BISPECIFIC ANTIBODY AGAINST IL6R and IL23 and USE THEREOF

Abstract

Provided is a bispecific antibody and use thereof, the bispecific antibody comprising: a first domain that specifically binds the interleukin-6 receptor IL-6R, and a second domain that specifically binds interleukin-23. The bispecific antibody can simultaneously target IL-6R and IL-23p19, with stronger specificity, more accurately targeting tumor cells and reducing the adverse effects of off-target toxicity and can perform a unique function to play a biological function that is difficult to achieve with monoclonal antibody drugs. Compared with monoclonal antibody combination therapies, it can also effectively reduce the cost of treatment and break the current upper limit of therapeutic efficacy in the treatment of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and IBD.

Description

BISPECIFIC ANTIBODY AGAINST IL6R and IL23 and USE THEREOFFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present invention belongs to the technical field of immunology and specifically relates to a bispecific antibody against IL6R and IL23 and use thereof.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Interleukin-6 (IL-6) is a multifunctional cytokine discovered in the 1980s and was previously known as hepatocyte stimulating factor, B-cell stimulating factor 2, cytotoxic T-cell differentiation factor, B-cell differentiation factor, hybridoma / plasmacytoma growth factor, monocyte granulocyte inducer type 2, and thrombopoietin. Interleukin-6 (IL-6) is produced by various types of cells such as T-cells, B-cells, monocytes, fibroblasts, osteoblasts, keratin-forming cells, endothelial cells, mesangial cells and some tumor cells. IL-6 comprises four α-helical domains with a motif of four cysteine residues which are necessary for its tertiary structure. IL-6 transmits different biological signals to various tissues and cells by interacting with different IL-6 receptors on the cell surface and then via downstream signaling pathways.

[0003] Interleukin 6 receptor (IL-6) plays an important role in immune regulation, hematopoiesis, inflammation and oncogenesis. IL-6 is involved in the treatment of a disease or condition and has been a target of drug discovery for the treatment of that disease or condition. Tocilizumab (TCZ) , the first humanized monoclonal antibody targeting the interleukin-6 receptor (IL-6R) , is an IgG1 antibody obtained by humanizing the mouse antibody PM1. Tocilizumab can be used as a therapeutic agent for IL-6-associated diseases and has been marketed under the trade names Actemra and RoActemra.

[0004] IL-23 plays a crucial role in the regulation and amplification of helper T cells and the activation of various innate immune cells. It is an essential cytokine in the pathogenesis of IBD. Because of its role in the differentiation and maturation of Th17 cells, mediating the onset and maintenance of inflammation, it becomes a very promising target. Activated Th17 cells produce a variety of pro-inflammatory cytokines, including IL-17A, IL-17F, IL-6, IL-22, TNF-α, and granulocyte macrophage colony-stimulating factors (GM-CSF) . There is evidence that IL-23 is a major trigger of intestinal inflammation compared to IL-12. First, in an animal model of colitis, anti-IL-23p19 antibody can induce remission in transgenic mice by down-regulating a variety of colitis cytokines and chemokines. Second, anti-CD40 systemic inflammation is dependent on IL-12, whereas intestinal inflammation and IL-17 production are enhanced by IL-23. Finally, the IL-23R gene has been associated with IBD in genome-wide association studies. The relative selectivity of the IL-23 in inflammatory response makes it an attractive therapeutic target.

[0005] Currently, no similar dual-target drugs have been approved for marketing at home or abroad. There is no report yet on bispecific antibodies against IL-6R and IL-23-p19.SUMMARY OF THE INVENTION

[0006] In order to address at least one of the above issues, the present disclosure provides a symmetric bispecific antibody that can specifically bind to IL6R and IL-23p19. The bispecific antibodies provided by the present disclosure have stronger specificity, can more accurately target tumor cells and reduce the adverse effects of off-target toxicity, and perform a unique function to play a biological function that is difficult to achieve with monoclonal antibody drugs.

[0007] According to one aspect of the present disclosure, provided is a bispecific antibody comprising: a first domain that specifically binds interleukin-6 receptor IL-6R, and a second domain that specifically binds interleukin-23 (IL-23) .

[0008] In some embodiments, the first domain is an antibody or a functional fragment thereof that specifically binds IL-6R.

[0009] In some embodiments, the second domain is an antibody or a functional fragment thereof that specifically binds IL-23.

[0010] In some embodiments, the first domain comprises the following three heavy chain variable region complementary determining regions (HCDRs) : HCDR1, having an amino acid sequence of HCDR1 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 19, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR1 contained in the heavy chain variable region; HCDR2, having an amino acid sequence of HCDR2 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 19, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR2 contained in the heavy chain variable region; and HCDR3, having an amino acid sequence of HCDR3 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 19, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR3 contained in the heavy chain variable region.

[0011] In some embodiments, the first domain comprises the following three light chain variable region complementary determining regions (LCDRs) : LCDR1, having an amino acid sequence of LCDR1 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 20, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR1 contained in the light chain variable region; LCDR2, having an amino acid sequence of LCDR2 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 20, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR2 contained in the light chain variable region; and LCDR3, having an amino acid sequence of LCDR3 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 20, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR3 contained in the light chain variable region.

[0012] In some embodiments, the first domain comprises HCDR1, HCDR2, and HCDR3 contained in the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 19, and LCDR1, LCDR2, and LCDR3 contained in the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 20.

[0013] In some embodiments, the HCDR1-HCDR3 and / or the LCDR1-LCDR3 are defined by IMGT numbering system, Kabat numbering system, Chothia numbering system, Contact numbering system, or a combination thereof.

[0014] In some embodiments, the first domain comprises a heavy chain variable region and / or a light chain variable region as follows, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to IMGT numbering system: a heavy chain variable region comprising the following 3 HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 2, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 3; and / or, a light chain variable region comprising the following 3 LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 with a sequence of YTS, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 5.

[0015] In some embodiments, the first domain comprises a heavy chain variable region and / or a light chain variable region as follows, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Kabat numbering system: a heavy chain variable region comprising the following 3 HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 6, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 7, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 8; and / or, a light chain variable region comprising the following 3 LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 9, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 10, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 5.

[0016] In some embodiments, the first domain comprises a heavy chain variable region and / or a light chain variable region as follows, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Chothia numbering system: a heavy chain variable region comprising the following 3 HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 11, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 12, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 8; and / or, a light chain variable region containing the following 3 LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 9, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 10, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 5.

[0017] In some embodiments, the first domain comprises a heavy chain variable region and / or a light chain variable region as follows, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Contact numbering system: a heavy chain variable region comprising the following 3 HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 13, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 14, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 15; and / or, a light chain variable region containing the following 3 LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 16, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 17, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 18.

[0018] In some embodiments, the first domain comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 19, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto; and, a light chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto.

[0019] In some embodiments, the first domain comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 19, and a light chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20.

