Circular RNA encoding a CD19-specific chimeric antigen receptor

Abstract

Provided are an engineered circular RNA molecule encoding a CD19-specific chimeric antigen receptor, a composition comprising the same, and use thereof are provided. Also provided herein are a vector suitable for preparing the engineered circular RNA molecule and a corresponding preparation method thereof.

Description

Circular RNA Encoding a CD19-specific Chimeric Antigen ReceptorTechnical field

[0001] The present invention relates to an engineered circular RNA molecule encoding a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) , a composition comprising the same, and use thereof. The present invention also relates to the vector as well as the method used for preparing the same.Background

[0002] Circular RNA is a common type of RNA in eukaryotes. Naturally occurring circular RNAs are primarily produced by a molecular mechanism within cells called "back-splicing" . Eukaryotic circular RNAs have been found to have a variety of molecular and cellular regulatory functions. For example, circular RNAs can regulate the expression of target genes by binding to microRNAs. Circular RNAs can also regulate gene expression by directly binding to target proteins.

[0003] Due to its circular nature, circular RNA has a longer half-life than linear mRNA, so it is speculated that circular RNA synthesized in vitro may have higher stability. Methods of forming circular RNAs in vitro include the chemical method, the enzymatic catalysis method, and the ribozyme catalysis method. Chemical methods are expensive and the size of the circular RNA molecules that can be produced is limited. The enzymatic method mainly utilizes T4 RNA ligase to catalyze the circularization of linear RNA, and the size of RNA payload that can achieve circularization is also limited. Ribozyme catalysis (e.g., based on Group I introns) is a promising method for the preparation of circular RNAs.

[0004] CAR T-cell therapy, or Chimeric Antigen Receptor T-cell therapy, is an innovative and personalized form of immunotherapy designed primarily to treat certain types of blood cancers like leukemia, lymphoma, and multiple myeloma. It has yielded remarkable clinical responses in patients with B-cell leukemia or lymphoma. Unfortunately, many challenges remain to be addressed to overcome its ineffectiveness in the treatment of other hematological and solid tumor malignancies. The major hurdles of CAR T-cell therapy are the associated severe life-threatening toxicities such as cytokine release syndrome and limited anti-tumor efficacy.Summary of the invention

[0005] In one aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA encoding a CD19-specific chimeric antigen receptor.

[0006] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a composition comprising a circular RNA encoding a CD19-specific chimeric antigen receptor. In embodiments, the composition comprising a circular RNA encoding a CD19-specific chimeric antigen receptor is a pharmaceutical composition. In embodiments, the pharmaceutical composition is used for the treatment of autoimmune diseases or conditions.

[0007] In one aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising:

[0008] a) a Group I / II intron,

[0009] b) a 3’ exon,

[0010] c) a sequence of interest encoding a CD19-specific CAR, and

[0011] d) a 5’ exon.

[0012] In embodiments of the above aspect, the circular RNA precursor further comprises linkers.

[0013] In one aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0014] a) a Group I / II intron,

[0015] b) a 3’ exon,

[0016] c) a sequence of interest encoding a CD19-specific CAR, and

[0017] d) 5’ exon.

[0018] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0019] a) a Group I / II intron,

[0020] b) a 3’ exon,

[0021] c) a linker A,

[0022] d) a sequence of interest encoding a CD19-specific CAR,

[0023] e) a linker B, and

[0024] f) a 5’ exon.

[0025] In yet another aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0026] a) a linker I,

[0027] b) a Group I / II intron,

[0028] c) a 3’ exon,

[0029] d) a sequence of interest encoding a CD19-specific CAR,

[0030] e) a 5’ exon, and

[0031] f) a linker II.

[0032] In yet another aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0033] a) a linker I,

[0034] b) a Group I / II intron,

[0035] c) a 3’ exon,

[0036] d) a linker A,

[0037] e) a sequence of interest encoding a CD19-specific CAR,

[0038] f) a linker B,

[0039] g) a 5’ exon, and

[0040] h) a linker II.

[0041] In one aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0042] a) a Group I / II intron, and

[0043] b) a sequence of interest encoding a CD19-specific CAR, comprising a 3’ exon at its 5’ end and a 5’ exon at its 3’ end.

[0044] In one aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0045] a) a linker I,

[0046] b) a Group I / II intron,

[0047] c) a sequence of interest encoding a CD19-specific CAR, comprising a 3’ exon at its 5’ end and a 5’ exon at its 3’ end, and

[0048] d) a linker II.

[0049] In one aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0050] a) a linker I,

[0051] b) a Group I / II intron,

[0052] c) a sequence of interest, comprising: (i) an IRES fragment I comprising a 3’ exon at its 5’ end, (ii) an ORF sequence encoding a CD19-specific CAR, and (iii) an IRES fragment II comprising a 5’ exon at its 3’ end, and

[0053] d) a linker II,

[0054] wherein the IRES fragment I and IRES fragment II together form a complete functional IRES.

[0055] In one aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0056] a) a linker I,

[0057] b) a Group I / II intron,

[0058] c) a sequence of interest, comprising: (i) an ORF sequence fragment I comprising a 3’ exon at its 5’ end, (ii) an IRES sequence, and (iii) an ORF sequence fragment II comprising a 5’ exon at its 3’ end, and

[0059] d) a linker II,

[0060] wherein the ORF sequence fragment I and ORF sequence fragment II together form a complete ORF sequence encoding a CD19-specific CAR.

[0061] In aspects and embodiments of the present invention, the Group I / II intron is a Group I self-splicing intron, which can be selected from the following group: cyanobacterium Anabaena Group I Intron, Azoarcus Group I Intron (Azo) , Scytalidium dimidiatum Group I Intron (Sd) , Staphylococcus phage Twort Group I Intron (Twort) , Scytonema-hofmani tRNA fMet group I intron (Sh) , or Agrobacterium-tumefaciens group I intron (At) .

[0062] In aspects and embodiments of the present invention, exon refers to a sequence comprising partial ribozyme recognition sequence which forms the complete ribozyme recognition sequence with the intron, thus facilitating the circularization process. The exon herein can be a natural or artificially modified sequence. As used herein, the ribozyme recognition sequence refers to the specific sequence that the ribozyme recognizes in order to achieve self-cleavage / splicing, or the specific structure formed by this sequence.

[0063] In aspects of the present invention, the linker I sequence and the linker II sequence are functional sequences which can improve circularization. For example, linker I and linker II are homology arm sequences capable of complementary pairing to each other to form a homology arm double-stranded region.

[0064] In some embodiments, linker I is upstream of the self-splicing intron and linker II is downstream of the 5’ exon.

[0065] In some embodiments, linker I or linker II is about 5-200 nucleotides in length, about 5-150 nucleotides in length, about 5-100 nucleotides in length, about 5-80 nucleotides in length, about 5-50 nucleotides in length, about 5-40 nucleotides in length, about 5-30 nucleotides in length, about 5-20 nucleotides in length, about 5-10 nucleotides in length, preferably, about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 or 40 nucleotides in length.

[0066] In aspects of the present invention, linker A and linker B comprise homology arms and / or spacers. In embodiments, linker A and linker B are homology arm sequences capable of complementary pairing to each other to form a homology arm double-stranded region. In embodiments, linker A and linker B are spacers. In embodiments, linker A and linker B both comprise a homology arm sequence and a spacer. As used herein, a “spacer” refers to any contiguous nucleotide sequence that is predicted to avoid interfering with proximal structures, for example, from the IRES, the sequence of interest, or intron.

[0067] As used herein, the term "self-splicing intron" refers to an intron having self-splicing ribozyme activity and capable of excising itself and joining two flanking exons. In some embodiments, the splicing is autocatalytic splicing.

[0068] In another aspect, it is an object of the present invention to provide an CD19 binding protein comprising a variable domain of heavy chain of heavy chain-only antibody (VHH) capable of specifically binding to CD19, wherein the VHH comprises CDR1, CDR2, and CDR3 contained in any one of SEQ ID NOs. 17-24. The CDR can be one of Kabat CDR, AbM CDR, Chothia CDR, or IMGT CDR.

[0069] In some embodiments of the CD19 binding protein of the present invention, the VHH comprises CDR1, CDR2, and CDR3 selected from the group consisting of (i) CDR1 having an amino acid sequence of GNIESRNC, CDR2 having an amino acid sequence of IGQVTGRS, and CDR3 having an amino acid sequence of AAAPGCLLSALRSADYRN; and (ii) CDR1 having an amino acid sequence of GDTLSNKW, CDR2 having an amino acid sequence of IRTDYAGT, and CDR3 having an amino acid sequence of AASYSGATTFRY.

[0070] In some embodiments of the CD19 binding protein of the present invention, the VHH comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs. 17-24 or an amino acid sequence which is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identical to any one of SEQ ID NOs. 17-24.

[0071] In some embodiments of the CD19 binding protein of the present invention, the CD19 binding protein further comprises an immunoglobulin Fc region, preferably the Fc region of human immunoglobulin. In preferred embodiments, the CD19 binding protein of the present invention is a monoclonal antibody. In more preferred embodiments, the CD19 binding protein of the present invention is a humanized antibody.

[0072] The CD19 binding protein of the present invention is capable of specifically binding to a cell surface CD19, such as CD19 expressed on B cell surface. In preferred embodiments, the B cell is a malignant B cell.

[0073] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition comprising the CD19 binding protein of the invention and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0074] The present invention also relates to use of the CD19 binding protein or the pharmaceutical composition of the invention in the manufacture of a medicament for preventing or treating a disease or condition in a subject, such as an autoimmune disease or a malignant B cell disease, such as an acute or chronic B cell leukemia or a B cell lymphoma.Brief description of the drawings

[0075] Figure 1 shows the design of the circular RNA precursor / circular RNA of the present invention.

[0076] Figure 2 shows the circCAR evaluation procedure.

[0077] Figure 3 shows the purity of isolated T cells, analyzed with FACS.

[0078] Figure 4 shows CAR+%cells in T cells transfected by 500ng circCAR RNA, analyzed with FACS.

[0079] Figure 5 shows the CAR+ T cell percentage in circCAR RNA transfected cells.

[0080] Figure 6 shows the CAR-T mediated Raji tumor cell killing.

[0081] Figure 7 shows the design and generation of circular RNA encoding anti-CD19 CAR.

[0082] Figure 8 shows PAGE gel electrophoresis or CGE analysis to confirm the purity of generated circRNA.

[0083] Figure 9 shows the CD-19 CAR expression level on circRNA transfected cells.

[0084] Figure 10 shows the target cell killing efficiency of CAR-T cells.

[0085] Figure 11 shows CD-19 CAR expression level on circRNA transfected cells and target cell killing efficiency of CAR-T cells.

[0086] Figure 12 Anti-tumor effects of circRNAs (RX1421, RX1660 and RX1697) in mice.

[0087] Figure 13. Dose-dependent anti-tumor effect of RX1697 in mice.Detailed description of the invention

[0088] In the present invention, unless indicated otherwise, the scientific and technological terminologies used herein refer to meanings commonly understood by a person skilled in the art. Also, the terminologies and experimental procedures used herein relating to protein and nucleotide chemistry, molecular biology, cell and tissue cultivation, microbiology, immunology, all belong to terminologies and conventional methods generally used in the art. For example, the standard DNA recombination and molecular cloning technology used herein are well known to a person skilled in the art, and are described in details in the following references: Sambrook, J., Fritsch, Efland Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989. In the meantime, in order to better understand the present invention, definitions and explanations for the relevant terminologies are provided below.

[0089] As used herein, the singular forms "a, " "an, " and "the" include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. It is further noted that the claims may be drafted to exclude any optional element. For example, a circular RNA precursor refers to one or more circular RNA precursors. As such, the terms "a" , "an" , "one or more" and "at last one" can be used interchangeably. For example, the term “at least one” refers to one, two or more. This statement is intended to serve as antecedent basis for use of such exclusive terminology as "solely, " "only" and the like in connection with the recitation of claim elements, or use of a "negative" limitation. Similarly, the terms "comprising" , "including" and "having" can be used interchangeably.

[0090] As used herein, the term "and / or" encompasses all combinations of items connected by the term, and each combination should be regarded as individually listed herein. For example, "Aand / or B" covers "A" , "A and B" , and "B" . For example, "A, B, and / or C" covers "A" , "B" , "C" , "A and B" , "A and C" , "B and C" , and "A and B and C" .

[0091] As used herein, "about, " "approximately, " "substantially, " and "significantly" will be understood by persons of ordinary skill in the art and will vary to some extent on the context in which they are used. If there are uses of these terms which are not clear to persons of ordinary skill in the art given the context in which they are used, "about" and "approximately" will mean plus or minus <10%of the particular term and "substantially" and "significantly" will mean plus or minus >10%of the particular term.

[0092] In the present application, "optional" or "optionally" means that the subsequently described event or circumstance may or may not occur, and that the description includes instances where said event or circumstance occurs and instances in which it does not.

[0093] "Polynucleotide" , "nucleic acid sequence" , "nucleotide sequence" , or "nucleic acid fragment" are used interchangeably to refer to a polymer of RNA or DNA that is single-or double-stranded, optionally containing synthetic, non-natural or altered nucleotide bases. Nucleotides (usually found in their 5'-monophosphate form) are referred to by their single letter designation as follows: "A" for adenylate or deoxyadenylate (for RNA or DNA, respectively) , "C" for cytidylate or deoxycytidylate, "G" for guanylate or deoxyguanylate, "U" for uridylate, "T" for deoxythymidylate, "R" for purines (A or G) , "Y" for pyrimidines (C or T) , "K" for G or T, "H" for A or C or T, "I" for inosine, and "N" for any nucleotide. Although the nucleotide sequences herein may be represented as DNA sequences (comprising T (s) ) , when referring to RNA, one skilled in the art can readily determine the corresponding RNA sequence (i.e., replacing T with U) .

[0094] For example, the nucleotide sequence of interest in the present invention can be a non-coding sequence, such as an antisense RNA, aptamer, guide RNA, or non-coding RNA existing in any organism.

[0095] Sequence "identity" has recognized meaning in the art, and the percentage of sequence identity between two nucleic acids or polypeptide molecules or regions can be calculated using the disclosed techniques. Sequence identity can be measured along the entire length of a polynucleotide or polypeptide or along a region of the molecule. (See, for example, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991) . There are many methods for determining sequence identity. An example of algorithms suitable for determining percent sequence identity is the algorithm used in the Basic Local Alignment Search Tool (hereinafter "BLAST" ) , see e.g., Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990 and Altschul et al, Nucleic Acids Res., 15: 3389-3402, 1997. Software for performing BLAST analysis is publicly available through the National Center for Biotechnology Information (hereafter "NCBI" ) . Default parameters used to determine sequence identity using software available from NCBI (such as BLASTN for nucleic acid sequences) are described in McGinnis et al. Nucleic Acids Res., 32: W20-W25, 2004.

[0096] A polynucleotide sequence (e.g., an RNA polynucleotide sequence or its fragments) "derived from" a designated polynucleotide sequence means the former polynucleotide sequence is originated from the latter. In some embodiments, the polynucleotide sequence which is derived from a particular polynucleotide sequence has a polynucleotide sequence that is identical, essentially identical or homologous to that particular sequence or a fragment thereof. Polynucleotide sequences derived from a particular polynucleotide sequence may be variants of that particular sequence or a fragment thereof. For example, it will be understood by one of ordinary skill in the art that the circular RNA molecules suitable for use herein may be altered such that they vary in sequence from the sequences from which they were derived, while retaining the desirable activity thereof. "Circular RNA precursor" herein refers to a linear RNA molecule capable of forming a covalently linked closed circular RNA molecule, e.g., by self-splicing. The circular RNA precursor may be produced by transcription from a nucleic acid vector comprising a coding sequence of the circular RNA precursor. Alternatively, the circular RNA precursor may also be obtained by chemical synthesis. As used herein, the terms “precursor RNA” “circular RNA precursor” and “linear RNA molecule for producing a circular RNA” have the same meaning and refer to the same thing, i.e., a linear RNA molecule capable of forming a covalently linked closed circular RNA molecule, e.g., by self-splicing under the action of the self-splicing intron, and thus they can be interchangeably used in the context of all aspects of the present invention described herein.

[0097] In some embodiments, the circular RNA precursor is capable of forming a covalently linked closed circular RNA molecule by self-splicing under the action of the self-splicing intron fragments and the residual circularizing elements. As used herein, the term “residual circularizing elements” refer to exon I (i.e., 3’ exon) and exon II (i.e., 5’ exon) in the circular RNA precursor of the present invention which are elements necessary to effect self-splicing and circularization of the precursor and are retained in the circular RNA molecule thus generated.

[0098] As used herein, the term "self-splicing intron" refers to an intron having self-splicing ribozyme activity and capable of excising itself and joining two flanking exons. In some embodiments, the splicing is autocatalytic splicing.

[0099] "Self-splicing introns" include, but are not limited to, Group I introns and Group II introns. Group I introns contain 14 subgroups, while most of the Group I introns belong to the IC3 subgroup. For example, the Group I intron may be a Group I intron of the cyanobacterium Anabaena belonging to the IC3 subgroup or a Group I intron from a T4 phage Group I intron belonging to the IA2 subgroup or a Group I intron from Azoarcus sp. BH72 belonging to the IC3 subgroup. Additional examples of self-splicing introns useful in the present invention include, but are not limited to, self-splicing introns derived from the following organisms: Enterobacteriophage T4, Bacteriophage Twort, Bacteriophage SPO1, Bacteriophage S3b, Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, Tetrahymena thermophila , Dunaliella parva, Pneumocystis carinii, Physarum polycephalum, Anabaena sp. PCC7120, Scytonema hofmanni, Agrobacterium tumefaciens, Synechocystis PCC 6803, Synechococcus elongatus PCC 6301, Neurospora crassa, Candida albicans, Scytalidium cerradiumydiaces, Pediadiaces Chlamydomonas nivalis, Chlorella vulgaris, Amoebidium parasiticum, Neurospora crassa, Emericella nidulans, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neochloris aquatica, Dunaliella parva, Symkania negevensis, Emericella nidulans. See e.g., Vicens, Q., et al., (2008) . Toward predicting self-splicing and protein-facilitated splicing of group I introns. RNA 14: 2013-2029; Tanner, A. M., et al., (1996) . Activity and thermostability of the small self-splicing group I intron in the pre-tRNAIIe of the purple bacterium Azoarcus. RNA 2: 74-83.

[0100] In some embodiments, the self-splicing intron is selected from the following group: cyanobacterium Anabaena Group I Intron such as AnaX, Azoarcus Group I Intron (Azo) , Scytalidium dimidiatum Group I Intron (Sd) , Staphylococcus phage Twort Group I Intron (Twort) , Scytonema-hofmani tRNA fMet Group I Intron (Sh) , or Agrobacterium-tumefaciens Group I Intron (At) . In some embodiments, the self-splicing intron has a sequence with 85%or more sequence identity to the above-mentioned self-splicing intron. In some embodiments, the self-splicing intron is a fragment of the above-mentioned self-splicing intron.

[0101] As used herein, “ORF sequence” refers to a sequence comprising a protein coding sequence or non-coding sequence.

[0102] “Circularization efficiency” as used herein may refer to the ratio of outcome circular RNA to input precursor in a given time period. Alternatively, “Circularization efficiency” as used herein may refer to the ratio of desired circular RNA to linear circRNA precursor or the ratio of circRNA to the sum of circRNA and linear circRNA precursor in the final product in a given time period. The circularizing efficiency can be determined by methods well known in the art, such as those described in Example 2, 4, 6 and 8 of the present application. It is expected that the circular RNA precursors of the present invention will have desired circularization efficiency.

[0103] “Reduced immunogenicity” as used herein may refer to that the circular RNA, upon contacted with cells, elicits a reduced immune response, i.e., an immune response at a level lower than a control circular RNA or control linear RNA. For example, reduced immune response refers to reduced expression of cytokines. The cytokines include, but are not limited to, IFNβ, TNFα, IL6 and / or RIG-I. In some embodiments, the immunogenicity of the circular RNA is reduced by at least about 10%, at least about 20%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%or more. It is expected that the circular RNA precursors of the present invention will have reduced immunogenicity.

[0104] As used herein, "spacer" refers to any contiguous nucleotide sequence that at least does not negatively interfere with the function of the elements connected by it. Generally, if it is desired to avoid the interaction of two near or adjacent elements, a spacer can be inserted between the two elements. The spacer sequences described herein can serve two functions: (1) to facilitate circularization and (2) to facilitate functionality by allowing correct folding of the residual circularizing element and the nucleotide sequence of interest (e.g., IRES) . In some embodiments, the spacer is no more than 150, no more than 100, no more than 50, no more than 30, no more than 10, no more than 5, or no more than 3 nucleotides in length. In some embodiments, the spacer is 5 nucleotides in length. In some embodiments, the spacer is 4 nucleotides in length. In some embodiments, the spacer is 3 nucleotides in length. In some embodiments, the first spacer may be absent. In some embodiments, the second spacer may be absent. In some embodiments, the first spacer and the second spacer may be absent.

[0105] As used herein, “CD19-specific Chimeric Antigen Receptor” or “CD19-specific CAR” may comprise an anti-CD19 antigen binding domain, a CD8α hinge domain, a CD8α transmembrane domain, a 4-1BB costimulatory domain, and a CD3ζ intracellular signaling domain. In embodiments, the CD19-specific CAR of the present invention comprises the following: a signal peptide, an anti-CD19 antigen binding domain, a CD8α hinge domain, a CD8α transmembrane domain, a CD28 costimulatory domain, and a CD3ζ intracellular signaling domain. In embodiments, the CD19-specific CAR of the present invention comprises the following: a signal peptide, an anti-CD19 antigen binding domain, a CD28 hinge domain, a CD28 transmembrane domain, a CD28 costimulatory domain, and a CD3ζ intracellular signaling domain. In embodiments, the CD19-specific CAR of the present invention comprises the following: a signal peptide, an anti-CD19 antigen binding domain, a CD8α hinge domain, a modified CD8αtransmembrane domain, a 4-1BB costimulatory domain, and a CD3ζ intracellular signaling domain. In embodiments, the CD19-specific CAR of the present invention comprises the following: a signal peptide, an anti-CD19 antigen binding domain, a CD28 hinge domain, a CD28 transmembrane domain, a 4-1BB costimulatory domain, and a CD3ζ intracellular signaling domain. In embodiments, the CD19-specific CAR of the present invention comprises the following: a signal peptide, an anti-CD19 antigen binding domain, a CD28 hinge domain, a CD28 transmembrane domain, a CD28 and 4-1BB costimulatory domain, and a CD3ζ intracellular signaling domain.

[0106] In embodiments, the CD19-specific CAR comprises an anti-CD19 antigen binding domain (ABD) comprising one of the following amino acid sequences #1 to #6:

[0107] Sequence #1 (SEQ ID NO: 11)

[0108] Sequence #2 (SEQ ID NO: 12)

[0109] Sequence #3 (SEQ ID NO: 13)

[0110] Sequence #4 (SEQ ID NO: 14)

[0111] Sequence #5 (SEQ ID NO: 15)

[0112] Sequence #6 (SEQ ID NO: 16)

[0113] In one aspect, it is an object of the present invention to provide a CD19 binding protein. “CD19 binding protein” , “CD19 binding domain” , “anti-CD19 antigen binding domain (ABD) ” , “antigen binding domain (ABD) ” , and “antigen binding protein (ABP) ” are interchangeably used herein and refer to an immunoglobulin or an antibody or a fragment thereof such as a scfv capable of specifically binding to the CD19 antigen. As used herein, “CD19 binding protein” , “CD19 binding domain” , “anti-CD19 antigen binding domain (ABD) ” , “antigen binding domain (ABD) ” , and “antigen binding protein (ABP) ” can also be interchangeably used to refer to the antigen binding portion of a CD19-specific chimeric antigen receptor of the present invention, such as a scfv capable of specifically binding to the CD19 antigen.

[0114] In one embodiment, the present invention provides a CD19 binding protein comprising a variable light chain (VL) and a variable heave chain (VH) of an antibody capable of specifically binding to CD19, wherein the VL and VH comprise CDR1, CDR2, and CDR3 as set forth in the following Table 1:

[0115] Table 1

[0116] In a specific embodiment, the CD19 binding protein comprises a variable light chain (VL) and a variable heave chain (VH) as set forth in the following Table 2:

[0117] Table 2

[0118] In a specific embodiment, the CD19 binding protein is a scFv comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 (RX1421) .

[0119] In one embodiment, the present invention provides a CD19 binding protein comprising a variable light chain (VL) and a variable heave chain (VH) of an antibody capable of specifically binding to CD19, wherein the VL and VH comprise CDR1, CDR2, and CDR3 as set forth in the following Table 3:

[0120] Table 3

[0121] In a specific embodiment, the CD19 binding protein comprises a variable light chain (VL) and a variable heave chain (VH) as set forth in the following Table 4:

[0122] Table 4

[0123] In a specific embodiment, the CD19 binding protein is a scFv comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 (RX1645) .

[0124] In another embodiment, the present invention provides a CD19 binding protein comprising a variable light chain (VL) and a variable heave chain (VH) of an antibody capable of specifically binding to CD19, wherein the VL and VH comprise CDR1, CDR2, and CDR3 selected from the following Table 5:

[0125] Table 5

[0126] In a specific embodiment, the CD19 binding protein comprises a variable light chain (VL) and a variable heave chain (VH) as set forth in the following Table 6:

[0127] Table 6

[0128] In a specific embodiment, the CD19 binding protein is a scFv comprising an amino acid sequence selected from the following Table 7:

[0129] Table 7

[0130] In one aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA encoding a CD19-specific chimeric antigen receptor as described in the present invention.

[0131] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a composition comprising a circular RNA encoding a CD19-specific chimeric antigen receptor. In embodiments, the composition comprising a circular RNA encoding a CD19-specific chimeric antigen receptor is a pharmaceutical composition. In embodiments, the pharmaceutical composition is used for the treatment of autoimmune diseases or conditions.

[0132] In one aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising:

[0133] a) a Group I / II intron,

[0134] b) a 3’ exon,

[0135] c) a sequence of interest encoding a CD19-specific CAR, and

[0136] d) a 5’ exon.

[0137] In embodiments of the above aspect, the circular RNA precursor further comprises linkers.

[0138] In one aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0139] a) a Group I / II intron,

[0140] b) a 3’ exon,

[0141] c) a sequence of interest encoding a CD19-specific CAR, and

[0142] d) 5’ exon.

[0143] In another aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0144] a) a Group I / II intron,

[0145] b) a 3’ exon,

[0146] c) a linker A,

[0147] d) a sequence of interest encoding a CD19-specific CAR,

[0148] e) a linker B, and

[0149] f) a 5’ exon.

[0150] In yet another aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0151] a) a linker I,

[0152] b) a Group I / II intron,

[0153] c) a 3’ exon,

[0154] d) a sequence of interest encoding a CD19-specific CAR,

[0155] e) a 5’ exon, and

[0156] f) a linker II.

[0157] In yet another aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0158] a) a linker I,

[0159] b) a Group I / II intron,

[0160] c) a 3’ exon,

[0161] d) a linker A,

[0162] e) a sequence of interest encoding a CD19-specific CAR,

[0163] f) a linker B,

[0164] g) a 5’ exon, and

[0165] h) a linker II.

[0166] In one aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0167] a) a Group I / II intron, and

[0168] b) a sequence of interest, comprising a 3’ exon at its 5’ end and a 5’ exon at its 3’ end, wherein said sequence of interest encodes a CD19-specific CAR.

[0169] In one aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0170] a) a linker I,

[0171] b) a Group I / II intron,

[0172] c) a sequence of interest, comprising a 3’ exon at its 5’ end and a 5’ exon at its 3’ end, and

[0173] d) a linker II,

[0174] wherein said sequence of interest encodes a CD19-specific CAR.

[0175] In one aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0176] a) a linker I,

[0177] b) a Group I / II intron,

[0178] c) a sequence of interest, comprising: (i) an IRES fragment I which comprises a 3’ exon at its 5’ end, (ii) a ORF sequence, encoding a CD19-specific CAR and (iii) an IRES fragment II comprising a 5’ exon at its 3’ end, and

[0179] d) a linker II,

[0180] wherein the IRES fragment I and IRES fragment II together form a complete functional IRES.

[0181] In one aspect, it is an object of the present invention to provide a circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0182] a) a linker I,

[0183] b) a Group I / II intron,

[0184] c) a sequence of interest, comprising: (i) an ORF sequence fragment I which comprises a 3’ exon at its 5’ end, (ii) an IRES sequence, and (iii) an ORF sequence fragment II comprising a 5’ exon at its 3’ end, and

[0185] d) a linker II,

[0186] wherein the ORF sequence fragment I and ORF sequence fragment II together form a complete ORF sequence encoding a CD19-specific CAR.

