Chimeric antigen receptors and uses thereof

Abstract

This disclosure relates to a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular domain, (b) a transmembrane domain comprising CLEC5A transmembrane domain, and (c) an intracellular domain comprising a signaling domain CLEC5A intracellular domain.

Description

CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND USES THEREOFTECHNICAL FIELD

[0001] This disclosure relates to chimeric antigen receptors, immune cells (such as macrophage or monocyte) for expressing the chimeric antigen receptor, and using the constructs described herein.BACKGROUND

[0002] Cellular immunotherapy is a promising new technology for fighting difficult to treat diseases, such as cancer, and persistent infections and also certain diseases that are refractory to other forms of treatment. A major breakthrough has come across with the discovery of CAR-T cell and their potential use in immunotherapy. Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is an effective treatment for certain types of hematological cancers, such as B cell leukemia and lymphoma. However, the therapeutic efficacy of CAR-T cells in solid tumors remains a challenge due, in part, to limited tumor infiltration of T cells. Myeloid cells are a major cellular compartment of the immune system. Modification of the myeloid cells by introducing a CAR may allow these infiltrating cells to better reduce or eliminate cancer cells.

[0003] As chimeric antigen receptors have various applications, there is a need to continue developing various therapeutics based on chimeric antigen receptors.SUMMARY

[0004] The present disclosure provides immune cells comprising a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular domain (ECD) , (b) a transmembrane domain comprising a C-type lectin domain family 5 member A (CLEC5A) transmembrane domain, and (c) an intracellular domain comprising a signaling domain of a CLEC5A intracellular domain.

[0005] In some embodiments, the ECD comprises an antigen binding domain that specifically binds to a tumor antigen or a tumor-associated antigen (TAA) .

[0006] In some embodiments, the immune cells comprise macrophages, monocytes, neutrophils, NK or non-phagocytic cells.

[0007] In some embodiments, the CAR comprises an intracellular domain, a transmembrane domain and an extracellular domain are arranged from N-terminus to C-terminus.

[0008] In some embodiments, the CLEC5A transmembrane domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

[0009] In some embodiments, the CLEC5A transmembrane domain comprises an amino acid sequence that is at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

[0010] In some embodiments, the CLEC5A intracellular domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

[0011] In some embodiments, the CLEC5A intracellular domain comprises an amino acid sequence that is at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the extracellular domain comprises a CLEC5A extracellular domain.

[0012] In some embodiments, the CLEC5A extracellular domain is selected from CLEC5A isoform 1 and CLEC5A isoform 2.

[0013] In some embodiments, the CLEC5A extracellular domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.

[0014] In some embodiments, the CLEC5A extracellular domain (ECD) is a CLEC5A truncated ECD of CLEC5A isoform 1 or CLEC5A isoform 2.

[0015] In some embodiments, the CLEC5A truncated ECD comprises more than 10 amino acids, more than 20 amino acids, more than 30 amino acids, more than 40 amino acids, more than 50 amino acids, more than 60 amino acids, more than 70 amino acids, more than 80 amino acids, more than 90 amino acids, more than 100 amino acids, more than 110 amino acids, more than 120 amino acids, more than 130 amino acids, more than 140 amino acids, more than 150 amino acids, more than 160 amino acids. In some embodiments, the CLEC5A truncated ECD comprises fewer than 10 amino acids, fewer than 20 amino acids, fewer than 30 amino acids, fewer than 40 amino acids, fewer than 50 amino acids, fewer than 60 amino acids, fewer than 70 amino acids, fewer than 80 amino acids, fewer than 90 amino acids, fewer than 100 amino acids, fewer than 110 amino acids, fewer than 120 amino acids, fewer than 130 amino acids, fewer than 140 amino acids, fewer than 150 amino acids, fewer than 160 amino acids. In some embodiments, the CLEC5A truncated ECD comprises an amino acid sequence that is at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.

[0016] In some embodiments, the CLEC5A extracellular domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.

[0017] In some embodiments, the extracellular domain comprises a hinge.

[0018] In some embodiments, the hinge is selected from a CD8 hinge, a CD28 hinge and an IgG subclass hinge (such as IgG1 and IgG4) .

[0019] In some embodiments, the hinge comprises an amino acid sequence that is at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.

[0020] In some embodiments, the hinge comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.

[0021] In some embodiments, the extracellular domain comprises a scFv targeting a tumor associated antigen (TAA) .

[0022] In some embodiments, TAA is selected from HER2, EpCAM, EGFR, BCMA, CD19, CD79b, CD38, GPRC5D, DLL3, CD70, GPC3, Fas ligand (FasL) , CD1d, Membrane glycolipids, globotriaosyl-ceramide (Gb3Cer / CD77) , gangliosides (GD2, GD3, and GM2) , , CD34, CD45, human leukocyte antigen-DR (HLA-DR) , CD123, CLL1, CD105, CD71, SSC, MAGE, MUC16, WT-l, B7H3, TEM8, CD22, LI-CAM, ROR-l, CEA, 4-1BB, ETA, 5T4, adenocarcinoma antigen, alpha-fetoprotein (AFP) , BAFF, B-lymphoma cell, CA242 antigen, CA-125, carbonic anhydrase 9 (CA-IX) , C-MET, CCR4, CD133, CD152, CD20, CD125, CD200, CD221, CD23 (IgE receptor) , CD28, CD30 (TNFRSF8) , CD33, CD4, CD40, CD44v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CEA, CNT0888, CTLA-4, DR5, CD3, FAP, fibronectin extra domain-B, folate receptor 1, GD2, GD3 ganglioside, glycoprotein 75, GPNMB, , HGF, human scatter factor receptor kinase, IGF-l receptor, IGF-I, IgGl, IL-5, IL-13, IL-6, IL-15, insulin-like growth factor I receptor, integrin α5β1, integrin αVβ3, MSLN, MS4A1, MUC1, mucin CanAg, N-glycolylneuraminic acid, NPC-1C, PD-1, PD-L1, PDGF-R-α, TWEAK, phosphatidylserine, prostatic carcinoma cells, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, tenascin C, TGF beta 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, tumor antigen CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR-l, VEGFR2, and vimentin.

[0023] In some embodiments, the selected TAA is HER2, and the scFv comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.

[0024] In some embodiments, the selected TAA is BCMA, and the scFv comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.

[0025] In some embodiments, the CAR comprises the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 9-14.

[0026] In some embodiments, the immune cells are selected from M0, M1 and M2 macrophages.

[0027] In another aspect, the disclosure provides nucleic acid constructs comprising one or more nucleic acid sequences encoding: (a) an extracellular domain, (b) a transmembrane domain, and (c) an intracellular domain, wherein the transmembrane domain comprises a CLEC5A transmembrane domain and the intracellular domain comprises a signaling domain of a CLEC5A intracellular domain.

[0028] In another aspect, the disclosure provides a method of modifying a macrophage or monocyte comprising: delivering to the macrophage or monocyte a viral vector comprising one or more nucleic acid sequences encoding: (a) an extracellular domain, (b) a transmembrane domain, and (c) an intracellular domain, wherein the transmembrane domain comprises a CLEC5A transmembrane domain and the intracellular domain comprises a signaling domain of a CLEC5A intracellular domain.

[0029] In another aspect, the disclosure provides a method of treatment comprising isolating monocytes from the patient, modifying them in the lab with the CAR, and then reinfusing them to attack tumors.

[0030] The present disclosure is also related to a pharmaceutical composition comprising the immune cells described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0031] The present disclosure is also related to methods of treating a subject having a disease, disorder, or condition, comprising administering a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition described herein.DESCRIPTION OF DRAWINGS

[0032] FIGS. 1A-1C are schematic diagrams illustrating the CAR constructs CAR-M01 (FIG. 1A) , CAR-M02 (FIG. 1B) and CAR-M03 (FIG. 1C) .

[0033] FIG. 2 are schematic diagrams illustrating the CAR constructs CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2, CAR-M01-BCMA, CAR-M02-BCMA and CAR-M03-BCMA.

[0034] FIG. 3 shows the expression levels of CAR targeting HER2 in transduced macrophages as determined by flow cytometry.

[0035] FIG. 4 shows the cell viability of CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2 and CAR-M03-HER2 macrophages.

[0036] FIG. 5 shows the killing of SK-BR-3 cells by CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2 and CAR-M03-HER2 macrophages at different E: T ratios.

[0037] FIGS. 6A-6B show the supernatant cytokine levels of CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2 and CAR-M03-HER2 transduced macrophages. FIG. 6A shows TNFα levels and IL6 and FIG. 6B shows IL6 levels.

[0038] FIG. 7 shows the CAR-M-HER2 expression in transduced M0, M1 and M2 macrophages as determined by flow cytometry.

[0039] FIG. 8 shows the viability of M0, M1 and M2 macrophages transduced to express CAR-M-HER2.

[0040] FIGS. 9A-9F show the killing of SK-BR-3 cells by CAR-M-HER2 M0, M1, M2 macrophages at different E: T ratios.

[0041] FIGS. 10A-10B show serial killing effects of CAR-M-HER2 M0, M1, M2 macrophages on tumor cells.

[0042] FIG. 11 shows the expression levels of CAR targeting BCMA in transduced macrophages as determined by flow cytometry.

[0043] FIG. 12 shows the cell viability of CAR-M01-BCMA, CAR-M02-BCMA and CAR-M03-BCMA macrophages.

[0044] FIG. 13 shows the killing of NCI-H929 cells by CAR-M01-BCMA, CAR-M02-BCMA and CAR-M03-BCMA macrophages at different E: T ratios.

[0045] FIGS. 14A-14B show the supernatant cytokine levels of UTD, CAR-M01-BCMA, CAR-M02-BCMA and CAR-M03-BCMA transduced macrophages. FIG. 14A shows TNFα levels and FIG. 14B shows IL6 levels.

[0046] FIG. 15 shows serial killing effects of CAR-M-BCMA macrophages on tumor cells.

[0047] FIG. 16 shows relevant amino acid sequences.DETAILED DESCRIPTION

[0048] The present disclosure provides immune cells comprising a chimeric antigen receptor (CAR) comprising: (a) an extracellular domain (ECD) , (b) a transmembrane domain comprising CLEC5A transmembrane domain, and (c) an intracellular domain comprising a signaling domain of a CLEC5A intracellular domain.

[0049] In some embodiments, the immune cells comprise macrophages, monocytes, neutrophils, NK or non-phagocytic cells.

[0050] In some embodiments, the immune cells comprise macrophages, monocytes or neutrophils.

[0051] In some embodiments, the CAR comprises, from N-terminus to C-terminus, an intracellular domain, a transmembrane domain and an extracellular domain.

[0052] In some embodiments, the CLEC5A transmembrane domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

[0053] In some embodiments, the CLEC5A intracellular domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

[0054] In some embodiments, the extracellular domain comprises a CLEC5A extracellular domain.

[0055] In some embodiments, the CLEC5A extracellular domain is selected from CLEC5A isoform 1 and CLEC5A isoform 2.

[0056] In some embodiments, the CLEC5A extracellular domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.

[0057] In some embodiments, the CLEC5A extracellular domain is a CLEC5A truncated ECD of CLEC5A isoform 1 or CLEC5A isoform 2.

[0058] In some embodiments, the CLEC5A extracellular domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.

[0059] In some embodiments, the extracellular domain comprises a hinge.

[0060] In some embodiments, the hinge is selected from a CD8 hinge, a CD28 hinge and an IgG subclass hinge (such as IgGl and IgG4) .

[0061] In some embodiments, the hinge comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.

[0062] In some embodiments, the extracellular domain comprises a scFv targeting a tumor associated antigen (TAA) .