[0020] In some embodiments, the second domain comprises the following three heavy chain variable region complementary determining regions (HCDRs) :

[0021] HCDR1, having an amino acid sequence of HCDR1 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 41, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR1 contained in the heavy chain variable region;

[0022] HCDR2, having an amino acid sequence of HCDR2 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 41, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR2 contained in the heavy chain variable region; and

[0023] HCDR3, having an amino acid sequence of HCDR3 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 41, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR3 contained in the heavy chain variable region.

[0024] In some embodiments, the second domain comprises the following three light chain variable region complementary determining regions (LCDRs) :

[0025] LCDR1, having an amino acid sequence of LCDR1 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 42, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR1 contained in the light chain variable region;

[0026] LCDR2, having an amino acid sequence of LCDR2 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 42, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR2 contained in the light chain variable region; and

[0027] LCDR3, having an amino acid sequence of LCDR3 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 42, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR3 contained in the light chain variable region.

[0028] In some embodiments, the second domain comprises HCDR1, HCDR2, and HCDR3 contained in the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 41, and LCDR1, LCDR2, and LCDR3 contained in the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 42.

[0029] In some embodiments, the HCDR1-HCDR3 and / or the LCDR1-LCDR3 are defined by IMGT numbering system, Kabat numbering system, Chothia numbering system, Contact numbering system, or a combination thereof.

[0030] In some embodiments, the second domain comprises a heavy chain variable region and / or a light chain variable region as follows, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to IMGT numbering system: a heavy chain variable region comprising the following 3 HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 23, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 24, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 25; and / or, a light chain variable region comprising the following 3 LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 26, LCDR2 with a sequence of GNS, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 27.

[0031] In some embodiments, the second domain comprises a heavy chain variable region and / or a light chain variable region as follows, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Kabat numbering system: a heavy chain variable region comprising the following 3 HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 28, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 29, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 30; and / or, a light chain variable region comprising the following 3 LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 31, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 32, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 27.

[0032] In some embodiments, the second domain comprises a heavy chain variable region and / or a light chain variable region as follows, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Chothia numbering system: a heavy chain variable region comprising the following 3 HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 33, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 34, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 30; and / or, a light chain variable region comprising the following 3 LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 31, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 32, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 27.

[0033] In some embodiments, the second domain comprises a heavy chain variable region and / or a light chain variable region as follows, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Contact numbering system: a heavy chain variable region comprising the following 3 HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 35, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 36, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 37; and / or, a light chain variable region comprising the following 3 LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 38, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 39, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 40.

[0034] In some embodiments, the second domain comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 41, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto; and a light chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 42, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto.

[0035] In some embodiments, the first domain and the second domain each independently comprise an antibody Fab fragment, Fab'fragment, F (ab') 2 fragment, Fv fragment, scFv fragment, nanobody, heavy chain variable region (VH) fragment, or light chain variable region (VL) fragment.

[0036] In some embodiments, the first domain comprises a Fab fragment, the second domain comprises a scFv fragment, and the second domain is linked to a VH fragment of the first domain.

[0037] In some embodiments, the first domain comprises an scFv fragment, the second domain comprises a Fab fragment, and the first domain is linked to a VH fragment of the second domain.

[0038] In some embodiments, the bispecific antibody further comprises an antibody Fc fragment.

[0039] In some embodiments, the Fc fragment of the antibody is linked to the N-terminus and / or C-terminus of the first domain or second domain, either directly or via a linker.

[0040] In some embodiments, the Fc fragment of an antibody is derived from IgG, IgA, IgM, IgD, or IgE, more preferably from IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4.

[0041] In some embodiments, the first domain and the second domain are connected either directly or via a linker.

[0042] In some embodiments, the linker has an amino acid sequence as shown in a general formula (GnS) m, wherein n and m are integers from 1 to 10, respectively; more preferably, n is an integer from 1 to 4, and m is an integer from 1 to 3, or an amino acid sequence having an insertion, substitution or deletion of 1, 2 or 3 amino acids as compared to the amino acid sequence shown in the general formula (GnS) m.

[0043] In some embodiments, the linker has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 47: GGGGSGGGGTGGGGS or SEQ ID NO: 48: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS, or an amino acid sequence having an insertion, substitution, or deletion of 1, 2, or 3 amino acids compared thereto.

[0044] In some embodiments, the bispecific antibody comprises a first peptide chain and a second peptide chain.

[0045] In some embodiments, the first peptide chain comprises, in order from the N-terminus to the C-terminus, the heavy chain of the first domain, a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) of the second domain, with each the portion being directly connected and connected via a linker; and the second peptide chain comprises the light chain of the first domain.

[0046] In some embodiments, the first peptide chain comprises, in order from the N-terminus to the C-terminus, the heavy chain of the first domain, a light chain variable region (VL) and a heavy chain variable region (VH) of the second domain, with each the portion being directly connected and connected via a linker; and the second peptide chain comprises the light chain of the first domain.

[0047] In some embodiments, the first peptide chain comprises, in order from the N-terminus to the C-terminus, a heavy chain of the second domain, a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) of the first domain, with each the portion being directly connected and connected via a linker; and the second peptide chain comprises a light chain of the second domain.

[0048] In some embodiments, the first peptide chain comprises, in order from the N-terminus to the C-terminus, a heavy chain of the second domain, a light chain variable region (VL) and a heavy chain variable region (VH) of the first domain, with each the portion being directly connected and connected via a linker; and the second peptide chain comprises a light chain of the second domain.

[0049] In some embodiments, the bispecific antibody further comprises an Fc fragment. In some embodiments, the first peptide chain comprises an Fc fragment. In some embodiments, the Fc fragment is located between the first domain and the second domain.

[0050] In some embodiments, the first peptide chain comprises, from the N-terminus to the C-terminus: a heavy chain of the antibody that specifically binds to IL-6R, a scFv of the antibody that specifically binds to IL-23.

[0051] In some embodiments, the first peptide chain comprises, from the N-terminus to the C-terminus: a heavy chain of the antibody that specifically binds to IL-6R, a heavy chain variable region of the antibody that specifically binds to IL-23, and a light chain variable region of the antibody that specifically binds to IL-23, connected to each other either directly or via a linker.

[0052] In some embodiments, the first peptide chain comprises, from the N-terminus to the C-terminus: a heavy chain of the antibody that specifically binds to IL-6R, a light chain variable region of the antibody that specifically binds to IL-23, and a heavy chain variable region of the antibody that specifically binds to IL-23, connected to each other either directly or via a linker.

[0053] In some embodiments, the second peptide chain comprises the light chain of an antibody that specifically binds to IL-6R.

[0054] In some embodiments, the bispecific antibody has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NOs: 22 and 45, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto. In some embodiments, the bispecific antibody has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NOs: 22 and 46, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto.

[0055] In some embodiments, the bispecific antibody of the present disclosure forms a dimer. In some embodiments, the bispecific antibody of the present disclosure forms a homodimer. In some embodiments, the bispecific antibody of the present disclosure forms a heterodimer.

[0056] According to another aspect of the present disclosure, provided is an isolated nucleic acid molecule encoding the bispecific antibody as described herein.