[0187] In aspects and embodiments of the present invention, the Group I / II intron is a Group I self-splicing intron, which can be selected from the following group: cyanobacterium Anabaena Group I Intron, Azoarcus Group I Intron (Azo) , Scytalidium dimidiatum Group I Intron (Sd) , Staphylococcus phage Twort Group I Intron (Twort) , Scytonema-hofmani tRNA fMet group I intron (Sh) , or Agrobacterium-tumefaciens group I intron (At) .

[0188] In aspects and embodiments of the present invention, exon refers to a sequence comprising partial ribozyme recognition sequence and formed the complete ribozyme recognition sequence with the 5’-end of intron facilitates the circularization process. The 5'-exon and the 5' end of the intron form a P1 structure containing a ribozyme recognition sequence I. The 3'-exon and both the 5' and 3' ends of the intron form a P10 structure containing a ribozyme recognition sequence II. The exon herein can be a natural or artificially modified sequence. As used herein, the ribozyme recognition sequence refers to the specific sequence that the ribozyme recognizes in order to achieve self-cleavage / splicing, or the specific structure formed by this sequence.

[0189] In aspects and embodiments of the present invention, a sequence of interest comprises a translation initiation element (TIE) and an ORF sequence encoding a CD19-specific CAR. In embodiments of the present invention, the TIE is an IRES (internal ribozyme entry site) .

[0190] As used herein, the term “ORF” comprises a protein coding sequence or non-coding sequence. In embodiments, the TIE is an IRES. In embodiments of the present inventions, the ORF encodes a CD19-specific chimeric antigen receptor.

[0191] In aspects of the present invention, the linker I sequence, and the linker II sequence are functional sequences which can improve circularization. For example, linker I and linker are homology arm sequences capable of complementary pairing to each other to form a homology arm double-stranded region.

[0192] In some embodiments, linker I is upstream of the self-splicing intron and linker II is downstream of the 5’ exon.

[0193] In some embodiments, linker I or linker II is about 5-200 nucleotides in length, about 5-150 nucleotides in length, about 5-100 nucleotides in length, about 5-80 nucleotides in length, about 5-50 nucleotides in length, about 5-40 nucleotides in length, about 5-30 nucleotides in length, about 5-20 nucleotides in length, about 5-10 nucleotides in length, preferably, about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 or 40 nucleotides in length.

[0194] In aspects of the present invention, linker A and linker B comprise homology arms and / or spacers. In embodiments, linker A and linker B are homology arm sequences capable of complementary pairing to each other to form a homology arm double-stranded region. In embodiments, linker A and linker B are spacers. In embodiments, linker A and linker B both comprise a homology arm sequence and a spacer.

[0195] CD19 binding protein

[0196] 1.scFv

[0197] In one aspect, the present invention provides a CD19 binding protein capable of specifically binding to CD19, wherein the CD19 binding protein comprises a light chain variable (VL) region and a heavy chain variable (VH) region, wherein the VL region comprises VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 and the VH region comprises VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3, wherein the VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 are selected from any one of the following groups,

[0198] (1) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 109, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 110; (corresponding to the CDRs of antibody hV2)

[0199] (2) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 123, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 124; (corresponding to the CDRs of antibody hu-KA-7082)

[0200] (3) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 253, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 254; (corresponding to the CDRs of antibody hu-KA-7088)

[0201] (4) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 229, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 230; (corresponding to the CDRs of antibody hu-KA-7081)

[0202] (5) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 131, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 132; (corresponding to the CDRs of antibody KA-7081)

[0203] (6) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 139, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 140; (corresponding to the CDRs of antibody KA-7082)

[0204] (7) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 147, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 148; (corresponding to the CDRs of antibody KA-7087)

[0205] (8) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 155, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 156; (corresponding to the CDRs of antibody KA-7088)

[0206] (9) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 163, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 164; (corresponding to the CDRs of antibody KA-7089)

[0207] (10) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 245, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 246; (corresponding to the CDRs of antibody hu-KA-7087)

[0208] (11) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 261, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 262; (corresponding to the CDRs of antibody hu-KA-7089)

[0209] (12) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 173, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 174; (corresponding to the CDRs of antibody hV1)

[0210] (13) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 175, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 176; (corresponding to the CDRs of antibody hu-hV3) , or

[0211] (14) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 185, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 186 (corresponding to the CDRs of antibody hV4) .

[0212] Unless indicated otherwise, the term "CD19 binding protein" refers to any protein that can specifically bind to CD19. CD19 binding protein can encompass the antibodies or immunoconjugates against CD19 as defined herein. The term "CD19 binding protein" encompasses immunoglobulin super family antibodies (IgSF) , or CDR-grafted molecules.

[0213] The term "specifically binding" herein means that an antigen-binding molecule (e.g., an antibody or a ligand of an antigen) specifically binds to an antigen (e.g., CD19) and substantially identical antigens, generally with high affinity, but does not bind to unrelated antigens with high affinity. Affinity is generally reflected in an equilibrium dissociation constant (KD) , where a relatively low KD indicates a relatively high affinity. In the case of antibodies, high affinity generally means having a KD of about 1 × 10-6 M or less, about 1 × 10-7 M or less, about 1 × 10-8 M or less, about 1 × 10-9 M or less, about 1×10-10 M or less, 1× 10-11M or less, or 1 × 10-12 M or less. KD is calculated as follows: KD = Kd / Ka, where Kd represents the dissociation rate and Ka represents the association rate. The equilibrium dissociation constant KD can be measured by methods well known in the art, such as surface plasmon resonance (e.g., Biacore) or equilibrium dialysis. Illustratively, KD can be obtained by the method as described in the examples herein.

[0214] Generally, the term "specificity" refers to the number of different types of antigens or epitopes to which a particular antigen-binding molecule or antigen-binding protein (such as an immunoglobulin single variable domain of the invention) can bind. The specificity of an antigen-binding protein can be determined based on its affinity and / or avidity. The affinity, represented by the equilibrium constant for the dissociation of an antigen with an antigen-binding protein (KD) , is a measure for the binding strength between an epitope and an antigen-binding site on the antigen-binding protein: the lesser the value of the KD, the stronger the binding strength between an epitope and the antigen-binding protein (alternatively, the affinity can also be expressed as the affinity constant (KA) , which is 1 / KD) . As will be clear to the skilled person, affinity can be determined in a manner known per se, depending on the specific antigen of interest. Avidity is the measure of the strength of binding between an antigen-binding protein (such as an immunoglobulin, an antibody, an immunoglobulin single variable domain or a polypeptide containing it) and the pertinent antigen. Avidity is related to both the affinity between an epitope and its antigen binding site on the antigen-binding protein and the number of pertinent binding sites present on the antigen-binding protein.

[0215] The term "antibody" herein is used in its broadest sense and refers to a polypeptide or a combination of polypeptides that comprises sufficient sequence from an immunoglobulin heavy chain variable region and / or sufficient sequence from an immunoglobulin light chain variable region to be capable of specifically binding to an antigen. "Antibody" herein encompasses various forms and various structures as long as they exhibit the desired antigen-binding activity, including intact antibodies and antigen-binding fragments thereof.

[0216] The term "antibody" herein includes a typical "four-chain antibody" , which is an immunoglobulin consisting of two heavy chains (HCs) and two light chains (LCs) . The heavy chain refers to a polypeptide chain consisting of, from the N-terminus to the C-terminus, a heavy chain variable region (VH) , a heavy chain constant region CH1 domain, a hinge region (HR) , a heavy chain constant region CH2 domain, and a heavy chain constant region CH3 domain; moreover, when the full-length antibody is of IgE isoform, the heavy chain optionally further comprises a heavy chain constant region CH4 domain. The light chain is a polypeptide chain consisting of, from the N-terminus to the C-terminus, a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) . The heavy chains are connected to each other and to the light chains through disulfide bonds to form a Y-shaped structure. The heavy chain constant regions of immunoglobulins differ in their amino acid composition and arrangement, and thus in their antigenicity. Accordingly, "immunoglobulin" herein can be divided into five classes, or isoforms of immunoglobulins, i.e., IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE, with their corresponding heavy chains being μ, δ, γ, α, and ε chains, respectively. The Ig of the same class may also be divided into different subclasses according to the differences in the amino acid composition of the hinge regions and the number and location of disulfide bonds in the heavy chains. For example, IgG may be divided into IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, and IgA may be divided into IgA1 and IgA2. The light chains can be divided into κ or λ chains according to the differences in the constant regions. Each of the five classes of Ig may have a κ chain or a λ chain.

[0217] "Antigen-binding fragment" and "antibody fragment" herein are used interchangeably and do not have the entire structure of an intact antibody, but comprise only a portion of the intact antibody or a variant of the portion that has the ability to bind to an antigen. "Antigen-binding fragment" or "antibody fragment" herein includes but is not limited to, a Fab, a Fab', a Fab'-SH, a F (ab') 2, an scFv, and a VHH.

[0218] Antibodies can be screened for competitive binding to a same epitope by conventional techniques known in the art. For example, antibodies compete or cross-compete for binding to antigen can be obtained by competitive or cross-competitive assays. A high throughput process for obtaining antibodies binding to a same epitope based upon their cross-competition is described in International Patent Publication No. WO 03 / 48731. Correspondingly, antibodies and antigen binding fragments thereof that compete with the antibody molecules of the invention for binding to same epitope on CD19 can be obtained by conventional techniques known in the art.

[0219] The term "scFv" (single-chain variable fragment) herein refers to a single polypeptide chain comprising VL and VH domains, wherein the VL and VH are linked through a linker (see, e.g., Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) ; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988) ; and Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Roseburg and Moore Ed., Springer-Verlag, New York, pp 269-315 (1994) ) . Such scFv molecules may have a general structure: NH2-VL-linker-VH-COOH or NH2-VH-linker-VL-COOH. An appropriate linker in the prior art includes GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 195) and consists of GGGGS (SEQ ID NO: 323) amino acid sequence repeats or a variant thereof. For example, a linker having the amino acid sequence (GGGGS) 4 (SEQ ID NO: 324) can be used, and variants thereof can also be used (Holliger et al. (1993) , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448) . Other linkers that can be used in the present disclosure are described in Alfthan et al. (1995) , Protein Eng. 8: 725-731; Choi et al. (2001) , Eur. J. Immunol. 31: 94-106; Hu et al. (1996) , Cancer Res. 56: 3055-3061; Kipriyanov et al. (1999) , J. Mol. Biol. 293: 41-56; and Roovers et al. (2001) , Cancer Immunol. In some cases, there may also be disulfide bonds between the VH and VL of the scFv, forming a disulfide-linked Fv (dsFv) .

[0220] "Antibody" herein may be derived from any animal, including, but not limited to, human and non-human animals which may be selected from primates, mammals, rodents, and vertebrates, such as Camelidae species, Lama glama, Lama guanicoe, Vicugna pacos, sheep, rabbits, mice, rats, or Chondrichthyes (e.g., shark) .

[0221] The term "humanized antibody" means an antibody obtained by grafting CDR sequences derived from another mammalian species, such as a mouse species, onto human framework sequences. To preserve the binding affinity, some residues in the backbone (referred to as FR) segments may be modified. The humanized antibodies or fragments thereof according to the present application can be prepared by techniques known to those skilled in the art.

[0222] The term "variable region" herein refers to a region of a heavy or light chain of an antibody involved in the binding of the antibody to an antigen. "Heavy chain variable region" is used interchangeably with "VH" and "HCVR" , and "light chain variable region" is used interchangeably with "VL" and "LCVR" . Heavy and light chain variable domains (VH and VL, respectively) of natural antibodies generally have similar structures, each of which contains four conservative framework regions (FRs) and three hypervariable regions (HVRs) . See, e.g., Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W. H. Freeman and Co., p. 91 (2007) . A single VH or VL domain may be sufficient to provide antigen-binding specificity. The terms "complementarity determining region" and "CDR" herein are used interchangeably and generally refer to a hypervariable region (HVR) of a heavy chain variable region (VH) or a light chain variable region (VL) , which is also known as the complementarity determining region because it is precisely complementary to an epitope in a spatial structure, wherein the heavy chain variable region CDR may be abbreviated as HCDR and the light chain variable region CDR may be abbreviated as LCDR. A "CDR" of a variable domain are amino acid residues within the variable region that are identified in accordance with the definitions of the Kabat, Chothia, the accumulation of both Kabat and Chothia, AbM, contact, and / or conformational definitions or any method of CDR determination well known in the art. The terms "framework region" or "FR" are used interchangeably and refer to those amino acid residues of an antibody heavy chain variable region or light chain variable region, other than CDRs. Generally, a typical antibody variable region consists of 4 FRs and 3 CDRs in the following order: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

[0223] For further description of the CDRs, see Kabat et al., J. Biol. Chem., 252: 6609-6616 (1977) ; Kabat et al., United States Department of Health and Human Services, Sequences of proteins of immunological interest (1991) ; Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) ; Al-Lazikani B. et al., J. Mol. Biol., 273: 927-948 (1997) ; MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996) ; Abhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008) ; Lefranc M. P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77 (2003) ; and Honegger and Plückthun, J. Mol. Biol., 309: 657-670 (2001) .

[0224] Antibody CDRs may be identified as the hypervariable regions originally defined by Kabat et al. See, e.g., Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D. C. The positions of the CDRs may also be identified as the structural loop structures originally described by Chothia and others. See, e.g., Chothia et al., Nature 342: 877-883, 1989. Other approaches to CDR identification include the "AbM definition, " which is a compromise between Kabat and Chothia and is derived using Oxford Molecular's AbM antibody modeling software (now ) , or the "contact definition" of CDRs based on observed antigen contacts, set forth in MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262: 732-745, 1996. In another approach, referred to herein as the "conformational definition" of CDRs, the positions of the CDRs may be identified as the residues that make enthalpic contributions to antigen binding. See, e.g., Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283: 1 156-1 166, 2008. Still other CDR boundary definitions may not strictly follow one of the above approaches, but will nonetheless overlap with at least a portion of the Kabat CDRs, although they may be shortened or lengthened in light of prediction or experimental findings that particular residues or groups of residues or even entire CDRs do not significantly impact antigen binding. As used herein, a CDR may refer to CDRs defined by any approach known in the art, including combinations of approaches. The methods used herein may utilize CDRs defined according to any of these approaches. For any given embodiment containing more than one CDR, the CDRs may be defined in accordance with any of Kabat, Chothia, extended, AbM, contact, and / or conformational definitions. In some embodiments, the CDR is one of Kabat CDR, AbM CDR, Chothia CDR, or IMGT CDR. In some embodiments, the CDRs are the Kabat CDRs. In other embodiments, the CDRs are the Chothia CDRs. In other words, in embodiments with more than one CDR, the CDRs may be any of Kabat, Chothia, combination CDRs, or combinations thereof.

[0225] In some embodiments, the VH region comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 109 and the VL region comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 110.

[0226] In some embodiments, the VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 are selected from any one of the following groups,

[0227] (a) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 97, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 98, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 99, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 100, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 101, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 102 (corresponding to the CDRs of antibody hV2 &hu-KA-7082 &hV4, Kabat CDRs) ;

[0228] (b) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 103, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 104, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 105, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 106, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 107, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 108 (corresponding to the CDRs of antibody hV2&hu-KA-7082 &hV4, Chothia CDRs) ;

[0229] (c) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 247, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 248, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 249, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 250, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 251, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 252 (corresponding to the CDRs of antibody hu-KA-7088) ;

[0230] (d) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 223, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 224, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 225, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 226, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 227, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 228 (corresponding to the CDRs of antibody hu-KA-7081) ;

[0231] (e) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 125, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 126, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 127, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 128, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 129, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 130 (corresponding to the CDRs of antibody KA-7081) ;

[0232] (f) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 133, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 134, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 135, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 136, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 137, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 138 (corresponding to the CDRs of antibody KA-7082) ;

[0233] (g) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 141, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 142, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 143, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 144, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 145, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 146 (corresponding to the CDRs of antibody KA-7087) ;

[0234] (h) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 149, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 150, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 151, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 152, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 153, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 154 (corresponding to the CDRs of antibody KA-7088) ;

[0235] (i) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 157, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 158, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 159, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 160, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 161, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 162 (corresponding to the CDRs of antibody KA-7089) ;

[0236] (j) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 239, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 240, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 241, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 242, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 243, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 244 (corresponding to the CDRs of antibody hu-KA-7087) ; or

[0237] (k) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 255, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 256, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 257, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 258, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 259, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 260 (corresponding to the CDRs of antibody hu-KA-7089) .

[0238] In some embodiments, the VH and VL regions respectively comprise an amino acid sequence selected from any one of the following groups, or a variant thereof with one or several conservative amino acid substitutions in residues that are not within a CDR,

[0239] (i) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 109, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 110;

[0240] (ii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 123, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 124;

[0241] (iii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 253, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 254;

[0242] (iv) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 229, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 230;

[0243] (v) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 131, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 132;

[0244] (vi) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 139, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 140;

[0245] (vii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 147, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 148;

[0246] (viii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 155, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 156;

[0247] (ix) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 163, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 164;

[0248] (x) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 245, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 246;

[0249] (xi) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 261, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 262;

[0250] (xii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 173, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 174;

[0251] (xiii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 175, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 176; or

[0252] (xiv) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 185, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 186.

[0253] In some embodiments, the VH has a sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 25 mutations (e.g., at most 20 mutations, at most 15 mutations, at most 10 mutations, at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with the VH corresponding to any one of groups (i) - (xiv) , and the VL has a sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 20 mutations (e.g., at most 15 mutations, at most 10 mutations, at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with the VL corresponding to any one of groups (i) - (xiv) .

[0254] As used herein, "mutation" includes insertion mutation, deletion mutation and substitution mutation, and in some embodiments, the substitution mutation is preferably a conservative amino acid substitution.

[0255] As used herein, "conservative amino acid" generally refers to amino acids that belong to the same class or have similar characteristics (e.g., charge, side chain size, hydrophobicity, hydrophilicity, backbone conformation, and rigidity) . Illustratively, the amino acids in each of the following groups belong to conservative amino acid residues of each other, and substitutions of amino acid residues within the groups belong to conservative amino acid substitutions: Illustratively, the following six groups are examples of amino acids that are considered to be conservative replacements of each other: 1) alanine (A) , serine (S) , and threonine (T) ; 2) aspartic acid (D) and glutamic acid (E) ; 3) asparagine (N) and glutamine (Q) ; 4) arginine (R) , lysine (K) , and histidine (H) ; 5) isoleucine (I) , leucine (L) , methionine (M) , and valine (V) ; and 6) phenylalanine (F) , tyrosine (Y) , and tryptophan (W) .

[0256] As used herein, "at most X mutations" means that the number of mutations may be selected from any natural number in the range of 0 to X.

[0257] In some embodiments, the CD19 binding protein is a monoclonal antibody. In some embodiments, the CD19 binding protein is a chimeric, humanized, or human antibody. In some embodiments, the CD19 binding protein is a Fab, Fab’ , F (ab’ ) 2, Fv, scFv, (scFv) 2, single chain antibody, dual variable region antibody, diabody, nanobody, or single variable region antibody. In some embodiments, the CD19 binding protein is a scFv, preferably a humanized scFv. In some embodiments, the scFv comprises a heavy chain variable region (VH) fused to N-terminal or C-terminal of a light chain variable region (VL) . In some embodiments, an amino acid linker may be positioned between the VH and VL in the scFv. In some embodiments, the VH and VL are linked together by a flexible linker. In some embodiments the flexible linker an amino acid sequence of SEQ ID NO: 195 or an amino acid sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 10 mutations (e.g., at most 9 mutations, at most 8 mutations, at most 7 mutations, at most 6 mutations, at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 195. In some embodiments, the flexible linker positioned between the VH and VL in the scFv comprises a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 273-282 or a nucleotide sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 10 mutations (e.g., at most 9 mutations, at most 8 mutations, at most 7 mutations, at most 6 mutations, at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with any one of SEQ ID NOs: 273-282.

[0258] In some embodiments, the CD19 binding protein comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 11, 13-16, 41-46 or 61-67. In some embodiments, the CD19 binding protein comprises an amino acid sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 50 mutations (e.g., at most 45 mutations, at most 40 mutations, at most 35 mutations, at most 30 mutations, at most 25 mutations, at most 20 mutations, at most 15 mutations, at most 10 mutations, at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 11, 13-16, 41-46 or 61-67.

[0259] Typically, the CD19 binding protein of the invention will bind to the antigen (i.e., CD19) with a dissociation constant (KD) of preferably 10 -7 to 10 -10 moles / liter (M) , more preferably 10 -8 to 10 -10 moles / liter, even more preferably 10 -9 to 10 -10M moles / liter, or less (as measured in a Biacore or in a KinExA or in a Fortibio assay) , and / or with an association constant (KA) of at least 10 -7M, preferably at least 10 -8M, more preferably at least 10 -9M, more preferably at least 10 -10M. In some embodiments, the binding affinity (KD) of the CD19 binding protein as described herein to CD19 (such as human CD19) can be about 0.002 to about 6500 nM. In some embodiments, the binding affinity is about any of 6500 nM, 6000 nM, 5500 nM, 5000 nM, 4500 nM, 4000 nM, 3500 nM, 3000 nM, 2500 nM, 2000 nM, 1500 nM, 1000 nM, 750 nM, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 90 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 10 nM, 8 nM, 7.5 nM, 7 nM, 6.5 nM, 6 nM, 5.5 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.3 nM, 0.1 nM, 0.01 nM, or 0.002 nM. In some embodiments, the binding affinity is less than about any of 6500 nM, 6000 nM, 5500 nM, 5000 nM, 4000 nM, 3000 nM, 2000 nM, 1000 nM, 900 nM, 800 nM, 250 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 7.5 nM, 7 nM, 6.5 nM, 6 nM, 5 nM, 4.5 nM, 4 nM, 3.5 nM, 3 nM, 2.5 nM, 2 nM, 1.5 nM, 1 nM, or 0.5 nM.

[0260] Any KD value greater than 10 -4M is generally considered to indicate non-specific binding. Specific binding of an antigen-binding protein to an antigen or epitope can be determined in any suitable manner known per se, including, for example, the assays described herein, Scatchard analysis and / or competitive binding assays, such as radioimmunoassays (RIA) , enzyme immunoassays (EIA) and sandwich competition assays.

[0261] 2.VHH

[0262] In one aspect, the CD19 binding molecule of the invention may contain at least one CD19 binding immunoglobulin single variable domain, such as variable domain of heavy chain of heavy chain-only antibody (VHH) .

[0263] In this aspect, the present invention provides a CD19 binding protein, wherein the CD19 binding protein comprises immunoglobulin single variable domain, capable of specifically binding to CD19, wherein the immunoglobulin single variable domain comprises CDR1, CDR2, and CDR3 contained in any one of SEQ ID NOs. 17-24.

[0264] The term "immunoglobulin single variable domain" as used herein means an immunoglobulin variable domain which is capable of specifically binding to an epitope of the antigen without pairing with an additional variable immunoglobulin domain. One example of immunoglobulin single variable domains in the meaning of the present invention is "domain antibody" , such as the immunoglobulin single variable domains VH and VL (VH domains and VL domains) . Another example of immunoglobulin single variable domains is "VHH domain" (or simply "VHH" ) from camelids, as defined hereinafter.

[0265] "VHH domains" , also known as heavy chain single domain antibodies, VHHs, V H H domains, VHH antibody fragments, and VHH antibodies, are the antigen binding immunoglobulin variable domain of "heavy chain antibodies" (i.e., "antibodies devoid of light chains" ) (Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains" ; Nature 363, 446-448 (1993) ) . The term "VHH domain" has been used in order to distinguish these variable domains from the heavy chain variable domains that are present in conventional 4-chain antibodies (which are referred to herein as "VH domains" ) and from the light chain variable domains that are present in conventional 4-chain antibodies (which are referred to herein as "VL domains" ) . VHH domains can specifically bind to an epitope without an additional antigen binding domain (as opposed to VH or VL domains in a conventional 4-chain antibody, in which case the epitope is recognized by a VL domain together with a VH domain) . VHH domains are small, robust and efficient antigen recognition units formed by a single immunoglobulin domain.

[0266] In the context of the present invention, the terms heavy chain single domain antibody, VHH domain, VHH, V H H domain, VHH antibody fragment, VHH antibody, as well as and " domain" ( "Nanobody" being a trademark of the company Ablynx N.V.; Ghent; Belgium) are used interchangeably.

[0267] The amino acid residues of VHH domains from Camelids are numbered according to the general numbering for VH domains given by Kabat et al. ( "Sequence of proteins of immunological interest" , US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91) , as shown e.g., in Figure 2 of Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999) .

[0268] However, it should be noted that -as is well known in the art for VH domains and for VHH domains -the total number of amino acid residues in each of the CDRs may vary and may not correspond to the total number of amino acid residues indicated by the Kabat numbering (that is, one or more positions according to the Kabat numbering may not be occupied in the actual sequence, or the actual sequence may contain more amino acid residues than the number allowed for by the Kabat numbering) . This means that, generally, the numbering according to Kabat may or may not correspond to the actual numbering of the amino acid residues in the actual sequence.

[0269] Alternative methods for numbering the amino acid residues of VH domains, which methods can also be applied in an analogous manner to VHH domains, are known in the art. However, in the present description, claims and figures, the numbering according to Kabat and applied to VHH domains as described above will be followed, unless indicated otherwise.

[0270] Further structural characteristics and functional properties of VHH domains and polypeptides containing the same can be summarized as follows: VHH domains (which have been "designed" by nature to functionally bind to an antigen without the presence of, and without any interaction with, a light chain variable domain) can function as a single, relatively small, functional antigen-binding structural unit, domain or polypeptide. This distinguishes the VHH domains from the VH and VL domains of conventional 4-chain antibodies, which by themselves are generally not suitable for practical application as single antigen-binding proteins or immunoglobulin single variable domains, but need to be combined in some form or another to provide a functional antigen-binding unit (as in for example conventional antibody fragments such as Fab fragments; in scFvs, which consist of a VH domain covalently linked to a VL domain) .

[0271] Because of these unique properties, the use of VHH domains -either alone or as part of a larger polypeptide -offers a number of significant advantages over the use of conventional VH and VL domains, scFvs or conventional antibody fragments (such as Fab-or F (ab') 2 -fragments) : only a single domain is required to bind an antigen with high affinity and with high selectivity, so that there is no need to have two separate domains present, nor to assure that these two domains are present in the right spatial conformation and configuration (i.e. through the use of especially designed linkers, as with scFvs) ; VHH domains can be expressed from a single gene and require no post-translational folding or modifications; VHH domains can easily be engineered into multivalent and multispecific formats (formated) ; VHH domains are highly soluble and do not have a tendency to aggregate; VHH domains are highly stable to heat, pH, proteases and other denaturing agents or conditions and, thus, may be prepared, stored or transported without the use of refrigeration equipments, conveying a cost, time and environmental savings; VHH domains are easy and relatively cheap to prepare, even on a scale required for production; VHH domains are relatively small (approximately 15 kDa, or 10 times smaller than a conventional IgG) compared to conventional 4-chain antibodies and antigen-binding fragments thereof, and therefore show high (er) penetration into tissues and can be administered in higher doses than such conventional 4-chain antibodies and antigen-binding fragments thereof; VHH domains can show so-called cavity-binding properties (especially due to their extended CDR3 loop, compared to conventional VH domains) and can therefore also access targets and epitopes not accessible to conventional 4-chain antibodies and antigen-binding fragments thereof.

[0272] Methods of obtaining VHH domains binding to a specific antigen or epitope have been described earlier, e.g., in WO2006 / 040153 and WO2006 / 122786; R. van der Linden et al., Journal of Immunological Methods, 240 (2000) 185-195; Li et al., J Biol Chem., 287 (2012) 13713-13721; Deffar et al., African Journal of Biotechnology Vol. 8 (12) , pp. 2645-2652, 17 June, 2009 and WO94 / 04678.

[0273] VHH domains derived from camelids can be "humanized" by replacing one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the original VHH sequence by one or more of the amino acid residues that occur at the corresponding position (s) in a VH domain from a conventional 4-chain antibody from a human being (also referred to as "sequence optimization" , and in addition to humanization, sequence optimization also encompasses other modification to the sequence by one or more mutations for providing improved VHH features, such as removing potential sites for post-translation modification) . A humanized VHH domain can contain one or more fully human framework region sequences, and in a specific embodiment, containing IGHV3 human framework region sequence.

