Selective degradation of multimeric proteins via chemically induced proximity to trim21

Abstract

A method for degrading a target protein in a cell via theTRIM21 E3 Ligase ubiquitin proteasomepathway comprises contacting the target protein with an effective amount of a compound selected from the compound of Formula (I), the compound of Formula (II), or a molecular glue compound or a PROTAC bearing the compound of Formula (I) or (II) as the ligand for recruiting TRIM21 ligase.

Description

Selective degradation of multimeric proteins via chemically induced proximity to TRIM21Field of the invention

[0001] Disclosed herein is a method for degrading a target protein in a cell via the TRIM21 E3 Ligase ubiquitin proteasome pathway, comprising contacting the target protein with an effective amount of a compound selected from the compound of Formula (I) , the compound of Formula (II) , or a molecular glue compound or a PROTAC bearing the compound of Formula (I) or (II) as the ligand for recruiting TRIM21 ligase.Background of the invention

[0002] Targeted protein degradation (TPD) via chemically induced proximity between specific E3 ubiquitin ligases and neo-substrate proteins is an emerging therapeutic modality for tackling proteins deemed undruggable with traditional small molecule inhibitors. Two categories of chemicals have been leveraged for TPD, including monovalent molecular glue degraders and bifunctional PROTACs (proteolysis targeting chimeras) . Molecular glues refer to compounds that can bring two proteins together by promoting their interactions. PROTAC molecules consist of two binding units -one that binds to the target protein and another that binds to an E3 ubiquitin ligase. This brings the target protein and the E3 ligase into close proximity, leading to ubiquitination of the target protein and subsequent degradation by the proteasome.

[0003] The impact of TPD is highlighted by IMiDs (immunomodulatory imide drugs) , which function as molecular glues to induce the degradation of multiple neo-substrates, such as the zinc-finger transcription factors Ikaros and Aiolos, to exert exceptional efficacy in treating multiple myeloma. Recently, a plethora of rationally designed PROTACs targeting disease-causing proteins have entered clinical trials and provided proof-of-concept for the efficacy and safety of TPD in human patients.

[0004] First-generation TPD agents utilize E3 ligases with general expression patterns and constitutive activity, and are thus unsuitable for disease-relevant proteins with indispensable functions in healthy tissues. To overcome such limitations, several strategies are actively being explored to install selectivity to TPD. First, by tinkering with chemical structures and ternary complex stability, TPD agents can gain selectivity in distinguishing highly similar targets. Second, the subcellular localization of E3 ubiquitin ligases can be harnessed to restrict TPD to specific subcellular compartments. Third, E3 ubiquitin ligases with tissue-specific expression can be exploited to limit TPD to specific tissues and cell types. In addition to their constitutively active counterparts, many E3 ligases are autoinhibited in the basal state and activated upon binding to specific substrates. Such a mechanism enhances the specificity of these E3 ligases towards their cognate substrates, but has so far not been exploited to improve TPD selectivity.

[0005] One area where selective TPD is an attractive technology is the therapeutic targeting of biomolecular condensates, which are membraneless assemblies enriching specific proteins and nucleic acids in subcellular environments. An explosion of recent studies unveils key functions of biomolecular condensates in normal and diseased states. In particular, aberrant protein condensation has been causally linked to neurodegeneration and cancer, thus revealing exciting therapeutic opportunities. However, selective degradation of proteins in biomolecular condensates without affecting those in the dilute phase has proven to be technically challenging.

[0006] Current TPD strategies mainly exploit E3 ligase complexes containing cereblon (CRBN) or von Hippel-Lindau (VHL) , despite the presence of over 600 E3 ligases in human cells. Thus, chemicals that employ additional E3 ligases with differentiated properties are highly sought after to avoid limitations and expand the application of TPD. TRIM21 is an E3 ubiquitin-protein ligase, which belongs to the RING-containing tripartite motif (TRIM) protein family. TRIM21 is a major autoantigen in autoimmune diseases and a modulator of innate immune signaling. TRIM21 uses antibodies as bridging molecules to direct invading pathogens for proteasomal degradation as a mechanism of intracellular immunity. This capability of TRIM21 was recently exploited as the Trim-Away technology to enable acute and rapid degradation of endogenous cellular proteins. Despite its enormous utility, Trim-Away requires electroporation or microinjection to deliver antibodies to cells, which is not feasible in most therapeutic settings. The TRIM21-directed degraders illustrated here provide chemical starting points to extend TRIM-Away to therapeutic applications. TRIM21 forms inactive dimers in which a central antiparallel coiled coil positions the two RING domains at the two ends of the dimer. Upon binding to multimeric substrates, RING domains from neighboring TRIM21 dimerize, leading to the activation of its enzymatic activity.

[0007] Aberrant protein assemblies cause several diseases. However, those aberrant protein assemblies are found to be undruggable targets. In the context of cancer, fusion transcription factors are commonly associated with chromosomal translocations, which are genetic abnormalities that can drive the development of certain types of cancer. A few of these fusions form aberrant multimers, such as EWS-FLI1 in Ewing sarcoma, NUP98-fusions in various hematological malignancies, including acute myeloid leukemia (AML) and acute lymphoblastic leukemia (ALL) , as well as in some cases of myelodysplastic syndromes (MDS) and chronic myeloid leukemia (CML) . Intracellular amyloid-like proteins aggregate, such as Tau, alpha-Synuclein, and mutant Huntingtin, are common etiology of neurodegeneration. Moreover, protein multimerization (such as cGAS and NLRP3) activates immune response, which may be the underlying cause of autoimmune disease.

[0008] Therefore, there is a need for degraders based on the E3 ligase TRIM21 for the selective degradation of multimeric proteins that cause the above-mentioned diseases.Summary of the invention

[0009] The inventors of the instant invention unexpectedly and surprisingly discovered that (S) -hydroxyl-acepromazine, a metabolite of the medication acepromazine commonly used in veterinary medicine as a sedative / tranquilizer, can be used as a monovalent degrader of several proteins in the multimeric nuclear pore complex via the E3 ubiquitin ligase TRIM21, indicating TRIM21-mediated TPD can serve as a general strategy to develop TRIM21-based degraders so as to induce selective degradation of multimeric proteins, including those in biomolecular condensates.

[0010] The inventors have found two classes of TRIM21-directed degraders with a high degree of selectivity towards multimeric neo-substrates. The first class, represented by the compound of formula (I) or (II) , comprising the serendipitously discovered (S) -ACE-OH, functions as a monovalent molecule glue to guide TRIM21 to recognize NUP98, resulting in the degradation of multiple proteins in the multimeric nuclear pore complex. The second class, i.e., bifunctional PROTACs comprising the compound of formula (I) as the ligand for recruiting an E3 ubiquitin ligase, TRIM21, degrades multimeric protein targets localized to various biomolecular condensates without affecting monomeric proteins in the dilute phase. These two classes show the potential of TRIM21-directed degraders to differentially modulate proteins in multimeric assemblies such as biomolecular condensates.

[0011] In the first aspect, disclosed herein is a compound of Formula (I) , or a pharmaceutically acceptable salt thereof, an isomer thereof, or a deuterated analog thereof,

[0012] wherein

[0013] X is O, S or NR1, wherein R1 is hydrogen or alkyl;

[0014] n is 1 to 12;

[0015] Ra and Rb are each independently hydrogen or alkyl;

[0016] Rc and Rd are each independently hydrogen, alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, or heteroaryl, each of said alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, or heteroaryl is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, heteroaryl, cyano, hydroxy, hydroxy, alkoxy, -NRm1C (O) NRn1Rp1, -NRm1C (O) Rn1, -C (O) NRm1Rn1, -NRm1Rn1, -C (O) Rm1, or -C (O) ORm1;

[0017] or Rc and Rd, together with the nitrogen atom to which they are attached, form a 3 to 12-membered ring comprising 0 to 3 additional heteroatoms selected from oxygen, nitrogen, or sulfur, and said ring is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, heteroaryl, cyano, hydroxy, hydroxyalkyl, alkoxy, hydroxyalkoxy, -NRm2Rn2, -C (O) Rm2, -C (O) ORm2, -NRm2C (O) NRn2Rp2, -NRm2C (O) Rn2, or -C (O) NRm2Rn2;

[0018] Re is hydrogen, alkyl, -NRm2Rn2, -NRm2C (O) NRn2Rp2, -NRm2C (O) Rn2, cycloalkyl, aryl, heterocyclyl, or heteroaryl, each of said alkyl, cycloalkyl, aryl, or heterocyclyl, or heteroaryl is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, heteroaryl, cyano, hydroxy, hydroxyalkyl, alkoxy, hydroxyalkoxy, -NRm3C (O) NRn3Rp3, -NRm3C (O) Rn3, -C (O) NRm3Rn3, -NRm3Rn3, -C (O) Rm3, or -C (O) ORm3,

[0019] p is 0 to 3;

[0020] q is 0 to 4;

[0021] Rf and Rg are each independently halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heterocyclyl, heteroaryl, cyano, hydroxy, alkoxy, -NRm2C (O) NRn2Rp2, -NRm2C (O) Rn2, -C (O) NRm2Rn2, -NRm2Rn2, -C (O) Rm2, or -C (O) ORm2;

[0022] wherein

[0023] Rm1, Rn1, Rp1, Rm2, Rn2, Rp2, Rm3, Rn3, and Rp3 are each independently hydrogen, alkyl, haloalkyl, alkoxyalkyl-, phenyl, cycloalkyl, heteroaryl, or heterocyclyl.

[0024] In the second aspect, disclosed herein is a compound of Formula (II) , or a pharmaceutically acceptable salt thereof, an isomer thereof, or a deuterated analog thereof,

[0025] wherein

[0026] X is O, S or NR1, wherein R1 is hydrogen or alkyl;

[0027] n is 1 to 12;

[0028] Ra and Rb are each independently hydrogen or alkyl;

[0029] Rc and Rd are each independently hydrogen, alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, or heteroaryl, each of said alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, or heteroaryl is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, heteroaryl, cyano, hydroxy, hydroxy, alkoxy, -NRm1C (O) NRn1Rp1, -NRm1C (O) Rn1, -C (O) NRm1Rn1, -NRm1Rn1, -C (O) Rm1, or -C (O) ORm1;

[0030] or Rc and Rd, together with the nitrogen atom to which they are attached, form a 3 to 12-membered ring comprising 0 to 3 additional heteroatoms selected from oxygen, nitrogen, or sulfur, and said ring is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, heteroaryl, cyano, hydroxy, hydroxyalkyl, alkoxy, hydroxyalkoxy, -NRm2Rn2, -C (O) Rm2, -C (O) ORm2, -NRm2C (O) NRn2Rp2, -NRm2C (O) Rn2, or -C (O) NRm2Rn2;

[0031] Re1 and Re2 are each independently hydrogen, alkyl, -NRm2Rn2, -NRm2C (O) NRn2Rp2, -NRm2C (O) Rn2, cycloalkyl, aryl, heterocyclyl, or heteroaryl, each of said alkyl, cycloalkyl, aryl, or heterocyclyl is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, heteroaryl, cyano, hydroxy, hydroxyalkyl, alkoxy, hydroxyalkoxy, -NRm3C (O) NRn3Rp3, -NRm3C (O) Rn3, -C (O) NRm3Rn3, -NRm3Rn3, -C (O) Rm3, or -C (O) ORm3;

[0032] p is 0 to 3;

[0033] q is 0 to 4;

[0034] Rf and Rg are each independently halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heterocyclyl, heteroaryl, cyano, alkoxy, -NRm2C (O) NRn2Rp2, -NRm2C (O) Rn2, -C (O) NRm2Rn2, -NRm2Rn2, -C (O) Rm2, -C (O) ORm2, cycloalkyl, phenyl, heteroaryl or heterocyclyl;

[0035] wherein

[0036] Rm1, Rn1, Rp1, Rm2, Rn2, Rp2, Rm3, Rn3, and Rp3 are each independently hydrogen, alkyl, haloalkyl, alkoxyalkyl-, phenyl, cycloalkyl, heteroaryl, or heterocyclyl.

