Novel 3-arylidene-2-indolinone derivatives for therapeutic use

Abstract

The present invention relates to the cytotoxic activity and tyrosine kinase inhibitory effects of 1-benzyl-3-(1H-indol-3-ylmethylidene)-1,3-dihydro-2H-indol-2-one derivatives. The invention provides novel 1-benzyl-3-(1H-indol-3-ylmethylidene)-1,3-dihydro-2H-indol-2-one derivatives for use in the treatment of human breast, lung, pancreas, colon and / or kidney cancer.

Description

[0001] Tarifname TERAPÖTİK^AMAÇLI^KULLANILMAK^ÜZERE^YENİ^3-ARİLİDEN-2-İNDOLİNON^TÜREVLERİ Buluşun^İlgili^Olduğu^Alan Mevcut buluş, 1-benzil-3-(1H-indol-3-ilmetiliden)-1,3-dihidro-2H-indol-2-on türevlerinin sitotoksik aktiviteleri ve tirozin kinaz inhibitör etkileri ile ilgilidir. Buluş kapsamında insan meme, akciğer, pankreas, kolon ve / veya böbrek kanseri tedavisinde kullanılmak üzere yeni 1-benzil-3- (1H-indol-3-ilmetiliden)-1,3-dihidro-2H-indol-2-on türevleri sunulmaktadır. Tekniğin^Bilinen^Durumu Kanser, hücrelerin kontrolsüz bölünmesi ve çoğalması ile ortaya çıkan ve genetik ve çevresel koşulların etkisi altında gelişen kompleks bir hastalıktır. Teknolojinin ilerlemesi ile birlikte günümüzde var olan tedavilere ek olarak yeni tedavi yöntemleri geliştirilmektedir. Standart olarak kabul edilen kemoterapi, radyoterapi ve cerrahi yöntemlere ek olarak aşıların, ayrıca biyolojik, hormonal, hedeflenmiş ve gen terapilerinin kullanımı giderek artmaktadır. Kanser tedavisinde kullanılan ilaçlar genellikle non-spesifik olarak, DNA hasarı ve hücre stresi yaratarak hücre ölümüne neden olmaktadır. Bu nedenle hedefe spesifik ve nanomolar bağlanma afinitesinde ilaçlara ihtiyaç bulunmaktadır. Tedavilerin başarılı olması ve yan etkilerinin en aza indirilmesi, enzim veya reseptör sistemlerine selektif ilaçların geliştirilmesi ile mümkün olmaktadır. Bu yaklaşım, kanser hücrelerinin kemoterapötik ilaçlara olan duyarlılığını artırmakta ve dolayısıyla daha düşük dozlarda etkinin elde edilmesine olanak tanımaktadır. Bu sayede kemoterapötik ilaçların yan etkilerinin azaltılması da mümkün olacaktır. Kanser ve bağışıklık sistemindeki hastalıklar dahil olmak üzere birçok hastalığa karşı ilaç geliştirilmesi araştırmalarının temel hedefleri arasında hastalığa spesifik ilişkili enzim veya reseptör mekanizmalarının baskılanması yer almaktadır. Hücre proliferasyonu, hücre göçü ve sağkalımı gibi hücresel süreçlerde anahtar rol oynayan tirozin kinaz aktivitesinin tümör hücrelerinde artmış olduğunun keşfedilmesiyle tirozin kinazlar araştırmacıların hedefi olmuştur. Bu hedef doğrultusunda hücrede fosforilasyonunu katalizleyen tirozin kinazlar hedef alınmış ve pek çok 2-indolinon türevi, tirozin kinaz inhibitörü olarak geliştirilmiştir. Tirozin kinazlar, membrana bağlı reseptör tirozin kinazlar (RTK) ve hücre içi tirozin kinazlar olmak üzere iki sınıfta toplanan büyük bir enzim ailesidir. RTK'lar, birçok büyüme faktörü (epidermal büyüme faktörü, EGF; trombosit kaynaklı büyüme faktörü, PDGF; vasküler endoteliyal büyüme faktörü, VEGF; fibroblast büyüme faktörü, FGF), sitokinler ve hormonların yüksek affinite ile bağlandığı hücre yüzey reseptörleridir. RTK’ların sitoplazmik yüzündeki bölgesi tirozin kinaz aktivitesi göstermektedir. Reseptöre ligandın bağlanmasıyla beraber, RTK’lar hücre içindeki hedef proteinlerin tirozin kalıntılarını ATP kullanarak fosforillemektedir. Tirozin kinazlar, pek çok spesifik substrat proteinlerde ATP'den tirozine fosfat taşıyarak hücre içi sinyallerin iletisini başlatmaktadır. Karsinogenez ile ilişkili büyüme faktörleri sinyal yolaklarının düzenlenmesinde önemli rol oynamaktadır. Bu hedef proteinler, hücre büyümesi, proliferasyon, farklılaşma, motilite, metabolizma ve programlanmış hücre ölümü gibi önemli biyolojik süreçlerde görev almaktadır (Du,^ Z.,^ Lovly,^ C.M., 2018, “Mechanisms^ of^ receptor^ tyrosine^ kinase^ activation^ in^ cancer”, Molecular^Cancer, 17, 58).^ Wang ve arkadaşlarının 2015’te yaptığı çalışma oksindol çekirdeğinin antikanser ajan geliştirmede farmakofor grup olarak seçilebileceğini ve bu bileşiklere yapılan flor atomu sübstitüsyonlarının aktivitede olumlu sonuçlar meydana getirdiğini göstermektedir (Wang,^S.Y.,^ Wang,^L.J.,^Jıang,^B.,^Wu,^N.,^Li,^X.Q.,^Luo,^J.,^Wang,^B.C.,^Zhang,^R.S.,^Xu,^Q.,^Shi,^D.Y.,^2015,^Synthesis^ and^biological^ evaluation^of^ novel^ fluorinated^anticancer^ agents^ incorporating^ the^ indolin-2-one^ moiety,^ RSC^ Advances,^ 5^ (111),^ 91795–91801). Kumar ve arkadaşlarının 2018’de gerçekleştirdikleri çalışmada ise oksindol halkasına yapılan C-3 ve C-5 sübstitüsyonlarının antitümör aktiviteyi artırdığı belirtilmiştir (Kumar,^N.P.,^Vanjarı,^Y.,^Thatıkonda,^S.,^Pooladanda,^V.,^ Sharma,^ P.,^ Srıdhar,^ B.,^ Godugu,^ C.,^ Kamal,^ A.,^ Shankaraıah,^ N.,^ 2018,^ Synthesis^ of^ enamino-2- oxindoles^ via^ conjugate^ addition^ between^ α-azido^ ketones^ and^ 3-alkenyl^ oxindoles:^ Cytotoxicity^ evaluation^and^apoptosis^inducing^studies,^Bioorganic^&^Medicinal^Chemistry^Letters,^28^(22),^3564– 3573). 2-İndolinon yapısı, çeşitli bitkilerde doğal alkoloid olarak da bulunabilmektedir. Örneğin, kronik myeloid lösemi tedavisinde kullanılan ve geleneksel Çin tıbbına ait bir reçetede bulunan İndigo naturalis'den elde edilen antilösemik etkiden sorumlu indurubin, 2-indolinon çekirdeği taşımaktadır (Hoessel,^ R.,^ Leclerc,^ S.,^ Endicott,^ J.A.,^ Nobel,^M.E.,^ Lawrie,^ A.,^ Tunnah,^ P.,^ Leost,^M.,^ Damiens,^ E.,^ Marie,^ D.,^ Marko,^ D.,^ Niederberger,^ E.,^ Tang,^ W.,^ Eisenbrand,^ G.,^ Meijer,^ L.,^ 1999,^ Indirubin,^ the^ active^ constituent^ of^ a^ Chinese^ antileukaemia^medicine,^ inhibits^ cyclin-dependent^ kinases, Nature^Cell^Biology,^1^(1),^60-7). İlaç tasarımı sırasında, ikame edilmiş indoller, birçok reseptör için önemli afiniteleri nedeniyle, farmakolojik olarak aktif çok sayıda kurşun bileşiği için "ayrıcalıklı bir iskele" olarak kabul edilmektedir. En basit indol türevlerinden biri olan isatin (1H-indol-2,3-dion, 1), anti-kanser aktivite de dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik özelliklere sahip analoglara öncülük etmiştir. Miyelositik lösemiyi tedavi etmek için kullanılan geleneksel Çin tıbbı preparatı Danggui Longhui Wan'nın aktif bileşeni olan Indirubinin (2), hücre döngüsü ilerlemesini düzenleyen genleri veya proteinleri inhibe ederek kanser hücrelerine karşı çoğalmaya karşı etkili olduğu bildirilmiştir. İndirubin-3-oksim (3) tarafından indüklenen inhibe edilmiş büyüme, sikline bağlı kinaz inhibitörü p21'in indüksiyonu, siklin D1'in inhibisyonu ve kaspaz-3'ün aktivasyonu ile ilişkilidir. İndirubin türevlerinin, sinyal transdüserini ve transkripsiyon 3 sinyallemesinin aktivatörünü inhibe ettiği ve kanser hücrelerinde apoptozu indüklediği bildirilmektedir.1H-indol-2,3-dion, çeşitli terapötik moleküller tasarlamak için ayrıcalıklı bir iskele olarak kullanılabilir ve birçok 1H-indol-2,3-dion türevi, antitümör ajanları olarak incelenmiştir. Bildirilen 1H-indol-2,3-dion türevleri arasında 5,7- dibromo-1-(naftalen-1-ilmetil)-1H-indol-2,3-dion (4), IC50ile güçlü anti-tümör özelliklerine sahiptir (Li,^ P.,^ Tan,^ Y.,^ Liu,^ G.,^ Liu,^ Y.,^ Liu,^ J.,^ Yin,^ Y.,^ &^ Zhao,^ G.