Methods and compositions for improved readthrough of pseudouridine-modified codons

Abstract

Provided are methods, compositions, and systems for decoding pseudouridine-modified (Ψ-modified) codons. In some aspects, provided are methods for improving translation of a target RNA in a host cell comprising a Ψ-modified codon, wherein the method comprises: introducing a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified codon or a nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell; and wherein the Ψ-modified codon is decoded as an amino acid, thereby improving translation of the target RNA. In some cases, the Ψ-modified codon is a premature termination codon (PTC).

Description

METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMPROVED READTHROUGH OF PSEUDOURIDINE-MODIFIED CODONSREFERENCE TO AN ELECTRONIC SEQUENCE LISTING

[0001] The content of the electronic sequence listing (FH01170PCT-seqlist. xml; Size: 289, 306 bytes; and Date of Creation: December 4, 2024) is herein incorporated by reference in its entirety.FIELD

[0002] The present application relates to compositions, systems and methods for improved decoding of pseudouridine-modified codons in RNA.BACKGROUND

[0003] Nonsense mutations, responsible for ～11%of genetic diseases, create premature termination codons (PTCs) and lead to truncated and often non-functional proteins. Several therapeutic strategies have been developed for diseases caused by PTCs. Small molecular drugs such as G418 and PTC124 have been identified as inducers of PTC readthrough, but the non-specificity and toxicity associated with prolonged use remain unresolved. Engineered tRNAs that are derived from a natural tRNA with altered anti-codon can achieve effective PTC readthrough. However, the lack of sequence specificity poses a challenge, as it can result in off-target effects in normal termination codons (NTCs) . In addition, base editing tools at the DNA or RNA level have been developed to correct PTCs. Unlike DNA editing, RNA editing enables the manipulation of genetic information in a reversible and tunable manner, offering a safer strategy that does not cause permanent changes to the genome. Currently, RNA base editors that leverage the deamination activity of ADAR and APOBEC proteins have been developed to achieve A to I and / or C to U conversion. However, their utilities can be limited by potential proximal and distal off-target editing problems.

[0004] Recently, programmable RNA pseudouridylation has emerged as a new type of RNA base editor to suppress PTCs. However, current methods suffer from low efficiency and limited precision. Although site-specific pseudouridylation or target RNAs is a potentially powerful technique, the methods available thus far have resulted in low editing efficiency of target RNAs. Accordingly, there is a need in the art for improved methods for promoting readthrough of PTCs. The present application addreses this and other needs. BRIEF SUMMARY

[0005] The present application provides methods for improving translation of a target RNA in a host cell comprising a pseudouridine-modified (Ψ-modified) codon, wherein the method comprises introducing a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified codon or a nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. The Ψ-modified codon (e.g., a Ψ-modified PTC) is decoded as an amino acid, thereby improving translation of the target RNA. In some cases, the methods further comprise performing targeted pseudouridylation of the target RNA. Some embodiments of the methods are also referred herein as the “RESTART V3”method, which can be used to improve decoding of Ψ-modified codons, such as to allow read-through of RNA transcripts having a premature termination codons (PTC) .

[0006] In some aspects, provided herein is a method for improving translation of a target RNA in a host cell comprising a pseudouridine-modified (Ψ-modified) codon, wherein the method comprises: introducing a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified codon or a nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell; and wherein the Ψ-modified codon is decoded as an amino acid, thereby improving translation of the target RNA. In some embodiments, the Ψ-modified codon is a Ψ-modified premature stop codon.

[0007] In some aspects, the present application provides a method for suppressing a premature termination codon (PTC) in a target RNA in a host cell, comprising modifying a target uridine residue in the PTC of the target RNA into a pseudouridine residue in the target RNA to provide a Ψ-modified PTC, and introducing a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified PTC or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the host cell, wherein the Ψ-modified PTC is decoded as an amino acid, thereby suppressing the PTC.

[0008] In some aspects, the present application provides a method for suppressing a premature termination codon (PTC) in a target RNA in a host cell, comprising modifying a target uridine residue in the PTC of the target RNA into a pseudouridine residue in the target RNA to provide a Ψ-modified PTC, wherein modifying the target uridine residue comprises introducing an engineered guide small nucleolar RNA (gsnoRNA) or a nucleic acid for expression of the gsnoRNA into the host cell, wherein the gsnoRNA comprises a guide sequence that hybridizes to a sequence comprising the target uridine residue in the target RNA, and wherein the gsnoRNA recruits a DKC1 protein to modify the target uridine residue into the pseudouridine residue in the target RNA. In some embodiments, the DKC1 protein is overexpressed in the host cell.

[0009] In some embodiments according to any of the methods described above, the PTC resulted from a mutation in a sense codon, and wherein the method results in accurate incorporation of the original amino acid encoded by the sense codon for at least 30%, at least 40%, or at least 50%of PTCs. In some embodiments, the method does not alter amino acid sequence and / or expression levels of proteins produced from non-target RNA. In some embodiments, the method does not alter the expression level of transcripts produced from non-target RNA. In some embodiments, the method results in an average of at least about 2-fold, at least about 3-fold, or at least about 5-fold higher efficiency in PTC suppression than a control method performed without introducing the nctRNA or the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell.

[0010] In some embodiments according to any of the methods described above, the PTC is a UGA codon, and wherein the Ψ-modified PTC is decoded as arginine or tryptophan. In some embodiments, the Ψ-modified PTC is decoded as arginine at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, or at least 95%of the time.

[0011] In some embodiments according to any of the methods described above, the method comprises modifying a target uridine residue in the PTC of the target RNA into a pseudouridine residue in the target RNA to provide a Ψ-modified PTC and introducing a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified PTC or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the host cell, wherein the nctRNA comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences provided in Table 5, and wherein the Ψ-modified PTC is decoded as an amino acid, thereby suppressing the PTC.

[0012] In some embodiments according to any of the methods described above, the method comprises modifying a target uridine residue in the PTC of the target RNA into a pseudouridine residue in the target RNA to provide a Ψ-modified PTC, and introducing a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified PTC or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the host cell, wherein the nctRNA comprises the sequences of any one of SEQ ID Nos: 193-276, and wherein the Ψ-modified PTC is decoded as an amino acid, thereby suppressing the PTC.

[0013] In some embodiments according to any of the methods described above, the nctRNA is tRNA-R-TCT and / or tRNA-W-CCA. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-R-TCT comprising the sequence of any one of SEQ ID Nos: 193-198 and / or tRNA-W-CCA comprising the sequence of any one of SEQ ID Nos: 213-217. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-R-TCT-1. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-R-TCT-1 comprising the sequence of SEQ ID Nos: 193.

[0014] In some embodiments according to any of the methods described above, the PTC is a UAG codon, and wherein the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine, leucine, or tyrosine. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-CTG, tRNA-L-CAA, tRNA-Y-ATA and / or tRNA-Y-GTA. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-CTG. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-CTG comprising the sequence of SEQ ID Nos: 224-227. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-L-CAA. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-L-CAA comprising the sequence of SEQ ID Nos: 243-249.

[0015] In some embodiments according to any of the methods described above, the PTC is a UAA codon, and wherein the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine or tyrosine. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG, tRNA-Y-ATA and / or tRNA-Y-GTA. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG, tRNA-Y-ATA and / or tRNA-Y-GTA comprising the sequence of any one of SEQ ID Nos: 250-265. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG comprising the sequence of SEQ ID Nos: 263-265. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG-1. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG-1 comprising the sequence of SEQ ID NO: 263.

[0016] In some embodiments according to any of the methods described above, the method results in the average of at least about 10-fold, at least about 15-fold, or at least about 20-fold higher efficiency in PTC suppression than a control method performed without introducing the nctRNA or the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell.

[0017] In some embodiments according to any of the methods described above, the method further comprises introducing a nucleic acid sequence encoding the DKC1 protein into the host cell. In some embodiments, the nucleic acid sequence encoding the DKC1 protein is under control of a CMV promoter. In some embodiments, the DKC1 protein is an endogenous DKC1 protein of the host cell. In some embodiments, the DKC1 protein is localized to the cytoplasm in the host cell. In some embodiments, the DKC1 protein comprises a DKC1 protein fragment corresponding to amino acid residues 41 to 420 of a human DKC1 isoform 3 protein, wherein the amino acid numbering is according to SEQ ID NO: 2. In some aspects, the DKC1 protein comprises an amino acid sequence having at least about 85% (i.e., at least 85%, or at least 88%, or at least 90%, or at least 91%, or at least 92%, or at least 93%, or at least 94%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%, or more) identity to SEQ ID NO: 88. In some aspects, the DKC1 protein comprises a naturally occurring DKC1 isoform with cytoplasmic localization in the host cell. In some embodiments, the DKC1 isoform corresponds to isoform 3 of human DKC1 protein. In some embodiments, the DKC1 protein comprises an amino acid sequence having at least 85%identity to SEQ ID NO: 2.

[0018] In some embodiments according to any of the methods described above, the method comprises introducing a nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA into the host cell.

[0019] In some embodiments according to any of the methods described above, the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell, and wherein the nucleic acid molecule comprises 1, 2, 3, 4, or more copies of a nucleic acid sequence encoding the nctRNA. In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the nctRNA comprises a nucleic acid molecule comprising 4 copies of a nucleic acid sequence encoding the nctRNA.

[0020] In some embodiments according to any of the methods described above, the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell, and wherein the nctRNA is overexpressed in the host cell to at least about 2-6 fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell. In some embodiments, the method does not affect the overall abundance of endogenous tRNAs in the host cell.

[0021] In some embodiments according to any of the methods described above, the PTC is a UGA codon, and wherein the nctRNA is tRNA-R-TCT, optionally wherein the Ψ-modified PTC is decoded as arginine. In some embodiments, the PTC is a UGA codon, and wherein the nctRNA is tRNA-R-TCT comprising the sequence of any one of SEQ ID Nos: 193-198, optionally wherein the Ψ-modified PTC is decoded as arginine. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-R-TCT, wherein the tRNA-R-TCT is a complete tRNA comprising an intron. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-R-TCT comprising the sequence of any one of SEQ ID Nos: 193-198, wherein the tRNA-R-TCT is a complete tRNA comprising an intron.

[0022] In some embodiments according to any of the methods described above, the PTC resulted from a sense-to-nonsense mutation of a glutamine sense codon, and wherein the nctRNA is tRNA-Q-CTG or tRNA-Q-TTG, optionally wherein the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine. In some embodiments, the PTC resulted from a sense-to-nonsense uridine mutation of a glutamine sense codon, wherein the nctRNA is tRNA-Q-CTG or tRNA-Q-TTG comprising the sequence of any one of SEQ ID Nos: 224-227 or 263-265.

[0023] In some embodiments according to any of the methods described above, the nctRNA is a mature tRNA. In some embodiments, the nctRNA is a complete tRNA comprising an intron.

[0024] In some embodiments according to any of the methods described above, the method does not result in off-target pseudo-uridylation of normal termination codons.

[0025] In some embodiments according to any of the methods described above, the nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA is under a promotor selected from the group consisting of U6 promotor and U1 promotor. In some embodiments, expression of the nctRNA is under control of one or more U6 promotors.

[0026] In some embodiments according to any of the methods described above, the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some embodiments, the nucleic acid encoding the nctRNA is present in a vector that further comprises the nucleic acid sequence encoding the DKC1 protein, and / or the nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA.

[0027] In some embodiments according to any of the methods described above, the method comprises introducing into the host cell a vector comprising a first nucleic acid sequence encoding a DKC1 protein and a second nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA. In some embodiments, the vector is a viral vector. In some embodiments, the vector is an adeno-associated viral (AAV) vector, optionally wherein the AAV is AAV-DJ or AAV2. In some embodiments, the AAV is AAV2.

[0028] In some embodiments according to any of the methods described above, the nctRNA, the nucleic acid encoding the nctRNA, and / or the vector is / are in a lipid nanoparticle. In some embodiments, the nanoparticle is conjugated to GalNAc3.

[0029] In some embodiments according to any of the methods described above, efficiency of decoding the PTC as an amino acid is at least 40%. In some embodiments according to any of the methods described above, the PTC is associated with a genetic disease or condition.

[0030] In some embodiments according to any of the methods described above, the host cell is an archaeal or eukaryotic cell. In some embodiments, the host cell is a mammalian cell. In some embodiments, the host cell is a human cell.

[0031] In some embodiments according to any of the methods described above, the method is carried out in vivo. In some embodiments according to any of the methods described above, the method is carried out ex vivo.

[0032] In some embodiments according to any of the methods described above, the PTC resulted from a nonsense mutation in a CFTR gene. In some embodiments according to any of the methods described above, the PTC resulted from a nonsense mutation in an IDUA gene.

[0033] In some aspects, provided herein is a method of treating a disease or condition associated with a PTC in a target RNA in a subject, comprising suppressing the PTC in a host cell of the subject using any of the methods described above, thereby treating the disease or condition in the subject. In some embodiments according to any of the methods described above, the disease or condition is selected from the group consisting of Cystic fibrosis, Hurler Syndrome, alpha-1-antitrypsin (A1AT) deficiency, Parkinson’s disease, Alzheimer's disease, albinism, Amyotrophic lateral sclerosis, Asthma, 8-thalassemia, Cadasil syndrome, Charcot-Marie-Tooth disease, Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) , Distal Spinal Muscular Atrophy (DSMA) , Duchenne / Becker muscular dystrophy, Dystrophic Epidermolysis bullosa, Epidermolysis bullosa, Fabry disease, Factor V Leiden associated disorders, Familial Adenomatous Polyposis, Galactosemia, Gaucher's Disease, Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Haemophilia, Hereditary Hemochromatosis, Hunter Syndrome, Huntington's disease, Inflammatory Bowel Disease (IBD) , Inherited polyagglutination syndrome, Leber congenital amaurosis, Lesch-Nyhan syndrome, Lynch syndrome, Marfan syndrome, Mucopolysaccharidosis, Muscular Dystrophy, Myotonic dystrophy types I and II, neurofibromatosis, Niemann-Pick disease type A, B and C, NY-esol related cancer, Peutz-Jeghers Syndrome, Phenylketonuria, Pompe’s disease, Primary Ciliary Disease, Prothrombin mutation related disorders, such as the Prothrombin G20210A mutation, Pulmonary Hypertension, (autosomal dominant) Retinitis Pigmentosa, Sandhoff Disease, Severe Combined Immune Deficiency Syndrome (SCID) , Sickle Cell Anemia, Spinal Muscular Atrophy, Stargardt’s Disease, Tay-Sachs Disease, Usher syndrome, X-linked immunodeficiency, Sturge-Weber Syndrome, and cancer.

[0034] In some embodiments according to any of the methods described above, the disease or condition is cystic fibrosis. In some embodiments, the PTC resulted from a nonsense mutation R553X in a CFTR gene of the subject. In some embodiments, the method results in a rescue of at least 10%of wild-type CFTR channel function in the host cell, optionally wherein the method results in a rescue of at least 30%of wild-type CFTR channel function in the host cell.

[0035] In some embodiments according to any of the methods described above, the disease or condition is Hurler syndrome. In some embodiments, (i) the subject is a mouse and the PTC resulted from a nonsense mutation W392X in an IDUA gene of the subject or (ii) the subject is a human and the PTC resulted from a nonsense mutation W402X in an IDUA gene of the subject. In some embodiments, the method restores at least 0.5%of wild-type IDUA activity in the host cell, optionally wherein the method restores at least about 10%of wild-type IDUA activity in the host cell. In some embodiments, the method results in a significant decrease in accumulation of glycosaminoglycans (GAGs) in the subject.

[0036] In some embodiments according to any of the methods described above, nonsense-mediated decay of the target RNA in the host cell is reduced by the method.

[0037] In some embodiments according to any of the methods described above, the method comprises introducing the nctRNA of the Ψ-modified PTC, and wherein the nctRNA comprises one or more tRNA modifications. In some embodiments, the one or more tRNA modifications comprise one or more modifications of a mature tRNA. In some embodiments, the one or more tRNA modifications comprise one or more modifications selected from the group consisting of psiU, m1A, m1G, and m5C. In some embodiments, the nctRNA comprises a tRNA-R-TCT-1 comprising one or more modifications selected from the group consisting of m5C 49; psiU 27, 28, 36, 39, 40, 54, 55; m1A 58; and m1G 9. In some embodiments, the nctRNA comprises a tRNA-R-TCT-1 comprising the modifications m5C 49; psiU 27, 28, 36, 39, 40, 54, 55; m1A 58; and m1G 9. In some embodiments, the modified tRNA significantly increases the readthrough efficiency of gsnoRNA compared to an unmodified tRNA of the same type. In some embodiments, the host cell expresses an endogenous level of DKC1. In some embodiments, the modified tRNA comprises a 5’ phosphorylation. In some embodiments, the modified tRNA comprises a 3’ CCA sequence addition. In some embodiments, the modified tRNA is a mature tRNA without introns.

[0038] Also provided are compositions, kits and articles of manufacture for use in any one the methods described above.

[0039] In some aspects, provided herein is an RNA-editing system comprising: (a) a gsnoRNA comprising a guide sequence that hybridizes to a sequence comprising a target uridine residue in premature termination codon (PTC) in a target RNA in a host cell, or a nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA; and (b) a nucleic acid encoding a near-cognate transfer RNA of the PTC. In some embodiments, the RNA-editing system further comprises a DKC1 protein, or a nucleic acid sequence encoding the DKC1 protein, wherein the gsnoRNA is capable of recruiting the DKC1 protein to modify the target uridine residue into a pseudouridine residue in the target RNA.

[0040] In some aspects, provided herein is a pharmaceutical composition comprising any of the RNA-editing systems described above, and a pharmaceutically acceptable carrier. In some embodiments, the pharmaceutical composition is for use in a method according to any of the methods described above.

[0041] In some aspects, provided herein is a host cell comprising the RNA-editing system according to any of the preceding embodiments. In some aspects, provided herein is a kit for editing a target RNA in a host cell, comprising the engineered RNA-editing system according to any of the preceding embodiments.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0042] FIG. 1A provides a schematic showing the amino acid incorporated in Ψ-modified PTC sites. Amino acids inserted at different PTC sites are represented by hexagon, rhombus and triangle, respectively.

[0043] FIG. 1B provides a schematic illustration showing that natural tRNA-R-TCT can recognize a ΨGA site, while it cannot recognize the unmodified UGA site.

[0044] FIG. 1C provides schematics of the ALDOB cDNA-reporter, gsnoRNA and natural tRNA construct used in Example 1 (top panel) , and a bar plot showing the relative fraction of EGFP positive cells for the indicated conditions, indicating PTC readthrough (bottom panel) . The experiment was performed with 200ng reporter construct, 200ng gsnoRNA construct, and 400 / 800ng tRNA construct co-transfected in HEK293T cells. Data are represented as the mean ± SD.

[0045] FIG. 1D provides schematics of the ALDOB cDNA-reporter, gsnoRNA-DKC1 iso3 and natural tRNA construct used in Example 1 (top panel) , and a bar plot showing the relative fraction of EGFP positive cells for the indicated conditions, indicating PTC readthrough (bottom panel) . The experiment was performed with 200ng reporter construct, 200ng gsnoRNA-DKC1 iso3 construct and 400 / 800ng tRNA construct co-transfected in HEK293T cells. Data are represented as the mean ± SD.

[0046] FIG. 1E provides representative fluorescence images from the experiment shown in FIG. 1D. Scale bars, 200 μm.

[0047] FIG. 2A provides a table showing near-cognate tRNAs and corresponding natural termination codons. The near-cognate tRNAs that bind to the amino acid incorporated in Ψ-modified PTCs are in bold.

[0048] FIGS. 2B-D provide bar plots showing the relative fraction of EGFP positive cells co-transfected with indicated Reporter 3, DKC1 iso3 and all near-cognate tRNAs of UGA (FIG. 2B) , UAG (FIG. 2C) and UAA (FIG. 2D) sites. The dotted lines indicate the RESTART v2 readthrough level in the corresponding reporter systems. The near-cognate tRNAs that greatly improve readthrough efficiency are indicated using asterisks.

[0049] FIG. 2E shows the results of an experiment testing PTC readthrough with the complete tRNA-R-TCT-1 with intron and compared to the mature one tRNA-R-TCT-1 without intron co-transfected with the RESTART v2 system. The bar plot shows the relative fraction of EGFP positive cells.

[0050] FIG. 2F provides schematics of multimeric design of tRNA-encoding nucleic acid constructs, including 1x, 2x, and 4x copies of tRNA cassettes (top panel) , and a bar plot showing the relative fraction of EGFP positive cells co-transfected with RESTART v2 and the indicated multimeric design of tRNA-encodin nucleic acid constructs (bottom panel) . Data are represented as the mean ± SD.

[0051] FIGS. 3A-3B provide a bar plots showing the relative fraction of EGFP positive cells (FIG. 3A) and corresponding Ψ modification rate (FIG. 3B) in HEK293T co-transfected with RESTART v1, v2 or v3 system and reporter 3, respectively. The Ψmodification rate of 18S (Ψ1367, a natural Ψ site in 18S rRNA) was utilized to evaluate the accuracy of the quantitative Ψ detection approach. Data are represented as the mean ± SD.

[0052] FIG. 4A shows differential expression analysis of unique tRNA transcripts grouped by anticodons in RESTART v3 treated cells relative to untreated cells. The asterisk denotes the overexpressed tRNA iso-acceptor tRNA-R-TCT. Pearson’s correlation coefficient analysis was used to assess the differential tRNA expression.

[0053] FIG. 4B shows differential expression analysis of unique tRNA transcripts grouped by unique iso-decoders in RESTART v3 treated cells relative to untreated cells. The asterisk denotes the overexpressed tRNA iso-decoder tRNA-R-TCT-1. Pearson’s correlation coefficient analysis was used to assess the differential tRNA expression.

[0054] FIG. 4C provides a sequence motif of the identified off-target Ψ sites for the gsnoRNA tested in Example 3.

[0055] FIG. 4D provides a scatterplot showing the expression level of genes by RNA-seq. Cells were transfected with the RESTART v3 or gctrl, in which the gsnoRNA targets a random sequence but not the specific target sequence. Pearson’s correlation coefficient analysis was used to assess the differential gene expression in different treated cells.

[0056] FIG. 4E provides a scatterplot showing the expression level of proteins by quantitative proteome analysis. Cells were transfected with the RESTART v3 or gctrl. Pearson’s correlation coefficient analysis was used to assess the differential protein abundance in different treated cells.

[0057] FIGS. 5A-5E provide results demonstrating functional PTC readthrough in CFTR and IDUA disease cell models.

[0058] FIG. 5A shows the current / voltage relationships of 16HBE14o-cells total membrane currents at basal steady state, first stimulation with 40 μM 8-CPT-cAMP (or 40 μM 8-CPT-cAMP and 10μM VX-770 in G551D cells) , and then perfusion with 10 μM CFTR inhibitor 172. The statistical analyses are unpaired Student’s t-tests. n = 5.

[0059] FIG. 5B shows the relative CFTR expression levels of 16HBE14o-G551D cells and 16HBE14o-R553X with or without RESTART treatment. The statistical analyses are unpaired Student’s t-tests. Data are represented as the mean ± SD.

[0060] FIG. 5C shows measurement of the IDUA catalytic activity with a 4-methylumbelliferyl IDUA substrate in WT, W392X (KI / +) and W392X (KI / KI) MEFs with or without RESTART treatment. The statistical analyses are unpaired Student’s t-tests. Data are represented as the mean ± SD.

[0061] FIG. 5D shows the GAG content in WT, W392X (KI / +) and W392X (KI / KI) MEFs with or without RESTART treatment. The statistical analyses are unpaired Student’s t-tests. Data are represented as the mean ± SD.

[0062] FIG. 5E shows the IDUA expression levels relative to GAPDH in W392X (KI / KI) MEFs with or without RESTART treatment. The statistical analyses are unpaired Student’s t-tests. Data are represented as the mean ± SD.

[0063] FIG. 6 shows the Ψ modification rate of cells transfected by RESTART v3 containing endogenous CFTR-R553X or mIDUA-W392X, respectively. The modification level indicated the endogenous modification. The Ψ modification rate of 18S (Ψ1367, a natural Ψ site in 18S rRNA) was utilized to evaluate the accuracy of the quantitative Ψdetection approach. Data are represented as the mean ± SD.

