358] Synthesis of Compound 24: bis (3, 3-bis (heptyloxy) propyl) 6, 6'- ( (2-hydroxyethyl) azanediyl) dihexanoate

[0359] Synthesis of 3, 3-bis (heptyloxy) propan-1-ol

[0360] To a solution of aheptan-1-ol (12.2 g, 105 mmol, 14.9 mL, 4.0 eq) and ethyl 3, 3-diethoxypropanoate (5.0 g, 26.3 mmol, 5.11 mL, 1.0 eq) was added KHSO4 (179 mg, 1.31 mmol, 77.1 uL, 0.05 eq) . The reaction was stirred at 75 ℃ for 12 hours. The residue was diluted with water (50.0 mL) and extracted with EtOAc (100 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=60 / 1 to 50 / 1) . Ethyl 3, 3-bis (heptyloxy) propanoate (10.0 g, 30.3 mmol, 57.6%yield) was obtained as yellow oil.

[0361] To a solution of Ethyl 3, 3-bis (heptyloxy) propanoate (10.0 g, 30.3 mmol, 1.0 eq) in THF (60.0 mL) was added LAH (1.15 g, 30.3 mmol, 1.0 eq) at 0℃. The reaction was stirred at 20 ℃for 2 hours. The reaction mixture was quenched by addition water (1.00 mL) at 0℃, 15%NaOH with solvent (1.00 mL) , and water (3.00 mL) . The combined organic layers were added MgSO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The crude product was used into the next step without further purification. 3, 3-bis (heptyloxy) propan-1-ol (6.00 g, crude) was obtained as a colorless oil. 1H NMR: 400 MHz, CDCl3, δ 4.66 (t, J = 5.6 Hz, 1 H) , 3.74 (t, J =5.2 Hz, 2 H) , 3.60 -3.66 (m, 2 H) , 3.42 -3.48 (m, 2 H) , 1.87 -1.91 (m, 2 H) , 1.55 -1.61 (m, 4 H) , 1.22 -1.32 (m, 16 H) , 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 6 H) .

[0362] Synthesis of 3, 3-bis (heptyloxy) propyl 6-bromohexanoate

[0363] To a solution of 3, 3-bis (heptyloxy) propan-1-ol (3.00 g, 10.4 mmol, 1.0 eq) and 6-bromohexanoic acid (2.43 g, 12.5 mmol, 1.2 eq) in DCM (18.0 mL) was added EDCI (2.99 g, 15.6 mmol, 1.5 eq) and DMAP (254 mg, 2.08 mmol, 0.2 eq) at 0 ℃. The reaction was stirred at 20℃ for 12 hours. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL*3) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=60 / 1 to 40 / 1) . 3, 3-bis (heptyloxy) propyl 6-bromohexanoate (1.80 g, 3.87 mmol, 37.2%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 1 H) , 4.15 (t, J = 6.4 Hz, 2 H) , 3.55 -3.61 (m, 2 H) , 3.39 -3.45 (m, 4 H) , 2.32 (t, J = 7.2 Hz, 2 H) , 1.86 -1.97 (m, 4 H) , 1.50 -1.68 (m, 8 H) , 1.28 -1.36 (m, 15 H) , 0.87 -0.90 (m, 6 H) .

[0364] Synthesis of compound 24

[0365] To a solution of 3, 3-bis (heptyloxy) propyl 6-bromohexanoate (1.80 g, 3.87 mmol, 1.0 eq) in ACN (7.8 mL) was added 2-aminoethanol (708 mg, 11.6 mmol, 702 uL, 3.0 eq) . The reaction was stirred at 90 ℃ for 4 hours. The residue was diluted with water (5.00 mL) and extracted with EtOAc (10.0 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (5.00 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=5 / 1 to 10 / 1) . Compound 24 (100 mg, 118 umol, 3.05%yield, 98%purity) was obtained as yellow oil. 3, 3-bis (heptyloxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (1.00 g, crude) was a by-product. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.60 (t, J = 6.0 Hz, 2 H) , 4.14 (t, J = 6.4 Hz, 4 H) , 3.53 -3.61 (m, 7 H) 3.41-3.45 (m, 4 H) 2.57 (t, J = 5.2 Hz, 3 H) , 2.45 (t, J = 7.6 Hz, 5 H) , 2.30 (t, J = 7.2 Hz, 5 H) , 1.94 -1.97 (m, 5 H) , 1.42 -1.67 (m, 23 H) , 1.28 -1.35 (m, 39 H) , 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 12 H) .

[0366] Synthesis of Compound 25: bis (3, 3-bis (octyloxy) propyl) 6, 6'- ( (2-hydroxyethyl) azanediyl) dihexanoate

[0367] To a solution of 3, 3-bis (octyloxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (1 g, 2.11 mmol, 1.0 eq) and 3, 3-bis (octyloxy) propyl 6-bromohexanoate (1.04 g, 2.11 mmol, 12.3 uL, 1.0 eq) in EtOH (5 mL) was added DIEA (546 mg, 4.22 mmol, 735 uL, 2.0 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 12 hours. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine 3 mL, dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by prep-HPLC (column: Phenomenex Luna C18 100 × 30 mm × 5um; mobile phase: [water (HCl) -ACN] ; B%: 60%-90%, 10 min) . The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate=10 / 1 to EtOAc / MeOH = 5 / 1) to give compound 25 (450 mg, 507.69 umol, 24.05%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 2H) , 4.12-4.16 (m, 4H) , 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 1H) , 3.53-3.61 (m, 6H) , 3.41-3.45 (m, 4H) , 2.57 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 2.45 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 5H) , 2.05 (s, 1H) , 1.94 (dd, J = 6.4, 12.8 Hz , 4H) , 1.53-1.67 (m, 14H) , 1.43-1.50 (m, 6H) , 1.25-1.33 (m, 47H) , 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 12H) .

[0368] Synthesis of Compound 26: bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (2-hydroxyethyl) azanediyl) dihexanoate

[0369] Synthesis of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propan-1-ol

[0370] To a solution of 3, 7-dimethyloctan-1-ol (12.5 g, 78.8 mmol, 24.9 mL, 3.0 eq) in ethyl 3, 3-diethoxypropanoate (5 g, 26.3 mmol, 5.11 mL, 1.0 eq) was added KHSO4 (179 mg, 1.31 mmol, 77.1 uL, 0.05 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 80℃ for 12 hours. The reaction mixture was poured into water (20 mL) and extracted with EtOAc (20 mL, 10 mL, 5 mL) , The combined organic layers were washed with brine (5 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1, product Rf = 0.50) to give ethyl 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propanoate (6.1 g, 14.7 mmol, 55.9%yield) as a colorless oil.

[0371] To a solution of ethyl 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propanoate (4.1 g, 10.6 mmol, 1.0 eq) in EtOH (5 mL) , THF (5 mL) and H2O (5 mL) was added NaOH (848 mg, 21.2 mmol, 2.0 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 25℃ for 3 hours. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with EtOAc (10 mL, 5 mL, 5 mL) , The combined organic layers were washed with brine (5 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 100 / 1 to 0 / 1) to give 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propanoic acid (3 g, 7.76 mmol, 73.1%yield) as a colorless oil.

[0372] A suspension of LiAlH4 (836 mg, 22.0 mmol, 1.2 eq) in THF (20 mL) at 0℃, a solution of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propanoic acid (7.1 g, 18.4 mmol, 1.0 eq) in THF (20 mL) was dropped added to the mixture dropwise at 0℃ for 20 minutes under N2. Then the reaction solution was warmed 25℃ and stirred for 3 hours. The reaction was cooled to 0℃, water (0.84 mL) was dropped in the reaction solution under N2 and created a lot of bubbles, then 15%aq. NaOH (0.84 mL) was added dropwise slowly at 0℃, after 5 minutes, water (2.5 mL) was dropped the reaction solution at 0℃, then Na2SO4 added the mixture and warmed to 25℃ stirred 15 minutes. The mixture was filtered and the filter cake concentrated under reduced pressure to give 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propan-1-ol (7.1 g, crude) as a colorless oil.

[0373] Synthesis of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate

[0374] To a solution of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propan-1-ol (28.6 g, 76.8 mmol, 1.0 eq) in DCM (200 mL) was added 6-bromohexanoic acid (22.5 g, 115 mmol, 1.5 eq) , EDCI (29.4 g, 154 mmol, 2.0 eq) and DMAP (469 mg, 3.84 mmol, 0.05 eq) at 0℃, then the mixture was stirred at 25℃ for 1.5 hours. The reaction mixture was poured into water (100 mL) and extracted with EtOAc (100 mL, 50 mL, 30 mL) , The combined organic layers were washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 100 / 1 to 0 / 1) to give 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (18 g, 32.7 mmol, 42.6%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.14-4.17 (m, 2H) , 3.59-3.68 (m, 2H) , 3.40-3.49 (m, 3H) , 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.86-1.98 (m, 3H) , 1.48-1.68 (m, 10H) , 1.25-1.30 (m, 8H) , 1.08-1.17 (m, 6H) , 0.86-0.91 (m, 18H) .

[0375] Synthesis of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0376] To a solution of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (6 g, 10.9 mmol, 1.0 eq) and 2-aminoethanol (6.67 g, 109 mmol, 6.60 mL, 10 eq) in EtOH (60 mL) was added at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 2 hours. The reaction mixture was poured into water (100 mL) and extracted with EtOAc (100 mL, 50 mL, 30 mL) , The combined organic layers were washed with (brine 30 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to DCM / MeOH = 10 / 1) to give 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (6 g, crude) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.58-4.63 (m, 3H) , 4.14 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 3.86 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 3.57-3.67 (m, 2H) , 3.43-3.50 (m, 2H) , 2.99-3.02 (m, 2H) , 2.87 (t, J = 8.0 Hz, 2H) , 2.32 (t, J =7.6 Hz, 2H) , 1.92-1.97 (m, 2H) , 1.74-1.78 (m, 2H) , 1.51-1.68 (m, 8H) , 1.26-1.39 (m, 11H) , 1.09-1.17 (m, 6H) , 0.86-0.89 (m, 18H) .

[0377] Synthesis of Compound 26

[0378] To a solution of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (6 g, 11.3 mmol, 1.0 eq) and 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (6.22 g, 11.3 mmol, 1.0 eq) in EtOH (60 mL) was added DIEA (2.93 g, 22.7 mmol, 3.94 mL, 2.0 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃for 24 hours. The reaction mixture was poured into water (50 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 20 mL) , The combined organic layers were washed with brine (20 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to EtOAc / MeOH = 5 / 1) to give Compound 26 (4 g, 3.96 mmol, 34.9%yield, 98.8%purity) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 2H) , 4.15 (t, J = 6.4 Hz, 4H) , 3.57-3.66 (m, 5H) , 3.44-3.51 (m, 4H) , 2.50-2.66 (m, 5H) , 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H) , 1.94 (q, J = 6.4 Hz, 4H) , 1.51-1.66 (m, 25H) , 1.28-1.36 (m, 22H) , 1.08-1.17 (m, 2H) , 0.86-0.90 (m, 36H) .

[0379] Synthesis of Compound 27: bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3-hydroxypropyl) azanediyl) dihexanoate

[0380] Compound 27 was prepared analogously to compound 26 but using 3-aminopropan-1-ol instead of 2-aminoethan-1-ol. Compound 27 was obtained as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.60 (t, J = 6.0 Hz, 2 H) , 4.14 (t, J = 6.0 Hz, 4 H) , 3.79 (t, J = 6.0 Hz, 2 H) , 3.55 -3.72 (m, 4 H) , 3.35 -3.46 (m, 4 H) , 2.55 -2.68 (m, 2 H) , 2.43 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4 H) , 1.86 -1.98 (m, 4 H) , 1.47 -1.71 (m, 23 H) , 1.06 -1.46 (m, 32 H) , 0.89 (t, J = 6.0 Hz, 36 H) .

[0381] Synthesis of Compound 28: bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3- ( (2- (methylamino) -3, 4-dioxocyclobut-1-en-1-yl) amino) propyl) azanediyl) dihexanoate

[0382] Synthesis of compound 28-2

[0383] A thumb bottle with magnetic stirrer, addition funnel and thermometer. To a solution of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (2.10 g, 3.83 mmol, 1.0 eq) and benzyl (3-aminopropyl) carbamate (3.99 g, 19.2 mmol, 5.0 eq) in EtOH (14.0 mL) was stirred at 50 ℃ for 12 hours. The residue was diluted with water (10.0 mL) and extracted with EtOAc (50.0 mL, 25.0 mL) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, EtOAc: MeOH=1 / 0 to 60 / 1) . Compound 28-1 (0.82 g, 1.20 mmol, 31.3%yield) was obtained as yellow oil. A seal tube equipped with magnetic stirrer, addition funnel and thermometer.

[0384] To a solution of compound 28-1 (406 mg, 600 umol, 1.0 eq) in EtOH (4.00 mL) was added DIEA (120 mg, 900 umol, 161 uL, 1.5 eq) and 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (495 mg, 900 umol, 1.5 eq) . The mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hours. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (50.0 mL, 25.0 mL) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH=100 / 1 to 60 / 1) . Compound 28-2 (595 mg, 520 umol, 86.6%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.35-7.21 (m, 5H) , 6.50 (s, 1H) , 5.05 (s, 2H) , 4.65 (t, 2H) , 4.11-3.80 (m, 4H) , 3.78-3.52 (m, 8H) , 3.10-3.01 (m, 2H) , 2.52-2.41 (m, 6H) , 2.39-2.17 (m, 4H) , 2.02-1.11 (m, 58H) , 0.88-0.74 (m, 36H) .

[0385] Synthesis of compound 28

[0386] A 100 mL three-necked round bottom flask equipped with magnetic stirrer, addition funnel and thermometer. To a solution of compound 28-2 (624 mg, 545 umol, 1.0 eq) in EtOH (5.00 mL) was added Pd / C (50.0 mg, 10%purity) under N2. The suspension was degassed under vacuum and purged with H2 several times. The mixture was stirred under H2 15 Psi at 20 ℃ for 72 hours. The reaction mixture was filtered and the filter cake was washed by EtOH (30.0 mL) . bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3-aminopropyl) azanediyl) dihexanoate was obtained as yellow oil. bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3-aminopropyl) azanediyl) dihexanoate (529 mg, 523 umol, 1.0 eq) and 3, 4-dimethoxycyclobut-3-ene-1, 2-dione (112 mg, 785 umol, 1.5 eq) were taken up into a microwave tube in THF (4.10 mL) at 25 ℃. The mixture was stirred at 25 ℃ for 1 hour. Then methylamine (2 M, 2.62 mL, 10 eq) was added at 25 ℃. The reaction stirred at 25 ℃ for 20 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to remove solvent. The residue was purified by column chromatography (SiO2, DCM: MeOH=60 / 1 to 50 / 1) and then product was purified by prep-TLC (SiO2, DCM: MeOH = 8: 1) . Compound 28 (145 mg, 130 umol, 24.8%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.20 (s, 1H) , 7.05 (s, 1H) , 4.67 (t, 2H) , 4.13-3.81 (m, 4H) , 3.78-3.52 (m, 8H) , 3.31-3.12 (m, 2H) , 2.52-2.41 (m, 6H) , 2.39-2.17 (m, 4H) , 2.04-1.11 (m, 61H) , 0.88-0.74 (m, 36H) .

