Compositions comprising a TTR guide RNA and a polynucleotide encoding an RNA-guided DNA binding agent and methods using the same

Abstract

Compositions and methods for editing, e.g., introducing double-stranded breaks, within the TTR gene are provided. Compositions and methods for treating subjects having amyloidosis associated with transthyretin (ATTR), are provided.

Description

Compositions comprising a TTR guide RNA and a polynucleotide encoding an RNA-guided DNA binding agent and methods using the sameCROSS REFERENCE

[0001] This application claims benefit of priorities of International Patent Application No. PCT / CN2025 / 071994 filed on 13 January 2025 and International Patent Application No. PCT / CN2025 / 076793 filed on 11 February 2025, which are herein incorporated by reference in their entirety.Technical Field

[0002] The present invention relates to compositions and methods for editing, e.g., introducing double-stranded breaks, within the TTR gene, and also relates to compositions and methods for treating subjects having amyloidosis associated with transthyretin (ATTR) .Background

[0003] Transthyretin-related amyloidosis (ATTR) is a complex condition with a diverse range of symptoms and challenges in treatment.

[0004] The nomenclature surrounding ATTR is multifaceted, encompassing terms such as "ATTR, " "TTR-related amyloidosis, " "TTR amyloidosis, " "ATTR amyloidosis, " "ATTR familial amyloidosis, " and "ATTRwt" or "wild-type ATTR. " These various terms reflect the nuanced nature of the disease, which can arise from either genetic mutation in the transthyretin (TTR) gene or the misfolding and deposition of wild-type TTR.

[0005] ATTR manifests in different classes, each with distinct characteristics and prognoses. Familial amyloid polyneuropathy (FAP) is often associated with sensorimotor neuropathy, while familial amyloid cardiomyopathy (FAC) and wild-type TTR amyloidosis (wt-TTR amyloidosis) commonly present with congestive heart failure. FAP and FAC are linked to genetic mutations in the TTR gene, with over 100 identified mutations, whereas wt-TTR amyloidosis is associated with aging and lacks a genetic mutation.

[0006] The prevalence of FAP and FAC globally is estimated to impact around 50,000 patients, underlining the need for effective treatments. While more than 100 mutations in TTR are associated with ATTR, certain mutations, such as those at T60, V30, and VI 22, are closely linked to neuropathy, cardiomyopathy, or both.

[0007] The current treatment landscape for ATTR faces significant challenges. Approaches such as liver transplantation, once studied extensively, are declining in use due to associated risks, and disease progression may continue post-transplantation. Small molecule stabilizers, including diflunisal and tafamidis, show promise in slowing ATTR progression but fall short of halting the disease.

[0008] In the pursuit of more effective treatments, recent research has delved into advanced therapeutic strategies. One notable approach involves small interfering RNA (siRNA) knockdown, antisense knockdown, or monoclonal antibodies targeting amyloid fibrils for destruction. While these approaches have shown promising preliminary data, there is a persistent need for treatments that can produce long-lasting suppression of TTR.

[0009] In conclusion, the complexities of ATTR demand innovative solutions.Summary

[0010] The present invention introduces a cutting-edge technical solution in the form of gene therapy. Specifically, the use of guide RNA with an RNA-guided DNA binding agent, such as the CRISPR / Cas system, is suggested. This approach aims to substantially reduce or knockout the expression of the TTR gene, thereby mitigating or eliminating the production of TTR protein associated with ATTR. The technical solution in the present invention is on achieving a long-term reduction or elimination of TTR, addressing a crucial gap in the current treatment landscape.

[0011] The present disclosure solves the above-mentioned technical problems through the following technical solutions.

[0012] The following embodiments are provided herein.

[0013] Embodiment 1 is a single guide RNA (sgRNA) comprising: a. a sequence selected from SEQ ID NOs: 601-604; b. a sequence that is at least 90%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 601-604; or c. a sequence that is at least 99%, at least 98%, at least 97%, at least 96%, at least 95%, at least 94%, at least 93%, at least 92%, at least 91%, or at least 90%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 601-604.

[0014] Embodiment 2 is a composition comprising a single guide RNA of embodiment 1.

[0015] Embodiment 3 is the composition of embodiment 2, wherein the composition further comprises an RNA-guided DNA binding agent or a nucleic acid encoding an RNA-guided DNA binding agent.

[0016] Embodiment 4 is a composition comprising: (i) a single guide RNA (sgRNA) or a vector encoding a single guide RNA (sgRNA) , wherein: a. the sgRNA comprises a sequence selected from SEQ ID NOs: 601-604; b. the sgRNA comprises a sequence that is at least 90%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 601-604; or c. the sgRNA comprises a sequence that is at least 99%, at least 98%, at least 97%, at least 96%, at least 95%, at least 94%, at least 93%, at least 92%, at least 91%, or at least 90%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 601-604.

[0017] Embodiment 5 is the composition of embodiment 4, wherein the composition further comprises (ii) an RNA-guided DNA binding agent or a nucleic acid encoding an RNA-guided DNA binding agent.

[0018] Embodiment 6 is the composition of embodiment 3 or 5, wherein the RNA-guided DNA binding agent is Cas9.

[0019] Embodiment 7 is the composition of embodiment 3, 5 or 6, wherein the nucleic acid encoding the RNA-guided DNA binding agent comprises an open reading frame (ORF) comprising a sequence that is at least 90%identical to SEQ ID NOs: 701-716, and 725.

[0020] Embodiment 8 is the composition of embodiment 7, wherein the nucleic acid encoding the RNA-guided DNA binding agent comprises an open reading frame (ORF) comprising a sequence that is at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%to SEQ ID NOs: 701-716, and 725.

[0021] Embodiment 9 is the composition of embodiment 8, wherein the nucleic acid encoding the RNA-guided DNA binding agent comprises an open reading frame (ORF) comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 701-716, and 725.

[0022] Embodiment 10 is the composition of any one of embodiments 7-9, wherein the ORF is a modified ORF.

[0023] Embodiment 11 is the composition of any one of embodiments 3, 5-10, wherein the nucleic acid encoding the RNA-guided DNA binding agent comprises an RNA sequence that is at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 253, 291, 293, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 317, 318, 319, 320, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 360, 585, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, and 724.

[0024] Embodiment 12 is the composition of any one of embodiments 3, 5-10, wherein the nucleic acid encoding the RNA-guided DNA binding agent comprises a DNA sequence that is at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 437, 475, 477, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 501, 502, 503, 504, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 544 and 586.

[0025] Embodiment 13 is the composition of any one of the preceding embodiments, wherein the composition further comprises: (iii) an ionizable lipid; (iv) a neutral lipid; (v) a helper lipid; (vi) a stealth lipid; or (vii) a combination of any one or more of (iii) - (vi) .

[0026] Embodiment 14 is the composition of embodiment 13, wherein the ionizable lipid is YZL480.

[0027] Embodiment 15 is the composition of embodiment 13 or 14, wherein the neutral lipid is selected from the group consisting of: distearoylphosphatidylcholine (DSPC) , dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) , dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) , dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG) , dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) , dioleoyl-phosphatidylethanolamine (DOPE) , palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC) , palmitoyloleoyl-phosphatidylethanolamine (POPE) and dioleoyl-phosphatidylethanolamine 4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1 carboxylate (DOPE-mal) , dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine (DPPE) , dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE) , distearoyl-phosphatidylethanolamine (DSPE) , 16-O-monomethyl PE, 16-O-dimethyl PE, 18-1-trans PE, 1-stearioyl-2-oleoylphosphatidyethanol amine (SOPE) and 1,2-dielaidoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (trans DOPE) ; preferably the neutral lipid is DSPC.

[0028] Embodiment 16 is the composition of any one of embodiments 13-15, wherein the helper lipid is steroid, optionally, the steroid is cholesterol.

[0029] Embodiment 17 is the composition of any one of embodiments 13-16, wherein the stealth lipid is pegylated lipid; optionally, the pegylated lipid is selected from the group consisting of: pegylated diacylglycerol (PEG-DAG) , 1- (monomethoxy-polyethyleneglycol) -2, 3-dimyristoylglycerol (PEG-DMG) , a pegylated phosphatidylethanoloamine (PEG-PE) , a PEG succinate diacylglycerol (PEG-S-DAG) such as 4-O- (2′, 3′-di (tetradecanoyloxy) propyl-1-O- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) butanedioate (PEG-S-DMG) , a pegylated ceramide (PEG-cer) , or a PEG dialkoxypropylcarbamate such as ω-methoxy (polyethoxy) ethyl-N- (2, 3-di (tetradecanoxy) propyl) carbamate or 2,3-di (tetradecanoxy) propyl-N- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) carbamate; preferably, the pegylated lipid is DMG-PEG2000.