[0064] FIG. 7 provide a bar plot showing the relative fraction of EGFP positive cells co-transfected with RESTART v3 and the unmodified or modified tRNA-TCT-1, and the modified tRNA-TCT-1 in the presence or absence of refolding. Data are represented as the mean ± SD.DETAILED DESCRIPTION

[0065] In some aspects, provided herein are methods for improving translation of a target RNA in a host cell comprising a pseudouridine-modified (Ψ-modified) codon, wherein the method comprises introducing a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified codon or a nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. The Ψ-modified codon is decoded as an amino acid, thereby improving translation of the target RNA. The present application is based in part on the inventors’ realization that introducing the near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified codon (or a nucleic acid encoding the nctRNA) improves efficiency of decoding the Ψ-modified codon as an amino acid (e.g., the amino acid cognate to the nctRNA) . Further provided herein are methods of increasing the efficiency of decoding a Ψ-modified codon as an amino acid in a cell, comprising introducing a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified codon or a nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell, wherein the nctRNA binds to the amino acid.

[0066] In some aspects, the present application provides methods for targeted suppression of premature termination codons (PTC) . In some cases, the PTC has been modified to comprise a pseudouridine reside, thereby providing a Ψ-modified PTC. In some embodiments, the method comprises modifying a target uridine residue in the PTC of the target RNA into a pseudouridine residue in the target RNA to provide a Ψ-modified PTC. In some embodiments, the method comprises introducing a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified PTC or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the host cell, wherein the Ψ-modified PTC is decoded as an amino acid, thereby suppressing the PTC. In some embodiments, the amino acid is the type of amino acid that binds to the nctRNA.

[0067] By providing methods for targeted suppression of PTCs, the present disclosure in some aspects addresses the significant problem of nonsense mutations, which create PTCs within mRNA coding regions, leading to truncated, non-functional proteins. Recent research has shown that over 20%of disease-associated single-base pair mutations are classified as nonsense mutations, which are three times more likely to be clinically recognized than missense mutations. As a result, PTCs are implicated in various inherited diseases and trigger severe phenotypes, including cystic fibrosis3, Hurler syndrome4, and etc. Therefore, developing therapeutic strategies to tackle PTC-mediated diseases is of vital importance. The present application addresses these and other needs.

[0068] Recently, RNA pseudouridylation-mediated RNA base editors have been developed to suppress PTCs. They are considered to be relatively safe since pseudouridyaltion does not recode sense codons and therefore potential off-target edits may have negligible biological consequences. However, while they hold great promise for the treatment of PTC-mediated diseases, their relatively low efficiency limits the application of such tools in research and therapeutics. Therefore, methods are needed to improve PTC readthrough, thereby suppressing PTCs.

[0069] The present disclosure addresses these and other needs. In some aspects, introducing (e.g., overexpressing) a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified codon (or a nucleic acid encoding the nctRNA) improves efficiency of decoding the Ψ-modified codon as an amino acid (e.g., the amino acid cognate to the nctRNA) . In some aspects, provided herein is a method for pseudouridine-mediated PTC readthrough termed “RESTART” (RESTART v3) , which utilizes near-cognate tRNAs to promote the translational readthrough of pseudouridylated PTCs. The results provided herein demonstrate that in cultured cells RESTART v3 showed an average of ～5-fold higher readthrough efficiency compared to the most effective pseudouridylation-based RNA editors currently available. In disease cell models of cystic fibrosis and Hurler syndrome, RESTART v3 efficiently restored the corresponding full-length proteins and successfully achieved functional rescues. Additionally, nearly half of the disease-relevant PTC sites can be accurately restored to the original amino acid, according to the database-documented portion of sense-to-nonsense codon mutations. Furthermore, while off-target edits can be induced by RESTART v3, they do not change the coding information or the expression level of transcripts; and RESTART v3 does not change the overall natural tRNA pool abundance. Hence, RESTART v3 is an effective and safe RNA base editor to repair PTCs.

[0070] In some embodiments, provided herein are methods of treating a disease or condition associated with a PTC in a target RNA in a subject, comprising suppressing the PTC in a host cell of the subject using any of the methods for PTC suppression, improving efficiency of Ψ-modified PTC decoding, or improving translation of mRNA disclosed herein. In some embodiments, suppressing the PTC treats the disease or condition in the subject.

[0071] Also provided are compositions, kits and articles of manufacture for use in any one the methods described herein. I. Definitions

[0072] Terms are used herein as generally used in the art, unless otherwise defined as follows.

[0073] The terms “polynucleotide, ” “nucleic acid, ” “nucleotide sequence, ” and “nucleic acid sequence” are used interchangeably. They refer to a polymeric form of nucleotides of any length, either deoxyribonucleotides or ribonucleotides, or analogs thereof.

[0074] As used herein, “complementarity” refers to the ability of a nucleic acid to form hydrogen bond (s) with another nucleic acid by traditional Watson-Crick and Wobble base-pairing. A percent complementarity indicates the percentage of residues in a nucleic acid molecule which can form hydrogen bonds (i.e., Watson-Crick and Wobble base pairing) with a second nucleic acid (e.g., about 5, 6, 7, 8, 9, 10 out of 10, being about 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, and 100%complementary respectively) . "Perfectly complementary" means that all the contiguous residues of a nucleic acid sequence form hydrogen bonds with the same number of contiguous residues in a second nucleic acid sequence. "Substantially complementary" as used herein refers to a degree of complementarity that is at least about any one of 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, or 100%over a region of about 40, 50, 60, 70, 80, 100, 150, 200, 250 or more nucleotides, or refers to two nucleic acids that hybridize under stringent conditions.

[0075] References to “hybridization” typically refer to specific hybridization, and exclude non-specific hybridization. Specific hybridization can occur under experimental conditions chosen, using techniques well known in the art, to ensure that the majority of stable interactions between probe and target are where the probe and target have at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%sequence identity.

[0076] Throughout the present description and claims the conventional three-letter and one-letter codes for naturally occurring amino acids are used, i.e. A (Ala) , G (Gly) , L (Leu) , I (lie) , V (Val) , F (Phe) , W (Trp) , S (Ser) , T (Thr) , Y (Tyr) , N (Asn) , Q (Gin) , D (Asp) , E (Glu) , K (Lys) , R (Arg) , H (His) , M (Met) , C (Cys) and P (Pro) .

[0077] The term “mismatch” is used herein to refer to opposing nucleotides in a double stranded RNA complex which do not form perfect base pairs according to the Watson-Crick and Wobble base pairing rules. Mismatching nucleotides are G-A, C-A, U-C, A-A, G-G, C-C, U-U pairs. Wobble base pairs are: G-U, I-U, I-A, and I-C base pairs.

[0078] The term “near cognate tRNA” of a Ψ-modified codon refers to a tRNA comprising an anticodon that does not match the Ψ-modified codon at a single position, creating an imperfect match with the Ψ-modified codon. For purposes of defining a “near cognate” tRNA of a Ψ-modified codon, Ψ-A is considered to be a match. Other codon / anticodon matches include C-G, G-C, U-A, and A-U, where the first base (before the dash) is the codon base and the second base is the anticodon base.

[0079] The present disclosure provides several types of compositions that are polynucleotide or polypeptide based, including variants and derivatives. These include, for example, substitutional, insertional, deletion and covalent variants and derivatives. The term “derivative” is synonymous with the term “variant” and generally refers to a molecule that has been modified and / or changed in any way relative to a reference molecule or a starting molecule.

[0080] As such, polynucleotides encoding peptides or polypeptides containing substitutions, insertions and / or additions, deletions and covalent modifications with respect to reference sequences, in particular, the polypeptide sequences disclosed herein, are included within the scope of this disclosure. For example, sequence tags or amino acids, such as one or more lysines, can be added to peptide sequences (e.g., at the N-terminal or C-terminal ends) . Sequence tags can be used for peptide detection, purification or localization. Lysines can be used to increase peptide solubility or to allow for biotinylation. Alternatively, amino acid residues located at the carboxy and amino terminal regions of the amino acid sequence of a peptide or protein may optionally be deleted providing for truncated sequences. Certain amino acids (e.g., C-terminal residues or N-terminal residues) alternatively may be deleted depending on the use of the sequence, as for example, expression of the sequence as part of a larger sequence that is soluble, or linked to a solid support.

[0081] The term “identity” refers to the overall relatedness between polymeric molecules, for example, between polynucleotide molecules (e.g. DNA molecules and / or RNA molecules) and / or between polypeptide molecules. Calculation of the percent identity of two polynucleic acid sequences, for example, can be performed by aligning the two sequences for optimal comparison purposes (e.g., gaps can be introduced in one or both of a first and a second nucleic acid sequences for optimal alignment and non-identical sequences can be disregarded for comparison purposes) . In certain embodiments, the length of a sequence aligned for comparison purposes is at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or 100%of the length of the reference sequence. The nucleotides at corresponding nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which needs to be introduced for optimal alignment of the two sequences. The comparison of sequences and determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a mathematical algorithm. For example, the percent identity between two nucleic acid sequences can be determined using methods such as those described in Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; each of which is incorporated herein by reference. For example, the percent identity between two nucleic acid sequences can be determined using the algorithm of Meyers and Miller (CABIOS, 1989, 4: 11-17) , which has been incorporated into the ALIGN program (version 2.0) using a PAM 120 weight residue table, a gap length penalty of 12 and a gap penalty of 4. The percent identity between two nucleic acid sequences can, alternatively, be determined using the GAP program in the GCG software package using an NWSgapdna. CMP matrix. Methods commonly employed to determine percent identity between sequences include, but are not limited to those disclosed in Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48: 1073 (1988) ; incorporated herein by reference. Techniques for determining identity are codified in publicly available computer programs. Exemplary computer software to determine homology between two sequences include, but are not limited to, GCG program package, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12 (1) , 387 (1984) ) , BLASTP, BLASTN, and FASTA Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990) ) .

[0082] “Percent (%) amino acid sequence identity” with respect to the polypeptide sequences identified herein is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical with the amino acid residues in the polypeptide being compared, after aligning the sequences considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be achieved in various ways that are within the skill in the art, for instance, using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign (DNASTAR) , or MUSCLE software. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full-length of the sequences being compared. For purposes herein, however, %amino acid sequence identity values are generated using the sequence comparison computer program MUSCLE (Edgar, R.C., Nucleic Acids Research 32 (5) : 1792-1797, 2004; Edgar, R.C., BMC Bioinformatics 5 (1) : 113, 2004, each of which are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes) .

[0083] The terms “non-naturally occurring” or “engineered” are used interchangeably and indicate the involvement of the hand of man. The terms, when referring to nucleic acid molecules or polypeptides mean that the nucleic acid molecule or the polypeptide is comprises at least one modification (e.g., at least one mutation, such as a substitution, insertion, or deletion, or at least one non-naturally occurring chemical modification) compared to a naturally-occurring nucleic acid molecule or polypeptide, or is at least substantially free from at least one other component with which they are naturally associated in nature and as found in nature.

[0084] The term “wildtype” as used herein in reference to an ACA scaffold sequence refers to the sequence of a naturally occurring box H / ACA small nucleolar RNA.

[0085] As used herein, “expression” refers to the process by which a polynucleotide is transcribed from a DNA template (such as into and mRNA or other RNA transcript) and / or the process by which a transcribed mRNA is subsequently translated into peptides, polypeptides, or proteins. Transcripts and encoded polypeptides may be collectively referred to as “gene product. ” If the polynucleotide is derived from genomic DNA, expression may include splicing of the mRNA in a eukaryotic cell.

[0086] The terms “polypeptide” or “peptide” are used herein to encompass all kinds of naturally occurring and synthetic proteins, including protein fragments of all lengths, fusion proteins and modified proteins, including without limitation, glycoproteins, as well as all other types of modified proteins (e.g., proteins resulting from phosphorylation, acetylation, myristoylation, palmitoylation, glycosylation, oxidation, formylation, amidation, polyglutamylation, ADP-ribosylation, pegylation, biotinylation, etc. ) .

[0087] The term “pharmaceutical composition” refers to a preparation which is in such form as to permit the biological activity of an active ingredient contained therein to be effective, and which contains no additional components which are unacceptably toxic to a subject to which the formulation would be administered.

[0088] A “pharmaceutically acceptable carrier” refers to one or more ingredients in a pharmaceutical formulation, other than an active ingredient, which is nontoxic to a subject. A pharmaceutically acceptable carrier includes, but is not limited to, a buffer, excipient, stabilizer, cryoprotectant, tonicity agent, preservative, and combinations thereof. Pharmaceutically acceptable carriers or excipients have preferably met the required standards of toxicological and manufacturing testing and / or are included on the Inactive Ingredient Guide prepared by the U.S. Food and Drug administration or other state / federal government or listed in the U.S. Pharmacopeia or other generally recognized pharmacopeia for use in mammals, and more particularly in humans.

[0089] The term “package insert” is used to refer to instructions customarily included in commercial packages of therapeutic products, that contain information about the indications, usage, dosage, administration, combination therapy, contraindications and / or warnings concerning the use of such therapeutic products.

[0090] An “article of manufacture” is any manufacture (e.g., a package or container) or kit comprising at least one reagent, e.g., a medicament for treatment of a disease or condition (e.g., coronavirus infection) , or a probe for specifically detecting a biomarker described herein. In certain embodiments, the manufacture or kit is promoted, distributed, or sold as a unit for performing the methods described herein.

[0091] It is understood that embodiments described herein include “consisting” and / or “consisting essentially of” embodiments.

[0092] Reference to “about” a value or parameter herein includes (and describes) variations that are directed to that value or parameter per se. For example, description referring to “about X” includes description of “X” .

[0093] As used herein, reference to “not” a value or parameter generally means and describes "other than" a value or parameter. For example, the method is not used to treat disease of type X means the method is used to treat disease of types other than X.

[0094] The term “about X-Y” used herein has the same meaning as “about X to about Y. ”

[0095] As used herein and in the appended claims, the singular forms “a, ” “an, ” or “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise.

[0096] The term “and / or” as used herein a phrase such as “A and / or B” is intended to include both A and B; A or B; A (alone) ; and B (alone) . Likewise, the term “and / or” as used herein a phrase such as “A, B, and / or C” is intended to encompass each of the following embodiments: A, B, and C; A, B, or C; A or C; A or B; B or C; A and C; A and B; B and C; A (alone) ; B (alone) ; and C (alone) . II. Methods

[0097] The methods provided herein comprise introducing a near-cognate tRNA (nctRNA) of a Ψ-modified codon in a host cell or a nucleic acid encoding the nctRNA of the Ψ-modified codon into the host cell. Transfer RNA (tRNA) perform the function of decoding genetic information into protein (amino acid) sequences. During typical protein translation, each tRNA is charged with a specific amino acid that matches with the anticodon triplet, which in turn matches with a codon in the RNA to be translated. Transfer RNA sequence frameworks are well known in the art. The acylation with an amino acid is to the terminal ribose of the CCA sequence, which is conserved at the 3' end in all three domains of life and occupies positions 74–76 in the tRNA sequence framework. In the tRNA cloverleaf secondary structure, the CCA sequence protrudes from the acceptor stem helical structure as a single-stranded motif. Upon folding of tRNA into an L shaped tertiary structure, the CCA sequence is placed at the end of the coaxially stacked acceptor stem and T stem. The acceptor-T helical arm is also known as the minihelix domain. The other long helical arm of the L is formed by coaxially stacking the dihydrouridine (D) stem with the anticodon stem to place the anticodon triplet at positions 34–36 opposite from the CCA end. The L is stabilized in the elbow region by a tertiary core, which is made up of nucleotides in the D loop, variable loop, and T loop. Upon entering the ribosome to a codon position complementary to the anticodon, a tRNA presents the amino acid attached to the CCA sequence for peptide bond synthesis, thus decoding the nucleic acid codon into a building block of proteins.

[0098] The near cognate tRNA of the Ψ-modified codon is a tRNA comprising an anticodon that does not match the Ψ-modified codon at a single position, creating an imperfect match with the Ψ-modified codon. For purposes of defining a “near cognate” tRNA of a Ψ-modified codon, Ψ-A is considered to be a match. Other codon / anticodon matches at a given position include C-G, G-C, U-A, and A-U, where the first base (before the dash) is the codon base and the second base is the anticodon base.

[0099] The present application uses the annotation tRNA-X-Z to refer to tRNAs, where X is the single-letter amino acid abbreviation for the amino acid that binds to the tRNA (sometimes referred to as the amino acid that “charges” the tRNA) , and Z is the anticodon sequence. The anticodon of the nctRNA comprises a single mismatch with the Ψ-modified codon.

[0100] Without being bound by theory, in view of the data provided herein, it appears a Ψ-G or Ψ-U pair can be formed at the first position of a Ψ-modified codon, indicating that these noncanonical pairs, mediated by Ψ modification, may promote codon recognition by the anticodon of a nctRNA. In some embodiments, a Ψ-G or Ψ-U pair at the first position of a Ψ-modified codon displays a significant stabilizing effect. In addition, a stable Ψ-A pair at the first position of a Ψ-modified codon seems to be capable of promoting a noncanonical A-C, G-G or A-G base pair at the second or third codon-anticodon positions, as evidenced by the proficient performance of tRNA-W-CCA (decoding UGG) and tRNA-Y-GTA (decoding UAC) to readthrough ΨAG and ΨAA. Without being bound by theory, the stabilizing effect of Ψ modification for binding of such nctRNA could result from the increased base stacking of the Ψ-A pair compared to the U-A pair.

[0101] In some embodiments, the Ψ-modified codon comprises a Ψ at the first position of the codon. In some cases, the Ψ pairs with a G or a U in the anticodon of the nctRNA. In this case, the anticodon of the nctRNA does not match the codon at the Ψ position, but does match the codon at the other two positions. In some emodiments, the Ψ-modified codon comprises a Ψ at the first position of the codon, and the Ψ pairs with an A in the anticodon. In these cases, the anticodon of the nctRNA comprises a mismatch with a different position of the codon. In some cases, the Ψ-modified codon has the sequence ΨAA and the nctRNA comprises a GTA anticodon (mismatch at the third position of the codon) . In some cases, the Ψ-modified codon has the sequence ΨAG and the nctRNA comprises a CCA anticodon (mismatch at the second position of the codon) . In some embodiments, the Ψ-modified codon has the sequence ΨAG and the nctRNA comprises a CTG anticodon (mismatch at the first position of the codon) . In some embodiments, the Ψ-modified codon has the sequence ΨAA, and the nctRNA comprises a TTG anticodon (mismatch at the first position of the codon) .

[0102] In some embodiments, provided herein is a method of enhancing readthrough of a ΨAA codon in a host cell, comprising introducing a nctRNA of the ΨAA codon or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the cell, wherein the nctRNA comprises a GTA anticodon. In some embodiments, the ΨAA codon is decoded as Y. In some embodiments, the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to at least about 1.5-fold, at least about 2-fold, at least about 3-fold, at least about 4-fold, at least about 5-fold, or at least about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to between about 2-fold and about 4-fold, between about 2-fold and about 6-fold, or between about 3-fold and about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell.

[0103] In some embodiments, provided herein is a method of enhancing readthrough of a ΨAA codon in a host cell, comprising introducing a nctRNA of the ΨAA codon or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the cell, wherein the nctRNA comprises a TTG anticodon. In some embodiments, the ΨAA codon is decoded as Q. In some embodiments, the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to at least about 1.5-fold, at least about 2-fold, at least about 3-fold, at least about 4-fold, at least about 5-fold, or at least about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to between about 2-fold and about 4-fold, between about 2-fold and about 6-fold, or between about 3-fold and about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell.

[0104] In some embodiments, provided herein is a method of enhancing readthrough of a ΨAG codon in a host cell, comprising introducing a nctRNA of the ΨAG codon or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the cell, wherein the nctRNA comprises a CTG anticodon. In some embodiments, the ΨAG codon is decoded as Q. In some embodiments, the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to at least about 1.5-fold, at least about 2-fold, at least about 3-fold, at least about 4-fold, at least about 5-fold, or at least about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to between about 2-fold and about 4-fold, between about 2-fold and about 6-fold, or between about 3-fold and about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell.

[0105] In some embodiments, provided herein is a method of enhancing readthrough of a ΨAG codon in a host cell, comprising introducing a nctRNA of the ΨAG codon or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the cell, wherein the nctRNA comprises a CAA anticodon. In some embodiments, the ΨAG codon is decoded as L. In some embodiments, the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to at least about 1.5-fold, at least about 2-fold, at least about 3-fold, at least about 4-fold, at least about 5-fold, or at least about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to between about 2-fold and about 4-fold, between about 2-fold and about 6-fold, or between about 3-fold and about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell.

[0106] In some embodiments, provided herein is a method of enhancing readthrough of a ΨAG codon in a host cell, comprising introducing a nctRNA of the ΨAG codon or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the cell, wherein the nctRNA comprises a GTA anticodon or an ATA anticodon. In some embodiments, the ΨAG codon is decoded as Y. In some embodiments, the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to at least about 1.5-fold, at least about 2-fold, at least about 3-fold, at least about 4-fold, at least about 5-fold, or at least about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to between about 2-fold and about 4-fold, between about 2-fold and about 6-fold, or between about 3-fold and about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell.

[0107] In some embodiments, provided herein is a method of enhancing readthrough of a ΨGA codon in a host cell, comprising introducing a nctRNA of the ΨGA codon or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the cell, wherein the nctRNA comprises a TCT anticodon. In some embodiments, the ΨAG codon is decoded as R. In some embodiments, the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to at least about 1.5-fold, at least about 2-fold, at least about 3-fold, at least about 4-fold, at least about 5-fold, or at least about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to between about 2-fold and about 4-fold, between about 2-fold and about 6-fold, or between about 3-fold and about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell.

[0108] In some embodiments, provided herein is a method of enhancing readthrough of a ΨGA codon in a host cell, comprising introducing a nctRNA of the ΨGA codon or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the cell, wherein the nctRNA comprises a TCG anticodon. In some embodiments, the ΨAG codon is decoded as R. In some embodiments, the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to at least about 1.5-fold, at least about 2-fold, at least about 3-fold, at least about 4-fold, at least about 5-fold, or at least about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to between about 2-fold and about 4-fold, between about 2-fold and about 6-fold, or between about 3-fold and about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell.

[0109] In some embodiments, provided herein is a method of enhancing readthrough of a ΨGA codon in a host cell, comprising introducing a nctRNA of the ΨGA codon or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the cell, wherein the nctRNA comprises a CCA anticodon. In some embodiments, the ΨAG codon is decoded as W. In some embodiments, the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to at least about 1.5-fold, at least about 2-fold, at least about 3-fold, at least about 4-fold, at least about 5-fold, or at least about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to between about 2-fold and about 4-fold, between about 2-fold and about 6-fold, or between about 3-fold and about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell.

[0110] In any of the embodiments herein, the method can be a method of modifying expression of a target RNA comprising the Ψ-modified codon. In any of the embodiments herein, the method can be a method of improving translation of a target RNA comprising the Ψ-modified codon. In any of the embodiments herein, the Ψ-modified codon can be a Ψ-modified PTC, and the method can be a method of suppressing the PTC. In some embodiments, the Ψ-modified codon is a Ψ-modified PTC, and the method is a method of suppressing nonsense-mediated decay caused by the PTC. In some embodiments, the PTC is a disease-associated PTC, and the method is a method of treating the disease associated with the PTC.

[0111] In some embodiments, the PTC is a UAG codon, and the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine, leucine, or tyrosine. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-CTG, tRNA-L-CAA, tRNA-Y-ATA and / or tRNA-Y-GTA. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-CTG. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Q-CTG comprising the sequence of any one of SEQ ID NO: 224-227. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Q-CTG comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NO: 224-227. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-L-CAA. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-L-CAA comprising the sequence of any one of SEQ ID NO:243-249. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-L-CAA comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NO: 243-249. In some embodiments, the PTC is a UAA codon, and the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine or tyrosine. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG, tRNA-Y-ATA and / or tRNA-Y-GTA. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Q-TTG comprising a sequence of any one of SEQ ID NO: 263-265. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Q-TTG comprising a sequence of at least about 95%(e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NO: 263-265. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG-1. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG-1 comprising the sequence of SEQ ID NO: 263. In some embodiments, the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to at least about 1.5-fold, at least about 2-fold, at least about 3-fold, at least about 4-fold, at least about 5-fold, or at least about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to between about 2-fold and about 4-fold, between about 2-fold and about 6-fold, or between about 3-fold and about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell.

