Nucleic acid construct, vector, and approach to reduce high mannose of recombinant protein

Abstract

A nucleic acid construct comprising a first polynucleotide encoding MGAT1 gene or a homologous gene having at least 85% sequence identity thereof, a second polynucleotide encoding MGAT2 gene or a homologous gene having at least 85% sequence identity thereof, and a third polynucleotide encoding MAN2A2 gene or a homologous gene having at least 85% sequence identity thereof. A nucleic acid construct combination comprising a first, a second, and a third nucleic acid constructs, which comprise a first polynucleotide encoding MGAT1 gene or a homologous gene having at least 85% sequence identity thereof, a second polynucleotide encoding MGAT2 gene or a homologous gene having at least 85% sequence identity thereof, and a third polynucleotide encoding MAN2A2 gene or a homologous gene having at least 85% sequence identity thereof respectively. A method of regulating the high mannose glycoform content of a recombinant protein during a mammalian cell culture process is also provided, which comprises an expression of the recombinant protein and an overexpression of three proteins that are involved in an N-glycosylation pathway in a mammalian host cell. A highly effective method for reducing the high mannose glycoform content of recombinant proteins in CHO cells.

Description

NUCLEIC ACID CONSTRUCT, VECTOR, AND APPROACH TO REDUCE HIGH MANNOSE OF RECOMBINANT PROTEINFIELD OF THE INVENTION

[0001] The present disclosure relates to the fields of biotech and biopharmaceuticals, in particular to a nucleic acid construct, a vector, and an approach of co-overexpression of N-acetylglucosaminyltransferase and α-mannosidase to reduce high mannose content of recombinant protein.BACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] N-linked glycosylation (N-glycosylation) is known to play a key role in governing the properties of recombinant glycoproteins, such as potency, safety, immunogenicity, and pharmacokinetic clearance. Chinese hamster ovary (CHO) cells have been commonly used to produce therapeutic proteins. The majority of recombinant biopharmaceuticals, most of which are monoclonal antibodies, are produced using CHO cells. An important reason is their ability to produce glycoproteins with complex glycosylation similar to those produced in humans and therefore compatible with the human immune system. However, endogenous human IgG contains a relatively low percentage (<1%) of high-mannose glycan (Flynn, Gregory C et al. Molecular immunology vol. 47, 11-12 (2010) ) , which is contrary to most commercially available recombinant mAb biologics. For recombinant monoclonal antibody biopharmaceuticals, a range of high mannose (HM) up to 10%is generally regarded as acceptable (A–Mab: A Case Study in Bioprocess Development) . Compared to other glycosylation structures, high mannose structures in the Fc region of IgG are generally associated with faster serum clearance (Yu, Marcella, et al. mAbs vol. 4, 4 (2012) : 475-87. ) , thus potentially affecting efficacy, making mannosylation an important process to control during antibody production. In addition, high mannose glycoproteins are expected to be more immunogenic. Due to the above reasons, it is generally desirable to select a production cell line that produces IgG with lower high mannose glycosylation.

[0003] For regulation of high mannose glycoforms, there are many effective methods to increase high mannose glycoform content in the published literature, such as glucosidase and mannosidase inhibitor addition (Fuhrmann, U., Bause, E., Legler, G. et al. Nature 307, 755–758 (1984) ; Elbein, A D et al. The Journal of biological chemistry vol. 265, 26 (1990) : 15599-605; Yu, M. et al. (2012) MAbs 4, 475–487) , gene engineering (Sealover, Natalie R et al. Journal of biotechnology vol. 167, 1 (2013) : 24-32. ) , increasing culture time and osmolality and so on. However, there are relatively few studies on decreasing the high mannose glycoform content of a protein. Most of these works focus on the cell culture including production media screening (Powers, David N., et al. Biotechnology Progress 36.1 (2020) : e2903. ) , pH regulation, shorten culture time (Fan, Y. et al. Biotechnol. Bioeng. 112, 2172–2184) , lowing osmolality (US 20210115125A1) and some additives (Pacis, Efren et al. Biotechnology and bioengineering vol. 108, 10 (2011) : 2348-58. ) , etc. However, these methods are not universal and are generally cell-specific. At the same time, the adoption of these methods is often accompanied by a reduced yield, changes in cell culture behavior, and changes in other product quality attributes. It is still necessary to find some methods that can reduce high mannose glycoforms especially mannose-5 (Man5) of therapeutic proteins without sacrificing antibodies yield and affecting CHO cell culture performance. This present invention solves this need in the art by providing a method that regulates high mannose content by co-overexpression of N-acetylglucosaminyltransferase and α-mannosidase.SUMMARY OF THE INVENTION

[0004] In one aspect, the present invention provides a method of regulating the high mannose glycoform content of a recombinant protein during a mammalian cell culture process, in particular a method of reducing the high mannose glycoform content, especially Man5 of a recombinant glycoprotein produced in a mammalian host cell CHO-K1 by overexpressing 3 genes involved in the N-glycan pathway. This invention is the first time to simultaneously overexpress 3 proteins involved in the N-glycan pathway (MGAT1, MGAT2, and MAN2A2) to manipulate the high mannose glycoform content of a therapeutic protein in CHO cells. With this method, high mannose glycoforms of the antibody, especially Man5, can be easily and significantly reduced.

[0005] The overexpression of 3 proteins involved in the N-glycan pathway (MGAT1, MGAT2, and MAN2A2) is achieved by transfecting the host cell with vectors carrying the genes. In one embodiment, MGAT1, MGAT2, and MAN2A2 are co-transfected to a production cell line that has been previously transfected to express a recombinant protein. In another embodiment, MGAT1, MGAT2, and MAN2A2 are co-transfected with antibody-encoding genes to an empty host cell line. Besides, the transfection process was simplified by constructing these 3 genes into one vector. In yet another embodiment, the host cells CHO-K1 are transfected with MGAT1, MGAT2, and MAN2A2 in advance to be engineered, and then transfected with antibody expression plasmids.

