Antibody-drug conjugates, pharmaceutical compositions and uses thereof

Abstract

Antibody-drug conjugates and pharmaceutical compositions thereof and methods of treating cancer therewith. The antibody-drug conjugates are conjugates of belotecan derivatives and anti-CD44v9 antibodies or antigen binding fragments thereof. The antibody-drug conjugates exhibit superior anti-tumor activity in various solid tumors.

Description

ANTIBODY-DRUG CONJUGATES, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND USES THEREOFField of the Invention

[0001] The present disclosure relates to antibody-drug conjugates and, in particular, to anti-CD44v9 antibody-drug conjugates. The present disclosure also relates to pharmaceutical compositions, preparation methods, uses, and methods of treatment of the conjugates.Background of the Invention

[0002] CD44 is a family of single transmembrane glycoproteins involved in homotypic cell-cell, cell-matrix, and cell-cytoskeletal interaction. There are several well-known ligands of CD44 including hyaluronic acid (HA) , osteopontin (OPN) , collagens, and matrix metalloproteinases (MMPs) . In humans, CD44 is encoded by 19 exons, among which the first five exons (exons 1-5) and the last five exons (exons 16-20) constantly encode CD44s which is the most common and the smallest CD44 protein. CD44 variant isoforms (CD44v) are generated by alternative splicing (v2-v10) and possess the ten CD44s exons plus any combination of the remaining nine variant exons. CD44v isoforms play various roles in cancer and could have impact on key features of carcinogenesis such as tumor initiating and metastasis. These key features often originate from altered signal transduction, resistance to oxidative stress, chemo- / radio resistance, adhesion, extracellular matrix interaction, tumor matrix formation or modulation of CSCs niche. In addition, CD44 variants have been shown to be important for Ras activation through formation of a co-receptor complex with the hepatocyte growth factor HGF and its receptor tyrosine kinase Met, whose phosphorylation activates Ras signaling. Some isoforms also exhibit an antiapoptotic effect and can block Fas-mediated apoptosis.

[0003] One isoform among those, CD44v9, so named for the spliced variants containing the v9 exon, is overexpressed in a variety of solid tumors including (but not limited to) head and neck, non-small cell lung, esophageal, pancreatic, colorectal, breast, bladder, and gastric cancers, with restricted presence on normal healthy tissues. Positive CD44v9 expression was also associated with larger tumor size, deeper tumor invasion, earlier lymph node metastasis, and more advanced clinical stage when compared with CD44v9-negative patient data in a meta-analysis study. Based on the above characteristics, CD44v9 is a promising target for potential antibody-derived cancer therapeutics development.

[0004] The major categories of CD44-targeted therapies include peptide mimetics, aptamers, pharmacological inhibitors, CD44 decoys, HA oligomers, HyACT (Hyaluronic Acid Chemo Transport) , neutralizing antibodies, and antibody drug conjugates. Monoclonal CD44-specific antibodies, which interfere with the binding of HA to CD44, led to the inhibition of anchorage-independent growth of murine mammary carcinoma cells and human colon carcinoma cells and can also induce apoptosis. HA oligosaccharides had similar effects and inhibited tumor growth in vivo most likely by interfering with the binding of hHA  (high molecular weight HA, ～2000 kDa) to CD44. Additionally, CD44 antibodies were employed as targeting agents for tumor-specific delivery of radiotherapy or cytotoxic payloads. Several therapeutic compounds mentioned above have been tested in clinical trials.

[0005] For example, a randomized phase II study of Hyaluronan-irinotecan (HA-IR) showed improvement in progression free survival compared to irinotecan in metastatic colorectal cancer patients, but the results were unfortunately not confirmed in a subsequent Phase III trial. Another Phase IIa trial of HA-irinotecan was conducted in combination with Carboplatin in extensive-stage small cell lung cancer (SCLC) compared to irinotecan with Carboplatin. The study concluded that while the treatments were well tolerated, there was no statistically significant difference between treatment and control arm, although there was a trend that CD44s positive tumors may gain survival benefit. For direct CD44 and specific variant targeting, a humanized antibody binding to the HA-binding proximal domain of all CD44 isoforms, RG7356, was tested  in clinical trials for AML (acute myelocytic leukemia) and advanced solid tumors with limited clinical efficacy but generally well tolerated. A phase I study of 186Re-Labeled chimeric monoclonal antibody specific for CD44v6, U36, was conducted in Head &Neck squamous cell cancer (HNSCC) patients. The study showed that U36 radio-conjugate can be safely administered with dose-limiting myelotoxicity and yielded transient therapeutic effect. While the above CD44-targeting drug modalities only produced modest clinical efficacy results, they were generally well tolerated, with some accompanying imaging studies suggesting tumor-specific targeting was achieved. However, a different clinical outcome was observed with a humanized monoclonal antibody (mAb) , Bivatuzumab (BIWA-4) , combined with potent microtubule inhibitor mertansine to specifically target CD44v6 in HNSCC (Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck) and metastatic breast cancer patients in phase I trials. Although partial responses were observed in 3 patients at high dose levels, these clinical trials were discontinued due to significant cutaneous toxicities with one fatal outcome attributed to the bivatuzumab-mertansine conjugate.

[0006] Taken together, while there are quite a few CD44 targeting anti-cancer agents have been investigated in clinical trials, no active compound has been successfully developed to be both satisfactorily therapeutic effective and safe sufficiently, and none of these investigated compounds in clinical trials are CD44v9 targeting. To date, no antibody drug conjugates (ADCs) targeting CD44v9 are approved or investigated in clinical trials. The unique information on druggability such as efficacy, safety, pharmacokinetic properties and therapeutic window of CD44v9 anti-cancer agents, especially ADCs, are unknown and need to be studied and established.Summary

[0007] In one aspect, provided is an antibody-drug conjugate having a structure of formula (I) ,

[0008] (T-L) γ-mAb  (I) ,

[0009] wherein:

[0010] T is a cytotoxic drug moiety having a structure of formula (II) ,

[0011] wherein R is -C (=O) Rx, -S (=O) Rx or -S (=O) 2Rx, wherein Rx is selected from a group consisting of C1-6 alkyl, halogenated C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, C3-6 cycloalkyl, C3-6 heterocyclyl, 6-10 membered aryl and 5-14 membered heteroaryl; preferably, R is -C (=O) Rx or -S (=O) 2Rx, wherein Rx is selected from a group consisting of C1-6 alkyl, halogenated C1-6 alkyl, C3-6 cycloalkyl, C3-6 heterocyclyl, 6-10 membered aryl and 5-14 membered heteroaryl; more preferably, R is -C (=O) Rx or -S (=O) 2Rx, wherein Rx is selected from a group consisting of C1-6 alkyl, C3-6 cycloalkyl, and phenyl;

[0012] L is a linker;

[0013] γ is an integer or a decimal ranging from 1 to 10, preferably from 5 to 8; and

[0014] mAb is an antibody moiety, wherein the antibody is an anti-CD44v9 antibody or an antigen binding fragment thereof.

[0015] In some embodiments, the linker has a structure of formula (III) ,

[0016] -L1- (L2) m1- (L3) m2- (L4) m3-E-G-  (III)

[0017] wherein L1 is bonded to T and G is bonded to mAb, and wherein

[0018] L1 is selected from a group consisting of Lys, Cit, Cit-Val, Val-Ala, Lys-Val,  wherein each of R’, R1 and R2 is independently H (hydrogen) , D (deuterium) or C1-4 alkyl, Z1 is Cit, Lys, Cit- Val, Cit-Ala, Val-Ala or Lys-Val, each of x1 and x3 is independently 0, 1 or 2, and L1 is bonded to T at position 1 of L1; preferably, L1 is selected from a group consisting of Lys, Cit, Cit-Val, Val-Ala, Lys-Val,

[0019] more preferably, L1 is

[0020] L2 is selected from a group consisting of

[0021] wherein each of R3, R4, R5 and R6 is independently selected from H (hydrogen) , D (deuterium) or C1-4 alkyl, each of y1 and y2 is independently 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8, and L2 is bonded to L1 at position 1 of L2; preferably L2 is selected from a group consisting of

[0022] more  preferably, L2 is

[0023] L3 is selected from a group consisting of amino, N-methylpiperidylene, pyrazolylene or triazolylene, optionally substituted with one or more R7, wherein each R7 is independently selected from H (hydrogen) , D (deuterium) , halogen, =O, CF3, CN, CH2CN, carboxyl, sulfonic acid group, C1-4 alkyl, C1-4 alkoxy, C2-6 alkenyl or C2-6 alkynyl; preferably, L3 is triazolylene having a structure of and bonded to L2 at position 1 of L3;

[0024] L4 is selected from a group consisting of

[0025] wherein L4 is bonded to E at position 2 of L4; preferably, L4 is selected from a group consisting of

[0026] more preferably, L4 is

[0027] E is selected from a group consisting of pyrimidylene, quinolylene or pyrrolo [2, 3-d] pyrimidylene, optionally substituted with one or more R12, wherein each R12 is independently selected from H (hydrogen) , D (deuterium) , halogen, CN, nitro,  C1-2 alkyl or halogenated C1-2 alkyl; preferably E is pyrimidinyl optionally substituted with one or more R12, wherein each R12 is independently H (hydrogen) or D (deuterium) ;

[0028] G is a thioether bond; and

[0029] m1 is 0, 1, 2, or 3, preferably m1 is 1; m2 is 0, 1, or 2, preferably m2 is 0 or 1; and m3 is 0, 1, 2, or 3, preferably m3 is 1.

[0030] In some embodiments, the cytotoxic drug moiety T is selected from a group consisting of

[0031] preferably, the cytotoxic drug moiety is

[0032] and more preferably, the cytotoxic drug moiety is

[0033] In preferable embodiments, the antibody-drug conjugate having a structure selected from a group consisting of:

[0034] wherein γ is an integer or a decimal ranging from 5 to 8, and mAb is an anti-CD44v9 antibody or an antigen binding fragment thereof.

[0035] In some embodiments, G of the linker moiety is formed from thiol group of a Cys residue in the mAb; preferably, the thiol group of a Cys residue in the mAb is a thiol group formed by opening a disulfide bond in the mAb.

[0036] In some embodiments, the mAb binds to a CD44v9 epitope comprising or consisting essentially of SEQ ID NO. 55 or 56.

[0037] In some embodiments, the mAb comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are the same as any of (a) to (d) :

[0038] (a) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 47; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 48;

[0039] (b) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 49; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 50;

[0040] (c) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 51; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 52; and

[0041] (d) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 53; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 54; and,

[0042] wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are preferably defined according to any of CDR definition schemes selected from a group consisting of Chothia, Kabat, IMGT, AbM and Contact.

[0043] In some embodiments, the mAb comprises:

[0044] (a) a heavy chain variable region comprising HCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region comprising LCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and LCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, according to IMGT definition of CDR; or

[0045] (b) a heavy chain variable region comprising HCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, HCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 and HCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and a light chain variable region comprising LCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID  NO: 34, LCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, and LCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, according to IMGT definition of CDR.

[0046] In some embodiments, the mAb comprises:

[0047] (a) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48;

[0048] (b) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50;

[0049] (c) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52; or

[0050] (d) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 54.

[0051] In some embodiments, the mAb comprises a heavy chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and a light chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.

[0052] In preferable embodiments, provided is an antibody-drug conjugate selected from a group consisting of:

[0053] wherein γ is an integer or a decimal ranging from 5 to 8, and mAb is an anti-CD44v9 monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof, wherein the mAb is linked via a thiol group of a Cys residue in the mAb, and the mAb comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are the same as any of (a) to (d) :

[0054] (a) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 47; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 48;

[0055] (b) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 49; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 50;

[0056] (c) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 51; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 52; and

[0057] (d) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 53; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 54; and,

[0058] wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are preferably defined according to any of CDR definition schemes selected from a group consisting of Chothia, Kabat, IMGT, AbM and Contact.

[0059] In preferable embodiments, provided is an antibody-drug conjugate having a structure of

[0060] wherein γ is an integer or a decimal ranging from 5 to 8, and mAb is an anti-CD44v9 monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof, wherein the thioether bond linked to the mAb is formed from a thiol group of a Cys residue in the mAb.

[0061] In some embodiments, the thiol group of a Cys residue in the mAb is a thiol group formed by opening a disulfide bond in the mAb or a free Cys residue contained in the mAb.

[0062] In some embodiments, the mAb binds specifically to a CD44v9 epitope comprising or consisting essentially of SEQ ID NO. 55 or 56.

[0063] In some embodiments, the mAb comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are the same as any of (a) to (d) :

[0064] (a) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 47; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 48;

[0065] (b) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 49; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 50;

[0066] (c) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 51; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 52; and

[0067] (d) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 53; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 54; and,

[0068] wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are preferably defined according to any of CDR definition schemes selected from a group consisting of Chothia, Kabat, IMGT, AbM and Contact.

[0069] In some embodiments, the mAb comprises:

[0070] (a) a heavy chain variable region comprising HCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region comprising LCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and LCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, according to IMGT definition of CDR; or

[0071] (b) a heavy chain variable region comprising HCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, HCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 and HCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and a light chain variable region comprising LCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, LCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, and LCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, according to IMGT definition of CDR.

[0072] In some embodiments, the mAb comprises:

[0073] (a) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48;

[0074] (b) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50;

[0075] (c) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52; or

[0076] (d) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 54.

[0077] In some embodiments, the mAb comprises a heavy chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and a light chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.

[0078] In another aspect, provided is a pharmaceutical composition for treatment of cancer, comprising an antibody-drug conjugate as disclosed herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0079] In a further aspect, provided is a method for treatment of cancer in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of an antibody-drug conjugate as disclosed herein.

[0080] In a further aspect, provided is an antibody-drug conjugate as disclosed herein for use in the treatment of cancer.

[0081] In a further aspect, provided is use of an antibody-drug conjugate as disclosed herein in the preparation of a medicament for treatment of cancer.