[0274] As used herein, "domain antibodies" especially refer to the VH or VL domains of non-camelid mammalians, in particular human 4-chain antibodies. In order to bind an epitope as a single antigen binding domain, i.e. without being paired with a VL or VH domain, respectively, specific selection for such antigen binding properties is required, e.g., by using libraries of human single VH or VL domain sequences.

[0275] Domain antibodies have, like VHHs, a molecular weight of approximately 13 to approximately 16 kDa and, if derived from fully human sequences, do not require humanization for e.g., therapeutical use in humans. As in the case of VHH domains, they are well expressed also in prokaryotic expression systems, providing a significant reduction in overall manufacturing cost.

[0276] "Domain antibodies" have been described in e.g., Ward, E. S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli" ; Nature 341: 544-546 (1989) ; Holt, L. J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy" ; TRENDS in Biotechnology 21 (11) : 484-490 (2003) .

[0277] Furthermore, it will also be clear to the skilled person that it is possible to "graft" one or more of the CDRs mentioned above onto other "scaffolds" , including but not limited to human scaffolds or non-immunoglobulin scaffolds. Suitable scaffolds and techniques for such CDR grafting are known in the art.

[0278] As used herein, the term "epitope" refers to any antigenic determinant on an antigen to which the paratope of an antibody binds. Antigenic determinants typically contain chemically active surface groupings of molecules such as amino acids or sugar side chains and typically have specific three dimensional structural characteristics, as well as specific charge characteristics. For example, an epitope typically includes at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14 or 15 consecutive or non-consecutive amino acids in a unique spatial conformation, which can be "linear" or "conformational" . See, e.g., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996) . In a linear epitope, all of the points of interaction between the protein and the interacting molecule (such as an antibody) occur linearly along the primary amino acid sequence of the protein. In a conformational epitope, the points of interaction occur across amino acid residues on the protein that are separated from one another.

[0279] Epitopes of a given antigen can be identified using a number of epitope mapping techniques, well known in the art. See, e.g., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) . For example, linear epitopes may be determined by e.g., concurrently synthesizing large numbers of peptides on solid supports, the peptides corresponding to portions of the protein molecule, and reacting the peptides with antibodies while the peptides are still attached to the supports. Such techniques are known in the art and described in, e.g., U.S. Pat. No. 4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715. Similarly, conformational epitopes may be identified by determining spatial conformation of amino acids such as by, e.g., x-ray crystallography and 2-dimensional nuclear magnetic resonance. See, e.g., Epitope Mapping Protocols, supra.

[0280] In some embodiments, the immunoglobulin single variable domain (such as VHH) comprises an amino acid sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 17-24, or a variant thereof with one or several conservative amino acid substitutions in residues that are not within a CDR.

[0281] In some embodiments, the immunoglobulin single variable domain (such as VHH) has a sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 25 mutations (e.g., at most 20 mutations, at most 15 mutations, at most 10 mutations, at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with any one of SEQ ID NOs: 17-24.

[0282] In some embodiments, the CDR1, CDR2, CDR3 are selected from any one of the following groups,

[0283] (1) CDR1 set forth in SEQ ID NO: 187, CDR2 set forth in SEQ ID NO: 188, CDR3 set forth in SEQ ID NO: 189 (corresponding to the CDRs of antibodies H19VHH-V1, H19VHH-V2, H19VHH-V3 and H19VHH-V4) ; or

[0284] (2) CDR1 set forth in SEQ ID NO: 190, CDR2 set forth in SEQ ID NO: 191, CDR3 set forth in SEQ ID NO: 192 (corresponding to the CDRs of antibodies 19VHH-V5, H19VHH-V6, H19VHH-V7 and H19VHH-V8) .

[0285] In another aspect, the CD19 binding protein of the invention also encompasses an anti-CD19 antibody molecule that binds to the same epitope as a VHH consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 17-24.

[0286] In some embodiments, the CD19 binding protein of the invention, in addition to the at least one immunoglobulin single variable domain that can specifically bind to CD19, further comprises an immunoglobulin Fc region, preferably the Fc region of human immunoglobulin. Inclusion of an immunoglobulin Fc region in the CD19 binding protein of the invention allows the binding protein to form dimmers, and also allows extension of the in vivo half-life of said binding protein. Fc region that can be used in the invention may be derived from immunoglobulins of different subtypes, such as IgG (e.g, IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 subtype) , IgA1, IgA2, IgD, IgE or IgM. The immunoglobulin Fc region generally includes a hinge region or a portion of the hinge region, the CH2 region, and the CH3 region of the immunoglobulin constant region.

[0287] In some embodiments, mutations can be introduced into wildtype Fc sequence for altering relevant activities mediated by Fc. Said mutations include, but not limited to, a) mutations altering CDC activity mediated by Fc; b) mutations altering ADCC activity mediated by Fc; or c) mutations altering in vivo half-life mediated by FcRn. Such mutations are described in Leonard G Presta, Current Opinion in Immunology 2008, 20: 460-470; Esohe E. Idusogie et al., J Immunol 2000, 164: 4178-4184; RAPHAEL A. CLYNES et al., Nature Medicine, D2000, Volume 6, Number 4: 443-446; Paul R. Hinton et al., J Immunol, 2006, 176: 346-356. For example, Fc-mediated ADCC or CDC activity can be increased or removed, or FcRn Affinity can be enhanced or attenuated by mutating 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids on the CH2 region. In addition, protein stability can be increased by mutating 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 amino acids of the hinge region.

[0288] In some embodiments, mutations may be introduced into the Fc sequence such that the mutated Fc tends to form homo-dimmers or hetero-dimmers more readily. For example, Ridgway, Presta et al. 1996 and Carter 2001 mentioned using the knob-hole model of the spatial interaction of amino acid side chain groups on Fc contacting interface to allow different Fc mutants to form hetero-dimmers more readily; in addition, CN 102558355A or CN 103388013A discloses to allow different Fc mutants to form hetero-dimmers more readily (CN 102558355A) , or Fcs with same mutations to form homo-dimmers more readily (CN 103388013A) , by changing the charges of the amino acids on Fc contacting interface which in turn changes the ionic interaction at the Fc contacting interface.

[0289] In some embodiments, in the CD19 binding protein of the invention, the immunoglobulin single variable domain capable of specifically binding to CD19 is linked to the immunoglobulin Fc region via a linker. Said linker may be a non-functional amino acid sequence of 1-20 or more amino acids in length, without secondary or higher structure. For example, the linker is a flexible joint such as GGGGS, GS, GAP, and the like.

[0290] In some embodiments, the CD19 binding protein of the invention is capable of specifically binding to a cell surface CD19. In some embodiments, the cell is human B cell. In some embodiments, the cell is a malignant B cell.

[0291] CD19-specific CAR

[0292] In one aspect, the present invention provides a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) , wherein said CD19-specific chimeric antigen receptor comprises an antigen binding domain (i.e., a CD19 binding domain) . As used herein, the CD19 binding domain refers to a CD19 binding protein of the present invention, especially a CD19-specific scFv or VHH of the present invention.

[0293] As used herein, "chimeric antigen receptor (CAR) " refers to an artificial immune effector cell surface receptor engineered to be expressed on an immune effector cell and specifically bound to an antigen, which at least comprises (1) an extracellular antigen-binding domain, e.g., a variable heavy or light chain of an antibody, (2) a transmembrane domain that anchors the CAR into the immune effector cell, and (3) an intracellular signaling domain. The CAR is capable of redirecting T cells and other immune effector cells to a selected target, e.g., a cancer cell, in a non-MHC-restricted manner using the extracellular antigen-binding domain. The extracellular domain of a chimeric antigen receptor may also include a signal peptide and / or a hinge region. The intracellular domain of a chimeric antigen receptor may also include a costimulatory domain.

[0294] In some embodiments, the CD19-specific CAR of the present invention further comprises a signal peptide.

[0295] As used herein, the term "signal peptide" in the context of a chimeric antigen receptor refers to a fragment of a protein or polypeptide that is used to direct the protein or polypeptide into the secretory pathway and transfer them to the cell membrane and / or cell surface. A non-limiting example of a signal peptide is CD8α or CSF2RA signal peptide. In some embodiments, the signal peptide comprises a CSF2RA signal peptide. In some embodiments, the CSF2RA signal peptide comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 194 or an amino acid sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 10 mutations (e.g., at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with SEQ ID NO: 194. In some embodiments, the CSF2RA signal peptide comprises a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 263-272 or a nucleotide sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 10 mutations (e.g., at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with any one of SEQ ID NOs: 263-272.

[0296] In some embodiments, the CD19-specific CAR of the present invention further comprises a hinge and / or transmembrane domain, or a hinge-transmembrane domain.

[0297] As used herein, the term "hinge domain" in the context of a chimeric antigen receptor generally refers to any oligopeptide or polypeptide that functions to connect a transmembrane domain and an antigen-binding domain. Specifically, the hinge domain serves to provide greater flexibility and accessibility to the antigen-binding domain. The hinge domain may be derived in whole or in part from a natural molecule, such as in whole or in part from an extracellular region of CD8, CD4, or CD28, or in whole or in part from an antibody constant region. Alternatively, the hinge region may be a synthetic sequence corresponding to a naturally occurring hinge sequence, or may be a completely synthetic hinge sequence.

[0298] As used herein, the term "transmembrane (TM) domain" in the context of a chimeric antigen receptor refers to a polypeptide structure that enables expression of the chimeric antigen receptor on the surface of an immune cell (e.g., a lymphocyte, an NK cell, or an NKT cell) and directs the cellular response of the immune cell against a target cell. The transmembrane domain may be natural or synthetic, and may be derived from any membrane-bound protein or transmembrane protein. The transmembrane domain is capable of signaling when the chimeric antigen receptor binds to a target antigen. A non-limiting example of a hinge region is the CD8 or CD28 transmembrane region.

[0299] As used herein, "immune cell" refers to a cell of hematopoietic origin functionally involved in the initiation and / or execution of innate and / or adaptative immune response.

[0300] In some embodiments, the hinge-transmembrane domain comprises a CD28 hinge-transmembrane domain. In some embodiments, the CD28 hinge-transmembrane domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 or an amino acid sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 25 mutations (e.g., at most 20 mutations, at most 15 mutations, at most 10 mutations, at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with SEQ ID NO: 47. In some embodiments, the CD28 hinge-transmembrane domain comprises a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 283-287 or a nucleotide sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 25 mutations (e.g., at most 20 mutations, at most 15 mutations, at most 10 mutations, at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with any one of SEQ ID NOs: 283-287.

[0301] In some embodiments, the hinge-transmembrane domain comprises a CD8 hinge-transmembrane domain. In some embodiments, the CD8 hinge-transmembrane domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 197 or an amino acid sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 25 mutations (e.g., at most 20 mutations, at most 15 mutations, at most 10 mutations, at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with SEQ ID NO:197. In some embodiments, the CD8 hinge-transmembrane domain comprises a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 288-292 or a nucleotide sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 25 mutations (e.g., at most 20 mutations, at most 15 mutations, at most 10 mutations, at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with any one of SEQ ID NOs: 288-292.

[0302] In some embodiments, the CD19-specific CAR of the present invention further comprises a costimulatory domain.

[0303] As used herein, the term "costimulatory domain" in the context of a chimeric antigen receptor refers to the intracellular signaling domain of a costimulatory molecule. Costimulatory molecules are cell surface molecules other than antigen receptors or Fc receptors that provide the second signal required for effective activation and functioning of T lymphocytes upon binding to the antigen. A non-limiting example of a costimulatory domain is the CD28 or 4-1BB costimulatory domain.

[0304] In some embodiments, the costimulatory domain comprises a CD28 costimulatory domain. In some embodiments, the CD28 costimulatory domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 or an amino acid sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 10 mutations (e.g., at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with SEQ ID NO: 48. In some embodiments, the CD28 costimulatory domain comprises a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 293-297 or a nucleotide sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 10 mutations (e.g., at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with any one of SEQ ID NOs: 293-297.

[0305] In some embodiments, the costimulatory domain comprises a 4-1BB costimulatory domain. In some embodiments, the 4-1BB costimulatory domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 198 or an amino acid sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 10 mutations (e.g., at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with SEQ ID NO: 198. In some embodiments, the 4-1BB costimulatory domain comprises a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 298-302 or a nucleotide sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 10 mutations (e.g., at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with any one of SEQ ID NOs: 298-302.

[0306] In some embodiments, the hinge-transmembrane domain comprises the CD28 hinge-transmembrane domain and the costimulatory domain comprises the CD28 costimulatory domain. In some embodiments, the hinge-transmembrane domain comprises the CD8 hinge-transmembrane domain and the costimulatory domain comprises the 4-1BB costimulatory domain.

[0307] In some embodiments, the CD19-specific CAR of the present invention further comprises an intracellular signaling domain.

[0308] As used herein, the term "intracellular signaling domain" in the context of a chimeric antigen receptor refers to a protein portion that transduces an effector function signal and directs a cell to perform a specified function. The intracellular signaling domain is responsible for intracellular primary signaling after the antigen-binding domain binds to the antigen, resulting in activation of the immune cell and immune response. In other words, the intracellular signaling domain is responsible for activating at least one of the normal effector functions of the immune cell in which the CAR is expressed. Exemplary intracellular signaling domains include CD3ζ.

[0309] The term "immune effector cell" or "effector cell" as used herein refers to a cell involved in an immune response, e.g., promoting an immune effector response. Examples of immune effector cells include T cells, e.g., α / β T cells and γ / δ T cells, B cells, natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, mast cells, and myeloid-derived phagocytes.

[0310] In some embodiments, the intracellular signaling domain comprises a CD3ζ signaling domain. In some embodiments, the CD3ζ signaling domain comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 or an amino acid sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 25 mutations (e.g., at most 20 mutations, at most 15 mutations, at most 10 mutations, at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with SEQ ID NO: 49. In some embodiments, the CD3ζsignaling domain comprises a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 303-312 or a nucleotide sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 25 mutations (e.g., at most 20 mutations, at most 15 mutations, at most 10 mutations, at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with any one of SEQ ID NOs: 303-312.

[0311] In some embodiments, the chimeric antigen receptor comprises, in the order from N-terminus to C terminus, the signal peptide, the antigen binding domain (i.e., the CD19 binding domain) , the hinge-transmembrane domain, the costimulatory domain, and the intracellular signaling domain. In some embodiments, the elements of the CAR may be connected by a linker. For example, the antigen binding domain (i.e., the CD19 binding domain) and the hinge-transmembrane domain may be connected by a linker, such as a linker having an amino acid sequence of AAA.

[0312] The term “element” , as used herein, refers to a separate or distinct part of something, for example, a nucleic acid / polypeptide sequence with a separate function within a longer nucleic acid / polypeptide sequence.

[0313] In some embodiments, the chimeric antigen receptor comprises, in the order from N-terminus to C terminus, the CSF2RA signal peptide, the CD19 binding protein, the CD28 hinge-transmembrane domain, the CD28 costimulatory domain, and the CD3ζ signaling domain. In some embodiments, the chimeric antigen receptor comprises, in the order from N-terminus to C terminus, the CSF2RA signal peptide, the CD19 binding protein, the CD8 hinge-transmembrane domain, the 4-1BB costimulatory domain, and the CD3ζ signaling domain.

[0314] In some embodiments, the chimeric antigen receptor comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 25-32, 68-80, or 199-208 or an amino acid sequence having at least 80%identity (e.g., at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%) or at most 120 amino acid mutations (e.g., at most 110 mutations, at most 100 mutations, at most 90 mutations, at most 80 mutations, at most 70 mutations, at most 60 mutations, at most 50 mutations, at most 45 mutations, at most 40 mutations, at most 35 mutations, at most 30 mutations, at most 25 mutations, at most 20 mutations, at most 15 mutations, at most 10 mutations, at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with any one of SEQ ID NOs: 25-32, 68-80, or 199-208.

[0315] Nucleic acid, vector and host cell

[0316] In one aspect, the present invention provides a nucleic acid molecule comprising an ORF region encoding the CD19 binding protein of the present invention or the CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) of the present invention.

[0317] According to one embodiment of the invention, the nucleic acid of the invention is in isolated form. In some embodiments, the nucleic acid molecule is an isolated nucleic acid molecule.

[0318] A polypeptide or nucleic acid molecule is considered to be "isolated" -for example, when compared to its native biological source and / or the reaction medium or cultivation medium from which it has been obtained -when it has been separated from at least one other component with which it is usually associated in said source or medium, such as another protein / polypeptide, another nucleic acid, another biological component or macromolecule or at least one contaminant, impurity or minor component. In particular, a polypeptide or nucleic acid molecule is considered "isolated" when it has been purified at least 2-fold, in particular at least 10-fold, more in particular at least 100-fold, and up to 1000-fold or more. A polypeptide or nucleic acid molecule that is "in isolated form" is preferably essentially homogeneous, as determined using a suitable technique, such as a suitable chromatographical technique, such as polyacrylamide gel electrophoresis.

[0319] In some embodiments, the nucleic acid molecule further comprises a translation initiation element (TIE) . In some embodiments, the ORF sequence or the coding sequence of the CD19 binding protein or the CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) of the present invention is operably linked to a translation initiation element (TIE) . In embodiments, the TIE is located at the 5’ end of the ORF or the coding sequence of the CD19 binding protein or the CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) of the present invention. In embodiments, the TIE is located at the 3’ end of the ORF or the coding sequence of the CD19 binding protein or the CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) of the present invention. In embodiments, the TIE is selected from an IRES sequence, 5’ UTR sequence, Kozak sequence, a sequence containing m6A modification, a sequence complementary to ribosome 18S rRNA, or any combination thereof. In embodiments, the TIE is an Internal Ribosome Entry Site (IRES) . In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises a TIE (such as IRES) and the ORF.

[0320] “Translation initiation element (TIE) ” as used herein refers to a sequence in the RNA molecule that can initiate the translation of said RNA molecule.

[0321] In some embodiments, the IRES is from RhinovirusB6 strainRvB6 / USA / 2021 / RAS4VQ, Taura syndrome virus, Tiiatoma virus, Theiler’s encephalomyelitis virus, Simian Virus 40, Solenopsis invicta virus 1, Rhopalosiphum padi virus, Reticuloendotheliosis virus, Human poliovirus 1, Plautia stall intestine virus, Kashmir bee virus, Human rhinovirus 2, Homalodisca coagulata virus-1, Human Immunodeficiency Virus type 1, Homalodisca coagulata virus-1, Himetobi P virus, Hepatitis C virus, Hepatitis A virus, Hepatitis GB virus, Foot and mouth disease virus, Human enterovirus 71, Equine rhinitis virus, Ectropis obliqua picoma-like virus, Encephalomyocarditis virus, Drosophila C Virus, Human coxsackievirus B3, Crucifer tobamovirus, Cricket paralysis virus, Bovine viral diarrhea virus 1, Black Queen Cell Virus, Aphid lethal paralysis virus, Avian encephalomyelitis virus, Acute bee paralysis virus, Hibiscus chlorotic ringspot virus, Classical swine fever virus, Human FGF2, Human SFTPA1, Human AML1 / RUNX1, Drosophila antennapedia, Human AQP4, Human AT1R, Human BAG-1, Human BCL2, Human BiP, Human c-IAPl, Human c-myc, Human eIF4G, Mouse NDST4L, Human LEF1, Mouse HIFl alpha, Human n. myc, Mouse Gtx, Human p27kipl, Human PDGF2 / c-sis, Human p53, Human Pim-1, Mouse Rbm3, Drosophila reaper, Canine Scamper, Drosophila Ubx, Human UNR, Mouse UtrA, Human VEGF-A, Human XIAP, Drosophila hairless, S. cerevisiae TFIID, S. cerevisiae YAP1, tobacco etch virus, turnip crinkle virus, EMCV-A, EMCV-B, EMCV-Bf, EMCV-Cf, EMCV pEC9, Picobirnavirus, HCV QC64, Human Cosavirus E / D, Human Cosavirus F, Human Cosavirus JMY, Rhinovirus NAT001, HRV14, HRV89, HRVC-02, HRV-A21, Salivirus A SHI, Salivirus FHB, Salivirus NG-J1, Human Parechovirus 1, Crohivirus B, Yc-3, Rosavirus M-7, Shanbavirus A, Pasivirus A, Pasivirus A 2, Echovirus E14, Human Parechovirus 5, Aichi Virus, Hepatitis A Virus HA 16, Phopivirus, CVA10, Enterovirus C, Enterovirus D, Enterovirus J, Human Pegivirus 2, GBV-C GT110, GBV-C K1737, GBV-C Iowa, Pegivirus A 1220, Pasivirus A 3, Sapelovirus, Rosavirus B, Bakunsa Virus, Tremovirus A, Swine Pasivirus 1, PLV-CHN, Pasivirus A, Sicinivirus, Hepacivirus K, Hepacivirus A, BVDV1, Border Disease Virus, BVDV2, CSFV-PK15C, SF573 Dicistravirus, Hubei Picoma-like Virus, CRPV, Salivirus A BN5, Salivirus A BN2, Salivirus A 02394, Salivirus A GUT, Salivirus A CH, Salivirus A SZ1, Salivirus FHB, CVB3, CVB1, Echovirus 7, CVB5, EVA71, CVA3, CVA12, EV24 or an aptamer to eIF4G.

[0322] In some embodiments, the IRES comprises a RhinovirusB6 strainRvB6 / USA / 2021 / RAS4VQ IRES or a fragment or variant thereof. In certain embodiments, the IRES comprises a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 50 or comprises a nucleotide sequence having at least 75%, e.g., at least 80%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 50 or at most 25 mutations (e.g., at most 20 mutations, at most 15 mutations, at most 10 mutations, at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with SEQ ID NO: 50.

[0323] The nucleic acid of the invention may also be in the form of, may be present in and / or may be part of a vector, such as for example a plasmid, cosmid or YAC. The vector may especially be an expression vector, i.e. a vector that can provide for expression of the CD19 binding protein or the CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) in vitro and / or in vivo (i.e. in a suitable host cell, host organism and / or expression system) . Such expression vector generally comprises at least one nucleic acid of the invention that is operably linked to one or more suitable regulatory elements, such as promoter (s) , enhancer (s) , terminator (s) , and the like. Such elements and their selection in view of expression of a specific sequence in a specific host are common knowledge of the skilled person. Specific examples of regulatory elements and other elements useful or necessary for expressing the CD19 binding protein of the present invention or the CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) of the present invention include such as promoters, enhancers, terminators, integration factors, selection markers, leader sequences, reporter genes, and the like.

[0324] As used herein, "vector" is a composition that comprises an isolated nucleic acid and may be used for delivering the isolated nucleic acid to the interior of a cell. Many vectors are known in the art, including but not limited to, linear polynucleotides, polynucleotides associated with ionic or amphiphilic compounds, plasmids, and viruses. Thus, the term "vector" includes autonomously replicating plasmids or viruses. The term should also be construed as including non-plasmid and non-viral compounds that facilitate the transfer of nucleic acids into cells, such as polylysine compounds and liposomes. Examples of vectors include, but are not limited to, viral vectors, naked DNA or RNA expression vectors, plasmid, cosmid or phage vectors, DNA or RNA expression vectors associated with cationic condensing agents, DNA or RNA expression vectors encapsulated in liposomes, and certain eukaryotic cells, such as producer cells.

[0325] In one aspect, the present application provides a vector (e.g., an expression vector) comprising the nucleic acid molecule of the present invention.

[0326] In some embodiments, the nucleic acid molecule is operably linked to a regulatory element. In some embodiments, the regulatory element is recognized by a host cell transformed with the vector.

[0327] The term “operably linked” , as used herein, refers to the association of nucleic acid sequences on a single nucleic acid fragment so that the function of one is affected by the other. For example, a promoter is operably linked with a coding sequence when it is capable of affecting the expression of that coding sequence (i.e., that the coding sequence is under the transcriptional control of the promoter) .

[0328] As used herein, “ (expression) regulatory element” or "expression control sequence" means a nucleic acid sequence that directs transcription of a nucleic acid. An expression control sequence can be a promoter, such as a constitutive or an inducible promoter, or an enhancer. The expression control sequence is operably linked to the nucleic acid sequence to be transcribed.

[0329] A "host cell" includes an individual cell or cell culture that can be or has been a recipient for vector (s) for incorporation of polynucleotide inserts. Host cells include progeny of a single host cell, and the progeny may not necessarily be completely identical (in morphology or in genomic DNA complement) to the original parent cell due to natural, accidental, or deliberate mutation. A host cell includes cells transfected in vivo with a nucleic acid molecule or polynucleotide (s) of this invention.

[0330] In another aspect, the invention relates to a (recombinant) host cell that expresses or is capable of expressing the CD19 binding protein of the present invention or the CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) of the present invention; and / or that comprises the nucleic acid molecule of the invention or transfected with the vector (e.g., an expression vector) of the invention. According to an embodiment, said host cells are bacterial cells; other useful cells are yeast cells, fungal cells or mammalian cells. In some embodiments, the host cells are mammalian cells. Suitable mammalian cells include for example HEK293 cells, CHO cells, BHK cells, HeLa cells, COS cells, and the like. However, amphibian cells, insect cells, plant cells, and any other cells used in the art for the expression of heterologous proteins can be used as well. In some embodiments, the host cell may be a prokaryotic or a eukaryotic cell. In some embodiments, the host cell may be a mammal cell, preferably a human cell, such as a T cell, a NK cell or a A549 cell. The host cell may be an immune effector cell, such as a T cell, a NK cell, an NKT cell, a macrophage, a neutrophil, or a granulocyte cell, or a population comprising these cells. In some embodiments, the T cell is a cytotoxic T cell, a helper T cell, a gamma delta T, a CD4+ / CD8+double positive T cell, a CD4+ T cell, a CD8+ T cell, a CD4 / CD8 double negative T cell, a CD3+T cell, a CD3+CD4-T cell, a CD3+CD4+ T cell, a naive T cell, an effector T cell, a helper T cell, a memory T cell, a regulator T cell, a Th0 cell, a Th1 cell, a Th2 cell, a Th3 (Treg) cell, a Th9 cell, a Th17 cell, a Thαβ helper cell, a Tfh cell, a stem memory TSCM cell, a central memory TCM cell, an effector memory TEM cell, or an effector memory TEMRA cell.

[0331] The nucleic acid molecule of the invention may be prepared or obtained in a manner known per se (e.g., by automated DNA / RNA synthesis and / or recombinant DNA / RNA technology) , based on the information on the amino acid sequences for the polypeptides of the invention given herein, and / or can be isolated from a suitable natural source. The nucleic acid molecule of this invention can be obtained using chemical synthesis, recombinant methods, or PCR. Methods of chemical polynucleotide synthesis are well known in the art and need not be described in detail herein. One of skill in the art can use the sequences provided herein and a commercial DNA / RNA synthesizer to produce a desired DNA / RNA sequence.

[0332] For preparing nucleic acid molecule using recombinant methods, a nucleic acid molecule comprising a desired sequence can be inserted into a suitable vector, and the vector in turn can be introduced into a suitable host cell for replication and amplification, as further discussed herein. Nucleic acid molecule may be inserted into host cells by any means known in the art. Cells are transformed by introducing an exogenous nucleic acid molecule by direct uptake, endocytosis, transfection, F-mating or electroporation. Once introduced, the exogenous nucleic acid molecule can be maintained within the cell as a non-integrated vector (such as a plasmid) or integrated into the host cell genome. The nucleic acid molecule so amplified can be isolated from the host cell by methods well known within the art. See, e.g., Sambrook et al., 1989. The nucleic acid molecule disclosed herein may exist in an expression cassette or expression vector (e.g., a plasmid for introduction into a bacterial host cell, or a viral vector such as a baculovirus vector for transfection of an insect host cell, or a plasmid or viral vector such as a lentivirus for transfection of a mammalian host cell) .

[0333] Alternatively, PCR allows reproduction of DNA sequences. PCR technology is well known in the art and is described in U.S. Patent Nos. 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 and 4,683,202, as well as PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.

[0334] RNA can be obtained by using the isolated DNA in an appropriate vector and inserting it into a suitable host cell. When the cell replicates and the DNA is transcribed into RNA, the RNA can then be isolated using methods well known to those of skill in the art, as set forth in Sambrook et al., 1989, supra, for example.

