Anti-lilrb4 antibody, bispecific antibody and uses thereof

Abstract

Provided are an anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof, a bispecific antibody binding to LILRB4 and NKG2A, an isolated polynucleotide, a vector, a host cell, a kit, a pharmaceutical composition, and the uses of these molecules in diagnosing, preventing, and treating diseases.

Description

ANTI-LILRB4 ANTIBODY, BISPECIFIC ANTIBODY AND USES THEREOFTECHNICAL FIELD

[0001] The disclosure relates to an anti-LILRB4 antibody, and a bispecific antibody exhibiting binding property to LILRB4 and NKG2A, and the uses of such antibodies.BACKGROUND

[0002] The statements in this section merely provide background information related to the present disclosure and do not necessarily constitute prior art.

[0003] LILRB4, a myeloid inhibitory receptor belonging to the family of leukocyte immunoglobulin-like receptors (LILRs / LIRs) , plays a pivotal role in the regulation of immune tolerance. LILRB4 primarily mediates suppressive immune responses by transmitting inhibitory signals through immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs (ITIMs) . This immune checkpoint molecule has gained considerable attention due to its potent regulatory functions. Its ability to induce effector T cell dysfunction and promote T suppressor cell differentiation has been demonstrated, indicating the therapeutic potential of LILRB4 for modulating excessive immune responses. (Xiang Z, Yin X, et. al., Biomolecules. 2024 Feb 4; 14 (2) : 187) .

[0004] NKG2A is revealed to be a key immune checkpoint for both natural killer (NK) cells and CD8 T cells. It forms heterodimer receptors with CD94 and targets the peptide-presenting human leukocyte antigen-E (HLA-E) molecules. Upon crosslinking, NKG2A / CD94 delivers inhibitory signals for NK cells and CD8 T cells, while blocking NKG2A can effectively unleash functions of these cytotoxic lymphocytes. The interaction between NKG2A and HLA-E contributes to tumor immune escape, and NKG2A-mediated mechanisms are currently being exploited to develop potential antitumor therapeutic strategies (Wang X, Xiong H, et. al., Front Immunol. 2022 Aug 10; 13: 960852) .SUMMARY

[0005] For the above-mentioned purpose, provided herein is a novel anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof, wherein the antibody or antigen binding fragment thereof comprise: a heavy chain variable domain (VH) comprising a HCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a HCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and a HCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and a light chain variable domain (VL) comprising a LCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a LCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a LCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; or

[0006] a heavy chain variable domain (VH) comprising a HCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, a HCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and a HCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 38; and a light chain variable domain (VL) comprising a LCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, a LCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and a LCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; or the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, and SEQ ID NO: 38, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, and SEQ ID NO: 52, respectively.

[0007] In another aspect, the disclosure provides a bispecific antibody, the bispecific antibody comprises an anti-LILRB4 single chain variable fragment (scFv) and a second binding fragment for binding an extracellular domain of human NKG2A.

[0008] The scFv comprises a first heavy chain variable domain (VH1) and a first light chain variable domain (VL1) , wherein the VH1 comprises: a HCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a HCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and a HCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and the VL1 comprises a LCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a LCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a LCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; or a heavy chain variable domain (VH) comprising a HCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, a HCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and a HCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 38; and a light chain variable domain (VL) comprising a LCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, a LCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and a LCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; or the VH1 comprises a HCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, a HCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and a HCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 38; and the VL1 comprises a LCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, a LCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and a LCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.

[0009] The anti-NKG2A Fab fragment comprises a second heavy chain variable domain (VH2) comprising a HCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, a HCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a HCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; and a second light chain variable domain (VL2) comprising a LCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, a LCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, and a LCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 23.

[0010] In another aspect, the disclosure provides an isolated polynucleotide encoding the anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof, or the bispecific antibody provided above.

[0011] In another aspect, the disclosure provides a vector comprising the isolated polynucleotide provided above.

[0012] In another aspect, the disclosure provides a host cell comprising the vector provided above.

[0013] In another aspect, the disclosure provides a kit comprising the anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof, the bispecific antibody, the isolated polynucleotide, the vector, or the host cell provided above.

[0014] In another aspect, the disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof, or the bispecific antibody provided above, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0015] In another aspect, the disclosure provides a use of the anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof, the bispecific antibody, the isolated polynucleotide, the vector, the host cell, the kit, or the pharmaceutical composition in the manufacture of a therapeutic agent for treatment, prevention, or diagnosis of a disease.

[0016] In another aspect, the disclosure provides a method of diagnosing, preventing, and treating a disease in a subject in need thereof, comprising administering to the subject an effective amount of the anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof, or the bispecific antibody, or the pharmaceutical composition. Optionally, the disease comprises autoimmune diseases, microbial infections, and neoplastic diseases.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0017] The following is a brief description of the drawings, which are presented for the purposes of illustrating the exemplary embodiments disclosed herein and not for the purposes of limiting the same.

[0018] FIG. 1 shows the schematic of bispecific antibodies in Example 3.

[0019] FIG. 2 shows the binding on 293T-hNKG2A / CD94 cells of ES038.115, ES038.116, human IgG1 isotype (abbreviated as HG1) and a human IgG1LALA isotype (abbreviated as HG1LALA) detected by FACS.

[0020] FIG. 3 shows the binding on Molm-13 cells of ES038.115, ES038.116, HG1 and HG1LALA detected by FACS.

[0021] FIG. 4 shows the binding on 293T-hLILRB4 cells of ES038.115, ES038.116, HG1 and HG1LALA detected by FACS.

[0022] FIG. 5 shows the activation of ES038.115, ES038.116, HG1 and HG1LALA on primary NK cells.

[0023] FIG. 6 shows the killing effects of ES038.115, ES038.116, ES011. C0010-1. HG1, HG1, and HG1LALA on primary NK mediated cytotoxicity toward Molm-13-Luc cells.

[0024] FIG. 7 shows the killing effects of ES038.115, ES038.116, ES011. C0010-1. HG1, HG1, and HG1LALA on primary NK mediated cytotoxicity toward THP-1-Luc cells.

[0025] FIG. 8 shows the functional activity of activating NFAT signaling in Jurkat-NKG2C / CD94 / DAP12 and 293T-hLILRB4 co-culture system.

[0026] FIG. 9 shows the binding on Thp-1 cells of ES011. C0010-1. HG4, ES011. C1001. HG4, ES011. Tab1. HG4 and human IgG4 isotype (abbreviated as HG4) detected by FACS.

[0027] FIG. 10 shows the activities of ES011. C0010-1. HG4, ES011. C1001. HG4, ES011. Tab2. HG4 and human IgG4 isotype (abbreviated as hIgG4) to block the interaction between LILRB4 and APOE.

[0028] FIG. 11 shows the activities of ES011. C0010-1. HG4, ES011. C1001. HG4, ES011. Tab2. HG4 and hIgG4 to block the interaction between LILRB4 and Fibronectin.

[0029] FIG. 12 shows the human LILRB4 binding activity of ES038.212, ES038.215, ES038.216, ES038.226, ES011. H0010. H12. HG1, ES011. H1001. H11. HG1 and human IgG1 isotype (HG1) on 293T-hNKG2A / CD94 cells detected by FACS.

[0030] FIG. 13 shows the binding on 293T-hLILRB4 cells of ES038.212, ES038.215, ES038.216, ES038.226, ES015. H017. H73DR02. HG1 and human IgG1 isotype (HG1) detected by FACS.

[0031] FIG. 14 shows the functional activity of activating NFAT signaling in Jurkat-NKG2C / CD94 / DAP12 and Molm-13 co-culture system.

[0032] FIG. 15 shows functional activity of activating NFAT signaling in Jurkat-NKG2C / CD94 / DAP12 system.