[0063] In some embodiments, TAA is selected from HER2, EpCAM, EGFR, BCMA, CD19, CD79b, CD38, GPRC5D, DLL3, CD70, GPC3, Fas ligand (FasL) , CD1d, Membrane glycolipids, globotriaosyl-ceramide (Gb3Cer / CD77) , gangliosides (GD2, GD3, and GM2) , , CD34, CD45, human leukocyte antigen-DR (HLA-DR) , CD123, CLL1, CD105, CD71, SSC, MAGE, MUC16, WT-l, B7H3, TEM8, CD22, LI-CAM, ROR-l, CEA, 4-1BB, ETA, 5T4, adenocarcinoma antigen, alpha-fetoprotein (AFP) , BAFF, B-lymphoma cell, CA242 antigen, CA-125, carbonic anhydrase 9 (CA-IX) , C-MET, CCR4, CD133, CD152, CD20, CD125, CD200, CD221, CD23 (IgE receptor) , CD28, CD30 (TNFRSF8) , CD33, CD4, CD40, CD44v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CEA, CNT0888, CTLA-4, DR5, CD3, FAP, fibronectin extra domain-B, folate receptor 1, GD2, GD3 ganglioside, glycoprotein 75, GPNMB, , HGF, human scatter factor receptor kinase, IGF-l receptor, IGF-I, IgGl, IL-5, IL-13, IL-6, IL-15, insulin-like growth factor I receptor, integrin α5β1, integrin αVβ3, MSLN, MS4A1, MUC1, mucin CanAg, N-glycolylneuraminic acid, NPC-1C, PD-1, PD-L1, PDGF-R-α, TWEAK, phosphatidylserine, prostatic carcinoma cells, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, tenascin C, TGF beta 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, tumor antigen CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR-l, VEGFR2, and vimentin.

[0064] In some embodiments, the TAA is HER2, and the scFv comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.

[0065] In some embodiments, the TAA is BCMA, and the scFv comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.

[0066] In some embodiments, the CAR comprises the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 9-14.

[0067] In some embodiments, the immune cells are selected from M0, M1 and M2 macrophages.

[0068] In another aspect, the disclosure provides nucleic acid constructs comprising one or more nucleic acid sequences encoding: (a) an extracellular domain, (b) a transmembrane domain, and (c) an intracellular domain, wherein the transmembrane domain comprises a CLEC5A transmembrane domain and the intracellular domain comprises a signaling domain of a CLEC5A intracellular domain.

[0069] In another aspect, the disclosure provides a method of modifying a macrophage or monocyte comprising: delivering to the macrophage or monocyte a viral vector comprising one or more nucleic acid sequences encoding: (a) an extracellular domain, (b) a transmembrane domain, and (c) an intracellular domain, wherein the transmembrane domain comprises a CLEC5A transmembrane domain and the intracellular domain comprises a signaling domain of a CLEC5A intracellular domain.

[0070] The present disclosure is also related to a pharmaceutical composition comprising the immune cells described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0071] The present disclosure is also related to a method of treating a subject having a disease, disorder, or condition, comprising administering a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition described herein.

[0072] As used herein, the term “immune cell” refers to a cell that is involved in an immune response, e.g., promotion of an immune response. Non-limiting examples of immune cells include macrophages, monocytes, neutrophils, dendritic cells, eosinophils, mast cells, platelets, large granular lymphocytes, Langerhans' cells, natural killer (NK) cells, T-lymphocytes, or B-lymphocytes. The source of immune cells can be obtained from a subject. Non-limiting examples of subjects include mice, rats, hamsters, guinea pigs, dogs, pigs, and primate mammals including monkeys and humans.

[0073] As used herein, the term “macrophages” refers to immune cells that specialized for detection, phagocytosis, and destruction of target cells, such as tumor cells. Macrophages are potent effectors of the innate immune system and are capable of at least three distinct anti-tumor functions: phagocytosis of dead and dying cells, microorganisms, cancer cells, cellular debris, or other foreign substances; cytotoxicity against tumor cells; and presentation of tumor antigens to orchestrate an adaptive anti-tumor immune response.

[0074] As used herein, the term “monocytes” refers to multipotent immune cells that circulate in the blood, bone marrow, and spleen, and generally do not proliferate when in a steady state. Typically, monocytes comprise chemokine receptors and pathogen recognition receptors that mediate migration from blood to tissues, such as during an infection. Monocytes can produce inflammatory cytokines, take up cells and / or toxic molecules, and differentiate into dendritic cells or macrophages.

[0075] As used herein, the term “neutrophils” refers to effective antimicrobial immune cells that proliferate and differentiate from stem cells into mature neutrophils in the bone marrow. Neutrophils far outnumber any other immune cell found in human blood and extravasate en masse into compromised tissue.

[0076] As used herein, the term “chimeric antigen receptor” OR “CAR” , refers to an artificial cell surface receptor that is engineered to be expressed on an immune effector cell and specifically targets a cell and / or binds an antigen. In some embodiments, CARs have been expressed with specificity to an antigen, for example, a tumor associated antigen. In some embodiments, the CAR comprises an extracellular domain, a transmembrane domain and an intracellular domain.

[0077] As used herein, the term “lipid nanoparticle” OR “LNP” refers to a particle having at least one dimension on the order of nanometers (e.g., l-1000nm) which includes one or more lipids. In some embodiments, LNPs comprise at least one agent that is either organized within inverse lipid micelles and encased within a lipid monolayer envelope or intercalated between adjacent lipid bilayers (e.g. lipid bilayer-agent-lipid bilayer) . In some embodiments, the morphology of the LNPs are not like a traditional liposome, which are characterized by a lipid bilayer surrounding an aqueous core, as they possess an electron-dense core, where the cationic / ionizable lipids are organized into inverted micelles around the encapsulated agent (e.g. mRNA molecules) (Cullis and Hope, 2017; Guevara et al., 2019b) .

[0078] As used herein, the term “CLEC5A” refers to a polypeptide derived from a wild-type CLEC5A or a functional variant thereof. The CLEC5A may be a wild-type CLEC5A (e.g., human CLEC5A) . The CLEC5A may have one or more mutations (e.g., insertions, deletions, or substitutions) . The CLEC5A may be a human CLEC5A.

[0079] As used herein, the terms “ECD, ” “extracellular domain” or “extracellular region” are used interchangeably herein to refer to the portion of a receptor that is outside the cell membrane. The extracellular domain can include the entire portion of a receptor that is outside the cell membrane, or just a part thereof (e.g., at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%of the entire portion) . The extracellular domain can be derived from the extracellular domain of a wild-type receptor or a functional variant thereof. The extracellular domain may have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, or substitutions. A CLEC5A extracellular domain ( “CLEC5A ECD” ) may be the extracellular domain derived from a wild-type CLEC5A or a functional variant thereof, or a portion thereof.

[0080] As used herein, the terms “ICD, ” “intracellular domain” , “intracellular region” or “cytoplasmic region” are used interchangeably herein to refer to the portion of a receptor that is inside the cell. The intracellular domain can include the entire portion of a receptor that is inside the cell, or just a part thereof (e.g., at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%of the entire portion) . The intracellular domain can be derived from the intracellular domain of a wild-type receptor or a functional variant thereof. The intracellular domain may have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, or substitutions. A CLEC5A intracellular domain ( “CLEC5A ICD” ) may be the intracellular domain derived from a wild-type CLEC5A or a functional variant thereof, or a portion thereof. A CLEC5A ICD may contain one or more signaling domains (e.g., the domain that associates DAP12) .

[0081] As used herein, the terms “TM, ” “transmembrane domain” or “transmembrane region” are used interchangeably herein to refer to the portion of a receptor that is embedded in the cell membrane. The transmembrane domain can include the entire portion of a receptor that is embedded in the cell membrane, or just a part thereof (e.g., at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%of the entire portion) . The transmembrane domain can be derived from the transmembrane domain of a wild-type receptor or a functional variant thereof. The transmembrane domain may have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, or substitutions. A CLEC5A transmembrane domain ( “CLEC5A TM” ) may be the transmembrane domain derived from a wild-type CLEC5A or a functional variant thereof, or a portion thereof.

[0082] As used herein, the terms “hinge domain” or “hinge region” or are used interchangeably herein to refer to the portion of a receptor that connects the transmembrane region and the extracellular domain. The hinge region may be part of an extracellular domain. The hinge region can be derived from the hinge region of a wild-type receptor or a functional variant thereof. The hinge region may have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, or substitutions. A CD8 hinge domain ( “CD8 hinge” ) may be the transmembrane domain derived from a wild-type CD8 or a functional variant thereof, or a portion thereof.

[0083] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs. Methods and materials are described herein for use in the present disclosure; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

[0084] In some embodiments, the modified immune cell, for example, a modified macrophage, monocyte, or dendritic cell, is generated by modifying the immune cell to express a CAR described herein. In some embodiments, the immune cell described herein expresses a CAR comprising an extracellular domain, a transmembrane domain, and an intracellular domain, wherein the immune cell comprises a macrophage, a monocyte, or a dendritic cell.

[0085] In some embodiments, the CAR described herein comprises a spacer domain or hinge between the extracellular domain and the transmembrane domain. In some embodiments, the CAR described herein comprises a spacer domain or hinge between the intracellular domain and the transmembrane domain. As used herein, the term “spacer domain” or “hinge” refers to any oligo-or polypeptide that functions to link a transmembrane domain to either an extracellular domain or to an intracellular domain in a polypeptide chain. In some embodiments, the spacer domain or hinge may comprise up to 300 amino acids, preferably 10 to 100 amino acids and most preferably 25 to 50 amino acids. In some embodiments, the linker is a short oligo-or polypeptide linker, preferably between 2 and 10 amino acids in length. An example of such a linker includes a glycine-serine doublet.

[0086] The present disclosure also provides immune cells comprising a nucleic acid sequence (e.g., an isolated nucleic acid sequence) encoding the CAR described herein. In some embodiments, the nucleic acid sequence comprises a nucleic acid sequence encoding an extracellular domain, a nucleic acid sequence encoding a transmembrane domain and a nucleic acid sequence encoding an intracellular domain. In some embodiments, the immune cells comprise monocytes, macrophages or a dendritic cells.

[0087] The present disclosure provides chimeric antigen receptors (CARs) comprising extracellular domains. In some embodiments, the extracellular domain comprises an antigen binding domain and an extracellular hinge domain. In some embodiments, the extracellular domain comprises an antigen binding domain and CLEC5A extracellular domain. In some embodiments, the extracellular domain comprises an antigen binding domain, a linker and a CLEC5A extracellular domain.

[0088] As used herein, the term “CLEC5A truncated ECD” refers to a partial sequence of the full-length CLEC5A extracellular domain, such as the CLEC5A stalk region, 1-5 amino acid longer or shorter than the CLEC5A stalk region, 1-10 amino acid longer or shorter than the CLEC5A stalk region, or 1-20 amino acid longer or shorter than the CLEC5A stalk region. The CLEC5A stalk region refers to amino acid positions 88-99 of CLEC5A (SEQ ID NO: 15) . The CLEC5A truncated ECD can be derived from the extracellular domain of a wild-type CLEC5A or a functional variant thereof.

[0089] The present disclosure provides CARs comprising an antigen binding domain that binds to an antigen, for example, on a target cell. In some embodiments, the CAR described herein comprises an antigen binding domain that binds to an antigen associated with viral infection, bacterial infection, parasitic infection, autoimmune disease, and / or cancer cells. In some embodiments, the antigen binding domain recognizes an antigen that acts as a cell surface marker on a target cell associated with a particular disease state. In some embodiments, the antigen binding domain binds to a tumor antigen, such as an antigen that is specific for a tumor or cancer of interest. In some embodiments, the tumor antigen comprises one or more antigenic cancer epitopes. In some embodiments, the tumor antigen comprises HER2, EpCAM, EGFR, BCMA, CD19, CD79b, CD38, GPRC5D, DLL3, CD70, GPC3, Fas ligand (FasL) , CD1d, Membrane glycolipids, globotriaosyl-ceramide (Gb3Cer / CD77) , gangliosides (GD2, GD3, and GM2) , , CD34, CD45, human leukocyte antigen-DR (HLA-DR) , CD123, CLL1, CD105, CD71, SSC, MAGE, MUC16, WT-l, B7H3, TEM8, CD22, LI-CAM, ROR-l, CEA, 4-1BB, ETA, 5T4, adenocarcinoma antigen, alpha-fetoprotein (AFP) , BAFF, B-lymphoma cell, CA242 antigen, CA-125, carbonic anhydrase 9 (CA-IX) , C-MET, CCR4, CD133, CD152, CD20, CD125, CD200, CD221, CD23 (IgE receptor) , CD28, CD30 (TNFRSF8) , CD33, CD4, CD40, CD44v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CEA, CNT0888, CTLA-4, DR5, CD3, FAP, fibronectin extra domain-B, folate receptor 1, GD2, GD3 ganglioside, glycoprotein 75, GPNMB, , HGF, human scatter factor receptor kinase, IGF-l receptor, IGF-I, IgGl, IL-5, IL-13, IL-6, IL-15, insulin-like growth factor I receptor, integrin α5β1, integrin αVβ3, MSLN, MS4A1, MUC1, mucin CanAg, N-glycolylneuraminic acid, NPC-1C, PD-1, PD-L1, PDGF-R-α, TWEAK, phosphatidylserine, prostatic carcinoma cells, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, tenascin C, TGF beta 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, tumor antigen CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR-l, VEGFR2, or vimentin.