[0037] In some embodiments of the first and second aspects, X is S.

[0038] In some embodiments of the first and second aspects, n is 1 to 6, or 2 to 4, or 3.

[0039] In some embodiments of the first and second aspects, Ra and Rb are each hydrogen.

[0040] In some embodiments of the first and second aspects, Rc and Rd are each independently hydrogen or alkyl.

[0041] In some embodiments of the first and second aspects, Rc and Rd, together with the nitrogen atom to which they are attached, form a 5-to 7-membered ring comprising 0 to 1 additional heteroatoms selected from oxygen, nitrogen, or sulfur, and said ring is unsubstituted or substituted with one or more substitutes selected from halogen, alkyl, hydroxy, hydroxyalkyl, alkoxy, or hydroxyalkoxy.

[0042] In some embodiments of the first and second aspects, Rc and Rd, together with the nitrogen atom to which they are attached, form a 6-membered ring comprising 0 to 1 additional nitrogen heteroatom and said ring is substituted with one or more substitutes selected from halogen, alkyl, hydroxy, hydroxyalkyl, alkoxy, or hydroxyalkoxy.

[0043] In some embodiments of the first and second aspects, p is 0. In some embodiments of the first and second aspects, q is 0.

[0044] In some embodiments of the first aspect, Re is hydrogen, alkyl, or -NRm2Rn2, wherein Rm2 and Rn2 are defined as in Formula (I) .

[0045] In some embodiments of the second aspect, Re1 and Re2 are each independently hydrogen, alkyl, aryl, or -NRm2Rn2, wherein Rm2 and Rn2 are defined as in Formula (I) . In some embodiments of the second aspect, Re1 is alkyl and Re2 is hydrogen, alkyl, aryl, or -NRm2Rn2, wherein Rm2 and Rn2 are defined as in Formula (I) . In some embodiments of the second aspect, Re1 and Re2 are different. In some embodiments of the second aspect, the carbon atom to which Re1 and Re2 are attached is a chiral center. In some embodiments of the second aspect, the carbon atom to which Re1 and Re2 are attached is in a (S) -or (R) -configuration. In some embodiments of the second aspect, the carbon atom to which Re1 and Re2 are attached is in a (S) -configuration.

[0046] In some embodiments of the first and second aspects, X is S; n is 1 to 6, or 2 to 4, or 3; Ra and Rb are each hydrogen; p and q are each 0; Rc and Rd are each independently alkyl; or Rc and Rd, together with the nitrogen atom to which they are attached, form a 5-to 7-membered ring comprising 0 to 1 additional heteroatoms selected from oxygen, nitrogen, or sulfur, and said ring is unsubstituted or substituted with one or more substitutes selected from halogen, alkyl, hydroxy, hydroxyalkyl, alkoxy, or hydroxyalkoxy; or Rc and Rd, together with the nitrogen atom to which they are attached, form a 6-membered ring comprising 0 to 1 additional nitrogen heteroatom and said ring is substituted with one or more substitutes selected from halogen, alkyl, hydroxy, hydroxyalkyl, alkoxy, or hydroxyalkoxy; Re is alkyl; or Re1 and Re2 are each independently hydrogen, alkyl; or Re1 is hydrogen and Re2 is hydrogen or alkyl.

[0047] In some embodiments of the first and second aspects, the compound is

[0048] In some embodiments of the first and second aspects, the compound is

[0049] In the third aspect, disclosed herein is a method for degrading a target protein in a cell via the TRIM21 E3 Ligase ubiquitin proteasome pathway, comprising contacting the target protein with an effective amount of a compound selected from the compound of Formula (I) , the compound of Formula (II) , or a molecular glue compound or a PROTAC bearing the compound of Formula (I) or (II) as the ligand for recruiting TRIM21 ligase.

[0050] In some embodiments of the third aspect, the cell is a cancerous cell.

[0051] In some embodiments of the third aspect, the contacting is in vitro.

[0052] In some embodiments of the third aspect, the contacting is in vivo.

[0053] In some embodiments of the third aspect, further comprising administering said compound to a subject.

[0054] In some embodiments of the third aspect, said target protein is any protein that forms multimers defined as multiple copies of a polypeptide encoded by a gene form a complex.

[0055] In some embodiments of the third aspect, said target protein is a multimeric protein that causes human disease.

[0056] In some embodiments of the third aspect, said target protein is protein aggregates or protein condensates.

[0057] In some embodiments of the third aspect, said target protein is amyloids or amyloid-like aggregates. In some embodiments, amyloid-like protein aggregates include Tau, alpha-Synuclein, and mutant Huntingtin.

[0058] In some embodiments of the third aspect, said target protein is NUP98-fusion proteins, EWS-FLI1, Tau fibrils, alpha-Synuclein fibrils, mutant Huntingtin, cGAS, or NLRP3.

[0059] In some embodiments of the third aspect, the degradation is achieved by recruitment of TRIM21 ubiquitin E3 ligase.

[0060] In some embodiments of the third aspect, the compound of Formula (I) or the compound of Formula (II) induces the recruitment of TRIM21 to the vicinity of the NPC to trigger the degradation of nuclear pore proteins.

[0061] In the four aspect, disclosed herein is a compound selected from the compound of Formula (I) , the compound of Formula (II) , or a molecular glue compound or a PROTAC bearing the compound of Formula (I) or (II) as the ligand for recruiting TRIM21 ligase for degrading a target protein in a cell via the TRIM21 E3 Ligase ubiquitin proteasome pathway; or use of a compound selected from the compound of Formula (I) , the compound of Formula (II) , or a molecular glue compound or a PROTAC bearing the compound of Formula (I) or (II) as the ligand for recruiting TRIM21 ligase in the manufacture of a reagent or medication for degrading a target protein in a cell via the TRIM21 E3 Ligase ubiquitin proteasome pathway.

[0062] In the fifth aspect, disclosed herein is the use of the compound of Formula (I) , or the compound of Formula (II) as the ligand for recruiting TRIM21 ligase of a PROTAC.

[0063] In the sixth aspect, disclosed herein is a method for treating or preventing a disease characterized by amyloid or amyloid-like aggregates, comprising administering a subject in need thereof a therapeutically effective amount of the compound of Formula (I) , the compound of Formula (II) , or a molecular glue compound or a PROTAC bearing the compound of Formula (I) or (II) as the ligand for recruiting TRIM21 ligase.

[0064] In some embodiments, the disease is Alzheimer’s , Huntington’s , and Parkinson’s diseases, type 2 diabetes, autoimmune disease, or a number of amyloidosis resulting from the systemic or local deposition of amyloid fibrils in intracellular and extracellular spaces of tissues and organs.Brief Description of the Drawings

[0065] The following detailed description, given by way of example, but not intended to limit the invention solely to the specific embodiments described, may best be understood in conjunction with the accompanying drawings.

[0066] Figure 1 shows that Acepromazine displays an interferon-enhanced selective anticancer activity:

[0067] - Figure 1A shows schematic of the competitive cell growth assay in which an equal mixture of WT A549 cells (labeled with H2B-GFP) and IFNGR1-deficient A549 cells (labeled with H2B-mCherry) were treated with IFNγ (20 ng / ml) and test compounds (10 μM) for four days followed by high-content imaging to quantify the ratio of GFP+ nuclei to mCherry+ nuclei.

[0068] - Figure 1B shows the effects of 81845 compounds on the ratio of GFP+ nuclei to mCherry+ nuclei in the primary screen.

[0069] - Figure 1C shows the chemical structures of hit compounds and their representative raw images from the primary screen. Green: H2B-GFP; Red: H2B-mCherry; Scale bar: 50 μm.

[0070] - Figure 1D shows the effects of hit compounds on the ratio of GFP+ nuclei to mCherry+ nuclei. Data represent the mean of three independent samples. One-way ANOVA followed by Dunnett’s multiple comparison test was used to determine statistical significance.

[0071] - Figure 1E shows the concentration-response curves of acepromazine on the viability of A549 cells treated with indicated cytokines (10 ng / ml) . Data represent the mean ± s.e.m. of three independent samples.

[0072] - Figure 1F shows the crystal violet staining of A549 cells co-cultured with indicated amounts of NK-92MI cells with or without acepromazine (10 μM) treatment for 48 h. A representative result was shown from two independent experiments.

[0073] - Figure 1G shows the effects of NK-92MI cells on the fitness of WT A549 cells (labeled with H2B-GFP) relative to IFNGR1-deficient A549 cells (labeled with H2B-mCherry) with or without acepromazine (10 μM) treatment for 48 h. The ratio of GFP+ nuclei to mCherry+ nuclei was determined by FACS. Data represent the mean of three independent samples. Student’s t tests (two-tailed) were used to determine statistical significance.

[0074] - Figure 1H shows the concentration-response curves of acepromazine on the viability of indicated cell lines and primary T lymphocytes with or without IFNγ (10 ng / ml) treatment. Data represent the mean ± s. e. m. of three independent samples.

[0075] Figure 2 shows that Acepromazine exhibits an interferon-enhanced selective anticancer activity independent of dopamine receptors.

[0076] - Figure 2A shows immunoblots of pSTAT1 and STAT1 in A549-Cas9 cells transduced with indicated sgRNAs and treated with IFNγ for 4 h. A representative result was shown from two independent experiments.

[0077] - Figure 2B shows the schematic of the NK92-MI killing assay. An equal mixture of WT A549 cells (labeled with H2B-GFP) and IFNGR1-deficient A549 cells (labeled with H2B-mCherry) were co-cultured with NK-92MI cells for 48 h followed by FACS to quantify the ratio of GFP+ nuclei to mCherry+ nuclei.

[0078] - Figure 2C shows the chemical structure of chlorpromazine.

[0079] - Figure 2D shows crystal violet staining of A549 (with or without 20 ng / ml IFNγ) treated with different concentrations of acepromazine or chlorpromazine.

[0080] - Figure 2E shows the expression levels of genes encoding dopamine receptors in indicated acepromazine-sensitive cancer cell lines. Normalized transcript expression values, denoted nTPM, were obtained from the human protein atlas.

[0081] Figure 3 shows the metabolic activation of acepromazine underlies its selective anticancer activity.

[0082] - Figure 3A shows the workflow for the preparation of conditioned medium (CM) .

[0083] - Figure 3B shows the effects of ACE, CM, and heated CM on the viability of DLD-1 (treated with 10 ng / ml IFNγ) for 3 days. Data represent the mean of three independent samples. One-way ANOVA followed by Dunnett’s multiple comparison test was used to determine statistical significance.

[0084] - Figure 3C shows the chemical reduction of ACE to ACE-OH.

[0085] - Figure 3D shows the detection of time-dependent conversion of ACE to ACE-OH in indicated cell lines by TLC.

[0086] - Figure 3E shows the separation of indicated ACE-OH enantiomers by chiral column chromatography.

[0087] - Figure 3F shows concentration-response curves of (S) -ACE-OH and (R) -ACE-OH on the viability of indicated cell lines with or without IFNγ (10 ng / ml) treatment. Data represent the mean ± s.e.m. of three independent samples.

[0088] - Figure 3G shows a heatmap showing the expression levels of genes encoding aldo-keto reductases in indicated cell lines. TPM (transcripts per million) values were downloaded from DepMap.

[0089] - Figure 3H shows the detection of ectopically expressed AKR1C1 / 2 / 3-3xFLAG in DLD-1 cells by anti-FLAG western blotting and ACE to ACE-OH conversion by TLC. A representative result was shown from two independent experiments.

[0090] - Figure 3I shows concentration-response curves of ACE on the viability of DLD-1 cells (treated with 10 ng / ml IFNγ) expressing AKR1C1 / 2 / 3-3xFLAG. Data represent the mean ± s.e.m. of three independent samples.