[0387] Synthesis of Compound 29: bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (2- (2- (2-hydroxyethoxy) ethoxy) ethyl) azanediyl) dihexanoate

[0388] Synthesis of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (2- (2- (2-hydroxyethoxy) ethoxy) ethyl) amino) hexanoate

[0389] To a solution of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (550 mg, 890. μmol, 1 eq) and 2- [2- (2-aminoethoxy) ethoxy] ethanol (678 mg, 4.55 mmol, 5 eq) in EtOH (5 mL) was stirred at 75 ℃ for 12 hours. TLC (Dichloromethane: Methanol = 10 / 1, Rf = 0.05) indicated 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate was consumed complete. The residue was diluted with H2O (20 mL) and extracted with EtOAc (20 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (30 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (2- (2- (2-hydroxyethoxy) ethoxy) ethyl) amino) hexanoate (550 mg, 890 μmol, 97.8%yield) as colorless oil. 1H NMR 400 MHz CDCl3 δ 4.60 (t, J = 5.72Hz, 1H) , 4.11-4.17 (m, 3H) , 3.71-3.75 (m, 2H) , 3.58-3.68 (m, 9H) , 3.42-3.51 (m, 2H) , 2.75-2.81 (m, 2H) , 2.59-2.64 (m, 2H) , 2.26-2.33 (m, 2H) , 1.91-1.98 (m, 2H) , 1.48-1.68 (m, 11H) , 1.31-1.43 (m, 5H) , 1.21-1.29 (m, 6H) , 1.09-1.18 (m, 6H) , 0.85-0.90 (m, 18H) .

[0390] Synthesis of compound 29

[0391] To a solution of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (550 mg, 890. μmol, 1.1 eq) and 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (2- (2- (2-hydroxyethoxy) ethoxy) ethyl) amino) hexanoate (538 mg, 979 μmol, eq) in EtOH (6 mL) was added DIEA (172 mg, 1.34 mmol, 232 μL, 1.5 eq) . The mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hours. TLC (Dichloromethane: Methanol = 10 / 1, Rf = 0.21) indicated 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (2- (2- (2-hydroxyethoxy) ethoxy) ethyl) amino) hexanoate was consumed complete. The residue was diluted with H2O (20 mL) and extracted with EtOAc (20 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (30 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～4%Methanol / Dichloromethane gradient @15 mL / min) to give Compound 29 (420 mg, 386 μmol, 43.4%yield) was obtained as colorless oil. 1H NMR 400 MHz CDCl3 δ 4.60 (t, J = 5.64 Hz, 2H) , 4.11-4.17 (m, 4H) , 3.71-3.77 (m, 2H) , 3.41-3.68 (m, 16H) , 2.60-2.68 (m, 2H) , 2.44 (t, J = 6.94 Hz, 3H) , 2.27-2.34 (m, 4H) , 1.92-1.98 (m, 4H) , 1.47-1.68 (m, 20H) , 1.21-1.44 (m, 22H) , 1.08-1.19 (m, 12H) , 0.84-0.92 (m, 36H) .

[0392] Synthesis of Compound 30: bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (2- (2- (2- ( (2- (methylamino) -3, 4-dioxocyclobut-1-en-1-yl) amino) ethoxy) ethoxy) ethyl) azanediyl) dihexanoate

[0393] Synthesis of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 13- (6- (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) -3-oxo-1-phenyl-2, 7, 10-trioxa-4, 13-diazanonadecan-19-oate

[0394] A solution of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (3.00 g, 5.46 mmol) in EtOH (30 mL) was added benzyl (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate (4.62 g, 16.4 mmol) and DIEA (2.12 g, 16.4 mmol) . The mixture was stirred at 75 ℃ for 12 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10: 1, Rf = 0.55) showed the reaction was completed. The reaction mixture was mixed with water (30 mL) and extracted with Ethyl acetate (20 mL *3) . Then the combined organic phase was washed by brine (20 mL *2) , dried over anhydrous Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, CH2Cl2: MeOH = 100 / 0 to 95 / 5) to give the compound 30-1 (1.52 g, 37.1%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.31-7.37 (m, 5H) , 5.08 (s, 2H) , 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.13 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 3.47-3.68 (m, 14H) , 2.74 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.58 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.30-2.37 (m, 2H) , 1.86-1.97 (m, 2H) , 1.49-1.66 (m, 10H) , 1.25-1.42 (m, 10H) , 1.06-1.21 (m, 6H) , 0.80-0.97 (m, 18H) .

[0395] A solution of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 3-oxo-1-phenyl-2, 7, 10-trioxa-4, 13-diazanonadecan-19-oate (1.52 g, 2.02 mmol) in EtOH (20 mL) was added DIEA (0.39 g, 3.04 mmol) and 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (1.33 g, 2.43 mmol) . The mixture was stirred at 90 ℃ for 24 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH =10: 1, Rf = 0.35) showed the reaction was completed. The reaction mixture was diluted with H2O (30 mL) , and extracted with Ethyl acetate 40 mL (20 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine 40 mL (20 mL *2) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, CH2Cl2: MeOH = 100 / 0 to 95 / 5) to give the 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 13- (6- (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) -3-oxo-1-phenyl-2, 7, 10-trioxa-4, 13-diazanonadecan-19-oate (1.82 g, 73.7%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.31-7.38 (m, 5H) , 5.08 (s, 2H) , 4.60 (t, J =5.6 Hz, 2H) , 4.13 (t, J =6.4 Hz, 4H) , 3.46-3.69 (m, 18H) , 2.71-2.94 (m, 6H) , 2.32-2.36 (m, 4H) , 1.87-1.99 (m, 4H) , 1.52-1.66 (m, 20H) , 1.28-1.41 (m, 20H) , 1.11-1.21 (m, 12H) , 0.88-0.93 (m, 36H) .

[0396] Synthesis of Compound 30

[0397] A solution of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 13- (6- (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) -3-oxo-1-phenyl-2, 7, 10-trioxa-4, 13-diazanonadecan-19-oate (1.52 g, 2.02 mmol) in THF (20 mL) was added Pd / C (0.26 g, 0.25 mmol) . The mixture was degassed and purged by H2 several times, stirred at 25 ℃ for 12 hours under H2 (15 psi) . TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate = 1: 1, Rf = 0.40) showed the reaction was completed. The reaction mixture was filtered and the filter was concentrated. to give the bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethyl) azanediyl) dihexanoate (1.53 g, 66.4%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.61 (t, J =5.6 Hz, 2H) , 4.13 (t, J =6.4 Hz, 4H) , 3.40-3.72 (m, 18H) , 2.76-2.87 (m, 2H) , 2.46-2.56 (m, 4H) , 2.31-2.36 (m, 4H) , 1.89-1.96 (m, 4H) , 1.48-1.67 (m, 20H) , 1.28-1.41 (m, 20H) , 1.12-1.21 (m, 12H) , 0.87-0.93 (m, 36H) .

[0398] To a solution of bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethyl) azanediyl) dihexanoate (500 mg, 461 μmol) and 3, 4-dimethoxycyclobut-3-ene-1, 2-dione (98.2 mg, 690 μmol) in THF (5 mL) . The mixture was stirred at 20 ℃ for 1 hour. Then was added methanamine (2 M, 2.30 mL) at 20 ℃. The mixture was stirred at 20 ℃ for 18 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, product Rf = 0.46) showed the reaction was completed. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to remove solvent. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether: Ethyl acetate=1 / 1 to 0 / 1) to give Compound 30 (200 mg, 167 μmol, 36.4%yield) as a colorless oil. 1HNMR: 400 MHz CDCl3 δ 4.52-4.66 (m, 2H) , 4.10-4.19 (m, 4H) , 3.76-3.86 (m, 2H) , 3.55-3.70 (m, 11H) , 3.41-3.51 (m, 4H) , 3.26-3.35 (m, 3H) , 2.54-2.98 (m, 5H) , 2.32 (t, J = 7.24 Hz, 4H) , 1.91-1.99 (m, 4H) , 1.47-1.70 (m, 20H) , 1.20-1.42 (m, 22H) , 1.06-1.18 (m, 12H) , 0.81-0.94 (m, 36H) .

[0399] Synthesis of Compound 31: bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3- (2, 4-dioxo-1, 2, 3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl) propyl) azanediyl) dihexanoate

[0400] Synthesis of 5- (3-aminopropyl) pyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione

[0401] A mixture of 5-iodo-2, 4-dimethoxypyrimidine (5.00 g, 18.7 mmol) , tert-butyl prop-2-yn-1-ylcarbamate (3.21 g, 20.6 mmol) , CuI (214 mg, 1.13 mmol) , TEA (22.7 g, 224 mmol, 31.3 mL) and Pd (PPh3) 2Cl2 (659 mg, 939 μmol) in MeCN (50 mL) under N2 atmosphere. The suspension was degassed and purged with N2 for 3 times. The mixture was stirred 80 ℃ for 12 hours. LCMS (EB10746-48-R1A) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (30.0 mL) and extracted with EtOAc (30.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (50.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 12 g  Silica Flash Column, Eluent of 0～25%Ethyl acetate: Petroleum ether gradient @20 mL / min) to give tert-butyl (3- (2, 4-dimethoxypyrimidin-5-yl) prop-2-yn-1-yl) carbamate (3.90 g, 68.6%yield, 96.9%purity) as yellow solid.

[0402] To a solution of tert-butyl (3- (2, 4-dimethoxypyrimidin-5-yl) prop-2-yn-1-yl) carbamate (3.00 g, 10.2 mmol) in MeOH (30 mL) was added Pd / C (500 mg, 10%purity) under N2 atmosphere. The suspension was degassed and purged with H2 for 3 times. The mixture was stirred under H2 (50 Psi) at 50 ℃ for 12 hours. LCMS (EB10746-51-P1E) showed the reaction was complete. The reaction mixture was concentrated under vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 12 g Silica Flash Column, Eluent of 0～50 %Ethyl acetate / Petroleum ether gradient @20 mL / min) to give tert-butyl (3- (2, 4-dimethoxypyrimidin-5-yl) propyl) carbamate (2.50 g, 82.2%yield) as yellow oil. 1H NMR 400 MHz DMSO-d6 δ 8.11 (s, 1H) , 6.79-6.89 (m, 1H) , 3.88-3.92 (m, 3H) , 3.85 (s, 3H) , 2.94-2.94 (m, 2H) , 2.40 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.53-1.63 (m, 2H) , 1.37 (s, 9H) .

[0403] A mixture of tert-butyl (3- (2, 4-dimethoxypyrimidin-5-yl) propyl) carbamate (2.50 g, 8.41 mmol) in dioxane (25 mL) and HCl (12 M, 25 mL) was stirred at 100 ℃ for 12 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.13) showed the reaction was complete. The reaction mixture was concentrated under vacuum to give 5- (3-aminopropyl) pyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (1.50 g, 86.7%yield, HCl) as brown solid. 1H NMR 400 MHz DMSO-d6 δ 7.27 (s, 1H) , 2.73 (t, J =7.6 Hz, 2H) , 2.21 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.61-1.76 (m, 2H) .

[0404] Synthesis of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (3- (2, 4-dioxo-1, 2, 3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl) propyl) amino) hexanoate

[0405] To a solution of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (1.02 g, 1.85 mmol) in DMSO (8 mL) was added 5- (3-aminopropyl) pyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (760 mg, 3.70 mmol, HCl) and DIEA (955 mg, 7.39 mmol, 1.29 mL) . Then the mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hours. LCMS (EB10746-79-R1A) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (3- (2, 4-dioxo-1, 2, 3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl) propyl) amino) hexanoate (1.00 g, 84.8%yield) as brown oil.

[0406] Synthesis of Compound 31

[0407] To a solution of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (3- (2, 4-dioxo-1, 2, 3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl) propyl) amino) hexanoate (600 mg, 470 μmol) in EtOH (10 mL) was added 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (258 mg, 470 μmol) , DIEA (182 mg, 1.41 mmol, 245 μL) . Then the mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.17) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (20.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (30.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～2%MeOH / CH2Cl2 gradient @15 mL / min) to give Compound 31 (120 mg, 23.0%yield) as yellow oil. 1H NMR DMSO-d6 δ 10.95 (s, 1H) , 10.44-10.67 (m, 1H) , 7.14 (s, 1H) , 4.53 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 4.02 (t, J = 6.4 Hz, 4H) , 3.48-3.58 (m, 4H) , 3.36-3.45 (m, 5H) , 2.20-2.35 (m, 9H) , 2.09-2.16 (m, 2H) , 1.76-1.89 (m, 4H) , 1.45-1.58 (m, 18H) , 1.16-1.36 (m, 24H) , 0.99-1.15 (m, 13H) , 0.84 (d, J = 6.4 Hz, 36H) .

[0408] Synthesis of Compound 32: bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3- ( (2, 4-dioxo-1, 2, 3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl) amino) propyl) azanediyl) dihexanoate

[0409] Synthesis of 5- ( (3-aminopropyl) amino) pyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione

[0410] A mixture of tert-butyl (3-aminopropyl) carbamate (7.30 g, 41.8 mmol, 7.31 mL) and 5-bromopyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (2.00 g, 10.4 mmol) in EtOH (14 mL) was stirred at 100 ℃for 12 hours. LCMS (EB10375-58-R1A) showed the reaction was complete. The reaction mixture was filtered and the filtrate was concentrated under vacuum to give tert-butyl (3- ( (2, 4-dioxo-1, 2, 3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl) amino) propyl) carbamate (2.65 g, 89.0%yield) as white solid. 1H NMR 400 MHz DMSO-d6 δ 10.80-11.26 (m, 1H) , 9.91-10.45 (m, 1H) , 6.77-6.85 (m, 1H) , 4.22 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 2.90-3.01 (m, 2H) , 2.73-2.84 (m, 2H) , 1.54-1.64 (m, 2H) , 1.37 (s, 9H) .

[0411] A mixture of tert-butyl (3- ( (2, 4-dioxo-1, 2, 3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl) amino) propyl) carbamate (2.60 g, 9.14 mmol) in CH2Cl2 (20 mL) and TFA (9.21 g, 80.7 mmol, 6 mL) was stirred at 25 ℃ for 12 hours. LCMS (EB10375-63-R1C) showed the reaction was complete. The reaction mixture was concentrated under vacuum to give 5- ( (3-aminopropyl) amino) pyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (5.50 g, crude) as white solid. 1H NMR 400 MHz DMSO-d6 δ 11.40-11.52 (m, 1H) , 10.74-10.95 (m, 1H) , 7.68-7.91 (m, 3H) , 6.97-7.10 (m, 1H) , 2.97-3.15 (m, 2H) , 2.76-2.93 (m, 2H) , 1.75-1.90 (m, 2H) .

[0412] Synthesis of Compound 32

[0413] Compound 32 was subsequently prepared using similar procedure as Compound 31 but using 5- ( (3-aminopropyl) amino) pyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione. 1H NMR 400 MHz CDCl3 δ6.48-6.74 (m, 1H) , 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 2H) , 4.14 (t, J = 6.4 Hz, 4H) , 3.57-3.69 (m, 4H) , 3.43-3.51 (m, 4H) , 2.91-3.22 (m, 6H) , 2.32 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 2.07-2.21 (m, 2H) , 1.91-1.97 (m, 4H) , 1.73-1.83 (m, 4H) , 1.51-1.70 (m, 17H) , 1.21-1.42 (m, 21H) , 1.07-1.18 (m, 12H) , 0.77-0.91 (m, 36H) .

[0414] Synthesis of Compound 33: bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (2- (2- (2- ( (2, 4-dioxo-1, 2, 3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl) amino) ethoxy) ethoxy) ethyl) azanediyl) dihexanoate

[0415] Synthesis of 5- ( (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethyl) amino) pyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione

[0416] A mixture of tert-butyl (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate (5.20 g, 20.9 mmol) and 5-bromopyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (1.00 g, 5.24 mmol) in EtOH (7 mL) was stirred at 100 ℃ for 12 hours. LCMS (EB10746-26-R1A) showed the reaction was complete. The reaction mixture was filtered and the filtrate was concentrated under vacuum to give tert-butyl (2- (2- (2- ( (2, 4-dioxo-1, 2, 3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl) amino) ethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate (1.56 g, 83.1%yield) as yellow solid. Amixture of tert-butyl (2- (2- (2- ( (2, 4-dioxo-1, 2, 3, 4-tetrahydropyrimidin-5-yl) amino) ethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate (1.56 g, 4.35 mmol) in DCM (15 mL) and TFA (4.61 g, 40.3 mmol, 3 mL, ) was stirred at 25 ℃ for 12 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.03) showed the reaction was complete. The reaction mixture was concentrated under vacuum to give 5- ( (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethyl) amino) pyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione (2.00 g, crude, TFA) as off-white solid. 1H NMR 400 MHz DMSO-d6 δ 11.39 (s, 1H) , 10.66 (d, J = 4.8 Hz, 1H) , 7.80 (s, 3H) , 6.91 (d, J = 5.6 Hz, 1H) , 3.51-3.64 (m, 8H) , 3.10 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.92-3.02 (m, 2H) .

