Bispecific antibodies and uses thereoftechnical filed

Abstract

Provided herein is a bispecific antibody comprising an IgG antibody binds specifically to a B-cell marker; and an anti-CD16A VHH covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody for treatment of an autoimmune disease.

Description

BISPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOFTechnical Filed

[0001] The present disclosure relates to a bispecific antibody and uses thereof, and more particularly to a bispecific antibody specifically binds to CD16A expressed on a natural killer cell and a B-cell marker such as CD19 or CD20 expressed on a B cell. The present disclosure further relates to the polypeptides, polynucleotides, vectors, cells, and method of treatment involved in the preparation and uses of the bispecific antibody.Background

[0002] Autoimmune diseases are induced by dysregulated inflammation against autoantigens then affect distinctive organs or system with a spectrum of symptoms and clinical conditions. Based on the specific target tissue and clinical manifestations, rheumatoid arthritis (RA) , multiple sclerosis (MS) , and inflammatory bowel disease (IBD) , systemic lupus erythematosus (SLE) , etc. are well characterized. The accumulatively prevalence of all these autoimmune diseases is about 5%–10%worldwide.

[0003] Treatment for autoimmune diseases aims to alleviate symptoms, control disease activity, and mitigate damage to affected tissues. Conventional treatments for autoimmune diseases suppress the general immune system to modulate the inflammation, such as the immunosuppressive / anti-inflammatory drugs. However, these therapeutic approaches are not always successful based on poor clinical efficacy due to the heterogeneous of different diseases, or the side effect, particularly increased infection risk due to the systematic immune suppression. Then target therapies appear to overcome the disadvantage of the conventional methods, leading to more selectively inflammatory inhibition and minimal disruption to homeostatic immune functions, such as Janus kinase (JAK) inhibitors, sphingosine 1-phosphate receptor (S1PR) modulators, anti-TNF-α antibodies, anti-IL-23 antibodies and B cell depletion therapies (BCDT) .

[0004] B cells are pivotal in autoimmune diseases, participant in multiple pathological mechanisms during the development of the diseases. Firstly, B cells directly contribute to the generation of autoantibody, which targets the autoantigen, inducing an antibody mediated immune attack on healthy tissues, followed by inflammation and damage. Secondly, B-cells can secrete various cytokines like TNF-α, IL-6, GM-CSF and IL-10, contributing to tissue inflammation and damage. Thirdly, B cells act as antigen-presenting cells (APCs) , capturing and presenting autoantigens to T cells, activating T cells to against healthy cells expressing the autoantigen, further amplifying the cell-mediated immune response. In addition, dysregulation of B-regs and tertiary lymphoid tissue (TLT) sustentation by B cells are also involved in autoimmune diseases.

[0005] BCDT was first considered for autoimmune diseases two decades ago, and it shows convincing clinical responses and acceptable safety profiles. Till now five monoclonal antibodies have been approved to treat autoimmune diseases, including RA, MS and SLE. B cell surface markers such as CD20 and CD19 are well-known targets for the antibody’s development in clinic. Therapies targeting CD20, exemplified by Rituximab, can deplete B cells effectively through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and complement-dependent cytotoxicity (CDC) , showed efficacy in several autoimmune diseases. Inebilizumab, an anti-CD19 ADCC enhancing afucosylated IgG1 antibody, also demonstrates clinical improvement in specific autoimmune disease. However, since the diverse spectrum of autoimmune diseases, monoclonal antibodies are not always responsive in all the autoimmune diseases. The role of B cells in pathogenesis, degree of B cell depletion, the heterogenicity of human B cell subsets, the variability of autoantibody effects, and the role of long-lived plasma cells, all contribute to different clinical efficacies crossing the various autoimmune diseases. CAR-T cell therapies and bispecific antibodies as emerging BCDT, are developed to enhance the B cell depletion and expand the populations.

[0006] Currently, FDA-approved CAR-T cell therapies in oncology are targeting CD19 and BCMA for B cell and plasma cell depletion. Similar CAR-T cell therapies now are re-purposed in the autoimmune area and show remarkable efficacy in the small number of patients. Car-T targeting CD19, such as Relma-Cel in the investigator-initiated trial (IIT) , 4 / 12 patients show 100%SRI-4 response rate followed up for at least six months, and 11 / 12 patients stop using traditional corticosteroids and immunosuppressants. Both MB-CART19.1 (autologous CD19 Car-T) and BRL-301A (universal CD19 Car-T) also demonstrate preliminary efficacy in idiopathic inflammatory myopathy (IIM) , systemic sclerosis (SSc) and SLE in the IITs. Meanwhile, BCMA targeting Car-T, like Eque-cel in phase1 (NCT04561557) , demonstrates durable pathogenic antibody clearance, and potential clinical efficacy in neuromyelitis optical spectrum disorder (NMOSD) . However, the promising efficacies of CAR T cells for B cell depletion in both oncology and autoimmune associate with significant toxicities. The major toxicities are cytokine release syndrome (CRS) , immune effector cell associated neurotoxicity syndrome (ICANS) and leukopenia, which limited the application of Car-T in the non-oncology area.

[0007] Like Car-T, nowadays bispecific antibodies which was developed in blood malignancies are also evaluated in autoimmune diseases. Mosunetuzumab is an FDA approved T cell engaging CD20 / CD3 bispecific antibody, that can redirect T cells to eliminate the malignant B cells. The study to explore the safety and pharmacodynamics of Mosunetuzumab to SLE patients is on-going (NCT05155345) . Another CD20 / CD3 bispecific antibody imvotamab is also trying to prove its early clinical efficacy in IIM (NCT06524687) , SLE (NCT06041568) and RA (NCT06087406) . In addition, with CD20 T cell engager, publications of Teclistamab, a BMCA / CD3 bispecific antibody approved in multiple myeloma are also reported the preliminary efficacy in SLE, IIM, SSc, RA and   syndrome. Side effects are also similar to the published clinic safety profiles of most of the CD3 bispecific T cell engager, such as CRS and lymphopenia.

[0008] Compared with Car-T and T cell engager, natural killer (NK) cell engager showed better safety profiles in the blood malignancy studies. CD16 / CD30 bispecific antibody AFM13, demonstrates no CRS / ICANS occurred in the Hodgkin's lymphoma patients without compromising the clinical efficacy (NCT02321592) ; and CD16 / IL-15 / CD133 trispecific antibody GTB-3550, either doesn’ t show CRS during the trail with acute myeloid leukemia patients (NCT03214666) . Till now, no application of NK cell engaging antibody in autoimmune disease was reported.

[0009] Natural killer (NK) cells are lymphocytes of innate immune system. Human NK cells are usually classified on the basis of two surface receptors CD56 and CD16 expression. CD56brightCD16- NK cells produce more cytokines, chemokines and growth factors but exhibit lower cytotoxicity. However, CD56dimCD16+ NK cells are highly toxic and also can produce cytokines and chemokines. There are two types of CD16 (FCγRIII) , encoded by two genes, A and B. One type, CD16A, is a transmembrane protein that co-localizes with CD3ζ and Fc-εRI-γ on NK cells. Upon ligation, it induces a potent series of signals resulting in cytokine production and cytotoxic effector activity via ADCC. The second type, CD16B, is found on neutrophils and is not involved in tumor cell killing. Although the extracellular domains are highly homologous, glycosylphosphatidylinositol linkage differentiates CD16B from CD16A. An essential feature of NK cells is their ADCC effector activity, a major mechanism pursued by majority of monoclonal antibody therapies, especially preventing cancer. The different polymorphism of CD16a, either 158F (lower affinity) or 158V (higher affinity) which affect its affinity for Fc portion, low affinity between Fc domain and CD16a make NK mediated ADCC efficacy is very limited, causing lots of tumors not respond to mAb therapy or relapse in the advanced time.

[0010] Various strategies have been used to improve NK ADCC anti-tumor potential. These include glycoengineering the Fc region of cytotoxic antibodies to improve their binding to CD16a, as well as amino acid substitutions. Another approach to augment NK killer function is the design of bi-or tri-specific antibody with one arm on tumor associated antigen, and another one on CD16 or other NK specific receptors, commonly called NK engagers structures (NKCE) . These constructs could recruit NK cells with high affinity to tumors, and then kill them directly. AFM13, a bispecific NKCE targeting CD30 and CD16a, has been evaluated in clinic for CD30 positive relapsed or refractory lymphomas. Other bispecific targeting CD16a and tumor antigen EGFR, CD123, CD33 and BCMA had been evaluated efficacy in clinical or preclinical studies. However, NKCE format was rarely used in the field of inflammatory or autoimmune disease till now. Artiva currently uses AlloNK, an allogeneic NK cells in combination with Rituximab for treatment of SLE in patients with active lupus nephritis in clinical trials. Activated T cells can drive cell death after engagement of their highly specific T cell receptors, and this mean T cells can easily produce storm of cytokines and generate system toxicity if off-target appeared. Because NK cells integrate information of different receptors, they are far less likely to kill normal cells expressing a target antigen. Hence, NK cells may have safer therapeutic index than T cells which means TCE or CAR-T cells.Summary

[0011] One aspect of the present disclosure provides a bispecific antibody comprising (a) an IgG antibody comprising two heavy chains (HCs) and two light chains (LCs) , each of the two heavy chains comprising a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) , each of the two light chains comprising a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) , wherein the IgG antibody binds specifically to a B-cell marker; and (b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody.

[0012] Another aspect of the disclosure provides a polypeptide comprising: (a) a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to a B-cell marker; and (b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody.

[0013] A further aspect of the disclosure provides the bispecific antibody of the aspect described above for use in treatment of an autoimmune disease; the use of the bispecific antibody or the polypeptide of the aspects described above in the preparation of a medicament for treatment of an autoimmune disease; or a method of treatment of an autoimmune disease comprising administering to a subject in need thereof the bispecific antibody of the aspect described above.

[0014] More aspects and advantages of the present disclosure will become apparent from the detailed description of the invention disclosed herein as set forth below.Brief Description of the Drawings

[0015] Figure 1. Diagram of CD20 or CD19xCD16a bispecific antibody according to embodiments of the present disclosure.

[0016] Figure 2. Binding affinity of BM366-01 / BM366-02 to CD16a (158V) determined by BLI assay.

[0017] Figure 3. Binding affinity of BM366-05 / BM366-09 / BM366-18 / BM366-18AF to human CD16a (158V and 158F) determined by SPR assay.

[0018] Figure 4. Binding affinity of BM366-09 BM366-18AF to cynomolgus CD16a (158F) determined by SPR assay.

