Masked antigen-binding constructs and methods of making thereof

Abstract

Provided are masked antigen-binding constructs that contain alpha-helix masks and methods of making masked antigen-binding constructs. In one aspect, the methods involve a computer-aided method for designing the alpha-helix masks.

Description

MASKED ANTIGEN-BINDING CONSTRUCTS AND METHODS OF MAKING THEREOFTECHNICAL FIELD

[0001] The disclosure relates to masked antigen-binding constructs that contain an alpha-helix mask and methods of making masked antigen-binding constructs.BACKGROUND

[0002] Although the binding of antigen-binding constructs (e.g., antibodies and antigen-binding fragments thereof) to their intended targets is often specific, most target molecules are not specific to the disease site and may be present in cells or tissues outside the disease site.

[0003] These off-target effects may be overcome by adding inhibitory or masking domains to the antigen-binding constructs via cleavable linkers. These linkers can be designed to be cleaved by enzymes specific to certain tissues or pathologies, allowing the masked antigen-binding constructs to be preferentially activated at the desired location. However, these inhibitory or masking domains that work for one antigen-binding construct often cannot work effectively for another, and adding a big protein domain to the antigen-binding construct can often lead to manufacturing problems. There is a need for effectively designing these inhibitory or masking domains for any given antigen-binding construct.SUMMARY

[0004] The present disclosure provides an activatable masked antigen-binding constructs in which an alpha-helix mask is added to an antigen-binding construct. Alpha-helix is one of the main forms of protein secondary structure, and the main chain of the polypeptide chain revolves around the central axis in a regular spiral. In an alpha-helix, the R groups of amino acids point to the outside and down to avoid steric hindrance with the backbone of the polypeptide chain. The core part of alpha-helix is tightly bound, and the atoms are linked together by van der Waals force. Since alpha-helix has a stable secondary structure, the scoring of screening processes such as structure prediction and molecular docking is more reliable. The present disclosure provides an alpha-helix mask can form a stable steric hindrance with the antigen-binding domain of a masked antigen-binding construct. This structure effectively blocks the antigen-binding ability of the masked antigen-binding  construct in normal tissues and selectively “turns on” the activity of the masked antigen-binding construct (e.g., antibody or antigen-binding fragment thereof) to bind to the target molecule in diseased tissue.

[0005] This alpha-helix mask can effectively prevent the masked antigen-binding construct from binding to its intended target until the alpha-helix mask is cleaved or otherwise removed. In other words, the alpha-helix mask masks the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct so that it cannot interact with its target. In some embodiments, following administration of the masked antigen-binding constructs to a patient, the alpha-helix mask can be removed (e.g., cleaved) by one or more molecules (e.g., proteases) present in the in vivo environment. In other uses, for example, when used non-therapeutically, the alpha-helix mask can be removed by adding one or more proteases to the medium in which the masked antigen-binding construct is used. Removal of the alpha-helix mask restores the ability of the masked antigen-binding construct to bind to its target, enabling specific targeting of the masked antigen-binding construct (e.g., antibody or antigen-binding fragment thereof) .

[0006] In one aspect, the disclosure is related to a masked antigen-binding domain, comprising

[0007] (a) an antigen-binding domain, and

[0008] (b) an alpha-helix mask,

[0009] wherein the alpha-helix mask comprises an alpha-helix coil, wherein the alpha-helix mask is linked to the antigen-binding domain, optionally by a single covalent bond, and blocks the interaction between the antigen-binding domain and its target antigen.

[0010] In one aspect, the disclosure is related to a masked antigen-binding domain, comprising

[0011] (a) an antigen-binding domain, and

[0012] (b) an alpha-helix mask,

[0013] wherein the alpha-helix mask comprises an alpha-helix coil, wherein the alpha-helix mask is linked to the antigen-binding domain by a single covalent bond and blocks the interaction between the antigen-binding domain and its target antigen.

[0014] In some embodiments, the alpha-helix mask may contain two or more alpha-helix coils (e.g., 2, 3, 4, or 5 alpha-helix coils) . In some embodiments, the two or more alpha-helix coils are linked together in a polypeptide, optionally with a linker sequence between adjoining alpha-helix coils.

[0015] In some embodiments, the alpha-helix coil does not form a coiled coil structure that is  linked to the antigen-binding domain by multiple covalent bonds.

[0016] In some embodiments, the alpha-helix mask comprises a single alpha-helix coil.

[0017] In one aspect, the disclosure is related to a masked antigen-binding domain, comprising

[0018] (a) an antigen-binding domain, and

[0019] (b) an alpha-helix mask,

[0020] wherein the alpha-helix mask comprises a single polypeptide comprising an alpha-helix coil.

[0021] In some embodiments, the masked antigen-binding domain further comprises a cleavable linker between (a) the antigen-binding domain, and (b) the alpha-helix mask.

[0022] In some embodiments, the cleavable linker can be cleaved by an enzyme to release the alpha-helix mask from the masked antigen-binding domain.

[0023] In some embodiments, the enzyme is an enzyme that is present in a tumor microenvironment (e.g., a matrix metalloproteinase) .

[0024] In some embodiments, the antigen-binding domain comprises (1) a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) , or (2) a VHH.

[0025] In some embodiments, the alpha-helix mask is linked to the N-terminus of the VH, the VL, or the VHH. In some embodiments, the alpha-helix mask is linked to the C-terminus of the VH, the VL, or the VHH.

[0026] In one aspect, the disclosure is related to a masked antigen-binding construct, comprising

[0027] (a) an antigen-binding domain, and

[0028] (b) an alpha-helix mask,

[0029] wherein the alpha-helix mask comprises an alpha-helix coil, wherein the alpha-helix mask is linked to the masked antigen-binding construct by a single covalent bond and blocks the interaction between the antigen-binding domain and its target antigen.

[0030] In some embodiments, the alpha-helix coil does not form a coiled coil structure that is linked to the masked antigen-binding construct by multiple covalent bonds.

[0031] In some embodiments, the alpha-helix mask comprises a single alpha-helix coil.

[0032] In one aspect, the disclosure is related to a masked antigen-binding construct, comprising

[0033] (a) an antigen-binding domain, and

[0034] (b) an alpha-helix mask,

[0035] wherein the alpha-helix mask comprises a single polypeptide comprising an  alpha-helix coil.

[0036] In some embodiments, the masked antigen-binding construct further comprises a cleavable linker between (a) the antigen-binding domain, and (b) the alpha-helix mask.

[0037] In some embodiments, the cleavable linker can be cleaved by an enzyme to release the alpha-helix mask from the masked antigen-binding construct.

[0038] In some embodiments, the enzyme is an enzyme that is present in a tumor microenvironment (e.g., a matrix metalloproteinase) .

[0039] In some embodiments, the masked antigen-binding construct comprises

[0040] (a) a first polypeptide comprising an alpha-helix mask, a cleavable linker, a VH; and

[0041] (b) a second polypeptide comprising a VL,

[0042] wherein the alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the first polypeptide.

[0043] In some embodiments, the masked antigen-binding construct further comprises a third polypeptide comprising a VHH.

[0044] In some embodiments, an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the third polypeptide.

[0045] In some embodiments, the masked antigen-binding construct further comprises a third polypeptide comprising a VH and VL.

[0046] In some embodiments, an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the third polypeptide.

[0047] In some embodiments, the masked antigen-binding construct further comprises:

[0048] (c) a third polypeptide comprising a VH; and

[0049] (d) a fourth polypeptide comprising a VL.

[0050] In some embodiments, an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the third polypeptide.

[0051] In some embodiments, the masked antigen-binding construct comprises

[0052] (a) a first polypeptide comprising an alpha-helix mask, a cleavable linker, a VL; and

[0053] (b) a second polypeptide comprising a VH,

[0054] wherein the alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the first polypeptide.

[0055] In some embodiments, the masked antigen-binding construct further comprises a third polypeptide comprising a VHH.

[0056] In some embodiments, an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the  C-terminus of the third polypeptide.

[0057] In some embodiments, the masked antigen-binding construct further comprises a third polypeptide comprising a VH and VL.

[0058] In some embodiments, an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the third polypeptide.

[0059] In some embodiments, the masked antigen-binding construct further comprises:

[0060] (c) a third polypeptide comprising a VH; and

[0061] (d) a fourth polypeptide comprising a VL.

[0062] In some embodiments, an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the fourth polypeptide.

[0063] In some embodiments, the masked antigen-binding construct comprises a first polypeptide comprising an alpha-helix mask, a cleavable linker, a VH and a VL, wherein the alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the first polypeptide.

[0064] In some embodiments, the masked antigen-binding construct further comprises a second polypeptide comprising a VHH.

[0065] In some embodiments, an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the second polypeptide.

[0066] In some embodiments, the masked antigen-binding construct further comprises a second polypeptide comprising a VH and VL.

[0067] In some embodiments, an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the second polypeptide.

[0068] In some embodiments, the masked antigen-binding construct further comprises a second polypeptide comprising a VH and a third polypeptide comprising a VL.

[0069] In some embodiments, the masked antigen-binding construct comprises a first polypeptide comprising an alpha-helix mask, a cleavable linker, and a VHH, wherein the alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the first polypeptide.

[0070] In some embodiments, the masked antigen-binding construct further comprises a second polypeptide comprising a VHH.

[0071] In some embodiments, an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the second polypeptide.

[0072] In some embodiments, the masked antigen-binding construct further comprises a second polypeptide comprising a VH and VL.

[0073] In some embodiments, an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the second polypeptide.

[0074] In some embodiments, the masked antigen-binding construct further comprises: asecond polypeptide comprising a VH and a third polypeptide comprising a VL.

[0075] In some embodiments, the alpha-helix mask has not more than 150 amino acids.

[0076] In some embodiments, the alpha-helix mask has not more than 100 amino acids.

[0077] In some embodiments, the alpha-helix mask has no more than 50 amino acids.

[0078] In some embodiments, the alpha-helix mask has 5-40 amino acids.

[0079] In some embodiments, the alpha-helix mask has 5-20 amino acids.

[0080] In some embodiments, the alpha-helix mask has one or more parameters that meet a threshold level.

[0081] In some embodiments, the one or more parameters are selected from the group consisting of (1) alpha-helix pLDDT (predicted Local Distance Difference Test) , (2) alpha-helix pTM score (predicted template modeling score) , (3) ipTM score (interface pTM score) between alpha-helix and the CDR region, and (4) an average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR region.

[0082] In some embodiments, the value of the alpha-helix pLDDT is greater than 55.

[0083] In some embodiments, the value of the alpha-helix pTM score is greater than 0.5.

[0084] In some embodiments, the value of the ipTM score between alpha-helix and the CDR region is greater than 0.6, more preferably greater than 0.8.

[0085] In some embodiments, the value of the average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR region is less than  more preferably less than

[0086] In some embodiments, the value of the average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR region is less than  and the value of the ipTM score is greater than 0.6.

[0087] In some embodiments, the value of the average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR region is less than  and the value of the ipTM score is greater than 0.8.

[0088] In some embodiments, the masked antigen-binding domain or the masked antigen-binding construct comprises only one alpha-helix mask.

[0089] In some embodiments, the masked antigen-binding domain or the masked antigen-binding construct comprises two alpha-helix masks, wherein the two alpha-helix masks are linked to the two different antigen binding domains, respectively.

[0090] In some embodiments, the alpha-helix coil comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 12, 16, 18 or 20, or an amino acid sequence that is at least 95%, 97%, or  99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 12, 16, 18 or 20.

[0091] In some embodiments, the cleavable linker comprises a first linker, a cleavable site and a second linker, wherein the cleavable site comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or 24, or an amino acid sequence that is at least 95%, 97%, or 99%identical to SEQ ID NO: 14 or 24.

[0092] In some embodiments, the first linker and / or the second linker comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13, 21, or 23, or an amino acid sequence that is at least 95%, 97%, or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13, 21, or 23.

[0093] In one aspect, the disclosure is related to a nucleic acid comprising a nucleic acid sequence encoding the masked antigen-binding domain described herein or the masked antigen-binding construct described herein.

[0094] In one aspect, the disclosure is related to a vector comprising the nucleic acid described herein.

[0095] In one aspect, the disclosure is related to a cell comprising the nucleic acid described herein or the vector described herein.

[0096] In one aspect, the disclosure is related to a method of producing a masked antigen-binding domain or a masked antigen-binding construct, the method comprising culturing the cell described herein.

[0097] In one aspect, the disclosure is related to a masked antibody-drug conjugate (ADC) comprising a therapeutic agent covalently bound to the masked antigen-binding domain described herein or the masked antigen-binding construct described herein.

[0098] In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent.

[0099] In one aspect, the disclosure is related to a nucleotide therapy comprising the nucleic acid described herein.

[0100] In one aspect, the disclosure is related to a cellular therapy comprising the masked antigen-binding domain described herein or the masked antigen-binding construct described herein.

[0101] In one aspect, the disclosure is related to a fusion protein, comprising (1) a cytokine, and (2) the masked antigen-binding domain described herein or the masked antigen-binding construct described herein.

[0102] In one aspect, the disclosure is related to a method of treating a subject having cancer, the method comprising administering, to a subject in need thereof, a therapeutically effective amount of a composition comprising the masked antigen-binding domain described herein,  the masked antigen-binding construct described herein, the ADC described herein, the nucleotide therapy described herein, the cellular therapy described herein, or the fusion protein described herein.

[0103] In one aspect, the disclosure is related to a computer-implemented method for producing a masked antigen-binding construct, the method comprising:

[0104] (a) providing information of a starting antigen-binding domain;

[0105] (b) generating candidate alpha-helix masks that can bind to a CDR region of the starting antigen-binding domain;

[0106] (c) assembling, in silico, the candidate alpha-helix masks from step (b) in the form of a masked antigen-binding construct that comprises the starting antigen-binding domain, and one of the candidate alpha-helix masks;

[0107] (d) performing structure prediction; and

[0108] (e) selecting a masked antigen-binding construct having one or more parameters that meet a threshold level.

[0109] In some embodiments, the one or more parameters are selected from the group consisting of (1) alpha-helix pLDDT (predicted Local Distance Difference Test) , (2) alpha-helix pTM score (predicted template modeling score) , (3) ipTM score (interface pTM score) between alpha-helix and the CDR region, and (4) an average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR region.

[0110] In some embodiments, the value of the alpha-helix pLDDT is greater than 55.

[0111] In some embodiments, the value of the alpha-helix pTM score is greater than 0.5.

[0112] In some embodiments, the value of the ipTM score between alpha-helix and the CDR region is greater than 0.6, more preferably greater than 0.8.

[0113] In some embodiments, the value of the average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR region is less than  more preferably less than

[0114] In some embodiments, the value of the average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR region is less than  and the value of the ipTM score is greater than 0.8. In some embodiments, the value of the average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR region is less than  and the value of the ipTM score is greater than 0.6.

[0115] In some embodiments, step (b) is performed using a protein language model (PLM) or a diffusion model design.

[0116] In some embodiments, step (d) is performed using a fast folding software.

[0117] In some embodiments, the fast folding software is selected from the group consisting of Alphafold2, ESMFold, and OmegaFold.

[0118] In some embodiments, at least 100 or 1000 antigen-binding constructs are generated in silico.

[0119] In some embodiments, the method further comprises making a vector comprising a nucleic acid sequence encoding the masked antigen-binding construct; and expressing the masked antigen-binding construct.

[0120] In one aspect, the disclosure is related to one or more machine-readable hardware storage devices for storing instructions that are executable by one or more data processing devices to perform the method described herein.

[0121] In one aspect, the disclosure is related to a system comprising:

[0122] one or more data processing devices; and

[0123] one or more machine-readable hardware storage devices that store instructions that are executable by the one or more data processing devices to execute the method described herein.

[0124] In some embodiments, the system further comprises one or more devices for making and expressing nucleic acid sequences.

[0125] In one aspect, the present disclosure provides a masked antigen-binding construct (e.g., antibody or antigen-binding fragment thereof) comprising at least one alpha-helix mask. In some embodiments, in a VH and VL pair, the alpha-helix is linked to the N-or C-terminus of the VH and not linked to the VL, or the alpha-helix is connected to the N-terminal or C-terminal of VL, and not connected to VH. In some embodiments, the alpha-helix is connected to the N-terminal or C-terminal of VHH. In some embodiments, the alpha-helix mask does have a coiled coil structure.

[0126] In some embodiments, in the masked antigen-binding construct, the alpha-helix mask can (1) provide steric hindrance due to its helical structure, and (2) have binding affinity to the target antigen of the antigen-binding construct.

[0127] In one aspect, the disclosure is related to a masked antigen-binding domain, comprising

[0128] (a) an antigen-binding domain, and

[0129] (b) an alpha-helix mask,

[0130] wherein the alpha-helix mask comprises an alpha-helix coil, wherein the alpha-helix mask is linked to the antigen-binding domain, optionally by a single covalent bond, and blocks the interaction between the antigen-binding domain and its target antigen.

[0131] In some embodiments, (1) the alpha-helix coil does not form a coiled coil structure that is linked to the antigen-binding domain by multiple covalent bonds; and / or (2) the alpha-helix coil specifically binds to the antigen-binding domain.

[0132] In some embodiments, the alpha-helix mask comprises a single alpha-helix coil, or one or more alpha-helix coils (e.g., 2, 3, 4, or 5 alpha-helix coils) .

[0133] In one aspect, the disclosure is related to an alpha-helix mask comprising: one or more alpha-helix peptides, wherein the one or more alpha-helix peptides are capable of specifically binding to an antigen-binding domain of an antibody or antibody fragment.

[0134] In some embodiments, the binding of the alpha-helix peptides to the antigen-binding domain is non-covalent.

[0135] In one aspect, the disclosure is related to a mask comprising: one or more alpha-helix peptides, and one or more loop peptides wherein the one or more loop peptides are capable of specifically binding to an antigen-binding domain of an antibody or antibody fragment.

[0136] In one aspect, the disclosure is related to a masked antigen-binding domain, comprising (a) an antigen-binding domain, and (b) an alpha-helix mask described herein, wherein the alpha-helix mask comprises an alpha-helix coil, wherein the alpha-helix mask is linked to the antigen-binding domain by one or more cleavable linker and blocks the interaction between the antigen-binding domain and its target antigen.

[0137] As used herein, the term “antibody” refers to any antigen-binding molecule that contains at least one (e.g., one, two, three, four, five, or six) complementary determining region (CDR) (e.g., any of the three CDRs from an immunoglobulin light chain or any of the three CDRs from an immunoglobulin heavy chain) and is capable of specifically binding to an epitope. Non-limiting examples of antibodies include: monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multi-specific antibodies (e.g., bi-specific antibodies) , single-chain antibodies, single variable domain (VHH) antibodies, chimeric antibodies, human antibodies, and humanized antibodies. An antibody may contain an Fc region of a human antibody. The term antibody also includes derivatives, e.g., bi-specific antibodies, single-chain antibodies, diabodies, linear antibodies, and multi-specific antibodies formed from antibody fragments.