[0112] In some embodiments, the Ψ-modified codon comprises a Ψ at the first position of the codon. In some cases, the Ψ pairs with a G or a U in the anticodon of the nctRNA. In this case, the anticodon of the nctRNA does not match the codon at the Ψ position, but does match the codon at the other two positions. In some emodiments, the Ψ-modified codon comprises a Ψ at the first position of the codon, and the Ψ pairs with an A in the anticodon. In these cases, the anticodon of the nctRNA comprises a mismatch with a different position of the codon. In some cases, the Ψ-modified codon has the sequence ΨAA and the nctRNA comprises a GTA anticodon (mismatch at the third position of the codon) . In some cases, the Ψ-modified codon has the sequence ΨAG and the nctRNA comprises a CCA anticodon (mismatch at the second position of the codon) . In some embodiments, the Ψ-modified codon has the sequence ΨAG and the nctRNA comprises a CTG anticodon (mismatch at the first position of the codon) . In some embodiments, the Ψ-modified codon has the sequence ΨAA, and the nctRNA comprises a TTG anticodon (mismatch at the first position of the codon) .

[0113] The present disclosure is exemplified by, but not limited to, reversing the effect of nonsense stop mutations that usually lead to translation termination and mRNA degradation (via Nonsense Mediated Decay, see below) . In another aspect, targeted pseudouridylation can act as a means to recode uridine-containing codons as a means to modulate protein function via amino acid substitution, for instance in crucial protein regions such as protein kinase active centers. In some embodiments, the present application provides a method of increasing the efficiency of decoding a Ψ-modified codon as an amino acid in a host cell, wherein the method comprises introducing a nctRNA of the Ψ-modified codon or a nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell, wherein the nctRNA is configured to bind to the amino acid. In some embodiments, the method comprises introducing a nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell (e.g., for expressing the nctRNA at a level that is higher than the endogenous nctRNA expression level in the host cell) .

[0114] One of the consequences of mutations leading to PTCs in the coding sequence of a gene is the decrease of the mRNA levels. This is due to a mechanism known as the Nonsense -Mediated Decay (NMD) , which is a cellular surveillance mechanism that degrades aberrant mRNA transcripts, preventing transcripts that were not correctly processed from being translated. It is estimated that one-third of genetic disorders are a result of a mutation leading to a PTC (such as for instance in CF, retiniti pigmentosa (RP) , and beta-thalassemia) . In a normal scenario, exon-junction complexes (EJCs) are formed during splicing. Then, during the first translation round, ribosomes displace these EJCs. On the other hand, when a PTC is located more than 50-54 nucleotides upstream of the last EJC, the NMD pathway is triggered by formation of a termination complex consisting of EJC-associated NMD factors. When this happens during the first pioneer round of translation and the ribosomes co-exist with at least one EJC downstream their location, this triggers the de capping and 5’-to-3’ exonuclease activity and also de-adenylation of the tail and 3’-to-5’ exonuclease-mediated transcript decay. In order to tackle the aforementioned genetic disorders, or any disorder that is due to a similar mutation, inhibition of this pathway in a gene-specific and sequence-specific manner is therefore crucial.

[0115] In some aspects, provided herein are methods for recoding a PTC, which results in an increase of mRNA levels, and in translational read-though of the recoded mRNA into a full-length protein. In some embodiments, the methods comprise modifying the PTC to provide a Ψ-modified PTC. In some embodiments, the method comprises introducing a nctRNA of the Ψ-modified PTC or a nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some embodiments, the method comprises introducing a nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell (e.g., for expressing the nctRNA at a level that is higher than the endogenous nctRNA expression level in the host cell) . In some embodiments, the methods and compositions provided herein allow for PTC read-through of more than 4%, more than 5%, more than 10%, more than 12%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, or more than 40%. In some embodiments, the methods and compositions herein allow for PTC readthrough of between about 10%and about 20%, between about 15%and about 30%, between about 20%and about 40%, or between about 30%and about 50%. In some embodiments, the methods and compositions herein allow for suppression of nonsense-mediated decay (NMD) by more than 10%, more than 12%, more than 15%, more than 20%, more than 30%, or more than 40%. In some embodiments, the methods and compositions herein allow for suppression of nonsense-mediated decay (NMD) by between about 10%and about 20%, between about 15%and about 30%, between about 20%and about 40%, or between about 30%and about 50%. PTC read-through can be assayed by evaluating protein levels, either by directly quantifying the protein expression or by assaying an activity of the expressed protein. Methods for assessing NMD suppression are also known in the art. For example, to assess NMD suppression, a known NMD-inhibition reporter assay (Zhang et al. 1998, RNA 4 (7) : 80l-8l5) can be used, and translational read-through of a gene carrying a PTC can also be assessed. As exemplified herein, fluorescent reporter genes carrying nonsense mutations were used as the target sequence. Without correction, this nonsense mutation leads to a lower abundance of mRNA (as a result of NMD) as well as to a truncated protein, resulting in the absence of fluorescent signal. As shown herein, correction of the mutation via targeted pseudouridylation allows the full length protein to be translated from the mRNA. The skilled person understands that the PTC region of the fluorescent reporter constructs described herein can be exchanged by any other model or therapeutically relevant target RNA of interest.

[0116] In some embodiments, provided herein are methods for reading through a PTC in an RNA encoding a protein, wherein the method results in expression of the full-length protein in the host cell of at least 4% (e.g., at least 5%, at least 6%, at least 7%, at least 8%, at least 9%or at least 10%) of the expression level of the full-length protein without a premature termination codon. In some embodiments, the method results in expression of the full-length protein, wherein the expression of the protein is detectable without enrichment (e.g., without enrichment by immunoprecipitation) . In some embodiments, the protein is detected via a tag (e.g., via a fluorescent tag) . In some embodiments, the protein is detected by immo-staining according to methods known in the art. In some embodiments, the method results in expression of the full-length protein in at least 20%of host cells (e.g., at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, or at least 50%of host cells) .

[0117] In some embodiments, provided herein is a method for decoding a Ψ-modified PTC as an amino acid, wherein the PTC resulted from a nonsense mutation in a sense codon, wherein the method comprises modifying a target uridine residue in the PTC of the target RNA into a pseudouridine residue in the target RNA to provide a Ψ-modified PTC, and introducing a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified PTC or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the host cell, wherein the Ψ-modified PTC is decoded as an amino acid, thereby suppressing the PTC. In some cases, the method results in accurate incorporation of the original amino acid encoded by the sense codon for at least 30%, at least 40%, or at least 50%of PTCs. In some embodiments, the method results in accurate incorporation of the original amino acid encoded by the sense codon by between about 30%and about 40%, between about 20%and about 40%, between about 20%and about 50%, between about 30%and about 50%, or between about 40%and about 60%of PTCs.

[0118] In some aspects, provided herein are methods for treating, preventing, and / or blocking nonsense-mediated RNA decay of a target mRNA, the methods comprising a) modifying a target uridine residue in a PTC of the target RNA into a pseudouridine residue in the target RNA to provide a Ψ-modified PTC, and b) introducing a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified PTC or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the host cell, wherein the Ψ-modified PTC is decoded as an amino acid, thereby treating, preventing, and / or blocking nonsense-mediated RNA decay of the target mRNA. In some embodiments, the nctRNA or the nucleic acid molecule encoding the nctRNA is introduced into the host cell before modifying the target urdine residue in a PTC of the target RNA into a pseudouridine residue in the target RNA to provide a Ψ-modified PTC. In some embodiments, the nctRNA or the nucleic acid molecule encoding the nctRNA is introduced into the host cell simultaneously with a gsnoRNA or a nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA into the host cell, wherein the gsnoRNA is designed to guide modification of the target uridine residue in the PTC of the target RNA into the pseudouridine residue in the target RNA.

[0119] In some embodiments, modifying the target uridine residue in a PTC of the target RNA into the pseudouridine residue comprises introducing a guide small nucleolar RNA (gsnoRNA) into the host cell, wherein the gsnoRNA comprises a guide sequence that hybridizes to a premature termination codon (PTC) sequence comprising a target uridine residue in the target mRNA, and wherein the gsnoRNA recruits a DKC1 protein to modify the target uridine residue into a pseudouridine residue in the target RNA. In some embodiments the DKC1 is overexpressed in the host cell (i.e., expressed at a level above the endogenous expression level) . In some embodiments, the PTC is a UAG codon, and the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine, leucine, or tyrosine. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-CTG, tRNA-L-CAA, tRNA-Y-ATA and / or tRNA-Y-GTA. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-CTG. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Q-CTG comprising the sequence of any one of SEQ ID NOs: 224-227. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Q-CTG comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 224-227. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-L-CAA. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-L-CAA comprising the sequence of any one of SEQ ID NOs: 243-249. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-L-CAA comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NO: 243-249. In some embodiments, the PTC is a UAA codon, and the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine or tyrosine. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG, tRNA-Y-ATA and / or tRNA-Y-GTA. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Q-TTG comprising a sequence of any one of SEQ ID NOs: 263-265. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Q-TTG comprising a sequence of at least about 95%(e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NO: 263-265. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG-1. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG-1 comprising the sequence of SEQ ID NOs: 263. In some embodiments, the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to at least about 1.5-fold, at least about 2-fold, at least about 3-fold, at least about 4-fold, at least about 5-fold, or at least about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to between about 2-fold and about 4-fold, between about 2-fold and about 6-fold, or between about 3-fold and about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell.

[0120] In some embodiments, the DKC1 protein is an endogenous protein of the host cell. In some embodiments, the DKC1 protein is an endogenous, naturally expressed DKC1 isoform of the host cell, wherein the DKC1 isoform has cytoplasmic localization in the host cell. In some embodiments, the DKC1 protein corresponds to isoform 2 of a human DKC1 protein.

[0121] In some embodiments, the DKC1 and snoRNA can be delivered into the cell together (e.g., as part of a ribonucleoprotein (RNP) complex) . In some embodiments, the DKC1, gsnoRNA, and nctRNA or nucleic acid encoding the nctRNA are delivered into the cell together. In some embodiments, the snoRNP comprises the gsnoRNA and DKC1, NHP2, GAR1, and / or NOP10. In some embodiments, a nucleic acid sequence encoding the DKC1, a nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA, and a nucleic acid sequence encoding the nctRNA are introduced into the cell together.

[0122] In some embodiments, modifying the target uridine residue in a PTC of the target RNA into the pseudouridine residue comprises introducing an engineered gsnoRNA into the host cell, wherein the gsnoRNA comprises a guide sequence that hybridizes to a sequence comprising a target uridine residue in the target RNA (e.g., mRNA) , wherein the host cell expresses a DKC1 isoform with cytoplasmic localization, and wherein the gsnoRNA recruits the DKC1 isoform to modify the target uridine residue into a pseudouridine residue in the target RNA. In some embodiments, the method comprises introducing a splice-switching antisense oligonucleotide (ASO) into the host cell, wherein the ASO enhances expression of a DKC1 protein that is an endogenous DKC1 isoform with cytoplasmic localization in the host cell.

[0123] Splice-switching antisense oligonucleotides (ASOs) alter splicing by directing splice site selection. Splice-switching ASOs can modulate pre-mRNA splicing by binding to target pre-mRNAs and blocking access of the splicing machinery to a particular splice site, and can be used to produce novel splice variants, correct aberrant splicing or manipulate alternative splicing. Methods for the design and delivery of splice-switching antisense oligonucleotides to cells have been described, for example in U.S. Patent Publications US20180334677 and US20120040917, U.S. Patent No. 10,190,117, and Disterer et al. Hum Gene Ther. 2014 Jul; 25 (7) : 587-98, the contents of which are herein incorporated by reference in their entirety.

[0124] In some embodiments, the splice-switching ASO binds to a pre-mRNA of a DKC1 gene and directs splicing of DKC1 isoform 3. In some embodiments, introducing the splice-switching ASO increases expression of a DKC1 protein that is an endogenous DKC1 isoform with cytoplasmic localization in the host cell by at least 1.1-, 1.2-, 1.3-, 1.4-, 1.5-, 1.6-, 1.7-, 1.8-, 1.9-, 2-, 3-, 4-, 5-, or 10-fold compared to the expression of the same isoform in the host cell in the absence of the ASO. In some embodiments, administering the splice-switching ASO increases expression of DKC1 isoform 3 by at least 1.1-, 1.2-, 1.3-, 1.4-, 1.5-, 1.6-, 1.7-, 1.8-, 1.9-, 2-, 3-, 4-, 5-, or 10-fold compared to the expression of DKC1 isoform 3 in the host cell in the absence of the ASO. In some embodiments, the splice-switching ASOs may be delivered via aptamers, Inverse Molecular Sentinel nanoprobes, ASO encapsulated liposome-DNA-polycation or ASO encapsulated liposome-protamine-hyluronic acid nanoparticles and the like. Suitable methods of delivering aptamers can be found in Kotula, J. W., et al., Aptamer-mediated delivery of splice-switching oligonucleotides to the nuclei of cancer cells. Nucleic Acid Ther, 2012. 22 (3) : p. 187-95, the contents of which are incorporated by reference in their entirety.

[0125] In some embodiments, the methods provided herein comprise modification of target RNA (e.g., mRNA) sequences in eukaryotic, (e.g., metazoan or mammalian cells, such as human cells) . In some aspects, the methods and compositions provided herein can be used with cells from any organ e.g. skin, lung, heart, kidney, liver, pancreas, gut, muscle, gland, eye, brain, blood and the like. The cell can be located in vitro or in vivo. One advantage of the methods, compositions, systems, kits, and articles of manufacture of the present disclosure is that they can be used with cells in situ in a living organism, but can also be used with cells in culture. In some embodiments cells are treated ex vivo and are then introduced into a living organism (e.g. re-introduced into an organism from whom they were originally derived) . The methods, compositions, systems, kits, and articles of manufacture of the present disclosure can also be used to readthrough PTCs or recode Ψ-modified codons in cells within a so-called organoid. Organoids can be thought of as three-dimensional in vitro-derived tissues but are driven using specific conditions to generate individual, isolated tissues (e.g. see Lancaster and Knoblich. 2014, Science 345 (6194) : 1247125) . In a therapeutic setting they are useful because they can be derived in vitro from a patient’s cells, and the organoids can then be re-introduced to the patient as autologous material, which is less likely to be rejected than a normal transplant. In some embodiments, the cell to be treated has a genetic mutation. The mutation may be heterozygous or homozygous. In some embodiments, the methods and compositions provided herein can be used to modify point mutations (e.g., to readthrought a PTC caused by a point mutation, or to recode a point mutation in a sense codon) . In some embodiments, the methods and compositions provided herein are suitable for modifying sequences in cells, tissues or organs implicated in a diseased state of a subject (e.g., a human subject) , for instance when the human subject suffers from a disease associated with a PTC.

[0126] The methods described herein can be used to make a change (pseudouridylation) in a target RNA sequence in a eukaryotic cell and / or to readthrough a Ψ-modified PTC or recode any other Ψ-modified codon through the use of near-cognate tRNA (nctRNA) of the Ψ-modified PTC or Ψ-modified sense codon. In some aspects, the methods comprise modifying a target uridine residue in a target RNA to pseudouridine to provide the Ψ-modified PTC or Ψ-modified sense codon. The target RNA sequence may comprise a mutation that one may wish to correct or alter, such as a point mutation (atransition or a trans version) . The target RNA may be any cellular or viral RNA sequence, but is more usually a pre-mRNA or an mRNA with a protein coding function. In some embodiments, the target sequence is endogenous to the eukaryotic, (e.g., mammalian, e.g., human) cell.

[0127] In some embodiments, the methods provided herein are suitable for promoting read-through of a PTC, wherein the PTC is an opal codon (UGA) , an amber codon (UAG) , or an ochre codon (UAA) . In some embodiments, the PTC is a UAG codon, and the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine, leucine, or tyrosine. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-CTG, tRNA-L-CAA, tRNA-Y-ATA and / or tRNA-Y-GTA. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-CTG. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Q-CTG comprising the sequence of any one of SEQ ID NOs: 224-227. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Q-CTG comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 224-227. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-L-CAA. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-L-CAA comprising the sequence of any one of SEQ ID NOs: 243-249. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-L-CAA comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 243-249. In some embodiments, the PTC is a UAA codon, and the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine or tyrosine. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG, tRNA-Y-ATA and / or tRNA-Y-GTA. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Q-TTG comprising a sequence of any one of SEQ ID NOs: 263-265. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Q-TTG comprising a sequence of at least about 95%(e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 263-265. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG-1. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG-1 comprising the sequence of SEQ ID NO: 263. In some embodiments, the PTC is a UGA codon, and the nctRNA is tRNA-R-TCT. In some embodiments, the PTC is a UGA codon, and the Ψ-modified PTC is decoded as arginine. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-R-TCT, wherein the tRNA-R-TCT is a complete tRNA comprising an intron. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-R-TCT comprising a sequence of any one of SEQ ID NOs: 193-198. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-R-TCT comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 193-198. In some embodiments, the PTC resulted from a sense-to-nonsense uridine mutation of a glutamine sense codon, and the nctRNA is tRNA-Q-CTG or tRNA-Q-TTG. In some embodiments, the PTC resulted from a sense-to-nonsense uridine mutation of a glutamine sense codon, and the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine. In some embodiments, the nctRNA is a mature tRNA. In some embodiments, the nctRNA is a complete tRNA comprising an intron.

[0128] In some embodiments, PTC is in a sequence encoding a protein, and the method results in expression of the full-length protein in at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 80%, or higher percentage of host cells. In some embodiments, the method results in expression of the full-length protein in at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 80%, or higher percentage of host cells.

[0129] Also provided are engineered gsnoRNA compositions or engineered RNA editing systems described herein for use in any one of the methods described herein, such as a method of editing a target RNA or a method of treatment. Use of any one of the engineered gsnoRNA compositions or engineered RNA editing systems described herein in the preparation of a medicament for treating a disease or condition. A. Methods of treatment

[0130] In some embodiments, the methods provided herein comprise improving translation of a target RNA comprising a pseudouridine-modified (Ψ-modified) codon, wherein the method comprises: introducing a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified codon or a nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell; and wherein the Ψ-modified codon is decoded as an amino acid, thereby improving translation of the target RNA. In some embodiments, the methods provided herein comprise decoding a pseudouridine-modified (Ψ-modified) codon, wherein the method comprises: introducing a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified codon or a nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell; and wherein the Ψ-modified codon is decoded as an amino acid. In some embodiments, the nctRNA comprises an anticodon corresponding to the desired amino acid for decoding the Ψ-modified codon. In some embodiments, the Ψ-modified codon is a Ψ-modified PTC, and the method allows for readthrough of the PTC. In some embodiments, the Ψ-modified codon is a Ψ-modified PTC, and the method suppresses nonsense-mediated decay.

[0131] In some aspects, the methods provided herein comprise modifying a target RNA using a gsnoRNA that recruits a DKC1 protein to modify the target RNA, thereby providing the Ψ-modified codon. In some embodiments, the gsnoRNA hybridizes to a target a sequence comprising a target uridine residue, and the modification of the RNA comprises modification of the target uridine to pseudouridine. In some embodiments, the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell, wherein the nucleic acid encoding the nctRNA is present in a vector that further comprises the nucleic acid sequence encoding the DKC1 protein, and / or the nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA. In some embodiments, the vector comprises the the nucleic acid sequence encoding the nctRNA, the nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA, and the nucleic acid sequence encoding the DKC1 protein.

[0132] In some embodiments, the target RNA is an endogenous RNA of a cell (e.g., a eukaryotic cell such as a mammalian or human cell) . In some embodiments, the target RNA is an endogenously transcribed RNA of the cell (e.g., transcribed from an endogenous nucleic acid sequence of the cell) . In some embodiments, the target RNA is transcribed from a nucleic acid sequence that has been introduced into the cell (e.g., an RNA transcribed from an exogenously added nucleic acid molecule) . In some embodiments, the target RNA is a ribosomal RNA. In some embodiments, the target RNA is a messenger RNA (mRNA) .

[0133] In some embodiments, the sequence comprising the target uridine in the target RNA is a stop codon, and modification of the target uridine to pseudouridine and introduction of the nctRNA or nucleic acid molecule encoding the nctRNA causes the stop codon to be translated as a coding codon. In some embodiments, the stop codon is a premature termination codon (PTC) . In some embodiments, the PTC is associated with a genetic disease or condition. Converting the target uridine in such a PTC to a pseudouridine, by using the means and methods of the present disclosure, and introduction of the nctRNA or nucleic acid molecule encoding the nctRNA then results in proper read-through of the reading frame during translation, thereby providing a (partly or fully) functional full length protein.

[0134] In some embodiments, provided herein is a method of treating a disease or condition associated with a PTC in a target RNA in a subject, comprising editing the target RNA in a cell of the subject using any of the RNA editing methods described herein to provide a Ψ-modified PTC, and introducing a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified PTC or a nucleic acid encoding the nctRNA into the cell of the subject. In some embodiments, the Ψ-modified PTC is decoded as an amino acid that binds to the nctRNA. Decoding the Ψ-modified PTC causes translation read-through of the PTC in the target RNA, thereby suppressing the PTC and treating the disease or condition in the subject.

[0135] In some embodiments, the disease or condition is selected from the group consisting of Cystic fibrosis, Hurler Syndrome, alpha-1-antitrypsin (A1AT) deficiency, Parkinson’s disease, Alzheimer's disease, albinism, Amyotrophic lateral sclerosis, Asthma, 8-thalassemia, Cadasil syndrome, Charcot-Marie-Tooth disease, Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) , Distal Spinal Muscular Atrophy (DSMA) , Duchenne / Becker muscular dystrophy, Dystrophic Epidermolysis bullosa, Epidermolysis bullosa, Fabry disease, Factor V Leiden associated disorders, Familial Adenomatous Polyposis, Galactosemia, Gaucher's Disease, Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Haemophilia, Hereditary Hemochromatosis, Hunter Syndrome, Huntington's disease, Inflammatory Bowel Disease (IBD) , Inherited polyagglutination syndrome, Leber congenital amaurosis, Lesch-Nyhan syndrome, Lynch syndrome, Marfan syndrome, Mucopolysaccharidosis, Muscular Dystrophy, Myotonic dystrophy types I and II, neurofibromatosis, Niemann-Pick disease type A, B and C, NY-esol related cancer, Peutz-Jeghers Syndrome, Phenylketonuria, Pompe’s disease, Primary Ciliary Disease, Prothrombin mutation related disorders, such as the Prothrombin G20210A mutation, Pulmonary Hypertension, (autosomal dominant) Retinitis Pigmentosa, Sandhoff Disease, Severe Combined Immune Deficiency Syndrome (SCID) , Sickle Cell Anemia, Spinal Muscular Atrophy, Stargardt’s Disease, Tay-Sachs Disease, Usher syndrome, X-linked immunodeficiency, Sturge-Weber Syndrome, and cancer. Exemplary diseases or conditions associated with PTCs in target RNAs are listed in the Human Gene Mutation Database ( available at hgmd. cf. ac. uk) and ClinVar database (see Landrum et al. ClinVar: improvements to accessing data. Nucleic Acids Res. 2020; 48 (D1) : D835-D844; available at ncbi. nlm. nih. gov / clinvar / intro) . In some embodiments, threonine or serine is incorporated at the ΨAA and ΨAG codons, and phenylalanine or tyrosine at the ΨGA codons.

[0136] In some embodiments, the disease or condition is cystic fibrosis. In some embodiments, the host cell is a bronchial epithelial cell (e.g., a human bronchial epithelial cell) . In some embodiments, the PTC resulted from a nonsense mutation R553X in a CFTR gene of the subject. In some embodiments, the method comprises introducing into the cell a nctRNA of the PTC comprising the R553X mutation, or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA of the PTC comprising the R553X mutation. In some embodiments, the method comprises introducing into the cell a nucleic acid molecule encoding the nctRNA of the PTC comprising the R553X mutation. In some embodiments, the nctRNA comprising the R553X mutation is a tRNA-R-TCT1 tRNA. In some embodiments, the method results in a rescue of 10%-35%of wild-type CFTR channel function, which is considered therapeutically relevant. In some embodiments, the method results in a rescue of 30%-40%of wild-type CFTR function. In some embodiments, the method results in a rescue of at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 35%, or at least 30%of wild-type CFTR channel function in the host cell. In some embodiments, the method results in a rescue of at least 30%of wild-type CFTR channel function in the host cell. Methods of measuring CFTR function are known in the art, including measuring current / voltage relationships of model cells such as 16HBE14o-cells total membrane currents at basal steady state, and with stimulation by cAMP (e.g., stimulation with 40 μM 8-CPT-cAMP) . In some embodiments, nonsense-mediated decay of the target CFTR RNA in the host cell is reduced by the method.