[0019] Figure 5. Binding of BM366-01 / BM366-02 to cell surface CD19 or CD20 determined by FACS.

[0020] Figure 6. ADCC activity of CD20xCD16a antibody (BM366-01) , in comparison with Ofatumumab and Rituximab, was evaluated using Jurkat CD16a (158F) -NFAT-luc reporter (Panel A) and Jurkat CD16a (158V) -NFAT-luc reporter (Panel B) .

[0021] Figure 7. ADCC activity of CD19xCD16a antibody (BM366-02) in comparison with Inebilizumab, was evaluated using Jurkat CD16a (158F) -NFAT-luc reporter (Panel A) and Jurkat CD16a (158V) -NFAT-luc (Panel B) .

[0022] Figure 8. ADCC activity of BM366-05 and BM366-18AF in comparison with Ofatumumab, Obinutuzumab and Rituximab, was evaluated using Jurkat CD16a (158F) -NFAT-luc reporter (Panel A) and Jurkat CD16a (158V) -NFAT-luc (Panel B) .

[0023] Figure 9. NK cell killing capacity of BM366-01and reference antibodies Rituximab and Ofatumumab, were determined using PBMC as effector cell and Raji cell as target cell.

[0024] Figure 10. NK cell killing capacity of BM366-02 and reference antibody Inebilizumab, were determined using PBMC as effector cell and Nalm-6 (Panel A) and Ramos cells (Panel B) as target cell.

[0025] Figure 11. NK cell killing capacity of BM366-01, BM366-05 and BM366-18AF in comparison with Ofatumumab, Obinutuzumab and Rituximab, were determined using PBMC as effector cell and Raji cells as target cell.

[0026] Figure 12. The depletion activity of BM366-01 / BM366-05 / Rituximab / Mosunetuzumab on PBMC B cells from three different SLE donors.

[0027] Figure 13. Detection of cytokine release (IFN-g for panel A, IL-6 for panel B, and TNF-a for panel C) after treatment with BM366-05 / Rituximab / Mosunetuzumab on PBMCs from three different SLE donors.

[0028] Figure 14. The depletion activity of BM366-01 / BM366-05 / Rituximab / Mosunetuzumab  / BM366-18 / BM366-18AF / Obinutuzumab on PBMC B cells from SLE donor S011.

[0029] Figure 15. Changes in the number of B cells in the peripheral blood of hCD20 / hCD16A KI C57 mice on D1 and D3 after BM366-18AF / Rituximab administration.

[0030] Figure 16. Changes in the number of B cells and NK cells in the lymph node of hCD20 / hCD16A KI C57 mice on D3 after BM366-18AF / Rituximab administration.

[0031] Figure 17. Changes in the number of B cells in the spleen of hCD20 / hCD16A KI C57 mice on D3 after BM366-18AF / Rituximab administration.

[0032] Figure 18. Changes in the proportion of CD3-CD19+ B cells (panel A) , memory B cells (panel B) and   B cells (panel C) in the peripheral blood of the cynomolgus monkey on D1, D3, and D5 after administration of BM366-18AF / Rituximab.

[0033] Figure 19. Changes in the proportion of CD3-CD19+ B cells (panel A) , memory B cells (panel B) , and   B cells (panel C) in the lymph node of the cynomolgus monkey on D5 after administration of BM366-18AF / Rituximab. Sequence Listings Detailed Description

[0034] Definition

[0035] Unless stated otherwise, the following terms and phrases as used herein are intended to have the following meanings.

[0036] As used herein, the term “antibody” generally refers to a tetramer comprising at least two heavy (H) chains and two light (L) chains inter-connected by disulfide bonds. Each heavy chain (HC) is comprised of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) . The heavy chain constant region is comprised of three domains, CH1, CH2 and CH3. Each light chain (LC) is comprised of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) . The light chain constant region is comprised of one domain. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, termed complementarity determining regions (CDRs) , interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FR) . Each VH and VL is composed of three CDRs and four FRs arranged from amino-terminus to carboxy -terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, and FR4. The CDRs in the heavy chain are termed HCDRs, i.e., HCDR1, HCDR2, and HCDR3. The CDRs in the light chain are termed LCDRs, i.e., LCDR1, LCDR2, and LCDR3. The variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with an antigen. The constant regions of the antibodies may mediate the binding of the immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (e.g., effector cells) and the first component (Clq) of the classical complement system.

[0037] The term “antibody” includes, but is not limited to, monoclonal antibodies, human antibodies, humanized antibodies, and chimeric antibodies. The antibodies can be of any isotype / class (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA and IgY) or subclass (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) .

[0038] A “heavy chain antibody” is devoid of a light chain and in the case of the heavy chain antibodies in camelids the CH1 domain is also missing. Consequently, a camelid heavy chain antibody associates with its cognate antigen via a single domain, the variable heavy chain domain of a heavy chain antibody or VHH. The terms VHH, nanobody or single domain antibody are used interchangeably herein. Therefore, an anti-CD16A VHH is an anti-CD16A nanobody, or an anti-CD16A single domain antibody. Throughout the disclosure, CD16A is sometime referred to as CD16. VHH antibodies are the isolated VHH domains of heavy-chain only antibodies produced by camelid species, such as alpaca, llama, and camel. These proteins consist of framework regions and three highly variable loops: CDR1, CDR2 and CDR3. Research has shown that it is the CDR3 loop that enables VHH antibodies to have such a wide range of bind specificities; the CDR3 loop tends to be 3-4 residues longer than that of conventional antibodies, allowing them to use these protrusions to extend into “hidden” epitope cavities; the CDR3 loop also has more variation in amino acid sequences in VHH antibodies than conventional antibodies, leading to ～7%higher sequence diversity per residue.

[0039] “Linker” refers to a sequence of amino acids comprising a linker peptide joining two juxtaposed variable domains forming an antigen-binding moiety with the C-terminus of one domain linked to the N-terminus of the other juxtaposed domain or vice versa. Regarding the amino acid composition, a peptide linker sequence is selected that does not interfere with the formation of Fv, i.e. VH / VL, antigen binding-and recognition sites as well as does not interfere with the multimerization, e.g., dimerization of the polypeptides of a bispecific antibody. For example, a linker comprising glycine and serine residues generally provides protease resistance. In some embodiments, (G4S) X peptide linkers are used, wherein, for example, x=1-10, preferably 1-6. Peptide linkers (G4S) 3 and (G4S) 4 are shown in SEQ ID NO: 16 and 17, respectively. The amino acid sequence of the linker can be optimized, for example, by phage-display methods to improve the formation of the antigen binding site and production yield of the polypeptide.

[0040] The term “ (specifically) binds to” , “ (specifically) recognizes, ” “is (specifically) directed to, ” or “ (specifically) reacts with” means in accordance with this invention that a binding domain interacts or specifically interacts with a given epitope or a given target side on the target molecules (antigens) , e.g. CD16A, and the target cell surface antigen, e.g., CD19 or CD20, respectively.

[0041] The term “does not essentially  / substantially bind” or “is not capable of binding” means that a binding domain of the present invention does not bind a protein or antigen other than CD16A, and  / or the target cell surface antigen, i.e., does not show reactivity of more than about 30%, preferably not more than about 20%, more preferably not more than about 10%, particularly preferably not more than about 9%, about 8%, about 7%, about 6%or about 5%with proteins or antigens other than CD16A, and / or the target cell surface antigen, whereby binding to CD16A, and / or the target cell surface antigen, respectively, is set to be about 100%.

[0042] As used herein, the term “complementarity determining domains” is used herein interchangeably with the term “complementary determining regions” ( “CDRs” ) , and generally refers to the hypervariable regions of VL and VH. The CDRs are the target protein-binding sites of the antibody chains that harbor specificity for such target protein. There are three CDRs (CDR1-3, numbered sequentially from the N-terminus) in each human VL or VH, constituting about 15-20%of the variable domains. CDRs can be referred to by their region and order. For example, “VH CDR1” or “HCDR1” both refer to the first CDR of the heavy chain variable region. The CDRs are structurally complementary to the epitope of the target protein and are thus directly responsible for the binding specificity. The remaining stretches of the VL or VH, the so-called framework regions, exhibit less variation in amino acid sequence (Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W. H. Freeman &Co., New York, 2000) . In the art, the CDR of the antibody can be defined by various methods / schemes, such as a Kabat definition scheme based on sequence variability (see Kabat et al., protein sequence in immunology, 5th edition, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991) ) , a Chothia definition scheme based on the position of a structural loop region (see A1-Lazikani et al., Jmol Biol 273: 927-48, 1997) and a IMGT definition scheme based on the concept of IMGT-ONTOLOGY and IMGT Scientific chart rules. In certain embodiments, the present application uses the IMGT rules to define the CDRs of an antibody. The definition rules of Martin, PyIgClassify and Combined definition rules of Kabat, Chothia, IMGT, Martin and PyIgClassify are also included in this application (see Mark L. Chiu et al., Antibodies 8 (4) , 55, 2019) .

[0043] Table A. Comparation of CDR numbering among different definition schemes (in Chothia numbering)

[0044] wherein, Laa-Lbb or Haa-Hbb may refer to, from N-terminal, the amino acids sequence from position aa to position bb of light chain or heavy chain respectively. For example, L24-L34 refers to the amino acid sequence from positions 24 to 34 of light chain.

[0045] Both the light and heavy chains are divided into regions of structural and functional homology. The terms “constant” and “variable” are used functionally. In this regard, it will be appreciated that the variable domains of both the light (VL) and heavy (VH) chain portions determine antigen recognition and specificity. Conversely, the constant domains of the light chain (CL) and the heavy chain (CH1, CH2 or CH3) confer important biological properties such as secretion, transplacental mobility, Fc receptor binding, complement binding, and the like. By convention, the numbering of the constant region domains increases as they become more distal from the antigen binding site or N-terminus of the antibody. The N-terminus is a variable region and at the C-terminus is a constant region; the CH3 and CL domains actually comprise the carboxy-terminal domains of the heavy and light chain, respectively.

[0046] As used herein, the term “humanized antibody” generally refers to an antibody which includes sequences of heavy chain variable regions and light chain variable regions derived from non-human species (e.g., mice) , but in which at least a portion of the VH and / or VL sequences have been changed to be similar to the human germline variable sequences. For example, the term “humanized antibody” is an antibody or a variant, derivative, analogue or fragment thereof that can bind to a related antigen with immune specificity and includes a framework region (FR) which includes substantially an amino acid sequence of a human antibody and a complementary determining region (CDR) which includes substantially an amino acid sequence of a non-human antibody. In the context of CDR, the term “substantially” means that the amino acid sequence of CDR has at least 80%, e.g., at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%or at least 99%identity with an amino acid sequence of CDR of a non-human antibody. The humanized antibodies include substantially at least one, typically two variable domains (Fab, Fab’, F (ab’) 2, Fab, Fv) , wherein all or substantially all CDR regions correspond to the CDR region of a non-human immunoglobulin and all or substantially all framework regions are frame regions with consensus sequence of human immunoglobulin. In some embodiments, the humanized antibody can further include at least a portion of a constant region of immunoglobulin (Fc) , typically a constant region of human immunoglobulin.