[0417] Synthesis of Compound 33

[0418] Compound 33 was subsequently prepared using similar procedure as Compound 31 but using 5- ( (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethyl) amino) pyrimidine-2, 4 (1H, 3H) -dione. 1H NMR 400 MHz CDCl3 δ 6.50-6.55 (m, 1H) , 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 2H) , 4.14 (t, J = 6.4 Hz, 5H) , 3.62-3.73 (m, 10H) , 3.45-3.57 (m, 6H) , 2.88-3.10 (m, 5H) , 2.35 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 1.89-1.96 (m, 4H) , 1.50-1.70 (m, 21H) , 1.26-1.42 (m, 21H) , 1.12-1.20 (m, 12H) , 0.86-0.94 (m, 36H) .

[0419] Synthesis of Compound 34: bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3- (1H-imidazole-4-carboxamido) propyl) azanediyl) dihexanoate

[0420] Synthesis of 1H-imidazole-4-carbonyl chloride

[0421] To a solution of 1H-imidazole-4-carboxylic acid (500 mg, 4.46 mmol, ) in CH2Cl2 (5 mL) was added oxalyl dichloride (1.13 g, 8.92 mmol, 781 μL) . Then add DMF (9.78 mg, 134 μmol, 10.3 μL) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 1 hour. LCMS showed the reaction was completed. The reaction mixture was concentrated under vacuum to give 1H-imidazole-4-carbonyl chloride 1H-imidazole-4-carbonyl chloride (550 mg, crude) as a yellow solid.

[0422] Synthesis of Compound 34

[0423] To a solution of bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3-aminopropyl) azanediyl) dihexanoate (440 mg, 434 μmol) and 1H-imidazole-4-carbonyl chloride (114 mg, 870 μmol) in CH2Cl2 (5 mL) was added PYRIDINE (68.8 mg, 869 μmol, 70.2 μL) , then the mixture was stirred at 25 ℃ for 24 hours under N2. TLC (Plate 1, CH2Cl2: MeOH = 10: 1, product Rf = 0.34) showed the reaction mixture was completed. The reaction mixture was diluted with H2O (10 mL) , and extracted with CH2Cl2 20 mL (10 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine 20 mL (10 mL *2) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, CH2Cl2: MeOH = 100 / 0 to 95 / 5) to give the Compound 34 (100 mg, 90.4 μmol, 20.8%yield) as a yellow oil. 1HNMR 400 MHz CDCl3 δ 7.58-7.79 (m, 2H) , 4.56-4.64 (m, 2H) , 4.09-4.19 (m, 4H) , 3.38-3.70 (m, 10H) , 2.88-3.20 (m, 6H) , 2.24-2.33 (m, 4 H) , 1.91-1.99 (m, 4H) , 1.72-1.85 (m, 4H) , 1.47-1.69 (m, 17H) , 1.20-1.43 (m, 21H) , 1.06-1.18 (m, 12H) , 0.81-0.93 (m, 36H) .

[0424] Synthesis of Compound 35: 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 11- (6- (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) -1- (1H-imidazol-4-yl) -1-oxo-5, 8-dioxa-2, 11-diazaheptadecan-17-oate

[0425] To a solution of bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethyl) azanediyl) dihexanoate (500 mg, 461 μmol) and 1H-imidazole-4-carbonyl chloride (500 mg, 461 μmol) in CH2Cl2 (5 mL) was added PYRIDINE (72.9 mg, 921μmol, 74.3 μL) , then the mixture was stirred at 25 ℃ for 12 hours under N2. TLC (Plate 1, CH2Cl2: MeOH = 10: 1, product Rf = 0.34) showed the reaction mixture was completed. The reaction mixture was diluted with H2O (10 mL) , and extracted with CH2Cl2 20 mL (10 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine 20 mL (10 mL *2) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, CH2Cl2: MeOH = 100 / 0 to 95 / 5) to give the Compound 35 (130 mg, 110μmol, 43.3%yield) as a colorless oil. 1HNMR 400 MHz CDCl3 δ 7.60-7.72 (m, 2H) 4.55-4.65 (m, 2H) , 4.10-4.20 (m, 4H) , 3.72-3.93 (m, 2H) , 3.60-3.68 (m, 11H) , 3.42-3.51 (m, 4H) , 2.73-3.13 (m, 5H) , 2.27-2.34 (m, 4H) , 1.92-1.99 (m, 4H) , 1.48-1.69 (m, 20H) , 1.20-1.40 (m, 22H) , 1.07-1.18 (m, 12H) , 0.83-0.92 (m, 36H) .

[0426] Synthesis of Compound 36: bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3- (4-amino-2-oxopyrimidin-1 (2H) -yl) propyl) azanediyl) dihexanoate

[0427] To a solution of compound 36-2 (360 mg, 355 μmol, 1 eq) in DCM (4 mL) was added TEA (71.9 mg, 711 μmol, 98.9 μL, 2 eq) and MsCl (81.4 mg, 711 μmol, 55.0 μL, 2 eq) at 0℃, and then the reaction mixture was warmed to 25℃ and stirred for 30 minutes. TLC (Dichloromethane: Methanol = 10 / 1, Rf = 0.42) indicated compound 36-2 was consumed complete. The reaction mixture was quenched with H2O (20 mL) and extracted with EtOAc (20 mL *3) , and the combined organic phase was washed with brine (50 mL) , dried over anhydrous Na2SO4, filtered, and concentrated under vacuum to give bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3- ( (methylsulfonyl) oxy) propyl) azanediyl) dihexanoate (380 mg, 348 μmol, 98.0%yield) as yellow oil.

[0428] To a solution of bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3- ( (methylsulfonyl) oxy) propyl) azanediyl) dihexanoate (380 mg, 348 μmol, 1eq) and 4-aminopyrimidin-2 (1H) -one (46.4 mg, 418 μmol, 1.2 eq) in MeCN (5 mL) was added Cs2CO3 (227 mg, 696 μmol, 2 eq) . Then the reaction mixture was warmed to 80℃ and stirred for 12 hours. TLC (Dichloromethane: Methanol= 10 / 1, Rf = 0.25) indicated compound cy-1-3 was consumed complete. The reaction mixture was quenched with H2O (20 mL) and extracted with EtOAc (20 mL *3) , and the combined organic phase was washed with brine (50 mL) , dried over anhydrous Na2SO4, filtered, and concentrated under vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～6%Methanol / Dichloromethane gradient @15 mL / min) to give Compound 36 (130 mg, 117 μmol, 33.75%yield) as yellow oil. 1H NMR 400 MHz CDCl3 δ 7.29-7.61 (m, 1 H) , 5.65-5.80 (m, 1H) , 4.54-4.66 (m, 2H) , 4.15 (s, 4H) , 3.78-4.02 (m, 2H) , 3.55-3.69 (m, 4H) , 3.41-3.52 (m, 4H) , 2.82-3.14 (m, 2H) , 2.27-2.50 (m, 6H) , 1.88-1.98 (m, 4H) , 1.45-1.72 (m, 22H) , 1.21-1.43 (m, 22H) , 1.15 (d, J = 5.36 Hz, 12H) , 0.76-0.95 (m, 36H) .

[0429] Synthesis of Compound 37: bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (2- (2- (2- (4-amino-2-oxopyrimidin-1 (2H) -yl) ethoxy) ethoxy) ethyl) azanediyl) dihexanoate

[0430] To a solution of Compound 29 (500 mg, 460 μmol, 1 eq) in DCM (5 mL) was added TEA (93.1 mg, 920 μmol, 128 μL, 2eq) and MsCl (105 mg, 920 μmol, 71.2 μL, 2 eq) at 0℃, and then the reaction mixture was warmed to 25℃ and stirred for 30 minutes. TLC (Dichloromethane: Methanol = 10 / 1, Rf = 0.42) indicated Compound 29 was consumed complete. The reaction mixture was quenched with H2O (20 mL) and extracted with EtOAc (20 mL *3) , and the combined organic phase was washed with brine (50 mL) , dried over anhydrous Na2SO4, filtered, and concentrated under vacuum to give bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (2- (2- (2- ( (methylsulfonyl) oxy) ethoxy) ethoxy) ethyl) azanediyl) dihexanoate (460 mg, 394 μmol, 85.8%yield) as yellow oil.

[0431] To a solution of bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (2- (2- (2- ( (methylsulfonyl) oxy) ethoxy) ethoxy) ethyl) azanediyl) dihexanoate (460 mg, 394 μmol, 1 eq) and 4-aminopyrimidin-2 (1H) -one (52.6 mg, 473 μmol, 1.2 eq) in MeCN (5 mL) was added Cs2CO3 (257 mg, 789 μmol, 2 eq) . Then the reaction mixture was warmed to 80℃ and stirred for 12 hours. TLC (Dichloromethane: Methanol= 10 / 1, Rf = 0.12) indicated bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (2- (2- (2- ( (methylsulfonyl) oxy) ethoxy) ethoxy) ethyl) azanediyl) dihexanoate was consumed complete. The reaction mixture was quenched with H2O (20 mL) and extracted with EtOAc (20 mL *3) , and the combined organic phase was washed with brine (50 mL) , dried over anhydrous Na2SO4, filtered, and concentrated under vacuum. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～6%Methanol / Dichloromethane gradient @15 mL / min) to give Compound 37 (200 mg, 169 μmol, 42.9%yield) as yellow oil. 1H NMR 400 MHz, CDCl3 δ 7.44-7.53 (m, 1H) , 6.76-7.07 (m, 2H) , 5.59 (dd, J = 1.42, 7.12 Hz, 1H) , 4.47-4.57 (m, 2H) , 4.02 (t, J = 6.32 Hz, 4H) , 3.74-3.78 (m, 1H) , 3.37-3.56 (m, 14H) , 3.31 (s, 7H) , 2.26 (t, J = 7.19 Hz, 4H) , 1.79-1.85 (m, 4H) , 1.43-1.55 (m, 16H) , 1.17-1.38 (m, 24H) , 1.01-1.17 (m, 14H) , 0.84 (d, J = 6.64 Hz, 36 H) .

[0432] Synthesis of Compound 38: 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (5- (dodecyloxy) -5-oxopentyl) (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0433] To a solution of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (0.69 g, 1.30 mmol, 1.0 eq) and dodecyl 5-bromopentanoate (455 mg, 1.30 mmol, 12.3 uL, 1.0 eq) in EtOH (7 mL) was added DIEA (337 mg, 2.60 mmol, 454 uL, 2.0 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 48 hours. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to EtOAc / MeOH = 5 / 1) to give Compound 38 (375 mg, 469 umol, 36.0%yield, 100%purity) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.59 (t, J = 6.4 Hz, 1H) , 4.14 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 3.59-3.66 (m, 2H) , 3.42-3.55 (m, 4H) , 2.57 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.44-2.49 (m, 4H) , 2.28-2.34 (m, 4H) , 1.94 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 1.48-4.65 (m, 17H) , 1.25-1.36 (m, 29H) , 1.12-1.17 (m, 6H) , 0.86-0.90 (m, 21H) .

[0434] Synthesis of Compound 39: 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) (6-oxo-6- (undecyloxy) hexyl) amino) hexanoate

[0435] To a solution of undecyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (500 mg, 1.52 mmol, 1.0 eq) and 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (834 mg, 1.52 mmol, 1.0 eq) in EtOH (10 mL) was added DIEA (392 mg, 3.03 mmol, 529 uL, 2.0 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 48 hours. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to EtOAc / MeOH = 5 / 1) to give compound 39 (330 mg, 413 umol, 27.2%yield, 100%purity) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.15 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 3.54-3.65 (m, 4H) , 3.44-3.49 (m, 2H) , 2.60 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.48 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H) , 1.95 (q, J = 6.4 Hz, 2H) , 1.46-1.68 (m, 17H) , 1.27-1.36 (m, 29H) , 1.08-1.17 (m, 6H) , 0.86-0.90 (m, 21H) .

[0436] Synthesis of Compound 40: 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (6- ( (3-ethylheptyl) oxy) -6-oxohexyl) (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0437] Synthesis of 3-ethylheptyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0438] To a solution of 3-ethylheptan-1-ol (9.14 g, 63.4 mmol) and 6-bromohexanoic acid (18.5 g, 95.0 mmol) in CH2Cl2 (55.0 mL) was added EDCI (18.2 g, 95.0 mmol) and DMAP (1.55 g, 12.7 mmol) . The mixture was stirred at 20 ℃ for 12 hours. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate=10: 1, start material: Rf=0.18; product: Rf= 0.63) indicated the 3-ethylheptan-1-ol was consumed complete. The residue was diluted with water (30 mL) and extracted with CH2Cl2 (30 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (30 mL *3) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether: Ethyl acetate=80 / 1 to 60 / 1) . 3-ethylheptyl 6-bromohexanoate (14.1 g, 43.9 mmol, 69.3%yield) was obtained as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.10 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.41 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.32 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 1.85-1.92 (m, 2H) , 1.62-1.70 (m, 2H) , 1.56-1.61 (m, 2H) , 1.44-1.53 (m, 2H) , 1.23-1.40 (m, 9H) , 0.84-0.91 (m, 6H) .

[0439] To a solution of 3-ethylheptyl 6-bromohexanoate (8.00 g, 24.9 mmol) in EtOH (160 mL) was added 2-aminoethanol (45.6 g, 745 mmol, 45.1 mL) . The mixture was stirred at 75 ℃ for 1 hour. The residue was diluted with water (50 mL) and extracted with EtOAc (50 mL *3 mL) . The combined organic layers were washed with brine (50 *3 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. Without purification, 3-ethylheptyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (7.35 g, crude) was obtained as colorless oil.

[0440] Synthesis of Compound 40

[0441] To a solution of compound 3-ethylheptyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (500 mg, 1.66 mmol) and 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (912 mg, 1.66 mmol) in EtOH (5.00 mL) was added DIEA (322 mg, 2.49 mmol, 433 μL) . The mixture was stirred at 90 ℃ for 24 hours. TLC (Dichloromethane: Methanol=10: 1, start material: Rf= 0.15; product: Rf= 0.55) indicated the compound compound 3-ethylheptyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate was consumed complete. The residue was diluted with water (5 mL) and extracted with EtOAc (10 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (10 mL *3) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Dichloromethane : Methanol=1 / 0 to 40 / 1) . Compound 40 (240 mg, 304 μmol, 18.3%yield, 97.6%purity) was obtained as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.59 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.06-4.16 (m, 4H) , 3.69-3.85 (m, 2H) , 3.56-3.66 (m, 2H) , 3.40-3.51 (m, 2H) , 2.72-2.92 (m, 5H) , 2.31 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 1.94 (m, 2H) , 1.45-1.76 (m, 17H) , 1.21-1.43 (m, 22H) , 1.08-1.18 (m, 6H) , 0.83-0.92 (m, 24H) .

[0442] Synthesis of Compound 41: 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (6- ( (3-butylheptyl) oxy) -6-oxohexyl) (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0443] Compound 41 was prepared analogously to Compound 40 starting with 3-butylheptyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate. Compound 41 was obtained as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.59 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 3.99-4.23 (m, 4H) , 3.53-3.69 (m, 4H) , 3.37-3.52 (m, 3H) , 2.45-2.66 (m, 5H) , 2.26-2.34 (m, 4H) , 1.91-1.99 (m, 2H) , 1.45-1.69 (m, 16H) , 1.16-1.44 (m, 26H) , 1.01-1.16 (m, 6H) , 0.82-0.92 (m, 24H) .

