Multi-specific molecules and uses thereof

Abstract

Disclosed is a multi-specific molecule targeting CD16A expressed on NK cells and HER2 or GPC3 expressed on tumor cells, enhanced by a complex formed by IL-15 and IL-15Rα contained in the multi-specific molecule. Also disclosed are polypeptides, compositions and methods relevant to the multi-specific molecule.

Description

MULTI-SPECIFIC MOLECULES AND USES THEREOFTechnical Filed

[0001] The present disclosure relates to a multi-specific molecule, and in particular to a multi-specific antibody and uses thereof. The present disclosure is more specifically directed to a trispecific killer engager (TriKE) targeting both HER2 and CD16A and crosslinking a IL-15 / IL-15Rα complex. The present disclosure also relates to polypeptides, pharmaceutical compositions, uses and methods in relation to the trispecific killer engager.Background

[0002] Natural killer (NK) cells are defined by the expression of the cell adhesion marker CD56 and lack of the T-cell receptor CD3 (CD56+CD3-) . NK cells can be divided into two functionally distinct subsets, CD56bright and CD56dim, based on the cell surface density of CD56. Comprising approximately 10%of circulating NK cells, CD56brightNK cells are generally thought to be more proliferative, to have a higher capacity for cytokine production after stimulation with IL-12 and IL-18, and to have poor cytotoxic effector activity at rest. CD56dimNK cells, however, are potently cytotoxic without stimulation, mediate antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) , and produce cytokines after stimulation with target cells.

[0003] CD16 (FcγRIII) binds to the Fc portion of IgG antibodies; one type, CD16A, is a transmembrane protein that co-localizes with CD3ζ and Fc-εRI-γ on NK cells. Upon ligation, it induces a potent series of signals resulting in cytokine production and cytotoxic effector activity via ADCC. The second type, CD16B, is found on neutrophils and is not involved in tumor cell killing. Although the extracellular domains are highly homologous, glycosylphosphatidylinositol linkage differentiates CD16B from CD16A. Most CD56brightNK cells in the peripheral blood express little to no CD16A. In contrast, the majority of CD56dim cells uniformly express high levels of CD16A. Down-regulation of CD16A occurs after mitogen stimulation and co-culture with malignant targets, an effect that is presumably mediated by a metalloprotease. This process may be important for rapid modulation of the surface density of CD16A, and in turn the activation status and effector function of NK cells.

[0004] The ADCC function of NK cells is highly pursued in antibody intervening immunotherapy. Bispecific antibodies with two targeting modules, one for recruiting ADCC receptors CD16A and the other for recognizing antigen, have drawn extensive attention due to the high efficacy for engaging NK cells to kill the target cells both in vitro and in vivo.

[0005] Interleukine-15 (IL-15) is a 15KD cytokine that enhances the proliferation and effector functions of IL-2Rβ / γ-expressing lymphocytes, such as NK cells and T cell subtypes. IL-15 is expressed in many cell types and tissues including monocytes, macrophages, DCs, keratinocytes fibroblasts, muscle cells, and neural cells. It shows 19%sequence homology but high similarity of many biological functions to IL-2. Unlike IL-2 receptor, IL-15 receptor alpha is trans expressed on IL-15 producing cells and forms IL-15α / IL-15 complex to deliver signals to NK, NKT, and memory CD8 T cells expressing IL-15Rβ (IL-2Rβ) and common γchain. This signaling induces the recruitment and activation of JAK1 and JAK3 then escalates to STAT3 and STAT5. The phosphorylated STAT3 and STAT5 form the homodimer which translocate to the nucleus and promote the transcription of target genes which can strongly promote the proliferation and differentiation of NK cells, enhance the proliferation and cytotoxicity of T lymphocytes. Although IL-15 activates the lymphocytes like IL-2, but IL-15 has no obvious effect on Treg cells and does not cause capillary leak syndrome, so IL-15 is a superior choice for tumor immunotherapy compared to IL-2.

[0006] Recombinant human IL-15 (rhIL-15) was evaluated in patients with metastatic melanoma and was shown to induce regression of lung metastases in two patients, but the narrow therapeutic window limited its continued development (NCT01021059) . Since the heterodimer IL-15 / IL-15Rα is a natural form of the IL-15 that is cleaved from cells and can also stimulate the downstream signaling independently, many studies are designed to explore the clinical efficacy of the IL-15 / IL-15Rα sushi complex. ImmunityBio’s nogapendekin alfa inbakicept (IL-15N72D: IL-15RαSu / Fc) is approved by FDA in combination with the Bacillus Calmette–Guérin (BCG) vaccine for BCG-unresponsive non-muscle invasive bladder cancer in 2024. IL-15N72D mutation increases the affinity to bind IL-15Rβγc and enhanced biological activity; IL-15RαSu, N-terminal IL-15Rα fragments, the so-called sushi domain (Su) , can act as the IL-15Rβ chain agonist independent of cell membrane IL-15Rα; IgG1 Fc fusion is used to improve the half-life and the biodistribution. Although the nogapendekin alfa inbakicept achieved proof of concept in bladder cancer treatment by intravesical administration, it is still very challenging to broaden the cancer indications due to the non-targeted exposure and systematic immune activation (NCT03228667) .

[0007] Her2 is a transmembrane, surface bound receptor tyrosine kinase and is normally involved in signal transduction pathways leading to cell growth and differentiation. Overexpression of Her2 is usually related to the occurrence and development of tumors. As a prognostic and predictive biomarker, amplification or over-expression of the Her2 gene occurs in about 15-30%breast cancers and 10-30%gastric / esophageal cancers. Overexpression of Her2 can also be observed in other tumors such as ovarian, endometrial, bladder, lung, colon, and head and neck tumors.

[0008] Trastuzumab, a monoclonal antibody recognizing the proximal membrane epitope of Her2 extracellular domain IV, is used as a first-line drug for the treatment of breast cancer. The mechanism of its antitumor action is by binding to the ECD of the HER2 receptor, including antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) , blockage of ligand-independent HER2 receptor dimerization. Two ADC drugs,  and derived from Trastuzumab are also approved by FDA to treat the Her2 expressed cancer types. These ADCs show anti-tumor effects by anti-HER2 function of trastuzumab, payload induced cytotoxicity, and tissue specific expression; strongly demonstrates the excellent tumor targeting of the trastuzumab.

[0009] Glypican-3 (GPC3) is a member of the heparan-sulfate proteoglycan (HSPG) family. The 70 kDa precursor encoded by GPC3 gene on chromosome Xq26.2 is cleaved by furin between Arg358 and Ser359, generating a 40KD N-terminal and a 30KD C-terminal subunit that remain linked by disulfide bonds. Mature GPC3 is a GPI-anchored heterodimer carrying two heparan-sulfate (HS) chains near its C-terminus, the shedding N-terminal fragment as soluble GPC3.

[0010] Expression of GPC3 is high in placenta and fetal liver, lung and kidney, but almost absent in healthy adult normal tissues. GPC3 is markedly over-expressed in several malignancies, especially hepatocellular carcinoma (HCC) and the GPC3 serum levels correlate with poor prognosis in HCC patients. As a promising oncology target, targeting GPC3, such as monoclonal antibodies, vaccines and GPC3 chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells have entered early phase clinical trials and showed preliminary evidence of clinic efficacy in HCC.

[0011] Currently, several formats of these bispecific antibodies are undergoing basic and clinical research, such as Bispecific Killer Cell Engager (BiKE) , bispecific diabody (BidAb) and tetra-valent, bispecific TANdAb. Recently, the more promising format TandAb has been developed by Affimed Therapeutics AG (Heidelberg, Germany) . TandAb is a tetravalent, bispecific, tandem diabody composed of the tail-to-head homodimer of the two tandem scFv connected by three (GGS) 3linkers. One TandAb, CD16 / CD30 AFM13, has completed phase II clinical trials for patients with relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma (clinical trial no. NCT02321592) . However, TandAb likely will encounter more production problems than BidAb since it contains more sub-domains, all of which should be paired elegantly to promise a correct TandAb. Furthermore, due to its tetra valence, two for CD16A and two for CD30, TandAb has risks for non-specifically activating CD16A in the absence of CD30 and inducing side effects. TriKEs, designed to target NK cells and tumor cells are actively evaluated in pre-clinical stage. TriKEs form an immune synapse between the NK cell and the tumor cell, mediate ADCC through the highly potent CD16 activating receptor, further enhances NK cell proliferation and persistence by IL-15 fusion.Summary

[0012] One aspect of the present disclosure provides a multi-specific molecule comprising (a) an anti-HER2 antibody comprising two heavy chains and two light chains; (b) an IL-15 polypeptide, covalently linked to C-terminus of one of the two heavy chains of the anti-HER2 antibody; (c) an IL-15Rα Sushi polypeptide, covalently linked to C-terminus of the other of the two heavy chains of the anti-HER2 antibody; and (d) an anti-CD16A VHH polypeptide, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα Sushi polypeptide.

[0013] Another aspect of the disclosure provides polypeptides selected from a group consisting of (a) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-HER2 antibody, a heavy chain constant region of the anti-HER2 antibody, an IL-15Rα Sushi polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide; (b) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-HER2 antibody, a heavy chain constant region of the anti-HER2 antibody, an IL-15 polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide; (c) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-HER2 antibody, a heavy chain constant region of the anti-HER2 antibody, a peptide linker, an IL-15Rα Sushi polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide; and (d) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-HER2 antibody, a heavy chain constant region of the anti-HER2 antibody, a peptide linker, an IL-15 polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide.

[0014] Another aspect of the disclosure provides a multi-specific molecule comprising (a) an anti-GPC3 antibody comprising two heavy chains and two light chains; (b) an IL-15 polypeptide, covalently linked to C-terminus of one of the two heavy chains of the anti-GPC3 antibody; (c) an IL-15Rα Sushi polypeptide, covalently linked to C-terminus of the other of the two heavy chains of the anti-GPC3 antibody; and (d) an anti-CD16A VHH polypeptide, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα Sushi polypeptide.

[0015] Another aspect of the disclosure is directed to a polypeptide selected from a group consisting of: (a) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-GPC3 antibody, a heavy chain constant region of the anti-GPC3 antibody, an IL-15Rα Sushi polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide; (b) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-GPC3 antibody, a heavy chain constant region of the anti-GPC3 antibody, an IL-15 polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide; (c) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-GPC3 antibody, a heavy chain constant region of the anti-GPC3 antibody, a peptide linker, an IL-15Rα Sushi polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide; and (d) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-GPC3 antibody, a heavy chain constant region of the anti-GPC3 antibody, a peptide linker, an IL-15 polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide.

[0016] Further aspects of the disclosure provide polynucleotides encoding the multi-specific molecule or the polypeptide, vectors and host cells comprising the polynucleotides, pharmaceutical compositions comprising the multi-specific molecules, the polypeptides, the polynucleotides, the vectors, or the host cells, and uses and methods of treatment of cancer involving the multi-specific molecules, the polypeptides, the polynucleotides, the vectors, or the host cells.

[0017] More aspects and advantages of the present disclosure will become apparent from the detailed description of the invention disclosed herein as set forth below.Brief Description of the Drawings

[0018] Figure 1. Diagram of different bispecific formats.

[0019] Figure 2: Cytotoxicity of different multi-specific antibodies on JIMT-1 cells in an in vitro assay.

[0020] Figure 3: Binding of BMP03-08, BMP01-16 and Trastuzumab to human, cynomolgus, mouse and rat HER2 protein on ELISA.

[0021] Figure 4: Binding of BMP03-08, BMP01-16 and Trastuzumab to human CD16A and CD16B protein on ELISA.

[0022] Figure 5: Weaker binding of BMP03-08 to human, cynomolgus, mouse and rat CD122 / CD132 heteromeric receptor than N-803 on ELISA.

[0023] Figure 6: Attenuated IL-15 receptor activation of BMP03-08 compared to IL-15.

[0024] Figure 7. Stimulation of activation marker CD25 on T-cells by BMP03-08.

[0025] Figure 8. BMP03-08 showed enhanced ADCC than BMP01-16 and trastuzumab in reporter assay.

[0026] Figure 9. BMP03-08 exhibited enhanced ADCC than BMP01-16 and trastuzumab.

[0027] Figure 10. Superior ADCC activity of BMP03-08 against JIMT-1.

[0028] Figure 11. BMP03-08 significantly inhibit MDA-MB-453 tumor growth. Average tumor growth for all groups was plotted on top and tumor growth of individual mouse for PBS vs BMP01-16+NK and PBS vs BMP03-08+NK were plotted on bottom.

[0029] Figure 12. BMP03-08 inhibits MDA-MB-231 tumor growth in vivo. Average tumor growth for all groups was plotted on top and tumor growth of individual mouse for PBS vs BMP03-08 3mpk and PBS vs BMP03-08 9mpk were plotted on bottom.

[0030] Figure 13. BMP03-08 inhibits NCI-H1975 tumor growth in vivo. Dosing Scheme was put on top, average tumor growth for all groups was plotted on bottom.

[0031] Figure 14. Binding of BM321 and GC33 to human GPC3, Cyno GPC3, human CD16-158V, human CD16-158F, human IL-15 on ELISA.