[0047] As used herein, the term “human antibody” generally refers to an antibody with variable and constant regions derived from the sequence of immunoglobulin of human germ line. Human antibodies are well known in the prior art (e.g., van Dijk, M. A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374) . The human antibodies can also be generated in transgenic animals (e.g., mice) which can generate a complete or selected set of human antibodies in absence of generated endogenous immunoglobulin after immunization (e.g., Jakobovits, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A. et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M. et al., YearImmunol. 7 (1993) 33-40) . Human antibodies can also be generated in a phage display library (e.g., Hoogenboom, H. R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597) . The term “human antibody” can also include antibodies modified in the constant regions.

[0048] As used herein, the term “chimeric antibody” generally refers to an engineered antibody which in its broadest sense contains one or more regions from one antibody and one or more regions from one or more other antibody (ies) . In particular a chimeric antibody comprises a VH domain and a VL domain of an antibody derived from a non-human animal, in association with a CH domain and a CL domain of another antibody, in particular a human antibody. As the non-human animal, any animal such as camel, mouse, rat, hamster, rabbit or the like can be used.

[0049] The term “bispecific antibody” as used herein refers to an antibody having two specificities to two different antigens. For example, a bispecific antibody may comprise a first specificity to a first antigen (e.g., CD16A) and a second specificity to a second antigen (e.g., CD19) different from the first antigen. In the present disclosure, a “bispecific antibody” as used herein refers to an antibody having a first specificity to CD16A, and a second specificity to a B-cell marker.

[0050] As used herein, the term “percent identical” or “percent identity, ” in the context of two or more nucleic acids or polypeptide sequences, refers to the extent to which two or more sequences or subsequences that are the same. Two sequences are “identical” if they have the same sequence of amino acids or nucleotides over the region being compared. Two sequences are “substantially identical” if two sequences have a specified percentage of amino acid residues or nucleotides that are the same (i.e., 60%identity, optionally 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%or 99%identity over a specified region or, when not specified, over the entire sequence) , when compared and aligned for maximum correspondence over a comparison window or designated region as measured using one of the following sequence comparison algorithms or by manual alignment and visual inspection. Optionally, the identity exists over a region that is at least about 30 nucleotides (or 10 amino acids) in length or more preferably over a region that is 100 to 500 or 1000 or more nucleotides (or 20, 50, 200 or more amino acids) in length. Two examples of algorithms that are suitable for determining percent sequence identity and sequence similarity are the BLAST and BLAST 2.0 algorithms, which are described in Altschul et al, Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, 1977; and Altschul et al , J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990, respectively.

[0051] Other than percentage of sequence identity noted above, another indication that two nucleic acid sequences or polypeptides are substantially identical is that the polypeptide encoded by the first nucleic acid is immunologically cross reactive with the antibodies raised against the polypeptide encoded by the second nucleic acid. Thus, a polypeptide is typically substantially identical to a second polypeptide, for example, where the two peptides differ only by conservative substitutions. Another indication that two nucleic acid sequences are substantially identical is that the two molecules or their complements hybridize to each other under stringent conditions. Yet another indication that two nucleic acid sequences are substantially identical is that the same primers can be used to amplify the sequence.

[0052] As used herein, the term “polypeptide” is used herein interchangeably with the term “protein” and refers to a polymer of amino acid residues. The terms apply to amino acid polymers in which one or more amino acid residue is an artificial chemical mimetic of a corresponding naturally occurring amino acid, as well as to naturally occurring amino acid polymers and non-naturally occurring amino acid polymer. Unless otherwise indicated, a particular polypeptide sequence also implicitly encompasses conservatively modified variants thereof.

[0053] As used herein, the term “B-cell marker” as used herein refers to membrane proteins expressed on B cells at any developmental stages. Therefore, B cell markers include markers for Pro B, Pre B, Immature B cell, marginal zone (MZ) B cells, follicular (FO) B cells,   B cells, antibody-secreting plasmablasts, plasma cells, memory B cells, and regulatory B cells (Bregs) . A preferable B-cell marker is selected from a group consisting of CD1d, CD5, CD19, CD20, CD21, CD23, CD27, CD30, CD38, CD40, CD43, CD45, CD69, CD95, CD138, CD184, TNFSF13B and TNFRSF17. A more preferable B-cell marker is CD19 or CD20.

[0054] As used herein, the term “autoimmune disease” includes an autoimmune disease susceptible to B cell depletion therapies or an autoimmune disease mediated by autologous B cells. Autoimmune disease treatable by the molecules provided by the present disclosure include, but are not limited to, psoriatic arthritis, rheumatoid arthritis (RA) ,   syndrome, systemic lupus erythematosus (Lupus, SLE) , Crohn’s disease, celiac disease, ulcerative colitis, inflammatory bowel disease (IBD) , Graves’ disease, Hashimoto’s thyroiditis, Addison’s disease, dermatomyositis, psoriasis, pemphigus vulgaris, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP) , Guillain-Barre syndrome, multiple sclerosis (MS) , myasthenia gravis, Type 1 diabetes, pernicious anemia, and autoimmune vasculitis.

[0055] As used herein, the term “anti-tumor activity” means a reduction in the rate of tumor cell proliferation, viability or metastatic activity. A possible way of showing anti-tumor activity is to show a decline in growth rate of tumor cells, tumor size stasis or tumor size reduction. Such activity can be assessed using accepted in vitro or in vivo tumor models, including but not limited to xenograft models, allograft models, MMTV models, and other known models known in the art to investigate anti-tumor activity.

[0056] As used herein, the term “subject” includes human and non-human animals. Non-human animals include all vertebrates, e.g., mammals and non-mammals, such as non-human primates, sheep, dog, cow, chickens, amphibians, and reptiles. Except when noted, the terms “patient” or “subject” are used herein interchangeably.

[0057] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable” generally refers to one or more non-toxic substances that do not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active ingredient. Such formulations may typically contain salts, buffers, preservatives, compatible carriers, and optionally other therapeutic agents. Such pharmaceutically acceptable formulations may also typically contain compatible solid or liquid fillers, diluents, or encapsulating materials suitable for administration to humans. When used in medicine, salt should be a pharmaceutically acceptable salt, but non-pharmaceutically acceptable salts can be conveniently used to prepare pharmaceutically acceptable salts and cannot be excluded from the scope of the present invention. Such pharmacologically and pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, salts prepared from the following acids: hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, maleic acid, acetic acid, salicylic acid, citric acid, boric acid, formic acid, malonic acid, succinic acid, etc. Pharmacologically acceptable salts can also be prepared as alkali metal salts or alkaline earth metal salts, such as sodium, potassium or calcium salts. The term “solvate” is used herein in the conventional sense to refer to a complex of a solute (e.g., an active compound, a salt of an active compound) and a solvent. Solvates usually do not significantly alter the physiological activity or toxicity of the compound and therefore can act as pharmacological equivalents. If the solvent is water, the solvent compound may be conveniently referred to as a hydrate, e.g., monohydrate, dihydrate, trihydrate, etc.

[0058] In the present application, the term "antigen binding fragment" , as used herein, generally refers to a polypeptide including one or more portions of an antibody that retain the ability to specifically interact with (e.g., by binding, steric hindrance, stabilizing / destabilizing, spatial distribution) an epitope of an antigen. Examples of binding fragments include, but are not limited to, single-chain Fvs (scFv) , disulfide-linked Fvs (sdFv) , Fab fragments, F (ab') fragments, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CHI domains; a F (ab') 2 fragment, a bivalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; a Fd fragment consisting of the VH and CHI domains; a Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of an antibody; a dAb fragment (Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989) , which consists of a VH domain; and an isolated complementarity determining region (CDR) or other epitope-binding fragments of an antibody. Antigen binding fragments also comprises single domain antibodies, maxibodies, minibodies, nanobodies, intrabodies, diabodies, triabodies, tetrabodies and bis-scFv (see, e.g., Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1136, 2005) . Antigen binding fragments can also comprise single chain molecules comprising a pair of tandem Fv segments (VH-CH1-VH-CH1) which, together with complementary light chain polypeptides, form a pair of antigen binding regions (Zapata et al, Protein Eng. 8: 1057-1062, 1995) . A fragment of a conventional antibody may also be a single domain antibody, such as a heavy chain antibody or VHH.

[0059] As used herein, the terms “treat, ” “treating, ” or “treatment” of any disease or disorder generally refer in one aspect, to ameliorating the disease or disorder (i.e., slowing or arresting or reducing the development of the disease or at least one of the clinical symptoms thereof) . In another aspect, “treat, ” “treating, ” or “treatment” refers to alleviating or ameliorating at least one physical parameter including those which may not be discernible by the patient. In yet another aspect, “treat, ” “treating, ” or “treatment” refers to modulating the disease or disorder, either physically, (e.g., stabilization of a discernible symptom) , physiologically, (e.g., stabilization of a physical parameter) or both. In yet another aspect, “treat, ” “treating, ” or “treatment” refers to preventing or delaying the onset or development or progression of the disease or disorder.

[0060] As used herein, the term “therapeutically acceptable amount” or “therapeutically effective dose” interchangeably refers to an amount sufficient to effect the desired result (i.e., a reduction in tumor size, inhibition of tumor growth, prevention of metastasis, inhibition or prevention of viral, bacterial, fungal or parasitic infection) . In some embodiments, a therapeutically acceptable amount does not induce or cause undesirable side effects. A therapeutically acceptable amount can be determined by first administering a low dose, and then incrementally increasing that dose until the desired effect is achieved.

[0061] As used herein, the terms “comprising” , “containing” , “having” , “include” , and “including” are to be construed as “including, but not limited to” unless otherwise noted. The terms “a, ” “an, ” and “the” and similar referents in the context of describing the invention and, specifically, in the context of the appended claims, are to be construed to cover both the singular and the plural unless otherwise noted. The use of any and all examples or exemplary language ( “for example” , “e.g. ” , “such as” ) is intended merely to illustrate aspects or embodiments of the invention and is not to be construed as limiting the scope thereof, unless otherwise claimed.