[0033] FIG. 16 shows the killing activities of bispecific antibodies (ES038.212, ES038.215, ES038.216, ES038.226) and related control antibodies.DETAILED DESCRIPTION

[0034] The present disclosure is explained in greater detail below. This description is not intended to be a detailed catalog of all the different ways in which the invention may be implemented, or all the features that may be added to the instant invention. For example, features illustrated with respect to one embodiment may be incorporated into other embodiments, and features illustrated with respect to a particular embodiment may be deleted from that embodiment. In addition, numerous variations and additions to the various embodiments suggested herein will be apparent to those skilled in the art in light of the instant disclosure which do not depart from the instant invention. Hence, the following description is intended to illustrate some particular embodiments of the invention, and not to exhaustively specify all permutations, combinations and variations thereof.

[0035] Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the disclosure pertains. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice for testing of the present disclosure, the preferred materials and methods are described herein. In describing and claiming the present disclosure, the following terminology will be used.

[0036] Anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof

[0037] The present disclosure provides examples of an anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof. In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof comprise: a heavy chain variable domain (VH) comprising a HCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a HCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and a HCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and a light chain variable domain (VL) comprising a LCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a LCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a LCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.

[0038] In some embodiments, the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, and SEQ ID NO: 38, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, and SEQ ID NO: 41, respectively.

[0039] In some embodiments, the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, and SEQ ID NO: 38, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, and SEQ ID NO: 52, respectively.

[0040] The CDRs are defined using Kabat definition except heavy chain CDR1, which is defined by the combination of Kabat and Chothia systems.

[0041] Kabat and Chothia systems are known to these skilled in the art, see, for example, Kabat E A, Wu T T, Perry H M, et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest [J] . 1991. Chothia, C. et al., (1987) J. Mol. Biol. 196: 901‐917. Al‐lazikani et al., (1997) J. Molec. Biol. 273: 927‐948.

[0042] The term "antibody" herein is used in the broadest sense and encompasses various antibody structures, including but are not limited to monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (e.g. bispecific antibodies) , and antibody fragments so long as they exhibit the desired antigen-binding activity.

[0043] Traditional antibodies are "Y" shaped tetramers. Each tetramer is typically composed of two identical pairs of polypeptide chains, each pair having one "light chain" monomer and one "heavy chain" monomer.

[0044] Antibody heavy chains typically include a variable heavy (VH) domain, which includes VH CDR1-3, and an Fc domain, which includes a CH2-CH3 monomer. In some embodiments, antibody heavy chains include a hinge and CH1 domain. Traditional antibody heavy chains are monomers that are organized, from N-to C-terminus: VH-CH1-hinge-CH2-CH3. The CH1-hinge-CH2-CH3 is collectively referred to as the heavy chain "constant domain" or "constant region" of the antibody, of which there are five different categories or "isotypes" : IgA, IgD, IgG, IgE and IgM. Thus, "isotype" as used herein is meant any of the subclasses of immunoglobulins defined by the chemical and antigenic characteristics of their constant regions.

[0045] Antibody light chains typically include a variable heavy (VH) domain, which includes VL CDR1-3, and a constant light chain region (often referred to as CL) . The antibody light chain is typically organized from N-to C-terminus: VL-CL.

[0046] The terms "antigen binding fragment" , as used herein, is a portion of an antibody such as F(ab′) 2, Fab′, Fab, scFv and the like. Antigen binding fragments can be produced by enzymatic cleavage or by recombinant techniques. For instance, papain or pepsin cleavage can be used to generate Fab or F (ab′) 2 fragments, respectively. Regardless of structure, an antibody fragment binds with the same antigen that is recognized by the intact antibody. The term "antigen binding fragment" also includes any synthetic or genetically engineered protein that acts like an antibody by binding to a specific antigen to form a complex.

[0047] The term "variable domain" refers to the domain of an antibody heavy or light chain that is involved in binding the antibody to antigen. The variable domains of the heavy chain and light chain of a native antibody generally have similar structures, with each domain comprising four conserved framework regions (FRs) and three hypervariable regions (HVRs) . See, e.g., Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) . A single VH or VL domain may be sufficient to confer antigen-binding specificity.

[0048] In some embodiments, the VH comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and the VL comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

[0049] In some embodiments, the VH comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and the VL comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.

[0050] In some embodiments, the VH comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and the VL comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25.

[0051] In some embodiments, the VH comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and the VL comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 27.

[0052] The identity percentage of two amino acid sequences is determined by dividing the number of the same residues by the total number of the amino acid residues and multiplying the quotient by 100 to obtain a percentage. Gaps are excluded when assessing identity. Therefore, two copies of completely identical sequences have 100%identity, but sequences with deletion, addition or replacement may have a lower degree of identity. A person skilled in the art will recognize that there are several computer programs that can be used to determine the identity of sequences, such as those programs using algorithms such as BLAST. BLAST nucleotide search is performed using the NBLAST program, and BLAST protein search is performed using the BLASTP program, and default parameters of each program are used.

[0053] In the present disclosure, the anti-LILRB4 antibody or antigen-binding fragment includes conservative substitutions within their sequence preferably do not significantly affect the desired activity of the polypeptide, antibody, or antigen-binding fragment. Substitutions may be naturally occurring or may be introduced for example using mutagenesis (e.g., Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551) . The amino acids glycine, alanine, valine, leucine and isoleucine, for example, can often be substituted for one another (amino acids having aliphatic side chains) . Of these possible substitutions, it is preferred that glycine and alanine are used to substitute for one another (since they have relatively short side chains) and that valine, leucine and isoleucine are used to substitute for one another (since they have larger aliphatic side chains which are hydrophobic) . Other amino acids which may often be substituted for one another include but are not limited to, phenylalanine, tyrosine and tryptophan (amino acids having aromatic side chains) ; lysine, arginine and histidine (amino acids having basic side chains) ; aspartate and glutamate (amino acids having acidic side chains) ; and asparagine and glutamine (amino acids having amide side chains) .

[0054] In some embodiments, the VH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and the VL comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the VH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and the VL comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. In some embodiments, , the VH comprises a mutation R44C as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and the VL comprises a mutation S104C as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.

[0055] In some embodiments, the VH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and the VL comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the VH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and the VL comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 27. In some embodiments, the VH comprises a mutation G44C as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and the VL comprises a mutation G103C as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 27.

[0056] In present disclosure, mutation “R44C” represents that the 44th animo acid R is substituted by animo acid C. The first amino acid of SEQ ID NO: 9 defines as 1st animo acid. Similarly, mutation “S104C” represents that the 104th animo acid S is substituted by animo acid C. The first amino acid of SEQ ID NO: 10 defines as 1st animo acid.

[0057] Similarly, mutation “G44C” represents that the 44th animo acid R is substituted by animo acid C. The first amino acid of SEQ ID NO: 26 defines as 1st animo acid. Mutation “G103C” represents that the 103rd animo acid G is substituted by animo acid C. The first amino acid of SEQ ID NO: 27 defines as 1st animo acid.

[0058] In some embodiments, the antibody is a Fab fragment, a F (ab') fragment, or a F (ab') 2 fragment.

[0059] Papain digestion of antibodies produces two identical antigen binding fragments, called "Fab" fragments, each with a single antigen binding site, and a residual "Fc" fragment, whose name reflects its ability to crystallize readily. Pepsin treatment yields an F (ab′) 2. Fab′fragments differ from Fab fragments by the addition of a few residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain including one or more cysteines from the antibody hinge region.

[0060] In some embodiments, the antibody or antigen binding fragment thereof is a monoclonal antibody, a single chain antibody fragment (scFv) , a minibody, a diabody or a triabody;

[0061] The term "monoclonal antibody" as used herein refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., the individual antibodies comprising the population are identical except for possible naturally occurring mutations and / or post-translation modifications (e.g., isomerizations, amidations) that may be present in minor amounts. Monoclonal antibodies are highly specific, and are directed against a single antigentic determinant or epitope. In contrast, polyclonal antibody preparations typically include different antibodies directed against different antigenic determinants (or epitopes) .