[0444] Synthesis of Compound 42: 3-methyloctyl 8- ( (6- (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0445] Compound 42 was prepared analogously to Compound 40 using 3-ethylheptan-1-ol instead of 3-methylhexan-1-ol. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.60 (t, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.15 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 4.10 (t, J = 3.2 Hz, 2H) , 3.42-3.67 (m, 6H) , 2.58 (brs, 2H) , 2.45-2.46 (m, 4H) , 2.28-2.33 (m, 4H) , 1.93-1.98 (m, 2H) , 1.27-1.64 (m, 44H) , 1.10-1.17 (m, 6H) , 0.85-0.92 (m, 24H) .

[0446] Synthesis of Compound 43: 3-butylheptyl 8- ( (6- (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0447] Compound 43 was prepared analogously to Compound 40 starting with 3-butylheptyl 8- ( (2-hydroxyethyl) amino) octanoate. Compound 43 was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.60 (t, J = 6.0 Hz, 1 H) , 4.07 -4.16 (m, 4 H) , 3.43 -3.65 (m, 6 H) , 2.56 -2.58 (m, 2 H) , 2.42 -2.49 (m, 4 H) , 2.27 -2.32 (m, 4 H) , 1.92 -1.97 (m, 2 H) , 1.06 -1.74 (m, 57 H) , 0.86 -0.91 (m, 24 H) .

[0448] Synthesis of Compound 44: 3, 7-dimethyloctyl 8- ( (6- (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0449] Compound 44 was prepared analogously to Compound 40 but using 3, 7-dimethyloctan-1-ol instead of 3-methylhexan-1-ol. Compound 44 was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 4.59 (t, J = 5.6 Hz, 1 H) , 4.09 -4.16 (m, 4 H) , 3.41 -3.66 (m, 6 H) , 2.56 -2.59 (m, 2 H) , 2.44 -2.45 (m, 4 H) , 2.27 -2.32 (m, 4 H) , 1.92 -1.97 (m, 2 H) , 1.01 -1.80 (m, 49 H) , 0.77 -0.91 (m, 27 H) .

[0450] Synthesis of Compound 45: 3, 3-dipropoxypropyl 8- ( (6- (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propoxy) -6-oxohexyl) (2-hydroxyethyl) amino) octanoate

[0451] Synthesis of 3, 3-dipropoxypropan-1-ol

[0452] To a solution of ethyl 3, 3-dipropoxypropanoate (3.40 g, 15.6 mmol, 1.0 eq) in THF (34.0 mL) was added LAH (650 mg, 17.1 mmol, 1.1 eq) in portions during a period of 10 minutes with stirring at 0 ℃ under N2, the reaction mixture considerable heat is developed during the reaction and a vigorous evolution of gas sets in at about 0 ℃. The reaction mixture was allowed to stir for 2 hours at 20 ℃. The reaction was cooled to 0℃, water (0.65 mL) was dropped in the reaction solution under N2 and created a lot of bubbles, then 15%aq. NaOH (0.65 mL) was added dropwise slowly at 0 ℃; after 5minutes, water (1.95 mL) was dropped the reaction solution at 0℃, then Na2SO4 added the mixture and warmed to 25 ℃ stirred 15 minutes. The mixture was filtered and the filter cake concentrated under reduced pressure to give a residue. 3, 3-dipropoxypropan-1-ol (2.50 g, crude) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.67 (t, J = 5.2 Hz, 1 H) , 3.73 -3.76 (m, 2 H) , 3.58 -3.64 (m, 2 H) , 3.40 -3.45 (m, 2 H) , 1.85 -1.92 (m, 2 H) , 1.57 -1.66 (m, 4 H) , 0.94 (t, J = 7.6 Hz, 6 H) .

[0453] Synthesis of 3, 3-dipropoxypropyl 8-bromooctanoate

[0454] A 100 mL three-necked round bottom flask equipped with magnetic stirrer, addition funnel and thermometer. To a solution of 3, 3-dipropoxypropan-1-ol (2.50 g, 14.2 mmol, 1.0 eq) and 8-bromooctanoic acid (4.75 g, 21.3 mmol, 1.5 eq) in DCM (15.0 mL) was added EDCI (5.44 g, 28.4 mmol, 2.0 eq) and DMAP (347 mg, 2.84 mmol, 0.2 eq) . The mixture was stirred at 20 ℃for 12 hours. The residue was diluted with water (20.0 mL) and extracted with EtOAc (30.0 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether: Ethyl acetate=15 / 1 to 10 / 1) . 3, 3-dipropoxypropyl 8-bromooctanoate (4.50 g, 11.8 mmol, 83.2%yield) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.61 (t, J = 6.00 Hz, 1 H) , 4.16 (t, J = 6.4Hz, 2 H) , 3.53 -3.59 (m, 2 H) , 3.37 -3.42 (m, 4 H) , 2.30 (t, J = 7.2 Hz, 2 H) , 1.93 -1.98 (m, 2 H) , 1.84 -1.87 (m, 2 H) , 1.55 -1.64 (m, 7 H) , 1.42 -1.44 (m, 2 H) , 1.32 -1.35 (m, 4 H) , 0.94 (t, J = 7.6 Hz, 6 H) .

[0455] Synthesis of Compound 45

[0456] A 40 mL seal tube with magnetic stirrer, addition funnel and thermometer. To a solution of 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (0.80 g, 1.51 mmol, 1.0 eq) and 3, 3-dipropoxypropyl 8-bromooctanoate (691 mg, 1.81 mmol, 1.2 eq) in EtOH (8.00 mL) was added DIEA (234 mg, 1.81 mmol, 316 μL, 1.2 eq) . The mixture was stirred at 90 ℃ for 12 hours. The residue was diluted with water (5.00 mL) and extracted with EtOAc (10.0 mL*3) . The combined organic layers were washed with brine (5.00 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether: Ethyl acetate=1 / 1 to 0 / 1) . Compound 45 (0.50 g, 602 μmol, 39.9%yield, 100%purity) was obtained as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.58 -4.63 (m, 2 H) , 4.13 -4.17 (m, 4 H) , 3.54 -3.66 (m, 6 H) , 3.37 -3.50 (m, 4 H) , 2.37 -2.70 (m, 6 H) , 2.28 -2.32 (m, 4 H) , 1.92 -1.98 (m, 4 H) , 1.46 -1.68 (m, 20 H) , 1.19 -1.41 (m, 19 H) , 1.08 -1.19 (m, 6 H) , 0.94 (t, J = 7.6 Hz, 6 H) , 0.86 -0.89 (m, 18 H) .

[0457] Synthesis of Compound 46: 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6- ( (6- (3, 3-bis (isopentyloxy) propoxy) -6-oxohexyl) (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0458] Synthesis of 3, 3-bis (isopentyloxy) propan-1-ol

[0459] To a solution of ethyl propiolate (5.00 g, 50.9 mmol, 5.00 mL, 1.0 eq) and 3-methylbutan-1-ol (22.4 g, 254 mmol, 27.7 mL) in toluene (30 mL) was added PtCl2 (271 mg, 1.02 mmol) at 25℃. Then the mixture was stirred at 80℃ for 24 hours under N2 atmosphere. The reaction solution was cooled to 25 ℃. Then the mixture was filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 80 g Silica Flash Column, Eluent of 0～2%Ethyl acetate / Petroleum ether gradient @50 mL / min) to give ethyl 3, 3-bis (isopentyloxy) propanoate (6.80 g, 48.6%yield) as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.91-4.97 (m, 1H) , 4.15 (dd, J =3.60 Hz, 7.20 Hz, 2H) , 3.58-3.68 (m, 2H) , 3.46-3.55 (m, 2H) , 2.66 (d, J = 5.88 Hz, 2H) , 1.61-1.75 (m, 2H) , 1.38-1.49 (m, 4H) , 1.24-1.29 (m, 3H) , 0.90 (d, J = 6.72 Hz, 12H) .

[0460] To a solution of 3, 3-bis (isopentyloxy) propanoate (1.00 g, 3.64 mmol in THF (10 mL) was added dropwise LAH (2.5 M, 1.60 mL) at 0 ℃ under N2 atmosphere. Then the reaction mixture was stirred at 25℃ for 3 hours. The reaction mixture was cooled to 0 ℃, H2O (0.15 mL) was dropped in the reaction solution under N2 and created a lot of bubbles, then 15%aq. NaOH (0.15 mL) was added dropwise slowly at 0 ℃; After 5 minutes, H2O (0.45 mL) was dropped the reaction solution at 0 ℃, then Na2SO4 added the mixture and warmed to 25 ℃ stirred 15 minutes. The mixture was filtered and the filtrate concentrated under reduced pressure to give a residue 3, 3-bis (isopentyloxy) propan-1-ol (790 mg, 93.2%yield) as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.63-4.68 (m, 1H) , 3.74 (t, J = 5.44 Hz, 2H) , 3.62-3.71 (m, 2H) , 3.44-3.52 (m, 2H) , 2.41-2.69 (m, 1H) , 1.84-1.94 (m, 2H) , 1.61-1.76 (m, 2H) , 1.44-1.52 (m, 4H) , 0.89-0.96 (m, 12H) .

[0461] Synthesis of 3, 3-bis (isopentyloxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0462] To a solution of 3, 3-bis (isopentyloxy) propan-1-ol (790 mg, 3.40 mmol) and 6-bromohexanoic acid (994 mg, 5.10 mmol) in DCM (5.0 mL) was added EDCI (1.30 g, 6.80 mmol) and DMAP (83.07 mg, 679 μmol) . The mixture was stirred at 20 ℃ for 1.5 hours. The residue was diluted with water (20 mL) and extracted with DCM (25 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (20 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～2%Ethyl acetate / Petroleum ether gradient @15 mL / min) to give 3, 3-bis (isopentyloxy) propyl 6-bromohexanoate (890 mg, 63.9%yield) as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.56-4.63 (m, 1H) , 4.15 (t, J = 6.52 Hz, 2H) , 3.58-3.68 (m, 2H) , 3.39-3.50 (m, 4H) , 2.33 (t, J = 7.44 Hz, 2H) , 1.85-1.98 (m, 4H) , 1.63-1.75 (m, 4H) , 1.41-1.52 (m, 6H) , 0.91 (dd, J = 1.16 Hz, 6.68 Hz, 12H) .

[0463] To a solution of 3, 3-bis (isopentyloxy) propyl 6-bromohexanoate (890 mg, 2.17 mmol) in EtOH (30 mL) was added 2-aminoethanol (1.33 g, 21.7 mmol, 1.31 mL) . The mixture was stirred at 75 ℃ for 2 hours. TLC (Petroleum ether: Ethyl acetate=10: 1, Rf = 0.04) indicated the 3, 3-bis (isopentyloxy) propyl 6-bromohexanoate was consumed complete. The residue was diluted with water (30 mL) and extracted with EtOAc (20 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (20 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give 3, 3-bis (isopentyloxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (760 mg, 89.7%yield) as colorless oil.

[0464] Synthesis of Compound 46

[0465] To a solution of 3, 3-bis (isopentyloxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (324 mg, 833 μmol) and 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloctyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (550 mg, 1.00 mmol) in EtOH (3 mL) was added DIEA (161 mg, 1.25 mmol, 217 μL) . The mixture was stirred at 90 ℃ for 48 hours. The residue was diluted with water (20 mL) and extracted with EtOAc (20 mL *3) . The combined organic layers were washed with brine (20 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～4%Dichloromethane: Methanol gradient @15 mL / min) . Compound 46 (220 mg, 244 μmol, 38.2%yield, 95.46%purity) was obtained as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.59 (t, J =5.6 Hz, 2H) , 4.14 (t, J=6.6 Hz, 4H) , 3.67-3.80 (m, 2H) , 3.56-3.67 (m, 4H) , 3.41-3.51 (m, 4H) , 2.65-2.88 (m, 5H) , 2.32 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 1.95 (q, J = 6.2 Hz, 4H) 1.44-1.75 (m, 20H) , 1.18-1.43 (m, 14H) 1.09-1.17 (m, 6H) , 0.81-0.97 (m, 30H) .

[0466] Synthesis of Compound 47: 3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloct-6-en-1-yl) oxy) propyl 6- ( (5- (dodecyloxy) -5-oxopentyl) (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0467] Compound 47 was prepared analogously to Compound 16 starting from 3, 7-dimethyloct-6-en-1-ol. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.10 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 4.60 (t, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.14 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 3.59-3.65 (m, 2H) , 3.43-3.55 (m, 4H) , 2.58 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.46 (q, J = 7.2 Hz, 4H) , 2.31 (q, J = 7.2 Hz, 4H) , 1.92-2.06 (m, 6H) , 1.56-1.71 (m, 22H) , 1.27-1.50 (m, 29H) , 1.12-1.18 (m, 3H) , 0.87-0.91 (m, 9H) .

[0468] Synthesis of Compound 48: bis (3, 3-bis ( (3, 7-dimethyloct-6-en-1-yl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (2-hydroxyethyl) azanediyl) dihexanoate

[0469] Compound 48 was prepared analogously to Compound 22 starting from 3, 7-dimethyloct-6-en-1-ol. Compound 48 (98.4%purity) was obtained as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz CDCl3) δ 5.08-5.12 (m, 1H) , 4.59 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.14 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 3.59-3.65 (m, 3H) , 3.42-3.49 (m, 2H) , 2.92 (brs, 2H) , 2.67 (t, J = 5.2 Hz, 1H) , 2.56 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 2.29-2.33 (m, 2H) , 1.92-2.05 (m, 8H) , 1.59-1.71 (m, 19H) , 1.51-1.57 (m, 4H) , 1.30-1.41 (m, 9H) , 1.14-1.18 (m, 3H) , 0.89-0.91 (m, 7H) .

[0470] Synthesis of Compound 49: 3, 3-bis ( ( (E) -3, 7-dimethylocta-2, 6-dien-1-yl) oxy) propyl 6- ( (5- (dodecyloxy) -5-oxopentyl) (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0471] Synthesis of 3, 3-bis ( ( (E) -3, 7-dimethylocta-2, 6-dien-1-yl) oxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate

[0472] To a solution of 3, 3-bis ( ( (E) -3, 7-dimethylocta-2, 6-dien-1-yl) oxy) propan-1-ol (2.6 g, 7.13 mmol, 2.14 mL, 1.0 eq) in DCM (18 mL) was added 6-bromohexanoic acid (2.09 g, 10.7 mmol, 1.5 eq) , EDCI (2.05 g, 10.7 mmol, 1.5 eq) and DMAP (174 mg, 1.43 mmol, 0.2 eq) at 0℃, then the mixture was stirred at 25℃ for 1.5 hours. The reaction mixture was poured into water (20 mL) and extracted with EtOAc (20 mL, 10 mL, 10 mL) , The combined organic layers were washed with brine (10 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 100 / 1 to 0 / 1) to give 3, 3-bis ( ( (E) -3, 7-dimethylocta-2, 6-dien-1-yl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (1.9 g, 3.51 mmol, 49.1%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.34-5.38 (m, 2H) , 5.08-5.12 (m, 2H) , 4.71 (t, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.12-4.19 (m, 4H) , 4.03-4.07 (m, 2H) , 3.41 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.97-2.14 (m, 11H) , 1.84-1.92 (m, 2H) , 1.68-1.69 (m, 12H) , 1.61 (s, 6H) , 1.46-1.52 (m, 2H) , 1.13-1.37 (m, 2H) , 0.84-0.91 (m, 2H) .