[0090] In some embodiments, the antigen binding domain comprises a domain that binds to an antigen. In some embodiments, the antigen binding domain is or comprises a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a synthetic antibody, a human antibody, a humanized antibody, a non-human antibody, or a fragment thereof, for example an scFv. In some embodiments, the antigen binding domain is or comprises an aptamer, a darpin, a centyrin, a naturally occurring or synthetic receptor, an affibody, or other engineered protein recognition molecule. In some embodiments, the antigen binding domain is or comprises a mammalian antibody or a fragment thereof. In some embodiments, the antigen binding domain is derived, in whole or in part, from the same species in which the CAR will ultimately be used. For example, for use in humans, an antigen binding domain of a CAR may comprise a human antibody, a humanized antibody, or a fragment thereof (e.g. a scFv) . In some embodiments, the antigen binding domain may be a domain that is endogenous to a particular immune cell type (e.g., a modified immune cell as provided herein) . In some embodiments, the antigen binding domain may be a domain that is not endogenous to a particular immune cell type (e.g., a modified immune cell as provided herein) .

[0091] The present disclosure provides CARs comprising an extracellular hinge domain. In some embodiments, the extracellular hinge domain is or comprises a human extracellular hinge domain. In some embodiments, the extracellular hinge domain may be a domain that is endogenous to a particular immune cell type. In some embodiments, the extracellular hinge domain may be a domain that is not endogenous to a particular immune cell type. In some embodiments, the extracellular hinge domain comprises a CD8 extracellular hinge domain or a CD28 extracellular hinge domain or an IgG subclass extracellular hinge domain. In some embodiments, the extracellular hinge domain optimizes the physicochemical parameters of the CAR, e.g., to provide an optimal size relative to tumor antigen (e.g., allowing for exclusion of inhibitory molecules) , optimal flexibility, optimal protein folding, optimal protein stability, optimal binding, optimal homodimerization, and / or lack of homodimerization.

[0092] The present disclosure provides chimeric antigen receptors (CARs) comprising a transmembrane domain. In some embodiments, the CAR comprises a transmembrane domain, for example, that connects the extracellular domain to the intracellular domain. In some embodiments, the transmembrane domain is naturally associated with one or more other domain (s) of a CAR. In some embodiments, the transmembrane domain can be modified to avoid the binding of other surface membrane proteins the transmembrane domain (e.g., in order to minimize interactions with other members of a receptor complex) . In some embodiments, the transmembrane domain may be derived either from a naturally-occurring or from a synthetic source. In some embodiments, the transmembrane domain is derived from a naturally-occurring membrane-bound or transmembrane protein. In some embodiments, the transmembrane domain is or comprises a human transmembrane domain. In some embodiments, the transmembrane domain may be a domain that is endogenous to a particular immune cell type (e.g., a modified immune cell as provided herein) . In some embodiments, the transmembrane domain may be a domain that is not endogenous to a particular immune cell type (e.g., a modified immune cell as provided herein) . In some embodiments, the transmembrane domain comprises a CLEC5A transmembrane domain.

[0093] The present disclosure provides chimeric antigen receptors (CARs) comprising one or more intracellular domains. In some embodiments, the intracellular domain is or comprises a human intracellular domain, or a portion thereof. In some embodiments, the intracellular domain may be a domain that is endogenous to a particular immune cell type (e.g., a modified immune cell as provided herein) . In some embodiments, the intracellular domain may be a domain that is not endogenous to a particular immune cell type (e.g., a modified immune cell as provided herein) . In some embodiments, the intracellular domain and / or other cytoplasmic domain of a CAR is responsible for activation of the cell in which the CAR is expressed (e.g., an immune cell) . In some embodiments, the intracellular domain of a CAR is responsible for signal activation and / or transduction in an immune cell comprising said CAR. In some embodiments, the intracellular domain comprises a CLEC5A intracellular domain.

[0094] In one aspect, the disclosure provides a modified macrophage, monocyte, or neutrophil. In some embodiments, the modified macrophage, monocyte, or neutrophil comprises a CAR described herein. In some embodiments, the modified macrophage, monocyte, or neutrophil exhibits increased anti-tumor activity relative to an unmodified cell of the same type.

[0095] The present disclosure, among other things, provides nucleic acid molecules encoding at least one CAR described herein or a fragment thereof. An immune cell can comprise a nucleic acid molecule (e.g., an exogenous nucleic acid molecule) encoding at least one CAR described herein. In some embodiments, the nucleic acid molecule encodes at least one CAR that comprises: (a) an extracellular domain (e.g., an extracellular domain as described herein) , (b) a transmembrane domain (e.g., a transmembrane domain as described herein) , and (c) an intracellular domain (e.g., an intracellular domain as described herein) .

[0096] Nucleic acid molecules encoding at least one CAR described herein or a fragment thereof can be a DNA molecule, an RNA molecule, or a combination thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises or is a messenger RNA (mRNA) transcript encoding at least one CAR described herein or a fragment thereof. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises or is a DNA construct encoding at least one CAR described herein or a fragment thereof.

[0097] In one aspect, the disclosure provides a method of engineering a cell to express the engineered receptor (e.g., CAR) described herein. In some embodiments, the method comprises exposing the cell to a vector such as a LNP or a viral vector like adenovirus (e.g., Ad5f35) , which contains nucleic acids encoding the engineered receptor (e.g., CAR) described herein. In some embodiments, the vector (e.g., Ad5f35) specifically target monocytes. In some embodiments, the vector is Ad5f35, which utilizes a chimeric fiber (Ad5 backbone with Ad35 knob) to target CD46, a receptor highly expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells. In some embodiments, the vector (e.g., Ad5f35) can specifically deliver nucleic acids encoding the engineered receptor (e.g., CAR) described herein to monocytes, macrophages, and dendritic cells.

[0098] In one aspect, the method described herein uses vivo transfection technology to deliver CAR-encoding nucleic acids (e.g., mRNA) via a vector (e.g., Ad5f35) , enabling the direct generation of CAR-expressing cells within the body. In some embodiments, the vector (e.g., Ad5f35) specifically target monocytes, macrophages, and dendritic cells.

[0099] In one aspect, the method described herein uses vivo transfection technology to deliver CAR-encoding nucleic acids (e.g., mRNA) via a Lipid Nanoparticle (LNP) , enabling the direct generation of CAR-expressing cells within the body.

[0100] Without being bound by theory, the CAR construct described herein (containing a signaling domain of the CLEC5A intracellular domain) relies on the presence of DAP12 or DAP10 to exert its function, because its activation requires the presence of DAP12 / DAP10 to trigger downstream signaling (such as Syk pathway) . In some embodiments, the CAR construct described herein can only efficiently function in cells that endogenously express the DAP12 or DAP10 signal adapter. In some embodiments, the CAR construct described herein can only efficiently function in myeloid cells and NK cells, which endogenously express the DAP12 or DAP10 signal adapter. In some embodiments, because DAP12 is primarily expressed on myeloid cells (monocytes, macrophages, neutrophils, dendritic cells) and NK cells, the CAR activity is restricted to these lineages. Without being bound by theory, this cell type specific expression of DAP12 or DAP10 combined with the cell-specific delivery by the vector (e.g., Ad5f35) or LNP, results in CAR activity that is restricted to myeloid cells thereby avoiding off-target activity in other cell types. By combining the selective targeting of the vector (e.g., Ad5f35) or LNP with the cell-type-specific signaling (DAP12 / DAP10) , the CAR activity is restricted to myeloid cells. This design helps avoid off-target activity in other cell types

[0101] The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration. The disclosure also provides methods of manufacturing a modified immune cell such as macrophage, monocyte, or neutrophil comprising a CAR for various uses as described herein.

[0102] CLEC5A

[0103] Human C‐type lectin domain family 5 member A (CLEC5A) , also known as myeloid DAP12-associating lectin-1 (MDL-1) , is a II-type transmembrane protein and only expresses on the myeloid lineages including macrophages, monocytes, neutrophiles, and dendritic cells (DCs) . As a pattern recognition receptor, CLEC5A transmits signals into cytoplasm through non-covalent binding to the adaptor protein DAP12. Phosphorylation of DAP12 then initiates a Syk kinase-based signaling cascade resulting in macrophages activation and release of chemokines and proinflammation cytokines, including IL-6, TNF, CCL3, and CXCL8. CLEC5A can trigger myeloid cell-related immune response and correlates with diverse infection and inflammatory diseases. CLEC5A promotes the production of high levels of pro-inflammatory cytokines and chemokines in flavivirus infections, especially dengue and Japanese encephalitis virus infections, and anti-CLEC5A mAb or CLEC5A inhibitors can reverse disease progression, suggesting that CLEC5A is a promising therapeutic target for flavivirus infections. In addition, similar in several autoimmune diseases, a high level of CLEC5A is found in active rheumatoid arthritis and CLEC5A activator increases proinflammation cytokines level. CLEC5A is also a pivotal contributor to cancer development and progression. Aberrant high CLEC5A expression significantly correlates with decreased overall survival in high-grade serious ovarian cancer (HGSOC) , gastric cancer, and glioma.

[0104] The human CLEC5A mRNA encodes a 165-residue polypeptide with an N-terminal signal peptide (a.a. 1-22) , followed by a short intracellular cytoplasmic domain (a.a. 23-56) , a transmembrane domain (a.a. 57-70) and an extracellular domain (a.a. 71-165) . The transmembrane domain contains a positively charged amino acid, Lys-58, which recruits DAP10 and DAP12 to associate with CLEC5A after activation. CLEC5A is mainly expressed by myeloid cells, including monocytes, macrophages, neutrophils, and dendritic cells, and is further upregulated by interferon-gamma (IFN-γ) . In addition, CLEC5A expression is under the control of the PU. 1 transcription factor, which is a central regulator of myeloid cell differentiation. CLEC5A expression is upregulated by the nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) , suggesting CLEC5A is regulated by oxidative stress. An X-ray crystal structure has revealed that CLEC5A is a homodimeric protein when it binds to dengue virus serotype. Moreover, the CLEC5A crystal structure revealed conformational flexibility, suggesting that CLEC5A can adopt various conformations in vivo and that its conformation is ligand-dependent.

[0105] A detailed review of CLEC5A and its functions can be found in Sung, Pei-Shan, Wei-Chiao Chang, and Shie-Liang Hsieh. “CLEC5A: a promiscuous pattern recognition receptor to microbes and beyond” Lectin in Host Defense Against Microbial Infections (2020) : 57-73; Chen, Rui, et al., “A pan-cancer analysis reveals CLEC5A as a biomarker for cancer immunity and prognosis” Frontiers in Immunology 13 (2022) : 831542; and Wang, Quhui, et al., “CLEC5A promotes the proliferation of gastric cancer cells by activating the PI3K / AKT / mTOR pathway” Biochemical and Biophysical Research Communications 524.3 (2020) : 656-662; each of which is incorporated by reference in its entirety.

[0106] Engineered receptor

[0107] The present disclosure provides an engineered receptor (e.g., CAR) comprising: (a) an extracellular domain (ECD) , (b) a transmembrane domain comprising CLEC5A transmembrane domain, and (c) an intracellular domain comprising a signaling domain of a CLEC5A intracellular domain.

[0108] Exemplary engineered receptors include, but are not limited to, chimeric antigen receptor (CAR) , engineered T-cell receptor (TCR) , and T-cell antigen coupler (TAC) receptor. The engineered receptor can comprise an extracellular antigen binding domain that specifically binds to an antigen (e.g., a tumor antigen) , a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain. The intracellular signaling domain can comprise a primary intracellular signaling domain and / or a co-stimulatory signaling domain. The engineered receptor can be encoded by a heterologous polynucleotide operably linked to a promoter (such as a constitutive promoter or an inducible promoter) .

[0109] The engineered receptor can comprise one or more specific binding domains that target at least one tumor antigen, and one or more intracellular effector domains, such as one or more primary intracellular signaling domains and / or co-stimulatory signaling domains.