[0138] As used herein, the term “antigen-binding construct” refers to any agent capable of binding to an antigen, e.g., a polypeptide or polypeptide complex. In some embodiments, the antigen binding construct is a protein that specifically binds to the antigen of interest. The antigen binding construct can be a monomer, dimer, multimer, protein, peptide, or protein or peptide complex; antibody, antibody fragment, or antigen binding fragment thereof; scFv, and the like. An antigen-binding construct can be a polypeptide construct that is monospecific,  bispecific, or multispecific. In some aspects, an antigen binding construct may comprise, for example, one or more antigen binding components (eg, Fab or scFv) linked to one or more Fc. Additional examples of antigen binding constructs are described below and are provided in the examples. An antigen-binding construct includes antibodies and antigen-binding fragments of antibodies, including, e.g., bispecific antibodies.

[0139] As used herein, the term “antigen-binding fragment” refers to a portion of a full-length antibody, wherein the portion of the antibody is capable of specifically binding to an antigen. The antigen-binding fragment may contain at least one variable domain (e.g., a variable domain of a heavy chain or a variable domain of light chain or VHH) . Non-limiting examples of antibody fragments include, e.g., Fab, Fab’, F (ab’) 2, and Fv fragments.

[0140] As used herein, the term “antigen-binding domain” refers to the antigen-binding portion of an antibody. In some embodiments, the antigen-binding domain is formed by a VH and a VL. In some embodiments, the antigen-binding domain is formed by a VHH.

[0141] As used herein, the term “alpha-helix mask” refers to a protein structure that comprises an alpha-helix, and the alpha-helix can effectively mask the antigen binding domain and lead to a decrease in the antigen binding activity of the antigen-binding domain.

[0142] As used herein, the terms “subject” and “patient” are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human, to whom treatment according to the methods of the present disclosure is provided. Veterinary and non-veterinary applications are contemplated in the present disclosure. Human patients can be adult humans or juvenile humans (e.g., humans below the age of 18 years old) . In addition to humans, patients include but are not limited to mice, rats, hamsters, guinea-pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g., monkey, chimpanzee, gorilla, and the like) , rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits) , lagomorphs, swine (e.g., pig, miniature pig) , equine, canine, feline, bovine, and other domestic, farm, and zoo animals.

[0143] As used herein, the term “linker” refers to an amino acid sequence of two or more amino acids in length. The linker can consist of neutral polar or nonpolar amino acids. A linker can be, for example, 2 to 100 amino acids in length, such as between 2 and 50 amino acids in length, for example, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, or 50 amino acids in length. A linker can be a cleavable linker, for example, by auto-cleavage, or enzymatic or chemical cleavage. Cleavable sites (e.g., enzyme cleavage sites) in amino acid sequences and enzymes and chemicals that cleave at such sites are also described herein. Enzymatic cleavage of a “linker” or a “cleavable site” can involve the use of an endopeptidase such as, for example,  Lys-C, Asp-N, Arg-C, V8, Glu-C, chymotrypsin, trypsin, pepsin, papain, thrombin, Genenase, Factor Xa, TEV (tobacco etch virus cysteine protease) , Enterokinase, HRV C3 (human rhinovirus C3 protease) , ininogenase, as well as subtilisin-like proprotein convertases (e.g., Furin (PC I) , PC2, or PC3) or N-arginine dibasic convertase. Chemical cleavage may involve use of, for example, hydroxylamine, N-chlorosuccinimide, N-bromosuccinimide, or cyanogen bromide.

[0144] As used herein, the term “coiled coil domain” or “coiled coil” refers to a structure that is formed by two alpha-helix coils that interact with each other. The alpha helical structures may be right-handed alpha helices.

[0145] As used herein, the term “cleavable site” may refer to a substrate for a protease. The cleavage of a cleavable site may involve the use of an endopeptidase such as, for example, Lys-C, Asp-N, Arg-C, V8, Glu-C, chymotrypsin, trypsin, pepsin, papain, thrombin, Genenase, Factor Xa, TEV (tobacco etch virus cysteine protease) , Enterokinase, HRV C3 (human rhinovirus C3 protease) , ininogenase, as well as subtilisin-like proprotein convertases (e.g., Furin (PC I) , PC2, or PC3) or N-arginine dibasic convertase. The cleavage of a cleavable site may involve the use of a chemical cleavage via, for example, hydroxylamine, N-chlorosuccinimide, N-bromosuccinimide, or cyanogen bromide.

[0146] As used herein, the terms “polypeptide, ” “peptide, ” and “protein” are used interchangeably to refer to polymers of amino acids of any length of at least two amino acids.

[0147] As used herein, the terms “polynucleotide, ” “nucleic acid molecule, ” and “nucleic acid sequence” are used interchangeably herein to refer to polymers of nucleotides of any length of at least two nucleotides, and include, without limitation, DNA, RNA, DNA / RNA hybrids, and modifications thereof.

[0148] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Methods and materials are described herein for use in the present invention; other, suitable methods and materials known in the art can also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. The details of one or more embodiments of the invention are set forth in the accompanying drawings and the description below. Other features, objects, and advantages of the invention will be apparent from the description and drawings, and from the claims. The contents of any patents, patent applications, and other references cited in the  specification are hereby incorporated by reference in their entirety.

[0149] DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0150] FIGS. 1A-1J show the structure prediction maps for CEA+TAm-R1-L16, CEA+TAm-R1-L17, N_L_Pani_mask70, CEA+TAm-R1-H1, CEA+TAm-R1-H4, CEA+TAm-R1-H5, N_H_Cet-mask72, N_H_Pani_mask1, Tra-R2-2, and Tra-R2-4. FIG. 1K shows an exemplary predicted structure for a masked anti-CD19 antibody.

[0151] FIGS. 2A-2B show the binding diagrams for the binding between example antibodies and mouse CD3 antigen, as measured by ELISA.

[0152] FIG. 3 is a schematic diagram showing a system for performing in silicon screening of alpha-helix masks.

[0153] FIG. 4 illustrates exemplary structures of a masked antigen-binding domain.

[0154] FIG. 5 illustrates exemplary structures of a masked Fab-Fc.

[0155] FIG. 6 illustrates exemplary structures of a masked VHH-Fc.

[0156] FIGS. 7A-7B illustrate exemplary structures of a masked ScFv-Fc.

[0157] FIGS. 8A-8B illustrate exemplary structures of a masked Fab-Fc fusion protein.

[0158] FIG. 9 illustrates exemplary structures of a masked ScFv-Fc fusion protein.

[0159] FIG. 10 illustrates exemplary structures of a masked Fab.

[0160] FIG. 11 illustrates exemplary structures of a masked VHH.

[0161] FIGS. 12A-12B illustrate exemplary structures of a masked ScFv.

[0162] FIGS. 13A-13B illustrate exemplary structures of a masked Fab fusion protein.

[0163] FIG. 14 illustrates exemplary structures of a masked ScFv fusion protein.

[0164] FIG. 15 illustrates exemplary structures of a masked ectodomain.

[0165] FIG. 16 shows the binding diagrams for the binding between exemplary anti-CD19 antibodies and Raji cells, as measured by flow cytometry.

[0166] FIGS. 17A-17B show the structure prediction for the first type of structure (FIG. 17A) and the second type of structure (FIG. 17B) for the masked anti-HER2 single domain antibodies.

[0167] FIGS. 18A-18B show the binding diagrams for the binding between exemplary anti-HER2 single domain antibodies and H1573 cells, as measured by flow cytometry. FIG. 18A shows the results of anti-HER2 single domain antibodies containing one alpha-helix. FIG. 18B shows the results of anti-HER2 single domain antibodies containing two alpha-helixes.

[0168] FIG. 19 shows the binding diagrams for the binding between exemplary anti-HER2  single domain antibodies and H1573 cells after enzyme cleavage, as measured by flow cytometry.

[0169] FIG. 20 shows the SDS-PAGE results of the anti-HER2 single domain antibodies before and after enzyme digestion.

[0170] FIG. 21 shows the binding diagrams for the binding between exemplary anti-CD3 single domain antibodies and Jurkat cells, as measured by flow cytometry.

[0171] FIG. 22 shows the binding diagrams for the binding between exemplary anti-CD3 single domain antibodies and Jurkat cells after enzyme cleavage, as measured by flow cytometry.

[0172] FIG. 23 shows the SDS-PAGE results of the anti-CD3 single domain antibodies before and after enzyme digestion.

[0173] FIG. 24 shows relevant amino acid sequences.DETAILED DESCRIPTION

[0174] Antibody is a class of immunoglobulins that can specifically bind to antigens. Due to this specific binding mechanism, antibodies can “mark” foreign microorganisms and infected cells to induce other immune mechanisms to attack them, or directly neutralize its target. Antibodies are widely used in medical practice and are the main targeted therapy drugs for malignant tumors, infectious diseases, autoimmune diseases, transplant rejection and chronic inflammatory diseases. It is difficult to find targets with abundant expression in diseased tissues but low expression in normal tissues. Thus, antibody drugs may react with normal tissues and cause side effects.

[0175] To solve this problem, antibodies can be masked and can be selectively activated in specific tissues. For example, some antibodies can be masked by a coiled coil. Coiled coil is a protein super secondary structure, formed by 2-7 alpha-helixes (the most common ones are formed by 2 or 4 alpha-helixes) intertwined to form a twist-like structure. In the coiled coil masking antibody design, two alpha-helixes are connected to the heavy chain and the light chain respectively, and the two alpha-helixes need to have a high enough affinity to form a coiled coil near the binding domain of the antibody to block antigen-antibody binding. The focus of the design is that the two alpha-helixes connected to the heavy chain and light chain of the antibody need to have high affinity against each other (as opposed to the interaction between the coiled coil and the antibody) . After the linker between an alpha-helixes and the antibody is digested by an enzyme, the coiled coil will be separated from the binding domain of the antibody, and the inhibition will be removed.

[0176] Different from the strategy of masking antigen-binding constructs by coiled coil, the  present disclosure uses computer virtual design or library screening of alpha-helixes that bind to CDRs, and connects such alpha-helixes via a cleavable linker (e.g., a cleavable linker containing a cleavable site) to antigen-binding construct variable regions. The alpha-helix (relying on the binding with the CDR of the masked antigen-binding construct) binds to the antigen-binding domain of the masked antigen-binding construct, and blocks the interaction between the target antigen and the masked antigen-binding construct. In specific tissues, the cleavable linker (e.g., a cleavable linker containing a cleavable site) can be cut off to selectively activate the masked antigen-binding construct to recognize the antigen, reducing the off-target toxicity of antigen-binding drugs. This method mainly considers the binding force between the alpha-helix and the CDR region rather than the interaction between alpha-helixes. Thus, the present design only needs one linker to be connected to one chain of the masked antigen-binding construct, and can be applied to single domain antibodies (or other antibodies with an single chain structure) . The masking effect of the present design can be adjusted by adjusting the strength of the interaction between the alpha-helix and the CDR region.

[0177] In one aspect, the disclosure is related to an alpha-helix mask, which is covalently linked to the N-terminus of either an antibody heavy chain variable region or an antibody light chain variable region (but not both) . In some embodiments, a masked antibody described herein may comprise two light chains and two heavy chains, and thus may comprise a pair of the alpha-helix masks described herein. In some embodiments, the two alpha-helix masks do not bind each other to form a coiled coil structure. In some embodiments, the interaction between the alpha-helix mask described herein and the CDR region of the masked antigen-binding construct (e.g., antibody) is much stronger than the interaction between two alpha-helix masks.

[0178] By comparison, in a traditional bivalent alpha-helix mask (e.g., a coiled coil) , two alpha-helix coil chains strongly bind each other to form the bivalent alpha-helix mask. The alpha-helix coil chains themselves do not bind to the CDR region of the masked antigen-binding construct (e.g., antibody) . A traditional bivalent alpha-helix mask (e.g., a coiled coil) may comprise two alpha-helix coil chains that strongly bind each other (via covalent or noncovalent interactions) to form the bivalent alpha-helix mask. Each of the two alpha-helix coil chains may be connected to the N terminus of an antibody heavy chain and an antibody light chain, respectively, blocking the interaction between the CDR and the target antigen. The alpha-helix coil chains themselves do not bind to the CDR region. A detailed description of traditional bivalent alpha-helix masks can be found in, e.g., Wranik, Bernd J.,  et al. "LUZ-Y, a novel platform for the mammalian cell production of full-length IgG-bispecific antibodies. " Journal of Biological Chemistry 287.52 (2012) : 43331-43339; Trang, Vivian H., et al. "A coiled-coil masking domain for selective activation of therapeutic antibodies. " Nature biotechnology 37.7 (2019) : 761-765, U.S. Patent Publication No. 2016 / 0002356; U.S. Patent Publication No. 2019 / 0352428, each of which is incorporated by reference in its entirety herein.

[0179] In one aspect, the masked antigen-binding constructs provided herein, in an uncleaved state, include a masked antigen-binding domain coupled to an alpha-helix mask via a cleavable linker (e.g., a cleavable linker containing a cleavable site) , such coupling leads to a decrease in the ability of the antigen-binding domain to bind its target antigen. In an activated state, e.g., a cleaved state, the antigen-binding domain is freed from the alpha-helix mask and can regains some or all of its ability to bind its target antigen.

[0180] Masked antigen-binding constructs (e.g., antibodies and antigen-binding fragments thereof) are provided that comprise a removable alpha-helix mask that blocks binding of the antigen-biding domain to its antigen target. A removable mask can be attached to the N-terminus of one or more of the heavy and / or light chains of the masked antigen-binding construct via a cleavable linker. The cleavable linker can be a matrix metalloproteinase (MMP) -cleavable sequence.

[0181] In the tumor microenvironment, altered proteolysis leads to unregulated tumor growth, tissue remodeling, inflammation, tissue invasion, and metastasis. MMPs represent the most prominent family of proteinases associated with tumorigenesis, and MMPs mediate many of the changes in the microenvironment during tumor progression. Upon exposure of the masked antigen-binding constructs (e.g., antibodies and antigen-binding fragments thereof) to an MMP, the cleavable linker is cleaved, thus allowing removal of the mask and enabling the masked antigen-binding constructs to bind its target antigen in a tumor microenvironment-specific manner.

[0182] In some embodiments, the masked antigen-binding constructs and methods of making thereof provide the below advantages.

[0183] First, the virtual mask screening efficiency is improved. The protein structure determines the functions of the protein. When the mask is composed of a small polypeptide with a loop-shaped secondary structure, the structure cannot be accurately predicted in most cases due to the lack of homologous template information, even for alphafold2, which represents the best prediction tool in the field of protein folding. However, when the secondary structure of the mask is selected to be an alpha-helix shape, it is easier to predict  the correct protein structure using alphafold2 during computer virtual screening. A correct folded structure is more conducive to computational analysis of protein interactions and can greatly improve the screening efficiency of the mask.

[0184] Second, the difficulty of developing single domain antibody masks is reduced. An alpha-helix mask can be easily connected to one end of a single domain antibody, without the need to construct a complex molecular structure to achieve the steric hindrance effect. In addition, although the helical structure of alpha-helix is easy to fold accurately, no one has yet developed an alpha-helix mask that has the ability to bind to the target protein to provide steric hinderance. Therefore, the type of mask can reduce the difficulty of developing single domain antibody masks.

[0185] Third, the mask can be more easily removed by enzymatic digestion. Usually, in order to achieve antibody masking, a sterically hindering mask, such as an albumin mask, or a loop-type mask with high affinity is used. However, the mask molecule is usually too large, leading to excessive immunogenicity. Also, due to the difficulty of computer calculation of loop-type masks, it is very difficult to select the appropriate loop-type masks. In addition, loop-type masks are generally relatively small short peptides. In order to achieve the masking effect, in most cases loop-type masks have very strong binding ability to the target protein, rendering them difficult to remove using enzyme digestion. In such a case, the affinity of the antibody after cleavage remains very low, and the masked antibody cannot exert its intended effects once it has been cleaved. Without being bound by theory, in the current disclosure, alpha-helix masks with a relatively weak binding affinity to the target protein (e.g., antibodies) are employed to provide steric hinderance. Such alpha-helix masks can achieve the ideal masking effects, and can be readily removed by enzyme cleavage.

[0186] Masked Antigen-binding Constructs

[0187] In a masked antigen-binding construct (e.g., antibodies and antigen-binding fragments thereof) , an antigen-binding construct can be coupled to an alpha-helix mask that prevents binding of the masked antigen-binding construct to its target antigen. The masked antigen-binding construct may contain or consist of an antigen-binding domain. The alpha-helix mask may contain a single alpha-helix coil. The alpha-helix mask may contain two or more alpha-helix coils (e.g., 2, 3, 4, or 5 alpha-helix coils) . In some embodiments, the two or more alpha-helix coils are linked together in a polypeptide, optionally with a linker sequence between adjoining alpha-helix coils.

[0188] The alpha-helix mask may be linked to the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct via a cleavable linker. The cleavable linker may contain a cleavable  site. The cleavable site may be recognized by an enzyme. In the masked antigen-binding construct, the alpha-helix coil may function as a mask to inhibit the binding between the masked antigen-binding construct and its target antigen. The binding between the masked antigen-binding construct and its target antigen may decrease by at least 10%, 20%, or 30%comparing to a control antigen-binding construct that does not contain the alpha-helix mask. The binding between the masked antigen-binding construct and its target antigen may decrease by at least 10%, 20%, or 30%comparing to an activated antigen-binding construct where the cleavable site has been cleaved (e.g., by enzyme digestion) .

[0189] In a masked antigen-binding construct, an alpha-helix mask can be linked to an antigen-binding construct via a cleavable linker. The masked antigen-binding construct may be an antibody. A typical antibody includes a heavy and light chain variable region. The alpha-helix mask can be linked to (1) the N-terminus of the heavy chain variable region or (2) the N-terminus of the light chain variable region. A bivalent antibody can have two binding sites, which may or may not be the same. In a normal monospecific antibody, the binding sites are the same and the antibody has two identical light and heavy chain pairs. In a bispecific antibody, the binding sites are different and formed from two different heavy and light chain pairs.

[0190] A bivalent antibody comprising two light and heavy chain pairs may be used, wherein the N-termini of one or more of the light chains and / or the heavy chains are linked via a cleavable linker to an alpha-helix mask, reducing binding affinity of the light and heavy chain variable region pair to a target.

[0191] The two light and heavy chain pairs may be the same. The two light and heavy chain pairs may be different. The light chains may include a light chain variable region and light chain constant region and the heavy chains may include a heavy chain variable region and heavy chain constant region. The heavy chain region may include CH1, hinge, CH2 and CH3 regions. The light chain can be linked to a first heterologous peptide and the heavy chain can be linked to a second heterologous peptide. The cleavable linker can have an MMP1 or MMP2 cleavage site.