[0030] Embodiment 18 is the composition of any one of embodiments 13-17, wherein the composition comprises an ionizable lipid of YZL480, DSPC, Cholesterol and DMG-PEG2000.

[0031] Embodiment 19 is the composition of any one of embodiments 13-18, wherein the composition comprises (1) an ionizable lipid with a concentration ranging from 40 mol %to 50 mol %of the total lipid component; (2) a neutral lipid with a concentration ranging from 5 mol %to 15 mol %of the total lipid component; (3) a helper lipid with a concentration ranging from 35 mol %to 55 mol %of the total lipid component; and (4) a stealth lipid with a concentration ranging from 1.0 mol %to 3.0 mol %of the total lipid component.

[0032] Embodiment 20 is the composition of any one of embodiments 13-19, wherein the composition comprises (1) an ionizable lipid with a concentration of 46.3 mol %of the total lipid component; (2) a neutral lipid with a concentration of 9.4 mol %of the total lipid component; (3) a helper lipid with a concentration of 42.3 mol %of the total lipid component; and (4) a stealth lipid with a concentration of 2 mol %of the total lipid component.

[0033] Embodiment 21 is the composition of any one of the preceding embodiments, wherein the composition has an N / P ratio of about 3-10.

[0034] Embodiment 22 is the composition of any one of the preceding embodiments, wherein the composition has an N / P ratio of about 4-8.

[0035] Embodiment 23 is the composition of any one of the preceding embodiments, wherein the composition has an N / P ratio of about 4, 4.5, 5, 5.5, 6, or 6.5.

[0036] Embodiment 24 is a pharmaceutical formulation comprising the composition of any one of the preceding claims, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0037] Embodiment 25 is a lipid nanoparticle (LNP) formulation comprising: (i) a single guide RNA (sgRNA) or a vector encoding a single guide RNA (sgRNA) , wherein the sgRNA comprises a sequence selected from SEQ ID NOs: 601-604; (ii) an RNA-guided DNA binding agent or a nucleic acid encoding an RNA-guided DNA binding agent, wherein the nucleic acid encoding the RNA-guided DNA binding agent comprises an open reading frame (ORF) comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 701-716, and 725; (iii) the ionizable lipid; (iv) the neutral lipid; (v) the helper lipid; (vi) the stealth lipid.

[0038] Embodiment 26 is the LNP formulation of embodiment 20, wherein the nucleic acid encoding the RNA-guided DNA binding agent comprises an RNA sequence that is at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 253, 291, 293, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 317, 318, 319, 320, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 360, 585, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, and 724.

[0039] Embodiment 27 is the LNP formulation of embodiment 20, wherein the nucleic acid encoding the RNA-guided DNA binding agent comprises a DNA sequence that is at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 437, 475, 477, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 501, 502, 503, 504, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 544 and 586.

[0040] Embodiment 28 is the LNP formulation of any one of embodiments 20-22, wherein ionizable lipid is YZL480.

[0041] Embodiment 29 is the LNP formulation of any one of embodiments 20-23, wherein the neutral lipid is DSPC; the helper lipid is Cholesterol; the stealth lipid is DMG-PEG2000.

[0042] Embodiment 30 is the LNP formulation of any one of embodiments 25-29, wherein the composition comprises an ionizable lipid with a concentration ranging from 40 mol %to 50 mol %of the total lipid component; (i) a neutral lipid with a concentration ranging from 5 mol %to 15 mol %of the total lipid component; (ii) a helper lipid with a concentration ranging from 35 mol %to 55 mol %of the total lipid component; and (ii) a stealth lipid with a concentration ranging from 1.0 mol %to 3.0 mol %of the total lipid component.

[0043] Embodiment 31 is the LNP formulation of any one of embodiments 25-30, wherein the composition comprises an ionizable lipid with a concentration of 46.3 mol %of the total lipid component; (i) a neutral lipid with a concentration of 9.4 mol %of the total lipid component; (ii) a helper lipid with a concentration of 42.3 mol %of the total lipid component; and (ii) a stealth lipid with a concentration of 2 mol %of the total lipid component.

[0044] Embodiment 32 is the LNP formulation of any one of the preceding embodiments, wherein the composition has an N / P ratio of about 3-10.

[0045] Embodiment 33 is the LNP formulation of any one of the preceding embodiments, wherein the composition has an N / P ratio of about 4-8.

[0046] Embodiment 34 is the LNP formulation of any one of the preceding embodiments, wherein the composition has an N / P ratio of about 4, 4.5, 5, 5.5, 6, or 6.5.

[0047] Embodiment 35 is a method of modifying a TTR gene and / or inducing a double-stranded break (DSB) within the TTR gene, wherein the method comprises delivering the composition of any one of embodiments 2-23, the pharmaceutical formulation of claim 24 or the LNP formulation of any one of embodiments 25-34 to a cell.

[0048] Embodiment 36 is a method of reducing TTR serum concentration, treating amyloidosis associated with TTR (ATTR) , and / or reducing or preventing accumulation of amyloids or amyloid fibrils comprising TTR in a subject in need thereof, wherein the method comprises administering the composition of any one of embodiments 2-23, the pharmaceutical formulation of embodiment 24 or the LNP formulation of any one of embodiments 25-34 to the subject.

[0049] Embodiment 37 is use of the composition of any one of embodiments 2-23, the pharmaceutical formulation of embodiment 24 or the LNP formulation of any one of embodiments 25-34 for the preparation of a medicament for modifying the TTR gene and / or inducing a double-stranded break (DSB) within the TTR gene.

[0050] Embodiment 38 is use of the composition of any one of embodiments 2-23, the pharmaceutical formulation of embodiment 24 or the LNP formulation of any one of embodiments 25-34 for the preparation of a medicament for reducing TTR serum concentration, treating amyloidosis associated with TTR (ATTR) , and / or reducing or preventing the accumulation of amyloids or amyloid fibrils comprising TTR in a subject.

[0051] Embodiment 39 is the composition of any one of embodiments 2-23, the pharmaceutical formulation of embodiment 24 or the LNP formulation of any one of embodiments 25-34 for use in modifying the TTR gene and / or inducing a double-stranded break (DSB) within the TTR gene.

[0052] Embodiment 40 is the composition of any one of embodiments 2-23, the pharmaceutical formulation of embodiment 24 or the LNP formulation of any one of embodiments 25-34 for use in reducing TTR serum concentration, treating amyloidosis associated with TTR (ATTR) , and / or reducing or preventing the accumulation of amyloids or amyloid fibrils comprising TTR in a subject.

[0053] Sequence Listing Notes: *=PS linkage; m=2'-O-Me nucleotide; f= 2'-fluoro modification; m1Ψmodification=N1-methylpseudouridine modification

[0054] Table 1 Detailed information of Sequence Listing Notes: *=PS linkage; m=2'-O-Me nucleotide; f= 2'-fluoro modification; m1Ψmodification=N1-methylpseudouridine modification

[0055] Beneficial effects:

[0056] The present application provides a composition, a pharmaceutical formulation, or a lipid nanoparticle (LNP) comprising a single guide RNA and an RNA-guided DNA binding agent such as the CRISPR / Cas system, which can efficiently editing TTR sequence with relatively high efficiency and good performance, thereby achieving a long-term reduction or elimination of TTR. Additionally, the LNP in the present application can be effectively delivered in vivo. Thus, they can be used for reducing TTR serum concentration, treating amyloidosis associated with TTR (ATTR) , and / or reducing or preventing accumulation of amyloids or amyloid fibrils comprising TTR.Brief description of the drawings

[0057] FIG. 1 shows the percentage editing of TTR gene observed following administration of mRNA with distinct codon optimization (m5815-1, SEQ ID NO: 717; Cas001C, SEQ ID NO: 719; or Cas001F, SEQ ID NO: 722) in PHH cell.

[0058] FIG. 2 shows the percentage editing of TTR gene observed following administration of mRNA with distinct codon optimization (m5815-1, SEQ ID NO: 717; Cas001D, SEQ ID NO: 720; or Cas001F, SEQ ID NO: 722) in PHH cell.

[0059] FIG. 3 shows the percentage editing of TTR gene observed following administration of mRNA with distinct codon optimization (Cas001E, SEQ ID NO: 721 or Cas001F, SEQ ID NO: 722) in PHH cell.

[0060] FIG. 4 shows the percentage editing of TTR gene observed following administration of mRNA with distinct codon optimization (Cas001F, SEQ ID NO: 722 or Cas001G, SEQ ID NO: 723) in PHH cell.

[0061] FIG. 5 shows the percentage of liver editing of TTR gene observed following administration of LNP formulations (encapsulated m5815-1, SEQ ID NO: 717; m5815-9, SEQ ID NO: 724 or Cas001F, SEQ ID NO: 722) to mice with murine TTR.