^ (2014). Synthesis^ and^ biological^ evaluation^ novel^ indoline- dione^ derivatives^ as^ antitumor^ Discoveries^ &^ Söz konusu İndolinon grubu kinaz inhibitörleri ilk kez 1997 yılında Mohammadi ve arkadaşları tarafından keşfedilmiştir. SU5402 ve SU49842-indolinon yapısındaki ilk tirozin kinaz inhibitörleridir. Bu küçük moleküller düşük molekül ağırlığına sahip ve birçoğu ATP bağlanma bölgesine ATP ile yarışarak bağlanmaktadır (Prakash,^P.,^Theivendren,^P.,^Raja,^S.,^2012,^İndolin-2-one^in^clinical^trials^ as^potential^kinase^inhibitors:^a^review,^Pharmacology^&^Pharmacy,^3,^62-71). ATP bağlanma bölgesini hedef alan bu bileşiklerden 4-[4[(Z)-(2-okso-1H-indol-3- iliden)metil]fenil]piperazin-1-karbaldehit yapısındaki SU4984 fibroblast büyüme faktörünün reseptörünü, 3-[4-metil-2-[(Z)-(2-okso-1H-indol-3-iliden)metil]-lH-pirol-3-il]propanoik asit yapısındaki SU5402 ise vasküler endotelyal büyüme faktörünün reseptörünü (VEGFR) engellemektedir. SU4984, FGFR1'in ATP bağlanma bölgesini hedef alır. Ayrıca fibroblast büyüme faktörü (FGF) kaynaklı hücre dışı sinyal düzenleyen kinaz (ERK) 1 ve ERK 2'nin fosforilasyonuyla trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) ve insülin reseptörlerinin tirozin fosforilasyonunu inhibe eder. SU4984 ayrıca jukstamembran aktive eden mutasyonlarla kök hücre büyüme faktörü reseptörü (KIT)'e karşı da etkilidir (Prakash,^P.,^Theivendren,^P.,^Raja,^S.,^2012,^ İndolin-2-one^ in^ clinical^trials^as^potential^kinase^inhibitors:^a^review,^Pharmacology^&^Pharmacy,^3,^62-71). SU5402, VEGFR ve FGFR1'i ATP yarışmalı şekilde inhibe eden tirozin kinaz inhibitörüdür. Oksindol yapısında olan ATP bağlanma bölgesini hedefleyen ilk kuşak FGFR tirozin kinaz inhibitörlerinden biri olan bileşiğin, yaptığı hidrojen bağı etkileşimleriyle FGFR1'e karşı SU4984' ten daha iyi inhibitör aktivite gösterdiği belirlenmiştir (Liang,^G.,^Liu,^Z.,^Wu,^J.,^Cai,^Y.,^Li,^X.,^2012,^ Anticancer^ molecules^ targeting^ fibroblast^ growth^ factor^ receptors,^ Trends^ in^ Pharmacological^ Sciences,^ 33,^ 531-541). Diğer bir oksindol türevi bileşik olan SU6668 (orantinib) Pfizer firması tarafından çoklu hedef RTK inhibitörü olarak geliştirilmiştir ve tespit edilen antitümör aktivesi nedeniyle üzerinde Faz 2 çalışmaları gerçekleştirilmektedir. Mohammadi ve arkadaşları, oksindol çekirdeğinin 5 ve 6 konumlarına yapılacak sübstitüsyonlarla daha spesifik, ATP yarışmalı protein tirozin kinaz (PTK) inhibitörlerinin geliştirilebileceğini önermişlerdir ve bu şekilde 2-indolinon çekirdeğinin aktiviteden sorumlu olduğu anlaşılmıştır (Mohammadi,^M.,^Mcmahon,^G.,^Sun,^L.,^Tang,^C.,^Hirth,^P.,^Yeh,^B.K.,^Hubbard,^S.R.,^Schlessinger,^J.,^ 1997,^Structures^of^the^Tyrosine^Kinase^Domain^of^Fibroblast^Growth^Factor^Receptor^in^Complex^ with^Inhibitors,^Science,^276(5314),^955-960). SU4984 ve SU4984 SU5402 Yapılan çeşitli çalışmalar sonucunda tirozin kinazın hidrofobik bölgesinin ATP'nin şekerinin OH ve adeninin N / NH gruplarıyla hidrojen bağları ile etkileştiği gözlenmiştir (Prakash,^ P.,^ Theivendren,^P.,^Raja,^S.,^2012,^İndolin-2-one^in^clinical^trials^as^potential^kinase^inhibitors:^a^review,^ Pharmacology^&^Pharmacy,^3,^62-71). 2-İndolinonların 3 konumuna fenil, imidazol, pirol gibi grupların eklenmesi RTK' lerin seçiciliğini artırmakta ve 3-sübstitüe-2-indolinonların literatürlerde RTK'leri seçici ve güçlü bir şekilde inhibe ettiği bildirilmiştir. Buna ek olarak, adenin-mimetik olarak görev yaparlar ve ATP bağlanma bölgesine bağlanırlar (Prakash,^P.,^Theivendren,^P.,^Raja,^S.,^2012,^İndolin-2-one^in^clinical^ trials^as^potential^kinase^inhibitors:^a^review,^Pharmacology^&^Pharmacy,^3,^62-71). Ayrıca, enzimin ATP bağlanma bölgesinde sunitinib ve semaksanib gibi 3-sübstitüe-2-indolinon yapısındaki tirozin kinaz inhibitörlerinin etkileşimleri incelenmiş ve sunitinibin polar bölgesinin hidrojen bağları ile bağlandığı, hem sunitinib hem de semaksanibin hidrofobik bölgesinin enzimin hidrofobik cebine yerleştiği görülmüştür (Kaur,^J.,^Kaur,^B.,^Singh,^P.,^2018,^Rational^modification^ of^semaxanib^and^sunitinib^for^developing^a^tumor^growth^inhibitor^targeting^ATP^binding^site^of^ tyrosine^kinase,^Bioorganic^&^Medicinal^Chemistry^Letters,^28,^129–133). Sunitinib ve ^^^^^^^^^^^^^^ Sunitinib Semaksanib Semaksanib (SU5416), klinik çalışmalarda test edilmiş ilk VEGFR tirozin kinaz inhibitörüdür (Prakash,^ P.,^ Theivendren,^ P.,^ Raja,^ S.,^ 2012,^ İndolin-2-one^ in^ clinical^ trials^ as^ potential^ kinase^ inhibitors:^a^review,^Pharmacology^&^Pharmacy,^3,^62-71). Semaksanib faz çalışmaları sırasında gösterdiği yan etkiler sebebiyle faz çalışmalarının durdurulmasının ardından, Semaksanibin yan etkilerini azaltmak amacıyla sunitinib geliştirilmiştir (Kaur,^J.,^Kaur,^B.,^Singh,^P.,^2018,^Rational^ modification^ of^ semaxanib^and^ sunitinib^ for^ developing^a^ tumor^growth^ inhibitor^ targeting^ATP^ binding^site^of^tyrosine^kinase,^Bioorganic^&^Medicinal^Chemistry^Letters,^28,^129–133). Sunitinibe benzer bir yapıya sahip olan toceranib (SU11654) VEGFR, PDGFR ve c-Kit gibi kinaz reseptörlerine karşı güçlü inhibitör etkilidir. Bileşik, deride oluşan mast hücre tümörlerinin tedavisine yönelik köpeklerde kullanımı için EMA'dan onay almıştır (Prakash,^ C.R.,^ Raja,^ S.,^ Theivendren,^P.^2012.^ ‘’Indolin-2-Ones^ in^Clinical^Trials^as^Potential^Kinase^ Inhibitors:^A^Review’’,^ Pharmacology^&^Pharmacy,^3,^62-71). Yapısal olarak toceranibe çok benzeyen SU14813, VEGFR, PDGFR, c-Kit ve FLT3'ü hedefleyen başka bir multikinaz inhibitörüdür. SU14813'ün dosetaksel ile kombine tedavisi, hem primer tümör büyümesinin inhibisyonunu hem de tümör taşıyan farelerin hayatta kalmasını önemli ölçüde artırdığı saptanmıştır (Patyna,^ S.,^ Laird,^ A.D.,^ Mendel,^ D.B.,^ O’Farrell,^A.M.,^Liang,^C.,^Guan,^H.,^Vojkovsky,^T.,^Vasile,^S.,^Wang,^X.,^Chen,^J.,^Grazzini,^M.,^Yang,^C.Y.,^ Haznedar,^J.O.,^Sukbuntherng,^J.,^Zhong,^W.Z.,^Cherrington,^J.M.,^Hu-Lowe,^D.^2006.^‘’SU14813:^a^novel^ multiple^ receptor^ tyrosine^ kinase^ inhibitor^ with^ potent^ antiangiogenic^ and^ antitumor^ activity’’,^ Molecular^Cancer^Therapeutics,^5(7),^1774-1782). Cl O N NCH3 N O S N H O O N H ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^SU11274^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^Toceranib^(SU11654)^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^SU14813 Kanser hücrelerinin birinci nesil TKI'lara dirençli hale gelmesi mümkündür (Iderzorig,^T.,^Kellen,^ J.,^Osude^C.,^Singh,^S.,^Woodman,^J.A.,^Garcia,^C.,^Puri,^N.^2018.