[0006] Thus, the nucleic acid construct, the vector, the cell line comprising the genes involved in the N-glycan pathway are also included in the present invention.

[0007] In one aspect, a nucleic acid construct comprising a first polynucleotide encoding MGAT1 gene or a homologous gene having at least 85%sequence identity thereof, a second polynucleotide encoding MGAT2 gene or a homologous gene having at least 85%sequence identity thereof, and a third polynucleotide encoding MAN2A2 gene or a homologous gene having at least 85%sequence identity thereof is provided.

[0008] A vector comprising the nucleic acid construct described above is also provided.

[0009] In another aspect, a nucleic acid construct combination is provided. The nucleic acid construct combination comprises a first, a second, and a third nucleic acid constructs comprising a first polynucleotide encoding MGAT1 gene or a homologous gene having at least 85%sequence identity thereof, a second polynucleotide encoding MGAT2 gene or a homologous gene having at least 85%sequence identity thereof, and a third polynucleotide encoding MAN2A2 gene or a homologous gene having at least 85%sequence identity thereof respectively.

[0010] A vector combination is also provided. The vector combination comprises a first, a second, and a third vectors comprising the first, the second, and the third nucleic acid constructs defined above.

[0011] In yet another aspect, an engineered mammalian cell line comprising the nucleic acid construct, the vector, the nucleic acid construct combination, or the vector combination described herein is provided. In one embodiment, the engineered mammalian cell line is capable of expressing a recombinant protein.

[0012] By employing the nucleic acid construct, the vector, the cell line, or the method described herein, the high mannose is decreased by 57%and 81%respectively in two exemplary experiments, along with a slight improvement in production. At the same time, the growth and metabolism of cells are not affected. The present invention thus provides a highly effective method for reducing the high mannose glycoform of recombinant proteins in CHO cells. The present invention focuses on the N-glycan synthesis pathway and regulates glycoforms through the overexpression of related enzymes. The same idea can also be applied to other cell lines with similar pathways.

[0013] In yet another aspect, a method of regulating the high mannose glycoform content of a recombinant protein during a mammalian cell culture process is provided. The method comprises an expression of the recombinant protein and an overexpression of three proteins that are involved in an N-glycosylation pathway in a mammalian host cell, wherein the three proteins are N-acetyl-glucosaminyltransferase-1, N-acetyl-glucosaminyltransferase-2, and α-mannosidase.

[0014] In yet another aspect, a recombinant protein produced by the method described herein is provided.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0015] Figure 1 shows a schematic representation of targeting plasmid vectors carrying MGAT1, MGAT2, and MAN2A2 genes in three separate vectors, which were used in Example 1 and Example 2.

[0016] Figures 2-4 show the plasmid maps of pWX191-MGAT1, pWX191-MGAT2, and pWX191-MAN2A2 respectively.

[0017] Figure 5 shows the plasmid map of empty vector pWX191.

[0018] Figures 6 and 7 show the plasmid maps of pWX039-HC-Z-Humira and pWX040-LC-B-Humira respectively.

[0019] Figure 8 shows a schematic representation of targeting plasmid vectors carrying MGAT1, MGAT2, and MAN2A2 genes together in one vector, which was used in Example 3.

[0020] Figure 9 shows the plasmid map of pWX191-MGAT1-MGAT2-MAN2A2.

[0021] Figure 10 shows a schematic representation of targeting plasmid vectors carrying MGAT1, MGAT2 and MAN2A2 genes in three independent vectors, which were used in Example 4.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0022] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as is commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention pertains. All publications and patents referred to herein are incorporated by reference. Discussion of documents, acts, materials, devices, articles, or the like which has been included in the present specification is for the purpose of providing context for the present disclosure. Such discussion is not an admission that any or all of these matters form part of the prior art with respect to any inventions disclosed or claimed.

[0023] DEFINITION

[0024] MGAT1, MGAT2, and MAN2A2 are three proteins that are involved in an N-glycosylation pathway. MGAT1 (N-acetyl-glucosaminyltransferase-1, encoded by MGAT1 gene) is a medial Golgi enzyme that catalyzes the first step in the conversion of oligomannose-type N-glycans into complex and hybrid N-glycans. The protein sequence of MGAT1 is 445 amino acids in length and it has general characteristics of other Golgi transferases that are type II transmembrane proteins. MGAT2 (N-acetyl-glucosaminyltransferase-2, encoded by MGAT2 gene) is a pivotal enzyme in the monoacylglycerol pathway for triacylglycerol synthesis. The enzyme is responsible for the final step in the synthesis of triacylglycerols, which are the main form of energy storage in adipose tissue. MAN2A2 (α-mannosidase, encoded by MAN2A2 gene) is a key enzyme involved in the posttranslational modification of proteins by N-glycosylation. It plays a crucial role in converting precursor high mannose-type N-glycans to mature complex-type structures. MGAT1, MGAT2, and MAN2A2 genes are referred to as function genes in the present disclosure.

[0025] The terms “polynucleotide, ” “nucleic acid” “nucleic acid construct” and “nucleic acid molecule” are used herein to include a polymeric form of nucleotides of any length, either ribonucleotides or deoxyribonucleotides. This term refers only to the primary structure of the molecule. Thus, the term also includes modifications, such as by methylation and / or by capping, and unmodified forms of the polynucleotide.

[0026] The terms “vector” , “cloning vector” and “expression vector” mean the vehicle by which a DNA or RNA sequence (e.g., a foreign gene) can be introduced into a host cell so as to transform the host and promote expression (e.g., transcription and translation) of the introduced sequence. Vectors may include plasmids, phages, viruses, etc. and are known in the art and discussed in greater detail below. In some embodiments, vectors herein are suitable to be introduced into a mammalian host cell so as to promote expression of a recombinant protein.