[0335] Suitable cloning vectors may be constructed according to standard techniques, or may be selected from a large number of cloning vectors available in the art. While the cloning vector selected may vary according to the host cell intended to be used, useful cloning vectors will generally have the ability to self-replicate, may possess a single target for a particular restriction endonuclease, and / or may carry genes for a marker that can be used in selecting clones containing the vector. Suitable examples include plasmids and bacterial viruses, e.g., pUC18, pUC19, Bluescript (e.g., pBS SK+) and its derivatives, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, phage DNAs, and shuttle vectors such as pSA3 and pAT28. These and many other cloning vectors are available from commercial vendors such as BioRad, Strategene, and Invitrogen.

[0336] The vectors containing the nucleic acid molecule of interest can be introduced into the host cell by any of a number of appropriate means, including electroporation, transfection employing calcium chloride, rubidium chloride, calcium phosphate, DEAE-dextran, or other substances; microprojectile bombardment; lipofection; and infection (e.g., where the vector is an infectious agent such as vaccinia virus) . The choice of introducing vectors or nucleic acid molecules will often depend on features of the host cell.

[0337] According to an embodiment, said host cells are bacterial cells; other useful cells are yeast cells, fungal cells or mammalian cells. In some embodiments, the host cells are mammalian cells. Suitable mammalian cells include for example HEK293 cells, CHO cells, BHK cells, HeLa cells, COS cells, and the like. However, amphibian cells, insect cells, plant cells, and any other cells used in the art for the expression of heterologous proteins can be used as well. In some embodiments, the host cell may be a prokaryotic or a eukaryotic cell. In some embodiments, the host cell may be a mammal cell, preferably a human cell, such as a T cell, a NK cell or a A549 cell. The host cell may be an immune effector cell, such as a T cell, a NK cell, an NKT cell, a macrophage, a neutrophil, or a granulocyte cell, or a population comprising these cells. In some embodiments, the T cell is a cytotoxic T cell, a helper T cell, a gamma delta T, a CD4+ / CD8+double positive T cell, a CD4+ T cell, a CD8+ T cell, a CD4 / CD8 double negative T cell, a CD3+T cell, a CD3+CD4-T cell, a CD3+CD4+ T cell, a naive T cell, an effector T cell, a helper T cell, a memory T cell, a regulator T cell, a Th0 cell, a Th1 cell, a Th2 cell, a Th3 (Treg) cell, a Th9 cell, a Th17 cell, a Thαβ helper cell, a Tfh cell, a stem memory TSCM cell, a central memory TCM cell, an effector memory TEM cell, or an effector memory TEMRA cell.

[0338] Those skilled in the art will recognize that, in view of the degeneracy of the genetic code, considerable sequence variation is possible among these polynucleotide molecules. In some embodiments, nucleic acid sequences of the invention are codon-optimized for expression in mammalian cells, preferably for expression in human cells. Codon-optimization refers to the exchange in a sequence of interest of codons that are generally rare in highly expressed genes of a given species by codons that are generally frequent in highly expressed genes of such species, such codons encoding the amino acids as the codons that are being exchanged.

[0339] In some embodiments, the nucleic acid molecule is a DNA or RNA molecule. In some embodiments, the nucleic acid molecule is a mRNA or circular RNA polynucleotide. In some embodiments, the nucleic acid molecule is a circular RNA polynucleotide.

[0340] Circular RNA molecule

[0341] Under the circumstances that said nucleic acid molecule is a circular RNA polynucleotide, the present invention provides a circular RNA polynucleotide encoding the CD19 binding protein or the CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) of the present invention.

[0342] The terms “circular RNA molecule” , “circular RNA polynucleotide” , “circRNA” , “circular RNA” or “cRNA” , as used herein, refers to an RNA molecule that forms a circular structure through covalent bonds.

[0343] The circular RNA polynucleotide of the present invention is translatable, that is, it can be translated to a protein, e.g., in an in vitro system or in a cell. The cell may be a eukaryotic cell or a prokaryotic cell.

[0344] The term “translate” , “translating” or “translation” , as used herein, means the formation of a polypeptide molecule by a ribosome based upon an RNA template.

[0345] In some embodiments, the circular RNA polynucleotide of the present invention does not comprise a UTR, such as a 5’ UTR and / or a 3’ UTR.

[0346] The circular RNA may comprise additional elements which may not impede the translation of protein from the circular RNA. In some embodiments, the additional elements may facilitate the production of the circular RNA or the translation of the protein from the circular.

[0347] In one aspect, the present invention provides a circular RNA polynucleotide (or a nucleic acid molecule) , which comprises a sequence of interest (TOI sequence) , wherein the sequence of interest comprises an ORF sequence encoding the CD19 binding protein or the CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) of the present invention. In some embodiments, the sequence of interest comprises a translation initiation element (TIE) . In some embodiments, the ORF sequence or the coding sequence of the CD19 binding protein or the CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) of the present invention is operably linked to a translation initiation element (TIE) . In embodiments, the TIE is located at the 5’ end of the ORF or the coding sequence of the CD19 binding protein or the CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) of the present invention. In embodiments, the TIE is located at the 3’ end of the ORF or the coding sequence of the CD19 binding protein or the CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) of the present invention. In embodiments, the TIE is selected from an IRES sequence, 5’ UTR sequence, Kozak sequence, a sequence containing m6A modification, a sequence complementary to ribosome 18S rRNA, or any combination thereof. In embodiments, the TIE is an Internal Ribosome Entry Site (IRES) .

[0348] “Translation initiation element (TIE) ” as used herein refers to a sequence in the RNA molecule that can initiate the translation of said RNA molecule.

[0349] In some embodiments, the IRES is from RhinovirusB6 strainRvB6 / USA / 2021 / RAS4VQ, Taura syndrome virus, Tiiatoma virus, Theiler’s encephalomyelitis virus, Simian Virus 40, Solenopsis invicta virus 1, Rhopalosiphum padi virus, Reticuloendotheliosis virus, Human poliovirus 1, Plautia stall intestine virus, Kashmir bee virus, Human rhinovirus 2, Homalodisca coagulata virus-1, Human Immunodeficiency Virus type 1, Homalodisca coagulata virus-1, Himetobi P virus, Hepatitis C virus, Hepatitis A virus, Hepatitis GB virus, Foot and mouth disease virus, Human enterovirus 71, Equine rhinitis virus, Ectropis obliqua picoma-like virus, Encephalomyocarditis virus, Drosophila C Virus, Human coxsackievirus B3, Crucifer tobamovirus, Cricket paralysis virus, Bovine viral diarrhea virus 1, Black Queen Cell Virus, Aphid lethal paralysis virus, Avian encephalomyelitis virus, Acute bee paralysis virus, Hibiscus chlorotic ringspot virus, Classical swine fever virus, Human FGF2, Human SFTPA1, Human AML1 / RUNX1, Drosophila antennapedia, Human AQP4, Human AT1R, Human BAG-1, Human BCL2, Human BiP, Human c-IAPl, Human c-myc, Human eIF4G, Mouse NDST4L, Human LEF1, Mouse HIFl alpha, Human n. myc, Mouse Gtx, Human p27kipl, Human PDGF2 / c-sis, Human p53, Human Pim-1, Mouse Rbm3, Drosophila reaper, Canine Scamper, Drosophila Ubx, Human UNR, Mouse UtrA, Human VEGF-A, Human XIAP, Drosophila hairless, S. cerevisiae TFIID, S. cerevisiae YAP1, tobacco etch virus, turnip crinkle virus, EMCV-A, EMCV-B, EMCV-Bf, EMCV-Cf, EMCV pEC9, Picobirnavirus, HCV QC64, Human Cosavirus E / D, Human Cosavirus F, Human Cosavirus JMY, Rhinovirus NAT001, HRV14, HRV89, HRVC-02, HRV-A21, Salivirus A SHI, Salivirus FHB, Salivirus NG-J1, Human Parechovirus 1, Crohivirus B, Yc-3, Rosavirus M-7, Shanbavirus A, Pasivirus A, Pasivirus A 2, Echovirus E14, Human Parechovirus 5, Aichi Virus, Hepatitis A Virus HA 16, Phopivirus, CVA10, Enterovirus C, Enterovirus D, Enterovirus J, Human Pegivirus 2, GBV-C GT110, GBV-C K1737, GBV-C Iowa, Pegivirus A 1220, Pasivirus A 3, Sapelovirus, Rosavirus B, Bakunsa Virus, Tremovirus A, Swine Pasivirus 1, PLV-CHN, Pasivirus A, Sicinivirus, Hepacivirus K, Hepacivirus A, BVDV1, Border Disease Virus, BVDV2, CSFV-PK15C, SF573 Dicistravirus, Hubei Picoma-like Virus, CRPV, Salivirus A BN5, Salivirus A BN2, Salivirus A 02394, Salivirus A GUT, Salivirus A CH, Salivirus A SZ1, Salivirus FHB, CVB3, CVB1, Echovirus 7, CVB5, EVA71, CVA3, CVA12, EV24 or an aptamer to eIF4G.

[0350] In some embodiments, the IRES comprises a RhinovirusB6 strainRvB6 / USA / 2021 / RAS4VQ IRES or a fragment or variant thereof. In certain embodiments, the IRES comprises a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 50 or comprises a nucleotide sequence having at least 75%, e.g., at least 80%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity to SEQ ID NO: 50 or at most 25 mutations (e.g., at most 20 mutations, at most 15 mutations, at most 10 mutations, at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with SEQ ID NO: 50.

[0351] In embodiments, the sequence of interest comprises one or more non-TIE functional element. As used herein, the term “non-TIE functional element” refers to a functional element that is not involved in translation initiation, such as a nucleotide sequence for regulating RNA translation, RNA circularization or RNA transcription. In embodiments, the non-TIE functional element is a 3’ UTR or a replicon.

[0352] In embodiments, the sequence of interest may comprise a spacer C. In embodiments, the spacer C is located between the TIE and the ORF. In some embodiments, the spacer C is no more than 50, no more than 40, no more than 30, no more than 20, no more than 10, no more than 9, no more than 8, no more than 7, no more than 6, no more than 5, no more than 4, or no more than 3 nucleotides in length. In some embodiments, the spacer C is 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, or 2 nucleotides in length.

[0353] In some embodiments, the sequence of interest comprises an IRES sequence, an ORF, and optionally a spacer C located between the IRES sequence and the ORF sequence.

[0354] In some embodiments, the circular RNA polynucleotide further comprises an exon I and / or an exon II.

[0355] In some embodiments, the exon I and the exon II may have the definitions mentioned herein.

[0356] In some embodiments, the exon I and the exon II (or the ribozyme recognition sequence II and the ribozyme recognition sequence I) are involved in or required for RNA circularization by a Group I intron (self-splicing intron) . The exon I and the exon II (or the ribozyme recognition sequence II and the ribozyme recognition sequence I) participate in circularization together with the Group I intron (self-splicing intron) but are retained in the final circular RNA.

[0357] In some embodiments, the exon I and the exon II (or the ribozyme recognition sequence II and the ribozyme recognition sequence I) are covalently linked. In some embodiments, 5’ end of the exon I is covalently linked to 3’ end of the exon II.

[0358] In some embodiments, the exon I and the exon II are derived from 3’ exon and 5’ exon of Group I intron of Staphylococcus phage Twort, respectively. In some embodiments, the exon I comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 316, a nucleotide sequence having at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 316 or a nucleotide sequence having less than 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 nucleotides different from SEQ ID NO: 316; and the exon II comprises or consists of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 319, a nucleotide sequence having at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 319 or a nucleotide sequence having less than 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 nucleotides different from SEQ ID NO: 319. In some embodiments, the exon I is 5 nucleotides, 6 nucleotides, 7 nucleotides, 8 nucleotides, 9 nucleotides, 10 nucleotides, 11 nucleotides, 12 nucleotides, 13 nucleotides, 14 nucleotides, or 15 nucleotides of SEQ ID NO: 316; and the exon II is 5 nucleotides, 6 nucleotides, 7 nucleotides, 8 nucleotides, 9 nucleotides, 10 nucleotides, 11 nucleotides, 12 nucleotides, 13 nucleotides, 14 nucleotides, or 15 nucleotides of SEQ ID NO: 319.

[0359] In embodiments, the ORF at the 5’ end of the sequence of interest comprises the exon I or the linker A sequence at the 5’ end of the ORF. In embodiments, the ORF at the 3’ end of the sequence of interest comprises the exon I or the linker B sequence at the 3’ end of the ORF.

[0360] In some embodiments, the circular RNA polynucleotide further comprises a linker A and / or linker B sequence. In some embodiments, the linker A is located between the exon I and the sequence of interest, and / or the linker B located between the exon II and the sequence of interest. In some embodiments, the linker A and the linker B are partially complementary to each other and together are capable of forming a duplex.

[0361] In aspects of the present invention, the linker A is located 3’ to the exon I. In aspects of the present invention, the linker B is located 5’ to the exon II. In aspects of the present invention, the linker A and linker B comprise homology arms and / or spacers. In embodiments, the linker A and linker B are homology arm sequences capable of complementary pairing to each other to form a homology arm double-stranded region. In embodiments, the linker A and linker B are spacers. In embodiments, linker A and linker B both comprise a homology arm sequence and a spacer. In embodiments, the sequences of said linker A and B are identical. In embodiments, the sequences of said linker A and B are different. In embodiments, said linker A and B are of identical length. In embodiments, the sequences of said linker A and B are of different lengths. In some embodiments, linker A or linker B is about 4 to 400 nucleotides in length (e.g., 50-300 nucleotides in length, 100-200 nucleotides in length, 150-200 nucleotides in length) , about 5-200 nucleotides in length, about 5-150 nucleotides in length, about 5-100 nucleotides in length, about 5-80 nucleotides in length, about 5-50 nucleotides in length, about 5-40 nucleotides in length, about 5-30 nucleotides in length, about 5-20 nucleotides in length, about 5-10 nucleotides in length, preferably, about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 or 300 nucleotides in length.

[0362] In certain embodiments, the linker A and the linker B are completely or partially complementary sequences and together are capable of forming a duplex. In certain embodiments, the linker A and the linker B are non-complementary sequences. In certain embodiments, about 60%, about 50%, about 45%, about 40%, about 35%, about 30%, about 25%, about 20%, about 15%, about 10%of the linker A and / or the linker B may be base paired with one another. In certain embodiments, about 20 nucleotides, about 16 nucleotides, about 15 nucleotides, about 14 nucleotides, about 13 nucleotides, about 12 nucleotides, about 11 nucleotides, about 10 nucleotides, about 9 nucleotides, about 8 nucleotides, about 7 nucleotides, about 6 nucleotides, about 5 nucleotides, about 4 nucleotides, about 3 nucleotides, about 2 nucleotides, about 1 nucleotides of the linker A and / or the linker B may be base paired with one another. In certain embodiments, about 1-20 nucleotides, about 2-15 nucleotides, about 3-14 nucleotides, about 4-13 nucleotides, about 5-12 nucleotides, about 6-11 nucleotides, about 7-10 nucleotides, about 8-9 nucleotides of the linker A and / or the linker B may be base paired with one another. In certain embodiments, the linker A and the linker B are predicted to form a duplex of about 20 base pairs, about 16 base pairs, about 15 base pairs, about 14 base pairs, about 13 base pairs, about 12 base pairs, about 11 base pairs, about 10 base pairs, about 9 base pairs, about 8 base pairs, about 7 base pairs, about 6 base pairs, about 5 base pairs, about 4 base pairs, about 3 base pairs, about 2 base pairs, about 1 base pair in length. In certain embodiments, the linker A and the linker B are predicted to form a duplex of about 1-20 base pairs, about 2-15 base pairs, about 3-14 base pairs, about 4-13 base pairs, about 5-12 base pairs, about 6-11 base pairs, about 7-10 base pairs, about 8-9 base pairs in length. In certain embodiments, the duplex is formed by the 3’ end of the linker A and 5’ end of the linker B. In certain embodiments, the duplex is formed by the 5’ end of the linker A and 3’ end of the linker B.

[0363] In various embodiments, the linker A and the linker B are not predicted to form a duplex of more than 8 base pairs in length with any sequences within 250 nucleotides in either direction. In some embodiments, the linker A and the linker B are not predicted to form a duplex of more than 8 base pairs in length with any sequences within 1000 nucleotides in either direction.

[0364] In some embodiments, the linker A may be absent. In some embodiments, the linker B may be absent. In some embodiments, the linker A and linker B may be absent. In certain embodiments, the linker A comprises a sequence according to SEQ ID NO: 317. In certain embodiments, the linker B comprises a sequence according to SEQ ID NO: 318.

[0365] The circular RNA polynucleotide may be unmodified, partially modified or fully modified. In some embodiments, the circular RNA polynucleotide comprises at least one nucleotide modification. In some embodiments, up to 100%of the nucleotides of the circular RNA polynucleotide are modified. In some embodiments, the at least one nucleotide modification is a cytidine modification, a uridine modification, or an adenosine modification. In some embodiments, the at least one nucleotide modification is selected from the group consisting of 5-methylcytosine (m5C) , N6-methyladenosine (m6A) , pseudouridine (ψ) , N1-methylpseudouridine (m1ψ) and 5-methoxyuridine (5moU) . In one embodiment, the circular RNA comprises less than 100%, less than 90%, less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%, less than 40%, less than 30%, less than 20%, less than 15%, less than 10%, less than 5%, less than 1%of a specific nucleotide modification. As used herein, the percentage of a particular nucleotide modification refers to the ratio of nucleotides in the sequence that have undergone that particular modification to nucleotides that can undergo that particular modification.

[0366] In some preferred embodiments, the circular RNA polynucleotide is unmodified. In some embodiments, the circular RNA polynucleotide does not contain nucleotide modification.

[0367] In some preferred embodiments, the circular RNA polynucleotide or the ORF comprises a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-10, 33-40, 51-60 or 81-88, preferably SEQ ID NOs: 81-88, or a nucleotide sequence with at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 1-10, 33-40, 51-60 or 81-88, preferably SEQ ID NOs: 81-88, or at most 120 amino acid mutations (e.g., at most 110 mutations, at most 100 mutations, at most 90 mutations, at most 80 mutations, at most 70 mutations, at most 60 mutations, at most 50 mutations, at most 45 mutations, at most 40 mutations, at most 35 mutations, at most 30 mutations, at most 25 mutations, at most 20 mutations, at most 15 mutations, at most 10 mutations, at most 5 mutations, at most 4 mutations, at most 3 mutations, at most 2 mutations, or 1 mutation) compared with any one of SEQ ID NOs: 1-10, 33-40, 51-60 or 81-88, preferably SEQ ID NOs: 81-88.

[0368] Preparation of circular RNA polynucleotide

[0369] The circular RNA polynucleotide of the present invention may be prepared by general strategies for RNA circularization methods, such as chemical methods using cyanogen bromide or a similar condensing agent, enzymatic methods using RNA or DNA ligases, and ribozymatic methods using self-splicing introns (Petkovic, S. &Muller, S., “RNA circularization strategies in vivo and in vitro” , Nucleic Acids Research, 43 (4) : 2454-2465 (2015) ; Beadudry, D. &Perreault, J., “An efficient strategy for the synthesis of circular RNA molecules” , Nucleic Acids Research, 23 (15) : 3064-3066 (1995) ; Micura, R., “Cyclic Oligoribonucleotides (RNA) by Solid-Phase Synthesis", Chemistry A European Journal, 5 (7) : 2077-2082 (1999) ) .

[0370] In some embodiments, the circular RNA polynucleotide of the present invention may be prepared by circularizing a circular RNA precursor. The circularization of the circular RNA precursor molecule may be performed by a ribozymatic method using self-splicing introns. In some embodiments, the circularization of the circular RNA precursor molecule may be performed by permutation intron exon (PIE) system or Integrated Catalytic Intron (ICI) system.

[0371] As used herein, "ICI based circularization system” or “ICI system” , used interchangeably, refers to the Integrated Catalytic Intron (ICI) based circularization system of the present invention. For example, a circular RNA precursor molecule may contain the target of interest (TOI) sequence, a Group I Intron, 3’-and 5’-exon sequences, and optionally homology arms and spacers which can facilitate RNA circularization. In one embodiment, the specific conserved sequence at the cleavage site of exon is at its 3’ end is cleaved by the nucleophilic attack of the free 3’ hydroxyl of guanylate, so that the 5’ exon produces a free 3’ hydroxyl. Subsequently, the exposed 3’ hydroxyl of 5’ exon attacks the conserved sequence between the Group I Intron and 3’ exon (e.g., ωG) , and the Group I Intron is excised. Thus the two exons (exon 1 and exon 2) undergo a circularization reaction to obtain the circular RNA.

[0372] As used herein, the terms “cleavage site” , “splice site” and “splicing site” can be used interchangeably.

[0373] "Circular RNA precursor" herein refers to a linear RNA molecule capable of forming a covalently linked closed circular RNA molecule, e.g., by self-splicing. The circular RNA precursor may be produced by transcription from a nucleic acid vector comprising the coding sequence of the circular RNA precursor. Alternatively, the circular RNA precursor may also be obtained by chemical synthesis. As used herein, the terms “circular RNA precursor” and “linear RNA molecule for producing a circular RNA” have the same meaning and refer to the same thing, i.e., a linear RNA molecule capable of forming a covalently linked closed circular RNA molecule, e.g., by self-splicing under the action of the self-splicing intron, and thus they can be interchangeably used in the context of all aspects of the present invention described herein.

[0374] In one aspect, the present invention provides a circular RNA precursor (for generating a circular RNA polynucleotide) , wherein the circular RNA precursor comprises a ribozyme mediated self-cleavage circularization system and a linear form of the circular RNA molecule of the present invention.

[0375] In one aspect, the present invention provides a circular RNA precursor (for generating a circular RNA polynucleotide) , wherein the circular RNA precursor comprises a ribozyme mediated self-cleavage circularization system and a sequence of interest, wherein the sequence of interest comprises an ORF region of the invention, an ORF region coding for the nucleic acid molecule of the invention, or an ORF region encoding the CD19 binding protein or the CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) of the present invention. In some embodiments, the ribozyme mediated self-cleavage system is a ribozyme mediated self-cleavage circularization system.

[0376] The term “circularization system” , as used herein, refers to a nucleic acid sequence that can be manipulated or be spontaneously spliced and ligated under suitable conditions to circularize a nucleic acid sequence adjacent to the circularizing element.

[0377] The ribozyme mediated self-cleavage circularization system may be positioned on either side or both sides of the ORF or the sequence of interest.

[0378] In some embodiments, the ribozyme mediated self-cleavage circularization system may comprise a self-splicing intron derived from Group I or Group II.

[0379] In embodiments for ICI system, the ribozyme mediated self-cleavage circularization system comprises in the 5’ to 3’ direction:

[0380] a) optionally a linker I,

[0381] b) optionally a spacer A,

[0382] c) a self-splicing intron (e.g., a Group I intron) ,

[0383] d) an exon I,

[0384] e) optionally a linker A,

[0385] f) optionally a linker B,

[0386] g) an exon II,

[0387] h) optionally a spacer B, and

[0388] i) optionally a linker II.

[0389] In some embodiments, the sequence of interest or the ORF region coding for the nucleic acid molecule of the invention, or an ORF region encoding the CD19 binding protein or the CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) of the present invention is located between the exon I and the exon II (when the linker A and the linker B are absent) , or between the linker A and the linker B (when the linker A and linker B exist) .

[0390] In some embodiments, the linker I and the linker II are complementary to each other and together are capable of forming a double-stranded region.

[0391] In some embodiments, the spacer A and spacer B are non-complementary sequences and together are capable of forming a non-pairing region.

[0392] In some embodiments, the 5’ end region of the Group I intron is capable of forming the loop and a part of the stem of the P1 structure, the 3’ end region of the exon II is capable of forming the remaining part of the stem of the P1 structure with the 5’ end region of the Group I intron, and the 5’terminal nucleotide of the Group I intron and the 3’ terminal nucleotide of exon II together form the splice site in said P1 structure.

[0393] In some embodiments, the 5’ end region of the exon II and the 3’ end region of the exon I are partially complementary to each other and together are capable of forming an exon duplex.

[0394] In some embodiments, the circular RNA precursor or the sequence of interest further comprises an internal ribosome entry site (IRES) element.

[0395] In some embodiments, the first nucleotide of the 5’ end region of the Group I intron is the nucleotide naturally occurring at the native 5’ splice site of the Group I intron, and the last nucleotide of the 3’ end region of the Group I intron is the nucleotide naturally occurring at the native 3’ splice site of the Group I intron. In preferred embodiments of the circular RNA precursor, the self-splicing intron is a naturally occurring Group I intron.

[0396] In embodiments of the above aspects, the Group I intron comprises a pairing G group and / or a 3’ end G group. In embodiments of the above aspects, said Group I intron forms a U-G base pair with the 3’ end U of exon II. In embodiments of the above aspects, the Group I intron comprises modification compared to the native Group I intron. In embodiments of the above aspects, the Group I intron does not comprise modification compared to the native Group I intron. In embodiments of the above aspects, no modification is located on the sequence forming P1 structure compared to the native Group I intron.

[0397] In aspects and embodiments of the present invention, the Group I intron is or is derived from a native self-splicing intron of the following organisms: Enterobacteriophage T4, Bacteriophage Twort, Bacteriophage SPO1, Bacteriophage S3b, Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, Tetrahymena thermophila, Dunaliella parva, Pneumocystis carinii, Physarum polycephalum, Anabaena sp. PCC7120, Scytonema hofmanni, Agrobacterium tumefaciens, Synechocystis PCC 6803, Synechococcus elongatus PCC 6301, Neurospora crassa, Candida albicans, Scytalidium cerradiumydiaces, Pediadiaces Chlamydomonas nivalis, Chlorella vulgaris, Amoebidium parasiticum, Neurospora crassa, Emericella nidulans, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neochloris aquatica, Dunaliella parva, Symkania negevensis, Emericella nidulans. In aspects and embodiments of the present invention, the Group I intron is or is derived from a Group I self-splicing intron, which can be selected from the following group: cyanobacterium Anabaena Group I Intron such as AnaX, Azoarcus Group I Intron (Azo) , Scytalidium dimidiatum Group I Intron (Sd) , Staphylococcus phage Twort Group I Intron (Twort) , Scytonema-hofmani tRNA fMet group I intron (Sh) , or Agrobacterium-tumefaciens group I intron (At) . In some embodiments, the Group I intron has a sequence with at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity to a native self-splicing intron (without any modification on the sequence forming P1 structure) . In some embodiments, the Group I intron retains the self-splicing activity of the self-splicing intron (anative self-splicing intron) . In some embodiments, the Group I intron retains more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 95%self-splicing activity compared to the (native) full length Group I intron. In some embodiments, the Group I intron is a native full length Group I intron or a Group I intron derived from a native Group I intron which retains more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 95%self-splicing activity compared to the native full length Group I intron.

[0398] In aspects and embodiments of the present invention, the Group I intron is or is derived from a Group I intron selected from Anabaena sp. YBS01, Staphylococcus phage Twort, Ncr. m. ND5, 1, Aaz. b. trnL, Kap. S516, Sce. mL2449, RB3. v. nrdB, 1, Bfu. S1506, Mpl. L798, Pan. m. ND3, 1, Osp. S1199, Azoarcus olearius BH72, Scytalidium dimidiatum, Scytonema-hofmani tRNA fMet, and Agrobacterium-tumefaciens, preferably Anabaena sp. YBS01, Staphylococcus phage Twort, . Azoarcus olearius BH72, Scytonema-hofmani tRNA fMet, Agrobacterium-tumefaciens, Aaz. b. trnL, Kap. S516, Sce. mL2449, RB3. v. nrdB, 1, and Pan. m. ND3, 1.

[0399] In some embodiments, the Group I intron is or is derived from a Group I intron of Staphylococcus phage Twort. In some embodiments, the Group I intron comprises a sequence of SEQ ID NO: 315 or a sequence having at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 315, or a sequence having less than 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 nucleotides different from SEQ ID NO: 315 (without any modification on the sequence forming P1 structure) .