[0473] To a solution of 3, 3-bis ( ( (E) -3, 7-dimethylocta-2, 6-dien-1-yl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (1.8 g, 3.32 mmol, 1.0 eq) and 2-aminoethanol (2.03 g, 33.2 mmol, 2.01 mL, 10 eq) in EtOH (18 mL) was added at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 12 hours. The reaction mixture was poured into water (10 mL) and extracted with EtOAc (10 mL, 5 mL, 3 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to DCM / MeOH = 10 / 1) to give 3, 3-bis ( ( (E) -3, 7-dimethylocta-2, 6-dien-1-yl) oxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (0.94 g, 1.80 mmol, 54.2%yield) as a colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.35 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 5.10 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 4.70 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.11-4.18 (m, 4H) , 4.02-4.07 (m, 2H) , 3.77 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 3.24 (brs, 3H) , 2.91 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.77 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.32 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.99-2.14 (m, 11H) , 1.61-1.68 (m, 22H) , 1.36-1.45 (m, 2H) .

[0474] Synthesis of Compound 49

[0475] To a solution of 3, 3-bis ( ( (E) -3, 7-dimethylocta-2, 6-dien-1-yl) oxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (0.84 g, 1.61 mmol, 1.0 eq) and dodecyl 5-bromopentanoate (562 mg, 1.61 mmol, 12.3 uL, 1.0 eq) in EtOH (8 mL) was added DIEA (416 mg, 3.22 mmol, 561 uL, 2.0 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 48 hours. The reaction mixture was poured into water (5 mL) and extracted with EtOAc (5 mL, 3 mL, 2 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to Ethyl acetate  / MeOH = 5 / 1) to give Compound 49 (370 mg, 464 umol, 28.8%yield, 99.1%purity) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.35 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 5.10 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 4.71 (t, J = 6.0 Hz, 1H) , 4.12-4.18 (m, 4H) , 4.02-4.08 (m, 4H) , 3.53 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 2.58 (t, J = 4.4 Hz, 2H) , 2.46 (q, J = 7.2 Hz, 4H) , 2.31 (q, J = 7.6 Hz, 4H) , 1.97-2.14 (m, 10H) , 1.61-1.68 (m, 24H) , 1.43-1.52 (m, 5H) , 1.27-1.33 (m, 20H) 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H) .

[0476] Synthesis of Compound 50: bis (3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (2-hydroxyethyl) azanediyl) dihexanoate

[0477] Synthesis of 3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propan-1-ol

[0478] To a solution of 3, 5, 5-trimethylhexan-1-ol (22.8 g, 158 mmol, 24.9 mL, 3.0 eq) in ethyl 3, 3-diethoxypropanoate (10 g, 52.6 mmol, 10.2 mL, 1.0 eq) was added KHSO4 (358 mg, 2.63 mmol, 154 uL, 0.05 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 80℃ for 12 hours. TLC (Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1, product Rf = 0.50) showed the reaction was completed. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 100 / 1 to 0 / 1) to give ethyl 3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propanoate (8.5 g, 22.0 mmol, 41.8%yield) as a colorless oil. 1HNMR 400 MHz CDCl3 δ 4.94 (t, J = 5.2 Hz, 1H) , 4.10-4.20 (m, 2H) , 3.61-3.65 (m, 2H) , 3.45-3.49 (m, 2H) , 2.64-2.66 (m, 2H) , 1.59-1.68 (m, 5H) , 1.37-1.42 (m, 2H) , 1.20-1.29 (m, 6H) , 1.04-1.09 (m, 3H) , 0.89-0.96 (m, 29H) .

[0479] A suspension of LiAlH4 (1.00 g, 26.4 mmol, 1.2 eq) in THF (10 mL) at 0℃, a solution of ethyl 3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propanoate (8.5 g, 22.0 mmol, 1.0 eq) in THF (45 mL) was dropped added to the mixture dropwise at 0℃ for 20 minutes under N2. Then the reaction solution was warmed 25℃ and stirred for 3 hours. TLC (Petroleum ether / Ethyl acetate = 5 / 1, product Rf = 0.20) showed the reaction was completed. The reaction was cooled to 0℃, water (1 mL) was dropped in the reaction solution under N2 and created a lot of bubbles, then 15%aq. NaOH (1 mL) was added dropwise slowly at 0℃; after 5minutes, water (3 mL) was dropped the reaction solution at 0℃, then Na2SO4 added the mixture and warmed to 25℃ stirred 15 minutes. The mixture was filtered and the filter cake concentrated under reduced pressure to give 3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propan-1-ol (8.1 g, crude) as a colorless oil. 1HNMR 400 MHz CDCl3 δ 4.66 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 3.75 (t, J = 5.2 Hz, 3H) , 3.65-3.69 (m, 3H) , 3.45-3.51 (m, 2H) , 1.84-1.92 (m, 2H) , 1.56-1.66 (m, 5H) , 1.41-1.44 (m, 3H) , 1.21-1.27 (m, 3H) , 1.05-1.11 (m, 3H) , 0.90-0.96 (m, 29H) .

[0480] Synthesis of 3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate

[0481] To a solution of 3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propan-1-ol (8.1 g, 23.5 mmol, 2.14 mL, 1.0 eq) in DCM (55 mL) was added 6-bromohexanoic acid (6.88 g, 35.3 mmol, 1.5 eq) , EDCI (6.76 g, 35.3 mmol, 1.5 eq) and DMAP (574 mg, 4.70 mmol, 0.2 eq) at 0℃, then the mixture was stirred at 25℃ for 1.5 hours. TLC (Petroleum ether / Ethyl acetate = 5 / 1, product Rf = 0.45) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (100 mL) and extracted with EtOAc (100 mL, 50 mL, 30 mL) , The combined organic layers were washed with brine (30 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 100 / 1 to 0 / 1) to give 3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (6.9 g, 13.2 mmol, 56.2%yield) as a colorless oil. 1HNMR 400 MHz CDCl3 δ4.60 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.16 (t, J = 6.8 Hz, 2H) , 3.59-3.63 (m, 2H) , 3.40-3.46 (m, 4H) , 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.8-1.97 (m, 4H) , 1.40-1.68 (m, 12H) , 1.21-1.27 (m, 3H) , 1.05-1.10 (m, 2H) , 0.90-0.95 (m, 23H) .

[0482] Synthesis of Compound 50

[0483] To a solution of 3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (1.0 g, 1.92 mmol, 1.0 eq) and 2-aminoethanol (1.17 g, 19.2 mmol, 1.16 mL, 10 eq) in EtOH (10 mL) was added at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 2 hours. TLC (Dichloromethane / Methanol = 10 / 1, product Rf = 0.20) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (10 mL) and extracted with EtOAc (10 mL, 5 mL, 3 mL) , The combined organic layers were washed with brine (3 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give 3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (0.96 g, crude) as a colorless oil.

[0484] To a solution of 3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl 6- ( (2-hydroxyethyl) amino) hexanoate (0.96 g, 1.91 mmol, 1.0 eq) and 3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (998 mg, 1.91 mmol, 1.0 eq) in EtOH (10 mL) was added DIEA (495 mg, 3.83 mmol, 666 uL, 2.0 eq) at 25℃, then the mixture was stirred at 90℃ for 12 hours. TLC (Dichloromethane / Methanol = 10 / 1, product Rf = 0.35) showed the reaction was completed. The reaction mixture was poured into water (50 mL) and extracted with EtOAc (50 mL, 30 mL, 20 mL) , The combined organic layers were washed with brine (20 mL) , dried over Na2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by column chromatography (SiO2, Petroleum ether / Ethyl acetate = 10 / 1 to EtOAc / MeOH = 5 / 1) to give Compound 50 (120 mg, 127 μmol, 6.66%yield, 100%purity) as a yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.60 (t, J = 5.6 Hz, 2H) , 4.15 (t, J = 6.8 Hz, 4H) , 3.68 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 3.57-3.63 (m, 4H) , 3.42-3.47 (m, 4H) , 2.76 (t, J = 4.8 Hz, 2H) , 2.65 (t, J =7.2 Hz, 4H) , 2.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H) , 1.95 (q, J = 6.4 Hz, 4H) , 1.58-1.69 (m, 16H) , 1.33-1.46 (m, 9H) , 1.21-1.26 (m, 4H) , 1.05-1.10 (m, 4H) , 0.90-0.94 (m, 46H) .

[0485] Synthesis of Compound 51: bis (3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3- ( (2- (methylamino) -3, 4-dioxocyclobut-1-en-1-yl) amino) propyl) azanediyl) dihexanoate

[0486] Synthesis of bis (3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) azanediyl) dihexanoate

[0487] A mixture of 3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (500 mg, 959 μmol) in EtOH (4 mL) was added benzyl (3-aminopropyl) carbamate (1.17 g, 4.79 mmol) and DIEA (743 mg, 5.75 mmol) . The suspension was degassed and purged with N2 for 3 times. The mixture was stirred at 75 ℃ for 12 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.31) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (5.00 mL) and extracted with EtOAc (10.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～10%MeOH / CH2Cl2 gradient @12 mL / min) to give 3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl 6- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) amino) hexanoate (390 mg, 59.1%yield) as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.37-7.29 (m, 5H) , 5.58 (s, 1H) , 5.10 (s, 2H) , 4.59 (t, J = 5.6 Hz, 1H) , 4.15 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 3.69-3.54 (m, 2H) , 3.50-3.39 (m, 2H) , 3.36-3.24 (m, 2H) , 2.72 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 2.61 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 2.29 (t, J = 7.6 Hz, 2H) , 1.94 (dd, J = 6.4 Hz, 12.4 Hz, 2H) , 1.74 (t, J = 6.4 Hz, 2H) , 1.69-1.49 (m, 9H) , 1.45-1.32 (m, 4H) , 1.25 (d, J = 3.2 Hz, 1H) , 1.21 (d, J = 3.2 Hz, 1H) , 1.09 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 1.06 (d, J = 6.0 Hz, 1H) , 0.94 (dd, J = 1.2 Hz, 6.4 Hz, 6H) , 0.90 (s, 18H) .

[0488] To a solution of 3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl 6- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) amino) hexanoate (390 mg, 601 μmol) in EtOH (4 mL) was added 3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl 6-bromohexanoate (376 mg, 721 μmol) and DIEA (117 mg, 901 μmol, 157 μL) under N2 atmosphere. The suspension was degassed and purged with N2 for 3 times. The mixture was stirred at 90 ℃ for 24 hours. LCMS (EB10648-15-P1A) showed the reaction was complete. The residue was diluted with water (10.0 mL) and extracted with EtOAc (10.0 mL *2) . The combined organic layers were washed with brine (10.0 mL) , dried over, filtered and concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～10%MeOH / CH2Cl2 gradient @12 mL / min) to give bis (3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) azanediyl) dihexanoate (450 mg, 68.7%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.46-7.28 (m, 5H) , 5.10 (s, 2H) , 4.59 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 4.15 (t, J = 6.4 Hz, 4H) , 3.66-3.54 (m, 4H) , 3.48-3.39 (m, 4H) , 3.32 (s, 2H) , 3.25-2.75 (m, 4H) , 2.58-2.22 (m, 6H) , 2.05 (s, 2H) , 1.95 (dd, J = 6.4 Hz, 12.4 Hz, 4H) , 1.71-1.61 (m, 10H) , 1.60-1.53 (m, 5H) , 1.48-1.30 (m, 9H) , 1.24 (d, J = 3.2 Hz, 2H) , 1.21 (d, J = 3.2 Hz, 2H) , 1.09 (d, J = 6.0 Hz, 2H) , 1.06 (d, J = 6.0 Hz, 2H) , 0.96-0.92 (m, 12H) , 0.90 (s, 36H) .

[0489] Synthesis of Compound 51

[0490] To a solution of bis (3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3- ( ( (benzyloxy) carbonyl) amino) propyl) azanediyl) dihexanoate (450 mg, 413 μmol) in THF (5 mL) was added Pd / C (45.0 mg, 42.3 μmol, 10%purity) under N2 atmosphere. The suspension was degassed and purged with H2 for 3 times. The mixture was stirred under H2 (15 Psi) at 25 ℃ for 12 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.16) showed the reaction was complete. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give bis (3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3-aminopropyl) azanediyl) dihexanoate (310 mg, 78.6%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.59 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 4.15 (t, J = 6.4 Hz, 4H) , 3.66-3.55 (m, 4H) , 3.51-3.39 (m, 4H) , 2.98 (t, J = 6.0 Hz, 2H) , 2.67 (t, J = 6.0 Hz, 2H) , 2.53 (t, J = 7.2 Hz, 3H) , 2.32 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 1.95 (dd, J = 6.4 Hz, 12.4 Hz, 6H) , 1.88-1.84 (m, 2H) , 1.83-1.75 (m, 4H) , 1.62-1.47 (m, 12H) , 1.45-1.30 (m, 9H) , 1.23 (dd, J = 3.2 Hz, 14.0 Hz, 4H) , 1.08 (dd, J = 6.0 Hz, 14.0 Hz, 4H) , 0.97-0.92 (m, 12H) , 0.90 (s, 36H) .

[0491] To a solution of bis (3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (3-aminopropyl) azanediyl) dihexanoate (310 mg, 324 μmol) in THF (4 mL) was added 3, 4-dimethoxycyclobut-3-ene-1, 2-dione (69.2 mg, 487 μmol) and Methylamine (2 M, 101 mg, 3.24 mmol, 1.62 mL) under N2 atmosphere. The suspension was degassed and purged with N2 for 3 times. The mixture was stirred at 25 ℃ for 21 hours. TLC (CH2Cl2: MeOH = 10 / 1, Rf = 0.43) showed the reaction was complete. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure to give a residue. The residue was purified by flash silica gel chromatography ( 4 g Silica Flash Column, Eluent of 0～10%MeOH / CH2Cl2 gradient @12 mL / min) to give Compound 51 (190 mg, 98.6%purity, 56.8%yield) as yellow oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.59 (t, J = 4.0 Hz, 2H) , 4.15 (t, J = 6.8 Hz, 4H) , 3.72 (s, 2H) , 3.65-3.59 (m, 4H) , 3.50-3.39 (m, 4H) , 3.31 (d, J = 5.2 Hz, 3H) , 3.02-2.74 (m, 5H) , 2.33 (t, J = 7.2 Hz, 4H) , 1.99-1.92 (m, 5H) , 1.72-1.56 (m, 18H) , 1.45-1.35 (m, 8H) , 1.24 (d, J = 2.4 Hz, 2H) , 1.21 (d, J = 2.4 Hz, 2H) , 1.08 (dd, J = 5.6 Hz, 14.0 Hz, 4H) , 0.94 (d, J = 5.2 Hz, 12H) , 0.90 (s, 36H) .

[0492] Synthesis of Compound 52: bis (3, 3-bis ( (3, 5, 5-trimethylhexyl) oxy) propyl) 6, 6'- ( (4- ( (2- (methylamino) -3, 4-dioxocyclobut-1-en-1-yl) amino) butyl) azanediyl) dihexanoate

[0493] Compound 52 was prepared using similar procedure as Compound 51 but using benzyl (4-aminobutyl) carbamate instead of benzyl (3-aminopropyl) carbamate. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.59 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 4.15 (t, J = 6.4 Hz, 4H) , 3.75-3.67 (m, 2H) , 3.65-3.55 (m, 4H) , 3.50-3.40 (m, 4H) , 3.32 (d, J = 4.4 Hz, 3H) , 3.19-3.04 (m, 6H) , 2.34 (t, J = 6.8 Hz, 4H) , 2.04-1.90 (m, 6H) , 1.83-1.74 (m, 6H) , 1.73-1.62 (m, 12H) , 1.47-1.37 (m, 8H) , 1.24 (d, J = 2.8 Hz, 2H) , 1.21 (d, J = 2.8 Hz, 2H) , 1.09 (d, J = 5.6 Hz, 2H) , 1.06 (d, J = 5.2 Hz, 2H) , 0.94 (d, J = 6.4 Hz, 12H) , 0.90 (s, 36H) .

[0494] Example 2. Production of Nanoparticle Compositions

[0495] This example exemplifies the production and characterization of lipid nanoparticles comprising the cationic lipid as synthesized in Example 1. Nanoparticles were prepared by mixing aqueous phase which contains RNA with ethanol phase which contains the lipid components. The two phases were mixed by using a microfluidic mixing process with a SCARM microfludic mixer (Shuogen Tech. co. ) .