^”Comparison^of^EMT^mediated^tyrosine^ kinase^ inhibitor^ resistance^ in^ NSCLC”,^ Biochemical^ and^ Biophysical^ Research^ Communications,^ 496(2),770-7). Edinilmiş ilaç direncinin üstesinden gelen ikinci ve üçüncü nesil TKI'ların varlığına rağmen, mevcut kemoterapötiklerin kullanımı, ilaç direncine ek olarak yan etkiler nedeniyle genellikle sınırlıdır. Daha etkili TKI'ların keşfedilmesine acil ihtiyaç vardır. Son yıllarda sentezlenen 3-ariliden-2-indolinon türevleri arasında, imidazotiyazol halkası taşıyan bileşiklerin bazıları, nM konsantrasyon aralıklarında nontoksik, güçlü antiproliferatif ajanlar olarak tanımlanmıştır. HeLa, HT-29 ve A549 hücreleri üzerinde gerçekleştirilen çalışmalarda, bileşiklerin mitokondriyal ölüm yolu yoluyla apoptozu indükledikleri ve hem kaspaz-3 hem de kaspaz-9 aktivasyonuna, PARP bölünmesine ve anti-apoptotik proteinler Bcl-2 ve Mcl-1’nin azaltılarak düzenlenmesine neden oldukları rapor edilmiştir. Aşağıda formülü verilen 2-indolinon türevi bileşik (I), fare BL6-B16 melanomu ve E0771 meme kanseri hücrelerinde in^ vivo olarak da incelenmiştir ve tümör hacminde bir azalmaya neden olduğu bulunmuştur (Morigi,^R.,^Locatelli,^A.,^Leoni,^A.,^Rambaldi,^M.,^Bortolozzi,^R.,^Mattiuzzo,^E.,^ Ronca,^R.,^Maccarinelli,^F.,^Hamel,^E.,^Bai,^R.,^Brancale,^A.,^Viola,^G.^2019.^‘’Synthesis,^in^vitro^and^in^ vivo^ biological^ evaluation^ of^ substituted^ 3-(5-imidazo[2,1-b]thiazolylmethylene)-2-indolinones^ as^ new^ potent^ anticancer^ agents’’,^ European^ Journal^ of^ Medicinal^ Chemistry, 166, 514-530). Son yıllarda yapılan bir araştırmada, sentezlenen indol halkasının 1-, 5- veya 6- pozisyonlarında sübstitüe bazı sunitinib türevleri, AMP ile aktive olan protein kinaz (AMPK) inhibisyonu için test edilmiş, AMPK'nin bileşiklerle hücresel etkileşimi, miyeloid lösemi hücrelerinde bir AMPK substratı olan Asetil-CoA karboksilazın (ACC) fosforilasyonunun inhibisyonu ile belirlenmiştir. İndol halkasının 5-konumunda 2-hidroksietil veya 3-amino-3-oksopropil grubu taşıyan iki türevin (II), nanomolar konsantrasyon aralıklarında hücresel AMPK’nin güçlü inhibitörü oldukları, ayrıca bileşiklerin K562 hücre hattında sitotoksisite göstermediği saptanmıştır (Matheson,^ C.J.,^ Casalvieri,^ K.A.,^ Backos,^ D.S.,^ Minhajuddin,^ M.,^ Jordan,^ C.T.,^ Reigan,^ P.^ 2020.^ ‘’Substituted^ oxindol-3-ylidenes^ as^ AMP-activated^ protein^ kinase^ (AMPK)^ inhibitors’’.^ European^ Journal^of^Medicinal^Chemistry,^197, 112316). N ONNH N N S R N H O O

[0002] N N H H R= OH, CONH (I) (II) Meme kanseri hücrelerinde onkoprotein p21 ile aktive olan kinaz 1'i (PAK1) hedefleyen yeni bir 2-indolinon türevi ZMF-005, 2020 yılında Yao ve arkadaşları tarafından tanımlanmıştır. ZMF- 005'in apoptozu indüklediği ve MDA-MB-231 hücrelerinde göçü baskıladığı bildirilmiştir (Yao,^D.,^ Ruhan,^A.,^Jiang,^J.,^Huang,^J.,^Wang,^J.,^Han,^W.^2020.^‘’Design,^synthesis^and^biological^evaluation^of^ 2-indolinone^ derivatives^ as^ PAK1^ inhibitors^ in^ MDA-MB-231^ cells’’,^ Bioorganic^ &^ Medicinal^ Chemistry^Letters,^30(17),^127355).2021 yılında yapılan diğer bir çalışmada, 1,2,3-triazol halkası taşıyan 2-indolinon türevlerinin VEGFR-2'ye karşı inhibitör etkileri, in^vitro ve in^vivo modellerde araştırılmıştır. Aşağıda formülü verilen bileşiğin (III) VEGFR-2 üzerinde daha fazla inhibitör aktivite, HT-29 ve MKN-45 hücreleri üzerinde daha iyi sitotoksisite ve sunitinibe göre HUVEC hücre hattına karşı daha az toksik olduğu saptanmıştır. Ayrıca, bu bileşiğin anjiyogenez üzerindeki inhibitör etkisi, floresan işaretli VEGFR-2 geni aktarılmış transgenik zebra balığı modeli kullanılarak in^ vivo olarak da doğrulanmıştır (Wang,^ D.,^ Liu,^ K.,^ Li,^ X.,^ Lu,^ G.,^ Xue,^W.,^ Qian,^ X.,^ Mohamed,^K.O., Meng,^F.^2021.^‘’Design,^synthesis,^and^in^vitro^and^in^vivo^anti-angiogenesis^study^of^ a^novel^vascular^endothelial^growth^factor^receptor-2^(VEGFR-2)^inhibitor^based^on^1,2,3-triazole^ . ZMF-005 (III) 2020 yılında yayımlanan başka bir çalışmada, N-benzil-2-indolinon iskeletine sahip bileşiklerin (IV ve V) in^vitroVEGFR-2 kinaz inhibitor etkinlikleri incelenmiş ve bileşiklerin çoğunun, sunitinib ile benzer şekilde 1 µM düzeyin altında IC50 (in^vitrohücrelerin %50 sinin çoğalmasını inhibe eden konsantrasyon) değerlerine sahip oldukları gözlenmiştir. Bileşiklerin CAKI-1 ve A498 renal tümör hücrelerine in^vitro etkinliklerinin de sunitinib ile kıyaslanabilir derecede olduğu, aynı zamanda bazı bileşiklerin normal renal hücre tiplerine karşı selektivite indeksinin sunitinibden daha yüksek olduğu rapor edilmiştir (Mahmoud,^H.K.,^Farghaly,^T.A.,^Abdulwahab,^H.G.,^Al-Qurashi,^N.T.,^ Shaaban,^M.R.^2020.^‘’Novel^2-indolinone^thiazole^hybrids^as^sunitinib^analogues:^Design,^synthesis,^ and^ potent^ VEGFR-2^ inhibition^ with^ anti-renal^ cancer^ Journal^ of^ EP 1139754 A1 sayılı patent belgesi, protein kinazların (PKs) aktivitesini modüle eden 3- heteroaridenidenil-2-indolinon bileşikleri ve bileşiklerin diğer kemoterapötik ajanlarla kombinasyonlarının kanser de dahil olmak üzere anormal protein kinaz aktivitesiyle ilgili bozuklukların tedavisinde kullanımı ile ilgilidir. Söz konusu belge kapsamında ayrıca, bu bileşiklerin kanser tedavisinde diğer kemoterapötik ajanların, özellikle florlu pirimidinlerin etkinliğini artırmasının beklendiği ifade edilmektedir. CA 2383623 A1 sayılı patent belgesi ise, protein kinazların aktivitesini modüle eden ve böylece, kanser gibi protein kinaz ile ilişkili hücresel bozuklukların önlenmesinde ve tedavisinde faydalı olması beklenen yeni 3-metilidenil-2-indolinon bileşikleri ve fizyolojik olarak kabul edilebilir tuzları ve ön ilaçları ile ilgilidir. CA 2726644 A1 sayılı patent belgesi, hücre proliferasyonunu, miyelom hücrelerinin yer değiştirmesini veya apoptozunu, anjiyojenez veya fibroz içeren hastalıkların tedavisi için yararlı olabilecek farmasötik bir kombinasyon ile ilgilidir. Söz konusu belge ayrıca, adı geçen hastalıkların tedavisi için, etkili miktarlarda spesifik aktif bileşiklerin eşzamanlı, ayrı ayrı veya sırayla uygulanmasını ve / veya radyasyon terapisi ve bir katkı maddesi ile sinerjik etki sağlayan bir oranda eş zamanlı tedaviyi içeren bir yöntemle ilgilidir ve bu spesifik bileşiklerin ve / veya radyoterapinin, karşılık gelen farmasötik kombinasyon preparatlarının üretimi için kombine kullanımına ilişkindir. Söz konusu buluş, 3-Z-[1-(4-(N-((4-metil-piperazin-1-il)-metilkarbonil)-N- metil-amino)-anilino)-1-fenil-metilen]'i içeren farmasötik kombinasyonu, -6-metoksikarbonil-2- indolinon veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunu ve N-[4-[2-(2-amino-4,7- dihidro-4-okso-1H-pirolo[2,3-d]pirimidin-5-il)etil]benzoil]-L Glutamik asit veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunu içermektedir. EP 0161918 A2 sayılı patent belgesi ise, bazı indolin ve 2-indolinon türevleri, bunların farmasötik formülasyonları ve bunların pozitif inotropik ajanlar olarak kullanımları ile ilgilidir. Söz konusu belge, kan basıncı ve kalp atış hızı üzerinde minimum etkiye neden olan güçlü, uzun süreli ve oral olarak etkili pozitif inotropik maddelerdir. Yukarıdaki bilgiler ışığında görülmektedir ki, 3-ariliden-2-indolinon türevleri SU-5416 (semaksanib), SU-11248 (sunitinib) ve SU-9516 tirozin kinaz inhibitörleridir. Değişik reseptör tirozin kinazlarını selektif olarak inhibe eden, antikanser ve antianjiojenik aktiviteye sahip sunitinibin, ilerlemiş renal ve gastrointestinal stromal kanserlerinin tedavisi için kullanımı 2006 yılında onaylanmıştır. 