[0032] Figure 15. Attenuated IL-15 receptor activation of BM321 compared to IL-15 and N803.

[0033] Figure 16. Binding of BM321 and GC33 to human GPC3 positive cell line Huh7, GPC3 negative cell line CHO and primary NK cells by FACS.

[0034] Figure 17. BM321 exhibited enhanced ADCC than GC33 against GPC3 positive cell line Huh7.

[0035] Figure 18. BMP321 inhibits HepG2 tumor growth in vivo.

[0036] Figure 19. BMP321 inhibits Huh7 tumor growth in vivo. Sequence Listings Detailed Description

[0037] Definition

[0038] Unless stated otherwise, the following terms and phrases as used herein are intended to have the following meanings.

[0039] As used herein, the term “antibody” generally refers to a tetramer comprising at least two heavy (H) chains and two light (L) chains inter-connected by disulfide bonds. Each heavy chain (HC) is comprised of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) . The heavy chain constant region is comprised of three domains, CH1, CH2 and CH3. Each light chain (LC) is comprised of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) . The light chain constant region is comprised of one domain. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, termed complementarity determining regions (CDRs) , interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FR) . Each VH and VL is composed of three CDRs and four FRs arranged from amino-terminus to carboxy -terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, and FR4. The CDRs in the heavy chain are termed HCDRs, i.e., HCDR1, HCDR2, and HCDR3. The CDRs in the light chain are termed LCDRs, i.e., LCDR1, LCDR2, and LCDR3. The variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with an antigen. The constant regions of the antibodies may mediate the binding of the immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (e.g., effector cells) and the first component (Clq) of the classical complement system.

[0040] The term “antibody” includes, but is not limited to, monoclonal antibodies, human antibodies, humanized antibodies, and chimeric antibodies. The antibodies can be of any isotype / class (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA and IgY) or subclass (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) .

[0041] A “heavy chain antibody” is devoid of a light chain and in the case of the heavy chain antibodies in camelids the CH1 domain is also missing. Consequently, a camelid heavy chain antibody associates with its cognate antigen via a single domain, the variable heavy chain domain of a heavy chain antibody or VHH. The terms VHH, nanobody or single domain antibody are used interchangeably herein. Therefore, an anti-CD16A VHH is an anti-CD16A nanobody, or an anti-CD16A single domain antibody. Throughout the disclosure, CD16A is sometime referred to as CD16. VHH antibodies are the isolated VHH domains of heavy-chain only antibodies produced by camelid species, such as alpaca, llama, and camel. These proteins consist of framework regions and three highly variable loops: CDR1, CDR2 and CDR3. Research has shown that it is the CDR3 loop that enables VHH antibodies to have such a wide range of bind specificities; the CDR3 loop tends to be 3-4 residues longer than that of conventional antibodies, allowing them to use these protrusions to extend into “hidden” epitope cavities; the CDR3 loop also has more variation in amino acid sequences in VHH antibodies than conventional antibodies, leading to ～7%higher sequence diversity per residue.

[0042] “Linker” refers to a sequence of amino acids comprising a linker peptide joining two juxtaposed variable domains forming an antigen-binding moiety with the C-terminus of one domain linked to the N-terminus of the other juxtaposed domain or vice versa. Regarding the amino acid composition, a peptide linker sequence is selected that does not interfere with the formation of Fv, i.e. VH / VL, antigen binding-and recognition sites as well as does not interfere with the multimerization, e.g., dimerization of the polypeptides of a multi-specific antigen-binding protein. For example, a linker comprising glycine and serine residues generally provides protease resistance. In some embodiments (G2S) X peptide linkers are used, wherein, for example, x = 1-20, e.g., (G2S) 3 (SEQ ID NO: 48) , or (G3S) X peptide linkers are used, wherein, for example, x=1-15 (e.g., x=3, SEQ ID NO: 49) or (G4S) X peptide linkers are used, wherein, for example, x=1-10, preferably 1-6 (e.g., x=3 or 4, SEQ ID NO: 37 or 38) . The amino acid sequence of the linker can be optimized, for example, by phage-display methods to improve the formation of the antigen binding site and production yield of the polypeptide.

[0043] The term “ (specifically) binds to” , “ (specifically) recognizes, ” “is (specifically) directed to, ” or “ (specifically) reacts with” means in accordance with this invention that a binding domain interacts or specifically interacts with a given epitope or a given target side on the target molecules (antigens) , e.g. CD16A, and the target cell surface antigen, e.g., HER2, respectively.

[0044] The term “does not essentially  / substantially bind” or “is not capable of binding” means that a binding domain of the present invention does not bind a protein or antigen other than CD16A, and  / or the target cell surface antigen, i.e., does not show reactivity of more than about 30%, preferably not more than about 20%, more preferably not more than about 10%, particularly preferably not more than about 9%, about 8%, about 7%, about 6%or about 5%with proteins or antigens other than CD16A, and / or the target cell surface antigen, whereby binding to CD16a, and / or the target cell surface antigen, respectively, is set to be about 100%.

[0045] As used herein, the term “complementarity determining domains” is used herein interchangeably with the term “complementary determining regions” ( “CDRs” ) , and generally refers to the hypervariable regions of VL and VH. The CDRs are the target protein-binding site of the antibody chains that harbors specificity for such target protein. There are three CDRs (CDR1-3, numbered sequentially from the N-terminus) in each human VL or VH, constituting about 15-20%of the variable domains. CDRs can be referred to by their region and order. For example, “VH CDR1” or “HCDR1” both refer to the first CDR of the heavy chain variable region. The CDRs are structurally complementary to the epitope of the target protein and are thus directly responsible for the binding specificity. The remaining stretches of the VL or VH, the so-called framework regions, exhibit less variation in amino acid sequence (Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W. H. Freeman &Co., New York, 2000) . In the art, the CDR of the antibody can be defined by various methods / schemes, such as a Kabat definition scheme based on sequence variability (see Kabat et al., protein sequence in immunology, 5th edition, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991) ) , a Chothia definition scheme based on the position of a structural loop region (see A1-Lazikani et al., Jmol Biol 273: 927-48, 1997) and a IMGT definition scheme based on the concept of IMGT-ONTOLOGY and IMGT Scientific chart rules. In certain embodiments, the present application uses the IMGT rules to define the CDRs of an antibody. The definition rules of Martin, PyIgClassify and Combined definition rules of Kabat, Chothia, IMGT, Martin and PyIgClassify are also included in this application (see Mark L. Chiu et al., Antibodies 8 (4) , 55, 2019) .

[0046] Table A. Comparation of CDR numbering among different definition schemes (in Chothia numbering)

[0047] wherein, Laa-Lbb or Haa-Hbb may refer to, from N-terminal, the amino acids sequence from No. aa to No. bb of light chain or heavy chain respectively. For example, L24-L34 refers to the amino acid sequence from No. 24 to No. 34 of light chain.

[0048] Both the light and heavy chains are divided into regions of structural and functional homology. The terms “constant” and “variable” are used functionally. In this regard, it will be appreciated that the variable domains of both the light (VL) and heavy (VH) chain portions determine antigen recognition and specificity. Conversely, the constant domains of the light chain (CL) and the heavy chain (CH1, CH2 or CH3) confer important biological properties such as secretion, transplacental mobility, Fc receptor binding, complement binding, and the like. By convention, the numbering of the constant region domains increases as they become more distal from the antigen binding site or amino-terminus of the antibody. The N-terminus is a variable region and at the C-terminus is a constant region; the CH3 and CL domains actually comprise the carboxy-terminal domains of the heavy and light chain, respectively.

[0049] As used herein, the term “humanized antibody” generally refers to an antibody which includes sequences of heavy chain variable regions and light chain variable regions derived from non-human species (e.g., mice) , but in which at least a portion of the VH and / or VL sequences have been changed to be similar to the human germline variable sequences. For example, the term “humanized antibody” is an antibody or a variant, derivative, analogue or fragment thereof that can bind to a related antigen with immune specificity and includes a framework region (FR) which includes substantially an amino acid sequence of a human antibody and a complementary determining region (CDR) which includes substantially an amino acid sequence of a non-human antibody. In the context of CDR, the term “substantially” means that the amino acid sequence of CDR has at least 80%, e.g., at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%or at least 99%identity with an amino acid sequence of CDR of a non-human antibody. The humanized antibodies include substantially at least one, typically two variable domains (Fab, Fab’ , F (ab’ ) 2, Fab, Fv) , wherein all or substantially all CDR regions correspond to the CDR region of a non-human immunoglobulin and all or substantially all framework regions are frame regions with consensus sequence of human immunoglobulin. In some embodiments, the humanized antibody can further include at least a portion of a constant region of immunoglobulin (Fc) , typically a constant region of human immunoglobulin.

[0050] As used herein, the term “human antibody” generally refers to an antibody with variable and constant regions derived from the sequence of immunoglobulin of human germ line. Human antibodies are well known in the prior art (e.g., van Dijk, M. A. and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374) . The human antibodies can also be generated in transgenic animals (e.g., mice) which can generate a complete or selected set of human antibodies in absence of generated endogenous immunoglobulin after immunization (e.g., Jakobovits, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A. et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M. et al., YearImmunol. 7 (1993) 33-40) . The human antibodies can also be generated in a phage display library (e.g., Hoogenboom, H. R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597) . The term “human antibody” can also include antibodies modified in the constant regions.

[0051] As used herein, the term “chimeric antibody” generally refers to an engineered antibody which in its broadest sense contains one or more regions from one antibody and one or more regions from one or more other antibody (ies) . In particular a chimeric antibody comprises a VH domain and a VL domain of an antibody derived from a non-human animal, in association with a CH domain and a CL domain of another antibody, in particular a human antibody. As the non-human animal, any animal such as camel, mouse, rat, hamster, rabbit or the like can be used.

[0052] The term “bispecific antibody” as used herein refers to an antibody having two specificities to one or more antigens or to different epitopes of the same antigen. For example, a bispecific antibody may comprise a first specificity to a first antigen (e.g., CD16A) and a second specificity to a second antigen (e.g., HER2) different from the first antigen. For example, a bispecific antibody may comprise a first specificity to a first epitope of an antigen and a second specificity to a second different epitope of the same antigen (e.g., CD16A) .

[0053] The term “multi-specific molecule” or “multi-specific antibody” as used interchangeably herein refers to a molecule or antibody having at least two specificities to one or more antigens, with and without one or more additional functionalities. For example, a multi-specific antibody may comprise a first specificity to a first antigen (e.g., CD16A) and a second specificity to a second specificity to a second antigen (e.g., HER2) , with additional functional domains such as IL-15 polypeptide and IL-15 receptor polypeptide (or a Sushi domain thereof) . A multi-specific molecule can be e.g. a bi-, tri-specific, tetra-or more specific molecule. In this disclosure, a tri-specific molecule with one specificity to CD16A expressed on a NK cell and another specificity to a tumor specific antigen (or tumor associated antigen) such as HER2, and an additional functional domain (such as IL-15 / IL-15Rα complex) , is sometimes referred to as tri-specific killer engage (or TriKE) .

[0054] As used herein, the term “percent identical” or “percent identity, ” in the context of two or more nucleic acids or polypeptide sequences, refers to the extent to which two or more sequences or subsequences that are the same. Two sequences are “identical” if they have the same sequence of amino acids or nucleotides over the region being compared. Two sequences are “substantially identical” if two sequences have a specified percentage of amino acid residues or nucleotides that are the same (i.e., 60%identity, optionally 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%or 99%identity over a specified region or, when not specified, over the entire sequence) , when compared and aligned for maximum correspondence over a comparison window or designated region as measured using one of the following sequence comparison algorithms or by manual alignment and visual inspection. Optionally, the identity exists over a region that is at least about 30 nucleotides (or 10 amino acids) in length or more preferably over a region that is 100 to 500 or 1000 or more nucleotides (or 20, 50, 200 or more amino acids) in length. Two examples of algorithms that are suitable for determining percent sequence identity and sequence similarity are the BLAST and BLAST 2.0 algorithms, which are described in Altschul et al, Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, 1977; and Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990, respectively.

[0055] Other than percentage of sequence identity noted above, another indication that two nucleic acid sequences or polypeptides are substantially identical is that the polypeptide encoded by the first nucleic acid is immunologically cross reactive with the antibodies raised against the polypeptide encoded by the second nucleic acid. Thus, a polypeptide is typically substantially identical to a second polypeptide, for example, where the two peptides differ only by conservative substitutions. Another indication that two nucleic acid sequences are substantially identical is that the two molecules or their complements hybridize to each other under stringent conditions. Yet another indication that two nucleic acid sequences are substantially identical is that the same primers can be used to amplify the sequence.

[0056] As used herein, the term “polypeptide” is used herein interchangeably with the term “protein” and refers to a polymer of amino acid residues. The terms apply to amino acid polymers in which one or more amino acid residue is an artificial chemical mimetic of a corresponding naturally occurring amino acid, as well as to naturally occurring amino acid polymers and non-naturally occurring amino acid polymer. Unless otherwise indicated, a particular polypeptide sequence also implicitly encompasses conservatively modified variants thereof.