[0110] The engineered receptor can be a chimeric antigen receptor (CAR) . Many chimeric antigen receptors are known in the art and can be suitable for the engineered cells described herein. CARs can also be constructed with a specificity for any cell surface marker by utilizing antigen binding fragments or antibody variable domains of, for example, antibody molecules.

[0111] CARs of the present disclosure may comprise an extracellular domain comprising at least one antigen binding domain that specifically binds at least one tumor antigen, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain.

[0112] The intracellular signaling domain may generate a signal that promotes an immune effector function of the CAR-containing cell (e.g., macrophage) . Immune effector function or immune effector response refers to function or response, e.g., of an immune effector cell, that enhances or promotes an immune attack of a target cell. For example, an immune effector function or response can refer to a property of a T or NK cell that promotes killing or the inhibition of growth or proliferation, of a target cell. Examples of immune effector function, include cytolytic activity (such as antibody-dependent cellular toxicity, or ADCC) and helper activity (such as the secretion of cytokines) . The intracellular signaling domain may generate a signal that promotes proliferation and / or survival of the CAR containing cell. The CAR may comprise one or more intracellular signaling domains selected from the signaling domains of CD28, CD137, CD3, CD27, CD40, ICOS, GITR, and OX40. The signaling domain of a naturally occurring molecule can comprise the entire intracellular or cytoplasmic portion, or the entire native intracellular signaling domain, of the molecule, or a fragment or derivative thereof.

[0113] The intracellular signaling domain of a CAR can comprise a primary intracellular signaling domain. “Primary intracellular signaling domain” refers to cytoplasmic signaling sequence that acts in a stimulatory manner to induce immune effector functions. The primary intracellular signaling domain may contain a signaling motif known as Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif, or ITAM. The primary intracellular signaling domain may comprise a functional signaling domain of a protein selected from the group consisting of CD3 zeta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, common FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon RIb) , CD79a, CD79b, Fcgamma R IIa, DAP10, and DAP12. The primary intracellular signaling domain may comprise a nonfunctional or attenuated signaling domain of a protein selected from the group consisting of CD3 zeta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, common FcR gamma (FCER1G) , FcR beta (Fc Epsilon RIb) , CD79a, CD79b, Fcgamma R IIa, DAP10, and DAP12. The nonfunctional or attenuated signaling domain can be a mutant signaling domain having a point mutation, insertion or deletion that attenuates or abolishes one or more immune effector functions, such as cytolytic activity or helper activity, including antibody-dependent cellular toxicity (ADCC) . The CAR may comprise a nonfunctional or attenuated CD3 zeta (i.e. CD3ζ or CD3z) signaling domain. The intracellular signaling domain may not comprise a primary intracellular signaling domain.

[0114] The intracellular signaling domain of a CAR can comprise one or more (such as any of 1, 2, 3, or more) co-stimulatory signaling domains. “Co-stimulatory signaling domain” can be the intracellular portion of a co-stimulatory molecule. The term “co-stimulatory molecule” refers to a cognate binding partner on an immune cell that specifically binds with a co-stimulatory ligand, thereby mediating a co-stimulatory response by the immune cell, such as, but not limited to, proliferation and survival. Co-stimulatory molecules are cell surface molecules other than antigen receptors or their ligands that contribute to an efficient immune response. A co-stimulatory molecule can be represented in the following protein families: TNF receptor proteins, Immunoglobulin-like proteins, cytokine receptors, integrins, signaling lymphocytic activation molecules (SLAM proteins) , and activating NK cell receptors. Co-stimulatory molecules include but are not limited to an MHC class I molecule, BTLA and a Toll ligand receptor, as well as OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a / CD18) , ICOS (CD278) , and 4-1BB (CD137) . Further examples of such co-stimulatory molecules include CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR) , SLAMF7, NKp80 (KLRF1) , NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL-2R beta, IL-2R gamma, IL-7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49d, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE / RANKL, DNAM1 (CD226) , SLAMF4 (CD244, 2B4) , CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229) , CD160 (BY55) , PSGL1, CD100 (SEMA4D) , CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3) , BLAME (SLAMF8) , SELPLG (CD162) , LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG / Cbp, CD19a, and a ligand that specifically binds with CD83.

[0115] The CAR can comprise a single co-stimulatory signaling domain. The CAR can comprise two or more co-stimulatory signaling domains. The intracellular signaling domain can comprise a functional primary intracellular signaling domain and one or more co-stimulatory signaling domains. The CAR may not comprise a functional primary intracellular signaling domain (such as CD3ζ) . The CAR can comprise an intracellular signaling domain consisting of or consisting essentially of one or more co-stimulatory signaling domains. The CAR can comprise an intracellular signaling domain consisting of or consisting essentially of a nonfunctional or attenuated primary intracellular signaling domain (such as a mutant CD3ζ) and one or more co-stimulatory signaling domains. Upon binding of the antigen binding domain to tumor antigen, the co-stimulatory signaling domains of the CAR can transduce signals for enhanced proliferation, survival and differentiation of the modified immune cells having the CAR, and inhibit activation induced cell death. The one or more co-stimulatory signaling domains can be derived from one or more molecules selected from the group consisting of CD27, CD28, 4-1BB (i.e., CD137) , OX40, CD30, CD40, CD3, lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) , CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 and ligands that specially bind to CD83.

[0116] The intracellular signaling domain of a CAR can comprise a co-stimulatory signaling domain derived from CD28. The intracellular signaling domain can comprise a primary intracellular signaling domain of CD3ζ and a co-stimulatory signaling domain of CD28. The intracellular signaling domain in the chimeric receptor of the present application can comprise a co-stimulatory signaling domain derived from 4-1BB (i.e., CD137) . The intracellular signaling domain can comprise a primary intracellular signaling domain of CD3ζ and a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB. The intracellular signaling domain can comprise a polypeptide comprising from the N-terminus to the C-terminus: a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB and a primary intracellular signaling domain of CD3ζ.

[0117] The intracellular signaling domain of the CAR can comprise a co-stimulatory signaling domain of CD28 and a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB. The intracellular signaling domain can comprise a primary intracellular signaling domain of CD3ζ, a co-stimulatory signaling domain of CD28, and a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB. The intracellular signaling domain can comprise a polypeptide comprising from the N-terminus to the C-terminus: a co-stimulatory signaling domain of CD28, a co-stimulatory signaling domain of 4-1BB, and a primary intracellular signaling domain of CD3ζ.

[0118] The antigen binding domain of a CAR may comprise one or more (such as any one of 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more) antibodies or antibody fragments, which can be selected from an scFv, a Fv, a Fab, a (Fab′) 2, a minibody, a diabody, a single domain antibody (sdAb) , or a VHH domain. The antigen binding domain of a CAR can comprise a ligand or an extracellular portion of a receptor that specifically binds to a tumor antigen. The CAR can be a monospecific, bispecific or multispecific CAR. The antigen binding domain of a CAR can specifically bind to a single tumor antigen. The antigen binding domain of a CAR can bind to two or more tumor antigens. The engineered receptor (e.g., CAR) may redirect the specificity of the engineered cells through the expression of a chimeric antigen receptor (CAR) or TCR on these cells.

[0119] The antigen may be a tumor antigen selected from the group consisting of BCMA, CLL1, CD4, GPC3, GPRC5D, GU2CYC, CD19, MUC16, MUC1, CAIX, CEA, CD8, CD7, CD10, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, EGP-2, EGP-40, EpCAM, ERBB2, ERBB3, ERBB4, FBP, fetal acetylcholine receptor, folate receptor-α, GD2, GD3, hTERT, IL-13Rα2, κ-light chain, KDR, LeY, L1 cell adhesion molecule, MAGE-A1, mesothelin, MAGEA3, p53, MART1, GP100, proteinase-3 (PR3) , tyrosinase, survivin, hTERT, EphA2, NY-ESO-1, h5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, CD123, CD44v6, NKCS1, IGF1R, EGFR, EGFR-VIII, Claudin 18.2, Claudin 6, NKG2D, Delta-like 3 (DLL3) , CD70, CS-1, c-Met, Glycolipid F77, PD-L1, PD-L2, and other tumor antigens with clinical significance, and combinations thereof. The antigen may be GPC3. The antigen may be DLL3. The antigen may be BCMA.

[0120] The tumor antigen can be derived from an intracellular protein of tumor cells. The tumor antigen can be expressed on the surface of tumor cells. Many TCRs specific for tumor antigens (including tumor-associated antigens) have been described, including, for example, NY-ESO-1 cancer-testis antigen, the p53 tumor suppressor antigens, TCRs for tumor antigens in melanoma (e.g., MARTI, gp 100) , leukemia (e.g., WT1, minor histocompatibility antigens) , and breast cancer (e.g., HER2, NY-BR1) .

[0121] The extracellular domain can be connected to the transmembrane domain by a hinge domain. The hinge domain can be a hinge domain of CD8α.

[0122] The CAR can also comprise a signal peptide (SP) , such as a CD8α signal peptide.

[0123] Many CARs targeting different tumor antigens have been widely disclosed in the field, such as CD19 CARs or BCMA CARs. The extracellular antigen binding domain of CD19 CARs can be or include the CD19 binding fragment (e.g., FMC63, SJ25C1, or those disclosed in different patents such as WO 2022 / 012683, etc. ) . BCMA CARs also have been well described, related patents include but not limited to WO 2016 / 014789, WO 2016 / 014565, WO 2013 / 154760, and WO 2018 / 028647, etc. The extracellular antigen binding domain of BCMA CARs may be or include BCMA binding fragment. The BCMA binding fragment may bind to one or more epitopes on BCMA. The BCMA CARs may be bivalent CARs comprising two anti-BCMA sdAbs targeting same or different BCMA epitopes.

[0124] The CAR protein sequence may comprise a sequence that has at least about 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 99%identity to any one of SEQ ID NOs: 9-14. The CAR protein sequence may comprise the sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 9-14. The CAR can be encoded by a vector. The vector may include a CAR DNA sequence.

[0125] The engineered receptor (such as CAR) can target one or more tumor antigens. Tumor antigens are proteins that are produced by tumor cells that can elicit an immune response, particularly T-cell mediated immune responses. The selection of the targeted antigen will depend on the particular type of cancer to be treated. Exemplary tumor antigens include, for example, a glioma-associated antigen, carcinoembryonic antigen (CEA) , β-human chorionic gonadotropin, alpha-fetoprotein (AFP) , lectin-reactive AFP, thyroglobulin, RAGE-1, MN-CAIX, human telomerase reverse transcriptase, RU1, RU2 (AS) , intestinal carboxyl esterase, mut hsp70-2, M-CSF, prostase, prostate-specific antigen (PSA) , PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, prostein, PSMA, HER2 / neu, survivin, telomerase, prostate-carcinoma tumor antigen-1 (PCTA-1) , MAGE, ELF2M, neutrophil elastase, ephrinB2, CD22, insulin growth factor (IGF) -I, IGF-II, IGF-I receptor and mesothelin.

[0126] The tumor antigen can comprise one or more antigenic cancer epitopes associated with a malignant tumor. Malignant tumors express a number of proteins that can serve as target antigens for an immune attack. These molecules include but are not limited to tissue-specific antigens such as MART-1, tyrosinase and gp100 in melanoma and prostatic acid phosphatase (PAP) and prostate-specific antigen (PSA) in prostate cancer. Other target molecules belong to the group of transformation-related molecules such as the oncogene HER2 / Neu / ErbB-2. Yet another group of target antigens are onco-fetal antigens such as carcinoembryonic antigen (CEA) . In B-cell lymphoma the tumor-specific idiotype immunoglobulin constitutes a truly tumor-specific immunoglobulin antigen that is unique to the individual tumor. B cell differentiation antigens such as CD19, CD20 and CD37 are other candidates for target antigens in B-cell lymphoma.

[0127] The tumor antigen can be a tumor-specific antigen (TSA) or a tumor-associated antigen (TAA) . A TSA is unique to tumor cells and does not occur on other cells in the body. A tumor associated antigen (TAA) is not unique to a tumor cell, and instead is also expressed on a normal cell under conditions that fail to induce a state of immunologic tolerance to the antigen. The expression of the antigen on the tumor can occur under conditions that enable the immune system to respond to the antigen. TAAs can be antigens that are expressed on normal cells during fetal development, when the immune system is immature, and unable to respond or they can be antigens that are normally present at extremely low levels on normal cells, but which are expressed at much higher levels on tumor cells.