[0091] Figure 4 shows the metabolic activation of acepromazine into its stereo-selective active metabolite (S)-ACE-OH.

[0092] - Figure 4A shows the Mass spectrum of extracted metabolites from the A549 conditioned medium. The dominant peak corresponds to the [M + H] + of ACE-OH.

[0093] - Figure 4B shows the Mass spectrum of extracted metabolites from the HCT-116 conditioned medium. The dominant peak corresponds to the [M + H] + of ACE.

[0094] - Figure 4C shows the synthesis of Compound 3 from the inactive enantiomer of ACE-OH (Compound 1) .

[0095] - Figure 4D shows the Three-dimensional structure of Compound 3 determined by X-ray crystallography. Gray: carbon; white: hydrogen; blue: nitrogen; yellow: sulfur; red: oxygen; dark red: bromine.

[0096] - Figure 4E shows the detection of ectopically expressed AKR1C1 / 2 / 3-3xFLAG in ME-180 cells by anti-FLAG western blotting. A representative result was shown from two independent experiments.

[0097] - Figure 4F shows the concentration-response curves of ACE on the viability of ME-180 cells expressing AKR1C1 / 2 / 3-3xFLAG. Data represent the mean ± s.e.m. of three independent samples.

[0098] - Figure 4G shows a heatmap showing the median expression levels of genes encoding AKR1C1 / 2 / 3 in indicated tumor types and normal tissues. Median TPM (transcripts per million) values were downloaded from GEPIA 2.

[0099] Figure 5 shows interferon-induced TRIM21 mediates the anticancer activity of acepromazine.

[0100] - Figure 5A shows a Scatterplot depicting genes with significantly enriched sgRNAs in A549-Cas9 cells treated with ACE (4-10 μM) and IFNγ (10 ng / ml) versus IFNγ (10 ng / ml) only (n = 3 per group) for 3 weeks. P values were computed by MAGeCK from the negative binomial model using a modified robust ranking aggregation algorithm.

[0101] - Figure 5B shows the Frequency histogram of all sgRNAs and ranks of sgRNAs targeting indicated genes.

[0102] - Figure 5C shows Immunoblots of TRIM21 and β-Actin in A549 cells pre-treated with indicated cytokines (10 ng / ml) with or without ACE (10 μM) treatment for 12 h. A representative result was shown from two independent experiments.

[0103] - Figure 5D shows Immunoblots of TRIM21 and β-Actin in A549 cells of indicated genotypes with or without IFNγ (10 ng / ml) treatment for 12 h. A representative result was shown from two independent experiments.

[0104] - Figure 5E shows Concentration-response curves of ACE on the viability of A549 cells with indicated genotypes with or without IFNγ (10 ng / ml) treatment. Data represent the mean ± s.e.m. of three independent samples.

[0105] - Figure 5F shows the Molecular architecture of TRIM21.

[0106] - Figure 5G shows the Crystal structure of the PRYSPRY domain of TRIM21 in complex with Fc (modified from PDB 2IWG) .

[0107] - Figure 5H shows Immunoblots of TRIM21 and β-Actin in A549-TRIM21 knockout (KO) cells rescued with indicated TRIM21 cDNAs. A representative result was shown from two independent experiments.

[0108] - Figure 5I shows concentration-response curves of ACE on the viability of A549-TRIM21 KO cells rescued with indicated TRIM21 cDNAs with or without IFNγ (10 ng / ml) treatment. Data represent the mean ± s. e. m. of three independent samples.

[0109] Figure 6 shows TRIM21 mediates the anticancer activity of acepromazine in multiple cancer cell lines.

[0110] - Figure 6A-Figure 6B show concentration-response curves of ACE on the viability of SiHa and HuH-7 cells with indicated genotypes with or without IFNγ (10 ng / ml) treatment. Data represent the mean ± s.e.m. of three independent samples.

[0111] Figure 7 shows Acepromazine induces TRIM21-dependent degradation of nuclear pore proteins.

[0112] - Figure 7A-Figure 7B show volcano plots depicting log2 transformed average fold change of each protein (quantified by label-free proteomics) and -log10 transformed P value comparing A549-TRIM21D355A treated with (A) ACE (10 μM) versus vehicle for 6h; (B) ACE (10 μM) versus ACE and bortezomib (100 nM) for 8 h. Three independent samples were included in the analyses. P values were calculated by Student’s t test (two tailed) .

[0113] - Figure 7C shows immunoblots of indicated proteins in IFNγ-pretreated A549 cells treated with (S) -ACE-OH or (R) -ACE-OH with or without for 8 h. A representative result was shown from two independent experiments.

[0114] - Figure 7D shows the schematic cross-section of the NPC (Created with Biorender) and the degree of nuclear pore protein depletion mapped to the cryo-electron tomography structure of the NPC (PDB: 7R5J) .

[0115] - Figure 7E shows a heatmap depicting time-dependent depletion of nuclear pore proteins (quantified by label-free proteomics) in IFNγ-stimulated A549 treated with ACE (10 μM) .

[0116] - Figure 7F shows transmission electron microscopy images of IFNγ-pretreated A549 cells treated with ACE (10 μM) for the indicated time. The red circles mark aberrant nuclei. A representative result was shown from three independent experiments. Scale bar: 10 μm.

[0117] - Figure 7G shows confocal microscopy images of nuclei (blue, stained with Hoechst 33342) , TRIM21-EGFP (green) , and NES-mCherry (red) in A549 cells. When indicated, cells were pre-treated with bortezomib (100 nM) for 2h followed by ACE (10 μM) treatment for 4h. A representative result was shown from three independent experiments. Scale bar: 10 μm.

[0118] - Figure 7H shows a schematic of the TRIM21-TurboID assay.

[0119] - Figure 7I shows a volcano plot depicting log2 transformed average fold change of each protein (quantified by label-free proteomics) and -log10 transformed P value comparing TRIM21-TurboID-enriched proteins from A549 cells treated with ACE (20 μM) versus vehicle for 4 h. Three independent samples were included in the analyses. P values were calculated by Student’s t test (two tailed) .

[0120] Figure 8 shows Acepromazine induces TRIM21-dependent degradation of nuclear pore proteins in multiple cancer cell lines.

[0121] - Figure 8A shows immunoblots of indicated proteins in ACE-sensitive or insensitive cell lines treated with indicated concentrations of ACE for 12 h with or without IFNγ (10 ng / ml) pretreatment. A representative result was shown from two independent experiments.

[0122] - Figure 8B shows immunoblots of indicated proteins in A549-TRIM21 KO cells treated with ACE (20 μM) for the indicated time.

[0123] - Figure 8C shows immunoblots of indicated proteins in IFNγ-stimulated A549 cells that were pretreated with bortezomib (100 nM) , MLN4924 (200 nM) , or TAK243 (200 nM) for 2 h followed by ACE (10 μM) treatment for 12 h. A representative result was shown from two independent experiments.

[0124] Figure 9 shows NUP98 is the primary target of acepromazine.

[0125] - Figure 9A shows the workflow of CRISPR-suppressor scanning (created with Biorender) .

[0126] - Figure 9B shows violin plot showing log2 transformed fold change in the average abundance of each sgRNA comparing A549-TRIM21D355A treated with ACE (dose escalating from 500 nM to 20 μM) versus vehicle for three weeks. Three independent samples were included in the analyses.

[0127] - Figure 9C shows scatter plot showing log2 transformed fold change in the average abundance of each NUP98-targeting sgRNA (y axis) in A549-TRIM21D355A cells treated with ACE versus vehicle for three weeks. The sgRNAs are arrayed by the amino acid position in the NUP98-NUP96 coding sequence on the x axis corresponding to the position of the predicted cut site. Data points represent the mean values of three independent samples.

[0128] - Figure 9D shows workflow to isolate ACE-resistant clones from A549-Cas9 cells transduced with the sgRNA targeting NUP98 K752.

[0129] - Figure 9E shows concentration-response curves of ACE on the viability of NUP98 mutant clones with IFNγ (10 ng / ml) pretreatment. Data indicate the mean ± s.e.m. of three independent samples.

[0130] - Figure 9F shows immunoblots of indicated proteins in IFNγ-stimulated parental A549 cells and NUP98 mutant clones (R1–R5) that were treated with ACE (10 μM) for 12 h. A representative result was shown from two independent experiments.

[0131] - Figure 9G shows volcano plot depicting log2 transformed average fold change of each protein (quantified by label-free proteomics) and -log10 transformed P value comparing TRIM21-TurboID enriched proteins from the NUP98 mutant clone (R1) treated with ACE (20 μM) versus vehicle for 4 h. Three independent samples were included in the analyses. P values were calculated by Student’s t test (two tailed) .

[0132] - Figure 9H shows schematic of the PML-GFP-degron assay.

[0133] - Figure 9I shows the effect of ACE on the levels of indicated PML-GFP-NPC fusion proteins in A549-TRIM21D355A cells. Data are the mean ± s.e.m. of six independent samples.

[0134] - Figure 9J shows confocal microscopy images of PML-GFP-NUP98domain 2 (green) in A549-TRIM21D355A cells treat with vehicle or ACE (10 μM) . Scale bar: 10 μm.

[0135] - Figure 9K shows NUP98APD in the cryo-electron tomography structure of the NPC (PDB: 7R5J) .

[0136] Figure 10 shows deletions in NUP98APD render acepromazine resistance.

[0137] - Figure 10A shows the cDNA sequences of NUP98 mutant clones.

[0138] - Figure 10B shows the deleted segment in NUP98 mutant clones highlighted in the structure of NUP98APD (PDB: 2Q5Y) .

[0139] - Figure 10C shows volcano plot depicting log2 transformed average fold change of each protein (quantified by label-free proteomics) and -log10 transformed P value comparing the NUP98 mutant clone (R1) treated with ACE (10 μM) versus vehicle for 8 h. Three independent samples were included in the analyses. P values were calculated by Student’s t test (two tailed) .

[0140] - Figure 10D shows the effect of ACE on the levels of indicated PML-GFP-NUP98 fusion proteins in A549-TRIM21D355A cells. Data are the mean ± s.e.m. of six independent samples.

[0141] Figure 11 shows crystal Structures of the PRYSPRY domain of TRIM21D355A in complex with acepromazine and its metabolites.

[0142] - Figure 11A shows ITC titration and curve fitting of ACE and its metabolites with the PRYSPRY domain of TRIM21D355A.

[0143] - Figure 11B-Figure 11D show the overall structure of the PRYSPRY domain of TRIM21D355A in complex with ACE (B) , (S) -ACE-OH (C) , and (R) -ACE-OH (D) .

[0144] - Figure 11E shows superimposed binding positions for ACE (magenta) , (S) -ACE-OH (cyan) , and (R) -ACE-OH (green) within the PRYSPRY domain of TRIM21D355A.

[0145] - Figure 11F -Figure 11H show close-up views of the binding poses for ACE (F) , (S) -ACE-OH (G) , and (R) -ACE-OH (H) within the pocket of the PRYSPRY domain of TRIM21D355A.

[0146] - Figure 11I shows superimposed ligand conformations of ACE (magenta) , (S) -ACE-OH (cyan) and (R) -ACE-OH (green) .

[0147] Figure 12 shows the characterization of the interaction of ACE and its metabolites with TRIM21 PRYSPRY.

[0148] - Figure 12A shows the binding of ACE and its metabolites to the PRYSPRY domain of TRIM21WT measured by MST. Raw MST traces and curve fitting are shown.

[0149] - Figure 12B shows electron density maps showing details of the regions occupied by indicated ligands in the PRYSPRY domain of TRIM21D355A. Fo-Fc omit map of ACE and its metabolites contoured at 3σ.

[0150] Figure 13 shows TRIM21-directed PROTACs selectively degrade multimeric proteins in biomolecular condensates.

[0151] - Figure 13A shows the chemical structure of TrimTAC1.