[0057] The term "knob-into-hole" or "KiH" technology as used herein refers to the technology directing the pairing of two polypeptides together in vitro or in vivo by introducing a protuberance (knob) into one polypeptide and a cavity (hole) into the other polypeptide at an interface in which they interact. For example, KiHs have been introduced in the Fc: Fc binding interfaces, CL: CH1 interfaces or VH / VL interfaces of antibodies (see, e.g., US 2011 / 0287009, US2007 / 0178552, WO 96 / 027011, WO 98 / 050431, and Zhu et al., 1997, Protein Science 6: 781-788) . In some embodiments, KiHs drive the pairing of two different heavy chains together during the manufacture of multispecific antibodies. For example, multispecific antibodies having KiH in their Fc regions can further comprise single variable domains linked to each Fc region, or further comprise different heavy chain variable domains that pair with similar or different light chain variable domains. KiH technology can also be used to pair two different receptor extracellular domains together or any other polypeptide sequences that comprises different target recognition sequences (e.g., including affibodies, peptibodies and other Fc fusions) .

[0058] The term "knob mutation" as used herein refers to a mutation that introduces a protuberance (knob) into a polypeptide at an interface in which the polypeptide interacts with another polypeptide. In some embodiments, the other polypeptide has a hole mutation (see e.g., US 5, 731, 168, US 5, 807, 706, US 5, 821, 333, US 7, 695, 936, US 8, 216, 805, each incorporated herein by reference in its entirety) .

[0059] The term "hole mutation" as used herein refers to a mutation that introduces a cavity (hole) into a polypeptide at an interface in which the polypeptide interacts with another polypeptide. In some embodiments, the other polypeptide has a knob mutation (see e.g., US 5,731,168, US 5,807,706, US 5,821,333, US 7,695,936, US 8,216,805, each incorporated herein by reference in its entirety) .

[0060] "Complex" or "complexed" as used herein refers to the association of two or more molecules that interact with each other through bonds and / or forces (e.g., van der waals, hydrophobic, hydrophilic forces) that are not peptide bonds. In one embodiment, the complex is heteromultimeric.

[0061] The term “HER2” (also known as HER2 / neu, ERBB2, CD340, receptor tyrosine-protein kinase erbB-2, proto-oncogene Neu, and human epidermal growth factor receptor 2) refers to a member of the human epidermal growth factor receptor (HER / EGFR / ERBB) family of receptor tyrosine kinases. Amplification or overexpression of HER2 plays a significant role in the development and progression of certain aggressive types of cancer, including colorectal cancer, gastric cancer, lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer (NSCLC) ) , biliary cancers (e.g., cholangiocarcinoma, gallbladder cancer) , bladder cancer, esophageal cancer, melanoma, ovarian cancer, liver cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, small intestine cancer, head and neck cancer, uterine cancer, cervical cancer, and breast cancer. Non-limiting examples of HER2 nucleotide sequences are set forth in GenBank reference numbers NP 001005862, NP 001289936, NP 001289937, NP 001289938, and NP 004448. Non-limiting examples of HER2 peptide sequences are set forth in GenBank reference numbers NP 001005862, NP 001276865, NP 001276866, NP 001276867, and NP 004439.

[0062] When HER2 is amplified or overexpressed in or on a cell, especially a cancer cell, the cell is referred to as being “HER2 positive. ” The level of HER2 amplification or overexpression in HER2 positive cells is commonly expressed as a score ranging from 0 to 3 (i.e., HER2 0, HER2 1+, HER2 2+, or HER2 3+) , with higher scores corresponding to greater degrees of expression. A “HER2 positive cancer” or “aHER2 positive tumor” as used exchangeably herein refers to a cancer or tumor with a score of HER2 1+, HER2 2+, or HER2 3+.

[0063] The term “GPC3 positive tumor” refers to a tumor or cancer that overexpresses GPC3. Cancers that overexpress GPC3 are typically solid tumors. Examples include, but are not limited to, hepatocellular carcinoma (HCC) , melanoma, ovarian clear-cell carcinomas, yolk sac tumors (YST) , neuroblastoma, hepatoblastoma, Wilms' tumors, squamous cell carcinoma of the lung, liposarcoma, cervical intraepithelial neoplasia, adenoma of the adrenal gland, schwannoma and embryonal tumors.

[0064] The term “IL-15 receptor” , “IL-15R” , “IL-15Ra” or “IL-15Rα” as used herein refers to a full-length naturally-occurring IL-15 receptor alpha (IL-15Ra) (e.g., a mammalian IL-15Ra, e.g., human IL-15Ra, e.g., GenBank Accession Number AAI21141.1) , an active fragment of IL-15Ra, or an active variant having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to a naturally-occurring wild type polypeptide of IL-15Ra or fragment thereof. As used herein, the terms IL-15R and IL-15Ra are interchangeable. The Sushi domain of IL-15Ra ( “IL-15RαSu” or “IL-15Rα Sushi” ) refers to a domain beginning at the first cysteine residue after the signal peptide of IL-15Ra, and ending at the fourth cysteine residue after said signal peptide.

[0065] The term “IL-15” as used herein refers to a full-length naturally-occurring IL-15 (e.g., a mammalian IL-15, e.g., human IL-15, e.g., GenBank Accession Number AAI00963.1) , an active fragment of IL-15, or an active variant having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to a naturally-occurring wild type polypeptide of IL-15 or fragment thereof. The variant includes a derivative, e.g., a mutant, of a wild type polypeptide or nucleic acid encoding the same. The IL-15 variant may have at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%activity of the wild type IL-15 polypeptide.

[0066] As used herein, the term “anti-tumor agent” or “antitumor drug” as used herein generally refers to any agent that can be used to treat a cell proliferative disorder such as cancer, including but not limited to, cytotoxic agents, chemotherapeutic agents, radiotherapy and radiotherapeutic agents, targeted anti-cancer agents, and immunotherapeutic agents.

[0067] As used herein, the term “anti-tumor activity” means a reduction in the rate of tumor cell proliferation, viability or metastatic activity. A possible way of showing anti-tumor activity is to show a decline in growth rate of tumor cells, tumor size stasis or tumor size reduction. Such activity can be assessed using accepted in vitro or in vivo tumor models, including but not limited to xenograft models, allograft models, MMTV models, and other known models known in the art to investigate anti-tumor activity.

[0068] As used herein, the term “subject” includes human and non-human animals. Non-human animals include all vertebrates, e.g., mammals and non-mammals, such as non-human primates, sheep, dog, cow, chickens, amphibians, and reptiles. Except when noted, the terms “patient” or “subject” are used herein interchangeably.

[0069] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable” generally refers to one or more non-toxic substances that do not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active ingredient. Such formulations may typically contain salts, buffers, preservatives, compatible carriers, and optionally other therapeutic agents. Such pharmaceutically acceptable formulations may also typically contain compatible solid or liquid fillers, diluents, or encapsulating materials suitable for administration to humans. When used in medicine, the salt should be a pharmaceutically acceptable salt, but non-pharmaceutically acceptable salts can be conveniently used to prepare pharmaceutically acceptable salts and cannot be excluded from the scope of the present invention. Such pharmacologically and pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, salts prepared from the following acids: hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, maleic acid, acetic acid, salicylic acid, citric acid, boric acid, formic acid, malonic acid, succinic acid, etc. Pharmacologically acceptable salts can also be prepared as alkali metal salts or alkaline earth metal salts, such as sodium, potassium or calcium salts. The term “solvate” is used herein in the conventional sense to refer to a complex of a solute (e.g., an active compound, a salt of an active compound) and a solvent. Solvates usually do not significantly alter the physiological activity or toxicity of the compound and therefore can act as pharmacological equivalents. If the solvent is water, the solvent compound may be conveniently referred to as a hydrate, e.g., monohydrate, dihydrate, trihydrate, etc.

[0070] As used herein, the terms “treat, ” “treating, ” or “treatment” of any disease or disorder generally refer in one aspect, to ameliorating the disease or disorder (i.e., slowing or arresting or reducing the development of the disease or at least one of the clinical symptoms thereof) . In another aspect, “treat, ” “treating, ” or “treatment” refers to alleviating or ameliorating at least one physical parameter including those which may not be discernible by the patient. In yet another aspect, “treat, ” “treating, ” or “treatment” refers to modulating the disease or disorder, either physically, (e.g., stabilization of a discernible symptom) , physiologically, (e.g., stabilization of a physical parameter) or both. In yet another aspect, “treat, ” “treating, ” or “treatment” refers to preventing or delaying the onset or development or progression of the disease or disorder.

[0071] As used herein, the term “therapeutically acceptable amount” or “therapeutically effective dose” interchangeably refers to an amount sufficient to effect the desired result (i.e., a reduction in tumor size, inhibition of tumor growth, prevention of metastasis, inhibition or prevention of viral, bacterial, fungal or parasitic infection) . In some embodiments, a therapeutically acceptable amount does not induce or cause undesirable side effects. A therapeutically acceptable amount can be determined by first administering a low dose, and then incrementally increasing that dose until the desired effect is achieved. A “prophylactically effective dosage, ” and a “therapeutically effective dosage, ” of the molecules of the present disclosure can prevent the onset of or result in a decrease in severity of, respectively, disease symptoms, including symptoms associated with cancer.

[0072] As used herein, the terms “comprising” , “containing” , “having” , “include” , and “including” are to be construed as “including, but not limited to” unless otherwise noted. The terms “a, ” “an, ” and “the” and similar referents in the context of describing the invention and, specifically, in the context of the appended claims, are to be construed to cover both the singular and the plural unless otherwise noted. The use of any and all examples or exemplary language ( “for example” , “e.g. ” , “such as” ) is intended merely to illustrate aspects or embodiments of the invention, and is not to be construed as limiting the scope thereof, unless otherwise claimed.

[0073] As used herein, the term “about” when referring to a measurable value such as an amount, a temporal duration, and the like, is meant to encompass variations of ±20%or in some instances ±10%or in some instances ±5%or in some instances ±1%or in some instances ±0.1%from the specified value, as such variations are appropriate to perform the disclosed methods.

[0074] The term “vector” includes shuttle and expression vectors. Typically, a vector could be a plasmid construct that also include an origin of replication (e.g., the Col E1 origin of replication) and a selectable marker (e.g., ampicillin or tetracycline resistance) , for replication and selection, respectively, of the plasmids in bacteria. An “expression vector” refers to a vector that contains the necessary control sequences or regulatory elements for expression of the antibodies including antibody fragment of the present disclosure, in bacterial or eukaryotic cells.

[0075] Multi-specific Molecules Targeting HER2 and CD16A

[0076] A first aspect of the disclosure provides a multi-specific molecule comprising: (a) an anti-HER2 antibody comprising two heavy chains and two light chains; (b) an IL-15 polypeptide, covalently linked to C-terminus of one of the two heavy chains of the anti-HER2 antibody; (c) an IL-15Rα Sushi polypeptide, covalently linked to C-terminus of the other of the two heavy chains of the anti-HER2 antibody; and (d) an anti-CD16A VHH polypeptide, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα Sushi polypeptide.

[0077] Anti-HER2 Antibodies

[0078] In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is an anti-HER2 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, and 17, respectively, according to Kabat definition.

[0079] In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is an anti-HER2 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21, 22, and 23, respectively, according to IMGT definition.

[0080] In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is an anti-HER2 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively.

[0081] In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is an anti-HER2 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, and 17, respectively, according to Kabat definition, and comprises a human IgG1 heavy chain constant region and a human IgG1 light chain constant region.

[0082] In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is an anti-HER2 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21, 22, and 23, respectively, according to IMGT definition, and comprises a human IgG1 heavy chain constant region and a human IgG1 light chain constant region.

[0083] In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is an anti-HER2 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively, and comprises a human IgG1 heavy chain constant region and a human IgG1 light chain constant region.

[0084] In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is an anti-HER2 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, and 17, respectively, according to Kabat definition, and comprises a first human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, and a second human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering, and a human IgG1 light chain constant region.

[0085] In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is an anti-HER2 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21, 22, and 23, respectively, according to IMGT definition, and comprises a first human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, and a second human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering, and a human IgG1 light chain constant region.

[0086] In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is an anti-HER2 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively, and comprises a first human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, and a second human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering, and a human IgG1 light chain constant region.

[0087] In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is an anti-HER2 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, and 17, respectively, according to Kabat definition, and comprises a heavy chain constant region and a light chain constant region having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to those as shown in SEQ ID NOs: 33 and 36, respectively.

[0088] In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is an anti-HER2 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21, 22, and 23, respectively, according to IMGT definition, and comprises a heavy chain constant region and a light chain constant region having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to those as shown in SEQ ID NOs: 33 and 36, respectively.

[0089] In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is an anti-HER2 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively, and comprises a heavy chain constant region and a light chain constant region having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to those as shown in SEQ ID NOs: 33 and 36, respectively.

[0090] In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is an anti-HER2 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, and 17, respectively, according to Kabat definition, and comprises a first heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 35, and a light chain constant region as shown in SEQ ID NO: 36.

[0091] In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is an anti-HER2 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21, 22, and 23, respectively, according to IMGT definition, and comprises a first heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 35, and a light chain constant region as shown in SEQ ID NO: 36.

[0092] In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is an anti-HER2 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively, and comprises a first heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 35, and a light chain constant region as shown in SEQ ID NO: 36.