[0082] Advantageous of the Invention

[0083] The antibody-drug conjugate in the present disclosure specifically targets CD44v9 and induces cytotoxicity in cells with ectopic CD44v9 expression while no obvious toxic side effects on CD44v9-normally expressed cells.

[0084] The antibody-drug conjugate in the present disclosure shows encouraging preclinical in vivo efficacy in multiple solid tumor models (including but not limited to NSCLC (Non-Small Cell Lung Carcinoma) , HNSCC (Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck) , ESCC (esophageal squamous cell carcinoma) , GC (Gastric Carcinoma) , BC (Bladder Cancer) , TNBC (Triple Negative Breast Cancer) and liver cancer) .

[0085] The antibody-drug conjugate hHTS033-KL in the present disclosure was well tolerated in non-human primate toxicology studies (HNSTD=30mg / kg) and no severe dermal toxicity were observed. hHTS033-KL could potentially have a wide  therapeutic window in clinical testing and can provide benefits for cancer patients with high unmet medical needs.Brief Description of the Drawings

[0086] Figure 1. RP-HPLC chromatograph of hHTS033-KL.

[0087] Figure 2. SEC chromatograph of hHTS033-KL.

[0088] Figure 3. Binding affinity of hHTS033-KL on tumor cell lines.

[0089] Figure 4. Internalization of hHTS033-KL on tumor cell lines.

[0090] Figure 5. Tumor growth curves on mouse subcutaneous MDA-MB-468 model -ADC drugs study.

[0091] Figure 6. The change curves of the average body weights of the tumor-bearing mice on the subcutaneous MDA-MB-468 CDX mice model.

[0092] Figure 7. Tumor growth curves on mouse subcutaneous 5637 model -ADC drugs study.

[0093] Figure 8. The change curves of the average body weights of the tumor-bearing mice on the subcutaneous 5637 CDX mice model.

[0094] Figure 9. The tumor growth curves of LD1-0025-361336 PDX model.

[0095] Figure 10. The relative change of body weight after treatment in LD1-0025-361336 PDX model.

[0096] Figure 11. The tumor growth curves of LD1-0017-361443 Gastric cancer PDX model.

[0097] Figure 12. The relative change of body weight after treatment in LD1-0017-361443 Gastric cancer PDX model.

[0098] Figure 13. The tumor growth curves of Liver cancer PDX model LD1-0011-360763.

[0099] Figure 14. The relative change of body weight after treatment in Liver cancer PDX model LD1-0011-360763.Detailed Description of the Invention

[0100] Definition

[0101] It is to be noted that the term “a” or “an” entity refers to one or more of that entity; for example, “atruncated nonsignaling variant” is understood to represent one or more truncated nonsignaling variants. As such, the terms “a” (or “an” ) , “one or more, ” and “at least one” can be used interchangeably herein.

[0102] As used herein, the term "antibody-drug conjugate" is a compound in which an antibody or an antigen binding fragment thereof is linked with a cytotoxic drug via a linker. In the context of this disclosure, the term "antibody-drug conjugate" , or sometimes “conjugate” , specifically refers to a compound in which an anti-CD44v9 antibody or an antigen binding fragment thereof is linked with a belotecan derivative via a linker.

[0103] As used herein, the term "linker" refers to a fragment that links a cytotoxic drug moiety with an antibody moiety. The linker is either cleavable or non-cleavable. For example, the linker can be cleaved in a specific environment (e.g., an intracellular low pH environment) or under a specific action (e.g., the action of lysosomal protease) , thereby dissociating the cytotoxic drug moiety from the antibody moiety.

[0104] As used herein, the term "antibody" is a complete monoclonal antibody or a multi-specific antibody (e.g., a bispecific antibody) . Therefore, an “anti-CD44v9 antibody” includes a complete anti-CD44v9 monoclonal antibody and a complete multi-specific antibody with one specificity to CD44v9 and the remaining specificity to one or more different antigens (e.g., tumor specific antigens or tumor associated antigens) or different epitopes of the same antigen.

[0105] As used herein, the term "monoclonal antibody" refers to an antibody from a group of substantially uniform antibodies, i.e., antibodies that make up the group are identical except for a small number of possible natural mutations. A monoclonal antibody has high specificity for one determinant (epitope) of an antigen, while a comparative polyclonal antibody contains different antibodies for different determinants (epitopes) . In addition to specificity, the monoclonal antibody has the  advantage of being free from contamination by other antibodies during synthesis. In the context of the present disclosure, a monoclonal antibody also specifically includes a chimeric antibody, i.e., a portion of a heavy chain and / or a light chain is the same as or homologous to a type, a class, or a subclass of antibodies, while the rest is the same as or homologous to another type, another class, or another subclass of antibodies, provided the antibody has required bioactivity. The chimeric antibody available in the disclosure includes an antibody containing a variable region antigen binding sequence from a rodent (e.g., a rat or a mouse) and a human constant region sequence.

[0106] The term "multispecific antibody" includes, for example, a bispecific or trispecific antibody which is an antibody having two and three different antigen binding specificities, respectively. Similarly, a tetra-specific antibody is an antibody having four different antigen binding specificities. Various forms of multi-specific antibody are available in the art, including but not limited to, BiTE, DART, Trimab, CrossMab, knob-in-hole IgG common LC, tandAbs, IgG-scFv, scFv2-Fc, and so on.

[0107] The term "bispecific antibody" , also known as "bifunctional antibody conjugate" , refers to an antibody formed by a first antibody (fragment) and a second antibody (fragment) through a coupling arm. The bispecific antibody retains the activity of each antibody and thus has bifunctional and bispecific properties. The dual anti-ADCs currently under investigation can be divided into two main categories: bispecific ADCs targeting dual tumor associated antigens (TAA) (e.g., MUC1 / EGFR-ADC) , and bispecific ADCs targeting dual epitopes (e.g., HER2 / HER2-ADC) .

[0108] The term “antigen” is used herein to mean molecules that trigger the production of antibodies by inducing an immune response. Typical antigens are proteins, or ectodomains or a part thereof, present on the surface of pathogens, such as bacteria, fungi, viruses, and other foreign particles. When these harmful agents enter the body, they induce an immune response in the body for the production of antibodies.

[0109] The term "complete antibody" refers to an antibody not subject to cleavage and may vary according to the class to which the antibody belongs. Complete antibody can be classified into different "classes" according to amino acid sequences of heavy chain constant regions. The main five classes are IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, and  several of which can also be further classified into different "subclasses" (isotypes) , such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2. For example, a complete antibody of an IgG type will be an antibody containing a heavy chain variable region (VH) , a light chain variable region (VL) , a light chain constant region (CL) and a heavy chain constant region (CH, including CH1, CH2 and CH3) . The variable and constant regions can be natural (e.g., human natural constant region sequences) or humanized (e.g., a humanized sequence from a mouse sequence via CDR grafting) . However, in the case of a heavy chain antibody, a complete antibody is an antibody containing VH, CH2 and CH3 only.

[0110] The term "antibody fragment" or “antigen binding fragment” of an antibody, as used herein interchangeably, refers to a fragment of a complete antibody containing an antigen binding region of the antibody. Examples of antibody fragment includes Fab, Fab’, F (ab’ ) 2, Fv, scFv and the like. Regardless of structure, an antibody fragment binds with the same antigen that is recognized by the intact antibody. The term “antibody fragment” also includes aptamers, spiegelmers, and diabodies. The term “antibody fragment” also includes any synthetic or genetically engineered protein that acts like an antibody by binding to a specific antigen to form a complex.

[0111] By “specifically binds” , “specific to” , or “has specificity to, ” it is generally meant that an antibody binds to an epitope via its antigen-binding domain, and that the binding entails some complementarity between the antigen-binding domain and the epitope. According to this definition, an antibody is said to “specifically bind” to an epitope when it binds to that epitope, via its antigen-binding domain more readily than it would bind to a random, unrelated epitope. The term “specificity” is used herein to qualify the relative affinity by which a certain antibody binds to a certain epitope. For example, antibody “A” may be deemed to have a higher specificity for a given epitope than antibody “B, ” or antibody “A” may be said to bind to epitope “C” with a higher specificity than it has for related epitope “D. ”

[0112] As used herein, “cancer” or “tumor” as used interchangeably herein is meant to a group of diseases which can be treated according to the disclosure and involve abnormal cell growth with the potential to invade or spread to other parts of the  body. Not all tumors are cancerous; benign tumors do not spread to other parts of the body. Possible signs and symptoms include: a new lump, abnormal bleeding, a prolonged cough, unexplained weight loss, and a change in bowel movements among others. There are over 100 different known cancers that affect humans. As used herein, “cancer” includes, without limitation, a solid cancer (e.g., a tumor) and a hematologic malignancy. A  “hematologic malignancy” , also known as a blood cancer, is a cancer that originates in blood-forming tissue, such as the bone marrow or other cells of the immune system. Hematologic malignancies include, without limitation, leukemias (such as acute myeloid leukemia (ANIL) , acute promyelocytic leukemia, acute lymphoblastic leukemia (ALL) , acute mixed lineage leukemia, chronic myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , hairy cell leukemia and large granular lymphocytic leukemia, myelodysplastic syndrome (MDS) , myeloproliferative disorders (polycythemia vera, essential thrombocytosis, primary myelofibrosis and chronic myeloid leukemia) , lymphomas, multiple myeloma, MGUS and similar disorders, Hodgkin’s lymphoma, non-Hodgkin lymphoma (NHL) , primary mediastinal large B-cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma, transformed follicular lymphoma, splenic marginal zone lymphoma, lymphocytic lymphoma, T-cell lymphoma, and other B-cell malignancies. “Solid cancers” include, without limitation, fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteogenic sarcoma, chordoma, angiosarcoma, endotheliosarcoma, lymphangiosarcoma, lymphangioendotheliosarcoma, synovioma, mesothelioma, Ewing's tumor, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, colon cancer, colorectal cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, bone cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, esophogeal cancer, stomach cancer, oral cancer, nasal cancer, throat cancer, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, sebaceous gland carcinoma, papillary carcinoma, papillary adenocarcinomas, cystadenocarcinoma, medullary carcinoma, bronchogenic carcinoma, renal cell carcinoma, hepatoma, bile duct carcinoma, choriocarcinoma, seminoma, embryonal carcinoma, Wilms' tumor, cervical cancer, uterine cancer, testicular cancer, small cell lung carcinoma, bladder carcinoma, lung cancer, epithelial  carcinoma, glioma, glioblastoma multiforme, astrocytoma, medulloblastoma, craniopharyngioma, ependymoma, pinealoma, hemangioblastoma, acoustic neuroma, oligodendroglioma, meningioma, skin cancer, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma.

[0113] As used herein, the terms “treat” or “treatment” refer to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures, wherein the object is to prevent or slow down (lessen) an undesired physiological change or disorder, such as the progression of cancer. Beneficial or desired clinical results include, but are not limited to, alleviation of symptoms, diminishment of extent of disease, stabilized (i.e., not worsening) state of disease, delay or slowing of disease progression, amelioration or palliation of the disease state, and remission (whether partial or total) , whether detectable or undetectable. “Treatment” can also mean prolonging survival as compared to expected survival if not receiving treatment. Those in need of treatment include those already with the condition or disorder as well as those prone to have the condition or disorder or those in which the condition or disorder is to be prevented.

[0114] As used herein, phrases such as “to a patient in need of treatment” or “asubject in need of treatment” includes subjects, such as mammalian subjects, that would benefit from administration of the conjugates or composition of the present disclosure used, e.g., for detection, for a diagnostic procedure and / or for treatment.

[0115] “Therapeutically effective amount” or “effective amount” refers to an amount effective, at dosages and for periods of time necessary, to achieve a desired therapeutic result. A therapeutically effective amount may vary according to factors such as the disease state, age, sex, and weight of the individual, and the ability of a therapeutic or a combination of therapeutics to elicit a desired response in the individual. Exemplary indicators of an effective therapeutic or combination of therapeutics include, for example, improved well-being of the patient, reduction in a tumor burden, arrested or slowed growth of a tumor, and / or absence of metastasis of cancer cells to other locations in the body.

[0116] By “conservative mutations” it is meant one or more changes of an amino acid residue to a homologous one (such as isoleucine to leucine, aspartate to glutamate,  or cysteine to serine) , which is not expected to perturb the protein significantly. Furthermore, nucleotide or amino acid substitutions, deletions, or insertions leading to conservative mutations or changes at “non-essential” amino acid regions may be made. For example, a polypeptide or amino acid sequence derived from a designated protein may be identical to the starting sequence except for one or more individual amino acid substitutions, insertions, or deletions, e.g., one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, fifteen, twenty or more individual amino acid substitutions, insertions, or deletions. In certain embodiments, a polypeptide or amino acid sequence derived from a designated protein has one to five, one to ten, one to fifteen, or one to twenty individual amino acid substitutions, insertions, or deletions relative to the starting sequence.

[0117] The abbreviation “CDR” stands for “complementarity determining region” which is part of the variable chains in immunoglobulins (antibodies) and T cell receptors, generated by B-cells and T-cells respectively, where these molecules bind to their specific antigen. Each of heavy chain variable region and light chain variable regions contains three CDRs, and they are named in this disclosure as HCDR1, HCDR2, and HCDR3 (for heavy chain) , and LCDR1, LCDR2, and LCDR3 (for light chain) , respectively. For antigen recognition and binding, a total of six CDRs from both the light and heavy chain variable region is required. However, nanobodies or heavy chain antibodies only require three CDRs in the heavy chain variable region to recognize and bind to an epitope on a specific antigen. Each of the heavy chain variable region and the light chain variable region can be expressed as FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (N toward C terminus) , wherein CDRs regions are distributed in four less variable framework regions (FRs) , i.e., FR1, FR2, FR3, and FR4.