[0152] - Figure 13B shows representative images of A549-TRIM21D355A or A549-CRBN cells expressing indicated reporter proteins treated with or without TrimTAC1 (4 μM) or dBET1 (100 nM) for 4 h. Scale bar: 10 μM.

[0153] - Figure 13C shows concentration-response curves of TrimTAC1 or dBET1 on the normalized intensities of indicated reporter proteins in A549-TRIM21D355A or A549-CRBN cells. Data indicate the mean ± s.e.m. of three independent samples.

[0154] - Figure 13D shows intensities of NUP98FG-mEGFP-BRD4BD2 in A549-TRIM21D355A cells treated with TrimTAC1 (2 μM) for indicated time. Each point represents the mean of three independent samples. One-way ANOVA followed by Dunnett’s multiple comparison test was used to determine statistical significance.

[0155] - Figure 13E shows normalized intensities of NUP98FG-mEGFP-BRD4BD2 in A549-TRIM21D355A cells with indicated treatment of TrimTAC1 (4 μM) , bortezomib (400 nM) , and TAK243 (1.5 μM) . Data indicate the mean ± s.e.m. of six independent samples. One way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparison test was used to determine statistical significance.

[0156] - Figure 13F shows the chemical structure of TrimTAC2.

[0157] - Figure 13G shows representative images of indicated FKBP12-mEGFP reporter proteins treated with vehicle or TrimTAC2 (10 μM) for 4 h. Scale bar: 10 μm.

[0158] - Figure 13H shows schematic illustration of TrimTAC selectivity towards multimeric proteins in biomolecular condensates.

[0159] Figure 14 shows design and characterization of TrimTACs.

[0160] - Figure 14A shows representative images of A549 cells expressing NUP98FG-mEGFP-BRD4BD2 pretreated with vehicle, bortezomib (400 nM) , or TAK-243 (1.5 μM) for 2 h followed by TrimTAC1 (4 μM) treatment for 4 h. Scale bar:

[0161] - Figure 14B shows representative images of A549 cells expressing indicated reporter proteins treated with or without TrimTAC2 (10 μM) for 4 h. Scale bar: 10 μm.

[0162] - Figure 14C shows representative images of A549 cells expressing NUP98FG-mEGFP-FKBP12 pretreated with vehicle, bortezomib (200 nM) , or TAK-243 (1 μM) for 2 h followed by TrimTAC2 (10 μM) treatment for 4 h. Scale bar:

[0163] - Figure 14D shows concentration-response curves of TrimTAC2 on the intensities of indicated reporter proteins in A549-TRIM21D355A cells. Data indicate the mean ± s.e.m. of three independent samples.

[0164] - Figure 14E shows intensities of NUP98FG-mEGFP-FKBP12 in A549-TRIM21D355A cells with indicated treatment of TrimTAC2 (10 μM) , bortezomib (200 nM) , and TAK243 (1 μM) . Data indicate the mean ± s.e.m. of six independent samples. One way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparison test was used to determine statistical significance.Detailed Description of the Invention

[0165] Definition

[0166] Unless specifically defined elsewhere in this document, all other technical and scientific terms used herein have the meaning commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.

[0167] As used herein, including the appended claims, the singular forms of words such as "a, " "an, " and "the, " include their corresponding plural references unless the context clearly dictates otherwise.

[0168] The term "alkyl" refers to a hydrocarbon group selected from linear and branched saturated hydrocarbon groups comprising from 1 to 18, such as from 1 to 12, further such as from 1 to 10, more further such as from 1 to 8, or from 1 to 6, or from 1 to 4, carbon atoms. Examples of alkyl groups comprising from 1 to 6 carbon atoms (i.e., C1-6 alkyl) include, but not limited to, methyl, ethyl, 1-propyl or n-propyl ( "n-Pr" ) , 2-propyl or isopropyl ( "i-Pr" ) , 1-butyl or n-butyl ( "n-Bu" ) , 2-methyl-1-propyl or isobutyl ( "i-Bu" ) , 1-methylpropyl or s-butyl ( "s-Bu" ) , 1, 1-dimethylethyl or t-butyl ( "t-Bu" ) , 1-pentyl, 2-pentyl, 3-pentyl, 2-methyl-2-butyl, 3-methyl-2-butyl, 3-methyl-1-butyl, 2-methyl-1-butyl, 1-hexyl, 2-hexyl, 3-hexyl, 2-methyl-2-pentyl, 3-methyl-2-pentyl, 4-methyl-2-pentyl, 3-methyl-3-pentyl, 2-methyl-3-pentyl, 2, 3-dimethyl-2-butyl and 3, 3-dimethyl-2-butyl groups. The alkyl group can be optionally enriched in deuterium, e.g., -CD3, -CD2CD3 and the like.

[0169] The term "halogen” refers to fluoro (F) , chloro (Cl) , bromo (Br) and iodo (I) .

[0170] The term "haloalkyl" refers to an alkyl group in which one or more hydrogen is / are replaced by one or more halogen atoms such as fluoro, chloro, bromo, and iodo. Examples of the haloalkyl include haloC1-8alkyl, haloC1-6alkyl or halo C1-4alkyl, but not limited to -CF3, -CH2Cl, -CH2CF3, -CCl2, CF3, and the like.

[0171] The term "alkyloxy" or "alkoxy" refers to an alkyl group as defined above attached to the parent molecular moiety through an oxygen atom. Examples of an alkyloxy, e.g., C1-6alkyloxy or C1-4 alkyloxy includes, but not limited to, methoxy, ethoxy, isopropoxy, propoxy, n-butoxy, tert-butoxy, pentoxy and hexoxy and the like.

[0172] The term "alkoxy-alkyl-" refers to an alkyl group as defined above further substituted with an alkoxy as defined above. Examples of an alkoxy-alkyl-, e.g., C1-8alkoxy-C1-8alkyl-or C1-6alkoxy-C1-6alkyl-includes, but not limited to, methoxymethyl, ethoxymethyl, ethoxyethyl, isopropoxymethyl, or propoxymethyl and the like.

[0173] The term "alkenyl" herein refers to a hydrocarbon group selected from linear and branched hydrocarbon groups comprising at least one C = C double bond and from 2 to 18, such as from 2 to 8, further such as from 2 to 6, carbon atoms. Examples of the alkenyl group, e.g., C2-6 alkenyl, include, but not limited to ethenyl or vinyl, prop-1-enyl, prop-2-enyl, 2-methylprop-1-enyl, but-1-enyl, but-2-enyl, but-3-enyl, buta-1, 3-dienyl, 2-methylbuta-1, 3-dienyl, hex-1-enyl, hex-2-enyl, hex-3-enyl, hex-4-enyl, and hexa-1, 3-dienyl groups.

[0174] The term "alkynyl" herein refers to a hydrocarbon group selected from linear and branched hydrocarbon group, comprising at least one C≡C triple bond and from 2 to 18, such as 2 to 8, further such as from 2 to 6, carbon atoms. Examples of the alkynyl group, e.g., C2-6 alkynyl, include, but not limited to ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl (propargyl) , 1-butynyl, 2-butynyl, and 3-butynyl groups.

[0175] The term "cycloalkyl" refers to a hydrocarbon group selected from saturated cyclic hydrocarbon groups, comprising monocyclic and polycyclic (e.g., bicyclic and tricyclic) groups including fused, bridged or spiro cycloalkyl.

[0176] For example, the cycloalkyl group may comprise from 3 to 12, such as from 3 to 10, further such as 3 to 8, further such as 3 to 6, 3 to 5, or 3 to 4 carbon atoms. Even further for example, the cycloalkyl group may be selected from monocyclic group comprising from 3 to 12, such as from 3 to 10, further such as 3 to 8, 3 to 6 carbon atoms. Examples of the monocyclic cycloalkyl group include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, 1-cyclopent-1-enyl, 1-cyclopent-2-enyl, 1-cyclopent-3-enyl, cyclohexyl, 1-cyclohex-1-enyl, 1-cyclohex-2-enyl, 1-cyclohex-3-enyl, cyclohexadienyl, cycloheptyl, cyclooctyl, cyclononyl, cyclodecyl, cycloundecyl, and cyclododecyl groups. In particular, Examples of the saturated monocyclic cycloalkyl group, e.g., C3-8cycloalkyl, include, but not limited to cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, and cyclooctyl groups. In a preferred embedment, the cycloalkyl is a monocyclic ring comprising 3 to 6 carbon atoms (abbreviated as C3-6 cycloalkyl) , including but not limited to, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, and cyclohexyl. Examples of the bicyclic cycloalkyl groups include those having from 7 to 12 ring atoms arranged as a fused bicyclic ring selected from [4, 4] , [4, 5] , [5, 5] , [5, 6] and [6, 6] ring systems, or as a bridged bicyclic ring selected from bicyclo [2.2.1] heptane, bicyclo [2.2.2] octane, and bicyclo [3.2.2] nonane. Further Examples of the bicyclic cycloalkyl groups include those arranged as a bicyclic ring selected from [5, 6] and [6, 6] ring systems.

[0177] The term "aryl" used alone or in combination with other terms refers to a group selected from:

[0178] - 5-and 6-membered carbocyclic aromatic rings, e.g., phenyl;

[0179] - bicyclic ring systems such as 7 to 12 membered bicyclic ring systems, wherein at least one ring is carbocyclic and aromatic, e.g., naphthyl and indanyl; and,

[0180] - tricyclic ring systems such as 10 to 15 membered tricyclic ring systems wherein at least one ring is carbocyclic and aromatic, e.g., fluorenyl.

[0181] The terms “aromatic hydrocarbon ring” and “aryl” are used interchangeable throughout the disclosure herein. In some embodiments, a monocyclic or bicyclic aromatic hydrocarbon ring has 5 to 10 ring-forming carbon atoms (i.e., C5-10 aryl) . Examples of a monocyclic or bicyclic aromatic hydrocarbon ring includes, but not limited to, phenyl, naphth-1-yl, naphth-2-yl, anthracenyl, phenanthrenyl, and the like. In some embodiments, the aromatic hydrocarbon ring is a naphthalene ring (naphth-1-yl or naphth-2-yl) or phenyl ring. In some embodiments, the aromatic hydrocarbon ring is a phenyl ring.

[0182] The term "heteroaryl" herein refers to a group selected from:

[0183] - 5-, 6-or 7-membered aromatic, monocyclic rings comprising at least one heteroatom, for example, from 1 to 4, or, in some embodiments, from 1 to 3, in some embodiments, from 1 to 2, heteroatoms, selected from nitrogen (N) , sulfur (S) and oxygen (O) , with the remaining ring atoms being carbon;

[0184] - 7-to 12-membered bicyclic rings comprising at least one heteroatom, for example, from 1 to 4, or, in some embodiments, from 1 to 3, or, in other embodiments, 1 or 2, heteroatoms, selected from nitrogen, oxygen or optionally oxidized sulfur as ring member (s) , with the remaining ring atoms being carbon and wherein at least one ring is aromatic and at least one heteroatom is present in the aromatic ring; and

[0185] - 11-to 14-membered tricyclic rings comprising at least one heteroatom, for example, from 1 to 4, or in some embodiments, from 1 to 3, or, in other embodiments, 1 or 2, heteroatoms, selected from nitrogen, oxygen or optionally oxidized sulfur as ring member (s) , with the remaining ring atoms being carbon and wherein at least one ring is aromatic and at least one heteroatom is present in an aromatic ring.

[0186] When the total number of S and O atoms in the heteroaryl group exceeds 1, those heteroatoms are not adjacent to one another. In some embodiments, the total number of S and O atoms in the heteroaryl group is not more than 2. In some embodiments, the total number of S and O atoms in the aromatic heterocycle is not more than 1. When the heteroaryl group contains more than one heteroatom ring member, the heteroatoms may be the same or different. The nitrogen atoms in the ring (s) of the heteroaryl group can be oxidized to form N-oxides.