[0137] Example 4 provides data demonstrating that expression of RESTART v3 rescued CFTR-R553X function to approximately 60%-80%of the VX-770-treated CFTR-G551D level, which is equivalent to 30%-40%of wild-type CFTR function, and surpasses the threshold range of 10%-35%rescue that is considered clinically relevant.

[0138] In some embodiments, the disease or condition is Hurler syndrome. In some embodiments, the subject is a mouse and the PTC resulted from a nonsense mutation W392X in an IDUA gene of the subject. In some embodiments, the subject is a human and the PTC resulted from a nonsense mutation W402X in an IDUA gene of the subject. In some embodiments, the method comprises introducing into the cell a nctRNA of the PTC comprising the W402X mutation, or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA of the PTC comprising the W402X mutation. In some embodiments, the method comprises introducing into the cell a nucleic acid molecule encoding the nctRNA of the PTC comprising the W402X mutation. In some embodiments, the nctRNA comprising the W402X mutation is tRNA-Q-CTG-1. In some embodiments, the method restores at least 0.5%, at least 1%, at least 2%, at least 5%, at least 6%, at least 8%, or at least 10%of wild-type IDUA activity in the host cell. In some embodiments, the method restores at least between 0.5%-10%, 2%-10%, 5%-10%, 6%-10%, 8%-10%, or 9%-10%of wild-type IDUA activity in the host cell. In some embodiments, the method results in a significant decrease in accumulation of glycosaminoglycans (GAGs) in the subject. In some embodiments, nonsense-mediated decay of the target IDUA RNA in the host cell is reduced by the method.

[0139] Example 4 provides data demonstrating that RESTART v3 significantly restored the IDUA activity (to approximately 10%of wild-type cells) , surpassing the 0.5%threshold associated with attenuated disease manifestation. Additionally, the accumulation of GAGs was significantly decreased, indicating the effective functional rescue in mIDUA-W392X primary cells under the action of RESTART v3 system.

[0140] In some embodiments, the present disclosure provides for the use of a near cognate RNA (nctRNA) of a Ψ-modified PTC, or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA of the PTC, in the manufacture of a medicament for the treatment of one or more of the diseases listed herein. In some embodiments, the present disclosure provides for the use of a near cognate RNA (nctRNA) of a Ψ-modified PTC or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA of the PTC, and a gsnoRNA or a nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA in the manufacture of a medicament for the treatment of one or more of the diseases listed herein. In some embodiments, the disease is cystic fibrosis (CF) . Exemplary PTCs associated with CF are known in the art, for example as described in international patent publication WO2019191232, the contents of which are herein incorporated by reference in their entirety. Exemplary cystic fibrosis-associated PTC mutations include, but are not limited to, G542X (UGA) , W1282X (UGA) , R553X (UGA) , R1162X (UGA) , Y122X (UAA) , W1089X, W846X, and W401X mutations, which can be modified through pseudouridylation to Ψ-modified PTC, and the Ψ-modified PTC can be read through (decoded) in a method comprising introducing an nctRNA of the Ψ-modified PTC or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA, thereby allowing the translation to full length proteins. In some embodiments, the host cell is an archaeal or eukaryotic cell. In some embodiments, the host cell is a mammalian cell. In some embodiments, the host cell is a human cell. In some embodiments, the method is carried out in vivo. In other embodiments, the method is carried out ex vivo.

[0141] The methods of the present disclosure can be applied to suppress NMD and / or promote PTC read-through of a disease-associated PTC for a wide range of known disease-associated PTCs. There are a large number of human diseases that result from nonsense mutations in the respective disease genes. For instance, Usher syndrome is an inherited retinal dystrophy (IRD) that is the principal cause of combined deafness and blindness. Nonsense mutations occur in 12%of Usher syndrome patients and have been described in different genes, such as the USH2A gene. Some Hurler Syndrome patients, suffering from skeletal abnormalities and cognitive impairment, carry a nonsense mutation in the IDUA gene that prevents the production of a functional full-length IDUA protein in these patients. A substantial fraction of cystic fibrosis (CF) cases, a chronic disease affecting the lungs and the digestive system, is due to nonsense mutations in the CFTR gene. The PTCs resulting from these nonsense mutations are identified in the coding region at several different sites, each of which leads to total lack of functional full-length CFTR protein. Nonsense mutations are also found in some relevant oncogenes of many cancer patients, resulting in complete lack of full-length protein products. Given the deleterious role of nonsense mutations in gene expression and disease, nonsense suppression becomes an attractive strategy and the ultimate goal in combating these diseases. B. Ψ Modification of a Codon in a Target RNA

[0142] In some embodiments, the method comprises editing a target RNA in a host cell to provide the Ψ-modified codon (e.g., a Ψ-modified PTC) . In some embodiments, the method comprises introducing an engineered guide small nucleolar RNA (gsnoRNA) or a nucleic acid encoding the gsnoRNA and a nucleic acid encoding a DKC1 protein into the host cell, wherein the gsnoRNA comprises a guide sequence that hybridizes to a sequence comprising a target uridine residue in the target RNA, and wherein the gsnoRNA recruits the DKC1 protein to modify the target uridine residue into a pseudouridine residue in the target RNA. In some embodiments, the gsnoRNA or the nucleic acid encoding the gsnoRNA and the nucleic acid encoding the DKC1 are introduced into the cell simultaneously with the nucleic acid encoding the nctRNA. In some embodiments, the method comprises contacting the cell with a first nucleic acid construct encoding the gsnoRNA and the DKC1 protein, and a second nucleic acid construct encoding the nctRNA. In some embodiments, the construct encoding the nctRNA comprises at least 2, 3, or 4 copies of a nucleic acid sequence encoding the nctRNA. In some embodiments, the method comprises contacting the cell with a nucleic acid construct encoding the gsnoRNA, the DKC1 protein, and the nctRNA.

[0143] Examples of DKC1 proteins and nucleic acids encoding DKC1 are described in WO2022247896, the content of which is herein incorporated by reference in its entirety, and in Section II. B. (i) . In some embodiments, the DKC1 protein is a DKC1 isoform (e.g., isoform 3) with cytoplasmic localization. In some embodiments, the DKC1 protein is part of a ribonucleoprotein (RNP) complex that associates with the gsnoRNA. In some embodiments, the DKC1 protein comprises a deletion of a nuclear localization signal (NLS) relative to a wildtype DKC1 protein of the same species. In some embodiments, the DKC1 protein is a truncated DKC1 variant or a DKC1 variant comprising a deletion, such as any of the truncation or deletion variants described in Section II. B. (i) . In some embodiments, the gsnoRNA recruits NOP10, GAR1, and NHP2 in the host cell.

[0144] In some embodiments, the method does not comprise introducing a DKC1 protein or nucleic acid encoding the DKC1 protein into the host cell. In some embodiments, the method does not comprise altering expression of an endogenous DKC1 protein in the host cell. Example 1 of the present application provides unexpected results demonstrating that introducing a nucleic acid molecule encoding a nctRNA combination with a nucleic acid molecule encoding a gsnoRNA for targeted pseudouridylation of a PTC to provide achieves efficient readthrough of the target PTC. The nctRNA is a nctRNA of the Ψ-modified PTC produced by pseudouridylation guided by the gsnoRNA. Based on these results, the combination of gsnoRNA and near-cognate tRNA could achieve a high readthrough efficiency of PTCs without introducing DKC1 isoform 3 or a nucleic acid encoding DKC1 isoform 3. Advantageously, this may allow for more efficient delivery in view of the small size of a system comprising the nctRNA or a nucleic acid sequence encoding the nctRNA, and the gsnoRNA or a nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA.

[0145] In some embodiments, the method comprises introducing a nucleic acid (e.g., a nucleic acid vector) encoding the gsnoRNA into the cell. In some embodiments, the method comprises contacting the cell with a nucleic acid construct encoding the gsnoRNA and the nctRNA. In other embodiments, the method comprises introducing a gsnoRNA oligonucleotide into the cell. In some embodiments, the method comprises contacting the cell with a first nucleic acid construct encoding the gsnoRNA, and a second nucleic acid construct encoding the nctRNA.

[0146] Examples of gsnoRNA and nucleic acids encoding gsnoRNA are described in WO2022247896, the content of which is herein incorporated by reference in its entirety, and in Section II. B. (ii) . In some embodiments, the gsnoRNA comprises a first hairpin and H box and a second hairpin and ACA box. In some embodiments, the gsnoRNA is prepared by in vitro transcription. In some embodiments, the gsnoRNA prepared by in vitro transcription comprises the sequence of any one of SEQ ID NOs: 4-6, 9-12, 15-19 and 22-36. In some embodiments, the gsnoRNA prepared by in vitro transcription comprises a 5’ cap modification or a 5’ hairpin (e.g., of a U6+U27 expression cassette) . In some embodiments, the gsnoRNA prepared by in vitro transcription comprises a 5’ cap modification. In some embodiments, the 5’ cap modification is is a m7G modification (e.g., a cap 0, cap 1, or cap 2 modification) or an m6Am modification. Suitable methods for adding a 5’ cap to an RNA oligonucleotide have been described, for example, in U.S. Patent No. 10,494,399, the contents of which are herein incorporated by reference in their entirety. In some embodiments, the gsnoRNA further comprises a 3’ hairpin (e.g., the gsnoRNA comprises the sequence of any one of SEQ ID NOs: 4-6, 9-12, 15-19 and 22-36 and a 3’ hairpin) . In some embodiments, the gsnoRNA comprises a 5’ cap modification and does not comprise a 3’ hairpin. In some embodiments, the in vitro transcripbed gsnoRNA is capable of guiding targeted pseudouridylation in the cell. In some embodiments, the 5’ cap modification is introduced by in vitro transcription using an m7G (5') ppp (5') G cap analog.

[0147] In some embodiments, modifying the target uridine residue in a target RNA to a pseudouridine comprises introducing a nucleic acid (e.g., a nucleic acid vector) encoding a gsnoRNA that is a half gsnoRNA (e.g., comprising a single hairpin and an H box, or comprising a single hairpin and an ACA box) into a cell. In other embodiments, the method comprises introducing a gsnoRNA that is a half gsnoRNA (e.g., comprising a single hairpin and an H box, or comprising a single hairpin and an ACA box) into a cell. The gsnoRNA or nucleic acid encoding the gsnoRNA can be introduced simultaneously or sequentially with the nctRNA or the nucleic acid encoding the nctRNA. In some embodients, the gsnoRNA comprises no more than 20, no more than 15, no more than 10, no more than 8, no more than 6, or no more than 4 2’-OMe or 2’-MOE modifications. In some embodiments, the gsnoRNA comprises between about 2 and about 6 2’-OMe or 2’-MOE modifications. In some embodiments, the gsnoRNA comprises about 4 2’-OMe or 2’-MOE modifications. In some embodiments, the gsnoRNA comprises no more than 5 modified sugars. In some embodiments, the gsnoRNA comprises two nucleosides comprising modified sugar moieties (e.g., 2’-OMe) at the 5’ end and two nucleosides comprising modified sugar moieties (e.g., 2’-OMe) at the 3’ end of the gsnoRNA. In some embodiments, the gsnoRNA comprises no more than four, three, or two nucleosides comprising modified sugar moieties (e.g., 2’-OMe) at the 5’ end and no more than four, three, or two nucleosides comprising modified sugar moieties (e.g., 2’-OMe) at the 3’ end of the gsnoRNA. In some embodiments, the gsnoRNA comprises one or more phosphorothioate inter-nucleosidic linkages. In some embodiments, the gsnoRNA comprises no more than 20, no more than 15, no more than 10, no more than 8, or no more than 6 phosphorothioate linkages. In some embodiments, the gsnoRNA comprises between about 2 and about 10 phosphorothioate linkages. In some embodiments, the gsnoRNA comprises about 6 phosphorothioate linkages. In some embodiments, the gsnoRNA comprises about three phosphorothioate linkages at the 5’ end and about three phosphorothioate linkages at the 3’ end of the gsnoRNA. In some embodiments, the gsnoRNA comprises no more than five, four, or three phosphorothioate linkages at the 5’ end and no more than five, four, or three phosphorothioate linkages at the 3’ end of the gsnoRNA. In some embodiments, the gsnoRNA comprises a 5’ hairpin, an H box (consensus sequence ANANNA) , a 3’ hairpin, and an ACA box (consensus sequence ANA) . In some embodiments, the gsnoRNA comprises a single hairpin and an H box (referred to herein as a gH5 or rH5 for 5’ half gsnoRNA encoding sequence or gsnoRNA oligonucleotide, respectively) , and lacks an ACA box. In some embodiments, the gsnoRNA comprises a single hairpin and an ACA box (referred to herein as a gH3 or rH3 for 3’ half gsnoRNA encoding sequence or gsnoRNA oligonucleotide, respectively) , and lacks an H box. In some embodiments, the gsnoRNA comprising a single hairpin is between 60 and 70 nucleotides in length. In some embodiments, the gsnoRNA comprising a single hairpin is about 65 nucleotides in length.

[0148] In some embodiments, the method of treating a disease or condition associated with a PTC in a target RNA in a subject comprises introducing a nctRNA of a PTC comprising a target uridine residue and an engineered gsnoRNA into a host cell of the subject, wherein the gsnoRNA comprises a guide sequence that hybridizes to the PTC comprising the target uridine residue in the target RNA, wherein the gsnoRNA comprises a scaffold sequence derived from wildtype ACA2b, ACA36, ACA44, ACA27, E2, ACA3, or ACA17, and wherein the gsnoRNA recruits a DKC1 protein in the host cell to modify the target uridine residue into a pseudouridine residue in the target RNA. In some embodiments, the DKC1 protein is an endogenous DKC1 protein of the host cell. In some embodiments, the method further comprises introducing a nucleic acid encoding the DKC1 protein into the host cell. In some embodiments, the DKC1 protein has cytoplasmic localization in the host cell. In some embodiments, the DKC1 protein comprises a DKC1 protein fragment corresponding to amino acid residues 41 to 420 of a human DKC1 isoform 3 protein, wherein the amino acid numbering is according to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the DKC1 protein comprises an amino acid sequence having at least 85% (e.g., at least about any one of 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) identity to SEQ ID NO: 88. In some embodiments, the DKC1 protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 88.

[0149] In some embodiments, the method of treating a disease or condition associated with a PTC in a target RNA in a subject comprises introducing an engineered gsnoRNA into a host cell of the subject, wherein the gsnoRNA comprises a guide sequence that hybridizes to the PTC comprising the target uridine residue in the target RNA, wherein the gsnoRNA comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4-6, 9-12, 15-19, 22-36, and 177-179, and wherein the gsnoRNA recruits a DKC1 protein in the host cell to modify the target uridine residue into a pseudouridine residue in the target RNA. In some embodiments, the DKC1 protein is an endogenous DKC1 protein of the host cell. In some embodiments, the method further comprises introducing a nucleic acid encoding the DKC1 protein into the host cell. In some embodiments, the DKC1 protein has cytoplasmic localization in the host cell. In some embodiments, the DKC1 protein comprises a DKC1 protein fragment corresponding to amino acid residues 41 to 420 of a human DKC1 isoform 3 protein, wherein the amino acid numbering is according to SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the DKC1 protein comprises an amino acid sequence having at least 85% (e.g., at least about any one of 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more) identity to SEQ ID NO: 88. In some embodiments, the DKC1 protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 88.

[0150] In some embodiments, the gsnoRNA is a half gsnoRNA, e.g., comprising a single hairpin and an H box, or a single hairpin and an ACA box. In some embodiments, the gsnoRNA comprises or consists of any one of the sequences set forth in SEQ ID NOS: 89-100 and 113-128. In some embodiments, the method of treating a disease or condition associated with a PTC in a target RNA in a subject comprises introducing an engineered gsnoRNA into a host cell of the subject, wherein the gsnoRNA comprises a sequence selected from SEQ ID NOs: 71-84. Sequences of exemplary engineered gsnoRNAs targeting uridine residues of exemplary disease-associated PTCs are shown in Table 4.

[0151] In some embodiments, the gsnoRNA comprises a scaffold sequence derived from a wildtype H / ACA-snoRNA selected from the group consisting of ACA19, ACA2b, ACA36, ACA44, ACA27, E2, ACA3, and ACA17. In some embodiment, the gsnoRNA comprises a scaffold sequence derived from ACA2b. In some embodiments, the gsnoRNA comprises a scaffold sequence derived from ACA36. In some embodiments, the gsnoRNA comprises a scaffold sequence derived from ACA19. In some embodiments, the gsnoRNA comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3-12, 15-19, 22-36, and 177-179. In some embodiments, the gsnoRNA comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 15-19. (i) DKC1 protein

[0152] In some embodiments, the methods, systems, kits, or articles of manufacture provided provided herein comprise a DKC1 protein for modifying a target uridine residue into a pseudouridine residue (e.g., the pseudoridine residue of the Ψ-modified PTC) , or a nucleic acid encoding the DKC1 protein. Examples of DKC1 proteins and related methods for increasing DKC1 expression and / or cytoplasmic localization are provided in WO2022247896, the content of which is herein incorporated by reference in its entirety. In some embodiments, modifying the target uridine residue comprises introducing an engineered guide small nucleolar RNA (gsnoRNA) or a nucleic acid for expression of the gsnoRNA into the host cell, wherein the gsnoRNA comprises a guide sequence that hybridizes to a sequence comprising the target uridine residue in the target RNA, and wherein the gsnoRNA recruits the DKC1 protein to modify the target uridine residue into the pseudouridine residue in the target RNA.

[0153] Dyskerin (DKC1) is a highly conserved multifunctional protein that acts as RNA-guided pseudouridine synthase, directing the enzymatic conversion of specific uridines to pseudouridines. It concentrates in the nucleoli and the Cajal bodies (CBs) where, in association with three other highly conserved proteins (Nop10, Nhp2, Gar1) , DKC1 composes a tetramer able to enter in the composition of different nuclear RNPs playing key biological functions. Within the nucleolus, the tetramer associates with H / ACA small nucleolar RNAs (snoRNAs) to compose the H / ACA snoRNPs, that regulate rRNA processing and pseudouridylate RNA targets by snoRNA-guided base complementarity. Within the CBs, it associates with CB specific small RNAs (scaRNAs) to compose the scaRNPs, that direct pseudouridylation of spliceosomal snoRNAs.

[0154] There are two DKC1 isoforms in human cells: DKC1 isoform 1 is the canonical DKC1 form containing the bipartite N-and C-terminal nuclear localization signals (NLSs) ; DKC1 isoform 3 is an alternative splicing variant, which is produced by retention of the intron 12 and lacks C-terminal NLS. The endogenous mRNA expression level of isoform1 is approximately 20-fold greater than that of isoform 35. In some embodiments, increasing the level of DKC1 isoform 3 enhances the target pseudouridylation editing efficiency (e.g., editing efficiency of target mRNAs) guided by gsnoRNAs. In some embodiments, increasing the level of DKC1 isoform 3 enhances PTC readthrough efficiency in a method comprising DKC1 pseudouridylation of the PTC guided by gsnoRNAs. In some embodiments, introducing the nctRNA or a nucleic acid encoding the nctRNA of the PTC into the host cell further increases PTC readthrough efficiency. In some embodiments, the method comprising introducing the nctRNA or a nucleic acid encoding the nctRNA of the PTC results in an average of at least about 2-fold, at least about 3-fold, or at least about 5-fold higher efficiency in PTC suppression / readthrough than a control method performed without introducing the nctRNA or the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some cases, the control method comprises increasing the level of DKC1 isoform 3 using any of the approaches described herein, without introducing the nctRNA or the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some cases, the control method comprises increasing the level of DKC1 isoform 3 using any of the approaches described herein, without expressing the nctRNA into the host cell.

[0155] In some aspects, compositions, systems, kits, or articles of manufacture of the present disclosure comprise nucleic acid constructs for expression of a DKC1 protein. In some aspects, compositions, systems, kits, or articles of manufacture of the present disclosure comprise a DKC1 protein (e.g., a DKC1 protein in complex with a gsnoRNA) . In some embodiments, the DKC1 protein is isoform 3 of a mammalian DKC1 protein. In some embodiments, the DKC1 protein is homologous to isoform 3 of a human DKC1 protein. In some embodiments, the DKC1 protein has at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%sequence identity to isoform 3 of human DKC1 protein. In some embodiments, the DKC1 protein is isoform 3 of human DKC1 protein. In some embodiments, the DKC1 protein comprises an amino acid sequence having at least 85% (e.g., at least any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 2. The sequence of full-length DKC1 (isoform 1) and isoform 3 DKC1 are shown in Table 1 below.

[0156] In some embodiments, the DKC1 protein is part of a ribonucleoprotein (RNP) complex that associates with the gsnoRNA. In some embodiments, the ribonucleoprotein complex comprises NOP10, GAR1, and / or NHP2.

[0157] In some aspects, the DKC1 is a truncated DKC1 protein variant. In some embodiments, the DKC1 protein comprises a deletion of a nuclear localization signal (NLS) relative to a wildtype DKC1 protein of the same species. In some embodiments, the DKC1 protein comprises a deletion of amino acid residues 9-21 of DKC1 isoform 3, wherein the amino acid numbering is based on SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the DKC1 protein comprises amino acid residues 22-420 of DKC1 isoform 3, wherein the amino acid numbering is based on SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the DKC1 protein comprises amino acid residues 35-420 of DKC1 isoform 3, wherein the amino acid numbering is based on SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the DKC1 protein comprises amino acid residues 41-420 of DKC1 isoform 3, wherein the amino acid numbering is based on SEQ ID NO: 2. Although the DKC1 sequence in SEQ ID NO: 2 is isoform 3 of human DKC1, the person of ordinary skill in the art will understand how to generate corresponding truncation and deletion variants of homologous DKC1 proteins based on sequence alignments (e.g., corresponding deletion / truncation variants of DKC1 proteins from other mammalian species) .

[0158] In some embodiments, the DKC1 protein comprises an amino acid sequence having at least 85% (e.g., at least any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 85. In some embodiments, the DKC1 protein comprises an amino acid sequence having at least 85% (e.g., at least any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 86. In some embodiments, the DKC1 protein comprises an amino acid sequence having at least 85% (e.g., at least any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 87. In some embodiments, the DKC1 protein comprises an amino acid sequence having at least 85% (e.g., at least any of 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) sequence identity to SEQ ID NO: 88. Table 1. DKC1 protein sequences

[0159] In some cases, the DKC1 is an amino acid sequence variant of any of the DKC1 proteins provided herein. For example, it may be desirable to improve the stability and / or other biological properties of DKC1 (e.g., of the catalytic domain of DKC1) or of its interaction with other proteins in a ribonucleoprotein complex. Structures of DKC1 and other proteins in the ribonucleoprotein complex have been described, for example in Rashid et al. (Molecular Cell (2006) 21 (2) : 249-260) and Czekay et al. (Front. Microbiol. (2021) 12: 654370) , the contents of which are herein incorporated by reference in their entirety. Amino acid sequence variants of a DKC1 protein may be prepared by introducing appropriate modifications into the nucleotide sequence encoding the target-binding moiety, or by peptide synthesis. Such modifications include, for example, deletions from, and / or insertions into and / or substitutions of residues within the amino acid sequences of the target-binding moiety. Any combination of deletion, insertion, and substitution can be made to arrive at the final construct, provided that the final construct possesses the desired characteristics.

[0160] In some embodiments, DKC1 protein variants having one or more amino acid substitutions are provided. Amino acid substitutions may be introduced into a DKC1 protein and the products screened for a desired activity

[0161] Conservative substitutions are shown in Table A below. TABLE A: CONSERVATIVE SUBSTITITIONS

[0162] Amino acids may be grouped into different classes according to common side-chain properties: a. hydrophobic: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile; b. neutral hydrophilic: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; c. acidic: Asp, Glu; d. basic: His, Lys, Arg; e. residues that influence chain orientation: Gly, Pro; f. aromatic: Trp, Tyr, Phe.

[0163] Non-conservative substitutions will entail exchanging a member of one of these classes for another class.