[0027] “Encode, ” as used in reference to a nucleotide sequence of nucleic acid encoding a gene product, e.g., a polypeptide, of interest, is meant to include instances in which a nucleic acid contains a nucleotide sequence that is the same as in a cell or genome that, when transcribed and / or translated into a polypeptide, produces the gene product. In some instances, a nucleotide sequence or nucleic acid encoding a gene product does not include intronic sequences.

[0028] “Recombinant” as used herein to describe a nucleic acid molecule means a polynucleotide of genomic, cDNA, semisynthetic, or synthetic origin which, by virtue of its origin or manipulation is not associated with all or a portion of the polynucleotide with which it is associated in nature. The term “recombinant” as used with respect to a protein or polypeptide means a polypeptide produced by expression of a recombinant polynucleotide. In general, the gene of interest is cloned and then expressed in transformed organisms, as described further below. The host organism expresses the foreign gene to produce the protein under expression conditions. Thus, for example, recombinant cells, such as a recombinant host cell, express genes that are not found within the native (naturally occurring) form of the cell or express a second copy of a native gene that is otherwise normally or abnormally expressed, under expressed or not expressed at all.

[0029] A “host cell, ” as used herein, denotes an in vitro eukaryotic cell (e.g., a mammalian cell, such as, a CHO cell line) , which eukaryotic cell can be, or has been, used as a recipient for a nucleic acid, and include the progeny of the original cell which has been genetically modified by the nucleic acid. It is understood that the progeny of a single cell may not necessarily be completely identical in morphology or in genomic or total DNA complement as the original parent, due to natural, accidental, or deliberate mutation. A “recombinant host cell” (also referred to as an “engineered host cell” ) is a host cell into which has been introduced a heterologous nucleic acid, e.g., an expression vector. For example, a subject eukaryotic host cell is a genetically modified eukaryotic host cell, by virtue of introduction into of a heterologous nucleic acid, e.g., an exogenous nucleic acid that is foreign to the eukaryotic host cell, or a recombinant nucleic acid that is not normally found in the eukaryotic host cell.

[0030] The terms “mammalian host cell, ” “host cell, ” and “mammalian cell” refer to cell lines derived from mammals that are capable of growth and survival when placed in either monolayer culture or in suspension culture in a medium containing the appropriate nutrients and growth factors. Typically, such cells are capable of expressing and secreting large quantities of a particular glycoprotein of interest into the culture medium.

[0031] As used herein, the term “cell line” refers to a population of cells produced from a single cell and therefore consisting of cells with a uniform genetic makeup.

[0032] The terms “expression, ” “express” and “expresses” generally refer to transcription and translation occurring within a host cell. The level of expression of gene product in a host cell may be determined on the basis of either the amount of corresponding mRNA that is present in the cell or the amount of the protein encoded by the gene. For example, mRNA transcribed from a product gene can be quantitated by Northern hybridization. (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 7.3-7.57, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ) . A protein encoded by a gene can be quantitated either by assaying for the biological activity of the protein or by employing assays that are independent of such activity, such as, for example, Western blotting analysis or radioimmunoassay using antibodies that are capable of reacting with the protein. (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 18.1-18.88 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ) . In some embodiments, the terms “expression, ” “express” and “expresses” are used in reference to a recombinant protein having low-mannose content produced by a method of the invention.

[0033] The method disclosed herein regulates the properties of the protein of interest during a mammalian cell culture process. The term “protein of interest” includes naturally occurring proteins, recombinant proteins, and engineered proteins (e.g., proteins that do not occur in nature and which have been designed and / or created by humans) . A protein of interest can, but need not be, a protein that is known or suspected to be therapeutically relevant. Particular examples of a protein of interest include antigen binding proteins (as described and defined herein) , peptibodies (i.e., a molecule comprising peptide (s) fused either directly or indirectly to other molecules such as an Fc domain of an antibody, where the peptide moiety specifically binds to a desired target; the peptide (s) may be fused to either an Fc region or inserted into an Fc-Loop, or a modified Fc molecule, for example as described in U.S. Patent Application Publication No. US2006 / 0140934 incorporated herein by reference in its entirety) , fusion proteins (e.g., Fc fusion proteins, wherein a Fc fragment is fused to a protein or peptide, including a peptibody) , cytokines, growth factors, hormones and other naturally occurring secreted proteins, as well as mutant forms of naturally occurring proteins.

[0034] The term “antigen binding protein” is used in its broadest sense and means a protein comprising a portion that binds to an antigen or target and, optionally, a scaffold or framework portion that allows the antigen binding portion to adopt a conformation that promotes binding of the antigen binding protein to the antigen. Specific examples of known antibodies which can be produced using the methods of the invention include but are not limited to adalimumab, bevacizumab, infliximab, abciximab, alemtuzumab, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, briakinumab, brodalumab, canakinumab, certolizumab pegol, cetuximab, conatumumab, denosumab, eculizumab, etrolizumab, evolocumab, gemtuzumab ozogamicin, golimumab, ibritumomab tiuxetan, labetuzumab, mapatumumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, muromonab-CD3, natalizumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, ranibizumab, rituximab, rovelizumab, tocilizumab, tositumomab, trastuzumab, ustekinumab, vedolizomab, zalutumumab, and zanolimumab.

[0035] The invention finds particular utility in regulating the presence and / or amount of glycosylation of a recombinant protein. The cell lines (also referred to as “host cells” ) used in the invention are genetically engineered to express a polypeptide of commercial or scientific interest. Cell lines are typically derived from a lineage arising from a primary culture that can be maintained in culture for an unlimited time. Genetically engineering the cell line involves transfecting, transforming or transducing the cells with a recombinant polynucleotide molecule, and / or otherwise altering (e.g., by homologous recombination and gene activation or fusion of a recombinant cell with a non-recombinant cell) so as to cause the host cell to express a desired recombinant polypeptide. Methods and vectors for genetically engineering cells and / or cell lines to express a polypeptide of interest are well known to those of skill in the art.