[0192] The antigen binding affinity of the masked antigen-binding construct may decrease by at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, or 99.7%by the presence of the alpha-helix mask (comparing to a control antigen-binding construct without the alpha-helix mask) . In some embodiments, the ratio between (1) the binding affinity without the alpha-helix mask and (2) the binding affinity with the alpha-helix mask ( “affinity reduction ratio” ) is at least 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6,  7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, or 1000. In some embodiments, the affinity reduction ratio is less than 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, or 1000. In some embodiments, the affinity reduction ratio is less than 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, or 1000

[0193] Cytotoxicity of the masked antigen-binding construct may decrease by at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, or 99.7%by the presence of the alpha-helix mask. In some embodiments, the ratio between (1) the cytotoxicity without the alpha-helix mask and (2) the cytotoxicity with the alpha-helix mask ( “cytotoxicity reduction ratio” ) is at least 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, or 1000. In some embodiments, the cytotoxicity reduction ratio is less than 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, or 1000.

[0194] Antigen binding affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=koff / kon) . In some embodiments, the KD for the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct (e.g., antibodies and antigen-binding fragments thereof) without the alpha-helix mask is less than 1 x 10-6M, less than 1 x 10-7M, less than 1 x 10-8 M, less than 1 x 10-9 M, less than 1 x 10-10 M, less than 1 x 10-11 M, less than 1 x 10-12 M, less than 1 x 10-13 M or less than 1 x 10-14 M. In some embodiments, the KD for the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct is less than 50 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, or 1 nM. In some embodiments, KD for the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct is greater than 1 x 10-7M, greater than 1 x 10-8M, greater than 1 x 10-9 M, greater than 1 x 10-10 M, greater than 1 x 10-11 M, greater than 1 x 10-12 M, greater than 1 x 10-13 M, greater than 1 x 10-14 M.

[0195] In some embodiments, the KD for the masked antigen-binding construct with the alpha-helix mask is less than 1 x 10-6M, less than 1 x 10-7M, less than 1 x 10-8 M, less than 1 x 10-9 M, less than 1 x 10-10 M, less than 1 x 10-11 M, less than 1 x 10-12 M, less than 1 x 10-13 M or less than 1 x 10-14 M. In some embodiments, the KD for the masked antigen-binding construct is less than 50 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, or 1 nM. In some embodiments, KD for the masked antigen-binding construct is greater than 1 x 10-7 M, greater than 1 x 10-8 M, greater than 1 x 10-9 M, greater than 1 x 10-10 M, greater than 1 x 10-11 M, greater than 1 x 10-12 M, greater than 1 x 10-13 M, greater than 1 x 10-14 M.

[0196] In some embodiments, the alpha-helix mask has at least 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, or 50 amino acids. In some embodiments, the alpha-helix mask has no more than 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, or 50 amino acids. In some embodiments, the alpha-helix mask has 5-40 amino acids. In some embodiments, the alpha-helix mask has 5-20 amino acids. In some embodiments, the alpha-helix mask has about 13～28 amino acids. In some embodiments, the alpha-helix mask has about 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, or 28 amino acids. In some embodiments, the alpha-helix mask is a single polypeptide.

[0197] A bispecific antibody described herein can be designed to have an IgG (e.g., IgG1 subtype) structure with knobs-into-holes (KIH) mutations, which can promote heterodimerization and avoid mispairing between the two heavy chains. In some embodiments, the bispecific antibody can have a common light chain.

[0198] An alpha-helix mask can be linked to an antibody variable region via a cleavable linker (e.g., including a cleavable site) . The same cleavable linker or site can be used for linking each heavy or light chain variable region of an antigen-binding construct (e.g., antibody or antigen-binding fragment thereof) to an alpha-helix mask. The cleavable linker or site can be one amenable to cleavage by a protease present extracellularly in the intended target tissue or pathology, such as a cancer, such that cleavage of the cleavable site releases the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct from the alpha-helix mask, allowing the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct to bind to its intended target, such as a cell-surface antigen or soluble ligand.

[0199] In addition to the variable regions, a masked antigen-binding construct can include all or part of a constant region, which can include any or all of a light chain constant region, CHI, hinge, CH2 and CH3 regions. As with other antigen-binding constructs one or more carboxy-terminal residues can be proteolytically processed or derivatized.

[0200] The alpha-helix can be connected to the N-terminus of the light chain of an antibody through a cleavable linker. As examples, the structural simulations of CEA+TAm-R1-L16, CEA+TAm-R1-L17, and N_L_Pani_mask70 are shown in FIGs. 1A-1C.

[0201] The alpha-helix can be connected to the N-terminus of the heavy chain of an antibody through a cleavable linker. As examples, the structural simulations CEA+TAm-R1-H1, CEA+TAm-R1-H4, CEA+TAm-R1-H5, N_H_Cet-mask72, N_H_Pani_mask1, Tra-R2-2,  and Tra-R2-4 are shown in FIGs. 1D-1J.

[0202] When the alpha-helix mask is linked to the heavy chain, the masked antigen-binding construct can comprise:

[0203] a) a first polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: an alpha-helix mask, a first linker, a cleavable linker, a second linker, a TAm heavy chain.

[0204] b) a second polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: a TAm light chain.

[0205] When the alpha-helix mask is linked to the light chain, the masked antigen-binding construct can comprise:

[0206] a) a first polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: an alpha-helix mask, a first linker, a cleavable linker, a second linker, a TAm light chain.

[0207] b) a second polypeptide comprising from N-terminus to C-terminus: a TAm heavy chain.

[0208] The masked antigen-binding construct may have an alpha-helix mask sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 12, 16, 18, or 20.

[0209] The masked antigen-binding construct may have a first linker sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 13, 21, or 23.

[0210] The masked antigen-binding construct may have a second linker sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 13 or 21.

[0211] The masked antigen-binding construct may have a cleavable linker sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 14 or 24.

[0212] The masked antigen-binding construct may have a light chain sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 10.

[0213] The masked antigen-binding construct may have a heavy chain sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 6.

[0214] Linkage of antigen-binding construct to the alpha-helix mask may cause a decrease in binding affinity of at least about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 2.5-fold, 5-fold, 10-fold, 15-fold, 20-fold, 25-fold, 30-fold, 40-fold, 50-fold, 100-fold, 200-fold, 500-fold, 750-fold or 1000-fold relative to the same antigen-binding construct without such linkage or after cleavage of such linkage. In some such antigen-binding constructs, the decrease in binding  affinity is less than about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 2.5-fold, 5-fold, 10-fold, 15-fold, 20-fold, 25-fold, 30-fold, 40-fold, 50-fold, 100-fold, 200-fold, 500-fold, 750-fold or 1000-fold. Effector functions of the masked antigen-binding construct, such as ADCC, phagocytosis, and CDC or cytotoxicity as a result of linkage to a drug in an antibody drug conjugate (ADC) can be reduced by the same factors or ranges. Upon proteolytic cleavage that serves to unmask a masked antigen-binding construct or otherwise remove the mask from the masked antigen-binding construct, the restored antigen-binding construct typically has an affinity or effect function that is within a factor of 2, 1.5 or preferably unchanged within experimental error compared with an otherwise identical control antigen-binding construct, which has never been masked.

[0215] General techniques for measuring the affinity of a masked antigen-binding construct for an antigen include, e.g., ELISA, RIA, Bio-Layer Interferometry (BLI) and surface plasmon resonance (SPR) .

[0216] The affinity of the masked antigen-binding construct to the target antigen can be determined by ELISA (e.g., using the methods described in Example 4) . The masked antigen-binding construct may have a binding EC50 that is greater than 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, or 100μg / ml. The masked antigen-binding construct may have a binding EC50 that is less than 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, or 100μg / ml. The masked antigen-binding construct may have an binding EC50 that is 10-50 or 10-100μg / ml. Linkage of the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct to the alpha-helix mask may lead to a decrease in the binding affinity of the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct by at least about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 2.5-fold, 5-fold, 10-fold, 15-fold, 20-fold, 25-fold, 30-fold, 40-fold, 50-fold, 100-fold, 200-fold, 500-fold, 750-fold or 1000-fold, relative to the same antigen-binding construct without such linkage or after cleavage of such linkage. Linkage of the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct to the alpha-helix mask may lead to a decrease in the binding affinity of the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct by about 9-27-fold relative to the same antigen-binding construct without such linkage or after cleavage of such linkage.

[0217] The affinity of the masked antigen-binding construct to the target antigen can be determined by BLI (e.g., using the methods described in Example 6) . Affinities can be deduced from the quotient of the kinetic rate constants (KD=kdis / ka) . The masked antigen-binding construct may have a KD that is less than 1 x 10-6 M, less than 1 x 10-7 M, less than 1 x 10-8 M, less than 1 x 10-9 M, or less than 1 x 10-10 M. The masked  antigen-binding construct may have a KD that is less than 50nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, or 1 nM. The masked antigen-binding construct may have a KD that is greater than 1 x 10-7M, greater than 1 x 10-8 M, greater than 1 x 10-9 M, greater than 1 x 10-10 M, greater than 1 x 10-11 M, or greater than 1 x 10-12 M. Linkage of the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct to the alpha-helix mask may lead to a decrease in the binding affinity of the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct by at least about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, 2.5-fold, 5-fold, 10-fold, 15-fold, 20-fold, 25-fold, 30-fold, 40-fold, 50-fold, 100-fold, 200-fold, 500-fold, 750-fold or 1000-fold, relative to the same antigen-binding construct without such linkage or after cleavage of such linkage. Linkage of the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct to the alpha-helix mask may lead to a decrease in the binding affinity of the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct by about 20%-60%or 30%-60%relative to the same antigen-binding construct without such linkage or after cleavage of such linkage.

[0218] The masked antigen-binding construct can be a masked antibody. The masked antigen-binding construct may have a heavy chain sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any of the heavy chain sequences shown in Table 9. The masked antigen-binding construct may have a heavy chain sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 27, 28, 31, 32, or 35. The masked antigen-binding construct may have a light chain sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any of the light chain sequences shown in Table 9. The masked antigen-binding construct may have a light chain sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 26, 30, 34, or 33.

[0219] The masked antigen-binding construct may have an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 3, 4, and 8, or an amino acid sequence that is at least 95%, 97%, or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 3, 4 and 8.

[0220] The masked antigen-binding construct may have an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 11, 15, 17, 19, 22, 27, 28, 31, 34, and 35, or an amino acid sequence that is at least 95%, 97%, or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 11, 15, 17, 19, 22, 27, 28, 31, 34, and 35.

[0221] The masked antigen-binding construct may contain a heavy chain constant region,  such as an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM or IgD constant region. Preferably, the heavy chain constant region is an IgG1 heavy chain constant region or an IgG4 heavy chain constant region. Furthermore, the masked antigen-binding construct can comprise a light chain constant region, either a kappa light chain constant region or a lambda light chain constant region.

[0222] The masked antigen-binding construct may contain an engineered Fc region. Replacements of amino acid residues in the Fc portion to alter antibody effector function are known in the art. The Fc portion of an antibody mediates several important effector functions e.g. cytokine induction, ADCC, phagocytosis, complement dependent cytotoxicity (CDC) and half-life / clearance rate of antibody and antigen-antibody complexes.

[0223] The masked antigen-binding construct may be derivatized or linked to another functional molecule (e.g., another peptide or protein) . For example, a labeled antigen-binding construct described herein can be derived by functionally linking an antigen-binding construct (by chemical coupling, genetic fusion, noncovalent association or otherwise) to one or more other molecular entities, such as another antigen-binding construct (e.g., a bispecific antibody or a diabody) , a detectable agent, a cytotoxic agent, a pharmaceutical agent, and / or a protein or peptide that can mediate associate of the masked antigen-binding construct with another molecule (such as a streptavidin core region or a polyhistidine tag) .

[0224] The masked antigen-binding construct may be further modified to generate glycosylation site mutants in which the O-or N-linked glycosylation site of the binding protein has been mutated.

[0225] The glycosylation of the masked antigen-binding construct may be modified. For example, an aglycoslated masked antigen-binding construct can be made (i.e., the masked antigen-binding construct lacks glycosylation) . Glycosylation can be altered to, for example, increase the affinity of the masked antigen-binding construct for an antigen. Such carbohydrate modifications can be accomplished by, for example, altering one or more sites of glycosylation within the masked antigen-binding construct sequence. For example, one or more amino acid substitutions can be made that result in elimination of one or more variable region glycosylation sites to thereby eliminate glycosylation at that site. Such aglycosylation can increase the affinity of the masked antigen-binding construct for an antigen.

[0226] Additionally or alternatively, the masked antigen-binding construct can be further modified with an altered type of glycosylation, such as a hypofucosylated masked antigen-binding construct having reduced amounts of fucosyl residues or a masked antigen-binding construct having increased bisecting GlcNAc structures. Such altered  glycosylation patterns have been demonstrated to increase the ADCC ability of the masked antigen-binding construct. Such carbohydrate modifications can be accomplished by, for example, expressing the masked antigen-binding construct in a host cell with altered glycosylation machinery.

[0227] The masked antigen-binding construct may not have a functional Fc region. For example, the masked antigen-binding construct can be Fab, Fab’, F (ab’) 2, VHH, ScFv, or a fusion protein thereof. The masked antigen-binding construct may have a functional Fc region. For example, the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct can be a Fab-Fc, VHH-Fc, ScFv-Fc, or a fusion protein thereof. The Fc region may contain LALA mutations (L234A and L235A mutations in EU numbering) , or LALA-PG mutations (L234A, L235A, P329G mutations in EU numbering) . The masked antigen-binding construct may have any of the structures illustrated in FIGs. 4-14. The masked antigen-binding construct may take the form of an ectodomain to form any of the structures illustrated in FIG. 15.

[0228] As shown in FIG. 4, in some embodiments, the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct can comprise or consist of a Fab. In some embodiments, a mask is linked to the VH of the Fab. In some embodiments, a mask is linked to the VL of the Fab. In some embodiments, antigen-binding construct can comprise or consist of a ScFv. In some embodiments, a mask is linked to the VH of the ScFv. In some embodiments, a mask is linked to the VL of the ScFv. In some embodiments, the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct can comprise or consist of a VHH. In some embodiments, a mask is linked to the VHH.

[0229] As shown in FIG. 5, in some embodiments, the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct can comprise or consist of a full-length antibody (including two Fabs linked to a Fc) . In some embodiments, a mask is linked to the VH of the full-length antibody. In some embodiments, a mask is linked to the VL of the full-length antibody. In some embodiments, the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct can comprise or consist of a Fab-Fc (including one Fab linked to a Fc) . In some embodiments, a mask is linked to the VH of the Fab. In some embodiments, a mask is linked to the VL of the Fab. In some embodiments, a mask is linked to the Fc (e.g., via the hinge region of the Fc) .

[0230] As shown in FIG. 6, in some embodiments, the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct can comprise or consist of a VHH-Fc (e.g., one or two VHHs linked to a Fc) . In some embodiments, a mask is linked to one VHH of the VHH-Fc. In some embodiments, a mask is linked to each of the two VHHs of the VHH-Fc. In some  embodiments, a mask is linked to the Fc (e.g., via the hinge region of the Fc) .

[0231] As shown in FIGS. 7A-7B, in some embodiments, the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct can comprise or consist of a ScFv-Fc (e.g., one or two ScFvs linked to a Fc) . In some embodiments, a mask is linked to the one ScFv of the ScFv-Fc (e.g., via the VL of the ScFv or the VH of the ScFv) . In some embodiments, a mask is linked each of the two ScFvs of the ScFv-Fc (e.g., via the VL of the ScFv or the VH of the ScFv) . In some embodiments, a mask is linked to the Fc (e.g., via the hinge region of the Fc) .

[0232] As shown in FIGS. 8A-8B, in some embodiments, the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct can comprise or consist of a Fab-Fc fusion protein. In some embodiments, the Fab-Fc fusion protein comprises (1) a Fab linked to a Fc, (2) a Fab linked to a Fc and a ScFv linked to the same Fc, or (3) a Fab linked to a Fc and a VHH linked to the same Fc. In some embodiments, a mask is linked to the VH of the Fab. In some embodiments, a mask is linked to the VL of the Fab. In some embodiments, a mask is linked to the Fc (e.g., via the hinge region of the Fc) . In some embodiments, a mask is linked to the VH of the ScFv. In some embodiments, a mask is linked to the VL of the ScFv. In some embodiments, a mask is linked to the VHH.

[0233] As shown in FIG. 9, in some embodiments, the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct can comprise or consist of a ScFv-Fc fusion protein. In some embodiments, the ScFv-Fc fusion protein comprises a ScFv linked to a Fc and a VHH linked to the same Fc. In some embodiments, a mask is linked to the VH of the ScFv. In some embodiments, a mask is linked to the VL of the ScFv. In some embodiments, a mask is linked to the VHH.

[0234] As shown in FIG. 10, in some embodiments, the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct can comprise or consist of a F (ab’) 2 (e.g., two Fabs linked to a hinge) . In some embodiments, a mask is linked to the VH of the each Fab in the F (ab’) 2. In some embodiments, a mask is linked to the VL of each Fab in the F (ab’) 2. In some embodiments, a mask is linked to the hinge.

[0235] As shown in FIG. 10, in some embodiments, the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct can comprise or consist of a Fab’ (e.g., a Fab linked to a hinge) . In some embodiments, a mask is linked to the VH of the Fab’. In some embodiments, a mask is linked to the VL of the Fab’. In some embodiments, a mask is linked to the hinge.

[0236] As shown in FIG. 11, in some embodiments, the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct can comprise or consist of a VHH-hinge (e.g., one or two VHHs linked to a hinge) . In some embodiments, a mask is linked to one VHH of the  VHH-hinge. In some embodiments, a mask is linked to each of the two VHHs of the VHH-hinge. In some embodiments, a mask is linked to the hinge.

[0237] As shown in FIGS. 12A-12B, in some embodiments, the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct can comprise or consist of a ScFv-hinge (e.g., one or two ScFvs linked to a hinge) . In some embodiments, a mask is linked to the one ScFv of the ScFv-hinge (e.g., via the VL of the ScFv or the VH of the ScFv) . In some embodiments, a mask is linked each of the two ScFvs of the ScFv-hinge (e.g., via the VL of the ScFv or the VH of the ScFv) . In some embodiments, a mask is linked to the hinge.

[0238] As shown in FIGS. 13A-13B, in some embodiments, the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct can comprise or consist of a Fab fusion protein. In some embodiments, the Fab fusion protein comprises (1) a Fab linked to a hinge, (2) a Fab linked to a hinge and a ScFv linked to the same hinge, or (3) a Fab linked to a hinge and a VHH linked to the same hinge. In some embodiments, a mask is linked to the VH of the Fab. In some embodiments, a mask is linked to the VL of the Fab. In some embodiments, a mask is linked to the hinge. In some embodiments, a mask is linked to the VH of the ScFv. In some embodiments, a mask is linked to the VL of the ScFv. In some embodiments, a mask is linked to the VHH.

[0239] As shown in FIG. 14, in some embodiments, the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct can comprise or consist of a ScFv fusion protein. In some embodiments, the ScFv fusion protein comprises a ScFv linked to a hinge and a VHH linked to the same hinge. In some embodiments, a mask is linked to the VH of the ScFv. In some embodiments, a mask is linked to the VL of the ScFv. In some embodiments, a mask is linked to the VHH.