[0093] In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is Trastuzumab. In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is Trastuzumab having KiH mutations. In some embodiments, the anti-HER2 antibody of the multi-specific molecule is Trastuzumab having T366S+L368A+Y407V substitutions in one heavy chain and a T366W substitution in another heavy chain, according to Eu Numbering scheme.

[0094] IL-15 Polypeptides

[0095] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule is a human IL-15 polypeptide.

[0096] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 4. In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 47.

[0097] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule is linked to the heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, and more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0098] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule is linked to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering scheme.

[0099] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide is linked to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering scheme.

[0100] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide is a human IL-15 polypeptide and linked to the heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering scheme.

[0101] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 4 and the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule is linked to the heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering scheme. In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 47 and the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule is linked to the heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering scheme.

[0102] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule is linked to the heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, and more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38 and the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule is linked to the heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering scheme.

[0103] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 4, is linked to the heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, and more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38, and is linked to the heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering scheme. In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15 polypeptide of the multi-specific molecule has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 47, is linked to the heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, and more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38, and is linked to the heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering scheme.

[0104] IL-15Rα Sushi Polypeptides

[0105] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule is a human IL-15Rα sushi polypeptide.

[0106] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 3.

[0107] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule is linked to the heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, and more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0108] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule is linked to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering.

[0109] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule is linked to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering.

[0110] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule is a human IL-15Rα sushi polypeptide and linked to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering.

[0111] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule is linked to a heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, and more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38 and to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering.

[0112] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule is a human IL-15Rα sushi polypeptide, linked to a heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, and more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38 and to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering.

[0113] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the IL-15Rαsushi polypeptide of the multi-specific molecule has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 3, linked to a heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, and more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38, and to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering.

[0114] Anti-CD16A VHH Polypeptides

[0115] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 27, 28, and 29, respectively, according to Kabat definition.

[0116] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 30, 31, and 32, respectively, according to IMGT definition.

[0117] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 26.

[0118] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0119] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 27, 28, and 29, respectively, according to Kabat definition, and is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0120] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 30, 31, and 32, respectively, according to IMGT definition, and is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0121] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence having at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 26 and is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0122] In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptides linked to the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα sushi polypeptide have same CDRs. In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptides linked to the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα sushi polypeptide have different CDRs. In some embodiments, in any one of the embodiments described above, the anti-CD16A VHH polypeptides linked to the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα sushi polypeptide have same amino acid sequences.

[0123] In preferable embodiments, provided is a multi-specific molecule comprising:

[0124] (a) an anti-HER2 antibody comprising a first heavy chain comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 24 and a first heavy chain constant region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 24 and a second heavy chain constant region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 35, and two light chains with each light chain comprising a light chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 25 and a light chain constant region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 36;

[0125] (b) an IL-15 polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4 or 47, covalently linked to C-terminus of the second heavy chain of the anti-HER2 antibody, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38;

[0126] (c) an IL-15Rα Sushi polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3, covalently linked to C-terminus of the first heavy chain of the anti-HER2 antibody, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38; and

[0127] (d) an anti-CD16A VHH polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 26, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα Sushi polypeptide, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0128] In preferable embodiments, provided is a multi-specific molecule comprising:

[0129] (a) Trastuzumab,

[0130] (b) an IL-15 polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4 or 47, covalently linked to C-terminus of one heavy chain of Trastuzumab, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38;

[0131] (c) an IL-15Rα Sushi polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3, covalently linked to C-terminus of the other heavy chain of Trastuzumab, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38; and

[0132] (d) an anti-CD16A VHH polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 26, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα Sushi polypeptide, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0133] In preferable embodiments, provided is a multi-specific molecule comprising:

[0134] (a) Trastuzumab having T366S+L368A+Y407V substitutions in a first heavy chain and a T366W substitution in a second heavy chain, according to Eu Numbering scheme,

[0135] (b) an IL-15 polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4, covalently linked to C-terminus of the first heavy chain of Trastuzumab, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38;

[0136] (c) an IL-15Rα Sushi polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3, covalently linked to C-terminus of the second heavy chain of Trastuzumab, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38; and

[0137] (d) an anti-CD16A VHH polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 26, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα Sushi polypeptide, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0138] Polypeptides, Polynucleotides, Vectors, and Host Cells

[0139] Polypeptides

[0140] A second aspect of the disclosure provides a plurality of polypeptides.

[0141] In some embodiments, provided is a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-HER2 antibody, a heavy chain constant region of the anti-HER2 antibody, an IL-15Rα Sushi polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide.

[0142] In some embodiments, provided is a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-HER2 antibody, a heavy chain constant region of the anti-HER2 antibody, an IL-15 polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide.

[0143] In some embodiments, provided is a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-HER2 antibody, a heavy chain constant region of the anti-HER2 antibody, a peptide linker, an IL-15Rα Sushi polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide.

[0144] In some embodiments, provided is a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-HER2 antibody, a heavy chain constant region of the anti-HER2 antibody, a peptide linker, an IL-15 polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide.

[0145] In any one of the embodiments described above under this section, the anti-HER2 antibody may be any one of the anti-HER2 antibodies described above under the section subtitled Anti-HER2 Antibodies.

[0146] In any one of the embodiments described above under this section, the IL-15 polypeptide may be any one of the IL-15 polypeptides described above under the section subtitled IL-15 Polypeptides.

[0147] In any one of the embodiments described above under this section, the IL-15RαSushi polypeptide may be any one of the IL-15Rα Sushi polypeptides described above under the section subtitled IL-15Rα Sushi Polypeptides.

[0148] In any one of the embodiments described above under this section, the anti-CD16A VHH polypeptide may be any one of the anti-CD16A VHH polypeptides described above under the section subtitled Anti-CD16A VHH Polypeptides.

[0149] In any one of the embodiments described above under this section, the linker may be independently a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38. In preferable embodiments, all the linkers contained in the same molecule are the same. In preferable embodiments, all the linkers contained in the same molecule are the same and have an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 38.

[0150] In preferable embodiments, provided is a polypeptide having an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 5, 6, 10, and 11. In preferable embodiments, provided is a polypeptide having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5. In preferable embodiments, provided is a polypeptide having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6. In preferable embodiments, provided is a polypeptide having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10. In preferable embodiments, provided is a polypeptide having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11.

[0151] Polynucleotides, Vectors, and Host Cells

[0152] Additional aspects of the disclosure provide a polynucleotide encoding any one of the multi-specific molecules and the polypeptides described above.

[0153] In some embodiments, provided is a polynucleotide encoding any one of the polypeptides described above.

[0154] In some embodiments, the polynucleotide is DNA, cDNA or RNA. In some embodiments, polynucleotide is cDNA.

[0155] In some embodiments, provided is a vector comprising the polynucleotide. In some embodiments, the vector is an expression vector. In some embodiments, the vector is a plasmid. In some embodiments, the plasmid is from E. coli. In some embodiments, the vector is a viral vector. In some embodiments, the viral vector is an AAV vector. In some embodiments, the viral vector is an AAV vector comprising the polynucleotide in the form of mRNA.

[0156] In some embodiments, provided is a host cell comprising the vector or the polynucleotide. In some embodiments, the host cell is a prokaryotic cell. In some embodiments, the host cell is a non-human eukaryotic cell. In some embodiments, the host cell is a HEK cell. In some embodiments, the host cell is a Vero cell. In some embodiments, the host cell is a CHO cell.

[0157] Multispecific Molecules Targeting GPC3 and CD16A

[0158] Another aspect of the disclosure provides a multi-specific molecule comprising (a) an anti-GPC3 antibody comprising two heavy chains and two light chains; (b) an IL-15 polypeptide, covalently linked to C-terminus of one of the two heavy chains of the anti-GPC3 antibody; (c) an IL-15Rα Sushi polypeptide, covalently linked to C-terminus of the other of the two heavy chains of the anti-GPC3 antibody; and (d) an anti-CD16A VHH polypeptide, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα Sushi polypeptide.

[0159] Anti-GPC3 antibody

[0160] In some embodiments, the anti-GPC3 antibody of the multi-specific molecule is an anti-GPC3 antibody comprising a heavy chain variable region comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43 and a light chain variable region comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44.

[0161] In some embodiments, the anti-GPC3 antibody of the multi-specific molecule is an anti-GPC3 antibody comprising a heavy chain comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 39 and a light chain comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40.

[0162] In some embodiments, the IL-15 polypeptide may be any one of the IL-15 polypeptides described above under the section subtitled IL-15 Polypeptides of the section title Multi-specific Molecules Targeting HER2 and CD16A.

[0163] In some embodiments, IL-15Rα Sushi polypeptide may be any one of the IL-15RαSushi polypeptides described above under the section subtitled IL-15Rα Sushi Polypeptides of the section title Multi-specific Molecules Targeting HER2 and CD16A.

[0164] In some embodiments, the anti-CD16A VHH polypeptide may be any one of the anti-CD16A VHH polypeptides described above under the section subtitled Anti-CD16A VHH Polypeptides of the section title Multi-specific Molecules Targeting HER2 and CD16A.

[0165] In preferable embodiments, provided is a multispecific antibody targeting GPC3 and CD16A, comprising a first heavy chain comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 45, a second heavy chain comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46, and two light chains each comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40.

[0166] Another apsect of the disclosure provides a polypeptide of the heavy chain of the multispecific antibodies or molecues targeting GPC3 and CD16A as provided herein. In some embodiments, provided is a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-GPC3 antibody, a heavy chain constant region of the anti-GPC3 antibody, an IL-15Rα Sushi polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide.

[0167] In some embodiments, provided is a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-GPC3 antibody, a heavy chain constant region of the anti-GPC3 antibody, an IL-15 polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide.

[0168] In some embodiments, provided is a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-GPC3 antibody, a heavy chain constant region of the anti-GPC3 antibody, a peptide linker, an IL-15Rα Sushi polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide.

[0169] In some embodiments, provided is a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-GPC3 antibody, a heavy chain constant region of the anti-GPC3 antibody, a peptide linker, an IL-15 polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide.

[0170] In some embodiments, the anti-GPC3 antibody of the polypeptide comprises: (a) a heavy chain variable region comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43 and a light chain variable region comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44; or (b) a heavy chain comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 39 and a light chain comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40.

[0171] In some embodiments, the IL-15 polypeptide: (a) is a human IL-15 polypeptide; and / or (b) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 4. In some embodiments, the IL-15 polypeptide: (a) is a human IL-15 polypeptide; and / or (b) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 47.

[0172] In some embodiments, the IL-15Rα sushi polypeptide: (a) is a human IL-15Rα sushi polypeptide; and / or (b) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 3.

[0173] In some embodiments, the anti-CD16A VHH polypeptide has one or more features selected from a group consisting of: (a) has CDR1, CDR2, and CDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 27, 28, and 29, respectively, according to Kabat definition; (b) has CDR1, CDR2, and CDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 30, 31, and 32, respectively, according to IMGT definition; and (c) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that shown in SEQ ID NO: 26.

[0174] In some embodiments, the peptide linker is independently a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.

[0175] In preferable embodiments, the polypeptide comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 45. In preferable embodiments, the polypeptide comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46.

[0176] Pharmaceutical Compositions

[0177] The present disclosure, in another aspect, provides a pharmaceutical composition comprising a multi-specific molecule, a polypeptide, a vector, or a host cell ( “collectively referred to as active ingredient” ) , as disclosed herein above, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0178] The present compositions can be in any form that allows for the composition to be administered to a patient. For example, the composition can be in the form of a solid, liquid or gas (aerosol) . Typical routes of administration include, without limitation, oral, topical, parenteral, sublingual, rectal, vaginal, ocular, intra-tumor, and intranasal. Parenteral administration includes subcutaneous injections, intravenous, intramuscular, intrasternal injection or infusion techniques. In one aspect, the compositions are administered parenterally. In yet another aspect, the compositions are administered intravenously.

[0179] Pharmaceutical compositions can be formulated so as to allow the active ingredient to be bioavailable upon administration of the composition to a patient. Compositions can take the form of one or more dosage units, where for example, a tablet can be a single dosage unit, and a container in aerosol form can hold a plurality of dosage units.

[0180] Materials used in preparing the pharmaceutical compositions can be non-toxic in the amounts used. It will be evident to those of ordinary skill in the art that the optimal dosage of the active ingredient (s) in the pharmaceutical composition will depend on a variety of factors. Relevant factors include, without limitation, the type of animal (e.g., human) , the particular form of the active ingredient, the manner of administration, and the employed composition.

[0181] The pharmaceutically acceptable carrier or vehicle can be particulate, so that the compositions are, for example, in tablet or powder form. The carrier (s) can be liquid, with the compositions being, for example, an oral syrup or injectable liquid. In addition, the carrier (s) can be gaseous or particulate, so as to provide an aerosol composition useful in, e.g., inhalatory administration.

[0182] The composition can be in the form of a liquid, e.g., an elixir, syrup, solution, emulsion or suspension. The liquid can be useful for oral administration or for delivery by injection. When intended for oral administration, a composition can comprise one or more of a sweetening agent, preservatives, dye / colorant and flavor enhancer. In a composition for administration by injection, one or more of a surfactant, preservative, wetting agent, dispersing agent, suspending agent, buffer, stabilizer and isotonic agent can also be included.