[0400] In aspects and embodiments of the present invention, the 5’-exon and the 5’ end of the intron form a P1 structure containing a ribozyme recognition sequence I, and the 3’-exon and both the 5’ and 3’ ends of the intron form a P10 structure containing a ribozyme recognition sequence II. As used herein, the ribozyme recognition sequence refers to the specific sequence that the ribozyme recognizes in order to achieve self-cleavage / splicing, or the specific structure formed by the participation of this sequence. As used herein, “exon I” and “exon 1” can also be used interchangeably with “3’-exon” , and “exon II” and “exon 2” can be used interchangeably with “5’-exon” . As used herein, in terms of a Group I intron that is used in the aspects and embodiments of the circular RNA precursor of the present invention, “5’-exon” refers to an RNA sequence which is the 3’ terminal portion of a 5’-flanking exon of the Group I intron (e.g., the exon naturally occurring 5’-upstream of the Group I intron) , and “3’-exon” refers to an RNA sequence which is the 5’ terminal portion of a 3’-flanking exon of the Group I intron (e.g., the exon naturally occurring 3’-downstream of the same Group I intron) . According to the present invention, the 5’-exon and 3’-exon are configured in such a way that the 3’ end region of the 5’-exon and the 5’ end region of the Group I intron are capable of forming a P1 structure containing a ribozyme recognition sequence I, and the 5’ end region of the 3’-exon and both the 5’ and 3’ end regions of the Group I intron are capable of forming a P10 structure containing a ribozyme recognition sequence II. In such a P1 structure, the 5’ end region of the intron alone forms a part of the stem-loop structure of the P1 structure. That is, the 5’ end region of the Group I intron itself forms the loop and a part of the stem of the P1 structure, while the 3’ end region of the 5’-exon, by pairing with the 5’ end region of the Group I intron, forms the remaining part of the stem of the P1 structure with the 5’ end region of the Group I intron. The 5’ end region of the 5’-exon (exon II) and the 3’ end region of the 3’-exon (exon I) are partially complementary to each other and together are capable of forming a stem-loop-like structure. The 5’-flanking exon of the Group I intron and the 3’-flanking exon of the Group I intron can independently be either a naturally occurring exon sequence or a modified exon sequence.

[0401] As used herein, "ribozyme recognition sequence" refers to a segment of nucleotide sequence which belongs to a part of the exon. The ribozyme recognition sequence is involved in or required for circularization by the Group I intron and participates in circularization together with the Group I intron but is retained in the final circular RNA. In embodiments, the ribozyme recognition sequence I or II comprises 2 to 50 nucleotides, for example 2 to 40, 2 to 30, 2 to 25, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10 nucleotides, in particular 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 or more nucleotides. In embodiments, the ribozyme recognition sequence I is comprised of 1 to 10 nucleotides, in particular 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 nucleotides. In embodiments, the ribozyme recognition sequence II is comprised of 1 to 10 nucleotides, in particular 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 nucleotides. As used herein, the terms "ribozyme recognition sequence" and “ribozyme recognition site” can be used interchangeably.

[0402] In embodiments, the ribozyme recognition sequence I is capable of connecting with the 5’ end region of the Group I intron, particularly the first nucleotide of the 5’ end region of the Group I intron, and thus forms a P1 structure. In embodiments, the ribozyme recognition sequence II is connected with the 3’ end of the Group I intron. In embodiments, the ribozyme recognition sequence I is located at the 3’ end of the exon II. In embodiments, the ribozyme recognition sequence II is located at the 5’ end of the exon I.

[0403] During the circularization of the circular RNA precursor, the Group I intron and the sequence upstream of its 5’ end (if present) , and the sequence downstream of the 3’ end of the exon II (if present) are excised, and the 5’ end of the exon I and the 3’ end of the exon II are covalently linked to achieve circularization of the RNA. During the circularization of the circular RNA precursor, the ribozyme recognition sequence I is capable of connecting with ribozyme recognition sequence II to form the ribozyme recognition sequence. That is, during the circularization of the circular RNA precursor, the cleavage occurs between the 5’ splice site of the Group I intron and the 3’ end of ribozyme recognition sequence I and between the 3’ splice site of the Group I intron and the 5’ end of ribozyme recognition sequence II.

[0404] As mentioned above, “exon I” or “exon II” is a sequence derived from the native exon of the self-splicing intron (the exon flanking the self-splicing intron) and capable of being recognized and / or spliced by the self-splicing intron (the Group I intron) , and thus is required for circularization.

[0405] In aspects and embodiments of the present invention, the exon II comprises a 3’ end U group. In embodiments of the above aspects, the exon I and / or the exon II comprises modification compared to the native Group I exon. In embodiments of the above aspects, the exon I and / or the exon II does not comprise modification compared to the native Group I exon. In embodiments of the above aspects, the modification is not located on the sequence forming P1 structure compared to the native Group I exon.

[0406] In some embodiments, the 5’ end of the exon I is directly connected to the 3’ end of the Group I intron. In some embodiments, the 5’ end of the exon II is directly connected to the 3’ end of the sequence of interest or the linker B.

[0407] According to the present disclosure, the exon I and exon II each comprise an exon segment. In some embodiments, the exon I is derived from or contains a 3’ exon adjacent to 3’ end of the Group I intron (anative Group I intron) , and accordingly the exon II is derived from or contains a 5’ exon adjacent to 5’ end of the (same) Group I intron (a native Group I intron) (without any modification on the sequence forming P1 structure) . In some embodiments, the exon I, the exon II, and the Group I intron are derived from a same native Group I exon / intron (without any modification on the sequence forming P1 structure) . In some embodiments, the exon I, the exon II and the Group I intron in combination retain the activity of forming a P1 structure containing a ribozyme recognition sequence I and a P10 structure containing a ribozyme recognition sequence I.

[0408] The term “adjacent” and its grammatical equivalents as used herein refers to right next to the object of reference. For example, the term “adjacent” in the context of a nucleotide sequence can mean without any nucleotides in between, i.e., the absence of intervening sequences between two nucleotide sequences.

[0409] In some embodiments, the exon I is derived from the native 3’ exon of the Group I intron (self-splicing intron) (the exon flanking (downstream of) the 3’ end of the self-splicing intron) or a contiguous fragment thereof starting from the 5’ terminal nucleotide. In some embodiments, the exon II is derived from the native 5’ exon of the Group I intron (self-splicing intron) (the exon flanking (downstream of) the 5’ end of the self-splicing intron) or a contiguous fragment thereof starting from the 3’ terminal nucleotide. In some embodiments, the exon I is the native 3’ exon of the Group I intron. In some embodiments, the exon II is the native 5’ exon of the Group I intron. In some embodiments, the exon I and / or exon II are a self-splicing exon segment. In some embodiments, the exon I and / or exon II comprise in part or in whole a naturally occurring exon sequence from a virus, bacterium or eukaryote. In other embodiments, the self-splicing exon segment comprises in part or in whole a non-naturally occurring sequence.

[0410] In some embodiments, the exon I is the entire native 3’ exon of the Group I intron (self-splicing intron) , or has at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity with the entire native 3’ exon of the Group I intron (self-splicing intron) , or has 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 or more nucleotide substitutions, deletions or additions compared to the entire native 3’ exon of the Group I intron (self-splicing intron) , (without any modification on the sequence forming P1 structure) .

[0411] In some embodiments, the exon I is derived from the native 3’ exon of the Group I intron. In some embodiments, the exon I is a contiguous fragment starting from the 5’ terminal nucleotide of the native 3’ exon of the Group I intron (self-splicing intron) . In some embodiments, the exon I has at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity with a contiguous fragment starting from the 5’ terminal nucleotide of the native 3’ exon. In some embodiments, the exon I has 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 or more nucleotide substitutions, deletions or additions compared to a continuous fragment starting from the 5’ terminal nucleotide of the native 3’ exon, (without any modification on the sequence forming P1 structure) .

[0412] In some embodiments, the contiguous fragment starting from the 5’ terminal nucleotide of the native 3’ exon comprises or consists of at least 1%, at least 5%, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%nucleotides of the native 3’ exon. In some embodiments, the contiguous fragment starting from the 5’ terminal nucleotide of the native 3’ exon is about 1-50, 2-30, 3-20, 4-18, 5-15 nucleotides in length. In some embodiments, the contiguous fragment starting from the 5’ terminal nucleotide of the native 3’ exon is at least 1 nucleotide in length, such as at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15 nucleotides, at least 20, at least 25, at least 50 or more nucleotides in length, (without any modification on the sequence forming P1 structure) . In some embodiments, the contiguous fragment starting from the 5’ terminal nucleotide of the native 3’ exon is 1 nucleotide in length or up to 2, up to 3, up to 4, up to 5, up to 6, up to 7, up to 8, up to 9, up to 10, up to 15, up to 20, up to 25, up to 50 nucleotides in length or up to the total length of the native 3’ exon, (without any modification on the sequence forming P1 structure) .

[0413] In some embodiments, the exon I is a contiguous sequence having least 75%identity (e.g., at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity) with the entire native 3’ exon of the Group I intron (self-splicing intron) as described herein, or has 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 or more nucleotide substitutions, deletions or additions compared to the entire native 3’ exon of the Group I intron (self-splicing intron) , including the 3’ nucleotide of the splice site dinucleotide, (without any modification on the sequence forming P1 structure) .

[0414] In some embodiments, where the Group I intron (self-splicing intron) is a Group I intron, the 3’ exon region comprises at least a sequence (such as a sequence of about 1 to about 20 nucleotides) at it 5’ terminus which can pair with the P1 region of the corresponding Group I intron to form a P10 duplex region.

[0415] It is believed that for self-splicing of Group I introns, the consecutive one or more nucleotides (such as at least about 1 to about 7 nucleotides) from the 5’ end of the native 3’ exon can pair with the P1 region to form a P10 duplex region, and thus plays an important role in self-splicing. Definitions of the P1 and P10 regions of Group I introns are known in the art and can be determined, for example, with reference to the following documents: Burke, J.M., et al., (1987) Structural conventions for group I introns; Stahley, R.M., et al (2006) RNA splicing: group I intron crystal structures reveal the basis of splice site selection and metal ion catalysis; and / or Woodson, A. S., (2005) Structure and assembly of group I introns.

[0416] In some embodiments, the exon II is the entire native 5’ exon of the Group I intron (self-splicing intron) , or has at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity with the entire native 5’ exon of the Group I intron, or has 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 or more nucleotide substitutions, deletions or additions compared to the entire native 5’ exon of the Group I intron (self-splicing intron) , (without any modification on the sequence forming P1 structure) .

[0417] In some embodiments, the exon II is derived from the native 5’ exon of the Group I intron. In some embodiments, the exon II is a contiguous fragment starting from the 3’ terminal nucleotide of the native 5’ exon of the Group I intron (self-splicing intron) . In some embodiments, the exon II has at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity with a contiguous fragment starting from the 3’ terminal nucleotide of the native 5’ exon, (without any modification on the sequence forming P1 structure) . In some embodiments, the exon II has 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 or more nucleotide substitutions, deletions or additions compared to a continuous fragment starting from the 3’ terminal nucleotide of the native 5’ exon, (without any modification on the sequence forming P1 structure) .

[0418] In some embodiments, the contiguous fragment starting from the 3’ terminal nucleotide of the native 5’ exon comprises or consists of at least 1%, at least 5%, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%of the nucleotides of the native 5’ exon, (without any modification on the sequence forming P1 structure) . In some embodiments, the contiguous fragment starting from the 3’ terminal nucleotide of the native 5’ exon is at least 1 nucleotide in length, such as at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15 nucleotides, at least 20, at least 25, at least 50 or more nucleotides in length. In some embodiments, the contiguous fragment starting from the 3’ terminal nucleotide of the native 5’ exon is 1 nucleotide in length or up to 2, up to 3, up to 4, up to 5, up to 6, up to 7, up to 8, up to 9, up to 10, up to 15, up to 20, up to 25, up to 50 nucleotides in length or up to the total length of the native 5’ exon, (without any modification on the sequence forming P1 structure) .

[0419] In some embodiments, the exon II is a contiguous sequence at least 75%identity (e.g., at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity) with the entire native 5’ exon of the Group I intron (self-splicing intron) as described herein, or has 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 or more nucleotide substitutions, deletions or additions compared to the entire native 5’ exon of the Group I intron (self-splicing intron) , including the 5’ nucleotide of the splice site dinucleotide, (without any modification on the sequence forming P1 structure) .

[0420] In some embodiments, where the self-splicing intron is a Group I intron, the 5’ exon region comprises a sequence (for example, a sequence of about 3 to about 8 consecutive nucleotides) at its 3’ terminus which can pair with the internal guide sequence (IGS) of the corresponding Group I intron to form a P1 double-stranded region.

[0421] It is believed that for self-splicing of Group I introns, about 3 to about 8 consecutive nucleotides from the 3’ end of the native 5’ exon can pair with the internal guide sequence (IGS) of the intron to form the P1 double-stranded region, thus playing an important role in self-splicing. Definitions of IGS and / or P1 region of Group I introns are known in the art and can be determined, for example, with reference to the following documents: Burke, J.M., et al., (1987) Structural conventions for group I introns; Stahley, R.M., et al (2006) RNA splicing: group I intron crystal structures reveal the basis of splice site selection and metal ion catalysis; and / or Woodson, A. S., (2005) Structure and assembly of group I introns.

[0422] In embodiments, the exon I is derived from any one selected from 3’ exon of Group I intron of Anabaena sp. YBS01, Staphylococcus phage Twort, Ncr. m. ND5, 1, Aaz. b. trnL, Kap. S516, Sce. mL2449, RB3. v. nrdB, 1, Bfu. S1506, Mpl. L798, Pan. m. ND3, 1, Osp. S1199, Azoarcus olearius BH72, Scytalidium dimidiatum, Scytonema-hofmani tRNA fMet, and Agrobacterium-tumefaciens. In embodiments, the exon II is derived from any one selected from 5’ exon of Group I intron of Anabaena sp. YBS01, Staphylococcus phage Twort, Ncr. m. ND5, 1, Aaz. b. trnL, Kap. S516, Sce. mL2449, RB3. v. nrdB, 1, Bfu. S1506, Mpl. L798, Pan. m. ND3, 1, Osp. S1199, Azoarcus olearius BH72, Scytalidium dimidiatum, Scytonema-hofmani tRNA fMet, and Agrobacterium-tumefaciens.

[0423] In some embodiments, the exon I and the exon II are derived from 3’ exon and 5’ exon of Group I intron of Staphylococcus phage Twort, respectively. In some embodiments, the exon I comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 316, a nucleotide sequence having at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 316 or a nucleotide sequence having less than 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 nucleotides different from SEQ ID NO: 316; and the exon II comprises or consists of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 319, a nucleotide sequence having at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 319 or a nucleotide sequence having less than 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 nucleotides different from SEQ ID NO: 319. In some embodiments, the exon I is 5 nucleotides, 6 nucleotides, 7 nucleotides, 8 nucleotides, 9 nucleotides, 10 nucleotides, 11 nucleotides, 12 nucleotides, 13 nucleotides, 14 nucleotides, or 15 nucleotides of SEQ ID NO: 316; and the exon II is 5 nucleotides, 6 nucleotides, 7 nucleotides, 8 nucleotides, 9 nucleotides, 10 nucleotides, 11 nucleotides, 12 nucleotides, 13 nucleotides, 14 nucleotides, or 15 nucleotides of SEQ ID NO: 319.

[0424] In some embodiments, the exon I and the exon II are configured to be capable of forming a stem-loop-like structure. In some embodiments, the loop of the stem-loop-like structure comprises the splicing junction.

[0425] In some embodiments, the presence of the stem-loop-like structure can be predicted and / or determined by the nucleotide sequences of the Group I intron, the exon I and the exon II involved in circularization. In some embodiments, the presence of a stem-loop-like structure can be predicted and / or determined from the nucleotide sequence by RNA structure prediction tools such as RNAfold (http:  / / rna. tbi. univie. ac. at / cgi-bin / RNAWebSuite / RNAfold. cgi) or RNAstructure (https:  / / rna. urmc. rochester. edu / RNAstructureWeb / index. html) .

[0426] In some embodiments, the exon I comprises the sequence structure of the following formula: 5’-first loop sequence-first pairing sequence-first non-pairing sequence-3’ ; and the exon II comprises the sequence structure of the following formula: 5’-second non-pairing sequence-second pairing sequence-second loop sequence-3’ , wherein the first non-pairing sequence or the second non-pairing sequence may be independently present or absent, and the first pairing sequence and the second pairing sequence can complementarily pair to each other to form the stem of the stem-loop-like structure, which also called as “an exon duplex” , wherein the first loop sequence of exon I and the second loop sequence of exon II can form the loop of the stem-loop-like structure, e.g., through self-splicing for circularization.

[0427] Typically, the sequences forming the loop of the stem-loop-like structure are derived from the 3’ exon (the exon I) and / or the 5’ exon region (the exon II) .

[0428] In some embodiments, where the Group I intron is a Group I intron, the first loop sequence of exon I comprises or consists of one or more nucleotides (for example, about 1 to about 20 nucleotides) which can pair with the P1 region of the corresponding Group I intron (or the structure formed by the Group I intron) to form a P10 duplex region during the circularization.

[0429] In some embodiments, the first loop sequence of exon I may comprise or consist of a nucleotide sequence of (N) n, wherein N represents any nucleotide (A, G, U, or C) , n represents an integer from 1-20, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20. In some specific embodiments, n is 2, 4, or 5.

[0430] In some embodiments, the first loop sequence of exon I comprises or consists of the about 1 to about 7 consecutive nucleotides starting from the 5’ terminal nucleotide of the native 3’ exon of the Group I intron.

[0431] In some embodiments, where the Group I intron is a Group I intron, the second loop sequence of exon II comprises or consists of one or more nucleotides (about 3 to about 8 nucleotides) which can pair with the internal guide sequence (IGS) of the corresponding Group I intron (or the structure formed by the Group I intron) to form a P1 duplex region during the circularization.

[0432] In some embodiments, the second loop sequence of exon II comprises or consists of the about 3 to about 8 consecutive nucleotides starting from the 3’ terminal nucleotide of the native 5’ exon of the Group I intron.

[0433] In some embodiments, the second loop sequence of exon II for example comprises or consists of CAU.

[0434] The pairing sequences forming the stem of the stem-loop-like structure may be derived from the exon regions, however, it may also be derived from the spacer sequences. Alternatively, the pairing sequence may be derived from an exon region and a linker sequence, i.e., the pairing sequence comprises at least a portion of an exon region and at least a portion of the linker.

[0435] Without being bound by any theory, the RNA circularization efficiency based on intron self-splicing (e.g., Group I intron self-splicing) is related to the number of base pairs or the type or composition of base pairs in the stem portion of the stem-loop-like structure formed by the residual circularizing element. The stability of the stem-loop-like structure (e.g., as can be predicted from calculated free energies) may affect the circularization efficiency.

[0436] In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure (i.e. exon duplex) comprises at least 2 base pairs, such as at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15 or more base pairs, such as 2-30 base pairs, such as 2-25 base pairs, such as 2-20 base pairs, such as 2-15 base pairs, such as 2-10 base pairs, such as 5-30 base pairs, such as 5-25 base pairs, such as 5-20 base pairs, such as 5-15 base pairs, such as 5-10 base pairs, preferably consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 2-15 or more consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 3-15 or more consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 4-15 or more consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 5-15 or more consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 6-15 or more consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 7-15 or more consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 8-15 or more consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 9-15 or more consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 10-15 or more consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 11-15 or more consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 12-15 or more consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 13-15 or more consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 14-15 or more consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 base pairs, preferably consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 5 base pairs, preferably consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 6 base pairs, preferably consecutive matched base pairs. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises 7 base pairs, preferably consecutive matched base pairs.

[0437] In some embodiments, the stem portion in the stem-loop-like structure comprises up to 2 base mismatches, or up to 1 base mismatch, preferably, the stem portion comprises no base mismatches.

[0438] In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises less than about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 100%GC content. In some embodiments, the stem portion of the stem-loop-like structure comprises about 10%-60%, 20-50%, or 30-40%GC content.

[0439] In aspects of the present invention, the linker I sequence and the linker II sequence are functional sequences which can improve circularization. For example, linker I and linker II are homology arm sequences capable of complementary pairing to each other to form a homology arm double-stranded region. In some embodiments, the linker I sequence is a homology arm I. In some embodiments, the linker II sequence is a homology arm II.

[0440] As used herein, the terms “linker I (or linker I sequence) ” and “homology arm I” have the same meaning and refer to the same thing, and thus they can be interchangeably used in the context of all aspects of the present invention described herein. As used herein, the terms “linker II (or linker II sequence) ” and “homology arm II” have the same meaning and refer to the same thing, and thus they can be interchangeably used in the context of all aspects of the present invention described herein. The linker I (homology arm I) and the linker II (homology arm II) may be of the same or different length, as long as they are complementary to each other and together are capable of forming a double-stranded region. In some embodiments of the present invention, in the double-stranded region formed by the linker I (homology arm I) and the linker II (homology arm II) described herein, the 3’ end nucleotide of the linker I (homology arm I) forms a base pair with the 5’ end nucleotide of the linker II (homology arm II) . In embodiments, one base pair in the double-stranded region is formed by the 3’ end nucleotide of the linker I and the 5’ end nucleotide of the linker II.

[0441] In some embodiments, linker I is upstream of the self-splicing intron and linker II is downstream of the 5’ exon. In some embodiments, the linker I sequence is located at the 5’ end of the circular RNA precursor. In some embodiments, the linker II sequence is located at the 3’ end of the circular RNA precursor. In some embodiments, the linker I sequence is adjacent or very close to the Group I intron.

[0442] In certain embodiments, the linker I sequence and the linker II sequence are completely or partially complementary sequences. Thus, in certain embodiments, at least 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%of the linker I sequence and the linker II sequence may be base paired with one another.

[0443] In some embodiments, the predicted mean minimum free energy (MFE) of the linker I sequence and the linker II sequence (the homology arms) is more than about-2.0 kal / mol, more than about-1.5 kal / mol, more than about -1.4 kal / mol, more than about -1.3 kal / mol, more than about -1.2 kal / mol, more than about -1.1 kal / mol, more than about -1.0 kal / mol, more than about -0.9 kal / mol, or more than about -0.8 kal / mol. In some embodiments, the predicted mean minimum free energy (MFE) of the linker I sequence and the linker II sequence (the homology arms) is from about -2.0 kal / mol to about -0.8 kal / mol. In some embodiments, the predicted mean minimum free energy (MFE) of the linker I sequence and the linker II sequence (the homology arms) is from about -1.5 kal / mol to about -1.0 kal / mol. In some embodiments, the predicted mean minimum free energy (MFE) of the linker I sequence and the linker II sequence (the homology arms) is from about -1.2 kal / mol to about -1.0 kal / mol. In some embodiments, the predicted mean minimum free energy (MFE) of the linker I sequence and the linker II sequence (the homology arms) is from about -1.1 kal / mol to about -1.0 kal / mol. The minimum free energy can be determined, for example, by RNAfold (http:  / / rna. tbi. univie. ac. at / cgi-bin / RNAWebSuite / RNAfold. cgi) or RNAstructure (https:  / / rna. urmc. rochester. edu / RNAstructureWeb / index. html) Structure Prediction Tool.

[0444] In some embodiments, linker I and / or linker II is about 4 to 400 nucleotides in length (e.g., 50-300 nucleotides in length, 100-200 nucleotides in length, 150-200 nucleotides in length) , about 5-200 nucleotides in length, about 5-150 nucleotides in length, about 5-100 nucleotides in length, about 5-80 nucleotides in length, about 5-50 nucleotides in length, about 5-40 nucleotides in length, about 5-30 nucleotides in length, about 5-20 nucleotides in length, about 5-10 nucleotides in length, preferably, about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 or 300 nucleotides in length. In some embodiments, linker I and / or linker II is less than 400, less than 350, less than 300, less than 250, less than 200, less than 150, less than 100, less than 50, less than 40, less than 30 nucleotides in length.

[0445] In some embodiments, the linker I and the linker II are homology arm sequences capable of complementary pairing to each other to form a double-stranded region. In some embodiments, double-stranded region is about 4 to 400 base pairs (e.g., 50-300 base pairs, 100-200 base pairs, 150-200 base pairs) , about 5-200 base pairs, about 5-150 base pairs, about 5-100 base pairs, about 5-80 base pairs, about 5-50 base pairs, about 5-40 base pairs, about 5-30 base pairs, about 5-20 base pairs, about 5-10 base pairs, preferably, about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 or 300 base pairs, preferably consecutive matched base pairs. In some embodiments, the double-stranded region is less than 400, less than 350, less than 300, less than 250, less than 200, less than 150, less than 100, less than 50, less than 40, less than 30 base pairs, preferably consecutive matched base pairs.

[0446] In certain embodiments, the linker I comprises a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 313, a nucleotide sequence having at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 313 or a nucleotide sequence having less than 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 nucleotides different from SEQ ID NO: 313. In certain embodiments, the linker II comprises a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 320, a nucleotide sequence having at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity with SEQ ID NO: 320 or a nucleotide sequence having less than 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 nucleotides different from SEQ ID NO: 320. In certain embodiments, the linker I is 30 nucleotides, 40 nucleotides, 50 nucleotides, 100 nucleotides, 150 nucleotides, 200 nucleotides, 250 nucleotides, 300 nucleotides of SEQ ID NO: 313. In certain embodiments, the linker II is 30 nucleotides, 40 nucleotides, 50 nucleotides, 100 nucleotides, 150 nucleotides, 200 nucleotides, 250 nucleotides, 300 nucleotides of SEQ ID NO: 320. In certain embodiments, the linker I comprises a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 313, and the linker II comprises a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 320.

[0447] In some embodiments, the circular RNA polynucleotide further comprises a linker A and / or linker B sequence. In some embodiments, the linker A is located between the exon I and the sequence of interest, and / or the linker B located between the exon II and the sequence of interest. In some embodiments, the linker A and the linker B are partially complementary to each other and together are capable of forming a duplex.

[0448] In aspects of the present invention, the linker A is located 3’ to the exon I. In aspects of the present invention, the linker B is located 5’ to the exon II. In aspects of the present invention, the linker A and linker B comprise homology arms and / or spacers. In embodiments, the linker A and linker B are homology arm sequences capable of complementary pairing to each other to form a homology arm double-stranded region. In embodiments, the linker A and linker B are spacers. In embodiments, linker A and linker B both comprise a homology arm sequence and a spacer. In embodiments, the sequences of said linker A and B are identical. In embodiments, the sequences of said linker A and B are different. In embodiments, said linker A and B are of identical length. In embodiments, the sequences of said linker A and B are of different lengths. In some embodiments, linker A or linker B is about 4 to 400 nucleotides in length (e.g., 50-300 nucleotides in length, 100-200 nucleotides in length, 150-200 nucleotides in length) , about 5-200 nucleotides in length, about 5-150 nucleotides in length, about 5-100 nucleotides in length, about 5-80 nucleotides in length, about 5-50 nucleotides in length, about 5-40 nucleotides in length, about 5-30 nucleotides in length, about 5-20 nucleotides in length, about 5-10 nucleotides in length, preferably, about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 or 300 nucleotides in length.

[0449] In certain embodiments, the linker A and the linker B are completely or partially complementary sequences and together are capable of forming a duplex. In certain embodiments, the linker A and the linker B are non-complementary sequences. In certain embodiments, about 60%, about 50%, about 45%, about 40%, about 35%, about 30%, about 25%, about 20%, about 15%, about 10%of the linker A and / or the linker B may be base paired with one another. In certain embodiments, about 20 nucleotides, about 16 nucleotides, about 15 nucleotides, about 14 nucleotides, about 13 nucleotides, about 12 nucleotides, about 11 nucleotides, about 10 nucleotides, about 9 nucleotides, about 8 nucleotides, about 7 nucleotides, about 6 nucleotides, about 5 nucleotides, about 4 nucleotides, about 3 nucleotides, about 2 nucleotides, about 1 nucleotides of the linker A and / or the linker B may be base paired with one another. In certain embodiments, about 1-20 nucleotides, about 2-15 nucleotides, about 3-14 nucleotides, about 4-13 nucleotides, about 5-12 nucleotides, about 6-11 nucleotides, about 7-10 nucleotides, about 8-9 nucleotides of the linker A and / or the linker B may be base paired with one another. In certain embodiments, the linker A and the linker B are predicted to form a duplex of about 20 base pairs, about 16 base pairs, about 15 base pairs, about 14 base pairs, about 13 base pairs, about 12 base pairs, about 11 base pairs, about 10 base pairs, about 9 base pairs, about 8 base pairs, about 7 base pairs, about 6 base pairs, about 5 base pairs, about 4 base pairs, about 3 base pairs, about 2 base pairs, about 1 base pair in length. In certain embodiments, the linker A and the linker B are predicted to form a duplex of about 1-20 base pairs, about 2-15 base pairs, about 3-14 base pairs, about 4-13 base pairs, about 5-12 base pairs, about 6-11 base pairs, about 7-10 base pairs, about 8-9 base pairs in length. In certain embodiments, the duplex is formed by the 3’ end of the linker A and 5’ end of the linker B. In certain embodiments, the duplex is formed by the 5’ end of the linker A and 3’ end of the linker B.