[0062] As used herein, the term “about” when referring to a measurable value such as an amount, a temporal duration, and the like, is meant to encompass variations of ±20%or in some instances ±10%or in some instances ±5%or in some instances ±1%or in some instances ±0.1%from the specified value, as such variations are appropriate to perform the disclosed methods.

[0063] Bispecific Antibodies

[0064] One aspect of the disclosure provides bispecific antibodies.

[0065] The bispecific antibody provided herein comprises:

[0066] (a) an IgG antibody comprising two heavy chains (HCs) and two light chains (LCs) , each of the two heavy chains comprising a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) , each of the two light chains comprising a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) , wherein the IgG antibody binds specifically to a B-cell marker; and

[0067] (b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody.

[0068] In some embodiments, the B-cell marker is selected from a group consisting of CD1d, CD5, CD19, CD20, CD21, CD23, CD27, CD30, CD38, CD40, CD43, CD45, CD69, CD95, CD138, CD184, TNFSF13B and TNFRSF17. In preferable embodiments, the B-cell marker is CD19 or CD20.

[0069] In some embodiments, the IgG antibody is an IgG1 antibody, e.g., a human IgG1 antibody. In some embodiments, the IgG antibody is an IgG1 antibody, e.g., a human IgG1 antibody. In some embodiments, the IgG antibody is an IgG2 antibody, e.g., a human IgG2 antibody. In some embodiments, the IgG antibody is an IgG3 antibody, e.g., a human IgG3 antibody. In some embodiments, the IgG antibody is an IgG4 antibody, e.g., a human IgG4 antibody. A human IgG1 antibody comprises a human heavy chain constant region and a human light chain constant region. A human heavy chain constant region has an amino acid sequence illustratively shown as in SEQ ID NO: 14. A human light chain constant region has an amino acid sequence illustratively shown as in SEQ ID NO: 15.

[0070] In some embodiments, the IgG antibody comprises an Fc region comprising at least one amino acid substitution compared to the naturally occurring Fc region, e.g., the naturally occurring human Fc region, to enhance the half-life of the bispecific antibody. Amino acid substitutions that contribute to extended half-life of an antibody are known in the art. For example, in some embodiments, the IgG antibody comprises M252Y / S254T / T256E ( “YTE” ) substitutions ( “YTE substitutions” ) in the Fc region according to the EU numbering. In some embodiments, the IgG antibody comprises M428L and / or N434S substitutions in the Fc region according to the EU numbering. In some embodiments, the IgG antibody comprises M252Y / S254T / T256E ( “YTE” ) substitutions and / or M428L and / or N434S substitutions in the Fc region according to the EU numbering. In some embodiments, the IgG antibody comprises a naturally occurring Fc region, e.g., the naturally occurring human Fc region.

[0071] In some embodiments, the IgG antibody comprises afucosylation at N297 in Fc region according to the EU numbering. The term “afucosylation” or “afucosylated” as used herein is meant the removal of the core fucose from N-glycan at N297 in Fc region according to the EU numbering. Different strategies to produce afucosylated antibodies were well discussed in the art. See, e.g., Pereira, Natasha A et al. “The "less-is-more" in therapeutic antibodies: Afucosylated anti-cancer antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. ” mAbs vol. 10, 5 (2018) : 693-711. doi: 10.1080 / 19420862.2018.1466767.

[0072] In some embodiments, the anti-CD16A VHH is directly linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody. In some embodiments, the anti-CD16A VHH is linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody via a flexible linker. The flexible linkers, in some embodiments, are peptide linkers. In some embodiments, the anti-CD16A VHH is linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody via a peptide linker consisting of Glycine and Serine. Illustrative examples of peptide linkers are shown in SEQ ID NO. : 16 or 17.

[0073] Therefore, in some embodiments, provided is a bispecific antibody provided herein comprises: (a) an IgG antibody comprising two heavy chains (HCs) and two light chains (LCs) , each of the two heavy chains comprising a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) , each of the two light chains comprising a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) , wherein the IgG antibody binds specifically to CD19 or CD20; and (b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody.

[0074] In some embodiments, provided is a bispecific antibody provided herein comprises: (a) an IgG antibody comprising two heavy chains (HCs) and two light chains (LCs) , each of the two heavy chains comprising a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) , each of the two light chains comprising a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) , wherein the IgG antibody binds specifically to CD19 or CD20; and (b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody via a peptide linker.

[0075] In some embodiments, provided is a bispecific antibody comprising: a first polypeptide chain (i.e., a heavy chain) having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4 and a second polypeptide chain (i.e., a light chain) having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5.

[0076] In some embodiments, provided is a bispecific antibody comprising: a first polypeptide chain (i.e., a heavy chain) having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 8 and a second polypeptide chain (i.e., a light chain) having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 9.

[0077] In some embodiments, provided is a bispecific antibody comprising: a heavy chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 149 and a light chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5.

[0078] In some embodiments, provided is a bispecific antibody comprising: a heavy chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 147 and a light chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 146.

[0079] The bispecific antibodies provided herein bind and deplete B cells involved in an autoimmune disease. B cell depletion therapies (BCDTs) , originally conceived as a method of eliminating cancerous B cells, were reimagined for use in autoimmune diseases in which B cells play a direct or indirect role. BCDTs such as those targeting CD20, CD19 and BAFF are now used to treat autoimmune diseases, including systemic lupus erythematosus and multiple sclerosis. The use of BCDTs in autoimmune disease has led to some surprises. For example, although antibody-secreting plasma cells are thought to have a negative pathogenic role in autoimmune disease, BCDT, even when it controls the disease, has limited impact on these cells and on antibody levels. BCDTs was reviewed by Lee, D. S. W., Rojas, O.L. & Gommerman, J.L. B cell depletion therapies in autoimmune disease: advances and mechanistic insights. Nat Rev Drug Discov 20, 179–199 (2021) .

[0080] Anti-CD16A VHH Polypeptides

[0081] In some embodiments, the anti-CD16A VHH polypeptide in any one of the embodiments described above, has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 46 to 48, respectively, according to Kabat definition.

[0082] In some embodiments, the anti-CD16A VHH polypeptide in any one of the embodiments described above, has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 49 to 51, respectively, according to IMGT definition; or

[0083] In some embodiments, the anti-CD16A VHH polypeptide in any one of the embodiments described above, has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.

[0084] Further examples of anti-CD16A VHH polypeptides are suitable for use in the bispecific antibodies and can be available from e.g., WO2024206126A1, CN112679609A, and co-pending PCT application PCT / CN2024 / 084063 filed on 27 March 2024.

[0085] Therefore, in some embodiments, provided is a bispecific antibody comprising: (a) an IgG antibody comprising two heavy chains (HCs) and two light chains (LCs) , each of the two heavy chains comprising a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) , each of the two light chains comprising a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) , wherein the IgG antibody binds specifically to a B-cell marker; and (b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH polypeptide has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 46 to 48, respectively, according to Kabat definition.

[0086] In some embodiments, provided is a bispecific antibody comprising: (a) an IgG antibody comprising two heavy chains (HCs) and two light chains (LCs) , each of the two heavy chains comprising a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) , each of the two light chains comprising a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) , wherein the IgG antibody binds specifically to a B-cell marker; and (b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH polypeptide has CDR1, CDR2, and CDR3 having amino acid sequences as shown in SEQ ID NOs: 49 to 51, respectively, according to IMGT definition.

[0087] In some embodiments, provided is a bispecific antibody comprising: (a) an IgG antibody comprising two heavy chains (HCs) and two light chains (LCs) , each of the two heavy chains comprising a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) , each of the two light chains comprising a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) , wherein the IgG antibody binds specifically to a B-cell marker; and (b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 3.

[0088] In some embodiments, provided is a bispecific antibody comprising: (a) an IgG antibody comprising two heavy chains (HCs) and two light chains (LCs) , each of the two heavy chains comprising a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) , each of the two light chains comprising a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) , wherein the IgG antibody binds specifically to CD19 or CD20; and (b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 3.

[0089] In some embodiments, provided is a bispecific antibody comprising: (a) an IgG antibody comprising two heavy chains (HCs) and two light chains (LCs) , each of the two heavy chains comprising a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) , each of the two light chains comprising a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) , wherein the IgG antibody binds specifically to CD19 or CD20; and (b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody via a peptide linker, wherein the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 3.

[0090] In some embodiments, provided is a bispecific antibody comprising: (a) an IgG antibody comprising two heavy chains (HCs) and two light chains (LCs) , each of the two heavy chains comprising a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) , each of the two light chains comprising a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) , wherein the IgG antibody binds specifically to CD19 or CD20; and (b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody via a peptide linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 16 or 17, wherein the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 3.

[0091] IgG Antibodies specifically binding to CD19

[0092] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD19 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 22 to 27, respectively, according to Kabat definition.

[0093] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD19 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 28 to 31, EAS, and SEQ ID NO: 33, respectively, according to IMGT definition.

[0094] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD19 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 64 to 69, respectively, according to Kabat definition.

[0095] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD19 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 70 to 73, HTS, and SEQ ID NO: 75, respectively, according to IMGT definition.

[0096] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD19 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 78 to 83, respectively, according to Kabat definition.

[0097] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD19 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 84 to 87, DAS, SEQ ID NO: 89, respectively, according to IMGT definition.

[0098] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD19 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 92 to 97, respectively, according to Kabat definition.

[0099] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD19 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 98 to 101, RMS, and SEQ ID NO: 103, respectively, according to IMGT definition.

[0100] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD19 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 106 to 111, respectively, according to Kabat definition.

[0101] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD19 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 112 to 115, DTS, and SEQ ID NO: 117, respectively, according to IMGT definition.

[0102] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD19 and comprises VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively.

[0103] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD19 and comprises VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 10 and 11, respectively.

[0104] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD19 and comprises VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 76 and 77, respectively.

[0105] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD19 and comprises VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 90 and 91, respectively.

[0106] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD19 and comprises VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 104 and 105, respectively.

[0107] In some embodiments, the IgG antibody binding specifically to CD19 in any one of the embodiments described above is Inebilizumab. In some embodiments, the IgG antibody binding specifically to CD19 is Inebilizumab with YTE substitutions.

[0108] Therefore, in some embodiments, provided is a bispecific antibody comprising: (a) an IgG antibody binds specifically to CD19, wherein the IgG antibody comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 22 to 27, respectively, according to Kabat definition; or HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 28 to 31, EAS, and SEQ ID NO: 33, respectively, according to IMGT definition; and (b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3.

[0109] In some embodiments, provided is a bispecific antibody comprising: (a) an IgG antibody binds specifically to CD19, wherein the IgG antibody comprises VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively; and (b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3.