[0062] A "single chain antibody fragment" or "scFv" refers to a fusion protein of the variable regions of the VH and VL of immunoglobulins. In some embodiments, the regions are connected with a short linker peptide of ten to about 25 amino acids. The linker can be rich in glycine for flexibility, as well as serine or threonine for solubility, and can either connect the N-terminus of the VH with the C-terminus of the VL, or vice versa. This protein retains the specificity of the original immunoglobulin, despite removal of the constant regions and the introduction of the linker. ScFv molecules are known in the art.

[0063] Generally, an scFv molecule with a linker of 3 to 12 residues cannot fold into a functional Fv domain and instead associates with a second scFv molecule to form a bivalent dimer (diabody) . Reducing the linker length below three residues can force scFv association into trimers (triabodies) .

[0064] In some embodiments, the minibody comprises a pair of single chain antibody fragments which are linked via CH3 domains.

[0065] In some embodiments, the triabody comprises three single chain antibody fragments with the peptide linkers arranged in a cyclic, head-to-tail fashion.

[0066] The term "diabody" refers to small antibody fragments with two antigen binding sites, which fragments comprise a variable heavy domain (VH) connected to a variable light domain (VL) in the same polypeptide chain (VH-VL) . By using a linker that is too short to allow pairing between the two domains on the same chain, the domains are forced to pair with the complementary domains of another chain and create two antigen binding sites. Diabody is described more fully in, for example, EP 404, 097, and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) .

[0067] In some embodiments, the antibody is chimeric.

[0068] In some embodiments, the antibody is a humanized antibody.

[0069] The term "humanized antibody" refers to a subset of chimeric antibodies in which a "hypervariable region" from a non-human immunoglobulin (the donor antibody) replaces residues from a hypervariable region (such as CDRs) in a human immunoglobulin (recipient antibody) . In general, a humanized antibody will include substantially all of at least one, and typically two, variable domains, in which all or substantially all of the hypervariable loops correspond to those of a non-human immunoglobulin sequence, and all or substantially all of the framework regions are those of a human immunoglobulin sequence, although the framework regions may include one or more substitutions that improve antibody performance, such as binding affinity, isomerization, immunogenicity, etc.

[0070] In some embodiments, the antibody is an IgG-based molecule comprising a Fc region or a partial region of Fc, optionally, the Fc is derived from IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4. In some embodiments, the antibody comprises a Fc region derived from IgG1, such as wild type human IgG1 Fc, or human IgG1 Fc with L234A and L235A numbering by EU numbering system.

[0071] The term "Fc region" herein is used to define a C-terminus region of an immunoglobulin heavy chain that contains at least a portion of the constant region. The term includes native sequence Fc regions and variant Fc regions. Although the boundaries of the Fc region of an IgG heavy chain might vary slightly, the human IgG heavy chain Fc region is usually defined to extend from Cys226, or from Pro230, to the carboxyl-terminus of the heavy chain. However, antibodies produced by host cells may undergo post-translational cleavage of one or more, particularly one or two, amino acids from the C-terminus of the heavy chain. Therefore, an antibody produced by a host cell by expression of a specific nucleic acid molecule encoding a full-length heavy chain may include the full-length heavy chain, or it may include a cleaved variant of the full-length heavy chain. This may be the case where the final two C-terminal amino acids of the heavy chain are glycine (G446) and lysine (K447, numbering according to Kabat EU index) . Therefore, the C-terminal lysine (Lys447) , or the C-terminal glycine (Gly446) and lysine (K447) , of the Fc region may or may not be present. Unless otherwise specified herein, numbering of amino acid residues in the Fc region or constant region is according to the EU numbering system, also called the EU index, as described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 (see also above) . For example, a subunit of an IgG Fc domain comprises an IgG CH2 and an IgG CH3 constant domain.

[0072] Methods of making all of the anti-LILRB4 antibodies or antigen binding fragments described above are well known to one of skill in the art. See, e.g., U.S. Pat. No. 5,807,715; Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (21) : 6851-5; Sharon et al. (1984) Nature 309(5966) : 364-7; Takeda et al. (1985) Nature 314 (6010) : 452-4.

[0073] The provided anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof blocks the inhibitory signals mediated by LILRB4, thus enhancing the immune response or reducing the immunosuppression caused by LILRB4.

[0074] Bispecific antibody

[0075] The disclosure provides a bispecific antibody, comprising:

[0076] a) an anti-LILRB4 scFv comprising a first heavy chain variable domain (VH1) and a first light chain variable domain (VL1) , wherein the VH1 comprises a HCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a HCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and a HCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and the VL1 comprises a LCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a LCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a LCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO:6; or the VH1 comprises a HCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, a HCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and a HCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 38; and the VL1 comprises a LCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, a LCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and a LCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; or

[0077] the VH1 comprises a HCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, a HCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and a HCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 38; and the VL1 comprises a LCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, a LCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO:51, and a LCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52; and

[0078] b) a second binding fragment for binding an extracellular domain of human NKG2A.

[0079] The term "bispecific antibody" means an antibody which comprises specificity for two target molecules. Bispecific antibodies of the disclosure are derived from antibodies or antigen-binding fragment thereof, which may be fusions or conjugates of antibodies and antigen binding fragments of antibodies, such as e.g. Fab, Fab′, F (ab′) 2 or scFv. Bispecific antibodies of the disclosure may also be fusions or conjugates of antibody fragments. A wide range of molecular formats for bispecific antibodies derived from antibodies and antibody fragments are known in the art, see e.g. (Spiess et al. : Molecular Immunology 67, (2015) , pp. 95-106) and (Brinkmann and Kontermann: MABS, 9 (2017) , pp 182-212) .

[0080] Bispecific antibodies may be made in a variety of ways described in the art, see e.g. (Spiess et al. : Molecular Immunology 67, (2015) , pp. 95-106) and (Brinkmann and Kontermann: MABS, 9 (2017) , pp 182-212) .

[0081] In some embodiment, the anti-LILRB4 scFv comprises:

[0082] (1) a VH1 comprising an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and a VL1 comprising an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; or

[0083] (2) a VH1 comprising an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and a VL1 comprising an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; or

[0084] (3) the VH comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and the VL comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; or

[0085] (4) the VH comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and the VL comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 27.

[0086] In some embodiment, the anti-LILRB4 scFv comprises:

[0087] (1) a VH1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and a VL1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8;

[0088] (2) a VH1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and a VL1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; or

[0089] (3) a VH1 comprising a mutation R44C as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and a VL1 comprising a mutation S104C as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; or

[0090] (4) the VH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and the VL comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; or

[0091] (5) the VH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and the VL comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; or

[0092] (6) the VH comprises a mutation G44C as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and the VL comprises a mutation G103C as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 27.

[0093] In some embodiments, from N-to C-terminus, the anti-LILRB4 scFv comprises a VL1-linker A-VH1 fragment, optionally, the linker A comprises n repeats of peptide G4S (SEQ ID NO: 17) , n is 0, 1, 2, 3, 4, 5, or 6. For instance, n is 2, 3, 4, or 5. In some embodiments, n is 3 or 4.

[0094] In some embodiments, the second binding fragment comprises an anti-NKG2A Fab fragment, a light chain of the anti-NKG2A Fab fragment is fused at its C-terminus to the N-terminus of the anti-LILRB4 scFv, optionally via a peptide linker.

[0095] In some embodiments, a light chain of the anti-NKG2A Fab fragment is fused at its C-terminus to the N-terminus of the anti-LILRB4 scFv via n repeats of peptide G4S (SEQ ID NO: 17) , n is 0, 1, 2, 3, 4, 5, or 6. For instance, n is 2, 3, or 4. In some embodiments, n is 2 or 3.