[0164] Also contemplated are fusion proteins comprising a fragment of a naturally occurring DKC1 protein or a functional variant thereof and a heterologous amino acid sequence, e.g., at the N-terminus, the C-terminus, or an internal location of the DKC1 fragment. (ii) Engineered gsnoRNA and Nucleic Acid Constructs

[0165] In some embodiments according to any of the methods provided herein, the method comprises performing targeted pseudouridylation of a target RNA to provide the Ψ-modified codon (e.g., Ψ-modified PTC) . In some cases, the method comprises modifying the target uridine residue by introducing an engineered guide small nucleolar RNA (gsnoRNA) or a nucleic acid for expression of the gsnoRNA into the host cell, wherein the gsnoRNA comprises a guide sequence that hybridizes to a sequence comprising the target uridine residue in the target RNA, and wherein the gsnoRNA recruits a DKC1 protein to modify the target uridine residue into the pseudouridine residue in the target RNA. Examples of gsnoRNA scaffolds and gsnoRNAs for targeted pseudouridylation in cells are provided in WO2022247896, the content of which is herein incorporated by reference in its entirety.

[0166] In some aspects, provided herein are engineered gsnoRNA based on H / ACA snoRNAs. In some embodiments, the gsnoRNA comprises a single guide sequence. In some embodiments, the gsnoRNA comprise two guide sequences. In some embodiments, the engineered gsnoRNA comprises more than two (e.g., 3, 4, 5, 6, or more) guide sequences. For example, H / ACA snoRNAs contain two hairpins followed by the H and ACA box motifs. In some embodiments, both hairpins of the engineered gsnoRNAs provided herein contain guide sequences that are capable of targeting the target pseudouridylation site. In other embodiments, only one hairpin of an engineered gsnoRNA contains a guide sequence capable of targeting the target pseudouridylation site. Exemplary engineered gsnoRNA sequences are provided in Tables 2 and 3 below.

[0167] In some aspects, the gsnoRNA is a synthetic oligonucleotide, which can be synthesized according to methods known in the art. In some embodiments, gsnoRNAs according to the present disclosure are oligoribonucleotides (full RNA) . However, in some embodiments, gsnoRNAs of the present disclosure may comprise DNA. In some embodiments, especially when exclusively consisting of nucleotides or linkages that can be expressed in a biological system, gsnoRNAs may be expressed in situ, e.g. from a plasmid or a viral vector.

[0168] In some aspects, the gsnoRNA comprises a scaffold sequence derived from a wildtype H / ACA-snoRNA selected from the group consisting of ACA2b and ACA36. In some aspects, the editing efficiency of a gsnoRNA derived from a wildtype H / ACA scaffold is at least 5% (e.g., between or between about 5%-15%or 5-10%) in mammalian cells (e.g., in human cells such as HEK293T cells) . In some embodiments, the gsnoRNA comprises a scaffold sequence derived from ACA2b. In some embodiments, the gsnoRNA comprises a scaffold sequence derived from ACA36. In some embodiments, the gsnoRNA comprises a scaffold sequence derived from ACA19.

[0169] In some aspects, the present kits, systems, or articles of manufacture comprise engineered gsnoRNA and engineered gsnoRNA scaffolds derived from wildtype H / ACA-snoRNA (e.g., from ACA2b, ACA36, or ACA19) , wherein the gsnoRNA are capable of modifying a PTC in an RNA encoding a protein, wherein said modification results in expression of the full-length protein. In some embodiments, the nctRNA improves the expression of the full-length protein in a host cell comprising or expressing an exogenously provided nctRNA, in comparison to a control cell that does not comprise or express the exogenously provided nctRNA. In some embodiments, the nctRNA improves the expression of the full-length protein in a host cell comprising or expressing an exogenously provided nctRNA, in comparison to a control cell that expresses an endogenous level of the nctRNA.

[0170] In some embodiments, the gsnoRNA comprises one or more guide sequences each located in a region corresponding to a hairpin structure of the wildtype H / ACA-snoRNA. In some embodiments, the gsnoRNA comprise one or more guide sequences located in a hairpin structure at the 3’ terminal part of the wildtype H / ACA-snoRNA. In some embodiments, the gsnoRNA comprise one or more guide sequences located in a hairpin structure at the 5’ terminal part of the wildtype H / ACA-snoRNA.

[0171] In some embodiments, the gsnoRNA comprises one or more mutations (e.g., substitution, insertion and / or deletion) in one or more hairpin structures (e.g., the 3’ and / or 5’ hairpin structures) of the wildtype ACA19. In some embodiments, the gsnoRNA comprises one or more mutations that alter the distance between the nucleotide residue in the guide region that hybridizes to the target uridine and the H / ACA box compared to a wildtype scaffold. In some embodiments, the one or more mutations comprise insertion or deletion of one or more nucleotide residues. In some embodiments, the engineered gsnoRNA comprises 14 nucleotides between the nucleotide residue in the guide region that hybridizes to the target uridine and the H / ACA box. In some embodiments, the engineered gsnoRNA comprises 15 nucleotides between the nucleotide residue in the guide region that hybridizes to the target uridine and the H / ACA box. In some embodiments, said mutations increase the efficiency of pseudouridylation (e.g., the efficiency of PTC-readthrough) by at least 1.2-, 1.3-, 1.4-, 1.5-, or 1.6-fold compared to the wildtype scaffold.

[0172] In some embodiments, the one or more mutations comprise substitutions in a small polyU sequence (e.g., a sequence of 4 or more, or 5 or more consecutive uridine (U) residues) . In some embodiments, the one or more mutations comprise altering a small polyU sequence so that it comprises no more than two consecutive U residues. In some embodiments, the one or more mutations comprise a single base mutation in a “UUUU” sequence. In some embodiments, the mutation is a “UUCU” mutation or a “UGUU” mutation. In some embodiments, the mutated polyU sequence is located in a loop region of the gsnoRNA scaffold. In some embodiments, the engineered gsnoRNA comprises the sequence of SEQ ID NO. 49 or 50. In some embodiments, the engineered gsnoRNA comprises the sequence of SEQ ID NO. 15 or 16. In some embodiments, said mutations increase the efficiency of pseudouridylation (e.g., the efficiency of PTC-readthrough) by at least 1.2-, 1.3-, 1.4-, 1.5-, or 1.6-fold compared to the wildtype scaffold.

[0173] In some embodiments, the one or more mutations comprise mutations that increase the openness of a guide region compared to the guide region of a wildtype scaffold. In some embodiments, the one or more mutations reduce the base-pairing probability of one or more residues within a guide region of the gsnoRNA scaffold (e.g., the 5’ guide region of the gACA19 scaffold) . In some embodiments, the one or more mutations comprise insertion or one or more nucleotides. In some embodiments, the one or more mutations comprise the addition of CU after residue 8, wherein the numbering is according to SEQ ID NO: 37. In some embodiments, the engineered gsnoRNA is the gsnoRNA of SEQ ID NO: 53.

[0174] In some embodiments, the one or more mutations are selected from the group consisting of substitution of residues 26-29 with UUCU, substitution of residues 26-29 with UGUU, addition of G to the 3’ hairpin structure after residue 115, and addition of a dinucleotide sequence (XX, e.g., CU) to the 5’ hairpin after residue 8, wherein X is a nucleotide selected from A, U, C, and G, and wherein the numbering is according to SEQ ID NO: 37.

[0175] In some embodiments, gsnoRNA comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 17-19 and 22-29.

[0176] In some embodiments, the gsnoRNA comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4-6, 9-12, 15-19, 22-36, and 177-179.

[0177] In some embodiments, the gsnoRNA comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 15-19.

[0178] In some embodiments, the gsoRNA comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20-21 and 145-150.

[0179] In some embodiments, the gsnoRNA is a disease-targeting gsnoRNA (e.g., any of the gsnoRNA sequences provided in Table 4) .

[0180] In some embodiments, the gsnoRNA comprises one or more chemically modified nucleosides and / or inter-nucleosidic linkages. In some embodiments, the gsnoRNA comprises one or more nucleosides having 2’ O-methyl (2’-OMe) or 2’-O-methoxyethyl (2’-MOE) modifications. In some embodiments, a gsnoRNA according to the present disclosure may be chemically modified almost in its entirety, for example by providing nucleotides with a 2’-O-methylated sugar moiety (2’-OMe) and / or with a 2’-O-methoxyethyl sugar moiety (2’-MOE) . In some embodients, the gsnoRNA comprises no more than 20, no more than 15, no more than 10, no more than 8, no more than 6, or no more than 4 2’-OMe or 2’-MOE modifications. In some embodiments, the gsnoRNA comprises between about 2 and about 6 2’-OMe or 2’-MOE modifications. In some embodiments, the gsnoRNA comprises about 4 2’-OMe or 2’-MOE modifications. In some embodiments, the gsnoRNA comprises no more than 5 modified sugars. In some embodiments, the gsnoRNA comprises two nucleosides comprising modified sugar moieties (e.g., 2’-OMe) at the 5’ end and two nucleosides comprising modified sugar moieties (e.g., 2’-OMe) at the 3’ end of the gsnoRNA. In some embodiments, the gsnoRNA comprises no more than four, three, or two nucleosides comprising modified sugar moieties (e.g., 2’-OMe) at the 5’ end and no more than four, three, or two nucleosides comprising modified sugar moieties (e.g., 2’-OMe) at the 3’ end of the gsnoRNA. In some embodiments, the gsnoRNA comprises one or more phosphorothioate inter-nucleosidic linkages. In some embodiments, the gsnoRNA comprises no more than 20, no more than 15, no more than 10, no more than 8, or no more than 6 phosphorothioate linkages. In some embodiments, the gsnoRNA comprises between about 2 and about 10 phosphorothioate linkages. In some embodiments, the gsnoRNA comprises about 6 phosphorothioate linkages. In some embodiments, the gsnoRNA comprises about three phosphorothioate linkages at the 5’ end and about three phosphorothioate linkages at the 3’ end of the gsnoRNA. In some embodiments, the gsnoRNA comprises no more than five, four, or three phosphorothioate linkages at the 5’ end and no more than five, four, or three phosphorothioate linkages at the 3’ end of the gsnoRNA. Example 7 provides results demonstrating that a limited number of modifications is sufficient for stability and function of gsnoRNA oligonucleotides.

[0181] In some embodiments, the gsnoRNA comprises one or more chemically modified nucleosides and / or inter-nucleosidic linkages. In some embodiments, the gsnoRNA comprises one or more nucleosides having 2’ O-methyl (2’-OMe) or 2’-O-methoxyethyl (2’-MOE) modifications. In some embodiments, a gsnoRNA according to the present disclosure may be chemically modified almost in its entirety, for example by providing nucleotides with a 2’-O-methylated sugar moiety (2’-OMe) and / or with a 2’-O-methoxyethyl sugar moiety (2’-MOE) . In some embodientsIn some embodiments, the gsnoRNA comprises a 5’ hairpin, an H box (consensus sequence ANANNA) , a 3’ hairpin, and an ACA box (consensus sequence ANA) . In some embodiments, the gsnoRNA comprises a single hairpin and an H box (referred to herein as a gH5 or rH5 for 5’ half gsnoRNA encoding sequence or gsnoRNA oligonucleotide, respectively) , and lacks an ACA box. In some embodiments, the gsnoRNA comprises a single hairpin and an ACA box (referred to herein as a gH3 or rH3 for 3’ half gsnoRNA encoding sequence or gsnoRNA oligonucleotide, respectively) , and lacks an H box. In some embodiments, the gsnoRNA comprising a single hairpin is between 60 and 70 nucleotides in length. In some embodiments, the gsnoRNA comprising a single hairpin is about 65 nucleotides in length.

[0182] In some embodiments, the gsnoRNA is prepared by in vitro transcription. In some embodiments, the gsnoRNA prepared by in vitro transcription comprises the sequence of any one of SEQ ID NOs: 4-6, 9-12, 15-19, 22-36. In some embodiments, the gsnoRNA prepared by in vitro transcription comprises a 5’ cap modification or a 5’ hairpin (e.g., of a U6+U27 expression cassette) . In some embodiments, the gsnoRNA prepared by in vitro transcription comprises a 5’ cap modification. In some embodiments, the 5’ cap modification is is a m7G modification (e.g., a cap 0, cap 1, or cap 2 modification) or an m6Am modification. Suitable methods for adding a 5’ cap to an RNA oligonucleotide have been described, for example, in U.S. Patent No. 10,494,399, the contents of which are herein incorporated by reference in their entirety. In some embodiments, the gsnoRNA further comprises a 3’ hairpin (e.g., the gsnoRNA comprises the sequence of any one of SEQ ID NOs: 4-6, 9-12, 15-19 and 22-36 and a 3’ hairpin) . In some embodiments, the gsnoRNA comprises a 5’ cap modification and does not comprise a 3’ hairpin. In some embodiments, the 5’ cap modification is introduced by in vitro transcription using an m7G (5') ppp (5') G cap analog.

[0183] Various chemistries and modification are known in the field of oligonucleotides that can be readily used in accordance with the disclosure. The regular internucleosidic linkages between the nucleotides may be altered by mono-or di-thioation of the phosphodiester bonds to yield phosphorothioate esters or phosphorodithioate esters, respectively. Other modifications of the internucleosidic linkages are possible, including amidation and peptide linkers. In a preferred aspect the gsnoRNAs of the present disclosure have one, two, three, four, five, six or more phosphorothioate linkages between the most terminal nucleotides of the gsnoRNA (hence, preferably at both the 5’ and 3’ end) , which means that in the case of three phosphorothioate linkages, the ultimate four nucleotides are linked accordingly. It will be understood by the skilled person that the number of such linkages may vary on each end, depending on the target sequence, or based on other aspects, such as toxicity. However, in some embodiments of the disclosure the gsnoRNA does comprise one or more PS linkages between any position at its terminal seven nucleotides.

[0184] The ribose sugar may be modified by substitution of the 2'-0 moiety with a lower alkyl (Cl -4, such as 2’-OMe) , alkenyl (C2-4) , alkynyl (C2-4) , methoxyethyl (2’-methoxyethoxy; or 2’-O-methoxyethyl; or 2’-MOE) , or other substituent. In some embodiments, substituents of the 2’ OH group are a methyl, methoxyethyl or 3, 3’-dimethylallyl group. The latter is known for its property to inhibit nuclease sensitivity due to its bulkiness, while improving efficiency of hybridization. Alternatively, locked nucleic acid sequences (LNAs) , comprising a 2'-4' intramolecular bridge (usually a methylene bridge between the 2' oxygen and 4' carbon) linkage inside the ribose ring, may be applied. Purine nucleobases and / or pyrimidine nucleobases may be modified to alter their properties, for example by amination or deamination of the heterocyclic rings. Other modifications that may be present in the gsnoRNAs of the present disclosure are 2’-F modified sugars, BNA and cEt. The exact chemistries and formats may depend from oligonucleotide construct to oligonucleotide construct and from application to application, and may be worked out in accordance with the wishes and preferences of those of skill in the art.

[0185] Examples of chemical modifications in a gsnoRNA include modifications of the sugar moiety, including by cross-linking substituents within the sugar (ribose) moiety (e.g. as in LNA or locked nucleic acids, BNA, cEt and the like) , by substitution of the 2 '-O atom with alkyl (e.g. 2’-O-methyl) , alkynyl (2’-O-alkynyl) , alkenyl (2’-O-alkenyl) , alkoxyalkyl (e.g. 2’-O-methoxyethyl, 2’-MOE) groups, having a length as specified above, and the like. In the context of the present disclosure, a sugar ‘modification’ also comprises 2’ deoxyribose (as in DNA) . In addition, the phosphodiester group of the backbone may be modified by thioation, dithioation, amidation and the like to yield phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoramidate, etc., internucleosidic linkages. The internucleosidic linkages may be replaced in full or in part by peptidic linkages to yield in peptidonucleic acid sequences and the like. Alternatively, or in addition, the nucleobases may be modified by (de) amination, to yield inosine or 2’ 6’-diaminopurines and the like. A further modification may be methylation of the C5 in the cytidine moiety of the nucleotide, to reduce potential immunogenic properties known to be associated with CpG sequences.

[0186] In some embodiments, the gsnoRNA does not comprise one or more chemically modified nucleosides and / or inter-nucleosidic linkages. In some embodiments, the gsnoRNA does not comprise any non-natural inter-nucleosidic linkages.

[0187] Mammalian H / ACA snoRNAs are generally embedded (positioned) within pre-mRNA intronic regions of protein-coding genes. During transcription elongation, several proteins with a functional role in pseudouridylation, such as NOP10, dyskerin (DKC1) or NHP2 bind to the nascent H / ACA snoRNA sequences. Following splicing, the guide RNAs are processed through debranching and exonucleolytic processing, resulting in a RNA-protein complex called ‘small nuclear ribonucleoproteins’ (snRNPs, or snRNP complex) . Box H / ACA snoRNAs have no preference for localization relative to the 5’ or 3’ ends of the intron and can be present in small or very large introns, as opposed to box C / D snoRNAs, which are usually localized 60-90 nucleotides upstream the 3’-splice site and are encoded in relatively small introns. It has been suggested by Kiss and Filipowicz (1995, Genes Dev 9 (11) : 141 1-1424) that a given snoRNA sequence could be excised and fully processed from an intronic region of any given actively spliced mRNA. To show the feasibility of this snoRNA processing independently from the host intron context, Kiss and Filipowicz artificially imbedded several snoRNAs (III 7a, U17b and U19) into the second intron of the human β-globin gene and expressed the resulting vector in fibroblast-like cells. After transfection, they found that the artificial, intronically delivered snoRNAs were properly processed from the human β-globin intron and the β-globin pre-mRNA was correctly spliced. Darzacq et al. (2002, EMBO J 21 (11) ; 2746-2756) corroborated that other guide RNAs could be inserted into the second intron of the human β-globin gene using an expression vector under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter and be delivered to mammalian cells via transfection.

[0188] In some aspects, provided herein are engineered gsnoRNA targeting disease-associated PTCs. In some embodiments, the engineered gsnoRNA targeting disease-associated PTCs comprise one or more mutations to enhance the editing efficiency and / or expression of the gsnoRNAs. In some embodiments, the engineered gsnoRNA targeting disease-associated PTCs are selected from SEQ ID NOs: 71-84. Sequences of exemplary engineered gsnoRNAs targeting disease-associated PTCs are shown in Table 4 below.

[0189] In some embodiments, the gsnoRNA may be administered in a free form (or ‘naked’ , without the context of a vector) , or being delivered to a cell by other means, such as liposomes, or nanoparticles, or by using iontophoresis. In some embodiments, the gsnoRNA can be administered in a ribonucleoprotein complex (e.g., in a complex comprising DKC1, HNP2, NOP10, and / or GAR1) . In some embodiments, the free gsnoRNA comprises one or more chemically modified nucleosides and / or inter-nucleosidic linkages as described above.

[0190] Exemplary engineered ACA scaffold sequences are shown in Table 2 below. The guide sequence is indicated as (Xn) and underlined, wherein Xn is a sequence of X nucleotides of length n, wherein X is any of A, U, G, or C and n is 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12. The guide sequence (Xn) can be modified to target the gsnoRNA to the desired target site, as will be understood by one of ordinary skill in the art. In some embodiments, n is an integer of a suitable length for the guide region. In some embodiments, n is 4, 5, 6, 7, 8, or 9.

[0191] Exemplary engineered gsnoRNA sequences, including exemplary guide sequences are shown in Table 3 below.

[0192] Exemplary engineered gsnoRNA sequences targeting exemplary disease-associated PTCs are shown in Table 4 below. Table 2. ACA scaffold sequences. Table 3. Exemplary gsnoRNA constructs (guide sequences are underlined) Table 4. Disease-associated PTC targeting gsnoRNA (guide sequences are underlined)

[0193] In some embodiments, the nucleotide sequence encoding the gsnoRNA is driven by a U6 or U1 promoter. C. Delivery to host cells

[0194] In some aspects, the methods provided herein comprise delivering (e.g., administering) a nctRNA and optionally a gsnoRNA and / or DKC1 protein, or a nucleic acid encoding the nctRNA or one or more nucleic acids encoding the nctRNA, gsnoRNA and / or DKC1 protein, to a host cell comprising the target RNA. The amount of nucleic acid encoding a nctRNA, gsnoRNA, and / or DKC1 protein to be administered, the dosage and the dosing regimen can vary from cell type to cell type, the disease to be treated, the target population, the mode of administration (e.g. systemic versus local) , the severity of disease and the acceptable level of side activity, but these can and should be assessed by trial and error during in vitro research, in pre-clinical and clinical trials. The trials are particularly straightforward when the modified sequence leads to an easily-detected phenotypic change.

[0195] In some embodiments, the method comprises delivering one or more nucleic acids (e.g., a nctRNA, a gsnoRNA or a nucleic acid encoding the nctRNA, gsnoRNA and / or DKC1 protein) and / or a pre-formed gsnoRNA protein complex (which may comprise the gsnoRNA, DKC1 protein, NOP10 protein, GAR1 protein, and / or NHP2 protein) to a cell (e.g., a mammalian or human cell) . Exemplary intracellular delivery methods, include, but are not limited to: viruses or virus-like agents; chemical-based transfection methods, such as those using calcium phosphate, dendrimers, liposomes, or cationic polymers (e.g., DEAE-dextran or polyethylenimine) ; non-chemical methods, such as microinjection, electroporation, cell squeezing, sonoporation, optical transfection, impalefection, protoplast fusion, bacterial conjugation, delivery of plasmids or transposons; particle-based methods, such as using a gene gun, magnectofection or magnet assisted transfection, particle bombardment; and hybrid methods, such as nucleofection. In some embodiments, the present application further provides cells produced by such methods, and organisms (e.g., non-human mammals) comprising or produced from such cells.

[0196] Methods of non-viral delivery of nucleic acids include lipofection, nucleofection, microinjection, biolistics, virosomes, liposomes, immunoliposomes, polycation or lipid: nucleic acid conjugates, naked DNA, artificial virions, and agent-enhanced uptake of DNA. Lipofection is described in e.g., U.S. Pat. Nos. 5,049,386, 4,946,787, and 4,897,355, and lipofection reagents are sold commercially (e.g., TRANSFECTAMINETMand  ) . In some embodiments,  2000 is used to transfect a nucleic acid encoding the nctRNA and optionally a gsnoRNA and / or DKC1 protein (e.g., one or more nucleic acid vectors encoding nctRNA, optionally wherein the one or more nucleic acid vectors also encode the gsnoRNA and / or the DKC1 protein) .

[0197] One suitable trial technique involves delivering the nucleic acid molecule according to the present disclosure to cell extracts, cell lines, or a test organism and then taking biopsy samples at various time points thereafter. The sequence of the target RNA can be assessed in the biopsy sample and the proportion of cells having the modification can easily be followed. After this trial has been performed once then the knowledge can be retained and future delivery can be performed without needing to take biopsy samples. A method of the present disclosure can thus include a step of identifying the presence of the desired change in the cell’s target RNA sequence, thereby verifying that the target RNA sequence has been modified. The change may be assessed on the level of the protein (length, glycosylation, function or the like) , or by some functional read-out, such as a (n) (inducible) current, when the protein encoded by the target RNA sequence is an ion channel, for example. In the case of CFTR function, an Ussing chamber assay or an NPD test in a mammal, including humans, are well known to a person skilled in the art to assess restoration or gain of function.

[0198] After pseudouridylation has occurred in a cell, the modified RNA can become diluted over time, for example due to cell division, limited half-life of the edited RNAs, etc. Thus, in practical therapeutic terms a method of the present disclosure may involve repeated delivery of an oligonucleotide until enough target RNAs have been modified to provide a tangible benefit to the patient and / or to maintain the benefits over time.

[0199] In some embodiments, nctRNA and / or gsnoRNAs can be delivered to cells in the form of a naked nucleic acid. One other way by which such constructs (anctRNA, a gsnoRNA and / or DKC1 protein, or one or more nucleic acids encoding the nctRNA, gsnoRNA and / or DKC1 protein) can be delivered to the cell (either in vitro, ex vivo or in vivo) is by using a delivery vehicle such as a viral vector.

[0200] Conventional viral based systems for nucleic acid delivery include retroviral, lenti virus, adenoviral, adeno-associated and herpes simplex virus vectors. Integration in the host genome is possible with the retrovirus, lentivirus, and adeno-associated virus methods, often resulting in long term expression of the inserted transgene. Additionally, high transduction efficiencies have been observed in many different cell types. The tropism of a retrovirus can be altered by incorporating foreign envelope proteins, expanding the potential target population of target cells. Lentiviral vectors are retroviral vectors that are able to transduce or infect non-dividing cells and typically produce high viral titers. Retroviral vectors are comprised of cis-acting long terminal repeats with packaging capacity for up to 6-10 kb of foreign sequence. The minimum cis-acting LTRs are sufficient for replication and packaging of the vectors, which are then used to integrate the nucleic acids into the target cell to provide permanent transgene expression. Widely used retroviral vectors include those based upon murine leukemia vims (MuLV) , gibbon ape leukemia virus (GaLV) , Simian Immuno deficiency vims (SIV) , human immuno deficiency vims (HIV) , and combinations thereof. In applications where transient expression is preferred, adenoviral based systems may be used. Adenoviral based vectors are capable of very high transduction efficiency in many cell types and do not require cell division. With such vectors, high titer and levels of expression have been obtained. This vector can be produced in large quantities in a relatively simple system.