[0036] The terms “low-mannose” and “low-mannose content, ” as used herein, refer to a glycoprotein composition, where no more than about 10%of the composition comprises glycoproteins having more than 4 mannose residues, i.e., species M5 or greater. Conversely, “high-mannose content” refers to a glycoprotein composition where more than about 10%of the composition comprises glycoproteins having more than 4 mannose residues. The terms “low mannose” and “low mannose content, ” are also used in reference to a glycoprotein composition including greater than about 90%, or greater than about 95%of the composition having glycoproteins including 4 or fewer than 4 mannose residues.

[0037] The term “aglycoprotein having low-mannose content” is used in reference to a recombinant glycoprotein composition, which when produced by culturing a host cell, includes, but are not limited thereto, no more than about 4%, no more than about 5%, no more than between about 4%and about 5%, no more than about 6%, no more than between about 5%and 6%, no more than about 7%, no more than between about 6%and 7%, no more than about 8%, no more than about 7%and 8%, no more than about 9%, no more than between 8%and 9%, no more than about 10%, or no more than between about 9%and 10%of the glycoproteins in the composition having greater than 4 mannose residues (i.e., species M5 or greater) . Accordingly, the term “aglycoprotein having low-mannose content” refers to a recombinant glycoprotein composition, which when produced by culturing a host cell, includes greater than about 90%, or greater than about 95%, of the glycoproteins in the composition having 4 or fewer than 4 mannose residues (i.e., 0-4 mannose residues) .

[0038] The term “fed-batch culture” refers to a form of suspension culture and means a method of culturing cells in which additional components are provided to the culture at a time or times subsequent to the beginning of the culture process. The provided components typically comprise nutritional supplements for the cells which have been depleted during the culturing process. Additionally or alternatively, the additional components may include supplementary components (e.g., a cell-cycle inhibitory compound) . A fed-batch culture is typically stopped at some point and the cells and / or components in the medium are harvested and optionally purified.

[0039] The present invention provides a nucleic acid construct comprising a first polynucleotide encoding MGAT1 gene or a homologous gene having at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5%, or at least 99.9%sequence identity thereof, a second polynucleotide encoding MGAT2 gene or a homologous gene having at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5%, or at least 99.9%sequence identity thereof, and a third polynucleotide encoding MAN2A2 gene, or a homologous gene having at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5%, or at least 99.9%sequence identity thereof.

[0040] In some embodiments, an IRES element is connected to the 5’ end of each of the first, the second, and the third polynucleotides. In some embodiments, the first, the second, and the third polynucleotides are linked to SV40 promoter.

[0041] The present invention also provides a vector comprising the nucleic acid construct described herein.

[0042] In some particular embodiments, the vector has a structure as shown in Figure 8.

[0043] The present invention also provides a nucleic acid construct combination comprising a first, a second, and a third nucleic acid constructs, wherein the first, the second, and the third nucleic acid constructs comprise a first polynucleotide encoding MGAT1 gene or a homologous gene having at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5%, or at least 99.9%sequence identity thereof, a second polynucleotide encoding MGAT2 gene or a homologous gene having at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5%, or at least 99.9%sequence identity thereof, and a third polynucleotide encoding MAN2A2 gene or a homologous gene having at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5%, or at least 99.9%sequence identity thereof respectively.

[0044] In some embodiments, an IRES element is connected to 5’ end of each of the first, the second, and the third polynucleotides defined above.

[0045] The present invention also provides a vector combination comprising a first, a second, and a third vectors, wherein the first, the second, and the third vectors comprise the first, the second, and the third nucleic acid constructs defined above respectively. In some particular embodiments, the vector combination comprises three vectors with structures as shown in Figure 1 or Figure 10. The present invention also provides an engineered mammalian cell line comprising the nucleic acid construct, the vector, the nucleic acid construct combination, or the vector combination described herein.

[0046] In some embodiments, the engineered mammalian cell line is a mammalian cell selected from the group consisting of Chinese Hamster Ovary (CHO) cell, NS0, SP2 / 0 and HEK293; preferably the CHO cell is selected from the group consisting of CHO-K1, CHO-Lec1, CHO-Lec10, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO DX B11 and CHO DG44.

[0047] In some embodiments, the engineered mammalian cell line overexpresses N-acetyl-glucosaminyltransferase-1 encoded by MGAT1 gene, N-acetyl-glucosaminyltransferase-2 encoded by MGAT2 gene, and α-mannosidase encoded by MAN2A2 gene.

[0048] In some embodiments, the engineered mammalian cell line is capable to express a recombinant protein; preferably the engineered mammalian cell line has been previously transfected or integrated to express the recombinant protein; more preferably the recombinant protein is expressed with a high mannose glycoform content less than or equal to 6.5%. In some preferred embodiments, the high mannose glycoform content is less than or equal to 2%, 2.5%, 2.7%, 5.5%, 5.7%, or 6.5%.

[0049] The present invention also provides a method of regulating the high mannose glycoform content of a recombinant protein during a mammalian cell culture process, comprising an expression of the recombinant protein and an overexpression of three proteins that are involved in an N-glycosylation pathway in a mammalian host cell, wherein the three proteins are N-acetyl-glucosaminyltransferase-1, N-acetyl-glucosaminyltransferase-2, and α-mannosidase.

[0050] In some embodiments, the expression of the recombinant protein is achieved by introducing a polynucleotide encoding the recombinant protein, and the overexpression of three proteins is achieved by introducing the nucleic acid construct, the vector, the nucleic acid construct combination, or the vector combination described herein to the mammalian host cell.

[0051] In some preferred embodiments, the mammalian host cell has been previously transfected or integrated to express the recombinant protein before the overexpression of the three proteins that are involved in an N-glycosylation pathway. In some preferred embodiments, the mammalian host cell has been previously transfected or integrated to express the three proteins that are involved in an N-glycosylation pathway before the expression of the recombinant protein. In some preferred embodiments, the mammalian host cell is co-transfected to express the recombinant protein and to overexpress the three proteins that are involved in an N-glycosylation pathway.