[0057] In some embodiments, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NOs: 49 and 50, or a nucleotide sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto. In some embodiments, the isolated nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NOs: 50 and 51, or a nucleotide sequence having at least 80%, at least 85%, at least 88%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity thereto.

[0058] According to yet another aspect of the present disclosure, provided is an expression vector comprising the isolated nucleic acid as described herein.

[0059] In some embodiments, the expression vector comprises an expression vector derived from an adenovirus, an adeno-associated virus, a lentivirus, or other acceptable expression vectors.

[0060] According to yet another aspect of the present disclosure, provided is a host cell comprising the isolated nucleic acid molecule as described herein, or the expression vector as described herein.

[0061] According to yet another aspect of the present disclosure, provided is a chimeric antigen receptor comprising an extracellular antigen-binding fragment, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain, wherein the extracellular antigen-binding fragment comprises the bispecific antibody as described herein.

[0062] According to yet another aspect of the present disclosure, provided is a conjugate comprising the bispecific antibody as described herein, and a conjugated moiety.

[0063] In some embodiments, the conjugated moiety is selected from the group consisting of a detectable label, a radioisotope, a fluorescent substance, a luminescent substance, a colored substance, an enzyme, polyethylene glycol (PEG) , a nuclide, a nucleic acid, a small-molecule toxin, a peptide with binding activity, a protein, a receptor, a ligand, and other active substances that inhibit growth of tumor cells, and promote apoptosis or necrosis of tumor cells.

[0064] According to yet another aspect of the present disclosure, provided is a pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody as described herein, an isolated nucleic acid molecule as described herein, or an expression vector as described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0065] In some embodiments, the pharmaceutical composition is a form selected from the group consisting of a tablet, a pulvis, a granule, a pill, an injection, a suspension, a powder, an emulsion, an aerosol, a gel, an eye drop, a sustained-release agent, and a sustained-release implant.

[0066] According to yet another aspect of the present disclosure, provided is a pharmaceutical cartridge comprising a pharmaceutical composition as described herein, and the pharmaceutical composition is encapsulated in a container.

[0067] In some embodiments, the container is selected from the group consisting of a glass ampoule, a glass vial, a plastic ampoule, a plastic vial, a plastic bag, and a prefilled syringe.

[0068] In some embodiments, the present disclosure relates to a pharmaceutical unit dosage form suitable for parenteral administration to a human, the pharmaceutical unit dosage form comprising the pharmaceutical composition as described herein in a suitable container. In some embodiments, the suitable container is a prefilled syringe. In some embodiments, the prefilled syringe comprises an injection needle.

[0069] According to yet another aspect of the present disclosure, provided is a kit comprising the bispecific antibody as described herein and, optionally, an instruction for use.

[0070] According to yet another aspect of the present disclosure, provided is use of the bispecific antibody described herein, the isolated nucleic acid molecule described herein, the expression vector described herein, the chimeric antigen receptor described herein, the conjugate described herein, or the pharmaceutical composition described herein in the preparation of a medicament for preventing and / or treating IL-6R and / or IL-23 related disease.

[0071] According to yet another aspect of the present disclosure, provided is a method for treating or preventing IL-6R and / or IL-23 related disease, comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of the bispecific antibody described herein, the isolated nucleic acid molecule described herein, the expression vector described herein, the chimeric antigen receptor described herein, the conjugate described herein, or the pharmaceutical composition described herein.

[0072] In some embodiments, the disease includes one or more of an inflammatory disease, an immune system disease, and a cancer-related disease.

[0073] In some embodiments, the disease includes one or more of allergy / asthma, arthritis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, systemic juvenile idiopathic arthritis (JIA) , osteoarthritis, psoriasis arthropica, ankylosing spondylitis, psoriasis, inflammatory bowel disease (IBD) , ulcerative colitis (UC) , Crohn's disease (CD) , Lyme arthritis, graft-versus-host disease (GVHD) , meningoencephalitis, immune-mediated inflammatory diseases of the central and peripheral nervous system, pancreatitis, graft-versus-host disease, arteritis, cardiovascular inflammation, neuromyelitis optica, Castleman's disease, giant cell arteritis, atherosclerosis, eosinophilic esophagitis, atopic dermatitis, primary sclerosing cholangitis, vasculitis, autoimmune thyroiditis, eczema, scleroderma, infection-associated endotoxic shock, aortitis graft rejection, cardiac disease, bone resorption, Paget's disease, osteoporosis, primary biliary cirrhosis, atherosclerosis, septicemia, periodontitis, hypochlorhydia, cytokine release syndrome (CRS) , systemic lupus erythematosus (SLE) , immune-related adverse events (irAE) , thyroid eye disease (TED) , chronic kidney disease (CKD) , Sjogren's syndrome, multiple sclerosis, systemic sclerosis-associated interstitial lung disease, polymyalgia rheumatica, myocardial infarction, uveitis, encephalomyelitis, myasthenia gravis, familial Mediterranean fever, Schnitzler syndrome, graft-versus-host disease, hematopoietic stem cell transplantation, kidney transplantation, heart transplantation, Behcet syndrome, esophageal adenocarcinoma, hepatocellular carcinoma, pancreatic carcinoma, non-small cell lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, uroepithelial carcinoma, prostate cancer, rectal cancer, colon cancer, bladder cancer, solid tumor (renal cell carcinoma) , hematopoietic and lymphocytic tumors, malignant solid tumors, adamantinomatous craniopharyngiomas, melanoma, recurrent glioblastoma, leukemias and lymphomas, amyotrophic lateral sclerosis, ALS, schizophrenia, major depressive disorder, diabetes mellitus, osteodystrophia fibrosa, obesity, hemophagocytic lymphohistiocytic hyperplasia, idiopathic retroperitoneal fibrosis, alopecia areata, pulmonary fibrosis, cystic fibrosis, gastrointestinal disorders associated with cystic fibrosis, irritable bowel syndrome, pelvic inflammatory disorders, Alzheimer's disease, Castleman's disease, dermatomyositis, Peyronie's disease, celiac disease, gallbladder disorders, pilonidal disease, peritonitis, surgical adhesions, surgical trauma, stroke, and Sjogren's syndrome.

[0074] Beneficial effects of the present invention:

[0075] The present disclosure provides a bispecific antibody that simultaneously targets IL-6R and IL-23p19. Compared with a monoclonal antibody, a bispecific antibody adds a specific antigen-binding site, which makes it more specific and more accurate in targeting tumor cells, reduces the adverse effects of off-target toxicity, and can perform a special function to play a biological function that is difficult to achieve with monoclonal antibodies. And compared with monoclonal antibody combination therapies, it can also effectively reduce the cost of treatment and break the current upper limit of therapeutic efficacy in the treatment of an autoimmune disease such as rheumatoid arthritis and IBD.