[0118] There are various methods and tools available in the art to predict the CDRs in an antibody according to various CDR definition schemes, including but not limited to Chothia, Kabat, IMGT, AbM and Contact. The Kabat definition is based on sequence variability and is the most commonly used. The Chothia definition is based on the location of the structural loop regions. The Contact definition is based on an analysis of the available complex crystal structures. This definition is likely to be the  most useful for people wishing to perform mutagenesis to modify the affinity of an antibody since these are residues which take part in interactions with antigen. A variety of online tools are available to automatically annotate the CDRs in an antibody submitted to the tool webpage. The definition of CDRs within a variable region will then lead to the definition of the FR1, FR2, FR3, and FR4 within that variable region.

[0119] By “subject” or “individual” or “animal” or “patient” or “mammal, ” is meant any subject, particularly a mammalian subject, for whom diagnosis, prognosis, or therapy is desired. Mammalian subjects include humans, domestic animals, farm animals, and zoo, sport, or pet animals such as dogs, cats, guinea pigs, rabbits, rats, mice, horses, cattle, cows, and so on.

[0120] As used herein, the term "C1-6 alkyl" refers to linear or branched alkyl containing 1 to 6 carbon atoms, including, for example, "C1-4 alkyl" , "C1-3 alkyl" and "C1-2 alkyl" . Specific examples include, but are not limited to methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, iso-pentyl, 2-methyl butyl, neopentyl, 1-ethyl propyl, n-hexyl, isohexyl, 3-methyl pentyl, 2-methyl pentyl, 1-methyl pentyl, 3, 3-dimethyl butyl, 2, 2-dimethyl butyl, 1, 1-dimethyl butyl, 1, 2-dimethyl butyl, 1, 3-dimethyl butyl, 2, 3-dimethyl butyl, 2-ethyl butyl and 1, 2-dimethyl propyl.

[0121] As used herein, the term "C2-6 alkenyl" refers to linear, branched or cyclic alkenyl containing at least a double bond and 2 to 6 carbon atoms, including, for example, "C2-4 alkenyl" . Examples thereof include, but are not limited to vinyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 1, 3-butadienyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 1, 3-pentadienyl, 1, 4-pentadienyl, 1-hexenyl, 2-hexenyl, 3-hexenyl, 1, 4-hexadienyl, cyclopentenyl, 1, 3-cyclopentadienyl, cyclohexenyl and 1, 4-cyclohexadienyl.

[0122] As used herein, the term "C2-6 alkynyl" refers to linear or branched alkynyl containing at least a triple bond and 2 to 6 carbon atoms, including, for example, "C2-4 alkynyl" . Examples thereof include, but are not limited to ethynyl, propynyl, 2-butynyl, 2-pentynyl, 3-pentynyl, 4-methyl-2-pentynyl, 2-hexynyl, 3-hexynyl and 5-methyl-2-hexynyl.

[0123] As used herein, the term "halogen" includes fluorine, chlorine, bromine and iodine.

[0124] As used herein, the term "C3-6 cycloalkyl" refers to saturated cyclic alkyl containing 3 to 6 carbon atoms. Specific examples include, but are not limited to cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl and cyclohexyl.

[0125] As used herein, the term "3-6 membered heterocyclyl" refers to a cyclic group containing 3 to 6 ring-forming atoms, at least one of which is a heteroatom, such as a nitrogen atom, an oxygen atom or a sulfur atom. Examples include but are but not limited to oxiranyl, oxocyclobutyl, pyrrolidinyl, tetrahydrofuranyl, piperidinyl, and piperazinyl.

[0126] As used herein, the term "C1-6 alkoxy" refers to a group having a structure of C1-6 alkyl-O-, wherein C1-6 alkyl is as defined previously. Specific examples include, but are not limited to methoxyl, ethoxyl, propoxyl, isopropoxyl, n-propoxyl, isopropoxyl, n-butoxyl, isobutoxyl, tert-butoxyl, pentoxyl and hexyloxyl.

[0127] As used herein, the term "6-10 membered aryl" refers to a monocyclic or polycyclic hydrocarbonyl having aromaticity containing 6 to10 ring-forming atoms, such as phenyl and naphthyl.

[0128] As used herein, the term "5-14 membered heteroaryl" refers to a cyclic group having aromaticity containing 5 to 14 ring-forming atoms, wherein at least one ring-forming atom is a heteroatom, such as a nitrogen atom, an oxygen atom or a sulfur atom. Specific examples include, but are not limited to furyl, thienyl, pyrrolyl, thiazolyl, isothiazolyl, thiadiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, oxadiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, 1, 2, 3-triazolyl, 1, 2, 4-triazolyl, 1, 2, 3-oxadiazolyl, 1, 2, 4-oxadiazolyl, 1, 2, 5-oxadiazolyl, 1, 3, 4-oxadiazolyl, pyridyl, 2-pyridone, 4-pyridone, pyrimidinyl, 1, 4-dioxacyclohexadienyl, 2H-1, 2-oxazinyl, 4H-1, 2-oxazinyl, 6H-1, 2-oxazinyl, 4H-1, 3-oxazinyl, 6H-1, 3-oxazinyl, 4H-1, 4-oxazinyl, pyridazinyl, pyrazinyl, 1, 2, 3-triazinyl, 1, 3, 5-triazinyl, and 1, 2, 4, 5-tetrazinyl.

[0129] Anti-CD44v9 antibodies

[0130] The antibody useful for the antibody-drug conjugate as described herein is an anti-CD44v9 antibody or an antigen binding fragment thereof.

[0131] In some embodiments, the anti-CD44v9 antibody specifically binds to CD44v9 expressed on a tumor cell and is internalized by the tumor cell.

[0132] In some embodiments, the anti-CD44v9 antibody binds to an epitope of CD44v9 comprising or consisting essentially of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 55 or 56. In some embodiments, the anti-CD44v9 antibody binds to an epitope of CD44v9 consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 55. In some embodiments, the anti-CD44v9 antibody binds to an epitope of CD44v9 consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 56.

[0133] In some embodiments, the anti-CD44v9 antibody comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are the same as any of (a) to (d) :

[0134] (a) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 47; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 48;

[0135] (b) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 49; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 50;

[0136] (c) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 51; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 52; and

[0137] (d) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 53; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 54; and,

[0138] wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are preferably defined according to any of CDR definition schemes selected from a group consisting of Chothia, Kabat, IMGT, AbM and Contact.

[0139] In some embodiments, the anti-CD44v9 antibody comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3, wherein the HCDR1,  HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are the same as the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 49; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 50; wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are preferably defined according to any of CDR definition schemes selected from a group consisting of Chothia, Kabat, IMGT, AbM and Contact.

[0140] In some embodiments, the anti-CD44v9 antibody comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are the same as the HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 51; and the LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 52; wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are preferably defined according to any of CDR definition schemes selected from a group consisting of Chothia, Kabat, IMGT, AbM and Contact.

[0141] In preferable embodiments, the anti-CD44v9 antibody comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region comprising LCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and LCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, according to IMGT definition of CDR.

[0142] In preferable embodiments, the anti-CD44v9 antibody comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, HCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 and HCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and a light chain variable region comprising LCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, LCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, and LCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, according to IMGT definition of CDR.

[0143] In preferable embodiments, the anti-CD44v9 antibody comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48.

[0144] In preferable embodiments, the anti-CD44v9 antibody comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50.

[0145] In preferable embodiments, the anti-CD44v9 antibody comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.

[0146] In preferable embodiments, the anti-CD44v9 antibody comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 54.

[0147] In preferable embodiments, the anti-CD44v9 antibody comprises a heavy chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and a light chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.

[0148] In preferable embodiments, the anti-CD44v9 antibody comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, a heavy chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and a light chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.

[0149] In preferable embodiments, the anti-CD44v9 antibody comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52, a heavy chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and a light chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.

[0150] In either of the embodiments described above, the anti-CD44v9 antibody is preferably of IgG type, more preferably IgG1 subtype. Preferably, the anti-CD44v9 antibody is of IgG1 type and comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 having an amino acid sequence of SEQ  ID NO: 3, and a light chain variable region comprising LCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and LCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, according to IMGT definition of CDR. Preferably, the anti-CD44v9 antibody is of IgG1 type and comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50. Preferably, the anti-CD44v9 antibody is of IgG1 type and comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.

[0151] Methods for producing and purifying the anti-CD44v9 antibody were disclosed in the art (see WO 2022 / 041104, WO 2019 / 161528, WO 2015 / 076425, and WO 2011 / 007853, the disclosure of each of them is incorporated herein in its entirety by reference) .

[0152] Belotecan Derivatives

[0153] The cytotoxic drug moiety useful for the antibody-drug conjugate as described herein is a belotecan derivative having a structure of formula (II) ,

[0154] wherein R is -C (=O) Rx, -S (=O) Rx or -S (=O) 2Rx, wherein Rx is selected from a group consisting of C1-6 alkyl, halogenated C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, C3-6 cycloalkyl, C3-6 heterocyclyl, 6-10 membered aryl and 5-14 membered heteroaryl; preferably, R is -C (=O) Rx or -S (=O) 2Rx, wherein Rx is selected from a group consisting of C1-6 alkyl, halogenated C1-6 alkyl, C3-6 cycloalkyl, C3-6 heterocyclyl, 6-10 membered aryl and 5-14 membered heteroaryl; more preferably, R is -C (=O) Rx or -S (=O) 2Rx, wherein Rx is selected from a group consisting of C1-6 alkyl, C3-6 cycloalkyl, and phenyl.

[0155] In some embodiments, the cytotoxic drug moiety useful for the antibody-drug conjugates described herein is selected from a group consisting of

[0156] In preferable embodiments, the cytotoxic drug moiety useful for the antibody-drug conjugates described herein is

[0157] In more preferable embodiments, the cytotoxic drug moiety useful for the antibody-drug conjugates described herein is

[0158] Methods for manufacturing and purifying the belotecan derivatives as described herein were available in the art (see, for example, WO 2020 / 156189, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference) .

[0159] Linkers

[0160] The anti-CD44v9 antibody is linked with the cytotoxic drug via a suitable linker to form the antibody-drug conjugates as described herein. The present disclosure envisages any linkers as conventionally used in the field in the antibody-drug conjugate be usable with the antibody-drug conjugates as described herein.

[0161] In some embodiments, linker has a structure of formula (III) ,

[0162] -L1- (L2) m1- (L3) m2- (L4) m3-E-G-  (III)

[0163] wherein L1 is bonded to the cytotoxic drug moiety and G is bonded to the anti-CD44v9 antibody moiety, and wherein

[0164] L1 is selected from a group consisting of Lys, Cit, Cit-Val, Val-Ala, Lys-Val,  wherein each of R’, R1 and R2 is independently H (hydrogen) , D (deuterium) or C1-4 alkyl, Z1 is Cit, Lys, Cit-Val, Cit-Ala, Val-Ala or Lys-Val, each of x1 and x3 is independently 0, 1 or 2, and L1 is bonded to the cytotoxic drug moiety at position 1 of L1; preferably, L1 is selected from a group consisting of Lys, Cit, Cit-Val, Val-Ala, Lys-Val,

[0165] more preferably, L1 is

[0166] L2 is selected from a group consisting of

[0167] wherein each of R3, R4, R5 and R6 is independently selected from H (hydrogen) , D (deuterium) or C1-4 alkyl, each of y1 and y2 is independently 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8, and L2 is bonded to L1 at position 1 of L2; preferably L2 is selected from a group consisting of

[0168] more preferably, L2 is

[0169] L3 is selected from a group consisting of amino, N-methylpiperidylene, pyrazolylene or triazolylene, optionally substituted with one or more R7, wherein each  R7 is independently selected from H (hydrogen) , D (deuterium) , halogen, =O, CF3, CN, CH2CN, carboxyl, sulfonic acid group, C1-4 alkyl, C1-4 alkoxy, C2-6 alkenyl or C2-6 alkynyl; preferably, L3 is triazolylene having a structure of and bonded to L2 at position 1 of L3;

[0170] L4 is selected from a group consisting of

[0171] wherein L4 is bonded to E at position 2 of L4; preferably, L4 is selected from a group consisting of

[0172] more preferably, L4 is

[0173] E is selected from a group consisting of pyrimidylene, quinolylene or pyrrolo [2, 3-d] pyrimidylene, optionally substituted with one or more R12, wherein each R12 is independently selected from H (hydrogen) , D (deuterium) , halogen, CN, nitro, C1-2 alkyl or halogenated C1-2 alkyl; preferably E is pyrimidinyl optionally substituted with one or more R12, wherein each R12 is independently H (hydrogen) or D (deuterium) ;

[0174] G is a thioether bond; and

[0175] m1 is 0, 1, 2, or 3, preferably m1 is 1; m2 is 0, 1, or 2, preferably m2 is 0 or 1; and m3 is 0, 1, 2, or 3, preferably m3 is 1.

[0176] In some embodiments, linker has a structure of formula (III) ,

[0177] -L1- (L2) m1- (L3) m2- (L4) m3-E-G-  (III)

[0178] wherein L1 is bonded to the cytotoxic drug moiety and G is bonded to the anti-CD44v9 antibody moiety, and wherein

[0179] L1 is selected from a group consisting of Lys, Cit, Cit-Val, Val-Ala, Lys-Val,

[0180] and L1 is bonded to the cytotoxic drug moiety at position 1 of L1;

[0181] L2 is selected from a group consisting of

[0182] L2 is bonded to L1 at position 1 of L2;

[0183] L3 is triazolylene having a structure of and bonded to L2 at position 1 of L3;

[0184] L4 is selected from a group consisting of

[0185] and L4 is bonded to E at position 2 of L4;

[0186] E is pyrimidinyl optionally substituted with one or more R12, wherein each R12 is independently H (hydrogen) or D (deuterium) ;

[0187] G is a thioether bond; and

[0188] m1 is 0, 1, 2, or 3, preferably m1 is 1; m2 is 0, 1, or 2, preferably m2 is 0 or 1; and m3 is 0, 1, 2, or 3, preferably m3 is 1.