[0052] In some embodiments, the recombinant protein is a protein comprising an antibody Fc region, preferably the recombinant protein is selected from the group consisting of Fc fusion proteins, antibodies, immunoglobulins, and peptibodies.

[0053] In some embodiments, the high mannose glycoform content of the recombinant protein expressed in the host cell is decreased compared to that produced by a culture where the cells do not overexpress proteins that are involved in an N-glycosylation pathway. In some preferred embodiments, the high mannose glycoform is selected from the group consisting of Mannose 5 (Man5) , Mannose 6 (Man6) , Mannose 7 (Man7) , Mannose 8 (Man8) , Mannose 9 (Man9) , and combinations thereof.

[0054] In some embodiments, the high mannose glycoform content of the recombinant protein is less than or equal to 6.5%. In some preferred embodiments, the high mannose glycoform content of the recombinant protein is less than or equal to 2%, 2.5%, 2.7%, 5.5%, 5.7%, or 6.5%.

[0055] In some embodiments, the high mannose glycoform content of the recombinant protein is reduced by at least 40%compared to that produced by a culture where the cells do not overexpress proteins that are involved in an N-glycosylation pathway. In some particular embodiments, the high mannose glycoform content of the recombinant protein is decreased by at least 40%, 57%, 70%or 80%.

[0056] In some embodiments, the mammalian cell culture process utilizes a fed-batch culture process, a perfusion culture process, and combinations thereof.

[0057] In some embodiments, the mammalian host cell is a mammalian cell selected from the group consisting of Chinese Hamster Ovary (CHO) cell, NS0, SP2 / 0 and HEK293; preferably the CHO cell is selected from the group consisting of CHO-K1, CHO-Lec1, CHO-Lec10, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO DX B11 and CHO DG44.

[0058] In some embodiments, the method decreases the high mannose glycoform content of the recombinant protein, in particular the Man5 content. In some preferred embodiments, the Man5 content is less than or equal to 1.5%, 1.6%, 3.9%, 4.0%, 4.2%, 4.5%or 4.8%.

[0059] In some embodiments, the method further comprises a harvest step for the recombinant protein.

[0060] Thus, the present invention also provides a recombinant protein produced by the method described above. The recombinant protein is a protein comprising an antibody Fc region, preferably the recombinant protein is selected from the group consisting of Fc fusion proteins, antibodies, immunoglobulins, and peptibodies. In some embodiments, the high mannose glycoform content of the recombinant protein is less than or equal to 6.5%. In some preferred embodiments, the high mannose glycoform content of the recombinant protein is less than or equal to 2%, 2.5%, 2.7%, 5.5%, 5.7%, or 6.5%. In some preferred embodiments, the Man5 content of the recombinant protein is less than or equal to 1.5%, 1.6%, 3.9%, 4.0%, 4.2%, 4.5%or 4.8%.

[0061] The following examples are offered to illustrate but not to limit the invention. In order to facilitate understanding, the specific embodiments are provided to help interpret the technical proposal, that is, these embodiments are only for illustrative purposes, but not in any way to limit the scope of the invention. Unless otherwise specified, embodiments do not indicate the specific conditions and are in accordance with the conventional conditions or the manufacturer's recommended conditions.

[0062] EXAMPLES

[0063] Example 1

[0064] The overexpression experiments used a monoclonal antibody-producing Chinese Hamster Ovary cell line to express a recombinant human antibody (e.g. Humira) . This cell line was cloned using antibiotic-based selection and historically exhibited middle levels of high-mannose expression (about 12%) . Before transfection, the host cells were vial thawed and passaged in BM001HB4Z2 medium with selection pressure in a 50mL spin tube (TPP) for more than 1 week, and the spin tube was incubated in the shaking incubator (Kuhner) at 36.5℃, 85%humidity, 6%CO2 and 225 RPM with 50 mm orbital diameter. The host cells of the previous generation need to be passaged with pressure-free BM001H, otherwise the transfection efficiency will be affected.

[0065] Two transfections were performed in this work. The detailed transfection plan is listed in Table 1. The empty vector (pWX191, whose map is shown in Figure 5) and plasmids with function genes (whose maps were shown in Figures 2, 3, and 4 respectively) were stably transfected into the Humira expressing cell line (A clone from CHO-K1 transfected with Humira antibody sequence) by electroporation according to the manufacturer’s protocol. Briefly, all the transfections follow the same procedures below.

[0066] 1) . Humira expressing cell line need to be passaged over 1 week after vial thaw. The host cell can be passaged for 1-3 days until the day of transfection to ensure that the cell density on the day of transfection is 16-22E5 cells / mL, and the viability is higher than 98%.

[0067] 2) . Electroporator (Biorad-GenePulser Xcell) needs to be pre-warmed before transfection. Reagents including DPBS and plasmids required for transfection need to be pre-cooled in 4℃refrigerator. Medium for transfected cells’ culture needs to be pre-warmed in a 36.5 ℃ incubator.

[0068] 3) . Host cells were counted by Vicell (Beckman) before transfection. For each transfection, 1E7 host cells are required and centrifugated at 290g for 5min.

[0069] 4) . The supernatant was discarded and the cell pellets were re-suspended with pre-cooled DPBS.

[0070] 5) . Plasmids were mixed together with DPBS gently according to pre-calculated amounts needed for each transfection.

[0071] 6) . The plasmid reagent mixture and host cells were mixed carefully and then transferred to an electroporation cuvette for electroporation by an electroporator.

[0072] 7) . After electroporation, cells of each transfection were added to individual 10 mL pre-warmed BM001H (CD CHO Medium (Gibco) ) in spin tubes. The spin tubes were incubated in a shaking incubator.