[0450] In various embodiments, the linker A and the linker B are not predicted to form a duplex of more than 8 base pairs in length with any sequences within 250 nucleotides in either direction. In some embodiments, the linker A and the linker B are not predicted to form a duplex of more than 8 base pairs in length with any sequences within 1000 nucleotides in either direction.

[0451] In some embodiments, the linker A may be absent. In some embodiments, the linker B may be absent. In some embodiments, the linker A and linker B may be absent. In certain embodiments, the linker A comprises a sequence according to SEQ ID NO: 317. In certain embodiments, the linker B comprises a sequence according to SEQ ID NO: 318.

[0452] As used herein, “exon I” , “exon II” , “exon I / II” can be used interchangeably with “exon 1” , “exon 2” or “exon 1 / 2” . As used herein, “exon I” , “exon 1” , and “3’ exon” can be used interchangeably. As used herein, “exon II” , “exon 2” , and “5’ exon” can be used interchangeably. As used herein, “Group I / II intron” and “self-splicing intron” can also be used interchangeably with “ribozyme” . As used herein, the “target of interest” or “TOI” can be used interchangeably with the “sequence of interest” .

[0453] As used herein, "spacer" refers to any contiguous nucleotide sequence that at least does not negatively interfere with the function of the elements it connects. Generally, if it is desired to avoid the interaction of two near or adjacent elements, a spacer can be inserted between the two elements. The spacer sequences described herein can serve two functions: (1) to facilitate circularization and (2) to facilitate functionality by allowing correct folding of the residual circularizing element and the nucleotide sequence of interest (e.g., IRES) . In some embodiments, the spacer is no more than 150, no more than 100, no more than 50, no more than 30, no more than 10, no more than 5, or no more than 3 nucleotides in length. In some embodiments, the spacer is 5 nucleotides in length. In some embodiments, the spacer is 4 nucleotides in length. In some embodiments, the spacer is 3 nucleotides in length.

[0454] In all aspects of the present invention described herein, the spacer A and spacer B are non-complementary to each other. In embodiments of the above aspects, spacer A and spacer B do not form any base pair between each other and thus together are capable of forming a non-pairing region. Accordingly, in some embodiments of the present invention described herein, the double-stranded region formed by the linker I and the linker II and the non-pairing region formed by the spacer A and spacer B together are capable of forming a stem-loop-like structure.

[0455] In embodiments, spacer A and spacer B have the same or different length. In embodiments, said spacer A and B have same length. In embodiments, said spacer A and B have different length. In embodiments, the sequences of said spacer A and B are identical. In embodiments, the sequences of said spacer A and B are different. In some embodiments, the spacer A is located at the 3’ end of the linker A. In some embodiments, the spacer B is located at the 5’ end of the linker B. In some embodiments, the spacer A and the spacer B are each 2 to 150 nucleotides in length (e.g., 4-50 nucleotides in length, 6-30 nucleotides in length, 8-20 nucleotides in length, 10-15 nucleotides in length, 2-15 nucleotides in length, 4-15 nucleotides in length) . In some embodiments, the spacer A and the spacer B are each at least 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 70, 90, 100, 130, or 150 nucleotides in length. In some embodiments, the spacer A and the spacer B are each about 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 or 50 nucleotides in length. In some embodiments, the spacer A and the spacer B are each no more than 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, or 30 nucleotides in length. In some embodiments, the spacer A and the spacer B are each between 4 and 50, 10 and 50, 20 and 50, 20 and 40, and / or 25 and 35 nucleotides in length. In certain embodiments, the spacer A and the spacer B are each 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 or 50 nucleotides in length. In some embodiments, the spacer sequence is at least 4 nucleotides in length, and / or about 4 to about 60 nucleotides in length. In some embodiments, the spacer A and spacer B are each about 4-20 nucleotides in length.

[0456] In some embodiments, the spacer A and the spacer B do not interfere, inhibit or disrupt the formation of the functional P1 structure formed by the exon II and the 5’ end of the intron. In some embodiments, the spacer A and / or the spacer B comprises polyA, polyU, polyAC, polyC or polyG. In some embodiments, the spacer A and / or the spacer B is a polyA sequence. In some embodiments, the spacer A and / or the spacer B is a polyAC sequence. In some embodiments, the spacer A and / or the spacer B are unstructured sequences or non-interfering P1 sequences.

[0457] The term “polyA” , as used herein, is an abbreviation of polyadenylation and refers to a sequence comprising consecutive adenine nucleotides with a length of at least 2.

[0458] As used herein, “structured” with regard to RNA refers to an RNA sequence that is predicted by the RNAFold software or similar predictive tools to form a structure (e.g., a hairpin loop) with itself or other sequences in the same RNA molecule. As used herein, “unstructured” with regard to RNA refers to an RNA sequence that is not predicted by RNA structure predictive tools to form a structure (e.g., a hairpin loop) with itself or other sequences in the same RNA molecule. In some embodiments, unstructured RNA can be functionally characterized using nuclease protection assays.

[0459] In some embodiments, the spacer A and / or the spacer B comprises or consists of a sequence selected from SEQ ID NO: 314.

[0460] In embodiments for “seamless ICI” system, the circular RNA precursor comprising in the 5’ to 3’ direction:

[0461] a) a linker I,

[0462] b) a spacer A,

[0463] c) a Group I intron,

[0464] d) a TOI sequence,

[0465] e) a spacer B, and

[0466] f) a linker II,

[0467] wherein the linker I and the linker II are complementary to each other and together are capable of forming a double-stranded region,

[0468] wherein the spacer A and spacer B are non-complementary sequences and together are capable of forming a non-pairing region,

[0469] wherein the 5’ end region of the Group I intron is capable of forming the loop and a part of the stem of the P1 structure, the 3’ end region of the TOI sequence is capable of forming the remaining part of the stem of the P1 structure, and the 5’ terminal nucleotide of the Group I intron and the 3’ terminal nucleotide of TOI sequence together form the splice site in said P1 structure. In embodiments, the 3’ end region of the TOI sequence and the 5’ end region of the Group I intron are capable of forming a P1 structure containing a ribozyme recognition sequence I, and wherein the 5’ end region of the TOI and both the 5’ and 3’ end regions of the Group I intron are capable of forming a P10 structure containing a ribozyme recognition sequence II.

[0470] In embodiments, the sequence of interest comprises a first fragment of the sequence of interest at its 3’ end and a second fragment of the sequence of interest at its 5’ end,

[0471] In embodiments, the first fragment of the sequence of interest and the second fragment of the sequence of interest are respectively derived from a 5’ terminal portion and a 3’ terminal portion of an ORF sequence, a TIE or a non-TIE functional element,

[0472] In embodiments, the first fragment of the sequence of interest comprises a ribozyme recognition sequence I located at its 3’ end, the second fragment of the sequence of interest comprises a ribozyme recognition sequence II located at its 5’ end,

[0473] In embodiments, in the circular RNA generated upon self-cleavage and circularization of the circular RNA precursor, the 3’ end of the ribozyme recognition sequence I is connected with the 5’ end of the ribozyme recognition sequence II,

[0474] In embodiments, the linker I and the linker II are complementary to each other and together are capable of forming a double-stranded region,

[0475] In embodiments, the spacer A and spacer B are non-complementary sequences and together are capable of forming a non-pairing region,

[0476] In embodiments, the 5’ end region of the Group I intron is capable of forming the loop and a part of the stem of the P1 structure, wherein the 3’ end region of the ribozyme recognition sequence I is capable of forming the remaining part of the stem of the P1 structure with the 5’ end region of the Group I intron, and

[0477] In embodiments, the 5’ end region of the ribozyme recognition sequence I and the 3’ end region of the ribozyme recognition sequence II are partially complementary to each other and together are capable of forming an exon duplex or a first stem-loop-like structure.

[0478] In embodiments, in the circular RNA generated upon self-cleavage and circularization of the circular RNA precursor, the 3’ end of the first fragment of the sequence of interest is connected with the 5’ end of the second fragment of the sequence of interest to form the complete ORF sequence, TIE or non-TIE functional element.

[0479] The linker I, linker II, spacer A, spacer B, Group I intron, ORF, TIE, non-TIE functional element, ribozyme recognition sequence I, ribozyme recognition sequence II may have the definitions mentioned above.

[0480] In embodiments, a ribozyme recognition sequence I is located at the 3’ end of the sequence of interest, and a ribozyme recognition sequence II is located at the 5’ end of the sequence of interest.

[0481] For the seamless ICI system, “ribozyme recognition sequence II” can be used interchangeably with the term “exon I” defined herein, while “ribozyme recognition sequence I” can be used interchangeably with the term “exon II” defined herein.

[0482] For the seamless ICI system, the sequence of interest is scanned for sequences that are homologous to ribozyme recognition sequence II and / or ribozyme recognition sequence I, thereby allowing splicing to occur without introducing any exon sequence heterogenous to the sequence of interest in the produced circular RNA.

[0483] In embodiments for PIE system, in some embodiments, the self-splicing intron comprises a first intron sequence on the 5’ of the ribozyme mediated self-cleavage circularization system and a second intron sequence on the 3’ of the ribozyme mediated self-cleavage circularization system.

[0484] In some embodiments, the self-splicing intron may be derived from Group I intron, wherein the first intron sequence may comprise a 3’ group I intron fragment and the second intron sequence may comprise a 5’ group I intron fragment. In some embodiments, the Group I intron may have the definitions mentioned herein.

[0485] In embodiments for ICI system, the ribozyme mediated self-cleavage circularization system comprises in the 5’ to 3’ direction:

[0486] a) optionally a linker I,

[0487] b) optionally a spacer A,

[0488] c) a 3’ self-splicing intron fragment (such as 3’ group I intron fragment) ,

[0489] d) an exon I,

[0490] e) optionally a linker A,

[0491] f) optionally a linker B,

[0492] g) an exon II,

[0493] h) 5’ self-splicing intron fragment (such as 5’ group I intron fragment) ,

[0494] i) optionally a spacer B, and

[0495] j) optionally a linker II.

[0496] In some embodiments, the 3’ group I intron fragment has 75%or higher sequence identity (such as 80%, 85%, 90%, 95%or 100%) to the 3’ proximal end of a natural group I intron, including the splice site dinucleotide and optionally the adjacent exon sequence. The adjacent exon sequence may have at least 1 nucleotide in length (e.g., at least 5 nucleotides in length, at least 10 nucleotides in length, at least 15 nucleotides in length, at least 20 nucleotides in length, at least 25 nucleotides in length, or at least 30 nucleotides in length) . In some embodiments, the 3’ group I intron fragment is as set forth in SEQ ID NO: 321.

[0497] In some embodiments, the 5’ group I intron fragment has 75%or higher sequence identity (such as 80%, 85%, 90%, 95%or 100%) to the 3’ proximal end of a natural group I intron, including the splice site dinucleotide and optionally the adjacent exon sequence. The adjacent exon sequence may have at least 1 nucleotide in length (e.g., at least 5 nucleotides in length, at least 10 nucleotides in length, at least 15 nucleotides in length, at least 20 nucleotides in length, at least 25 nucleotides in length, or at least 30 nucleotides in length) . In some embodiments, the 5’ group I intron fragment is as set forth in SEQ ID NO: 322.

[0498] For PIE system, during the circularization of the circular RNA precursor comprising Group I intron self-splicing sequences, the circular RNA precursor undergoes the double trans esterification reactions characteristic of group I catalytic introns. Firstly, 3’ OH of a free guanine nucleoside (or one located in the intron) or a nucleotide cofactor (GMP, GDP, GTP) attacks phosphate at the splice site in the 5’ group I intron fragment and results in a break. Then the 3’ OH of the break attacks phosphate at the splice site in the 3’ group I intron fragment and triggers the second transesterification, thereby joining the circularization unit together.

[0499] The circular RNA precursor may further comprise additional elements, such as elements that can facilitate the circularization of the circular RNA precursor and / or the translation of the protein coding region.

[0500] The circular RNA precursor may be (e.g., chemically) unmodified, partially modified or fully modified. In some embodiments, the circular RNA precursor comprises at least one nucleotide modification. In some embodiments, up to 100%of the nucleotides of the circular RNA precursor are modified. In some embodiments, the at least one nucleotide modification is a cytidine modification, an uridine modification, or an adenosine modification. In some embodiments, the at least one nucleoside modification is selected from the group consisting of 5-methylcytosine (m5C) , N6-methyladenosine (m6A) , pseudouridine (ψ) , N1-methylpseudouridine (m1ψ) and 5-methoxyuridine (5moU) . In some embodiments, the circular RNA precursor comprises less than 100%, less than 90%, less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%, less than 40%, less than 30%, less than 20%, less than 15%, less than 10%, less than 5%, less than 1%of a specific nucleotide modification. As used herein, the percentage of a particular nucleotide modification refers to the ratio of nucleotides in the sequence that have undergone that particular modification to nucleotides that can undergo that particular modification.

[0501] In some preferred embodiments, the circular RNA precursor is unmodified. In some embodiments, the circular RNA precursor does not contain nucleotide chemical modification.

[0502] In some preferred embodiments, the circular RNA precursor comprises a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 89-96 or 211-220, preferably SEQ ID NOs: 89-96, or a nucleotide sequence with at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%or 100%sequence identity to any one of SEQ ID NOs: 89-96 or 211-220, preferably SEQ ID NOs: 89-96.

[0503] In embodiments of the above aspect, the circular RNA precursor of the invention allows generation of a circular RNA comprising the exon I, optionally the linker A, the sequence of interest, optionally the linker B, and the exon II through the self-splicing of the circular RNA precursor.

[0504] The circular RNA precursor may be circularized under suitable conditions, which depend on the specific circularizing strategy and are known to those skilled in the art. For example, the condition for circularizing a circular RNA precursor comprising Group I intron self-splicing sequences may be in the presence of magnesium ions and guanosine nucleotide or nucleoside and under a temperature at which RNA circularization occurs (e.g., between about 20℃ and about 60℃) .

[0505] The circularization of the circular RNA precursor may be performed in vitro. Alternatively, the circularization of the circular RNA precursor may be performed in a cell, wherein the circular RNA precursor may be introduced into a cell or a DNA template for the circular RNA precursor may be introduced into a cell to be transcribed to the circular RNA precursor, then the circular RNA precursor is circularized in the cell.

[0506] The term “transcribe” , “transcribing” or “transcription” , as used herein, means the formation or synthesis of an RNA molecule by an RNA polymerase using a DNA molecule as a template. The RNA polymerase that can be used in the present invention includes, but is not limited to, T7-type RNA polymerase.

[0507] The circular RNA precursor of the present invention may be artificially synthesized or be obtained by transcription from a DNA template.

[0508] The DNA template may be comprised in a vector.

[0509] In another aspect, the present invention also provides a nucleic acid vector for generating a circular RNA molecule, said vector comprising a coding sequence of the circular RNA precursor of the invention.

[0510] The nucleic acid vector of the present invention comprises a transcription unit, which is a polynucleotide sequence that can be transcribed to the circular RNA precursor. The vector may further comprise a promoter that initiate the transcription of the transcription unit. The promoter may be located upstream of and adjacent to the transcription unit. The promoter may be an RNA polymerase promoter. In embodiments of the above aspect, the nucleic acid vector further comprises a promoter sequence operably linked to the coding sequence of the circular RNA precursor. The operably linked promoter allows in vivo and / or in vitro transcription of the circular RNA precursor. The promoter is, for example, a T7 RNA polymerase promoter, a T6 viral RNA polymerase promoter, a SP6 viral RNA polymerase promoter, a T3 viral RNA polymerase promoter or a T4 viral RNA polymerase promoter.

[0511] In embodiments of the above aspect, the nucleic acid vector further comprises an RNA polymerase promoter. In some embodiments, the RNA polymerase promoter is operably linked to the coding sequence of the circular RNA precursor.

[0512] Nucleic acid vectors may be introduced into the desired host cells by methods known in the art, e.g., transfection, electroporation, microinjection, transduction, cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate precipitation, lipofection (lysosome fusion) , use of a gene gun, or a DNA vector transporter (see, e.g., Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963 (1992) ; Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621 (1988) ; and Hartmut et al., Canadian Patent Application No. 2, 012, 311) .

[0513] The nucleic acid vector of the present invention may be a DNA construct, such as a plasmid, or a viral vector.

[0514] The elements in the circular RNA, the circular RNA precursor or the nucleic acid vector of the present invention are operably linked to each other.

[0515] In some embodiments, the present invention relates to a method of producing a circular RNA polynucleotide, the method comprising allowing the circular RNA precursor of the invention to undergo circularization to produce the circular RNA polynucleotide.

[0516] The method may be performed in vitro (i.e., in a cell-free system) or in a cell. The circularization step may be performed in vitro or in a cell. In vitro methods are known to the skilled person. For example, there are a number of commercially available in vitro transcription kits.

[0517] In some embodiments, artificially synthesized circular RNA precursor is introduced into a host cell, and the circular RNA precursor is circularized in the cell to obtain the circular RNA. In some embodiments, the vector provided herein is introduced into a host cell and is transcribed in the cell to the circular RNA precursor, and the circular RNA precursor is circularized in the cell to obtain the circular RNA.

[0518] In another aspect, the present invention provides a method for preparing a circular RNA polynucleotide, the method comprises:

[0519] 1) providing the circular RNA precursor of the invention or obtaining a circular RNA precursor by transcribing from the nucleic acid vector of the invention;

[0520] 2) incubating the circular RNA precursor under the conditions allowing autocatalytic circularization to generate a circular RNA polynucleotide; and

[0521] 3) harvesting the circular RNA polynucleotide obtained in step 2) .

[0522] In another aspect, the present invention provides a method for preparing a circular RNA polynucleotide, comprising:

[0523] (a) providing a circular RNA precursor of the invention,

[0524] (b) allowing the RNA precursor to undergo intramolecular self-cleavage, thereby generating the circular RNA polynucleotide, and

[0525] (c) recovering or enriching the circular RNA polynucleotide generated from step (b) .

[0526] In particular embodiments, polynucleotides of the nucleic acid molecule or the nucleic acid vector, the circular RNA precursor, or the circular RNA polynucleotide may be codon-optimized. A codon-optimized sequence may be one in which codons in a polynucleotide encoding a polypeptide have been substituted in order to increase the expression, stability and / or activity of the polypeptide. Factors that influence codon optimization include, but are not limited to one or more of: (i) variation of codon biases between two or more organisms or genes or synthetically constructed bias tables, (ii) variation in the degree of codon bias within an organism, gene, or set of genes, (iii) systematic variation of codons including context, (iv) variation of codons according to their decoding tRNAs, (v) variation of codons according to GC%, either overall or in one position of the triplet, (vi) variation in degree of similarity to a reference sequence for example a naturally occurring sequence, (vii) variation in the codon frequency cutoff, (viii) structural properties of mRNAs transcribed from the DNA sequence, (ix) prior knowledge about the function of the DNA sequences upon which design of the codon substitution set is to be based, and / or (x) systematic variation of codon sets for each amino acid. In some embodiments, a codon optimized polynucleotide may minimize ribozyme collisions and / or limit structural interference between the expression sequence and the core functional element. Codon optimization can be performed by methods known in the art.

[0527] Method

[0528] In one aspect, the present invention provides a method for expressing a CD19 binding protein or a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) in a cell, comprising introducing the nucleic acid molecule of the present invention, the vector of the present invention, the circular RNA polynucleotide of the present invention, the circular RNA precursor of the present invention, or the nucleic acid vector of the present invention into the cell. In some embodiments, the method is performed in vivo, in vitro or ex vivo.

[0529] The nucleic acid molecule, the vector, the circular RNA polynucleotide, the circular RNA precursor, or the nucleic acid vector may be introduced into the host cell by methods known in the art, e.g., electroporation, microinjection, transduction, cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate precipitation, lipofection (lysosome fusion) , or use of a gene gun.

[0530] In some embodiments, in order to express protein in a cell, the nucleic acid molecule, the vector, the circular RNA polynucleotide, the circular RNA precursor, or the nucleic acid vector may be introduced into the cell using, for example, lipofection or electroporation. In some embodiments, the nucleic acid molecule, the vector, the circular RNA polynucleotide, the circular RNA precursor, or the nucleic acid vector may be introduced into a cell using a nanocarrier which can be, for example, a lipid, a polymer or a lipo-polymeric hybrid, such as a lipid nanoparticle (LNP) .

[0531] According to an embodiment, said host cells are bacterial cells; other useful cells are yeast cells, fungal cells or mammalian cells. In some embodiments, the host cells are mammalian cells. Suitable mammalian cells include for example HEK293 cells, CHO cells, BHK cells, HeLa cells, COS cells, and the like. However, amphibian cells, insect cells, plant cells, and any other cells used in the art for the expression of heterologous proteins can be used as well. In some embodiments, the host cell may be a prokaryotic or a eukaryotic cell. In some embodiments, the host cell may be a mammal cell, preferably a human cell, such as a T cell, a NK cell or a A549 cell. The host cell may be an immune effector cell, such as a T cell, a NK cell, an NKT cell, a macrophage, a neutrophil, or a granulocyte cell, or a population comprising these cells. In some embodiments, the T cell is a cytotoxic T cell, a helper T cell, a gamma delta T, a CD4+ / CD8+double positive T cell, a CD4+ T cell, a CD8+ T cell, a CD4 / CD8 double negative T cell, a CD3+T cell, a CD3+CD4-T cell, a CD3+CD4+ T cell, a naive T cell, an effector T cell, a helper T cell, a memory T cell, a regulator T cell, a Th0 cell, a Th1 cell, a Th2 cell, a Th3 (Treg) cell, a Th9 cell, a Th17 cell, a Thαβ helper cell, a Tfh cell, a stem memory TSCM cell, a central memory TCM cell, an effector memory TEM cell, or an effector memory TEMRA cell.

[0532] The protein expressed from the circular RNA may be further purified. Methods for purifying a protein are well known to those skilled in the art.

[0533] In some embodiments, the present invention relates to a method of producing a protein, the method comprising expressing the protein from the nucleic acid molecule of the present invention, the vector of the present invention, the circular RNA polynucleotide of the present invention, the circular RNA precursor of the present invention, or the nucleic acid vector of the present invention, and optionally purifying the protein. The circular RNA may be produced by any method provided herein.

[0534] The term “purify” , “purifying” or “purification” , as used herein, generally refers to isolation of the substance of interest (for example, a compound, a polynucleotide, a protein or a polypeptide) such that the substance constitutes the main component of the purified product, such as 70%or more, 80%or more, 90%or more, 91%or more, 92%or more, 93%or more, 94%or more, 95%or more, 96%or more, 97%or more, 98%or more, 99%or more or 100%of the purified product.

[0535] In some embodiments, the present invention relates to a cell or a cell population comprising the nucleic acid molecule of the present invention, the vector of the present invention, the circular RNA polynucleotide of the present invention, the circular RNA precursor of the present invention, or the nucleic acid vector of the present invention. The cell may be a mammal cell, preferably a human cell, more preferably a T cell or a NK cell. The cell or a cell population may be an immune effector cell, such as a T cell, a NK cell, an NKT cell, a macrophage, a neutrophil, or a granulocyte cell, or a population comprising these cells. In some embodiments, the T cell is a cytotoxic T cell, a helper T cell, a gamma delta T, a CD4+ / CD8+ double positive T cell, a CD4+ T cell, a CD8+ T cell, a CD4 / CD8 double negative T cell, a CD3+ T cell, a CD3+CD4-T cell, a CD3+CD4+ T cell, a naive T cell, an effector T cell, a helper T cell, a memory T cell, a regulator T cell, a Th0 cell, a Th1 cell, a Th2 cell, a Th3 (Treg) cell, a Th9 cell, a Th17 cell, a Thαβ helper cell, a Tfh cell, a stem memory TSCM cell, a central memory TCM cell, an effector memory TEM cell, or an effector memory TEMRA cell.

[0536] In some embodiments, the method is performed in vivo, in vitro or ex vivo.

[0537] In another aspect, the present invention also provides a method of expressing the circular RNA of the present invention in vivo, comprising

[0538] (a) delivering the circular RNA precursor of the present invention to a cell, and

[0539] (b) expressing the circular RNA polynucleotide of the present invention in vivo.

[0540] According to an embodiment, said cell may be bacterial cells; other useful cells are yeast cells, fungal cells or mammalian cells. In some embodiments, the cells are mammalian cells. Suitable mammalian cells include for example HEK293 cells, CHO cells, BHK cells, HeLa cells, COS cells, and the like. However, amphibian cells, insect cells, plant cells, and any other cells used in the art for the expression of heterologous proteins can be used as well. In some embodiments, the cell may be a prokaryotic or a eukaryotic cell. In some embodiments, the cell may be a mammal cell, preferably a human cell, such as a T cell, a NK cell or an A549 cell. The cell may be an immune effector cell, such as a T cell, a NK cell, an NKT cell, a macrophage, a neutrophil, or a granulocyte cell, or a population comprising these cells. In some embodiments, the T cell is a cytotoxic T cell, a helper T cell, a gamma delta T cell, a CD4+ / CD8+ double positive T cell, a CD4+ T cell, a CD8+T cell, a CD4 / CD8 double negative T cell, a CD3+ T cell, a CD3+CD4-T cell, a CD3+CD4+ T cell, a naive T cell, an effector T cell, a helper T cell, a memory T cell, a regulator T cell, a Th0 cell, a Th1 cell, a Th2 cell, a Th3 (Treg) cell, a Th9 cell, a Th17 cell, a Thαβ helper cell, a Tfh cell, a stem memory TSCM cell, a central memory TCM cell, an effector memory TEM cell, or an effector memory TEMRA cell.

[0541] Composition

[0542] In one aspect, the present invention provides a composition comprising the CD19 binding protein, the CD19-specific CAR, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the circular RNA polynucleotide, the circular RNA precursor, the nucleic acid vector, the cell or cell population of the present invention.

[0543] In some embodiments, the nucleic acid molecule, the circular RNA polynucleotide, the circular RNA precursor, or the nucleic acid vector is encapsulated in an LNP. In some embodiments, the LNP is a targeted LNP. In some embodiments, the LNP is an immune cell targeted LNP. In some embodiments, the immune cell is a T cell, a NK cell, an NKT cell, a macrophage, a neutrophil, or a granulocyte cell, or a population comprising these cells. In some embodiments, the T cell is a cytotoxic T cell, a helper T cell, a gamma delta T, a CD4+ / CD8+ double positive T cell, a CD4+T cell, a CD8+ T cell, a CD4 / CD8 double negative T cell, a CD3+ T cell, a CD3+CD4-T cell, a CD3+CD4+ T cell, a naive T cell, an effector T cell, a helper T cell, a memory T cell, a regulator T cell, a Th0 cell, a Th1 cell, a Th2 cell, a Th3 (Treg) cell, a Th9 cell, a Th17 cell, a Thαβ helper cell, a Tfh cell, a stem memory TSCM cell, a central memory TCM cell, an effector memory TEM cell, or an effector memory TEMRA cell.

[0544] In some embodiments, the T cell targeted LNP is conjugated with an antibody capable of specifically binding to CD3, CD7, or CD8, or an antigen binding fragment thereof.

[0545] In some embodiments, the composition is a pharmaceutical composition. In some embodiments, the composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.

[0546] The term "pharmaceutical composition" as used herein means a combination of at least one drug and optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient combined together to achieve a certain objective. In certain embodiments, the pharmaceutical composition includes temporally and / or spatially separated combinations, so long as they can act together to achieve the objective of the present application. For example, the components contained in the pharmaceutical composition (e.g., the nucleic acid molecule according to the present application) may be administered to an individual as a whole or separately. When administered to an individual separately, the components contained in the pharmaceutical composition may be administered to the individual simultaneously or sequentially. The pharmaceutical composition according to the present application may comprise conventional components of cell culture to maintain the activity of the nucleic acid molecule. The pharmaceutically acceptable carrier may also include water, an aqueous buffer solution, an isotonic salt solution such as PBS (phosphate-buffered saline) , glucose, mannitol, dextrose, lactose, starch, magnesium stearate, cellulose, magnesium carbonate, 0.3%glycerol, hyaluronic acid, ethanol, or a polyalkylene glycol such as polypropylene glycol, triglyceride, etc. The pharmaceutical composition or pharmaceutical formulation according to the present application may be administered by any suitable route, for example, intravenous administration, intradermal, subcutaneous, and intramuscular injection, etc. The composition according to the present application may comprise a wetting agent, an emulsifier or a buffer substance as an additive.