[0096] In some embodiments, the anti-NKG2A Fab fragment comprises a second heavy chain variable domain (VH2) comprising a HCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, a HCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a HCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; and a second light chain variable domain (VL2) comprising a LCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, a LCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, and a LCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 23.

[0097] In some embodiments, the anti-NKG2A Fab fragment comprises a second heavy chain variable domain (VH2) comprising an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a second light chain variable domain (VL2) comprising an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.

[0098] In some embodiments, the VH2 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and the VL2 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.

[0099] In some embodiments, second binding fragment comprises a human Fc fragment derived from IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4.

[0100] In some embodiments, second binding fragment comprises a wildtype human Fc fragment.

[0101] In some embodiments, second binding fragment comprises a human IgG1 Fc with LALA mutation, i.e., mutation L234A and L235A.

[0102] In some embodiments, second binding fragment comprises a human IgG1 Fc with mutations S239D, A330L and I332E.

[0103] The bispecific antibody comprises a heavy chain (HC) and a light chain (LC) , wherein:

[0104] (1) the HC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and the LC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; or

[0105] (2) the HC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and the LC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; or

[0106] (3) the HC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, and the LC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 29; or

[0107] (4) the HC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and the LC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; or

[0108] (5) the HC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, and the LC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 33; or

[0109] (6) the HC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and the LC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35.

[0110] In some embodiments, the bispecific antibody comprising:

[0111] (1) a HC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and a LC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; or

[0112] (2) a HC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and a LC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; or

[0113] (2) a HC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, and a LC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 29; or

[0114] (2) a HC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and a LC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; or

[0115] (2) a HC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, and a LC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 33; or

[0116] (2) a HC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and a LC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35.

[0117] LILRB4 is expressed on immune cells where it binds to MHC class I (MHC-1) molecules (such as HLA-G) on antigen-presenting cells and transduces a negative signal that inhibits stimulation of an immune response. LILRB4 can also function in antigen capture and presentation. It is thought to control inflammatory responses and cytotoxicity to help focus the immune response and limit autoreactivity. LILRB4 is also upregulated or specifically expressed in some cancer cells, such as acute myeloid leukemia (AML) cells. Upon stimulation of ligands such as HLA-G on tumor cells, LILRB4 inhibits immune activation, thereby indirectly promoting tumor growth. Therefore, LILRB4 is a potential immune checkpoint.

[0118] NKG2A is an inhibitory receptor who is selectively expressed on cytotoxic lymphocytes, including natural killer cells (NK) and CD8 positive (CD8+) T cells. Understandably, the blockade of NKG2A and its ligand (s) MHC-1 molecule, such as HLA-E (human) , Qa-1 (mouse) , benefits for improving immune response mediated by natural killing cells (NK) and CD8+ T cells in a subject (e.g., human, mouse) in need.

[0119] The bispecific antibody provided by the disclosure binds to NKG2A, NKG2C and LILRB4, thus eliminating the immunosuppression mediated by NKG2A and activating immune response through NKG2C, further improving the immune response, especially, innate immune response. Understandably, the bispecific antibody also helps to recruit immune cells and enrich them at neoplastic disease location, to improve the antineoplastic effect.

[0120] In some embodiments, the bispecific antibody can increase cytotoxicity of natural killing cells (NK) , natural killing T cells (NKT) and / or CD8 T cells.

[0121] In some embodiments, the bispecific antibody can increase NK degranulation or NK-mediated specific lysis toward LILRB4 expressing tumor cells.

[0122] In some embodiments, the bispecific antibody also helps to recruit immune cells and enrich them to the location of the tumor expressing LILRB4 for better tumor killing.

[0123] In some embodiments, the bispecific antibody binds to human NKG2A with median effect concentration (EC50) no more than 5 nM, 3 nM, 1 nM, or 0.8 nM; and the bispecific antibody binds to human LILRB4 with EC50 no more than 5 nM, 3 nM, 2 nM, or 1 nM. Optionally, the EC50 can obtain by Fluorescence activated Cell Sorting (FACS) .

[0124] Isolated polynucleotide, Vector and Host cell

[0125] Provided herein is an isolated polynucleotide encoding the anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof, or the bispecific antibody provided above.

[0126] An "isolated" polynucleotide is one that has been identified, separated and / or recovered from a component of its production environment (e.g., natural or recombinant) .

[0127] The polynucleotide is nucleic acid sequence of DNA, RNA, DNA / RNA hybrids, or modifications thereof. In some embodiments, the polynucleotide is a nucleic acid sequence of DNA. The encoding polynucleotide (DNA or RNA) may be recombinant or synthetic molecule.

[0128] As is known in the art, the polynucleotide encoding the components of the antibodies described herein can be incorporated into expression vectors as is known in the art and depending on the host cells used to produce the antibodies described herein. Generally, the polynucleotide is operably linked to any number of regulatory elements (promoters, origin of replication, selectable markers, ribosomal binding sites, inducers, etc. ) . The expression vectors can be extra-chromosomal or integrating vectors.

[0129] Another aspect of the disclosure provides a vector comprising the isolated polynucleotide.

[0130] As used herein, the terms "vector" refers to a polynucleotide that can be engineered to contain a cloned polynucleotide or polynucleotides that can be propagated in a host cell.

[0131] A vector may be any suitable vector, including chromosomal, non-chromosomal, and synthetic nucleic acid vectors (anucleic acid sequence comprising a suitable set of expression control elements) . The vector generally includes, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter (e.g., SV40, CMV, EF-1α) , and a transcription termination sequence.

[0132] Another aspect of the disclosure provides a host cell comprising the vector.

[0133] The term "host cell" as used herein refers to the particular subject cell transfected with a polynucleotide molecule or a vector and the progeny or potential progeny of such a cell. Progeny of such a cell may not be identical to the parent cell transfected with the polynucleotide molecule due to mutations or environmental influences that may occur in succeeding generations or integration of the polynucleotide molecule into the host cell genome.

[0134] The polynucleotide and / or vectors of the antibodies described herein are then transformed into any number of different types of host cells as is well known in the art, including mammalian, bacterial, yeast, insect and / or fungal cells, with mammalian cells (e.g. CHO cells) , finding use in many embodiments.

[0135] In some embodiments, the host cell is a mammalian cultured cell line, including but are not limited to, CHO, BHK, NS0, 293 and their derivatives.

[0136] A vector can be introduced into the host cell by methods known in the art, e.g., electroporation, chemical transfection (e.g., DEAE-dextran) , transformation, transfection, and infection and / or transduction (e.g., with recombinant virus) .

[0137] Kit

[0138] The present disclosure provides a kit comprising the anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof, the bispecific antibody, the isolated polynucleotide, the vector, or the host cell.

[0139] Typically, a kit includes two or more components required for performing a therapeutic or detection method of the disclosure. Kit components include, but are not limited to, one or more antibody, isolated polynucleotide, vector or host cell of the disclosure, appropriate reagents, and / or equipment. Reagents may include, for example, fluorescent tags, enzymatic tags, or other detectable tags. The reagents may also include secondary or tertiary antibodies or reagents for enzymatic reactions, wherein the enzymatic reactions produce a product that may be visualized. equipment may include, for example, containers with one or more pharmaceutically acceptable carriers, additional containers etc., as will be readily apparent to those skilled in the art. Instructions, either as inserts or a label, indicating quantities of the components to be administered, guidelines for administration, and / or guidelines for mixing the components, can also be included in the kit.