[0201] Packaging cells are typically used to form virus particles that are capable of infecting a host cell. Such cells include 293T cells, which package adenovirus, and ψ2 cells or PA317 cells, which package retrovirus. Viral vectors are usually generated by producing a cell line that packages a nucleic acid vector into a viral particle. The vectors typically contain the minimal viral sequences required for packaging and subsequent integration into a host, other viral sequences being replaced by an expression cassette for the polynucleotide (s) to be expressed. The missing viral functions are typically supplied in trans by the packaging cell line. For example, AAV vectors used in gene therapy typically only possess ITR sequences from the AAV genome which are required for packaging and integration into the host genome. Viral DNA is packaged in a cell line, which contains a helper plasmid encoding the other AAV genes, namely rep and cap, but lacking ITR sequences. The cell line may also be infected with adenovirus as a helper. The helper virus promotes replication of the AAV vector and expression of AAV genes from the helper plasmid. The helper plasmid is not packaged in significant amounts due to a lack of ITR sequences. Contamination with adenovirus can be reduced by, e.g., heat treatment to which adenovirus is more sensitive than AAV.

[0202] In some embodiments, the viral vector is based on Adeno-Associated Virus (AAV) . In some embodiments, the viral vector is for instance a retroviral vector such as a lentivirus vector and the like. Also, plasmids, artificial chromosomes, and plasmids usable for targeted homologous recombination and integration in the human genome of cells may be suitably applied for delivery of a gsnoRNA as described herein. In some embodiments, when the gsnoRNA is delivered by a viral vector, it is in the form of an RNA transcript that comprises the sequence of an oligonucleotide according to the present disclosure in a part of the transcript. In some embodiments, an AAV vector according to the present disclosure is a recombinant AAV vector and refers to an AAV vector comprising part of an AAV genome comprising an exon-intron-exon sequence according to the present disclosure encapsidated in a protein shell of capsid protein derived from an AAV serotype. Part of an AAV genome may contain the inverted terminal repeats (ITR) derived from an adeno-associated virus serotype, such as AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 and others. In some embodiments, the AAV is AAV2. Protein shell comprised of capsid protein may be derived from an AAV serotype such as AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and others. A protein shell may also be named a capsid protein shell. AAV vector may have one or all wild type AAV genes deleted, but may still comprise functional ITR nucleic acid sequences. Functional ITR sequences are necessary for the replication, rescue and packaging of AAV virions. The ITR sequences may be wild type sequences or may have at least 80%, 85%, 90%, 95, or 100%sequence identity with wild type sequences or may be altered by for example in insertion, mutation, deletion or substitution of nucleotides, as long as they remain functional. In this context, functionality refers to the ability to direct packaging of the genome into the capsid shell and then allow for expression in the host cell to be infected or target cell. In the context of the present disclosure a capsid protein shell may be of a different serotype than the AAV vector genome ITR. An AAV vector according to the present disclosure may thus be composed of a capsid protein shell, i.e. the icosahedral capsid, which comprises capsid proteins (VP1, VP2, and / or VP3) of one AAV serotype, e.g. AAV serotype 2, whereas the ITRs sequences contained in that AAV2 vector may be any of the AAV serotypes described above, including an AAV2 vector. An “AAV2 vector” thus comprises a capsid protein shell of AAV serotype 2, while e.g. an “AAV5 vector” comprises a capsid protein shell of AAV serotype 5, whereby either may encapsidate any AAV vector genome ITR according to the present disclosure. In some embodiments, a recombinant AAV vector according to the present disclosure comprises a capsid protein shell of AAV serotype 2, 5, 8 or AAV serotype 9 wherein the AAV genome or ITRs present in said AAV vector are derived from AAV serotype 2, 5, 8 or AAV serotype 9; such AAV vector is referred to as an AAV2 / 2, AAV 2 / 5, AAV2 / 8, AAV2 / 9, AAV5 / 2, AAV5 / 5, AAV5 / 8, AAV 5 / 9, AAV8 / 2, AAV 8 / 5, AAV8 / 8, AAV8 / 9, AAV9 / 2, AAV9 / 5, AAV9 / 8, or an AAV9 / 9 vector.

[0203] In some embodiments, a recombinant AAV vector according to the present disclosure comprises a capsid protein shell of AAV serotype 2 and the AAV genome or ITRs present in said vector are derived from AAV serotype 5; such vector is referred to as an AAV 2 / 5 vector. In some embodiments, a recombinant AAV vector according to the present disclosure comprises a capsid protein shell of AAV serotype 2 and the AAV genome or ITRs present in said vector are derived from AAV serotype 8; such vector is referred to as an AAV 2 / 8 vector. In some embodiments, a recombinant AAV vector according to the present disclosure comprises a capsid protein shell of AAV serotype 2 and the AAV genome or ITRs present in said vector are derived from AAV serotype 9; such vector is referred to as an AAV 2 / 9 vector. In some embodiments, a recombinant AAV vector according to the present disclosure comprises a capsid protein shell of AAV serotype 2 and the AAV genome or ITRs present in said vector are derived from AAV serotype 2; such vector is referred to as an AAV 2 / 2 vector. In some embodiments, a nucleic acid molecule harboring an exon-intron-guide RNA-intron-exon sequence according to the present disclosure represented by a nucleic acid sequence of choice is inserted between the AAV genome or ITR sequences as identified above, for example an expression construct comprising an expression regulatory element operably linked to a coding sequence and a 3’ termination sequence. “AAV helper functions” generally refers to the corresponding AAV functions required for AAV replication and packaging supplied to the AAV vector in trans. AAV helper functions complement the AAV functions which are missing in the AAV vector, but they lack AAV ITRs (which are provided by the AAV vector genome) . AAV helper functions include the two major ORFs of AAV, namely the rep coding region and the cap coding region or functional substantially identical sequences thereof. Rep and Cap regions are well known in the art. The AAV helper functions can be supplied on an AAV helper construct, which may be a plasmid.

[0204] Introduction of the helper construct into the host cell can occur e.g. by transformation, transfection, or transduction prior to or concurrently with the introduction of the AAV genome present in the AAV vector as identified herein. The AAV helper constructs of the present disclosure may thus be chosen such that they produce the desired combination of serotypes for the AAV vector’s capsid protein shell on the one hand and for the AAV genome present in said AAV vector replication and packaging on the other hand. “AAV helper virus” provides additional functions required for AAV replication and packaging.

[0205] Suitable AAV helper viruses include adenoviruses, herpes simplex viruses (such as HSV types 1 and 2) and vaccinia viruses. The additional functions provided by the helper virus can also be introduced into the host cell via vectors, as described in US 6, 531, 456. In some embodiments, an AAV genome as present in a recombinant AAV vector according to the present disclosure does not comprise any nucleotide sequences encoding viral proteins, such as the rep (replication) or cap (capsid) genes of AAV. An AAV genome may further comprise a marker or reporter gene, such as a gene for example encoding an antibiotic resistance gene, a fluorescent protein (e.g. gfp ) or a gene encoding a chemically, enzymatically or otherwise detectable and / or selectable product (e.g. lacZ, aph, etc. ) known in the art. In some embodiments, an AAV vector according to the present disclosure is an AAV2 / 5, AAV2 / 8, AAV2 / 9 or AAV2 / 2 vector.

[0206] In some embodiments, a gsnoRNA and DKC1 are delivered to the cell as a ribonucleoprotein complex (e.g., a complex comprising the gsnoRNA, DKC1, NOP10, GAR1, and / or NHP2) . Methods for intracellular delivery of protein or protein complexes, such as pre-formed gsnoRNA-DKC1 / NOP10 / GAR1 / NHP2 complex, include, but are not limited to, mechanical methods, such as microinjection, electroporation and mechanical deformation of cells using a microfluidic device; carrier-based methods, such as cell-penetrating peptides (CPPs) , virus-like particles, supercharged proteins, nanocarriers, supramolecular carrier-based delivery systems, and nanoparticle-stabilized nanocapsules. See, for example, Fu et al. Bioconjugate Chem. 2014, 25, 1602-1608. Some mechanical methods, such as microinjection and electroporation, can be invasive, and low-throughput. In some embodiments, the ribonucleoprotein complex is delivered into the cell by inserting the complex through the cell membrane while passing cells through a microfluidic system, such as CELL  (see, for example, U.S. Patent Application Publication No. 20140287509) .

[0207] In some embodiments, the gsnoRNA and the nctRNA are delivered to the cell as RNA. In some embodiments, the nctRNA comprises one or more tRNA modifications. In some embodiments, the one or more tRNA modifications comprise one or more modifications of a mature tRNA. In some embodiments, the one or more tRNA modifications comprise one or more modifications selected from the group consisting of psiU, m1A, m1G, and m5C. In some embodiments, the modified tRNA significantly increases the readthroughefficiency of gsnoRNA compared to an unmodified tRNA of the same type. In some embodiments, the modified tRNA comprises a 5’ phosphorylation. In some embodiments, the modified tRNA comprises a 3’ CCA sequence. In some embodiments, the modified tRNA is a mature tRNA without introns. In some embodiments, the method does not comprise introducing a DKC1 or a nucleic acid sequence encoding a DKC1 into the host cell.

[0208] In some embodiments, modified gsnoRNA and tRNA oligos are delivered to a cell via lipofectamine (i.e.,  2000) . In some embodiments, a cell is the HEK293T cell. In some embodiments, the modified tRNA oligo is a modified tRNA-TCT-1. In some embodiments, the modified tRNA-TCT-1 comprises one or more known mutations selected from a group consisting of m5C 49; psiU 27, 28, 36, 39, 40, 54, 55; m1A 58; or m1G. In some embodiments, the modified tRNA-TCT-1 comprises the known mutations m5C 49; psiU 27, 28, 36, 39, 40, 54, 55; m1A 58; and m1G. In some embodiments, addition of the known mutations to the modified tRNA significantly increases the readthrough efficiency of gsnoRNA above that of the corresponding unmodified tRNA. In some embodiments, refolding the modified tRNA does not further improve the readthrough efficiency.

[0209] In some embodiments, RESTART v3 is delivered to a cell via AAV transduction. In some embodiments, a cell is a 16HBE cell comprising a CFTR-R553X mutation. In some embodiments, a cell is a MEF cell comprising a mIDUA-W392X mutation. In some embodiments, transduction with RESTART v3 results in the detection of at least about 50%psiU modification at the first U. In some embodiments, transduction with RESTART v3 results in the detection of at least about 70%psiU modification at the first U.

[0210] As described above, introduction of the nucleic acid molecule or molecules according to the present disclosure into the cell is performed by general methods known to the person skilled in the art. After pseudouridylation, the read-out of the effect (alteration of the target RNA sequence using the nctRNA) can be monitored through different ways in an optional identification step. Hence, the identification step of whether the desired pseudouridylation of the target uridine has indeed taken place and of the efficiency of Ψ-modified codon readthrough and / or decoding depends generally on the position of the target uridine in the target RNA sequence, and the effect that is incurred by the presence of the uridine (point mutation, PTC) . Hence, in some embodiments, depending on the ultimate effect of U to Ψconversion, the identification step comprises: assessing the presence of a functional, elongated, full length and / or wild type protein; assessing whether splicing of the pre-mRNA was altered by the pseudouridylation; or using a functional read-out, wherein the target RNA after the pseudouridylation encodes a functional, full length, elongated and / or wild type protein. The functional assessment for each of the diseases mentioned herein will generally be according to methods known to the skilled person.

[0211] The nucleic acid molecule, such as a gsnoRNA expression construct or vector according to the present disclosure is suitably administrated in aqueous solution, e.g. saline, or in suspension, optionally comprising additives, excipients and other ingredients, compatible with pharmaceutical use. Administration may be by inhalation (e.g. through nebulization) , intranasally, orally, by injection or infusion, intravenously, subcutaneously, intra-dermally, intra-cranially, intravitreally, intramuscularly, intra-tracheally, intra-peritoneally, intra-rectally, and the like. Administration may be in solid form, in the form of a powder, a pill, or in any other form compatible with pharmaceutical use in humans. The present disclosure is particularly suitable for treating genetic diseases, such as CF.

[0212] In some embodiments, the nctRNA of a codon comprising a target uridine residue and a gsnoRNA targeting the target uridine residue are delivered in a single delivery complex (e.g., a single lipid nanoparticle) . In some embodiments, the nctRNA of a codon comprising a target uridine residue and a gsnoRNA targeting the target uridine residue are delivered in separate delivery vehicles (e.g., separate LNPs, which can be administered simultaneously or sequentially, in either order) . In some embodiments, coding sequences for expression of the nctRNA of a codon comprising a target uridine residue and for a gsnoRNA targeting the target uridine residue are on the same vector. In some embodiments, coding sequences for expression of the nctRNA of a codon comprising a target uridine residue and for a gsnoRNA targeting the target uridine residue are on the separate vectors. In some embodiments, a coding sequence for a DKC1 protein (e.g., DKC1 isoform 3) is provided on the same vector as the coding sequence for the nctRNA. In some embodiments, a coding sequence for a DKC1 protein (e.g., DKC1 isoform 3) is provided on the same vector as the coding sequence for the gsnoRNA. In some embodiments, a coding sequence for a DKC1 protein (e.g., DKC1 isoform 3) is provided on the same vector as the coding sequence for the nctRNA and the coding sequence for the gsnoRNA. In some embodiments, a coding sequence for a DKC1 protein (e.g., DKC1 isoform 3) is provided on a separate vector, which can be delivered sequentially or simultaneously with any of the nctRNA, the gsnoRNA, and / or one or more vectors encoding the nctRNA and / or the gsnoRNA. In some embodiments, a DKC1 protein is delivered as a protein. In some embodiments, the method does not comprise delivering a DKC1 protein or a nucleic acid sequence encoding the DKC1.

[0213] In some embodiments the nucleic acid molecule, such as a nctRNA, gsnoRNA, and / or expression construct or vector for expression of an nctRNA, gsnoRNA, and / or DKC1 protein can be delivered systemically. In some embodiments, the nucleic acid molecule, such as a nctRNA, gsnoRNA, and / or expression construct or vector for expression of an nctRNA, gsnoRNA, and / or DKC1 protein can be delivered to cells or delivered locally to a tissue in which the target sequence’s phenotype is seen. For instance, mutations in CFTR cause CF which is primarily seen in lung epithelial tissue, so with a CFTR target sequence in some embodiments the deliver the nucleic acid construct specifically and directly to the lungs. This can be conveniently achieved by inhalation e.g. of a powder or aerosol, typically via the use of a nebuliser. In some embodiments, the nebulizer is a nebulizer that uses a so-called vibrating mesh, including the PARI eFlow (Rapid) or the i-neb from Respironics. It is to be expected that inhaled delivery of oligonucleotide constructs according to the present disclosure can also target these cells efficiently, which in the case of CFTR gene targeting could lead to amelioration of gastrointestinal symptoms also associated with CF. In some diseases the mucus layer shows an increased thickness, leading to a decreased absorption of medicines via the lung. One such a disease is chronical bronchitis, another example is CF. A variety of mucus normalizers are available, such as DNases, hypertonic saline or mannitol, which is commercially available under the name of Bronchitol. When mucus normalizers are used in combination with the presently disclosed system, they might increase the effectiveness of those medicines. Accordingly, administration of components of the presently disclosed system to a subject, such as a human subject, may be combined with mucus normalizers. In addition, administration of components of the presently disclosed system can be combined with administration of small molecule for treatment of CF, such as potentiator compounds for example Kalydeco (ivacaftor; VX-770) , or corrector compounds, for example VX-809 (lumacaftor) and / or VX-661. Alternatively, or in combination with the mucus normalizers, delivery in mucus penetrating particles or nanoparticles can be applied for efficient delivery of components of the presently disclosed system (e.g., nctRNA or nucleic acid molecule (s) encoding the nctRNA, and optionally gsnoRNA and / or DKC1 protein, or nucleic acid molecule (s) encoding the gsnoRNA and / or DKC1 protein) to epithelial cells of for example lung and intestine. In some embodiments, administration of components of the presently disclosed system (e.g., nctRNA or nucleic acid molecule (s) encoding the nctRNA, and optionally gsnoRNA and / or DKC1 protein, or nucleic acid molecule (s) encoding the gsnoRNA and / or DKC1 protein) to a subject, such as a human subject, is combined with antibiotic treatment to reduce bacterial infections and the symptoms of those such as mucus thickening and / or biofilm formation. The antibiotics can be administered systemically or locally or both. For application in CF patients the components of the presently disclosed system (e.g., nctRNA or nucleic acid molecule (s) encoding the nctRNA, and optionally gsnoRNA and / or DKC1 protein, or nucleic acid molecule (s) encoding the gsnoRNA and / or DKC1 protein) , or packaged or complexed components of the presently disclosed system may be combined with any mucus normalizer such as a DNase, mannitol, hypertonic saline and / or antibiotics and / or a small molecule for treatment of CF, such as potentiator compounds for example ivacaftor, or corrector compounds, for example lumacaftor and / or VX-661. To increase access to the target cells, Broncheo-Alveolar Favage (BAF) could be applied to clean the lungs before administration of the components of the presently disclosed system (e.g., nctRNA or nucleic acid molecule (s) encoding the nctRNA, and optionally gsnoRNA and / or DKC1 protein, or nucleic acid molecule (s) encoding the gsnoRNA and / or DKC1 protein) .

[0214] In some embodiments, the method comprises delivering the nctRNA of a Ψ-modified codon in a lipid nanoparticle (LNP) formulation. In some embodiments, the LNP is delivered intravenously. In some embodiments, the LNP is delivered intratracheally. In some embodiments, gsnoRNA for modifying a target uridine residue to pseudouridine to provide the Ψ-modified codon and nctRNA of the Ψ-modified codon are delivered simultaneously by intravenous and / or intratracheal LNP administration. Any small RNA delivery system can be used for delivery of nctRNA and / or gsnoRNA, such as conjugation to GalNAc3 to mediate liver-specific uptake.

[0215] In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG, the PTC is a UAA codon, and the method results in an average of at least about 10-fold, at least about 15-fold, or at least about 20-fold higher efficiency in PTC suppression than a control method performed without introducing the nctRNA or the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some embodiments, provided herein is a method for suppressing a UAA PTC in a target RNA in a host cell, comprising: modifying a target uridine residue in the PTC of the target RNA into a pseudouridine residue in the target RNA to provide a Ψ-modified PTC (ΨAA) , and introducing a tRNA-Q-TTG or a nucleic acid molecule encoding the tRNA-Q-TTG into the host cell, wherein the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine, thereby suppressing the PTC. In some embodiments, the nctRNA (tRNA-Q-TTG) is overexpressed in the host cell to at least about 1.5-fold, at least about 2-fold, at least about 3-fold, at least about 4-fold, at least about 5-fold, or at least about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to between about 2-fold and about 4-fold, between about 2-fold and about 6-fold, or between about 3-fold and about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell. In some embodiments, the method results in an average of at least about 10-fold, at least about 15-fold, or at least about 20-fold higher efficiency in PTC suppression than a control method performed without introducing the nctRNA or the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some embodiments, the nctRNA is a mature tRNA. In some embodiments, the nctRNA is a complete tRNA comprising an intron.

[0216] In some embodiments, the nctRNA is tRNA-R-TCT, and the tRNA-R-TCT is a complete tRNA comprising an intron. In some embodiments, the method comprises introducing the tRNA-R-TCT as a complete tRNA comprising an intron into the host cell. In some embodiments, the method comprises introducing a nucleic acid molecule encoding the complete the tRNA-R-TCT comprising the intron into the cell. III. Compositions and systems

[0217] In some aspects, provided herein is a nucleic acid vector comprising a nucleic acid sequence encoding a nctRNA of a PTC and a nucleic acid sequence encoding a gsnoRNA targeting the PTC. Non-limiting examples of PTCs and that can be Ψ-modified and corresponding nctRNAs are provided in Section II. A. Non-limiting examples of gsnoRNA scaffolds are provided in Section II. B. (ii) . In some embodiments, the nucleic acid vector further comprises a nucleic acid sequence encoding the DKC1 protein. Non-limiting examples of DKC1 proteins are provided in Section II. B. (i) .

[0218] In some embodiments, provided herein is a system comprising a nctRNA of a Ψ-modified codon such as a Ψ-modified PTC, and an engineered RNA-editing system to provide the Ψ-modified codon by modifying a target uridine residue in the codon to pseudouridine. In some embodiments, the engineered RNA-editing system comprises a gsnoRNA (such as any one of the gsnoRNAs described in Section II. B. (ii) ) comprising a guide sequence that hybridizes to a sequence comprising a target uridine residue in a target RNA in a host cell, or a nucleic acid molecule encoding the gsnoRNA. In some embodiments, the engineered RNA-editing system comprises a DKC1 protein (such as any one of the DKC1 proteins described in Section II. B. (ii) ) , or a nucleic acid molecule encoding the DKC1 protein, wherein the gsnoRNA is capable of recruiting the DKC1 protein to modify the target uridine residue into a pseudouridine residue in the target RNA. In some embodiments, the DKC1 protein is a DKC1 isoform with cytoplasmic localization.

[0219] In some embodiments, a system or kit herein comprises a nucleic acid molecule encoding the nctRNA of a Ψ-modified codon in a target RNA. In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the nctRNA comprises 1, 2, 3, 4, or more nucleic acid sequences encoding a nctRNA. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises 1, 2, 3, 4, or more nucleic acid sequences encoding the same nctRNA. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises 1, 2, 3, 4, or more copies of a nucleic acid sequence encoding the nctRNA. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises 4 copies of a nucleic acid sequence encoding the nctRNA. Each of the copies of the nucleic acid sequence can be operably linked to a promoter. In some embodiments, a system or kit herein comprises a nucleic acid molecule encoding a gsnoRNA targeting the codon in a target RNA that is modified to provide the Ψ-modified codon. In some embodiments, a system or kit herein further comprises a nucleic acid molecule encoding an agent that promotes expression of isoform 3 of a DKC1 protein (e.g., a splice-switching antisense oligonucleotide (ASO) , wherein the ASO enhances expression of a DKC1 protein that is an endogenous DKC1 isoform with cytoplasmic localization in the host cell) . In some embodiments, a system or kit herein comprises a sequence encoding a DKC1 isoform or DKC1 protein variant, wherein the isoform or variant has cytoplasmic localization.

[0220] In some aspects, provided herein is a host cell comprising any of the nctRNA, nucleic acid molecules for expressing nctRNA, gsnoRNAs, other nucleic acid constructs / molecules, or engineered RNA-editing systems described herein.

[0221] In some aspects, provided herein is a kit for suppressing a premature termination codon (PTC) in a target RNA, comprising any of the ntcRNAs, gsnoRNAs, nucleic acid constructs / molecules, or engineered RNA-editing systems described herein. A. Near Cognate tRNAS (nctRNAs) and nucleic acid molecules encoding the nctRNA

[0222] In some aspects, provided herein is an nctRNA or a nucleic acid molecule encoding an nctRNA. In some embodiments, the nctRNA or nucleic acid molecule encoding the nctRNA is for use in a method of suppressing a premature termination codon (PTC) in a target RNA in a host cell, comprising: modifying a target uridine residue in the PTC of the target RNA into a pseudouridine residue in the target RNA to provide a Ψ-modified PTC, and introducing the nctRNA of the Ψ-modified PTC or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the host cell, wherein the Ψ-modified PTC is decoded as an amino acid, thereby suppressing the PTC.

[0223] The near cognate tRNA of the Ψ-modified codon is a tRNA comprising an anticodon that does not match the Ψ-modified codon at a single position, creating an imperfect match with the Ψ-modified codon. For purposes of defining a “near cognate” tRNA of a Ψ-modified codon, Ψ-A is considered to be a match. Other codon / anticodon matches at a given position include C-G, G-C, U-A, and A-U, where the first base (before the dash) is the codon base and the second base is the anticodon base.