[0189] In some embodiments, linker has a structure of formula (III) ,

[0190] -L1- (L2) m1- (L3) m2- (L4) m3-E-G-  (III)

[0191] wherein L1 is bonded to the cytotoxic drug moiety and G is bonded to the anti-CD44v9 antibody moiety, and wherein

[0192] L1 is and bonded to the cytotoxic drug moiety at position 1 of L1;

[0193] L2 is and bonded to L1 at position 1 of L2;

[0194] L3 is triazolylene having a structure of and bonded to L2 at position 1 of L3;

[0195] L4 is and bonded to E at position 2 of L4;

[0196] E is pyrimidinyl;

[0197] G is a thioether bond; and

[0198] m1 is 1; m2 is 0 or 1; and m3 is 1.

[0199] It is noted that the thioether bond (G) in the present disclosure is formed from a thiol group of a Cys residue in the anti-CD44v9 antibody, which Cys residue may be formed by opening a disulfide bond in the antibody or is a free Cys residue  contained in the antibody. As will be readily known in the art, depending on different demarcation schemes, the thioether bond (G) may also be considered not a part of the linker but belonging to a part of the anti-CD44v9 antibody, as seen from the final conjugates synthesized. For example, in some embodiments, the linker moiety does not contain the thioether bond and the sulfur atom forms part of a Cys residue of an anti-CD44V9 antibody.

[0200] Antibody-Drug Conjugates

[0201] The present disclosure, in one aspect, provides an antibody-drug conjugate having a structure of formula (I) ,

[0202] (T-L) γ-mAb  (I) ,

[0203] wherein:

[0204] T is a cytotoxic drug moiety having a structure of formula (II) ,

[0205] wherein R is -C (=O) Rx, -S (=O) Rx or -S (=O) 2Rx, wherein Rx is selected from a group consisting of C1-6 alkyl, halogenated C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, C3-6 cycloalkyl, C3-6 heterocyclyl, 6-10 membered aryl and 5-14 membered heteroaryl; preferably, R is -C (=O) Rx or -S (=O) 2Rx, wherein Rx is selected from a group consisting of C1-6 alkyl, halogenated C1-6 alkyl, C3-6 cycloalkyl, C3-6 heterocyclyl, 6-10 membered aryl and 5-14 membered heteroaryl; more preferably, R is -C (=O) Rx or -S (=O) 2Rx, wherein Rx is selected from a group consisting of C1-6 alkyl, C3-6 cycloalkyl, and phenyl;

[0206] L is a linker moiety;

[0207] γ is an integer or a decimal ranging from 1 to 10; and

[0208] mAb is an antibody moiety, wherein the antibody is an anti-CD44v9 antibody or an antigen binding fragment thereof.

[0209] In some embodiments, provided is an antibody-drug conjugate having a structure of formula (I) ,

[0210] (T-L) γ-mAb  (I) ,

[0211] wherein:

[0212] T is a cytotoxic drug moiety as defined herein above in the Belotecan Derivatives section;

[0213] L is a linker moiety as defined herein above in the Linkers section;

[0214] γ is an integer or a decimal ranging from 1 to 10; and

[0215] mAb is an antibody moiety, wherein the antibody is an anti-CD44v9 antibody or an antigen binding fragment thereof.

[0216] In some embodiments, provided is an antibody-drug conjugate having a structure of formula (I) ,

[0217] (T-L) γ-mAb  (I) ,

[0218] wherein:

[0219] T is a cytotoxic drug moiety as defined herein above in the Belotecan Derivatives section;

[0220] L is a linker moiety;

[0221] γ is an integer or a decimal ranging from 1 to 10; and

[0222] mAb is an anti-CD44v9 antibody or an antigen binding fragment thereof as defined herein above in the Anti-CD44v9 antibodies section.

[0223] In some embodiments, provided is an antibody-drug conjugate having a structure of formula (I) ,

[0224] (T-L) γ-mAb  (I) ,

[0225] wherein:

[0226] T is a cytotoxic drug moiety as defined herein above in the Belotecan Derivatives section;

[0227] L is a linker moiety as defined herein above in the Linkers section;

[0228] γ is an integer or a decimal ranging from 1 to 10; and

[0229] mAb is an anti-CD44v9 antibody or an antigen binding fragment thereof as defined herein above in the Anti-CD44v9 antibodies section.

[0230] In either of the embodiments described above, γ is preferably an integer or a decimal ranging from 5 to 8, for example, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, or 8. The parameter γ is also known as DAR (drug to antibody ratio) , which is one of the most important quality parameters of an antibody-drug conjugate and it is presented as the average number of drug molecules conjugated to an antibody.

[0231] Various analytical approaches for DAR assessment are available in the art, including but not limited to, Ultraviolet-Visible (UV / Vis) spectroscopy, Hydrophobic interaction chromatography (HIC) , Reversed phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) , and Liquid chromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry (LC-ESI-MS) . In some embodiments, the value of parameter γ is determined by RP-HPLC for the antibody-drug conjugates disclosed herein.

[0232] In preferable embodiments, the antibody-drug conjugate disclosed herein is selected from a group consisting of:

[0233] wherein γ is an integer or a decimal ranging from 5 to 8, and mAb is an antibody moiety, wherein the antibody is an anti-CD44v9 antibody or an antigen binding fragment thereof.

[0234] In preferable embodiments, the anti-CD44v9 antibody is as defined herein above in the Anti-CD44v9 antibodies section.

[0235] As discussed herein above, in the antibody-drug conjugates disclosed herein, the thioether bond (G) is formed from a thiol group of a Cys residue in the anti-CD44v9 antibody, which Cys residue may be formed by opening a disulfide bond in the antibody or is a free Cys residue contained in the antibody.

[0236] In further preferable embodiments, the antibody-drug conjugate disclosed herein is selected from a group consisting of:

[0237] wherein γ is an integer or a decimal ranging from 5 to 8, and mAb is an anti-CD44v9 monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof, wherein the mAb is linked via a thiol group of a Cys residue in the mAb, and the mAb comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are the same as any of (a) to (d) :

[0238] (a) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 47; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 48;

[0239] (b) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 49; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 50;

[0240] (c) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 51; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 52; and

[0241] (d) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 53; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 54; and,

[0242] wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are preferably defined according to any of CDR definition schemes selected from a group consisting of Chothia, Kabat, IMGT, AbM and Contact.

[0243] In preferable embodiments, the mAb is an anti-CD44v9 monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region comprising HCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region comprising LCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and LCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, according to IMGT definition of CDR.

[0244] In preferable embodiments, the mAb is an anti-CD44v9 monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region comprising HCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, HCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 and HCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and a light chain variable region comprising LCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, LCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, and LCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, according to IMGT definition of CDR.

[0245] In preferable embodiments, the mAb is an anti-CD44v9 monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48.

[0246] In preferable embodiments, the mAb is an anti-CD44v9 monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50.

[0247] In preferable embodiments, the mAb is an anti-CD44v9 monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof comprising a heavy chain variable  region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.

[0248] In preferable embodiments, the mAb is an anti-CD44v9 monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 54.

[0249] In preferable embodiments, the mAb is an anti-CD44v9 monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, a heavy chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and a light chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.

[0250] In preferable embodiments, the mAb is an anti-CD44v9 monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52, a heavy chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and a light chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.

[0251] In more preferable embodiments, the antibody-drug conjugate disclosed herein has a structure of

[0252] wherein γ is an integer or a decimal ranging from 5 to 8, and mAb is an anti-CD44v9 monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof, wherein the thioether bond linked to the mAb is formed from a thiol group of a Cys residue in the  mAb, and the mAb is an anti-CD44v9 antibody or an antigen binding fragment thereof as defined herein above in the Anti-CD44v9 antibodies section

[0253] In some embodiments, the mAb binds specifically to a CD44v9 epitope comprising or consisting essentially of SEQ ID NO. 55 or 56.

[0254] In more preferable embodiments, the mAb comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3,

[0255] wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are the same as any of (a) to (d) :

[0256] (a) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 47; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 48;

[0257] (b) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 49; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 50;

[0258] (c) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 51; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 52; and

[0259] (d) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 53; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 54; ,

[0260] wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are preferably defined according to any of CDR definition schemes selected from a group consisting of Chothia, Kabat, IMGT, AbM and Contact.

[0261] In more preferable embodiments, the mAb comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region comprising LCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 having an amino acid  sequence of SEQ ID NO: 5, and LCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, according to IMGT definition of CDR.

[0262] In preferable embodiments, the mAb comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, HCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 and HCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and a light chain variable region comprising LCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, LCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, and LCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, according to IMGT definition of CDR.

[0263] In more preferable embodiments, the mAb comprises: (a) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48; (b) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50; or (c) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52; or (d) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 54.

[0264] In preferable embodiments, the mAb comprises: (a) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50; or (b) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.

[0265] In preferable embodiments, the mAb comprises a heavy chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and a light chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.

[0266] In more preferable embodiments, the mAb is an anti-CD44v9 monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, a heavy chain constant region  having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and a light chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.

[0267] In more preferable embodiments, the mAb is an anti-CD44v9 monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52, a heavy chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and a light chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.

[0268] In either of the embodiments described above, γ is preferably an integer or a decimal ranging from 5 to 8, for example, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, or 8. The parameter γ is also known as DAR (drug to antibody ratio) , which is one of the most important quality parameters of an antibody-drug conjugate and it is presented as the average number of drug molecules conjugated to an antibody.

[0269] Various analytical approaches for DAR assessment are available in the art, including but not limited to, Ultraviolet-Visible (UV / Vis) spectroscopy, Hydrophobic interaction chromatography (HIC) , Reversed phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) , and Liquid chromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry (LC-ESI-MS) . In some embodiments, the value of parameter γ is determined by RP-HPLC for the antibody-drug conjugates disclosed herein.

[0270] In either of the more preferable embodiments, γ is preferably 7.8 as determined by RP-HPLC.

[0271] In preferable embodiments, an antibody-drug conjugate disclosed herein has a structure of

[0272] wherein γ is 7.8 as determined by RP-HPLC, and mAb is an anti-CD44v9 antibody or an antigen binding fragment thereof, wherein the thioether bond linked to the mAb is formed from a thiol group of a Cys residue in the mAb and the mAb comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region comprising LCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and LCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, according to IMGT definition of CDR.

[0273] In preferable embodiments, an antibody-drug conjugate disclosed herein has a structure of

[0274] wherein γ is 7.8 as determined by RP-HPLC, and mAb is an anti-CD44v9 antibody or an antigen binding fragment thereof, wherein the thioether bond linked to the mAb is formed from a thiol group of a Cys residue in the mAb and the mAb comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50.

[0275] In preferable embodiments, an antibody-drug conjugate disclosed herein has a structure of

[0276] wherein γ is 7.8 as determined by RP-HPLC, and mAb is an anti-CD44v9 antibody or an antigen binding fragment thereof, wherein the thioether bond linked to the mAb is formed from a thiol group of a Cys residue in the mAb and the mAb comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, a heavy chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and a light chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.

[0277] Methods for manufacturing the linker moieties are known in the art and also exemplified in the examples disclosed herein. A detailed description of the synthesis of the linkers and intermediates used therein is discussed in, for example, EP 3725798, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference.

[0278] Methods for preparing the antibody-drug conjugates disclosed herein can be readily performed according to routine practice in the art and are also exemplified herein in the examples. A detailed description of the synthesis of antibody-drug conjugates with the same cytotoxic drug moiety and linker moiety, but with different antibodies are discussed in, for example, EP 3725798, supra.

[0279] It has been shown in the present disclosure that an antibody-drug conjugate (hHTS033-KL) could be internalized after binding to CD44v9 on tumor cell surface. Then, the payload would be released and interfere with function of the topoisomerase I enzyme and eventually leads to apoptotic cell death.

[0280] Pharmaceutical Compositions

[0281] The present disclosure, in another aspect, provides a pharmaceutical composition comprising an antibody-drug conjugate as disclosed herein, and a  pharmaceutically acceptable carrier. The compositions are suitable for veterinary or human administration.

[0282] The present compositions can be in any form that allows for the composition to be administered to a patient. For example, the composition can be in the form of a solid, liquid or gas (aerosol) . Typical routes of administration include, without limitation, oral, topical, parenteral, sublingual, rectal, vaginal, ocular, intra-tumor, and intranasal. Parenteral administration includes subcutaneous injections, intravenous, intramuscular, intrasternal injection or infusion techniques. In one aspect, the compositions are administered parenterally. In yet another aspect, the compositions are administered intravenously.

[0283] Pharmaceutical compositions can be formulated so as to allow a conjugate to be bioavailable upon administration of the composition to a patient. Compositions can take the form of one or more dosage units, where for example, a tablet can be a single dosage unit, and a container of a conjugate in aerosol form can hold a plurality of dosage units.

[0284] Materials used in preparing the pharmaceutical compositions can be non-toxic in the amounts used. It will be evident to those of ordinary skill in the art that the optimal dosage of the active ingredient (s) in the pharmaceutical composition will depend on a variety of factors. Relevant factors include, without limitation, the type of animal (e.g., human) , the particular form of the conjugate, the manner of administration, and the composition employed.

[0285] The pharmaceutically acceptable carrier or vehicle can be particulate, so that the compositions are, for example, in tablet or powder form. The carrier (s) can be liquid, with the compositions being, for example, an oral syrup or injectable liquid. In addition, the carrier (s) can be gaseous or particulate, so as to provide an aerosol composition useful in, e.g., inhalatory administration.

[0286] The composition can be in the form of a liquid, e.g., an elixir, syrup, solution, emulsion or suspension. The liquid can be useful for oral administration or for delivery by injection. When intended for oral administration, a composition can comprise one or more of a sweetening agent, preservatives, dye / colorant and flavor  enhancer. In a composition for administration by injection, one or more of a surfactant, preservative, wetting agent, dispersing agent, suspending agent, buffer, stabilizer and isotonic agent can also be included.