2-İndolinon türevlerinde yapı-aktivite araştırmaları, indol halkasındaki 5 ve 7 konumundaki elektron çeken sübstitüentlerin, 1 konumunda 1 karbon zincirli bir aromatik halkanın tümör hücrelerine karşı etkinliği artırdığını göstermiştir. 2-indolinon bileşikleri ile kanser tedavisine yönelik olarak hücrede fosforilasyonu katalizleyen tirozin kinazlar hedef alınmış ve pek çok 2-indolinon türevi tirozin kinaz inhibitörü olarak geliştirilmiştir. 2-indolinon bileşiklerinin kanser tedavisine yönelik antitümör aktivitesi test edilmesine rağmen, bahsi geçen bu bileşiklerin türevlendirilmiş versiyonlarının antikanser etkinliğinin araştırıldığı bir çalışmaya rastlanmamıştır. Dolayısıyla, ilgili teknik alanda yeni 3- ariliden-2-indolinon türevleriyle ilgili çalışmalara yönelik bir ihtiyaç bulunmaktadır. Mevcut buluş bu amaçla, 1-benzil-3-(1H-indol-3-ilmetiliden)-1,3-dihidro-2H-indol-2-on türevlerinin sitotoksik aktivitelerini, tirozin kinaz inhibitör etkilerini ve ayrıca söz konusu bileşiklerin endikasyonlarını sağlamaktadır. Buluşun^Kısa^Açıklaması Mevcut buluş bir yönüyle, insan meme, akciğer, pankreas, kolon ve / veya böbrek kanseri tedavisinde kullanılmak üzere aşağıda bileşik sunmaktadır: Formül^5^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ burada; R1, bir hidrojen, alkil, metoksi, triflorometoksi, halojen, nitro, siyano, karboksamit, sülfonik asit, sodyum sülfonat veya sülfonamid grubunu temsil eder; R2, bir hidrojen, alkil, triflorometil, metoksi, triflorometoksi, halojen, nitro, amin, dimetilamin, siyano, karboksilik asit, sülfonik asit veya hidroksil grubunu temsil eder; ve R3 ve R4 birbirinden bağımsız olarak bir hidrojen veya metil grubunu temsil eder. Mevcut buluş kapsamındaki yapılanmalarda, söz konusu R1, R2, R3 veya R4 grupları aşağıda yer alan gruplardan seçilmektedir: R4H veya CH3Mevcut buluşa ait bileşik, bir tirozin kinaz inhibitörü olmasının yanı sıra hücre apoptozunu kanserde uyaran bir bileşiktir. Şekillerin^açıklaması Şekil^1:^^A498 böbrek kanser hücrelerine 48 saat uygulanan Y3 (A) maddesi ile 72 saat uygulanan Y8 ve Y23 (B) maddelerinin genel tirozin kinaz aktivitesi üzerine etkisi. Şekil^2:^^MIAPaCa-2 pankreas kanser hücrelerine 72 saat uygulanan Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y8, Y14 ve Y21 maddelerinin genel tirozin kinaz aktivitesi üzerine etkisi. Şekil^ 3:^ ^HCT116 kolon kanser hücrelerine 72 saat uygulanan Y4 ve 20C maddelerinin genel tirozin kinaz aktivitesi üzerine etkisi. Şekil^4:^^A498 böbrek kanser hücre hattında uygulanan Y3 maddesinin kontrollere göre apoptoz değerlerinin analiz karşılaştırması. Şekil^ 5:^ ^A498 böbrek kanser hücre hattında pozitif kontrol için kullanılan Sunitinib malatın uygun doz tespiti değerlendirmesi. Şekil^6:^^MiaPaca-2 pankreas kanser hücre hattında uygulanan Y1, Y3, Y4, Y5, Y8, Y14 ve Sunitinib maddelerinin kontrollere göre apoptoz değerlerinin analiz karşılaştırması. Buluşun^Ayrıntılı^Açıklaması Bu ayrıntılı açıklamada, mevcut buluşa ait yeni 3-ariliden-2-indolinon türevleri olan 1-benzil-3- (1H-indol-3-ilmetiliden)-1,3-dihidro-2H-indol-2-on türevlerinin sitotoksik aktiviteleri ve tirozin kinaz inhibitör etkileri ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.2-İndolinon çekirdeğinin antikanser ajan geliştirmede farmakofor grup olarak seçilebileceği ve bu bileşiklerde oksindol halkasının 1, 3, 5 ve 7 konumundaki sübstitüsyonlarının antitümör aktiviteyi artırdığı belirlenmiştir. Bu bulgulardan yola çıkılarak tasarlanan mevcut buluş, genel formül 5’e sahip yeni 1-benzil-3- (1H-indol-3-ilmetiliden)-1,3-dihidro-2H-indol-2-on türevleri insan meme, akciğer, pankreas, kolon ve / veya böbrek kanseri tedavisinde kullanılmak üzere sunulmaktadır. Söz konusu kullanıma yönelik sunulan mevcut buluş, yeni türevlendirilmiş ürünleri ve bahsedilen yeni ürünlerin sentez yöntemlerini de kapsamaktadır. Formül 5’e sahip bileşiklerin kimyasal yapısı aşağıda gösterilmektedir. Formül^5 Kanser, ateroskleroz, artrit gibi proliferatif hastalıklar ve diyabet gibi metabolik hastalıklarda hedef protein olan kinazlara karşı etkili birçok 3-ariliden-2-indolinon türevi tirozin kinaz inhibitörü olarak geliştirilmiştir. Bu amaç doğrultusunda sentezlenen yeni 3-ariliden-2-indolinon türevleri, literatürde mevcut 3-ariliden türevlerinden farklı olarak 1H-indol-2,3-dion halka sistemininin 1- konumunda sübstitüe benzil artığı taşıyan 1-benzil-3-(1H-indol-3-ilmetiliden)- 1,3-dihidro-2H-indol-2-on türevleridir. Söz konusu benzil artığı taşıyan türevler (Formül 5) geliştirilmiş ve sentezlenmiştir. Bu nedenle, mevcut buluş bir yönüyle genel formül 5’e sahip yeni 1-benzil-3-(1H-indol-3- ilmetiliden)-1,3-dihidro-2H-indol-2-on türevleri sağlamaktadır: burada R1,^R2,^R3ve R4uygun şekilde aşağıdakilerden biri olarak seçilebilir: R1^=^H, 5-CH3, 5-CH(CH3)2, 5-C(CH3)3, 5-OCH3, 5-OCF3, 5-F, 5-Cl, 5-Br, 5-I, 5-NH2, 5-NO2, 5- CN, 5-COOH, 5-CONH2, 5-SO3H, 5-SO3Na, 5-SO2NH2, 7-CH3, 7-CF3, 7-OCH3, 7-F, 7-Cl, 7-Br, 5,7-diCH3, 5-F-7-CH3, 5-Cl-7-CH3, 7-F-6-Cl, 5,7-diCl, 5,7-diBr, R2^= H, 2-CH3, 2-C2H5, 2-CH(CH3)2, 2-C(CH3)3, 2-CF3, 2-OCH3, 2-SCH3,2-OCF3, 2-F, 2-Cl, 2-Br, 2-I, 2-NO2, 2-NH2, 2-CN, 2-COOH, 2-OH, 3-CH3, 3-C2H5, 3-CH(CH3)2, 3-C(CH3)3, 3-CF3, 3- OCH3, 3-SCH3, 3-OCF3, 3-SCF3, 3-F, 3-Cl, 3-Br, 3-I, 3-NO2, 3-NH2, 3-CN, 3-COOH, 3-OH, 4-CH3, 4-C2H5, 4-CH(CH3)3, 4-C(CH3)3, 4-CF3, 4-OCH3, 4-SCH3,4-OCF3, 4-SCF3,4-F, 4-Cl, 4-Br, 4-I, 4- NO2, 4-NH2, 4-N(CH3)2, 4-CN, 4-COOH, 4-SO3H, 4-OH, 2,3-diCH3, 2,4-diCH3, 2,5-diCH3, 2,6- diCH3, 3,4-diCH3, 3,5-diCH3, 3,5-diCF3, 2,4-diOCH3, 2,5-diOCH3, 3,4-diOCH3, 3,5-diOCH3, 2- CH3-3-Cl, 2-CH3-5-Cl, 4-CH3-3-CF3, 2-OCH3-5-CH3, 2-F-5-CF3, 4-F-3-CF3, 2-Cl-5-CF3, 4-Cl-3- CF3, 5-Cl-2-OCH3, 2,3-diF, 2,4-diF, 2,5-diF, 2,6-diF, 3,4-diF, 3,5-diF, 2,3-diCl, 2,4-diCl, 2,5- diCl, 2,6-diCl, 3,4-diCl, 3,5-diCl, 2-Cl-4F, 2-Cl-6F, 4-Br-2-F, R3^=^H, CH3, R4^=^H, CH3. Başka bir yönüyle mevcut buluş, buluşa ait bileşiklerin sentezi için bir yöntem sunmaktadır. 1- benzil-1H-indol-2,3-dion türevleri (2),^ 1H-indol-2,3-dion (1) türevlerinin dimetilformamid (DMF) varlığında, K2CO3katalizörlüğünde ve benzil halojenür ile reaksiyonundan elde edilmiştir. Örneğin, benzil halojenür tercihen benzil iyodür, benzil bromür ve benzil klorürü içeren bir gruptan seçilebilir. Daha tercihen ise, benzil klorürdür (Torres,^J.C.,^Pinto,^A.C.,^Garden,^S.J.