[0183] The liquid compositions, whether they are solutions, suspensions or other like form, can also include one or more of the following: sterile diluents such as water for injection, saline solution, preferably physiological saline, Ringer’s solution, isotonic sodium chloride, fixed oils such as synthetic mono or digylcerides which can serve as the solvent or suspending medium, polyethylene glycols, glycerin, cyclodextrin, propylene glycol or other solvents; antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl paraben; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; buffers such as acetates, citrates or phosphates and agents for the adjustment of tonicity such as sodium chloride or dextrose. A parenteral composition can be enclosed in ampoule, a disposable syringe or a multiple-dose vial made of glass, plastic or other material. Physiological saline is an exemplary adjuvant. An injectable composition is preferably sterile.

[0184] The amount of the active ingredient that is effective in the treatment of a particular disorder or condition will depend on the nature of the disorder or condition and can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vitro or in vivo assays can optionally be employed to help identify optimal dosage ranges. The precise dose to be employed in the compositions will also depend on the route of administration, and the seriousness of the disease or disorder, and should be decided according to the judgment of the practitioner and each patient’s circumstances.

[0185] The compositions comprise an effective amount of an active ingredient such that a suitable dosage will be obtained. Typically, this amount is at least about 0.01%of an active ingredient by weight of the composition. When intended for oral administration, this amount can be varied to range from about 0.1%to about 80%by weight of the composition. In one aspect, oral compositions can comprise from about 4%to about 50%of the active ingredient by weight of the composition. In yet another aspect, present compositions are prepared so that a parenteral dosage unit contains from about 0.01%to about 2%by weight of the active ingredient.

[0186] For intravenous administration, the composition can comprise from about 0.01 to about 100 mg of an active ingredient per kg of the animal’s body weight. In one aspect, the composition can include from about 1 to about 100 mg of an active ingredient per kg of the animal’s body weight. In another aspect, the amount administered will be in the range from about 0.1 to about 25 mg / kg of body weight of the active ingredient.

[0187] Generally, the dosage of an active ingredient administered to a patient is typically about 0.01 mg / kg to about 2000 mg / kg of the animal’s body weight. In one aspect, the dosage administered to a patient is between about 0.01 mg / kg to about 10 mg / kg of the animal’s body weight, in another aspect, the dosage administered to a patient is between about 0.1 mg / kg and about 250 mg / kg of the animal’s body weight, in yet another aspect, the dosage administered to a patient is between about 0.1 mg / kg and about 20 mg / kg of the animal’s body weight, in yet another aspect the dosage administered is between about 0.1 mg / kg to about 10 mg / kg of the animal’s body weight, and in yet another aspect, the dosage administered is between about 1 mg / kg to about 10 mg / kg of the animal’s body weight.

[0188] The pharmaceutical compositions provided herein can further comprise one or more additional anti-cancer agent available in the market.

[0189] Uses and Therapies

[0190] The multi-specific molecule, the polypeptide, the vector, and the host cell (“collectively referred to as active ingredient” ) , as disclosed herein above, are useful for treating a HER2 or GPC3 positive cancer in a patient. The active ingredient can be used accordingly in a variety of settings for the treatment of animal cancers. Without being bound by theory, in one embodiment, the active ingredient disclosed herein binds to or associates with CD16A expressed on, or associated with, the NK cell surface, to HER2 or GPC3 (as the case may be) expressed on a tumor cell and forms a “NK engager” to induce the NK cells to kill the tumor cells. In the present disclosure, the NK engager is further enhanced due to the IL-15 / IL-15Ra complex.

[0191] The present disclosure, in a further aspect, provides a method for treating a HER2 or GPC3positive cancer in a subject, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the active ingredient disclosed herein.

[0192] The present disclosure, in a further aspect, provides a method for prevention of a HER2 or GPC3 positive cancer in a subject at a risk of suffering from the cancer, comprising administering to the subject a prophylactically effective amount of the active ingredient disclosed herein.

[0193] In some embodiments, provided are methods for treating or preventing a HER2 or GPC3 positive cancer are provided, including administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of the active ingredient disclosed herein and a chemotherapeutic agent. In one embodiment, the chemotherapeutic agent is that with which treatment of the cancer has not been found to be refractory. In another embodiment, the chemotherapeutic agent is that with which the treatment of cancer has been found to be refractory. The active ingredient can be administered to a patient that has also undergone surgery as treatment for the cancer. In some embodiments, the patient has been found to be refractory to a HER2 antibody, for example, Trastuzumab or Margetuximab.

[0194] In a specific embodiment, the active ingredient is administered concurrently with the chemotherapeutic agent or with radiation therapy. In another specific embodiment, the chemotherapeutic agent or radiation therapy is administered prior or subsequent to administration of the active ingredient, in one aspect at least an hour, five hours, 12 hours, a day, a week, a month, in further aspects several months (e.g., up to three months) , prior or subsequent to administration of the active ingredient.

[0195] Additionally, methods of treatment of a HER2 or GPC3 positive cancer with the active ingredient disclosed herein are provided as an alternative to chemotherapy or radiation therapy where the chemotherapy or the radiation therapy has proven or can prove too toxic, e.g., results in unacceptable or unbearable side effects, for the subject being treated. The animal being treated can, optionally, be treated with another cancer treatment such as surgery, radiation therapy or chemotherapy, depending on which treatment is found to be acceptable or bearable.

[0196] Equivalently, the present disclosure also provides the active ingredient as disclosed herein for use in the treatment of a HER2 or GPC3 positive cancer in a subject. Equivalently, the present disclosure also provides use of the active ingredient as disclosed herein in the manufacturing of a medicament for treatment of a HER2 or GPC3 positive cancer in a subject.

[0197] A “HER2 positive” cancer, cancer cell, subject or patient, as used herein, refers to a cancer, cancer cell, subject, or patient exhibiting a score of at least 2 when using a  (DakoCytomation California Inc., Carpenteria, Calif. ) or a cancer, cancer cell, subject, or patient that has been identified as such by FISH, having a centromere 17 corrected HER2 gene copy number greater than 2 (HER2 FISH / CEP17>2; FISH positive) . In certain embodiments, the HER2 positive cell exhibits a score of at least 2+ or 3+ using the  Immunohistochemistry assay.

[0198] In some instances, the HER2 positive cancer is a HER2 positive solid tumor. Additionally, or alternatively, the HER2 positive cancer may be a locally advanced or metastatic HER2 positive cancer. In some instances, the HER2 positive cancer is a HER2 positive breast cancer or a HER2 positive gastric cancer. In some embodiments, the HER2 positive cancer is selected from the group consisting of a HER2 positive gastroesophageal junction cancer, a HER2 positive colorectal cancer, a HER2 positive lung cancer (e.g., a HER2 positive non-small cell lung carcinoma) , a HER2 positive pancreatic cancer, a HER2 positive colorectal cancer, a HER2 positive bladder cancer, a HER2 positive salivary duct cancer, a HER2 positive ovarian cancer (e.g., a HER2 positive epithelial ovarian cancer) , or a HER2 positive endometrial cancer. In some instances, the HER2 positive cancer is prostate cancer.

[0199] In some embodiments, the HER2 positive cancer has metastasized the central nervous system (CNS) . In some instances, the metastasized HER2 cancer has formed CNS neoplasms. Examples of primary CNS cancers could be gliomas (which may include glioblastoma (also known as glioblastoma multiforme) , astrocytomas, oligodendrogliomas, and ependymomas, and mixed gliomas) , meningiomas, medulloblastomas, neuromas, primary CNS lymphoma (in the brain, spinal cord, or meninges) , among others. Examples of metastatic cancers include those originating in another tissue or organ, e.g., breast, lung, lymphoma, leukemia, melanoma (skin cancer) , colon, kidney, prostate, or other types that metastasize to brain.

[0200] In some embodiments, the HER2 positive cancer is breast cancer. Breast cancer is known to be a heterogeneous disease. There are different subtypes that can be defined based on (i) a molecular profile of a breast cancer tumor, (ii) gene array testing, or (iii) an immunohistochemical analysis approach. In some embodiments, the breast cancer is Basal or Luminal subtype. In particular, mammary ducts are bilayered structures composed of a luminal layer and a myoepithelial layer that adhere to a basement membrane. The term basal refers to certain cancers that arise from the basal layer of the stratified epithelia. Breast carcinomas of the basal subtype reside in the basal layer of the ductal epithelium of the breast as opposed to the apical or luminal layers. Such cancers have distinct cytological features and gene expression profiles such as an intermediate filament profile (cytokeratins) first observed in the basal cells of the skin.

[0201] Exemplary GPC3 positive cancers are hepatocellular carcinoma (HCC) , melanoma, ovarian clear-cell carcinomas, yolk sac tumors (YST) , neuroblastoma, hepatoblastoma, Wilms' tumors, squamous cell carcinoma of the lung, liposarcoma, cervical intraepithelial neoplasia, adenoma of the adrenal gland, schwannoma and embryonal tumors. In preferable embodiments, the GPC3 positive cancer is HCC. Examples

[0202] Example 1: Design TriKEs with different formats and KiH mutations

[0203] This example shows construction and engineering of multi-specific molecules with different format. These different formats are illustrated in Figure 1.

[0204] BM130-97 (Trastuzumab, HC: SEQ ID NO: 1 and LC: SEQ ID NO: 2) was chosen as a building block together with selected CD16A VHHs to construct TriKEs for its success treating HER2+ breast and gastric cancer in clinic. Human IL-15 (SEQ ID NO: 4) and the sushi domain of human IL-15 receptor α (SEQ ID NO: 3) were chosen as building blocks together with selected CD16A VHH (BMP01-16, SEQ ID NO: 26) to construct TriKEs for its clinical potency.

[0205] Trispecific antibodies BMP03-02 and BMP03-08 exemplified in the examples were constructed by fusing IL-15 to C-terminal of BM130-97 hole heavy chain with (G4S) 3 or (G4S) 4 linkers (SEQ ID NO: 37 or 38) , while IL-15RαSu to C-terminal of BM130-97 knob heavy chain with (G4S) 3 or (G4S) 4 linkers, and CD16A VHH (BMP01-16, SEQ ID NO: 26) to C-terminal of IL-15 or IL-15RαSu with (G4S) 3 or (G4S) 4 linkers. The light chain (SEQ ID NO: 2) of BM130-97 was not modified. Thus, BMP03-02 has a first heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, a second heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and two light chains each having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. BMP03-08 has a first heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, a second heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, and two light chains each having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.

[0206] Trispecific antibodies BMP03-04 exemplified in the examples were constructed by fusing IL-15 to C-terminal of BM130-97 hole heavy chain with (G4S) 3 linkers, while IL-15RαSu to C-terminal of BM130-97 knob heavy chain with (G4S) 3 linkers, and CD16A VHH (BMP01-16, SEQ ID NO: 26) to C-terminal of the light chain of BM130-97. Thus, BMP03-04 has a first heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, a second heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, and two light chains each having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.

[0207] Similarly, trispecific antibody BM321 exemplified in the examples were constructed by two heavy chains with KIH structure (SEQ ID No: 41; SEQ ID No: 42) and two light chains (SEQ ID No: 40) . One building block of the trispecific antibody was an anti-GPC3 IgG1 antibody GC33 exemplified in the examples, constructed by heavy chain (SEQ ID No: 39) and light chain (SEQ ID No: 40) .

[0208] Selected trispecifics described above were subjected to further verification using ADCC assay. This example demonstrates better ADCC activity of BMP03-02 antibody using PBMC as effector cells and HER2-expressing cell line JIMT-1 as target cells.

[0209] One day before PBMC killing experiment, 2.5×104 / 100μL target cells were seeded in a 96 plate and incubated overnight at 37℃ in a 5%CO2 incubator. On the day of the experiment, the antibody to be tested was serially diluted 5 times with RPMI-1640 medium. The target cell culture medium was discarded, and 50 μL diluted antibody were added to each well containing target cells. Then 5×105 PBMC cells expanded from isolated human PBMCs were added to each well at 100 μL / well. Set up the following three groups of controls at the same time. (1) Target cell spontaneous release group: 50 μL target cells and 150 μL test medium without test molecules; (2) Antibody-independent cytotoxicity group: 50 μL target cells, 100 μL PBMC cells and 50 μL medium without test molecules; and (3) Target cell maximum release group: 50 μL target cells and 120 μL medium, 30 μL / well lysis solution was added at the end of the experiment to determine the maximum LDH release. Incubate further for 4-6 hours in a 5%CO2 incubator at 37℃.

[0210] After incubation, 50 μL / well of LDH-containing medium supernatant was transferred to a 96-well transparent flat bottom plate, 50 μL of CytoTox reagent was added to the supernatant and incubated at room temperature for 30 min in the dark, then 50 μL of stop solution was added and placed in. Measure the absorbance at 490nm or 492nm within 1 hour.

[0211] The cell killing ratio was calculated by the following formula. Statistical analysis and graphing of data were carried out with GraphPad Prism software.

[0212] Cytotoxicity%= (sample antibody sample OD-antibody-independent cytotoxicity group OD)  /  (target cell maximum release group OD-target cell spontaneous release group OD) *100

[0213] In experiments performed essentially as described above, BMP03-02 has similar EC50 as BMP01-16 but higher maximum activity, while BMP03-04 shown much weaker killing potency. Detailed results were shown in Figure 2.