[0287] The liquid compositions, whether they are solutions, suspensions or other like form, can also include one or more of the following: sterile diluents such as water for injection, saline solution, preferably physiological saline, Ringer's solution, isotonic sodium chloride, fixed oils such as synthetic mono or digylcerides which can serve as the solvent or suspending medium, polyethylene glycols, glycerin, cyclodextrin, propylene glycol or other solvents; antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl paraben; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; buffers such as acetates, citrates or phosphates and agents for the adjustment of tonicity such as sodium chloride or dextrose. A parenteral composition can be enclosed in ampoule, a disposable syringe or a multiple-dose vial made of glass, plastic or other material. Physiological saline is an exemplary adjuvant. An injectable composition is preferably sterile.

[0288] The amount of the conjugate that is effective in the treatment of a particular disorder or condition will depend on the nature of the disorder or condition and can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vitro or in vivo assays can optionally be employed to help identify optimal dosage ranges. The precise dose to be employed in the compositions will also depend on the route of administration, and the seriousness of the disease or disorder, and should be decided according to the judgment of the practitioner and each patient's circumstances.

[0289] The compositions comprise an effective amount of a conjugate such that a suitable dosage will be obtained. Typically, this amount is at least about 0.01%of a conjugate by weight of the composition. When intended for oral administration, this amount can be varied to range from about 0.1%to about 80%by weight of the composition. In one aspect, oral compositions can comprise from about 4%to about 50%of the conjugate by weight of the composition. In yet another aspect, present compositions are prepared so that a parenteral dosage unit contains from about 0.01%to about 2%by weight of the conjugate.

[0290] For intravenous administration, the composition can comprise from about 0.01 to about 100 mg of a conjugate per kg of the animal's body weight. In one aspect, the composition can include from about 1 to about 100 mg of a conjugate per kg of the animal's body weight. In another aspect, the amount administered will be in the range from about 0.1 to about 25 mg / kg of body weight of the conjugate.

[0291] Generally, the dosage of a conjugate administered to a patient is typically about 0.01 mg / kg to about 2000 mg / kg of the animal's body weight. In one aspect, the dosage administered to a patient is between about 0.01 mg / kg to about 10 mg / kg of the animal's body weight, in another aspect, the dosage administered to a patient is between about 0.1 mg / kg and about 250 mg / kg of the animal's body weight, in yet another aspect, the dosage administered to a patient is between about 0.1 mg / kg and about 20 mg / kg of the animal's body weight, in yet another aspect the dosage administered is between about 0.1 mg / kg to about 10 mg / kg of the animal's body weight, and in yet another aspect, the dosage administered is between about 1 mg / kg to about 10 mg / kg of the animal's body weight.

[0292] The conjugate or compositions can be administered by any convenient route, for example by infusion or bolus injection, by absorption through epithelial or mucocutaneous linings (e.g., oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc. ) . Administration can be systemic or local. Various delivery systems are known, e.g., encapsulation in liposomes, microparticles, microcapsules, capsules, etc., and can be used to administer a conjugate or composition. In certain embodiments, more than one conjugate or composition is administered to a patient.

[0293] In specific embodiments, it can be desirable to administer one or more conjugate or compositions locally to the area in need of treatment. This can be achieved, for example, and not by way of limitation, by local infusion during surgery; topical application, e.g., in conjunction with a wound dressing after surgery; by injection; by means of a catheter; by means of a suppository; or by means of an implant, the implant being of a porous, non-porous, or gelatinous material, including membranes, such as sialastic membranes, or fibers. In one embodiment, administration can be by direct injection at the site (or former site) of a cancer, tumor or neoplastic or pre-neoplastic  tissue. In another embodiment, administration can be by direct injection at the site (or former site) of a manifestation of an autoimmune disease.

[0294] In certain embodiments, it can be desirable to introduce one or more conjugate or compositions into the central nervous system by any suitable route, including intraventricular and intrathecal injection. Intraventricular injection can be facilitated by an intraventricular catheter, for example, attached to a reservoir, such as an Ommaya reservoir.

[0295] Pulmonary administration can also be employed, e.g., by use of an inhaler or nebulizer, and formulation with an aerosolizing agent, or via perfusion in a fluorocarbon or synthetic pulmonary surfactant.

[0296] In yet another embodiment, the conjugate or compositions can be delivered in a controlled release system, such as but not limited to, a pump or various polymeric materials can be used. In yet another embodiment, a controlled-release system can be placed in proximity of the target of the conjugate or compositions, e.g., the brain, thus requiring only a fraction of the systemic dose.

[0297] The term “carrier” refers to a diluent, adjuvant or carrier, with which a conjugate is administered. Such pharmaceutical carriers can be liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. The carriers can be saline, gum acacia, gelatin, starch paste, talc, keratin, colloidal silica, urea, and the like. In addition, auxiliary, stabilizing, thickening, lubricating and coloring agents can be used. In one embodiment, when administered to a patient, the conjugate or compositions and pharmaceutically acceptable carriers are sterile. Water is an exemplary carrier when the conjugates are administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable pharmaceutical carriers also include carriers such as starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol and the like. The present compositions, if desired, can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents.

[0298] In an embodiment, the conjugates are formulated in accordance with routine procedures as a pharmaceutical composition adapted for intravenous administration to animals, particularly human beings. Typically, the carriers or vehicles for intravenous administration are sterile isotonic aqueous buffer solutions. Where necessary, the compositions can also include a solubilizing agent. Compositions for intravenous administration can optionally comprise a local anesthetic such as lignocaine to ease pain at the site of the injection. Generally, the ingredients are supplied either separately or mixed together in unit dosage form, for example, as a dry lyophilized powder or water free concentrate in a hermetically sealed container such as an ampoule or sachette indicating the quantity of active agent. Where a conjugate is to be administered by infusion, it can be dispensed, for example, with an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline. Where the conjugate is administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline can be provided so that the ingredients can be mixed prior to administration.

[0299] The composition can include various materials that modify the physical form of a solid or liquid dosage unit. For example, the composition can include materials that form a coating shell around the active ingredients. The materials that form the coating shell are typically inert, and can be selected from, for example, sugar, shellac, and other enteric coating agents. Alternatively, the active ingredients can be encased in a gelatin capsule.

[0300] The compositions can consist of gaseous dosage units, e.g., it can be in the form of an aerosol. The term aerosol is used to denote a variety of systems ranging from those of colloidal nature to systems consisting of pressurized packages. Delivery can be by a liquefied or compressed gas or by a suitable pump system that dispenses the active ingredients.

[0301] Whether in solid, liquid or gaseous form, the present compositions can include a pharmacological agent used in the treatment of cancer.

[0302] Uses and Therapies

[0303] The conjugates are useful for inhibiting the multiplication of tumor cells or cancer cells, causing apoptosis in tumor or cancer cells, or for treating cancer in a  patient. The conjugates can be used accordingly in a variety of settings for the treatment of animal cancers. The conjugates can be used to deliver a drug or drug unit to a tumor cell or cancer cell. Without being bound by theory, in one embodiment, the antibody moiety of the conjugate disclosed herein binds to or associates with CD44v9 antigen expressed on, or associated with, the cell surface of a cancer cell or a tumor cell, and the conjugate can be taken up inside a tumor cell or cancer cell through receptor-mediated endocytosis. The CD44v9 antigen can be attached to a tumor cell or cancer cell or can be an extracellular matrix protein associated with the tumor cell or cancer cell. Once inside the cell, one or more specific peptide sequences within the linker moiety are hydrolytically cleaved, resulting in release of a cytotoxic drug or a drug-linker compound. The released cytotoxic drug or drug-linker compound is then free to migrate within the cell and induce cytotoxic or cytostatic activities. In an alternative embodiment, the cytotoxic drug or drug-linker compound is cleaved from the conjugate outside the tumor cell or cancer cell, and the cytotoxic drug or drug-linker compound subsequently penetrates the cell.

[0304] The present disclosure, in a further aspect, provides a method for treating or preventing cancer in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of an antibody-drug conjugate disclosed herein.

[0305] The cancer may be a solid cancer or a hematologic malignancy, positive for CD44v9 antigen. A  “hematologic malignancy” , also known as a blood cancer, is a cancer that originates in blood-forming tissue, such as the bone marrow or other cells of the immune system. Hematologic malignancies include, without limitation, leukemias (such as acute myeloid leukemia (ANIL) , acute promyelocytic leukemia, acute lymphoblastic leukemia (ALL) , acute mixed lineage leukemia, chronic myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , hairy cell leukemia and large granular lymphocytic leukemia) , myelodysplastic syndrome (MDS) , myeloproliferative disorders (polycythemia vera, essential thrombocytosis, primary myelofibrosis and chronic myeloid leukemia) , lymphomas, multiple myeloma, MGUS and similar disorders, Hodgkin’s lymphoma, non-Hodgkin lymphoma (NHL) , primary mediastinal large B-cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma,  transformed follicular lymphoma, splenic marginal zone lymphoma, lymphocytic lymphoma, T-cell lymphoma, and other B-cell malignancies. “Solid cancers” include, without limitation, fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteogenic sarcoma, chordoma, angiosarcoma, endotheliosarcoma, lymphangiosarcoma, lymphangioendotheliosarcoma, synovioma, mesothelioma, Ewing's tumor, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, colon cancer, colorectal cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, bone cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, esophogeal cancer, stomach cancer, oral cancer, nasal cancer, throat cancer, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, sebaceous gland carcinoma, papillary carcinoma, papillary adenocarcinomas, cystadenocarcinoma, medullary carcinoma, bronchogenic carcinoma, renal cell carcinoma, hepatoma, bile duct carcinoma, choriocarcinoma, seminoma, embryonal carcinoma, Wilms' tumor, cervical cancer, uterine cancer, testicular cancer, small cell lung carcinoma, bladder carcinoma, lung cancer, epithelial carcinoma, glioma, glioblastoma multiforme, astrocytoma, medulloblastoma, craniopharyngioma, ependymoma, pinealoma, hemangioblastoma, acoustic neuroma, oligodendroglioma, meningioma, skin cancer, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma. Preferably, the cancers treatable by the present disclosure include NSCLC (Non-Small Cell Lung Carcinoma) , HNSCC (Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck) , esophageal cancer such as ESCC (esophageal squamous cell carcinoma) , GC (Gastric Carcinoma) , BC (Bladder Cancer) , breast cancer such as TNBC (Triple Negative Breast Cancer) , colorectal cancer, and liver cancer.

[0306] In some embodiments, methods for treating or preventing cancer are provided, including administering to a patient in need thereof an effective amount of a conjugate disclosed herein and a chemotherapeutic agent. In one embodiment, the chemotherapeutic agent is that with which treatment of the cancer has not been found to be refractory. In another embodiment, the chemotherapeutic agent is that with which the treatment of cancer has been found to be refractory. The conjugates can be administered to a patient that has also undergone surgery as treatment for the cancer.

[0307] In a specific embodiment, the conjugate is administered concurrently with the chemotherapeutic agent or with radiation therapy. In another specific embodiment, the chemotherapeutic agent or radiation therapy is administered prior or subsequent to administration of a conjugates, in one aspect at least an hour, five hours, 12 hours, a day, a week, a month, in further aspects several months (e.g., up to three months) , prior or subsequent to administration of a conjugate.

[0308] A chemotherapeutic agent can be administered over a series of sessions. Suitable chemotherapeutic agents include, but are not limited to, methotrexate, taxol, L-asparaginase, mercaptopurine, thioguanine, hydroxyurea, cytarabine, cyclophosphamide, ifosfamide, nitrosoureas, cisplatin, carboplatin, mitomycin, dacarbazine, procarbizine, topotecan, nitrogen mustards, cytoxan, etoposide, 5-fluorouracil, BCNU, irinotecan, camptothecins, bleomycin, doxorubicin, idarubicin, daunorubicin, dactinomycin, plicamycin, mitoxantrone, asparaginase, vinblastine, vincristine, vinorelbine, paclitaxel, and docetaxel. With respect to radiation, any radiation therapy protocol can be used depending upon the type of cancer to be treated. For example, but not by way of limitation, x-ray radiation can be administered; in particular, high-energy megavoltage (radiation of greater that 1 MeV energy) can be used for deep tumors, and electron beam and orthovoltage x-ray radiation can be used for skin cancers. Gamma-ray emitting radioisotopes, such as radioactive isotopes of radium, cobalt and other elements, can also be administered.

[0309] Additionally, methods of treatment of cancer with a conjugate are provided as an alternative to chemotherapy or radiation therapy where the chemotherapy or the radiation therapy has proven or can prove too toxic, e.g., results in unacceptable or unbearable side effects, for the subject being treated. The animal being treated can, optionally, be treated with another cancer treatment such as surgery, radiation therapy or chemotherapy, depending on which treatment is found to be acceptable or bearable.

[0310] The conjugates can also be used in an in vitro or ex vivo fashion, such as for the treatment of certain cancers, including, but not limited to leukemias and lymphomas, such treatment involving autologous stem cell transplants. This can  involve a multi-step process in which the animal's autologous hematopoietic stem cells are harvested and purged of all cancer cells, the animal's remaining bone-marrow cell population is then eradicated via the administration of a high dose of a conjugate with or without accompanying high dose radiation therapy, and the stem cell graft is infused back into the animal. Supportive care is then provided while bone marrow function is restored and the animal recovers.

[0311] Equivalently, the present disclosure also provides an antibody-drug conjugate as disclosed herein for use in the treatment of cancer in a subject. Equivalently, the present disclosure also provides use of an antibody-drug conjugate as disclosed herein in the manufacturing of a medicament for treatment of cancer in a subject. In both of the equivalent aspects, the cancer is a preferably a solid cancer as defined above, and more preferably, NSCLC (Non-Small Cell Lung Carcinoma) , HNSCC (Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck) , esophageal cancer such as ESCC (esophageal squamous cell carcinoma) , GC (Gastric Carcinoma) , BC (Bladder Cancer) , breast cancer such as TNBC (Triple Negative Breast Cancer) , colorectal cancer, and liver cancer.

