Formulation comprising antibody-drug conjugate targeting claudin18.2, method for preparing the same, and use thereof

Abstract

Provided are a pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2, a method for preparing the pharmaceutical formulation and a therapeutic and / or prophylactic use of the pharmaceutical formulation.

Description

FORMULATION COMPRISING ANTIBODY-DRUG CONJUGATE TARGETING CLAUDIN18.2, METHOD FOR PREPARING THE SAME, AND USE THEREOFTECHNICAL FIELD

[0001] The present invention relates to the filed of the pharmaceutical formulation of antibody-drug conjugate (ADC) targeting Claudin18.2 (CLDN18.2) . More specifically, the present invention relates to a pharmaceutical formulation, in particular a lyophilized formulation, a liquid formulation and a reconstituted liquid formulation, comprising an antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2, a method for preparing the pharmaceutical formulation and a therapeutic and / or prophylactic use of the pharmaceutical formulation.BACKGROUND

[0002] Claudins are a family of proteins, which are important components constituting the tight junctions between cells. They establish an intercellular barrier that controls the intercellular flow of molecules, the barrier can control the flow of molecules between cells. Claudins family proteins have tetraspanin domains, and their N-terminus and C-terminus are included in the cytoplasm. Different Claudins proteins are expressed in different tissues, and their functional changes are related to the development of cancer in various tissues. For example, Claudin-1 is expressed in colon cancer and has prognostic value, Claudin-18 is highly expressed in gastric cancer and pancreatic cancer, and Claudin-10 is highly expressed in hepatocellular carcinoma. Claudins, as cell membrane surface proteins, are useful targets for various therapeutic strategies.

[0003] Isoform 2 of Claudin-18 (Claudin 18.2 or CLDN18.2) is a highly selective cell lineage marker. Its expression in normal tissues is strictly confined to differentiated epithelial cells of the gastric mucosa, but its expression was absent from the gastric stem cell zone. CLDN18.2 is expressed in a considerable portion of primary gastric cancer, and the expression level thereof is retained in gastric metastatic cancer tissues. In addition to gastric cancer, the expression of CLDN18.2 is also found in pancreatic cancer. CLDN18.2 is an ideal target molecule for treating these cancers (Singh, P., Toom, S. &Huang, Y. Anti-CLDN18.2 antibody as new targeted therapy for advanced gastric cancer. J Hematol Oncol 10, 105 (2017) . https:  / / doi. org / 10.1186 / s13045-017-0473-4) .

[0004] With regard to gastric cancer, in 2014, there were about 410, 000 new cases and 290, 000 deathsin China, accounting for almost half of the new cases and deaths worldwide, and they are still showing an increasing trend. However, there is a large unmet need for clinical tumor treatment, so it is extremely necessary to develop drugs targeting Claudin18.2.

[0005] Despite the clinical success has been achieved by therapeutic antibodies, naked MAbs targeting cell surface tumor antigens rarely provide sufficient efficacy alone. To increase the low activity of Mab, new strategies focus on conjugating them to toxic molecules. Plant and bacterial toxins and chemotherapeutic small molecules can be good candidates because they are very potent and active in very small amounts.

[0006] Due to technological advances over the past several years, the field of antibody-drug conjugates (ADCs) for the treatment of cancer has recently experienced an increasing development activity by pharmaceutical companies in order to solve the problems that the ADCs initially presented in terms of immunogenicity, affinity, specificity, undesirable toxicity, yield, half-life, etc.

[0007] Despite some advances, there is still a need for additional therapeutic strategies for the treatment of tumors as well as for components used in such therapeutic strategies, in particular for anti-Claudin18.2 antibodies with high affinity, good specificity, and / or low risk of immunogenicity, and for ADC molecules with higher activity, low toxicity, prolonged half-life, good specificity or affinity, and / or good half-life or druggability.

[0008] There is a need for a novel pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 that is sufficiently stable and suitable for administration. The pharmaceutical formulation, in particular the lyophilized formulation, has good stability, remains stable during storage and transportation, and the lyophilized formulation is readily to be administrated upon reconstitution.

[0009] BRIEF SUMMARY

[0010] The present invention provides a pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 (ADC) .

[0011] In a first aspect, the present invention provides a pharmaceutical formulation comprising (i) an antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 or a pharmaceutically acceptable salt or a solvate thereof; (ii) a buffer, (iii) a stabilizer, and / or (iv) a surfactant; wherein the pH of the formulation is about 5.5-7.5, for example, about 6.0-6.5, e.g., 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0 or 7.2, preferably, about 6.5.

[0012] In some embodiments, wherein the Claudin18.2 antibody-drug conjugate is selected from:

[0013] wherein Ab is an antibody or an antigen-binding fragment thereof targeting Claudin18.2,

[0014] wherein q represents an average DAR,

[0015] In IEX019-02, IEX019-04, IEX019-05, q is 2-5, for example, 3-5, 3.5-4.5 or 3 -4,

[0016] In IEX019-03, q is 5-11, for example, 7-9 or 7.5-8.5.

[0017] According to the context, it should be understood that when the variable after the square brackets in the ADC structural formula is designated as an average DAR, e.g., q in the above structrure formula, it represents the ratio of drug moiety (such as Exatecan) to Ab as determined by a conventional determination method, for example, as described in the Definitions section herein. The average DAR may be a decimal, for average DAR, for example, when referring to "q is 3-5" or "q is a number from 3 to 5, " it means that q is any number selected from between 3 and 5, including integers and decimals.

[0018] In some embodiments, wherein the Claudin18.2 antibody-drug conjugate is selected from:

[0019] wherein Ab is an antibody or an antigen-binding fragment thereof targeting Claudin18.2,

[0020] In formula I-A, y is an integer of 1 or 2,

[0021] In formula I-B, I-C or I-D, y is an integer of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10,

[0022] It should be understood that, when the variable after the square brackets of the ADC structural formula is not specified as an average DAR, such as y in Formulae I-Ato I-D, it does not represent an average DAR, but refers to the number of Linker-payloads (i.e., the structures in the square brackets of Formulae I-Ato I-D) linked to each Ab in said ADC molecule, unless otherwise specified or contradictory according to the context. For example, when y is 2, it means that one Ab is connected to two Linker-payloads in the ADC molecule.

[0023] In some embodiments, the antibody or the antigen-binding fragment thereof targeting to Claudin18.2 comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 respectively consisting of amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 1, 2 and 3, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 respectively consisting of amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 6, 7 and 8;

[0024] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment thereof targeting to Claudin18.2 comprises a heavy chain variable region and / or a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region

[0025] (i) comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; or

[0026] (ii) comprises or consists an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the amino acid set forth in SEQ ID NO: 4; or

[0027] (iii) comprises or consists of an amino acid sequence having one or more (preferably no more than 10, and more preferably no more than 5, 4, 3, 2, or 1) amino acid alterations (preferably amino acid replacements, and more preferably conservative amino acid replacements) compared with an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, preferably, the amino acid alterations do not occur in the CDRs; and / or

[0028] the light chain variable region

[0029] (i) comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9; or

[0030] (ii) comprises or consists an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the amino acid set forth in SEQ ID NO: 9; or

[0031] (iii) comprises or consists of an amino acid sequence having one or more (preferably no more than 10, and more preferably no more than 5, 4, 3, 2, or 1) amino acid alterations (preferably amino acid replacements, and more preferably conservative amino acid replacements) compared with an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, preferably, the amino acid alterations do not occur in the CDRs.

[0032] In some embodiments, the antibody or an antigen-binding fragment thereof targeting to Claudin18.2 comprises heavy chains and a light chain, wherein

[0033] the heavy chain

[0034] (i) comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11; or

[0035] (ii) comprises or consists an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the amino acid set forth in SEQ ID NO: 11; or

[0036] (iii) comprises or consists of an amino acid sequence having one or more (preferably no more than 20 or 10, and more preferably no more than 5, 4, 3, 2, or 1) amino acid alterations (preferably amino acid replacements, and more preferably conservative amino acid replacements) compared with an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11; and / or

[0037] the light chain

[0038] (i) comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12; or

[0039] (ii) comprises or consists an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the amino acid set forth in SEQ ID NO: 12; or

[0040] (iii) comprises or consists of an amino acid sequence having one or more (preferably no more than 20 or 10, and more preferably no more than 5, 4, 3, 2, or 1) amino acid alterations (preferably amino acid replacements, and more preferably conservative amino acid replacements) compared with an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12.

[0041] In some embodiments, the buffer is selected from one or more of histidine, citric acid, succinic acid, glutamic acid, phosphoric acid, acetic acid or a salt thereof; preferably, the buffer is a combination of histidine and histidine hydrochloride, or is histidine.

[0042] In some embodiments, the stabilizer is selected from one or more of carbohydrates, polyols; preferably, the carbohydrate is selected from sucrose, trehalose, glucose, lactose, maltose, cyclodextrin, maltodextrin and dextran, the polyol is selected from mannitol, sorbitol and xylitol; more preferably, the stabilizer is selected from sucrose, trehalose, mannitol or a combination thereof.

[0043] In some embodiments, the surfactant is selected from alkyl poly (ethylene oxide) , polysorbate, pluronics or a combination thereof; preferably, selected from polysorbate-20, polysorbate-80, polysorbate-60, or polysorbate-40.

[0044] In some embodiments, the buffer is a combination of histidine and histidine hydrochloride, or is histidine; the stabilizer is sucrose; trehalose; or a combination of sucrose and mannitol; and / or

[0045] the surfactant is polysorbate 80.

[0046] In some embodiments, the pharmaceutical formulation comprises about 1-200 mg / ml, preferably 15-60 mg / ml, more preferably about 20-40 mg / mL of the antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 or the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.

[0047] In some embodiments, the pharmaceutical formulation further comprises about 1-100 mM, preferably about 5-50mM, more preferably about 10-30mM of the buffer.

[0048] In some embodiments, the pharmaceutical formulation further comprises about 10-200 mg / ml, preferably about 50-100 mg / ml, more preferably about 60-90 mg / ml of the stabilizer.

[0049] In some embodiments, the pharmaceutical formulation further comprises about 0.01-5 mg / ml, preferably about 0.05-1 mg / ml, more preferably about 0.1-0.3 mg / ml of the surfactant.

[0050] In some embodiments, the pharmaceutical formulation comprises:

[0051] (i) about 20-40 mg / ml of the antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 or the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof;

[0052] (ii) about 20 mM of the buffer;

[0053] (iii) about 60-90 mg / ml of the stabilizer; and

[0054] (iv) about 0.1-0.3 mg / ml of the surfactant.

[0055] In some embodiments, wherein the pharmaceutical formulation comprises:

[0056] (i) about 20-40 mg / ml of the antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 or the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof;

[0057] (ii) about 20 mM of the buffer, the buffer is a combination of histidine and histidine hydrochloride, or is histidine;

[0058] (iii) about 60-90 mg / ml of the stabilizer, the stabilizer is sucrose; trehalose; or a combination of sucrose and mannitol; and

[0059] (iv) about 0.1-0.3 mg / ml of polysorbate 80;

[0060] wherein the pH of the liquid formulation is about 6.0-6.5, preferably about 6.5.

[0061] In some embodiments, wherein the pharmaceutical formulation comprises:

[0062] (i) about 20mg / ml of the antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 or the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof;

[0063] (ii) about 20 mM of the buffer; the buffer is a combination of histidine and histidine hydrochloride, or is histidine;

[0064] (iii) about 8% (w / v) of the stabilizer; the stabilizer is sucrose; trehalose; or a combination of sucrose and mannitol; and

[0065] (iv) about 0.02% (w / v) of polysorbate 80;

[0066] wherein the pH of the formulation is about 6.5.

[0067] In a second aspect, the present invention provides a lyophilized pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate, the lyophilized pharmaceutical formulation forms or is able to provide the pharmaceutical formulation as described in the above first aspect after reconstitution.

[0068] In some embodiments, the lyophilized pharmaceutical formulation is prepared by lyophilizing the pharmaceutical formulation as described in the above first aspect.

[0069] In a third aspect, the present invention provides a lyophilized pharmaceutical formulation containing an antibody-drug conjugate, which comprises:

[0070] (i) about 1%-60% (w / w) , preferably about 15%-40% (w / w) of the antibody-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or a solvate thereof;

[0071] (ii) about 0.5%-10% (w / w) , preferably about 2%-5% (w / w) of a buffer;

[0072] (iii) about 20%-90% (w / w) , preferably about 50%-85% (w / w) of a stabilizer; and / or

[0073] (iv) about 0.05%-2% (w / w) , preferably about 0.1%-0.5% (w / w) of a surfactant;

[0074] wherein the antibody-drug conjugate, the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, the buffer, the stabilizer and / or the surfactant are as defined in the above first aspect.

[0075] In a fourth aspect, the present invention provides a liquid pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate, the liquid pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate is obtained upon reconstituting the lyophilized pharmaceutical formulation as described above with a solvent, the pH thereof is about 5.5-7.5, preferably about 6.0-6.5, more preferably about 6.5.

[0076] In some embodiments, the liquid pharmaceutical formulation is used for injection or infusion administration, for example for intravenous injection, subcutaneous injection or intramuscular injection.

[0077] In a fifth aspect, the present invention provides a delivery device comprising the pharmaceutical formulation, a lyophilized pharmaceutical formulation or the liquid pharmaceutical formulation of the  present invention.

[0078] In a sixth aspect, the present invention provides a pre-filled syringe comprising the pharmaceutical formulation, the lyophilized pharmaceutical formulation or the liquid pharmaceutical formulation of the present invention, for intravenous injection, intramuscular injection or subcutaneous injection.

[0079] In a seventh aspect, the present invention provides a use of the pharmaceutical formulation, the lyophilized pharmaceutical formulation and the liquid pharmaceutical formulation of the present invention in manufacture of a medicament, preferably, the pharmaceutical formulation, the lyophilized pharmaceutical formulation and the liquid pharmaceutical formulation are used for preventing or treating tumor.

[0080] More preferably, the tumor is cancer, for example epithelial cancer or digestive tract cancer, for example gastric cancer or gastroesophageal junction cancer or pancreatic cancer or colorectal cancer or colon cancer.

[0081] In an eighth aspect, the present invention provides a pharmaceutical combination, which comprises the pharmaceutical formulation, the lyophilized pharmaceutical formulation, or the liquid pharmaceutical formulation of the present invention, as well as one or more other therapeutic agents, for example chemotherapeutic agents, angiogenesis inhibitors, cytokines, cytotoxic agents, other antibodies, small molecule drugs or immunomodulators.

[0082] In a ninth aspect, the present invention provides a kit of parts comprising the pharmaceutical formulation, the lyophilized pharmaceutical formulation, or the liquid pharmaceutical formulation of the present invention, or the pharmaceutical combination of the present invention, preferably the kit is in the form of a drug dosage unit.

[0083] The formulation of the antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 of the present invention has the following advantages and / or benefits:

[0084] (1) The formulation of the present invention has shown excellent stability to a variety of influence factors aganist stability, such as temperature, oscillation, freeze-thaw, light. After long-term storage or accelerated experiment, no obvious changes regarding appearance of the formulation, protein concentration, insoluble particles, DAR and the like are observed, and good antibody activity is maintained, which is conducive to long-term storage or transportation;

[0085] (2) The lyophilized formulation of the present invention reconstitutes rapidly. There is no significant change in the physicochemical properties and activity of the reconstituted antibody-drug conjugate, which is beneficial for patients to administer;

[0086] (3) The process for preparing the formulation of the present invention is simple and highly reproducible. Moreover, the conjugate in the formulation of the present invention has the following advantages:

[0087] (1) binding to target cells expressing human CLDN18.2 and having high affinity therefor;

[0088] (2) capable of entering cells through endocytosis to kill target cells; in some embodiments, the ADC of the present invention has high endocytosis efficiency;

[0089] (3) having significant bystander killing effect;

[0090] (4) having high antitumor efficacy;

[0091] (5) having low toxicity;

[0092] (6) having good stability;

[0093] (7) having good druggability.

[0094] BRIEF DESCRIPTON OF THE DRAWINGS:

[0095] FIG. 1 shows the cell binding effect of IEX019 molecules.

[0096] FIG. 2 shows the endocytosis of IEX019 molecules in DANG-hCLDN18.2 cell.

[0097] FIG. 3 shows the killing effect of IEX019 molecules in cell line with low expression of hCLDN18.2 (FIG. 3A) , the killing effect of IEX019 molecules in cell line with moderate expression of hCLDNA18.2 (FIG. 3B)  and the killing effect of IEX019 molecules in cell line with high expression of hCLDN18.2 (FIG. 3C) .

[0098] FIG. 4 shows the bystander killing effect of IEX019 molecules.

[0099] FIG. 5 shows the tumor inhibition efficacy (FIG. 5A) of IEX019 molecules in mice and the body weight change (FIG. 5B) .

[0100] FIG. 6 shows the tumor inhibition efficacy (FIG. 6A) of IEX019 molecules in mice and the body weight change (FIG. 6B) .

[0101] FIG. 7 shows the tumor inhibition efficacy (FIG. 7A) of IEX019 molecules in mice and the body weight change (FIG. 7B) .

[0102] FIG. 8 shows the DSC profile of ADC pH buffer solution screening.

[0103] DETAILED DESCRIPTION OF INVENTION

[0104] I. Definitions

[0105] Before the present invention is described in detail below, it should be understood that the present invention is not limited to the particular methodology, protocols, and reagents described herein, as these may vary. It should also be understood that the terminology used herein is only intended to describe specific embodiments rather than to limit the scope of the present invention, which will be limited only by the appended claims. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by those of ordinary skill in the art.

[0106] For the purpose of explaining this specification, the following definitions will be used, and wherever appropriate, terms used in the singular form may also include the plural form, and vice versa. It should be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing specific embodiments only, and is not intended to be limiting.

[0107] The term "about" used in combination with a numerical value is intended to encompass the numerical values in a range from a lower limit less than the specified numerical value by 5%to an upper limit greater than the specified numerical value by 5%.

[0108] As used herein, the term "and / or" refers to any one of the options or two or more of the options.

[0109] As used herein, the term "comprise" or "include" is intended to mean that the described elements, integers or steps are included, but not to the exclusion of any other elements, integers or steps. The term "comprise" or "include" used herein, unless otherwise specified, also encompasses the situation where the entirety consists of the described elements, integers or steps. For example, when referring to "comprise" an antibody variable region of a particular sequence, it is also intended to encompass an antibody variable region consisting of the specific sequence.

[0110] The term “CLAUDIN” or “CLDN” used herein is the most important skeleton protein that determines the structures of tight junctions between cells, and it is involved in adhesion junctions and plays an important role in the metastasis and invasion of tumor cells. Claudin proteins are widely present in mammalian  epithelial and endothelial cells, primarily on the lateral surface of epithelial cells and on the plasma membrane of basal cells. Different Claudin proteins have their respective specific expression in different tissues, wherein the Claudin18 (CLDN18) gene is located at 3q22.3, has a molecular weight of 24 kDa, comprises 261 amino acid residues, and is a member of the Claudins superfamily. Its protein structure comprises 2 extracellular loops and 4 transmembrane region. Two subtypes of human CLDN18 or Claudin18 protein are Claudin18.1 or CLDN18.1 (UniProt ID: P56856-1) and Claudin18.2 or CLDN18.2 (UniProt ID: P56856-2) , respectively. In the primary structural sequences of the two proteins, only the amino acid residues at some positions from the N-terminus signal peptide to the extracellular loop 1 (Loops) structure are different. Especially at the extracellular loop 1, CLDN18.1 and CLDN18.2 differ by only 8 amino acids. The intergeneric and inerspecies sequence homology of the two subtypes of CLDN18 protein is also very high. The sequences of the extracellular loop 1 of CLDN18.2 are completely identical in different species such as human, mouse and rhesus monkey, while the homology of human and mouse CLDN18.2 proteins reaches 84%, indicating that the sequence of CLDN18.2 protein is extremely conserved (O. Tureci. et al., Gene, 481: 83-92, 2011) . CLDN18.2 or any variants and isoforms thereof may be isolated from cells or tissues in which they are naturally expressed, or recombinantly produced using techniques well known in the art and / or those described herein. In an embodiment, the CLDN18.2 as described herein is a human CLDN18.2.