[0076] DETAILED DESCRIPTION OF THE EMBODIMENTS

[0077] Interleukin-6 (IL-6) binds to two receptors, one is the specific receptor IL-6R (80kDa type I transmembrane protein) , and the other is gp130, which is a common receptor subunit for members of the IL-6 cytokine family. The gp130 can be expressed in all cells, but the expression of the IL-6 receptor (IL-6R) is more restricted and is found mainly in hepatocytes, neutrophils, monocytes and CD4+ T cells. The dimerization of the interleukin IL-6 receptor gp130 initiates cellular events including activation of the JAK-STAT3 pathway and ras-mediated MAP kinase signaling.

[0078] IL-23, a member of the IL-12 cytokine family, is a pro-inflammatory cytokine. It consists of two subunits, a unique p19 subunit and a p40 subunit shared with IL-12. IL-23 is produced primarily by macrophages and dendritic cells in the intestinal epithelium.

[0079] The present disclosure provides a symmetric bispecific antibody that can specifically bind to IL6R and IL-23p19. This bispecific antibody simultaneously targets IL6R and IL23, and may potentially increase binding specificity and reduce adverse effects caused by off-target and the like when binding to two different cell surface antigens. It can block the IL6 / IL6R signaling pathway and IL-23 / IL-23R signaling pathway with synergistic effects. Compared with a monoclonal antibody, the bispecific antibody adds a specific antigen-binding site, which makes it more specific and more accurate in targeting tumor cells, and reduces the adverse effects of off-target toxicity, and can perform a special function to play a biological function that is difficult to achieve with monoclonal antibody drugs. Compared with monoclonal antibody combination therapies, it can also effectively reduce the cost of treatment and break the current upper limit of therapeutic efficacy in the treatment of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and IBD.

[0080] The inventors have screened mutants 206mab with a multifold increase in affinity based on the interleukin-6 receptor monoclonal antibody drug tocilizumab (TCZ) by genetic modification (see Chinese Patent Application No. 2024104525229, which is incorporated herein by reference in its entirety) . The anti-human interleukin 6 receptor (IL-6R) monoclonal antibody formulation of the present disclosure, VDJ020-14, is based on 206mab (VDJ001) , which has been modified with amino acid mutations to potential high-risk modification site, oxidation of methionine (Met) in the CDR regions, thereby avoiding a series of late-stage drugability and commercialization risks associated with the post-translational modification sites. The Fc region of the antibody was modified to reduce its affinity for FcRn at pH 7.4 and increase its affinity at pH 6.0, in order to prolong the half-life of the antibody while ensuring its activity (see Chinese Patent for Invention No. 202410452522.9, which is incorporated herein by reference in its entirety) .

[0081] The IL-23 antibody portion is a scFv fragment of a humanized monoclonal antibody targeting IL-23 known as guselkumab (also referred to as VDJ013-17 herein) , which is the first approved IL-23 monoclonal antibody for the treatment of psoriasis in the world. In addition to psoriasis, it is also developed for the treatment of Crohn's disease, ulcerative colitis, and hidradenitis suppurativa, and other autoimmune diseases.

[0082] The sequences of the heavy chain variable region, the light chain variable region and the CDR thereof of the monoclonal antibodies involved in the bispecific antibody of the present disclosure are shown in Tables 1 and 2.

[0083] Table 1. CDR sequences of monoclonal antibodies involved in bispecific antibodies

[0084] Table 2. Sequences of heavy chain variable region and light chain variable region of monoclonal antibodies involved in bispecific antibodies

[0085] Definition

[0086] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in the present invention have the same meanings as commonly used in the field to which the present invention belongs. For the purpose of interpreting this description, the following definitions will be applied and, where appropriate, terms used in the singular form will also include the plural form and vice versa.

[0087] The singular form "a" and "an" as used herein include plural reference unless the context clearly indicates otherwise.

[0088] The term "about" as used herein is understood by those of ordinary skill in the art and can vary within a certain range depending on its context. If the use of this term is not otherwise clear to those of ordinary skill in the art based on the context in which it is used, the term "about" shall mean up to ±10%of a specified value.

[0089] The term "affinity" or "binding affinity" as used herein refers to the overall strength of non-covalent interactions between a single binding site of a molecule (e.g., a bispecific antibody or a bispecific binding molecule) and its binding ligand (e.g., an antigen) . Binding affinity can usually be expressed in terms of the dissociation constant (KD) , which is the ratio of the rate of dissociation (kd) to the rate of binding (ka) , i.e., KD= kd / ka. The affinity can be measured by conventional methods known in the art, such as surface plasmon resonance (SPR) .

[0090] The term "specific recognition" or "specific binding" as used herein refers to that antibodies exhibit selectivity in recognizing and binding to ligands or receptors and can be distinguished from unwanted or non-specific binding. In one embodiment, as measured by SPR, for example, the degree of binding of the bispecific antibody of the present disclosure to unrelated proteins is less than about 10%of the degree of binding to IL-6R and IL-23. In certain embodiments, the bispecific antibodies provided by the present disclosure bind to IL-6R and IL-23 with a KD of 10-7 M or less, e.g., 10-10 M to 10-11 M.

[0091] The term "substitution" as used herein for amino acids refers to the replacement of at least one amino acid residue in an amino acid sequence by a different "replacing" amino acid residue. The term "insertion" as used herein for amino acids refers to the incorporation of at least one additional amino acid into an amino acid sequence. While inserts typically consist of inserting 1 or 2 amino acid residues, it is also possible to prepare larger "peptide inserts" , e.g., inserting about 3 to 5 or even up to about 10, 15 or 20 amino acid residues. As disclosed above, the inserted residues may be naturally occurring or non-naturally occurring. The term "deletion" as used herein for amino acids refers to the removal of at least one amino acid residue from an amino acid sequence.

[0092] The bispecific antibodies or the fragments thereof of the present disclosure may comprise conservative amino acid substitutions at one or more amino acid residues, e.g., at essential or non-essential amino acid residues. "Conservative amino acid substitution" is the replacement of an amino acid residue by another amino acid residue with a similar side chain. Families of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art and include basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine) , acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid) , uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine) , non-polar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan) , β-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) , and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) . Thus, in the present disclosure, an essential or non-essential amino acid residue in a bispecific antibody or linker is preferably replaced with another amino acid residue from the same side chain family. In certain embodiments, the amino acid chain segments may be replaced with chain segments that are structurally similar and have different order and / or composition of side chain family members. Alternatively, in certain embodiments, mutations may be introduced randomly along all or a portion of the coding sequence, such as by saturation mutagenesis, and the resulting mutants may be incorporated into the bispecific antibodies of the present disclosure and screened with respect to the ability of these polypeptides to bind to a desired target.

[0093] The term "antibody" as used herein includes an intact antibody and any antigen-binding fragment (i.e., "antigen-binding portion" , "antigen-binding polypeptide" , or "immunoconjugator" ) or their single chains. "Antibody" is a glycoprotein comprising at least two heavy (H) chains and two light (L) chains interconnected by disulfide bonds, or an antigen-binding portion thereof. Each heavy chain includes a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH) . Each light chain includes a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) . The VH and VL regions each contain three regions that are highly variable in terms of amino acid composition and arrangement order, called hypervariable region or complementarity determining region (CDR) , CDRl, CDR2 and CDR3. The regions other than the CDR region in the VH and VL regions are relatively conserved in terms of amino acid composition and arrangement order and are called framework region (FR) . VH or VL each has four framework regions, denoted by FR1, FR2, FR3, and FR4, respectively.