[0073] 8) . About 24 hours after transfection, 10 mL of BM001HB8Z4G10 media (CD CHO Medium (Gibco) + 8 μg / mL of Blasticidin (Gibco) + 400 μg / mL of Zeocin (Gibco) + 1000 μg / mL of Geneticin (Gibco) ) was added to each spin tube for pressure selection.

[0074] Table 1. Transfection Plan

[0075] Note:

[0076] 1) . Monoclonal antibody Humira is the target protein used for evaluation in this work. Humira expressing cell line is a clone that produces Monoclonal antibody Humira.

[0077] 2) . Pool-01 was transfected with an empty vector and worked as the control group.

[0078] 3) . Pool-02 was transfected with MGAT1, MGAT2 and MAN2A2. These 3 genes were on 3 independent plasmids.

[0079] The cells derived from one transfection were defined as one pool. Each pool was passaged every 2 or 3 days after transfection. The selection medium was BM001HB4Z2G5 (CD CHO Medium (Gibco) + 4 μg / mL of Blasticidin (Gibco) + 200 μg / mL of Zeocin (Gibco) + 500 μg / mL of Geneticin (Gibco) ) . After cells were recovered from selection pressure, all pools were evaluated by fed-batch culture in spin tubes.

[0080] The recovered stable pools were evaluated by fed-batch cultures according to the protocol shown in Table 2. Fed-batch culture medium is ActiProTM Cell Culture Media (Gibco) . Feeds-Cell BoostTM 7a Supplement (HyClone) and Cell BoostTM 7b Supplement (HyClone) were added at a level of 3%and 0.3%respectively on Days 3 / 5 / 7 / 9 / 11. The feeding day and percentages might be adjusted based on cell growth and metabolic profiles. Glucose was fed from the feed Cell BoostTM 7a Supplement (HyClone) and a glucose stock solution. The glucose concentration of the feed Cell BoostTM 7a Supplement (HyClone) is around 85g / L and the glucose concentration in the stock solution is 400g / kg. The target concentration of glucose was determined by the operator based on the same above described parameters (lactate concentration, glucose consumption and growth profile) .

[0081] Table 2. Protocol of pool fed-batch cultures

[0082] Pool fed-batch cells were harvested on D14 or when viability dropped below 60%by centrifugation at 3, 000 g for 10 min. Supernatants from harvested cultures were measured for titer by Protein-A HPLC and also were purified by one-step Protein-A chromatography and then analyzed for product quality analysis including SEC-UPLC and N-Glycan.

[0083] Pool fed-batch results were summarized in Table 3. Pool 01 and 02 were both harvested on Day 14 with similar end-run viability of around 60%. Both pools have a similar cell growth profile and lactate metabolism. Most importantly, the harvest titer of pool 01 and pool 02 are comparable.

[0084] Table 3. Fed-Batch Culture Results

[0085] The glycosylation analysis results are shown in the Table 4. In the empty vector (control) group, Man5 is the predominant high-mannose glycoform, and Man6-9 account for a very low proportion. Compared to the control, co-transfection of MGAT1, MGAT2 and MAN2A2 can remarkably reduce high mannose content by about 57%. Man5 is the most predominantly decreased high mannose glycoform.

[0086] Table 4. N_Glycan_LC Results of Pools

[0087] The SEC-UPLC testing was also performed for pool 01 and 02 and the detailed results were shown in Table 5. Compared to the control group, co-transfected with MGAT1, MGAT2 and MAN2A2 will not affect the purity of the antibody.

[0088] Table 5. SEC-UPLC Results of Pools

[0089] Example 2

[0090] CHO-K1 host cell was thawed and passaged in BM001H medium over one week for stable transfections. The CHO-K1 host cells were simultaneously transfected with heavy chain, light chain, as well as MGAT1, MGAT2 and MAN2A2 expression vectors (three vectors shown in Figure 1 and whose maps were shown in Figures 2, 3, and 4 respectively) . DNA of the heavy chain and the light chain of Humira were synthesized and cloned into the vectors pWX039 and pWX040 (WuXi Biologics proprietary) respectively to construct the final expression vectors pWX039-HC-Z-Humira (whose map is shown in Figure 6) and pWX040-LC-B-Humira (whose map is shown in Figure 7) .

[0091] The detailed stable transfection settings were listed in the Table 6. The stable transfections were performed, as described previously. Approximately 24 hours after transfection, 10 mL of BM001HB12Z8G10 media (CD CHO Medium (Gibco) + 12 μg / mL of Blasticidin (Gibco) + 800 μg / mL of Zeocin (Gibco) + 1000 μg / mL of Geneticin (Gibco) ) was added to each spin tube for pressure selection and then passaged with selection medium BM001HB6Z4G5 (CD CHO Medium (Gibco) + 6 μg / mL of Blasticidin (Gibco) + 400 μg / mL of Zeocin (Gibco) + 500 μg / mL of Geneticin (Gibco) ) . After recovery of these pools, they were evaluated by a fed-batch production run, and the fed-batch culture protocol was the same as that in Example 1. After the cells were harvested, supernatants of both pools were measured for titer by Protein-A HPLC, and also were purified by one-step Protein-A chromatography and analyzed for product quality analysis including SEC-UPLC and N-Glycan.

[0092] Table 6. Transfection Plan

[0093] Note:

[0094] 1) . Monoclonal antibody Humira is the target protein that will be produced by host cells after gene transfection and used for high mannose evaluation in this work.

[0095] 2) . Plasmids of pWX039-HC-Z-Humira and pWX040-LC-B-Humira contain the heavy chain and the light chain of target protein (monoclonal antibody Humira) for host cell antibody production respectively.

[0096] 3) . Pool 03 was co-transfected with an empty vector and worked as the control group.

[0097] 4) . Pool 04 was co-transfected with MGAT1, MGAT2 and MAN2A2. These 3 genes were on 3 independent plasmids.