[0110] In some embodiments, provided is an anti-CD19 antibody comprising HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 64 to 69, respectively, according to Kabat definition.

[0111] In some embodiments, provided is an anti-CD19 antibody comprising HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 70 to 73, HTS, and SEQ ID NO: 75, respectively, according to IMGT definition.

[0112] In some embodiments, provided is an anti-CD19 antibody comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a light chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.

[0113] IgG Antibodies specifically binding to CD20

[0114] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD20 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 52 to 57, respectively, according to Kabat definition.

[0115] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD20 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 58 to 61, DAS, and SEQ ID NO: 63, respectively, according to IMGT definition.

[0116] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD20 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 34 to 39, respectively, according to Kabat definition.

[0117] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD20 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 40 to 43, ATS, and SEQ ID NO: 45, respectively, according to IMGT definition.

[0118] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD20 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 120 to 125, respectively, according to Kabat definition.

[0119] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD20 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 126 to 129, ATS, and SEQ ID NO: 131, respectively, according to IMGT definition.

[0120] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD20 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 134 to 139, respectively, according to Kabat definition.

[0121] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD20 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 140 to 143, QMS, and SEQ ID NO: 145, respectively, according to IMGT definition.

[0122] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD20 and comprises VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.

[0123] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD20 and comprises VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 12 and 13, respectively.

[0124] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD20 and comprises VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 118 and 119, respectively.

[0125] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above binds specifically to CD20 and comprises VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 132 and 133, respectively.

[0126] In some embodiments, the IgG antibody in any one of the embodiments described above is Ofatumumab, Obinutuzumab, or Ublituximab.

[0127] In some embodiments, the IgG antibody binding specifically to CD20 is Ofatumumab. In some embodiments, the IgG antibody binding specifically to CD20 is Obinutuzumab. In some embodiments, the IgG antibody binding specifically to CD20 is Ublituximab. In some embodiments, the IgG antibody binding specifically to CD20 is Ofatumumab with YTE substitutions. In some embodiments, the IgG antibody binding specifically to CD20 is Obinutuzumab with YTE substitutions. In some embodiments, the IgG antibody binding specifically to CD20 is Ublituximab with YTE substitutions. In some embodiments, the IgG antibody binding specifically to CD20 is an afucosylated Obinutuzumab. In some embodiments, the IgG antibody binding specifically to CD20 is an afucosylated Obinutuzumab with YTE substitutions.

[0128] Therefore, in some embodiments, provided is a bispecific antibody comprising: (a) an IgG antibody binds specifically to CD20, wherein the IgG antibody comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 52 to 57, respectively, according to Kabat definition; or HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 34 to 39, respectively, according to IMGT definition; and (b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3.

[0129] In some embodiments, provided is a bispecific antibody comprising: (a) an IgG antibody binds specifically to CD20, wherein the IgG antibody comprises VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively; and (b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3.

[0130] In some embodiments, provided is a bispecific antibody comprising: (a) an IgG antibody binds specifically to CD20, wherein the IgG antibody is Ofatumumab; and (b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH polypeptide has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3.

[0131] In some embodiments, provided is an anti-CD20 / CD16A bispecific antibody comprising a heavy chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4 and a light chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5.

[0132] In some embodiments, provided is an anti-CD19 / CD16A bispecific antibody comprising a heavy chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 8 and a light chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 9.

[0133] In some embodiments, provided is an anti-CD20 / CD16A bispecific antibody comprising a heavy chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 149 and a light chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5.

[0134] In some embodiments, provided is an anti-CD20 / CD16A bispecific antibody comprising a heavy chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 147 and a light chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 146.

[0135] In some embodiments, provided is an anti-CD20 / CD16A bispecific antibody comprising a heavy chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 147 and a light chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 146, in which the bispecific antibody is afucosylated.

[0136] Polypeptides, Polynucleotides, Vectors, and Host Cells

[0137] Polypeptides

[0138] A second aspect of the disclosure provides a plurality of polypeptides.

[0139] In some embodiments, provided is a polypeptide comprising a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to a B-cell marker and an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody.

[0140] In preferable embodiments, provided is a polypeptide comprising a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to a B-cell marker selected from a group consisting of CD1d, CD5, CD19, CD20, CD21, CD23, CD27, CD30, CD38, CD40, CD43, CD45, CD69, CD95, CD138, CD184, TNFSF13B and TNFRSF17 and an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody.

[0141] In preferable embodiments, provided is a polypeptide comprising a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to CD19 or CD20, and an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody.

[0142] In preferable embodiments, provided is a polypeptide comprising a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to CD19 or CD20, and an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody via a peptide linker.

[0143] In preferable embodiments, provided is a polypeptide comprising a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to CD19 or CD20, and an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody via a peptide linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 16 or 17.

[0144] In any one of the embodiments described above under this section, the anti-CD16A VHH may be any one of the anti-CD16A VHH described above under the section subtitled Anti-CD16A VHH Polypeptides.

[0145] In any one of the embodiments described above under this section, the IgG antibody may be any one of the IgG antibodies described above under the section subtitled IgG Antibodies specifically binding to CD19 or IgG Antibodies specifically binding to CD20.

[0146] In preferable embodiments, provided is a polypeptide comprising a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to CD19 or CD20, and an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH comprises CDR1, CDR2, and CDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 46 to 48, respectively, according to Kabat definition.

[0147] In preferable embodiments, provided is a polypeptide comprising a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to CD19 or CD20, and an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH comprises CDR1, CDR2, and CDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 49 to 51, respectively, according to IMGT definition.

[0148] In preferable embodiments, provided is a polypeptide comprising a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to CD19 or CD20, and an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH comprises an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.

[0149] In preferable embodiments, provided is a polypeptide comprising a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to CD19 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 22 to 27, respectively, according to Kabat definition, and an anti-CD16A VHH covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH comprises CDR1, CDR2, and CDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 46 to 48, respectively, according to Kabat definition.

[0150] In preferable embodiments, provided is a polypeptide comprising a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to CD19 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 28 to 31, EAS, and SEQ ID NO: 33, respectively, according to IMGT definition, and an anti-CD16A VHH covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH comprises CDR1, CDR2, and CDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 49 to 51, respectively, according to IMGT definition.

[0151] In preferable embodiments, provided is a polypeptide comprising a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to CD20 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 52 to 57, respectively, according to Kabat definition, and an anti-CD16A VHH covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH comprises CDR1, CDR2, and CDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 46 to 48, respectively, according to Kabat definition.

[0152] In preferable embodiments, provided is a polypeptide comprising a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to CD20 and comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 58 to 61, DAS, and SEQ ID NO: , respectively, according to IMGT definition, and an anti-CD16A VHH covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH comprises CDR1, CDR2, and CDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 49 to 51, respectively, according to IMGT definition.

[0153] In preferable embodiments, provided is a polypeptide comprising a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to CD19 and comprises VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively, and an anti-CD16A VHH covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH comprises an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.

[0154] In preferable embodiments, provided is a polypeptide comprising a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to CD20 and comprises VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively, and an anti-CD16A VHH covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH comprises an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.

[0155] In preferable embodiments, provided is a polypeptide comprising a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to CD20 and comprises VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 132 and 133, respectively, and an anti-CD16A VHH covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody, wherein the anti-CD16A VHH comprises an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. In preferable embodiments, provided is a polypeptide having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, 8, 147 or 149.

[0156] Polynucleotides, Vectors, and Host Cells

[0157] Additional aspects of the disclosure provide a polynucleotide encoding any one of the bispecific antibody and the polypeptides described above.

[0158] In some embodiments, provided is a polynucleotide encoding any one of the polypeptides described above.

[0159] In some embodiments, the polynucleotide is DNA, cDNA or RNA. In some embodiments, polynucleotide is cDNA.

[0160] In some embodiments, provided is a vector comprising the polynucleotide. In some embodiments, the vector is an expression vector. In some embodiments, the vector is a plasmid. In some embodiments, the plasmid is from E. coli. In some embodiments, the vector is a viral vector. In some embodiments, the viral vector is an AAV vector. In some embodiments, the viral vector is an AAV vector comprising the polynucleotide in the form of mRNA.

[0161] In some embodiments, provided is a host cell comprising the vector or the polynucleotide. In some embodiments, the host cell is a prokaryotic cell. In some embodiments, the host cell is a non-human eukaryotic cell. In some embodiments, the host cell is a HEK cell. In some embodiments, the host cell is a Vero cell. In some embodiments, the host cell is a CHO cell.

[0162] Pharmaceutical Compositions

[0163] The present disclosure, in another aspect, provides a pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody, a polypeptide, a vector, or a host cell ( “collectively referred to as active ingredients” ) , as disclosed herein above, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0164] The present compositions can be in any form that allows for the composition to be administered to a patient. For example, the composition can be in the form of a solid, liquid or gas (aerosol) . Typical routes of administration include, without limitation, oral, topical, parenteral, sublingual, rectal, vaginal, ocular, intra-tumor, and intranasal. Parenteral administration includes subcutaneous injections, intravenous, intramuscular, intrasternal injection or infusion techniques. In one aspect, the compositions are administered parenterally. In yet another aspect, the compositions are administered intravenously.

[0165] Pharmaceutical compositions can be formulated so as to allow the active ingredient to be bioavailable upon administration of the composition to a patient. Compositions can take the form of one or more dosage units, where for example, a tablet can be a single dosage unit, and a container in aerosol form can hold a plurality of dosage units.

[0166] Materials used in preparing the pharmaceutical compositions can be non-toxic in the amounts used. It will be evident to those of ordinary skill in the art that the optimal dosage of the active ingredient (s) in the pharmaceutical composition will depend on a variety of factors. Relevant factors include, without limitation, the type of animal (e.g., human) , the particular form of the active ingredient, the manner of administration, and the employed composition.

[0167] The pharmaceutically acceptable carrier or vehicle can be particulate, so that the compositions are, for example, in tablet or powder form. The carrier (s) can be liquid, with the compositions being, for example, an oral syrup or injectable liquid. In addition, the carrier (s) can be gaseous or particulate, so as to provide an aerosol composition useful in, e.g., inhalatory administration.

[0168] The composition can be in the form of a liquid, e.g., an elixir, syrup, solution, emulsion or suspension. The liquid can be useful for oral administration or for delivery by injection. When intended for oral administration, a composition can comprise one or more of a sweetening agent, preservatives, dye / colorant and flavor enhancer. In a composition for administration by injection, one or more of a surfactant, preservative, wetting agent, dispersing agent, suspending agent, buffer, stabilizer and isotonic agent can also be included.