[0111] The term “anti-CLDN18.2 antibody” , “anti-CLDN18.2” , “CLDN18.2 antibody” or “antibody that binds to CLDN18.2” or “antibody that specifically binds to CLDN18.2” or “antibody targeting to CLDN18.2” or “antibody targeting CLDN18.2” used herein refers to an antibody capable of binding to (human) CLDN18.2 with sufficient affinity such that the antibody can be used as a therapeutic agent targeting (human) CLDN18.2. In an embodiment, the (human) CLDN18.2 antibody binds to (human) CLDN18.2 with high affinity in vitro or in vivo. In an embodiment, the (human) CLDN18.2 antibody does not bind to CLDN18.1. In an embodiment, the (human) CLDN18.2 antibody binds to cells expressing CLDN18.2 but does not bind to cells expressing CLDN18.1. In some embodiments, the binding is determined, e.g., by radioimmunoassay (RIA) , bio-layer interferometry (BLI) , MSD assay, surface plasmon resonance (SPR) or flow cytometry. The expression of CLDN18.2 in cell may be determined by multiple method, for example anti-CLDN18.2 antibody. For example, the binding strength of cell with “high expression of CLDN18.2” and anti-CLDN18.2 antibody (e.g., determined by FACS) may be over 500, 600, 700, 800, 900 or preferably over 1000 times, such as over 1100 times, over 1200, 1300, 1400 times or higher times than that of anti-CLDN18.2 antibody and cell without CLDN18.2 expression. For example, the binding strength of cell with “moderate expression of CLDN18.2” and anti-CLDN18.2 antibody (e.g., determined by FACS) may be 5-500 times than that of anti-CLDN18.2 antibody and cell without CLDN18.2 expression, such as 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 times or higher, but no more than 500 times.

[0112] The terms “whole antibody” , “intact antibody” or “full-length antibody” , are used interchangeably herein to refer to an antibody molecule having the structure of a native immunoglobulin molecule. In the case of a conventional four-chain IgG antibody, the full-length antibody comprises two heavy chains (H) and two light chains (L) interconnected by disulfide bonds. In the case of heavy chains antibody having only heavy chains but lacking light chains, the full-length antibody comprises two heavy chains (H) interconnected by disulfide bonds.

[0113] For the conventional four-chain IgG antibody, the full-length antibody heavy chain generally consists of heavy chain variable regions (abbreviated herein as VH) and heavy chain constant regions, wherein the heavy chain constant region comprises at least 3 domains CH1, CH2, and CH3. The full-length antibody light chain consists of light chain variable regions (abbreviated herein as VL) and light chains constant region, wherein the light chain constant region consists of one domain CL. Each heavy chain variable region VH or each light chain variable region consists of three CDRs and 4 FRs, arranged from amino-terminus to carboxyl-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, and FR4.

[0114] The term “antibody fragment” includes a portion of a whole antibody. In preferred embodiments, the antibody fragment is antigen-binding fragment.

[0115] "Antigen-binding fragment" refers to a molecule different from a whole antibody, which comprises a portion of the whole antibody and binds to an antigen to which the whole antibody binds. Examples of the antibody fragment include, but are not limited to, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab') 2; a dAb (domain antibody) ; a linear antibody; a single-chain antibody (e.g., scFv) ; a single-domain antibody, for example VHH; a bivalent or  bispecific antibody or a fragment thereof; a Camelidae antibody.

[0116] The term "antigen" refers to the molecule that elicits an immune response. This immune response may involve the production of antibody or the activation of specific immune cells, or both. Technicans will understand that any large molecule, including almost all proteins or peptides, can be used as antigens. In addition, antigens can be derived from recombinant or genomic DNA. As used herein, the term "epitope" refers to a moiety of an antigen (e.g., CLDN18.2) that specifically interacts with an antibody molecule.

[0117] "Complementarity determining region" or "CDR region" or "CDR" is a region in an antibody variable domain that is highly variable in sequence and forms a structurally defined loop ( "hypervariable loop" ) and / or comprises antigen-contacting residues ( "antigen contact site" ) . CDRs are primarily responsible for binding to antigen epitopes. The CDRs of heavy and light chains are generally referred to as CDR1, CDR2, and CDR3, which are numbered sequentially from N-terminus. The CDRs located in heavy chains variable domain of an antibody are referred to as HCDR1, HCDR2, and HCDR3, whereas the CDRs located in light chains variable domain of an antibody are referred to as LCDR1, LCDR2, and LCDR3. In a given amino acid sequence of light chain variable regions or heavy chain variable regions, the exact amino acid sequence boundary of each CDR can be determined using any one or a combination of many well-known antibody CDR numbering systems including, e.g., Chothia based on the three-dimensional structure of antibodies and the topology of the CDR loops (Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883; Al-Lazikani et al., Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins, Journal of Molecular Biology, 273: 927-948 (1997) ) , Kabat based on antibody sequence variability (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th edition, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987) ) , AbM (University of Bath) , Contact (University College London) , International ImMunoGeneTics database (IMGT) (imgt. cines. fr / on the World Wide Web) , and North CDR definition based on the affinity propagation clustering using a large number of crystal structures (North et al, “ANew Clustering of Antibody CDR Loop Conformations” , Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011) ) .

[0118] The followings are the range of CDRs defined by kabat, AbM, Chothia, Contact and IMGT protocols.

[0119] CDRs may also be determined based on having the same Kabat numbering positions as the reference CDR sequences (e.g., any of the exemplary CDRs of the present invention) .

[0120] Unless otherwise specified, the term "CDR" or "CDR sequence" used herein encompasses CDR sequences determined by any one of the schemes described above.

[0121] Unless otherwise specified, residue positions of an antibody variable region (including heavy chain variable region residues and light chain variable region residues) in the present invention are positions numbered according to the Kabat numbering system (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) )

[0122] In an embodiment, the heavy chain variable region CDR of the antibody of the present invention is determined according to the following schemes:

[0123] VH CDR1 is determined according to AbM scheme; and VH CDR2 and 3 are determined according to Kabat scheme.

[0124] In an embodiment, the light chain variable region CDR of the antibody of the present invention is determined according to the Kabat scheme.

[0125] In an embodiment, the heavy chain variable region CDR of the antibody of the present invention is determined according to the following schemes: VH CDR1 is determined according to the AbM schem; and VH CDR2 and 3 are determined according to Kabat scheme; and each CDR of light chain variable area is determined according to Kabat scheme .

[0126] It should be noted that boundaries of CDRs of variable regions of an antibody based on different assignment systems may differ. That is, CDR sequences of variable regions of an antibody defined by different assignment systems differ. Therefore, when it comes to defining an antibody with specific CDR sequences defined in the present invention, the scope of antibody also encompasses such antibodies whose variable region sequences comprise the specific CDR sequences, but having claimed CDR boundaries different from the specific CDR boundaries defined by the present invention due to a different schemes (e.g., different assignment system schemes or their combinations) applied.

[0127] Antibodies with different specificities (i.e., different binding sites for different antigens) have different CDRs (under the same assignment system) . However, although CDRs differ from antibody to antibody, only a limited number of amino acid positions within the CDRs are directly involved in antigen binding. The smallest overlapping region can be determined using at least two of the Kabat, Chothia, AbM, Contact, and North methods, thereby providing a "minimal binding unit" for antigen binding. The minimal binding unit may be a sub-portion of the CDR. As will be clear to those skilled in the art, residues of the rest CDR sequences can be determined via antibody structure and protein folding. Therefore, any variants of the CDRs given herein are also contemplated in the present invention. For example, in a CDR variant, the amino acid residues in the minimal binding unit may remain unchanged, while the other CDR residues defined by Kabat or Chothia may be substituted by conservative amino acid residues.

[0128] The term "Fc region" is used herein to define a C-terminus region of an immunoglobulin heavy chain, which comprises at least one portion of a constant region. The term includes Fc regions of native sequences and variant Fc regions. “Fc domain” of a native immunoglobulin comprises two or three constant domains, namely a CH2 region and a CH3 region, and optionally comprises a CH4 region. For example, an immunoglobulin Fc domain in native antibody comprises the second and the third constant domains (a CH2 region and a CH3 region) derived from two heavy chains of IgG, IgA and IgD, or comprises the second and the third and the fourth constant domains (aCH2 region, a CH3 region and a CH4 region) derived from two heavy chains of IgM and IgE. Unless otherwise stated, the numbering of amino acid residues in the Fc region or constant region is based on an EU numbering system, which is also called EU index as described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. In the present invention, the term “Fc region” does not comprise the heavy chain variable region VH and the light chain variable region VL and the heavy chain constant region CH1 and the light chain constant region CL of an  immunoglobulin, but may comprise the hinge region in the N-terminus of the heavy chain chain constant region in some cases.

[0129] "Antibody in IgG form" is used to define the IgG form that the heavy chain constant region of the antibody belonging to. Heavy chain constant regions of antibodies of different types are different. For example, an antibody in the form of IgG4 refers to its heavy chain constant region is derived from IgG4, or an antibody in the form of IgG1 refers to its heavy chain constant region is derived from IgG1.

[0130] As used herein, the term "binding" or "specific binding" means that binding interactions to antigen are selective and can be distinguished from unwanted or non-specific interactions. The ability of antigen binding sites to bind to specific antigens can be determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or conventional binding assay known in the art, such as radioimmunoassay (RIA) , thin-layer biomembrane interference assay, MSD assay or surface plasmon resonance (SPR) .

[0131] As used herein, "antibody-drug conjugate (ADC) " refers to a structure / compound obtained by linking an antibody and a drug, typically via a linker.

[0132] The general term “carbohydrate” or “sachharide” used herein refers to a monocarbohydrate, for example glucose (Glc) , galactose (Gal) , mannose (Man) and fucose (Fuc) . The term “carbohydrate derivative” used herein refers to a derivative of a monocarbohydrate, i.e. a monocarbohydrate comprising a substituent and / or a functional group. Examples of carbohydrate derivatives include amino carbohydrates and carbohydrate acids, e.g. glucosamine (GlcN) , galactosamine (GalN) , N-acetylglucosamine (GlcNAc) , N-acetylgalactosamine (GalNAc) , N-acetylneuraminic acid (NeuNAc) and N-acetylmuramic acid (MurNAc) , glucuronic acid (GlcA) and iduronic acid (IdoA) . Examples of carbohydrate derivatives also include compounds herein denoted E (A) x, wherein E is a carbohydrate or a carbohydrate derivative, and wherein E comprises x functional groups A.

[0133] A core-N-acetylglucosamine substituent (core-GlcNAc substituent) is defined herein as a GlcNAc that is bonded to an antibody via C1, preferably via an N-glycosidic bond being bonded to the amide nitrogen atom in the side chain of an asparagine amino acid of the antibody. The core-GlcNAc substituent may be present at a native glycosylation site of the antibody, but it may also be introduced on a different site on the antibody. Herein, the core-N-acetylglucosamine substituent is a monocarbohydrate substituent, or (if said core-GlcNAc substituent is fucosylated) a dicarbohydrate core- (Fucα1-6) GlcNAc substituent, also referred to as GlcNAc (Fuc) .

[0134] "Glycosylation modification" refers to the process of changing the glycan chain of antibodies by glycosylation engineering. Glycosylation of antibodies may be further modified for various purposes to obtain antibodies with novel glycosylation, for example, removing the glycosylation to eliminate FcγR affinity and complement binding / effector functions, reducing the fucose and sialic acid groups and adding the bisecting N-acetylglucosamine, galactose and mannose to enhance Fc-mediated ADCC and CDC effects. Methods for glycosylation modification are known in the art, for example, increasing or decreasing the saccharide chain (s) on the surface of the antibody by changing the glycosylation site of the antibody, or modifying the saccharide chains by in vitro chemical or enzymatic methods, or catalyzing the glycosylation of antibody by changing the glycosylation pathway of the expression system (e.g., consisting of glycosidases, glycosyltransferases, and the like) , and changing the glycosylation of antibodies by influencing the cell culture conditions. In some embodiments, the "glycosylation modification" of the present invention is carried out by modifying saccharide chain (s) with in vitro enzymatic method. Preferably, the glycosylation modification of the present invention is carried out by modifying saccharide chain (s) with glycosidases (e.g., endoglycosidases or glycosyltransferases) .

[0135] An antibody with modified glycosylation of the present invention refers to an antibody with a modified glycosylation pattern compared to an antibody with a native glycosylation pattern. Preferably, the antibody with modified glycosylation refers to an antibody obtained by modification on the saccharide chain (s) in vitro by enzymatic method (e.g., modifying the saccharide chain (s) by glycosidases (e.g., endoglycosidase or glycosyltransferases) ) on the antibody after expression in an expression system (e.g., mammalian cell) . More preferably, the antibody with modified glycosylation of the present invention refers to an antibody comprising a core-GlcNAc and a carbohydrate derivative E (A) x linked thereto, wherein the GlcNAc is bonded to the antibody via C1, preferably via an N-glycosidic bond to the amide nitrogen atom in the side  chain of an asparagine amino acid of the antibody. If the GlcNAc in a GlcNAc-E (A) x substituent is fucosylated, fucose is generally linked to C6 of the -GlcNAc substituent viaα-1 , 6. A fucosylated -GlcNAc substituent is denoted core-GlcNAc (Fuc) . A fucosylated GlcNAc-E (A) x substituent is denoted GlcNAc (Fuc) -E (A) x .

[0136] The term "site-specific conjugation" as used herein refers to conjugations by which a drug / an active substance is specifically linked to a specific position of an antibody through a linker.

[0137] The term "alkyl" as used herein refers to a fully saturated branched or unbranched hydrocarbon group. The alkyl preferably comprises 1-24 carbon atoms, more preferably 1-16 carbon atoms, 1-12 carbon atoms, 1-6 carbon atoms or 1-4 carbon atoms. Representative examples of alkyl include, but are not limited to, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, n-hexyl, 3-methylhexyl, 2, 2-dimethylpentyl, 2, 3-dimethylpentyl, n-heptyl, n-octyl, n-nonyl, n-decyl, etc.

[0138] The term "aryl" refers to a monocyclic or bicyclic aromatic hydrocarbon group having 6-20, e.g., 6-12 carbon atoms in the ring moiety. Preferably, aryl is (C6-C10) aryl. Non-limiting examples include phenyl, biphenyl, naphthyl or tetrahydronaphthyl, each of which may be optionally substituted with 1-4 substituents such as alkyl, trifluoromethyl, cycloalkyl, halogen, hydroxyl, alkoxy, acyl, alkyl-C (O) -O-, aryl-O-, heteroaryl-O-, amino, sulfhydryl, alkyl-S-, aryl-S-, nitro, cyano, carboxyl, alkyl-O-C (O) -, carbamoyl, alkyl-S (O) -, sulfonyl, sulfonylamino, heterocyclyl, etc., wherein R is independently hydrogen, alkyl, aryl, heteroaryl, aryl-alkyl-, heteroaryl-alkyl-, etc.

[0139] The term "cycloalkyl" is a cyclic alkyl group, that is, a monovalent, saturated or unsaturated hydrocarbon group having a cyclic structure. Cycloalkyl includes all saturated or partially saturated (containing 1 or 2 double bonds) hydrocarbon groups having a cyclic structure. Cycloalkyl group may comprise 3 or more carbon atoms in the ring, e.g., 3-18, 3-10, or 3-8 carbon atoms, and typically 3 to 6 atoms according to the present invention. Examples of cycloalkyl group include, but are not limited to, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl.

[0140] As used herein, the term "heteroaryl" refers to a 5-20 membered (e.g. 5-14, 5-8, 5-6 membered) monocyclic-or bicyclic-or fused polycyclic ring systems containing 1-8 heteroatoms selected from N, O or S. Preferably, heteroaryl is a 5-10 membered ring system. Representative heteroaryl groups include 2-or 3-thienyl, 2-or 3-furyl, 2-or 3-pyrrolyl, 2-, 4-or 5-imidazolyl, 3-, 4-or 5-pyrazolyl, 2-, 4-or 5-thiazolyl, 3-, 4-or 5-isothiazolyl, 2-, 4-or 5-oxazolyl, 3-, 4-or 5-isoxazolyl, 3-1, 2, 4-triazolyl or 5-1, 2, 4-triazolyl, 4-1, 2, 3-triazolyl or 5-1, 2, 3-triazolyl, tetrazolyl, 2-, 3-or 4-pyridyl, 3-or 4-pyridazinyl, 3-, 4-or 5-pyrazinyl, 2-pyrazinyl, 2-, 4-or 5-pyrimidinyl.

[0141] The term "pharmaceutically acceptable salt" represents a salt that retains the biological effects and properties of the ADC conjugate of the present invention, and is not biologically or otherwise undesired. The ADC conjugates of the present invention may exist in the form of their pharmaceutically acceptable salts, including acid addition salts and base addition salts. In the present invention, a pharmaceutically acceptable non-toxic acid addition salt represents a salt formed by the ADC conjugate of the present invention and an organic or inorganic acid, including but not limited to hydrochloric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydriodic acid, phosphoric acid, nitric acid, perchloric acid, acetic acid, oxalic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, benzenesulfonic acid, methanesulfonic acid, salicylic acid, succinic acid, citric acid, lactic acid, propionic acid, benzoic acid, p-toluenesulfonic acid, malic acid, etc. The pharmaceutically acceptable non-toxic base addition salt represents a salt formed by the ADC conjugate of the present invention and an organic or inorganic base, including but not limited to an alkali metal salt, such as a lithium, a sodium or a potassium salt; an alkaline earth metal salt, such as a calcium or a magnesium salt; a salt of an organic base, such as an ammonium salt formed with a N group-containing organic base.

[0142] The term "solvate" represents an association compound formed by one or more solvent molecules and the ADC conjugate of the present invention. Solvents for forming solvates include, but are not limited to, water, methanol, ethanol, isopropanol, ethyl acetate, tetrahydrofuran, N, N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide, and the like.

[0143] Unless contradicted by the context, "pharmaceutically acceptable" and "pharmaceutically usable" are  used interchangeably herein.

[0144] The term "drug-to-antibody ratio" or "DAR" refers to the ratio of small molecule drug moiety (D) conjugated to the Ab moiety as described herein to the Ab moiety. In some embodiments as described herein, for example DAR may be 1 to 20, such as 2-18, 4-16, 5-12, 6-10, 2-8, 3-8, 2-6, 4-6, 6-10, e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15. DAR can also be calculated as the average DAR of the molecule population in the product, i.e., the overall ratio of the small molecule drug moiety (D) conjugated to the Ab moiety as described herein to the Ab moiety in the product, as measured by detection methods (e.g., by conventional methods such as mass spectrometry, ELISA assay, electrophoresis and / or HPLC) , such DAR is referred to as the average DAR in the context. In some embodiments, the conjugates of the invention have an average DAR value of 1 to 20, such as for example 2-18, 4-16, 5-12, 6-10, 2-8, 3-8, 2-6, 4-6, 6-10, for example 1.0-8.0, 2.0-6.0, for example 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 or 10.0, ranges with two of these values as endpoints.