[0496] The ethanol phase was prepared by adding (1) an ionizable cationic lipid, specifically a cationic lipid as prepared in Example 1, (2) a neutral lipid, specifically DSPC, (3) a negative phospholipid, specifically DSPG, (4) a steroid, specifically cholesterol and (5) a PEG lipid, specifically DMG-PEG2000 into ethanol.

[0497] RNA was dissolved in 50 mM sodium citrate buffer (pH=4) at concentrations of 0.1 mg / mL. The weight ratio of the RNA or DNA molecules to the ionizable cationic lipid was kept at 1: 10.

[0498] The lipid solution (ethanol phase) was injected at 1 mL / min, and aqueous phase was injected at 3 mL / min into the mixer. The volume ratio of the aqueous phase to the ethanol phase was 3: 1.

[0499] After mixed, the solution with LNP were obtained and subsequently processed by dialysis to remove ethanol and achieve buffer exchange. Dialysis was conducted twice against Tris-HCl Solution (20 mM, pH 7.4) at volumes about 2500 times that of the mixed solution using Dialysis Membranes (Solarbio) with a molecular weight cutoff of 8-14 KD at 4 ℃ overnight. Then 40%sucrose solution was added and the final nanoparticle solution with 8%sucrose were stored at -80 ℃.

[0500] A Zetasizer Nano ZS (BeNano, Bettersize) were used to determine the particle size and the polydispersity index (PDI) of the nanoparticle compositions in PBS or Tris-HCl.

[0501] A QUANT-ITTM RIBOGREEN RNA assay (Shanghai ShineGene Molecular Biotechnology Co., LTD. ) , was used to evaluate the encapsulation of RNA by the nanoparticle composition. The samples were diluted in TE buffer solution (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.4) , and then100 μL of the diluted samples were transferred to a polystyrene 96 well plate. The plate was incubated at a temperature of 40 ℃ for 10 minutes. The RIBOGREEN or PICOGREEN reagent is diluted 1: 200 in TE buffer, and 100 μL of this solution is added to each well. The fluorescence intensity was measured using a microplate reader (Molecular Devices i3max) at an excitation wavelength of, for example, about 488 nm and an emission wavelength of, for example, about 525 nm. The fluorescence values of the reagent blank were subtracted from that of each of the samples and the percentage of free RNA or DNA was determined by dividing the fluorescence intensity of the intact sample (without addition of Triton X-100) by the fluorescence value of the disrupted sample (caused by the addition of Triton X-100) .

[0502] Example 3. Cell staining and Flow cytometry of PBMC

[0503] Cell suspensions obtained after cultured with Nanoparticle Compositions loaded with GFP or tdTomato was incubated with 1 μL FVS620 (mGFP-LNP) or FVS520 (mtdTomato-LNP) for 10 minutes to identify the dead cells. Then, excess LIVE / DEAD Dye were removed by washing the cell pellet with cell staining buffer. Then the cell pellet was resuspended in 100 μL of cell staining buffer and incubated with 6 μL of an antibody cocktail composed of BV650 Mouse Anti-Human CD3 (SK7) , Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Human CD14 (M5E2) , BV421 Mouse Anti-Human CD56 (NCAM16.2 ) , BV510 Mouse Anti-Human HLA-DR (G46-6) , APC Mouse Anti-Human CD11C (B-ly6) and APC-H7 Mouse anti-Human CD45 (2D1) for 15-25 minutes at room temperature to assess the percentage of GFP or tdTomato positive cells within DC (HLA-DR+CD11C+) , Monocyte (CD45+CD14+) , NK (CD56+) and T cells (CD45+CD3+) . Next, excess antibodies were removed by washing the cell pellet with cell staining buffer. Finally, the cell pellet was resuspended in 100 μL of cold cell staining buffer and kept on ice until analysis by flow cytometer. Cells were then analyzed by CytoFLEX (Beckman Coulter) . The resulting data were analyzed by CytExpert to assess the percentage of GFP or tdTomato positive cells within different kind of cells in PBMC.

[0504] Example 4. Intravenous Injections and tissue extraction of C57 mice

[0505] LNPs formulated with tdTomato mRNA were injected IV at a dose of 2 mg / kg. After 24 hours of administration, the mice were deeply anesthetized with 1.25%Tribromoethanol (Lab Animal Technology Develop Co. ) and dissected, 200 μL of whole blood was taken from the vena cava into Heparin Tubes (BD) , followed by collecting the liver and spleen.

[0506] Example 5. Spleen cell isolation, cell staining and flow cytometry

[0507] Spleens excised from C57 mice were grind and finally filtered through a 70-μm cell strainer into a fresh 15 mL tube. The filter was washed with cold PBS prior centrifuging the sample at 500 rpm for 5 minutes twice. The supernatant was removed, and the red blood cells (RBCs) were lysed by resuspending the cell pellet in 1 mL of 1×RBC lysis buffer (eBioscienceTM) and incubating at room temperature for 10 minutes. Following the incubation, the sample was centrifuged at 500 rpm for 5 minutes and wash with PBS for two times. Finally, the RBC free cell pellet was resuspended in 400 μL of cell staining buffer (BD Pharmingen) prior to antibody staining for flow cytometry.

[0508] 40 μL of single-cell suspensions obtained from spleen excised from C57 mice was incubated with 1 μL FVS520 for 10 minutes to identify the dead cells. Then, excess LIVE / DEAD Dye were removed by washing the cell pellet with cell staining buffer. Then the cell pellet was resuspended in 100 μL of cell staining buffer and incubated with 4 μL of an antibody cocktail composed of PE / Cyanine7 anti-mouse CD45.2 Antibody, APC Hamster Anti-Mouse CD3e (145-2C11) , APC-Cy7 Rat Anti-CD11b (M1 / 70) and BV421 Rat Anti-Mouse F4 / 80 (T45-2342) for 15-25 minutes at room temperature to assess the percentage of tdTomato positive cells within T cells (CD45+CD3+) and macrophage (CD45+CD11b+F4 / 80+) . And the cell pellet was resuspended in 100 μL of cell staining buffer and incubated with 3 μL of an antibody cocktail composed of PE / Cyanine7 anti-mouse CD45.2 Antibody, APC-Cy7 Rat Anti-CD11b (M1 / 70) and BV421 Hamster Anti-Mouse CD11c (HL3) for 15-25 minutes at room temperature to assess the percentage of tdTomato positive cells within DC (CD45+CD11b+CD11c+) . Next, excess antibodies were removed by washing the cell pellet with cell staining buffer. Finally, the cell pellet was resuspended in 100 μL of cold cell staining buffer and kept on ice until analysis by flow cytometer. Cells were then analyzed by CytoFLEX (Beckman Coulter) . The resulting data were analyzed by CytExpert to assess the percentage of tdTomato positive cells within each population stained for in the spleens.

[0509] Example 6. Liver cell isolation, cell staining and flow cytometry

[0510] 200 mg Liver was taken and fully cut into a 6 Well Cell Culture Plates, adding 3 mL of liver digestive enzymes which was made of 2 mg / mL Collagenase II (Sangon Biotech, A004174-0001) , 2 mg / mL DNase I (Sangon Biotech, A610099-0001) and 1mg / mL Hyaluronidase (Sangon Biotech, A002594-0300) in DMEM and digested at 37℃ for 1 hour. After digestion, the tissue was gently ground using the inner core of a 5 mL syringe into 15 mL tube and centrifugation at 500g at room temperature for 5minutes. Then, the supernatant was sucked up and the cells were wash with PBS for two times. The supernatant was removed, and the red blood cells (RBCs) were lysed by resuspending the cell pellet in 1 mL of 1× RBC lysis buffer (eBioscienceTM) and incubating at room temperature for 10 minutes. Following the incubation, the sample was centrifuged at 500 rpm for 5 minutes and wash with PBS for two times. Finally, the RBC free cell pellet was resuspended in 1 mL of cell staining buffer (BD Pharmingen) prior to antibody staining for flow cytometry.

[0511] 40 μL of single-cell suspensions obtained from liver excised from C57 mice was incubated with 1 μL FVS520 for 10 minutes to identify the dead cells. Then, excess LIVE / DEAD Dye were removed by washing the cell pellet with cell staining buffer. Then the cell pellet was resuspended in 100 μL of cell staining buffer and incubated with 3 μL of an antibody cocktail composed of PE / Cyanine7 anti-mouse CD45.2 Antibody, Apc Rat Anti-Mouse CD31 (MEC 13.3) and Brilliant Violet 421TN anti-mouse CD68 Antibody for 15-25 minutes at room temperature to assess the percentage of tdTomato positive cells within hepatocyte (CD45-CD31-) . Next, excess antibodies were removed by washing the cell pellet with cell staining buffer. Finally, the cell pellet was resuspended in 100 μL of cold cell staining buffer and kept on ice until analysis by flow cytometer. Cells were then analyzed by CytoFLEX (Beckman Coulter) . The resulting data were analyzed by CytExpert to assess the percentage of tdTomato positive cells within each population stained for in the spleens.

[0512] Example 7. Blood cell isolation, cell staining and flow cytometry

[0513] 100 μL of the blood were incubated with 1 μL FVS520 for 10 minutes to identify the dead cells. Then, the red blood cells (RBCs) were lysed by resuspending the cell pellet in 2 mL of 1× RBC lysis buffer (eBioscienceTN) and incubating at room temperature for 10 minutes. Following the incubation, the sample was centrifuged at 500 rpm for 5 minutes and wash with PBS for two times. Finally, the RBC free cell pellet was resuspended in 100 μL of cell staining buffer (BD Pharmingen) . Then the cells were stained as spleen cells in the following Example 11. Finally, the cells were washed and resuspended in 100 uL of cell staining buffer and analyzed by CytoFLEX flow cytometer.

[0514] Example 8. In vitro transfection in PBMC of LNP composition containing different negative phospholipid

[0515] This example shows the study of transfection and expression efficiency of the GFP mRNA loaded LNPs which composed with ionizable lipid of Compound 25, different negative phospholipid, Cholesterol, and DMG-PEG with mole ratio of 50: 10: 38.5: 1.5 in PBMCs. The LNP formulations were prepared and characterized according to the procedures as described in Example 2.

[0516] Table 2 summarizes particle size and PDI value as determined for the formulations prepared with the lipid compounds of the present application. As shown in Table 2, the choice of Secondary Phospholipid dramatically affected the particle size (e.g., diameter) , and polydispersity index (PDI) of the compositions. The tested LNPs had particle size between approximately 80 nm and 180 nm, polydispersity indices between 0.15 and 0.40, and encapsulation efficiency of about 80%-96%, which is ideal for RNA delivery.

[0517] Table 2. Formulation details and Characteristics of LNPs composition containing different negative phospholipid encapsulated with mGFP

[0518] PBMCs were placed at a density of 1×106 cells in tissue culture 6-well plates with 2 mL of Eagle's Minimum Essential Medium. LNPs containing a total amount of 2000 ng GFP mRNA were added to the wells respectively and cultured for 24 hours. Cells were analyzed by flow cytometry after stained with antibody (Staining method showed in Example 3) to measure GFP fluorescence intensity to determine the expression level in different kind of cells.

[0519] As shown in FIG. 1, LNP with different negative phospholipid have great influence on transfection efficiency in different kind of cells in PBMCs. Among them, LNP composed of DSPG achieved higher GFP expression in DC and monocyte of PBMCs. Next, lipid screen and formulation screen were performed based on DSPG.

[0520] Example 9. In vitro transfection in PBMCs of LNP containing phosphatidylglycerol with different ionizable lipids

[0521] This example shows the study of transfection and expression efficiency of the LNPs composed with different ionizable lipid, DSPG, Cholesterol and DMG-PEG with mole ratio of 50: 10: 38.5: 1.5 and GFP mRNA as payload in PBMCs. The LNP formulations were prepared and characterized according to the procedures as described in Example 2.

[0522] Table 3 summarizes particle size and PDI value as determined for the formulations prepared with the different ionizable lipid. As shown in Table 3, the choice of ionizable lipid dramatically affected the particle size (e.g., diameter) , and polydispersity index (PDI) of the compositions. The tested LNPs had particle size between approximately 90 nm and 150 nm, polydispersity indices between 0.25 and 0.35, and encapsulation efficiency of about 85-95%, which is ideal for RNA delivery.

[0523] Table 3. Formulation details and Characteristics of nanoparticle containing phosphatidylglycerol with different ionizable lipids encapsulated with mGFP

[0524] PBMCs were placed at a density of 1×106 cells in tissue culture 6-well plates with 2 mL of Eagle's Minimum Essential Medium. LNPs containing a total amount of 2000 ng GFP mRNA were added to the wells respectively and cultured for 24 hours. Cells were analyzed by flow cytometry after stained with antibody to measure GFP fluorescence intensity to determine the expression level in different kind of cells.

[0525] As shown in FIG. 2, LNP composed of different ionizable lipid showed different GFP expression levels. Among them, LNP composed of ionizable lipid 47, 22 and 25 achieved higher GFP expression in PBMCs than SM102 and MC3. All of compounds exhibited comparable expression levels of payload mRNA to MC3. But, all of the group of nanoparticle compositions showed APC (DC and Monocyte) target delivery with higher GFP expression and there is barely expression in NK and T cells. These results indicate that DSPG could induce targeted delivery to APC and suitable for all nanoparticle compositions.

[0526] Example 10. In vitro screening of LNP containing phosphatidylglycerol with different formulation

[0527] This example shows the study of transfection and expression efficiency of the nanoparticle compositions including the lipid compounds of present application and GFP mRNA or tdTomato mRNA as payload in PBMCs and THP-1 macrophage. The nanoparticle compositions were prepared and characterized according to the procedures as described in Example 2.

[0528] Table 4 summarizes particle size and PDI value as determined for the formulations prepared with the lipid compounds of the present application. As shown in Table 4, the choice of ionizable lipid and mole ratio of ionizable lipid to Secondary Phospholipid affected the particle size (e.g., diameter) , and polydispersity index (PDI) of the compositions. The tested LNPs had particle size between approximately 80 nm and 240 nm, polydispersity indices between 0.10 and 0.45, and encapsulation efficiency of about 30-98%.

[0529] Table 4. Formulation details and Characteristics of nanoparticle with different compositions encapsulated with mGFP or tdTomato

[0530] PBMCs were placed at a density of 1x106 cells in tissue culture 6-well plates with 2 mL of Eagle's Minimum Essential Medium. LNPs containing a total amount of 2000 ng GFP mRNA and tdTomato mRNA were added to the wells respectively and cultured for 24 hours (GFP mRNA) and 6 hours (tdTomato mRNA) . Cells were analyzed by flow cytometry after stained with antibody to measure GFP fluorescence intensity to determine the expression level in different kind of cells.

[0531] THP-1 cells were seeded at a density of 2x105 cells / mL in tissue culture dish with 25 mL of RPMI 1640 Medium (GibcoTM, 22400089) supplemented with 10%fetal bovine serum (GibcoTN, 10099141C) and 1%penicillin / streptomycin (GibcoTM, 15140122) . PMA with 100 ng / mL was added for 48 hours to differentiate THP-1 into THP-1 macrophages. Then replace with the fresh medium and cultured for 24 hours. Then cells were detected by flow cytometry with BV421-labeled anti-CD11b antibody, and the cell differentiation state was observed under light microscope.

[0532] THP-1 macrophages were placed at a density of 1.5x105 cells in tissue culture 24-well plates with 0.5 mL of Dulbecco's Modified Eagle's Medium (gibco, C11995500BT) . LNPs containing a total amount of 500 ng tdTomato mRNA were added to the wells respectively and cultured for 6 hours. THP-1 macrophages were analyzed by flow cytometry directly to measure tdTomato fluorescence intensity to determine the expression level in different kind of cells.