[0187] The terms “aromatic heterocyclic ring” and “heteroaryl” are used interchangeable throughout the disclosure herein. In some embodiments, a monocyclic or bicyclic aromatic heterocyclic ring has 5-, 6-, 7-, 8-, 9-or 10-ring forming members with 1, 2, 3, or 4 heteroatom ring members independently selected from nitrogen (N) , sulfur (S) and oxygen (O) and the remaining ring members being carbon. In some embodiments, the monocyclic or bicyclic aromatic heterocyclic ring is a monocyclic or bicyclic ring comprising 1 or 2 heteroatom ring members independently selected from nitrogen (N) , sulfur (S) and oxygen (O) . In some embodiments, the monocyclic or bicyclic aromatic heterocyclic ring is a 5-to 6-membered heteroaryl ring, which is monocyclic and which has 1 or 2 heteroatom ring members independently selected from nitrogen (N) , sulfur (S) and oxygen (O) . In some embodiments, the monocyclic or bicyclic aromatic heterocyclic ring is a 8-to 10-membered heteroaryl ring, which is bicyclic and which has 1 or 2 heteroatom ring members independently selected from nitrogen, sulfur and oxygen.

[0188] Examples of the heteroaryl group or the monocyclic or bicyclic aromatic heterocyclic ring include, but are not limited to, (as numbered from the linkage position assigned priority 1) pyridyl (such as 2-pyridyl, 3-pyridyl, or 4-pyridyl) , cinnolinyl, pyrazinyl, 2, 4-pyrimidinyl, 3, 5-pyrimidinyl, 2, 4-imidazolyl, imidazopyridinyl, isoxazolyl, oxazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, thiadiazolyl (such as 1, 2, 3-thiadiazolyl, 1, 2, 4-thiadiazolyl, or 1, 3, 4-thiadiazolyl) , tetrazolyl, thienyl (such as thien-2-yl, thien-3-yl) , triazinyl, benzothienyl, furyl or furanyl, benzofuryl, benzoimidazolyl, indolyl, isoindolyl, indolinyl, oxadiazolyl (such as 1, 2, 3-oxadiazolyl, 1, 2, 4-oxadiazolyl, or 1, 3, 4-oxadiazolyl) , phthalazinyl, pyrazinyl, pyridazinyl, pyrrolyl, triazolyl (such as 1, 2, 3-triazolyl, 1, 2, 4-triazolyl, or 1, 3, 4-triazolyl) , quinolinyl, isoquinolinyl, pyrazolyl, pyrrolopyridinyl (such as 1H-pyrrolo [2, 3-b] pyridin-5-yl) , pyrazolopyridinyl (such as 1H-pyrazolo [3, 4-b] pyridin-5-yl) , benzoxazolyl (such as benzo [d] oxazol-6-yl) , pteridinyl, purinyl, 1-oxa-2, 3-diazolyl, 1-oxa-2, 4-diazolyl, 1-oxa-2, 5-diazolyl, 1-oxa-3, 4-diazolyl, 1-thia-2, 3-diazolyl, 1-thia-2, 4-diazolyl, 1-thia-2, 5-diazolyl, 1-thia-3, 4-diazolyl, furazanyl (such as furazan-2-yl, furazan-3-yl) , benzofurazanyl, benzothiophenyl, benzothiazolyl, benzoxazolyl, quinazolinyl, quinoxalinyl, naphthyridinyl, furopyridinyl, benzothiazolyl (such as benzo [d] thiazol-6-yl) , indazolyl (such as 1H-indazol-5-yl) and 5, 6, 7, 8-tetrahydroisoquinoline.

[0189] "Heterocyclyl, " "heterocycle" or "heterocyclic" are interchangeable and refer to a non-aromatic heterocyclyl group comprising one or more heteroatoms selected from nitrogen, oxygen or optionally oxidized sulfur as ring members, with the remaining ring members being carbon, including monocyclic, fused, bridged, and spiro ring, i.e., containing monocyclic heterocyclyl, bridged heterocyclyl, spiro heterocyclyl, and fused heterocyclic groups.

[0190] The term "monocyclic heterocyclyl” refers to monocyclic groups in which at least one ring member is a heteroatom selected from nitrogen, oxygen or optionally oxidized sulfur. A heterocycle may be saturated or partially saturated.

[0191] Exemplary monocyclic 4 to 9-membered heterocyclyl groups include, but not limited to, (as numbered from the linkage position assigned priority 1) pyrrolidin-1-yl, pyrrolidin-2-yl, pyrrolidin-3-yl, imidazolidin-2-yl, imidazolidin-4-yl , pyrazolidin-2-yl, pyrazolidin-3-yl, piperidin-1-yl, piperidin-2-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, 2, 5-piperazinyl, pyranyl, morpholinyl, morpholino, morpholin-2-yl, morpholin-3-yl, oxiranyl, aziridin-1-yl, aziridin-2-yl, azocan-1-yl, azocan-2-yl, azocan-3-yl, azocan-4-yl, azocan-5-yl, thiiranyl, azetidin-1-yl, azetidin-2-yl, azetidin-3-yl, oxetanyl, thietanyl, 1, 2-dithietanyl, 1, 3-dithietanyl, dihydropyridinyl, tetrahydropyridinyl, thiomorpholinyl, thioxanyl, piperazinyl, homopiperazinyl, homopiperidinyl, azepan-1-yl, azepan-2-yl, azepan-3-yl, azepan-4-yl, oxepanyl, thiepanyl, 1, 4-oxathianyl, 1, 4-dioxepanyl, 1, 4-oxathiepanyl, 1, 4-oxaazepanyl, 1, 4-dithiepanyl, 1, 4-thiazepanyl and 1, 4-diazepanyl, 1, 4-dithianyl, 1, 4-azathianyl, oxazepinyl, diazepinyl, thiazepinyl, dihydrothienyl, dihydropyranyl, dihydrofuranyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydrothienyl, tetrahydropyranyl, tetrahydrothiopyranyl, 1-pyrrolinyl, 2-pyrrolinyl, 3-pyrrolinyl, indolinyl, 2H-pyranyl, 4H-pyranyl, 1, 4-dioxanyl, 1, 3-dioxolanyl, pyrazolinyl, pyrazolidinyl, dithianyl, dithiolanyl, pyrazolidinyl, imidazolinyl, pyrimidinonyl, or 1, 1-dioxo-thiomorpholinyl.

[0192] "Pharmaceutically acceptable salts" refers to those salts which are, within the scope of sound medical judgment, suitable for use in contact with the tissues of humans and lower animals without undue toxicity, irritation, allergic response and the like, and are commensurate with a reasonable benefit / risk ratio. A pharmaceutically acceptable salt may be prepared in situ during the final isolation and purification of the compounds disclosed herein, or separately by reacting the free base function with a suitable organic acid or by reacting the acidic group with a suitable base.

[0193] In addition, if a compound disclosed herein is obtained as an acid addition salt, the free base can be obtained by basifying a solution of the acid salt. Conversely, if the product is a free base, an addition salt, such as a pharmaceutically acceptable addition salt, may be produced by dissolving the free base in a suitable organic solvent and treating the solution with an acid, in accordance with conventional procedures for preparing acid addition salts from base compounds. Those skilled in the art will recognize various synthetic methodologies that may be used without undue experimentation to prepare non-toxic pharmaceutically acceptable addition salts.

[0194] As defined herein, "a pharmaceutically acceptable salt thereof" include salts of at least one compound of Formula (I) , and salts of the stereoisomers of the compound of Formula (I) , such as salts of enantiomers, and  / or salts of diastereomers.

[0195] The term "effective amount" or “therapeutically effective amount” refers to an amount of the active ingredient, such as compound that, when administered to a subject for degrading purpose disclosed herein or for treating a disease, or at least one of the clinical symptoms of a disease or disorder, is sufficient to affect such treatment for the disease, disorder, or symptom. The “therapeutically effective amount” can vary with the compound, the disease, disorder, and / or symptoms of the disease or disorder, severity of the disease, disorder, and / or symptoms of the disease or disorder, the age of the subject to be treated, and / or the weight of the subject to be treated. An appropriate amount in any given instance can be apparent to those skilled in the art or can be determined by routine experiments. In some embodiments, “therapeutically effective amount” is an amount of at least one compound and  / or at least one stereoisomer thereof, and  / or at least one pharmaceutically acceptable salt thereof disclosed herein effective to “treat” as defined above, a disease or disorder in a subject. In the case of combination therapy, the “therapeutically effective amount” refers to the total amount of the combination objects for the effective treatment of a disease, a disorder or a condition.

[0196] Molecular glues can enhance complex formation between an E3 ligase and a target protein by binding between protein–protein interfaces and are generally defined as small molecules that interact with two protein surfaces to induce or enhance the affinity of these two proteins for each other, and then induce the degradation of the target protein.

[0197] PROTACs are bifunctional molecules consisting of a recruiting ligand for a ubiquitin ligase (e.g., E3 ubiquitin ligase) and a ligand for targeting an endogenous protein connected via a linker that which function to recruit the target proteins to an E3 Ubiquitin Ligase for degradation. In some embodiments, the compound of Formula (I) or (II) serves as the recruiting ligands in a PROTAC compound for the TRIM21 ubiquitin ligase.

[0198] Target protein is defined as a multimeric protein that causes human disease. Examples include but not limited to NUP98-fusion proteins, EWS-FLI1, Tau fibrils, alpha-Synuclein fibrils, mutant Huntingtin, cGAS, NLRP3. Multimers refer to multiple copies of a polypeptide encoded by a gene form a complex.

[0199] “Target protein” , or “protein” refers to any protein involved in the metabolism or catabolism of a cell and / or organ of a subject, especially including proteins that modulate a disease state or condition to be treated with the relevant compounds disclosed herein. Target proteins may also include proteins from microbes, such as bacteria, viruses, fungi and protozoa. In general, target proteins may include, for example, structural proteins; receptors; enzymes; cell surface proteins; proteins pertinent to the integrated function of a cell, including proteins involved in catalysis, aromatase activity, motor activity, helicase activity, metabolic processes (such as anabolism and catabolism) , antioxidant activity, proteolysis, biosynthesis, kinase activity, oxidoreductase activity, transferase activity, hydrolase activity, lyase activity, isomerase activity, ligase activity, enzyme regulator activity, signal transducer activity, structural molecule activity, binding activity (to a protein, lipid or carbohydrate) , receptor activity, cell motility, membrane fusion, cell communication, regulation of biological processes, development, cell differentiation, response to stimulus, behavioral proteins, cell adhesion proteins, proteins involved in cell death, proteins involved in transport (including protein transporter activity, nuclear transport, ion transporter activity, channel transporter activity, carrier activity, permease activity, secretion activity, electron transporter activity) , pathogenesis, chaperone regulator activity, nucleic acid binding activity, transcription regulator activity, extracellular organization and biogenesis activity, and translation regulator activity.

[0200] Amyloids are aggregates of proteins characterized by their fibrillar morphology, and a β-sheet secondary structure known as cross-β. Amyloid-like aggregates refer to a diverse group of protein aggregates that share similarities with amyloids but may lack the cross-β structure. Amyloid and amyloid-like protein aggregates are highly ordered protein structures that form when previously healthy proteins undergo misfolding and lose their normal structure and physiological functions. Amyloid or amyloid-like protein aggregates are associated with human diseases, including Alzheimer’s , Huntington’s , and Parkinson’s diseases, type 2 diabetes, and a number of amyloidosis resulting from the systemic or local deposition of amyloid fibrils in intracellular and extracellular spaces of tissues and organs. Examples of amyloid-like protein aggregates include, but not limited to, Tau, alpha-Synuclein, and mutant Huntingtin.

[0201] Protein multimerization refers to the ability of proteins to interact and thus form complexes with more than one monomer or unit.

[0202] Target proteins may include proteins from eukaryotes and prokaryotes, including humans and other animals, microbes, plants and viruses, among numerous others.