[0145] The term "therapeutic agent" as used herein encompasses any substance that is effective in the prevention or treatment of a tumor, such as a cancer, including chemotherapeutic agents, cytokines, angiogenesis inhibitors, cytotoxic agents, other antibodies, small molecule drugs or immunomodulators (e.g., immunosuppressants) .

[0146] The term "cytotoxic agent" used herein refers to a substance that inhibits or prevents cell function and / or causes cell death or destruction. In the context, it is also sometimes referred to as a "toxin" .

[0147] “Free drug” is an antitumor compound or cytotoxic agent in free form which is dissociated from ADC molecule of the present invention. In the context, free drug is sometimes referred to as a free toxin.

[0148] "Chemotherapeutic agent" includes chemical compound useful in the treatment of cancer or immune system diseases.

[0149] The term "small molecule drug" refers to organic compounds with low molecular weight and capable of modulating biological processes. "Small molecules" are defined as molecules having a molecular weight of less than 10 kD, typically less than 2 kD and preferably less than 1 kD. Small molecules include, but are not limited to, inorganic molecules, organic molecules, organic molecules containing inorganic components, molecules containing radioactive atoms, synthetic molecules, peptide mimetics, and antibody mimetics. As therapeutic agents, small molecules may be more permeable into cells, less susceptible to degradation and less likely to elicit an immune response compared with large molecules.

[0150] As used herein, the term "immunomodulator" refers to a natural or synthetic active agent or drug that suppresses or modulates an immune response. The immune response may be a humoral response or cellular response. Immunomodulators include immunosuppressants. In some embodiments, the immunomodulators of the invention include immune checkpoint inhibitors or immune checkpoint agonists.

[0151] The term "effective amount" refers to an amount or dose of the antibody-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt thereof, antibody or fragment or composition or combination of the present invention, which will produce expected effects in patients or subjectsin need of treatment or prevention after being administered to patients or subjects in a single dose or multiple doses.

[0152] "Therapeutically effective amount" refers to an amount that can effectively achieve desired therapeutic results at a required dose for a required period of time. The therapeutically effective amount is also such an amount, at which any toxic or harmful effect of the antibody-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt thereof, antibody or antibody fragment or composition or combination is inferior to the therapeutic beneficial effect. "Therapeutically effective amount" preferably inhibits a measurable parameter (e.g., tumor volume) by at least about 30%, or even more preferably by at least 40%, 45%, 50%, 55%, 60%,  65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or even 100%compared with untreated subjects.

[0153] "Prophylactically effective amount" refers to an amount that can effectively achieve desired prevention results at a required dose for a required period of time. Generally, since the prophylactic dose is administered before or at an earlier stage of the disease in a subject, the prophylactically effective amount will be less than the therapeutically effective amount.

[0154] The terms "host cell" , "host cell line" and "host cell culture" are used interchangeably and refer to cells into which exogenous nucleic acids are introduced, including the descendants of such cells. Host cells include "transformants" and "transformed cells" , which include primary transformed cells and descendants derived from them, regardless of the number of passages. The descendants may not be exactly the same as parent cells in term of nucleic acid conten, and may contain mutations. The mutant descendants with the same function or biological activity screened or selected from the initially transformed cells are included herein.

[0155] The term "label" as used herein refers to a compound or composition that is directly or indirectly conjugated or fused to an agent (such as a polynucleotide probe or antibody) and facilitates the detection of the agent to which it is conjugated or fused. The label itself can be detectable (for example, radioisotope label or fluorescent label) or can catalyze a chemical change of a detectable substrate compound or composition in the case of enzymatic labeling. The term is intended to cover direct labeling of a probe or an antibody by coupling (i.e., physically connecting) a detectable substance to the probe or antibody and indirect labeling of a probe or an antibody by reacting with another directly labeled reagent.

[0156] "Individual" or "subject" include mammals. Mammal include, but is not limited to, domestic animal (such as cattle, sheep, cat, dog and horse) , primate (such as human and non-human primate, e.g. monkey) , rabbit, and rodent (such as mouse and rat) . In some embodiments, the individual or subject is a human.

[0157] An "Isolated" antibody or other molecule (e.g., ADC molecule) is such an antibody or molecule that has been separated from components in their natural environment or the environment in which it is expressed. In some embodiments, the antibody or ADC molecule is purified to more than 95%or 99%purity, as measured by, such as by electrophoresis (e.g., SDS-PAGE, isoelectric focusing (IEF) , capillary electrophoresis) or chromatography (e.g., ion exchange or reverse phase HPLC) .

[0158] The term "anti-tumor effect" refers to biological effects that can be demonstrated by various means, including but not limited to, for example, reduction of tumor volume, reduction of tumor cell number, reduction of tumor cell proliferation or reduction of tumor cell survival.

[0159] The terms "tumor" and "cancer" are sometimes used interchangeably herein, covering solid tumors and blood tumors.

[0160] The terms "cancer" and "cancerous" refer to or describe physiological diseases in mammals characterized by unregulated cell growth. In some embodiments, cancer suitable for treatment by the antibody-drug conjugate of the present invention includes gastric cancer, pancreatic cancer, or gastroesophageal junction cancer, including metastatic forms of those cancers.

[0161] The term "tumor" refers to growth and proliferation of all neoplastic cells, whether malignant or benign, as well as all pre-cancerous and cancerous cells and tissues. The terms "cancer" , "cancerous" and "tumor" are not mutually exclusive when mentioned herein.

[0162] The term "pharmaceutical auxiliary material" refers to diluents, adjuvants (e.g., Freund's adjuvants (complete and incomplete) ) , excipients, carriers, stabilizers, or the like, see Handbook of Pharmaceutical Excipients, 8th Ed, R. C. Rowe, P. J. Seskey and S. C. Owen, Pharmaceutical Press, London, Chicago.

[0163] The term "pharmaceutical composition" refers to a composition that exists in a form allowing effective biological activity of the active ingredient contained therein, and does not contain additional ingredients having unacceptable toxicity to a subject to which the composition is administered.

[0164] The term "pharmaceutical combination" refers to a non-fixed combination product or a fixed combination product, including but not limited to a kit and a pharmaceutical composition. The term "unfixed  combination" means that the active ingredients (e.g., (i) the ADC molecule in pharmaceutical formulation of the present invention, and (ii) other therapeutic agent (s) ) are administered, either simultaneously or sequentially (without specific time limits or at the same or different time intervals) , to a patient as separate entities, wherein such administration provides prophylactically or therapeutically effective level of two or more active agents in the patient. In some embodiments, the ADC molecule of the present invention and the other therapeutic agent (s) used in the pharmaceutical combination are administered at levels not exceeding the respective levels when they are used alone. The term "fixed combination" means that two or more active agents are administered simultaneously to patients in the form of a single entity. It is preferred to select the dose and / or time interval of two or more active agents, so that the combined use of the components can produce greater effect than the single use of any one component alone in the treatment of disease or disorder. Each agent can be in the form of separate formulation, the formulation forms can be the same or different.

[0165] The term "combination therapy" refers to the administration of two or more therapeutic agents or therapeutic modes (such as radiotherapy or surgery) to treat the diseases as described herein. Such administration includes co-administration of these therapeutic agents in a substantially simultaneous manner, such as in a single capsule with a fixed proportion of active ingredients. Alternatively, such administration includes co-administration of each active ingredient in multiple or separate containers (such as tablets, capsules, powders and liquids) . The powder and / or liquid can be reconstituted or diluted to a required dose before administration. In addition, such administration also includes the use of each type of therapeutic agent at approximately the same time or at different times in a sequential manner. In either case, the treatment regimen will provide a beneficial effect of pharmaceutical combination in treating the condition or disorder described herein.

[0166] As used herein, "treatment" (or "treat" or "treating" ) refers to slowing, interrupting, arresting, alleviating, stopping, reducing, or reversing the progression or severity of an existing symptom, condition, state, or disease.

[0167] As used herein, "prevention" (or "prevent" or "preventing" or “prophylactic” ) includes the inhibition of the onset or development of a disease or disorder or a symptom of a particular disease or disorder. In some embodiments, subjects with family history of cancer are candidates for prophylactic regimens. Generally, in the context of cancer, the term "prevention" (or “prophylactic” ) refers to an administration of a drug prior to the onset of signs or symptoms of a cancer, particularly in subjects at risk of cancer.

[0168] The term "vector" as used herein refers to a nucleic acid molecule capable of proliferating another nucleic acid to which it is linked. The term includes vectors that serve as self-replicating nucleic acid structures as well as vectors binding to the genome of a host cell into which they have been introduced. Some vectors are capable of directing the expression of a nucleic acid to which they are operably linked. Such vectors are called "expression vectors" herein.

[0169] "Subject / patient / individual sample" refers to a collection of cells or fluids obtained from a patient or subject. The source of the tissue or cell samples may be solid tissues, e.g., from fresh, frozen and / or preserved organ or tissue samples or biopsy samples or puncture samples; blood or any blood component; body fluids such as cerebrospinal fluids, amniotic fluids, peritoneal fluids, or interstitial fluids; cells from a subject at any time during pregnancy or development. Tissue samples may comprise compounds which are naturally not mixed with tissues, such as preservatives, anticoagulants, buffers, fixatives, nutrients, antibiotics, and the like.

[0170] The term “lyophilized formulation” refers to a composition obtained by a lyophilization process of a liquid formulation. Preferably, it is a solid composition having a water content of less than 5%, preferably less than 3%.

[0171] The term "buffer" refers to a pH buffer that can keep the pH of a solution stable. Preferably, the buffer can keep pH of the liquid formulation of the present invention or the liquid formulation obtained by reconstituting the lyophilized formulation of the present invention at about 5.5 to 7.5, for example about 6.0-6.5, about 5.5-7.2, about 6.0-7.0, or about 6.3-6.8. Preferably, the buffer is selected from one or more of histidine, citric acid, succinic acid, glutamic acid, phosphoric acid, acetic acid or a salt thereof. Wherein, the salt includes, but is not limited to a salt formed with acid, such as hydrochloride or sulfuric acid, a salt formed with alkali metal, such as lithium, sodium or potassium salt, for example histidine hydrochloride.

[0172] The term “stabilizer” refers to a chemical substance that can keep stability of a formulation in terms of chemical, physical and / or biological aspects. Preferably, the stabilizer is selected from one or more of carbohydrates, polyols. The carbohydrates can select from, but are not limited to: sucrose, trehalose, glucose, lactose, maltose, cyclodextrin, maltodextrin and dextran. The polyols can select from, but are not limited to: mannitol, sorbitol and xylitol. The carbohydrate or polyol may be in the form of hydrate.

[0173] The term "surfactant" refers to a substance that can significantly reduce the surface tension of a solution system. The concentration of the surfactant in the liquid formulation is, for example, about 0.01 mg / mL to 5 mg / mL, for example 0.01-2, about 0.05-1, about 0.05-2, about 0.1-0.5, about 0.1-0.4, about 0.1-0.3, about 0.2-0.4 mg / ml. Preferably, the surfactant is a nonionic surfactant, includes but is not limited to alkyl poly (ethylene oxide) ; polysorbates, such as polysorbate-20, polysorbate-80, polysorbate-60, or polysorbate-40; pluronics; or a combination thereof, and the like.

[0174] The term “reconstituted” formulation means the liquid formulation obtained by dissolving and / or suspending a solid formulation (e.g., a lyophilized formulation) in a physiologically acceptable solution. Herein, in some cases, “reconstituted” and “redissolved” and the like are used interchangeably in term of the formulation.

[0175] As used herein, "w / v" refers to "weight / volume" , for example, "1%w / v" means 1 g / 100 mL = 0.01 g / mL = 10 mg / mL.

[0176] II. Embodiments

[0177] In an aspect, the present invention provides a pharmaceutical formulation comprising (i) an antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof; (ii) abuffer, (iii) a stabilizer, and / or (iv) a surfactant, wherein the pH of the formulation is about 5.5-7.5, preferably about 6.0-6.5, more preferably about 6.5.

[0178] In an embodiment, the antibody-drug conjugate targeting Claudin 18.2 is represented by formula I:

[0179] wherein

[0180] L1 is a linker;

[0181] E is carbohydrate or carbohydrate derivative, preferably selected from galactose (Gal) , mannose (Man) , N-acetylglucosamine (GlcNAc) , glucose (Glc) , N-acetylgalactosamine (GalNAc) , glucuronic acid (Gcu) , fucose (Fuc) and N-acetylneuraminic acid (sialic acid) ;

[0182] and GlcNAc is N-acetylglucosamine, Fuc is fucose;

[0183] D is an antitumor drug, preferably Exatecan, DXd, MMAE or DM1;

[0184] r is 1-5, for example 1, 2, 3, 4 or 5, preferably 1 or 2;

[0185] b is 0 or 1;

[0186] wherein x is 1 or 2; and

[0187] y is 1 to 10; for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8;

[0188] preferably x is 1, y is 2.

[0189] In some embodiments, E is GalNAc.

[0190] In some embodiments, E is 6-deoxy-2-acetamidogalactose, which is linked to L1 via the C atom at position 6.

[0191] In some embodiments, the GlcNAc linked to the Ab is present at Asn297-glycosylation site of two heavy chains of the antibody.

[0192] In some embodiments, L1 has the following structure

[0193] Q is -N (H) C (O) CH2-or -CH2-;

[0194] R1 is independently selected from hydrogen, halogen, -OR2, -NO2, -CN, -S (O) 2R2, C1-C12 alkyl, aryl, heteroaryl, C1-C12 alkylaryl, C1-C12 alkylheteroaryl, aryl C1-C12 alkyl and heteroarylC1-C12 alkyl, and wherein the alkyl, aryl, heteroaryl, alkylaryl, alkylheteroaryl, arylalkyl and heteroarylalkyl are optionally substituted, wherein two substituents R1 may be linked together to form a fused, bridged or spiro cycloalkyl or fused or spiro aromatic or heteroaromatic substituent, and wherein R2 is independently selected from hydrogen, halogen, C1-C24 alkyl, aryl, heteroaryl, C1-C12 alkylaryl, C1-C12 alkylheteroaryl, arylC1-C12 alkyl and heteroaryl C1-C12 alkyl;

[0195] R3 and R4 are each independently selected from hydrogen, halogen, C1-C24 alkyl, aryl, heteroaryl, C1-C12 alkylaryl, C1-C12 alkylheteroaryl, aryl C1-C12 alkyl and heteroaryl C1-C12 alkyl;

[0196] c is 0, 1, 2, 3 or 4;

[0197] m is 0 or 1;

[0198] n is 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10;

[0199] Y is O, S or NR1;

[0200] L2 and L3 are each independently C1-C12 alkyl, and one or more carbon atoms (e.g., 1, 2, 3, or 4) in said alkyl are independently replaced by heteroatoms selected from O, N and S, with the proviso that the O, N and / or S are not directly connected to each other;

[0201] each L4 are independently cleavable linker.

[0202] In some embodiments, each L4 is independently

[0203] wherein R5 and R6 are each independently selected from hydrogrn and C1-C12 alkyl; and

[0204] Ar is selected from aryl, preferably is phenyl.

[0205] In some embodiments, each L4 is independently

[0206] In some embodiments, -L1-has the following structure

[0207] In some embodiments, the antibody-drug conjugate targeting claudin18.2 has an average DAR of 1-15, for example 2-10, 2-8 or 3-5.

[0208] In some embodiments, the antibody-drug conjugate targeting claudin18.2 is selected from:

[0209] wherein Ab is an antibody or an antigen-binding fragment thereof targeting Claudin18.2,

[0210] wherein q represents an average DAR,

[0211] In IEX019-02, IEX019-04, IEX019-05, q is 2-5, for example 3-5 or 3.5-4.5, in IEX019-03, q is 5-11, for example 7-9 or 7.5-8.5.

[0212] In some embodiments, the heavy chain constant region HC of the present invention is a heavy chain constant region of IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, preferably the heavy chain constant region of IgG1, for example the heavy chain constant region of wildtype IgG1. In some embodiments, the antidody light chain constant region LC of the present invention is the lambda or Kappa light chain constant region.

[0213] In some specific embodiments of the present invention, the Claudin18.2 antibody of the present invention comprises a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3 respectively consisting of amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 1, 2 and 3, and / or a LCDR1, a LCDR2 and a LCDR3 respectively consisting of amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 6, 7 and 8.

[0214] In some embodiments of the present invention, the Claudin18.2 antibody of the present invention comprises a VH and / or a VL, wherein the VH consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and the VL consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9.

[0215] In some embodiments of the present invention, the Claudin18.2 antibody of the present invention comprises a heavy chain and / or a light chain, wherein the heavy chain consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11, and the light chain consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12.

[0216] In an embodiment of the present invention, the amino acid alteration described herein includes amino acid replacement, insertion or deletion. Preferably, the amino acid alteration described herein is an amino acid replacement, preferably a conservative replacement. In a preferred embodiment, the amino acid alteration described herein occurs in a region outside the CDR (e.g., in FR) . More preferably, the amino acid alteration described herein occurs in a region outside the heavy chain variable region and / or outside the light chain  variable region. In some embodiments, the amino acid alteration described herein occurs in a Fc region of an antibody heavy chain constant region.

[0217] In some embodiments, the replacement is a conservative replacement. A conservative replacement refers to the replacement of an amino acid by another amino acid of the same class, e.g., the replacement of an acidic amino acid by another acidic amino acid, the replacement of a basic amino acid by another basic amino acid, or the replacement of a neutral amino acid by another neutral amino acid. In certain embodiments, the replacement occurs in the CDRs of the antibody. Generally, an obtained variant has modifications (e.g., improvements) in certain biological properties (e.g., increased affinity) relative to the parent antibody, and / or will substantially retain certain biological properties of the parent antibody. Exemplary replacement variants are affinity mature antibodies.

[0218] The Claudin18.2 antibody of the present invention may be an antibody with modified glycosylation. In some embodiments, the antibody is obtained after the enzymatic modification on the saccharide chain (s) in vitro (e.g., modifying the saccharide chain (s) by glycosidases (e.g., endoglycosidase or glycosyltransferases) ) . In some embodiments, the antibody with modified glycosylation refers to an antibody in which the saccharide chain (s) at the glycosylation site of the antibody is modified from a heterogeneous structural N the saccharide chain (s) to a single structural N the saccharide chain (s) with a reactive group (e.g., any reactive group that can react with the linker moiety, such as an azide group, a ketone group, and an alkyne group) . In a preferred embodiment, the N-glycosylation site is a conserved N-glycosylation site on the Fc domain of an antibody, such as Asn297.

[0219] Methods of modifying antibody glycosylation applicable to the present invention, for example, see PCT / NL2013 / 050744, PCT / EP2016 / 059194 or PCT / EP2017 / 052792, and the patent applications are incorporated herein in their entirety.

[0220] In a preferred embodiment, the GlcNAc-E (A) x substituents exist at the Asn297-glycosylation sites of the two heavy chains of the antibody.

[0221] In some embodiments, L in formula (I) of the present invention is a linker. Any linker known in the art may be used to link with the anti-human CLDN18.2 of the present invention, and preferably, the linker can achieve the site-specific conjugation of the ADC.