[0140] Pharmaceutical Composition

[0141] Provided herein is a pharmaceutical composition comprising the anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof, or the bispecific antibody, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0142] As used herein, the term "carrier" refers to a diluent, adjuvant (e.g., Freund's adjuvant (complete and incomplete) ) , excipient, or vehicle with which the therapeutic is administered. The anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof, or the bispecific antibody as active ingredient is dissolved, dispersed or admixed in the carrier that is pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient as is well known.

[0143] Suitable pharmaceutically acceptable carriers are, for example, water, saline, phosphate buffered saline (PBS) , dextrose, glycerol, ethanol, or the like and combinations thereof. Other suitable carriers are well known to those skilled in the art. In addition, if desired, the composition can contain minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents.

[0144] The pharmaceutical composition could be formulated for parenteral (e.g., orally, nasally, or by inhalation, ophthalmic, rectal, intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) administration in dosage unit form (i.e., physically discrete units containing a predetermined quantity of active compound for ease of administration and uniformity of dosage) . The formulation of the pharmaceutical composition is compatible with their intended route of administration (e.g., intravenous, intraarterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) .

[0145] In some embodiments, the pharmaceutical compositions are formulated into an injectable composition. The injectable pharmaceutical compositions may be prepared in any conventional form, such as for example liquid solution, suspension, emulsion, or solid forms suitable for generating liquid solution, suspension, or emulsion. Preparations for injection may include sterile and / or non-pyretic solutions ready for injection, sterile dry soluble products, such as lyophilized powders, ready to be combined with a solvent just prior to use, including hypodermic tablets, sterile suspensions ready for injection, sterile dry insoluble products ready to be combined with a vehicle just prior to use, and sterile and / or non-pyretic emulsions. The solutions may be either aqueous or nonaqueous.

[0146] Medical Uses

[0147] The present disclosure provides a use of the anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof, the bispecific antibody, the isolated polynucleotide, the vector, the host cell, the kit, or the pharmaceutical composition in the manufacture of a therapeutic agent for treatment, prevention, or diagnosis of a disease, optionally, the disease comprises autoimmune diseases, microbial infections, and neoplastic diseases.

[0148] The present disclosure provides a method of diagnosing, preventing, and treating a disease in a subject in need thereof, comprising administering to the subject an effective amount of a therapeutic agent, i.e., the anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof, the bispecific antibody, the isolated polynucleotide, the vector, the host cell, the kit, or the pharmaceutical composition.

[0149] As used herein, the term "treating" or "treatment" refers to therapeutic treatment, wherein the object is to slow down (lessen) an undesired physiological change or disorder, such as the progression of cancer. Beneficial or desired clinical results include, but are not limited to, alleviation of symptoms, diminishment of extent of disease, stabilized (i.e., not worsening) state of disease, delay or slowing of disease progression, amelioration or palliation of the disease state, and remission (whether partial or total) , whether detectable or undetectable. “Treatment” can also mean prolonging survival as compared to expected survival if not receiving treatment.

[0150] As used herein, the term "preventing" or “prevention” refers to the total or partial inhibition of the development, recurrence, onset or spread of a disease and / or symptom related thereto.

[0151] An "effective amount" refers to an amount effective, at dosages and for periods of time necessary, to achieve the desired effect, including a therapeutic or prophylactic result. An effective amount herein may vary according to factors such as the disease state, age, sex, and weight of the patient, and the ability of the antibody to elicit a desired response in the individual.

[0152] The "subject" , "individual" or "patient" is meant any subject, particularly a mammalian subject, for whom diagnosis, prognosis, or therapy is desired. Mammalian subjects include humans, domestic animals, farm animals, and zoo, sport, or pet animals such as dogs, cats, guinea pigs, rabbits, rats, mice, horses, cattle, cows, and so on.

[0153] In some embodiments, the autoimmune diseases and microbial infections are characterized by redness, swelling, heat and pain, as consequences of capillary dilation with edema and migration of phagocytic leukocytes. Some examples of inflammatory responses include arthritis, contact dermatitis, hyper-IgE syndrome, inflammatory bowel disease, allergic asthma, and idiopathic inflammatory disease. Idiopathic inflammatory disease includes, for example, psoriasis and lupus (e.g., systemic lupus erythematosus (SLE) , drug-induced lupus erythematosus, and lupus nephritis) .

[0154] In some embodiments, the disease comprises the neoplastic disease which is characterized with expression of LILRB4 and / or NKG2A.

[0155] In some embodiments, the neoplastic diseases comprise hematopoietic cancer or solid tumor, which is malignant or benign.

[0156] In some embodiments, the disease comprises LILRB4 expressing hematopoietic cancer and solid tumors. In some embodiments, the neoplastic disease includes acute myeloid leukemia, breast cancer, carcinoid cancer, cervical cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, renal cancer, colorectal cancer, gastric cancer, testicular cancer, thyroid cancer, bladder cancer, urethral cancer, renal cell carcinoma (RCC) , or hematologic malignancy.

[0157] In some embodiments, without limitation, the methods of treatment reduce the rate of the increase of volume of a tumor in a subject over time, reduce the risk of developing a metastasis, or reduce the risk of developing an additional metastasis in a subject. In some embodiments, the treatment can halt, slow, retard, or inhibit progression of a cancer. In some embodiments, the treatment can result in the reduction of in the number, severity, and / or duration of one or more symptoms of the cancer in a subject.

[0158] The anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof, or the bispecific antibody can improve the immune response, especially, innate immune response.

[0159] The daily dosage of the therapeutic agent could obtain from cell culture assays, animal studies or clinical research. A therapeutically effective amount of therapeutic agent or active agent (such as, antibody or antigen-binding fragment) will be an amount that treats the disease in a subject, decreases the severity, frequency, and / or duration of one or more symptoms of a disease in a subject. The effectiveness and dosing can be determined by a health care professional or veterinary professional using methods known in the art, as well as by the observation of one or more symptoms of disease in a subject. In addition, it is understood that the specific dose level for any particular subject will depend upon a variety of factors including the activity of the specific compound employed, the age, body weight, general health, gender, and diet of the subject, the time of administration, the route of administration, the rate of excretion, and the half-life of the antibody or antigen-binding fragment in vivo.

[0160] EXAMPLES

[0161] The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

[0162] Standard reference works setting forth the general principles of recombinant DNA technology known to those of skill in the art include Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley &Sons, New York (1998 and Supplements to 2001) ; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N. Y. (1989) ; Kaufman et al., Eds., Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995) ; McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991) .

[0163] The materials used in the examples of the present disclosure are known and commercially available.

[0164] Example 1: Chimeric antibody generation and characterization

[0165] 1.1 Stable cell lines

[0166] 293T human LILRB4 cell line (abbreviated as 293T-hLILRB4) was purchased from KYinno.

[0167] Molm-13-Luc and THP-1-Luc were purchased from KYinno.

[0168] Human NKG2A / CD94 stably expressing cell line has been generated for in vitro assays. 293T cells were transfected with human NKG2A / CD94 expression plasmid and selectively cultured in medium containing 0.2 g / mL puromycin for 2 weeks. Single cell clones were then isolated by limiting dilution and screened by FACS to obtain the monoclonal cell lines stably expressing human NKG2A / CD94, i.e., 293T-hNKG2A / CD94.

[0169] For Jurkat-NFAT-Human NKG2C / CD94 stable pool generation, Jurkat-NFAT cells were transfected with human NKG2C / CD94 (Full length NKG2C, Uniprot_P26717, Met1-Leu231) and DAP10 (Full length, Uniprot_Q9UBK5, Met 1-Pro 48) expression plasmids and selectively cultured in medium containing 800 g / mL hygromycin and 0.2 g / mL puromycin.

[0170] 1.2 Recombinant proteins, i.e., Jurkat-NKG2C / CD94 / DAP12

[0171] Human LILRB4 extracellular domain (ECD, Uniprot_Q8NHJ6, Gln22-Glu259, Accession#Q13241-1, Lys32-Ile179) recombinant proteins with his tag were purchased from Acrobiosystem for Biacore analysis.