[0533] As shown in FIG. 3, the transfection efficiency was greatly affected by different contents of DSPG and 7.5%-20%mole ratio of DSPG showed APC target delivery ability. In addition, it is also affected by cationic lipids. Finally, it can be seen that LNPs composed with ionizable lipid, DSPC, DSPG, Cholesterol, and DMG-PEG with mole ratio of 50: 0: 10: 38.5: 1.5 has the highest transfection efficiency among all cationic lipids. In addition, the level of transfection efficiency in THP-1 macrophage is further verified that 50: 0: 10: 38.5: 1.5 is the highest among all cationic lipids. Therefore, subsequent cell level experiments were mainly based on this formulation.

[0534] Example 11. In vivo distribution of LNP with different formulations using In Vivo Imaging System (IVIS) in mouse

[0535] To further assess the potency of expression of sample formulations, expression of luciferase following intravenous (IV) administration of a nanoparticle of the disclosure comprising an mRNA encoding luciferase was measured.

[0536] Nanoparticle compositions including cholesterol as a structural lipid, DSPC as helper lipid, DSPG or DOPA as negative phospholipid, DMP-PEG as PEG lipid, the compound as prepared in Example 1 as cationic lipid, and luciferase mRNA as payload, were prepared according to or via methods similar to those described in Example 2. The Nanoparticle compositions and particle size, PDI value and encapsulation efficiencies were determined and shown in Table 5. The particle diameter of the formulations including compound of the disclosure were between approximately 80 nm to 150 nm. The polydispersity indices (PDI) were between 0.15 and 0.40. The encapsulation efficiencies of Luc mRNA were 28%-92%.

[0537] Table 5. Formulation details and Characteristics of nanoparticle with different compositions loaded with luciferase mRNA

[0538] The lipid nanoparticles encapsulating Luc mRNA were intravenously administered to C57BL / 6J Mice at a dosage of 0.5 mg / kg. After 6 hours or 24 hours, the mice were sacrificed and isolated spleen, kidney, heart, lung and liver to assess expression of luciferase via IVIS. The standard MC3 formulations were included for comparison. Luminescence was quantified as Avg Radiance [p / s / cm2 / sr] .

[0539] Table 6. Luminesce of different organs after IV administration of LNP with different formulations.

[0540] As shown in FIG. 4 and Table 6, in the standard MC3 formulations, luciferase shows no expression in spleen. But when DSPG / 18PA is added, luciferase expression of nanoparticle compositions in spleen was increase. Among them, F43, F46, F48 and F50 showed the highest expression level in which nanoparticle compositions composed with ionizable lipid, DSPC, DSPG, Cholesterol, and DMG-PEG with mole ratio of 50: 0: 10: 38.5: 1.5 and 42.5: 8.5: 15: 32.7: 1.3. These result improved that 50: 0: 10: 38.5: 1.5 and 42.5: 8.5: 15: 32.7: 1.3 were the suitable formulation for delivery mRNA to spleen which is rich in immune cells.

[0541] Example 12. In vivo mRNA expression in antigen-presenting cells in spleen and peripheral blood following IV administration of LNPs with different negative phospholipids in C57 Mouse

[0542] To further screen the best LNP formulation which could target delivery mRNA to Antigen-presenting cells (APC, include Macrophages and DC) with higher transfection efficiency, nanoparticle composition composed with of Compound 01, DSPC, different negative phospholipid (PA, PS, PG) , cholesterol and DMG-PEG with mole ratio of 42.5: 8.5: 15: 32.7: 1.3 and tdTomato mRNA as payload were injected IV at a dose of 2 mg / kg. After 24 hours of administration, spleen cells and blood cells were isolation and staining for detecting the transfection efficiency in different kinds of cells in spleen and blood.

[0543] Nanoparticle compositions were prepared according to or via methods similar to those described in Example 2. The particle size, PDI value and encapsulation efficiencies were determined and shown in Table 7. The particle diameter of the formulations was between approximately 80 nm to 220 nm. The polydispersity indices (PDI) were between 0.10 and 0.5. The encapsulation efficiencies of Luc mRNA were 55%-90%.

[0544] Table 7. Formulation details and Characteristics of nanoparticle with different compositions encapsulated with tdTomato mRNA

[0545] As show in FIG 5, compared with other negative phospholipid, LNP composed with DSPG showed the highest transfection efficiency in all kind of cells especially macrophage and DC in blood and macrophage in spleen. This result showed that DSPG was the best negative phospholipid for APC target LNP.

[0546] Example 13. In vivo mRNA expression in antigen-presenting cells in spleen and peripheral blood following IV administration of LNPs with four v. s. five lipid components in C57 Mouse

[0547] As show in Example 11, nanoparticle compositions composed with ionizable lipid, DSPC, DSPG, Cholesterol, and DMG-PEG with mole ratio of 50: 0: 10: 38.5: 1.5 and 42.5: 8.5: 15: 32.7: 1.3 could delivery mRNA to spleen which is rich in APC effectually. In order to screen the APC target delivery formulation, nanoparticle compositions composed with Compound 01, DSPC, DSPG, Cholesterol, and DMG-PEG with mole ratio of 50: 0: 10: 38.5: 1.5 (F24) and 42.5: 8.5: 15: 32.7: 1.3 (F54) were prepared and measured the transfection efficiency in macrophages of spleen and monocyte of blood.

[0548] As shown in FIG. 6, F54 with five lipid components showed the better targeting transfection efficiency to APC than F24 with four lipid components, which was different with in vitro..

[0549] Example 14. In vivo mRNA expression in antigen-presenting cells in spleen and peripheral blood following IV administration of LNPs containing phosphatidylglycerol with different lipid composition ratios.

[0550] In order to further optimize the LNP formulation for target delivery payload to APC, nanoparticle compositions of Compound 01 or 05, DSPC, DSPG, cholesterol and DMG-PEG with different mole ratio (show in Table 8) and tdTomato mRNA as payload were injected IV at a dose of 2 mg / kg. After 24 hours of administration, spleen cells and blood cells were isolated and stained for detecting the transfection efficiency in different kinds of cells in spleen and blood.

[0551] Nanoparticle compositions were prepared according to or via methods similar to those described in Example 2. The particle size, PDI value and encapsulation efficiencies were determined and shown in Table 8. The particle diameter of the formulations was between approximately 90 nm to 160 nm. The polydispersity indices (PDI) were between 0.10 and 0.35. The encapsulation efficiencies of Luc mRNA were 60%-90%.

[0552] Table 8. Formulation details and Characteristics of nanoparticle with different compositions encapsulated tdTomato mRNA

[0553] As shown in FIG 7, with the increase of DSPG mole ratio, the transfection efficiency of nanoparticle composition comprising formulation of 01 increased at the beginning and decreased in late when the mole ratio of DSPG is exceed 25%. These results in macrophage and DC of blood and spleen suggest that the nanoparticle composition comprising formulation of 01 with a DSPG proportion ranging from 12%to 25%exhibits good APC cell uptake. Then, nanoparticle composition comprising formulation of 05 with a DSPG proportion ranging from 12%to 18%was prepared. As shown in FIG 7, 42.5: 8.5: 15: 32.7: 1.3 was the best mole ratio of nanoparticle composition composed with 05, DSPC, DSPG, cholesterol and DMG-PEG in select mole contents. Then, nanoparticle compositions composed with ionizable lipid, DSPC, DSPG, cholesterol and DMG-PEG with mole ratio of 42.5: 8.5: 15: 32.7: 1.3 called APC-LNP was used to target delivery mRNA to APC in vivo preferentially.

[0554] Example 15. In vivo delivery efficiency in APC and hepatocyte of APC-specific LNP formulations and classic liver targeting LNP formulations.

[0555] In order to verify APC-LNP could target delivery mRNA to APC rather than hepatocyte. LNP with standard formulation (the molar ratio of ionizable lipid: DSPC: DSPG: Cholesterol: DMG-PEG was 50: 10: 0: 38.5: 1.5) were prepared as control. LNPs composition with different ionizable lipids and molar ratio were injected IV at a dose of 2 mg / kg. After 24 hours of administration, liver cells and blood cells were isolation and staining.

[0556] Nanoparticle compositions were prepared according to or via methods similar to those described in Example 2. The particle size, PDI value and encapsulation efficiencies were determined and shown in Table 9. The particle diameter of the formulations was between approximately 90 nm to 150 nm. The polydispersity indices (PDI) were between 0.10 and 0.30. The encapsulation efficiencies of Luc mRNA were 35%-90%.

[0557] Table 9. Formulation details and Characteristics of nanoparticles with different compositions encapsulated with tdTomato mRNA

[0558] Table 10. In vivo delivery efficiency in APCs and hepatocytes

[0559] As show in FIG. 8 and Table 10, the transfection efficiency of APC-LNP in macrophage and DC in blood were higher than standard formulations in all test ionizable lipids. Moreover, all APC-LNP has almost no transfection efficiency in hepatocytes while LNP with standard formulation could effectively deliver mRNA to hepatocytes. These results indicated APC-LNP could target deliver mRNA to APC rather than hepatocytes which is important for non-liver targeted LNP delivery and can be used for cancer vaccine.

[0560] Example 16. In vivo delivery efficiency of various cell subsets in different organs following IV injection of the APC-specific LNP formulation

[0561] In order to further test the efficiency of APC targeted delivery of APC-LNP, APC-LNP composed with two kinds of ionizable lipid (01, 05) and tdTomato mRNA as payload was prepared and injected IV at a dose of 2 mg / kg. After 24 hours of administration, blood cells, spleen cells, liver cells, Lymph node cells and Lung cells were isolation and staining.

[0562] Nanoparticle compositions were prepared according to or via methods similar to those described in Example 2. The particle size, PDI value and encapsulation efficiencies were determined and shown in Table 11. The particle diameter of the formulations was between approximately 100 nm to 105 nm. The polydispersity indices (PDI) were between 0.20 and 0.25. The encapsulation efficiencies of Luc mRNA were 65%-75%.

[0563] Table 11. Formulation details and Characteristics of nanoparticle with different compositions encapsulated with tdTomato mRNA

[0564] As show in FIG. 9, two kinds of APC-LNP could target delivery tdTomato to APC (DC and macrophage) cells in different organs such as blood, spleen, LLN , liver and lung, and rarely delivered to T cells and NK cells in those organs. In addition, APC-LNP does not target liver cells and lung tissue cells. In summary, APC-LNP could high specially target APC cells of mainly organs which indicate that it is suitable for tumor vaccine production.

[0565] Example 17. In vitro transfection of APC-specific LNP formulation with different cationic lipids in PBMC and THP-1 Macrophages.

[0566] This example shows the study of transfection and expression efficiency of the LNPs including the lipid compounds of present application and tdTomato mRNA as payload in PBMCs and THP-1 macrophages. The LNP formulations were prepared and characterized according to the procedures as described in Example 2.

[0567] Table 12 summarizes particle size and PDI value as determined for the formulations prepared with the lipid compounds of the present application. As shown in Table 12, the choice of ionizable lipid and mole ratio of DSPG affected the particle size (e.g., diameter) , and polydispersity index (PDI) of the compositions. The tested LNPs had particle size between approximately 85 nm and 240 nm, polydispersity indices between 0.10 and 0.41, and encapsulation efficiency of about 10%-90%.

[0568] Table 12. Formulation details and Characteristics of nanoparticle with different compositions encapsulated with tdTomato mRNA

[0569] PBMCs and THP-1 macrophages were placed at a density of 1.5×105 cells in tissue culture 24-well plates with 0.5 mL of Dulbecco's Modified Eagle's Medium (gibco, C11995500BT) . LNPs containing a total amount of 500 ng tdTomato mRNA were added to the wells respectively and cultured for 6 hours. PBMCs were analyzed by flow cytometry after stained with antibody and THP-1 macrophages were analyzed by flow cytometry directly to measure tdTomato fluorescence intensity to determine the expression level in different kind of cells.

[0570] As we known, for in vitro transfection, LNP composed with ionizable lipid, DSPC: DSPG: Cholesterol: DMG-PEG with the molar ratio of 50: 0: 10: 38.5: 1.5 showed the higher efficiency than LNP with the molar ratio of 42.5: 8.5: 15: 32.7: 1.3 in APC cells of PBMC and THP-1 Macrophages. So, we prepared LNP composed with those two molar ratios to evaluate the effect of ionizable lipid. As showed in FIG. 10, , LNP composed with ionizable lipid 01, 18, 19, 09, 10, 21 and 20, showed the better expression efficiency in APC cells of PBMC and LNP with ionizable lipid 40, 14, 42 and 44 had better expression efficiency in THP-1 Macrophages.

[0571] Example 18. In vivo delivery efficiency in APC cells following IV administration of APC-specific formulation with different ionizable lipids.

[0572] LNPs composition of different ionizable lipids, DSPC, DSPG, cholesterol, and DMG-PEG with mole ratio of 42.5: 8.5: 15: 32.7: 1.3 and tdTomato mRNA as payload were injected IV at a dose of 2 mg / kg. After 24 hours of administration, spleen cells and blood cells were isolation and staining.

[0573] Nanoparticle compositions were prepared according to or via methods similar to those described in Example 2. The particle size, PDI value and encapsulation efficiencies were determined and shown in Table 13. The particle diameter of the formulations was between approximately 90 nm to 125 nm. The polydispersity indices (PDI) were between 0.09 and 0.25. The encapsulation efficiencies of tdTomato mRNA were 59%-90%.

[0574] Table 13. Formulation details and Characteristics of nanoparticle of different compositions encapsulated with tdTomato mRNA

[0575] As show in FIG 11, LNP with different ionizable lipids containing 15%of DSPG could delivery mRNA to macrophage and DC in blood and spleen effectively via IV injection. All tested APC-LNP containing 15%DSPG exhibited higher overall APC delivery efficiency compared with F58, which contains no DSPG. Among them, F54 with Compound 01 as ionizable lipid showed best APC delivery efficiency.

[0576] Example 19. Immune cell activation and cytokine release induced by APC-specific LNP loaded with mRNA expressing tumor-associated antigen

[0577] Targeted delivery and expression of mRNA-encoding tumor antigens in APCs could facilitate the processing and presentation of antigens to the major histocompatibility complex (MHC) , especially MHC class I, thereby achieving higher activation of specific CD8+ T cells and better tumor control.

[0578] APC-LNP composed with two kinds of ionizable lipid (01, 05) and mRNA which expressing a tumor-associated antigen called Trp1 as payload was prepared and injected IV at a dose of 1 mg / kg to observe the activation of immune cells in C57 mice. After 24 hours of administration, blood cells, spleen cells, liver cells, Inguinal lymph node (LLN) cells and Lung cells were isolated and stained.

[0579] Nanoparticle composition was prepared according to or via methods similar to those described in Example 2. The particle size, PDI value and encapsulation efficiencies were determined and shown in Table 14. The particle diameter of the formulations was between approximately 80 nm to 105 nm. The polydispersity indices (PDI) were between 0.05 and 0.15. The encapsulation efficiencies of Trp1 mRNA were 63%-75%.

[0580] Table 14. Formulation details and Characteristics of nanoparticles encapsulated with Trp1 mRNA

[0581] As show in FIG. 12, no obvious immune cell activation was observed with empty APC-LNP. In comparison, significant activation of T cells, B cells, and NK cells was observed in the spleen, lymph nodes, liver, and peripheral blood following injection of mTrp1-encapsulated APC-LNP. In the lymph nodes, the activation ratio of T cells exceeded 90%, and the activation ratio of B cells and NK cells exceeded 95%. As show in FIG. 13, the cytokine increases with the activation of immune cells which can increase anti-tumor activity.

[0582] These data collectively indicate that APC-LNP can achieve specific and extensive delivery and expression of mRNA in APC cells in different tissues, leading to the induction of specific immune activation and potent anti-tumor immunity. APC-LNP holds great potential for the development of next-generation mRNA cancer vaccines.