[0094] There are five major classes of immunoglobulins, IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and these major classes can be further categorized into subclasses (isotypes) such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2. The heavy chain constant domains corresponding to the different classes of immunoglobulins are called α, δ, ε, γ, and μ, respectively. The CL lengths of the different types (κor λ) of immunoglobulins are essentially the same, but the CH lengths of the different classes of immunoglobulins are different, e.g., IgG, IgA, and IgD include CH1, CH2, and CH3, whereas IgM and IgE include CHl, CH2, CH3, and CH4. The hinge region, located between CH1 and CH2, is rich in proline and easily stretches and bends, thus changing the distance between antigen-binding sites and facilitating antibody binding to antigenic epitopes located in different positions. The hinge region is susceptible to hydrolysis by papain, pepsin, etc., producing different hydrolyzed fragments. The position of Ig that is hydrolyzed by papain is at the proximal N terminus of the hinge region, where the two heavy chains are connected by disulfide bonds, which cleaves Ig into two identical Fab segments and one Fc segment. The Fab segment is a fragment antigen binding (Fab) and consists of an intact light chain and the VH and CH1 domains of a heavy chain.

[0095] The term "homodimer" as used herein refers to a formation from a bispecific antibody of the present disclosure, including two identical bispecific antibodies of the present disclosure. The term "heterodimer" as used herein refers to a formation from a bispecific antibody of the present disclosure, including two different bispecific antibodies of the present disclosure.

[0096] The term "individual" or "subject" as used herein, refers to a mammal, including, but not limited to, human and non-human mammals, e.g., a mammal including, but not limited to, a domesticated animal (e.g., a cow, horse, dog, sheep, goat, cat, and dog) , primate (e.g., human and monkey) , and a rodent (e.g., rabbit, mouse, and rat) .

[0097] The range of values, as used herein, should be understood as having been enumerated for all numbers within that range. For example, the range of 1 to 20 should be understood to include any number, combination of numbers, or subrange from the following groups: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20.

[0098] The term "linker" as used herein refers to a (peptide) linker of natural and / or synthetic origin, consisting of linear amino acids. The respective domains in the bispecific antibodies of the present disclosure may be connected by a linker, wherein each linker is fused and / or otherwise connected (e.g., via a peptide bond) to at least two polypeptides or domains. In some embodiments, the amino acid sequences of all linkers present in the bispecific antibodies of the present disclosure are identical. In other embodiments, the amino acid sequences of at least two linkers present in the bispecific antibodies of the present disclosure are different. The linker should be of a length suitable for linking two or more monomeric domains in such a way that the linker is able to ensure that the different domains to which it is linked are correctly folded and appropriately presented so as to exert its biological activity function. In various embodiments, the linker has a flexible conformation. Suitable flexible linkers include, for example, having glycine, glutamine and / or serine residues. In some embodiments, the amino acid residues in the linker may be arranged in small repeating units of up to 5 amino acids.

[0099] "Percentage (%) sequence identity" relative to a reference amino acid sequence refers to the percentage of amino acid residues in the candidate sequence that are identical to amino acid residues in the reference amino acid sequence after the alignment of the sequences and (as needed) introduction of gaps to obtain the maximum percentage of sequence identity, without regard to any conservative substitutions as part of the sequence identity. To determine the percentage of amino acid sequence identity, alignments can be performed in various ways within the scope of the art, such as using BLAST, ALIGN, or Megalign (DNASTAR) software. Those skilled in the art may determine appropriate parameters for aligning sequences, including any algorithms required to achieve optimal alignment over the full length of the sequences being compared.

[0100] The term "pharmaceutically acceptable carrier" as used herein refers to a component in a pharmaceutical formulation, other than the active ingredient, that is non-toxic to a subject. Pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, buffers, excipients, stabilizers, or preservatives.

[0101] The term "treatment" as used herein refers to the alleviation and / or amelioration of the disorder and / or diseases or symptoms associated with it, as well as the prevention of worsening of the disorder's symptoms. Desired therapeutic effects include, but are not limited to, prevention of disease occurrence or recurrence, remission of symptoms, reduction of any direct or indirect pathological outcome of the disease, prevention of metastasis, slowing of the rate of progression of the disease, amelioration or alleviation of symptoms, and alleviation or amelioration of prognosis. It should be understood, however, that the treatment of a disease or symptom does not require the complete elimination of the disease, or the symptoms associated with it.

[0102] The term "effective amount" as used herein refers to the amount that is effective in the necessary dosage and time period to achieve the desired therapeutic or prophylactic effect.

[0103] In order to make the object, technical solution and advantage of the present invention clearer and more understandable, the present invention is further described in detail in the following in conjunction with examples. The specific examples described herein are intended to explain the present invention and should not be construed as limiting the scope of the present invention. The actual scope of protection of the present invention is set forth in the claims. In the following description, explanations of well-known structures and techniques have been omitted to avoid unnecessary confusion about the concepts of the present disclosure. Such structures and techniques have been also described in numerous publications. The equipment, instruments, reagents and / or kits used in the following examples for which sources, unless otherwise specified, are obtained commercially through the marketplace or by conventional methods known to those skilled in the art. Example

[0104] Example 1 Construction of expression plasmid

[0105] The bispecific antibodies of this example are against the IL6R target and the IL-23-p19 target. Among them, the anti-IL6R monoclonal antibody was VDJ020-14 intact molecule, and the anti-IL-23 monoclonal antibody was VDJ013-17 intact molecule. The anti-IL6R×IL-23 bispecific antibody was formed by connecting VDJ020-14 intact molecule or its scFv with VDJ013-17 intact molecule or its scFv by a linker. The heavy-chain gene and light-chain gene of the bispecific antibody were cloned into the pCDNA3.4 vector through HindIII&EcoRI restriction sites, respectively, to construct the heavy-chain recombinant plasmid and light chain recombinant plasmid of the bispecific antibody, respectively. The sequences of bispecific antibody were shown in Table 3, wherein the linker has an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 47: GGGGSGGGGTGGGGS or SEQ ID NO: 48: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS.

[0106] Table3. Sequences of bispecific antibodies

[0107] Example 2 Transient expression of bispecific antibodies

[0108] Expi-CHO-Scells were suspended at a density of 2×106cells / ml in the medium, placed in an Erlenmeyer flask, and cultured under conditions of 100 rpm, 37℃ and 5%CO2 for 20-25h, and when the density of the cells reached about 5×106 cells / ml, and the cells were in the logarithmic growth phase with a viability of more than 95%, they were used for transfection experiments. The heavy chain recombinant plasmid and light chain recombinant plasmid obtained in Example 1 were added to Trans Buffer A (Medium Bank) and mixed gently, and polyetherimide (PEI) was added to Trans Buffer A and mixed gently. The diluted PEI solution was added to the corresponding diluted plasmid, mixed gently and incubated at room temperature for 5 min. The mixture solution was added to an Erlenmeyer flask containing Expi-CHO-Scells and cultured in a shaker at 100 rpm, 37℃, and 5%CO2, for performing co-transfection of the host cells with dual plasmids. 24 hours after transfection, the transfected cells were cultured in a shaker at 100 rpm, 32℃, and 5%CO2.10-14 d after transfection, the cell culture was collected by centrifugation at 3000 rpm for 15 min to complete the expression of bispecific antibodies.