[0098] Table 7 shows the cell growth and metabolism summary of fed-batch culture results. Pool 03 and 04 showed a similar cell culture performance. Both pool 03 and 04 were harvested on Day 14, and the end-run viability was much high around 82%. There was no lactate accumulation in both pools. Compared with the control pool, pool 04 exhibited a higher titer.

[0099] Table 7. Fed Batch Culture Results

[0100] Table 8 shows the N-Glycan-LC results of Pool 03 and 04. The high mannose content of pool 03 and 04 were 10.1%and 2.0%respectively, demonstrating that co-transfection with MGAT1, MGAT2 and MAN2A2 can significantly decrease the high mannose by over 80%. Meanwhile, the purity of expressed protein was not affected (Table 9) . From the N-glycan results in Example 1 and Example 2, the inventors can also see that the proportion of G0 increased after co-transfection of MGAT1, MGAT2 and MAN2A2. This is because the product of Man5 processed by the enzymes encoded by these three genes is G0, which means higher mannose glycoforms converted to G0.

[0101] Table 8. N-Glycan-LC Results of Pools

[0102] Table 9 SEC-UPLC Results of Pools

[0103] Example 3

[0104] To simplify the transfection process in Example 2, the plasmids of MGAT1, MGAT2 and MAN2A2 were optimized. In this example, the coding sequences of three genes, MGAT1, MGAT2 and MAN2A2 were constructed in one vector, with each gene connected by an IRES element. Figure 8 shows the schematic diagram of the 3-gene expression vector. The vector was cloned into pWX191 to obtain the final pWX191-MGAT1-MGAT2-MAN2A2 shown in Figure 9. In this example, the host cell transfected is still CHO-K1. The plasmid vectors carrying Humira heavy chain and light chain, together with 3 human glycosyltransferase genes (MGAT1, MGAT2 and MAN2A2) were transfected into CHO-K1 host cells. The detailed stable transfection protocol was listed in the Table 10. The stable transfection process and fed-batch cultures were performed, which is same as that in the Example 1.

[0105] Table 10. Transfection Plan

[0106] Note:

[0107] 1) . Monoclonal antibody Humira is the target protein that will be produced by host cells after gene transfection and used for high mannose evaluation in this work.

[0108] 2) . Plasmids of pWX039-HC-Z-Humira and pWX040-LC-B-Humira contain the heavy chain and the light chain of target protein (monoclonal antibody Humira) for host cell antibody production respectively.

[0109] 3) . Pool 03 was co-transfected with an empty vector and worked as the control group.

[0110] 4) . Pool 05 was co-transfected with MGAT1, MGAT2 and MAN2A2 and these 3 genes were constructed in one vector.

[0111] Table 11 shows the cell growth and metabolism summary of fed-batch culture results. The table shows that both pools were successfully cultured for 14 days. Pool 03 and 05 showed a similar cell culture performance including similar IVCD, end-run viability, end-run lactate, and so on. In addition, pool 03 and 05 exhibited the comparable harvest titer.

[0112] Table 11. Fed Batch Culture Results

[0113] Table 12 shows the N-Glycan-LC results of both pools. The high mannose content of pool 03 and 05 were 10.1%and 2.7%respectively. After co-transfection with the 3 function genes, the high mannose was remarkably reduced by over 73%. The results show that putting MGAT1, MGAT2 and MAN2A2 in one plasmid can also work, providing us with a way to optimize the transfection process.

[0114] Table 12. N-Glycan-LC Results

[0115] Table 13. SEC-UPLC Results of Pools

[0116] Example 4

[0117] In this example, the CHO-K1 host cells were first transfected with function genes. Here, the function genes including MGAT1, MGAT2, and MAN2A2 were constructed on 3 separate vectors which were integrated into the host genome by random integration. Two sets of vector designs were tested, where the first set of vectors was function genes initiated with SV40 (left panel of Figure 10) and the second vector was function genes placed behind an IRES element (right panel of Figure 10) . And these plasmids were linearized before transfection.

[0118] The first-round transfection settings are listed in Table 14. The stable transfection process is same as in the Example 1. Here, the selection medium was BM001HG5 (CD CHO Medium (Gibco) +500 μg / mL of Geneticin (Gibco) ) . After all pools were recovered, a second transfection with expression molecule plasmids was performed in the modified host cells. Table 15 shows the second-round transfection protocol. At this stage, the selection medium of pool 06 was BM001HB9Z4 (CD CHO Medium (Gibco) + 9 μg / mL of Blasticidin (Gibco) + 400 μg / mL of Zeocin (Gibco) ) , pool 07 and 08 were BM001HB6Z4G5 (CD CHO Medium (Gibco) + 6 μg / mL of Blasticidin (Gibco) + 400 μg / mL of Zeocin (Gibco) + 500 μg / mL of Geneticin (Gibco) ) . After all the transfected pools were completely recovered, the pools were evaluated by fed-batch cultures.

[0119] Table 14. First-round transfection Plan

[0120] Table 15. Second-round transfection Plan

[0121] The cell growth and metabolism of fed batch culture results for all pools were summarized in the Table 16.

[0122] Table 16. Fed Batch Culture Results

[0123] All pools were harvested on day 14 with a relatively high end-run viability and good lactate metabolism. Compared to the pool 06, there was a slight decrease in harvest titer in pools 07 and 08 which had been transfected with 3 function genes before. All pools were purified by one-step Protein A chromatography and then analyzed for N-glycan and SEC purity. The glycoform analysis results are shown in Table 17. The high mannose content of pool 06, 07 and 08 were 10.9%, 6.5%and 5.7%respectively. After being transfected with 3 function genes, the high mannose was reduced by over 40%for both pools. The result shows that genetically modified host cells have lower high mannose content, especially man5 and comparable purity (Table 18) . This demonstrates another way to use the 3 genes in which the host ells were genetically engineered first by overexpressing MGAT1, MGAT2 and MAN2A2.