[0312] Sequences

[0313] Table 1. Sequences of Variable Regions of anti-CD44v9 antibody HTS033 (mouse antibody)

[0314] Table 2. Sequences of Variable Region of anti-CD44v9 antibody hHTS033 25-1 (humanized antibody)

[0315] Table 3. Sequences of Variable Regions of anti-CD44v9 antibody hHTS033 25-3 (humanized antibody)

[0316] Table 4. Sequences of Variable Regions of anti-CD44v9 antibody mAb116 (mouse antibody)

[0317] Table 5. Light / heavy chain variable region sequences of HTS033, hHTS033 25-1, hHTS033 25-3 and mAb116

[0318] Table 6: Sequences of constant regions of heavy  / light chains of hHTS033 25-1 and hHTS033 25-3

[0319] CD44v9 epitope to which HTS033, hHTS033 25-1, hHTS033 25-3, and mAb116 bind:

[0320] CD44v9 epitope: SHEGLEEDKD (SEQ ID NO: 55)

[0321] CD44v9 epitope variant: SHEGLEEDKDH (SEQ ID NO: 56)

[0322] Examples

[0323] Example 1. synthesis of (S) -N- (2- (4-ethyl-4-hydroxyl-3, 14-dione-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4', 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-11-yl) ethyl) -N-isopropylmethanesulfonamide (compound T030)

[0324] Methylsulfonyl chloride (462 mg, 12.77 mmol, purity: about 70%) was added dropwise to a solution of belotecan hydrochloride (3 g, 6.38 mmol) and triethylamine (2.58 g, 25.54 mmol) in dichloromethane (40 mL) . The resulting mixture was reacted at room temperature for 2 h. Suction filtration was performed, and the filter cake was washed three times with dichloromethane (3 mL) to obtain the title compound (2.2 g) .

[0325] Structural characterization data are as follows:

[0326] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.32 (d, J = 8.4 Hz, 1H) , 8.20 (dd, J =8.4, 1.2 Hz, 1H) , 7.93-7.84 (m, 1H) , 7.79 (t, J = 7.6 Hz, 1H) , 7.35 (s, 1H) , 6.56 (s, 1H) , 5.44 (d, J = 9.2 Hz, 4H) , 3.98 (p, J = 6.7 Hz, 1H) , 3.50 (t, J = 8.0 Hz, 2H) , 3.42-3.35  (m, 2H) , 3.00 (s, 3H) , 1.93-1.82 (m, 2H) , 1.15 (d, J = 6.7 Hz, 6H) , 0.88 (t, J = 7.3 Hz, 3H) .

[0327] ESI-MS (m / z) : 512.2 [M+H] + .

[0328] [α] D20 is +28.19° (c =0.101g / 100mL, CH3CN) .

[0329] Example 2. Preparation of 4- ( (S) -2- (4-aminobutyl) -35- (4- ( (6- (2- (methylsulfonyl) pyrimidin-5-yl) hex-5-ynamido) methyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) -4, 8-dioxo-6, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33-nonaoxa-3, 9-diazapentatriacontamido) benzyl ( (S) -4-ethyl-11- (2- (N-isopropylmethylsulfonamido) ethyl) -3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) carbonate (compound “TL033” )

[0330] Step 1: synthesis of methyl 6- (2- (methylthio) pyrimidin-5-yl) -5-hexynoate (compound 3-2)

[0331] At room temperature, methyl 5-hexynoate (500 mg, 3.97 mmol) and 5-bromo-2-methylthiopyrimidine were dissolved in N, N-dimethylformamide (3 ml) , then triethylamine (3 ml) , cuprous iodide (75 mg, 0.4 mmol) and Bis (triphenylphosphine) palladium (II) dichloride (279 mg, 0.4 mmol) were successively added. The resulting mixture was heated to 95 ℃ under nitrogen protection and reacted for 6 h under stirring, quenched with water, and extracted with ethyl acetate (20 mL×3) . Organic phases were combined, washed with saturated saline (20 mL×2) and dried over anhydrous sodium sulfate. The desiccant was removed by filtration, and the solvent was evaporated under reduced pressure. Purification was performed on preparative liquid chromatography to obtain the title compound (300 mg) . ESI-MS (m / z) : 251.3 [M + H] +.

[0332] Preparative liquid chromatography:

[0333] chromatographic column: Waters SunFire C18 5μm 19x250mm

[0334] Mobile phase A: acetonitrile; Mobile phase B: water containing 0.05%formic acid

[0335] Time: 0min-16min; Mobile phase A: 10%-90%; Flow rate: 28mL / min

[0336] Step 2: synthesis of 6- (2- (methylthio) pyrimidin-5-yl) -5-hexynoic acid (compound 3-3)

[0337] At room temperature, compound 3-2 (200 mg, 0.8 mmol) was dissolved in a mixed solution of tetrahydrofuran and water (4 mL / 4 mL) , and lithium hydroxide monohydrate (235 mg, 5.6 mmol) was added, and reacted at room temperature under stirring for 4 h, then diluted with water and extracted with ethyl acetate (20 ml x 2) . The aqueous phase was adjusted to pH=3 with 1N hydrochloric acid, and extracted with ethyl acetate (20 mL×3) , then organic phases were combined, washed with saturated saline (20 mL×2) and dried over anhydrous sodium sulfate. The desiccant was removed by filtration, and the solvent was evaporated under reduced pressure to obtain the title compound (120 mg) .

[0338] Step 3: synthesis of 6- (2- (methylsulfonyl) pyrimidin-5-yl) -5-hexynoic acid (compound 3-4)

[0339] At room temperature, compound 3-3 (20 mg, 0.085 mmol) was dissolved in dichloromethane (4 mL) , and m-chloroperoxybenzoic acid (22 mg, 0.127 mmol) was added for reaction at room temperature overnight under stirring. Purification was performed on preparative liquid chromatography to obtain the title compound (20 mg) .

[0340] ESI-MS (m / z) : 269.1 [M + H] +.

[0341] Preparative liquid chromatography:

[0342] chromatographic column: Waters SunFire C18 5μm 19x250mm

[0343] Mobile phase A: acetonitrile; Mobile phase B: water containing 0.05%formic acid

[0344] Time: 0min-16min; Mobile phase A: 10%-90%; Flow rate: 28mL / min

[0345] Step 4: synthesis of 6- (2- (methylsulfonyl) pyrimidin-5-yl) -N- (prop-2-yn-1-yl) hex-5-ynamide

[0346] At 25℃, prop-2-ynyl-1-amine (189 mg, 3.4 mmol) and compound 3-4 (800 mg, 2.83 mmol) were dissolved in dichloromethane (10 mL) , then N, N-diisopropylethylamine (738 mg, 5.67 mmol) and O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (1.63 g, 4.25 mmol) were successively added and reacted for 2 hours under stirring. The reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the residue was purified by flash silica gel column chromatography (ethyl acetate / petroleum ether =3 / 1) to obtain the title compound (700 mg) .

[0347] ESI-MS (m / z) : 306.1 [M+H] +.

[0348] Step 5: synthesis of 4- ( (S) -35-azido-2- (4- ( ( (4-methoxyphenyl) benzhydryl) amino) butyl) -4, 8-dioxo-6, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33-nonazo-3, 9-diazapentatriacontamino) benzyl ( (S) -4-ethyl-11- (2- (N-isopropylmethanesulfonamide) ethyl) -3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-2H-pyrano [2, 3-b] -1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) carbonate

[0349] At 25℃ and under nitrogen protection, T-030 (250 mg, 0.49 mmol) was dissolved in dichloromethane (10 mL) and cooled to 0℃, then a solution of 4-dimethylaminopyridine (478 mg, 3.91 mmol) in dichloromethane (3 mL) was added, followed by the slow and dropwise addition of a solution of triphosgene (72 mg, 0.24  mmol) in dichloromethane (10 mL) and reacted at 0℃ for 20 min under stirring. The reaction solution was bubbled with nitrogen for 20 min, then a solution of (S) -2- (32-azido-5-oxo-3, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30-nonaoxa-6-azatriacetamido) -N- (4- (hydroxymethyl) phenyl) -6 ( ( (4-methoxyphenyl) benzhydryl) amino) acetamide (518 mg, 0.49 mmol) in dichloromethane (7 mL) was added and reacted at 0℃ for 1 h under stirring. The reaction solution was concentrated under reduced pressure, the residue was purified by preparative high performance liquid chromatography to obtain the title compound (500 mg) .

[0350] ESI-MS (m / z) : 1597.5 [M+H] +.

[0351] Preparative liquid chromatography:

[0352] Chromatographic column: Daisogel C18 10μm 100x250mm

[0353] Mobile phase A: water; Mobile phase B: acetonitrile

[0354] Step 6: synthesis of (S) -4-ethyl-11- (2- (N-isopropylmethanesulfonamido) ethyl) -3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl (4- ( (S) -2- (4- ( ( (4-methoxyphenyl) diphenyl methyl) amino) butyl) -35- (4- ( (6- (2- (methylsulfonyl) pyrimidin-5-yl) hex-5-ynamido) methyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) -4, 8-dioxo-6, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33-nonoxy-3, 9-diazapentatriacontamido) benzyl) carbonate

[0355] At room temperature, compound 33-1 (14 mg, 0.05 mmol) was dissolved in dimethyl sulfoxide and water (2.0 mL: 0.5 mL) , followed by an addition of cuprous bromide (11 mg, 0.08 mmol) and reacted for 1 h under stirring. Purification was performed on preparative high performance liquid chromatography to obtain the title compound (30 mg) .

[0356] ESI-MS (m / z) : 815.9 [ (M-273)  / 2+H] +.

[0357] Preparative liquid chromatography:

[0358] Chromatographic column: Daisogel C18 10μm 50x250mm

[0359] Mobile phase A: water; Mobile phase B: acetonitrile

[0360] Step 7: synthesis of 4- ( (S) -2- (4-aminobutyl) -35- (4- ( (6- (2- (methylsulfonyl) pyrimidin-5-yl) hex-5-ynamido) methyl) -1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) -4, 8-dioxo-6, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33-nonaoxa-3, 9-diazapentatriacontamido) benzyl ( (S) -4-ethyl-11- (2- (N-isopropylmethylsulfonamido) ethyl) -3, 14-dioxo-3, 4, 12, 14-tetrahydro-1H-pyrano [3', 4': 6, 7] indolizino [1, 2-b] quinolin-4-yl) carbonate (compound TL033)

[0361] Compound 33-2 (30 mg, 0.02 mmol) was dissolved in dichloromethane (1.0 mL) , and trifluoroacetic acid (0.2 mL) was added to the reaction solution and reacted at room temperature for 30 min. Purification was performed on preparative high performance liquid chromatography to obtain the trifluoroacetate of the title compound (20.0 mg) .

[0362] Preparative liquid chromatography:

[0363] Chromatographic column: Daisogel C18 10μm 50x250mm

[0364] Mobile phase A: water containing 0.1%trifluoroacetic acid; Mobile phase B: acetonitrile

[0365] Identification of the title compound is as follows:

[0366] 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.18 (s, 1H) , 9.10 (s, 2H) , 8.38 (t, J =5.56 Hz, 1H) , 8.32 (d, J = 8.40 Hz, 1H) , 8.22 –8.20 (m, 2H) , 8.09 (t, J = 5.68 Hz, 1H) , 7.91 –7.87 (m, 2H) , 7.82 –7.78 (m, 1H) , 7.69 (brs, 3H) , 7.61 (d, J = 8.56 Hz, 2H) , 7.32 (d, J = 8.56 Hz, 2H) , 7.06 (s, 1H) , 5.56 (d, J = 16.96 Hz, 1H) , 5.51 (d, J = 16.96 Hz, 1H) , 5.47 (d, J = 19.28 Hz, 1H) , 5.42 (d, J = 19.28 Hz, 1H) , 5.14 (d, J = 12.20 Hz, 1H) , 5.07 (d, J = 12.16 Hz, 1H) , 4.48 (t, J = 5.24 Hz, 2H) , 4.46 –4.43 (m, 1H) , 4.29 (d, J =5.60 Hz, 2H) , 4.08 –3.95 (m, 5H) , 3.79 (t, J = 5.28 Hz, 2H) , 3.51 –3.43 (m, 32H) , 3.40 (s, 3H) , 3.39 –3.35 (m, 2H) , 3.30 –3.26 (m, 2H) , 3.00 (s, 3H) , 2.82 –2.74 (m, 2H) , 2.56 (t, J = 7.08 Hz, 2H) , 2.29 (t, J = 7.36 Hz, 2H) , 2.23 –2.13 (m, 2H) , 1.82 (p, J =7.24 Hz, 2H) , 1.78 –1.63 (m, 2H) , 1.61 –1.49 (m, 2H) , 1.42 –1.27 (m, 2H) , 1.15 (d, J = 6.80 Hz, 3H) , 1.13 (d, J = 6.76 Hz, 3H) , 0.90 (t, J = 7.32 Hz, 3H) .

[0367] ESI-MS (m / z) : 816.0 [M / 2+H] +.

[0368] [α] D20 is -19.55° (c =1.000g / 100mL, CH3CN) .

[0369] Example 3. Preparation of anti-CD44v9 antibody-drug conjugate hHTS033-KL

[0370] 0.3mL of antibody hHTS033 25-1 (33.5mg / mL) was diluted with 0.25 ml of a solution (pH 7.6) containing 20mM PB (phosphate buffer) , 150mM NaCl and 20 mM sodium edetate, then 0.45mL of a solution (pH 7.6) containing 20mM PB and 150mM NaCl was added and evenly mixed. The mixture was adjusted with 1M Na2HPO4 solution to pH=7.5, then 10mM TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine) solution was added in an amount of 6.0 equiv and evenly mixed, which was allowed to stand at room temperature for 120 min. To the solution system, trifluoroacetate of TL033 dissolved in dimethyl sulfoxide was added in an amount of 10 equiv. and evenly mixed. The resulting mixture was allowed to stand at room temperature for 90 min. Then 6.1 ml of 100mM cysteine was added to terminate the reaction. At last, the buffer was replaced with a histidine buffer solution of pH 6 by G-25 gel column to obtain a coupling product of TL033 with antibody hHTS033 25-1, which was named as hHTS033-KL.