[0222] In some embodiments, the linker applicable to the present invention may be any linker capable of conjugating an antibody to a drug. In some embodiments, the linker can be a linker used in techniques that can achieve site-specific conjugation.

[0223] In a preferred embodiment, the linker of the present invention is a linker linked with an antibody oligosaccharide. The term "linker linked with an antibody oligosaccharide" as defined herein is any linker that conjugates an antibody to a drug by linking with a reactive group on the saccharide chain (s) at the glycosylation site of the antibody. The saccharide chain (s) on the glycosylation sites of antibodies are generally saccharide chain (s) , and are generally modified to transform the heterogeneous structure N saccharide chain (s) into a single structural N saccharide chain (s) with reactive groups. The reactive group carried by the saccharide chain (s) is further linked to the "linker" to achieve the site-specific conjugation of the drug and the antibody, and thus the antibody-drug conjugate is obtained.

[0224] In an embodiment, "linker linked with an antibody oligosaccharide" of the present invention, in particular refers to any linker that can achieve the site-specific conjugation with the reactive group on the N-glycosylation site at the conserved N-glycosylation site (e.g., Asn297) on the Fc domain of an antibody, for example the linker of PCT / NL2013 / 050744 or PCT / EP2021 / 075401, and the patent applications are incorporated herein in their entirety.

[0225] In an embodiment, the reactive group of the present invention is an azide group, a ketone group, or an alkyne group. In an embodiment, the linker of the present invention is a linker containing an alkyne group. In an embodiment, the reactive group of the present invention is an azide group, a ketone group or an alkyne group, preferably an azide group, and the linker of the present invention is a linker containing an alkyne group. When such type of linker is mentioned in the present invention, since the reactive group reacts with a group of linker to form a new group, the group formed after the reaction of the reactive group  in the antibody-drug conjugate can also be defined as a part of the "linker" , for example, as shown in formula (I) of the present invention.

[0226] Linkers suitable for use in the present invention also include, e.g., cathepsin-degradable linkers, such as Val-Cit linkers (e.g., vc-PAB) , cBu-Cit linkers, and CX linkers; non-cleavable linkers, such as an SMCC linker or an MD linker; acid-sensitive linkers, silyl ether linkers, disulfide-carbamate linkers, MC-GGFG linker, TRX linker, galactoside-containing linkers, pyrophosphate linkers, near infrared-sensitive linkers, UV-sensitive linkers such as PC4AP (Antibody-drug conjugates: Recent advances in linker chemistry, Su, Z., Xiao, D., Xie, F., Liu, L., Wang, Y., Fan, S., Li, S. (2021) . Antibody-drug conjugates: Recent advances in linker chemistry. Acta Pharmaceutica Sinica B) . Linkers suitable for use in the present invention may also be a combination of one or more linkers. For example, a cathepsin-degradable linker may be combined with other type of linker (s) to form a new linker. Thus, the “linker” described herein encompasses a single type of linker or a combination of different types of linkers, as long as it enables conjugation of the antibody of the present invention to a drug. Thus, in one embodiment, the linker suitable for use in the present invention is MC-VC-PAB, vc-PAB, SMCC, or MC-GGFG.

[0227] D in the formula (I) of the present invention may be any anti-tumor compound and is not particularly limited as long as it is a compound that has an anti-tumor effect and has a substituent or partial structure capable of being linked to a linker structure. For example, the anti-tumor compound may be a pharmaceutically active compound that acts on a tumor. For an anti-tumor compound, it is preferable that a part or all of the linker may be cleaved in tumor cells to release the anti-tumor compound, thereby exhibiting an anti-tumor effect. When the linker is cleaved where it is linked to the drug, the anti-tumor compound is released in an unmodified structure and exhibits its original anti-tumor effect.

[0228] In some embodiments, the anti-tumor compound may be, e.g., a cytotoxic agent or a chemotherapeutic agent, such as camptothecins exatecan (atopoisomerase I inhibitor, exatecan) and Dxd (a novel topoisomerase I inhibitor exatecan derivative) , auristatins such as monomethyl auristatin E (MMAE) , or maytansinoids such as small molecule microtubule inhibitor DM1. The structures in the examples of the present application show the structures of representative compounds of these anti-tumor compounds.

[0229] In some embodiments, the buffer is selected from one or more of histidine, citric acid, succinic acid, glutamic acid, phosphoric acid, acetic acid or a salt thereof. Wherein, a salt of amino acid (histidine, glutamic acid) includes, but is not limited to a salt formed by the amino acid and hydrochloric acid or sulfuric acid. The salt of phosphoric acid, acetic acid, succinic acid, citric acid includes, but is not limited to, an alkali metal salt of the corresponding acid, such as lithium, sodium, or potassium salt. Preferably, the histidine salt is histidine hydrochloride. Preferably, the buffer is selected from a combination of histidine and histidine hydrochloride, and histidine.

[0230] In some embodiments, the stabilizer is selected from one or more of carbohydrates, polyols, preferably, the carbohydrate is selected from, but is not limited to: sucrose, trehalose, glucose, lactose, maltose, cyclodextrin, maltodextrin and dextran, the polyol is selected from, but is not limited to: mannitol, sorbitol and xylitol. The carbohydrate or polyol may be in the form of hydrate.

[0231] In some embodiments, the stabilizer is selected from sucrose, trehalose, mannitol or a combination thereof. In some embodiments, the stabilizer is sucrose or trehalose. In some embodiments, the stabilizer is a combination of sucrose and mannitol.

[0232] In some embodiments,

[0233] the buffer is a combination of histidine and histidine hydrochloride or is histidine;

[0234] the stabilizer ia sucrose; trehalose; or a combination of sucrose and mannitol; and / or

[0235] the surfactant is polysorbate 80.

[0236] In some embodiments, the concentration of the antibody-drug conjugate targeting claudin18.2, or a pharmaceutically acceptable salt, or a solvate thereof in the pharmaceutical formulation is about 1-200 mg / ml, for example about 5-100 mg / ml, about 10-80 mg / ml, about 15-60 mg / ml, about 20-50 mg / ml, about 20-40 mg / ml, for example about 5, about 10, about 15, about 20, about 25, about 30, about 40, about 50, about 60, about 70, about 80, about 90, about 100, about 110, about 120, about 130, about 140, about 150, about 160, about 170, about 180, about 190 or about 200 mg / ml, preferably about 15-60 mg / ml, more preferably about 20-40 mg / mL.

[0237] In some embodiments, the concentration of the buffer in the pharmaceutical formulation is about 1-100 mM, about 5-50 mM, about 5-30 mM, about 5-20mM or about 10-30 mM, for example about 5, about 10, about 15, about 20, about 25, about 30, about 40, about 50, about 60, about 70, about 80, about 90 or about 100mM, preferably about 5-50 mM, more preferably about 10-30 mM.

[0238] In some embodiments, the concentration of the stabilizer in the pharmaceutical formulation is about 10-200 mg / ml, about 20-180 mg / ml, about 30-160 mg / ml, about 40-150 mg / ml, about 50-130 mg / ml, about 50-100 mg / ml or about 60-90 mg / ml, for example, about 10, about 20, about 30, about 40, about 50, about 60, about 70, about 80, about 90, about 100, about 110, about 120, about 130, about 140, about 150, about 160, about 170, about 180, about 190 or about 200 mg / ml; preferably about 50-100 mg / ml, more preferably 60-90 mg / ml. When the stabilizers are more than one components, the concentrations of each components can be selected from the following ranges or values: about 30-160 mg / ml, about 40-150 mg / ml, about 50-130 mg / ml, about 50-100 mg / ml, about 60-90 mg / ml, about 30-50 mg / ml or about 10-30 mg / ml, for example, about 10, about 20, about 30, about 40, about 50, about 60, about 70, about 80, about 90 or about 100 mg / ml.

[0239] In some embodiments, the concentration of the surfactant in the pharmaceutical formulation is about 0.01-5 mg / ml, for example 0.01-2, about 0.05-1, about 0.05-2, about 0.1-0.5, about 0.1-0.4, about 0.1-0.3, about 0.2-0.4 mg / ml, for example about 0.2, about 0.3, about 0.4, about 0.5, about 0.6, about 0.7 or about 0.8 mg / ml, preferably about 0.05-1 mg / ml, more preferably about 0.1-0.3 mg / ml.

[0240] In some embodiments, the pH of the pharmaceutical formulation is about 5.5-7.5, for example about 6.0-6.5, for example about 5.6, about 5.7, about 5.8, about 5.9, about 6.0, about 6.1, about 6.2, about 6.3, about 6.4, about 6.5, about 6.6, about 6.7, about 6.8, about 6.9, about 7.0, about 7.1 or about 7.2, more preferably about 6.0-6.5.

[0241] In some embodiments, the pharmaceutical formulation comprises:

[0242] (i) about 20-40 mg / ml of the antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 or the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof;

[0243] (ii) about 20 mM of the buffer;

[0244] (iii) about 60-90 mg / ml of the stabilizer; and

[0245] (iv) about 0.1-0.3 mg / ml of the surfactant.

[0246] In some embodiments, wherein the pharmaceutical formulation comprises:

[0247] (i) about 20-40 mg / ml of the antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 or the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof;

[0248] (ii) about 20 mM of the buffer, the buffer is a combination of histidine and histidine hydrochloride, or is histidine;

[0249] (iii) about 60-90 mg / ml of the stabilizer, the stabilizer is sucrose; trehalose; or a combination of sucrose and mannitol; and

[0250] (iv) about 0.1-0.3 mg / ml of polysorbate 80;

[0251] wherein the pH of the pharmaceutical formulation is about 6.0-6.5, preferably about 6.5.

[0252] In some embodiments, wherein the pharmaceutical formulation comprises:

[0253] (i) about 20mg / ml of the antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 or the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof;

[0254] (ii) about 20 mM of the buffer; the buffer is a combination of histidine and histidine hydrochloride, or is histidine;

[0255] (iii) about 8% (w / v) of the stabilizer; the stabilizer is sucrose; trehalose; or a combination of sucrose and mannitol; and

[0256] (iv) about 0.02% (w / v) polysorbate 80;

[0257] wherein the pH of the pharmaceutical formulation is about 6.5.

[0258] In some embodiments, the pharmaceutical formulation is liquid pharmaceutical formulation.

[0259] In another aspect, the present invention provides a lyophilized pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate, the lyophilized pharmaceutical formulation forms or may provide the pharmaceutical formulation as described above after reconstitution.

[0260] In some embodiments, the lyophilized pharmaceutical formulation is prepared by lyophilizing the pharmaceutical formulation as described above.

[0261] In some embodiments, upon reconstituting the lyophilized formulation with a vehicle, a liquid formulation with a pH of about 5.5-7.5, preferably6.0-6.5, for example about 6.0, about 6.1, about 6.2, about 6.3, about 6.4, about 6.5 is provided.

[0262] In another aspect, the present invention provides a lyophilized pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate, which comprises

[0263] (i) about 1%-60% (w / w) , preferably about 15%-40% (w / w) , for example 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%or 55% (w / w) of an antibody-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or a solvate thereof;

[0264] (ii) about 0.5%-10% (w / w) , preferably about 2%-5% (w / w) , for example 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 6%, 7%, 8%or 9% (w / w) of a buffer;

[0265] (iii) about 20%-90% (w / w) , preferably about 50%-85% (w / w) , for example 25%, 30%, 35%, 40%, 45%,  50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%or 80% (w / w) of a stabilizer; and / or

[0266] (iv) about 0.05%-2% (w / w) , preferably about 0.1%-0.5% (w / w) , for example 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.2%or 1.5% (w / w) of a surfactant;

[0267] wherein the antibody-drug conjugate, the buffer, the stabilizer and / or the surfactant are as defined herein.

[0268] It should be understood that a range formed by two specific numerical values listed herein as endpoints or a range formed by a specific numerical value and an endpoint of a range as new endpoints is contemplated by the present invention as if they are specifically disclosed herein.

[0269] In some embodiments, the lyophilized formulation of the present invention is the formulation disclosed in Example 3. In addition, based on the formulation disclosed in Example 3, embodiments obtained by fluctuating the concentration value of each ingredient in these formulations up and down by 50%, 40%, 30%, 20%, 10%or 5%, and by fluctuating the pH up and down by 5%, 4%, 3%, 2%, 1%or 0.5%are also included in this application.

[0270] In another aspect, the present invention provides a liquid pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate, the liquid pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate is obtained after reconstituting the lyophilized pharmaceutical formulation as described above with a vehicle, the pH thereof is about 5.5-7.5, preferably about 6.0-6.5, preferably about 6.5.

[0271] In some embodiments, the liquid pharmaceutical formulation is preferably used for injection or infusion administration, for example for intravenous injection, subcutaneous injection or intramuscular injection.

[0272] In another aspect, the present invention provides a delivery device comprising the pharmaceutical formulation, the lyophilized pharmaceutical formulation or the liquid pharmaceutical formulation of the present invention.

[0273] In another aspect, the present invention provides a use of the formulation of the present invention (the pharmaceutical formulation, the lyophilized pharmaceutical formulation or the liquid pharmaceutical formulation as described above) in preparing a medicament, preferably, the medicament is used for preventing or treating tumor;

[0274] more preferably, the tumor is cancer, for example epithelial cancer or digestive tract cancer, for example gastric cancer or gastroesophageal junction cancer or pancreatic cancer or colorectal cancer or colon cancer.

[0275] It should be understood, unless specifically stated, when the formulation of the present invention is liquid, it further comprises a vehicle, especially an injectable vehicle, including but not limited to, for example, purified water such as ultra-pure water, water for injection, sterile water, double distilled water, etc. The vehicle capable of reconstituting the lyophilized formulation of the present invention includes, but is not limited to, for example, purified water such as ultra-pure water, water for injection, sterile water, double distilled water, normal saline, Ringer's solution, glucose injection, etc.

[0276] In some embodiments, the present invention provides a pre-filled syringe comprising the pharmaceutical formulation, the lyophilized pharmaceutical formulation or the liquid pharmaceutical formulation of the present invention as described above, for used in intravenous injection, subcutaneous injection or intramuscular injection.

[0277] In another aspect, the present invention provides a method for preparing the pharmaceutical formulation accroding to the present invention, which comprises the following steps:

[0278] i. providing an isolated and purified antibody-drug conjugate of the present invention or the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, and optionally adding it into an ultrafiltration centrifuge tube for centrifugation and concentration;

[0279] ii. formulating a solution, preferably an aqueous solution of the buffer, the stabilizer, preferably, the species and the concentrations of the buffer and the stabilizer, the pH of the solution are as defined in the pharmaceutical formulation as described above.

[0280] iii. ultrafiltrating and replacing the antibody-drug conjugate of step i into the solution of step ii;

[0281] iv. adjusting the concentration of the antibody-drug conjugate or the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof after replacement to the concentration of pharmaceutical formulation as described above;

[0282] v. adding the surfactant or the solution thereof, preferably the aqueous solution thereof, to bring the final concentration of the surfactant to the concentration defined in the pharmaceutical formulation as described above; and

[0283] vi. optionally sterile filtering the solution of step v.

[0284] In another aspect, the present invention further provides a method for preparing the lyophilized pharmaceutical formulation of the present invention, in addition to the above steps i-v and optional step vi, the method further comprises the following steps:

[0285] vii. lyophilizing the solution of step v or vi to obtain the lyophilized pharmaceutical formulation.

[0286] In another aspect, the present invention further provides a pharmaceutical combination or a pharmaceutical combination product,

[0287] the pharmaceutical combination comprises the pharmaceutical formulation, the lyophilized pharmaceutical formulation, or the liquid pharmaceutical formulation of the present invention, as well as one or more other therapeutic agents (e.g., therapeutic agents, include chemotherapeutic agents, angiogenesis inhibitors, cytokines, cytotoxic agents, other antibodies, small molecule drugs or immunomodulators (e.g., immune checkpoint inhibitors or agonists) etc. ) .

[0288] In another aspect, the present invention provides a kit of parts comprising the pharmaceutical formulation, the lyophilized pharmaceutical formulation, or the liquid pharmaceutical formulation of the present invention, the pharmaceutical combination of the present invention, preferably the kit is in the form of a drug dosage unit. Dosage units may thus be provided in accordance with dosing regimens or drug administration intervals.

[0289] In an embodiment, the kit of parts of the present invention comprises the followings in the same package:

[0290] -the first container comprising the formulation of the present invention;

[0291] -the second container comprising a pharmaceutical composition comprising other therapeutic agent (s) .

[0292] In another aspect, the present invention provides a method for preventing or treating tumor (e.g., cancer) in a subject, which comprises administrating an effective amount of the formulation, pharmaceutical combination or the kit of the present invention to a subject.

[0293] In some embodiments, the patient with tumor (e.g., cancer) has (e.g., increased level, e.g. neuclic acid or protein level of) CLDN18.2. In some embodiments, the tumor cells of patient express CLDN18.2, for example moderately express CLDN18.2, preferably highly express CLDN18.2.

[0294] In some embodiments, the tumor, for example cancer includes solid tumor and blood tumor and metastasis lension. In an embodiment, examples of solid tumor include malignant tumors. The cancer may be early, intermediate, or advanced or metastatic.

[0295] In a specific embodiment, the formulation of the present invention is capable of killing tumor cells, and / or inhibiting the proliferation of tumor cells, for example tumor cells expressing CLDN18.2, for example digestive tract tumor cells, for example gastric cancer cells or pancreatic cancer cells or colon cancer cells or colorectal cancer cells.

[0296] In some embodiments, CLDN18.2 is expressed or overexpressed on the cells surface; in some embodiments, the target cells are CHO cells or 293 cells (for example CHO-Scells or HEK293 cells) expressing CLDN18.2; in some embodiments, the target cells are cancer cells expressing CLDN18.2, for example cells that naturally express CLDN18.2 or express CLDN18.2 after artificial transfection or have an increased level of CLDN18.2 expression after artificial transfection, for example gastric cancer cells or pancreatic cancer cell line or colon cancer or colorectal cancer cell line that express CLDN18.2. In some embodiments, the target cells are cell lines with moderate expression level of hCLDN18.2, for example NUGC-4, SNU620. In some embodiments, the target cells are cell lines with high expression level of hCLDN18.2, for example the DAN-G cells overexpressing hCLDN18.2.

[0297] In some embodiments, the tumor is tumor immune escape.

[0298] In some embodiments, the tumor is cancer, for example epithelial tumor, such as digestive tract tumor, such as epithelial cancer or digestive tract cancer, such as gastric cancer or gastroesophageal junction cancer or pancreatic cancer or colorectal cancer or colon cancer.

[0299] The subjects may be mammals, for example, primates, preferably, advanced primates, for example, human (e.g., individuals who suffer from or are at risk of developing the disease described herein) . In an embodiment, the subjects suffer from the disease described herein (e.g., cancer) or are at risk of developing the disease described herein. In certain embodiments, the subject is receiving or has received other treatments, such as chemotherapy and / or radiation therapy. In some embodiments, the subjects have previously received or are currently receiving immunotherapy.

[0300] In another aspect, the present invention provides a use of the formulation, the pharmaceutical combination or the kit of the present invention in the manufacture of or in the production of a medicament for the use as described herein, for example for preventing or treating the related diseases or disorders as mentioned herein.

[0301] In some embodiments, the formulation, the pharmaceutical combination or the kit of the present invention may delay the onset of the disorders and / or symptoms associated with the disorders.

[0302] In some embodiments, the formulation of the present invention can also be administrated in combination with one or more other therapies, for example therapeutic modes and / or other therapeutic agents, for the use as described herein, for example for preventing and / or treating the related diseases or disorders as mentioned herein.