[0128] Non-limiting examples of TSA or TAA antigens include the following: Differentiation antigens such as MART-1 / MelanA, gp 100 (Pmel 17) , tyrosinase, TRP-1, TRP-2 and tumor-specific multilineage antigens such as MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; overexpressed embryonic antigens such as CEA; overexpressed oncogenes and mutated tumor-suppressor genes such as p53, Ras, HER2 / neu; unique tumor antigens resulting from chromosomal translocations; such as BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; and viral antigens, such as the Epstein Barr virus antigens EBVA and the human papillomavirus (HPV) antigens E6 and E7. Other large, protein-based antigens include TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB3, c-Met, nm-23HI, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-Catenin, CDK4, Mum-1, p15, p16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alpha-fetoprotein, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOv18, NB / 70K, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, 90K\Mac-2 binding protein\cyclophilin C-associated protein, TAAL6, TAG72, TLP, and TPS.

[0129] Nucleic acids encoding the engineered receptor (e.g., CAR)

[0130] The present disclosure provides nucleic acids encoding the engineered receptor (e.g., CAR, TCR) described herein. The nucleic acids described herein can be used to transfect or transduce cells to make the cells express the engineered receptor described herein.

[0131] A nucleic acid of the present disclosure can be operably linked to a transcriptional control element, e.g., a promoter, and enhancer, etc.

[0132] An EF1α promoter, a CMV promoter, or a PGK promoter can be used. The promoter may be a CD8 cell-specific promoter, a CD4 cell-specific promoter, a neutrophil-specific promoter, or an NK-specific promoter. For example, a CD4 gene promoter can be used; see, e.g., Salmon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 7739; and Marodon et al. (2003) Blood 101: 3416. As another example, a CD8 gene promoter can be used. NK cell-specific expression can be achieved by use of an NcrI (p46) promoter; see, e.g., Eckelhart et al. Blood (2011) 117: 1565.

[0133] Other examples of suitable promoters include the immediate early cytomegalovirus (CMV) promoter sequence. This promoter sequence is a strong constitutive promoter sequence capable of driving high levels of expression of any nucleic acid sequence operatively linked thereto. Other constitutive promoter sequences can also be used, including, but not limited to a simian virus 40 (SV40) early promoter, a mouse mammary tumor virus (MMTV) or human immunodeficiency virus (HIV) long terminal repeat (LTR) promoter, a MoMuLV promoter, an avian leukemia virus promoter, an Epstein-Barr virus immediate early promoter, a Rous sarcoma virus promoter, the EF-1 alpha promoter, as well as human gene promoters such as, but not limited to, an actin promoter, a myosin promoter, a hemoglobin promoter, and a creatine kinase promoter. Further, the disclosure should not be limited to the use of constitutive promoters. Inducible promoters are also contemplated as part of the disclosure. The use of an inducible promoter provides a molecular switch capable of turning on expression of the nucleic acid sequence which it is operatively linked when such expression is desired, or turning off the expression when expression is not desired. Examples of inducible promoters include, but are not limited to a metallothionine promoter, a glucocorticoid promoter, a progesterone promoter, and a tetracycline promoter.

[0134] The nucleic acid of the present disclosure may be provided for the production of a CAR or a TCR described herein (e.g., in a mammalian cell) . The nucleic acid of the present disclosure may also provide for amplification of the nucleic acid.

[0135] A vector, for example an expression vector (e.g., an adenoviral vector, a lentiviral vector) can be used to introduce the nucleic acid described herein into an immune cell (e.g., macrophage) or precursor thereof. The vector (e.g., an adenoviral vector) of the present disclosure may comprise one or more nucleic acids encoding for the engineered receptor described herein. The vector (e.g., adenoviral vector) may comprise additional elements that will aid in the functional expression of the CAR described herein. The expression vector may comprise a mammalian promoter. The vector may comprise an elongation-factor-1-alpha promoter (EF-1α promoter) . The use of an EF-1α promoter may increase the efficiency in expression of downstream transgenes (e.g., a CAR encoding nucleic acid) . Physiologic promoters (e.g., an EF-1α promoter) may be less likely to induce integration mediated genotoxicity, and may abrogate the ability of the retroviral vector to transform stem cells. Other physiological promoters suitable for use in a vector (e.g., adenoviral vector) can be incorporated into a vector of the present disclosure. The vector (e.g., adenoviral vector) may comprise a non-requisite cis acting sequence that can improve titers and gene expression.

[0136] The nucleic acid can encode a naked CAR. The nucleic acid can comprise from the 5' end to the 3' end, a signal peptide, an extracellular antigen binding domain, optionally a hinge domain, a CLEC5A transmembrane domain, a CLEC5A intracellular signaling domain.

[0137] Engineered cells

[0138] One aspect of the present disclosure provides engineered cells (e.g., macrophages) containing the engineered receptor (e.g., CAR) described herein. The engineered receptor (e.g., CAR) may redirect the specificity of the engineered cells. CAR expression may be induced through electroporation of engineered cells for the insertion of genetic material, or by infecting these cells with viral vectors, such as lentiviruses or retroviruses containing the desired genetic material. Such genetic editing may improve the potency of the engineered cells by improving homing, cytokine production, recycle killing, and / or improved engraftment.

[0139] The engineered cells may be engineered immune effector cells (e.g., macrophages) made by the methods described herein. The engineered immune effector cells may be engineered to express the CAR described herein. The engineered immune effector cells can exhibit antitumor properties. The engineered cells (e.g., macrophages) may be transformed with nucleic acids encoding the CAR so that the CAR is expressed on the cell surface. The cells (e.g., macrophages) may be transduced with a viral vector encoding the CAR. The viral vector may be a retroviral vector. The viral vector may be an adenoviral vector. The viral vector may be a lentiviral vector. The engineered cells may stably express the CAR. The engineered cells (e.g., macrophages) may be transfected or transduced with a nucleic acid, for example, mRNA, cDNA, or DNA, encoding a CAR.

[0140] The cells may be immune cells, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) , hematopoietic stem cells, pluripotent stem cells, or embryonic stem cells. The cells may be immune cells. The cells may be selected from a group consisting of macrophages, T cells, αβT cells, γδT cells, NK cells, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) , hematopoietic stem cells, pluripotent stem cells, embryonic stem cells, and a combination thereof. The cells may be T cells. The cells may be NK cells. The cells may be αβ T cells. The cells may be γδ T cells. The cells may be Vδ1 T cells. The cells may be macrophages. The cells may be M0, M1, or M2 macrophages.

[0141] The engineered cells may be autologous cells, syngeneic cells, allogeneic cells, or xenogeneic cells with respect to the individual receiving them. The engineered cells may be modified by changing the major histocompatibility complex (MHC) profile, by inactivating β2-microglobulin to prevent the formation of functional Class I MHC molecules, or by inactivating Class II MHC molecules. The engineered cells may be autologous cells obtained from the human subject receiving them. The engineered cells may be autologous cells obtained from the human subject receiving them.

[0142] The engineered cells described herein may include eukaryotic cells, e.g., mammalian cells. The engineered cells may be human cells. The engineered cells may be equine, bovine, murine, ovine, canine, or feline cells.

[0143] To evaluate the CAR positive rate (CAR+%) of the engineered cells, the engineered cells may be subjected to a flow cytometry analysis (e.g., following the methods described in Example 4) . The engineered cells may have a CAR positive rate of more than 15%, more than 20%, more than 25%, more than 30%, more than 35%, more than 40%, more than 45%, more than 50%, more than 55%, more than 60%, more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, or more than 90%. The engineered cells may have a CAR positive rate of more than 30-40%.

[0144] The viability of the cells can be determined (e.g., following the methods in Example 5) . The cells may have a viability rate that is comparable to untreated cells. Comparing to untransduced cells, the cells prepared by the methods described herein may have a comparable or a higher viability rate. Comparing to untransduced cells, the cells prepared by the methods described herein may have a viability rate that is higher by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 10, 00%.

[0145] The cytotoxicity of the engineered cells against tumor cells may be evaluated in a cell killing assay, where the engineered cells are co-cultured with tumor cells (e.g., following the methods in Example 6) . The effector cell: target cell (E: T) ratio may be 9: 1, 3: 1, 1: 1, 1: 3, or 1: 9. The engineered cells (e.g., macrophages) may be co-cultured with target cells for at least or about 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 12 hours, 16 hours, 18 hours, 1 day, 2 days, 3 days, or longer. The in vitro cytotoxicity of the engineered immune cells, as measured by killing percentage, may be at least 15%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, or at least 95%. The in vitro cytotoxicity of the engineered immune cells, as measured by killing percentage, may be below 15%, below 20%, below 30%, below 40%, below 50%, below 60%, below 70%, below 80%, below 90%, below 95%. The in vitro cytotoxicity of the engineered immune cells, as measured by killing percentage, may be about 40%-90%, about 40%-80%, or about 50%-80%. The cytotoxicity may be specific for the target cells that express a target antigen specifically recognized by the engineered cells. The engineered cells may induce little or background cytotoxicity against target cells which do not express the target antigen. Comparing to untransduced cells (UnT) , the in vitro cytotoxicity of the engineered cells may be higher by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 10, 00%.

[0146] The engineered cells can secrete cytokines (e.g., IL6 and / or TNF-α) in a cytokine release assay (e.g., following the methods described in Example 7) , where the engineered cells are co-cultured with tumor cells (e.g., SK-BR-3 cells) . The effector cell: target cell (E: T) ratio may be 9: 1, 3: 1, 1: 1, 1: 3, or 1: 9. The engineered cells (e.g., macrophages) may be co-cultured with target cells for at least or about 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 12 hours, 16 hours, 18 hours, 1 day, 2 days, 3 days, or longer. The engineered cells may secrete an amount of IL6 that is more than 5 pg / ml, more than 10 pg / ml, more than 20 pg / ml, more than 50 pg / ml, more than 100 pg / ml, more than 200 pg / ml, more than 300 pg / ml, more than 400 pg / ml, more than 500 pg / ml, or more than 1000 pg / ml, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells. The engineered cells secrete an amount of IL6 that is less than 5 pg / ml, less than 10 pg / ml, less than 20 pg / ml, less than 50 pg / ml, less than 100 pg / ml, less than 200 pg / ml, less than 300 pg / ml, less than 400 pg / ml, less than 500 pg / ml, or less than 1000 pg / ml, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells. The engineered cells may secrete an amount of IL6 that is 0-20 pg / ml, 5-50 pg / ml, or 0-50 pg / ml, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells. Comparing to untransduced cells, the secretion of IL6 of the engineered cells may be higher by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 10, 00%, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells.

[0147] The engineered cells may secrete an amount of TNFα that is more than 5 pg / ml, more than 10 pg / ml, more than 20 pg / ml, more than 30 pg / ml, more than 40 pg / ml, more than 50 pg / ml, more than 60 pg / ml, more than 70 pg / ml, more than 80 pg / ml, more than 90 pg / ml, or more than 100 pg / ml, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells. The engineered cells may secrete an amount of TNFα that is less than 5 pg / ml, less than 10 pg / ml, less than 20 pg / ml, less than 30 pg / ml, less than 40 pg / ml, less than 50 pg / ml, less than 60 pg / ml, less than 70 pg / ml, less than 80 pg / ml, less than 90 pg / ml, or less than 100 pg / ml, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells. The engineered cells may secrete an amount of TNFα that is 0-20 pg / ml, 5-50 pg / ml, or 0-50 pg / ml, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells. Comparing to untransduced cells, the secretion of TNFα of the engineered cells may be higher by more than 5%, more than 10%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60%, more than 70%, more than 80%, more than 90%, more than 100%, more than 150%, more than 200%, more than 250%, more than 300%, more than 400%, more than 500%, more than 600%, more than 700%, more than 800%, more than 900%, or more than 1000%, after 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, or 12 days of co-culture with tumor cells.

[0148] A detailed review of engineered cells (e.g. macrophages) can be found, e.g., in Yang, Shuaixi, et al. "Advances in engineered macrophages: a new frontier in cancer immunotherapy. " Cell Death &Disease 15.4 (2024) : 238, which is incorporated by reference in its entirety.

[0149] Methods of treatment

[0150] The engineered cells described herein can be used in a variety of experimental, therapeutic and commercial applications.