[0169] The liquid compositions, whether they are solutions, suspensions or other like form, can also include one or more of the following: sterile diluents such as water for injection, saline solution, preferably physiological saline, Ringer’s solution, isotonic sodium chloride, fixed oils such as synthetic mono or digylcerides which can serve as the solvent or suspending medium, polyethylene glycols, glycerin, cyclodextrin, propylene glycol or other solvents; antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl paraben; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; buffers such as acetates, citrates or phosphates and agents for the adjustment of tonicity such as sodium chloride or dextrose. A parenteral composition can be enclosed in ampoule, a disposable syringe or a multiple-dose vial made of glass, plastic or other material. Physiological saline is an exemplary adjuvant. An injectable composition is preferably sterile.

[0170] The amount of the active ingredients that is effective in the treatment of a particular disorder or condition will depend on the nature of the disorder or condition and can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vitro or in vivo assays can optionally be employed to help identify optimal dosage ranges. The precise dose to be employed in the compositions will also depend on the route of administration, and the seriousness of the disease or disorder, and should be decided according to the judgment of the practitioner and each patient’s circumstances.

[0171] The compositions comprise an effective amount of an active ingredient such that a suitable dosage will be obtained. Typically, this amount is at least about 0.01%of an active ingredient by weight of the composition. When intended for oral administration, this amount can be varied to range from about 0.1%to about 80%by weight of the composition. In one aspect, oral compositions can comprise from about 4%to about 50%of the active ingredient by weight of the composition. In yet another aspect, present compositions are prepared so that a parenteral dosage unit contains from about 0.01%to about 2%by weight of the active ingredient.

[0172] For intravenous administration, the composition can comprise from about 0.01 to about 100 mg of an active ingredient per kg of the animal’s body weight. In one aspect, the composition can include from about 1 to about 100 mg of an active ingredient per kg of the animal’s body weight. In another aspect, the amount administered will be in the range from about 0.1 to about 25 mg / kg of body weight of the active ingredient.

[0173] Generally, the dosage of an active ingredient administered to a patient is typically about 0.01 mg / kg to about 2000 mg / kg of the animal’s body weight. In one aspect, the dosage administered to a patient is between about 0.01 mg / kg to about 10 mg / kg of the animal’s body weight, in another aspect, the dosage administered to a patient is between about 0.1 mg / kg and about 250 mg / kg of the animal’s body weight, in yet another aspect, the dosage administered to a patient is between about 0.1 mg / kg and about 20 mg / kg of the animal’s body weight, in yet another aspect the dosage administered is between about 0.1 mg / kg to about 10 mg / kg of the animal’s body weight, and in yet another aspect, the dosage administered is between about 1 mg / kg to about 10 mg / kg of the animal’s body weight.

[0174] The pharmaceutical compositions provided herein can further comprise one or more additional anti-cancer agent available in the market.

[0175] Uses and Therapies

[0176] The bispecific antibody, the polypeptide, the vector, and the host cell ( “collectively referred to as active ingredients” ) , as disclosed herein above, are useful for treating an autoimmune disease in a subject, such as a human patient.

[0177] The present disclosure, in a further aspect, provides a method for treating an autoimmune disease in a subject, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of one of the active ingredients, such as the bispecific antibody, disclosed herein.

[0178] The present disclosure, in a further aspect, provides use of one of the active ingredients, such as the bispecific antibody, disclosed herein for the preparation of a medicament for treatment of an autoimmune disease.

[0179] The present disclosure, in a further aspect, provides one of the active ingredients, such as the bispecific antibody, disclosed herein for use in treatment of an autoimmune disease.

[0180] In any one of the aspects mentioned above in this section, the autoimmune disease is an autoimmune disease susceptible to B cell depletion therapies or an autoimmune disease mediated by autologous B cells. In preferable embodiments, the autoimmune disease is selected from a group consisting of psoriatic arthritis, rheumatoid arthritis (RA) ,   syndrome, systemic lupus erythematosus (Lupus, SLE) , Crohn’s disease, celiac disease, ulcerative colitis, inflammatory bowel disease (IBD) , Graves’ disease, Hashimoto’s thyroiditis, Addison’s disease, dermatomyositis, psoriasis, pemphigus vulgaris, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP) , Guillain-Barre syndrome, multiple sclerosis (MS) , myasthenia gravis, Type 1 diabetes, pernicious anemia, and autoimmune vasculitis.

[0181] In a preferable embodiment, provided is a method for treatment of rheumatoid arthritis in a subject, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the bispecific antibody disclosed herein. Alternatively, provided is the use of the bispecific antibody disclosed herein in the preparation of a medicament for treatment of rheumatoid arthritis. Alternatively, provided is the bispecific antibody disclosed herein for use in the treatment of rheumatoid arthritis.

[0182] In a preferable embodiment, provided is a method for treatment of multiple sclerosis in a subject, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the bispecific antibody disclosed herein. Alternatively, provided is the use of the bispecific antibody disclosed herein in the preparation of a medicament for treatment of multiple sclerosis. Alternatively, provided is the bispecific antibody disclosed herein for use in the treatment of multiple sclerosis. Examples

[0183] Example 1. Humanization of anti-CD19 domain

[0184] Humanization of Anti-CD19 VH / VL was performed in 3 steps. First, FMC63 VH and VL from NCBI database accession PDB: 7URV_D were used to search against IMGT-aligned human germline IGHV and IGKV gene sequences compiled from IMGT database. The closest human gene allele IGHV4-30-4*01 and IGKV1-39*01 were selected based on sequence identity. CDR residues according to Kabat scheme were inserted at the corresponding positions in the germline sequences. Second, the 3D structure of CDR grafted sequences was predicted by AlphaFold, subset of vernier zone residues were selected and back mutated to parental residues if suspected by visualization to be incompatible with CDR. Lastly, humanness score T20 of resulting sequences were calculated based on a report by Sean et. al., BMC Biotechnology, 13: 55, 2013. The humanization process ultimately generated humanized anti-CD19 antibody comprising VH and VL having amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 6 and 7, respectively. The humanized anti-CD19 antibody further comprises a human IgG1 heavy chain constant region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, and a human IgG1 light chain constant region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15.

[0185] Example 2. Design of bispecific constructs

[0186] This example demonstrates the construction of two bispecific antibodies with one domain binding to CD19 or CD20 antigen, and the other domain binding to CD16A. CD16-VH-RM72, a fully human CD16A single domain antibody was chosen as a building block for constructions. CD16-VH-RM72 has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. IgG1 type anti-CD20 mAb Ofatumumab or Obinutuzumab (BM366-09, Heavy chain: SEQ ID NO: 148; Light chain: SEQ ID NO: 146) was fused to N-terminal of CD16-VH-RM72 chain with a flexible (G4S) 3 linker in between to generate BM366-01 (Heavy chain: SEQ ID NO: 4; Light chain: SEQ ID NO: 5) and BM366-05 (with YTE mutation of BM366-01, Heavy chain: SEQ ID NO: 149; Light chain: SEQ ID NO: 5) or BM366-18 (Heavy chain: SEQ ID NO: 147; Light chain: SEQ ID NO: 146) and BM366-18AF (Afucosylation version of BM366-18, i.e., the core fucose from the glycan at N297 (EU numbering) position was removed; Heavy chain: SEQ ID NO: 147; Light chain: SEQ ID NO: 146) . Humanized anti-CD19 IgG antibody as mentioned in Example 1 was fused to N-terminal of CD16-VH-RM72 chain with a flexible (G4S) 3 linker in between to generate another bispecific antibody, BM366-02 (Heavy chain: SEQ ID NO: 8; Light chain: SEQ ID NO: 9) . These bispecific constructs were shown in Figure 1.

[0187] Example 3. CHO cell production and binding activity

[0188] DNA encoding these constructs BM366-01 / BM366-02 / BM366-05 / BM366-18 were transiently transfected into Expi-CHO cells to produce recombinant bispecific antibodies, the resultant conditioned medium was harvested and BM366-01 / BM366-02 / BM366-05 / BM366-18 bispecific antibodies were purified using Protein A column. Second step of purification was performed using POROS XS. BM366-18AF was produced by transiently transfect plasmids into FucoFree TurboCHOTM cells, in which two fucosyltransferase (Fut8) alleles in the genome of CHO-K1 cells were knocked out. Fut8 can catalyze the formation of α-1, 6 fucosidic bonds, therefore, the antibodies produced by FucoFree TurboCHOTM cells are no fucosylation. More than 98%purity was achieved for BM366-01 / BM366-02 / BM366-05 / BM366-18 / BM366-18AF after these 2 steps purification process. Expression titer for these five bispecific is about 66 mg / liter for BM366-01, 75 mg / liter for BM366-02, 750 mg / liter for BM366-05, 127 mg / liter for BM366-18, and 200 mg / liter for BM366-18AF. For cell-based assays described below, endotoxins level was measured using a standard LAL-assay.

[0189] The purified antibodies were used for binding affinity measurement. Binding to CD16A was determined using biotin-CD16A 158V antigen immobilized on streptavidin probe by gator technology. Equilibrium dissociation constants (KD) for binding were determined by fitting 1: 1 Langmuir model to the data. BM366-01 and BM366-02 bind to CD16A 158V with KD value at 6.37E-011 M and 7.33E-011 M respectively (Figure 2) .

[0190] Further, we used the surface plasmon resonance (SPR) method to detect the affinity of BM366-05 / BM366-09 / BM366-18 / BM366-18AF for hCD16A 158F, hCD16A 158V, and Cyno CD16A 158F. Specifically, 0.5 μg / mL of his-tagged CD16A antigen was injected into the experimental channel at a flow rate of 10 μL / min and captured by an Anti-his mAb (10 μg / mL) immobilized on the CM5 chip. Subsequently, BM366 antibody (start from 25 nM, 2-fold dilution, 5 gradients) was injected into the experimental and reference channels at a flow rate of 30 μL / min. After 200 s association, dissociation is carried out for about 300 s. The KD value is obtained by fitting in a 1: 1 binding. As shown in Figure 3, the KD values of BM366-05 bind to hCD16A 158F and hCD16A 158V are 4.813E-10M and 8.707E-10M, respectively. The KD values of BM366-09 bind to hCD16A 158F and hCD16A 158V were 4.059E-8M and 1.392E-8M, respectively. Encouragingly, the KD values of BM366-18 for hCD16A 158F and hCD16A 158V were 3.189E-10M and 4.543E-10M, respectively, which were 30-fold and 127-fold higher than those of BM366-09. The affinity of BM366-18AF (without fucose modification) for hCD16A 158F (KD: 1.710E-10M) and hCD16A 158V (KD: 1.686E-10M) was 1.86-fold and 2.39-fold higher than that of BM366-18, respectively. These results indicate that both the bispecific antibody containing anti-CD16A VH and the absence of fucose modification can further improve the affinity of the bispecific antibody to the human CD16A antigen. In order to evaluate the efficacy in cynomolgus monkeys, we measured the affinity of BM366 antibody for Cyno CD16A (158F) . As shown in Figure 4, the KD value of BM366-09 bind to Cyno CD16A (158F) is 1.626E-8M, which is close to that of human CD16A. Although BM366-18AF bind Cyno CD16A (158F) with KD values of 2.461E-9M, which are about 7-fold higher than that of parent antibody BM366-09, it is much lower than the affinity for binding to human CD16A. BM366-18AF has an increased affinity for the CD16A 158F genotype compared to obinutuzumab, and a significant proportion (approximately 80-85%) of the population carries at least one 158F allele.