[0172] Human NKG2A / CD94 extracellular domain (ECD, Uniprot_P26715, Pro94-Leu233, Accession#Q13241-1, Lys32-Ile179) recombinant proteins with human Fc tag were purchased from ChemPartner for immunization and hybridoma screening.

[0173] Human APOE3 with His Tag was purchased from Acrobiosystems (Cat No. : APE-H5246) . Fibronetin Fragment was purchased from Sigma (Cat No. : F0287) .

[0174] 1.3 Chimeric antibody generation

[0175] Several anti-LILRB4 monoclonal chimeric antibodies were generated in house, named as C0010-1 or C1001. According to the sequencing results, a human IgG 1 or IgG 4 were introduced to produce ES011. C0010-1. HG1, ES011. C0010-1. HG4 or ES011. C1001. HG4. The prefix “ES011” stands for a research code, and the suffix “HG1” or “HG4” stands for the subclass of Fc region in present disclosure.

[0176] The amino acid sequences of these obtained antibodies are list in Table 1-1.

[0177] Table 1-1. Summary of monoclonal antibodies

[0178] As comparison, three benchmark anti-LILRB4 monoclonal antibodies were generated, with the amino acid sequences shown in Table 1-2.

[0179] Table 1-2. Summary of benchmark antibodies

[0180] 1.4 Antibody characterization

[0181] 1.4.1 Binding activity

[0182] The binding of anti-LILRB4 antibodies to cell membrane human LILRB4 was detected by FACS assay using THP-1-Luc cells. The EC50 and top MFI values analyzed using Four-Parameter nonlinear fitting by GraphPad Prism 9.0 are summarized in Table 2.

[0183] ES011. C0010-1. HG4 and ES011. C1001. HG4 strongly bound to THP-1 cells (FIG. 9) , and the binding activity was comparable to that of ES011. Tab1. HG4.

[0184] Table 2. Binding of anti-LILRB4 antibodies to cell membrane human LILRB4

[0185] 1.4.2 Affinity detection

[0186] The binding affinity of ES011. Tab1. HG4, ES011. Tab3. HG4, ES011. C1001. HG4, ES011. Tab2. HG4, and ES011. C0010-1. HG4 to human LILRB4 ECD recombinant protein was determined using Bio-Layer Interferometry (Octet) . The association and dissociation curves were fitted with 1: 1 binding model, and the Ka / Kd / KD values for each antibody were calculated and summarized in Table 3.

[0187] ES011. C1001. HG4 and ES011. C0010-1. HG4 showed a comparable antigen binding affinity with ES011. Tab3. HG4 and ES011. Tab2. HG4 in the test.

[0188] Table 3. Human LILRB4 binding affinity of testing antibodies

[0189] 1.4.3 Blocking activities

[0190] The activities of ES011. C0010-1. HG4, ES011. C1001. HG4, and ES011. Tab2. HG4 to block the interaction between LILRB4 and its ligands were assessed by competitive ELISA. Briefly, human APOE-his was coated overnight at 1 μg / mL in 1× PBS at 4 ℃. Dilute Abs (30 μg / ml, 1 / 5 dilution, 8 points) in blocking buffer with 8 μg / ml Hlilrb4-Biotin protein were added and incubated at 37 ℃ for 30 min. Anti-IgG (Fc specific, 1: 5000 dilution) were added at 100 μl / well and incubate at 37 ℃ for 0.5 hr after blocking and washing. TMB was added to each well as substrate and chromogenic reaction for 10 mins before detected in microplate reader at 450 nm.

[0191] Functional cell-based assay using a Jurkat-NFAT-luciferase reporter cell line engineered to express the LILRB4 / CD3ζ chimeric receptor. On Day 1, a 96-well plate was coated with fibronectin (20 μg / mL in DPBS, 50 μL / well) and incubated overnight at 4℃. On Day 2, the plate was washed and blocked for 2 hours at 37℃ with RPMI 1640 containing 10%FBS. Jurkat-NFAT-LILRB4 / CD3ζ cells were harvested, counted, and resuspended in assay buffer (RPMI 1640 with 10%FBS) at a density of 1 × 106 cells / mL. Cells (50 μL / well) were then added to the plate, followed immediately by the addition of 50 μL / well of a 2× concentration of the test monoclonal antibodies. The cell-antibody mixture was incubated for 5 hours at 37 ℃. Finally, 100 μL of luciferase detection reagent was added to each well. After a 5-minute incubation at room temperature, luminescence intensity, which correlates with NFAT pathway activation, was measured using a Tecan INFINITE F PLEX microplate reader.

[0192] As showed in FIG. 10, ES011. C0010-1. HG4, ES011. C1001. HG4 and ES011. Tab2. HG4 showed strong LILRB4 / APOE interaction blocking activity. ES011. C0010-1. HG4, and ES011. C1001. HG4 also showed strong LILRB4 / Fibronectin interaction blocking activity (FIG. 11) . The blocking parameters were listed in Table 4.

[0193] Table 4. Summary of blocking activities

[0194] Example 2: Antibody humanization

[0195] 2.1 Humanization of ES011. C0010-1 and ES011. C1001

[0196] Complementarity-determining region (CDR) grafting method was used for humanization of ES011. C0010-1 or ES011. C1001.

[0197] Briefly, IGHV3-7*01, IGHV3-11*05 and IGKV4-1*01 were first selected as humanization templates for heavy chain and light chain, respectively, based on their homology to the original mouse antibody sequences. CDRs were defined using Kabat definition except heavy chain CDR1, which was defined using a combination of Kabat and Chothia systems. For grafting, the CDRs and different combinations of canonical residues from ES011. C0010-1 or ES011. C1001 were grafted onto the templates. A human IgG 1 were introduced. The resulting variants were produced and designated as H0010. H12. HG1 (also named as ES011. H0010. H12. HG1) and H1001. H11. HG1 (also named as ES011. H1001. H11. HG1) , respectively. The suffix “HG1” stands for the subclass of Fc region. The amino acid sequences of these antibodies are list in Table 5.

[0198] Table 5. Summary of monoclonal antibodies

[0199] 2.2 Characterization of the humanized variants

[0200] 2.2.1 Affinity detection

[0201] The binding affinity of C0010-1 derived humanized variant H0010. H12. HG1 or C1001 derived humanized variant H1001. H11 to LILRB4-ECD-His was determined using Biacore. The association and dissociation curves were fit with 1: 1 binding model, and the Ka / Kd / KD values for each antibody were calculated and summarized in Tables 6-7. H0010. H12 retained human LILRB4 binding affinity of the parental antibody C0010-1, and H1001. H11 retained human LILRB4 binding affinity of the parental antibody C1001.

[0202] Table 6. Human LILRB4 binding affinity of ES011. C0010-1 and H0010. H12. HG1

[0203] Table 7. Human LILRB4 binding affinity of ES011. C0010-1 and H0010. H12. HG1

[0204] Example 3: Bispecific antibody generation and characterization

[0205] 3.1 Bispecific antibody generation

[0206] ES038.115, ES038.116, ES038.212, ES038.215, ES038.216 and ES038.226 were generated in Biointron. According to the sequencing results, a human IgG1 with L234A and L235A mutations (LALA mutation) were introduced to ES038.116, a human IgG1 with S239D, A330L and I332E mutations (DLE mutation) were introduced to ES038.215 and ES038.226. ES038.115, ES038.212 and ES038.216 harbor a wildtype human IgG1 Fc. All the bispecific antibodies are symmetrical (FIG. 1) , with molecule weight about 200KD. The major components of the bispecific antibodies are list in Table 8.