[0151] In one aspect, the disclosure provides a pharmaceutical composition comprising the engineered cells and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0152] CAR-M (Chimeric Antigen Receptor Macrophage) therapy is a cutting-edge immunotherapy that genetically engineers a patient's own macrophages, a type of immune cell, to recognize and destroy cancer cells, especially in solid tumors, by introducing a specific CAR receptor, turning these powerful "garbage collectors" into targeted cancer killers that also activate broader immune responses. This personalized treatment involves isolating monocytes from the patient, modifying them in the lab with the CAR, and then reinfusing them to attack tumors, showing promise in clinical trials for solid cancers by reprogramming the tumor environment.

[0153] In one aspect, the disclosure provides a method of treating a disease or disorder in a subject (e.g., human subject) , the method comprising administering to the subject, an effective amount of the engineered cell described herein, or the pharmaceutical composition described herein. The disease or disorder may be cancer, an autoimmune disease, a tumor, or an infection.

[0154] The disease or disorder may be solid tumor. “Solid tumor” refers to an abnormal mass of tissue that usually does not contain cysts or liquid areas. Solid tumors may be benign (not cancer) , or malignant (cancer) . Different types of solid tumors are named for the type of cells that form them. Examples of solid tumors are sarcomas, carcinomas, and lymphomas. Leukemias (cancers of the blood) generally do not form solid tumors.

[0155] In one aspect, the disclosure provides a method of modulating an immune response comprising administering an effective amount of engineered cells described herein to a subject in need thereof.

[0156] The term “effective amount” as used herein means an amount effective, at dosages and for periods of time necessary to achieve the desired results.

[0157] In another aspect, the present disclosure provides a method for treating a disease or disorder by administering an effective amount of engineered cells described herein to a subject in need thereof. The disease or disorder may be infectious disease, autoimmune disease, or tumor. The cancer may be hematological cancer or solid tumor. Examples of cancer that can be treated include, but are not limited to, acute myeloid leukemia (AML) , B-cell acute lymphoid leukemia (BALL) , T-cell acute lymphoid leukemia (TALL) , acute lymphoid leukemia (ALL) , chronic myelogenous leukemia (CML) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) , multiple myeloma (MM) , myelodysplastic syndrome (MDS) , myeloproliferative neoplasms (MPNs) , chronic myeloid leukemia (CML) , and blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN) , breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, melanoma, oral cancer, mesothelioma, ovarian cancer, colorectal cancer, gastric cancer, cervical cancer, brain cancer, skin cancer, lymphoma, epithelial neoplasms, soft tissue sarcoma, esophageal cancers, or CNS tumors.

[0158] The disclosure further includes the use of the engineered cells described herein in the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition to modulate an immune response, to treat an infection or to treat cancer as described hereinabove.

[0159] The engineered cells can also be used in experimental models, for example, to further study and elucidate the function of the cells.

[0160] One or more of the engineered cells described herein can be administered to a subject in a single, unified form, such as an intravenous injection, or in multiple forms, for example, as multiple intravenous infusions or injections, or subcutaneous injections. The engineered cells may expand within a subject's body, in vivo, after administration to a subject. The engineered cells can be frozen to provide cells for multiple treatments with the same cell preparation. The engineered cells of the disclosure, and pharmaceutical compositions comprising the same, can be packaged as a kit. A kit can include instructions (e.g., written instructions) on the use of the engineered cells and compositions comprising the same.

[0161] A method of treatment can comprise administering to a subject a therapeutically effective amount of the engineered cells. The therapeutically effective amount of the engineered cells may be administered for at least 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, or 1 year. The therapeutically effective amount of the engineered cells may be administered for at least one week. The therapeutically effective amount of the engineered cells may be administered for at least two weeks.

[0162] The engineered cells described herein can be administered before, during, or after the occurrence of a disease or condition, and the timing of administering the engineered cells can vary. For example, the engineered cells can be used as a prophylactic and can be administered continuously to subjects with a propensity to conditions or diseases in order to lessen a likelihood of the occurrence of the disease or condition. The engineered cells can be administered to a subject during or as soon as possible after the onset of the symptoms. The administration of the engineered cells can be initiated immediately within the onset of symptoms, within the first 3 hours of the onset of the symptoms, within the first 6 hours of the onset of the symptoms, within the first 24 hours of the onset of the symptoms, within 48 hours of the onset of the symptoms, or within any period of time from the onset of symptoms. The initial administration can be via any route practical (e.g., intravenous infusions or injections) , such as by any route described herein using any formulation described herein. The administration of the engineered cells of the disclosure may be an intravenous administration. One or multiple dosages of the engineered cells can be administered as soon as is practicable after the onset of a cancer or an infectious disease, and for a length of time necessary for the treatment of the disease, such as, for example, from about 24 hours to about 48 hours, from about 48 hours to about 1 week, from about 1 week to about 2 weeks, from about 2 weeks to about 1 month, from about 1 month to about 3 months. For the treatment of cancer, one or multiple dosages of the engineered cells can be administered years after onset of the cancer and before or after other treatments. The engineered cells can be administered for at least about 10 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, at least 48 hours, at least 72 hours, at least 96 hours, at least 1 week, at least 2 weeks, at least 3 weeks, at least 4 weeks, at least 1 month, at least 2 months, at least 3 months, at least 4 months, at least 5 months, at least 6 months, at least 7 months, at least 8 months, at least 9 months, at least 10 months, at least 11 months, at least 12 months, at least 1 year, at least 2 years at least 3 years, at least 4 years, or at least 5 years. The length of treatment can vary for each subject.

[0163] Methods for administration of engineered cells for adoptive cell therapy are known and can be used in connection with the provided methods and compositions. For example, adoptive T cell therapy methods are described, e.g., in US Patent Application Publication No. 2003 / 0170238 to Gruenberg et al; US Patent No. 4, 690, 915 to Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8 (10) : 577-85) . See, e.g., Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31 (10) : 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1) : 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8 (4) : e61338. The cell therapy, e.g., adoptive T cell therapy can be carried out by autologous transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from the subject who is to receive the cell therapy, or from a sample derived from such a subject. Thus, the cells may be derived from a subject, e.g., patient, in need of a treatment and the cells, following isolation and processing are administered to the same subject.

[0164] The cell therapy can be carried out by allogeneic transfer, in which the cells are isolated and / or otherwise prepared from a subject other than a subject who is to receive or who ultimately receives the cell therapy, e.g., a first subject. The cells then may be administered to a different subject, e.g., a second subject, of the same species. The first and second subjects may be genetically identical. The first and second subjects may be genetically similar. The second subject may express the same HLA class or supertype as the first subject.

[0165] The subject (e.g., human subject) may have been treated with a therapeutic agent targeting the disease or condition, e.g., the tumor, prior to administration of the cells or composition containing the cells. The subject may be refractory or non-responsive to the other therapeutic agent. The subject may have persistent or relapsed disease, e.g., following treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) , e.g., allogenic HSCT. The administration may effectively treat the subject despite the subject having become resistant to another therapy.

[0166] The subject may be responsive to the other therapeutic agent, and treatment with the therapeutic agent reduces disease burden. The subject may be initially responsive to the therapeutic agent, but exhibits a relapse of the disease or condition over time. The subject may have not relapsed. The subject may be determined to be at risk for relapse, such as at a high risk of relapse, and thus the cells are administered prophylactically, e.g., to reduce the likelihood of or prevent relapse. The subject may has not received prior treatment with another therapeutic agent.

[0167] The subject may have persistent or relapsed disease, e.g., following treatment with another therapeutic intervention, including chemotherapy, radiation, and / or hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) , e.g., allogenic HSCT. The administration may effectively treat the subject despite the subject having become resistant to another therapy.

[0168] The engineered cells described herein can be administered to an animal, such as a mammal, even more a human, to treat a cancer. In addition, the engineered cells can be used for the treatment of any condition related to a cancer, especially a cell-mediated immune response against a tumor cell (s) , where it is desirable to treat or alleviate the disease.

[0169] The engineered cells (e.g., macrophages) described herein can be included in a composition for immunotherapy. The composition can include a pharmaceutical composition and further include a pharmaceutically acceptable carrier. A therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition comprising the engineered cells can be administered.

[0170] The engineered cells can be immediately used in the above therapeutic, experimental or commercial applications or the cells can be cryopreserved for use at a later date. The pharmaceutical compositions can be included in a container, pack, or dispenser together with instructions for administration.

[0171] The engineered cells disclosed herein can be formulated in unit dosage forms suitable for single administration of precise dosages. The unit dosage forms may comprise additional lymphocytes. In unit dosage form, the formulation is divided into unit doses containing appropriate quantities of one or more compounds. The unit dosage can be in the form of a package containing discrete quantities of the formulation. Non-limiting examples are packaged tablets or capsules, and powders in vials or ampoules. Aqueous suspension compositions can be packaged in single-dose non-reclosable containers. Multiple-dose reclosable containers can be used, for example, in combination with a preservative or without a preservative. The pharmaceutical composition may not comprise a preservative. Formulations for parenteral injection can be presented in unit dosage form, for example, in ampoules, or in multi-dose containers with a preservative.

[0172] EXAMPLES

[0173] The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

[0174] Example 1: Plasmid Construction

[0175] CAR constructs were cloned into the first-generation E1 / E3 deleted adenoviral backbone using standard molecular biology techniques.

[0176] CAR-M01-HER2 construct (FIG. 2) comprises a human C-type lectin domain family 5 member A isoform1 (CLEC5A) intracellular domain (CLEC5A ICD) , a CLEC5A transmembrane domain (CLEC5A TM) , a reverse CD8 hinge (C to N CD8 hinge) and an anti-HER2 scFv under the control of an EF1α promoter, a CMV promoter, or a PGK promoter.

[0177] CAR-M02-HER2 construct (FIG. 2) comprises a human C-type lectin domain family 5 member A isoform1 (CLEC5A) intracellular domain (CLEC5A ICD) , a CLEC5A transmembrane domain (CLEC5A TM) , a CLEC5A extracellular truncated domain (CLEC5A truncated) , a (GGGGS) 2 linker and an anti-HER2 scFv under the control of an EF1α promoter, a CMV promoter, or a PGK promoter.

[0178] CAR-M03-HER2 construct (FIG. 2) comprises a human C-type lectin domain family 5 member A isoform1 (CLEC5A) intracellular domain (CLEC5A ICD) , a CLEC5A transmembrane domain (CLEC5A TM) , a CLEC5A extracellular domain (CLEC5A ECD) , a (GGGGS) 2 linker and anti-HER2 scFv under the control of an EF1α promoter. a CMV promoter, or a PGK promoter.

[0179] CAR-M01-BCMA construct (FIG. 2) comprises a human C-type lectin domain family 5 member A isoform1 (CLEC5A) intracellular domain (CLEC5A ICD) , a CLEC5A transmembrane domain (CLEC5A TM) , a reverse CD8 hinge (C to N CD8 hinge) , and an anti-BCMA scFv under the control of an EF1α promoter. a CMV promoter, or a PGK promoter.

[0180] CAR-M02-BCMA construct (FIG. 2) comprises a human C-type lectin domain family 5 member A isoform1 (CLEC5A) intracellular domain (CLEC5A ICD) , a CLEC5A transmembrane domain (CLEC5A TM) , a CLEC5A extracellular truncated domain (CLEC5A truncated) , a (GGGGS) 2 linker and anti-BCMA scFv under the control of an EF1α promoter. a CMV promoter, or a PGK promoter.

[0181] CAR-M03-BCMA construct (FIG. 2) comprises a human C-type lectin domain family 5 member A isoform1 (CLEC5A) intracellular domain (CLEC5A ICD) , a CLEC5A transmembrane domain (CLEC5A TM) , a CLEC5A extracellular domain (CLEC5A ECD) , a (GGGGS) 2 linker, and an anti-BCMA scFv under the control of an EF1α promoter. a CMV promoter, or a PGK promoter.

[0182] Example 2: Ad5f35 Adenovirus Production

[0183] For Ad5f35 adenovirus production, CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2, CAR-M01-BCMA, CAR-M02-BCMA and CAR-M03-BCMA were cloned into pAd5f35. All cloning steps were validated by restriction enzyme digestion and sequencing. pAd5f35 is a first-generation E1 / E3 deleted adenoviral backbone. Ad5f35-CAR-M01-HER2, Ad5f35-CAR-M02-HER2, Ad5f35-CAR-M03-HER2, Ad5f35-CAR-M01-BCMA, Ad5f35-CAR-M02-BCMA and Ad5f35-CAR-M03-BCMA were generated, expanded, concentrated and purified using standard techniques in HEK293A cells. Adenoviral titer was determined using Adeno-XTM Rapid Titer Kit (Clontech 632250) and validated by functional transgene expression in human macrophages.