[0303] In some embodiments, the therapeutic mode includes surgery, radiotherapy, local irradiation or focused irradiation, etc.

[0304] In some embodiments, therapeutic agents are selected from chemotherapeutic agents, angiogenesis inhibitors, cytokines, cytotoxic agents, other antibodies, small molecule drugs or immunomodulators (e.g., immune checkpoint inhibitors or agonists) .

[0305] Other exemplary antibodies include antibodies that specifically bind to immune checkpoints.

[0306] The combination therapy of the present invention covers combination administration (for example, two or more therapeutic agents are included in the same or separate formulations) , and separate administration. In  the latter case, the administration of the pharmaceutical formulation of the present invention can occur before, at the same time, and / or after the administration of other therapeutic agents and / or drugs.

[0307] The composition can also be administered topically via an implanted membrane, sponge, or another suitable material that absorbs or encapsulates the desired molecules. In certain embodiments, when an implanted device is used, the device can be implanted into any suitable tissue or organ, and the desired molecules can be delivered via diffusion, time-released bolus, or continuous administration.

[0308] In another aspect, the present invention provides the formulation of the present invention as described above, for use in treatment and / or as a medicament, for example, for the use as described herein, for example, for preventing or treating the related diseases or disorders as mentioned herein.

[0309] These and other aspects and embodiments of the present invention are illustrated in the Figures (brief description of the Figures ) and in the following detailed description of the present invention and are exemplified in the following examples. Any or all of the features described above and throughout the present invention may be combined in various embodiments of the present invention. The following examples further illustrate the present invention. However, it should be understood that the examples are described by way of illustration rather than limitation, and various modifications may be made by those skilled in the art.Examples

[0310] Example 1.1 Synthesis of IEX019 ADC molecules

[0311] Anti-CLDN18.2 monoclonal antibody HB37A6 is prepared by reference to CN202010570517. X ( (corresponding to PCT / CN2021 / 100870) ) . On the basis of HB37A6, ADCs conjugated with different small molecule compounds were further designed and synthesized. The specific processes are as follows:

[0312] Example 1.1.1 preparation of IEX019-02

[0313] 1) . Preparation of compound 6

[0314] Under N2 atmosphere, chlorosulfonyl isocyanate (CSI) (0.87 mL, 1.4 g, 10 mmol) , Et3N (2.8 mL, 2.0 g, 20 mmol) and 2- (2-aminoethoxy) ethanol (1.2 mL, 1.26 g, 12 mmol) were added to a solution of BCN-OH (5, 1.5 g, 10 mmol) in DCM (150 mL) . The mixture was stirred for 10 minutes and quenched by adding NH4Cl aqueous solution (saturated, 150mL) . The aqueous layer was extracted with DCM (150mL) after separation. The combined organic layer was dried (Na2SO4) and concentrated. The residues were purified by column chromatography. The product 6 (2.06 g, 5.72 mmol, 57%) was obtained as light yellow thick oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 6.0 (bs, 1H) , 4.28 (d, J = 8.2 Hz, 2H) , 3.78–3.73 (m, 2H) , 3.66–3.61 (m, 2H) , 3.61–3.55 (m, 2H) , 3.34 (t, J = 4.9 Hz, 2H) , 2.37–2.15 (m, 6H) , 1.64–1.48 (m, 2H) , 1.40 (quintet, J = 8.7 Hz, 1H) , 1.05–0.92 (m, 2H) .

[0315] 2) Preparation of compound 7

[0316] CSI (11 μL, 18 mg, 0.13 mmol) was added to a stirred solution of 6 (47 mg, 0.13 mmol) in DCM (10 mL) . After 30 minutes, a solution of Et3N (91 μL, 66 mg, 0.65 mmol) and diethanolamine (16 mg, 0.16 mmol) in DMF (0.5 mL) was added. After 30 minutes, p-nitrophenyl chloroformate (52 mg, 0.26 mmol) and Et3N (54 μL, 39 mg, 0.39 mmol) were added. After additional 4.5 hours, the reaction mixture was concentrated. The residue was purified by gradient column chromatography (33 → 66%EtOAc / heptane (1%AcOH) ) to obtain 7 (88 mg, 0.098 mmol, 75%) , as colorless oil. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) 8.28–8.23 (m, 4H) , 7.42–7.35 (m, 4H) , 4.52 (t, J = 5.4 Hz, 4H) , 4.30 (d, J = 8.3 Hz, 2H) , 4.27–4.22 (m, 2H) , 3.86 (t, J = 5.3 Hz, 4H) , 3.69–3.65 (m, 2H) , 3.64–3.59 (m, 2H) , 3.30–3.22 (m, 2H) , 2.34–2.14 (m, 6H) , 1.62–1.46 (m, 2H) , 1.38 (quintet, J = 8.7 Hz, 1H) , 1.04–0.92 (m, 2H) .

[0317] 3) Preparation of compound 9

[0318] Compound 8 (163 mg, 240 μmol) was added to a mixture of Exatecan mesylate (125 mg, 235 μmol) and DIPEA (61 mg, 82 μL, 0.47 mmol) in dry DMP (0.9 mL) . After 20 hours, the reaction mixture was diluted into 9mL of DCM and purified by gradient column chromatography (0 → 40%MeOH / DCM) to obtain 9 (155 mg, 159 μmol, 68%) . LCMS (ESI+) C55H54FN6O10+ (M+H) + calculated value: 977.39; found: 977.80.

[0319] 4) Preparation of compound 1

[0320] A solution of Et3N (73 mg, 101 μL, 0.72 mmol) and compound 7 (65 mg, 72 μmol) in DMF (1.4 mL) was added to a soluiton of compound 9 (155 mg, 159 μmol) in DMF (1.6 mL) . The reaction mixture was sitrred for 24 hours, diluted with DCM (20 mL) and purified by gradient column chromatography (0 → 40% MeOH / DCM) to obtain compound 1 (94 mg, 44 μmol, 28%) , as a pale yellow solid. LCMS (ESI+) C102H118F2N16O29S22+ (M / 2+H) +calculated value: 1066.88; found: 1067.12.

[0321] 5) HB37A6 was enzymatically reconstituted to HB37A6- (GlcNAc (Fuc) 1-6-N3-GalNAc) 2 HB37A6 was expressed in HEK293 cells and purified. The obtained HB37A6 (16.4 mg / mL) was incubated with EndoSH (1%w / w) as described in PCT / EP2017 / 052792 to obtain trimmed HB37A6 with -GlcNAc or with GlcNAc (Fuc) at the Asn297 position. The above trimmed HB37A6 was incubated with enzymes His-TnGalNAcT (4.5%w / w) disclosed in PCT / EP2016 / 059194 and 6-azide-GalNAc-UDP (25eq (equivalent) compared with antibody) disclosed in PCT / EP2016 / 059194 (in a solution of histidine (20 mM) + NaCl (150 mM) containing 6 mM MnCl2) at 30 ℃ for 16 h.

[0322] Then, the obtained incubation mixture was purified using a 50 mL protA column (Hitrap Mabselect Sure, GE, 11-0034-95) . The incubation mixture obtained above was introduced to the column, and the column was washed with TBS + 0.2%Triton and TBS. The column was then eluted with 0.1 M acetate buffer solution (pH 2.9) , and neutralized with 2.5 M Tris-HCl (pH 7.2) . After dialysis with PBS for 3 times, the obtained (modified) glycosylated antibody was concentrated to 32.6 mg / mL using a Vivaspin Turbo 15 ultrafiltration device (Sartorius) .

[0323] The obtained glycosylated antibody was analyzed by mass spectrometry, the main steps are as follows: the glycosylated antibody was treated with IdeS prior to mass spectrometry analysis to analyze the Fc / 2 fragment. 20 μg of (modified) glycosylated antibody solution was inculated with IdeS (FabricatorTM) (1.25 U / μL) in PBS (pH 6.6) at a total volume of 10 μL for 1 hour at 37℃. The sample was diluted to 80 μL and analyzed on JEOL AccuTOF (ESI-TOF) , and deconvoluted spectra were obtained by Magtran software. Mass spectrometry analysis of the IdeS-digested sample revealed that the main product corresponded to the obtained HB37A6- (GlcNAc (Fuc) 1-6-N3-GalNAc) 2, with an observed mass of 24, 330.4.

[0324] Thus, the above results demonstrated that HB37A6- (GlcNAc (Fuc) 1-6-N3-GalNAc) 2, in which GlcNAcs at Asn297s in both heavy chains were substituted by 6-azido-GalNAc (substituted at position 4) was obtained.

[0325] 6) Preparation of conjugate HB37A6-SYNtecan E (IEX019-02)

[0326] The bioconjugate IEX019-02 of the present invention was prepared by conjugating compound 1 (linker-payload) as the linker-conjugate to azide-modified HB37A6- (GlcNAc (Fuc) 1-6-N3-GalNAc) 2 asthe biomolecule. Thus, to a solution of HB37A6- (GlcNAc (Fuc) 1-6-N3-GalNAc) 2 (10.8 mL, 350 mg, 32.6 mg / ml, PBS pH 7.4) were added PBS pH 7.4 (808 μL) , and 1, 2-propylene glycol (11.3 mL) and compound 1 (350 μL, 40 mM DMF solution) . The reaction was incubated overnight at room temperature, then filtered and dialyzed to PBS pH 7.4. The residual free drug was removed by adding Charcoal (350mg) and spinning overnight at room temperature. The charcoal was removed by centrifugation and filteration. The ADC was purified by AKTA Purifier-10 (GE Healthcare) with Superdex200 26 / 600 SEC (GE Healthcare) column.

[0327] Mass spectrometry analysis of the IdeS-digested samples revealed that the two main products corresponded to the obtained ADC, namely HB37A6-SYNtecan E conjugate. 1st peak: the observed mass is 26469 Da (calculated mass is 26465 Da) , corresponding to the conjugated Fc / 2 fragment (2x blocked lactone form of the payload) . 2ed peak: the observed mass of 26499 Da (calculated mass 26501 Da) , corresponding to the bound Fc / 2 fragment (2x open carboxylate form of the payload) .

[0328] The resulting structure is as follows. The concentration, DAR value and SEC purity of ADC products were determined by UV, SEC, RP-HPLC and LC-MS. The purity of the monomer detected by SE-HPLC was >99%, and the concentration was 6.12 mg / ml.

[0329] wherein q represents an average DAR, for example 3-5, 3.2-4.8, or 3.5-4.5, such as 3.52 as measured in Table 1.

[0330] wherein Ab is HB37A6.

[0331] Example 1.1.2 Preparation of IEX019-03

[0332] wherein q represents an average DAR, for example 5-11, 6-10, 7-9 or 7.5-8.5, such as 7.9 as measured in Table 1.

[0333] wherein Ab is HB37A6.

[0334] (a) a reducing agent solution (TCEP (Sigma, C4706) , dissolved in water) was added to a solution of HB37A6 (antibody HB37A6 was dissolved in a PBS buffer solution (Thermo, 10010023) ) , the reaction mixture was shaken in a shaker for 2-4 h, wherein

[0335] (i) the optimal concentration of HB37A6 was 5-10mg  / mL.

[0336] (ii) the optimal molar ratio of TCEP / mAb was 4.5 ～ 6.5.

[0337] (iii) the optimal temperature for reaction was 20-37℃.

[0338] (iv) the optimal pH value for reaction was generally between 6.5 and 8.0.

[0339] (b) an excess of the linker-toxin MC-GGFG-DXD (purchased from Levena biopharma, SET0218, the structure is shown below) was dissolved in DMSO and reacted with the thiol group of the antibody reduced in step (a) . The reaction mixture was shaken in a shaker for 1-2 h, wherein

[0340] (i) the optimal molar ratio of DXD / mAb was 10.0～12.0,

[0341] (ii) the optimal temperature for reaction was 20-37℃,

[0342] the crude ADC was obtained.

[0343] (c) the obtained crude ADC was purified by spin desalination, ultrafiltration or dialysis to obtain the final ADC product IEX019-03.

[0344] (d) the ADC product was detected by HIC, LC-MS and SEC HPLC to determine the average DAR value and SEC purity.

[0345] Example 1.1.3 Preparation of IEX019-04

[0346] wherein q represents an average DAR, for example 3-5, 3.2-4.8 or 3.0-4.0, such as 3.5 as measured inTable 1.

[0347] wherein Ab is HB37A6.

[0348] The molecule was prepared according to the following methods.

[0349] (a) a reducing agent solution (TCEP (Sigma, C4706) , dissolved in water) was added to a solution of antibody HB37A6 (antibody HB37A6 was dissolved in a PB buffer solution) . After the completion of the addition, the reaction mixture was shaken in a shaker for 2-4h, wherein

[0350] (i) the optimal concentration of antibody HB37A6 was 5-10mg  / mL.

[0351] (ii) the optimal molar ratio of TCEP / mAb was 1.9 ～ 2.7.

[0352] (iii) the optimal temperature for reducing reaction was 20-37℃.

[0353] (iv) the optimal pH value for reaction was generally between 6.5 and 8.0.

[0354] (b) an excess of the linker-payload MC-VC-PAB-MMAE with reactive group (maleimide-linked drugs) (purchased from Levena biopharma, SET0221) was dissolved in the organic solvent DMSO, and reacted with the reduced thiol group generated in step (a) . The reaction mixture was shaken in a shaker for 1-2 h.

[0355] (i) the optimal molar ratio of MC-VC-PAB-MMAE / mAb was 8.0 ～ 10.0.

[0356] (ii) the optimal temperature for binding reaction was 20 ～ 37℃.

[0357] (c) after the completion of the binding reaction, acetylcysteine solution was added to terminate the reaction in step (b) . The mixture was incubated at 20-25 ℃ for 5-15 min after mixing.

[0358] (d) the obtained crude ADC product was purified by spin desalination, ultrafiltration or dialysis to obtain the final ADC product IEX019-04.

[0359] (e) the ADC product was detected by HIC and SEC-HPLC to determine the average DAR value and SEC purity.

[0360] Example 1.1.4 Preparation of IEX019-05

[0361] wherein q represents an average DAR, for example 3-5, 3.2-4.8, or 3.0-4.5, such as 3.3 as measured in Table 1,

[0362] wherein Ab is HB37A6,

[0363] The molecule was prepared according to the following methods,

[0364] (a) a solution of linker-payload SMCC-DM1 (purchased from Levena Biopharma, SET0101, dissolved in organic solvent like DMSO) was added to a solution of antibody HB37A6 (antibody HB37A6 was dissolved in PB buffer solution) , after the addition, the reaction mixture was shaken in a shaker for 2-5h, wherein:

[0365] (i) the optimal concentration of antibody HB37A6 was 5 ～ 10mg  / mL;

[0366] (ii) the optimal molar ratio of linker-payload / mAb was 5.5 ～ 6.5;

[0367] (iii) the optimal pH value for reaction was generally between 6.5 and 8.0;

[0368] (iv) the optimal temperature for reaction was 20-37℃;

[0369] the crude ADC product was obtained,

[0370] (b) the obtained crude ADC product was purified by spin desalination, ultrafiltration or dialysis to obtain the final ADC product IEX019-05.

[0371] (c) the average DAR value and SEC purity of ADC product were determined using ultraviolet spectrophotometry and SEC high performance liquid chromatography.

[0372] Example 1.1.5 Preparation of IEX019-06

[0373] The preparation process was similar to that of IEX019-02, except that the HB37A6 monoclonal antibody was replaced by the reference antibody IgG.

[0374] Example 1.1.6 Preparation of IEX019-07

[0375] The preparation process was similar to that of IEX019-04, except that the HB37A6 monoclonal antibody was replaced by the reference antibody IgG.

[0376] The informations of all monoclonal antibodies and ADCs were summarized in Table 1.

[0377] Table 1. the informations of IEX019 molecules

[0378] *in which the heavy chain of IgG is SEQ ID NO: 13, and the light chain of IgG is SEQ ID NO: 14.

[0379] Example 1.2 Celluar binding experimrnt of IEX019 molecules

[0380] In order to test whether small molecule conjugation alters the binding properties of IEX019-01 monoclonal antibody to target cells, the DAN-G cell line (hCLDN18.2 negative) and the DAN-G-hCLDN18.2 cell line (overexpressing hCLDN18.2) prepared in Example 1 of CN202010570517. X were used, and the affinity of IEX019-01 and IEX019-02 to the target was detected by flow cytometry (FACS) . The specific experimental methods are as follows.

[0381] Tested cells (CHO-hCLDN18.2) were counted and diluted to 1×106 cells / ml, added to a U-bottom 96-well plate at 100 μl / well. The cell culture medium was removed by centrifugation at 500 g for 5 min. The molecules IEX019-01 and IEX019-02 and the reference molecule IEX019-06 were added to the U-plate and the cells were resuspended, 100 μl per well. The starting concentration of said molecules was 900 nM and then diluted sequentially at 3-fold series for a total of 10 concentration points. The mixture was placed on ice for 30 min. The supernatant was removed by centrifugation at 500 g for 5 min. The cells were washed with PBS once. 100 μl of goat anti-human Fc PE-labeled secondary antibody (SouthernBiotech, J2815-5H87B) was added to each well. The mixtures were incubated on ice in the dark for 30 minutes. The supernatant was removed by centrifugation at 500 g for 5 min. The cells were washed with PBS once.  Cells were resuspended with 50 μl of 1× PBS and detected by the FACS. Experimental data were analyzed using GraphPad Prism software.

[0382] IEX019-01 and IEX019-02 did not bind to non-target cell DAN-G, but exhibited a strong affinity to DANG-hCLDN18.2, which indicated that antibody binding was dependent on the expression specificity of the target, and the conjugation of Exatecan did not affect the antibody binding. At the same time, the reference molecule IEX019-06 (anegative control with IgG as the monoclonal antibody, IgG was conjugated to Exatecan toxin using the same technology) did not bind to the target cells (FIG. 1) .

[0383] Example 1.3 Endocytosis experiment of IEX019 molecules

[0384] Strong endocytosis is one of important properties fo ADC drugs. When the ADC binds to the antigen on the surface of the cell membrane, the ADC-antigen complex enters the cell through endocytosis and kills the target cell. Therefore, the endocytosis efficiency of ADCs is one of the important indexs to determine the tumor inhibition effect.

[0385] To test the endocytosis efficiency of antibodies after being conjugated to small molecule compounds, the endocytosis of different IEX019 molecules on DANG-hCLDNA18.2 cells were tested by flow cytometry. After digestion of DANG-hCLDNA18.2 cells, the cell density was adjusted. The cells were plated onto a 96-well plate at 1*105 cells / well, then were centrifuged at 500g for 3min. The supernatants were discarded. 100 μl of tested molecule was taken to resuspend the cells (the molecular concentration is 50 nM) and 5 replicates were set up for each sample (i.e., endocytosis time: 0h, 1h, 2h, 3h, 4h) . The mixtures were placed on ice and incubated for 1 h. After 1 h, the mixtures were centrifuged at 500g for 3min. The supernatants were discarded. 200 μl of FACS buffer (1%FBS, 1X PBS) was added to each well to rinse twice. One set of samples was taken and transferred to a new 96-well plate and incubated at 37 ℃ for 4 h. The rest of the samples continued to be incubated on ice. The previous operations were repeated. The samples were incubated at 37℃ for 3h, 2h, 1h, and 0h, respectively. After the specific incubation time was completed, the mixtures were centrifuged at 500 g for 3 min. The supernatants were discarded. 100 μl of anti-hFC-PE antibody (SouthernBiotech) diluted at 1: 400 was added to each well. The mixtures were incubated on ice in the dark for 30 min. After the completion of the secondary antibody incubation, the mixtures were centrifuged at 500g for 3 min. The supernatants were discarded. 200 μl of FACS buffer was added to each well to rinse twice. Finally, the cells were resuspended with 100 μl PBS for detection.