[0109] Example 3 Purification and characterization of bispecific antibodies

[0110] Two bispecific antibodies and the control monoclonal antibodies were subjected to purification and purity identification. The fermentation supernatant obtained in Example 2 was first subjected to affinity chromatography using a HiTrap MabSelect Sure prepacked column (Cytiva) . The column was rinsed with pure water and equilibrated with PB buffer, then the supernatant was loaded onto the chromatography column for binding. After loading, the column was rinsed with PB buffer to the baseline, and then the protein was eluted with 0.1 M citrate eluent. After neutralizing with 1 M Tris-HCl, the eluted protein was concentrated appropriately and loaded onto the Superdex200 (Cytiva) equilibrated well with PBS for further purification. The collected antibodies were concentrated to a certain concentration and then identified by SDS-PAGE electrophoresis. The expression level and SEC-HPLC identification results are shown in Table 4.

[0111] The results in Table 4 indicate that the expression levels of the bispecific antibodies VDJ013-19 and VDJ013-20 was significantly increased compared to those of the monoclonal antibodies, and the SEC-HPLC purities of both bispecific antibodies were consistent, reaching more than 90%.

[0112] Table 4. Expression level and SEC-HPLC purity identification of Antibodies

[0113] Example 4 Biological activity assay of bispecific antibodies for IL6R

[0114] The HEK293-IL6 luciferase reporter gene assay cell line was constructed by transfecting the pGL4.47 [luc2P SIE Hygro] plasmid from Promega into HEK293 cells (ATCC) . The HEK293-IL6-res reporter gene cells were digested with trypsin, mixed by gently blowing and centrifuged, and the supernatant was discarded. The cells were resuspended and counted. The cell density was adjusted to 5×105 cells / mL and added to the corresponding wells at 80μL / well. IL6 (R&D, 206-IL-010 / CF) was diluted to 50ng / mL and added to the sample wells and positive control wells at 10μL / well, while basal medium was added to the negative control wells at 10μL / well. The antibodies VDJ020-14, VDJ013-19, and VDJ013-20 were diluted to different concentration gradients with the medium. The diluted antibodies were added to the corresponding wells in the 96-well plate at 10μL / well, with duplicates for each concentration. The basal medium was added accordingly to positive and negative control groups at 10μl / well. The cell plates were incubated in a 37℃, 5%CO2 cell incubator for 22h. The next day, One Lite assay reagent that had been thawed, mixed and warmed to room temperature was then added to the above 96-well plate at 100 μL / well. The plates were mixed on a shaker for 3 min, and luminescence values were read using a multifunctional microplate reader. And the data were plotted using Prism 5 (GraphPad) software to calculate the IC50 values and relative biological activities, and the results are shown in Table 5. The results indicate that the biological activity of the bispecific antibodies VDJ013-19 and VDJ013-20 for IL6R target is comparable to that of the monoclonal antibodies.

[0115] Table 5. Biological activity assay of bispecific antibodies for IL6R target

[0116] Example 5 Biological activity assay of bispecific antibodies for IL23 target

[0117] HEK293-IL23 luciferase reporter gene cells (Genomeditech) were plated at 18000 cells per well. 0.4 μg / mL of human IL-23 stimulating factor (SinoBiological, CT012-H08H) working solution was formulated and added to positive and sample wells at 10 μL / well. The antibody samples were diluted and the antibodies with different concentration gradients were added into the positive wells containing plated cells and incubated at 37 ℃ for 22 hours. Finally, 100 μL of One-Lite reagent (Vazyme) was added to each well and incubated at room temperature for 5 minutes before reading the chemiluminescence values with a TECAN multifunctional microplate reader. And the data were plotted using Prism 5 (GraphPad) software to calculate the IC50 value, and the results are shown in Table 6. The results indicate that the biological activity of the bispecific antibody for the IL23 target is comparable to that of the monoclonal antibodies.

[0118] Table 6. Biological activity assay of bispecific antibodies for IL23 target

[0119] Example 6 Relative binding activity assay of bispecific antibodies for IL6R target

[0120] Human IL-6R gene (NP_000556.1) was cloned into pCDNA3.4 vector to construct a human IL-6R plasmid with his tag. The human IL6R (hIL6R) was obtained by transiently expressing in HEK293, and purifying by nickel column. ELISA was used to detect the binding ability of bispecific antibodies to hIL6R. The hIL6R was diluted to 1 μg / mL and added at 100 μL / well. The plates were coated at 4℃ overnight. The next day, the plate was washed and blocked with 5%skim milk for 2 hours. Then the plate was washed and the antibody samples with different concentrations were added and incubated at 37℃ for 1h. The plate was washed, 100 μL of HRP-labeled goat anti-human IgG secondary antibody (Solarbio, K0031G-HRP) was added to each plate, and the plates were incubated at 37℃ for 30 min. Then TMB substrate solution was added, and the color development was allowed to proceed at 37℃ for 10 min, and finally 50 μL of H2SO4 was added to stop the reaction. The OD450 values were read using a TECAN multifunctional microplate reader. The data were plotted using the Prism 5 (GraphPad) software to calculate EC50 values and relative binding activities, and the results are shown in Table 7. The results indicate that both the bispecific antibodies VDJ013-19 and VDJ013-20 have high binding activity to the IL6R target.

[0121] Table 7. Relative binding activity assay of bispecific antibodies for IL6R target

[0122] Example 7 Affinity assay of bispecific antibodies for IL6R target

[0123] The affinities of two bispecific antibodies and the control monoclonal antibody to the hIL6R protein respectively were assayed by Bio-Layer Interferometry (BLI) . Antibodies were all diluted to 15 μg / mL, and hIL6R protein was serially diluted from 50 nM to 3.125 nM by doubling dilution. The antibodies were loaded onto an hFc probe at a speed of 400 rpm, and then diluted different gradients of hIL6R were allowed to bind to the antibody-attached hFc probe (Gator) . The probes bound with antigen-antibody complexes were placed in analyte-free Q buffer (10nM PBS (pH7.4) +0.02%Tween+0.2%BSA) to dissociate the bound analyte. The probes were immersed in Regeneration buffer (10 nM glycine, pH 1.7) to remove any residual bound analyte, and then the probe was regenerated and stored. The affinity data were obtained by integrating the fitted curves of various concentrations using the analysis software provided with the Gator system. The results are shown in Table 8. Both bispecific antibodies, VDJ013-19 and VDJ013-20, have high affinity for IL6R.