[0240] As shown in FIG. 15, in some embodiments, the masked antigen-binding construct can be linked to an ectodomain of a transmembrane protein. In some embodiments, the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct can comprise or consist of a ScFv, a VHH, or a VHH linked to a ScFv. In some embodiments, a mask is linked to the VH of the ScFv. In some embodiments, a mask is linked to the VL of the ScFv. In some embodiments, a mask is linked to the VHH.

[0241] The masked antigen-binding constructs can be tested for relevant biological activity and / or antibody properties. Determination of what constitutes a relevant antigen-binding construct property is a case specific exercise. Non-limiting examples of antigen-binding construct properties include, but are not limited, to antigenicity, immunogenicity, immunomodulatory activity, expression of the masked antigen-binding construct in a  homologous host, expression of the masked antigen-binding construct in a heterologous host, expression of the masked antigen-binding construct in a plant cell, susceptibility of the masked antigen-binding construct to in vitro post-translational modifications and susceptibility of the masked antigen-binding construct to in vivo post-translational modifications. The masked antigen-binding constructs may have comparable or improved relevant biological activity and / or antigen-binding construct properties as compared to the starting antigen-binding construct.

[0242] A masked antigen-binding construct or a fragment thereof constructed and / or identified in accordance with the present disclosure can be tested in vitro and / or in vivo for its ability to modulate the biological activity of cells. Such ability can be assessed by, e.g., detecting the expression of antigens and genes; detecting the proliferation of cells; detecting the activation of signaling molecules (e.g., signal transduction factors and kinases) ; detecting the effector function of cells; or detecting the differentiation of cells. Techniques known to those of skill in the art can be used for measuring these activities. For example, cellular proliferation can be assayed by 3H-thymidine incorporation assays and trypan blue cell counts. Antigen expression can be assayed, for example, by immunoassays including, but are not limited to, competitive and non-competitive assay systems using techniques such as western blots, immunohistochemistry radioimmunoassays, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) , “sandwich” immunoassays, immunoprecipitation assays, precipitin reactions, gel diffusion precipitin reactions, immunodiffusion assays, agglutination assays, complement-fixation assays, immunoradiometric assays, fluorescent immunoassays, protein A immunoassays, and FACS analysis. The activation of signaling molecules can be assayed, for example, by kinase assays and electrophoretic shift assays (EMSAs) .

[0243] The masked antigen-binding constructs described herein, fragments thereof, or compositions thereof are preferably tested in vitro and then in vivo for the desired therapeutic or prophylactic activity prior to use in humans. For example, assays which can be used to determine whether administration of a specific pharmaceutical composition is indicated include cell culture assays in which a patient tissue sample is grown in culture and exposed to, or otherwise contacted with, a pharmaceutical composition, and the effect of such composition upon the tissue sample is observed. The tissue sample can be obtained by biopsy from the patient. This test allows the identification of the therapeutically most effective therapy (e.g., prophylactic or therapeutic agent) for each individual patient. In vitro assays can be carried out with representative cells of cell types involved a particular disorder to determine if a pharmaceutical composition described herein has a desired effect upon such  cell types. For example, in vitro assay can be carried out with cell lines.

[0244] Designing Alpha-Helix Masks

[0245] An alpha-helix library can be constructed by extracting the alpha-helix substructures or loop-containing helix bundle substructures from protein structure databases.

[0246] Candidate alpha-helixes that can bind to a starting antigen-binding domain (e.g., an antigen-binding domain in an antigen-binding construct) ’s CDR can be screened from the library by a virtual screening algorithm. The screening of alpha-helixes can include one of more of the below steps:

[0247] 1) inputting the structure information of the starting antigen-binding domain (e.g., a VH-VL pair, or a VHH) that needs to be masked into a protein language model (e.g., the ProtGPT2 model) or a diffusion model (e.g., 3D Equivariant Diffusion model) , to generate candidate alpha-helix masks that can bind to a CDR region of the starting antigen-binding domain. In some cases, Supervised Fine-Tuning can be performed on the input data. A language model trained using a protein database is called a protein language model. Protein language models such as ESM2 and OmegaPLM can be used for structure prediction. Protein language models such as ProtGPT2 and ProGen can be used for design of new functional proteins. In the present disclosure, the ProtGPT2 architecture was modified and conditional branches were added. Supervised Fine-Tuning (SFT) can performed on ProtGPT2 to input the three-dimensional structure of the antigen-binding domain to generate alpha-helix candidate sequences that bind to the CDR region of the antigen-binding domain. The protein language model (e.g., the ProtGPT2 model) can be used for de novo protein design and engineering. The protein language model (e.g., the ProtGPT2 model) can be based on transformer architecture (e.g., the GPT2 transformer architecture) . Fine-tuning training may be performed using paired target sequences and alpha-helix sequences to enable the model to generate alpha-helix sequences targeting specific targets (e.g., CDR region) . During model inference, the model may be provided with a specified target position to generate a large number of candidate alpha-helix sequences. As for the Diffusion model, the structure of candidate targets may be inputted and the binding sites may be specified to allow the diffusion model to generate alpha-helix structures and sequences in the region of the binding sites.

[0248] 2) assembling, in silico, the candidate alpha-helix masks generated by the models in the form of “alpha-helix mask+cleavable linker+antigen-binding domain” , and using fast folding software, such as Alphafold2, ESMFold, OmegaFold to perform structure prediction to select alpha-helix masks that can interact with the starting antigen-binding domain’s CDR  region. The selection criteria include (1) an alpha-helix pLDDT (predicted Local Distance Difference Test) greater than 55 (preferably greater than 65, more preferably greater than 80, more preferably greater than 90) ; (2) an alpha-helix pTM score (predicted template modeling score) greater than 0.5 (preferably greater than 0.6, more preferably greater than 0.75, more preferably greater than 0.9) ; (3) an ipTM score (interface pTM score) between alpha-helix and antigen-binding domain’s CDR that is greater than 0.45 (preferably greater than 0.6, more preferably greater than 0.75, more preferably greater than 0.9) ; and / or (4) an average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR that is less than  (preferably less than more preferably less than more preferably less than  more preferably less than more preferably less than more preferably less than  ).

[0249] The virtually selected masked antigen-binding domains can then be produced using molecular cloning for wet lab testing.

[0250] The calculation methods for pLDDT and ipTM can be found in Jumper et al. “Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. ” Nature 596.7873 (2021) : 583-589, which is incorporated by reference in its entirety. The “alpha-helix pLDDT” means that only the pLDDT of the predicted structure with masking alpha-helix is calculated, and this value can be greater than 55. The “alpha-helix ptm” is used to evaluate the accuracy of the alpha-helix structure prediction, and this value can be greater than 0.5. The “ipTM” evaluates the correctness of the docking between the masking alpha-helix sequence and the antigen-binding domain, and this value can be greater than 0.45. The “Distance” measures the spatial distance between the masking alpha-helix and the CDRs of the antigen-binding domain, and this value can be less than Its calculation is as follows:

[0251] where dij represents the Euclidean distance from the ith amino acid of alpha-helix to the jth amino acid of the antigen-binding domain's CDR region.

[0252] In step (2) , various diffusion models can be used. The diffusion model is a kind of a generative model. There are currently four major generative models: Generative Adversarial Network (GAN) , Variational Autoencoder (VAE) , Flow-based Model and Diffusion Model. The diffusion model surpasses the original SOTA (state of the art) GAN in the image generation tasks, and produces high-quality image generation models such as DALLE 2, Imagen, and stable-diffusion. And it has excellent performance in many other application  fields, such as computer vision, natural language processing, waveform signal processing, multimodal modeling, molecular graph modeling, etc.

[0253] The diffusion model mainly includes forward process and reverse process. The forward process (diffusion process) continuously adds noise (standard Gaussian distribution) to the input data, and the added noise increases as the time step increases, and finally becomes pure noise as the time step approaches positive infinity. The backward process starts from a random noise and gradually restores the original data-the denoising process is the process of generating the target.

[0254] Diffusion models have also been introduced into the field of drug design and molecular discovery, such as for molecular docking (DIFFDOCK) , small molecule drug generation (DiffSBDD) , protein design (RFDiffusion) etc. In physics, chemistry, biology, various objects with geometric features, such as position vectors (such as atomic coordinates of molecules) and force vectors, need to be described. The equations described by these geometric features do not depend on the choice of the coordinate system. Underlying these geometric features is the symmetry information of the system. Therefore, how to maintain these geometric features and symmetry in the neural network is a key issue in the application of artificial intelligence to natural science problems. Through the design of the model, the equivariant neural network keeps the geometric features and equivariance of the data from input to output, and shows smaller data requirements and better performance than traditional neural networks. To this end, a3D Equivariant Diffusion model was developed to generate the sequence and structure co-design of the scaffold functional protein targeting the specified protein region. The antigen-binding domain’s conformation can be inputted. The CDR that needs to be bound can be specified. The 3D Equivariant Diffusion model can be used to generate end-to-end sequences and conformations of candidate alpha-helixes that bind to the antigen-binding domain’s CDR region.

[0255] The designing of the alpha-helix masks may be performed within 1 minute. The designing of the alpha-helix masks may be performed within 1 day.

[0256] Cleavable sites and linkers

[0257] A cleavable linker may be used to couple an alpha-helix mask to an antigen-binding construct (e.g., an antibody or antigen-binding fragment thereof) . A cleavable linker can have a cleavable site and optionally two linkers, e.g., before and after the cleavable site. The cleavable linker can be any segments of amino acids conventionally used as a cleavable linker for joining peptide domains. Suitable cleavable likers can vary in length, such as 1-20,  2-15, 3-12, 4-10, 6-20, 6-10, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 amino acids long. In some embodiments, the cleavable linker has at least 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, or 50 amino acids. In some embodiments, the cleavable linker has no more than 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, or 50 amino acids. In some embodiments, the cleavable linker has about 14～30 amino acids. In some embodiments, the cleavable linker has about 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 30 amino acids. In some embodiments, the cleavable site has about 6-10 amino acids. In some embodiments, the cleavable site in the cleavable linker has about 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids.

[0258] A cleavable site may be recognized and cleaved by a protease expressed extracellularly so it contacts a masked antigen-binding construct (e.g., an antigen-binding domain) , releasing the masked antigen-binding construct and allowing it to contact its target, such as a receptor extracellular domain or soluble ligand. Several matrix metalloproteinase sites (MMP1-28) may be suitable. MMPs play a role in tissue remodeling and are implicated in neoplastic processes such as morphogenesis, angiogenesis and metastasis. Examples of MMPs are provided in US 2013 / 0309230, WO 2009 / 025846, WO 2010 / 081173, WO 2014 / 107599, WO 2015 / 048329, US 20160160263, and Ratnikov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111: E4148-E4155 (2014) ; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0259] The cleavable site may be cleaved in the tumor microenvironment. The cleavable site may be a matrix metalloprotease (MMP) cleavage site. The MMP cleavage site may be selected from an MMP2 cleavage site, an MMP7 cleavage site, an MMP9 cleavage site and an MMP13 cleavage site. Following cleavage by an MMP, the heavy chain and / or light chain of the masked antigen-binding construct may comprise a stub amino acid remnant of the MMP cleavage site. The stub amino acid remnant may contain the sequence LRSG, SG, or VR at the N terminus of the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct.

[0260] A cleavable site may also be cleaved at dibasic sites (e.g., an Arginine-Arginine, Lysine-Arginine, or Lysine-Lysine site) . Enzymes that cleave at dibasic sites are known in the art and include, for example, N-arginine dibasic convertase (Chow et al., JBC 275: 19545-19551 (2000) ) and subtilisin-like proprotein convertases such as Furin (PCI) , PC2, and PC3 (Steiner (1991) in Peptide Biosynthesis and Processing (Fricker ed. ) pp. 1-16, CRC Press, Boca Raton, FL; Muller et al., JBC 275: 39213-39222, (2000)) .

[0261] In addition, one or more linkers can be used to couple an alpha-helix mask to an antigen-binding construct. Glycine and glycine-serine polymers are relatively unstructured, and therefore may be able to serve as a neutral linker between components. Glycine accesses significantly more phi-psi space than even alanine, and is much less restricted than residues with longer side chains (see Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)) . Some exemplary linkers are in the form S (G) nS, wherein n is from 5-20. Other exemplary linkers are (G) n, glycine-serine polymers (including, for example, (GS) n, (GSGGS) n (SEQ ID NO: 36) , glycine-alanine polymers, alanine-serine polymers, and other flexible linkers.

[0262] Providing a Starting Antigen-binding Construct

[0263] The methods of the present disclosure may employ a starting antigen-binding construct (e.g., an antibody or an antigen-binding fragment thereof) as the starting material ( “starting antigen-binding construct” ) . Alpha-helix masks can be designed for an antigen-binding domain (e.g., starting antigen-binding domain) in a starting antigen-binding construct.

[0264] The starting antigen-binding construct may be a non-human, humanized, human, chimeric, or veneered antibody. The starting antigen-binding construct may be a nanobody, dAb, scFb, Fab, and the like. The starting antigen-binding construct may be a BiTe, a (scFv) 2, a nanobody, a nanobody-HSA, a DART, a TandAb, a scDiabody, a scDiabody-CH3, scFv-CH-CL-scFv, a HSAbody, scDiabody-HAS, or a tandem-scFv. The antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct may be a VHH-scAb, a VHH-Fab, a Dual scFab, a F (ab’) 2, a diabody, a crossMab, a DAF (two-in-one) , a DAF (four-in-one) , a DutaMab, a DT-IgG, a knobs-in-holes common light chain, a knobs-in-holes assembly, a charge pair, a Fab-arm exchange, a SEEDbody, a LUZ-Y, a Fcab, aκλ-body, an orthogonal Fab, a DVD-IgG, a IgG (H) -scFv, a scFv- (H) IgG, IgG (L) -scFv, scFv- (L) IgG, IgG (L, H) -Fv, IgG (H) -V, V (H) -IgG, IgG (L) -V, V (L) -IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zybody, DVI-IgG, Diabody-CH3, a triple body, a miniantibody, a minibody, a TriBi minibody, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv, a F (ab’) 2-scFv2, a scFv-KIH, a Fab-scFv-Fc, a tetravalent HCAb, a scDiabody-Fc, a Diabody-Fc, a tandem scFv-Fc, an Intrabody, a dock and lock, a lmmTAC, an IgG-IgG conjugate, a Cov-X-Body, or a scFv1-PEG-scFv2.

[0265] The starting antigen-binding construct may be a monoclonal antibody. The starting antigen-binding construct may be immunospecific for a cancer cell antigen, preferably one on the cell surface. The antigen-binding portion of a masked antigen-binding construct may bind a therapeutic antigen. Such therapeutic antigens include antigens that may be targeted for  treatment of any disease or disorder, including, but not limited to, cancer, autoimmune disorders, and infections.

[0266] Targets to which antigen-binding constructs can be directed include receptors on cancer cells and their ligands or counter-receptors (i.e., tumor-associated antigens) . Such targets include, but are not limited to, CD3, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD40, CD44, CD47, CD52, CD70, CD79a, CD123, Her-2, EphA2, lymphocyte associated antigen 1, VEGF or VEGFR, CTLA-4, LIV-1, nectin-4, CD74, SLTRK-6, EGFR, CD73, PD-L1, CD 163, CCR4, CD 147, EpCam, Trop-2, CD25, C5aR, Ly6D, alpha v integrin, B7H3, B7H4, Her-3, folate receptor alpha, GD-2, CEACAM5, CEACAM6, c-MET, CD266, MUC1, CD 10, MSLN, sialyl Tn, Lewis Y, CD63, CD81, CD98, CD166, tissue factor (CD142) , CD55, CD59, CD46, CD164, TGF beta receptor 1 (TGFpRl) , TGFpR2, TGFpR3, FasL, MerTk, Axl, Clecl2A, CD352, FAP, CXCR3, and CD5.

[0267] Some examples of commercial antibodies and their targets suitable for use in the masked antigen-binding constructs described herein include, but are not limited to, anti-mouse CD3 antibody TAm, anti-human HER2 antibody Trastuzumab, anti-human EGFR antibody Cetuximab (C225) and Panitumumab, brentuximab or brentuximab vedotin, CD30, alemtuzumab, CD52, rituximab, CD20, trastuzumab Her / neu, nimotuzumab, cetuximab, EGFR, bevacizumab, VEGF, palivizumab, RSV, abciximab, GpIIb / IIIa, infliximab, adalimumab, certolizumab, golimumab TNF-alpha, baciliximab, daclizumab, IL-2R, omalizumab, IgE, gemtuzumab or vadastuximab, CD33, natalizumab, VLA-4, vedolizumab alpha4beta7, belimumab, BAFF, otelixizumab, teplizumab CD3, ofatumumab, ocrelizumab CD20, epratuzumab CD22, alemtuzumumab CD52, eculizumab C5, canakimumab IL-lbeta, mepolizumab IL-5, reslizumab, tocilizumab IL-6R, ustekinumab, briakinumab IL-12, 23, hBU12 (CD19) (US20120294853) , humanized 1F6 or 2F12 (CD70) (US20120294863) , BR2-14a and BR2-22a (LIV-1) (WO2012078688) .

[0268] A masked antigen-binding construct provided herein may be useful for treating an autoimmune disease. Nonlimiting antigens that may be bound by the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct useful for treating an autoimmune disease include TNF-a, IL-1, IL-2R, IL-6, IL-12, IL-23, IL-17, IL-17R, BLyS, CD20, CD52, a4p7 integrin, and a4-integrin.

[0269] Knobs-into-holes (KIH) technology may be used, which involves engineering CH3 domains to create either a “knob” or a “hole” in each heavy chain to promote heterodimerization. The KIH technique is described e.g., in Xu, Yiren, et al. “Production of bispecific antibodies in ‘knobs-into-holes’ using a cell-free expression system. ” MAbs. Vol. 7.  No. 1. Taylor&Francis, 2015, which is incorporated by reference in its entirety. One heavy chain may have a T366W, and / or S354C (knob) substitution (EU numbering) , and the other heavy chain has an Y349C, T366S, L368A, and / or Y407V (hole) substitution (EU numbering) . One heavy chain may have one or more of the following substitutions Y349C and T366W (EU numbering) . The other heavy chain can have one or more the following substitutions E356C, T366S, L368A, and Y407V (EU numbering) . Furthermore, a substitution (-ppcpScp-->-ppcpPcp-) can also be introduced at the hinge regions of both substituted IgG.

[0270] As an example, the starting antigen-binding construct can be a bispecific antibody that includes one cancer antigen-binding domain (e.g., CEA) and one anti-CD3 antigen-binding domain. The cancer antigen-binding domain can be in the form of a single-domain antibody (VHH) , and the CD3 antigen-binding domain can be in the form of a Fab. The antigen-binding domains can be located at the N-terminal of the Fc, and the Fc hinge region (Hinge) can act as a linker to connect the two fragments. A Fc-containing two-chain asymmetric structure design can be adopted. The Fc region can endow the masked antigen-binding construct with a longer half-life and good stability. At the same time, the design of a two-chain Knob into Hole (KIH) structure can reduce the probability of mismatching, improving the homogeneity and yield of the target antigen-binding construct.