[0062] FIGs. 6-9 shows the percentage editing of TTR gene observed following administration of mRNA with distinct UTR combinations in PHH cell.

[0063] FIGs. 10-11 shows the percentage of liver editing of TTR gene observed following administration of LNP formulations (encapsulated Cas001F with distinct UTR combinations) to mice with murine TTR.

[0064] FIG. 12 shows the percentage of liver editing of TTR gene observed following administration of LNP formulations to mice with humanized TTR.

[0065] FIG. 13 shows the percentage of liver editing of TTR gene observed following administration of LNP formulations (encapsulated with different guide RNAs) to humanized TTR mice. Detailed description of the preferred embodiment

[0066] Before describing the present teachings in detail, it is to be understood that the disclosure is not limited to specific compositions or process steps, as such may vary. It should be noted that, as used in this specification and the appended claims, the singular form “a” , “an” and “the” include plural references unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “aconjugate” includes a plurality of conjugates and reference to “a cell” includes a plurality of cells and the like.

[0067] Numeric ranges are inclusive of the numbers defining the range. Measured and measurable values are understood to be approximate, taking into account significant digits and the error associated with the measurement. Also, the use of “comprise” , “comprises” , “comprising” , “contain” , “contains” , “containing” , “include” , “includes” , and “including” are not intended to be limiting. It is to be understood that both the foregoing general description and detailed description are exemplary and explanatory only and are not restrictive of the teachings.

[0068] Unless specifically noted in the above specification, embodiments in the specification that recite “comprising” various components are also contemplated as “consisting of’ or “consisting essentially of” the recited components; embodiments in the specification that recite “consisting of” various components are also contemplated as “comprising” or “consisting essentially of” the recited components; and embodiments in the specification that recite “consisting essentially of” various components are also contemplated as “consisting of” or “comprising” the recited components (this interchangeability does not apply to the use of these terms in the claims) . The term “or” is used in an inclusive sense, i.e., equivalent to “and / or” unless the context clearly indicates otherwise.

[0069] The section headings used herein are for organizational purposes only and are not to be construed as limiting the desired subject matter in any way. In the event that any material incorporated by reference contradicts any term defined in this specification or any other express content of this specification, this specification controls. While the present teachings are described in conjunction with various embodiments, it is not intended that the present teachings be limited to such embodiments. On the contrary, the present teachings encompass various alternatives, modifications, and equivalents, as will be appreciated by those of skill in the art.

[0070] Definitions

[0071] “Polynucleotide” and “nucleic acid” are used herein to refer to a multimeric compound comprising nucleosides or nucleoside analogs which have nitrogenous heterocyclic bases or base analogs linked together along a backbone, including conventional RNA, DNA, mixed RNA-DNA, and polymers that are analogs thereof. A nucleic acid “backbone” can be made up of a variety of linkages, including one or more of sugar-phosphodiester linkages, peptide-nucleic acid bonds ( “peptide nucleic acids” or PNA; PCT No. WO 95 / 32305) , phosphorothioate linkages, methylphosphonate linkages, or combinations thereof. Sugar moieties of a nucleic acid can be ribose, deoxyribose, or similar compounds with substitutions, e.g., 2’ methoxy or 2’ halide substitutions. Nitrogenous bases can be conventional bases (A, G, C, T, U) , analogs thereof (e.g., modified uridines such as 5-methoxyuridine, pseudouridine, or Nl-methylpseudouridine, or others) ; inosine; derivatives of purines or pyrimidines (e.g., N4-methyl deoxyguanosine, deaza-or aza-purines, deaza-or aza-pyrimidines, pyrimidine bases with substituent groups at the 5 or 6 position (e.g., 5-methylcytosine) , purine bases with a substituent at the 2, 6, or 8 positions, 2-amino-6-methylaminopurine, 06-methylguanine, 4-thio-pyrimidines, 4-amino-pyrimidines, 4-dimethylhydrazine-pyrimidines, and 04-alkyl-pyrimidines; US Pat. No. 5,378,825 and PCT No. WO 93 / 13121) . For general discussion see The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., ed., 11th ed., 1992) . Nucleic acids can include one or more “abasic” residues where the backbone includes no nitrogenous base for position (s) of the polymer (US Pat. No. 5,585,481) . A nucleic acid can comprise only conventional RNA or DNA sugars, bases and linkages, or can include both conventional components and substitutions (e.g., conventional bases with 2’methoxy linkages, or polymers containing both conventional bases and one or more base analogs) . Nucleic acid includes “locked nucleic acid” (LNA) , an analogue containing one or more LNA nucleotide monomers with a bicyclic furanose unit locked in an RNA mimicking sugar conformation, which enhance hybridization affinity toward complementary RNA and DNA sequences (Vester and Wengel, 2004, Biochemistry 43 (42) : 13233-41) . RNA and DNA have different sugar moieties and can differ by the presence of uracil or analogs thereof in RNA and thymine or analogs thereof in DNA.

[0072] “Polypeptide” as used herein refers to a multimeric compound comprising amino acid residues that can adopt a three-dimensional conformation. Polypeptides include but are not limited to enzymes, enzyme precursor proteins, regulatory proteins, structural proteins, receptors, nucleic acid binding proteins, antibodies, etc. Polypeptides may, but do not necessarily, comprise post-translational modifications, non-natural amino acids, prosthetic groups, and the like.

[0073] As used herein, an “RNA-guided DNA binding agent” means a polypeptide or complex of polypeptides having RNA and DNA binding activity, or a DNA-binding subunit of such a complex, wherein the DNA binding activity is sequence-specific and depends on the sequence of the RNA. Exemplary RNA-guided DNA binding agents include Cas cleavases / nickases and inactivated forms thereof (“dCas DNA binding agents” ) . “Cas nuclease” , also called “Cas protein” , as used herein, encompasses Cas cleavases, Cas nickases, and dCas DNA binding agents. Cas cleavases / nickases and dCas DNA binding agents include a Csm or Cmr complex of a type III CRISPR system, the CaslO, Csml, or Cmr2 subunit thereof, a Cascade complex of a type I CRISPR system, the Cas3 subunit thereof, and Class 2 Cas nucleases. As used herein, a “Class 2 Cas nuclease” is a single-chain polypeptide with RNA-guided DNA binding activity, such as a Cas9 nuclease or a Cpfl nuclease. Class 2 Cas nucleases include Class 2 Cas cleavases and Class 2 Cas nickases (e.g., H840A, D10A, or N863A variants) , which further have RNA-guided DNA cleavases or nickase activity, and Class 2 dCas DNA binding agents, in which cleavase / nickase activity is inactivated. Class 2 Cas nucleases include, for example, Cas9, Cpfl, C2cl, C2c2, C2c3, HF Cas9 (e.g., N497A, R661A, Q695A, Q926A variants) , HypaCas9 (e.g., N692A, M694A, Q695A, H698A variants) , eSPCas9 (1.0) (e. g, K810A, K1003A, R1060A variants) , and eSPCas9 (l. l) (e.g., K848A, K1003A, R1060A variants) proteins and modifications thereof. Cpfl protein, Zetsche et al., Cell, 163: 1-13 (2015) , is homologous to Cas9, and contains a RuvC-like nuclease domain. Cpfl sequences of Zetsche et al. are incorporated by reference in their entirety. See, e.g., Zetsche et al., “Cas9” encompasses Spy Cas9, the variants of Cas9 listed herein, and equivalents thereof. See, e.g., Makarova et al., Nat Rev Microbiol, 13 (11) : 722-36 (2015) ; Shmakov et al., Molecular Cell, 60: 385-397 (2015) .

[0074] “mRNA” is used herein to refer to a polynucleotide that is RNA or modified RNA and comprises an open reading frame that can be translated into a polypeptide (i.e., can serve as a substrate for translation by a ribosome and amino-acylated tRNAs) . mRNA can comprise a phosphate-sugar backbone including ribose residues or analogs thereof, e.g., 2’-methoxy ribose residues. In some embodiments, the sugars of a nucleic acid phosphate-sugar backbone consist essentially of ribose residues, 2’-methoxy ribose residues, or a combination thereof. In general, mRNAs do not contain a substantial quantity of thymidine residues (e.g., 0 residues or fewer than 30, 20, 10, 5, 4, 3, or 2 thymidine residues; or less than 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, or 0.1%thymidine content) . An mRNA can contain modified uridines at some or all of its uridine positions.

[0075] As used herein, “TTR” refers to transthyretin, which is the gene product of a TTR gene.