[0203] Non-limiting examples of target proteins include B7, B7-1 and B7-2 (providing second signals to T cells) , TINFRlm, BET bromodomain, TNFR2, NADPH oxidase, BclIBax and other partners in the apoptosis pathway, C5a receptor, HMG-CoA reductase, PDE V phosphodiesterase type, PDE IV phosphodiesterase type 4, PDE I, PDEII, PDEIII, squalene cyclase inhibitor, CXCR1, CXCR2, nitric oxide (NO) synthase, cyclo-oxygenase 1, cyclo-oxygenase 2, 5HT receptors, dopamine receptors, G Proteins, i.e., Gq, histamine receptors, 5-lipoxygenase, tryptase serine protease, thymidylate synthase, purine nucleoside phosphorylase, GAPDH trypanosomal, glycogen phosphorylase, carbonic anhydrase, chemokine receptors, JAW STAT, RXR and similar, HIV 1 protease, HIV 1 integrase, influenza neuramimidase, hepatitis B reverse transcriptase, sodium channel, protein P-glycoprotein (and MRP) , tyrosine kinases, CD23, CD124, tyrosine kinase p56 lek, CD4, CD5, IL-2 receptor, IL-1 receptor, TNF-alphaR, ICAM1, Cat+ channels, VC AM, VLA-4 integrin, selectins, CD40 / CD40L, newokmms and receptors, mosme monophosphate dehydrogenase, p38 MAP Kinase, RaslRaflMEWERK pathway, interleukin-1 converting enzyme, caspase, HCV, NS3 protease, HCVNS3 RNA helicase, glycinamide ribonucleotide formyl transferase, rhinovirus 3C protease, herpes simplex virus-1 (HSV-I) , protease, cytomegalovirus (CMV) protease, poly (ADP-ribose) polymerase, cyclin dependent kinases, vascular endothelial growth factor, oxytocin receptor, microsomal transfer protein inhibitor, bile acid transport inhibitor, 5 alpha reductase inhibitors, angiotensin 11, glycine receptor, noradrenaline reuptake receptor, endothelin receptors, neuropeptide Y and receptor, adenosine receptors, adenosine kinase and AMP deaminase, purinergic receptors (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2X1-7) , farnesyltransferases, geranylgeranyl transferase, TrkA a receptor for NGF, beta-amyloid, tyrosine kinase Flk-IIKDR, vitronectin receptor, integrin receptor, Her-21 neu, telomerase inhibition, tumor associated protein (TMP) , Bcr-Abl tyrosine kinase, cytosolic phospholipaseA2 and EGF receptor tyrosine kinase. Additional protein targets include, for example, ecdysone 20-monooxygenase, ion channel of the GABA gated chloride channel, acetylcholinesterase, voltage-sensitive sodium channel protein, calcium release channel, and chloride channels. Additional target proteins include acetyl-CoA carboxylase, adenylosuccinate synthetase, protoporphyrinogen oxidase, and enolpyruvylshikimate-phosphate synthase. Exemplary target proteins include, for example, drug resistant and multiple drug resistance (MDR) proteins.

[0204] “Fusion Protein” refers to proteins formed through joining of parts or whole of two or more proteins, e.g., the target proteins as mentioned above.

[0205] “Multimeric protein” refers to a protein that is composed of two or more separate polypeptide chains that combine to form a single protein, e.g., the target proteins as mentioned above. The polypeptide chains may be coupled non-covalently or covalently, for example, via disulfide bonds. A multimeric protein can be homomultimeric (in the same polypeptide chain) or heteromultimeric (in different polypeptide chains) .

[0206] A "subject" may be a human or non-human mammal or a bird. Non-human mammals include, for example, livestock and pets, such as ovine, bovine, porcine, canine, feline and murine mammals. Preferably, the subject is human.

[0207] Examples

[0208] Hereinafter, Examples 1 to 6 elaborate how ACE can induce the recruitment of TRIM21 to the vicinity of the NPC to trigger the degradation of nuclear pore proteins, Example 7 further confirms that two TRIM21-directed PROTACs bearing the ACE moiety as the ligand for recruiting TRIM21 ligase selectively degraded multimeric proteins in biomolecular condensates; Examples 8 and 9 prepared the two TRIM21-directed PROTACs, i.e., TrimTAC1 and TrimTAC2; and finally Example 11 lists the (biological) materials, assays and methods used in the invention.

[0209] Example 1: Acepromazine displays an interferon-enhanced selective anticancer activity

[0210] Interferon gamma (IFNγ) is a key inflammatory cytokine in the tumor microenvironment that orchestrates diverse antitumor responses, and the presence of IFNγ can be used to identify small molecules with enhanced cytotoxicity to cancer cells.

[0211] An in vitro competitive cell growth assay was designed by using the lung adenocarcinoma cell line A549: first, CRISPR / Cas9 was used to delete IFNGR1 (encoding a subunit of the IFNγ receptor) from A549 cells, resulting in a pool of cells unable to sense IFNγ (Figure 2A) ; ; second, histone H2B-GFP and H2B-mCherry fusion proteins in wild-type (WT) and IFNGR1-deficient A549 cells were expressed, respectively; third, the two engineered cell populations were mixed at a 1: 1 ratio, treated them with IFNγ and small molecules (81845 compounds, each at 10 μM) from an in-house chemical library, and monitored the changes in the ratio of green to red nuclei four days later (Figure 1A) .

[0212] Three compounds –acepromazine (hereafter referred to as ACE) , acetophenazine, and piperacetazine over ～80,000 small drug-like molecules (at 10 μM) , were identified to selectively reduce the fitness of WT A549 cells relative to IFNGR1-deficient cells (indicated by reduced ratios of green to red nuclei) (Figure 1B to Figure 1D) . The three hit molecules share a common acetyl-substituted phenothiazine core linked to different amine-containing moieties by a propyl chain (Figure 1C) . By measuring A549 viability, the enhancement of ACE cytotoxicity were found with both IFNγ and interferon beta (IFNβ) , but not with tumor necrosis factor alpha (TNFα) (Figure 1E) . The natural killer (NK) cell line NK92-MI, which secretes IFNγupon encountering with cancer cells, were utilized to mimic the sources of IFNγ production in the tumor microenvironment. ACE cytotoxicity against A549 cells were enhanced by coculturing with NK92-MI. Such enhancement was lost in IFNGR1-deficient A549 cells (Figure 1F-Figure 1G and Figure 2B) .

[0213] ACE is an antipsychotic drug used in humans during the 1950s, but is currently used only as a sedative in veterinary medicine. The behavioral effect of ACE is primarily attributed to antagonism of post-synaptic dopamine receptors. However, chlorpromazine (Figure 2C) , a closely related analog that is still used as an antipsychotic drug in humans, but, unlike acepromazine, acetophenazine, and piperacetazine, does not share the carbonyl group on the tricyclic fused ring, did not display interferon-enhanced anticancer activity (Figure 2D) .

[0214] Similar assays were conducted to examine the cytotoxicity for six cancer cell lines (two cervical cancer cell lines, i.e., HeLa and SiHa; one liver cancer cell line, i.e., HuH-7; one lymphoma cell line, i.e., Mino; one colorectal cancer cell line, i.e., DLD-1; and one cervical cancer cell line, i.e., ME-180) , one normal cell line, and activated T lymphocytes from two healthy donors. IFNγ-enhanced cytotoxicity was observed in two cervical cancer cell lines (HeLa and SiHa) and one liver cancer cell line (HuH-7) . In contrast, no IFNγ-enhanced cytotoxicity was observed in one lymphoma cell line (Mino) , one colorectal cancer cell line (DLD-1) , and one cervical cancer cell line (ME-180) . Moreover, the non-cancerous keratinocyte cell line HaCat and activated T lymphocytes from healthy donors were also resistant to IFNγ-enhanced ACE cytotoxicity. These data, taken together, revealed that ACE possesses an interferon-enhanced anticancer activity in a subset of cancer cell lines.

[0215] Moreover, ACE-sensitive cancer cell lines did not express dopamine receptors (Figure 2E) . These findings indicated that ACE exerts its anticancer activity independent of dopamine receptors.

[0216] Example 2: Metabolic activation of acepromazine underlies its selective anticancer activity

[0217] Sensitive cell line A549 was treated with ACE and then the insensitive cell line DLD-1 was treated with the conditioned medium as shown Figure 3A. The results found that untreated ACE was not toxic to DLD-1, while ACE following A549 conditioning exhibited potent cytotoxicity. Heating did not inactive the cytotoxic activity in the conditioned medium, suggesting that the active ingredient is a small-molecule metabolite (Figure 3B) . The total metabolites were thus extracted from conditioned medium of both ACE-sensitive and insensitive cell lines and resolved them on thin-layer chromatography (TLC) . Ultraviolet-light illumination of TLC revealed time-dependent conversion of ACE into a slower-migrating species in sensitive cell lines (A549 and HeLa) , but not in insensitive cell lines (DLD-1 and HCT-116) (Figure 3C) .

[0218] As the carbonyl group of ACE is known to be susceptible to reduction to ACE-OH (hydroxyethylpromazine) , ACE-OH was prepared in the lab and used as a reference. The migration pattern of the slower migrating species matched ACE-OH (Figure 3C) . Moreover, liquid chromatography–mass spectrometry analyses confirmed the new species differed from ACE by 2 Daltons, corresponding to the addition of two hydrogen atoms (Figure 4A-Figure 4B) . These results revealed selective conversion of ACE into ACE-OH by sensitive cancer cell lines.

[0219] The conversion of ACE into ACE-OH created a chiral center. As enantiomers of chiral drugs can have reduced, no, or even deleterious effects, the ACE-OH racemic mixture, obtained by reduction of ACE with LiAlH4, was resolved into two enantiomer fractions by chiral column chromatography (Figure 3D) . By chemical derivation to facilitate crystallization followed by X-ray diffraction, the absolute conformations and optical activities of the two enantiomers were determined to be (S) - (-) -ACE-OH and (R) - (+) -ACE-OH (Figure 4C-Figure 4D) . A549 and DLD-1 cells were treated with the purified ACE-OH enantiomers, i.e, (S) - (-) -ACE-OH and (R) - (+) -ACE-OH. (S) -ACE-OH displayed IFNγ-enhanced toxicity to both cell lines. In contrast, (R) -ACE-OH was inactive in either cell line (Figure 3E) . Taken together, (S) -ACE-OH was the active metabolite of ACE.

[0220] The aldo-keto reductase (AKR) family of enzymes catalyze the reduction of ketones to alcohols. The expression levels of genes encoding aldo-keto reductases were compared in ACE-activating versus non-activating cell lines and high levels of AKR1C1, AKR1C2, and AKR1C3 were found to be associated with ACE activation (Figure 3F) . AKR1C1, AKR1C2, or AKR1C3 were individually expressed into DLD-1 cells and they were all found to enable DLD-1 to convert ACE into ACE-OH (Figure 3G) . Moreover, expression of AKR1C1, AKR1C2, or AKR1C3 rendered DLD-1 cell more sensitive to ACE (Figure 3H) . Similar results were obtained in another ACE-insensitive cell line ME-180 (Figure 4E-Figure 4F) . Notably, AKR1C1 / 2 / 3 are overexpressed in cholangiocarcinoma, liver hepatocellular carcinoma, and lung squamous cell carcinoma, but not in normal tissues (Figure 4G) . These observations not only explain the observed anticancer selectivity of ACE, but also suggest that activation of ACE by tumor-associated AKR1C1 / 2 / 3 could be a strategy to enrich cytotoxic metabolites in tumors.

[0221] Example 3: Interferon-induced TRIM21 mediates the anticancer activity of acepromazine

[0222] The mechanism by which interferons enhance ACE’s anticancer activity was investigated in this Example. Pooled genome-wide CRISPR-Cas9 knockout screening was performed by targeting 19, 114 genes with four individual sgRNAs per gene. SgRNA-transduced A549 cells were treated with either IFNγ or IFNγplus a sub-lethal dose of ACE for three weeks. Afterwards, genomic DNAs were isolated from surviving cells and performed next-generation sequencing to measure the abundance of each sgRNA. Using the MAGeCK algorithm, six top-ranking enriched genes were found, included five involved in IFNγ sensing and signal transduction (IFNGR1, IFNGR2, JAK1, JAK2, and STAT1) as well as TRIM21 (Figure 5A-Figure 5B) .