[0271] In some embodiments, the starting antigen-binding construct may have a knob-Fc that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 1, and a hole-Fc that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 2.

[0272] In some embodiments, the starting antigen-binding construct may have a TAm heavy chain variable region (VH) sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 3. The starting antigen-binding construct may have a CEA nanobody (VHH) sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 4. The starting antigen-binding construct may have a IgG4 CH1 domain sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 5. The starting antigen-binding construct may have a TAm heavy chain (knob) sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 6. The starting antigen-binding construct may have a  CEA (VHH) heavy chain (hole) sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 7.

[0273] In some embodiments, the starting antigen-binding construct may have a TAm light chain variable region (VL) sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 8. The starting antigen-binding construct may have a light chain constant region (CL) sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 9. The starting antigen-binding construct may have a TAm light chain sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 10.

[0274] In some embodiments, the starting antigen-binding construct may have a heavy chain sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 25,

[0275] In some embodiments, the starting antigen-binding construct may have a heavy chain sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any of the heavy chain sequences shown in Table 9. The starting antigen-binding construct may have a heavy chain sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 25, 29, or 32. The starting antigen-binding construct may have a light chain sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to any of the light chain sequences shown in Table 9. The starting antigen-binding construct may have a light chain sequence that is at least 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%identical to SEQ ID NO: 26, 30, or 33.

[0276] The starting antigen-binding constructs can be prepared using a wide variety of techniques known in the art including the use of hybridoma, recombinant, and phage display technologies, or a combination thereof. For example, monoclonal antibodies can be produced using hybridoma techniques including those known in the art. The term “monoclonal antibody” refers to an antibody that is derived from a single clone, including any eukaryotic, prokaryotic, or phage clone.

[0277] Antibody fragments that recognize specific epitopes can be generated by known techniques. For example, Fab and F (ab′) 2 fragments described herein can be produced by proteolytic cleavage of immunoglobulin molecules, using enzymes such as papain (to  produce Fab fragments) or pepsin (to produce F (ab′) 2 fragments) . F (ab′) 2 fragments contain the variable region, the light chain constant region and the CH1 domain of the heavy chain.

[0278] Production of Masked Antigen-binding Constructs

[0279] Masked antigen-binding constructs can be produced by any of a number of techniques known in the art. For example, expression from host cells, wherein expression vector (s) encoding the heavy and light chains is (are) transfected into a host cell by standard techniques. The various forms of the term “transfection” are intended to encompass a wide variety of techniques commonly used for the introduction of exogenous DNA into a prokaryotic or eukaryotic host cell, e.g., electroporation, calcium-phosphate precipitation, DEAE-dextran transfection and the like. Although it is possible to express the masked antigen-binding constructs (e.g., antibodies or antigen-binding fragments thereof) described herein in either prokaryotic or eukaryotic host cells, expression of antigen-binding constructs in eukaryotic cells is preferable, and most preferable in mammalian host cells, because such eukaryotic cells (and in particular mammalian cells) are more likely than prokaryotic cells to assemble and secrete a properly folded and immunologically active antigen-binding construct.

[0280] The variable regions of the heavy and light chain DNA sequences can be cloned into a mammalian expression vector, in frame with a pre-inserted human heavy chain constant region or kappa light chain constant region. The molecules can be produced by co-transfecting Expi 293FTM cells with mammalian expression vectors using polyethyleneimine. Cells can be transfected with the corresponding expression vectors at a ratio of 1: 1.5 [ “heavy chain vector” : “light chain vector” ] .

[0281] Preferred mammalian host cells for expressing the masked antigen-binding constructs (e.g., antibodies) described herein include Chinese Hamster Ovary (CHO cells) , NS0 myeloma cells, COS cells, SP2 cells, and HEK293 cells. When recombinant expression vectors encoding antigen-binding constructs are introduced into mammalian host cells, the masked antigen-binding constructs are produced by culturing the host cells for a period of time sufficient to allow for expression of the masked antigen-binding construct in the host cells or, more preferably, secretion of the masked antigen-binding construct into the culture medium in which the host cells are grown. Antigen-binding constructs can be recovered from the culture medium using standard protein purification methods.

[0282] Host cells can be used to produce functional antibody fragments, such as Fab fragments or scFv molecules. In some cases, it can be advantageous to transfect a host cell with DNA encoding functional fragments of either the light chain and / or the heavy chain of a  masked antigen-binding construct. Recombinant DNA technology can also be used to remove some, or all, of the DNA encoding either or both of the light and heavy chains that is not necessary for binding to the antigens of interest. The molecules expressed from such truncated DNA molecules are also encompassed by the masked antigen-binding constructs described herein. In addition, bifunctional antibodies can be produced in which one heavy and light chain pair is from a masked antigen-binding construct described herein and another heavy and light chain pair is specific for an antigen other than the antigens of interest. Such a bifunctional antibody can be produced by crosslinking a masked antigen-binding construct described herein to a second antigen-binding construct by standard chemical crosslinking methods.

[0283] In certain systems for recombinant expression of a masked antigen-binding construct (e.g., an antibody, or an antigen-binding portion thereof) , a recombinant expression vector encoding both the masked antigen-binding construct heavy chain and the masked antigen-binding construct light chain is introduced into CHO cells by calcium phosphate-mediated transfection. Within the recombinant expression vector, the masked antigen-binding construct heavy and light chain genes are each operatively linked to CMV promoter or AdMLP promoter regulatory elements to drive high levels of transcription of the genes. The recombinant expression vector can also carry selection markers, which allows for selection of CHO cells that have been transfected with the vector. Standard molecular biology techniques can be used to prepare the recombinant expression vector, transfect the host cells, select for transformants, culture the host cells and recover the masked antigen-binding construct from the culture medium. Still further the disclosure provides a method of synthesizing a recombinant antigen-binding construct described herein by culturing a host cell described herein in a suitable culture medium until a recombinant antigen-binding construct described herein is synthesized. The method can further comprise isolating the recombinant antigen-binding construct from the culture medium.

[0284] Masked antigen-binding constructs used in the present formulations can be recovered and purified from recombinant cell cultures by methods including, but not limited to, protein A purification, ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography and lectin chromatography. High performance liquid chromatography (HPLC) can also be employed for purification. See, e.g., Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1997-2001) .

[0285] Masked antigen-binding constructs described herein can be expressed in a modified form. For instance, a region of additional amino acids, particularly charged amino acids, can be added to the amino-terminus of a masked antigen-binding construct to improve stability and persistence in the host cell, during purification, or during subsequent handling and storage. Also, peptide moieties can be added to a masked antigen-binding construct to facilitate purification. Such regions can be removed prior to final preparation of a masked antigen-binding construct. Such methods are described in many standard laboratory manuals, such as Sambrook, supra; Ausubel, et al., ed., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001) .

[0286] Masked antigen-binding constructs described herein can include purified products, products of chemical synthetic procedures, and products produced by recombinant techniques from a eukaryotic host, including, for example, yeast, higher plant, insect and mammalian cells. Depending upon the host employed in a recombinant production procedure, the antigen-binding construct or masked antigen-binding construct of the present disclosure can be glycosylated or can be non-glycosylated, with glycosylated preferred. Such methods are described in many standard laboratory manuals, such as Sambrook, supra; Ausubel, supra, Colligan, Protein Science, supra.

[0287] The purity of the masked antigen-binding construct can be measured by size exclusion chromatography (SEC) . The masked antigen-binding construct may have a purity that is greater than 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, e.g., as measured by SEC. The masked antigen-binding construct may have a purity that is less than 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 72.5%, 75%, 77.5%, 80%, 82.5%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%, e.g., as measured by SEC. The masked antigen-binding construct may have a purity that is 95%-100%or 95%-100%as measured by SEC.

[0288] The yield of the masked antigen-binding construct can be measured by SEC. The masked antigen-binding construct may have a yield that is greater than 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, or 80 mg / L. The masked antigen-binding construct may have a yield that is less than 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, or 80 mg / L. The masked antigen-binding construct may have a yield that is 40-60, or 50-60 mg / L.

[0289] Methods of Using the Masked Antigen-binding Constructs

[0290] The masked antigen-binding constructs herein may be used in methods of therapeutic treatment. The present disclosure provides methods for preventing, managing, treating, or  ameliorating a disorder comprising administering to a subject in need thereof one or more masked antigen-binding constructs described herein alone or in combination with one or more therapies (e.g., one or more prophylactic or therapeutic agents) . Nonlimiting exemplary diseases and disorders that may be treated with the masked antigen-binding constructs provided herein include cancer, autoimmune disorders, and infections. Generally, any disease or disorder that may be treated with a therapeutic antibody may be treated with a masked antigen-binding construct provided herein. A masked antigen-binding construct may result in reduced side-effects compared to the unmasked version of the masked antigen-binding construct, for example, because the masked antigen-binding construct does not bind its antigen until the mask has been removed. By selecting suitable cleavable linkers between the alpha-helix mask and the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct, the masked antigen-binding construct will remain masked until it reaches the vicinity of its target antigen, particularly its target antigen at the site of the disease or disorder. For example, in some instances, by selecting a cleavable site that is cleaved by a protease that is present at higher concentration near a tumor, the masked antigen-binding construct may have an improved safety profile or therapeutic window because the masked antigen-binding construct does not significantly bind its antigen until it reaches the tumor.

[0291] Methods for treating cancer in a subject are provided, comprising:

[0292] a) identifying a subject as having elevated levels of MMP in the cancer relative to surrounding non-cancer tissue; and

[0293] b) administering to the subject a therapeutically effective amount of a masked antigen-binding construct provided herein, wherein each masking domain of the masked antigen-binding construct comprises a cleavable site and wherein the cleavable site is a matrix metalloprotease (MMP) cleavage site. The MMP cleavage site may be selected from an MMP2 cleavage site, an MMP7 cleavage site, an MMP9 cleavage site and an MMP13 cleavage site. The MMP may be selected from MMP2, MMP7, MMP9, and MMP13.

[0294] Step a) may contain:

[0295] i) isolating cancer tissue and non-cancer tissue from the subject;

[0296] ii) detecting MMPs in the isolated cancer tissue and the non-cancer tissue; and

[0297] iii) comparing the amount of staining in the cancer tissue relative to the non-cancer tissue.

[0298] The present disclosure also provides compositions comprising one or more masked antigen-binding constructs described herein and methods of preventing, managing, treating, or ameliorating a disorder or one or more symptoms thereof utilizing said compositions.  Additional therapeutic or prophylactic agents include, but are not limited to, small molecules, synthetic drugs, peptides, polypeptides, proteins, nucleic acids (e.g., DNA and RNA nucleotides including, but not limited to, antisense nucleotide sequences, triple helices, RNAi, and nucleotide sequences encoding biologically active proteins, polypeptides or peptides) , antibodies, synthetic or natural inorganic molecules, mimetic agents, and synthetic or natural organic molecules.

[0299] Any therapy that is known to be useful, or that has been used or is currently being used for the prevention, management, treatment, or amelioration of a disorder or one or more symptoms thereof can be used in combination with the masked antigen-binding construct described herein.

[0300] The masked antigen-binding constructs described herein can be used directly against a particular antigen. The antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct described herein may belong to a subclass or isotype that is capable of mediating the lysis of cells to which the masked antigen-binding construct binds. The antigen-binding portion of the masked antigen-binding constructs described herein may belong to a subclass or isotype that, upon complexing with cell surface proteins, activates serum complement and / or mediates antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) by activating effector cells such as natural killer cells or macrophages.

[0301] As used herein, the term “effective amount” refers to the amount of a compound (e.g., a masked antigen-binding construct) sufficient to effect beneficial or desired results. An effective amount can be administered in one or more administrations, applications or dosages and is not intended to be limited to a particular formulation or administration route. Generally, a therapeutically effective amount of active component is in the range of 0.01 mg / kg to 100 mg / kg, 0.1 mg / kg to 100 mg / kg, 1 mg / kg to 100 mg / kg, 0.01 mg / kg to 10 mg / kg, 0.1 mg / kg to 10 mg / kg, 1 mg / kg to 10 mg / kg. The dosage administered can vary depending upon known factors, such as the pharmacodynamic characteristics of the particular agent, and its mode and route of administration; the age, health, and weight of the recipient; the type and extent of disease or indication to be treated, the nature and extent of symptoms, kind of concurrent treatment, frequency of treatment, and the effect desired. The initial dosage can be increased beyond the upper level in order to rapidly achieve the desired blood-level or tissue-level. Alternatively, the initial dosage can be smaller than the optimum, and the daily dosage may be progressively increased during the course of treatment. Human dosage can be optimized, e.g., in a conventional Phase I dose escalation study designed to run from 0.5 mg / kg to 20 mg / kg. Dosing frequency can vary, depending on factors such as route of administration,  dosage amount, serum half-life of the masked antigen-binding construct, and the disease being treated. Exemplary dosing frequencies are once per day, once per week and once every two weeks.

[0302] The present disclosure provides a method for treating cancer in a cell, tissue, organ, animal or patient. The present disclosure provides a method for treating a solid cancer in a human. Examples of cancers include, but are not limited to, solid tumors, soft tissue tumors, hematopoietic tumors that give rise to solid tumors, and metastatic lesions. Examples of hematopoietic tumors that have the potential to give rise to solid tumors include, but are not limited to, diffuse large B-cell lymphomas (DLBCL) , follicular lymphoma, myelodysplastic syndrome (MDS) , a lymphoma, Hodgkin's disease, a malignant lymphoma, non-Hodgkin’s lymphoma, Burkitt’s lymphoma, multiple myeloma, Richter’s Syndrome (Richter’s Transformation) and the like. Examples of solid tumors include, but are not limited to, malignancies, e.g., sarcomas (including soft tissue sarcoma and osteosarcoma) , adenocarcinomas, and carcinomas, of the various organ systems, such as those affecting head and neck (including pharynx) , thyroid, lung (small cell or non-small cell lung carcinoma (NSCLC) ) , breast, lymphoid, gastrointestinal tract (e.g., oral, esophageal, stomach, liver, pancreas, small intestine, colon and rectum, anal canal) , genitals and genitourinary tract (e.g., renal, urothelial, bladder, ovarian, uterine, cervical, endometrial, prostate, testicular) , central nervous system (e.g., neural or glial cells, e.g., neuroblastoma or glioma) , skin (e.g., melanoma) and the like. The solid tumor may be an NMDA receptor positive teratoma. The cancer may be selected from breast cancer, colon cancer, pancreatic cancer (e.g., a pancreatic neuroendocrine tumors (PNET) or a pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) ) , stomach cancer, uterine cancer, and ovarian cancer. The cancer may be selected from, but not limited to, leukemias such as acute lymphoblastic leukemia (ALL) , chronic lymphocytic leukemia (CLL) , acute myelogenous leukemia (AML) , chronic myelogenous leukemia (CML) , hairy cell leukemia (HCL) , T-cell prolymphocytic leukemia (T-PLL) , large granular lymphocytic leukemia, adult T-cell leukemia, and acute monocytic leukemia (AMoL) .

[0303] The methods described herein include administering to the subject a masked antigen-binding construct as described herein, e.g., in combination with one or more additional therapies, e.g., surgery or administration of another therapeutic preparation. In the case of cancer, for example, the additional therapy may include chemotherapy, e.g., a cytotoxic agent. The additional therapy may include a targeted therapy, e.g. a tyrosine kinase inhibitor, a proteasome inhibitor, or a protease inhibitor. The additional therapy may include an anti-inflammatory, anti-angiogenic, anti-fibrotic, or antiproliferative compound, e.g., a  steroid, a biologic immunomodulatory, such as an inhibitor of an immune checkpoint molecule, a monoclonal antibody, an antibody fragment, an aptamer, an siRNA, an antisense molecule, a fusion protein, a cytokine, a cytokine receptor, a bronchodilator, a statin, an anti-inflammatory agent (e.g. methotrexate) , or an NSAID. The additional therapy may include combining therapeutics of different classes. The masked antigen-binding construct preparation and the additional therapy can be administered simultaneously or sequentially.

[0304] Proteases in tissues can be monitored using a variety of techniques, including both those that monitor protease activity as well as those that can detect proteolytic activity. Conventional methods that can detect the presence of proteases in a tissue, which could include both inactive and active forms of the protease, include IHC, RNA sequencing, Western blot, or ELISA-based methods. Additional techniques can be used to detect protease activity in tissues, which includes zymography, in situ zymography by fluorescence microscopy, or the use of fluorescent proteolytic substrates. In addition, the use of fluorescent proteolytic substrates can be combined with immuno-capture of specific proteases. Additionally, antibodies directed against the active site of a protease can be used by a variety of techniques including IHC, fluorescence microscopy, Western blotting, ELISA, or flow cytometry (See, Sela-Passwell et al. Nature Medicine. 18: 143-147.2012; LeBeau et al. Cancer Research. 75: 1225-1235.2015; Sun et al. Biochemistry. 42: 892-900.2003; Shiryaev et al. 2: e80.2013. )

[0305] A nucleic acid comprising a nucleic acid sequence encoding the masked antigen-binding construct can be developed as a RNA drug or a DNA drug and can be used for therapeutic purposes. The DNA drug or RNA drug can be delivered through vehicles like lipid nanoparticles ( “LNP” ) . After translation of the nucleic acid into the masked antigen-binding constructs inside patients’ body, the masked molecules can be activated similarly as described above. Administering the masked molecules as a DNA drug or a RNA drug may improve the safety profile or therapeutic window of the masked molecules.

[0306] The masked antigen-binding constructs can be used in cellular therapies, such as CAR-T therapies. Vectors, such retroviral and lentiviral vectors, can be used to transfect the target cells (such as T cells) to express the masked antigen-binding construct as part of a chimeric antigen receptor (CAR) . The expressed CAR on the cell surface can have a masked antigen-binding domain which can be activated as describe above. Comparing to traditional CAR-T therapies, cellular therapies with the masked antigen-binding construct may have an improved safety profile or therapeutic window.

[0307] Similar to an ADC, the masked antigen-binding construct can be a part of a fusion  molecule containing a peptide / protein / cytokine / enzyme etc.

[0308] Structural Analysis of Antigen-binding Constructs

[0309] There are two general approaches to predicting the structure of a protein of interest: template-based modelling, in which the previously determined structure of a related protein is used to model the unknown structure of the target; and template-free modelling, which does not rely on global similarity to a structure in the Protein Data Bank (PDB) and hence can be applied to proteins with novel folds. Both of these methods can be used to predict the interaction of the alpha-helix mask and the antibody. In some embodiments, a template-free modelling method (e.g., alphafold2 or esmfold) is used.