[0076] As used herein, “amyloid” refers to abnormal aggregates of proteins or peptides that are normally soluble. Amyloids are insoluble, and amyloids can create proteinaceous deposits in organs and tissues. Proteins or peptides in amyloids may be misfolded into a form that allows many copies of the protein to stick together to form fibrils. While some forms of amyloid may have normal functions in the human body, “amyloids” as used herein refers to abnormal or pathologic aggregates of protein. Amyloids may comprise a single protein or peptide, such as TTR, or they may comprise multiple proteins or peptides, such as TTR and additional proteins.

[0077] As used herein, “amyloid fibrils” refers to insoluble fibers of amyloid that are resistant to degradation. Amyloid fibrils can produce symptoms based on the specific protein or peptide and the tissue and cell type in which it has aggregated.

[0078] As used herein, “amyloidosis” refers to a disease characterized by symptoms caused by deposition of amyloid or amyloid fibrils. Amyloidosis can affect numerous organs including the heart, kidney, liver, spleen, nervous system, and digestive track.

[0079] As used herein, “ATTR” , “TTR-related amyloidosis” , “TTR amyloidosis, ” “ATTR amyloidosis, ” or “amyloidosis associated with TTR” refers to amyloidosis associated with deposition of TTR.

[0080] As used herein, “familial amyloid cardiomyopathy” or “FAC” refers to a hereditary transthyretin amyloidosis (ATTR) characterized primarily by restrictive cardiomyopathy. Congestive heart failure is common in FAC. Average age of onset is approximately 60-70 years of age, with an estimated life expectancy of 4-5 years after diagnosis.

[0081] As used herein, “familial amyloid polyneuropathy” or “FAP” refers to a hereditary transthyretin amyloidosis (ATTR) characterized primarily by sensorimotor neuropathy. Autonomic neuropathy is common in FAP. While neuropathy is a primary feature, symptoms of FAP may also include cachexia, renal failure, and cardiac disease. Average age of onset of FAP is approximately 30-50 years of age, with an estimated life expectancy of 5-15 after diagnosis.

[0082] As used herein, “wild-type ATTR” and “ATTRwt” refer to ATTR not associated with a pathological TTR mutation such as T60A, V30M, V30A, V30G, V30L, V122I, V122A, or V122 (-) . ATTRwt has also been referred to as senile systemic amyloidosis. Onset typically occurs in men aged 60 or higher with the most common symptoms being congestive heart failure and abnormal heart rhythm such as atrial fibrillation. Additional symptoms include consequences of poor heart function such as shortness of breath, fatigue, dizziness, swelling (especially in the legs) , nausea, angina, disrupted sleep, and weight loss. A history of carpal tunnel syndrome indicates increased risk for ATTRwt and may in some cases be indicative of early-stage disease. ATTRwt generally leads to decreasing heart function over time but can have a better prognosis than hereditary ATTR because wild-type TTR deposits accumulate more slowly. Existing treatments are similar to other forms of ATTR (other than liver transplantation) and are generally directed to supporting or improving heart function, ranging from diuretics and limited fluid and salt intake to anticoagulants, and in severe cases, heart transplants. Nonetheless, like FAC, ATTRwt can result in death from heart failure, sometimes within 3-5 years of diagnosis.

[0083] As used herein, “hereditary ATTR” refers to ATTR that is associated with a mutation in the sequence of the TTR gene. Known mutations in the TTR gene associated with ATTR include those resulting in TTR with substitutions of T60A, V30M, V30A, V30G, V30L, VI 221, VI 22 A, or V122 (-) .

[0084] As used herein, “indels” refer to insertion / deletion mutations consisting of a number of nucleotides that are either inserted or deleted at the site of double-stranded breaks (DSBs) in a target nucleic acid.

[0085] As used herein, “knockdown” refers to a decrease in expression of a particular gene product (e.g., protein, mRNA, or both) . Knockdown of a protein can be measured either by detecting protein secreted by tissue or population of cells (e.g., in serum or cell media) or by detecting total cellular amount of the protein from a tissue or cell population of interest.

[0086] Methods for measuring knockdown of mRNA are known, and include sequencing of mRNA isolated from a tissue or cell population of interest. In some embodiments, “knockdown” may refer to some loss of expression of a particular gene product, for example a decrease in the amount of mRNA transcribed or a decrease in the amount of protein expressed or secreted by a population of cells (including in vivo populations such as those found in tissues) .

[0087] As used herein, “mutant TTR” refers to a gene product of TTR (i.e., the TTR protein) having a change in the amino acid sequence of TTR compared to the wildtype amino acid sequence of TTR. The human wild-type TTR sequence is available at NCBI Gene ID: 7276; Ensembl: Ensembl: ENSG00000118271. Mutants forms of TTR associated with ATTR, e.g., in humans, include T60A, V30M, V30A, V30G, V30L, V122I, V122A, or V122 (-) .

[0088] As used herein, “treatment” refers to any administration or application of a therapeutic for disease or disorder in a subject, and includes inhibiting the disease, arresting its development, relieving one or more symptoms of the disease, curing the disease, or preventing reoccurrence of one or more symptoms of the disease. For example, treatment of ATTR may comprise alleviating symptoms of ATTR.

[0089] As used herein, the term “pathological mutation” refers to a mutation that renders a gene product, such as TTR, more likely to cause, promote, contribute to, or fail to inhibit the development of a disease, such as ATTR.

[0090] As used herein, the term “lipid nanoparticle” (LNP) refers to a particle that comprises a plurality of (i.e., more than one) lipid molecules physically associated with each other by intermolecular forces. The LNPs may be, e.g., microspheres (including unilamellar and multilamellar vesicles, e.g., “liposomes” lamellar phase lipid bilayers that, in some embodiments, are substantially spherical and, in more particular embodiments, can comprise an aqueous core, e.g., comprising a substantial portion of RNA molecules) , a dispersed phase in an emulsion, micelles, or an internal phase in a suspension. Any LNP known to those of skill in the art to be capable of delivering nucleotides to subjects may be utilized with the guide RNAs and the nucleic acid encoding an RNA-guided DNA binding agent described herein.

[0091] As used herein, the terms “nuclear localization signal” (NLS) or “nuclear localization sequence” refers to an amino acid sequence which induces transport of molecules comprising such sequences or linked to such sequences into the nucleus of eukaryotic cells. The nuclear localization signal may form part of the molecule to be transported. In some embodiments, the NLS may be linked to the remaining parts of the molecule by covalent bonds, hydrogen bonds or ionic interactions.

[0092] As used herein, the phrase “pharmaceutically acceptable” means that which is useful in preparing a pharmaceutical composition that is generally non-toxic and is not biologically undesirable and that are not otherwise unacceptable for pharmaceutical use.

[0093] As used herein, “infusion” refers to an active administration of one or more agents with an infusion time of, for example, between approximately 30 minutes and 12 hours. In some embodiments, the one or more agents comprise an LNP, e.g., comprising an mRNA encoding an RNA-guided DNA binding agent (such as Cas9) described herein and a sgRNA described herein.

[0094] The term “about” or “approximately” means an acceptable error for a particular value as determined by one of ordinary skill in the art, which depends in part on how the value is measured or determined.

[0095] Types of Modifications

[0096] A. 2'-O-methyl modifications

[0097] Modified sugars are believed to control the puckering of nucleotide sugar rings, a physical property that influences oligonucleotide binding affinity for complementary strands, duplex formation, and interaction with nucleases. Substitutions on sugar rings can therefore alter the confirmation and puckering of these sugars. For example, 2'-O-methyl (2'-O-Me) modifications can increase binding affinity and nuclease stability of oligonucleotides, though as shown in the Examples, the effect of any modification at a given position in an oligonucleotide needs to be empirically determined.

[0098] The terms "mA, " "mC, " "mU, " or "mG" may be used to denote a nucleotide that has been modified with 2'-O-Me.

[0099] Modification of a ribonucleotide as 2'-O-methyl ribonucleotide can be depicted as follows:

[0100] B. 2’-fluoro modifications

[0101] Another chemical modification that has been shown to influence nucleotide sugar rings is halogen substitution. For example, 2’-fluoro (2’-F) substitution on nucleotide sugar rings can increase oligonucleotide binding affinity and nuclease stability.

[0102] In this application, the terms “fA, ” “fC, ” “fU, ” or “fG” may be used to denote a nucleotide that has been substituted with 2’-F.

[0103] A ribonucleotide without and with a 2’-F substitution can be depicted as follows:

[0104] C. Phosphorothioate modifications

[0105] Phosphorothioate (PS) linkage or bond refers to a bond where a sulfur is substituted for one nonbridging phosphate oxygen in a phosphodiester linkage, for example in the bonds between nucleotides bases. When phosphorothioates are used to generate oligonucleotides, the modified oligonucleotides may also be referred to as S-oligos.