^(2004).^ ‘’Application^of^a^catalytic^palladium^biaryl^synthesis^reaction,^via^C-H^functionalization,^to^the^total^ synthesis^ of^ Amaryllidaceae^ alkaloids’’,^ Tetrahedron,^ 60(44),^ 9889-9900;^ Vine,^ K.L.,^ Locke,^ J.M.,^ Ranson,^M.,^Pyne,^S.G.,^Bremner,^J.B.^(2007).^‘’An^investigation^into^the^cytotoxicity^and^mode^of^action^ of^some^novel^N-alkyl-substituted^isatins’’,^Journal^of^Medicinal^Chemistry,^50(21),^5109-5117). İkinci olarak, 1H-indol-2,3-dion (2) ve hidrazin hidrat reaksiyonundan 1,3-dihidro-2H-indol-2-on türevleri (3)^elde edilmiştir. Üçüncü aşamada, 1,3-dihidro-2H-indol-2-on (3) türevleri, etanol ve piperidinli ortamda 1H-indol-3-karbaldehidler (4)^ile reaksiyona sokularak 1-benzil-3-(1H-indol- 3-ilmetiliden)-1,3-dihidro-2H-indol-2-on türevleri (5)^ sentezlenmiştir (Şema 1) (Mologni,^ L.,^ Rostagno,^R.,^Brussolo,^S.,^Knowles,^P.P.,^Kjaer,^S.,^Murray-Rust,^J.,^Rosso,^E.,^Zambon,^A.,^Scapozza,^L.,^ McDonald,^ N.Q.,^ Lucchini,^ V.,^ Gambacorti-Passerini,^ C.^ (2010).^ ‘’Synthesis,^ structure-activity^ relationship^and^crystallographic^studies^of^3-substituted^indolin-2-one^RET^inhibitors’’,^Bioorganic^ &^Medicinal^Chemistry, 18,^1482-1496; Zhong,^Y.,^Xue,^M.,^Zhao,^X.,^Yuan,^J.,^Liu,^X.,^Huang,^J.,^Zhao,^Z.,^ Li,^ H.,^ Xu,^ Y.^ (2013).^ Substituted^ indolin-2-ones^ as^ p90^ ribosomal^ S6^ protein^ kinase^ 2^ (RSK2)^ inhibitors:^Molecular^docking^simulation^and^structure-activity^relationship^analysis. Bioorganic^&^ Medicinal^Chemistry,^21,^1724-1734). Bileşiklerin (5)^analitik saflıkta oldukları elementel analiz ile belirlenmiş, yapılarının doğruluğu spektral analizler (IR,1H NMR,13C NMR-APT, HSQC-2D, HMBC- 2D ve LCMS) ile kanıtlanmıştır. Şema^1 Şema 1’de verilmiş söz konusu bileşikler (1, 2, 3, 4, 5) için R1,^R2, R3 ve R4 uygun şekilde aşağıdaki gibi seçilir: R1, hidrojen, alkil, metoksi, triflorometoksi, halojen, nitro, siyano, karboksamit, sülfonik asit, sodyum sülfonat, sülfonamid’i temsil eder. R2, hidrojen, alkil, triflorometil, metoksi, triflorometoksi, halojen, nitro, amin, dimetilamin, siyano karboksislik asit, sülfonik asit, hidroksil’i temsil eder. R3 ve R4, hidrojen ve metil’i temsil eder. Mevcut buluşa ait bileşiklerin deneysel yöntemleri ve bulguları aşağıda verilen örneklerde ayrıntılı bir şekilde açıklanmaktadır. ÖRNEKLER Hücresel^Deneyler^ve Yöntemler Mevcut buluşa ait 1-benzil-3-(1H-indol-3-ilmetiliden)-1,3-dihidro-2H-indol-2-on türevlerinin (Formül^5) sitotoksiteleri, genel tirozin kinaz inhibitör etkileri ve hücre ölümü (apoptoz / nekroz) analizleri aşağıda verilen yöntemler ile incelenmiştir. Test edilen kanser hücreleri, bileşiğin insan böbrek (CAKI-1, A498), pankreas (MIA PaCa-2), kolon (HT-29 VE HCT-116), meme (MCF-7 ve MDA-MB-231) ve akciğer (A549) kanseri hücreleridir. MTT deneylerinde HUVEC (insan umbilikal ven endotel hücresi), MCF-10F (insan meme epitel hücresi) ve Beas2b (insan akciğer bronşiyal epitel hücresi) hücre hatları sağlıklı kontrol hücresi olarak kullanılmıştır. Hücre^Kültürü^Uygulamaları İnsan böbrek (A498), akciğer (A549), pankreas (Miapaca-2), kolon (HT29 ve HCT116) hücreleri %10 fetal sığır serumu, 100 IU / mL penicillin, 100 µg / mL streptomycin ve 2 mmol / L glutamin içeren Dulbecco’nun Modifiye Eagle Medyumu (DMEM) medyum içerisinde, insan meme (MCF-7 ve MDAMB-231) hücreleri DMEM:F12, insan CAKI-1 renal karsinoma hücreleri ise McCoy’s 5A medyumunda standart kültür şartlarında (37°C, %5 CO2içeren nemli ortam) inkübe edilmiştir. Normal hücre soyu olarak kullanılan Beas2b (insan akciğer bronşiyol epitel hücresi)ve HEK293 (böbrek tübül epiteli) hücreleri RPMI medyumunda, ve HUVEC (insan göbek kordonu endotel hücreleri) ve MCF-10F (insan meme epitel hücresi) hücresi 100 μg / ml penisillin / streptomisin içeren DMEM medyum içerisinde kültüre edilmiştir. Kültür şişesinin %70’ini kaplamış olan hücreler fosfat tamponu ile yıkandıktan sonra tripsin-etilendiamin tetraasetik asit (Tripsin-EDTA; %0.25) solüsyonunun uygulanmasıyla tutunmuş oldukları flaskın yüzeyinden kaldırılarak pasajlanarak ve sayılarak her deney öncesi uygun pleytlere ekilmiştir. Hücreler 0,1, 1, 5 ve 10 µM konsantrasyonlarda toplam 45 adet 2-indolinon bileşikleri (5) ile muamele edilmiştir. Stok bileşikler 1 ml dimetilsülfoksit (DMSO) içerisinde hazırlanmış ve 4 farklı dilüsyon medyum ile hazırlanarak hücrelere uygulanmıştır. Kontrol grubu hücrelere, deney gruplarına benzer konsantrasyonda DMSO uygulanmıştır. 1 ^M’ın altında IC50 değerine sahip olan 2-indolinon bileşiklerinin (5) IC50 ^M düzeyinde hücrelere uygulanmasından 24, 48 ve 72 saat sonra hücreler toplanmış, hücre lizatları üzerinde sırasıyla sitotoksisite, genel tirozin kinaz aktivite tayini ve hücre ölümü (apoptoz / nekroz) analizleri gerçekleştirilmiştir. MTT^Testi^ile^Hücre^Canlılığının^Değerlendirilmesi MTT (3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolyum bromür) kolorimetrik testi, kültür ortamındaki mitokondriyal aktivitesi devam eden canlı hücrelerin kantitasyonunu sağlamaktadır. Hücre kültürü şartlarındaki standart prosedüre göre hücreler %10 FBS ve %1 penisilin / streptomisin içeren RPMI-1640 ve DMEM kültür ortamlarında idame ettirilmiştir. Hücre sayımları için tripan mavisi testi kullanılmıştır. 45 adet 2-indolinon bileşiğinin (5) tüm kanser hücre hatlarındaki hücre canlılığı üzerine etkileri MTT testi ile araştırılmıştır. Hücreler 96 kuyucuklu düz tabanlı pleyte her kuyucukta 5000 hücre olacak şekilde ekildi ve ertesi gün hücrelere 0,1, 1, 5 ve 10 ^M konsantrasyonlarda 2-indolinon bileşikleri (5) uygulanmıştır.2-indolinon bileşiklerinin uygulamasından 48 ve / veya 72 saat sonra supernatantın 50 ^l’si yavaşça atılarak (asit ortam olduğu için), her kuyucuğa 10 µl hacminde 5 mg / ml konsantrasyonda MTT eklenmiştir ve 4 saat inkübasyon sonrası kuyucuklarda oluşan formazan kristalleri 100 µl DMSO eklenmesi ile çözündürülmüştür ve optik yoğunluk 570 nm test dalga boyunda ve 630 nm referans dalga boyunda okunmuştur. Hücre canlılığı, kontrol ve test kuyucuklarının absorbansı kıyaslanarak % hücre canlılığı olarak ifade edilmiştir. Her bileşik için hazırlanan doz-cevap eğrilerinden IC50 değeri hesaplanmıştır. Ayrıca bileşiklerin içerdiği DMSO miktarı ile uyumlu negatif kontrol kuyucukları hazırlanarak olası DMSO etkisi elimine edilmiştir. MTT ile bileşiklerin reaksiyonunu anlamak için de, kullanılan konsantrasyonlarda hücresiz (MTT+bileşikler) negatif kontroller hazırlanmıştır (Mosmann, 1983).2-indolinon bileşiklerinden (5) kanser hücrelerini 1 ^M konsantrasyonun altında IC50 değerinde öldürenler seçileceği için, öncelikle bu maddeler sağlıklı hücreler üzerinde test edilmiştir ve bu maddeler arasından sağlıklı hücrelerde toksik etki yaratmayanlar (hücre canlılığını %’80 nin altına düşürmeyen) belirlenmiştir. Elde edilen absorbans değerleri kontrole göre karşılaştırılarak eşleşmemiş t testi ile istatistiksel