[0214] Example 2: CHO production and binding characterization of trispecific to HER2 by ELISA

[0215] This example demonstrates CHO production and binding characterization of trispecific to HER2 protein by ELISA.

[0216] Different heavy chains together with corresponding light chain were transiently co-expressed in the ExpiCHO-Scell line (Thermo, A29127) to generate trispecific antibodies. The protein from the ExpiCHO-Ssupernatant was purified using HiTrap MabSelect PrismA (Cytiva, 17549854) , then further purified using POROSTM GoPureTM XS (Thermo, A36638) through AKTA avant150 following manufacturer's instructions. The purified antibody was subjected to in vitro binding and functional characterizations.

[0217] The HER2 proteins from different species including human (SinoBiological, 10004-H08H) , cynomolgus (SinoBiological, 90295-C08H) , mouse (SinoBiological, 50714-M08H) and rat (SinoBiological, 80079-R08H) were coated on the ELISA plate 4℃ overnight, then washed with PBS containing 0.05%Tween20 (PBST) . Serially diluted trispecific antibody BMP03-08 and control antibodies were added to coated ELISA plate and incubated at 37℃for 1 hour, and the binding ability of trispecific antibody to HER2 was detected with an HRP-conjugated Goat anti-human Fab antibody (Sigma-Aldrich, A0293) . The ELISA results showed the binding of BMP03-08 trispecific antibody and control antibody to human, cynomolgus, mouse and rat HER2 proteins. Detailed results were shown in Figure 3.

[0218] In experiments performed essentially as described above, trispecific antibodies BMP03-08 bonded to human and cynomolgus HER2 with affinity below nanomolar. BMP03-08, BMP01-16 and BM130-97 (Trastuzumab) showed similar binding affinities on human, cynomolgus HER2, and none of them showed cross-binding to mouse or rat HER2. The detailed results were shown in Figure 3 and Table 1.

[0219] Table 1: EC50 for Binding of BMP03-08, BMP01-16, BM130-97 and IgG1κ isotype to human, cynomolgus, mouse and rat HER2 on ELISA

[0220] Example 3: Bias-binding with huCD16A.

[0221] The binding of trispecific antibodies to human CD16A and CD16B proteins were characterized by ELISA. The human CD16 proteins including CD16A-158V (KACTUS, FCR-HM43A) , CD16A-158F (KACTUS, CDA-HM416) , CD16B-NA1 (KACTUS, FCR-HM11B) and CD16B-NA2 (KACTUS, FCR-HM42B) were coated on the ELISA plate 4℃ overnight, then washed with PBS containing 0.05%Tween20 (PBST) . Serially diluted trispecific antibody BMP03-08 were added to coated ELISA plate and incubated at 37℃ for 1 hour, and the binding ability of bispecific antibody to CD16 was detected with an HRP-conjugated Goat anti-human Fab antibody (Sigma-Aldrich, A0293) . The ELISA results showed the binding of BMP03-08 trispecific antibody and control antibodies to human CD16A-158V, CD16A-158F, CD16B-NA1 and CD16B-NA2 proteins. Detailed results were shown in Figure 4.

[0222] In experiments performed essentially as described above, trispecific antibody BMP03-08 bonded to human CD16 with similar affinity as BMP01-16. BMP03-08 showed much weak binding to CD16B NA1 or NA2 proteins with more than 100-fold decreased affinity compared to the binding of CD16A. Trastuzumab however only showed weak binding to human CD16. The detailed results were shown in Figure 4 and Table 2.

[0223] Table 2: EC50 for Binding of BMP03-08, BMP01-16 and BM130-97 to human CD16A and CD16B on ELISA

[0224] Example 4: Cross-binding with CD122 / CD132 heterodimer from different species

[0225] The binding of trispecific antibodies to CD122 / CD132 (IL-2Rβγ or IL-15Rβγ) heterodimeric receptor protein from different species including human, cynomolgus, mouse and rat were characterized by ELISA. The heterodimer protein from human (ACROBiosystems, ILG-H5283) , cynomolgus (ACROBiosystems, ILG-C5283) , mouse (ACROBiosystems, ILG-M5283) and rat (ACROBiosystems, ILG-R5283) were coated on the ELISA plate 4℃ overnight, then washed with PBS containing 0.05%Tween20 (PBST) . Serially diluted trispecific antibody BMP03-08 and the positive control N-803 (MCE, HY-P99661) were added to coated ELISA plate and incubated at 37℃ for 1 hour, and the binding ability of trispecific antibody to the heteromeric receptor was detected with an HRP-conjugated Goat anti-human Fc antibody (JacksonImmunoResearch, 109-035-098) . The ELISA results showed the binding of BMP03-08 trispecific antibody and control antibody N-803 to human, cynomolgus, mouse and rat CD122 / CD132 heterodimers. Detailed results were shown in Figure 5.

[0226] In experiments performed essentially as described above, trispecific antibodies BMP03-08 bonded to IL-15Rβγ with much weaker binding than N-803. N-803 bond to human and cynomolgus IL-15Rβγ with high EC50 at 0.0761 nM and 0.4487 nM respectively, while trispecific antibody BMP03-08 bond to human and cynomolgus IL-15Rβγ with much lower EC50 at 17.84 nM and 406.6 nM respectively. There was more than 200-fold decreased affinity.

[0227] Example 5: IL-15 receptor assay

[0228] This example demonstrates evaluation of IL-15 biological activity of BMP03-08 antibody by luciferase reporter assay using hIL2 / IL15 dual effector (hCD122 / hCD132) reporter cells.

[0229] IL-2 and IL-15 share the heterodimeric CD122 (IL-2Rβ)  / CD132 (IL-2Rγ) receptor to deliver their signals within target cells. Their specificity of action is conferred by their αreceptor chains, CD25 (IL-2Rα) and CD215 (IL-15Rα) . The binding of IL-15 or IL-15 / IL-15RαSu complex to their heterodimeric or heterotrimeric receptors leads to the activation of a signaling cascade through tyrosine kinases of the Janus family (JAK1 and JAK3) and signal transducer and transcription activator 5 (STAT5) . Thus, IL-15 activity can be measured using hIL2 / IL15 dual effector (hCD122 / hCD132) reporter cell (Cobier, CBP74170) that expresses an inducible produced firefly luciferase after IL-15 receptor activation.

[0230] The day before experiment, hIL2 / IL15 dual effector (hCD122 / hCD132) reporter cells were inoculated onto 96 plates at a density of 5×105 per well, 100 μL / well, and cultured overnight at 37℃ in a 5%CO2 incubator. On the day of the experiment, the antibody to be tested was diluted 3 times in RPMI-1640 medium containing 10%heat-inactivated FBS. Then 11.1 μL diluted antibody was added to each well containing effector cells and cultured further in a 5%CO2 incubator at 37℃ for 6 hours. Recombinant human IL-15 (Sino Biological, GMP-10360-HNAE) was used as assay controls. At the end of incubation, 100 μL of Ultra Luciferase Detection Kit (Cobier) reaction substrate was added to each well, pipette repeatedly to lyse the cells, leave at room temperature for 3-10 min, then transfer the lysate to a 96-well white plate to avoid the generation of air bubbles, and use a microplate reader to detect the fluorescence value. The relative light unit (RLU) value of the test well was shown and putted into GraphPad Prism software for statistical analysis and graphing.

[0231] In experiments performed essentially as described above, BMP03-08 and rhIL-15 treatments resulted in induction of luciferase production in a dose dependent manner, while rhIL-15 demonstrated superior activity comparing to BMP03-08 with regards to EC50. EC50 for BMP03-08 and rhIL-15 were 0.0946 nM and 10.48 nM respectively in JIMT-1 assay. Detailed results were shown in Figure 6.

[0232] Example 6: T cell activation

[0233] This example demonstrates the T cell-activation potency of BMP03-08 antibody. T cell function was assessed expression of activation markers.

[0234] CD3+ T cells were isolated from PBMCs (Oricells) using human CD3 MicroBeads (Miltenyi Biotec, 130-097-043) following manufacturer's instructions. 1×105  / 100 μL / well T-cells were seeded in 96-well plate, and stimulated with 50 μL 3-times serial-diluted antibodies with KBM 581 media. IL-2 was used as assay control. Cells were incubated for 72 hours at 37℃ in a 5%CO2 incubator, cells were subjected to immunostaining and fluorescent analysis. Cells were collected and stained with CD3-Alexa Flour 700 (Invitrogen, 56-0038-42) , CD4-APC (BioLegend, 300514) , CD8-eFluor 450 (Invitrogen, 48-0088-42) , CD25-R-PE (BioLegend, 356105) and CD69-Alexa Fluor 488 (BioLegend, 310916) under corresponding conditions, after which flowcytometry and fluorescent-pattern analysis were conducted using the AttuneTM NxT flow cytometer (Invitrogen, A24860) and FlowJo analysis software.

[0235] In experiments performed essentially as described above, T-cell activation was determined by measuring the expression of CD69 and CD25 on T cells, which was assessed through immunostaining. BMP03-08 exhibited dose-dependent enhancement of the expression of activation markers. CD3+T-cells derived from PBMC expressed CD69 in the early stage under BMP03-08 or IL-2 stimulation (data not shown) , and both CD4+T-cells and CD8+T-cells expressed more CD25, which was upregulated by the presence of IL-2 or IL-15. Detailed results were shown in Figure 7.

[0236] Example 7: ADCC reporter assay

[0237] This example demonstrates evaluation of ADCC biological activity of BMP03-08 antibody by luciferase reporter assay using Jurkat / NFAT-luc-CD16A transgenic cell line as effector cells and HER2 expressing tumor cell line as target cells.

[0238] The day before the ADCC experiment, HER2+ / - target cells were inoculated onto 96 plates at a density of 2×104 per well, 100 μL / well, and cultured overnight at 37℃ in a 5%CO2 incubator. On the day of the experiment, the antibody to be tested was diluted 5 times in RPMI-1640 medium containing 10%heat-inactivated FBS. 50 μL diluted antibody was added to each well containing target cells. BMP01-16 was used as positive control, while human IgG1κ isotype (MCE, HY-P99001) and BM130-97 were used as negative control. Then 2×104 Jurkat-NFAT-Luc2-CD16a-158V or Jurkat-NFAT-Luc2-CD16a-158F effector cells (50 μL / well) were added to the wells and cultured further in a 5%CO2 incubator at 37℃ for 6 hours. At the end of incubation, 100 μL of Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega, E2520) reaction substrate was added to each well, pipette repeatedly to lyse the cells, leave at room temperature for 5-30 min, then transfer the lysate to a 96-well white plate to avoid the generation of air bubbles, and use a microplate reader to detect the fluorescence value.

[0239] The ADCC Luciferase induction fold is calculated by the fold change of the relative light unit (RLU) value of the test well and the control well (simulated buffer reaction with target cells and effector cells) : Fold change = (RLU test drug-RLU culture medium control)  /  (RLU NC-RLU culture medium control) , using GraphPad Prism software for statistical analysis and graphing.

[0240] Culture medium control: only add culture medium

[0241] NC control: target cells + effector cells without samples to be tested

[0242] In experiments performed essentially as described above, BMP03-08, BMP01-16 and BM130-97 treatments resulted in induction of ADCC in a dose and target cell dependent manner on different target cell lines. BMP03-08 shows HER2 antigen-dependent ADCC when comparing MC38 and MC38-HER2 as target cell, similarly to BMP01-16. BMP03-08 demonstrated superior ADCC activity comparing to BM130-97 (Trastuzumab) with regards to EC50 (Table 3) and maximum fold induction. BMP03-08 enhanced ADCC stronger than BMP01-16 regardless of CD16 genotype. Detailed results were shown in Figure 8.

[0243] Table 3. EC50 of luciferase activity of Jurkat T-CD16A-158F or 158V cells after incubation with antibodies

[0244] Example 8: NK cell killing assay

[0245] This example demonstrates enhancement of NK cell killing activity of BMP03-08 antibody by cell counting kit-8 assay using NK expanded from PBMC as effector cells and HER2-expressing tumor cell lines as target cells.

[0246] One day before NK killing experiment, 1×104 / 100μL target cells were seeded in a 96 plate and incubated overnight at 37℃ in a 5%CO2 incubator. On the day of the experiment, the antibody to be tested was serially diluted 5 times with RPMI-1640 medium. The target cell culture medium was discarded, and 50 μL diluted antibody were added to each well containing target cells. Then 3×104 NK cells expanded from isolated human PBMCs were added to each well at 50 μL / well. Set up the following three groups of controls at the same time. (1) Target cell maximum growth group: same amount of target cells and 100 μL test medium without test molecules; (2) Antibody-independent cytotoxicity group: same amount of target cells and effector NK cells with 50 μL medium without test molecules; and (3) Media only group: same total amount of 100 μL medium as other wells. Incubate further for 48-72 hours in a 5%CO2 incubator at 37℃.

[0247] At the end of incubation, 10 μL of Cell Counting Kit-8 (Beyotime, C0046) solution was added to each well, mixed by gently tapping, allowing to continuously culture for indicated duration in cell culture incubator. The absorbance at 450 nm were then measured in a microplate reader. Medium only wells were served as blank control.