[0310] The steps in standard template-based modelling include selection of a suitable structural template; alignment of the target sequence to the template structure; and molecular modelling to account for mutations, insertions and deletions present in the target–template alignment. Closely related templates can be detected by using single-sequence search methods such as BLAST to scan the PDB sequences. To detect more distantly related templates, a target sequence profile built from a multiple-sequence alignment can be used to scan a database of sequence profiles for proteins of known structure by profile–profile comparison or can be matched to a library of structural templates to assess sequence–structure compatibility. Template selection methods return an initial target–template alignment that can be adjusted manually, often in an iterative manner after model building. Given an alignment to a template, established tools can be used to quickly construct molecular models of the target sequence by performing side-chain optimization only at mutated positions and by rebuilding the backbone around insertions and deletions. For target protein sequences that are only distantly related to proteins of known structure, more sophisticated approaches that rely on multiple templates and perform aggressive backbone conformational sampling may be required. Together with available crystal structures, template-based modelling approaches can provide structural information for roughly two-thirds of known protein families.

[0311] Template-free modelling approaches can be applied to proteins without global structural similarity to a protein in the PDB. Lacking a structural template, these methods require a conformational sampling strategy for generating candidate models, as well as a ranking criterion by which native-like conformations can be selected. The structure prediction process without a template typically begins with the construction of a multiple-sequence alignment of the target protein and related sequences. The sequences of the target and its  homologues are then used to predict local structural features, such as secondary structure and backbone torsion angles, and non-local features, such as residue–residue contacts or inter-residue distances across the polypeptide chain. These predicted features guide the process of building 3D models of the target protein structure, which are then refined, ranked and compared with one another to select the final predictions. End-to-end deep neural network directly predicts the 3D coordinates of all heavy atoms for a given protein using embed multiple sequence alignments (MSAs) and pairwise features. Leveraging the insight that language models learn evolutionary patterns across millions of sequences, single-sequence protein structure prediction methods direct inference of structure from primary sequence using a large language model enables high resolution structure prediction.

[0312] Structural analysis of the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct (e.g., antibody) or the masked antigen-binding construct can be conducted to identify key framework residues in the starting framework regions that may be need to be retained if they are non-identical to those corresponding residue in the acceptor antibody. These key residues may be identified by methods well known in the art, e.g., by modeling of the interactions of the CDR and framework residues to identify framework residues important for antigen binding and sequence comparison to identify unusual framework residues at particular positions. (See, e.g., Queen et al., U.S. Pat. No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988) , which are incorporated herein by reference in their entireties. ) Three-dimensional immunoglobulin models are commonly available and are familiar to those skilled in the art. Computer programs are available which illustrate and display probable three-dimensional conformational structures of selected candidate immunoglobulin sequences. Inspection of the three-dimensional conformational structures permits analysis of the likely role of the residues in the functioning of the candidate immunoglobulin sequence, i.e., the analysis of residues that influence the ability of the candidate immunoglobulin to bind its antigen. In this way, FR residues can be selected and combined from the consensus and import sequences so that the desired antibody characteristic, such as increased affinity for the target antigen (s) , is achieved.

[0313] The structure of the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct (e.g., antibody) or the masked antigen-binding construct can predicted by deep learning-based folding methods, such as Alphafold2, RosettaFold, or VibrantFold. The antibody structure can be modeled using Antibody Modeler in Molecular Operating Environment (Molecular Operating Environment (MOE) , 2011.10; Chemical Computing Group Inc., Montreal, QC, Canada) . The MOE Antibody Homology Modeling accounts for the particular structural  composition of antibodies when searching for template candidates and composing templates. As a result, models can be generated based on templates containing framework and CDR loops from different sources composed as dimers. A knowledge-based approach can be applied with an underlying database of antibody structures currently in the Protein Data Bank (PDB) , clustered by class, species, subclass and framework sequence identity. This database can be enriched with additional antibody structures and can be continually updated and reclustered.

[0314] Multiple structural models can be provided for each starting antigen-binding construct or each masked antigen-binding construct in order to generate a single consensus structure. The consensus structure is then used for further structure-based analysis. Structural models can be eliminated if they contain any deletion or gap in the modeled structure.

[0315] Having identified an appropriate structural model, one of ordinary skill in the art can annotate the modeled structure to identify CDRs or FRs by correlating the structure with the annotated sequence of the starting antigen-binding construct provided above. For example, if there is a deletion or insertion at in the modeled structure, the structural model can be shifted or recalibrated to correlate with the structural positions of the original starting antigen-binding construct.

[0316] Many programs are available for modeling and evaluating the 3D structure of a masked antigen-binding construct (e.g., antibody) (see, e.g., U.S. Patent No. 7,117,096) . For example, a molecular mechanics software may be employed for these purposes, examples of which include, but are not limited to CONGEN, SCWRL, UHBD, GENPOL and AMBER.

[0317] CONGEN (CONformation GENerator) is a program for performing conformational searches on segments of proteins (R. E. Bruccoleri (1993) Molecular Simulations 10, 151–174 (1993) ; R. E. Bruccoleri, E. Haber, J. Novotny, (1988) Nature 335, 564–568 (1988) ; R. Bruccoleri, M. Karplus. (1987) Biopolymers 26, 137–168) . It is most suited to problems where one needs to construct undetermined loops or segments in a known structure, i.e. homology modeling. The basic energy function used includes terms for bonds, angles, torsional angels, improper angles, van der Waals and electrostatic interactions with distance dependent dielectric constant using Amber94 forcefield which can be determined using CONGEN. The program can be used to perform both conformational searches and structural evaluation using basic or refined scoring function. The program can calculate other properties of the molecules such as the solvent accessible surface area and conformational entropies, given steric constraints.

[0318] SCWRL is a side chain placing program that can be used to generate side chain  rotamers and combinations of rotamers using the backbone dependent rotamer library (Dunbrack R L Jr, Karplus M (1993) J Mol Biol 230: 543–574; Bower, M J, Cohen F E, Dunbrack R L (1997) J Mol Biol 267, 1268–1282) . The library provides lists of chi1-chi2-chi3-chi4 values and their relative probabilities for residues at given phi-psi values. The program can further explore these conformations to minimize sidechain-backbone clashes and sidechain-sidechain clashes. Once the steric clash is minimized, the side chains and the backbone of the substituted segment can be energy minimized to relieve local strain using CONGEN (Bruccoleri and Karplus (1987) Biopolymers 26: 137–168) .

[0319] Several automatic programs that are developed specifically for building antibody structures may be used for structural modeling of the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct (e.g., antibody) or the masked antigen-binding construct. The ABGEN program is an automated antibody structure generation algorithm for obtaining structural models of antibody fragments (Mandal et al. (1996) Nature Biotech. 14: 323–328) . ABGEN utilizes a homology based scaffolding technique and includes the use of invariant and strictly conserved residues, structural motifs of known Fab, canonical features of hypervariable loops, torsional constraints for residue replacements and key inter-residue interactions. Specifically, the ABGEN algorithm consists of two principal modules, ABalign and ABbuild. ABalign is the program that provides the alignment of an antibody sequence with all the V-region sequences of antibodies whose structures are known and computes alignment score scores. The highest scoring library sequence is considered to be the best fit to the test sequence. ABbuild then uses this best fit model output by ABalign to generate the three-dimensional structure and provides Cartesian coordinates for the desired antibody sequence.

[0320] WAM (Whitelegg N R J and Rees, A R (2000) Protein Engineering 13, 819–824) is an improved version of ABM which uses a combined algorithm (Martin, A C R, Cheetham, J C, and Rees A R (1989) PNAS 86, 9268–9272) to model the CDR conformations using the canonical conformations of CDRs loops from PDB database and loop conformations generated using CONGEN. In short, the modular nature of antibody structure makes it possible to model its structure using a combination of protein homology modeling and structure predictions.

[0321] The method described herein can be used to model antibody structure. Because antibody is one of the most conserved proteins in both sequence and structure, homology models of antibodies are relatively straightforward, except for certain CDR loops that are not yet determined within existing canonical structures or those with insertion or deletions. In  some cases, these loops can be modeled using algorithms that combine homology modeling with conformational search, or using deep learning algorithms as described herein.

[0322] Systems, Software, and Interfaces

[0323] The methods described herein (e.g., in silico screening of alpha-helix masks) often require a computer, processor, software, module or other apparatus. Methods described herein typically are computer-implemented methods, and one or more portions of a method sometimes are performed by one or more processors. Embodiments pertaining to methods described herein generally are applicable to the same or related processes implemented by instructions in systems, apparatus and computer program products described herein. Processes and methods described herein may be performed by automated methods. An automated method may be embodied in software, modules, processors, peripherals and / or an apparatus comprising the like. As used herein, software refers to computer readable program instructions that, when executed by a processor, perform computer operations, as described herein.

[0324] Data or datasets can be characterized by one or more features or variables, including e.g., values for amino acid sequences. The sequencing apparatus may be included as part of the system. A system may contain a computing apparatus and a sequencing apparatus, where the sequencing apparatus is configured to receive physical nucleic acid and generate sequence reads, and the computing apparatus is configured to process the reads from the sequencing apparatus.

[0325] Implementations of the subject matter and the functional operations described herein can be implemented in digital electronic circuitry, in tangibly-embodied computer software or firmware, in computer hardware, including the structures described herein and their structural equivalents, or in combinations of one or more of the structures. Implementations of the subject matter described herein can be implemented as one or more computer programs, i.e., one or more modules of computer program instructions encoded on a tangible program carrier for execution by, or to control the operation of, a processing device. Alternatively, or in addition, the program instructions can be encoded on a propagated signal that is an artificially generated signal, e.g., a machine-generated electrical, optical, or electromagnetic signal that is generated to encode information for transmission to suitable receiver apparatus for execution by a processing device. A machine-readable medium can be a machine-readable storage device, a machine-readable storage substrate, a random or serial access memory device, or a combination of one or more of them.

[0326] Referring to FIG. 3, system 10 processes data via applying a processor to the input data, and outputs information (e.g., in silico screening of alpha-helix masks) . System 10 includes client device 12, data processing system 18, data repository 20, network 16, and wireless device 14. The processor processes the input data based on the methods described herein.

[0327] Data processing system 18 retrieves, from data repository 20, data 21 representing one or more processor parameter values, including e.g., the value threshold level and / or the antigen-binding construct sequences. Data processing system 18 inputs the retrieved data into a processor, e.g., into data processing program 30. In this embodiment, data processing program 30 is programmed to perform in silico screening of alpha-helix masks.

[0328] Data processing system 18 can generate data for a graphical user interface that, when rendered on a display device of client device 12, display a visual representation of the output. The values for these parameters can be stored in data repository 20 or memory 22.

[0329] Client device 12 can be any sort of computing device capable of taking input from a user and communicating over network 16 with data processing system 18 and / or with other client devices. Client device 12 can be a mobile device, a desktop computer, a laptop computer, a cell phone, a personal digital assistant (PDA) , a server, an embedded computing system, and so forth.

[0330] Data processing system 18 can be any of a variety of computing devices capable of receiving data and running one or more services. Data processing system 18 can include a server, a distributed computing system, a desktop computer, a laptop computer, a cell phone, and the like. Data processing system 18 can be a single server or a group of servers that are at a same position or at different positions (i.e., locations) . Data processing system 18 and client device 12 can run programs having a client-server relationship to each other. Although distinct modules are shown in the figure, client and server programs may run on the same device.

[0331] Data processing system 18 can receive data from wireless device 14 and / or client device 12 through input / output (I / O) interface 24 and data repository 20. Data repository 20 can store a variety of data values for data processing program 30. The processing program (which may also be referred to as a program, software, a software application, a script, or code) can be written in any form of programming language, including compiled or interpreted languages, or declarative or procedural languages, and it can be deployed in any form, including as a stand-alone program or as a module, component, subroutine, or other unit suitable for use in a computing environment. The data processing program may, but need not,  correspond to a file in a file system. The program can be stored in a portion of a file that holds other programs or information (e.g., one or more scripts stored in a markup language document) , in a single file dedicated to the program in question, or in multiple coordinated files (e.g., files that store one or more modules, sub programs, or portions of code) . The data processing program can be deployed to be executed on one computer or on multiple computers that are located at one site or distributed across multiple sites and interconnected by a communication network.

[0332] Interface 24 can be a type of interface capable of receiving data over a network, including, e.g., an Ethernet interface, a wireless networking interface, a fiber-optic networking interface, a modem, and so forth. Data processing system 18 also includes a processing device 28. As used herein, a “processing device” encompasses all kinds of apparatuses, devices, and machines for processing information, such as a programmable processor, a computer, or multiple processors or computers. The apparatus can include special purpose logic circuitry, e.g., an FPGA (field programmable gate array) or an ASIC (application specific integrated circuit) or RISC (reduced instruction set circuit) . The apparatus can also include, in addition to hardware, code that creates an execution environment for the computer program in question, e.g., code that constitutes processor firmware, a protocol stack, an information base management system, an operating system, or a combination of one or more of them.

[0333] Data processing system 18 also includes a memory 22 and a bus system 26, including, for example, a data bus and a motherboard, which can be used to establish and to control data communication between the components of data processing system 18. Processing device 28 can include one or more microprocessors. Generally, processing device 28 can include an appropriate processor and / or logic that is capable of receiving and storing data, and of communicating over a network. Memory 22 can include a hard drive and a random access memory storage device, including, e.g., a dynamic random access memory, or other types of non-transitory, machine-readable storage devices. Memory 22 stores data processing program 30 that is executable by processing device 28. These computer programs may include a data engine for implementing the operations and / or the techniques described herein. The data engine can be implemented in software running on a computer device, hardware or a combination of software and hardware.

[0334] Various methods and formulae can be implemented, in the form of computer program instructions, and executed by a processing device. Suitable programming languages for expressing the program instructions include, but are not limited to, Python, C, C++, an  embodiment of FORTRAN such as FORTRAN77 or FORTRAN90, Java, Visual Basic, Perl, Tcl / Tk, JavaScript, ADA, and statistical analysis software, such as SAS, R, MATLAB, SPSS, and Stata etc. Various aspects of the methods may be written in different computing languages from one another, and the various aspects are caused to communicate with one another by appropriate system-level-tools available on a given system.

[0335] The processes and logic flows described in this disclosure can be performed by one or more programmable computers executing one or more computer programs to perform functions by operating on input information and generating output. The processes and logic flows can also be performed by, and apparatus can also be implemented as, special purpose logic circuitry, e.g., an FPGA (field programmable gate array) or an ASIC (application specific integrated circuit) or RISC.

[0336] Computers suitable for the execution of a computer program include, by way of example, general or special purpose microprocessors, or both, or any other kind of central processing unit.

[0337] Computer readable media suitable for storing computer program instructions and information include various forms of non-volatile memory, media and memory devices, including by way of example semiconductor memory devices, e.g., EPROM, EEPROM, and flash memory devices; magnetic disks, e.g., internal hard disks or removable disks; magneto optical disks; and CD ROM and (Blue Ray) DVD-ROM disks. The processor and the memory can be supplemented by, or incorporated in, special purpose logic circuitry.

[0338] To provide for interaction with a user, implementations of the subject matter described in this disclosure can be implemented on a computer having a display device, e.g., a CRT (cathode ray tube) or LCD (liquid crystal display) monitor, for displaying information to the user and a keyboard and a pointing device, e.g., a mouse or a trackball, by which the user can provide input to the computer. Other kinds of devices can be used to provide for interaction with a user as well. In addition, a computer can interact with a user by sending documents to and receiving documents from a device that is used by the user; for example, by sending web pages to a web browser on a user’s client device in response to requests received from the web browser.

[0339] Implementations of the subject matter described herein can be implemented in a computing system that includes a back end component, e.g., as an information server, or that includes a middleware component, e.g., an application server, or that includes a front end component, e.g., a client computer having a graphical user interface or a Web browser through which a user can interact with an implementation of the subject matter, or any  combination of one or more such back end, middleware, or front end components. The components of the system can be interconnected by any form or medium of digital information communication, e.g., a communication network. Examples of communication networks include a local area network ( “LAN” ) and a wide area network ( “WAN” ) , e.g., the Internet.

[0340] The computing system can include clients and servers. A client and server are generally remote from each other and typically interact through a communication network. The relationship of client and server arises by virtue of computer programs running on the respective computers and having a client-server relationship to each other. The server may be in the cloud via cloud computing services.

[0341] While this disclosure includes many specific implementation details, these should not be construed as limitations on the scope of any of what may be claimed, but rather as descriptions of features that may be specific to particular implementations. Certain features that are described in this disclosure in the context of separate implementations can also be implemented in combination in a single implementation. Conversely, various features that are described in the context of a single implementation can also be implemented in multiple implementations separately or in any suitable subcombination. Moreover, although features may be described above as acting in certain combinations and even initially claimed as such, one or more features from a claimed combination can in some cases be excised from the combination, and the claimed combination may be directed to a subcombination or variation of a subcombination.

[0342] Similarly, while operations are described in a particular order, this should not be understood as requiring that such operations be performed in the particular order shown or in sequential order, or that all illustrated operations be performed, to achieve desirable results. In certain circumstances, multitasking and parallel processing may be advantageous. Moreover, the separation of various system components in the implementations described above should not be understood as requiring such separation in all implementations, and it should be understood that the described program components and systems can generally be integrated together in a single software product or packaged into multiple software products.

[0343] Particular implementations of the subject matter have been described. Other implementations are within the scope of the claims. For example, the actions recited in the claims can be performed in a different order and still achieve desirable results. The processes depicted in the accompanying figures may not necessarily require the particular order shown, or sequential order, to achieve desirable results. In some implementations, multitasking and  parallel processing may be advantageous.

[0344] EXAMPLES

[0345] The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

[0346] Example 1: In silico screening of alpha-helix that blocks antibody CDR regions

[0347] This example describes the process of screening alpha-helixes that mask the CDRs of anti-mouse CD3 antibody TAm, anti-human HER2 antibody Trastuzumab, anti-human EGFR antibodies Cetuximab (C225) , Panitumumab, anti-CD19 antibody Blinatumomab, anti-HER2 single domain antibody ErBB, and anti-CD3 single domain antibody EP03 by in silico screening. For these antibodies, the alpha-helix was placed at the N-terminus of the heavy or light chain of the antibody and the antibodies were screened in silico, through indicators including alpha-helix pLDDT, alpha-helix ptm, ipTM, and Distance. For the specific screening process in the example, please refer to the Detailed Description in the subsection tilted “Designing Alpha-Helix Masks” . Example 3 and Example 5 show the specific structures. The table below shows the screening results:

[0348] Table 1: alpha-helix masked antigen-binding construct evaluation index table

[0349] The calculation methods for pLDDT and ipTM in the above table can be found in Jumper, John, et al. “Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. ” Nature 596.7873 (2021) : 583-589, which is incorporated by reference in its entirety. “Alpha-helix  pLDDT” means that only the pLDDT of the predicted structure with masking alpha-helix is calculated, and this value should be greater than 55. “Alpha-helix ptm” is used to evaluate the accuracy of the alpha-helix structure prediction, and this value should be greater than 0.5. “ipTM” evaluates the correctness of the docking between the masking alpha-helix sequence and the antibody, and this value should be greater than 0.45. “Distance” measures the spatial distance between the masking alpha-helix and the CDRs of the antibody, and this value should be less than Its calculation is as follows:

[0350] where dij represents the Euclidean distance from the ith amino acid of alpha-helix to the jth amino acid of the antibody CDR region; m represents the number of amino acids in the alpha-helix and n represents the number of amino acids in the CDR region.