[0371] Example 4. Average number of drug molecules connected to each antibody (DAR value)

[0372] The average number of drug molecules conjugated to each antibody molecule in the antibody-drug conjugate may be determined using the Reversed Phase HPLC (RP-HPLC) analysis method described below.

[0373] Reversed phase chromatography separates components according to hydrophobic difference. After being reduced to break inter-chain disulfide bonds of ADC that has not been reduced during manufacture, heavy chains or light chains conjugated with different numbers of drug molecules displays different in their hydrophobic. Species with more conjugated drugs display higher hydrophobic with better retention on reversed phase column and longer retention time. In low organic phase condition, the sample is retained on the column; then the components are eluted with increasing organic phase gradients from those with low hydrophobic to those with high hydrophobic and are detected by UV detector. The relative abundance of heavy chains or light chains with different numbers of drug conjugated is used to calculate the DAR.

[0374] The peak sequence of each component was LC0 (light chain unconjugated to any linker-payload) , LC1 (light chain conjugated to 1 linker-payloads) , HC0 (hight chain unconjugated to any linker-payload) , HC1 (heavy chain conjugated to 1 linker-payloads) , HC2 (heavy chain conjugated to 2 linker-payloads) , HC3 (heavy chain conjugated to 3 linker-payloads) . The percentage content of each component can be obtained by measuring the peak area ratio of each peak. Then the DAR of corresponding samples are calculated as follows:

[0375] DAR = (LC0 [Area] *0 +LC1 [Area] *1)  /  (LC0 [Area] +LC1 [Area] ) *2 + (HC0 [Area] *0+HC1 [Area] *1+HC2 [Area] *2+HC3 [Area] *3)  /  (HC0 [Area] *0+HC1 [A rea] +HC2 [Area] +HC3 [Area] ) *2

[0376] A RP-HPLC chromatogram of hHTS033-KL was shown in Figure 1. Figure 1 showed an average number of payloads conjugated per antibody measured and calculated by RP-HPLC was 7.8.

[0377] Example 5. Measurement of aggregates in antibody-drug conjugate

[0378] Aggregates in the antibody-drug conjugate were detected using size exclusion chromatography in high performance liquid chromatography. The method was as follows.

[0379] High performance liquid chromatography system: Agilent 1260 Infinity II HPLC system

[0380] Detector: Ultraviolet absorption spectrometer (Detection wavelength: 280 nm)

[0381] Column type: TOSOH TSKgel G3000SWXL (7.8×300 mm, 5 μm)

[0382] Mobile phase: 200 mmol / L KHPO4, 150 mmol / L NaCl, 15% (v / v) isopropyl alcohol, pH7.0

[0383] Flow rate: 0.75 mL / min

[0384] Analysis time: 18 min

[0385] Column temperature: Room temperature

[0386] Injection volume: 50 μg

[0387] Data analysis: substance

[0388] A size exclusion chromatogram of hHTS033-KL was shown in Figure 2. Figure 2 showed a detection graph of aggregates, and a content of the aggregates in the antibody-drug conjugate hHTS033-KL measured by the method was 0.7%.

[0389] Example 6. Binding affinity evaluation of hHTS033-KL on tumor cell lines

[0390] To evaluate the binding affinity of ADCs, tumor cells of NCI-H292 (Non-small cell lung cancer, BMCR, Cat#SCSP-582) , A253 (submaxillary salivary gland cancer, Meisen CTCC, Cat#CTCC-007-0437 ) , A549 (Non-small cell lung cancer, iCell, Cat#iCell-h011) , PC-9 (Non-small cell lung cancer, CELLCOOK, Cat#CC0204) and Detroit 562 (Pharyngeal cancer, BMCR, Cat#TCHu231) were detached by 1mM Trypsin-EDTA and centrifuged at 1200rpm for 5 min. Resuspended cell pellet in 5%BSA in PBS. 5×105 / 50 μL / well cells were added into the 96-well assay plate, incubated at 2-8℃ for 30min. ADCs were diluted to the final concentration as indicated and incubated with cells at 4 ℃ for 1h Wash cells and anti-Human IgG (Fc specific) -FITC (Fluorescein Isothiocyanate) antibody (Sigma, Cat#F9512-2ml) was used as a  secondary Ab at the 4℃ incubator for 45 minutes. The data were analyzed using a FACSAriaTM Fusion flow cytometer (MACSQuant X) and Graphpad Prism 8 software.

[0391] As shown in Figure 3, hHTS033-KL specifically bound to cell lines of NCI-H292, PC-9, A253, Detroit 562 with EC50 values of 0.6734 nM, 2.613 nM, 2.179 nM, 3.197nM, respectively (Table 7) , but not to A549 cell line, indicating A549 did not express CD44v9. Isotype control ADC (Human IgG-KL-DAR8, Sichuan Kelun-Biotech Biopharmacuetical Co., Ltd) did not bind to any of the above cell lines.

[0392] Table 7. The EC50 (nM) of hHTS033-KL binding to NCI-H292, A253, A549, PC-9 and Detroit 562

[0393] Example 7. Internalization of hHTS033-KL on tumor cell lines

[0394] PC-9, A253, NCI-H292 and Detroit 562 cell culture were maintained in vitro as independent monolayer cultures at 37℃ in an atmosphere of 5%CO2. The cells were detached by 1mM EDTA in PBS, washed with PBS for 2 times, then were harvested by centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes. Cell pellet were resuspended and incubated with 50 μg / mL hHTS033-KL at 4℃ for 1h. After washing, cells were incubated in 2%BSA in PBS respectively at 37℃ for 0, 0.5, 1, 2, 4, and 8 hours. Then cells were fixed with 4%PFA  (paraformaldehyde) at room temperature for 15 min. Wash and resuspend cells in PBS, and put it at 4 ℃ overnight. Cells were then stained with FITC conjugated anti-Human antibody for 45 min and analyzed with FACs by calculating surface MFI (Mean Fluorescent Intensity) .

[0395] As shown in Figure 4, hHTS033-KL can be internalized by cell lines of PC-9, A253, NCI-H292 and Detroit 562. Table 8 shows the T1 / 2 (h) of internalization of hHTS033-KL on tumor cell lines of each cell line.

[0396] Table 8. The T1 / 2 (h) of internalization of hHTS033-KL on tumor cell lines of PC-9, A235, NCI-H292 and Detroit 562

[0397] Example 8. Antitumor activity study of hHTS033-KL in human triple-negative breast cancer cell MDA-MB-468 subcutaneous xenograft mouse

[0398] Human triple-negative breast cancer cell MDA-MB-468 (National Collection of Authenticated Cell Cultures, Cat#TCHu136) was cultured in RPMI-1640 medium containing 10%fetal bovine serum in a 5%CO2 incubator at 37℃. Cells were detached with 0.25%trypsin and 0.02%EDTA solution, collected and implanted subcutaneously at 5 × 106 cells / animal into the right axilla of female NCG mice (6-8 weeks old) which were purchased from Jiangsu GemPharmatech Co., Ltd. The mice were randomized when the average tumor volume reached around 200 mm3. Mice were given a single intravenous injection of hHTS033-KL, hHTS033 25-1 and isotype control ADC (Human IgG-KL-DAR8) at 10 mg / kg on Day 32 after tumor inoculation respectively. Body weight and tumor volume were measured twice weekly over the entire duration of the studies. Tumor volume was calculated as follows: V (mm3) = 0.5×length (mm) × width2 (mm) . The differences between / among groups were analyzed using unpaired two-tailed t-tests by GraphPad Prism version 6.0.

[0399] Curves and statistical analysis of tumor volume of mice given a single intravenous injection of hHTS033-KL, hHTS033 25-1 and isotype control ADC are shown in Figure 5 and Table 9. hHTS033-KL at 10 mg / kg induced tumor regression (p < 0.0001) , all 5 mice achieved tumor eradication at D50 and the sustained anti-tumor effect was observed till the end of study. The body weight of the animals (Fig. 6) tended to increase, no death occurred, and the tolerance was good during the administration.

[0400] Table 9. Tumor volume (Mean ± SEM) in CDX (MDA-MB-468)

[0401] Note: ****means p < 0.0001; ***means p < 0.001; **means p < 0.01; p < 0.05 means there is a  significant difference; ns means p > 0.05, there is no significant difference.

[0402] Example 9. Antitumor activity study of hHTS033-KL in Human Bladder Cancer cell 5637 subcutaneous xenograft mouse model

[0403] Human bladder cancer cell 5637 (Shanghai Xunqing Biotechnology Co., Ltd. ) was cultured in RPMI-1640 medium containing 10%fetal bovine serum in a 5%CO2 incubator at 37℃. Cells were collected and implanted subcutaneously at 107 cells / animal into the right axilla of female Balb / c nude mice (6-8 weeks old) purchased from Jiangsu GemPharmatech Co., Ltd. Animals were randomized into six groups with 5 mice in each group when the average tumor volume reached around 200 mm3. Mice were given a single intravenous injection of hHTS033-KL (5mg / kg or 2.5 mg / kg) , hHTS033 25-1 (5mg / kg ) , isotype control ADC (Human IgG-KL-DAR8, Sichuan Kelun-Biotech Biopharmacuetical Co., Ltd) (5mg / kg or 2.5 mg / kg) or vehicle on Day 4 after tumor inoculation respectively. Tumor volume was calculated as follows: V(mm3) = 0.5 × length (mm) × width2 (mm) . Body weight and tumor volume were measured 2–3 times per week over the entire duration of the studies. The differences between / among groups were analyzed using unpaired two-tailed t-tests by GraphPad Prism version 6.0.

[0404] Curves and statistical analysis of tumor volume are shown in Figure 7 and

[0405] Table 10. hHTS033-KL treatment at 2.5 mg / kg and 5 mg / kg resulted in 173.4%and 192.3%TGI respectively while hHTS033 25-1 treatment at 5 mg / kg has no anti-tumor activity. hHTS033-KL treatment at both 2.5mg / kg and 5mg / kg achieved sustained tumor regression. During the administration, the body weight of the animals (Fig. 8) tended to increase, and no death occurred, indicating that hHTS033-KL at 2.5 mg / kg and 5mg / kg dosing level were both well-tolerated in 5637 xenograft model.

[0406] Table 10. Tumor volume (Mean ± SEM) in CDX (5637)

[0407] Note: ****means p < 0.0001; ***means p < 0.001; **means p < 0.01; p < 0.05 means there is a significant difference; ns means p > 0.05, there is no significant difference.

[0408] Example 10. Antitumor activity study of hHTS033-KL in NSCLC PDX mouse model

[0409] Tumors (shown in Table 11) were sliced into 3 mm× 3 mm× 3 mm (about 45～60 mg) fragments and implanted subcutaneously in the right flank of mice (female NCG mice, ages 35-42 days) which were purchased from GemPharmatech Co., Ltd. When the average tumor size reached 161.42 mm3, the mice were randomized into two groups based on the tumor volume. Mice were given hHTS033-KL and isotype control ADC (Human IgG-KL-DAR8, Sichuan Kelun-Biotech Biopharmacuetical Co., Ltd) at 10mg / kg intravenously on Day 0 (Day of the first administration of the drug) , Day 7 and Day 14 respectively. Tumor size was measured twice weekly in two dimensions using a caliper, and the tumor volume was expressed in mm3 using the formula: V = 0.5 a × b2 where a and b are the long and short diameters of the tumor, respectively. The weight of individual animal was recorded twice weekly t-test was performed to compare the differences between 2 groups. All data were analyzed with GraphPad  Prism 8, while p < 0.05 meant the difference between groups reached statistical significance.

[0410] Table 11. LD1-0025-361336 Lung cancer PDX model information

[0411] Note: FP4+3 (frozen passage 4+3) indicated the tumors were the 4th generation when frozen and were passaged 3 generations after recovery.

[0412] The results were shown in Figures 9 and 10 and Table 12. The treatment of hHTS033-KL (10 mg / kg, QW*3) showed statistical significant anti-tumor effect on Lung cancer PDX model LD1-0025-361336 compared to isotype control ADC (10 mg / kg, QW*3) group. All the mice were well tolerated with the treatments in this study assessed by body weight changes.

[0413] Table 12. Summary of efficacy endpoints of the test articles in LD1-0025-361336 Lung cancer PDX model

[0414] Example 11. Efficacy study of hHTS033-KL in Gastric cancer PDX model LD1-0017-361443

[0415] Tumors (shown in Table 13) were sliced into 3 mm× 3 mm× 3 mm (about 45～60 mg) fragments and implanted subcutaneously in the right flank of mice (female Nu / Nu mice, ages 35-42 days) which were purchased from Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. When the average tumor size reached 163.38  mm3 on day 15 post inoculation, the mice were randomized into 3 groups based on the tumor volume. Mice were given hHTS033-KL, isotype control ADC (Human IgG-KL-DAR8, Sichuan Kelun-Biotech Biopharmacuetical Co., Ltd) at 10mg / kg and Vehicle control intravenously on Day 0 (Day of the first administration of the drug) and Day 7 respectively. Tumor size was measured twice weekly, and the tumor volume was expressed in mm3 using the formula: V = 0.5 a × b2 where a and b are the long and short diameters of the tumor, respectively. The weight of individual animal was recorded twice weekly. One-way ANOVA was performed to compare the tumor volume of each group with Vehicle group. t-test was performed to compare the differences between 2 groups. All data were analyzed with GraphPad Prism 8, while p < 0.05 meant the difference between groups reached statistical significance.

[0416] Table 13. LD1-0017-361443 Gastric cancer PDX model information

[0417] Note: FP2+3 (frozen passage 2+3) indicated the tumors were the 2nd generation when frozen and were passaged 3 generations after recovery.