[0386] The experiment results are shown in FIG. 2, incubation at 37℃ for 0 h was the zero point of the endocytosis, and after 2 hours of incubation, all molecules reached the maximum amount of the endocytosis, about 60%, indicating that the ADC molecules designed and synthesized based on IEX019-01 maintained a strong ability to be endocytosed consistent with the monoclonal antibody after binding to tumor cells.

[0387] Example 1.4 In vitro Cell killing effect of IEX019 molecules

[0388] The effect of ADCs on cell viability was tested on a variety of cell lines expressing hCLDNA8.2 at different levels (Table 2) using the CellTiter-Glo (Promega, G9242) assay kit.

[0389] Table 2. The expression levels of hCLDN18.2 in the cell lines used

[0390] After digesting the used cells with EDTA / Trypsin, the density was adjusted. Cells were evenly plated into a 96-well plate (Table 3) . The diluted sample IEX019 molecules with specific concentrations (IEX019-02, IEX019-03, IEX019-04, initial dilution concentration was 100 nM, 3-fold dilution was taken) were added, and the wells without the addition of IEX019 molecules were used as a control. The plate was placed in an incubator at 37 ℃ for 5 days. After 5 days, 100 μl of CellTiter-Glo detection reagent was added to each well, and then was incubated for 30 minutes at room temperature and detected with a microplate reader. The relative cell viability (relative cell viability = sample / control *100%) was calculated and the curve was fitted by Graph Pad Prism 8.0.

[0391] As shown in FIG. 3, the killing of the cell line by ADC molecules was dependent on the expression level of hCLDN18.2 on surface. In hCLDNA8.2-negative DANG, IEX019 molecules had no significant effect on cell viability (Fig. 3A) , and in cell lines (NUGC-4, SNU620) with moderate expression levels, IEX019 molecules showed a certain degree of cell killing (Fig. 3B) . In cell line DAN-G-hCLDN18.2 with high expression, IEX019 molecules all showed a significant killing effect (FIG. 3C) . The results indicated that IEX019 molecules had good selectivity and efficacy.

[0392] Table 3. the plating density of cells

[0393] Example 1.5: Bystander killing effect

[0394] In the synthesis process of ADC drugs, small molecule compounds may be linkeded to antibodies through cleavable linkers, and after entering into the cell membrane via endocytosis, the linkers are cleaved, and the small molecules are released to kill the target cells. After the death of the target cell, the small molecule compound is released from the target cell into the intercellular space to further kill the non-target cells within a certain range, and such effect is known as the bystander killing effect. Since cells within tumors may vary greatly in target expression levels (tumor heterogeneity) , the bystander killing effect is important  for effectively killing tumor cells and inhibiting tumor growth.

[0395] Non-targeting cell DAN-G and target cell DANG-hCLDN18.2 were used in the present invention to test the bystander killing effect of IEX019 molecules.

[0396] After digesting the used cells with EDTA / Trypsin, the density was adjusted. Six-well cell culture plates were prepared, and 7.5×104 cells of DANG cells and DANG-hCLDN18.2 cells were added. The two kinds of cells were co-incubated. 200 μl of tested samples (IgG (SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14) , IEX019-02, IEX019-05, IEX019-06, Exatecan (Macklin, E881532) were added to each well at a final concentration of 50 nM with 3 replicates for each sample. The cell culture plate was placed in an incubator at 37 ℃ for 5 days. After 5 days, the culture supernatants were discarded. After rinsed with PBS, Trypsin-EDTA was added to digest the cells. All digested cells were collected and transferred to a 96-well plate. According to the antibody incubation protocol of flow cytometry technology, the cells were incubated with primary antibody (IEX019-01, 100 nM) and secondary antibody (anti-hFc-PE, Southern Biotech) at 4℃ for 1 h and 0.5 h, respectively. After rinsed with PBS, the live / dead Violet dye (Thermo, L34964) was diluted at 1:1, 000 and added to each well at 100 μl for incubation at 4℃ for 20 min. After rinsed with PBS, cells were resuspended with 100 μl PBS for detection. The populations in each sample were distinguished using the live / dead dye, wherein the populations with IEX019-01-negative (i.e., hCLDN18.2-negative) were DAN-G cells, and cells with IEX019-01-positive (i.e., hCLDN18.2-positive) were DAN-G-hCLDN18.2. The number of two kinds of cells in each sample was counted, and the relative cell viability of each kind of cells was calculated according to the following equation, and the curve was fitted by Graph Pad Prism 8.0.

[0397] Relative viability of DANG cells = number of DNAG cells in sample group  / number of DNAG cells in IgG group*100%

[0398] Relative viability of DANG-hCLDN18.2 cells= number of DNAG-18.2 cells in sample group  / number of DNAG-18.2 cells in IgG group*100%

[0399] Cell viability in the IgG group was set to 100%.

[0400] As shown in FIG. 4, the negative control sample IEX019-06 had no killing effect on both kinds of cells; The IEX019-05 molecule linked the DM1 toxin to the IEX019-01 monoclonal antibody via a non-cleavable linker and had no ability to kill surrounding non-target cells, thus can only kill DANG-hCLDNA8.2 cells and had no effect on DANG cells. Only IEX019-02 had a significant bystander killing effect, was able to kill both target and non-target cells.

[0401] Example 1.6: Anti-tumor efficacy of IEX019 molecules in DAN-G-hCLDN18.2 mice xenograft tumor model

[0402] To demonstrate the in vivo efficacy of IEX019 molecules, the anti-tumor efficacy of the antibody molecules of the present invention were tested using CB-17-SCID mice inoculated with DANG-hCLDN18.2 cells. SPF grade Female CB-17-SCID mice (14-17g, purchased from Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. ) were used in the experiment, and the certificate number was NO. 110011201108225246.

[0403] DANG-hCLDN18.2 cells were routinely subcultured for subsequent in vivo experiments. The DANG-hCLDN18.2 cells were collected by centrifugation, dispersed with PBS (1×) to prepare a cell suspension with a cell concentration of 3×106 cells / ml. DANG-hCLDN18.2 tumor-bearing mice models were  established by subcutaneously inoculating 0.2 ml of the cell suspension into the right abdominal region of CB-17 SCID mice on day 0.

[0404] On day 5 after tumor cell inoculation, all mice with tumor volumes of 50.16-136.68mm3 were divided into groups (6 mice per group) in a serpentine manner. The dosages and modes of administration are shown in Table 4. Administrations were conducted on day 5 after inoculation, and the tumor volume and body weight of the mice were monitored twice a week, as shown in FIG. 5A and 5B, and the monitoring ended after 92 days.

[0405] The relative tumor growth inhibition (TGI%) was calculated on day 50 after inoculation, and the calculating formula was as follows:

[0406] TGI%= 100%* (tumor volume of control group –tumor volume of treatment group)  /  (tumor volume of control group–tumor volume of control group prior to administration) .

[0407] Measurement of tumor volume: the maximum long axis (L) and maximum wide axis (W) of the tumor were measured by vernier calipers, and the tumor volume was calculated according to the following formula:

[0408] V=L*W2 / 2. Body weight was determined using an electronic balance.

[0409] Table 4. Experimental design table (notes: single administration, once in total)

[0410] Results of tumor growth inhibition were as shown in Table 5 and FIG. 5A: on day 50 after inoculation, the tumor growth inhibition of single administration of IEX019-02 reached 103.60%compared with IEX019-01 monoclonal antibody, which was significantly better than that of IEX019-03 and IEX019-04, with tumor growth inhibition of 93.70%and 35.20%, respectively. On day 82 after inoculation, 100%of mice in the IEX019-02 group showed complete tumor regression. At the same time, the body weights of the mice were measured, and the results showed that there was no significant difference in the body weights of the mice, as shown in FIG. 5B.

[0411] Table 5. tumor growth inhibition on day 50

[0412] Example 1.7: Anti-tumor efficacy of IEX019 molecules in NUGC-4 mice xenograft tumor model

[0413] To demonstrate the in vivo efficacy of IEX019 molecules, the anti-tumor efficacy of the antibody molecules of the present invention were tested using CB-17-SCID mice inoculated with NUGC-4 cells.

[0414] SPF grade Female CB-17-SCID mice (14-17g, purchased from Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. ) were used in the experiment, and the certificate number was NO. 110011201109348141.

[0415] NUGC-4 cells were routinely subcultured for subsequent in vivo experiments. NUGC-4 cells were collected by centrifugation, and dispersed with PBS (1×) to prepare a cell suspension with a cell concentration of 3×107 cells / ml. NUGC-4 tumor-bearing mice models were established by subcutaneously inoculating 0.2 ml of cell suspension into the right abdominal region of CB-17 SCID mice on day 0.

[0416] On day 5 after tumor cell inoculation, all mice with tumor volumes of 72.25-140.50mm3 were divided into groups (6 mice per group) in a serpentine manner. The dosages and modes of administration are shown in Table 6. Administrations were conducted on day 5 after inoculation, and the tumor volume and body weight of the mice were monitored twice a week, as shown in FIG. 6A and 6B, and the monitoring ended after 40 days.

[0417] The relative tumor growth inhibition (TGI%) was calculated on day 33 after inoculation, and the calculating formula was as follows:

[0418] TGI%= 100%* (tumor volume of control group –tumor volume of treatment group)  /  (tumor volume of control group–tumor volume of control group prior to administration) .

[0419] Measurement of tumor volume: The maximum long axis (L) and maximum wide axis (W) of the tumor were determined by vernier calipers, and the tumor volume was calculated according to the following formula:

[0420] V=L*W2 / 2. Body weight was determined using an electronic balance.

[0421] Table 6. Experimental design table (notes: single administration, once in total)

[0422] Results of tumor growth inhibition were as shown in Table 7 and FIG. 6A: on day 33 after inoculation, the tumor growth inhibition of single administration of IEX019-02 and IEX019-03 were 80.04%and 54.31%, respectively, compared with negative control IEX019-06. At the same time, the body weights of the mice were measured, and the results showed that there was no significant difference in the body weights of the mice, as shown in FIG. 6B.

[0423] Table 7. tumor growth inhibition on day 33

[0424] Example 1.8: Anti-tumor efficacy of IEX019 molecules in SNU620 mice xenograft tumor model

[0425] To demonstrate the in vivo efficacy of IEX019 molecules, the anti-tumor efficacy of the antibody molecules of the present invention were tested using CB-17-SCID mice inoculated with SNU620 cells. SPF grade Female CB-17-SCID mice (18-20g, purchased from Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. ) were used in the experiment, and the certificate number was NO. 110011211102179364.

[0426] SNU620 cells were routinely subcultured for subsequent in vivo experiments. SNU620 cells were collected by centrifugation, and dispersed with PBS (1×) to prepare a cell suspension with a cell concentration of 3×107 cells / ml. SNU620 tumor-bearing mice models were established by subcutaneously inoculating 0.2 ml of the cell suspension into the right abdominal region of CB-17 SCID mice on day 0.

[0427] On day 7 after tumor cell inoculation, all mice with tumor volumes of 58.1-117.3mm3 were divided into groups (6 mice per group) in a serpentine manner. The dosages and modes of administration are shown in Table 8. Administrations were conducted on day 7 after inoculation, and the tumor volume and body weight of the mice were monitored twice a week, as shown in FIG. 7A and 7B, and the monitoring ended after 39 days.

[0428] The relative tumor growth inhibition (TGI%) was calculated on day 39 after inoculation, and the calculating formula was as follows:

[0429] TGI%= 100%* (tumor volume of control group –tumor volume of treatment group)  /  (tumor volume of control group–tumor volume of control group prior to administration) .

[0430] Measurement of tumor volume: The maximum long axis (L) and maximum wide axis (W) of the tumor were measured by vernier calipers, and the tumor volume was calculated according to the following formula:

[0431] V=L*W2 / 2. Body weight was determined using an electronic balance.

[0432] Table 8. Experimental design table (notes: single administration, once in total)

[0433] The results of tumor growth inhibition were shown in Table 9 and FIG. 7A: on day 39 after inoculation, the tumor growth inhibition of IEX019-02 10 mg / kg after a single administration was 143.77%compared with hIgG, and 100%of mice showed complete tumor regression. There was no significant difference in mice body weight in each administration group compared with the hIgG control group (FIG. 7B) .

[0434] Table 9. Tumor growth inhibition on day 39

[0435] Example 2 Formula study of IEX019-02 formulations

[0436] 1. Overview

[0437] The purpose of the present experiment was to develop a long-term stable IEX019-02 formulation. The development of formula of the formulation consisted of two steps: 1) pH buffer solution screening (store at 40 ℃ stress condition for 4 weeks) . 2) auxiliary material screening, including liquid samples were placed at 25 ℃ and 40 ℃ stress condition for 4 weeks, freeze-thaw for 5 cycles, and 3 days of oscillation (150 rpm, 25℃) . Lyophilized samples were placed at 40℃ for 2, 4, and 12 weeks. Analytical methods include DSC, appearance, pH, molecule concentration of ADCs, insoluble particles (HIAC) , SE-HPLC, iCIEF, Caliper-R / NR, DAR value, free drug, reconstitution time, and binding activity.

[0438] 2. Overview of analytical methods for formulations

[0439] 2.1 Appearance

[0440] The appearance of the samples, including clarity, color, and visible particles were examined under a black-and-white background of the YB-2 Clarity Detector.

[0441] 2.2 pH value

[0442] The pHs of the samples were measured using a pH meter with a glass electrode. The pH meter was calibrated with three different standard buffer solutions (pH 4.01, 7.00, and 9.21) before the first use every day. The calibration slope was between 95.0%and 105.0%, and the zero drift was between -60.0 mV and + 60.0 mV.

[0443] 2.3 Molecule concentration of ADCs

[0444] The absorbance of ADCs at 280 nm and 365 nm was detected by Nanodrop or solo-VPE, and the molecule concentration of ADCs were calculated according to the following formula. CF is the correction factor, AWV is the absorbance at 365 nm, and EC is the extinction coefficient (1.52 Au *mL*mg-1*cm-1)

[0445] 2.4 Insoluble particles (HIAC)

[0446] The insoluble particles were measured in term of sizes under a laminar flow hood using a HIAC particle analyzer (HIAC 9703+) and counted. 0.45 mL of samples were tested in a single run, and four runs were performed consecutively. The results of the first run were discarded, and the average number of insoluble particles per milliliter of the last three runs was reported (insoluble particle size ≥ 2 / 10 / 25 μm) .

[0447] 2.5 Purity of size exclusion chromatography SE-HPLC

[0448] SE-HPLC is a purity analysis method that separates proteins based on protein size. The SE-HPLC analysis procedures were performed as follows: the detection was performed on an Agilent 1260 HPLC System equipped with a TSKgel G3000SWXL column (7.8×300 mm, 5 μm particle size) and a UV detector (detection wavelength: 280 nm) . The temperatures of the sampler and the column oven were set as 5±3 ℃and 25±3 ℃, respectively. The mobile phases were 0.078 M potassium phosphate monobasic, 0.122 M potassium phosphate dibasic trihydrate, 0.15 M potassium chloride, and 15% (v / v) IPA, pH 7.0±0.1, and the flow rate was set as 0.8 mL / min. 100 μg of each sample was injected into the HPLC vial. The detection wavelength was set as 280 nm and the run time was 20 minutes. Finally, all the raw data were processed by CDS software.

[0449] 2.6 Drug-to-antibody ratio DAR

[0450] The DAR analysis procedures were as follows: the detection was performed on a Waters Ultra Performance Liquid Chromatograph UPLC System equipped with a Waters / ACQUITY UPLC Protein BEH C4 Column,  column (2.1×150 mm, 1.7 μm particle size) , and a UV detector (detection wavelength: 280 nm) . The temperatures of the sampler and the autosampler were set as 5±3 ℃ and 70±1 ℃, respectively. Mobile phase A was 0.1%trifluoroacetic acid in water containing 5%IPA; Mobile phase B was: 0.1%trifluoroacetic acid in acetonitrile containing 5%IPA. The flow rate was 0.25 mL / min. 100 μg of each sample was injected into the HPLC vial. The detection wavelength was set as 280 nm and the run time was 45 minutes. Finally, all raw data was processed by Empower software.

[0451] 2.7 Free drug

[0452] The Free Drug analysis procedures were as follows: the detection was performed on an Agilent Technologies 1260 system equipped with an Agilent Eclipse Plus C18 column (4.6×100 mm, 3.5 μm particle size) and a UV detector (detection wavelength: 365 nm) . The temperature of the sampler and the column were set as 5±3 ℃ and 50±1 ℃, respectively. Mobile phase A was 0.1%trifluoroacetic acid in water; Mobile phase B was 0.085%trifluoroacetic acid in acetonitrile. The flow rate was 1.0 mL / min. 40 μL of each sample was injected into the HPLC vial. The detection wavelength was set as 365 nm and the run time was 18 minutes. Finally, all raw data was processed using Empower3 software.

[0453] 2.8 Charge variants iCIEF

[0454] The sample was diluted to 2.0 mg / ml with ultrapure water, and then 20 μL of the diluted sample was mixed with 80 μL of premixed solution to prepare a loading mixture with a final concentration of 0.4 mg / mL. The premixed solution consisted of 4.0 μL of amphoteric electrolytes 3-10, 35 μL of 1%methylcellulose, 0.5 μL of isoelectric point marker with pI 7.05, 0.5 μL of isoelectric point marker with pI 9.91, 37.5 μL of 8 M urea solution, 1.0 μL of 500 mM arginine solution, and 1.5 μL of 3.3%HAc solution. The detection needed to be completed within 48 hours after the sample was mixed with the premix solution. The loading solution was analyzed using the iCE3 Capillary Isoelectric Focusing Analysis System equipped with FC-coated full-column imaging capillaries. After separation, the raw data was processed using Water / Empower FR5.0.

[0455] 2.9 Purity of reduced / non-reduced capillary gel electrophoresis Caliper-NR / R

[0456] The non-reduced Caliper-SDS was analyzed on a SCIEX / PA800 Plus instrument equipped with a PDA detector (diode array detector) . Samples were diluted to 2.0 mg / mL. 50 μL of the sample was placed in a 1.5 mL centrifuge tube, 5 μL of NEM (N-ethylmaleimide) was added to the centrifuge tube, and 45 μL of SDS sample buffer solution (PB-CA (citrate phosphate buffer solution) containing 0.8%SDS) was added. The samples were mixed well and centrifuged, and placed at 70℃ for 10 minutes. Capillary right-end injection method (effective capillary separation length was 20.2 cm) was used. The detection wavelength was 220 nm. After 20 seconds of continuous injection using a forward voltage of -5 kV, the separation was performed with a forward voltage of +15 kV for 35 minutes.

[0457] The reduced Caliper-SDS was analyzed on a SCIEX / PA800 Plus instrument equipped with a PDA detector. Samples were diluted to 2.0 mg / mL. 50 μL of the sample was placed in a 1.5 mL centrifuge tube, and 45 μL of pH 6.5 sample buffer solution (PB-CA (phosphate citrate buffer solution) containning 0.8%SDS) and 5 μL of BME (β-mercaptoethanol) were added, respectively. The samples were mixed well and centrifuged, and placed at 70℃ for 10 minutes, and then centrifuged in a centrifuge at 13, 000 rpm for about 1 minute. Capillary left-end injection method (effective capillary separation length was 20.2 cm) was used. The detection wavelength was 220 nm. After 20 seconds of continuous injection using a backward voltage of -5 kV, then the separation was performed with a backward voltage of -15 kV for 35 minutes.