[0547] As used herein, "pharmaceutically acceptable carrier" or "pharmaceutical acceptable excipient" includes any material which, when combined with an active ingredient, allows the ingredient to retain biological activity and is non-reactive with the subject's immune system. Examples include, but are not limited to, any of the standard pharmaceutical carriers such as a phosphate buffered saline solution, water, emulsions such as oil / water emulsion, and various types of wetting agents. Preferred diluents for aerosol or parenteral administration are phosphate buffered saline (PBS) or normal (0.9%) saline. Compositions comprising such carriers are formulated by well known conventional methods (see, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; and Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21 st Ed. Mack Publishing, 2005) .

[0548] In an embodiment, pharmaceutically acceptable carriers may include, but are not limited to, buffers, stabilizers, or preservatives. Examples of pharmaceutically or cosmetically acceptable carriers are physiologically compatible solvents, dispersion media, coating, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delay agents, etc., such as salts, buffers, sugars, antioxidants, aqueous or non-aqueous carriers, preservatives, wetting agents, surfactants or emulsifiers, or combinations thereof. The amount of pharmaceutically or cosmetically acceptable carrier in a composition may be experimentally determined based on the activity of the carrier and the desired properties of the preparation, such as stability and / or minimum oxidation. The carrier or excipient is "acceptable" in the sense that it is compatible with other components of the composition and is not harmful to its recipient.

[0549] The composition of the present invention may be formulated for any administration route. Preferably, the composition may be formulated in a form for intrarticularis (in joints) , parenteral, intravenous, intramuscular, dermal, buccal, subelingual, transnasal, intraperitoneal, subcutaneous, oral, topical, intrathecal, inhaled, transrectal, patch, pump, percutaneous, transrectal, muscular, body surface, mucosal, or intracranial administration.

[0550] In some embodiments, the composition further comprises a delivery carrier. The invention also provides a composition, which comprises a delivery carrier (e.g., lipid nanoparticles) comprising the CD19 binding protein, the CD19-specific CAR, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the circular RNA polynucleotide, the circular RNA precursor, the nucleic acid vector, the cell or cell population of the present invention or a delivery vector encoding the CD19 binding protein, the CD19-specific CAR, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the circular RNA polynucleotide, the circular RNA precursor, the nucleic acid vector, the cell or cell population of the present invention.

[0551] In one embodiment, the delivery carrier is selected from one or more of the following: macromolecular complexes, liposomes, nanocapsules, nanoparticles, exosomes, exosome-lipid conjugates, microspheres, beads, oil-in-water emulsions, lipid-nanoparticle conjugates, micelles, mixed micelles, and peptide-based polymeric complexes. In some embodiments, a suitable liposome, nanoparticle, or lipid-nanoparticle conjugate contains one or more non-cationic lipids, one or more cholesterol-based lipids, and / or one or more PEG-modified lipids. In another embodiment, a suitable liposome, nanoparticle, or lipid-nanoparticle conjugate contains lipids including (but not limited to) monoglycerides, diglycerides, thiolipids, lysolecithin, phospholipids, saponins, cholic acids, etc. In one embodiment, the compositions described herein comprise one or more liposomes or lipid nanoparticles. In some embodiments, the LNP is a targeted LNP. In some embodiments, the LNP is an immune cell targeted LNP. In some embodiments, the immune cell is a T cell, a NK cell, an NKT cell, a macrophage, a neutrophil, or a granulocyte cell, or a population comprising these cells. In some embodiments, the T cell is a cytotoxic T cell, a helper T cell, a gamma delta T, a CD4+ / CD8+ double positive T cell, a CD4+ T cell, a CD8+ T cell, a CD4 / CD8 double negative T cell, a CD3+ T cell, a CD3+CD4-T cell, a CD3+CD4+ T cell, a naive T cell, an effector T cell, a helper T cell, a memory T cell, a regulator T cell, a Th0 cell, a Th1 cell, a Th2 cell, a Th3 (Treg) cell, a Th9 cell, a Th17 cell, a Thαβ helper cell, a Tfh cell, a stem memory TSCM cell, a central memory TCM cell, an effector memory TEM cell, or an effector memory TEMRA cell. In some embodiments, the T cell targeted LNP is conjugated with an antibody capable of specifically binding to CD3, CD7, or CD8, or an antigen binding fragment thereof.

[0552] In one embodiment, the delivery carrier comprises at least one targeting moiety. In another embodiment, the targeting moiety is a binding ligand, a mouse antibody, a human or humanized antibody, or a fragment thereof.

[0553] In some embodiments, the CD19 binding protein, the CD19-specific CAR, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the circular RNA polynucleotide, the circular RNA precursor, the nucleic acid vector, the cell or cell population described herein can be combined with the delivery carrier. In some embodiments, the combination may refer to incorporation into the delivery carrier, encapsulation within the liquid of the delivery carrier, dispersion within the delivery carrier, linking to the delivery carrier by linking molecules, embedding in the delivery carrier, compounding with the delivery carrier, dispersion in a solution containing the delivery carrier, mixing with the delivery carrier, binding with the delivery carrier, inclusion into the delivery carrier as a suspension, inclusion into or combination with micelles, attaching to a colloidal dispersion system, or combination with the delivery carrier in other ways.

[0554] In one embodiment, the delivery vector includes a non-viral, viral, plasmid, and non-plasmid vector. In one embodiment, examples of the virus delivery vectors include, but are not limited to, adenovirus vectors, adeno-associated virus (also known as adeno-associated virus, AAV) vectors, poxvirus vectors, herpes simplex virus I vectors, retrovirus vectors, lentiviral vectors, etc. In one embodiment, the delivery carrier is an AAV carrier. In one embodiment, the coding sequence of the nucleic acid vector and / or the circular RNA precursor and / or the circular RNA is operably linked to an expression element on the delivery vector.

[0555] The composition of the present invention may be formulated for a variety of means of administration in accordance with known techniques. See, for example, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (9th Ed. 1995) . In the manufacture of a pharmaceutical composition, the active agent is typically admixed with, inter alia, a pharmaceutical acceptable carrier.

[0556] The composition of the present invention may be (formulated to be) administered in any manner suitable to the disease to be treated and the subject. In certain embodiments, the administration manner may include, but is not limited to, parenteral or non-parenteral route, including oral, sublingual, buccal, percutaneous, rectal, vaginal, intradermal, intranasal route or parenteral route such as intravenous (i. v. ) , intraperitoneal, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intracranial, intrathecal, intratumoral, transdermal, transmucosal intraarticular, intra-synovial, intrasternal, intrathecal, intrahepatic, intralesional or intracranial injection or infusion. The pharmaceutical compositions may be injected, for instance, directly into a tumor, lymph node, tissue, organ, or site of infection.

[0557] Dosage forms suitable for oral administration include, but are not limited to, tablet, capsule, powder, pill, granule, suspension, solution or preconcentrate of solution, emulsion or preconcentrates of emulsion. Pharmaceutical acceptable carriers that can be used in an oral dosage form include water, glycols, oils, alcohols, flavoring agents, preservatives, coloring agents and the like. Carriers such as starches, sugars, microcrystalline cellulose, diluents, filler, glidants, granulating agents, lubricants, binders, stabilizers, disintegrating agents and the like can be used to prepare an oral solid preparation such as powder, capsule or tablet.

[0558] Dosage forms suitable for parenteral administration include, but are not limited to, sterile liquid preparations, e.g., isotonic aqueous solutions, emulsions, suspensions, dispersions, or viscous compositions, which may be buffered to a desirable pH. Parenteral dosage forms may be ready for use or dry products ready to be dissolved or suspended in a pharmaceutically acceptable carrier. Parenteral dosage forms may be formulated sterile or are capable of being sterilized prior to administration to a subject. Pharmaceutical acceptable carriers that can be used to provide parenteral dosage forms include, but are not limited to, water for injection; aqueous vehicles such as, but not limited to, sodium chloride injection, Ringer's injection, dextrose injection; water-miscible carriers such as, but not limited to, ethyl alcohol, polyethylene glycol, and polypropylene glycol; non-aqueous carriers such as, but not limited to, corn oil, cottonseed oil, peanut oil, sesame oil, ethyl oleate, isopropyl myristate, and benzyl benzoate; and solubilizing agent such as cyclodextrin.

[0559] Treatment method

[0560] In one aspect, the present invention provides a method of treating a disease in a subject, comprising administering an effective amount of the CD19 binding protein, the CD19-specific CAR, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the circular RNA polynucleotide, the circular RNA precursor, the nucleic acid vector, the cell or cell population or the composition of the present invention.

[0561] As used herein, the terms “administer” , “administering” , “administration” , “dose” , “dosing” , and the like refer to a method that can be used to enable the delivery of the composition to the desired site of biological action. These methods include, but are not limited to, intra-articular (in joints) , parenteral, intravenous, intramuscular, intradermal, buccal, sublingual, transnasal, intraperitoneal, subcutaneous, oral, topical, intrathecal, inhalation, transrectal, patch, pump, percutaneous, transrectal, muscular, body surface, mucosal, intracranial, etc administration. Possible administration techniques for the agents and methods described herein can be found, for example, in Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, current edition; Pergamon and Remington, Pharmaceutical Sciences (current edition) , Mack Publishing Co., Easton, Pa.

[0562] In one aspect, the present invention provides use of the CD19 binding protein, the CD19-specific CAR, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the circular RNA polynucleotide, the circular RNA precursor, the nucleic acid vector, the cell or cell population or the composition in the manufacture of a medicament for treating a disease in a subject.

[0563] In one aspect, the present invention provides the CD19 binding protein, the CD19-specific CAR, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the circular RNA polynucleotide, the circular RNA precursor, the nucleic acid vector, the cell or cell population or the composition, for use in treating a disease in a subject.

[0564] As used herein, the terms "subject" and "patient" refer to an organism that receives treatment for a particular disease or disorder (e.g., a cancer or an infectious disease) as described herein. Examples of the subject and the patient include mammals, such as human, primate, pig, goat, rabbit, hamster, cat, dog, guinea pig, members of the bovine family (such as cattle, bison, buffalo, elk, yak, etc. ) , cattle, sheep, horse, bison, etc., that receive treatment for a disease or disorder (e.g., a cell proliferative disorder, such as a cancer or an infectious disease) .

[0565] As used herein, the term "treatment" or “treating” refers to surgical or therapeutic treatment for the purpose of preventing or slowing (reducing) the progression of an undesirable physiological or pathological change, such as a cell proliferative disorder (e.g., a cancer or an infectious disease) , in a subject being treated. Beneficial or desired clinical results include, but are not limited to, alleviation of symptoms, decrease of severity of disease, stabilization (i.e., not worsening) of state of disease, delay or slowing of disease progression, amelioration or palliation of state of disease, and remission (whether partial or total) of state of disease, whether detectable or undetectable. Subjects in need of treatment include those already with a disorder or disease, as well as those who are susceptible to a disorder or disease or those who intend to prevent a disorder or disease. When referring to terms such as slowing, alleviation, decrease, palliation, and remission, their meanings also include elimination, disappearance, nonoccurrence, etc.

[0566] As used herein, the term "effective amount" refers to an amount of a therapeutic agent that is effective in preventing or alleviating symptoms of a disease or the progression of the disease when administered to a cell, tissue or subject alone or in combination with another therapeutic agent. "Effective amount" also refers to an amount of a compound that is sufficient to alleviate symptoms, e.g., to treat, cure, prevent, or alleviate related medical disorders, or to increase the rates at which such disorders are treated, cured, prevented, or alleviated. When the active ingredient is administered alone to an individual, a therapeutically effective dose refers to the amount of the ingredient alone. When a combination is used, a therapeutically effective dose refers to the combined amounts of the active ingredients that produce the therapeutic effect, whether administered in combination, sequentially, or simultaneously.

[0567] In some embodiments, said disease is an autoimmune disease, or a malignant B cell disease such as an acute or chronic B cell leukemia or a B cell lymphoma.

[0568] The term "malignant disease" herein refers to or describes a physiological condition in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth.

[0569] In some embodiments, the autoimmune disease is a severe, a relapsing, or a refractory autoimmune disease.

[0570] In some embodiments, the disease is a CD19-related tumor or cancer. In some embodiments, the disease is a malignant B cell disease. In some embodiments, the disease is acute myelogenous leukemia, myelodysplastic syndrome, chronic myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, non-Hodgkin's lymphoma, multiple myeloma, plasmacytoma, monoclonal gammopathy of unknown significance, Waldenstrom's macroglobulinemia (lymphoplasmacytic lymphoma) , heavy chain disease, primary amyloidosis, post-transplant lymphoproliferative disorder, Hodgkin's lymphoma, MALT lymphoma, B-cell lymphoma, mantle cell lymphoma, (germinal center-like) diffuse large cell lymphoma, Burkitt lymphoma, dual-lineage leukemia, dual-phenotype leukemia, hairy cell leukemia, precursor B acute lymphoblastic leukemia / lymphoma, primary cutaneous follicular center lymphoma, follicular lymphoma, or marginal zone B-cell non-Hodgkin's lymphoma.

[0571] The term "cancer" herein refers to or describes a physiological condition in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth. Included in this definition are benign and malignant cancers. The term "tumor" or "neoplasm" herein refers to all neoplastic cell growth and proliferation, whether malignant or benign, and all pre-cancerous and cancerous cells and tissues. The terms "cancer" and "tumor" are not mutually exclusive when referred to herein.

[0572] In some embodiments, the CD19-related tumor or cancer means that a tumor cell or cancer cell surface expresses CD19. In some embodiments, the tumor is a tumor highly expressing CD19 (CD19+) . In some embodiments, the tumor that highly expressing CD19 (CD19+) refers to a tumor cell population in which at least 60%of the tumor cells express CD19. In some embodiments, the tumor that highly expressing CD19 (CD19+) refers to a tumor cell population in which at least 70%of the tumor cells express CD19. In some embodiments, the tumor that highly expressing CD19 (CD19+) refers to a tumor cell population in which at least 80%of the tumor cells express CD19. In some embodiments, the tumor that highly expressing CD19 (CD19+) refers to a tumor cell population in which at least 90%of the tumor cells express CD19. In some embodiments, the tumor that highly expressing CD19 (CD19+) refers to a tumor cell population in which at least 95%of the tumor cells express CD19. In some embodiments, the tumor that highly expressing CD19 (CD19+) refers to a tumor cell population in which at least 98%of the tumor cells express CD19. In some embodiments, the tumor that highly expressing CD19 (CD19+) refers to a tumor cell population in which at least 99%of the tumor cells express CD19.

[0573] As one skilled in the art will understand, the CD19 binding protein, the CD19-specific CAR, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the circular RNA polynucleotide, the circular RNA precursor, the nucleic acid vector, the cell or cell population or the composition of the present invention may be administered to patients in a variety of forms depending on the selected route of administration. The specific mode of administration and administration protocol will be selected by the attending clinician taking into account specific conditions (e.g., individual, disease, condition of disease involved, specific treatment) . In some embodiments, the method comprises administering the CD19 binding protein, the CD19-specific CAR, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the circular RNA polynucleotide, the circular RNA precursor, the nucleic acid vector, the cell or cell population or the composition of the present invention by a mode selected from intraarticular (in joint) , parenteral, intravenous, intramuscular, dermal, buccal, sublingual, nasal, intraperitoneal, subcutaneous, oral, topical, intrathecal, inhaled, rectal, patch, pump, percutaneous, transrectal, muscular, body surface, mucous membrane, intracranial, etc. administration. In some embodiments, parenteral administration may be performed by continuous infusion over a selected period of time. In some embodiments, the CD19 binding protein, the CD19-specific CAR, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the circular RNA polynucleotide, the circular RNA precursor, the nucleic acid vector, the cell or cell population or the composition of the present invention is formulated in a form to be administered by a mode selected from intraarticular (in the joint) , parenteral, intravenous, intramuscular, dermal, buccal, sublingual, nasal, intraperitoneal, subcutaneous, oral, topical, intrathecal, inhaled, rectal, patch, pump, percutaneous, transrectal, muscular, body surface, mucous membrane, intracranial, etc. administration.

[0574] The quantity and frequency of administration will be determined by such factors as the condition of the subject (e.g., age, body weight, sex, and response of the subject to the medicament) , and the type and severity of the subject's disease, although appropriate dosages may be determined by clinical trials.

[0575] The CD19 binding protein, the CD19-specific CAR, the nucleic acid molecule, the vector, the host cell, the circular RNA polynucleotide, the circular RNA precursor, the nucleic acid vector, the cell or cell population or the composition of the present invention can be administrated or formulated in one or more doses. In some embodiments, said effective amount of the nucleic acid molecule of the present invention, the circular RNA precursor of the present invention or the composition of the present invention can be administrated or formulated as a single dose. In some embodiments, said effective amount of the nucleic acid molecule of the present invention, the circular RNA precursor of the present invention or the composition of the present invention can be administrated or formulated as more than one dose over a period time.

[0576] The present invention further provides the following embodiments.

[0577] Embodiment 1. An isolated CD19 binding protein comprising a variable domain of heavy chain of heavy chain-only antibody (VHH) capable of specifically binding to CD19, wherein the VHH comprises CDR1, CDR2, and CDR3 contained in any one of SEQ ID NOs. 17-24.

[0578] Embodiment 2. The CD19 binding protein of embodiment 1, wherein the CDR is one of Kabat CDR, AbM CDR, Chothia CDR, or IMGT CDR.

[0579] Embodiment 3. The CD19 binding protein of embodiment 1, wherein the VHH comprises CDR1, CDR2, and CDR3 selected from the group ocnsisting of (i) CDR1 having an amino acid sequence of GNIESRNC, CDR2 having an amino acid sequence of IGQVTGRS, and CDR3 having an amino acid sequence of AAAPGCLLSALRSADYRN; and (ii) CDR1 having an amino acid sequence of GDTLSNKW, CDR2 having an amino acid sequence of IRTDYAGT, and CDR3 having an amino acid sequence of AASYSGATTFRY.

[0580] Embodiment 4. The CD19 binding protein of embodiment 1, wherein the VHH comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs. 17-24 or an amino acid sequence which is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identical to any one of SEQ ID NOs. 17-24.

[0581] Embodiment 5. An isolated CD19 binding protein comprising a variable light chain (VL) and a variable heave chain (VH) of an antibody capable of specifically binding to CD19, wherein the VL comprises a VL-CDR1 having an amino acid sequence of RASQDISKYLN, a VL-CDR2 having an amino acid sequence of HTSRLHS, and a VL-CDR3 having an amino acid sequence of QQGSTLPYT or QQGNTLPYT, and the VH comprise a VH-CDR1 having an amino acid sequence of DYGVS, GVSLPDY, DVGVS, GVSLPDV, DFGVS, DHGVS, DYGIS or EYGVS, a VH-CDR2 having an amino acid sequence of VIWGSETTYYNSALKS or WGSET, and a VH-CDR3 having an amino acid sequence of HYYYGGSYAMDY.

[0582] Embodiment 6. The CD19 binding protein of embodiment 5, wherein the VL and VH comprise CDR1, CDR2, and CDR3 selected from the following group:

[0583] Embodiment 7. The CD19 binding protein of embodiment 6, comprising a variable light chain (VL) and a variable heave chain (VH) selected from the following group of VL and VH or a VL and a VH having an amino acid sequence at least 80%, at 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identical to a VL and a VH selected from the following group of VL and VH:

[0584] Embodiment 8. The CD19 binding protein of embodiment 7, which is a scFv comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 14, 41-46, and 61-67 or an amino acid sequence which is at least 80%, at 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identical to any one of SEQ ID NOs: 14, 41-46, and 61-67.

[0585] Embodiment 9. The CD19 binding protein of any one of embodiments 1 to 8, further comprising an immunoglobulin Fc region, preferably the Fc region of human immunoglobulin.

[0586] Embodiment 10. The CD19 binding protein of any one of embodiments 1 to 9, which is capable of specifically binding to a cell surface CD19.

[0587] Embodiment 11. The CD19 binding protein of embodiment 10, wherein the cell is human B cell.

[0588] Embodiment 12. The CD19 binding protein of embodiment 11, wherein the B cell is a malignant B cell.

[0589] Embodiment 13. An isolated nucleic acid molecule encoding the CD19 binding protein of any one of embodiments 1 to 12.

[0590] Embodiment 14. An expression vector comprising the nucleic acid molecule of embodiment 13 operably linked to an expresion regulatory element.

[0591] Embodiment 15. A recombinant cell comprising the nucleic acid molecule of embodiment 13 or transfected with the expression vector of embodiment 14.

[0592] Embodiment 16. A pharmaceutical composition comprising the CD19 binding protein of any one of embodiments 1 to 12 and a pharmaceutically acceptable excipient.

[0593] Embodiment 17. Use of the CD19 binding protein of any one of embodiments 1 to 12 or the pharmaceutical composition of embodiment 16 in the manufacture of a medicament for preventing or treating a disease or condition in a subject.

[0594] Embodiment 18. Use of embodiment 17, wherein said disease or condition is an autoimmune disease.

[0595] Embodiment 19. Use of embodiment 18, wherein said disease or condition is an autoimmune disease or a malignant B cell disease such as an acute or chronic B cell leukemia or a B cell lymphoma.

[0596] Embodiment 20. A circular RNA polynucleotide encoding a CD19-specific chimeric antigen receptor.

[0597] Embodiment 21. The circular RNA polynucleotide of embodiment 20, wherein said CD19-specific chimeric antigen receptor comprises an antigen binding domain, a transmembrane domain, and a costimulatory domain, and wherein the antigen binding domain is the CD19 binding protein of any one of embodiments 1 to 12.

[0598] Embodiment 22. The circular RNA polynucleotide of embodiment 21, wherein the transmembrane domain is a CD28 hinge-transmembrane domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47.

[0599] Embodiment 23. The circular RNA polynucleotide of embodiment 21, wherein the costimulatory domain is a CD28 costimulatory domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48.

[0600] Embodiment 24. The circular RNA polynucleotide of any one of embodiments 21 to 23, wherein said CD19-specific chimeric antigen receptor further comprises a CD3zeta domain.

[0601] Embodiment 25. The circular RNA polynucleotide of embodiment 24, wherein the CD3zeta domain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.

[0602] Embodiment 26. The circular RNA polynucleotide of any one of embodiments 21 to 25, wherein said CD19-specific chimeric antigen receptor comprises an antigen binding domain comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs. 11-16, 41-46, and 61-67.

[0603] Embodiment 27. The circular RNA polynucleotide of any one of embodiments 21 to 25, wherein said CD19-specific chimeric antigen receptor comprises an antigen binding domain comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs. 17-24.

[0604] Embodiment 28. The circular RNA polynucleotide of any one of embodiments 21 to 27, wherein said CD19-specific chimeric antigen receptor comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 25-32 and 68-80.

[0605] Embodiment 29. The circular RNA polynucleotide of embodiment 21, which comprises a sequence selected from SEQ ID NOs. 1 to 10, 33-40, 51-60, and 81-83.

[0606] Embodiment 30. A composition comprising the circular RNA polynucleotide of any one of embodiments 20-29.

[0607] Embodiment 31. The composition of embodiment 30, wherein said composition is a pharmaceutical composition.

[0608] Embodiment 32. Use of the circular RNA of any one of embodiments 20-29 or the composition of embodiment 30 or 31 in the manufacture of a medicament for preventing or treating a disease or condition in a subject.

[0609] Embodiment 33. A circular RNA precursor comprising:

[0610] a) a Group I / II intron,

[0611] b) a 3’ exon,

[0612] c) a sequence of interest, comprising an IRES and an ORF sequence encoding a CD19-specific chimeric antigen receptor, and

[0613] d) a 5’ exon.

[0614] Embodiment 34. A circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0615] a) optionally a linker I,

[0616] b) a Group I / II intron,

[0617] c) a 3’ exon,

[0618] d) optionally a linker A,

[0619] e) a sequence of interest, comprising an IRES and an ORF sequence encoding a CD19-specific chimeric antigen receptor,

[0620] f) optionally a linker B,

[0621] g) a 5’ exon, and

[0622] h) optionally a linker II.

[0623] Embodiment 35. A circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0624] a) a linker I,

[0625] b) a Group I / II intron,

[0626] c) a sequence of interest, comprising: (i) an IRES fragment I comprising a 3’ exon at its 5’ end, (ii) an ORF sequence encoding a CD19-specific chimeric antigen receptor, and (iii) an IRES fragment II comprising a 5’ exon at its 3’ end, and

[0627] d) a linker II,

[0628] wherein the IRES fragment I and IRES fragment II together form a complete functional IRES.

[0629] Embodiment 36. A circular RNA precursor comprising from 5’ to 3’ direction:

[0630] a) a linker I,

[0631] b) a Group I / II intron,

[0632] c) a sequence of interest, comprising: (i) an ORF sequence fragment I which comprises a 3’ exon at its 5’ end, (ii) an IRES sequence, and (iii) an ORF sequence fragment II comprising a 5’ exon at its 3’ end, and

[0633] d) a linker II,

[0634] wherein the ORF sequence fragment I and ORF sequence fragment II together form a complete ORF sequence encoding a CD19-specific chimeric antigen receptor.

[0635] Embodiment 37. The circular RNA precursor of any one of embodiments 33-36, wherein the CD19-specific chimeric antigen receptor comprises an antigen binding domain which is the CD19 binding protein of any one of embodiments 1 to 12.

[0636] Embodiment 38. The circular RNA precursor of any one of embodiments 33-37, wherein the CD19-specific chimeric antigen receptor comprises an antigen binding domain comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs. 11-24, 41-46, and 61-67.

[0637] Embodiment 39. The circular RNA precursor of any one of embodiments 33-37, wherein the ORF sequence encoding a CD19-specific chimeric antigen receptor comprises a sequence selected from SEQ ID NOs. 1-10, 33-40 and 51-60.

[0638] Embodiment 40. A nucleic acid vector for generating a circular RNA molecule, said vector comprises a coding sequence of the circular RNA precursor of any one of embodiments 33-39.

[0639] Embodiment 41. The nucleic acid vector of embodiment 40, which further comprises an RNA polymerase promoter sequence operably linked to the coding sequence of the circular RNA precursor.

[0640] Embodiment 42. A circular RNA, which is prepared from the circular RNA precursor of any one of embodiments 33-39.

[0641] Embodiment 43. The circular RNA polynucleotide of any one of embodiments 20-29 and 42 or the circular RNA precursor of any one of embodiments 33-39, wherein the CD19-specific chimeric antigen receptor comprises the CD19 binding protein of any one of embodiments 1 to 12 as the antigen binding domain.

[0642] Embodiment 44. Use of the circular RNA of any of embodiments 20-29 and 42 or the composition of embodiment 30 or 31 in the manufacture of a medicament for preventing or treating a disease or condition in a subject.

[0643] Embodiment 45. Use of embodiment 44, wherein said disease or condition is an autoimmune disease.

[0644] Embodiment 46. Use of embodiment 32 or 44, wherein said disease or condition is an autoimmune disease or a malignant B cell disease such as an acute or chronic B cell leukemia or a B cell lymphoma.

[0645] Examples

[0646] The following examples have been included to provide guidance to one of ordinary skill in the art for practicing representative embodiments of the presently disclosed subject matter. In light of the present disclosure and the general level of skill in the art, those of skill can appreciate that the following examples are intended to be exemplary only and that numerous changes, modifications, and alterations can be employed without departing from the scope of the presently disclosed subject matter. The synthetic descriptions and specific examples that follow are only intended for the purposes of illustration, and are not to be construed as limiting in any manner the present invention.

[0647] Example 1. Method for generation of circular CD19 specific CAR RNAs

[0648] Circular CD19 specific CAR RNA molecules of the present invention are formed as follows. A plasmid containing a sequence coding for a precursor RNA is prepared. An exemplary precursor RNA has the following structure: 5’ linker-Group I intron-3’ exon-IRES-CD19 specific CAR-5' exon-3’ linker. The linearized plasmid is then subjected to in vitro transcription (IVT) to obtain the linear precursor RNA molecules for generating the circular RNA molecules (circCAR RNAs) containing 3’ exon-IRES-CD19 specific CAR-5' exon (Figure 1) .

[0649] A typical IVT reaction can include the following reagents in Table 8.

[0650] Table 8: Reagent in a typical IVT reaction

[0651] Immediately after preparation, the IVT reaction is incubated at 37℃ for 3h. When the IVT reaction has reached the plateau, the reaction is stopped by adding DNase I (final conc. of DNase I is 1U / 1μg template) , and incubating 30min at 37℃. Then, 100 mM EDTA (final conc. of EDTA is 30 mM) is added to stop DNase I activity, thereby obtaining the IVT reaction mix.