olarak “Graphpad Prism 5.04” yazılımı kullanılarak değerlendirilmiştir. “P<0,05” anlamlı olarak kabul edilmiştir. Mevcut buluş sahipleri, sitotoksik etkileri değerlendirirken, buluşa ait bileşiklerin kanser hücrelerinde etkili, sağlıklı hücrelerde ise etkisiz olmasını amaçlamaktadırlar. Buluşa ait bileşikler ayrıca, halihazırda tedavide kullanılan referans kemoterapi ilaçlarından biri olan sunitinib ile de karşılaştırılmıştır. Genel^Tirozin^Kinaz^İnhibitör (TKI)^ Etkinin^Değerlendirilmesi (ELISA) Sağlıklı hücrelerde nontoksik özellikleri ile öne çıkan 11 adet 2-indolinon bileşiğinin (Y1,^Y2,^Y3,^ Y4,^Y5,^Y8,^Y14,^Y21,^Y23,^20C,^22C) kanser hücrelerinde genel tirozin kinaz etkinliği üzerine olan etkilerin belirlenmesi amacı ile Takara Universal Tyrosine Kinase Assay Kit’i kullanılmıştır. Hücreler 6 kuyucuklu pleytlere (4.105hücre / kuyucuk) ekilmiştir ve seçilen her bir molekülün IC50 değerinde konsantrasyonu 48 veya 72 saat süresince hücrelere uygulanmıştır. Kontrol grubundaki hücreler ise sadece medyum ile inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi sonunda her kuyudaki hücreler PBS ile yıkanmıştır ve kit içindeki ekstraksiyon tamponunun 1 ml’si ile hücre kazıyıcısı kullanılarak hücreler kuyucuklardan kaldırılmıştır. Hücre lizatı ependorf tüplere aktarılarak +4⁰C’de 10 dakika 10.000 g de santrifüj edildi ve süpernatant aktivite tayininde örnek kullanılmıştır. Kontrol ve deney gruplarından elde edilen ekstraktlar 1:25 oranında sulandırıldıktan sonra kit içerisindeki 96 kuyucuklu pleytteki ikişer kuyucuğa 40 μl olarak aktarılmıştır. Ayrıca yine kit içeriğindeki standart solüsyon kit talimatları doğrultusunda sulandırılarak her konsantrasyon üçer kuyucuğa 40 μl olarak aktarılmıştır. Tüm kuyucuklara 10 μl 40 mM ATP-2Na solüsyonu eklenmiştir ve pleyt 37⁰C’de 30 dakika inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrası tüm kuyucuklar 4 kez yıkama tamponu ile yıkanmıştır. Her kuyucuğa 100 μl bloklama solüsyonu eklenmiştir ve 30 dakika 37 C’de tekrar inkübasyon yapılmıştır. İnkübasyon sonrası kuyucuklardaki sıvı atılarak her kuyucuğa 50 μl anti-fosfotirozin–HRP solüsyonu eklenmiş ve 37⁰C’de 30 dakika inkübasyon yapılmıştır. Kuyucuklar dört kez yıkama tamponu ile yine yıkanmıştır ve her kuyucuğa 100 μl HRP-substrat solüsyonu (TMBZ) eklenerek 15 dakika 37⁰C’de inkübasyon yapılmıştır. Her kuyucuğa 100 μl stop solüsyonu eklenerek reaksiyon durdurulmuştur ve her kuyucuktaki optik yoğunluk 405 nm’de mikropleyt okuyucu (BioTek, ABD) ile ölçülmüştür. Standart solüsyonların absorbans değerlerinden elde edilen standart eğri ile her örnekteki tirozin kinaz aktivitesi, kit ile hesaplanmıştır (Chan^WY,^Lau^PM,^Yeung^KW,^Kong^ SK.^ The^ second^ generation^ tyrosine^ kinase^ inhibitor^ dasatinib^ induced^ eryptosis^ in^ human^ erythrocytes-An^ in^ vitro^ study. Toxicol^ Lett.^ 2018;295:10-21). Bu aktivite her örnekteki protein miktarına bölünerek kontrol grubuna kıyasla normalize edilmiştir. Apoptoz / Nekroz^Tayini^(Flow^Sitometri)^^^ 1 μM’ın altında IC50 değerine sahip, selektivite indeksi en yüksek ve genel TKI etkinliği belirlenen 2-indolinon türevlerinin (5) apoptoz ve nekrozu uyarıp uyarmadığı pankreas ve böbrek kanser hücrelerinde Annexin V ve propidyum iyod boyaması ile belirlenmiştir.2-İndolinon bileşikleri ile inkübasyon sonrası (IC50 μM konsantrasyonda; 48 ve / veya 72. saatler) hücreler, PBS ile iki kez yıkanmış ve hücre peleti Annexin V bağlama tamponunda süspanse edilmiştir. Bu inkübasyon sonrası hücreler 15 dakika, karanlıkta ve oda sıcaklığında FITC-konjuge Annexin V ve propidyum iyod boyama solüsyonu ile inkübe edilmiştir. Hücreler daha sonra akım sitometrisi ile analiz edilmiştir (Beckman coulter,Navios) (Wlodkowic,^D.,^ Skommer,^ J.,^ Darzynkiewicz,^ Z.^ 2009.^ Flow^ cytometry-based^apoptosis^detection,^Methods^Mol^Biol.,^559,^^1-14). Hücre^Canlılık^Testleri^Bulguları Hücre canlılığı, 48 ve 72 saatte nadiren 5 µM ve sıklıkla 10 µM mevcut buluşa ait bileşikler ile önemli ölçüde azalmıştır. IC50değerleri, en etkili sitotoksik doza sahip olan bahsi geçen bileşikler (IC50 < 1 µM ) ile tedavi edilen insan meme, akciğer ve böbrek kanseri hücrelerinde uygulamaları takip eden 24, 48 ve 72 saatin sonunda hesaplanmıştır. Mevcut buluşa ait bileşiklerden kanser hücrelerini en az %50 oranında (p<0,05) öldürenler seçilerek, IC50 değerindeki μM konsantrasyonun 10 kat konsantrasyonu normal sağlıklı hücreler için toksik olup olmadığı test edilmiştir. Elde edilen in^vitro sonuçlar Tablo 1'de gösterilmiştir.

[0003] Tablo^1:^Genel formül 5’e sahip bileşiklerin ve sunitinib malatın, insan meme hücreleri (MCF-7 ve MDA-MB-231), akciğer (A549), böbrek (CAKI-1 ve A498) kanser hücreleri ve normal hücre hatları (MCF-10F / Beas2b ve HUVEC) üzerinde IC50değerleri (µM). Tablo^2:^Genel formül 5’e sahip bileşiklerin ve sunitinib malatın, insan pankreas (MIAPaCa-2) ve kolon (HT29, HCT-116) kanser hücreleri ve normal hücre hatları (MCF-10F / Beas2b ve HUVEC) üzerinde IC50değerleri (µM). e hatlarına (MCF-7 ve MDA-MB-231) karşı 1 µM’dan daha düşük IC50değerlerine sahip olan bileşiklerin R1 7-klor sübstitüe bileşik 22C ve R1 7-klor ve R2 3-metil sübstitüe bileşik 27C olduğunu göstermektedir. Bileşik 22C (IC50= 0.57 µM) MCF-7 ve bileşik 27C^(IC50= 0.81 µM) MDA-MB-231 için en güçlü ve nontoksik anti-kanserojen madde olarak tespit edilmiştir. Sağlıklı meme kanseri MCF-10F hücre hatlarında IC50 değerleri >10 µM olan iki bileşiğin selektivite indeksleri (SI) sırasıyla >17 ve >12’dir. Bu veriler 22C^ ve 27C bileşiklerinin referans bileşik sunitinib malattan (MCF-7 için IC50= 9.78 µM; MDA-MB-231 için >10 µM) çok daha güçlü etkili ve SI değerlerinin daha yüksek olduğunu göstermektedir (Tablo 1). Test edilen bileşikler içinde akciğer kanseri A549 hücre hattına karşı en etkili bileşiğin R15-klor ve R24-metil sübstitüe bileşik 17C (IC50= 1.11 µM) olduğu belirlenmiştir. Ancak, bu maddenin sağlıklı hücrelerde sitotoksisitesi yüksek bulunmuştur. Bu bulgular 17C bileşiğinin ve test edilen bileşiklerin çoğunun sunitinib malattan (IC50= >10 µM) daha etkili olduğunu göstermektedir (Tablo 1). Böbrek kanseri CAKI-1 hücre hattına karşı test edilen bileşiklerin hiçbiri 1 µM’dan daha düşük IC50değerlerine sahip bulunmamıştır. Test edilen bileşiklerin çoğu 2.49-9.81 µM aralığında CAKI- 1 hücre hatlarına sitotoksisite göstermiştir. Oysa böbrek kanseri A498 hücre hattına karşı on bileşik 1 µM’dan daha düşük konsantrasyonda sitotoksisite göstermiştir. R15-klor ve R24-klor sübstitüe bileşik 19C (IC50= 0.51 µM), R17-klor ve R24-metil sübstitüe bileşik 28C (IC50= 0.6 µM), R15-flor ve R24-klor sübstitüe bileşik 12C (IC50= 0.63 µM), R15-metil ve R23-metil sübstitüe bileşik 48C (IC50= 0.73 µM), ve R15-klor ve R24-flor sübstitüe bileşik 17C (IC50= 0.77 µM), R15- metil ve R24-flor sübstitüe bileşik 45C (IC50= 0.78 µM), R15-metil sübstitüe bileşik Y3 (IC50= 