[0124] Table 8. Affinity assay of the antibodies for IL6R

[0125] Example 8 Affinity assay of bispecific antibodies for IL23 target

[0126] The affinities of two bispecific antibodies and the control monoclonal antibody to the hIL23 protein respectively was assayed by Bio-Layer Interferometry (BLI) . Antibodies were all diluted to 15 μg / mL and hIL23 protein (SinoBiological, CT012-H08H) ) was serially diluted from 200 nM to 3.125 nM by doubling dilution. The antibodies were loaded onto an hFc probe at a speed of 400 rpm, and then diluted different gradients of hIL23 were allowed to bind to the antibody-attached hFc probe (Gator) . The probes bound with antigen-antibody complexes were placed in analyte-free Q buffer (10nM PBS (pH7.4) +0.02%Tween+0.2%BSA) to dissociate the bound analyte. The probes were immersed in Regeneration buffer (10 nM glycine, pH 1.7) to remove any residual bound analyte, and then the probe was regenerated and stored. The affinity data were obtained by integrating the fitted curves of various concentrations using the analysis software provided with the gator system. The results are shown in Table 9. The affinity was not fitted to a specific value because the samples exceeded the upper detection limit of the instrument and the dissociation constants were not measured, Preliminarily, the bispecific antibodies VDJ013-19 and VDJ013-20 both have high affinity for IL23.

[0127] Table 9. Affinity assay of the antibodies for IL23

[0128] The nucleotide sequences of VDJ013-19, VDJ013-20, VDJ013-17, and VDJ020-14 involved in the present examples are shown in Table 10 and the amino acid sequences are shown in Table 11.

[0129] Table 10. Nucleotide sequences of antibodies

[0130] Table 11. Amino acid sequences of antibodies

[0131] The technical solutions of the present disclosure are not limited to the above specific examples, and all technical deformation made according to the technical solutions of the present disclosure shall fall within the scope of protection of the present disclosure.