[0184] Example 3: Adenoviral Transduction of Human Macrophages

[0185] Monocytes enriched fractions from PBMCs were pooled and subjected to STEMCELL human monocyte enrichment kit without CD16 depletion (Negative selection) (Stemcell Technologies 19058) according to the manufacturer’s instructions. The pre-selection and post-selection (positive and negative fraction) purity was tested using flow cytometry. Selected human monocytes were seeded in Cell dishes in RPMI1640 with 10%FBS, penicillin, streptomycin, 10 ng / ml recombinant human GM-CSF (UA. BIO UA040002) for 7 days for monocytes-derived macrophages (MDMs) induction. Selected human monocytes were seeded in Cell dishes in RPMI1640 with 10%FBS, penicillin, streptomycin, and 50 ng / ml recombinant human MCSF (Stemcell 78057) for 7 days for Monocytes-derived M0 macrophages (M0) induction. Selected human monocytes were seeded in Cell dishes in RPMI1640 with 10%FBS, penicillin, streptomycin, and 50 ng / ml recombinant human MCSF (Stemcell 78057) for 6 days, then supplemented 50 ng / mL recombinant human IFN-γ (Stemcell 78020) for 24hrs for Monocytes-derived M1 macrophages (M1) induction. Selected human monocytes were seeded in Cell dishes in RPMI1640 with 10%FBS, penicillin, streptomycin, and 50 ng / ml recombinant human MCSF (Stemcell 78057) for 6 days, then supplemented 25 ng / mL recombinant human IL-10 (Stemcell 78024) for 24hrs for Monocytes-derived M2 macrophages (M2) induction. Differentiation was monitored by light microscopy.

[0186] Differentiated macrophages were transduced with Ad5f35 adenovirus on day 7 at an MOI of 1000: 1. Differentiated macrophages were harvested at day 9, cell viability after Ad5f35 adenovirus transduction was detected by a cell counter, and CAR expression was detected by flow cytometry.

[0187] Example 4: CAR-M-HER2 Macrophage Expression

[0188] To assess expression of chimeric antigen receptors targeting HER2, adenoviral transduced macrophages were harvested. APC Labeled Human HER2 protein (Acro HE2-HA2H9) was added to the cells and the cells were incubated for 30 minutes. The cells were then spun down at 300×g for 5 minutes and the supernatant was removed. DAPI solution (1: 200 diluted in PBS) was added to the cells and the cells were incubated for 5 minutes. CAR expression was determined through flow cytometry measuring DAPI-APC+ cells. Cells expressing the CAR were brighter in the APC channel than adenoviral un-transduced control cells (UTD) . The CAR expression data are shown in FIG. 3. CAR-M01-HER2 transduced cells were 30.7%CAR positive. CAR-M02-HER2 transduced cells were 45%CAR positive. CAR-M03-HER2 transduced cells were 44.1%CAR positive.

[0189] Example 5: CAR-M-HER2 Macrophage Viability

[0190] After Ad5f35-CAR virus transduction, viability of CAR-M transduced cells was evaluated. The GM-CSF (10ng / mL) (UA. BIO #UA040002) induced macrophages (MDMs) were transduced with Ad5f35 adenovirus encoding the exemplary chimeric antigen receptors targeting HER2.48hrs after Ad5f35 adenovirus transduction, macrophages were digested by enzyme free cell dissociation solution PBS based (1×) liquid (Sigma-Aldrich #S-014-B) . Macrophages were spun down, and supernatant was discarded. Macrophages were resuspended in RPMI1640 with 10%FBS medium. The viability of untransduced and transduced macrophages was evaluated by a cell counter. The cell viability data is shown in FIG. 4. The viability percentages of untransduced (UTD) and transduced macrophages (CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2) were about 85%-91%.

[0191] Example 6: Cell Killing of CAR-M-HER2 Macrophages against Tumor Cells

[0192] The cell killing effects of human macrophages expressing exemplary chimeric antigen receptors against tumor cells were assessed. Human macrophages were transduced with Ad5f35 adenovirus encoding the exemplary chimeric antigen receptors targeting HER2. The untransduced and transduced macrophages were cultured with the CFSE-labeled HER2-Positive SK-BR-3 cells at different effector to target ratios (E: T) from 9: 1 to 1: 9 for 48hrs. The cells were spun down, and the supernatant was discarded. Cells were digested by enzyme free cell dissociation solution PBS based (1x) liquid (Sigma-Aldrich #S-014-B) . The cells were spun down, and supernatant was discarded. The cells were stained with live dead staining, and analyzed by flow cytometry (on a CytoFLEX LX flow cytometer) . Cell killing percentage was calculated as: Killing (%) = (1-CFSE+Live+ counts (CAR-M)  / CFSE+Live+ counts (UTD) ) ×100.

[0193] The CAR-M mediated SK-BR-3 killing data are shown in FIG. 5. CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2, and CAR-M03-HER2 mediated SK-BR-3 killing at 48hrs in a dose dependent manner. The maximum killing percentage was over 90%for all three HER2 targeting CAR-M expressing cells. Example 7: CAR-M-HER2 Macrophage Cytokine Secretion

[0194] For assessment of cytokine secretion, Human macrophages were transduced with Ad5f35 adenovirus encoding the exemplary chimeric antigen receptors targeting HER2. The untransduced and transduced macrophages were cultured with the CFSE-labeled HER2-Positive SK-BR-3 cells at different effector to target ratios (E: T) from 9: 1 to 1: 9 for 48hrs. Supernatant were recovered for TNFαand IL6 detection by ELISA, using ELISA MAXTM Deluxe Set Human TNFα kit (Biolegend 430204) and ELISA MAXTM Deluxe Set Human IL-6 kit (Biolegend 430504) . Supernatant cytokine levels of UTD, CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2 transduced cells are shown in FIGS. 6A-6B. Almost no TNFα and IL6 secretion was observed after CAR-M expressing cells (UTD, CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2) were co-cultured with CFSE-labeled HER2-Positive SK-BR-3 cells at different effector to target ratios (E: T) from 9: 1 to 1: 9 for 48hrs.

[0195] Example 8: CAR-M-HER2 M0, M1, M2 Macrophage Expression

[0196] To assess expression of chimeric antigen receptors targeting HER2, adenoviral transduced M0, M1, M2 macrophages were harvested. APC Labeled Human HER2 protein (Acro HE2-HA2H9) was added to the cells and the cells were incubated for 30 minutes. The cells were then spun down at 300 xg for 5 minutes and the supernatant was removed. DAPI solution (1: 200 diluted in PBS) was added to the cells and the cells were incubated for 5 minutes. CAR expression was determined through flow cytometry measuring DAPI-APC+ cells. Cells expressing the CAR were brighter in the APC channel than adenoviral un-transduced control cells (UTD) . The CAR expression data is shown in FIG. 7. CAR expressions of transduced M0 macrophages (CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2) were about 66%-76%. CAR expressions of transduced M1 macrophages (CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2) were about 37%-78%. CAR expressions of transduced M2 macrophages (CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2) were about 62%-78%.

[0197] Example 9: CAR-M-HER2 M0, M1, M2 Macrophage Viability

[0198] After Ad5f35-CAR virus transduction, the viability of M0, M1 and M2 macrophages was evaluated. Monocyte enriched fractions were pooled and subjected to STEMCELL human monocyte enrichment kit without CD16 depletion (Negative selection) (Stemcell Technologies 19058) . The pre-selection and post-selection (positive and negative fraction) purity was tested using flow cytometry. Selected human monocytes were seeded in Cell dishes in RPMI1640 with 10%FBS, penicillin, streptomycin, and 50 ng / ml recombinant human MCSF (Stemcell 78057) for 7 days for Monocytes-derived M0 macrophages (M0) induction. Selected human monocytes were seeded in Cell dishes in RPMI1640 with 10%FBS, penicillin, streptomycin, and 50 ng / ml recombinant human MCSF (Stemcell 78057) for 6 days, then supplemented 50 ng / mL recombinant human IFN-γ (Stemcell 78020) for 24hrs for Monocytes-derived M1 macrophages (M1) induction. Selected human monocytes were seeded in Cell dishes in RPMI1640 with 10%FBS, penicillin, streptomycin, and 50 ng / ml recombinant human MCSF (Stemcell 78057) for 6 days, then supplemented 25 ng / mL recombinant human IL-10 (Stemcell 78024) for 24hrs for Monocytes-derived M2 macrophages (M2) induction. Differentiation was monitored by light microscopy. Differentiated macrophages were transduced with Ad5f35 adenovirus on day 7 at an MOI of 1000: 1. Differentiated macrophages were harvested at day 9, and cell viability after Ad5f35 adenovirus transduction was detected by a cell counter. The cell viability data is shown in FIG. 8. The viability percentages of untransduced (UTD) and transduced M0 macrophages (CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2) were about 94%-96%. The viability percentages of transduced M1 macrophages (CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2) were about 78%-91%. The viability percentages of transduced M2 macrophages (CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2) were about 92%-96%.

[0199] Example 10: Cell Killing of CAR-M-HER2 M0, M1, M2 Macrophage on Tumor Cells

[0200] The cell killing effects of M0, M1 and M2 macrophages expressing exemplary chimeric antigen receptors against tumor cells were assessed. M0, M1 and M2 macrophages were transduced with Ad5f35 adenovirus encoding the exemplary chimeric antigen receptors targeting HER2. The untransduced and transduced macrophages were cultured with the CFSE-labeled HER2-Positive SK-BR-3 cells at different effector to target ratios (E: T) 3: 1 and 9: 1 for 48hrs or 72hrs. The cells were spun down, and supernatant was discarded. Cells were digested by enzyme free cell dissociation solution PBS based (1×) liquid (Sigma-Aldrich #S-014-B) . Cells were spun down, and supernatant was discarded. Cells were stained with live dead staining, and analysis by flowcytometry. Cell killing percentage was calculated as: Killing (%) = (1-CFSE+Live+ counts (CAR-M)  / CFSE+Live+ counts (UTD) ) ×100.

[0201] The CAR-M mediated SK-BR-3 killing effects are shown in FIGS. 9A-9F. At effector to target ratios (E: T) 3: 1 and 9: 1 for 48hrs or 72hrs, M0 macrophages (CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2) , M1 macrophages (CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2) , and M2 macrophages (CAR-M01-HER2, CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2) all showed CAR-M mediated SK-BR-3 killing effects. At effector to target ratios (E: T) 3: 1 for 48hrs, the killing percentage was over 70%for CAR-M01 HER2 targeting M0 and M2 macrophages. The killing percentage was over 98%for CAR-M02 HER2 targeting M0, M1 and M2 macrophages. The killing percentage was over 92%for CAR-M03 HER2 targeting M0 and M2 macrophages. At effector to target ratios (E: T) 9: 1 for 72hrs, the killing percentage was over 98%for CAR-M01 HER2 targeting M0 and M2 macrophages. The killing percentage was over 93%for CAR-M02 HER2 targeting M0, M1 and M2 macrophages. The killing percentage was over 98%for CAR-M03 HER2 targeting M0, M1 and M2 macrophages.

[0202] Example 11: Serial Killing Effects of CAR-M-HER2 M0, M1, M2 Macrophage on Tumor Cells

[0203] M0, M1, M2 macrophages were transduced with Ad5f35 adenovirus encoding the exemplary chimeric antigen receptors targeting HER2. The untransduced and transduced macrophages were cultured with the CFSE-labeled HER2-Positive SK-BR-3 cells at effector to target ratio E: T=9: 1 (CAR+: 1.8E5, SK-BR-3: 2E4) for 72hrs. Then CTV-labeled HER2-Positive SK-BR-3 cells (SK-BR-3: 2E4) were added and cultured for 72hrs. Then CFSE-labeled HER2-Positive SK-BR-3 cells (SK-BR-3: 2E4) were added and cultured for 72hrs. 3 rounds of killing were tested. Every 72hrs, Live CFSE or CTV-labeled HER2-Positive SK-BR-3 cells counts were tested by flow cytometry. The following equation was used for calculation of cell killing percentages: Killing (%) = (1-CFSE (or CTV) +Live+ counts (CAR-M)  / CFSE (or CTV) +Live+ counts (UTD) ) ×100.