[0583] Example 20. Comparison of in vitro transfection of APC-LNP v. s. Lipoplex (LPX) in PBMC

[0584] This example shows the study of transfection and expression efficiency of the GFP mRNA loaded APC-LNP and Lipoplex (LPX) in PBMCs. APC-LNP composed with ionizable lipid of Compound 01, DSPC, negative lipid, cholesterol, and DMG-PEG with mole ratio of 42.5: 8.5: 15: 32.7: 1.3 were prepared and characterized according to the procedures as described in Example 2.

[0585] LPX was prepared by mixing mRNA solution with Liposome solution according to US20200246267A1. Firstly, liposomes were prepared by ethanol injection. The DOTMA / DOPE lipid were dissolved in ethanol with 66: 33 molar ratio and the total lipid was 29.55 mM. 0.2 mL DOTMA / DOPE ethanol solution was injected into 1.8 mL DEPC water rapidly, and then the mixture was diluted with 18 ml DEPC water. The liposome colloid was settled for 1 hour. Then the liposomes were ultrafiltered for 3 times with 100k ultrafiltration tube to remove ethanol and exchange to DEPC water. Finaly, the liposomes were concentrated to 29.55mM and the concentration of DOTMA was 13.2 mg / mL.

[0586] mGFP-LPX formulation with an N / P ratio of 0.65 were prepared as follows: firstly, mixing mGFP RNA solution with 1.5M NaCl solution to pre-condense the mGFP. Then an appropriate amount of liposome was mixed with the mGFP-NaCl solution to form the mGFP-LPX in 150 mM NaCl solution. The mGFP-LPX was incubated at room temperature for 10 minutes and stored at 4-8℃ for further experiment.

[0587] Table 15 summarizes particle size and PDI value as determined for the formulations prepared with the lipid compounds of the present application and mGFP-LPX. The tested APC-LNPs and LPX had particle size between approximately 110-220 nm, and polydispersity indices between 0.1-0.2. The encapsulation efficiencies of GFP mRNA were 40%-80%.

[0588] Table 15. Formulation details and Characteristics of APC-LNP and LPX encapsulated with mGFP

[0589] PBMCs were placed at a density of 2×105 cells in tissue culture 24-well plates with 0.5 mL of Eagle's Minimum Essential Medium. APC-LNP and LPX containing a total amount of 50 ng, 100 ng, 250 ng, 500 ng, and 1000 ng GFP mRNA were added to the wells respectively. After culturing for 24 hours, the cells were stained with antibody (Staining method showed in Example 3) and analyzed by flow cytometry to measure the expression level of GFP mRNA in different kinds of cells.

[0590] As shown in FIGs. 14A and 14B, comparing to LPX, APC-LNPs caused a higher gene expression in the DC and monocyte cells. And FIGs. 14C and 14D shows that both APC-LNP and LPX caused almost no transfection in NK and T cells. Those results showed that APC-LNP with higher transfection efficiency and specificity could target DC and monocyte more efficiently than LPX.

[0591] Example 21. Immune Activation and Specific T cell stimulation using APC-LNP loading OVA mRNA in mouse.

[0592] To further assess the capacity of APC-targeted LNPs to deliver antigenic mRNA and induce specific T cell responses in vivo, we utilized OVA mRNA as the antigenic mRNA and measured the levels of specific T cells in mice post-immunization.

[0593] APC-LNP loaded with control mRNA and OVA mRNA were prepared and characterized according to the procedures as described in Example 2. Control mRNA is prepared based on pST1-empty-MITD DNA template. It does not encode a protein and can be used as an irrelevant RNA control. LPX encapsulated with OVA mRNA were prepared according to the method described in example 20. Table 16 summarizes particle size and PDI value as determined for the formulations prepared with the lipid compounds of the present application and OVA-LPX.

[0594] Table 16. Formulation details and Characteristics of APC-LNP and LPX

[0595] In this experiment, 12 tumor-free C57BL / 6 mice were used, randomly divided into four groups based on their weight: a PBS control group, LNP-Control group, LNP-OVA group, and LPX-OVA group. LNP group were immunized intravenously at a dosage of 5 μg per mouse per administration, while LPX group was administered intravenously at a dosage of 40 μg per mouse per administration. Initial immunization was carried out on Day 0, followed by booster immunizations on Days 3, 7, and 15. The PBS control group received PBS as a vehicle control. Peripheral blood was collected on Day 13, 19, 25, 32, and 39 for flow cytometry analysis to measure the ratio of OT1+ / CD8+ in the peripheral blood. Peripheral blood was also collected 4 hours post-administration on Day 0 for ELISA testing of IFN-α levels in each group.

[0596] As shown in FIG. 15A, flow cytometry results indicated a significant increase in the OT1+ / CD8+ ratio in the peripheral blood of the LNP-OVA group compared to the LNP-Control group (Day 13, P=0.002; Day 19, P=0.003; Day 25, P=0.009; Day 32, P=0.006; Day 39, P=0.006) . This demonstrated that four immunizations with 5 μg of LNP-OVA could activate the immune response in C57BL / 6 mice, and that CD8+OT1+ T cells (i.e., specific response T cells) could be stably maintained at a higher level in vivo. ELISA results showed that plasma levels of IFN-α in the LNP-OVA group were significantly higher than those in the LNP-Control and LPX-OVA groups (P<0.0001; FIG. 15B) , suggesting that a single administration of 5 μg of LNP-OVA could activate a strong non-specific immune response.

[0597] Example 22. Anti-tumor efficacy of APC-LNP in xenograft mouse model.

[0598] Therapeutic efficacy of APC-LNP was assessed in MC38-OVA subcutaneous (s. c. ) tumor models. C57BL / 6 mice were subcutaneous injected MC38-OVA tumor cells at 2E5 cells per mouse. After 6 days, tumor-loaded C57BL / 6 mice were randomly divided into three groups based on their weight and tumor size. Three groups of mice were immunized three times with PBS, control mRNA-LNP and OVA-LNP respectively, via intravenous injection. For PBS group, 200 μL PBS was injected into each mouse on day 6, day 9, day 14, respectively. For LNP groups, 5 μg control mRNA or OVA mRNA in 200 μL LNP solution was injected into each mouse at the same timepoints.

[0599] APC-LNP loaded with control mRNA and OVA mRNA were prepared and characterized according to the procedures as described in Example 2. Table 17 summarizes particle size and PDI value of APC-LNP.

[0600] Table 17 Formulation details and Characteristics of APC-LNP

[0601] Tumor sizes were measured with a caliper every two to three days for calculating tumor volumes using the equation (a2 × b)  / 2 (a, width; b, length) . Animals were euthanized when exhibiting signs of impaired health or when the length of the tumor exceeded 15 mm.

[0602] As FIG. 16A shown, the tumor increasing rate of mice in OVA-LNP immunized group was slower than the other groups, which means APC-LNP can protect mice against tumor growth. And the immunization with OVA-LNP led to little change on mice weight (FIG. 16B) , which means the dose of APC-LNP can be increased furtherly. So, this experiment shows the potential therapeutic efficacy of APC-LNP upon tumor.

[0603] While preferred embodiments of the present invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. It is not intended that the invention be limited by the specific examples provided within the specification. While the invention has been described with reference to the aforementioned specification, the descriptions and illustrations of the embodiments herein are not meant to be construed in a limiting sense. Numerous variations, changes, and substitutions will now occur to those skilled in the art without departing from the invention. Furthermore, it shall be understood that all aspects of the invention are not limited to the specific depictions, configurations or relative proportions set forth herein which depend upon a variety of conditions and variables. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed in practicing the invention. It is therefore contemplated that the invention shall also cover any such alternatives, modifications, variations or equivalents. It is intended that the following claims define the scope of the invention and that methods and structures within the scope of these claims and their equivalents be covered thereby.

Claims

1.A lipid nanoparticle composition targeting to antigen-presenting cells (APCs) , comprising:1) at least a therapeutic agent,2) at least a cationic or ionizable cationic lipid,3) at least a neutral lipid,4) at least a steroid or steroid analogue,5) at least a PEGylated lipid, and6) DSPG, wherein said DSPG is present in a molar percentage of the composition from about 10%to about 25%.2.The composition according to claim 1, wherein said DSPG is present in a molar percentage of the composition from about 10%to about 20%.3.The composition according to claim 1 or 2, wherein said DSPG is present in a molar percentage of the composition from about 12%to about 20%.4.The composition according to any one of claims 1-3, wherein said DSPG is present in a molar percentage of the composition from about 12%to about 18%.5.The composition according to any one of claims 1-4, wherein said DSPG is present in a molar percentage of the composition of about 15%.6.The composition according to any one of claims 1-5, wherein said ionizable cationic lipid has formula (I) , or a salt, tautomer, or stereoisomer thereof, wherein:1) m and p are independently selected from any integer ranging from 3 to 8;2) n is selected from any integer ranging from 2 to 4;3) X is a bond, -C (O) O-, or a biodegradable group;4) R1 is a hydrogen bond donor-containing group or hydrogen bond acceptor-containing group;5) both of R2 are same and selected from C1-C12 alkyl, substituted C1-C12 alkyl, C2-C12 alkenyl, substituted C2-C12 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl and substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof;6) R3 is: (a) selected from C4-C22 alkyl, substituted C4-C22 alkyl, C4-C22 alkenyl, substituted C4-C22 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof; or (b) an acetal group ofwherein both of R4 are same and selected from C1-C16 alkyl, substituted C1-C16 alkyl, C2-C16 alkenyl, substituted C2-C16 alkenyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl and combinations of thereof.7.The composition according to claim 6, wherein said ionizable cationic lipid has formula (II) , or a salt, tautomer, or stereoisomer thereof, wherein q is selected from any integer ranging from 2 to 4.8.The composition according to claim 6 or 7, wherein R2 is C7-C12 alkyl.9.The composition according to any one of claims 6-8, wherein each R2 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains.10.The composition according to any one of claims 6, 8 and 9, wherein R2 of said formula (I) is selected from C6-C12 alkyl, substituted C6-C12 alkyl, C6-C12 cycloalkyl, substituted C6-C12 cycloalkyl, C6-C12 alkenyl, substituted C6-C12 alkenyl and combinations of thereof.11.The composition according to claim 10, wherein R3 is C7-C12 alkyl.12.The composition according to any one of claims 6 and 8-11, wherein R3 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains.13.The composition according to any one of claims 6 and 8-12, wherein R3 is the same with R2.14.The composition according to any one of claims 7-9, R4 of said formula (II) are independently selected from C2-C12 alkyl, substituted C2-C12 alkyl, C3-C12 cycloalkyl, substituted C3-C12 cycloalkyl, C2-C12 alkenyl, substituted C2-C12 alkenyl and combinations of thereof.15.The composition according to any one of claims 7-9 and 14, wherein R4 is C7-C12 alkyl.16.The composition according to any one of claims 7-9, 14 and 15, wherein each R4 has at least one carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains.17.The composition according to any one of claims 7-9 and 14-16, wherein R4 is the same with R2.18.The composition according to any one of claims 9, 12 and 16, wherein said carbon atom with hydrogen atom (s) substituted by one or two side chains is the second or more distant carbon atom counting from the junction.19.The composition according to any one of claims 9, 12, 16 and 18, wherein said one or two side chains are C1-C4 alkyls.20.The composition according to any one of claims 6-19, wherein each R2, R3 and / or each R4 is independently selected from one of the following formulas: 21.The composition according to any one of claims 6-20, wherein R1 is selected from hydroxyalkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or optionally substituted amino alkylenyl group having 1 to 6 carbon atoms.22.The composition according to any one of claims 6-21, wherein R1 is selected from one of the following formulae: wherein o is selected from 1, 2, 3, 4, and 5.23.The composition according to any one of claims 6-22, wherein said ionizable lipid is selected from a group consisting of Compound No: 01-52 as shown in Table 1.24.The composition according to any one of claims 1-23, wherein said ionizable cationic lipid is present in a molar percentage of the composition from about 30%to about 48%.25.The composition according to any one of claims 1-24, wherein said ionizable cationic lipid is present in a molar percentage of the composition from about 40%to 45%.26.The composition according to any one of claims 1-25, wherein the molar ratio of said ionizable cationic lipid to said phosphatidylglycerol ranges from about 10: 1 to about 1: 1.27.The composition according to any one of claims 1-26, wherein the molar ratio of said ionizable cationic lipid to said phosphatidylglycerol ranges from about 2.8: 1 to 2: 1.28.The composition according to any one of claims 1-27, wherein the neutral lipid is disteroylphosphatidylcholine (DSPC) or dioleoyl-phosphatidylethanolamine (DOPE) .29.The composition according to any one of claims 1-28, wherein said neutral lipid is present in a molar percentage of the composition from about 4%to about 14%.30.The composition according to any one of claims 1-29, wherein the molar ratio of said ionizable cationic lipid to said neutral lipid ranges from about 2: 1 to about 8: 1.31.The composition according to any one of claims 1-30, wherein the molar ratio of said ionizable cationic lipid to said neutral lipid ranges from about 5: 1.32.The composition according to any one of claims 1-31, wherein said steroid is cholesterol, sitosterol or stigmasterol.33.The composition according to any one of claims 1-32, wherein said steroid or steroid analogue is present in a molar percentage of the composition from about 25%to about 47%.34.The composition according to any one of claims 1-33, wherein the molar ratio of said ionizable cationic lipid to said steroid or steroid analogue ranges from about 2: 1 to 1: 2.35.The composition according to any one of claims 1-34, wherein the molar ratio of said ionizable cationic lipid to said steroid or steroid analogue ranges from about 1.2: 1 to 1: 1.2.36.The composition according to any one of claims 1-35, wherein said PEGylated lipid is 1- (monomethoxy-polyethyleneglycol) -2, 3-dimyristoylglycerol (PEG-DMG) .37.The composition according to any one of claims 1-36, wherein said PEGylated lipid is present in a molar percentage of the composition from about 1%to about 3%.38.The composition according to any one of claims 1-37, wherein the molar ratio of said ionizable cationic lipid to said PEGylated lipid ranges from about 100: 1 to about 20: 1.39.The composition according to any one of claims 1-38, wherein said therapeutic agent is a nucleic acid molecule.40.The composition according to claim 39, wherein said nucleic acid molecule is DNA or RNA.41.The composition according to claim 39 or 40, wherein said nucleic acid molecule is plasmid DNA or closed-ended DNA (ceDNA) .42.The composition according to claim 39 or 40, wherein said nucleic acid molecule is selected from a group consisting of messenger RNA (mRNA) , guide RNA (gRNA) , a short interfering RNA (siRNA) , an RNA interference (RNAi) molecule, a microRNA (miRNA) , an antagomir, an antisense RNA, a ribozyme, a small hairpin RNA (shRNA) , or a mixture thereof.43.The composition according to any one of claims 39-42, wherein said nucleic acid molecule encodes at least one pharmaceutically active peptide or protein.44.The composition according to claim 43, wherein said nucleic acid molecule is RNA encoding at least one antigen.45.The composition according to claim 44, wherein said antigen is a disease-associated antigen or elicits an immune response against a disease-associated antigen or cells expressing a disease-associated antigen.46.The composition according to claim 45, wherein said antigen is a tumor-associated antigen or elicits an immune response against cancer, tumor or an infectious disease.47.The composition according to claim 46, wherein said antigen is a tumor neoantigen.48.The composition according to any one of claims 39-47, wherein said nucleic acid molecule further comprises RNA encoding at least one immunologically active compound.49.The composition according to claim 48, wherein said immunologically active compound does not encode an antigen.50.A pharmaceutical composition comprising the composition of any one of claims 1-49, and a pharmaceutically acceptable excipient.51.A method of delivering a nucleic acid molecule to an APC cell in vivo or in vitro, comprising subjecting the composition of any one of claims 1-49 or the pharmaceutical composition of claim 50 to said APC cell.52.A method of treating or preventing a disease in a subject in need thereof, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of the composition of any one of claims 1-49 or the pharmaceutical composition of claim 50, wherein said composition comprising a nucleic acid molecule having therapeutic activity.53.The method according to claim 52, wherein said composition is administered by injection.

Images