[0106] A "*" may be used to depict a PS modification. In this application, the terms A*, C*, U*, or G*may be used to denote a nucleotide that is linked to the next (e.g., 3') nucleotide with a PS bond.

[0107] In this application, the terms "mA*, " "mC*, " "mU*, " or "mG*" may be used to denote a nucleotide that has been substituted with 2'-O-Me and that is linked to the next (e.g., 3') nucleotide with a PS bond. Similarly, the terms "fA*, " "fC*, " "fU*, " or "fG*" may be used to denote a nucleotide that has been substituted with 2'-F and that is linked to the next (e.g., 3') nucleotide with a PS bond. Equivalents of a PS linkage or bond are encompassed by embodiments described herein.

[0108] The diagram below shows the substitution of S-into a nonbridging phosphate oxygen, generating a PS bond in lieu of a phosphodiester bond:

[0109] The following examples further illustrate the present disclosure, but the present disclosure is not limited thereto.

[0110] Below presents preferred embodiments of the present disclosure based on the drawings in order to illustrate the technical schemes of the present disclosure in detail.Examples

[0111] Example. 1 SpCas9 CDS codon optimization

[0112] The HepG2 was cultured in advanced DMEM media supplemented with 5%fetal bovine serum (GibcoTM) . A volume of 225 uL of cells with a density of 50,000 cells / well was mixed with 25 uL mixture of LipofectamineTM RNAiMAX (InvitrogenTM) , Cas9 mRNA and sgRNA sg5815-3 (SEQ ID NO: 602) in two doses (3.125 / 12.5 nM sgRNA, mRNA: sgRNA=4: 1, w / w) , then the cell mixture was seeded onto a 48-well plate and cultured at 37℃ and 5%CO2. Cells were harvested on day three post-transfection.

[0113] For Primary liver hepatocytes, Primary human liver hepatocytes (PHH) cells were thawed and resuspended in hepatocyte thawing medium with supplements (Lonza, Cat. MCHT50) followed by centrifugation at 100 g for 10 minutes. The supernatant was discarded and the pelleted cells resuspended in hepatocyte plating medium (Lonza, Cat. MP100) plus 10%fetal bovine serum. Cells were counted and plated on Ultra Low Adsorption Cell Culture 96-well plates (Liver Biotech, Cat. LV-ULA002-96W) at a density of 40,000 cells / well. Plated cells were allowed to settle and adhere for 24 hours in a tissue culture incubator at 37℃ and 5%CO2 atmosphere. After incubation cells were checked for monolayer formation and media was replaced with hepatocyte culture medium (Lonza, Cat. CC-3198) plus 10%fetal bovine serum. Each Cas9 mRNA and sgRNA sg5815-3 (SEQ ID NO: 602) was transfected in at least two doses (0.78 / 1.56 / 3.125 / 6.25 / 12.5 nM sgRNA, mRNA: sgRNA=4: 1, w / w) using LipofectamineTM RNAiMAX Transfection Reagent. The plate was placed at 37℃ and 5%CO2 and cells were harvested on day three post-transfection.

[0114] Total genomic DNA were extracted separately using the Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) according to the manufacturer’s instructions. Briefly, Cell pellets (below 5x106 cells) were suspended in cold PBS buffer with 1 μL Proteinase K and 3 μL Rnase A, then lysed by Cell Lysis Buffer and vortexed immediately and thoroughly. The lysed mixture was incubated for 5 minutes at 56℃ in a thermal mixer with agitation at full speed (～1400 rpm) , followed by adding 400 μL gDNA Binding Buffer and mixing thoroughly. The mixture was transferred to gDNA Purification Column, followed by centrifuge, washing, and elution of the column-bound genomic DNA. Extracted DNA was quantified by NanoDrop One or Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) , and were stored at -20℃ until use.

[0115] To quantitatively determine the efficiency of editing at the target location in the genome, NGS was utilized to identify the presence of insertions and deletions introduced by gene editing. Primers used for NGS which around the target area within the TTR genes were designed. Additional PCR was performed per the manufacturer's protocols (lllumina) to add chemistry for sequencing. The amplicons were sequenced on Illumina NextSeq 1000 instrument. The reads were aligned to a reference genome after eliminating those having low quality scores. The resulting files containing the reads were mapped to the reference genome (BAM files) , where reads that overlapped the target region of interest were selected and the number of wild types reads versus the number of reads which contain an insertion, substitution, or deletion was calculated.

[0116] FIGs. 1-3 illustrate the mean editing efficiency of TTR gene in PHH cells. Cas001F mRNA exhibited superior editing efficiency compared to m5815-1 and Cas001C / D / E. On the other hand, FIG. 4 depicts the average editing efficiency of TTR gene in HepG2 cell line, where Cas001F mRNA demonstrated comparable editing efficacy with Cas001G at higher dose but slightly better performance than Cas001G at lower dose.

[0117] Example. 2 LNP encapsulated distinct codon optimized mRNA delivery to mice having murine TTR.

[0118] The Cas9 mRNA and sgRNA were encapsulated within lipid nanoparticles (LNP) using a Precision MPF-L2TM AITESEN. In general, the lipid nanoparticle components were dissolved in 100%ethanol with the lipid component (ALC-0315, DSPC, cholesterol and ALC-0159 in molar ratio of 46.3: 42.7: 389.4: 1.6) . The RNA cargos were dissolved in 25 mM citrate, 100 mM NaCl, pH 5.0, resulting in a concentration of RNA cargo of approximately 0.45 mg / mL. The LNPs were formulated with a lipid amine to RNA phosphate (N: P) molar ratio of about 6, with the ratio of mRNA to gRNA at 2: 1 by weight. RNA in aqueous buffer conditions is mixed with ethanolic lipid mix, respectively in the volume ratio of 3 parts of RNA and 1 part of lipid mix. After mixing, the LNPs were collected, and then remaining buffer was exchanged into PH7.5 TSS (contain 5%w / v sucrose, 45 mM NaCl, 50 mM Tris , 100-fold excess of sample volume) , overnight at 4℃ under gentle stirring using a 10 kDa dialysis bag. The resulting mixture was then filtered using a 0.2 μm sterile filter. The resulting filtrate was stored at 2-8℃.

[0119] Table 2. Prescription of LNP-0315

[0120] Dynamic Light Scattering ( "DLS" ) is used to determine the average particle size and polydispersity index ( "PDI" ) and of LNP samples. Average particle size and polydispersity are measured by dynamic light scattering (DLS) using a Malvern Zetasizer DLS instrument. Dilute LNP samples in 1x PBS at volumetric ratios of 1: 99 prior to testing. Measure the mean hydrodynamic diameter of each sample by reporting average particle size along with PDI. Zeta potential of the LNP is also measured by Malvern Zetasizer. Samples are diluted at volumetric ratios of 1: 19 in 10mM NaCl prior to measurement.

[0121] A fluorescence-based assay ( ThermoFisher Scientific) is used to determine the encapsulation efficiency, which is calclulated as (Total RNA-Free RNA)  / Total RNA. LNP samples are diluted with1x TE buffer containing 1%Triton-X 100 to a proper concentration to determine total RNA or 1x TE buffer to determine free RNA. Standard curves are prepared by utilizing the starting RNA solution used to make the formulations according to the manufacturer's instructions) .  stain is then added to each of the standards and samples and incubated to allow staining for approximately 5 minutes at room temperature, in the absence of light. A Tecan INFINITE 200 PRO is used to read the samples with excitation and emission wavelength at 480nm, 520nm respectively. Total RNA and free RNA are calculated from the appropriate standard curves after subtracting the fluorescence value of the reagent blank from that of each of the samples. Typically, when preparing LNPs, encapsulation was >80%, particle size was <120 nm, and pdi was < 0.2

[0122] The selected codon-optimized mRNA was assessed for in vivo editing efficiency. CD-1 female mice, aged 6-10 weeks, were utilized in each mouse study. Animals were weighed prior to dosing for dose calculations. For in vivo characterization, the LNPs were administered to mice at 0.3 mg total RNA (mg guide RNA + mg mRNA) per kg. LNPs were administered via the lateral tail vein at a volume of 0.2 mL per animal. Adverse effects were monitored approximately 6 hours post-dose. Body weight was measured at twenty-four hours post-administration, and animals were euthanized after 6 days using exsanguination under isoflurane anesthesia. Blood samples were collected through cardiac puncture into serum separator tubes or buffered sodium citrate tubes for plasma as described herein. Liver tissue from the left median lobe of each animal was collected for DNA extraction and analysis in studies involving in vivo editing.

[0123] For the in vivo studies, genomic DNA was extracted from 10 mg of tissue using Tissue / Cell Genomic DNA Extraction Kit (DenoGen, Cat. #DNS033-48) according to the manufacturer's protocol, which includes homogenizing the tissue in lysis buffer (approximately 400 μL per10 mg tissue) . All DNA samples were normalized to 100 ng / μL concentration for NGS analysis as described in Example 1.