[0351] In some cases, the alpha-helix was connected to the N-terminus of the light chain through a cleavable linker. The structural simulations of CEA+TAm-R1-L16, CEA+TAm-R1-L17, and N_L_Pani_mask70 are shown in FIGs. 1A-1C.

[0352] In some cases, the alpha-helix was connected to the N-terminus of the heavy chain through a cleavable linker. The structural simulations CEA+TAm-R1-H1, CEA+TAm-R1-H4, CEA+TAm-R1-H5, N_H_Cet-mask72, N_H_Pani_mask1, Tra-R2-2, and Tra-R2-4 are shown in FIGs. 1D-1J.

[0353] Example 2: Preparation, screening and bispecific antibody construction of CD3 antibody and CEA antibody

[0354] On the basis of the anti-mouse CD3 antibody, the anti-mouse CD3 antibody TAm was obtained through mutation, library construction, humanization and multiple screening.

[0355] CEA antibodies were obtained by immunizing llamas (lama) . Adult alpacas were immunized subcutaneously with 250μg of recombinant tumor antigen human CEA, once every other month, for a total of 5 times. PBMC cells were isolated. RNA was extracted to construct a phage antibody library. After the library was packaged to form phage particles, the liquid phase method was used for panning. The phages were combined with biotinylated CEA antigen solution, and then separated by streptavidin magnetic beads. Through multiple screening methods (e.g., ELISA and engineered cells overexpressing CEA) , the CEA antibody C17 was selected, which is referred to as CEA in the structure.

[0356] Bispecific antibody structure design: The bispecific antibody includes one CEA  antigen-binding domain and one mouse CD3 antigen-binding domain. The CEA antigen-binding domain is in the form of a single-domain antibody (VHH) , and the CD3 antigen-binding domain is in the form of a Fab. The TAm and CEA antibodies are located at the N-terminal of the Fc, and the Fc hinge region (Hinge) acts as a linker to connect the two fragments.

[0357] A Fc-containing two-chain asymmetric structure design was adopted. The Fc region endows the antibody with a longer half-life and good stability. At the same time, the design of a two-chain Knob into Hole (KIH) structure greatly reduces the probability of mismatching, improving the homogeneity and yield of the target bispecific antibody. The heavy chain structures from the N-terminal to the C-terminal of the bispecific antibody are: (1) TAm VH-CH1-knob-Fc, and (2) CEA (VHH) -hole-Fc. The light chain structure is TAm VL-CL (kappa) .

[0358] The two heavy chain IgG4 Fc are knob-Fc and hole-Fc respectively. The sequences of knob-Fc and hole-Fc are shown in the table below. The light chain is a kappa light chain.

[0359] Table 2: Fc sequence list

[0360] The table below shows the heavy chain variable region (VH) sequence and CH1 sequence of (1) the antibody targeting mouse CD3 (TAm) , and (2) the single domain antibody C17 targeting CEA (CEA) .

[0361] Table 3: TAm and CEA antibody heavy chain sequence list

[0362] The table below shows the light chain variable region (VL) sequence and light chain constant region (CL) sequence of the antibody targeting mouse CD3 (TAm) .

[0363] Table 4: TAm antibody light chain sequence list

[0364] Example 3: Preparation of CEA-TAm bispecific antibody using humanized C17 as an anti-CEA antibody and TAm as an anti-mouse CD3 antibody

[0365] Alpha-helix was linked to the N-terminus of the heavy or light chain of TAm as an antibody mask.

[0366] The Masked antigen-binding construct structure is as follows (N-terminal-C-terminal) : alpha-helix+linker 1+cleavable site+linker 2-TAm H chain (heavy chain containing knob) or TAm L chain (light chain) .

[0367] The alpha-helix-TAm antibody light chain and heavy chain sequences are shown in the tables below. The letter “L” in the name represents that the alpha-helix was linked to the light chain; the letter “H” in the name represents that the alpha-helix was linked to the heavy chain (knob) .

[0368] Table 5: alpha-helix-TAm antibody light chain / heavy chain sequences

[0369] Table 6: alpha-helix-TAm antibody light chain / heavy chain sequences

[0370] In the above table, the cleavable linker sequence GSWPHGSLQAARGS (SEQ ID NO: 21) contains a cleavable site sequence WPHGSLQAAR (SEQ ID NO: 14) and the cleavable linker sequence GLSGRSDNHGS (SEQ ID NO: 23) contains a cleavable site sequence LSGRSDNH (SEQ ID NO: 24) .

[0371] The heavy and light chain variable region DNA sequences were cloned into a mammalian expression vector in frame with a pre-inserted human IgG4 heavy chain or kappa light chain constant region.

[0372] The masked antigen-binding constructs were produced by co-transfecting Expi 293FTM cells (ThermoFisher) with mammalian expression vectors using polyethyleneimine (Polyethylenimine “Max” (PEI) ; Polysciences, Cat. No.: 24765-2) . Cells were transfected with the corresponding expression vectors at a ratio of 1: 4: 2 [ “heavy chain (knob) vector” : “heavy chain Fc (hole) vector” : “light chain vector” ] . The heavy chain and light chain composition of the bispecific antibodies are shown in the table below. CEA+TAm is a bispecific antibody without alpha-helix structure. Monoclonal antibody TAm mAb (IgG4) is used as a bivalent anti-mouse CD3 antibody control without alpha-helix structure.

[0373] Table 7: CEA-TAm bispecific antibody heavy chain and light chain composition

[0374] Expi 293FTM cells were cultured in suspension in CD OptiCHOTM medium at 37℃, 5%CO2, 135 rpm. The day before transfection, 293F cells were sub-cultured in a 1L gas-permeable Erlenmeyer culture flask (Corning) . The cell seeding density was 1.0×106 cells / ml, and the cell volume was 200 mL. On the day of transfection, the estimated cell density is 1.8-2.0×106 cells / ml. On the day of transfection, the cell suspension was centrifuged at 1000 rpm for 5 min at room temperature to collect the cells. The cells were washed once with Expi293 medium, and re-suspended with 200 ml Expi293 medium. 400μg plasmid was diluted with 5 ml Opti-MEM medium and vortexed for 15 seconds. 1.2 mg PEI was diluted with 5 ml Opti-MEM medium and vortexed for 15 sec. The PEI-containing solution was added to the DNA-containing solution drop by drop, mixed gently, and incubated at room temperature for 15 minutes. Next, the plasmid / PEI mixture was added to the cell suspension, and incubated in an incubator at 37℃, 5%CO2, and 85 rpm. 200ml EX-CELLTM293 medium and 2 mM Glutamine (Gibco) were added after 4 hours, and the rotation speed was adjusted to 135 rpm to continue culturing. Cell proliferation inhibitor (3.8 mM VPA) was added after 24 hours, and 40 ml medium D was added after 72 hours. After 7 days of culture, the supernatant was collected by centrifugation at 18000 rpm for 30 min for purification. The solution was sterile filtered with a 0.22μm filter. Sodium azide was added to reach a final concentration of 0.01%w / v. The solution was stored at 4℃.

[0375] Protein A was used to purify the target protein. Cell culture supernatants were loaded onto Mabselect Prism A FF (GE; 17-5498-01) equilibrated with 20 ml 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5. Unbound protein was removed by using at least 10 column volumes of 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5. The target protein was eluted with 5 column volumes of 20 mM Na-Citrate, pH 3.5. The protein solution was neutralized by adding 1 / 10 volume of 1 M Tris, pH 9.5.

[0376] The target protein was exchanged into the desired buffer using ZebaTM desalting spin columns (ThermoFisher) or ultrafiltration tubes (Millipore) . The protein concentration and purity were determined by SDS-PAGE electrophoresis and NanoDrop2000.2-3μg sample were used for SDS-PAGE electrophoresis. The target protein was aliquoted and stored at -80℃.

[0377] After the target protein was concentrated and filtered, it was added to a gel filtration column (Gel Filtration, HiLoad Superdex 200, GE) , which was equilibrated with 20 mM histidine, 140 mM sodium chloride solution at pH 6.0. The sample was eluted with 0.5 ml / min pH 7.2 PBS buffer at room temperature, to analyze molecular weight, purity, aggregation, etc.

[0378] In an alternative purification method, proteins were purified from cell supernatants by protein A affinity chromatography (MabSelect SuRe, GE) . The protein eluate was then subjected to cation exchange chromatography (HiTrap SP HP, GE) and subsequently passed through a gel filtration column (SEC) for fractionation and analysis. Proteins obtained using this purification method showed a target antibody content of>90%purity.

[0379] The protein yield and purity are shown in the table below.

[0380] Table 8: Antibody Yield and Purity

[0381] Example 4: The binding to mouse CD3 antigen (as measured by ELISA)

[0382] Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to assess the binding of the antibody to mouse CD3εantigen.

[0383] The specific protocol is listed below:

[0384] Antigen coating: the antigen mouse CD3ε-Fc (ACRO syetems, CDE-M5256) was diluted to 1μg / ml with PBS, added to the microtiter plate at 100μl / well, and left overnight at 4℃.

[0385] Blocking: the plate was washed 3 times with 0.05%PBST, and 200μl / well of 2%skimmed milk powder-PBS was added to block the plate at room temperature for 1 hour.

[0386] Primary antibody detection: the plate was washed 3 times with 0.05%PBST. The  sample antibody was diluted to 20μg / ml, and serial-diluted (at a dilution factor of 3) to 6.67 μg / ml, 2.22μg / ml, 0.74μg / ml, 0.25μg / ml, 0.08μg / ml, 0.03μg / ml, 0.01μg / ml, 0.003μg / ml, 0.001ug / ml, 0.0003μg / ml, and 0.0001μg / ml. The prepared serially diluted antibody samples were added to the microtiter plate at 100μl / well, and incubated (sealed) at room temperature for 1h.

[0387] Secondary antibody detection: the plate was washed 3 times with 0.05%PBST. Goat Anti-Human Kappa Light Chains (Bound and Free) -HRP (Sigma-Aldrich, A7164) was diluted at 1: 5000, added to the microtiter plate at 100μl / well, and incubated (sealed) at room temperature for 1 hour.

[0388] Color development: the plate was washed 6 times with 0.05%PBST. 100μl / well of TMB color development solution was added into the microplate. After 10 min of color development, 100μl / well of 1M HCl was added to stop color development.

[0389] Reading: a microplate reader was used to detect the absorbance at 450 nm.

[0390] The GraphPad software was used to fit the standard curve, and the EC50 of antibody binding to antigen was calculated.

[0391] The experimental results showed that, compared with the monoclonal antibody TAm (IgG4) , the bispecific antibody CEA+TAm had a similar binding curve to mouse CD3 antigen, with an EC50 of about 14.41μg / ml. The bispecific antibody CEA+TAm with the alpha-helix mask showed greatly reduced binding to mouse CD3 antigen (as compared to CEA+TAm) , and the affinity reduction ratio calculated from the OD value is 9-27 times. The affinity reduction ratio of CEA+TAm-R1-H4 exceeds 500 times.

[0392] The experimental results are shown in Figures 2A and 2B and the table below.

[0393] Table 9: The binding EC50 (μg / ml) of the antibody to mouse CD3 antigen and the reduction factor of the antibody affinity

[0394] Example 5: Preparation of anti-human HER2 (ERBB2)  / EGFR (ERBB1) antibodies

[0395] Anti-human HER2 antibody Trastuzumab, anti-human EGFR antibody Cetuximab (C225) and Panitumumab antibody were used as controls, and masked monoclonal antibodies were prepared according to Example 1. Alpha-helix was constructed as an antibody mask to the N-terminus of the heavy or light chain of the antibody. The antibody sequences are shown in the table below.

[0396] Table 10. Anti-human HER2 (ERBB2)  / EGFR (ERBB1) antibody sequence list

[0397] The variable regions of the heavy and light chain DNA sequences were cloned into a mammalian expression vector, in frame with a pre-inserted human IgG1 heavy chain constant region or kappa light chain constant region.

[0398] The molecules were produced by co-transfecting Expi 293FTM cells (ThermoFisher) with mammalian expression vectors using polyethyleneimine (Polyethylenimine “Max” (PEI) ; Polysciences, Cat. No.: 24765-2) . Cells were transfected with the corresponding expression vectors at a ratio of 1: 1.5 [ “heavy chain vector” : “light chain vector” ] . Protein expression and purification were performed according to the methods in Example 3.

[0399] The protein yield and purity of the monoclonal antibodies are shown in the table below.

[0400] Table 11: yield and purity of anti-human HER2 / EGFR antibodies

[0401] Example 6: Affinity of the antibodies to human HER2 and human EGFR, as measured by biofilm interferometry (BLI)

[0402] Biofilm interferometry (BLI) experiments were performed on OCTECT RED96e (ForteBio) at 30℃with 0.02%PBST solution as the running buffer (10 mmol / L Na2HPO4; 1.75 mmol / L KH2PO4; 137 mmol / L NaCl; 2.65 mmol / L KCl; pH 7.2-7.4, 0.02%Surfactant Tween 20) .

[0403] First, the sample antibody was captured on the surface of the AHC2 sensor chip (Anti-hIgG Fc, sartorius) with immobilized anti-human Fc. Specifically, the sample antibody was diluted to 5μg / ml, and 1.5 nm protein was coupled to the surface of the AHC sensor chip by 0.02%PBST.

[0404] Analytes human HER2 (ACRO Systems, HE2-H5225) and recombinant tumor antigen human EGFR (CEACAM-5 / CD66e, ACRO Systems, EGR-H5222) were diluted to 200 nM in 0.02%PBST.

[0405] After the sample antibody was captured by the chip, it was used to bind and dissociate with different concentrations of analytes to obtain the KD value of the interaction. The experimental parameters are as follows: Baseline1: 60s, Loading: 240s, Baseline2: 180s, Association: 240s, Dissociation: 600s, Loading Response: 1.5-2.0 (nm) , High sensitivity kinetics: 2Hz. Kinetic constants were derived by fitting the rate equation for 1: 1 Langmuir binding by numerical integration to obtain the equilibrium dissociation constant (KD) . Date Analysis HT 12 software (sartorius, 50-5029) was used to simultaneously fit the binding-dissociation curve to calculate Kon and Koff. Affinity KD=Koff / Kon.

[0406] The results showed that the affinities of anti-HER2 antibodies to human HER2 was 3.10 nM-7.91 nM. Compared with Trastuzumab, the binding of masked antigen-binding constructs Tra-R2-2 and Tra-R2-4 containing alpha-helix structure decreased by 57%and  55%, respectively, indicating that alpha-helix at the N-terminal of the heavy chain of the antibody significantly hinders binding with the HER2 antigen, and the mass of the bound antigen decreased by more than 50%. Compared with Trastuzumab, the affinity of Tra-R2-4 decreased by 1.5 times, and the affinity of Tra-R2-2 changed little.

[0407] The affinities between anti-EGFR antibodies (Cetuximab and N_H_Cet-mask72) and human EGFR antigen was 3.18 nM-3.95 nM, and the affinity did not change much. Compared with Cetuximab, the binding of N_H_Cet-mask72, a masked antigen-binding construct containing alpha-helix structure, to human EGFR antigen decreased by 30%. This indicates that alpha-helix at the N-terminus of the heavy chain of the antibody obviously hinders binding with the EGFR antigen, and the mass of the bound antigen decreased by 30%.

[0408] The affinities of anti-EGFR antibodies (Panitumumab, N_L_Pani_mask70 and N_H_Pani_mask1) to human EGFR antigens ranged from 0.998 nM to 1.10 nM, with little change in affinity. Compared with Panitumumab, the binding of N_L_Pani_mask70 and N_H_Pani_mask1 containing alpha-helix structure decreased by 31%and 28%, respectively. This indicates that alpha-helix at the N-terminus of the antibody light chain or the N-terminus of the antibody heavy chain obviously hinders binding with the EGFR antigen, and the mass of the bound antigen decreased by about 30%.

[0409] Example 7: Preparation of anti-CD19 antibodies based on Blinatumomab

[0410] Anti-CD19 antibody Blinatumomab was used as control, and masked monoclonal antibodies were prepared according to Example 3. Alpha-helix was constructed as an antibody mask to the N-terminus of the heavy or light chain of the antibody. The antibody sequences are shown in the table below.

[0411] Table 12: anti-CD19 antibody sequence list

[0412] For each antibody, the sequences were inserted into the pCDNA3.1 vector, and then the plasmids were transfected into HEK 293F cells through PEI (polysciences, 24765-2) for transient expression of the target protein. After culturing for 5 days, the cell supernatant was harvested. Ni Sepharose excel or Protein A (Cytiva) was used to purify the target protein. SDS-PAGE gel electrophoresis was used to analyze the purity.

[0413] The protein yield and purity of the monoclonal antibodies are shown in the table below.

[0414] Table 13: yield and purity of anti-CD19 antibodies

[0415] Example 8: The binding of the anti-CD19 antibodies to Raji cells (as measured by flow cytometry)

[0416] The binding of the anti-CD19 antibodies to Raji cells was assessed using flow cytometry. The specific protocol is described below:

[0417] Raji cells were collected, resuspend in PBS, and placed in a 96-well plate. 100μl of serially diluted antibodies was added to each well. The cells were resuspended by gently pipetting, and incubated at 4℃ for 2 h. After washing twice with PBS, 100μl of diluted PE-anti-human IgG Fc antibody (Rb pAb to 6X tag (FITC) , (abcam, Cat: ab1206) ) was added to each well, and incubated at 4℃ for 0.5 h. After washing twice with PBS, the plate was read with Beckman Cytoflex. The results showed that the designed mask-Blinatumomab antibodies had a significant decrease in their binding ability to Raji cells. The specific results are shown in FIG. 16 and the table below:

[0418] Table 14: The binding EC50 (μg / ml) of the anti-CD19 antibodies to Raji cells

[0419] Example 9: Preparation of anti-HER2 single domain antibodies based on ErBB

[0420] The single domain antibody ERBB was constructed based on IgG4-Fc, namely ErBB-Fc. An alpha-helix mask was added to the N-terminus of the single domain antibody, that is, alpha-helix+linker 1+substrate+linker 2-ErBB H chain-Fc. In this example, the alpha-helix mask may have two types of structures. The first type has a secondary structure that is a single helical structure, and the second type has a secondary structure that is composed of two helical structures, as shown in the FIGS. 17A-17B. The antibody sequences are shown in the table below.

[0421] Table 15: anti-HER2 single domain antibody sequence list

[0422] Protein expression and purification were performed according to the methods in Example 3. The protein yield and purity of the monoclonal antibodies are shown in the table below.