[0191] Binding of bispecific to cell surface CD19 or CD20 was evaluated using FACS assay. Human B lymphoblastoma cells Ramos which are known for high CD19 and CD20 expression was used for this purpose. 1×10^6 Ramos cell was incubated with various concentrations of antibody (500 and 5nM) for 30 minutes at 4℃ followed by staining with FITC-anti human Fc secondary antibody. Rituximab and Inebilizumab were used as positive controls along with IgG1 and IgG4 as isotype control. The results showed both antibodies can bind to CD19 or CD20 on cell surface with high affinity (Figure 5) .

[0192] Example 4. Bispecific antibody-mediated activation of Jurkat CD16a (158F / V) -NFAT-luc cells

[0193] Jurkat CD16A (158F / V) -NFAT-luc reporter cells were Jurkat cell line stably transfected exogenous luciferase gene under the control of NFAT responsive element and human FCGR3A gene bearing 158F or 158V mutation respectively. When Jurkat CD16A (158F / V) -NFAT-luc reporter is engaged by bispecific antibody in the presence of target cell, nuclear factor of activated T cells (NFAT) was activated and promoted downstream luciferase expression. The amount of luciferase produced is indicative of degree of cell activation triggered by BM366-01 or BM366-02.

[0194] Ramos cells were seeded at a density of 1×10^4 cells per well at a ratio of 1: 1 together with Jurkat-NFAT-Luc2-CD16A-158F or 158 V cell. Then, a serially diluted of BM366-01 or BM366-02 antibody were added. Rituximab and Ofatumumab were positive control for BM366-01 and Inebilizumab for BM366-02. Human IgG1 and BMP01-16, an unrelated bispecific antibody was used as negative controls. After incubation for 6 hrs, luciferase expression was detected using ultra luciferase detection kit. BM366-01 showed better induction ADCC efficacy in a dose and target cell dependent manner compared with its parent antibody Ofatumumab and Rituximab with an EC50 is 30 pM for 158 F and 7 pM for 158 V genotype. Detailed information was shown in Figure 6.

[0195] BM366-02 also can stimulate reporter cell activation in a concentration-dependent manner with an EC50 of 4 pM (for 158 F) and 1 pM (for 158 V) , better than the reference mAb Inebilizumab, which is an ADCC enhancing afucosylated IgG1 (Figure 7) .

[0196] Similarly, the activation of Jurkat CD16A (158F / V) -NFAT-luc reporter by BM366-05 and BM366-18AF were measured in the presence of SU-DHL-2 target cells. As shown in Figure 8, the EC50 of BM366-05 is 14.9 pM (for 158F) , 16.21-fold higher than that of Rituximab and 26.67-fold higher than that of Ofatumumab and 4.08-fold higher than that of Obinutuzumab but weaker than that of bispecific antibody BM366-18AF (0.54-fold) . For activation of Jurkat CD16A (158V) -NFAT-luc reporter cells, the EC50 of BM366-05 is 6.2 pM, 12.25-fold higher than that of Rituximab and 15.14-fold higher than that of Ofatumumab and 1.88-fold higher than that of Obinutuzumab and similar to BM366-18AF (0.92-fold) .

[0197] Example 5. Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC)

[0198] The efficacies of BM366-01 and BM366-02 were further characterized by their ability to enhance NK cell killing in vitro. The killing was evaluated by detecting lactate dehydrogenase (LDH) released from dying cells in assay’s supernatants using PBMC as effector and CD19 / CD20 antigen expressing cell as target cell.

[0199] Firstly, Multiple PBMC were screened and one PBMC donor Lot#2407110217 was selected as suitable effector cell for the following assay. Raji cell was used as target cell to evaluate ADCC efficacy of BM366-01, with anti-CD20 Rituximab and anti-CD20 Ofatumumab as references. Nalm-6 and Ramos cells were used to evaluate ADCC efficacy of BM366-02, with anti-CD19 Inebilizumab as reference.

[0200] The day before ADCC experiments, frozen PBMCs were recovered and incubated at 37℃. Raji cell, Nalm-6 and Ramos cell were harvested and seeded into a 96 well plate at 25000 / well. A serially diluted BM366-01 and reference antibodies (anti-CD20 Rituximab, anti-CD20 Ofatumumab, and anti-CD19 Inebilizumab) were added. After incubation for 30 min, human PBMC was added at an Effector: Target ratio of 20: 1. LDH released in culture supernatant was detected using LDH detection kit after an additional 4 hours of incubation. Effector cell only, target cell only, media only, maximum cell lysis were set to substrate background. Cell killing percentage was calculated by the following formula.

[0201] BM366-01 exhibited superior ADCC killing activity with EC50 of 72 pM than its parent antibody Ofatumumab (EC50: 317 pM) and Rituximab (EC50: 832 pM) . This result is consistent with the previous ADCC reporter assay which BM366-01 is about ten-fold more active than Rituximab (Figure 9) .

[0202] BM366-02 also displayed more efficient ADCC killing than Inebilizumab using both Nalm-6 and Ramos cell as target cells. Detailed results were shown in Figure 10.

[0203] As shown in Figure 11, BM366-05 exhibited ADCC activity similar to BM366-01 and was 10-fold higher than its parental antibody, Ofatumumab. Similarly, BM366-18AF, demonstrated the most potent ADCC activity (EC50: 0.13 nM) , was 4-fold more effective than its parental antibody, Obinutuzumab. This indicates that these bispecific antibodies containing CD16A-targeting nanobodies exhibit enhanced killing activity.

[0204] Example 6. SLE PBMC B cell depletion assay

[0205] Next, the efficacy of BM366-01 and BM366-05 were further characterized by their B cell depletion potency, in which PBMCs from three different patients with systemic lupus erythematosus (SLE) . The result was evaluated by detecting B cell counts in each well by FACS after 24h of BM366 antibodies treatment.

[0206] The main experimental procedure is briefly described as follows: after resuscitation, PBMCs were added to a 96-well round bottom plate at 1.5x10^5 / well, followed by different concentrations of antibodies and mixed well (starting at 25 nM, 4-fold dilution, 9 concentration gradients) . After 24 h of incubation at 37℃, the supernatant was collected and frozen in a -80℃ for subsequent detection of cytokine release. The cell pellet was washed once with a FACS buffer, then resuspended and incubated for 30 min at 4℃ with eF450 labeled anti-human CD45 and Brilliant Violet 786 labeled anti-human CD19. The number of B cells per well was counted by FACS.

[0207] As shown in Figure 12, the EC50 of BM366-05 depletion B cells in Donor YG001 was 39 pM, which was close to BM366-01 and 5.95-fold and 13.8-fold higher than that of Rituximab and Mosunetuzumab (a humanized anti-CD20 / CD3 bispecific antibody developed by Roche and sold under tradename LunsumioTM) , respectively. In addition, BM366-05 has a better maximum depletion efficiency than Rituximab and Mosunetuzumab. On Donor YG002 and JX24JK01CR, BM366-05 has the strongest EC50, which is 1.89-fold and 40.8-fold higher than Rituximab and 99-fold and 899.4-fold higher than Mosunetuzumab, respectively.

[0208] Detection of IFN-g, IL-6, TNF-α in cell supernatant according to the instructions of the ELISA kit (R&D) . In these three different donors, BM366-05 did not mediate significant IFN-g, IL-6, and TNF-α releases at different concentration ranges. However, in Donor1 (YG001) and Donor2 (YG002) , treatment with Mosunetuzumab resulted in significantly higher IFN-g, IL-6, and TNF-α releases, up to 1,000-fold higher than in the control group (Figure 13) .

[0209] Therefore, the above results indicate that BM366-05 has a higher maximum depletion efficiency and a more efficient EC50 than Rituximab in different donors. Although mosunetuzumab has greater depletion efficiency in some donors, higher cytokine release suggests that it may have a lower safety profile than BM366-05.

[0210] Similar to BM366-05, BM366-18 / BM366-18AF bispecific antibody had better B cell depletion activity than its parent antibody. As shown in Figure 14, BM366-18 has a 2-fold higher depletion activity of B cells derived from PBMCs in SLE patients compared with Obinutuzumab. The activity of BM366-18AF, the fucose free form of BM366-18, was further improved, 6.4-fold higher than that of Obinutuzumab. Moreover, BM366-18AF was more active than BM366-01 and BM366-05, although only 1.2～2.4-fold better.

[0211] Example 7. In vivo pharmacodynamics study of BM366 bispecific antibodies in hCD20 / hCD16A KI C57 mice (158VV)

[0212] B-hCD16A / hCD20 mice was obtained by cross-breeding B-hCD16A mice and B-hCD20 mice and was used in this pharmacodynamics study at 6-8 weeks of age. Mice were grouped according to their body weight and number of peripheral blood B cells, including Obinutuzumab group (1mpk) , Rituximab group (1mpk) , BM366-05 group (1.2mpk) , BM366-18AF group (1.2mpk) , and control group (n=3) . Antibodies are administered by intravenous injection. Peripheral blood was collected before administration (D0) and on the first and third days after administration, and the changes of B cells (mCD45 mCD3-mCD19) and NK cells (mCD45 mCD3-mCD19-NK1.1) in peripheral blood were detected by flow cytometry. Mice were euthanized on the third day, and the spleen, lymph nodes (from groin, armpit and neck) , and tibia bone marrow of the hind limbs were collected for flow cytometry to detect changes in B cells.