[0458] 2.10 Binding activity

[0459] Gradiently diluted references, controls, and test samples were added to a 96-well high-binding plate, and the products were bound to the antigen coated on the plate. After washing, peroxidase-labeled goat anti-human IgG Fcγ detection antibody (Jackson, 109-035-098#) was added to the plate. The detection antibody can bind to the captured ADC product. After the final washing, TMB (3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine) substrate solution was added to the plate. TMB can react specifically with peroxide in the presence of peroxidase to generate single color signal, and the signal intensity is proportional to the amount of ADC products bound on the plate. After the color reaction was terminated, the absorbance value of 450 nm-620 nm was read on the microplate reader.

[0460] The EC50s of the reference, control and test samples in the same plate were obtained by using the four-parameter fitting regression model to plot the curves of the reference, control and test samples by SoftMax Pro software, and the relative binding activity of the control and the test samples was calculated by the following formula:

[0461] Relative binding activity of the control or test samples = EC50 of the reference / EC50 of the control or test samples× 100%.

[0462] 2.11 Reconstitution time

[0463] A greater than 5.2 ml of water for injection was taken by a 10 ml syringe, and the air was excluded so that the final volume of water for injection in the syringe was 5.2 ml. The syringe was inserted through the center of the stopper. The timer was pressed after adding the water for injection along the wall of the bottle. The aluminum cap of the bottle mouth was grasped with a hand. The wrist was rotated slightly clockwise. If no particles werre observed within 10 minutes, the timer was pressed again, and the time was the reconstitution time.

[0464] 2.12 DSC

[0465] DSC is a thermal analysis instrument that measures the heat difference between a test sample and a reference when heated. This experiment was measured using MicroCal PEAQ DSC (Malvern, SYS12907) . Prior to the analysis, the protein sample was first diluted to 1 mg / mL using its reference buffer solution. 400 μL of each reference buffer solution was added to the odd-numbered wells of the 96-well plate, and 400 μL of samples were added to the even-numbered wells of the same plate. The experimental parameters were set so that the scan temperature rised from 10 ℃ to 95 ℃ at a rate of 90 ℃ / h. Thermalgram analysis was performed using MicroCal PEAQ DSC automated data analysis software.

[0466] 2.13 Detection of glass transition temperature (Tg’ )

[0467] The glass transition temperature (Tg') of the protein formula was determined by TA 2000 DSC. 20 μL of sample was placed in an aluminum sample tray, and the sample tray to which the sample was added and an empty sample tray (reference) were placed in the DSC instrument. The corresponding parameters (see the table below) , including the heating / cooling rate, the target temperature of heating / cooling, and the holding time of the platform after reaching the target temperature, were set in the control panel. Once completing the setup, the data sampling began. The mDSC pattern was recorded during this process and the glass transition temperature (Tg') was obtained by Universal Analysis.

[0468] 2.14 Collapse temperature (Tc)

[0469] The collapse temperature (Tc) was measured by Lyostat5 LED lyophilization microscopy. When testing a sample, the sample holder was placed on the temperature control block, the side door of the sample cell was closed to ensure that the sample holder was in the center of the temperature control block. A piece of quartz glass with 16 mm diameter was placed on the sample holder with a vacuum pen and was brought to contact with the temperature control block. Next, a 70 μm thick metal gasket was clamped with tweezers and placed on the quartz slide, keeping the metal gasket coaxial with the center of the quartz sheet. A certain volume (typically 2 μL) of the test sample was taken with a pipette and dropped in the center of the quartz sheet. A 13 mm diameter coverslip was carefully placed on the metal gasket with a vacuum pen to ensure that the edge of the sample was moved above the light penetration hole of the temperature control block for easy visualization of the sample. The lid was rotated back on the platform, and the nitrogen outlet  pipe was fixed on the lid to avoid frosting. Then, the corresponding parameters (see the table below) , including the heating / cooling rate, the target temperature of heating / cooling, the holding time of the platform after reaching the target temperature, and the frequency of image collection, were set in the control panel. Once completing the setup, the data sampling began. The sublimation front moved from the outer edge of the sample to the middle during the lyophilization. The front of the sublimation front was in a frozen state, and the rear thereof was in a dry strate. When the sample temperature was higher than the collapse temperature (Tc) , collapse occured. The photos in the experiment were carefully reviewed, starting from the photos of the cooler temperatures. When a tiny void appeared in the collected photo, it was a microstructure collapse, and the corresponding temperature was deemed as the collapse temperature.

[0470] 3. pH buffer solution screening

[0471] 3.1 Purpose of the experiment

[0472] The purpose of this experiment is to screen the optimal pH of buffer system for IEX019-02 at a concentration of 40 mg / mL.

[0473] 3.2 Experimental protocol

[0474] As shown in Table 10, three buffer systems were studied at a concentration of 40 mg / mL IEX019-02 in 8 groups of experiments.

[0475] Under high temperature conditions (40℃) , the stabilities of 3 different pH buffer systems in 8 groups of experiments were evaluated for 4 weeks. The test items performed in the study included DSC, appearance, pH, molecule concentration of ADC, SE-HPLC, Caliper-NR / R, free drug, DAR value, and iCIEF.

[0476] Table 10. Experimental protocol for ADC pH buffer solution screening

[0477] 3.3 Sample preparation

[0478] IEX019-02 stock solution (10 mg / mL ADC, 20 mM histidine solution, 8% (w / v) sucrose, pH 6.0) was concentrated in ultrafiltration tubes, and then was exchanged into systems of 20 mM citric acid buffer solution (pH 5.0, 6.0) , 20 mM succinic acid buffer solution (pH 5.0, 5.5, 6.0) and 20 mM histidine buffer solution (pH 5.5, 6.0, 6.5) , respectively. The concentration of IEX019-02 was adjusted to approximately 40 mg / mL. The solutions were filtered with a 0.22 μm PES filter in a biosafety cabinet to obtain the samples F1-F8 as shown in Table 10. The samples were then filled into 2 mL vials with a filling volume of 1 mL / vial. After filling, the vials were stoppered and capped immediately. The samples were placed under different storage conditions according to Table 10, and at least 1 vial was placed at each sampling point for each formula.

[0479] 3.4 Results and discussion

[0480] The results of pH buffer solution screening for the formulae of IEX019-02 formulation were summarized in Table 11-20.

[0481] 3.4.1 DSC

[0482] As shown in Table 11 and FIG. 8, the Tm onset values of samples in 8 kinds of pH buffer systems (F1-F8) all over than 58℃, which indicated that the molecules had good conformational stability.

[0483] Table 11. Summerized results of the DSC in ADC pH buffer solution screening

[0484] 3.4.2 Appearance

[0485] At T0, the samples were slightly yellow, slightly opalescence liquid with a small amount of protein particles in the 8 pH buffer systems (F1-F8) . After being placed at 40℃ for 1 or 2 weeks, a large number of visible particles and turbidity were observed for F1～F2 (citric acid buffer system, pH 5.0 and pH 6.0) , F6 (histidine / hydrochloride histidine buffer system, pH 5.5) and F3～F4 (succinic acid / sodium succinate buffer system, pH 5.0 and pH 5.5) . A small amount of particles were observed for F5 (succinic acid / sodium succinate buffer system, pH 6.0) and F7～F8 (histidine / hydrochloride histidine buffer system, pH 6.3 and 6.5) and the samples were clear. After being placed at 40℃ for 4 weeks, a large number of particles were presented in all samples, but the amounts of particles for F1～F4 were relatively larger.

[0486] 3.4.3 pH value

[0487] As shown in Table 12, except for the histidine 6.0 group (F7) , no significant changes in pH value were observed for the other pH buffer systems (F1-F6, F8) after being placed for 4 weeks at 40℃ compared with T0.

[0488] Table 12. Summerized pH results in IEX019-02 pH buffer solution screening

[0489] 3.4.4 Molecule concentration of IEX019-02

[0490] As shown in Table 13, compared with T0, no significant changes in IEX019-02 concentration were observed for the samples in 8 pH buffer systems (F1-F8) after being placed at 40℃ for 4 weeks.

[0491] Table 13. Summerized results of the IEX019-02 concentration in pH buffer solution screening

[0492] Notes: IEX019-02 concentrations were tested with Nanodrop in this experiment.

[0493] 3.4.5 Purity of size exclusion chromatography SE-HPLC

[0494] As shown in Table 14, compared with T0, the SE-HPLC monomers in the 8 pH buffer systems (F1-F8) decreased significantly after being placed at 40℃ for 1, 2 and 4 weeks. At the end of week 1, the SE-HPLC monomer decreased by 1.7%～23.1%, and the SE-HPLC monomer in F6～F8 (histidine buffer system, pH 5.5, pH 6.3 and pH 6.5) decreased by 1.7%-2.6%. At the end of week 2, the SE-HPLC monomer decreased by 8.2%～30.2%, and the SE-HPLC monomer in F6～F8 (histidine buffer system, pH 5.5, pH 6.3 and pH 6.5) decreased by 8.2%-10.5%. At the end of week 4, the SE-HPLC monomer decreased by 9.4%～56.2%, and the SE-HPLC monomer in F6～F8 (histidine buffer system, pH 5.5, pH 6.3 and pH 6.5) decreased by 9.4%-10.8%which was less than that of other pH buffer systems. Therefore, histidine buffer solution was preferred.

[0495] Table 14. Summerized results of the SE-HPLC in pH buffer solution screening

[0496] 3.4.6 Charge variants iCIEF

[0497] As shown in Table 15, the iCIEF main peaks of the 8 pH buffer systems (F1-F8) decreased by 11.6%-21.8%compared with T0 after being placed at 40℃ for 4 weeks. The iCIEF main peak for F7 (histidine buffer, pH 6.3) , F8 (histidine buffer, pH 6.5) , F5 (succinic acid buffer, pH 6.0) decreased by 11.6%-17.1%, which was lower than other pH buffer systems (iCIEF main peak decreased by 18.6%-21.8%) . Therefore, F7, F8 and F5 were superior.

[0498] Table 15. Summerized results of the iCIEF in pH buffer solution screening

[0499] 3.4.7 Purity of reduced capillary electrophoresis Caliper-R

[0500] As shown in Table 16, compared with T0, the purity of Caliper-R for 8 pH buffer systems (F1-F8) decreased by 1.0 %-4.6 %after being placed at 40 ℃ for 4 weeks. The purity of Caliper-R for F5 (succinate buffer system, pH 6.0) and F6～F8 (histidine buffer system, pH 5.5, pH 6.3 and pH 6.5) decreased by 1.0 %, which was lower than other pH buffer systems (the purity of Caliper-R decreased by 1.4 %-4.6 %) . Therefore, F5, F6, F7 and F8 showed better performances.

[0501] Table 16. Summerized results of the Caliper-R in pH buffer solution screening

[0502] 3.4.8 Purity of non-reduced capillary electrophoresis Caliper-NR

[0503] As shown in Table 17, compared with T0, the purity of Caliper-NR for 8 pH buffer systems (F1-F8) decreased by 3.6%-8.5%after being placed at 40℃ for 4 weeks. The purity of Caliper-NR for F2 (citrate buffer system, pH 6.0) decreased by 3.6%, which was less than that of other pH buffer systems (the purity of Caliper-NR decreased by 4.0%-8.5%) .

[0504] Table 17. Summerized results of the Caliper-NR in pH buffer solution screening

[0505] 3.4.9 Free drug

[0506] As shown in Table 18, the free drug for 8 pH buffer systems (F1-F8) increased by 25.8%-34.4%mol / mol after being placed at 40℃ for 4 weeks compared with T0. The free drug for F8 (histidine buffer system, pH 6.5) increased by 25.8%mol / mol, which was less than other pH buffer systems (the free drug increased by 29.2%-34.4%mol / mol) . Therefore, F8 performed better.

[0507] Table 18. Summerized results of the free drug in pH buffer solution screening

[0508] 3.4.10 Drug-to-antibody ratio DAR

[0509] As shown in Table 19, compared with T0, the DAR values for 8 pH buffer systems (F1-F8) decreased by 1.84-2.95 after being placed at 40 ℃ for 4 weeks. The DAR value for F8 (histidine buffer system, pH 6.5) decreased by 1.84, which was less than other pH buffer systems (DAR value decreased by 2.19-2.95) . Therefore, F8 performed better.

[0510] Table 19. Summerized results of the DAR values in pH buffer solution screening

[0511] 3.4.11 Summary

[0512] Based on the DSC and the stability results at 40℃, the sample with F8 formula (20 mM histidine buffer solution, pH 6.5) had a higher Tm Onset value, and showed a good appearance under stability conditions, and had relatively higher purity of size exclusion chromatography and high stability of charge isomer, lower decrease in drug-to-antibody ratio and less free drug, so F8 formula (20 mM histidine buffer  solution, pH 6.5) was finally selected for the next round of auxiliary materials screening.

[0513] 4.Auxiliary materials screening experiment

[0514] 4.1 Purpose of the experiment

[0515] The purpose of this study is to screen the optimal auxiliary materials for histidine buffer system and a IEX019-02 concentration of 40 mg / mL.

[0516] 4.2 Experimental protocol

[0517] The formula design and sampling plan for the auxiliary materials screening experiment were shown in Tables 20 and 21. Lyophilized samples of 3 sets of formula with 4 kinds of auxiliary materials were incubated under high temperature conditions for 12 weeks, and liquid samples were incubated under high temperature conditions (40℃ and 25℃ for 4 weeks) , freeze-thaw (5 cycles from room temperature to -70℃) and oscillation conditions (150 rpm, oscillation at 25℃ for 3 days) , and the optimal auxiliary materials were selected according to the stability of the three sets of formulae. The test items included appearance, pH value, molecule concentration of ADC, SE-HPLC, iCIEF, Caliper-R / NR, drug-to-antibody ratio, free drug, collapse temperature Tc, glass transition temperature Tg’ , DSC, insoluble particles (HIAC method) , moisture of lyophilized samples and binding activity (ELISA) , etc.

[0518] Table 20. Auxiliary materials screening experiment

[0519] Table 21. Sampling plans of auxiliary materials screening

[0520] 4.3 Sample preparation

[0521] According to the composition of the stock solution and experimental design, IEX019-02 stock solution (40 mg / mL ADC, 20 mM histidine solution, 8% (w / v) sucrose, pH 6.5) was taken and exchanged into a solution of 20 mM histidine solution and 8.8%trehalose dihydrate (w / v) (pH 6.5) and a solution of 20 mM histidine buffer solution, 2%sucrose (w / v) , 4%mannitol (w / v) (pH 6.5) by ultrafiltration, respectively. The concentration of IEX019-02 was greater than 40mg / ml at this time. According to Table 20, the IEX019-02 was then diluted to 40 mg / mL by adding the corresponding ultrafiltration buffer, and then 5%polysorbate 80 was added to a concentration of 0.02% (w / v) , to obtain Fe01-Fe03. After the completion of the preparation, the samples for each formula were filtered with a 0.22 μm PES filter and filled into 20 mL and 6 mL vials with a filling volume of 5 mL / vial and 3 mL / vial. After filling, the 20 mL vials were semi-stoppered and lyophilized according to the procedures described in Table 22 immediately, the 6 mL vials were stoppered and capped. The samples were placed under different storage conditions according to Table 21, and at least 1 vial was placed at each sampling point for each formula.

[0522] Table 22. Lyophilized procedures for auxiliary materials screening

[0523] 4.4 Results and discussion

[0524] Results of auxiliary materials screening experiment are summarized in Table 23-35.

[0525] 4.4.1 Tc, Tg’ and Tm valus of the samples

[0526] As shown in Table 23, the Tcs of 3 formulae (Fe01-Fe03) were all higher than -21℃. The Tcs of Fe01 and Fe02 were close, and Tc of Fe03 was higher and was -9.2℃. Tg' varied widely, which were -28.3℃, -26.6℃, and -32.8℃, respectively. The Tm onsets of 3 formulae (Fe01-Fe03) were all higher than 67.0℃, and the Tm values were higher than 79℃, indicating that these three formulae had good stability.

[0527] Table 23. Summerized results of Tc, Tg’ and Tm1 valus of the samples

[0528] 4.4.2 Results of reconstitution time and moisture

[0529] As shown in Table 24, the reconstitution time of the lyophilized samples of the three formulae (Fe01-Fe03) varied widely, and the reconstitution time of Fe01 was relatively short. There was no significant change in the moisture of the three groups during the stability process, which was less than 0.6 %.

[0530] Table 24. Summerized results of the reconstitution time and moisture of lyophilized samples in auxiliary materials screening

[0531] 4.4.3 Appearance

[0532] As shown in Table 25, the liquid samples of the three formulae (Fe01-Fe03) were slightly yellow, slightly opalescence liquid with no visible particle at T0. After 3 days of oscillation, freeze-thawing for 5 times, and being placed at 25℃ for 4 weeks, there were essentially free of visible particles or free of visible particles for the 3 formulae (Fe01-Fe03) . However, visible particles appeared after being placed at 40 ℃for 2 weeks and 4 weeks. The lyophilized samples were slightly yellow complete powder cake before reconstitution, and there were essentially free of visible particles after reconstitution.

[0533] Table 25. Summerized results of the appearance in auxiliary materials screening investigation

[0534] Notes: SY: slightly yellow, SO: slightly opalescence liquid, FP: free of visible particles, EFP: essentially free of visible particles (≤ 3) , NEFP: presence of visible particles (>3) ; FT-3C: freeze-thawing for 3 times; FT-5C: freeze-thawing for 5 times; A-1D: oscillation for 1 day; A-3 D: oscillation for 3 days

[0535] 4.4.4 Molecule concentration of ADC

[0536] As shown in Table 26, compared with T0, there was no significant change in the molecule concentrations of ADC for the liquid samples of the three formulae (Fe01-Fe03) after stroing at 40 ℃ or 25 ℃ for 4 weeks, 5 cycles of freeze-thawing or oscillation at 25 ℃ for 3 days. The lyophilized samples were placed at 40℃ for 12 weeks without significant change in the molecule concentration of ADC.

[0537] Table 26. Summerized results of the concentration in auxiliary materials screening investigation

[0538] 4.4.5 pH value

[0539] As shown in Table 27, there was no significant change in the pH of the liquid samples of the three formulae (Fe01-Fe03) after being placed at 40 ℃ or 25 ℃ for 4 weeks, 5 cycles of freeze-thawing or 3 days of oscillation at 25 ℃ compared with T0. Lyophilized samples were placed at 40℃ for 12 weeks without significant change in pH.

[0540] Table 27. Summerized results of the pH value in auxiliary materials screening investigation

[0541] 4.4.6 Insoluble particles (HIAC)

[0542] As shown in Table 28, there was no significant change in the insoluble particles of the liquid samples of the three formulae (Fe01-Fe03) during the five cycles of freeze-thawing compared with T0. However, the insoluble particles of Fe03 increased significantly after oscillation at 25℃ for 3 days, and the remaining samples (Fe01-Fe02) did not change significantly. The 3 formulations (Fe01-Fe03) were placed at a high temperature of 40 ℃ for 2 weeks, and the particles increased significantly. The insoluble particulates of the samples of the 3 formulae (Fe01-Fe03) increased slightly after lyophilization. After lyophilization, the samples were placed at a high temperature of 40℃ for 2 weeks, 4 weeks and 12 weeks, and there was no significant change in the insoluble particles for Fe01, while the insoluble particlesfor Fe02 and Fe03 increased significantly.