[0248] The cell killing ratio was calculated by the following formula. Statistical analysis and graphing of data were carried out with GraphPad Prism software.

[0249] Cell killing%= 100%-100* [ (antibody sample OD –blank OD) – (antibody-independent cytotoxicity group OD –blank OD) ]  /  [ (target cell maximum growth group OD -blank OD) – (independent cytotoxicity group OD –blank OD) ]

[0250] In experiments performed essentially as described above, BMP03-08 treatments result in various degree of induction of cell killing depending on cell type and HER2 expression levels (see Figure 11 (A) HER2+++ cells, (B) HER2++ cells, and (C) HER2 + / -cells) . In all cases, especially DS8201 resistant cell lines IGROV-1 and MKN-45, BMP03-08 demonstrated superior enhancement of NK killing activity compared to BMP01-16 and BM130-97 (Trastuzumab) with regards to EC50 and maximum cytotoxicity. Detailed results were shown in Figure 9.

[0251] Example 9: PBMC cell killing assay

[0252] This example demonstrates enhancement of immune cell killing activity of BMP03-08 antibody by live cell imaging-based assay using PBMC as effector cells and HER2-expressing tumor cell line JIMT-1 as target cells.

[0253] One day before ADCC killing experiment, target cells were digested and well-stained with Celltracker CM-DiI (YEASEN, 40718ES72) , then 5×103 / 100μL target cells were seeded in a 96 plate and incubated overnight at 37℃ in a 5%CO2 incubator. On the day of the experiment, the antibody to be tested was serially diluted 5 times with RPMI-1640 medium. The target cell culture medium was discarded, and 50 μL diluted antibody were added to each well containing target cells. Then 1×105 human PBMC cells were added to each well at 50 μL / well. Finally, diluted Caspase -3 / 7 Dye for Apoptosis (Sartorius, 4440) were added to each well at 50 μL / well. Set up the following three groups of controls at the same time. (1) Target cell maximum growth group: same amount of target cells and 100 μL test medium without test molecules; and (2) Antibody-independent cytotoxicity group: same amount of target cells and effector NK cells with 50 μL medium without test molecules; and (3) Effector only group: same amount of effector cells and 100 μL test medium without test molecules. Plate was placed in  S3 Live-Cell Analysis Instrument and incubate further for more than 3 days inside a 5%CO2 incubator at 37℃ with a scan every 2 hours.

[0254] After incubation, scan schedule was terminated, and all the images were analyzed with S3 Live-Cell Analysis System. Both green and red fluorescent channels plus HD phase contrast images were collected and analyzed. Red signal represented target cells, green signal represented apoptosis cells and green plus red signals represented dead target cells. Here, total overlap area (μm2 / image) was used to indicate cytotoxicity level in the time courses.

[0255] In experiments performed essentially as described above, BMP03-08 treatments result in induction of target cell apoptosis in a time course manner. n consistent with previous luciferase reporter assay and NK killing assay, in case of JIMT-1, BMP03-08 demonstrated superior enhancement of PBMC killing activity compared to BM130-97 (Trastuzumab) and BMP01-16 with regards to maximum overlap signal. Detailed results were shown in Figure 10.

[0256] Example 10: In vivo efficacy of BMP03-08 in MDA-MB-453 CDX mouse model

[0257] This example demonstrates the in vivo efficacy testing of BMP03-02 and BMP03-08 antibodies using the MDA-MB-453 cell derived xenograft (CDX) mouse model.

[0258] MDA-MB-453 cells were cultured in DMEM medium containing 10%heat-inactivated FBS, and the tumor cells were collected when the required cell number was reached. On day 0, 0.1 mL 5×106 MDA-MB-453 human breast cancer cells were mixed with equal volume of Matrigel (Corning, 354234) and implanted subcutaneously into the right forelimb of 6～8-week-old female B-NDG mice (Beijing Biocytogen Co., Ltd) . The engrafted mice were randomly divided into 6 groups with 5 mice in each group when the average tumor volume reaches 80mm3 according to the tumor volume and body weight, and the tumor volume CV within group is <1 / 3. The day of grouping was defined as PG-D0, and the test antibody was given on the day of random grouping. Mice were treated with BMP01-16, BMP03-02 and BMP03-08 mixed with NK cells intravenously at an equal molar dose levels (2.4 mg / kg for BMP01-16 and 2.7 mg / kg for BMP03-02 and BMP03-08) once a week for 4 weeks. In addition, two control groups were set up, including the MDA-MB-453 cancer cell group and the NK + vehicle group. Tumor volumes were recorded twice a week from the day post administration. Data analysis and graphing were performed using GraphPad Prism software.

[0259] In experiments performed essentially as described above, there were significant tumor growth inhibition with BMP01-16 and all three BMP03 molecules by day 17, the time point after the 3rd dosage. In contrast, only NK supplementary had no tumor suppressive effect, indicating the anti-tumor activity was rely on the NK Engager in this experimental setting, and no body weight loss at 2.4 or 2.7 mg / kg doses. BMP03-08 showed efficacy earlier than BMP03-02 and. Detailed results were shown in Figure 11.

[0260] Example 11: In vivo efficacy of BMP03-08 in MDA-MB-231 CDX mouse model

[0261] This example demonstrates the in vivo efficacy testing of BMP01-16 antibody using the MDA-MB-231 mouse model.

[0262] Bone marrow cells from CB-17 / SCID-hCD16A mice (Beijing Biocytogen Co., Ltd) were transplanted into the tail vein of irradiated 4-week old CB17 / SCID mice (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) to construct hCD16A knock-in mice. MDA-MB-231 cells were cultured in DMEM medium containing 10% heat-inactivated FBS, and the tumor cells were collected when the required cell number was reached. One month later, 0.2 ml 5×106 MDA-MB-231 human breast cancer cells + 50% Matrigel (Corning, 354234) (PBS : Matrigel at 1:1 volume ratio) were injected subcutaneously into the right forelimb of each mouse for tumor engraftment. When the average tumor volume reached about 80-100 mm3, the tumor-bearing mice were randomly divided into 3 groups (5 mice per group) according to the tumor volume and body weight, and the tumor volume CV within group is <1 / 3. The day of grouping was defined as PG-D0, and the test antibody was given on the day of random grouping. The doses were 3 mg / kg and 9 mg / kg BMP03-08, respectively. Antibodies were intraperitoneally administered twice a week in the following 3 weeks. Body weight and tumor volume were measured twice a week. Tumor growth inhibition (TGI) was calculated as follows: TGI%=(1-T / C)x100%, T and C were the average TVs of the treatment group and the control group at the end of the experiment. Data analysis was performed using GraphPad Prism software, and the results were shown as the mean 士 S.E.M of tumor volume.

[0263] In experiments performed essentially as described above, treatments started when tumor reached about 80-100 mm3 in size. Both 3 ang 9 mg / kg BMP03-08 had significant tumor growth inhibition with TGI at 38% and 53% on day 21 after grouping, the time point at which the study was terminated. Detailed results were shown in Figure 12.

[0264] Example 12: In vivo efficacy of BMP03-08 in NCI-H1975 / huPBMC-NCG mouse model

[0265] This example demonstrates the in vivo efficacy testing of BMP03-08 antibody in human non-small cell lung cancer cell line NCI-H1975  / huPBMC-NCG mouse model.

[0266] NCI-H1975 cells were cultured in RPMI-1640 medium containing 10%heat-inactivated FBS, and the tumor cells were collected when the required cell number was reached. On day 0, 0.2 ml 1×106 NCI-H1975 cells + 50%Matrigel (Corning, 354234) (PBS : Matrigel at 1: 1 volume ratio) were injected subcutaneously into the right forelimb of 8～10-week-old female C-NKG mice (Cyagen Biosciences Inc. ) . Human PBMC cells (Hycells, WEZ4220) were transplanted into the tail vein of mice to construct human immune reconstitution mice 3 days before or 3 days after engrafting, respectively. The engrafted mice were randomly divided into 2 groups with 3 mice in each group according to the tumor volume and body weight. The day of engrafting was defined as D0, and the test antibody was given on the day 17. Mice were treated with either PBS or 0.6 mg / kg BMP03-08 intraperitoneally once a week for 4 weeks. Tumor volumes were recorded twice a week from the day post administration. Data analysis and graphing were performed using GraphPad Prism software.

[0267] In experiments performed essentially as described above, there was significant tumor growth inhibition with BMP03-08 after the second dosage under all conditions. Detailed results were shown in Figure 13.

[0268] Example 13: Binding characterization of trispecific antibody BM321 to human CD16a-158V, human CD16a-158F, human GPC3, and Cyno GPC3 by ELISA

[0269] This example demonstrates the binding potency of BM321 to human CD16a-158V, human CD16a-158F, human GPC3, and Cyno GPC3.

[0270] The antigens were coated on the ELISA plate 4℃ overnight, then washed with PBS containing 0.05%Tween20 (PBST) . Serially diluted trispecific antibody BM321 and control antibodies GC33 were added to coated ELISA plate and incubated at 37℃ for 1 hour, and the binding ability of trispecific antibody was detected with an HRP-conjugated Goat anti-human Fc antibody. The ELISA results showed the binding of BM321 trispecific antibody and control antibody to human CD16a-158V, human CD16a-158F, human GPC3, and Cyno GPC3 proteins. Detailed results were shown in Figure 14.

[0271] In experiments performed essentially as described above, trispecific antibodies BM321 bonded to human CD16a-158V and human CD16a-158F with similar potency, both EC50 were 7nM, much stronger binding than GC33.

[0272] Trispecific antibodies BM321 bonded to human GPC3 and cyno GPC3 with similar potency, both EC50 were 1nM, the potencies were close to GC33.

[0273] Example 14: BM321 attenuated activity in IL-15 receptor assay

[0274] This example demonstrates evaluation of IL-15 biological activity of BM321 antibody by luciferase reporter assay using hIL2 / IL15 dual effector (hCD122 / hCD132) reporter cells.

[0275] Similar methodology was applied as shown in Example 5. In experiments performed essentially as described above, BM321, rhIL-15 and N-803 treatments resulted in induction of luciferase production in a dose dependent manner, while rhIL-15 and N-803 demonstrated superior activity compared to BM321 with regards to EC50. EC50 of BM321, rhIL-15 and N-803 were 8nM, 0.08nM and 0.001nM respectively. Detailed results were shown in Figure 15.

[0276] Example 15: Cellular binding characterization of trispecific antibody BM321 to Huh7, NK cells and negative cell line CHO by FACS

[0277] This example demonstrates the binding specificity and potency of BM321 to GPC3 positive cell line Huh7 and primary NK cells.

[0278] The antibody was serially diluted in staining buffer (1× PBS containing 2 %FBS) to prepare eight concentration gradients and kept on ice. Human GPC3 positive HuH-7 tumor cells were detached with 0.02 %EDTA, counted, and an appropriate number was collected by centrifugation. The pellet was resuspended in staining buffer. CD16a positive NK cells and CHO cells (negative cell line) were processed identically.

[0279] Each cell was distributed equally into a 96-well U-bottom plate, centrifuged, and the supernatant was discarded. Cells were resuspended in 50 μL of the diluted antibody per well and incubated on ice for 30 min. After centrifugation and removal of unbound antibody, cells were washed twice with 200 μL staining buffer (repeat centrifugation) . Finally, cells were resuspended in 50 μL of FITC-conjugated anti-human Fc secondary antibody per well, incubated on ice for 30 min in the dark, washed again, and analyzed by flow cytometry for fluorescence signal. Detailed results were shown in Figure 16.

[0280] In experiments performed essentially as described above, trispecific antibody BM321 bond to human GPC3 positive cell line Huh7 with binding ratio up to 77%and control mab GC33 only showed 25%binding ratio. Meanwhile BM321 bond to human NK cells (CD16a positive) with binding ratio up to 29%and GC33 only showed 10%binding ratio. Both BM321 and GC33 didn’ t bind to negative control cell CHO.

[0281] Example 16: Huh7 PBMC cell killing assay

[0282] This example demonstrates enhancement of immune cell killing activity of BMP321 antibody by live cell imaging-based assay using PBMC as effector cells and GPC3-expressing tumor cell line Huh7 as target cells.

[0283] Similar methodology was applied as shown in Example 9. Briefly, one day before ADCC killing experiment, Huh7 cells were digested and well-stained with Celltracker CM-DiI, then 5×103 / 100μL target cells were seeded in a 96 plate and incubated overnight at 37℃in a 5%CO2 incubator. On the day of the experiment, the antibodies were serially diluted 3 times with RPMI-1640 medium. The target cell culture medium was discarded, and 50 μL diluted antibody were added to each well containing target cells. Then 1×105 human PBMC cells were added to each well at 50 μL / well. Finally, diluted  Caspase -3 / 7 Dye for Apoptosis (Sartorius, 4440) were added to each well at 50 μL / well. Plate was placed in  S3 Live-Cell Analysis Instrument and incubate further for 6 days inside a 5%CO2 incubator at 37℃.

[0284] In experiments performed essentially as described above, BM321 treatments result in induction of target cell apoptosis in a time course manner. BM321 demonstrated superior enhancement of PBMC killing activity compared to GC33 with regards to apoptosis fluorescence signal. Representative results were shown in Figure 17.