[0124] The liver editing results for m5815-1, m5815-9, and Cas001F (360) are presented in FIG. 5. In comparison to m5815-1 and m5815-9, Cas001F demonstrates a higher efficiency in editing the murine TTR gene.

[0125] Example. 3 SpCas9 mRNA UTR screening

[0126] For Primary liver hepatocytes, Primary human liver hepatocytes (PHH) cells were thawed and resuspended in hepatocyte thawing medium with supplements (Lonza, Cat. MCHT50) followed by centrifugation at 100 g for 10 minutes. The supernatant was discarded and the pelleted cells resuspended in hepatocyte plating medium (Lonza, Cat. MP100) plus 10%fetal bovine serum. Cells were counted and plated on Ultra Low Adsorption Cell Culture 96-well plates (Liver Biotech, Cat. LV-ULA002-96W) at a density of 40,000 cells / well. Plated cells were allowed to settle and adhere for 24 hours in a tissue culture incubator at 37℃ and 5%CO2 atmosphere. After incubation cells were checked for monolayer formation and media was replaced with hepatocyte culture medium (Lonza, Cat. CC-3198) plus 10%fetal bovine serum. Cas9 mRNA harbored different UTR sequences and sgRNA sg5815-3 (SEQ ID NO: 602) was transfected in at least two doses (0.78 or 6.25 nM sgRNA, mRNA: sgRNA=4: 1, w / w) using LipofectamineTM RNAiMAX Transfection Reagent. The plate was placed at 37℃ and 5%CO2 and cells were harvested on day three post-transfection. The method for extraction of total genomic DNA and subsequent NGS analysis was performed according to the protocol described in Example 1.

[0127] FIGs. 6-9 illustrate the mean editing efficiency of the TTR gene with Cas001F, harboring distinct UTR combinations in PHH cells, which show efficient editing of the human TTR sequence with each tested UTR combination.

[0128] Example. 4 LNP encapsulated mRNA with different UTR combinations delivery to mice having murine TTR.

[0129] The preparation and formulation analytics method of LNP is elucidated in Example 2. The selected mRNA with different UTR combinations were assessed for in vivo editing efficiency. CD-1 female mice, aged 6-10 weeks, were utilized in each mouse study. Animals were weighed prior to dosing for dose calculations. For in vivo characterization, the LNPs were administered to mice at 0.1 mg total RNA (mg guide RNA (sgRNA sg5815-1 (SEQ ID NO: 601) ) + mg mRNA) per kg. LNPs were administered via the lateral tail vein at a volume of 0.2 mL per animal. Adverse effects were monitored approximately 6 hours post-dose. Body weight was measured at twenty-four hours post-administration, and animals were euthanized after 6 days using exsanguination under isoflurane anesthesia. Blood samples were collected through cardiac puncture into serum separator tubes or buffered sodium citrate tubes for plasma as described herein. Liver tissue from the left median lobe of each animal was collected for DNA extraction and analysis in studies involving in vivo editing.

[0130] For the in vivo studies, genomic DNA was extracted from 10 mg of tissue using Tissue / Cell Genomic DNA Extraction Kit (DenoGen, Cat. #DNS033-48) according to the manufacturer's protocol, which includes homogenizing the tissue in lysis buffer (approximately 400 μL per10 mg tissue) . All DNA samples were normalized to 100 ng / μL concentration for NGS analysis as described in Example 1.

[0131] The liver editing results for the chosen UTR combinations are depicted in FIG. 10 and FIG. 11, which show efficient editing of the murine TTR sequence with each tested UTR combination. Out of the 13 combinations, 10 exhibited an editing value exceeding 30%, with two (m565 (SEQ ID NO: 344 / SEQ ID NO: 528) and m569 (SEQ ID NO: 347 / SEQ ID NO: 531) ) surpassing a remarkable editing value of 55%.

[0132] Example. 5 LNP delivery to humanized TTR mice.

[0133] The Cas9 mRNA and sgRNA were encapsulated within lipid nanoparticles (LNP) using a Precision MPF-L2TM AITESEN. In general, the lipid nanoparticle components were dissolved in 100%ethanol with the lipid component (ALC-0315, DSPC, cholesterol and ALC-0159 in molar ratio of 46.3: 42.7: 389.4: 1.6) . The RNA cargos were dissolved in 25 mM citrate, 100 mM NaCl, pH 5.0, resulting in a concentration of RNA cargo of approximately 0.45 mg / mL. The LNPs were formulated with a lipid amine to RNA phosphate (N: P) molar ratio of about 6, with the ratio of mRNA to gRNA at 2: 1 by weight. RNA in aqueous buffer conditions is mixed with ethanolic lipid mix, respectively in the volume ratio of 3 parts of RNA and 1 part of lipid mix. After mixing, the LNPs were collected, and then remaining buffer was exchanged into PH7.5 TSS (contain 5%w / v sucrose, 45 mM NaCl, 50 mM Tris , 100-fold excess of sample volume) , overnight at 4℃ under gentle stirring using a 10 kDa dialysis bag. The resulting mixture was then filtered using a 0.2 μm sterile filter. The resulting filtrate was stored at 2-8℃.

[0134] Table 3. Prescription of LNP-GEB100

[0135] Dynamic Light Scattering ( "DLS" ) is used to determine the average particle size and polydispersity index ( "PDI" ) and of LNP samples. Average particle size and polydispersity are measured by dynamic light scattering (DLS) using a Malvern Zetasizer DLS instrument. Dilute LNP samples in 1x PBS at volumetric ratios of 1: 99 prior to testing. Measure the mean hydrodynamic diameter of each sample by reporting average particle size along with PDI. Zeta potential of the LNP is also measured by Malvern Zetasizer. Samples are diluted at volumetric ratios of 1: 19 in 10mM NaCl prior to measurement.

[0136] A fluorescence-based assay (  ThermoFisher Scientific) is used to determine the encapsulation efficiency, which is calculated as (Total RNA-Free RNA)  / Total RNA. LNP samples are diluted with 1x TE buffer containing 1%Triton-X 100 to a proper concentration to determine total RNA or 1x TE buffer to determine free RNA. Standard curves are prepared by utilizing the starting RNA solution used to make the formulations according to the manufacturer's instructions) .  stain is then added to each of the standards and samples and incubated to allow staining for approximately 5 minutes at room temperature, in the absence of light. A Tecan INFINITE 200 PRO is used to read the samples with excitation and emission wavelength at 480nm, 520nm respectively. Total RNA and free RNA are calculated from the appropriate standard curves after subtracting the fluorescence value of the reagent blank from that of each of the samples. Typically, when preparing LNPs, encapsulation was >80%, particle size was <120 nm, and pdi was < 0.2

[0137] CD-1 female mice, aged 6-10 weeks, were utilized in each mouse study. Animals were weighed prior to dosing for dose calculations. For in vivo characterization, LNP GEB100 were administered to mice at 0.2 / 0.5 / 1.0 mg total RNA (mg guide RNA+ mg mRNA) per kg. LNPs were administered via the lateral tail vein at a volume of 0.2 mL per animal. Adverse effects were monitored approximately 6 hours post-dose. Body weight was measured at twenty-four hours post-administration, and animals were euthanized after 6 days using exsanguination under isoflurane anesthesia. Blood samples were collected through cardiac puncture into serum separator tubes or buffered sodium citrate tubes for plasma as described herein. Liver tissue from the left median lobe of each animal was collected for DNA extraction and analysis in studies involving in vivo editing.

[0138] Results for liver editing are shown in FIG. 12. A dose response for editing was evident.

[0139] Example. 6 LNP delivery to humanized TTR mice

[0140] Lipid nanoparticles containing sg5815-300 (SEQ ID NO: 603) and sg200-355 (SEQ ID NO: 604) were prepared for the animal experiment. LNP-YZL480 (shown in table 4) contained YZL480, Cholesterol, DSPC, and DMG-PEG2000 in the molar ratios recited in Table 4. LNP-YZL480 were prepared using the Precision MPF-L2TM AITESEN. In general, the lipid nanoparticle components were dissolved in 100%ethanol with the lipid component (YZL480, DSPC, cholesterol, and DMG-PEG2000 in molar ratio of 46.3: 9.4: 42.3: 2) . The RNA cargos were dissolved in 25 mM citrate, 100 mM NaCl, pH 5.0, resulting in a concentration of RNA cargo of approximately 0.45 mg / mL. The LNPs were formulated with a lipid amine to RNA phosphate (N: P) molar ratio of about 6, with the ratio of mRNA to gRNA at 2: 1 by weight. RNA in aqueous buffer condition mixed with ethanolic lipid mix, respectively in the volume ratio of 3 parts of RNA and 1 part of lipid mix. After mixing, the LNPs were collected, and then remaining buffer was exchanged into pH 7.5 TSS (contain 5%w / v sucrose, 45 mM NaCl, 50 mM Tris , 100-fold excess of sample volume) , overnight at 4℃ under gentle stirring using a 10 kDa dialysis bag. The resulting mixture was then filtered using a 0.2 μm sterile filter. The resulting filtrate was stored at 2-8℃.