[0223] TRIM21 encodes a tripartite motif-containing E3 ubiquitin ligase, whose expression is induced by interferons. Western blotting of A549 lysates confirmed that TRIM21 was induced by IFNβ or IFNγ, but not by TNFα (Figure 5C) .

[0224] The following assay of this example confirmed that interferons enhance ACE’s anticancer activity were by inducing the expression of TRIM21. Two A549 TRIM21- / -clones were generated. In addition, TRIM21 was overexpressed in A549 cells (TRIM21OE) to mimic interferon-induced expression of TRIM21 (Figure 5D) . The measured cell viability shown that loss of TRIM21 rendered A549 cells resistant to ACE, whereas TRIM21OE resulted in enhanced sensitivity to ACE overriding the effect of IFNγ (Figure 5E) . Similar results were obtained in two additional ACE-sensitive cell lines (SiHa and HuH-7) (Figure 6A-Figure 6B) . These results confirmed that interferon-induced TRIM21 mediated the anticancer activity of ACE.

[0225] TRIM21 is an innate immune sensor, which recognizes cytosolic antibody-coated viruses to trigger antiviral responses. The C-terminal PRYSPRY domain of TRIM21 has a hydrophobic pocket that binds the fragment crystallizable (Fc) region of antibodies (Figure 5F) . Three residues in this pocket important for Fc binding were selected and expressed their alanine substitution mutants (D355A, W381A, and W383A) in TRIM21- / -cells (Figure 5G) . The W381A and W383A mutants could not restore ACE sensitivity. In contrast, the D355A mutant displayed increased ACE sensitivity in comparison to WT TRIM21 (Figure 5H) . The identification of both loss-and gain-of-activity mutations suggests that this pocket in TRIM21PRYSPRY is involved in the protein-compound or protein-protein interactions that mediates ACE activity.

[0226] Example 4: Acepromazine induces TRIM21-dependent degradation of nuclear pore proteins

[0227] This example confirmed that ACE functions by directing TRIM21 to degrade some proteins required for cell viability since TRIM21 possesses an N-terminal RING domain with E3 ubiquitin ligase activity.

[0228] Each of the following nuclear pore proteins, i.e., GLE1, NUP35, SMPD4, NUP155, NUP214, AAAS, NUP88, NUP210, were found to be degraded at least 50%during the course of period of 4, 6, 8, 12 hours treated by ACE. Specifically, label-free quantitative proteomics was used to compare the proteomes of A549 TRIM21 (D355A) OE cells treated with vehicle or ACE (Figure 7A) . Among the above list, several nuclear pore proteins-NUP35, NUP155, SMPD4, and GLE1-were found to be significantly depleted following ACE treatment.

[0229] This phenomenon was also observed in ACE-sensitive cell lines, but not in cell lines that are ACE-insensitive or TRIM21-deficient (Figure 8A-Figure 8B) .

[0230] Moreover, inhibition of the proteasome (by bortezomib treatment) or the E1 ubiquitin activating enzyme (by TAK243 treatment) prevented ACE-induced depletion of these proteins (Figure 7B and Figure 8C) . The following part confirms that ACE-OH did induce the degradation of nuclear pore proteins in a stereo-selective manner since ACE is an inactive prodrug and only its metabolite (S) -ACE-OH has anticancer activity. Indeed, (S) -ACE-OH but not (R) -ACE-OH triggered the degradation of NUP35, NUP155, SMPD4, and GLE1 in IFNγ-stimulated A549 cells (Figure 7C) .

[0231] The nuclear pore complex (NPC) is composed of ～1000 building blocks assembled from copies of ～30 proteins and organized as three stacked rings (the inner, cytoplasmic, and nuclear rings) flanked by cytoplasmic filament and nuclear basket (Figure 7D) . By monitoring the abundance of each nuclear pore protein in ACE-treated A549 cells over time, the inner ring of NPC was found to be depleted rapidly (as short as four hours post ACE treatment) , followed by the depletion of subunits from the cytoplasmic ring. Subunits specific to the nuclear ring and nuclear basket was not depleted over the 12-hour window (Figure 7D-Figure 7E) . Consistent with the degradation of NPC subunits, high-resolution imaging by transmission electron microscopy revealed the distortion and fragmentation of nuclei in ACE-treated A549 cells (Figure 7F) . Moreover, in A549 cells expressing GFP-tagged TRIM21 and NES (nuclear export signal) -tagged mCherry, ACE treatment resulted in the entrance of both proteins into the nucleus, consistent with the impairment of NPC function. ACE-dependent mis-localization of TRIM21-mEGFP and NES-mCherry could be rescued by bortezomib treatment (Figure 7G) . Taken together, these results show that ACE directs the recruitment of TRIM21 from the cytosol to attack the inner ring of NPC.

[0232] The model of ACE-induced recruitment of TRIM21 to the NPC was confirmed by the expression of TRIM21 fused with the biotin ligase TurboID in A549 cells, which converts biotin into the reactive intermediate biotin–AMP to covalently label proteins proximal to TRIM21 (Figure 7H) . Cells were treated with only biotin or biotin plus ACE, and then used streptavidin beads to capture biotinylated proteins. Label-free quantitative proteomics revealed that the ACE-treated group enriched NUP35, NUP54, NUP58, and GLE1 (Figure 7I) . Notably, NUP35 and GLE1 were also the top depleted proteins following ACE treatment. These results, taken together, demonstrate that ACE induces the recruitment of TRIM21 to the vicinity of the NPC to trigger the degradation of nuclear pore proteins.

[0233] Example 5: NUP98 is the primary targeting site of acepromazine

[0234] The following assay confirmed that the degradation of nuclear pore proteins is attributed to ACE cytotoxicity since NPCs are the essential gateways connecting the nucleoplasm and cytoplasm. Mutations in the NPC that could render cells resistant to ACE were identified. The recently described CRISPR-suppressor scanning method was used by designing a pool of tilling sgRNAs targeting the entire coding sequences of 27 nuclear pore proteins (except the nuclear ring-specific subunits) , enabling the generation of large numbers of diverse nuclear pore protein variants in situ by the Cas9 nuclease (Figure 9A) . A549-Cas9 cells transduced with the tilling sgRNA library were then cultured in the absence or presence of ACE for three weeks. Next generation sequencing revealed the enrichment of sgRNAs targeting amino acids E721, K750, K752, and F777 in NUP98, forming a hotspot in the ACE-treated group (Figure 9B) .

[0235] NUP98 is a nuclear pore protein synthesized as a NUP98-NUP96 precursor, which undergoes autoproteolysis by its autoproteolytic domain (NUP98APD) . The identified hotspot associated with ACE-resistance fell within NUP98APD (Figure 9C) . The underlying mechanism of resistance was further resolved by transducing A549-Cas9 cells with the most enriched sgRNA (targeting K752) and selected five resistance clones following ACE treatment (Figure 9D-Figure 9E) . Sequencing of NUP98 cDNA flanking the sgRNA cut site revealed the skipping of a short exon, resulting in the deletion of a segment in NUP98APD (Figure 10A-Figure 10B) . Western blotting of these resistant clones revealed the disappearance of NUP98 and the appearance of a protein larger than 180 KDa, suggesting the impairment of NUP98-NUP96 autoproteolytic processing (Figure 9F) . In one of the resistant clones, ACE did not induce TRIM21 to the vicinity of the NPC to degrade nuclear pore proteins (Figure 9G and Figure 10C) .

[0236] How impaired NUP98-NUP96 processing could evade TRIM21 recognition to render ACE resistance was further explored. The complex organization of the NPC poses a challenge for detailed structure-function analysis. A degron assay was designed by taking advantage of the promyelocytic leukemia (PML) nuclear bodies, which are subnuclear structures formed via phase separation. PML-GFP expression resulted in bright nuclear foci that were easily visualized by high-content imaging. 13 proteins were identified in the vicinity of NUP98 within the NPC and generated PML-GFP fusions of 32 fragments corresponding to these 13 proteins, including NUP35, NUP88, NUP93, NUP96, NUP98, NUP155, NUP160, NUP188, NUP205, NUP214, AAAS, GLE1, and SPMD4 (Figure 9H) . By high content imaging, PML-GFP-NUP98domain 2 stood out as most sensitive to ACE-mediated degradation (Figure 9H and Figure 9I) . The minimal degron was narrowed down By truncation analysis to amino acid positions 733-880 that resides in NUP98APD (Figure 9I and Figure 10D) . Thus, CRISPR-suppressor screening and PML-GFP-degron assay converged to the same APD domain in NUP98, indicating NUP98 as the primary target of acepromazine.

[0237] Example 6: Crystal Structures of TRIM21PRYSPRY in complex with acepromazine and its metabolites

[0238] The PRYSPRY domain of WT and D355A mutant TRIM21 were purified to further explore the mechanism of action of ACE and its metabolites at the molecular level. Isothermal titration calorimetry (ITC) revealed modest binding affinities of ACE (dissociation constant / Kd: 5.66 μM) , (R) -ACE-OH (Kd: 9.11 μM) , and (S) -ACE-OH (Kd: 17.9 μM) to TRIM21PRYSPRY (D355A) (Figure 11A) . No binding signal was detected with WT TRIM21PRYSPRY up to 50 μM of titrated compounds (ACE) . Microscale thermophoresis (MST) was then used to complement ITC findings and observed weak binding of ACE (Kd: 44.6 μM) and (S) -ACE-OH (Kd: 237.3 μM) to WT TRIM21PRYSPRY (Figure 12A) . No binding of (R) -ACE-OH to WT TRIM21PRYSPRY was detected by MST. These biophysical measurements revealed weak binding of ACE and its metabolites to TRIM21PRYSPRY, which alone could not explain why (S) -ACE-OH was active whereas ACE and (R) -ACE-OH were inactive.

[0239] The co-crystal structures of TRIM21PRYSPRY (D355A) in complex with ACE, (S) -ACE-OH and (R) -ACE-OH were then determined with resolutions of  and  respectively (Figure 11B-11E and Figure 12B) . These structures revealed that the tricyclic phenothiazine rings of these ligands occupy a shallow hydrophobic pocket formed by Y328, M330, A335, L371, W383 and F450. The oxygen atom in the acetyl group or hydroxyl group of the ligands acts as a hydrogen bond acceptor, interacting with the backbone of L371 (Figure 11F-11H) . Notably, the aliphatic chain of the ligands exhibits flexibility, resulting in different orientations of the amine group. In the case of ACE and (R) -ACE-OH, the amine group extends outside the pocket, while in the case of (S) -ACE-OH, it forms polar interactions with the side chains of E389 and Q395 (Figure 11I) . As (S) -ACE-OH is the active metabolite with degrader activity, these structural observations suggest that the side chain conformation of these ligands is a critical determinant of degrader activity.

[0240] Example 7: TRIM21-directed PROTACs selectively degrade multimeric proteins in biomolecular condensates

[0241] The co-crystal structures of TRIM21PRYSPRY (D355A) in complex with ACE revealed the aliphatic chain as a potential exit vector for PROTAC design. A TRIM21-based PROTAC (TrimTAC1) was prepared by linking ACE and JQ1 (ahigh affinity binder of BRD4) with a three-carbon aliphatic chain (Figure 13A and Example 8) . dBET1 (CAS: 1799711-21-9, purchased from TargetMol) , which is a CRBN-based PROTAC targeting BRD4, was used as a positive control.