[0285] Example 17: In vivo efficacy of BM321 in HepG2 PBMC / NOG mouse model

[0286] This example demonstrates the in vivo efficacy testing of BM321 and GC33 antibodies using the HepG2 cell derived xenograft (CDX) mouse model with PBMC reconstitution.

[0287] GPC3 positive liver cancer cell line HepG2 cell was inoculated subcutaneously into the right forelimb of 6～8-week-old female NOG mice. The engrafted mice were randomly divided into 3 groups with 3～4 mice in each group when the average tumor volume reaches 80～90mm3 according to the tumor volume and body weight. The day of grouping was defined as PG-D0, the PBMC reconstitution and test antibody injection were on the day of random grouping. Mice were treated with BM321, GC33 and PBS at an equal molar dose levels (5 mg / kg for BM321 and 3.8 mg / kg for GC33) intraperitoneally twice weekly for 6 doses. Tumor volumes were recorded twice a week from the day post administration. Data analysis and graphing were performed using GraphPad Prism software.

[0288] In experiments performed essentially as described above, there were significant tumor growth inhibition by BM321 (TGI-88%) treatment till day 24. In contrast, GC33 had no tumor suppressive effect, proved superior anti-tumor efficacy of the trispecific antibody BM321. Detailed results were shown in Figure 18.

[0289] Example 18: In vivo efficacy of BM321 in Huh7 PBMC / NSG mouse model

[0290] This example demonstrates the in vivo efficacy testing of BM321 and GC33 antibodies using the Huh7 cell derived xenograft (CDX) mouse model with human NK reconstitution.

[0291] GPC3 positive liver cancer cell line Huh7 cell was inoculated subcutaneously into the right forelimb of 6～8-week-old female NSG mice. The engrafted mice were randomly divided into 6 groups with 5～6 mice in each group when the average tumor volume reaches 80～90mm3 according to the tumor volume and body weight. The day of grouping was defined as PG-D0, the treatment started from the day of random grouping. Mice were treated with BM321, GC33 and PBS mixed with 5 million NK cells intravenously once weekly for 3～4 doses. In detail, BM321 (5.5 mg / kg and 10 mg / kg) mixed with NK cells was injected 3 times; PBS or GC33 (4.2 mg / kg and 16.7 mg / kg) mixed with NK cells were injected 4 times. Tumor volumes were recorded twice a week from the day post administration. Data analysis and graphing were performed using GraphPad Prism software.

[0292] In experiments performed essentially as described above, there was significant tumor growth inhibition by 10 mg / kg BM321 treatment till day 25. The anti-tumor effect of BM321 was in dose dependent mode, on day 25 the TGI of the low dose was 36%and the high dose group of BM321 was 70%. In contrast, the TGI of the low dose GC33 was 30%and the TGI of high dose GC33 was 53%. Compared to the GC33 treatment, BM321 proved superior anti-tumor efficacy in both low dose and high dose group. The PBS mixed with NK treatment didn’t show tumor suppressive effect.Detailed results were shown in Figure 19.

Claims

1.A multi-specific molecule comprising(a) an anti-HER2 antibody comprising two heavy chains and two light chains;(b) an IL-15 polypeptide, covalently linked to C-terminus of one of the two heavy chains of the anti-HER2 antibody;(c) an IL-15Rα Sushi polypeptide, covalently linked to C-terminus of the other of the two heavy chains of the anti-HER2 antibody; and(d) an anti-CD16A VHH polypeptide, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα Sushi polypeptide.2.The multi-specific molecule of claim 1, wherein the anti-HER2 antibody is selected from a group consisting of:(a) an anti-HER2 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, and 17, respectively, according to Kabat definition;(b) an anti-HER2 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21, 22, and 23, respectively, according to IMGT definition; and(c) an anti-HER2 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively.3.The multi-specific molecule of claim 2, wherein the anti-HER2 antibody comprises:(a) a human IgG1 heavy chain constant region and a human IgG1 light chain constant region;(b) a first human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, and a second human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering, and a human IgG1 light chain constant region;(c) a heavy chain constant region and a light chain constant region having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to those as shown in SEQ ID NOs: 33 and 36, respectively; or(d) a first heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 35, and a light chain constant region as shown in SEQ ID NO: 36.4.The multi-specific molecule of any one of claims 1-3, wherein:(i) the IL-15 polypeptide has one or more features selected from a group consisting of:(a) is a human IL-15 polypeptide;(b) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 4 or 47;(c) is linked to a heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38; and(d) is linked to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering; and / or(ii) the IL-15Rα sushi polypeptide has one or more features selected from a group consisting of:(a) is a human IL-15Rα sushi polypeptide;(b) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 3;(c) is linked to a heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38; and(d) is linked to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering; and / or(iii) the anti-CD16A VHH polypeptide has one or more features selected from a group consisting of:(a) has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 27, 28, and 29, respectively, according to Kabat definition;(b) has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 30, 31, and 32, respectively, according to IMGT definition;(c) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 26; and(d) is linked to the IL-15 polypeptide and / or the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.5.The multi-specific molecule of any one of claims 1-4, wherein the multi-specific molecule comprises:(a) an anti-HER2 antibody comprising a first heavy chain comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 24 and a first heavy chain constant region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 24 and a second heavy chain constant region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 35, and two light chains with each light chain comprising a light chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 25 and a light chain constant region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 36;(b) an IL-15 polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4, covalently linked to C-terminus of the second heavy chain of the anti-HER2 antibody, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38;(c) an IL-15Rα Sushi polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3, covalently linked to C-terminus of the first heavy chain of the anti-HER2 antibody, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38; and(d) an anti-CD16A VHH polypeptide having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 26, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα Sushi polypeptide, preferably via a peptide linker such as a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.6.A polypeptide selected from a group consisting of:(a) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-HER2 antibody, a heavy chain constant region of the anti-HER2 antibody, an IL-15Rα Sushi polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide;(b) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-HER2 antibody, a heavy chain constant region of the anti-HER2 antibody, an IL-15 polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide;(c) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-HER2 antibody, a heavy chain constant region of the anti-HER2 antibody, a peptide linker, an IL-15Rα Sushi polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide; and(d) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-HER2 antibody, a heavy chain constant region of the anti-HER2 antibody, a peptide linker, an IL-15 polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide.7.The polypeptide of claim 6, wherein the anti-HER2 antibody is selected from a group consisting of:(a) an anti-HER2 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16, and 17, respectively, according to Kabat definition;(b) an anti-HER2 antibody comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21, 22, and 23, respectively, according to IMGT definition;(c) an anti-HER2 antibody comprising a heavy chain variable region and a light chain variable region as shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively.8.The polypeptide of claim 7, wherein the anti-HER2 antibody comprises:(a) a human IgG1 heavy chain constant region and a human IgG1 light chain constant region;(b) a heavy chain constant region and a light chain constant region having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to those as shown in SEQ ID NOs: 33 and 36, respectively; or(c) a first human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, and a second human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering, and a human IgG1 light chain constant region; and(d) a first heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 34, a second heavy chain constant region as shown in SEQ ID NO: 35, and a light chain constant region as shown in SEQ ID NO: 36.9.The polypeptide of any one of claims 6-8, wherein:(i) the IL-15 polypeptide:(a) is a human IL-15 polypeptide; and / or(b) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 4 or 47; and / or(ii) the IL-15Rα sushi polypeptide:(a) is a human IL-15Rα sushi polypeptide; and / or(b) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 3; and / or(iii) the anti-CD16A VHH polypeptide has one or more features selected from a group consisting of:(a) has CDR1, CDR2, and CDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 27, 28, and 29, respectively, according to Kabat definition;(b) has CDR1, CDR2, and CDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 30, 31, and 32, respectively, according to IMGT definition; and(c) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that shown in SEQ ID NO: 26; and / or(iv) the peptide linker is independently a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38.10.A polynucleotide encoding the polypeptide of any one of claims 6 to 9.11.A vector, preferably a plasmid, comprising the polynucleotide of claim 10.12.A host cell, preferably a eukaryotic cell, comprising the polynucleotide of claim 11.13.A pharmaceutical composition comprising the multi-specific molecule of any one of claims 1 to 5, the polypeptide of any one of claims 6 to 9, the polynucleotide of claim 10, the vector of claim 11, or the host cell of claim 12; and a pharmaceutically acceptable carrier.14.Use of the multi-specific molecule of any one of claims 1 to 5, the polypeptide of any one of claims 6 to 9, the polynucleotide of claim 10, the vector of claim 11, the host cell of claim 12, or the pharmaceutical composition of claim 13, in the preparation of a medicament for treatment of a HER2 positive cancer; preferably the HER2 positive cancer is is selected from the group consisting of colorectal cancer, gastric cancer, lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer (NSCLC) ) , biliary cancers (e.g., cholangiocarcinoma, gallbladder cancer) , bladder cancer, esophageal cancer, melanoma, ovarian cancer, liver cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, small intestine cancer, head and neck cancer, uterine cancer, cervical cancer, and breast cancer.15.A multi-specific molecule comprising(a) an anti-GPC3 antibody comprising two heavy chains and two light chains;(b) an IL-15 polypeptide, covalently linked to C-terminus of one of the two heavy chains of the anti-GPC3 antibody;(c) an IL-15Rα Sushi polypeptide, covalently linked to C-terminus of the other of the two heavy chains of the anti-GPC3 antibody; and(d) an anti-CD16A VHH polypeptide, covalently linked to C-termini of both the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα Sushi polypeptide.16.The multi-specific molecule of claim 15, wherein(i) the anti-GPC3 antibody comprises: (a) a heavy chain variable region comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43 and a light chain variable region comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44; or (b) a heavy chain comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 39 and a light chain comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40; and / or(ii) the IL-15 polypeptide: (a) is a human IL-15 polypeptide; (b) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 4; (c) is linked to a heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38; and (d) is linked to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having substitutions of T366S+L368A+Y407V, according to Eu Numbering; and / or(iii) the IL-15Rα sushi polypeptide: (a) is a human IL-15Rα sushi polypeptide; (b) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 3; (c) is linked to a heavy chain via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38; and (d) is linked to a heavy chain comprising a human IgG1 heavy chain constant region having a T366W substitution, according to Eu Numbering; and / or(iv) the anti-CD16A VHH polypeptide has one or more features selected from a group consisting of: (a) has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 27, 28, and 29, respectively, according to Kabat definition; (b) has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 30, 31, and 32, respectively, according to IMGT definition; (c) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 26; and (d) is linked to the IL-15 polypeptide and the IL-15Rα sushi polypeptide via a linker, preferably a peptide linker, more preferably, a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38;preferably, the multi-specific molecule comprises or consists of a first heavy chain comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 45, a second heavy chain comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 46, and two light chains each comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40.17.A polypeptide selected from a group consisting of:(a) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-GPC3 antibody, a heavy chain constant region of the anti-GPC3 antibody, an IL-15Rα Sushi polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide;(b) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-GPC3 antibody, a heavy chain constant region of the anti-GPC3 antibody, an IL-15 polypeptide, and an anti-CD16A VHH polypeptide;(c) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-GPC3 antibody, a heavy chain constant region of the anti-GPC3 antibody, a peptide linker, an IL-15Rα Sushi polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide; and(d) a polypeptide comprising from N-to C-terminus a heavy chain variable region of an anti-GPC3 antibody, a heavy chain constant region of the anti-GPC3 antibody, a peptide linker, an IL-15 polypeptide, a peptide linker, and an anti-CD16A VHH polypeptide.18.The polypeptide of claim 17, wherein(i) the anti-GPC3 antibody comprises: (a) a heavy chain variable region comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43 and a light chain variable region comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44; or (b) a heavy chain comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 39 and a light chain comprising or consisting of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40; and / or(ii) the IL-15 polypeptide: (a) is a human IL-15 polypeptide; and / or (b) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 4; and / or(iii) the IL-15Rα sushi polypeptide: (a) is a human IL-15Rα sushi polypeptide; and / or (b) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that as shown in SEQ ID NO: 3; and / or(iv) the anti-CD16A VHH polypeptide has one or more features selected from a group consisting of: (a) has CDR1, CDR2, and CDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 27, 28, and 29, respectively, according to Kabat definition; (b) has CDR1, CDR2, and CDR3 have amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 30, 31, and 32, respectively, according to IMGT definition; and (c) has an amino acid sequence having at least 80%, preferably 100%, sequence identity to that shown in SEQ ID NO: 26; and / or(v) the peptide linker is independently a linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 or 38;preferably, the polypeptide comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 45 or SEQ ID NO: 46.19.Use the multi-specific molecule of claim 15 or 16, or the polypeptide of claim 17 or 18 in the preparation of a medicament for treatment of a GPC3 positive cancer; preferably the GPC3 positive cancer is selected from the group consisting of hepatocellular carcinoma (HCC) , melanoma, ovarian clear-cell carcinomas, yolk sac tumors (YST) , neuroblastoma, hepatoblastoma, Wilms' tumors, squamous cell carcinoma of the lung, liposarcoma, cervical intraepithelial neoplasia, adenoma of the adrenal gland, schwannoma and embryonal tumors.

Images