0.87 µM), R15-klor ve R3 metil sübstitüe bileşik Y23 (IC50= 0.89 µM), R15-metil ve R24-klor sübstitüe bileşik 47C (IC50= 0.9 µM) ve R15-metil ve R23-flor sübstitüe bileşik Y8 (IC50= 0.93 µM) en güçlü sitotoksisite gösteren bileşikler olarak saptanmıştır. Bu bileşiklerden sağlıklı MCF-10F / Beas2b hücre hatlarında IC50 değerleri >10 µM olan Y3, Y8 ve Y23 bileşiklerinin selektivite indeksleri >11’dir. Sunitinib malatın CAKI-1 ve A498 hücre hatlarında IC50değerleri sırasıyla 5.13 ve >10 µM olarak belirlenmiştir. Mevcut buluş kapsamında tüm etkili türevler, renal karsinom tedavisi için kullanılan referans ilaç olan sunitinib malattan çok daha güçlü antikanser aktivite sergilemiştir (Tablo 1). Pankreas MIAPaCa-2 kanser hücre hattına karşı on dört bileşik 1 µM’dan daha düşük konsantrasyonda sitotoksisite göstermiştir. R15-metil sübstitüe bileşik Y3 (IC50= 0.13 µM), R15- triflorometoksi ve R3 metil sübstitüe bileşik Y14 (IC50= 0.15 µM), R15-flor sübstitüe bileşik Y5 (IC50= 0.27 µM), R24-metil sübstitüe bileşik Y21 (IC50= 0.40 µM), nonsübstitüe bileşik Y1 (IC50= 0.43 µM), R15,7-diklor sübstitüe bileşik 36C (IC50= 0.46 µM), R15-klor sübstitüe bileşik Y2 (IC50= 0.48 µM), R15- klor ve R24-metil sübstitüe bileşik Y22 (IC50= 0.49 µM), R15- flor ve R24-klor sübstitüe bileşik 12C (IC50= 0.49 µM), R15-triflorometoksi sübstitüe bileşikY4 (IC50= 0.53 µM), R1 5-metil ve R23-flor sübstitüe bileşikY8 (IC50= 0.54 µM), R17-flor ve R24-flor sübstitüe bileşik31C (IC50= 0.73 µM), R17- flor ve R24-metil sübstitüe bileşik 35C (IC50= 0.62 µM) ve R15- triflorometoksi ve R24-flor sübstitüe bileşik 3C (IC50= 0.95 µM) en güçlü sitotoksisite gösteren bileşikler olarak saptanmıştır. Bu bileşiklerden sağlıklı MCF-10F / Beas2b hücre hatlarında IC50 değerleri >10 µM olan Y3, Y5, Y1,^Y21,^Y2,^Y4^ve Y8^ bileşiklerinin selektivite indeksleri sırasıyla >77, 37, 23, 25, 21, 19 ve 19’dur. Bulgular bu bileşiklerin MIAPaCa-2 kanser hücre hattına karşı çoğunun Sunitinib malatın daha selektif ve güçlü etkili olduğunu göstermektedir (Tablo 2). Hücresel test sonuçları test edilen 45 adet 2-indolinon bileşiği (5) arasında kolon HT-29 kanser hücre hattına karşı 1 µM’dan daha düşük IC50 değerlerine sahip olan bileşiklerin R1 5- triflorometoksi R24-klor sübstitüe bileşik 5C (IC50= 0.44 µM), R17-klor R24-flor sübstitüe bileşik 24C (IC50= 0.73 µM) ve R23-flor sübstitüe bileşik 51C (IC50= 0.93 µM) olduğunu göstermektedir. Bu bileşiklerden sağlıklı MCF-10F / Beas2b hücre hatlarında IC50 değerleri >10 µM olan 51C bileşiğinin selektivite indeksi >11’dir. Sunitinib malatın kolon HT-29 kanser hücre hattına karşı IC50 değeri 2.94 µM olarak belirlenmiştir. Veriler 51C bileşiğinin kolon HT-29 kanser hücre hattına karşı Sunitinib malatın daha güçlü ve selektif etkili olduğunu göstermektedir (Tablo 2). Kolon HCT-116 kanser hücre hattına karşı on bileşik 1 µM’dan daha düşük konsantrasyonda sitotoksisite göstermiştir. R17- flor ve R2 4-metil sübstitüe bileşik 35C (IC50= 0.23 µM), R15- triflorometoksi sübstitüe bileşik Y4 (IC50= 0.57 µM), R15-klor ve R23-metil sübstitüe bileşik 20C (IC50= 0.27 µM), R17-flor ve R24-flor sübstitüe bileşik 31C (IC50= 0.39 µM), R15-metil ve R24-flor sübstitüe bileşik 45C (IC50= 0.47 µM), R15-metil ve R23-metil sübstitüe bileşik 48C (IC50= 0.60 µM), R17-flor ve R23-metil sübstitüe bileşik 34C (IC50= 0.64 µM), R15- flor ve R24-klor sübstitüe bileşik12C (IC50= 0.64 µM) ve R15-flor sübstitüe bileşik17C (IC50= 0.93 µM) en güçlü sitotoksisite gösteren bileşikler olarak saptanmıştır. Bu bileşiklerden sağlıklı MCF-10F / Beas2b hücre hatlarında IC50değerleri >10 µM olan Y4^bileşiğinin selektivite indeksi >19’dur. Sunitinib malatın kolon HCT-116 kanser hücre hattına karşı IC50 değeri 1.78 µM olarak belirlenmiştir. Veriler Y4 bileşiğinin kolon HCT-116 kanser hücre hattına karşı Sunitinib malatın daha güçlü etkili olduğunu ve SI değerinin yüksek olduğunu göstermektedir (Tablo 2). Mevcut buluş sahipleri, elde edilen test sonuçları ile, bahsi geçen bileşiklerin sunitinib malattan daha etkili, sağlıklı hücreler için daha az toksik ve selektivite indekslerinin daha yüksek olduğunu, ayrıca R3 de metil sübstitüe türevlerin genellikle non-sübstitüe türevlerden daha düşük etkili olduğunu da ortaya koymaktadır (Tablo 1 ve 2).

[0004] Formül^5’e^sahip^bileşikler^ile^muamele^edilen^A498,^Mia-Pa-Ca-2^ve^HCT-116 hücrelerinde^ genel^tirozin^kinaz^inhibisyonu sonuçları A498, MIAPaCa-2 ve HCT-116 kanser hücre hatlarında sitotoksisiteleri ve sağlıklı hücrelerde nontoksik özellikleri ile öne çıkan formül (5) yapısına sahip olan 11 adet 2-indolinon bileşiğinin (Y1,^Y2,^Y3,^Y4,^Y5,^Y8,^Y14,^Y21,^Y23,^20C ve 22C) kanser hücrelerinde genel tirozin kinaz etkinliği üzerine olan etkileri belirlenmiştir. A498 hücrelerine 48 saat IC50konsantrasyonda uygulanan Y3 maddesi genel tirozin kinaz aktivitesini kontrole kıyasla anlamlı olarak azaltmıştır (p<0,05) (Şekil 1A). 72 saat IC50 konsantrasyonlarda uygulanan Y8 ve Y23 bileşikleri kontrol grubuna kıyasla genel tirozin kinaz aktivitesinde anlamlı bir değişikliğe yol açmamıştır (p>0,05) (Şekil 1B). MIAPaCa-2 pankreas kanseri hücrelerine IC50 konsantrasyonlarda 72 saat uygulanan Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y8, Y14 ve Y21 bileşiklerinden Y21 maddesi hariç diğer tüm maddeler kontrol grubuna kıyasla genel tirozin kinaz aktivitesini anlamlı olarak azaltmıştır (*p<0,05; **p<0,01) (Şekil 2). HCT-116 kolon kanseri hücrelerine IC50konsantrasyonlarda 72 saat uygulanan Y4 ve 20C bileşikleri kontrol grubuna kıyasla tirozin kinaz aktivitesinde anlamlı bir değişikliğe yol açmamıştır (p>0,05) (Şekil 3). Böbrek, pankreas ve kolon kanser hücrelerine uygulanan A serisi maddelerden MTT sonuçlarına göre normal hücrelerde nontoksik özellikleri ile ayrılan bileşiklerin genel tirozin kinaz aktivitelerinde kontrole kıyasla anlamlı seviyede (en az p<0,05) azaltan 2-indolinon türevinin belirlenmesi gerçekleştirilen bu testte A498 hücresi üzerinde Y3 maddesinin, MIAPaCa-2 hücreleri üzerinde Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y8 ve Y14 bileşiklerinin genel tirozin kinaz aktivitesini azalttığı belirlenmiştir. Apoptoz / Nekroz^Tayini^(Flow^Sitometri)^^Sonuçları^ MTT sonuçlarına göre IC50 değerlerinde, A498 hücre hatlarına uygulanan Y3 maddesinin; Annexin V / PI flow sitometri apoptoz sonuçları canlılık, erken apoptoz ve geç apoptoz değerleri kontrol gruplarıyla karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı görülmüştür. Nekroz açısından karşılaştırılma yapıldığında ise kontrol grubuna göre her hangi bir artış veya azalış görülmemiştir. Nekroz seviyeleri tüm deneylerde kontrolle aynı değerlerde çıkmıştır (Şekil 4). Bu sebeple istatistiksel değerlendirilmeye alınmamıştır. Y3 maddesi uygulanan grupta kontrol grubuna göre apoptoz oranı anlamlı derecede arttı (Şekil 4). Anlamlılık değerleri: **p<0.01 ve *** p<0.001. Y3 