[0141] Female mice carrying human TTR gene, aged 6-8 weeks, were utilized in this study. To compare the in vivo efficiency of LNP GEB100-1 (shown in table 5) and LNP GEB100-OP1 (shown in table 6) , animals were divided into two groups and administered with LNP GEB100-1 and LNP GEB100-OP1 respectively, at a dose of 0.05 mg / kg. Serum was extracted before administration and before being sacrificed to analyze the reduction of TTR protein in the serum after gene editing. After 6 days of administration, the animals were sacrificed and the liver tissues were collected for DNA extraction and editing efficiency analysis via NGS. The result is summarized in FIG. 13.

[0142] Table 4 Prescription of LNP-YZL480

[0143] Table 5 Prescription of LNP GEB100-1

[0144] Table 6 Prescription of LNP GEB100-OP1

[0145] YZL480 has the structure shown as follows:

[0146] The ionizable lipids were synthesized using a similar method as described in PCT / CN2024 / 106309. For example, the specific synthesis method for YZL480 is as follows:

[0147] Synthesis of YZL 480-1:

[0148] To a solution of SM1 (5 g, 89 mmol, 1.0 eq. ) in DMF (200 mL) was added DMPA (59 g, 446 mmol, 5 eq. ) under N2. Stir the mixture under UV lamp for 0.5 h. The mixture was concentrated in vacuum to give the residue YZL480-1 (7 g, Yield 42%) as yellow oil., which was used in the next step without further purification.

[0149] LCMS: m / z=377.2 [M+H] +

[0150] TLC (PE: EA=20: 1, Rf=0.6, KMnO4)

[0151] Synthesis of YZL480-2:

[0152] A solution of YZL-1 (7 g, 18.6 mmol, 1.0 eq. ) in THF: H2O=1: 1 (200 mL) was added LiOH (6 g, 149 mmol, 8 eq) at room temperature. The mixture was stirred rt for 16 hours. The reaction mixture was added EA (30ml) and H2O. Then extract with EA (30ml*3) . Dried concentrated to crude product which was further purified by com-flash (EA in PE=0-10%) to afford product YZL480-2 (5 g, yield: 72 %) as yellow oil.

[0153] LCMS: m / z=363.3 [M+H] +

[0154] TLC (PE: EA=20: 1, Rf=0.7, KMnO4)

[0155] Synthesis of YZL480-3:

[0156] A solution of YZL480-2 (5 g, 13.8 mmol, 1.0 eq. ) in DCM (50 mL) was added DMAP (2 g, 16.5 mmol, 1.2 eq. ) , DCC (3.4 g, 16.5 mmol, 1.2 eq. ) at room temperature. The mixture was stirred rt for 16 hours. The mixture was concentrated in vacuum to give the residue, which was purified by silica column chromatography (PE: EA=0-10%) to give the title compound YZL480-3 (2.6 g, yield: 43 %) as yellow oil.

[0157] LCMS: m / z=463.3 [M+H] +

[0158] TLC (PE: EA=10: 1, Rf=0.6, KMnO4)

[0159] Synthesis of YZL480-4:

[0160] A solution of YZL480-3 (2.6 g, 5.6 mmol, 1.0 eq. ) in DCM (40 mL) was added SM2 (1.46 g, 8.4 mmol, 1.5 eq. ) , Et3N (1.7 g, 16.8 mmol, 3 eq. ) at room temperature. The mixture was stirred rt for 16 hours. The mixture was concentrated in vacuum to give the residue, which was purified by silica column chromatography (PE: EA=0-10%) to give the title compound YZL480-4 (2.4 g, yield: 79%) as yellow oil. LCMS: m / z=541.7 [M+H] +, TLC (PE: EA=10: 1, Rf=0.8)

[0161] Synthesis of YZL480:

[0162] A solution of YZL480-4 (1.5 g, 2.8 mmol, 2.2 eq. ) in ACN (50 mL) was added SM2 (0.1 g, 1.26 mmol, 1 eq) , K2CO3 (0.5 g, 3.78 mmol, 3 eq) , KI (0.25 g, 1.5 mmol, 1.2 eq) at room temperature. The mixture was stirred 80 ℃ for 16 hours. The mixture was concentrated in vacuum to give the residue, which was purified by silica column chromatography (DCM: MeOH=10: 1) to give the title compound YZL480 (477 mg, yield: 18%) as yellow oil.

[0163] TLC (DCM: MeOH=10: 1, Rf=0.5)

[0164] LCMS: m / z=963.7, [M+H] +; tR = 2.377 min

[0165] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.06 (t, J = 6.8 Hz, 4H) , 3.80 (t, J = 5.2 Hz, 2H) , 2.92–2.82 (m, 2H) , 2.81–2.67 (m, 4H) , 2.63–2.42 (m, 17H) , 2.26–2.12 (m, 2H) , 1.80–1.70 (m, 4H) , 1.67–1.48 (m, 17H) , 1.42–1.18 (m, 41H) , 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 12H) .

[0166] Dynamic Light Scattering ( "DLS" ) is used to determine the average particle size and polydispersity index ( "PDI" ) and of LNP samples. Average particle size and polydispersity are measured by dynamic light scattering (DLS) using a Malvern Zetasizer DLS instrument. Dilute LNP samples in 1x PBS at volumetric ratios of 1: 99 prior to testing. Measure the mean hydrodynamic diameter of each sample by reporting average particle size along with PDI. Zeta potential of the LNP is also measured by Malvern Zetasizer. Samples are diluted at volumetric ratios of 1: 19 in 10mM NaCl prior to measurement.

[0167] A fluorescence-based assay ( ThermoFisher Scientific) is used to determine the encapsulation efficiency, which is calclulated as (Total RNA-Free RNA)  / Total RNA. LNP samples are diluted with1x TE buffer containing 1%Triton-X 100 to a proper concentration to determine total RNA or 1x TE buffer to determine free RNA. Standard curves are prepared by utilizing the starting RNA solution used to make the formulations according to the manufacturer's instructions) .   stain is then added to each of the standards and samples and incubated to allow staining for approximately 5 minutes at room temperature, in the absence of light. A Tecan INFINITE 200 PRO is used to read the samples with excitation and emission wavelength at 480nm, 520nm respectively. Total RNA and free RNA are calculated from the appropriate standard curves after subtracting the fluorescence value of the reagent blank from that of each of the samples. Typically, when preparing LNPs, encapsulation was >80%, particle size was <120 nm, and pdi was < 0.2.