[0418] The results were shown in Figure 11, Figure 12 and Table 14. In summary, the treatment of hHTS033-KL 10 mg / kg QW*2 resulted in statistically significant anti-tumor effect on Gastric cancer PDX model LD1-0017-361443 compared to vehicle control group; The treatment of hHTS033-KL 10 mg / kg QW*2 showed statistically significant anti-tumor effect compared to isotype control ADC 10 mg / kg QW*2 group. All the mice were well tolerated with the treatments in this study assessed by body weight changes.

[0419] Table 14. Summary of efficacy endpoints of the test articles in LD1-0017-361443 Gastric cancer PDX model

[0420] Note: the mice of vehicle group were sacrificed on day 11, the data analysis was based on the tumor size of day 11.

[0421] Example 12. Efficacy study of hHTS033-KL in Liver cancer PDX model LD1-0011-360763

[0422] Tumors (shown in Table 15) were sliced into 3 mm× 3 mm× 3 mm (about 45～60 mg) fragments and implanted subcutaneously in the right flank of mice (female Nu / Nu mice, ages 35-42 days) which were purchased from Beijing Vital River Laboratory Animal Technology co. LTD. When the average tumor size reached around 150 mm3 on day 34 post inoculation, the mice were randomized into 3 groups based on the tumor volume. Mice were given hHTS033-KL, isotype control ADC (Sichuan Kelun-Biotech Biopharmacuetical Co., Ltd) at 10mg / kg and Vehicle control intravenously on Day 0 (Day of the first administration of the drug) , Day 7 and Day 14 respectively. Tumor size and body weight were measured twice weekly. The tumor volume was expressed in mm3 using the formula: V = 0.5 a × b2 where a and b are the long and short diameters of the tumor, respectively. One-way ANOVA was performed to compare the tumor volume of each group with Vehicle group. t-test was performed to compare the differences between 2 groups. All data were analyzed with GraphPad  Prism 8, while p<0.05 meant the difference between groups reached statistical significance.

[0423] Table 15. LD1-0011-360763 Liver cancer PDX model information

[0424] Note: FP2+2 (frozen passage 2+2) indicated the tumors were the 2nd generation when frozen and were passaged 2 generations after recovery.

[0425] The curves and statistical analysis were shown in Figure 13, Figure 14 and

[0426] Table 16. In summary, the treatments of hHTS033-KL 10 mg / kg QW*3 resulted in statistically significant anti-tumor effect on Liver cancer PDX model LD1-0011-360763 compared to vehicle control group; The treatment of hHTS033-KL 10 mg / kg QW*3 also showed statistically significant anti-tumor effect compared to isotype control ADC (Human IgG-KL-DAR8, Sichuan Kelun-Biotech Biopharmacuetical Co., Ltd) 10 mg / kg QW*3 treated group. All the mice were well tolerated with the treatments in this study assessed by body weight changes.

[0427] Table 16. Summary of efficacy endpoints of the test articles in LD1-0011-360763 Liver cancer PDX model

[0428] Example 13.4-Week GLP Repeat-Dose Toxicity Study of hHTS033-KL Following a 6-Week Recovery Phase in Cynomolgus Monkeys

[0429] Experiment of repeated administration of hHTS033-KL to cynomolgus monkeys: 40 cynomolgus monkeys (Zhanjiang Prima Biotech Inc. ) were randomly divided into 4 groups, and there were 5 male and 5 female in each group. Vehicle, 10 mg / kg of hHTS033-KL, 20 mg / kg of hHTS033-KL and 30 mg / kg of hHTS033-KL were infused intravenously on day 1, the day 15 and day 29, respectively. During the experiment, animals were observed for any abnormalities, and blood samples thereof were collected for hematology and blood biochemical index analysis. Animals for main phase necropsy (day 36) and animals for recovery phase necropsy (day 71) were euthanized respectively and sampled for pathological analysis.

[0430] As shown in Table 17, under the conditions of this study, repeated dosing of cynomolgus monkeys with hHTS033-KL at 10, 20 and 30 mg / kg via intravenous infusion for 4 weeks (once every 2 weeks for 3 doses in total) , was clinically well tolerated. Transient slight irritation non-test article related histopathological changes were noted at the administration site in all doses groups, and no significant abnormalities were noted in the neurologic, cardiovascular and respiratory system. The highest non-severely toxic dose (HNSTD) of hHTS033-KL was 30 mg / kg, and the main toxicity findings were decreased reticulocytes and pigmentation in skin and / or oral mucosa. After a 6-week recovery phase, these above changes resolved without notable delayed toxicity.

[0431] Table 17. Summary of toxicological results of repeated administration of hHTS033-KL to cynomolgus monkeys

[0432] HNSTD*: Maximum dose without severe toxicity

Claims

1.An antibody-drug conjugate having a structure of formula (I) , (T-L) γ-mAb   (I) ,wherein:(i) T is a cytotoxic drug moiety having a structure of formula (II) ,wherein R is -C (=O) Rx, -S (=O) Rx or -S (=O) 2Rx, wherein Rx is selected from a group consisting of C1-6 alkyl, halogenated C1-6 alkyl, C2-6 alkenyl, C2-6 alkynyl, C3-6 cycloalkyl, C3-6 heterocyclyl, 6-10 membered aryl and 5-14 membered heteroaryl; preferably, R is -C (=O) Rx or -S (=O) 2Rx, wherein Rx is selected from a group consisting of C1-6 alkyl, halogenated C1-6 alkyl, C3-6 cycloalkyl, C3-6 heterocyclyl, 6-10 membered aryl and 5-14 membered heteroaryl; more preferably, R is -C (=O) Rx or -S (=O) 2Rx, wherein Rx is selected from a group consisting of C1-6 alkyl, C3-6 cycloalkyl, and phenyl;(ii) L is a linker;(iii) γ is an integer or a decimal ranging from 1 to 10, preferably from 5 to 8; and(iv) mAb is an antibody moiety, wherein the antibody is an anti-CD44v9 antibody or an antigen binding fragment thereof.2.The antibody-drug conjugate of claim 1, wherein the linker has a structure of formula (III) , -L1- (L2) m1- (L3) m2- (L4) m3-E-G-   (III)wherein L1 is bonded to T and G is bonded to mAb, and wherein(i) L1 is selected from a group consisting of Lys, Cit, Cit-Val, Val-Ala, Lys-Val, wherein each of R’, R1 and R2 is independently H (hydrogen) , D (deuterium) or C1-4 alkyl, Z1 is Cit, Lys, Cit-Val, Cit-Ala, Val-Ala or Lys-Val, each of x1 and x3 is independently 0, 1 or 2, and L1 is bonded to T at position 1 of L1; preferably, L1 is selected from a group consisting of Lys, Cit, Cit-Val, Val-Ala, Lys-Val,more preferably, L1 is(ii) L2 is selected from a group consisting ofwherein each of R3, R4, R5 and R6 is independently selected from H (hydrogen) , D (deuterium) or C1-4 alkyl, each of y1 and y2 is independently 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8, and L2 is bonded to L1 at position 1 of L2; preferably L2 is selected from a group consisting ofmore preferably, L2 is(iii) L3 is selected from a group consisting of amino, N-methylpiperidylene, pyrazolylene or triazolylene, optionally substituted with one or more R7, wherein each R7 is independently selected from H (hydrogen) , D (deuterium) , halogen, =O, CF3, CN, CH2CN, carboxyl, sulfonic acid group, C1-4 alkyl, C1-4 alkoxy, C2-6 alkenyl or C2-6 alkynyl; preferably, L3 is triazolylene having a structure ofand bonded to L2 at position 1 of L3;(iv) L4 is selected from a group consisting ofwherein L4 is bonded to E at position 2 of L4; preferably, L4 is selected from a group consisting ofmore preferably, L4 is(v) E is selected from a group consisting of pyrimidylene, quinolylene or pyrrolo [2, 3-d] pyrimidylene, optionally substituted with one or more R12, wherein each R12 is independently selected from H (hydrogen) , D (deuterium) , halogen, CN, nitro, C1-2 alkyl or halogenated C1-2 alkyl; preferably E is pyrimidinyl optionally substituted with one or more R12, wherein each R12 is independently H (hydrogen) or D (deuterium) ;(vi) G is a thioether bond; and(vii) m1 is 0, 1, 2, or 3, preferably m1 is 1; m2 is 0, 1, or 2, preferably m2 is 0 or 1; and m3 is 0, 1, 2, or 3, preferably m3 is 1.3.The antibody-drug conjugate of claim 1 or 2, wherein the cytotoxic drug moiety T is selected from a group consisting of preferably, the cytotoxic drug moiety isandmore preferably, the cytotoxic drug moiety is4.The antibody-drug conjugate of any of claims 1 to 3, wherein the antibody-drug conjugate having a structure selected from a group consisting of: wherein γ is an integer or a decimal ranging from 5 to 8, and mAb is an anti-CD44v9 antibody or an antigen binding fragment thereof.5.The antibody-drug conjugate of any of claims 2 to 4, wherein G of the linker moiety is formed from thiol group of a Cys residue in the mAb; preferably, the thiol group of a Cys residue in the mAb is a thiol group formed by opening a disulfide bond in the mAb.6.The antibody-drug conjugate of any of claims 1 to 5, wherein the mAb binds to a CD44v9 epitope comprising or consisting essentially of SEQ ID NO. 55 or 56.7.The antibody-drug conjugate of any of claims 1 to 6, wherein the mAb comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are the same as any of (a) to (d) :(a) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 47; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 48;(b) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 49; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 50;(c) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 51; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 52; and(d) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 53; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 54; and,wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are preferably defined according to any of CDR definition schemes selected from a group consisting of Chothia, Kabat, IMGT, AbM and Contact.8.The antibody-drug conjugate of any of claims 1 to 7, wherein the mAb comprises:(a) a heavy chain variable region comprising HCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region comprising LCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and LCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, according to IMGT definition of CDR; or(b) a heavy chain variable region comprising HCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, HCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 and HCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and a light chain variable region comprising LCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, LCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, and LCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, according to IMGT definition of CDR.9.The antibody-drug conjugate of any of claims 1 to 8, wherein the mAb comprises:(a) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48;(b) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50;(c) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52; or(d) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 54.10.The antibody-drug conjugate of claim 9, wherein the mAb comprises a heavy chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and a light chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.11.An antibody-drug conjugate selected from a group consisting of: wherein γ is an integer or a decimal ranging from 5 to 8, and mAb is an anti-CD44v9 monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof, wherein the mAb is linked via a thiol group of a Cys residue in the mAb, and the mAb comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are the same as any of (a) to (d) :(a) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 47; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 48;(b) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 49; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 50;(c) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 51; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 52; and(d) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 53; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 54; and,wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are preferably defined according to any of CDR definition schemes selected from a group consisting of Chothia, Kabat, IMGT, AbM and Contact.12.An antibody-drug conjugate having a structure of wherein γ is an integer or a decimal ranging from 5 to 8, and mAb is an anti-CD44v9 monoclonal antibody or an antigen binding fragment thereof, wherein the thioether bond linked to the mAb is formed from a thiol group of a Cys residue in the mAb.13.The antibody-drug conjugate of claim 12, wherein the thiol group of a Cys residue in the mAb is a thiol group formed by opening a disulfide bond in the mAb or a free Cys residue contained in the mAb.14.The antibody-drug conjugate of claim 12 or 13, wherein the mAb binds specifically to a CD44v9 epitope comprising or consisting essentially of SEQ ID NO. 55 or 56.15.The antibody-drug conjugate of any of claims 12 to 14, wherein the mAb comprises a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3, wherein the  HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are the same as any of (a) to (d) :(a) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 47; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 48;(b) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 49; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 50;(c) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 51; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 52; and(d) HCDR1, HCDR2 and HCDR3 of heavy chain variable region of SEQ ID NO: 53; and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of light chain variable region of SEQ ID NO: 54; and,wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, and LCDR3 are preferably defined according to any of CDR definition schemes selected from a group consisting of Chothia, Kabat, IMGT, AbM and Contact.16.The antibody-drug conjugate of claim 15, wherein the mAb comprises:(a) a heavy chain variable region comprising HCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, HCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and HCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and a light chain variable region comprising LCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, LCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and LCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, according to IMGT definition of CDR; or(b) a heavy chain variable region comprising HCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, HCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 and HCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, and a light chain variable region comprising LCDR1 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, LCDR2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, and LCDR3 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, according to IMGT definition of CDR.17.The antibody-drug conjugate of claim 16, wherein the mAb comprises:(a) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 48;(b) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 50;(c) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 52; or(d) a heavy chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, and a light chain variable region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 54.18.The antibody-drug conjugate of any of claims 12 to 17, wherein the mAb comprises a heavy chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and a light chain constant region having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.19.A pharmaceutical composition for treatment of cancer, comprising an antibody-drug conjugate of any of claims 1 to 18, and a pharmaceutically acceptable carrier.20.Use of an antibody-drug conjugate of any of claims 1 to 18 in the preparation of a medicament for treatment of cancer; optionally, the cancer is a solid tumor, preferably NSCLC (Non-Small Cell Lung Carcinoma) , HNSCC (Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck) , esophageal cancer such as ESCC (esophageal squamous cell carcinoma) , GC (Gastric Carcinoma) , BC (Bladder Cancer) , breast cancer such as TNBC (Triple Negative Breast Cancer) , colorectal cancer, and liver cancer.21.An antibody-drug conjugate of any of claims 1 to 18 for use in the treatment of cancer; optionally, the cancer is a solid tumor, preferably NSCLC (Non-Small Cell Lung Carcinoma) , HNSCC (Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck) , esophageal cancer such as ESCC (esophageal squamous cell carcinoma) , GC (Gastric Carcinoma) , BC (Bladder Cancer) , breast cancer such as TNBC (Triple Negative Breast Cancer) , colorectal cancer, and liver cancer.

Images