[0224] Examples of sequences of nctRNA are provided in Table 5 below. The annotation tRNA-X-Z to is used to refer to the tRNAs, where X is the single-letter amino acid abbreviation for the amino acid that binds to the tRNA (sometimes referred to as the amino acid that “charges” the tRNA) , and Z is the anticodon sequence. The anticodon of the nctRNA comprises a single mismatch with the Ψ-modified codon. Table 5: Sequences of nctRNA used

[0225] In some embodiments, the methods, systems, kits, or articles of manufacture provided herein comprise a near-cognate tRNA (nctRNA) of a Ψ-modified codon, or of a codon targeted by a gsnoRNA herein for pseudouridine modification. In some embodiments, the methods, systems, kits, or articles of manufacture provided provided herein comprise a near-cognate tRNA comprise a nucleic acid molecule encoding the nctRNA of the Ψ-modified codon, or of the codon targeted by a gsnoRNA herein for pseudouridine modification. In some embodiments, the introduction or expression of a near-cognate tRNA in the cell promotes the translational readthrough of pseudouridylated PTCs. The Examples herein provide data demonstrating in cultured cells, introduction of a nucleic acid molecule encoding a nctRNA of Ψ-modified PTCs showed an average of ～5-fold higher readthrough efficiency compared to the most effective pseudouridylation-based RNA editors currently available.

[0226] In some embodiments, the PTC is a UGA codon, and the Ψ-modified PTC is decoded as arginine or tryptophan. In certain embodiments, the nctRNA is tRNA-R-TCT and / or tRNA-W-CCA. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-R-TCT-1. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-R-TCT comprising the sequence of any one of SEQ ID NOs: 193-198. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-R-TCT comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity of any one of SEQ ID NOs: 193-198. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-W-CCA comprising the sequence of any one of SEQ ID NOs: 213-217. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-W-CCA comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 213-217. In some embodiments, provided herein is a nucleic acid molecule encoding tRNA-R-TCT and / or tRNA-W-CCA for use in a method of reading through a ΨGA codon. In some embodiments, provided herein is a nucleic acid molecule encoding tRNA-R-TCT-1 for use in a method of reading through a ΨAG codon. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises 1, 2, 3, 4, or more nucleic acid sequences encoding a nctRNA. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises 1, 2, 3, 4, or more nucleic acid sequences encoding the same nctRNA. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises 1, 2, 3, 4, or more copies of a nucleic acid sequence encoding the nctRNA. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises 4 copies of a nucleic acid sequence encoding the nctRNA. Each of the copies of the nucleic acid sequence can be operably linked to a promoter.

[0227] In some embodiments, the PTC is a UAG codon, and the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine, leucine, or tyrosine. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-CTG, tRNA-L-CAA, tRNA-Y-ATA and / or tRNA-Y-GTA. In some embodiments, provided herein is a nucleic acid molecule encoding tRNA-Q-CTG, tRNA-L-CAA, tRNA-Y-ATA and / or tRNA-Y-GTA for use in a method of reading through a ΨAG codon. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-CTG. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Q-CTG comprising the sequence of any one of SEQ ID NOs: 224-227. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Q-CTG comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 224-227. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-CTG. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-L-CAA. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-L-CAA comprising the sequence of any one of SEQ ID NOs: 243-249. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-L-CAA comprising a sequence of at least about 95%(e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 243-249. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises 1, 2, 3, 4, or more nucleic acid sequences encoding a nctRNA. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises 1, 2, 3, 4, or more nucleic acid sequences encoding the same tRNA. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises 1, 2, 3, 4, or more copies of a nucleic acid sequence encoding the nctRNA.

[0228] In some embodiments, the PTC is a UAA codon, and the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine or tyrosine. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG, tRNA-Y-ATA and / or tRNA-Y-GTA. In some embodiments, provided herein is a nucleic acid molecule encoding tRNA-Q-TTG, tRNA-Y-ATA and / or tRNA-Y-GTA for use in a method of reading through a ΨAA codon. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG-1. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Q-TTG comprising a sequence of any one of SEQ ID NOs: 263-265. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Q-TTG comprising a sequence of at least about 95%(e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 263-265. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Y-ATA comprising the sequence SEQ ID NO: 250. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Y-ATA comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to SEQ ID NO: 250. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Y-GTA comprising the sequence of any one of SEQ ID NO: 251-262. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-Y-GTA comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 251-262. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises 1, 2, 3, 4, or more nucleic acid sequences encoding a nctRNA. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises 1, 2, 3, 4, or more nucleic acid sequences encoding the same tRNA. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises 1, 2, 3, 4, or more copies of a nucleic acid sequence encoding the nctRNA. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises 4 copies of a nucleic acid sequence encoding the nctRNA. Each of the copies of the nucleic acid sequence can be operably linked to a promoter.

[0229] In some embodiments, the nctRNA is tRNA-Q-TTG, the PTC is a UAA codon, and the method results in an average of at least about 10-fold, at least about 15-fold, or at least about 20-fold higher efficiency in PTC suppression than a control method performed without introducing the nctRNA or the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some embodiments, provided herein is a method for suppressing a UAA PTC in a target RNA in a host cell, comprising: modifying a target uridine residue in the PTC of the target RNA into a pseudouridine residue in the target RNA to provide a Ψ-modified PTC (ΨAA) , and introducing a tRNA-Q-TTG or a nucleic acid molecule encoding the tRNA-Q-TTG into the host cell, wherein the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine, thereby suppressing the PTC. In some embodiments, the nctRNA (tRNA-Q-TTG) is overexpressed in the host cell to at least about 1.5-fold, at least about 2-fold, at least about 3-fold, at least about 4-fold, at least about 5-fold, or at least about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell. In some embodiments, the nctRNA is overexpressed in the host cell to between about 2-fold and about 4-fold, between about 2-fold and about 6-fold, or between about 3-fold and about 6-fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell. In some embodiments, the method results in an average of at least about 10-fold, at least about 15-fold, or at least about 20-fold higher efficiency in PTC suppression than a control method performed without introducing the nctRNA or the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell. In some embodiments, the nctRNA is a mature tRNA. In some embodiments, the nctRNA is a complete tRNA comprising an intron. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-R-TCT, and the tRNA-R-TCT is a complete tRNA comprising an intron.

[0230] In some embodiments, provided herein is a method of enhancing readthrough of a ΨGA codon in a host cell, comprising introducing a nctRNA of the ΨGA codon or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the cell, wherein the nctRNA comprises a sequence matching any one of SEQ ID NOs: 193-276. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-R-TCG. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-R-TCG comprising the sequence of any one of SEQ ID NOs: 199-204. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-R-TCG comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 199-204. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-G-TCC. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-G-TCC comprising the sequence of any one of SEQ ID NOs: 205-208. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-G-TCC TCG comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 205-208. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-S-TGA. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-S-TGA comprising a sequence of any one of SEQ ID NOs: 209-212. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-S-TGA TCG comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 209-212. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-C-GCA. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-C-GCA comprising a sequence of any one of SEQ ID NOs: 218-223. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-C-GCA comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 218-223. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-K-CTT. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-K-CTT comprising a sequence of any one of SEQ ID NO: 228-237. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-K-CTT comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 228-237. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-E-CTC. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-E-CTC comprising a sequence of any one of SEQ ID NOs: 238-239. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-E-CTC comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 238-239. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-S-CGA. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-S-CGA comprising a sequence of any one of SEQ ID NOs: 240-242. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-S-CGA comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 240-242. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-L-CAA. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-L-CAA comprising a sequence of any one of SEQ ID NOs: 243-249. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-L-CAA comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NO: 243-249. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-K-TTT. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-K-TTT comprising a sequence of any one of SEQ ID NO: 266-272. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-K-TTT comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 266-272. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-E-TTC. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-E-TTC comprising a sequence of any one of SEQ ID NOs: 273-276. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-E-TTC comprising a sequence of at least about 95% (e.g., at least about 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99%or more) identity to any one of SEQ ID NOs: 273-276.

[0231] In some embodiments, the PTC is a UGA codon, and the Ψ-modified PTC is decoded as arginine or tryptophan. In certain embodiments, the nctRNA is tRNA-R-TCT and / or tRNA-W-CCA. In some embodiments, the nctRNA is tRNA-R-TCT-1. In some embodiments, the nctRNA is a modified tRNA-R-TCT-1 comprising one or more modifications selected from a group of modifications comprising m5C 49; psiU 27, 28, 36, 39, 40, 54, 55; m1A 58; m1G 9. In some embodiments, the nctRNA is a tRNA-R-TCT-1 comprising the known modifications m5C 49; psiU 27, 28, 36, 39, 40, 54, 55; m1A 58; m1G 9. In some embodiments, the modified tRNA-R-TCT-1 demonstrates increased readthrough efficiency of gsnoRNAs compared to an unmodified tRNA-R-TCT-1 under the same conditions, as shown in FIG. 7. In some embodiments, the modified tRNA-R-TCT-1 does not show a further increase in readthrough efficiency when refolded. In some embodiments, provided herein is a nucleic acid molecule encoding a modified tRNA-R-TCT-1 for use in a method of reading through a ΨAG codon.

[0232] In any of the embodiments herein, the sequence encoding the nctRNA can be operably linked to a promoter for expression of the nctRNA. Any suitable promoter can be used (e.g., a promoter optimized for expression in eukaryotic cells) . In some embodiments, the promoter is a constitutive promoter. In some embodiments, the promoter is a U6 promoter. In some embodiments, the promoter is a U1 promoter. In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the nctRNA comprises at least 4 sequences encoding an nctRNA, and each of the 4 sequences is under the control of a U6 promoter. In some embodiments, the 4 sequences encoding nctRNA are 4 copies of the same sequence encoding the same nctRNA. In other embodiments, the 4 sequences can be different. promoter. B. Nucleic Acid Molecules and Vectors

[0233] In some aspects, provided herein is a nucleic acid molecule encoding a nctRNA of a Ψ-modified codon for use in a method of enhancing readthrough of the Ψ-modified codon. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises 1, 2, 3, 4, or more copies of an expression cassette for the nctRNA. In some cases, the nucleic acid molecule comprises at least 3 or at least 4 copies of a nucleic acid sequence encoding the nctRNA. Each nucleic acid sequence encoding the nctRNA is operably linked to a promoter for expression in the host cell. In some embodiments, the promoter is a U6 promoter (e.g., an hU6 promoter or an mU6 promoter) .

[0234] In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the nctRNA is provided in combination with a nucleic acid molecule encoding a DKC1 protein (e.g., DKC1 isoform 3) . In some embodiments of the methods described herein, the method comprises introducing a nucleic acid molecule encoding the DKC1 protein into the host cell. In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the nctRNA further comprises a sequence encoding a DKC1 protein (e.g., DKC1 isoform 3) . In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises a promoter operably linked to a nucleotide sequence encoding the DKC1. In some embodiments, the promoter is a Pol II promoter. In some embodiments, the promoter is a CMV promoter. In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the nctRNA further comprises a sequence encoding a gsnoRNA operably linked to a promoter.

[0235] In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the nctRNA is provided in combination with a nucleic acid molecule encoding a gsnoRNA targeting a uridine residu in a codon of a target in the host cell for pseudouridylation to provide the Ψ-modified codon. In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the nctRNA further comprises a sequence encoding the gsnoRNA. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises a promoter operably linked to a nucleotide sequence encoding the gsnoRNA. In some embodiments, the promoter operably linked to the gsnoRNA is a U6 promoter (e.g., a hU6 promoter or a mU6 promoter) . In some embodiments, the nucleic acid molecule encoding the nctRNA further comprises a sequence encoding a DKC1 protein (e.g., DKC1 isoform 3) operably linked to a promoter.

[0236] As disclosed herein, vectors may carry DNA or RNA, and are generally used to express the nctRNA, gsnoRNA, and / or DKC1 protein constructs of the present disclosure after the vector is processed in the cell in which it is introduced. Such is generally through transcription of the DNA or RNA present in the vector. In some embodiments, vectors are viral vectors (that may be used to infect target cells to be treated) , or plasmids, that may be introduced into the cell in a variety of ways, known to the person skilled in the art.

[0237] In some embodiments, the nucleic acid molecule (s) encoding the nctRNA, DKC1 protein, and / or the gsnoRNA is / are present in a viral vector. In some embodiments, the method comprises introducing into the host cell a vector (e.g., a plasmid or viral vector) comprising a first nucleic acid sequence encoding the nctRNA, a second nucleic acid sequence encoding the DKC1 protein, and a third nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA. In some embodiments, the vector is an adeno-associated viral (AAV) vector. IV. Pharmaceutical compositions, kits, and articles of manufacture

[0238] In some aspects, provided herein is an RNA-editing system comprising: (a) a gsnoRNA comprising a guide sequence that hybridizes to a sequence comprising a target uridine residue in premature termination codon (PTC) in a target RNA in a host cell, or a nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA; and (b) a nucleic acid encoding a near-cognate transfer RNA of the PTC. In some embodiments, the RNA-editing system further comprises a DKC1 protein, or a nucleic acid sequence encoding the DKC1 protein, wherein the gsnoRNA is capable of recruiting the DKC1 protein to modify the target uridine residue into a pseudouridine residue in the target RNA.

[0239] In some aspects, provided herein is a pharmaceutical composition comprising any of the nctRNAs, gsnoRNAs, nucleic acid constructs / molecules, vectors, or engineered RNA-editing systems described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0240] Pharmaceutical compositions can be prepared by mixing the therapeutic agents described herein having the desired degree of purity with optional pharmaceutically acceptable carriers, excipients or stabilizers (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) ) , in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions. Acceptable carriers, excipients, or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include buffers, antioxidants including ascorbic acid, methionine, Vitamin E, sodium metabisulfite; preservatives, isotonicifiers (e.g. sodium chloride) , stabilizers, metal complexes (e.g. Zn-protein complexes) ; chelating agents such as EDTA and / or non-ionic surfactants.

[0241] In some embodiments, the pharmaceutical composition is contained in a single-use vial, such as a single-use sealed vial. In some embodiments, the pharmaceutical composition is contained in a multi-use vial. In some embodiments, the pharmaceutical composition is contained in bulk in a container. In some embodiments, the pharmaceutical composition is cryopreserved.

[0242] In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises a nctRNA of a Ψ-modified codon, such as a Ψ-modified PTC. In other embodiments, the pharmaceutical composition comprises a nucleic acid construct (e.g., a vector such as a plasmid or viral vector) encoding the nctRNA. In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises a gsnoRNA. In other embodiments, the pharmaceutical composition comprises a nucleic acid construct (e.g., a vector such as a plasmid or viral vector) encoding the gsnoRNA. In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises free gsnoRNAs ( ‘naked’ gsnoRNAs) , or gsnoRNAs conjugated to other components, such as ligands for targeting, for uptake and / or for intracellular trafficking. gsnoRNAs may be used in aqueous solutions (generally pharmaceutically acceptable carriers and / or solvents) , or formulated using transfection agents, liposomes or nanoparticulate forms (e.g. SNALPs, LNPs and the like) . Such formulations may comprise functional ligands to enhance bioavailability and the like.

[0243] The present application further provides kits and articles of manufacture for use in any embodiment of the treatment methods described herein. The kits and articles of manufacture may comprise any one of the formulations and pharmaceutical compositions described herein.

[0244] In some aspects, provided herein is a kit for recoding a sense codon or reading through a PTC in a host cell, comprising any of the nctRNA, gsnoRNA, and / or nucleic acid molecules described in Section II. In some embodiments, the kit further comprises an agent for enhancing expression of an endogenous DKC1 isoform 3 in the host cell. In some embodiments, the kit comprises a splice-switching antisense oligonucleotide (ASO) , wherein the ASO enhances expression of a DKC1 protein that is an endogenous DKC1 isoform with cytoplasmic localization in the host cell. In some embodiments, the kit further comprises a DKC1 protein or nucleic acid encoding a DKC1 protein. In some embodiments, the DKC1 protein is a DKC1 isoform (e.g., isoform 3) with cytoplasmic localization. In some embodiments, the DKC1 protein is part of a ribonucleoprotein (RNP) complex that associates with the gsnoRNA. In some embodiments, the DKC1 protein comprises a deletion of a nuclear localization signal (NLS) relative to a wildtype DKC1 protein of the same species. In some embodiments, the DKC1 protein is a truncated DKC1 variant or a DKC1 variant comprising a deletion, such as any of the truncation or deletion variants described in Section II B above. In some embodiments, the kit further includes instructions for editing the target RNA according to any of the methods described herein. In some embodiments, the kit further comprises instructions for recoding the sense codon, reading through the PTC, suppressing nonsense-mediated decay, and / or improving translation of a target RNA comprising a pseudouridine-modified (Ψ-modified) codon according to any of the methods provided herein. In some embodiments, the kit further comprises instructions for treating a disease or condition associated with a PTC in a target RNA in a subject, comprising suppressing the PTC in a host cell of the subject using any of the methods disclosed herein.

[0245] In some aspects, provided herein is a kit for improving translation of a target RNA comprising a pseudouridine-modified (Ψ-modified) codon in a host cell, comprising an RNA-editing system, wherein the RNA editing system comprises: (a) a gsnoRNA comprising a guide sequence that hybridizes to a sequence comprising a target uridine residue in a target RNA in a host cell, or a nucleic acid molecule encoding the gsnoRNA, wherein the gsnoRNA is capable of recruiting a DKC1 protein to modify the target uridine residue into a pseudouridine residue in the target RNA to provide a Ψ-modified codon, and b) a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified codon or a nucleic acid encoding the nctRNA. In some embodiments, the DKC1 protein is a DKC1 isoform with cytoplasmic localization. In some embodiments, the DKC1 protein is a DKC1 isoform (e.g., isoform 3) with cytoplasmic localization. In some embodiments, the DKC1 protein is part of a ribonucleoprotein (RNP) complex that associates with the gsnoRNA. In some embodiments, the DKC1 protein comprises a deletion of a nuclear localization signal (NLS) relative to a wildtype DKC1 protein of the same species. In some embodiments, the DKC1 protein is a truncated DKC1 variant or a DKC1 variant comprising a deletion, such as any of the truncation or deletion variants described in Section II B above. In some embodiments, the kit further includes instructions for decoding the Ψ-modified codon and improving translation of the target RNA according to any of the methods described herein.

[0246] The kits of the present disclosure are in suitable packaging. Suitable packaging includes, but is not limited to, vials, bottles, jars, flexible packaging (e.g., sealed Mylar or plastic bags) , and the like. Kits may optionally provide additional components such as buffers and interpretative information. The present application thus also provides articles of manufacture, which include vials (such as sealed vials) , bottles, jars, flexible packaging, and the like.

[0247] The instructions relating to the use of the compositions generally include information as to dosage, dosing schedule, and route of administration for the intended treatment. The containers may be unit doses, bulk packages (e.g., multi-dose packages) or sub-unit doses. For example, kits may be provided that contain sufficient dosages of the nctRNA, gsnoRNA, and / or DKC1 protein, or nucleic acid molecule (s) encoding the nctRNA, gsnoRNA and / or DKC1 protein as disclosed herein to provide effective treatment of an individual or of many individuals. Additionally, kits may be provided that contain sufficient dosages of the nctRNA, gsnoRNA, and / or DKC1 protein, or nucleic acid molecule (s) encoding the nctRNA, gsnoRNA and / or DKC1 protein to allow for multiple administrations to an individual. Kits may also include multiple unit doses of the pharmaceutical compositions and instructions for use and packaged in quantities sufficient for storage and use in pharmacies, for example, hospital pharmacies and compounding pharmacies.

[0248] In some embodiments, the kit comprises a delivery system. The delivery system may be a unit dose delivery system. Delivery systems for these various dosage forms can be syringes, dropper bottles, plastic squeeze units, atomizers, nebulizers or pharmaceutical aerosols in either unit dose or multiple dose packages. In some embodiments, there is provided a delivery system of any one of the nctRNA, gsnoRNA, and / or DKC1 protein, or nucleic acid molecule (s) encoding the nctRNA, gsnoRNA, and / or DKC1 protein described herein, comprising the nctRNA, gsnoRNA and / or DKC1 protein, or nucleic acid molecule (s) encoding the nctRNA, gsnoRNA, and / or DKC1 protein and a device for delivering the nctRNA, gsnoRNA and / or DKC1 protein, or nucleic acid molecule (s) encoding the nctRNA, gsnoRNA and / or DKC1 protein.

[0249] All of the features disclosed in this specification may be combined in any combination. Each feature disclosed in this specification may be replaced by an alternative feature serving the same, equivalent, or similar purpose. Thus, unless expressly stated otherwise, each feature disclosed is only an example of a generic series of equivalent or similar features. EXAMPLES

[0250] The present disclosure will be more fully understood by reference to the following examples. They should not, however, be construed as limiting the scope of the present disclosure. It is understood that the examples and embodiments described herein are for illustrative purposes only and that various modifications or changes in light thereof will be suggested to persons skilled in the art and are to be included within the spirit and purview of this application and scope of the appended claims. Example 1. Exploiting near-cognate tRNAs for readthrough of premature  termination codon

[0251] This example demonstrates the ability of near-cognate tRNAs to increase the efficiency of Ψ-modified PTC readthrough by the RESTART system.

[0252] To identify which near-cognate tRNAs were responsible for Ψ-modified PTC readthrough, HEK293T cells were transfected with FLAG-tagged Reporter-3 (containing either a TAA, TAG, or TGA PTC) along with 4x tRNA plasmid and DKC1-isoform3 construct as part of the RESTART system. The effects of PTC-read-through on amino acid composition of the FLAG-tagged protein were quantified by immunoprecipitation and subsequent mass spectrometry analysis. Based on these experiments, each Ψ-modified PTC was recognized by a specific set of near-cognate tRNAs. FIG. 1A provides a schematic showing the amino acid incorporated in preferentially incorporated into Ψ-modified PTC sites. Amino acids inserted at different PTC sites are represented by hexagon, rhombus and triangle, respectively. Ψ-modified UGA sites were decoded as arginine (～95%) and tryptophan (～5%) . The near-cognate tRNAs incorporate amino acids into Ψ-modified PTC sites, but not into unmodified PTC sites. As shown in FIG. 1B, for example natural tRNA-R-TCT can recognize a ΨGA site, while it cannot recognize the unmodified UGA site.

[0253] To assess the effects of increased near-cognate tRNA abundance on the efficiency of Ψ-modified PTC readthrough, a cDNA-EGFP reporter system was designed, which contains an ALDOB gene with a W148X PTC site. Such a reporter allows measurement of efficiency of PTC readthrough by monitoring the expression level of relative EGFP positive cell percentage and intensity. Because Ψ-modified UGA was translated into arginine and tryptophan in the mass spectrometry data, tRNA-R-TCT and tRNA-W-CCA were chosen as near-cognate tRNAs.

[0254] In these experiments, the RESTART V1 system used introduction of a nucleic acid construct encoding a gsnoRNA into the host cell, as shown in FIG. 1C. RESTART V2 used introduction of a nucleic acid construct encoding a gsnoRNA and a DKC1 protein (DKC1 isoform 3) into the host cell, as shown in FIG. 1D. Overexpression of near-cognate tRNAs in combination with RESTART v1 showed increased PTC readthrough with all near-cognate tRNAs (FIG. 1C) . Overexpression of near-cognate tRNAs in combination with RESTART v2 also showed increased PTC readthrough with all near-cognate tRNAS (FIGS. 1D, 1E) . Example 2: Optimization of near-cognate tRNAsimproves the efficiency of PTC- readthrough

[0255] To identify optimal near-cognate tRNAs, all the iso-decoders were screened for the possible near-cognate tRNAs for each PTC (FIG. 2A) . Using the EGFP reporter system, the screen identified multiple near-cognate tRNAs that improved PTC-readthrough over RESTART v2 (FIGS. 2B, 2C, 2D) . Furthermore, including an intron in tRNA-R-TCT resulted in higher PTC-readthrough (FIG 2E) . Multiple constructs containing 1x, 2x, or 4x of the optimal near-cognate tRNA were designed. The 4x construct exhibited the best PTC-readthrough (FIG. 2F) . The combination of the best-performing tRNA with RESTART v2 led to the development of RESTART v3. RESTART v3 demonstrated higher selectivity of arginine incorporation at UGA and glutamine incorporation at UGA / UAA compared to RESTART v2.

[0256] To investigate the increased readthrough efficiency of RESTART v3 over RESTART v2, the PRAISE bioinformatics pipeline was used to quantify the levels of PTC modification under RESTART v1, v2 and v3. RESTART v1 displayed reduced PTC modification, while the editing efficiency of RESTART v2 was comparable to that of RESTART v3 (FIG. 3A) . However, RESTART v3 displayed significantly higher readthrough efficiency over RESTART v2, suggesting that RESTART v3 more efficiently recognizes Ψ-modified PTCs (FIG 3B) .