Claims

1.A single guide RNA (sgRNA) comprising:a. a sequence selected from SEQ ID NOs: 601-604;b. a sequence that is at least 90%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 601-604; orc. a sequence that is at least 99%, at least 98%, at least 97%, at least 96%, at least 95%, at least 94%, at least 93%, at least 92%, at least 91%, or at least 90%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 601-604.2.A composition comprising a single guide RNA of claim 1.3.The composition of claim 2, wherein the composition further comprises an RNA-guided DNA binding agent or a nucleic acid encoding an RNA-guided DNA binding agent.4.A composition comprising:(i) a single guide RNA (sgRNA) or a vector encoding a single guide RNA (sgRNA) ,wherein:a. the sgRNA comprises a sequence selected from SEQ ID NOs: 601-604;b. the sgRNA comprises a sequence that is at least 90%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 601-604; orc. the sgRNA comprises a sequence that is at least 99%, at least 98%, at least 97%, at least 96%, at least 95%, at least 94%, at least 93%, at least 92%, at least 91%, or at least 90%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 601-604.5.The composition of claim 4, wherein the composition further comprises (ii) an RNA-guided DNA binding agent or a nucleic acid encoding an RNA-guided DNA binding agent.6.The composition of claim 3 or 5, wherein the RNA-guided DNA binding agent is Cas9.7.The composition of claim 3, 5 or 6, wherein the nucleic acid encoding the RNA-guided DNA binding agent comprises an open reading frame (ORF) comprising a sequence that is at least 90%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 701-716, and 725.8.The composition of any one of claims 3 and 5-7, wherein the nucleic acid encoding the RNA-guided DNA binding agent comprises an open reading frame (ORF) comprising a sequence that is at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 701-716, and 725.9.The composition of any one of claims 3 and 5-8, wherein the nucleic acid encoding the RNA-guided DNA binding agent comprises an open reading frame (ORF) comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 701-716, and 725.10.The composition of any one of claims 7-9, wherein the ORF is a modified ORF.11.The composition of any one of claims 3 and 5-10, wherein the nucleic acid encoding the RNA-guided DNA binding agent comprises an RNA sequence that is at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%identity to a sequence selected from SEQ ID NOs: 253, 291, 293, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 317, 318, 319, 320, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 360, 585, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, and 724.12.The composition of any one of claims 3 and 5-10, wherein the nucleic acid encoding the RNA-guided DNA binding agent comprises a DNA sequence that is at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%identity to a sequence selected from SEQ ID NOs: 437, 475, 477, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 501, 502, 503, 504, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 544 and 586.13.The composition of any one of claims 2 to 12, wherein the composition further comprises:(iii) an ionizable lipid;(iv) a neutral lipid;(v) a helper lipid;(vi) a stealth lipid; or(vii) a combination of any one or more of (iii) - (vi) .14.The composition of claim 13, wherein the ionizable lipid is YZL480.15.The composition of claim 13 or 14, wherein the neutral lipid is selected from the group consisting of: distearoylphosphatidylcholine (DSPC) , dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) , dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) , dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG) , dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) , dioleoyl-phosphatidylethanolamine (DOPE) , palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC) , palmitoyloleoyl-phosphatidylethanolamine (POPE) and dioleoyl-phosphatidylethanolamine 4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1 carboxylate (DOPE-mal) , dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine (DPPE) , dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE) , distearoyl-phosphatidylethanolamine (DSPE) , 16-O-monomethyl PE, 16-O-dimethyl PE, 18-1-trans PE, 1-stearioyl-2-oleoylphosphatidyethanol amine (SOPE) and 1, 2-dielaidoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (trans DOPE) ; preferably the neutral lipid is DSPC.16.The composition of any one of claims 13-15, wherein the helper lipid is steroid, optionally, the steroid is cholesterol.17.The composition of any one of claims 13-16, wherein the stealth lipid is pegylated lipid; optionally, the pegylated lipid is selected from the group consisting of: pegylated diacylglycerol (PEG-DAG) , 1- (monomethoxy-polyethyleneglycol) -2, 3-dimyristoylglycerol (PEG-DMG) , a pegylated phosphatidylethanoloamine (PEG-PE) , a PEG succinate diacylglycerol (PEG-S-DAG) such as 4-O- (2′, 3′-di (tetradecanoyl-oxy) propyl-1-O- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) butanedioa te (PEG-S-DMG) , a pegylated ceramide (PEG-cer) , or a PEG dialkoxypropylcarbamate such as ω-methoxy (polyethoxy) ethyl-N- (2, 3-di (tetradecanoxy) propyl) carbamate or 2, 3-di (tetradecanoxy) propyl-N- (ω-methoxy (polyethoxy) ethyl) carbamate; preferably, the pegylated lipid is DMG-PEG2000.18.The composition of any one of claims 2-17, wherein the composition comprises an ionizable lipid of YZL480, DSPC, Cholesterol and DMG-PEG2000.19.The composition of any one of claims 2-18, wherein the composition comprises (1) an ionizable lipid with a concentration ranging from 40 mol %to 50 mol %of the total lipid component; (2) a neutral lipid with a concentration ranging from 5 mol %to 15 mol %of the total lipid component; (3) a helper lipid with a concentration ranging from 35 mol %to 55 mol %of the total lipid component; and (4) a stealth lipid with a concentration ranging from 1.0 mol %to 3.0 mol %of the total lipid component.20.The composition of any one of claims 2-19, wherein the composition comprises (1) an ionizable lipid with a concentration of 46.3 mol %of the total lipid component; (2) a neutral lipid with a concentration of 9.4 mol %of the total lipid component; (3) a helper lipid with a concentration of 42.3 mol %of the total lipid component; and (4) a stealth lipid with a concentration of 2 mol %of the total lipid component.21.The composition of any one of claims 2-20, wherein the composition has an N / P ratio of about 3-10.22.The composition of any one of claims 2-20, wherein the composition has an N / P ratio of about 4-8.23.The composition of any one of claims 2-20, wherein the composition has an N / P ratio of about 4, 4.5, 5, 5.5, 6, or 6.5.24.A pharmaceutical formulation comprising the composition of any one of claims 2-20, and a pharmaceutically acceptable carrier.25.A lipid nanoparticle (LNP) formulation comprising:(i) a single guide RNA (sgRNA) or a vector encoding a single guide RNA (sgRNA) , wherein the sgRNA comprises a sequence selected from SEQ ID NOs: 601-604;(ii) an RNA-guided DNA binding agent or a nucleic acid encoding an RNA-guided DNA binding agent, wherein the nucleic acid encoding the RNA-guided DNA binding agent comprises an open reading frame (ORF) comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 701-716, and 725;(iii) an ionizable lipid;(iv) a neutral lipid;(v) a helper lipid;(vi) a stealth lipid.26.The LNP formulation of claim 25, wherein the nucleic acid encoding the RNA-guided DNA binding agent comprises an RNA sequence that is at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 253, 291, 293, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 317, 318, 319, 320, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 360, 585, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, and 724.27.The LNP formulation of claim 25 or 26, wherein the nucleic acid encoding the RNA-guided DNA binding agent comprises a DNA sequence that is at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 437, 475, 477, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 501, 502, 503, 504, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 544 and 586.28.The LNP formulation of any one of claims 25-27, wherein the ionizable lipid is YZL480.29.The LNP formulation of any one of claims 25-28, wherein the neutral lipid is DSPC; or the helper lipid is Cholesterol; or the stealth lipid is DMG-PEG2000.30.The LNP formulation of any one of claims 25-29, wherein the composition comprises an ionizable lipid with a concentration ranging from 40 mol %to 50 mol %of the total lipid component; (i) a neutral lipid with a concentration ranging from 5 mol %to 15 mol %of the total lipid component; (ii) a helper lipid with a concentration ranging from 35 mol %to 55 mol %of the total lipid component; and (ii) a stealth lipid with a concentration ranging from 1.0 mol %to 3.0 mol %of the total lipid component.31.The LNP formulation of any one of claims 25-30, wherein the composition comprises an ionizable lipid with a concentration of 46.3 mol %of the total lipid component; (i) a neutral lipid with a concentration of 9.4 mol %of the total lipid component; (ii) a helper lipid with a concentration of 42.3 mol %of the total lipid component; and (ii) a stealth lipid with a concentration of 2 mol %of the total lipid component.32.The LNP formulation of any one of claims 25-31, wherein the composition has an N / P ratio of about 3-10.33.The LNP formulation of any one of claims 25-32, wherein the composition has an N / P ratio of about 4-8.34.The LNP formulation of any one of claims 25-33, wherein the composition has an N / P ratio of about 4, 4.5, 5, 5.5, 6, or 6.5.35.A method of modifying a TTR gene and / or inducing a double-stranded break (DSB) within the TTR gene, wherein the method comprises delivering the composition of any one of claims 2-23, the pharmaceutical formulation of claim 24 or the LNP formulation of any one of claims 25-34 to a cell.36.A method of reducing TTR serum concentration, treating amyloidosis associated with TTR (ATTR) , and / or reducing or preventing accumulation of amyloids or amyloid fibrils comprising TTR in a subject in need thereof, wherein the method comprises administering the composition of any one of claims 2-23, the pharmaceutical formulation of claim 24 or the LNP formulation of any one of claims 25-34 to the subject.37.Use of the composition of any one of claims 2-23, the pharmaceutical formulation of claim 24 or the LNP formulation of any one of claims 25-34 for the preparation of a medicament for modifying a TTR gene and / or inducing a double-stranded break (DSB) within the TTR gene.38.Use of the composition of any one of claims 2-23, the pharmaceutical formulation of claim 24 or the LNP formulation of any one of claims 25-34 for the preparation of a medicament for reducing TTR serum concentration, treating amyloidosis associated with TTR (ATTR) , and / or reducing or preventing accumulation of amyloids or amyloid fibrils comprising TTR in a subject.39.The composition of any one of claims 2-23, the pharmaceutical formulation of claim 24 or the LNP formulation of any one of claims 25-34 for use in modifying a TTR gene and / or inducing a double-stranded break (DSB) within the TTR gene.40.The composition of any one of claims 2-23, the pharmaceutical formulation of claim 24 or the LNP formulation of any one of claims 25-34 for use in reducing TTR serum concentration, treating amyloidosis associated with TTR (ATTR) , and / or reducing or preventing accumulation of amyloids or amyloid fibrils comprising TTR in a subject.

Images