[0124] Table 17. N-Glycan-LC Results of Pools

[0125] Table 18. SEC-UPLC Results of Pools

Claims

1.A nucleic acid construct comprising a first polynucleotide encoding MGAT1 gene or a homologous gene having at least 85%sequence identity thereof, a second polynucleotide encoding MGAT2 gene or a homologous gene having at least 85%sequence identity thereof, and a third polynucleotide encoding MAN2A2 gene or a homologous gene having at least 85%sequence identity thereof.2.The nucleic acid construct according to claim 1, wherein an IRES element is connected to the 5’ end of each of the first, the second, and the third polynucleotides.3.A vector comprising the nucleic acid construct according to claim 1.4.A nucleic acid construct combination comprising a first, a second, and a third nucleic acid constructs, wherein the first, the second, and the third nucleic acid constructs comprise a first polynucleotide encoding MGAT1 gene or a homologous gene having at least 85%sequence identity thereof, a second polynucleotide encoding MGAT2 gene or a homologous gene having at least 85%sequence identity thereof, and a third polynucleotide encoding MAN2A2 gene or a homologous gene having at least 85%sequence identity thereof respectively.5.The nucleic acid construct combination according to claim 4, wherein an IRES element is connected to 5’ end of each of the first, the second, and the third polynucleotides defined in claim 4.6.A vector combination comprising a first, a second, and a third vectors, wherein the first, the second, and the third vectors comprise the first, the second, and the third nucleic acid constructs defined in claim 4 respectively.7.An engineered mammalian cell line comprising the nucleic acid construct according to claim 1, the vector according to claim 3, the nucleic acid construct combination according to claim 4, or the vector combination according to claim 6.8.The engineered mammalian cell line according to 7, wherein the engineered mammalian cell line is a mammalian cell selected from the group consisting of Chinese Hamster Ovary (CHO) cell, NS0, SP2 / 0 and HEK293; preferably the CHO cell is selected from the group consisting of CHO-K1, CHO-Lec1, CHO-Lec10, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO DX B11, CHO DG44.9.The engineered mammalian cell line according to 7, wherein the engineered mammalian cell line overexpresses N-acetyl-glucosaminyltransferase-1, N-acetyl-glucosaminyltransferase-2, and α-mannosidase.10.The engineered mammalian cell line according to 7, wherein the engineered mammalian cell line is capable to express a recombinant protein; preferably the engineered mammalian cell line has been previously transfected or integrated to express the recombinant protein; more preferably the recombinant protein is expressed with a high mannose glycoform content less than or equal to 5.5%.11.A method of regulating the high mannose glycoform content of a recombinant protein during a mammalian cell culture process, comprising an expression of the recombinant protein and an overexpression of three proteins that are involved in an N-glycosylation pathway in a mammalian host cell, wherein the three proteins are N-acetyl-glucosaminyltransferase-1, N-acetyl-glucosaminyltransferase-2, and α-mannosidase.12.The method according to claim 11, wherein the expression of the recombinant protein is achieved by introducing a polynucleotide encoding the recombinant protein, and the overexpression of three proteins is achieved by introducing the nucleic acid construct according to claim 1, the vector according to claim 3, the nucleic acid construct combination according to claim 4, or the vector combination according to claim 6 to the mammalian host cell.13.The method according to claim 11, wherein the mammalian host cell has been previously transfected or integrated to express the recombinant protein before the overexpression of the three proteins that are involved in an N-glycosylation pathway; orwherein the mammalian host cell has been previously transfected or integrated to express the three proteins that are involved in an N-glycosylation pathway before the expression of the recombinant protein.14.The method according to claim 11, wherein the mammalian host cell is co-transfected to express the recombinant protein and to overexpress the three proteins that are involved in an N-glycosylation pathway.15.The method according to claim 11, wherein the recombinant protein is a protein comprising an antibody Fc region, preferably the recombinant protein is selected from the group consisting of Fc fusion proteins, antibodies, immunoglobulins, and peptibodies.16.The method according to claim 11, wherein the high mannose glycoform content of the recombinant protein expressed in the host cell is decreased compared to that produced by a culture where the cells do not overexpress proteins that are involved in an N-glycosylation pathway.17.The method according to claim 16, wherein the high mannose glycoform is selected from the group consisting of Mannose 5 (Man5) , Mannose 6 (Man6) , Mannose 7 (Man7) , Mannose 8 (Man8) , Mannose 9 (Man9) , and combinations thereof.18.The method according to claim 16, wherein the high mannose glycoform content of the recombinant protein is less than or equal to 6.5%.19.The method according to claim 16, wherein the high mannose glycoform content of the recombinant protein is reduced by at least 40%compared to that produced by a culture where the cells do not overexpress proteins that are involved in an N-glycosylation pathway.20.The method according to claim 11, wherein the mammalian cell culture process utilizes a fed-batch culture process, a perfusion culture process, and combinations thereof.21.The method according to claim 11, wherein the mammalian host cell is a mammalian cell selected from the group consisting of Chinese Hamster Ovary (CHO) cell, NS0, SP2 / 0 and HEK293; preferably the CHO cell is selected from the group consisting of CHO-K1, CHO-Lec1, CHO-Lec10, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO DX B11, CHO DG44.22.The method according to claim 11, wherein the method decreases the high mannose glycoform content of the recombinant protein, in particular the Man5 content.23.The method according to any one of claims 11-22, wherein the method further comprises a harvest step for the recombinant protein.24.A recombinant protein produced by the method according to claim 23.25.The recombinant protein according to claim 24, wherein the recombinant protein is a protein comprising an antibody Fc region, preferably the recombinant protein is selected from the group consisting of Fc fusion proteins, antibodies, immunoglobulins, and peptibodies.26.The recombinant protein according to claim 24, wherein the high mannose glycoform content of the recombinant protein is less than or equal to 6.5%.

Images