[0207] Table 8. Summary of anti-LILRB4 / NKG2A / 2C antibodies

[0208] 3.2 Bispecific antibody characterization

[0209] 3.2.1 Binding activity

[0210] Human NKG2A / CD94 and human LILRB4 binding activity of ES038.115, ES038.116, human IgG1 isotype (HG1) and a human IgG1LALA isotype (HG1LALA) were detected by FACS assay using 293T-hNKG2A / CD94, Molm-13-Leu as well as 293T-hLILRB4 cells. ES038.115 and ES038.116 strongly bind to 293T-hNKG2A / CD94 (FIG. 2) , Molm-13-Leu (FIG. 3) , 293T-hLILRB4 cells (FIG. 4) and with similar affinity. The EC50 and top MFI values analyzed using Four-Parameter nonlinear fitting by GraphPad Prism 9.0 are summarized in Table 9-1.

[0211] Table 9-1. Binding of ES038.115 and ES038.116 to membrane NKG2A / CD94 and LILRB4

[0212] Human NKG2A / CD94 and human LILRB4 binding activity of ES038.212, ES038.215, ES038.216, ES038.226, ES011. H0010. H12. HG1, ES011. H1001. H11. HG1, monoclonal IgG1 antibody H17. H73 (also called ES015. H017. H73DR02. HG1, reference to Example 4.1 of PCT / CN2024 / 098762) , and human IgG1 isotype (HG1) were detected by FACS assay using 293T-hNKG2A / CD94, as well as 293T-hLILRB4 cells. The EC50 and top MFI values analyzed using Four-Parameter nonlinear fitting by GraphPad Prism 9.0 are summarized in Table 9-2. Table 9-2. Binding of testing antibodies to membrane NKG2A / CD94 and LILRB4

[0213] ES038.212, ES038.215, ES038.216, and ES038.226 strongly bind to 293T-hLILRB4 cells (FIG. 12) and 293T-hNKG2A / CD94 (FIG. 13) and with similar affinity.

[0214] 3.2.2 CD107a degranulation assay

[0215] The effects of ES038.115 and ES038.116 in NK cell degranulation were studied with this assay. Briefly, NK cells were isolated from human PBMC using Ficoll gradient and the human NK cell isolation kit (Stemcell) . NK cells were cultured overnight with recombinant IL-2 (400IU / ml) . Following activation, the cell viability was more than 90%, as determined by cell counter. NK cells were then co-cultured for 24 hours with 5 × l04 of the Molm-13-Luc expressing LILRB4 in the presence of ES038.115 and ES038.116 or human IgG1, human IgG1LALA isotype controls. Cells were then collected and stained for the following markers: anti-human CD56, live / dead, and anti-human CD107a. Cells were acquired fresh on BD Canto II.In the presence of ES038.115 and ES038.116, there was an increase in NK cell degranulation as measured by CD107a expression by flow cytometry (FIG. 5) . Detailed results show below.

[0216] 3.2.3 Primary NK cytotoxicity assay

[0217] The effects of ES038.115, ES038.116 and ES011. C0010-1. HG1 on primary NK mediated cytotoxicity toward Molm-13-Luc and THP-1-Luc were studied with this assay. Briefly, NK cells were isolated from human PBMC using Ficoll gradient and the human NK cell isolation kit (Stemcell) . NK cells were primed with recombinant IL-2 for 24 hours. After NK activation, serial dilutions of antibodies and NK cells were added to U-bottomed 96-well microtiter plates for pre-incubation. Target cells were treated with IFNγ overnight to induce HLA-E expression. Following a short centrifugation, the co-cultures were incubated for 24 hours at 37 ℃ in a 95%humidified chamber with 5%CO2. The signal of luciferase reporter gene was detected with Percentages of specific lysis were calculated using the following formula:

[0218] As shown in FIG. 6 and FIG. 7, ES038.115 and ES038.116 significantly improved primary NK -mediated specific lysis toward LILRB4 expressing tumor cell lines, Molm-13-Luc and THP-1-Luc than monoclonal antibody ES011. C0010-1. HG1.

[0219] 3.2.4 Jurkat-NFAT NKG2C / CD94 reporter assay

[0220] ES038.115 and ES038.116, as well as monoclonal IgG1 anti-NKG2A / 2C antibody ES015. H017. H73DR02. HG1, were tested for the functional activity of activating NFAT signaling in Jurkat-NKG2C / CD94 / DAP12 and 293T-hLILRB4 co-culture system.

[0221] ES038.216, ES038.226, as well as ES015. H017. H73DR02. HG1 were tested for the functional activity of activating NFAT signaling in Jurkat-NKG2C / CD94 / DAP12, or in Jurkat-NKG2C / CD94 / DAP12 and Molm-13 co-culture system.

[0222] The testing antibodies or isotype antibody (HG1, HG1LALA) were added to the co-culture at titrating concentrations. Following five hours of incubation at 37 ℃, luciferase activity was quantified using One-Glo Reagent. Relative Luciferase Units (RLU) data was plotted using GraphPad software.

[0223] As shown in FIG. 8, the ES038.115 and ES038.116 can activate NFAT signaling in a NKG2C-expressing Jurkat T cell line when crosslinking by 293T-hLILRB4 cells. However, monoclonal antibody (H17. H73) could hardly activate NFAT signaling.

[0224] As shown in FIG. 14, ES038.216 and ES038.226 can activate NFAT signaling in a NKG2C-expressing Jurkat T cell line when crosslinking by Molm-13 cells with similar potency.

[0225] As shown in FIG. 15, ES038.216, ES038.226 and ES015. H017. H73DR02. HG1 can’ t activate NFAT signaling in a NKG2C-expressing Jurkat T cell line without crosslinking by Molm-13 cells.

[0226] 3.2.5 PBMC Killing activity

[0227] The effects of bispecific antibody on PBMC -mediated cytotoxicity toward Molm-13-Luc were studied with this assay. Briefly, human PBMC were recovered primed with recombinant IL-2 for 24 hours. Serial dilutions of antibodies and PBMC cells were added to U-bottomed 96-well microtiter plates for pre-incubation. Target cells were treated with IFNγ overnight to induce HLA-E expression. Following a short centrifugation, the co-cultures were incubated for 24 hours at 37 ℃ in a 95%humidified chamber with 5%CO2. The signal of luciferase reporter gene was detected with Percentages of specific lysis were calculated using the following formula:

[0228] Human IgG1 anti-LILRB4 monoclonal antibodies ES011. H0010. H12. HG1 and ES011. H1001. H11. HG1, human IgG1 anti-NKG2A / 2C antibodies ES015. H017. H73DR02. HG1 and ES015. H017. H73DR02. HG1LALA, were tested as controls.

[0229] As shown in FIG. 16, ES038.215 and ES038.226 significantly improved PBMC-mediated specific lysis toward LILRB4 expressing tumor cell line Molm-13-Luc than monoclonal anti-LILRB4 antibodies. DLE mutation in IgG1 helps to improve PBMC-mediated specific lysis toward LILRB4 expressing tumor cell line.

[0230] While particular embodiments have been described, alternatives, modifications, variations, improvements, and substantial equivalents that are or may be presently unforeseen may arise to applicants or others skilled in the art. Accordingly, the appended claims as filed and as they may be amended are intended to embrace all such alternatives, modifications, variations, improvements, and substantial equivalents.