[0213] As shown in Figure 15, a significant decrease in B cells in peripheral blood was induced in both dosing groups on the first day after administration. BM366-18AF has the best clearance effect, better than Rituximab. On the third day, BM366-18AF was able to clear 99.9%of peripheral blood B cells compared to baseline (D0) , and Rituximab had clearance efficiencies of 97.1%. The clearance efficiency of BM366-18AF against B cells in lymph nodes was 92%, and Rituximab cleared B cells with efficiencies of 81% (Figure 16) . In addition, the group treated with bispecific antibodies BM366-18AF had more NK cells. In the spleen, BM366-18AF cleared 95%of B cells compared to the control group (PBS) , which was better than Rituximab (64%) (Figure 17) .

[0214] Example 8. In vivo pharmacodynamics study of BM366 bispecific antibodies in cynomolgus monkey

[0215] In vivo pharmacodynamics study was conducted by using adult Cynomolgus. Before starting the PD study, ADA-negative animals were selected for enrollment. The main experimental steps were as follows: BM366 antibody was coated with an ELISA plate at a concentration of 1μg / mL, and a 1: 100 dilution of cynomolgus monkey serum was added after 1h of blockade at room temperature. After an additional 1 h of incubation, the EZ-LinkTM NHS-biotin-labeled BM366 antibody was added. Three washes were performed after 1 h of incubation and SA-HRP was added. After adding TMB, the OD450nm value was measured. Serum with OD450nm values less than 2-fold the blank serum were ADA negative.

[0216] All antibodies were injected i. v. as a single dose. Before the start of administration (D0) , blood was collected from each cynomolgus monkey and the counts of different B cell subsets and NK cells were detected by flow cytometry as baseline. Peripheral blood was collected on D1, D3 and D5 after administration, and the number of B cell subsets and NK cells was also detected by flow cytometry. On the fifth day, one inguinal lymph node was collected from each cynomolgus monkey and flow cytometry was performed to detect the B cell subset and NK cells. Peripheral blood B cells from each cynomolgus monkey were analyzed by flow cytometry on the first, third, and fifth days following administration of 10 mpk or 12 mpk antibodies. As shown in Figure 18A, both Rituximab and BM366-18AF achieved more than 99%depletion of CD3-CD19+ B cells.

[0217] Similar depletion was observed for memory B cells and  B cells in peripheral blood (Figures 18B and 18C) . Furthermore, we evaluated the effects of these antibodies on the deep clearance of B cells in lymph nodes. As illustrated in Figure 19A, BM366-18AF exhibited excellent depletion of B cells in lymph nodes, with a 93.4%reduction in the proportion of CD3-CD19+ B cells compare to the vehicle group, which was superior to the effect of Rituximab (78.2%) . Likewise, a similar depletion trend was noted for memory B cells and  B cells in lymph nodes (Figures 19B and 19C) The data was analyzed by GraphPad Prism 8.

Claims

1.A bispecific antibody comprising(a) an IgG antibody comprising two heavy chains (HCs) and two light chains (LCs) , each of the two heavy chains comprising a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) , each of the two light chains comprising a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) , wherein the IgG antibody binds specifically to a B-cell marker; and(b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody.2.The bispecific antibody of claim 1, wherein the B-cell marker is selected from a group consisting of CD1d, CD5, CD19, CD20, CD21, CD23, CD27, CD30, CD38, CD40, CD43, CD45, CD69, CD95, CD138, CD184, TNFSF13B and TNFRSF17; preferably, the B-cell marker is CD19 or CD20.3.The bispecific antibody of claim 1 or 2, wherein the IgG antibody is an IgG1 antibody, preferably, a human IgG1 antibody; more preferably, a human IgG1 antibody comprising: (a) M252Y / S254T / T256E substitutions in Fc region according to the EU numbering; and / or (b) an afucosylation at N297 in Fc region according to the EU numbering.4.The bispecific antibody of any one of claims 1 to 3, wherein the anti-CD16A VHH is covalently linked to C-terminus of each of two heavy chains of the IgG antibody via a peptide linker; preferably the peptide linker has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 16 or 17.5.The bispecific antibody of any one of claims 1 to 4, wherein the anti-CD16A VHH comprises:(a) CDR1, CDR2, and CDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 46 to 48, respectively, according to Kabat definition;(b) CDR1, CDR2, and CDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 49 to 51, respectively, according to IMGT definition; or(c) an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.6.The bispecific antibody of any one of claims 1 to 5, wherein the IgG antibody binds specifically to CD19 and comprises:(a) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 22 to 27, respectively, according to Kabat definition;(b) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 28 to 31, EAS, and SEQ ID NO: 33, respectively, according to IMGT definition;(c) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 64 to 69, respectively, according to Kabat definition;(d) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 70 to 73, HTS, and SEQ ID NO: 75, respectively, according to IMGT definition;(e) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 78 to 83, respectively, according to Kabat definition;(f) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 84 to 87, DAS, SEQ ID NO: 89, respectively, according to IMGT definition;(g) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 92 to 97, respectively, according to Kabat definition;(h) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 98 to 101, RMS, and SEQ ID NO: 103, respectively, according to IMGT definition;(i) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 106 to 111, respectively, according to Kabat definition;(j) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 112 to 115, DTS, and SEQ ID NO: 117, respectively, according to IMGT definition;(k) VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively;(l) VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 10 and 11, respectively;(m) VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 76 and 77, respectively;(n) VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 90 and 91, respectively; or(o) VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 104 and 105, respectively.7.The bispecific antibody of any one of claims 1 to 5, wherein the IgG antibody binds specifically to CD20 and comprises:(a) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 52 to 57, respectively, according to Kabat definition;(b) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 58 to 61, DAS, and SEQ ID NO: 63, respectively, according to IMGT definition;(c) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 34 to 39, respectively, according to Kabat definition;(d) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 40 to 43, ATS, and SEQ ID NO: 45, respectively, according to IMGT definition;(e) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 120 to 125, respectively, according to Kabat definition;(f) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 126 to 129, ATS, and SEQ ID NO: 131, respectively, according to IMGT definition;(g) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 134 to 139, respectively, according to Kabat definition;(h) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 140 to 143, QMS, and SEQ ID NO: 145, respectively, according to IMGT definition;(i) VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively;(j) VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 12 and 13, respectively;(k) VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 118 and 119, respectively; or(l) VH and VL having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 132 and 133, respectively.8.The bispecific antibody of any one of claims 1 to 7, wherein the bispecific antibody comprises(a) a heavy chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4 and a light chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5;(b) a heavy chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 8 and a light chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 9;(c) a heavy chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 149 and a light chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5;(d) a heavy chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 147 and a light chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 146; or(e) a heavy chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 147 and a light chain having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 146, in which the bispecific antibody is afucosylated.9.A polypeptide comprising:(a) a heavy chain of an IgG antibody, wherein the IgG antibody binds specifically to a B-cell marker; preferably, the B-cell marker is selected from a group consisting of CD1d, CD5, CD19, CD20, CD21, CD23, CD27, CD30, CD38, CD40, CD43, CD45, CD69, CD95, CD138, CD184, TNFSF13B and TNFRSF17, more preferably, the B-cell marker is CD19 or CD20; and / or preferably, the IgG antibody is an IgG1 antibody, more preferably, a human IgG1 antibody, and even more preferably, a human IgG1 antibody comprising: (a) M252Y / S254T / T256E substitutions in Fc region according to the EU numbering; and / or (b) an afucosylation at N297 in Fc region according to the EU numbering; and(b) an anti-CD16A VHH, covalently linked to C-terminus of the heavy chain of the IgG antibody, preferably via a peptide linker, more preferably via a peptide linker having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 16 or 17.10.The polypeptide of claim 9, wherein the heavy chain of the IgG antibody binds specifically to CD19 and comprises a heavy chain variable region and a heavy chain constant region, wherein the heavy chain variable region comprises(a) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 22 to 24, respectively, according to Kabat definition;(b) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 28 to 30, respectively, according to IMGT definition;(c) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 64 to 66, respectively, according to Kabat definition;(d) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 70 to 72, respectively, according to IMGT definition;(e) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 78 to 80, respectively, according to Kabat definition;(f) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 84 to 86, respectively, according to IMGT definition;(g) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 92 to 94, respectively, according to Kabat definition;(h) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 98 to 100, respectively, according to IMGT definition;(i) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 106 to 108, respectively, according to Kabat definition;(j) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 112 to 114, respectively, according to IMGT definition;(k) VH having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;(l) VH having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10;(m) VH having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76;(n) VH having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 90; or(o) VH having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 104.11.The polypeptide of claim 9, wherein the heavy chain of the IgG antibody binds specifically to CD20 and comprises a heavy chain variable region and a heavy chain constant region, wherein the heavy chain variable region comprises(a) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 52 to 54, respectively, according to Kabat definition;(b) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 58 to 60, respectively, according to IMGT definition;(c) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 34 to 36, respectively, according to Kabat definition;(d) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 40 to 42, respectively, according to IMGT definition;(e) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 120 to 122, respectively, according to Kabat definition;(f) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 126 to 128, respectively, according to IMGT definition;(g) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 134 to 136, respectively, according to Kabat definition;(h) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 140 to 142, respectively, according to IMGT definition;(i) VH having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;(j) VH having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12;(k) VH having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 118; or(l) VH having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 132.12.The polypeptide of any one of claims 9 to 11, wherein the anti-CD16A VHH comprises:(a) CDR1, CDR2, and CDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 46 to 48, respectively, according to Kabat definition;(b) CDR1, CDR2, and CDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 49 to 51, respectively, according to IMGT definition; or(c) an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.13.The polypeptide of any one of claims 9 to 12, wherein the polypeptide has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, 8, 147 or 149.14.A polynucleotide encoding the polypeptide of any one of claims 9 to 13.15.A vector, preferably a plasmid, comprising the polynucleotide of claim 14.16.A host cell, preferably a eukaryotic cell, comprising the polynucleotide of claim 14.17.A pharmaceutical composition comprising the bispecific antibody of any one of claims 1 to 8, the polypeptide of any one of claims 9 to 13, the polynucleotide of claim 14, the vector of claim 15, or the host cell of claim 16; and a pharmaceutically acceptable carrier.18.Use of the bispecific antibody of any one of claims 1 to 8, the polypeptide of any one of claims 9 to 13, the polynucleotide of claim 14, the vector of claim 15, the host cell of claim 16, or the pharmaceutical composition of claim 17, in the preparation of a medicament for treatment of an autoimmune disease.19.An anti-CD19 antibody or an antigen-binding fragment thereof, comprising:(i) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 64 to 69, respectively, according to Kabat definition;(ii) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 having an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 70 to 73, HTS, and SEQ ID NO: 75, respectively, according to IMGT definition; or(iii) a heavy chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a light chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.

Images