[0204] The CAR-M mediated SK-BR-3 serial killing effects are shown in FIGS. 10A-10B. At effector to target ratios (E: T) 9: 1 for 3 rounds killing, M0 macrophages (CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2) , M1 macrophages (CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2) , M2 macrophages (CAR-M02-HER2, CAR-M03-HER2) showed the specific and potent serial killing against CFSE or CTV-labeled HER2-Positive SK-BR-3 cells. For the CAR-M02-HER2 construct, M0, M1 and M2 macrophages showed similar killing efficacies (over 60%killing at the 3rd round) . For the CAR-M03-HER2 construct, M2 macrophages (over 90%killing at the 3rd round) showed superior killing efficacy than M0 macrophages (about 84%killing at the 3rd round) and M1 macrophages (about 66%killing at the 3rd round) .

[0205] Example 12: CAR-M-BCMA Macrophage Expression

[0206] To assess expressions of chimeric antigen receptors targeting BCMA, adenoviral transduced macrophages were harvested. APC Labeled Human BCMA protein (Acro BCA-HA2H4) was added to the cells and the cells were incubated for 30 minutes. The cells were then spun down at 300×g for 5 minutes and the supernatant was removed. DAPI solution (1: 200 diluted in PBS) was added to the cells and the cells were incubated for 5 minutes. CAR expression was determined through flow cytometry measuring DAPI-APC+ cells. Cells expressing the CAR were brighter in the APC channel than adenoviral un-transduced control cells (UTD) . The CAR expression data are shown in FIG. 11. CAR-M01-BCMA transduced cells were 73.4%CAR positive. CAR-M02-BCMA transduced cells were 71.1%CAR positive. CAR-M03-BCMA transduced cells were 89.4%CAR positive.

[0207] Example 13: CAR-M-BCMA Macrophage Viability

[0208] After Ad5f35-CAR virus transduction, viability of CAR-M transduced cells was evaluated. The GM-CSF (10ng / mL) (UA. BIO #UA040002) induced macrophages (MDMs) were transduced with Ad5f35 adenovirus encoding the exemplary chimeric antigen receptors targeting BCMA. 48hrs after Ad5f35 adenovirus transduction, macrophages were digested by enzyme free cell dissociation solution PBS based (1×) liquid (Sigma-Aldrich #S-014-B) . The macrophages were spun down, and supernatant was discarded. The cells were resuspended in RPMI1640 with 10%FBS medium, and the viability of untransduced and transduced macrophages was evaluated by a cell counter. The cell viability data are shown in FIG. 12. The viability percentages of untransduced (UTD) and transduced macrophages (CAR-M01-BCMA, CAR-M02-BCMA, CAR-M03-BCMA) were about 90%-94%.

[0209] Example 14: Cell Killing of CAR-M-BCMA Macrophage against Tumor Cells

[0210] The cell killing effects of human macrophages expressing exemplary chimeric antigen receptors on tumor cells were assessed. Human macrophages were transduced with Ad5f35 adenovirus encoding the exemplary chimeric antigen receptors targeting BCMA. The untransduced and transduced macrophages were cultured with the CFSE-labeled BCMA-Positive NCI-H929 cells at different effector to target ratios (E: T) from 9: 1 to 1: 9 for 48hrs. The cells were spun down, and supernatant were discarded. Cells were digested by enzyme free cell dissociation solution PBS based (1x) liquid (Sigma-Aldrich #S-014-B) . Cells were spun down, and supernatant was discarded. Cells were stained with live dead staining, and then analyzed by flowcytometry. Cell killing percentage was calculated as: Killing (%) = (1-CFSE+Live+ counts (CAR-M)  / CFSE+Live+ counts (UTD) ) ×100.

[0211] The CAR-M mediated NCI-H929 killing data are shown in FIG. 13. CAR-M01-BCMA, CAR-M02-BCMA, CAR-M03-BCMA showed specific and potent cell killing against CFSE-labeled BCMA-Positive NCI-H929 cells killing at 48hrs in a dose dependent manner. The maximum killing percentage was over 95%for all three BCMA targeting CAR-M constructs.

[0212] Example 15: CAR-M-BCMA Macrophage Cytokine Secretion

[0213] For assessment of cytokine secretion, human macrophages were transduced with Ad5f35 adenovirus encoding the exemplary chimeric antigen receptors targeting BCMA. The untransduced and transduced macrophages were cultured with the CFSE-labeled BCMA-Positive NCI-H929 cells at different effector to target ratios (E: T) from 9: 1 to 1: 9 for 48hrs. Supernatant was recovered for TNFα and IL6 detection by ELISA, using ELISA MAXTM Deluxe Set Human TNFα kit (Biolegend 430204) and ELISA MAXTM Deluxe Set Human IL-6 kit (Biolegend 430504) . Supernatant cytokine levels of UTD, CAR-M01-BCMA, CAR-M02-BCMA, CAR-M03-BCMA transduced cells are shown in FIGS. 14A-14B. Almost no TNFα secretion was detected after UTD, CAR-M01-BCMA, CAR-M02-BCMA, CAR-M03-BCMA transduced cells were co-cultured with CFSE-labeled BCMA-Positive NCI-H929 cells at different effector to target ratios (E: T) from 9: 1 to 1: 9 for 48hrs. Only very low IL6 secretion was detected after UTD, CAR-M01-BCMA, CAR-M02-BCMA, CAR-M03-BCMA transduced cells were co-cultured with CFSE-labeled BCMA-Positive NCI-H929 cells at different effector to target ratios (E: T) from 9: 1 to 1: 9 for 48hrs.

[0214] Example 16: Serial Killing Effects of CAR-M-BCMA Macrophage on Tumor Cells

[0215] Human macrophages were transduced with Ad5f35 adenovirus encoding the exemplary chimeric antigen receptors targeting BCMA. The untransduced and transduced macrophages were cultured with the CFSE-labeled BCMA-Positive NCI-H929 cells at effector to target ratios E: T=9: 1 (CAR+: 1.8E5, NCI-H929: 2E4) for 72hrs. CTV-labeled BCMA-Positive NCI-H929 cells (NCI-H929: 2E4) were added and cultured for 72hrs. CFSE-labeled BCMA-Positive NCI-H929 cells (NCI-H929: 2E4) were added and cultured for 72hrs. 3 rounds of killing were tested. Every 72hrs, Live CFSE or CTV-labeled BCMA-Positive NCI-H929 cells counts were tested by flow cytometry. The following equation was used for calculation of cell killing percentages: Killing (%) = (1-CFSE (or CTV) +Live+counts (CAR-M)  / CFSE (or CTV) +Live+ counts (UTD) ) ×100.

[0216] The CAR-M mediated NCI-H929 serial killing data are shown in FIG. 15. At effector to target ratios (E: T) 9: 1 for 3 rounds killing, CAR-M01-BCMA, CAR-M02-BCMA, CAR-M03-BCMA transduced cells all showed the specific and potent serial killing (over 98%killing at the 3rd round) against CFSE or CTV-labeled BCMA-Positive NCI-H929 cells.

Claims

1.An immune cell comprising a chimeric antigen receptor (CAR) comprising:(a) an extracellular domain (ECD) ,(b) a transmembrane domain comprising a CLEC5A transmembrane domain, and(c) an intracellular domain comprising a signaling domain of a CLEC5A intracellular domain;wherein the immune cell is a macrophage, a monocyte, a neutrophil, a dendritic cell or an NK cell.2.The immune cell of claim 1, wherein the CAR comprises, from N-terminus to C-terminus, the intracellular domain, the transmembrane domain, and the extracellular domain.3.The immune cell of any one of claim 1-2, wherein the CLEC5A transmembrane domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.4.The immune cell of any one of claim 1-3, wherein the CLEC5A intracellular domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.5.The immune cell of any one of claim 1-4, wherein the extracellular domain comprises a CLEC5A extracellular domain, optionally, a truncated CLEC5A extracellular domain.6.The immune cell of claim 5, wherein the CLEC5A extracellular domain is selected from the extracellular domain of CLEC5A isoform 1 and the extracellular domain of CLEC5A isoform 2.7.The immune cell of claim 6, wherein the CLEC5A extracellular domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.8.The immune cell of claim 5, wherein the CLEC5A extracellular domain is a truncated extracellular domain of CLEC5A isoform 1 or CLEC5A isoform 2.9.The immune cell of claim 8, wherein the CLEC5A extracellular domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.10.The immune cell of any one of claim 1-4, wherein the extracellular domain comprises a hinge.11.The immune cell of claim 10, wherein the hinge is selected from a CD8 hinge, a CD28 hinge, and an IgG subclass hinge.12.The immune cell of claim 11, wherein the hinge comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.13.The immune cell of any one of claim 1-12, wherein the extracellular domain comprises a scFv that specifically binds to a tumor associated antigen (TAA) .14.The immune cell of claim 13, wherein the TAA is selected from HER2, EpCAM, EGFR, BCMA, CD19, CD79b, CD38, GPRC5D, DLL3, CD70, GPC3, Fas ligand (FasL) , CD1d, Membrane glycolipids, globotriaosyl-ceramide (Gb3Cer / CD77) , gangliosides (GD2, GD3, and GM2) , , CD34, CD45, human leukocyte antigen-DR (HLA-DR) , CD123, CLL1, CD105, CD71, SSC, MAGE, MUC16, WT-l, B7H3, TEM8, CD22, LI-CAM, ROR-l, CEA, 4-1BB, ETA, 5T4, adenocarcinoma antigen, alpha-fetoprotein (AFP) , BAFF, B-lymphoma cell, CA242 antigen, CA-125, carbonic anhydrase 9 (CA-IX) , C-MET, CCR4, CD133, CD152, CD20, CD125, CD200, CD221, CD23 (IgE receptor) , CD28, CD30 (TNFRSF8) , CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CEA, CNT0888, CTLA-4, DR5, CD3, FAP, fibronectin extra domain-B, folate receptor 1, GD2, GD3 ganglioside, glycoprotein 75, GPNMB, , HGF, human scatter factor receptor kinase, IGF-l receptor, IGF-I, IgGl, IL-5, IL-13, IL-6, IL-15, insulin-like growth factor I receptor, integrin a5b1, integrin avb3, MSLN, MS4A1, MUC1, mucin CanAg, N-glycolylneuraminic acid, NPC-1C, PD-1, PD-L1, PDGF-R a, TWEAK, phosphatidylserine, prostatic carcinoma cells, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, tenascin C, TGF beta 2, TGF-b, TRAIL-R1, TRAIL-R2, tumor antigen CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR-l, VEGFR2, and vimentin.15.The immune cell of claim 14, wherein the TAA is HER2, and the scFv comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.16.The immune cell of claim 14, wherein the TAA is BCMA, and the scFv comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.17.The immune cell of any one of claim 1-16, wherein the extracellular domain comprises a linker.18.The immune cell of claim 17, wherein the linker is a (G4S) n linker.19.The immune cell of any one of claim 1-18, wherein the immune cell is selected from M0, M1 and M2 macrophages.20.A nucleic acid construct comprising one or more nucleic acid sequences encoding:(a) an extracellular domain,(b) a transmembrane domain comprising CLEC5A transmembrane domain, and(c) an intracellular domain comprising a signaling domain CLEC5A intracellular domain.21.A method of modifying a macrophage or monocyte comprising: delivering to the macrophage or monocyte a viral vector comprising one or more nucleic acid sequences encoding:(a) an extracellular domain,(b) a transmembrane domain comprising CLEC5A transmembrane domain, and(c) an intracellular domain comprising a signaling domain CLEC5A intracellular domain.22.A method of modifying a macrophage or monocyte comprising: delivering to the macrophage or monocyte a lipid nanoparticle (LNP) or lentivirus comprising one or more nucleic acid sequences encoding:(a) an extracellular domain,(b) a transmembrane domain comprising CLEC5A transmembrane domain, and(c) an intracellular domain comprising a signaling domain CLEC5A intracellular domain.23.A pharmaceutical composition comprising an immune cell of any one of claim 1-19.24.The pharmaceutical composition of claim 23, wherein the pharmaceutical composition comprises a pharmaceutically acceptable carrier.25.A method of treating a subject having a disease, disorder, or condition, comprising administering a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of claim 20 or 24.

Images