maddesinin uygulanması A498 hücrelerinde nekroza sebep olmamıştır. Bu hücreler için değerlendirme apoptoz açısından gerçekleştirilmiştir. NH H3CO N A498 hücre hatlarına uygun dozu tespit etmek amaçlı Annexin V / PI flow sitometri ve geç apoptoz değerleri kontrol gruplarıyla karşılaştırıldığında istatistiksel olarak 10 µM dozu en anlamlı görülmüş ve deney aşamalarında bu doz kullanıldı (Şekil 6). Anlamlılık değerleri: **p<0.01 ve *** p<0.001. Nekroz açısından karşılaştırılma yapıldığında ise kontrol grubuna göre her hangi bir artış veya azalış görülmemiştir. Nekroz seviyeleri tüm deneylerde kontrolle aynı değerlerde çıkmıştır (Şekil 5). MTT sonuçlarına göre IC50 değerlerinde, MiaPaca-2 hücre hatlarına uygulanan Y1, Y3, Y4, Y5, Y8, Y14 ve Sunitinib malatın Annexin V / PI flow sitometri apoptoz sonuçları erken apoptoz ve geç apoptoz değerleri kontrol gruplarıyla karşılaştırıldığında apoptoz artışının istatistiksel olarak anlamlı olduğu gözlendi (Şekil 6). Anlamlılık değerleri: **p<0.01 ve *** p<0.001. MTT sonuçlarına göre IC50 değerlerinde, MiaPaca-2 hücre hatlarına uygulanan Y1, Y3, Y4, Y5, Y8, Y14 ve Sunitinib malatın Annexin V / PI flow sitometri apoptoz sonuçları erken apoptoz ve geç apoptoz değerleri kontrol gruplarıyla karşılaştırıldığında apoptoz artışının istatistiksel olarak anlamlı olduğu gözlendi (Şekil 6). Anlamlılık değerleri: **p<0.01 ve *** p<0.001. Nekroz açısından karşılaştırılma yapıldığında ise kontrol grubuna göre her hangi bir artış veya azalış görülmemiştir. Nekroz seviyeleri tüm deneylerde kontrolle aynı değerlerde çıkmıştır (Şekil 6). Bu sebeple istatistiksel değerlendirilmeye alınmamıştır. Y1, Y3, Y4, Y5, Y8, Y14 ve Sunitinib maddesinin uygulanması MiaPaca-2 hücrelerinde nekroza sebep olmamıştır. Bu hücreler için değerlendirme apoptoz açısından gerçekleştirilmiştir. Y1^^^^^R1= H R2= H^^^^^^^^R3= H Y2^^^^^R1= 5-Cl R2= H R3= H Y3^^^^^R1= 5-CH3R2= H R3= H Y4^^^^^R1= 5-OCF3R2= H R3= H Y5^^^^^R1= 5-F R2= H R3= H Y8^^^^^R1= 5-CH3R2= 3-F^^^^^^R3= H Y14^^^R1= 5-OCF3 R2= H R3= CH3 Selektivite indeksi en yüksek ve genel TKI etkinliği belirlenen 2-indolinon türevlerinin (5) apoptoz ve nekrozu uyarıp uyarmadığı pankreas ve böbrek kanser hücrelerinde Annexin V ve propidyum iyod boyaması ile belirlenmiştir. Test edilen Y1, Y2,Y3, Y4, Y8 ve Y14 bileşiklerinin Annexin V / PI flow sitometri apoptoz değerlerinin MTT sonuçlarıyla korele şekilde ortalama %40 ve üzeri olduğu saptanmıştır. Kontrol grupları ve maddelerin apoptoz oranları GraphPad 9.0 sürümünde t test ile analiz edilmiştir. Seçilen A serisi 2-indolinon türevi bileşiklerin kontrole göre apoptoz oranının %20 den fazla olması bu iş paketi için başarı kriteri olarak belirlenmiştir. Belirlenen Annexin V / PI flow sitometri apoptoz değerlerinin MTT sonuçlarıyla korele şekilde ortalama %40 ve üzeri olduğunun saptanması genel TKI etkinlikleri saptanan test edilen Y1, Y2,Y3, Y4, Y8 ve Y14 bileşiklerinin apoptozu uyararak inhibitör etki gösterdiğini kanıtlamaktadır. Ayrıca, tirozin kinazlar hücre çoğalması, farklılaşması ve göçü gibi biyolojik olayların gerçekleşmesini sağlayan hücresel sinyal iletiminde rol alan önemli regülatör moleküllerdir. Mevcut buluşa ait bileşik bir tirozin kinaz inhibitörü ile ilgili olup, bahsedilen kanserlerin tedavisinde kullanılmak üzere sunulmakta ve söz konusu etki mekanizması, tirozin kinazların inhibisyonu ve hücre apoptozunun indüklenmesiyle sağlanmaktadır. Mevcut buluşun tercih edilen diğer yapılanmalarında söz konusu bileşikler ile gerçekleştirilen moleküler modelleme çalışmalarında çeşitli RTK’lara (EGFR, HER2 / neu VEGFR, PDGFR-β, IGFR, c-MET, AXL, CAK, FGFR4, HEK8, RET) bağlanma enerjileri belirlenmiş olup, incelenen bileşiklerin hepsinin nanomolar düzeyde etkili olduğu saptanmıştır. Buluş sahipleri, analiz edilen bileşiklerde özellikle c-MET enzimine en yüksek oranda bağlanma gözlemlemiştir. Söz konusu c-MET enzimine bağlanma enerjisinin -12 kcal / mol’den daha küçük olduğu saptanan en etkili türevin indol halkasının 7- konumunda klor taşıyan bileşik olduğu da ayrıca ortaya koyulmaktadır. Bu veriler ışığında görülmektedir ki, mevcut buluş kapsamında insan meme, akciğer, pankreas, kolon ve / veya böbrek kanseri tedavisinde kullanılmak üzere sunulan bileşikler, ilgili teknik alanda yeni 2-indolinon türevlerine duyulan gereksinimi karşılamaktadır. Söz konusu bileşikler, özellikle halihazırda tedavide kullanılan referans kemoterapi ilaçlarından biri olan sunitinib malattan daha etkili, sağlıklı hücreler için daha az toksik ve selektivite indekslerinin daha yüksek olması bakımlarından avantajlıdır. Buluşun koruma kapsamı ekte verilen istemlerde belirtilmiş olup teknikte uzman bir kişinin, buluşun ana temasından ayrılmadan yukarıda anlatılanlar ışığında benzer yapılanmalar ortaya koyabileceği açıktır.

Claims

İSTEMLER 1. İnsan meme, akciğer, pankreas, kolon ve / veya böbrek kanseri tedavisinde kullanılmak üzere aşağıda yer alan formüle sahip bir bileşik:Formül^5 burada; R1, bir hidrojen, alkil, metoksi, triflorometoksi, halojen, nitro, siyano, karboksamit, sülfonikasit, sodyum sülfonat veya sülfonamid grubunu temsil eder; R2, bir hidrojen, alkil, triflorometil, metoksi, triflorometoksi, halojen, nitro, amin, dimetilamin, siyano, karboksilik asit, sülfonik asit veya hidroksil grubunu temsil eder; ve R3 ve R4 birbirinden bağımsız olarak bir hidrojen veya metil grubunu temsil eder.

2. İstem 1’e göre sunulan bir bileşik olup, özelliği söz konusu R1, R2, R3ve R4gruplarının aşağıda yer alan gruplardan seçilmesidir: R1; H, 5-CH3, 5-CH(CH3)2, 5-C(CH3)3, 5-OCH3, 5-OCF3, 5-F, 5-Cl, 5-Br, 5-I, 5-NH2, 5- NO2, 5-CN, 5-COOH, 5-CONH2, 5-SO3H, 5-SO3Na, 5-SO2NH2,7-CH3, 7-CF3, 7-OCH3, 7- F, 7-Cl, 7-Br, 5,7-diCH3, 5-F-7-CH3, 5-Cl-7-CH3, 7-F-6-Cl, 5,7-diCl, 5,7-diBr, R2; H, 2-CH3, 2-C2H5, 2-CH(CH3)2, 2-C(CH3)3, 2-CF3, 2-OCH3, 2-SCH3, 2-OCF3, 2-F, 2- Cl, 2-Br, 2-I, 2-NO2, 2-NH2, 2-CN, 2-COOH, 2-OH, 3-CH3, 3-C2H5, 3-CH(CH3)2, 3- C(CH3)3, 3-CF3, 3-OCH3, 3-SCH3, 3-OCF3, 3-SCF3, 3-F, 3-Cl, 3-Br, 3-I, 3-NO2, 3-NH2, 3- CN, 3-COOH, 3-OH, 4-CH3, 4-C2H5, 4-CH(CH3)3, 4-C(CH3)3, 4-CF3, 4-OCH3, 4-SCH3, 4- OCF3,4-SCF3,4-F, 4-Cl, 4-Br, 4-I, 4-NO2, 4-NH2, 4-N(CH3)2, 4-CN, 4-COOH, 4-SO3H, 4- OH, 2,3-diCH3, 2,4-diCH3, 2,5-diCH3, 2,6-diCH3, 3,4-diCH3, 3,5-diCH3, 3,5-diCF3, 2,4- diOCH3, 2,5-diOCH3, 3,4-diOCH3, 3,5-diOCH3, 2-CH3-3-Cl, 2-CH3-5-Cl, 4-CH3-3-CF3, 2-OCH3-5-CH3, 2-F-5-CF3, 4-F-3-CF3, 2-Cl-5-CF3, 4-Cl-3-CF3, 5-Cl-2-OCH3, 2,3-diF, 2,4- diF, 2,5-diF, 2,6-diF, 3,4-diF, 3,5-diF, 2,3-diCl, 2,4-diCl, 2,5-diCl, 2,6-diCl, 3,4-diCl, 3,5-diCl, 2-Cl-4F, 2-Cl-6F, 4-Br-2-F, R3; H veya CH3, ve R4;^H veya CH3.

3. İstem 1’e göre sunulan kullanıma yönelik bileşik olup, özelliği söz konusu bileşiğin bir tirozin kinaz inhibitörü olarak kullanıma yönelik olmasının yanı sıra hücre apoptozunu kanserde uyaran bir bileşik olarak kullanıma yönelik olmasıdır.

Images