[0652] Next, the circularization reaction can be performed with a mixture including: the IVT reaction mix, 30mM MgCl2 and DNase / RNase Free Water up to 60μL. The mixture can be incubated at 55℃ for 15min.

[0653] To purify the circCAR RNAs, the poly-A tailing reaction and RNaseR treatment are conbimed to remove the linear RNA, followed by buffer exchange to eliminate proteins, NTPs, and other impurities. Following the cleanup, the circRNA can be quantified using the NanoDrop and analyzed by PAGE gel electrophoresis or CGE to confirm the circRNA purity.

[0654] Example 2. Humanization of FMC63 scFv improves the tumor cell killing efficiency of CART in vitro

[0655] The RTU LNP encapsulating circCAR RNAs was prepared as follows. The ionizable lipid RXLP031, DSPC, cholesterol and DMG-PEG2000 were mixed at a molar ratio of 38: 30: 30: 2 in absolute ethanol. Structure of ionizable lipid RXLP031 is shown below.

[0656] The aqueous buffer was prepared in 25 mM Acetate (pH 4.5) , without RNA payload. To form empty LNP, one volume of the lipid mixture was mixed with three volumes of the aqueous buffer by INanoTM L+ (Micro&Nano) , at a flow rate of 12ml / min, with start waste and end waste according to manufacturer’s protocol. The mixture was then dialyzed twice against 1x PBS buffer by Slide-A-Lyzer dialysis cassette. The suspension was then concentrated into pre-defined concentration with Ultra-4 Centrifugal Filter Unit (100 kDa MWCO) . Then, the mixture was filtered with 0.65 / 0.22μm PES Sterile syringe filter. The molar ratio of ionizable lipid to circCAR RNA (circular RNA encoding CAR) was 6: 1. One volume of empty LNP was then mixed with three volumes of aqueous RNA payload by pipetting mix. The mixture was then incubated at 25 ℃ for 5 mins. Exemplary circCAR RNAs prepared and tested are SEQ ID NOs: 1-10 as listed in below Table 9.

[0657] Table 9: Exemplary circCAR RNAs

[0658] The evaluation process is summarized in Figure 2. Human PBMCs from healthy donors were obtained from Shanghai Saily Biotechnology Co., Ltd. The T cells were isolated using a negative selection immunomagnetic cell separation method and T cell purity after isolation was confirmed by FACS analysis with CD3 and CD8 antibody staining (Figure 3) . T cells were cultured with DynaBeadsTM Human T-activator CD3 / CD28 for T cell Expansion and Activation (#11161D, ThermoFisher) at 1: 1 (bead: cell) ratio for 3 days and rhIL-2 (300IU / mL) was added to activate the T cells. After 48 hours, the T cells were collected and resupended in fresh media with fresh cytokines. At 72 hours, the cells were collected and resuspended in fresh media with cytokines, and plated in 12 well plates at 3 X 105 cells per well. The cells were transfected with 500ng and 200ng formulated circRNA. At 72 hours post transfection, part of the cells were collected, washed and stained with viability dye (LIVE / DEADTM Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, L34963, ThermoFisher) and anti-FMC63 antibody conjugated with APC (APC-Labeled Monoclonal Anti-FMC63 Antibody, Mouse IgG1 (Y45) (Site-specific conjugation) , FM3-AY54P1, ACRO) . The labelled cells were then analyzed on a flow cytometer, and the flow cytometry data is showen in Figure 4. The data was analyzed, the expression of CAR was recorded for each circRNA transfected cell wells (Figure 5) . The rest of the cells were collected, counted and resuspended in fresh medium. 1 X 104 of each circRNA trasfected cells were coincubated with 1 X 104 Raji-Luc cells in 96 well plate. At 24 hours post coincubation, the target cell death was monitored through the measurement of Bioluminescence. Raji cells co-incubated with untransfected T cells were used as control. The percentage of target cell death from cell supernatant was calculated as followed. Percentage of target cell death %= (1-Luc treated / Luc control) X 100. Target Raji cell killing rate is shown in Figure 6.

[0659] Example 3. Generation of Anti-CD19 VHH antibodies and circular CD19 specific CAR based on the same

[0660] Humanized anti-CD19 VHH antibodies generated for the purpose of the invention comprise the following anti-CD19 VHH sequences listed in Table 10.

[0661] Table 10: Humanized anti-CD19 VHH antibodies

[0662] Chimeric antigen receptor (CAR) comprising an extracellular antigen binding domain were designed and prepared, in which the extracellular antigen binding domain comprises an anti-CD19 VHH as set out in above SEQ ID NOs: 17-24) .

[0663] Circular RNA encoding CD19 specific CAR comprising anti-CD19 VHH was formed as decribed in Example 1. Briefly, a plasmid containing a sequence coding for a precursor RNA was prepared. The structures of the precursor RNAs are shown in Figure 7A and 7C. The linearized plasmid was then subjected to in vitro transcription (IVT) to obtain the linear precursor for generating the circular RNA containing 3’ exon-IRES-CD19 specific CAR-5’ exon or IRES-CD19 specific CAR (Figure 7A and 7C) .

[0664] The IVT reaction includes the following reagents in Table 11:

[0665] Table 11: Reagent in the IVT reacion

[0666] Immediately after preparation, the IVT reaction was incubated at 37℃ for 3h. When the IVT reaction reached the plateau, the reaction was stopped by adding DNase I (final conc. of DNase I is 1U / 1μg template) , and incubating 30min at 37℃. Then, 100 mM EDTA (final conc. of EDTA is 30 mM) was added to stop DNase I activity, thereby obtaining the IVT reaction mix.

[0667] Next, the circularization reaction was performed with a mixture including: the IVT reaction mix, 30mM MgCl2 and DNase / RNase Free Water up to 60μL. The mixture was incubated at 55℃ for 15min.

[0668] To purify the circRNA, the poly-A tailing reaction and RNaseR treatment were combined to remove the linear RNA, followed by buffer exchange to eliminate proteins, NTPs, and other impurities. Following the cleanup, the circRNA were quantified using the NanoDrop and analyzed by PAGE gel electrophoresis or CGE to confirm the circRNA purity.

[0669] The circRNAs prepared and mentioned in this Example, their structures and sequences are listed in Table 12.

[0670] Table 12

[0671] Example 4. Circular CD19 specific CAR generation

[0672] Circular CD19 specific CAR RNAs were formed as decribed in Example 1.. Briefly, a plasmid containing a sequence coding for a precursor RNA was prepared. The structures of the precursor RNAs (3’ Group I intron-IRES-CD19 specific CAR-5’ Group I intron or 5’ HA-spacer-Group I intron-IRES-CD19 specific CAR-spacer-3’ HA) and the generation of circular RNAs encoding corresponding anti-CD19 CAR are shown in Figure 7B and 7D. The linearized plasmid was then subjected to in vitro transcription (IVT) to obtain the linear precursor for generating the circular RNA containing 3’ exon-IRES-CD19 specific CAR-5’ exon or IRES-CD19 specific CAR (Figure 7B and 7D) . The IVT reaction described in Example 1 was used. Exemplary precursor sequences used in this Example are SEQ ID NOs: 89-96.

[0673] Immediately after preparation, the IVT reaction was incubated at 37℃ for 3h. When the IVT reaction reached the plateau, the reaction was stopped by adding DNase I (final conc. of DNase I is 1U / 1μg template) , and incubating 30min at 37℃. Then, 100 mM EDTA (final conc. of EDTA is 30 mM) was added to stop DNase I activity, thereby obtaining the IVT reaction mix.

[0674] Next, the circularization reaction was performed with a mixture including: the IVT reaction mix, 30mM MgCl2 and DNase / RNase Free Water up to 60μL. The mixture was incubated at 55℃ for 15min.

[0675] To purify the circRNA, the poly-A tailing reaction and RNaseR treatment were combined to remove the linear RNA, followed by buffer exchange to eliminate proteins, NTPs, and other impurities. Following the cleanup, the circRNA were quantified using the NanoDrop and analyzed by PAGE gel electrophoresis or CGE to confirm the circRNA purity (Figure 8) .

[0676] Structures and sequences of exemplary circular RNAs prepared and tested in this Example are as listed below in Tables 13 and 14.

[0677] Table 13

[0678] Table 14

[0679] Example 5. Circular CAR showed good expression and killing efficiency using affinity matured and humanized scFv

[0680] The RTU LNP encapsulating circCAR RNAs (SEQ ID NOs. 1, 3, and 51-60) was prepared as follows. The ionizable lipid RXLP031, DSPC, cholesterol and DMG-PEG2000 were mixed at a molar ratio of 38: 30: 30: 2 in absolute ethanol. Structure of ionizable lipid RXLP031 is shown in Example 2. The aqueous buffer was prepared in 25 mM Acetate (pH 4.5) , without RNA payload. To form empty LNP, one volume of the lipid mixture was mixed with three volumes of the aqueous buffer by INanoTM L+ (Micro&Nano) , at a flow rate of 12ml / min, with start waste and end waste according to manufacturer’s protocol. The mixture was then dialyzed twice against 1x PBS buffer by Slide-A-Lyzer dialysis cassette. The suspension was then concentrated into pre-defined concentration with Ultra-4 Centrifugal Filter Unit (100 kDa MWCO) . Then, the mixture was filtered with 0.65 / 0.22μm PES Sterile syringe filter. The molar ratio of ionizable lipid to circular RNA encoding CAR was 6: 1. One volume of empty LNP was then mixed with three volumes of aqueous RNA payload by pipetting mix. The mixture was then incubated at 25 ℃ for 5 mins.

[0681] Human PBMCs from healthy donors were obtained from Shanghai Saily Biotechnology Co., Ltd. The T cells were isolated using a negative selection immunomagnetic cell separation method and T cell purity after isolation was confirmed by FACS analysis with CD3 and CD8 antibody staining. T cells were cultured with DynaBeadsTM Human T-activator CD3 / CD28 for T cell expansion and activation (#11161D, ThermoFisher) at 1: 1 (bead: cell) ratio for 3 days and rhIL-2 (300IU / mL) was added to activate the T cells. After 48 hours, the T cells were collected and resupended in fresh media with fresh cytokines. At 72 hours, the cells were collected and resuspended in fresh media with cytokines and plated in 12 well plates at 3E5 cells per well. The cells were transfected with 500ng and 100ng formulated circRNA.

[0682] At 48 hours post transfection, the cells were collected, washed and stained with viability dye (LIVE / DEADTM Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, L34963, ThermoFisher) and biotinylated CD19 protein (RPL-P81Q7, ACRO) . After washing to remove unbound protein, stain the cells with streptavidin-APC (STN-NA113, ACRO) . The labelled cells were then analyzed on a flow cytometer, and the expression level is shown in Figure 9.

[0683] Raji-luc cells were collected, and live cells were added into 96-well plate, at a concentration of 1E5 cells / ml, 100μl  / well. CAR-T cells were collected, followed by counting cell number, and then adjusting concentration of live cells to 1E5 or 2E4 cells / ml. 100μL CAR-T cells were added into 96-well with plated Raji-Luc cells. K562-Luc cells were collected, followed by adjusting live cell concentration to 1E5 cells / ml, and adding the cells into 96-well plate, 100μl  / well. CAR-T cells were collected, followed by counting cell number, and then adjusting concentration of live cells to be 1E6 or 5E5 cells / ml. 100μL CAR-T cells were added into 96-well with plated K562-Luc cells.

[0684] At 24 hours post coincubation, the target cell death was monitored through the measurement of Bioluminescence. Raji cells or K562 cells co-incubated with untransfected T cells were used as control. The percentage of target cell death from cell supernatant was calculated as followed. Percentage of target cell death %= (1-Luc treated / Luc control) X 100. The killing rate is shown in Figure 10.

[0685] The scFvs used for constructing the circCAR RNAs in this Example are affinity matured and humanized. Specifically, fusion proteins of candidate anti-CD19 scFv and human IgG1 were prepared and purified, and their binding affinity to human CD19 protein were evaluated with Bio-layer Interferometry (BLI) by Kyinno Biotechnology. Binding affinity (KD) of exemplary fusion proteins are provided in Table 15.

[0686] Table 15

[0687] Example 6. ICI-CAR can efficiently kill tumor cells in vitro and in vivo

[0688] 1. Lipid Nanoparticles (LNPs) Preparations

[0689] 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) , Cholesterol, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-NH2 were from Sinopeg Lipids. DSPE-PEG5000-NH2 was from Ruixi Lipids. Ionizable lipids were self-synthesized and purified. The Quant-itTM RiboGreen RNA Assay Kit was from ThermoFisher Scientific. The structure of the ionizable lipid and the formulation of the lipid composition are provided in Tables 16 and 17.

[0690] Table 16: Ionizable Lipid#and Lipid Structure

[0691] Table 17

[0692] Ionizable lipids (listed above) , helper lipid DSPC, cholesterol, and stealth lipid DSPE-PEG2000 and anchor DSPE-PEG2000-NH2 (or DSPE-PEG5000-NH2) were mixed in absolute ethanol, at a N / P ratio listed in the Table above. Circular RNA payloads (RX1421, RX1660 and RX1697) were suspended in 25mM Acetate Buffer (pH 4.5) . To form LNPs, three volumes of CAR encoding RNA were mixed with one volume of lipids in ethanol solution by microfluidic mixing with the INanoTM L+ (Micro&Nano) at a flow rate of 12 ml / min. The N / P ratio of ionizable lipid to circular RNA (cRNA) payload was 6. After encapsulation, the LNP were dialyzed twice against PBS. The LNP formulation was concentrated to target RNA concentration > or = 0.100 mg / mL by  Ultra Centrifugal Filter (100 kDa MWCO) and filtered by a 0.65 / 0.22 um sterile filter.

[0693] 2. VHH conjugation and tLNP preparation

[0694] 2.1 Transglutaminase mTG is available from Zedira, Amicon Ultra-15 100kD (catalog UFC910096) is available from Milipore.

[0695] 2.2 Sequence of anti-CD7 VHH (with Q tag, T017) ) :

[0696] 2.3 Method

[0697] a) VHH conjugation on parental LNP

[0698] Anti-CD7 VHH was mixed firstly with mTG enzyme at the ratio in the list below. The mixture of VHH mTG was added in the solution of parental LNP. The mixture was then placed in incubated under 25 ℃ for a time range listed in Table 18 below and shake in a thermomixer at 300 rpm.

[0699] b) Removal of unconjugated VHH and mTG enzyme

[0700] Unconjugated VHH and mTG enzyme were removed by centrifuge tube of 100 KDa.

[0701] Table 18: Reaction Parameters

[0702] In vitro potency

[0703] Human PBMCs from healthy donors were obtained from Shanghai Saily Biotechnology Co., Ltd. The cell density was adjusted to 5E5 / ml with culture medium (90%1640+ 10%HI FBS + 1%PS+300U / ml IL2) and cells were added into 24-well plate at 1ml / well. The cells were transfected with 50ng and 5ng formulated circRNA and incubated at 37℃ CO2 Incubator for 72 hours with duplicate wells.

[0704] At 72 hours post transfection, the cells were collected, washed and stained with viability dye (LIVE / DEADTM Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, L34963, ThermoFisher) , FITC anti-human CD3 Antibody (300440, Biolegend) and BD PharmingenTM PE-CyTM7 Mouse Anti-Human CD4 (557852, BD Biosciences) . The CAR positive cells were stained with biotinylated recombinant Protein L, His, AvitagTM (RPL-P81Q7, ACRO) . After washing to remove unbound protein, stain the cells with streptavidin-APC (STN-NA113, ACRO) . The B cells were stained with PE anti-human CD19 antibody (302254, Biolegend) to identify the killing efficiency.

[0705] The labelled cells were then analyzed on a flow cytometer, and the results were shown in Figure 11. CircRNA medated CARs were expressed in both CD4 positive and CD8 positive cells. Circular RNAs RX1660 and RX1697 had similar expression levels and B cell killing efficiency as circular RNA RX1421. CAR expression was observed within the CD3-positive T cell population. This population was further divided into well-defined CD4-positive and CD4-negative subsets, and CAR expression was present in both.

[0706] In vivo efficacy

[0707] NOG mice (NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug / JicCrl, N=3) , female, 7-8 weeks, were injected with 0.01 mg*kg-1 of circRNA-LNPs encoding CAR by intravenous injection. On day 0 (D0) , each mouse was inoculated intravenously with 5 × 105 Raji-Luc cells (luciferase-expressing Raji lymphoma cells) to establish tumors. On day 3 (D3) , all mice received 1 × 107 human peripheral blood mononuclear cells (hPBMCs) via intravenous injection to engraft a humanized immune system, followed by the first bioluminescence imaging to quantify baseline tumor burden via luciferase (Luc) signal and re-grouping. circRNA-LNPs were administered systemically on day 4 (D4) and day 8 (D8) . Tumor progression was monitored through serial in vivo bioluminescence imaging at four timepoints: day 3 (pre-treatment baseline) , day 8 (post-first circRNA-LNP dose) , day 11 (mid-treatment) , and day 14 (endpoint) , animals were intraperitoneally injected with 15 mg / ml of Luciferin substrate and whole-body luminescence was determined by a bioluminescent in vivo imaging system (IVIS) .

[0708] As shown in Figure 12, circRNAs produced from different precursors i.e. RX1421, RX1660 and RX1697 coated with the same LNP showed comparable anti-tumor effects in mice. Region of interest (ROI) analysis measured the intensity of luciferase within the tumor region of a mouse model. The resulting luminescent signal served as a biomarker for tumor size, with lower values indicating smaller tumors.

[0709] Dose-dependent anti-tumor effect

[0710] NOG mice (NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug / JicCrl, N=3) , female, 7-8 weeks, were injected with 0.003 to 0.1 mg*kg-1 of circRNA-LNPs encoding CAR by intravenous injection. On day 0 (D0) , each mouse was inoculated intravenously with 5 × 105 Nalm6-Luc cells (luciferase-expressing Nalm6 human B cell precursor leukemia cell line) to establish tumors. On day 6 (D6) , all mice received 1 × 107 human peripheral blood mononuclear cells (hPBMCs) via intravenous injection to engraft a humanized immune system, followed by the first bioluminescence imaging to quantify baseline tumor burden via luciferase (Luc) signal and re-grouping. circRNA-LNPs were administered systemically on day 7 (D7) and day 14 (D14) . Tumor progression was monitored through serial in vivo bioluminescence imaging at four timepoints: day 6 (pre-treatment baseline) , day 10 (3 days post-first circRNA-LNP dose) , day 14 (7 days post-first odse and pre-second dose) , day 17 (3 days post-second dose) , day 20 (6 days post-second dose) and day 21 (end point) animals were intraperitoneally injected with 15 mg / ml of Luciferin substrate and whole-body luminescence was determined by a bioluminescent in vivo imaging system (IVIS) .

[0711] As shown in Figure 13, circRNA RX1697 coated with LNP demonstrated a dose-dependent anti-tumor effect. Across the tested doses of 0.003 mpk, 0.01 mpk, 0.03 mpk, and 0.1 mpk, the three higher doses (0.01, 0.03, and 0.1 mpk) all showed robust tumor cell killing activity, with the 0.1 mpk dose being particularly effective. Even at the lowest dose of 0.003 mpk, RX1697 still effectively suppressed tumor growth, although its potency was less pronounced compared to the higher doses.

[0712] The sequences mentioned in the Examples are listed as below

[0713] Table 19

[0714] While the invention is described in conjunction with the enumerated embodiments, it will be understood that they are not intended to limit the invention to those embodiments. The invention is intended to cover all alternatives, modifications, and equivalents that may be included within the scope of the present invention. One skilled in the art will recognize many methods and materials similar or equivalent to those described herein, which could be used in the practice of the present invention. The present invention is in no way limited to the methods and materials described. In the event that one or more of the incorporated literature, patents, and similar materials differs from or contradicts this application, including but not limited to defined terms, term usage, described techniques, or the like, this application controls.

[0715] All references including patents, patent applications and publications cited in the present application are incorporated herein by reference in their entirety, as if each of them is individually incorporated. Further, it would be appreciated that one skilled in the art could make various changes or modifications to the invention without departing from the scope of the invention defined by the appended claims below. Accordingly, the present invention is not intended to be limited to the disclosed embodiments. Rather the present invention is intended to cover the disclosed embodiments as well as others falling within the scope and spirit of the invention to the fullest extent permitted in view of this disclosure and the inventions defined by the claims appended herein below.

Claims

1.A circular RNA molecule encoding a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) , wherein said CD19-specific chimeric antigen receptor comprises a CD19 binding domain,wherein the CD19 binding domain comprises a light chain variable (VL) region and a heavy chain variable (VH) region, wherein the VL region comprises VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 and the VH region comprises VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3, wherein the VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 are selected from any one of the following groups,(1) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 109, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 110;(2) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 123, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 124;(3) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 253, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 254;(4) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 229, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 230;(5) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 131, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 132;(6) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 139, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 140;(7) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 147, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 148;(8) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 155, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 156;(9) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 163, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 164;(10) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 245, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 246;(11) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 261, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 262;(12) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 173, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 174;(13) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 175, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 176; and(14) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 185, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 186.2.The circular RNA molecule of claim 1, wherein the VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 are selected from any one of the following groups,(a) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 97, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 98, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 99, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 100, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 101, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 102;(b) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 103, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 104, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 105, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 106, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 107, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 108;(c) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 247, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 248, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 249, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 250, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 251, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 252;(d) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 223, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 224, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 225, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 226, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 227, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 228;(e) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 125, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 126, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 127, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 128, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 129, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 130;(f) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 133, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 134, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 135, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 136, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 137, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 138;(g) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 141, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 142, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 143, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 144, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 145, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 146;(h) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 149, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 150, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 151, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 152, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 153, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 154;(i) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 157, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 158, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 159, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 160, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 161, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 162;(j) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 239, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 240, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 241, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 242, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 243, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 244; and(k) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 255, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 256, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 257, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 258, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 259, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 260.3.The circular RNA molecule of claim 1 or 2, wherein the VH and VL regions respectively comprise an amino acid sequence selected from any one of the following groups, or a variant thereof with one or several conservative amino acid substitutions in residues that are not within a CDR,(i) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 109, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 110;(ii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 123, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 124;(iii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 253, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 254;(iv) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 229, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 230;(v) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 131, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 132;(vi) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 139, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 140;(vii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 147, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 148;(viii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 155, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 156;(ix) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 163, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 164;(x) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 245, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 246;(xi) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 261, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 262;(xii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 173, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 174;(xiii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 175, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 176; and(xiv) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 185, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 186.4.The circular RNA molecule of any one of the preceding claims, wherein the CD19 binding domain is a scFv, preferably a humanized scFv.5.The circular RNA molecule of any one of the preceding claims, wherein the CD19 binding domain comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13-16, 41-46 and 61-67.6.The circular RNA molecule of any one of the preceding claims, wherein the chimeric antigen receptor further comprises a hinge-transmembrane domain, preferably, the hinge-transmembrane domain comprises a CD28 hinge-transmembrane domain, such as, a CD28 hinge-transmembrane domain comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 47.7.The circular RNA molecule of any one of the preceding claims, wherein the chimeric antigen receptor further comprises a costimulatory domain, preferably, the costimulatory domain comprises a CD28 costimulatory domain or a 4-1BB costimulatory domain, such as, a CD28 costimulatory domain comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 or a 4-1BB costimulatory domain comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 198.8.The circular RNA molecule of any one of the preceding claims, wherein the chimeric antigen receptor further comprises an intercellular signaling domain, preferably, the intercellular signaling domain comprises a CD3ζ signaling domain, such as, a CD3ζ signaling domain comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49.9.The circular RNA molecule of any one of the preceding claims, wherein the chimeric antigen receptor further comprises a signal peptide, preferably, the signal peptide comprises a CSF2RA signal peptide, such as, a CSF2RA signal peptide comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 194.10.The circular RNA molecule of claim 9, wherein the chimeric antigen receptor comprises, in the order from N-terminus to C-terminus, the signal peptide, the CD19 binding domain, the hinge-transmembrane domain, the costimulatory domain, and the intercellular signaling domain.11.The circular RNA molecule of any one of the preceding claims, wherein the chimeric antigen receptor comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 68-80, 200-203 and 205-208.12.The circular RNA molecule of any one of the preceding claims, further comprising an internal ribosome entry site (IRES) .13.The circular RNA molecule of any one of the preceding claims, comprising a nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2-5, 7-10, 51-60 and 81-88.14.A pharmaceutical composition comprising the circular RNA molecule of any one of claims 1-13.15.The composition of claim 14, wherein the circular RNA molecule is encapsulated in a LNP, preferably a T cell targeted LNP.16.The composition of claim 15, wherein the T cell targeted LNP is conjugated with an antibody capable of specifically binding to CD3, CD7, or CD8, or an antigen binding fragment thereof.17.Use of the circular RNA molecule of any one of claims 1-13, or the composition of any one of claims 14-16 in the manufacture of a medicament for preventing or treating a disease in a subject.18.A method of treating a disease in a subject, comprising administering an effective amount of the circular RNA molecule of any one of claims 1-13 or the composition of any one of claims 14-16 to the subject.19.The use of claim 17 or the method of claim 18, wherein said disease is an autoimmune disease, or a malignant B cell disease such as an acute or chronic B cell leukemia or a B cell lymphoma.20.The use or method of claim 19, wherein the autoimmune disease is a severe, a relapsing, or a refractory autoimmune disease.21.A precursor RNA for generating a circular RNA, comprising a ribozyme mediated self-cleavage circularization system and a linear form of the circular RNA molecule of any one of claims 1-13.22.The precursor RNA of claim 21, comprising a nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 89-96 and 211-220.23.A method of producing a circular RNA, comprising allowing the precursor RNA of claim 21 or 22 to undergo self-cleavage circularization to produce the circular RNA.24.A method for expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) in a cell, comprising introducing the circular RNA molecule of any one of claims 1-13 into the cell.25.The method of claim 24, wherein the method is performed in vivo, in vitro or ex vivo.26.The method of claim 24 or 25, wherein the cell is a T cell.27.A CD19 binding protein capable of specifically binding to CD19, comprising a light chain variable (VL) region and a heavy chain variable (VH) region, wherein the VL region comprises VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 and the VH region comprises VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3, wherein the VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 are selected from any one of the following groups,(1) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 109, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 110;(2) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 123, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 124;(3) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 253, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 254;(4) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 229, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 230;(5) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 131, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 132;(6) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 139, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 140;(7) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 147, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 148;(8) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 155, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 156;(9) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 163, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 164;(10) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 245, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 246;(11) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 261, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 262;(12) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 173, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 174;(13) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 175, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 176; and(14) VL-CDR1, VL-CDR2, and VL-CDR3 contained in SEQ ID NO: 185, and VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 contained in SEQ ID NO: 186.28.The CD19 binding protein of claim 27, wherein the VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2, and VH-CDR3 are selected from any one of the following groups,(a) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 97, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 98, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 99, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 100, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 101, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 102;(b) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 103, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 104, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 105, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 106, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 107, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 108;(c) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 247, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 248, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 249, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 250, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 251, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 252;(d) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 223, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 224, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 225, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 226, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 227, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 228;(e) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 125, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 126, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 127, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 128, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 129, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 130;(f) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 133, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 134, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 135, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 136, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 137, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 138;(g) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 141, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 142, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 143, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 144, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 145, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 146;(h) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 149, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 150, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 151, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 152, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 153, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 154;(i) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 157, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 158, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 159, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 160, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 161, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 162;(j) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 239, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 240, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 241, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 242, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 243, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 244; and(k) VL-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 255, VL-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 256, VL-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 257, VH-CDR1 set forth in SEQ ID NO: 258, VH-CDR2 set forth in SEQ ID NO: 259, and VH-CDR3 set forth in SEQ ID NO: 260.29.The nucleic acid molecule of claim 27 or 28, wherein the VH and VL regions respectively comprise an amino acid sequence selected from any one of the following groups, or a variant thereof with one or several conservative amino acid substitutions in residues that are not within a CDR,(i) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 109, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 110;(ii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 123, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 124;(iii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 253, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 254;(iv) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 229, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 230;(v) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 131, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 132;(vi) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 139, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 140;(vii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 147, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 148;(viii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 155, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 156;(ix) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 163, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 164;(x) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 245, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 246;(xi) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 261, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 262;(xii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 173, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 174;(xiii) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 175, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 176; and(xiv) a VH comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 185, and a VL comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 186.30.The CD19 binding protein of any one of claims 27-29, which is an anti-CD19 antibody or an antigen binding fragment thereof.31.The CD19 binding protein of any one of claims 27-30, which is humanized.32.The CD19 binding protein of any one of claims 27-31, comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs:13-16, 41-46 and 61-67.

Images