Claims

1.A bispecific antibody comprising: a first domain that specifically binds interleukin-6 receptor IL-6R, and a second domain that specifically binds interleukin-23.2.The bispecific antibody according to claim 1, characterized in that the first domain is an antibody or a functional fragment thereof that specifically binds IL-6R; and / orthe second domain is an antibody or a functional fragment thereof that specifically binds interleukin-23.3.The bispecific antibody according to claim 1 or 2, characterized in that the first domain comprises:(1) the following three heavy chain variable regions complement determining region HCDRs:HCDR1, having an amino acid sequence of HCDR1 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 19, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR1 contained in the heavy chain variable region;HCDR2, having an amino acid sequence of HCDR2 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 19, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR2 contained in the heavy chain variable region;HCDR3, having an amino acid sequence of HCDR3 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 19, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR3 contained in the heavy chain variable region; and / or(2) the following three light chain variable areas complement the decision area LCDR:LCDR1, having an amino acid sequence of LCDR1 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 20, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR1 contained in the light chain variable region;LCDR2, having an amino acid sequence of LCDR2 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 20, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR2 contained in the light chain variable region;LCDR3, having an amino acid sequence of LCDR3 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 20, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR3 contained in the light chain variable region;preferably, the first domain comprises:HCDR1, HCDR2 and HCDR3 contained in the heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 19, and LCDR1, LCDR2, and LCDR3 contained in the light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 20;preferably, the HCDR1-HCDR3 and / or the LCDR1-LCDR3 are defined by IMGT numbering system, Kabat numbering system, Chothia numbering system, Contact numbering system, or a combination thereof.4.The bispecific antibody according to claim 1 or 2, characterized in that the first domain comprises:(1) a heavy chain variable region and / or a light chain variable region as follows, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to IMGT numbering system: a heavy chain variable region comprising the following 3 HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 2, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 3;and / or, a light chain variable region comprising the following 3 LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 with a sequence of YTS, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 5;or(2) a heavy chain variable region and / or a light chain variable region as follows, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Kabat numbering system: a heavy chain variable region comprising the following 3 HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 6, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 7, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 8; and / or, a light chain variable region comprising the following 3 LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 9, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 10, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 5;or(3) a heavy chain variable region and / or a light chain variable region as follows, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Chothia numbering system: a heavy chain variable region comprising the following 3 HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 11, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 12, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 8; and / or, a light chain variable region containing the following 3 LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 9, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 10, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 5;or(4) a heavy chain variable region and / or a light chain variable region as follows, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Contact numbering system: a heavy chain variable region comprising the following 3 HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 13, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 14, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 15; and / or, a light chain variable region containing the following 3 LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 16, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 17, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 18.5.The bispecific antibody according to claim 1 or 2, characterized in that the first domain comprises:a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 19, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; anda light chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto;preferably, the first domain comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 19, and a light chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20.6.The bispecific antibody according to claim 1 or 2, characterized in that the second domain comprises the following three heavy chain variable region complementary determining regions HCDRs:HCDR1, having an amino acid sequence of HCDR1 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 41, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR1 contained in the heavy chain variable region;HCDR2, having an amino acid sequence of HCDR2 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 41, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR2 contained in the heavy chain variable region; andHCDR3, having an amino acid sequence of HCDR3 contained in a heavy chain variable region as shown in SEQ ID NO: 41, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of HCDR3 contained in the heavy chain variable region; and / orthe following three light chain variable region complementary determining regions LCDRs:LCDR1, having an amino acid sequence of LCDR1 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 42, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR1 contained in the light chain variable region;LCDR2, having an amino acid sequence of LCDR2 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 42, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR2 contained in the light chain variable region; andLCDR3, having an amino acid sequence of LCDR3 contained in a light chain variable region as shown in SEQ ID NO: 42, or an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared to the amino acid sequence of LCDR3 contained in the light chain variable region;preferably, the HCDR1-HCDR3 and / or the LCDR1-LCDR3 are defined by IMGT numbering system, Kabat numbering system, Chothia numbering system, Contact numbering system, or a combination thereof.7.The bispecific antibody according to claim 1 or 2, characterized in that the second domain comprises:(1) a heavy chain variable region and / or a light chain variable region as follows, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to IMGT numbering system:a heavy chain variable region comprising the following 3 HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 23, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 24, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 25; and / or, a light chain variable region comprising the following 3 LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 26, LCDR2 with a sequence of GNS, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 27;or(2) a heavy chain variable region and / or a light chain variable region as follows, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Kabat numbering system:a heavy chain variable region comprising the following 3 HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 28, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 29, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 30; and / or, a light chain variable region comprising the following 3 LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 31, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 32, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 27;or(3) a heavy chain variable region and / or a light chain variable region as follows, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Chothia numbering system:a heavy chain variable region comprising the following 3 HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 33, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 34, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 30; and / or, a light chain variable region comprising the following 3 LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 31, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 32, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 27;or(4) a heavy chain variable region and / or a light chain variable region as follows, wherein HCDR1-HCDR3 and / or LCDR1-LCDR3 are defined according to Contact numbering system:a heavy chain variable region comprising the following 3 HCDRs: HCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 35, HCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 36, and HCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 37; and / or, a light chain variable region comprising the following 3 LCDRs: LCDR1 with a sequence of SEQ ID NO: 38, LCDR2 with a sequence of SEQ ID NO: 39, and LCDR3 with a sequence of SEQ ID NO: 40.8.The bispecific antibody according to claim 1 or 2, characterized in that the second domain comprises:a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 41, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto; anda light chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 42, an amino acid sequence having a substitution, deletion, or addition of one or more amino acids compared thereto, or an amino acid sequence having at least 80%sequence identity thereto;preferably, the second domain comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 40 and a light chain variable region having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 41.9.The bispecific antibody according to claim 1 or 2, characterized in that the first domain and the second domain each independently comprise an antibody Fab fragment, Fab' fragment, F (ab') 2 fragment, Fv fragment, scFv fragment, nanobody, heavy chain variable region VH fragment or light chain variable region VL fragment;preferably, the first domain comprises a Fab fragment, the second domain comprises a scFv fragment, and the second domain is linked to a VH fragment of the first domain;preferably, the first domain comprises an scFv fragment, the second domain comprises a Fab fragment, and the first domain is linked to a VH fragment of the second domain;preferably, the bispecific antibody further comprises an antibody Fc fragment,preferably, the Fc fragment of an antibody is linked to the N-terminus and / or C-terminus of the first domain or second domain, either directly or via a linker,preferably, the Fc fragment of the antibody is derived from IgG, IgA, IgM, IgD or IgE, more preferably from IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4,preferably, the first domain and the second domain are connected either directly or via a linker,preferably, the linker has an amino acid sequence as shown in the general formula (GnS) m, n and m are integers from 1 to 10, respectively; more preferably, n is an integer from 1 to 4, and m is an integer from 1 to 3, or an amino acid sequence having an insertion, substitution or deletion of 1, 2 or 3 amino acids as compared to the amino acid sequence shown in the general formula (GnS) m.10.An isolated nucleic acid molecule encoding a bispecific antibody according to any one of claims 1-9.11.An expression vector comprising an isolated nucleic acid according to claim 10.12.A host cell comprising an isolated nucleic acid molecule according to claim 10 or an expression vector according to claim 11.13.A chimeric antigen receptor comprising an extracellular antigen-binding fragment, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain, wherein the extracellular antigen-binding fragment comprises a bispecific antibody according to any one of claims 1-9.14.A conjugate comprising: a bispecific antibody according to any one of claims 1-9; and a conjugated moiety;preferably, the conjugated moiety is selected from the group consisting of a detectable label, a radioisotope, a fluorescent substance, a luminescent substance, a colored substance, an enzyme, polyethylene glycol (PEG) , a nuclide, a nucleic acid, a small-molecule toxin, a peptide with binding activity, a protein, a receptor, a ligand, and other active substances that inhibit growth of tumor cells, and promote apoptosis or necrosis of tumor cells.15.A pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody according to any one of claims 1-9, an isolated nucleic acid molecule according to claim 10, or an expression vector according to claim 11, and a pharmaceutically acceptable carrier;preferably, the pharmaceutical composition is a form selected from the group consisting of a tablet, a pulvis, a granule, a pill, an injection, a suspension, a powder, an emulsion, an aerosol, a gel, an eye drop, a sustained-release agent, and a sustained-release implant.16.A pharmaceutical cartridge comprising a pharmaceutical composition according to claim 15, the pharmaceutical composition being encapsulated in a container.preferably, the container is selected from the group consisting of a glass ampoule, a glass vial, a plastic ampoule, a plastic vial, a plastic bag, and a prefilled syringe.17.A kit comprising a bispecific antibody according to any one of claims 1-9, and optionally, an instruction for use.18.Use of a bispecific antibody according to any one of claims 1-9, an isolated nucleic acid molecule according to claim 10, an expression vector according to claim 11, a chimeric antigen receptor according to claim 13, a conjugate according to claim 14, or a pharmaceutical composition according to claim 15 in the preparation of a medicament for preventing and / or treating IL-6R and / or IL-23 related disease.19.A method for treating or preventing IL-6R and / or IL-23 related disease comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of a bispecific antibody according to any one of claims 1-9, an isolated nucleic acid molecule according to claim 10, an expression vector according to claim 11, a chimeric antigen receptor according to claim 13, a conjugate according to claim 14, or a pharmaceutical composition according to claim 15.20.The method according to claim 19, characterized in that the disease comprises one or more of an inflammatory disease, an immune system disease and a cancer-related disease,preferably, the disease includes one or more of allergy / asthma, arthritis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, systemic juvenile idiopathic arthritis, osteoarthritis, psoriasis arthropica, ankylosing spondylitis, psoriasis, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, Crohn's disease, Lyme arthritis, graft-versus-host disease, meningoencephalitis, immune-mediated inflammatory diseases of the central and peripheral nervous system, pancreatitis, graft-versus-host disease, arteritis, cardiovascular inflammation, neuromyelitis optica, Castleman's disease, giant cell arteritis, atherosclerosis, eosinophilic esophagitis, atopic dermatitis, primary sclerosing cholangitis, vasculitis, autoimmune thyroiditis, eczema, scleroderma, infection-associated endotoxic shock, aortitis graft rejection, cardiac disease, bone resorption, Paget's disease, osteoporosis, primary biliary cirrhosis, atherosclerosis, septicemia, periodontitis, hypochlorhydia, cytokine release syndrome, systemic lupus erythematosus, immune-related adverse events, thyroid eye disease, chronic kidney disease, Sjogren's syndrome, multiple sclerosis, systemic sclerosis-associated interstitial lung disease, polymyalgia rheumatica, myocardial infarction, uveitis, encephalomyelitis, myasthenia gravis, familial Mediterranean fever, Schnitzler syndrome, graft-versus-host disease, hematopoietic stem cell transplantation, kidney transplantation, heart transplantation, Behcet syndrome, esophageal adenocarcinoma, hepatocellular carcinoma, pancreatic carcinoma, non-small cell lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, uroepithelial carcinoma, prostate cancer, rectal cancer, colon cancer, bladder cancer, solid tumor, hematopoietic and lymphocytic tumors, malignant solid tumors, adamantinomatous craniopharyngiomas, melanoma, recurrent glioblastoma, leukemias and lymphomas, amyotrophic lateral sclerosis, ALS, schizophrenia, major depressive disorder, diabetes mellitus, osteodystrophia fibrosa, obesity, hemophagocytic lymphohistiocytic hyperplasia, idiopathic retroperitoneal fibrosis, alopecia areata, pulmonary fibrosis, cystic fibrosis, gastrointestinal disorders associated with cystic fibrosis, irritable bowel syndrome, pelvic inflammatory disorders, Alzheimer's disease, Castleman's disease, dermatomyositis, Peyronie's disease, celiac disease, gallbladder disorders, pilonidal disease, peritonitis, surgical adhesions, surgical trauma, stroke, and Sjogren's syndrome, wherein the solid tumor is preferably renal cell carcinoma.

Images