[0257] Next, LC-MS / MS analysis was performed to investigate whether overexpressing near-cognate tRNAs impacts the amino acid incorporation at the Ψ-modified PTC sites. Based on these experiments, the amino acids incorporated were highly specific, which matched well with the tRNAs that were overexpressed. For instance, we RESTART v3-edited UGAs were specifically readthrough by arginine when tRNA-R-TCT was overexpressed (99.45%arginine incorporation) . Similarly, UAGs and UAAs were accurately decoded as glutamine when we overexpressed tRNA-Q-CTG and tRNA-Q-TTG, respectively (98.77%and 90.58%glutamine incorporation, respectively) . The results indicated that RESTART v3 enabled higher precision of arginine incorporation at UGA compared to RESTART v2, while it also significantly increased the proportion of glutamine incorporation at UAG / UAA compared to RESTART v2. Thus, RESTART v3 can enable precise translation of UGA to arginine, and UAG / UAA to glutamine. Together, these results demonstrate that RESTART v3 can achieve accurate correction of PTC sites.

[0258] According to the Human Gene Mutation Database (HGMD; hgmd. org) , among sense-to-nonsense mutations, 56%of UGAs are caused by arginine mutations, while 45%and 27%of UAGs and UAAs are caused by glutamine mutations. Based on the characteristic of RESTART v3 to incorporate amino acids at PTC sites, the analysis provided in these Examples shows that RESTART v3 has the potential to accurately repair a wide range of nonsense mutation sites, effectively restoring the original amino acid at the sites. Overall, these experiments show that RESTART v3 can precisely repair nearly half of the natural nonsense mutations (estimated 45%) , highlighting its potential to treat diseases that require precise correction. Example 3: Specificity of RESTART v3

[0259] Omics-based methods were used to ask if use of RESTART v3 induced any global off-target effects. Using tRNA-seq, it was found that when tRNAs were sorted by anticodons, only the overexpressed tRNA showed a significant increase in abundance, while the rest of the tRNAs exhibited no significant change (FIG. 4A) . Additionally, only the overexpressed tRNA exhibited a significant increase without affecting its other iso-decoders (FIG. 4B) . Transcriptome-wide Ψ sequencing revealed 335 off-target sites on mRNA in cells treated with RESTART v3, which were abundant in CDS regions and absent in normal termination codons. In this experiment, 282 off-target Ψ sites were identified in CDS regions of mRNA, 48 off-target Ψ sites were identified in 3’ UTR regions of mRNA, only 2 off-target Ψ sites were identified in 5’ UTR regions of mRNA, and only 3 off-target Ψ sites were identified start codons of mRNA. The off-target sites largely resembled the on-target sequence, suggesting a gsnoRNA-dependent mechanism (FIG. 4C) . However, RESTART v3 does not alter the mRNA sense codons. Lastly, RNA-sequencing and proteomics analysis also revealed no significant changes in RNA or protein expression as a result of tRNA overexpression, suggesting that RESTART v3 is safe to utilize for readthrough of PTCs (FIGS. 4D, 4E) . Example 4. RESTART v3 restores gene function in multiple disease contexts

[0260] This example demonstrates that RESTART V3 can restore functions for genes with endogenous PTC sites that are relevant to diseases, and that RESTART V3 can accurately modify pseudouridine sites in 16HBE (CFTR-R553X) and MEF (mIDUA-W392X) cells.Cystic Fibrosis

[0261] We first focused on cystic fibrosis (CF) , a progressive, genetic disease caused by defects in the CFTR gene that affects the lungs, pancreas, and other organs. Nonsense mutations account for about 10%of mutations in cystic fibrosis (CF) patients; hence, we used a human bronchial epithelial (16HBE14o-) cell line with the nonsense mutation R553X as a disease cell model. We also employed 16HBE14o-cells with G551D mutation as a positive control, which is the most prevalent CFTR gating mutation but can be partially rescued by the CFTR potentiator VX-770, producing ～50%of the total CFTR activity. A rescue of 10%-35%of CFTR channel function is considered therapeutically relevant. To assess whether RESTART could rescue CFTR function, we used a whole-cell patch-clamp assay. Our results showed that expression of RESTART v3 rescued CFTR-R553X function to approximately 60%-80%of the VX-770-treated CFTR-G551D level, which is equivalent to 30%-40%of wild-type CFTR function.

[0262] RESTART v3 efficacy at restoring CFTR function was compared with G418, which is a known small molecule to induce translational readthrough. We found that G418-treated 16HBEge-R553X cells showed negligible improvement in CFTR function (FIG. 5A) . We also observed NMD inhibition by RESTART v3 in 16HBE14o-R553X cells (FIG. 5B) . NMD suppression by RESTART v3 is stronger than RESTART v2, which may result from its higher readthrough efficiency. Thus, the results demonstrated that RESTART v3 mediated efficient PTC editing of endogenous mRNA and led to the rescue of protein function.Hurler Syndrome

[0263] Hurler syndrome is the most severe subtype of mucopolysaccharidosis type I, a rare genetic disorder that results in a deficiency of the metabolic enzyme α-L-iduronidase (IDUA) . The enzyme is responsible for the metabolism of glycosaminoglycans (GAGs) in lysosomes, and its deficiency causes progressive damage and dysfunction of multiple bodily systems. To further evaluate the therapeutic potential of RESTART v3 system, we employed the primary mouse embryonic fibroblasts (MEF) derived from a mouse model of Hurler syndrome. This model harbors a homozygous mIDUA-W392X mutation (TGG to TAG) , which is analogous to the W402X mutation found in human patients with Hurler syndrome. Ten days after introducing RESTART v3 system by AAVDJ, we collected the mIDUA-W392X MEF and measured the function by evaluating the IDUA catalytic activity and GAG accumulation. We found that RESTART v3 significantly restored the IDUA activity (to approximately 10%of wild-type cells) (FIG. 5C) , surpassing the 0.5%threshold associated with attenuated disease manifestation. Additionally, the accumulation of GAGs was significantly decreased (FIG. 5D) , indicating the effective functional rescue in mIDUA-W392X primary cells under the action of RESTART v3 system. Moreover, the NMD reduction in response to the RESTART v3 system suggests its potential role in inhibiting NMD and promoting functional rescue in cells with nonsense mutations (FIG. 5E) . Together, these findings highlight the potential of the RESTART v3 system for achieving functional readthrough in clinically relevant genetic diseases.

[0264] The PTC site modification rate achieved by RESTART v3 in cells carrying the CFTR-R553X and mIDUA-W392X mutations was also measured, using the pseudouridinylated 18S rRNA as a control. The Ψ modification rate of 18S (Ψ1367, a Ψ site in 18S rRNA) was utilized to evaluate the accuracy of the quantitative Ψ detection approach. In 16HBE cells carrying CFTR-R553X, AAV transduction with RESTART v3 resulted in the detection of approximately 70%psiU modification at the first U in R553X, as shown in FIG. 6. In MEF cells carrying mIDUA-W392X, AAV transduction with RESTART v3 led to the detection of approximately 50%psiU modification at the first U in W392X, as shown in FIG. 6. Data are represented as the mean ± SD. Example 5: A modified nctRNA shows increased readthrough efficiency.

[0265] The readthrough efficiency of the reporter when delivering the plasmid construct and RNA oligos of gnsoRNA + nctRNA was measured in HEK293T cells. The tRNA oligo required 5’ phosphorylation, 3’ CCA sequence addition, and was a mature tRNA without introns. Under the same gsnoRNA oligo conditions, the unmodified tRNA-R-TCT-1 oligo did not improve the readthroughefficiency, as shown in FIG. 7. Adding known modifications (m5C 49; psiU 27, 28, 36, 39, 40, 54, 55; m1A 58, m1G 9) to the tRNA-R-TCT-1 oligo significantly increased the readthrough efficiency of gsnoRNA, surpassing the efficiency of the plasmid construct. However, refolding the modified tRNA-R-TCT-1 did not further improve the readthrough efficiency of the modified tRNA. Together, these findings show that delivering modified gsnoRNA + nctRNA oligoseffectively achieves readthrough of the PTC in the reporter, with higher readthrough efficiency compared to plasmid transfection. Data are represented as the mean ± SD.

Claims

1.A method for suppressing a premature termination codon (PTC) in a target RNA in a host cell, comprising:modifying a target uridine residue in the PTC of the target RNA into a pseudouridine residue in the target RNA to provide a Ψ-modified PTC, andintroducing a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified PTC or a nucleic acid molecule encoding the nctRNA into the host cell,wherein the Ψ-modified PTC is decoded as an amino acid, thereby suppressing the PTC.2.The method of claim 1, wherein modifying the target uridine residue comprises introducing an engineered guide small nucleolar RNA (gsnoRNA) or a nucleic acid for expression of the gsnoRNA into the host cell, wherein the gsnoRNA comprises a guide sequence that hybridizes to a sequence comprising the target uridine residue in the target RNA, and wherein the gsnoRNA recruits a DKC1 protein to modify the target uridine residue into the pseudouridine residue in the target RNA.3.The method of claim 2, wherein the DKC1 protein is overexpressed in the host cell.4.The method of any of claims 1-3, wherein the PTC resulted from a mutation in a sense codon, and wherein the method results in accurate incorporation of the original amino acid encoded by the sense codon for at least 30%, at least 40%, or at least 50%of PTCs.5.The method of any of claims 1-4, wherein the method does not alter amino acid sequences and / or expression levels of proteins produced from non-target RNA.6.The method of any of claims 1-5, wherein the method does not alter the expression level of transcripts produced from non-target RNA.7.The method of any of claims 1-6, wherein the method results in an average of at least about 2-fold, at least about 3-fold, or at least about 5-fold higher efficiency in PTC suppression than a control method performed without introducing the nctRNA or the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell.8.The method of any of claims 1-7, wherein the PTC is a UGA codon, and wherein the Ψ-modified PTC is decoded as arginine or tryptophan.9.The method of claim 8, wherein the Ψ-modified PTC is decoded as arginine at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, or at least 95%of the time.10.The method of any of claims 1-6, wherein the nctRNA comprises the sequence of any one of SEQ ID NOs: 193-276.11.The method of claim 8 or 9, wherein the nctRNA is tRNA-R-TCT and / or tRNA-W-CCA.12.The method of any of claims 8-11, wherein the nctRNA is tRNA-R-TCT comprising the sequence of any one of  SEQ ID NOs: 193-198 and / or tRNA-W-CCA comprising the sequence of any one of SEQ ID Nos: 213-217.13.The method of claim 11 or 12, wherein the nctRNA is tRNA-R-TCT-1.14.The method of any of claims 11-13, wherein the nctRNA is tRNA-R-TCT-1 comprising the sequence of SEQ ID Nos: 193.15.The method of any of claims 1-7, wherein the PTC is a UAG codon, and wherein the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine, leucine, or tyrosine.16.The method of claim 15, wherein the nctRNA is tRNA-Q-CTG, tRNA-L-CAA, tRNA-Y-ATA and / or tRNA-Y-GTA.17.The method of claim 16, wherein the nctRNA is tRNA-Q-CTG.18.The method of claim 16 or 17, wherein the nctRNA is tRNA-Q-CTG comprising the sequence of SEQ ID Nos: 224-227.19.The method of claim 16, wherein the nctRNA is tRNA-L-CAA.20.The method of claim 16 or 19, wherein the nctRNA is tRNA-L-CAA comprising the sequence of SEQ ID Nos: 243-249.21.The method of any of claims 1-7, wherein the PTC is a UAA codon, and wherein the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine or tyrosine.22.The method of claim 21, wherein the nctRNA is tRNA-Q-TTG, tRNA-Y-ATA and / or tRNA-Y-GTA.23.The method of claim 21 or 22, wherein the nctRNA is tRNA-Q-TTG, tRNA-Y-ATA and / or tRNA-Y-GTA comprising the sequence of any one of  SEQ ID Nos: 250-265.24.The method of claim 22 or 23, wherein the nctRNA is tRNA-Q-TTG.25.The method of any one of claims 22-24, wherein the nctRNA is tRNA-Q-TTG comprising the sequence of SEQ ID NOs: 263-265.26.The method of claim 24, wherein the nctRNA is tRNA-Q-TTG-1.27.The method of any one of claims 24-26, wherein the nctRNA is tRNA-Q-TTG-1 comprising the sequence of SEQ ID NO: 263.28.The method of any of claims 1-27, wherein the method results in an average of at least about 10-fold, at least about 15-fold, or at least about 20-fold higher efficiency in PTC suppression than a control method performed without introducing the nctRNA or the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell.29.The method of any of claims 2-28, further comprising introducing a nucleic acid sequence encoding the DKC1 protein into the host cell.30.The method of claim 29, wherein the nucleic acid sequence encoding the DKC1 protein is under control of a CMV promoter.31.The method of any of claims 2-29, wherein the DKC1 protein is an endogenous DKC1 protein of the host cell.32.The method of any of claims 2-31, wherein the DKC1 protein is localized to the cytoplasm in the host cell.33.The method of any of claims 2-32, wherein the DKC1 protein comprises a DKC1 protein fragment corresponding to amino acid residues 41 to 420 of a human DKC1 isoform 3 protein, wherein the amino acid numbering is according to SEQ ID NO: 2.34.The method of any of claims 2-33, wherein the DKC1 protein comprises an amino acid sequence having at least 85%identity to SEQ ID NO: 88.35.The method of any one of claims 2-34, wherein the DKC1 protein comprises a naturally occurring DKC1 isoform with cytoplasmic localization in the host cell.36.The method any of claims 2-32, wherein the DKC1 isoform corresponds to isoform 3 of human DKC1 protein.37.The method of any one of claims 2-36, wherein the DKC1 protein comprises an amino acid sequence having at least 85%identity to SEQ ID NO: 2.38.The method of any of claims 2-37, wherein the gsnoRNA comprises a scaffold sequence derived from a wildtype H / ACA-snoRNA selected from the group consisting of ACA19, ACA2b, ACA36, ACA44, ACA27, E2, ACA3, and ACA17.39.The method of any one of claims 2-38, wherein the method comprises introducing a nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA into the host cell.40.The method of any of claims 1-39, wherein the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell, and wherein the nucleic acid molecule comprises 1, 2, 3, 4, or more copies of a nucleic acid sequence encoding the nctRNA.41.The method of claim 40, wherein the nucleic acid molecule encoding the nctRNA comprises a nucleic acid molecule comprising 4 copies of a nucleic acid sequence encoding the nctRNA.42.The method of any of claims 1-41, wherein the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell, and wherein the nctRNA is overexpressed in the host cell to at least about 2-6 fold of the endogenous level of expression for a corresponding native tRNA in the host cell.43.The method of any of claims 1-42, wherein the method does not affect the overall abundance of endogenous tRNAs in the host cell.44.The method of any of claims 1-14 and 29-43, wherein the PTC is a UGA codon, and wherein the nctRNA is tRNA-R-TCT, optionally wherein the Ψ-modified PTC is decoded as arginine.45.The method of any of claims 1-14 and 29-44, wherein the PTC is a UGA codon, and wherein the nctRNA is tRNA-R-TCT comprising the sequence of any one of  SEQ ID NO: 193-198, optionally wherein the Ψ-modified PTC is decoded as arginine.46.The method of any of claims 1-14 and 29-43, wherein the nctRNA is tRNA-R-TCT, wherein the tRNA-R-TCT is a complete tRNA comprising an intron.47.The method of any one of claims 1-14, 29-43, and 46, wherein the nctRNA is tRNA-R-TCT comprising the sequence of any one of SEQ ID NO: 193-198, wherein the tRNA-R-TCT is a complete tRNA comprising an intron.48.The method of any of claims 1-7, 15-18, and 21-43, wherein the PTC resulted from a sense-to-nonsense mutation of a glutamine sense codon, and wherein the nctRNA is tRNA-Q-CTG or tRNA-Q-TTG, optionally wherein the Ψ-modified PTC is decoded as glutamine.49.The method of any of claims 1-7, 15-18, 21-43, and 48, wherein the PTC resulted from a sense-to-nonsense mutation of a glutamine sense codon, and wherein the nctRNA is tRNA-Q-CTG or tRNA-Q-TTG comprising the sequence of any one of SEQ ID NO: 224-227 or 263-265.50.The method of any of claims 1-49, wherein the nctRNA is a mature tRNA.51.The method of any of claims 1-50, wherein the nctRNA is a complete tRNA comprising an intron.52.The method of any of claims 1-51 wherein the method does not result in off-target pseudo-uridylation of normal termination codons.53.The method of any of claims 39-52 wherein the nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA is under a promoter selected from the group consisting of U6 promoter and U1 promoter.54.The method of any of claims 1-53, wherein expression of the nctRNA is under control of one or more U6 promoters.55.The method of any of claims 2-54, wherein the method comprises introducing the nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell, and wherein the nucleic acid encoding the nctRNA is present in a vector that further comprises the nucleic acid sequence encoding the DKC1 protein, and / or the nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA.56.The method of any of claims 2-54, wherein the method comprises introducing into the host cell a vector comprising a first nucleic acid sequence encoding a DKC1 protein and a second nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA.57.The method of claim 55 or 56, wherein the vector is a viral vector.58.The method of claim any of claims 55-57, wherein the vector is an adeno-associated viral (AAV) vector, optionally wherein the AAV is AAV-DJ or AAV2.59.The method of claim 58, wherein the AAV is AAV2.60.The method of any of claims 1-56, wherein the nctRNA, the nucleic acid encoding the nctRNA, and / or the vector is / are in a lipid nanoparticle, optionally wherein the nanoparticle is conjugated to GalNAc3.61.The method of any one of claims 1-60, wherein efficiency of decoding the PTC as an amino acid is at least 40%.62.The method of any of claims 1-61, wherein the PTC is associated with a genetic disease or condition.63.The method of any one of claims 1-62, wherein the host cell is an archaeal or eukaryotic cell.64.The method of claim 63, wherein the host cell is a mammalian cell.65.The method of claim 64, wherein the host cell is a human cell.66.The method of any one of claims 1-65, wherein the method is carried out in vivo.67.The method of any one of claims 1-66, wherein the method is carried out ex vivo.68.The method of any of claims 1-67, wherein the PTC resulted from a nonsense mutation in a CFTR gene.69.The method of any of claims 1-67, wherein the PTC resulted from a nonsense mutation in an IDUA gene.70.A method of treating a disease or condition associated with a PTC in a target RNA in a subject, comprising suppressing the PTC in a host cell of the subject using the method of any one of claims 1-69, thereby treating the disease or condition in the subject.71.The method of claim 70, wherein the disease or condition is selected from the group consisting of Cystic fibrosis, Hurler Syndrome, alpha-1-antitrypsin (A1AT) deficiency, Parkinson’s disease, Alzheimer's disease, albinism, Amyotrophic lateral sclerosis, Asthma, 8-thalassemia, Cadasil syndrome, Charcot-Marie-Tooth disease, Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) , Distal Spinal Muscular Atrophy (DSMA) , Duchenne / Becker muscular dystrophy, Dystrophic Epidermolysis bullosa, Epidermolysis bullosa, Fabry disease, Factor V Leiden associated disorders, Familial Adenomatous Polyposis, Galactosemia, Gaucher's Disease, Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Haemophilia, Hereditary Hemochromatosis, Hunter Syndrome, Huntington's disease, Inflammatory Bowel Disease (IBD) , Inherited polyagglutination syndrome, Leber congenital amaurosis, Lesch-Nyhan syndrome, Lynch syndrome, Marfan syndrome, Mucopolysaccharidosis, Muscular Dystrophy, Myotonic dystrophy types I and II, neurofibromatosis, Niemann-Pick disease type A, B and C, NY-esol related cancer, Peutz-Jeghers Syndrome, Phenylketonuria, Pompe’s disease, Primary Ciliary Disease, Prothrombin mutation related disorders, such as the Prothrombin G20210A mutation, Pulmonary Hypertension, (autosomal dominant) Retinitis Pigmentosa, Sandhoff Disease, Severe Combined Immune Deficiency Syndrome (SCID) , Sickle Cell Anemia, Spinal Muscular Atrophy, Stargardt’s Disease, Tay-Sachs Disease, Usher syndrome, X-linked immunodeficiency, Sturge-Weber Syndrome, and cancer.72.The method of claim 71, wherein the disease or condition is cystic fibrosis, optionally wherein the PTC resulted from a nonsense mutation R553X in a CFTR gene of the subject.73.The method of claim 68 or claim 72, wherein the method results in a rescue of at least 10%of wild-type CFTR channel function in the host cell, optionally wherein the method results in a rescue of at least 30%of wild-type CFTR channel function in the host cell.74.The method of claim 71, wherein the disease or condition is Hurler syndrome, optionally wherein (i) the subject is a mouse and the PTC resulted from a nonsense mutation W392X in an IDUA gene of the subject or (ii) the subject is a human and the PTC resulted from a nonsense mutation W402X in an IDUA gene of the subject.75.The method of claim 69 or claim 74, wherein the method restores at least 0.5%of wild-type IDUA activity in the host cell, optionally wherein the method restores at least about 10%of wild-type IDUA activity in the host cell.76.The method of any of claims 69 and 74-75, wherein the method results in a significant decrease in accumulation of glycosaminoglycans (GAGs) in the subject.77.The method of any of claims 1-76, wherein nonsense-mediated decay of the target RNA in the host cell is reduced by the method.78.An RNA-editing system comprising:(a) a gsnoRNA comprising a guide sequence that hybridizes to a sequence comprising a target uridine residue in premature termination codon (PTC) in a target RNA in a host cell, or a nucleic acid sequence encoding the gsnoRNA; and(b) a a near-cognate transfer RNA of the PTC or a nucleic acid encoding a near-cognate transfer RNA of the PTC.79.The RNA-editing system of claim 78, further comprising a DKC1 protein, or a nucleic acid sequence encoding the DKC1 protein, wherein the gsnoRNA is capable of recruiting the DKC1 protein to modify the target uridine residue into a pseudouridine residue in the target RNA.80.A pharmaceutical composition comprising the RNA-editing system of claim 78 or claim 79, and a pharmaceutically acceptable carrier.81.A host cell comprising the RNA-editing system of claim 78 or claim 79.82.A kit for editing a target RNA in a host cell, comprising the engineered RNA-editing system of claim 78 or claim 79.83.A method for improving translation of a target RNA in a host cell comprising a pseudouridine-modified (Ψ-modified) codon, wherein the method comprises:introducing a near-cognate transfer RNA (nctRNA) of the Ψ-modified codon or a nucleic acid encoding the nctRNA into the host cell; andwherein the Ψ-modified codon is decoded as an amino acid, thereby improving translation of the target RNA.84.The method of claim 1, wherein the Ψ-modified codon is a Ψ-modified premature stop codon.85.The method of any one of claims 1-54, 56-77, and 84, wherein the method comprises introducing the nctRNA of the Ψ-modified PTC, and wherein the nctRNA comprises one or more tRNA modifications.86.The method of claim 85, wherein the one or more tRNA modifications comprise one or more modifications of a mature tRNA.87.The method of claim 85 or 86, wherein the one or more tRNA modifications comprise one or more modifications selected from the group consisting of psiU, m1A, m1G, and m5C.88.The method of any one of claims 1-11, 13, 28-54, 56-77, and 84-87, wherein the nctRNA comprises a tRNA-R-TCT-1 comprising one or more modifications selected from the group consisting of m5C 49; psiU 27, 28, 36, 39, 40, 54, 55; m1A 58; and m1G 9.89.The method of any one of claims 1-11, 13, 28-54, 56-77, and 84-88, wherein the nctRNA comprises a tRNA-R-TCT-1 comprising the modifications m5C 49; psiU 27, 28, 36, 39, 40, 54, 55; m1A 58; and m1G 9.90.The method of any one of claims 85-89, wherein the modified tRNA significantly increases the readthrough efficiency of gsnoRNA compared to an unmodified tRNA of the same type.91.The method of any one of claims 1-2 and 85-90, wherein the host cell expresses an endogenous level of DKC1.92.The method of any one of claims 1-91, wherein the modified tRNA comprises a 5’ phosphorylation.93.The method of any one of claims 1-92, wherein the modified tRNA comprises a 3’ CCA sequence addition.94.The method of any one of claims 1-93, wherein the modified tRNA is a mature tRNA without introns.

Images