[0423] Table 16: yield and purity of anti-HER2 single domain antibodies

[0424] Example 10: The binding of the anti-HER2 single domain antibodies to H1573 cells (as measured by flow cytometry)

[0425] The binding of the anti-HER2 single domain antibodies to H1573 cells was assessed using flow cytometry. The specific protocol is described below:

[0426] H1573 cells were collected, resuspend in PBS, and placed in a 96-well plate. 50μl of serially diluted antibodies was added to each well. The cells were resuspended by gently pipetting, and incubated at 4℃ for 2 h. After washing twice with PBS, 100μl of diluted PE-anti-human IgG Fc antibody (Invitrogen#12-4998-82, Lot: 2533138) was added to each well, and incubated at 4℃ for 0.5 h. After washing twice with PBS, the plate was measured by using Beckman Cytoflex. The results showed that the designed mask-ErBB single domain antibodies had a significant decrease (up to 10 times) in their binding ability to H1573 cells. The specific results are shown in FIGS. 18A-18B.

[0427] Example 11: The binding of the anti-HER2 single domain antibodies to H1573 cells after enzyme cleavage (as measured by flow cytometry)

[0428] 250 ng of enzyme (R&D, Catalog#: 911-MP) was used to digest 50μg of antibody in a 250μl system. The digestion was performed at 37℃ for 15 hours. H1573 cells were  collected, resuspended in PBS, and placed in a 96-well plate. Serially diluted enzyme-digested antibodies were added to each well. The cells were resuspended by gently pipetting, and incubated at 4℃ for 2 hours. After washing twice with PBS, 100μl of diluted PE-goat anti-human IgG Fc antibody (Invitrogen#12-4998-82, Lot: 2533138) was added to each well, and incubated at 4℃ for 0.5 h. After washing twice with PBS, the plate was measured by Beckman Cytoflex. The experimental results showed that, after enzyme digestion, the flow cytometry curve of the antibody and masking antibody was basically consistent with the starting control antibody ErBB-Fc, indicating that the mask had fallen off after enzyme digestion. The specific results are shown in FIG. 19 and the below table:

[0429] Table 17: The binding EC50 (μg / ml) of the anti-HER2 single domain antibodies to H1573 cells after enzyme cleavage

[0430] Further, the anti-HER2 single domain antibodies were analyzed using SDS-PAGE before and after enzyme digestion. The results are shown in FIG. 20. It can be seen from the SDS-PAGE results that the molecular weight after enzyme digestion is smaller than the molecular weight before enzyme digestion, indicating that the mask had fallen off after enzyme digestion.

[0431] Example 12: Preparation of anti-CD3 single domain antibodies based on EP03

[0432] The single domain antibody EP03 was constructed based on IgG4-Fc, namely ErBB-Fc. An alpha-helix mask was added to the N-terminus of the single domain antibody, that is, alpha-helix+linker 1+substrate+linker 2-EP03 H chain-Fc. In this example, the alpha-helix mask may have two types of structures. The first type has a secondary structure that has a single helical structure, and the second type has a secondary structure that has two helical structures. The antibody sequences are shown in the table below.

[0433] Table 18: anti-CD3 single domain antibody sequence list

[0434] Protein expression and purification were performed according to the methods in Example 3. The protein yield and purity of the monoclonal antibodies are shown in the table below. Compared with the starting EP03-Fc, EP03-H1 and EP03-H2 (having a single  alpha-helix) had significant improvements, while EP03-dH1 and EP03-dH2 (having two alpha-helixes) also had significant improvements.

[0435] Table 19: yield and purity of anti-CD3 single domain antibodies

[0436] Example 13: The binding of the anti-CD3 single domain antibodies to Jurkat cells (as measured by flow cytometry)

[0437] The binding of the anti-CD3 single domain antibodies to Jurkat cells was assessed using flow cytometry, based on the methods described in Example 10.

[0438] The results showed that the designed mask-EP03 single domain antibodies had a significant decrease in their binding ability to Jurkat cells. The specific results are shown in FIG. 21 and the table below.

[0439] Table 20: The binding EC50 (μg / ml) of the anti-CD3 antibodies to Jurkat cells

[0440] Example 14: The binding of the anti-CD3 single domain antibodies to Jurkat cells after enzyme cleavage (as measured by flow cytometry)

[0441] The binding of the anti-CD3 single domain antibodies to Jurkat cells after enzyme cleavage was assessed using flow cytometry, based on the methods described in Example 11.

[0442] The experimental results showed that, after enzyme digestion, the flow cytometry curve of the antibody and masking antibody was basically consistent with the starting control antibody EP03-Fc, indicating that the mask had fallen off after enzyme digestion. The specific results are shown in FIG. 22 and the below table:

[0443] Table 21: The binding EC50 (μg / ml) of the anti-CD3 single domain antibodies to Jurkat cells after enzyme cleavage

[0444] Further, the anti-CD3 single domain antibodies were analyzed using SDS-PAGE before and after enzyme digestion. The results are shown in FIG. 23. It can be seen from the SDS-PAGE results that the molecular weight after enzyme digestion is smaller than the molecular weight before enzyme digestion, indicating that the mask had fallen off after enzyme digestion.

[0445] OTHER EMBODIMENTS

[0446] It is to be understood that while the invention has been described in conjunction with the detailed description thereof, the foregoing description is intended to illustrate and not limit the scope of the invention, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages, and modifications are within the scope of the following claims.

Claims

1.A masked antigen-binding domain, comprising(a) an antigen-binding domain, and(b) an alpha-helix mask,wherein the alpha-helix mask comprises an alpha-helix coil, wherein the alpha-helix mask is linked to the antigen-binding domain, optionally by a single covalent bond, and blocks the interaction between the antigen-binding domain and its target antigen.2.The masked antigen-binding domain of claim 1, wherein (1) the alpha-helix coil does not form a coiled coil structure that is linked to the antigen-binding domain by multiple covalent bonds; and / or (2) the alpha-helix coil specifically binds to the antigen-binding domain.3.The masked antigen-binding domain of claim 1 or claim 2, wherein the alpha-helix mask comprises a single alpha-helix coil, or one or more alpha-helix coils (e.g., 2, 3, 4, or 5 alpha-helix coils) .4.A masked antigen-binding domain, comprising(a) an antigen-binding domain, and(b) an alpha-helix mask,wherein the alpha-helix mask comprises a single polypeptide comprising an alpha-helix coil.5.The masked antigen-binding domain of any one of claims 1-4, wherein the masked antigen-binding domain further comprises a cleavable linker between (a) the antigen-binding domain, and (b) the alpha-helix mask.6.The masked antigen-binding domain of claim 5, wherein the cleavable linker can be cleaved by an enzyme to release the alpha-helix mask from the masked antigen-binding domain.7.The masked antigen-binding domain of claim 6, wherein the enzyme is an enzyme that is present in a tumor microenvironment (e.g., a matrix metalloproteinase) .8.The masked antigen-binding domain of any one of claims 1-7, wherein the antigen-binding domain comprises (1) a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) , or (2) a VHH.9.The masked antigen-binding domain of claim 8, wherein the alpha-helix mask is linked to the N-terminus or the C-terminus of the VH, the VL, or the VHH.10.A masked antigen-binding construct, comprising(a) an antigen-binding domain, and(b) an alpha-helix mask,wherein the alpha-helix mask comprises an alpha-helix coil, wherein the alpha-helix mask is linked to the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct by a single covalent bond and blocks the interaction between the antigen-binding domain and its target antigen.11.The masked antigen-binding construct of claim 10, wherein the alpha-helix coil does not form a coiled coil structure that is linked to the antigen-binding portion of the masked antigen-binding construct by multiple covalent bonds.12.The masked antigen-binding construct of claim 10 or claim 11, wherein the alpha-helix mask comprises a single alpha-helix coil.13.A masked antigen-binding construct, comprising(a) an antigen-binding domain, and(b) an alpha-helix mask,wherein the alpha-helix mask comprises a single polypeptide comprising an alpha-helix coil.14.The masked antigen-binding construct of any one of claims 10-13, wherein the masked antigen-binding construct further comprises a cleavable linker between (a) the antigen-binding domain, and (b) the alpha-helix mask.15.The masked antigen-binding construct of claim 14, wherein the cleavable linker can be cleaved by an enzyme to release the alpha-helix mask from the masked  antigen-binding construct.16.The masked antigen-binding construct of claim 15, wherein the enzyme is an enzyme that is present in a tumor microenvironment (e.g., a matrix metalloproteinase) .17.The masked antigen-binding construct of any one of claims 10-16, comprising(a) a first polypeptide comprising an alpha-helix mask, a cleavable linker, a VH; and(b) a second polypeptide comprising a VL,wherein the alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the first polypeptide.18.The masked antigen-binding construct of claim 17, wherein the masked antigen-binding construct further comprises a third polypeptide comprising a VHH.19.The masked antigen-binding construct of claim 18, wherein an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the third polypeptide.20.The masked antigen-binding construct of claim 17, wherein the masked antigen-binding construct further comprises a third polypeptide comprising a VH and VL.21.The masked antigen-binding construct of claim 20, wherein an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the third polypeptide.22.The masked antigen-binding construct of claim 17, wherein the masked antigen-binding construct further comprises:(c) a third polypeptide comprising a VH; and(d) a fourth polypeptide comprising a VL.23.The masked antigen-binding construct of claim 22, wherein an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the third polypeptide.24.The masked antigen-binding construct of any one of claims 10-16, comprising(a) a first polypeptide comprising an alpha-helix mask, a cleavable linker, a VL; and(b) a second polypeptide comprising a VH,wherein the alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the first polypeptide.25.The masked antigen-binding construct of claim 24, wherein the masked antigen-binding construct further comprises a third polypeptide comprising a VHH.26.The masked antigen-binding construct of claim 25, wherein an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the third polypeptide.27.The masked antigen-binding construct of claim 24, wherein the masked antigen-binding construct further comprises a third polypeptide comprising a VH and VL.28.The masked antigen-binding construct of claim 27, wherein an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the third polypeptide.29.The masked antigen-binding construct of claim 24, wherein the masked antigen-binding construct further comprises:(c) a third polypeptide comprising a VH; and(d) a fourth polypeptide comprising a VL.30.The masked antigen-binding construct of claim 29, wherein an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the fourth polypeptide.31.The masked antigen-binding construct of any one of claims 10-16, comprising a first polypeptide comprising an alpha-helix mask, a cleavable linker, a VH and a VL, wherein the alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the first polypeptide.32.The masked antigen-binding construct of claim 31, wherein the masked antigen-binding construct further comprises a second polypeptide comprising a VHH.33.The masked antigen-binding construct of claim 32, wherein an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the second polypeptide.34.The masked antigen-binding construct of claim 31, wherein the masked antigen-binding construct further comprises a second polypeptide comprising a VH and VL.35.The masked antigen-binding construct of claim 34, wherein an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the second polypeptide.36.The masked antigen-binding construct of claim 27, wherein the masked antigen-binding construct further comprises: a second polypeptide comprising a VH and a third polypeptide comprising a VL.37.The masked antigen-binding construct of any one of claims 10-16, comprising a first polypeptide comprising an alpha-helix mask, a cleavable linker, and a VHH, wherein the alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the first polypeptide.38.The masked antigen-binding construct of claim 37, wherein the masked antigen-binding construct further comprises a second polypeptide comprising a VHH.39.The masked antigen-binding construct of claim 38, wherein an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the second polypeptide.40.The masked antigen-binding construct of claim 37, wherein the masked antigen-binding construct further comprises a second polypeptide comprising a VH and VL.41.The masked antigen-binding construct of claim 40, wherein an alpha-helix mask is linked to either the N-terminus or the C-terminus of the second polypeptide.42.The masked antigen-binding construct of claim 37, wherein the masked antigen-binding construct further comprises: a second polypeptide comprising a VH and a third polypeptide comprising a VL.43.The masked antigen-binding domain of any one of claims 1-9 or the masked antigen-binding construct of any one of claims 10-42, wherein the alpha-helix mask has no more than 150 amino acids.44.The masked antigen-binding domain of claim 43, wherein the alpha-helix mask has 5-40 amino acids.45.The masked antigen-binding domain of claim 44, wherein the alpha-helix mask has 5-20 amino acids.46.The masked antigen-binding domain of any one of claims 1-9 or the masked antigen-binding construct of any one of claims 10-42, wherein the alpha-helix mask has one or more parameters that meet a threshold level.47.The threshold level of claim 46, wherein the one or more parameters are selected from the group consisting of (1) alpha-helix pLDDT (predicted Local Distance Difference Test) , (2) alpha-helix pTM score (predicted template modeling score) , (3) ipTM score (interface pTM score) between alpha-helix and the CDR region, and (4) an average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR region.48.The threshold level of claim 47, wherein the value of the alpha-helix pLDDT is greater than 55.49.The threshold level of claim 47, wherein the value of the alpha-helix pTM score is greater than 0.5.50.The threshold level of claim 47, wherein the value of the ipTM score between alpha-helix and the CDR region is greater than 0.6, more preferably greater than 0.8.51.The threshold level of claim 47, wherein the value of the average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR region is less than more preferably less than 52.The threshold level of claim 47, wherein the value of the average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR region is less than and the value of the ipTM score is greater than 0.6.53.The threshold level of claim 52, wherein the value of the average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR region is less than and the value of the ipTM score is greater than 0.8.54.The masked antigen-binding domain of any one of claims 1-9 or the masked antigen-binding construct of any one of claims 10-42, comprising only one alpha-helix mask.55.The masked antigen-binding domain of any one of claims 1-9 or the masked antigen-binding construct of any one of claims 10-42, comprising two alpha-helix masks, wherein the two alpha-helix masks are linked to the two different antigen binding domains, respectively.56.The masked antigen-binding domain of any one of claims 1-9 or the masked antigen-binding construct of any one of claims 10-42, wherein the alpha-helix coil comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 12, 16, 18 or 20, or an amino acid sequence that is at least 95%, 97%, or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 12, 16, 18 or 20.57.The masked antigen-binding domain of any one of claims 5-9 or the masked antigen-binding construct of any one of claims 14-42, wherein the cleavable linker comprises a first linker, a cleavable site and a second linker, wherein the cleavable site comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or 24, or an amino acid sequence that is at least 95%, 97%, or 99%identical to SEQ ID NO: 14 or 24.58.The masked antigen-binding domain of claim 57, wherein the first linker and / or the second linker comprises the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13, 21, or 23, or an amino acid sequence that is at least 95%, 97%, or 99%identical to the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 13, 21, or 23.59.A nucleic acid comprising a nucleic acid sequence encoding the masked antigen-binding domain of any one of claims 1-9 or the masked antigen-binding construct of  any one of claims 10-42.60.A vector comprising the nucleic acid of claim 59.61.A cell comprising the nucleic acid of claim 59 or the vector of claim 60.62.A method of producing a masked antigen-binding domain or a masked antigen-binding construct, the method comprising culturing the cell of claim 61.63.A masked antibody-drug conjugate (ADC) comprising a therapeutic agent covalently bound to the masked antigen-binding domain of any one of claims 1-9 or the masked antigen-binding construct of any one of claims 10-42.64.The ADC of claim 63, wherein the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent.65.A nucleotide therapy comprising the nucleic acid of claim 59.66.A cellular therapy comprising the masked antigen-binding domain of any one of claims 1-9 or the masked antigen-binding construct of any one of claims 10-42.67.A fusion drug, molecule, or protein, comprising (1) a cytokine, and (2) the masked antigen-binding domain of any one of claims 1-9 or the masked antigen-binding construct of any one of claims 10-42.68.A method of treating a subject, the method comprising administering, to a subject in need thereof, a therapeutically effective amount of a composition comprising the masked antigen-binding domain of any one of claims 1-9, the masked antigen-binding construct of any one of claims 10-42, the ADC of claim 63 or claim 64, the nucleotide therapy of claim 65, the cellular therapy of claim 66, or the fusion protein of claim 67.69.A computer-implemented method for producing a masked antigen-binding construct, the method comprising:(a) providing information of a starting antigen-binding domain;(b) generating candidate alpha-helix masks that can bind to a CDR region of the starting antigen-binding domain;(c) assembling, in silico, the candidate alpha-helix masks from step (b) in the form of a masked antigen-binding construct that comprises the starting antigen-binding domain, and one of the candidate alpha-helix masks;(d) performing structure prediction; and(e) selecting a masked antigen-binding construct having one or more parameters that meet a threshold level.70.The method of claim 69, wherein the one or more parameters are selected from the group consisting of (1) alpha-helix pLDDT (predicted Local Distance Difference Test) , (2) alpha-helix pTM score (predicted template modeling score) , (3) ipTM score (interface pTM score) between alpha-helix and the CDR region, and (4) an average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR region.71.The method of claim 70, wherein the value of the alpha-helix pLDDT is greater than 55.72.The method of claim 70, wherein the value of the alpha-helix pTM score is greater than 0.5.73.The method of claim 70, wherein the value of the ipTM score between alpha-helix and the CDR region is greater than 0.6, more preferably greater than 0.8.74.The method of claim 70, wherein the value of the average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR region is less than more preferably less than 75.The threshold level of claim 70, wherein the value of the average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR region is less than and the value of the ipTM score is greater than 0.8.76.The threshold level of claim 70, wherein the value of the average minimum distance between the alpha-helix’s alpha carbon atoms and the CDR region is less than and the value of the ipTM score is greater than 0.6.77.The method of any one of claims 69-76, wherein step (b) is performed using a protein language model (PLM) or a diffusion model design.78.The method of claim any one of claims 69-77, wherein step (d) is performed using a fast folding software.79.The method of claim 78, wherein the fast folding software is selected from the group consisting of Alphafold2, ESMFold, and OmegaFold.80.The method of any one of claims 69-79, wherein at least 100 or 1000 antigen-binding constructs are generated in silico.81.The method of any one of claims 69-80, wherein the method further comprises making a vector comprising a nucleic acid sequence encoding the masked antigen-binding construct; and expressing the masked antigen-binding construct.82.One or more machine-readable hardware storage devices for storing instructions that are executable by one or more data processing devices to perform the method of any one of claims 69-80.83.A system comprising:one or more data processing devices; andone or more machine-readable hardware storage devices that store instructions that are executable by the one or more data processing devices to execute the method of any one of claims 69-80.84.The system of claim 83, wherein the system further comprises one or more devices for making and expressing nucleic acid sequences.85.An alpha-helix mask comprising:one or more alpha-helix peptides, wherein the one or more alpha-helix peptides are capable of specifically binding to an antigen-binding domain of an antibody or antibody fragment.86.The alpha-helix mask of claim 85, wherein the binding of the alpha-helix peptides to the antigen-binding domain is non-covalent.87.A mask comprising: one or more alpha-helix peptides, and one or more loop peptides wherein the one or more loop peptides are capable of specifically binding to an antigen-binding domain of an antibody or antibody fragment.88.A masked antigen-binding domain, comprising(a) an antigen-binding domain, and(b) an alpha-helix mask of any one of claims 85-86,wherein the alpha-helix mask comprises an alpha-helix coil, wherein the alpha-helix mask is linked to the antigen-binding domain by one or more cleavable linker and blocks the interaction between the antigen-binding domain and its target antigen.

Images