Claims

1.An anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof, comprising:a heavy chain variable domain (VH) comprising a HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and a light chain variable domain (VL) comprising a LCDR1, LCDR2 and LCDR3, whereinthe HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 6, respectively; orthe HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, and SEQ ID NO: 38, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, and SEQ ID NO: 41, respectively; orthe HCDR1, HCDR2 and HCDR3 comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, and SEQ ID NO: 38, respectively; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, and SEQ ID NO: 52, respectively.2.The anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof of claim 1, wherein(1) the VH comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and the VL comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; or(2) the VH comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and the VL comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; or(3) the VH comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and the VL comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; or(4) the VH comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and the VL comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 27.3.The anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof of claim 1 or 2, wherein(1) the VH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and the VL comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; or(2) the VH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and the VL comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; or(3) the VH comprises a mutation R44C as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and the VL comprises a mutation S104C as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; or(4) the VH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and the VL comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; or(5) the VH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and the VL comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; or(6) the VH comprises a mutation G44C as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and the VL comprises a mutation G103C as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 27.4.The anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof of any of claims 1-3, wherein:(1) the antibody is a Fab fragment, a F (ab') fragment, or a F (ab') 2 fragment; or(2) the antibody or antigen binding fragment thereof is a monoclonal antibody, a single chain antibody fragment (scFv) , a minibody, a diabody or a triabody; or(3) the antibody is a chimeric or humanized antibody; or(4) the antibody is an IgG-based molecule comprising a Fc region or a partial region of Fc, optionally, the Fc is derived from IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4.5.A bispecific antibody, comprising:a) an anti-LILRB4 single chain variable fragment (scFv) comprising a first heavy chain variable domain (VH1) and a first light chain variable domain (VL1) , whereinthe VH1 comprises a HCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a HCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and a HCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and the VL1 comprises a LCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a LCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and a LCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6; orthe VH1 comprises a HCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, a HCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and a HCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 38; and the VL1 comprises a LCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, a LCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, and a LCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 41; orthe VH1 comprises a HCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, a HCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and a HCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 38; and the VL1 comprises a LCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, a LCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and a LCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52; andb) a second binding fragment for binding an extracellular domain of human NKG2A.6.The bispecific antibody of claim 5, wherein: the anti-LILRB4 scFv comprises:(1) a VH1 comprising an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and a VL1 comprising an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; or(2) a VH1 comprising an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and a VL1 comprising an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; or(3) the VH comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and the VL comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; or(4) the VH comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and the VL comprises an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 27.7.The bispecific antibody of claim 5 or 6, wherein: the anti-LILRB4 scFv comprises:(1) a VH1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and a VL1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; or(2) a VH1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and a VL1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; or(3) a VH1 comprising a mutation R44C as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and a VL1 comprising a mutation S104C as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 10; or(4) the VH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and the VL comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25; or(5) the VH comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and the VL comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 27; or(6) the VH comprises a mutation G44C as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and the VL comprises a mutation G103C as compared to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 27.8.The bispecific antibody of any of claims 5-7, wherein:from N-to C-terminus, the anti-LILRB4 scFv comprises a VL1-linker A-VH1 fragment;optionally, the linker A comprises n repeats of peptide G4S (SEQ ID NO: 17) , n is 0, 1, 2, 3, 4, 5, or 6.9.The bispecific antibody of any of claims 5-8, wherein the second binding fragment comprises an anti-NKG2A Fab fragment, a light chain of the anti-NKG2A Fab fragment is fused at its C-terminus to the N-terminus of the anti-LILRB4 scFv; orthe light chain of the anti-NKG2A Fab fragment is fused at its C-terminus to the N-terminus of the anti-LILRB4 scFv via n repeats of peptide G4S (SEQ ID NO: 17) , n is 0, 1, 2, 3, 4, 5, or 6.10.The bispecific antibody of any of claims 5-9, whereinthe anti-NKG2A Fab fragment comprises a second heavy chain variable domain (VH2) comprising a HCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, a HCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and a HCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; and a second light chain variable domain (VL2) comprising a LCDR1 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, a LCDR2 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, and a LCDR3 comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 23.11.The bispecific antibody of any of claims 5-10, whereinthe anti-NKG2A Fab fragment comprises a second heavy chain variable domain (VH2) comprising an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a second light chain variable domain (VL2) comprising an amino acid sequence with at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; orthe VH2 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and the VL2 comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.12.The bispecific antibody of any of claims 5-11, wherein second binding fragment comprises a human Fc fragment, optionally,(1) the Fc is derived from IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4; or(2) the Fc is a wildtype human Fc fragment; or(3) the Fc comprises a human IgG1 Fc with mutations L234A and L235A; or(4) the Fc comprises a human IgG1 Fc with mutations S239D, A330L and I332E.13.The bispecific antibody of any of claims 5-12, comprising a heavy chain (HC) and a light chain (LC) , wherein(1) the HC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and the LC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; or(2) the HC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and the LC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; or(3) the HC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, and the LC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 29; or(4) the HC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and the LC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; or(5) the HC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, and the LC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 33; or(6) the HC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and the LC comprises an amino acid sequence with at least 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identity to an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35.14.The bispecific antibody of any of claims 5-13, wherein, comprising:(1) a HC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and a LC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; or(2) a HC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and a LC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; or(2) a HC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 28, and a LC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 29; or(2) a HC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and a LC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 31; or(2) a HC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, and a LC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 33; or(2) a HC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and a LC comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35.15.The bispecific antibody of any of claims 5-13, wherein(1) the bispecific antibody binds to NKG2A, NKG2C and LILRB4; or(2) the bispecific antibody increases cytotoxicity of NK cells, NKT cells and / or CD8 T cells; or(3) the bispecific antibody increases NK degranulation; or(4) the bispecific antibody increases NK-mediated specific lysis toward LILRB4 expressing tumor cells; or(5) the bispecific antibody binds to human NKG2A with EC50 no more than 5 nM, 3 nM, 1 nM, or 0.8 nM; and the bispecific antibody binds to human LILRB4 with EC50 no more than 5 nM, 3 nM, 2 nM, or 1 nM.16.An isolated polynucleotide encoding the anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof of any of claims 1-4, or the bispecific antibody of any of claims 5-15.17.A vector comprising the isolated polynucleotide of claim 16.18.A host cell comprising the vector of claim 17.19.A kit comprising the anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof of any of claims 1-4, or the bispecific antibody of any of claims 5-15, or the isolated polynucleotide of claim 16, or the vector of claim 17, or the host cell of claim 18.20.A pharmaceutical composition comprising the anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof of any of claims 1-4, or the bispecific antibody of any of claims 5-15, and a pharmaceutically acceptable carrier.21.Use of the anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof of any of claims 1-4, or the bispecific antibody of any of claims 5-15, or the isolated polynucleotide of claim 16, or the vector of claim 17, or the host cell of claim 18, the kit of claim 19, or the pharmaceutical composition of claim 20 in the manufacture of a therapeutic agent for treatment, prevention, or diagnosis of a disease, optionally, the disease comprises autoimmune diseases, microbial infections, and neoplastic diseases.22.A method of diagnosing, preventing, and treating a disease in a subject in need thereof, comprising administering to the subject an effective amount of the anti-LILRB4 antibody or antigen binding fragment thereof of any of claims 1-4, or the bispecific antibody of any of claims 5-15, or the pharmaceutical composition of claim 20, optionally, the disease comprises autoimmune diseases, microbial infections, and neoplastic diseases.23.The use or method of claim 21 or 22, wherein the disease comprises the neoplastic disease which is characterized with expression of LILRB4 and / or NKG2A, optionally, the disease comprises LILRB4 expressing hematopoietic cancer and solid tumors;the autoimmune diseases and microbial infections are characterized by redness, swelling, heat and pain, as consequences of capillary dilation with edema and migration of phagocytic leukocytes.24.The use or method of claim 21 or 22, wherein:the neoplastic disease includes acute myeloid leukemia, breast cancer, carcinoid cancer, cervical cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, renal cancer, colorectal cancer, gastric cancer, testicular cancer, thyroid cancer, bladder cancer, urethral cancer, renal cell carcinoma (RCC) , or hematologic malignancy;the autoimmune diseases and microbial infections comprise arthritis, contact dermatitis, hyper-IgE syndrome, inflammatory bowel disease, allergic asthma, and idiopathic inflammatory disease.

Images