[0543] Table 28. Summerized results of HIAC in auxiliary materials screening investigation

[0544] 4.4.7 Purity of size exclusion chromatography SE-HPLC

[0545] As shown in Table 29, compared with T0, there was no significant change in the SE-HPLC monomers for the liquid samples of the 3 formulae (Fe01-Fe03) after 5 cycles of freeze-thawing or 3 days of oscillation at 25 ℃. However, the purity of SE-HPLC decreased significantly after being placed at 40℃ or 25℃ for 4 weeks. There was no significant change in the purity of SE-HPLC for the samples of the three formulae after lyophilization. After the lyophilized samples were placed at 40℃ for 2, 4, and 12 weeks, the purity of SE-HPLC for Fe01, Fe02, and Fe03 decreased by 1.3%, 2.0%, and 5.4%, respectively,

[0546] Table 29. Summerized results of the SE-HPLC in auxiliary materials screening investigation

[0547] 4.4.8 Charge variants iCIEF

[0548] As shown in Table 30, compared with T0, there was no significant change in the iCIEF main peaks for the three formulae after being placed at 25 ℃ for 4 weeks, 5 cycles of freeze-thawing or oscillation at 25 ℃for 3 days. After being placed at 40 ℃ for 4 weeks, the iCIEF main peak of the three formulae (Fe01-Fe03) decreased by 9.8%-11.8%. After lyophilization, there was no significant change in the iCIEF main peak for the three formulae (Fe01-Fe03) . The lyophilized samples were placed at 40℃ for 2 weeks, 4 weeks, and 12 weeks, and after 12 weeks, the iCIEF main peak for the 3 formulae (Fe01-Fe03) decreased by 2.0%-3.1%.

[0549] Table 30. Summerized results of the iCIEF in auxiliary materials screening investigation

[0550] 4.4.9 Purity of reduced capillary electrophoresis Caliper-R

[0551] As shown in Table 31, compared with T0, there was no significant change in the purity of Caliper-R for the 3 formulae (Fe01-Fe03) after being placed at 25 ℃ for 4 weeks, 5 cycles of freeze-thawing, oscillation at 25 ℃ for 3 days . However, the purity of Caliper-R slightly decreased when the liquid samples were placed at 40℃ for 4 weeks and the lyophilized samples were placed at 40℃ for 12 weeks.

[0552] Table 31. Summerized results of the Caliper-R in auxiliary materials screening investigation

[0553] 4.4.10 Purity of non-reduced capillary electrophoresis Caliper-NR

[0554] As shown in Table 32, compared with T0, there was no significant change in the purity of Caliper-NR of the liquid samples for the three formulae (Fe01-Fe03) after being placed at 25℃ for 4 weeks, 5 cycles of freeze-thawing or oscillation at 25 ℃ for 3 days. After being placed at 40℃ for 4 weeks, the purity of Caliper-NR for the 3 formulae (Fe01-Fe03) decreased by 5.3%-5.5%. After being placed at 40℃ for 12 weeks, the purity of Caliper-NR of the lyophilized samples for the 3 formulae (Fe01-Fe03) decreased by 0.9%-2.9%.

[0555] Table 32. Summerized results of the Caliper-NR in auxiliary materials screening investigation

[0556] 4.4.11 Free drug

[0557] As shown in Table 33, compared with T0, there was no significant change in the free drug for the three formulae (Fe01-Fe03) after the liquid samples were placed at 25℃ for 2 weeks, freeze-thawed for 5 cycles or oscillated at 25 ℃ for 3 days. However, the free drug increased by 1.4%-4.5%after being placed at 25℃ for 4 weeks, the free drug increased by 26.3%-33.7%after being placed at 40℃ for 2 weeks, or the free drug of the 3 formulae (Fe01-Fe03) significantly increased by 41.6%-50.1%after 4 weeks. The lyophilized samples were placed at 40℃ for 2 weeks, 4 weeks and 12 weeks, there was no significant change in the free drug after 4 weeks, and the free drug of the 3 formulae (Fe01-Fe03) increased by 0.9%-4.2%after 12 weeks.

[0558] Table 33. Summerized results of the free drug in auxiliary materials screening investigation

[0559] 4.4.12 Drug-to-antibody ratio DAR

[0560] As shown in Table 34, compared with T0, there was no significant change in the DAR values for the three formulae (Fe01-Fe03) after the liquid samples were placed at 25℃ for 4 weeks, freeze-thawed for 5 cycles or oscillated at 25℃ for 3 days. However, the DAR value decreased by 0.95-1.12 after being placed at 40℃ for 2 weeks, and the DAR value of the 3 formulae (Fe01-Fe03) decreased by 1.51-1.74 after 4 weeks. The lyophilized samples were placed at 40℃ for 2 weeks, 4 weeks and 12 weeks, there was no significant change in the DAR value after 4 weeks, and the DAR value of the 3 formulae (Fe01-Fe03) decreased by 0.41-0.56 after 12 weeks.

[0561] Table 34. Summerized results of the DAR in auxiliary materials screening investigation

[0562] 4.4.13 Binding activity

[0563] As shown in Table 35, the binding activity of the samples were tested at week 2 and week 4. Compared with T0, there was no significant change in the activity when the liquid samples were placed at 25℃ for 2 weeks, at lyophilized T0 and placed at 40℃ for 2 weeks and 4 weeks after lyophilization.

[0564] Table 35. Summerized results of the activity in auxiliary materials screening

[0565] Notes: *represents measured activivties. T0, 25℃-2W, Lyo-T0, Lyo-40℃-2W exhibited IC50 values.

[0566] 4.4.14 Summary

[0567] Based on the overall results and the above analysis, the stability of Fe01 (20 mM histidine / histidine hydrochloride, 8% (w / v) sucrose, 0.02% (w / v) polysorbate 80, pH 6.5) was better than the rest of the formulae, Fe01 was thus selected as the formula of formulation.

[0568] 5. Formula confirmation

[0569] 5.1 Purpose of the experiment

[0570] The lyophilized samples were prepared using the formula screened in the auxiliary materials screening stage, and the final formula and lyophilization process were confirmed by long-term (2 -8 ℃) , accelerated (25 ±2 ℃) and high temperature (40 ±2 ℃) stability experiments on the lyophilized samples.

[0571] 5.2 Experimental protocol

[0572] Through long-term (2 -8 ℃) , accelerated (25 ± 2 ℃) and high temperature (40 ± 2 ℃) stability experiments, the stability of the lyophilized formulations was performed for DP formula (final product formula) obtained from the auxiliary materials screening to confirm the final formula, and the stability protocols are shown in Table 36.

[0573] Table 36. Protocls for DP formula confirmation

[0574] 5.3 Sample preparation

[0575] The 20 mg / mL stock solution was divided into 20 mL vials at 5.6 mL / bottle. The 40mg / ml was divided into 20mL vials at 5.6 ml / bottle. The vials were semi-stoppered and then lyophilized, and the lyophilization process is shown in Table 37. The lyophilized DP was placed under different test conditions (5℃ long-term experiment, 25℃ accelerated experiment and 40℃ high-temperature experiment) as described in Table 36 and sampled for detection at the specified time. 3 vials of DP at each time point were placed.

[0576] Table 37. Lyophilization process parameters of DP

[0577] 5.4 Results and discussion

[0578] The results of stability experiments under long-term, accelerated and high-temperature conditions are summarized in Table 38.

[0579] The results showed that: after the samples with a IEX019-02 concentration of 20 mg / mL and 40 mg / mL were investigated at 2-8 ℃ for 12 weeks, the appearance before reconstitution did not change significantly compared with that at T0 before reconstitution, the appearance after reconstitution did not change significantly compared with that of T0, and all of the pH value, ADC concentration, reconstitution time, moisture, drug-to-antibody ratio, purity of size exclusion chromatography, purity of non-reduced capillary electrophoresis, purity of reduced capillary electrophoresis, insoluble particles, charge variants and free drugs did not change significantly, which indicated that the sample was stable under the condition of 2-8℃.However, the sample with a IEX019-02 concentration of 20 mg / mL had a shorter reconstitution time than the sample with a concentration of 40 mg / mL.

[0580] After the samples with a IEX019-02 concentration of 20 mg / mL were investigated at 25 ℃ under accelerated condition for 12 weeks, there was no significant change in appearance before and after  reconstitution compared with that of T0; and all of the pH value, protein concentration, reconstitution time, moisture, drug-to -antibody ratio, purity of size exclusion chromatography, purity of non-reduced capillary electrophoresis, purity of reduced capillary electrophoresis, insoluble particles, charge variants and free drugs did not change significantly.

[0581] After the samples with a IEX019-02 concentration of 20 mg / mL and 40 mg / mL were investigated under high-temperature condition of 40 ℃ for 4 weeks, there was no significant change in appearance before and after reconstitution compared with that of T0; and all of the pH value, protein concentration, moisture, drug-to-antibody ratio, purity of size exclusion chromatography, purity of non-reduced capillary electrophoresis, purity of reduced capillary electrophoresis, insoluble particles, charge variants and free drugs did not change significantly. However, the sample with a IEX019-02 concentration of 20 mg / mL had a shorter reconstitution time than the sample with a molecular concentration of ADC of 40 mg / mL.

[0582] In summary, the formulae for formulation obtained by screening showed good stability during 12 weeks of long-term storage (2-8 ℃) , and the key qualitative properties shown in the acceleration and high temperature stability experiments did not change significantly compared with T0. So, it was confirmed that the formula for formulation of "20 mg / ml ADC, 20 mM histidine buffer, 8% (w / v) sucrose, 0.02% (w / v) polysorbate 80, pH 6.5" is suitable.

[0583] Sequence informations:

Claims

1.A pharmaceutical formulation comprising (i) an antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 or a pharmaceutically acceptable salt or a solvate thereof; (ii) a buffer, (iii) a stabilizer, and / or (iv) a surfactant;wherein the pH of the pharmaceutical formulation is about 5.5-7.5, preferably about 6.0-6.5, more preferably about 6.5.2.The pharmaceutical formulation accroding to claim 1, wherein the antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 is selected from: wherein Ab is an antibody or an antigen-binding fragment thereof targeting Claudin18.2;wherein q represents an average DAR,in IEX019-02, IEX019-04, IEX019-05, q is 2-5, for example 3-5 or 3.5-4.5, in IEX019-03, q is 5-11, for example 7-9 or 7.5-8.5.3.The pharmaceutical formulation accroding to claim 1, wherein the antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 is selected from: wherein Ab is an antibody or an antigen-binding fragment thereof targeting Claudin18.2, andin formula I-A, y is an integer of 1 or 2,in formula I-B, I-C or I-D, y is an integer of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.4.The pharmaceutical formulation accroding to claim 2 or 3, wherein the antibody or an antigen-binding fragment thereof targeting to Claudin18.2 comprise a HCDR1, a HCDR2, a HCDR3 respectively consisting of amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 1, 2 and 3, as well as an LCDR1, an LCDR2 and an LCDR3 respectively consisting of amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 6, 7 and 8;preferably, the antibody or an antigen-binding fragment thereof targeting to Claudin18.2 comprises a heavy chain variable region and / or a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region(i) comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; or(ii) comprises or consists an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the amino acid set forth in SEQ ID NO: 4; or(iii) comprises or consists of an amino acid sequence having one or more (preferably no more than 10, and more preferably no more than 5, 4, 3, 2, or 1) amino acid alterations (preferably amino acid replacements, and more preferably conservative amino acid replacements) compared with an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, preferably, the amino acid alterations do not occur in the CDRs; and / orthe light chain variable region(i) comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9; or(ii) comprises or consists an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the amino acid set forth in SEQ ID NO: 9; or(iii) comprises or consists of an amino acid sequence having one or more (preferably no more than 10, and more preferably no more than 5, 4, 3, 2, or 1) amino acid alterations (preferably amino acid replacements, and more preferably conservative amino acid replacements) compared with an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, preferably, the amino acid alterations do not occur in the CDRs.5.The pharmaceutical formulation accroding to any one of claims 2-4, wherein the antibody or an antigen-binding fragment thereof targeting to Claudin18.2 comprises a heavy chain and a light chain, wherein the heavy chain(i) comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11; or(ii) comprises or consists an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the amino acid set forth in SEQ ID NO: 11; or(iii) comprising or consists of an amino acid sequence having one or more (preferably no more than 20 or 10, and more preferably no more than 5, 4, 3, 2, or 1) amino acid alterations (preferably amino acid replacements, and more preferably conservative amino acid replacements) compared with an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11; and / orthe light chain(i) comprises or consists of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12; or(ii) comprises or consists an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%identity to the amino acid set forth in SEQ ID NO: 12; or(iii) comprises or consists of an amino acid sequence having one or more (preferably no more than 20 or 10, and more preferably no more than 5, 4, 3, 2, or 1) amino acid alterations (preferably amino acid replacements, and more preferably conservative amino acid replacements) compared with an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12.6.The pharmaceutical formulation accroding to any one of claims 1-5, wherein the pharmaceutical formulation comprises about 1-200 mg / ml, preferably15-60 mg / ml, more preferably about 20-40 mg / mL of the antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 or or the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.7.The pharmaceutical formulation accroding to any one of claims 1-6, wherein the pharmaceutical formulation comprises about 1-100 mM, preferably about 5-50mM, more preferably about 10-30mM of the buffer.8.The pharmaceutical formulation accroding to any one of claims 1-7, wherein the pharmaceutical formulation comprises about 10-200 mg / ml, preferably about 50-100 mg / ml, more preferably about 60-90 mg / ml of the stabilizer.9.The pharmaceutical formulation accroding to any one of claims 1-8, wherein the pharmaceutical formulation comprises about 0.01-5 mg / ml, preferably about 0.05-1 mg / ml, more preferably about 0.1-0.3 mg / ml of the surfactant.10.The pharmaceutical formulation accroding to any one of claims 1-9, wherein the buffer is selected from one or more of histidine, citric acid, succinic acid, glutamic acid, phosphoric acid, acetic acid or a salt thereof;preferably, the buffer is a combination of histidine and histidine hydrochloride, or histidine.11.The pharmaceutical formulation accroding to any one claims 1-10, wherein the stabilizer is selected from one or more of carbohydrates, and polyols;preferably, the carbohydrates are selected from sucrose, trehalose, glucose, lactose, maltose, cyclodextrin, maltodextrin and dextran, and the polyols are selected from mannitol, sorbitol and xylitol;more preferably, the stabilizer is selected from sucrose, trehalose, mannitol or a combination thereof.12.The pharmaceutical formulation accroding to any one of claims 1-11, wherein the surfactant is selected from alkyl poly (ethylene oxide) , polysorbate, pluronics or a combination thereof;preferably, the surfactant is selected from polysorbate-20, polysorbate-80, polysorbate-60, or polysorbate-40.13.The pharmaceutical formulation accroding to any one of claims 1-12, wherein the pharmaceutical formulation comprises:(i) about 20-40 mg / ml of the antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 or the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof;(ii) about 20 mM of the buffer;(iii) about 60-90 mg / ml of the stabilizer;(iv) about 0.1-0.3 mg / ml of the surfactant.14.The pharmaceutical formulation accroding to any one of claims 1-13, wherein,the buffer is a combination of histidine and histidine hydrochloride, or is histidine;the stabilizer is sucrose; trehalose; or a combination of sucrose and mannitol; and / orthe surfactant is polysorbate 80.15.The pharmaceutical formulation accroding to any one of claims 1-14, wherein the pharmaceutical formulation comprises:(i) about 20-40 mg / ml of the antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 or the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof;(ii) about 20 mM of the buffer; the buffer is a combination of histidine and histidine hydrochloride, or is histidine;(iii) about 60-90 mg / ml of the stabilizer; the stabilizer is sucrose; trehalose; or a combination of sucrose and mannitol; and(iv) about 0.1-0.3 mg / ml of polysorbate 80;wherein the pH of the formulation is about 6.0-6.5, preferably about 6.5.16.The pharmaceutical formulation accroding to any one of claims 1-14, wherein the pharmaceutical formulation comprises:(i) about 20mg / ml of the antibody-drug conjugate targeting Claudin18.2 or the pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof;(ii) about 20 mM of the buffer; the buffer is a combination of histidine and histidine hydrochloride, or is histidine;(iii) about 8% (w / v) of the stabilizer; the stabilizer is sucrose; trehalose; or a combination of sucrose and mannitol; and(iv) about 0.02% (w / v) of polysorbate 80;wherein the pH of the formulation is about 6.5.17.A lyophilized pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate, the lyophilized pharmaceutical formulation forms the pharmaceutical formulation according to any one of claims 1-16 after reconstitution.18.The lyophilized formulation comprising an antibody-drug conjugate accroding to claim 17, wherein the lyophilized pharmaceutical formulation is prepared by lyophilizing the pharmaceutical formulation according to any one of claims 1-17.19.A lyophilized pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate comprising(i) about 1%-60% (w / w) , preferably about 15%-40% (w / w) of an antibody-drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt or a solvate thereof;(ii) about 0.5%-10% (w / w) , preferably about 2%-5% (w / w) of a buffer;(iii) about 20%-90% (w / w) , preferably about 50%-85% (w / w) of a stabilizer; and / or(iv) about 0.05%-2% (w / w) , preferably about 0.1%-0.5% (w / w) of a surfactant;wherein the antibody-drug conjugate, the buffer, the stabilizerand / or the surfactant are as defined in claims 1-16.20.A liquid pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate, the liquid pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate is obtained by reconstituting the lyophilized pharmaceutical formulation according to claims 17-19 with a vehicle , which has a pH of about 5.5-7.5, preferably about 6.0-6.5, more preferably 6.5.21.The liquid pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate accroding to claim 20, wherein the liquid pharmaceutical formulation is used for injection or infusion administration, for example for intravenous injection, subcutaneous injection or intramuscular injection.22.A delivery device comprising the pharmaceutical formulation of any one of claims 1-16, or the lyophilized pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate of any one of claims 17-19, or the liquid pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate of claim 20 or 21.23.A pre-filled syringe comprising the pharmaceutical formulation of any one of claims 1-16, the lyophilized pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate of any one of  claims 17-19, or the liquid pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate of claim 20 or 21, for use in intravenous injection, subcutaneous injection or intramuscular injection.24.The use of the pharmaceutical formulation of any one of claims 1-16, or the lyophilized pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate of any one of claims 17-19, or the liquid pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate of claim 20 or 21, in the manufacture of a medicament, preferably the medicament is used for treating or preventing tumor,more preferably, the tumor is cancer, for example epithelial cancer or digestive tract cancer, for example gastric cancer, gastroesophageal junction cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer or colon cancer.25.A pharmaceutical combination comprising the pharmaceutical formulation of any one of claims 1-16, or the lyophilized pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate of any one of claims 17-19, or the liquid pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate of claim 20 or 21, as well as one or more other therapeutic agents, for example chemotherapeutic agents, angiogenesis inhibitors, cytokines, cytotoxic agents, other antibodies, small molecule drugs or immunomodulators.26.A kit of parts comprising the pharmaceutical formulation of any one of claims 1-16, or the lyophilized pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate of any one of claims 17-19, or the liquid pharmaceutical formulation comprising an antibody-drug conjugate of claim 20 or 21, or the pharmaceutical combination of claim 25, preferably the kit in the form of a drug dosage unit.

Images