[0242] The PROTAC activity of TrimTAC1 was evaluated by stably expressing an mEGFP-tagged variant of the second bromodomain of BRD4 (BRD4BD2) together with TRIM21 (D355A) or CRBN in A549 cells to provide cell models. While dBET1 potently (half-maximal degradation concentration / DC50: 31 nM) degraded mEGFP-BRD4BD2, TrimTAC1 was inactive in degrading mEGFP-BRD4BD2 at concentrations up to 100 μM (Figure 13B-13C) .

[0243] TRIM21 has been exploited in the Trim-Away technology, which uses antibodies to direct TRIM21 to degrade intracellular proteins. A recent follow-up mechanistic study revealed that target-induced clustering triggers intermolecular dimerization of the RING domain of TRIM21 to switch on its ubiquitination activity. Moreover, the distances between adjacent NUP98APD in the dilated and constricted NPCs are 28.2 nm and 23.7 nm, respectively, which is compatible with TRIM21 clustering (Figure 9K) . The following assay confirmed that TRIM21-directed PROTACs could drive selective degradation of target proteins present in multimeric assemblies that permits the dimerization of TRIM21 RING domains.

[0244] The N-terminal FG (phenylalanine-glycine) repeat domain of NUP98 was fused to the mEGFP-BRD4BD2 reporter. The resulting fusion protein (NUP98FG-mEGFP-BRD4BD2) formed nuclear condensates in A549 cells, which were efficiently and rapidly degraded by both TrimTAC1 and dBET1 when TRIM21 (D355A) or CRBN were respectively expressed (Figure 13B-13D) . Pretreating cells with inhibitors targeting the proteasome (bortezomib) or the E1 ubiquitin activating enzyme (TAK243) prevented TrimTAC1-induced degradation of NUP98FG-mEGFP-BRD4BD2 nuclear condensates (Figure 13E and Figure 14A) .

[0245] To avoid over-reliance on JQ1, a second TRIM21-based PROTAC was synthesized, i.e., TrimTAC2 based on SLF (Synthetic Ligand of FKBP12) (Figure 13F and Example 9) . TrimTAC2 efficiently degraded the NUP98FG-mEGFP-FKBP12 condensates without affecting the soluble mEGFP-FKBP12 (Figure 14B-Figure 14E) .

[0246] mEGFP-FKBP12 was fused to three additional condensate-forming proteins: PML (PML-NB) , Coilin (Cajal bodies) , and NPM1 (nucleolus) to further test the generalizability of TrimTACs to degrade proteins present in biomolecular condensates. mEGFP-FKBP12 was fused to the kinases CDK4 and BTK as examples of non-condensate proteins. In A549 cells expressing TRIM21 (D355A) , TrimTAC2 degraded condensate-forming fusion proteins (PML, Coilin, and NPM1) , but did not degrade fusion proteins that do not form condensates (CDK4 and BTK) (Figure 13G) . Taken together, these results indicate that TRIM21-directed PROTACs possess the unique ability to degrade proteins in biomolecular condensates sparing proteins in the dilute phase.

[0247] Example 8: Preparation of TrimTAC1

[0248] 0. Preparation of compound 8

[0249] 0.1 Synthesis of compound 7

[0250] To a solution of hydridosodium (1.11 g, 27.8 mmol) in DMF (80 mL) was added 1- (10H-dibenzo [2, 1-b: 1', 2'-e] [1, 4] thiazin-2-yl) ethan-1-one (5.61 g, 23.2 mmol) and 2- [ (3-bromopropyl) oxy] tetrahydropyran (6.73 g, 30.1 mmol) at 0 ℃. The mixture was kept at this temperature for 5 h. The reaction mixture was poured into ice-water (100 mL) and extracted with EtOAc (100 mLx2) . The combined organic layer was washed with brine (100 mL) for 3 times, dried over Na2SO4 and filtered. The filtrate was concentrated to give a residue. Then the crude was dissolved in MeOH (100 mL) . TsOH, H2O (2.2 g, 11.6 mmol) was added and the mixture and stirred for another 3 h at 25℃. The solvent was removed and the residue was purified by silica gel chromatography (EtOAc / petroleum ether = 1 / 2) to give 7 (3.43 g, 11.41 mmol, 48.9 %) was obtained as white solid. MS (ESI) : m / z = 300.2.

[0251] 0.2 Synthesis of compound 8

[0252] To a solution of 7 (1.83 g, 6.01 mmol) , 4- (dimethylamino) pyridine (0.15 g, 1.2 mmol) in DCM (50 mL) was added 4-methylbenzenesulfonyl chloride (1.38 g, 7.22 mmol) followed by triethylamine (1.25 mL, 9.02 mmol) at 0 ℃. The mixture was warmed to 25 ℃ and stirred for 15h. After 7 was consumed, the solution was poured into ice-water (25mL) and extracted with DCM (50mLx2) . The combined organic layer was washed with citric acid (50 mL) and brine (50 mL) , dried over Na2SO4 and filtered. The filtrate was concentrated to give a residue, which was purified by silica gel chromatography (EtOAc / petroleum ether =1 / 5) to give 8 (2.33 g, 5.08 mmol, 88.7%) as yellow oil. MS (ESI) : m / z = 454.2.

[0253] 1. Synthesis of compound 10

[0254] To a solution of 8 (453 mg, 1 mmol) in ACN (20 mL) was added tert-butyl (3- (piperazin-1-yl) propyl) carbamate (316 mg, 1.3 mmol) followed by potassium carbonate (276.05 mg, 1.997 mmol) at 25℃. The mixture was stirred at 85℃ for 15h. The reaction mixture was filtered. The filtrate was concentrated to give a residue, which was purified by flash column (MeOH / DCM = 1 / 20) to give 10 (491 mg, 0.49 mmol, 48.9%) was obtained as white solid. MS (ESI) : m / z = 525.2.

[0255] 2. Synthesis of compound 11

[0256] To a solution of 10 (277 mg, 0.49 mmol) in DCM (3 mL) was added hydrogen chloride (2 mL, 8.0 mmol) at 0℃. The mixture was stirred at 25℃ for 2h. Afte 10 was consumed, the solvent was poured out, and the residue was freeze-dried to give 11 (crude) white solid. MS (ESI) : m / z = 425.2.

[0257] 3. Synthesis of TrimTAC1

[0258] To a solution of 11 (crude, 0.49 mmol) , JQ-1 (196 mg, 0.49 mmol, IUPAC name:

[0259] (S) -tert-butyl 2- (4- (4-chlorophenyl) -2, 3, 9-trimethyl-6H-thieno [3, 2-f] [1, 2, 4] triazolo [4, 3-a] [1, 4] diazepin-6-yl) acetate, CAS: 1268524-70-4, purchased from Macklin) and DIPEA (0.161 mL, 0.973 mmol) in DMAc (5 mL) was added HATU (322 mg, 0.85 mmol) at 0℃. The mixture was warmed to 25 oC and stirred for 1hr. After 11 was consumed, the reaction mixture was poured into ice-water (25mL) and extracted with EtOAc (20mLx3) . The combined organic layer was washed with brine (10 mL) for 3 times, dried over Na2SO4 and concentrated, the crude was purified by silica gel chromatography (DCM / MeOH =1 / 13) to give TrimTAC1 (153 mg, 0.19 mmol, 38.7%for 2 steps) as white solid. MS (ESI) : m / z = 807.2.1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.56 (d, J = 8.0 Hz, 1H) , 7.49 (d, J = 8.5 Hz, 2H) , 7.45 –7.40 (m, 3H) , 7.35 –7.14 (m, 3H) , 7.13 –6.93 (m, 2H) , 4.50 (t, J = 7.2 Hz, 1H) , 4.08-3.94 (m, 2H) , 3.65-3.57 (m, 2H) , 3.27 –3.20 (m, 2H) , 3.15-3.09 (m, 3H) , 2.69 –2.65 (m, 2H) , 2.62 –2.55 (m, 8H) , 2.41 (s, 3H) , 2.37 –2.31 (m, 2H) , 1.79-1.73 (m, 2H) , 1.62 (s, 3H) , 1.26 –1.24 (m, 4H) .

[0260] Example 9: Preparation of TrimTAC2

[0261] 1. Synthesis of compound 13

[0262] To a solution of 8 (500 mg, 1.1 mmol) and K2CO3 (305 mg, 2.2 mmol) in ACN (20 mL) was added tert-butyl (2- (2- (2- (piperazin-1-yl) ethoxy) ethoxy) ethyl) carbamate (524 mg, 1.65 mmol) . The mixture was stirred at 25℃. The mixture was stirred at 85℃ for 15 h. The reaction mixture was filtered. The filtrate was concentrated to give a residue, which was purified by flash column (MeOH / DCM = 1 / 20) to give 13 (484 mg, 0.81 mmol, 73.1%) was obtained as white solid. MS (ESI) : m / z = 599.2, [M+H] +.

[0263] 2. Synthesis of compound 14

[0264] To a solution of 13 (484 mg, 0.81 mmol) in DCM (5 mL) was added hydrogen chloride (3 mL, 12 mmol, 4 M 1, 4-dioxane) at 0℃. The mixture was stirred at 25℃ for 2h. After13 was consumed, the solvent was poured out, and the residue was dissolved in water (5 mL) . The mixture was adjust pH to 8 with 2 M NaHCO3aq. And the solvent was poured out and the residue was freeze-dried to give 14 (229 mg, 0.46 mmol, 56.9%) as white solid. MS (ESI) : m / z = 499.2, [M+H] +.

[0265] 3. Synthesis of compound 15

[0266] To a solution of 14 (229 mg, 0.46 mmol) in DCM (5 mL) was added glutaric anhydride (52 mg, 0.46 mmol) and DIPEA (177 mg, 1.37 mmol) . The mixture was stirred at 25 ℃ for 1 h. Water (50 mL) was then added and the reaction mixture stirred for another 30 minutes. The reaction mixture was concentrated. The residue was purified by Pre-HPLC to give 15 (159.4mg, 0.26 mmol, 57.7%) as colorless oil. MS (ESI) : m / z =613.2, [M+H] +.

[0267] 4. Synthesis of TrimTAC2

[0268] 15 (104 mg, 0.17 mmol) , COMU (145 mg, 0.34 mmol, with the chemical name of (1-Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidenaminooxy) dimethylaminomorpholinocarbenium Hexafluorophosphate and CAS: 1075198-30-9) , and N-methylmorpholine (34 mg, 0.34 mmol, ) were dissolved in DMF (2 mL) and incubated for 1 min. SLF (96 mg, 0.18 mmol, with the chemical name of 1- (3, 3-dimethyl-1, 2-dioxopentyl) - (2S) -2-piperidinecarboxylic acid, (1R) -1- (3-aminophenyl) -3- (3, 4-dimethoxyphenyl) propyl ester, and CAS: 195513-96-3) and catalytic 4-dimethylaminopyridine were added in DMF (1 mL) and the reaction was stirred at 25 ℃ for 2h. The reaction was diluted to 1 mL with water / acetonitrile / formic acid (50 / 50 / 0.1) and purified by Pre-HPLC to afford TrimTAC2 (61 mg, 0.055 mmol, 33.5%) as white solid. MS (ESI) : m / z = 1120.2, [M+H] +. 1H NMR (400 MHz, cdcl3) δ 9.03 (d, J = 15.4 Hz, 1H) , 7.69 –7.57 (m, 2H) , 7.50 –7.40 (m, 2H) , 7.25 –7.14 (m, 4H) , 7.11 (d, J = 7.4 Hz, 1H) , 7.01 –6.91 (m, 2H) , 6.87 (d, J = 8.0 Hz, 1H) , 6.79 –6.74 (m, 1H) , 6.70 –6.65 (m, 2H) , 5.80 –5.67 (m, 1H) , 4.05 –3.93 (m, 3H) , 3.85 (s, 3H) , 3.84 (s, 3H) , 3.66 –3.52 (m, 9H) , 3.46 –3.40 (m, 2H) , 3.36 –3.29 (m, 1H) , 3.23 –3.17 (m, 1H) , 3.07 –2.70 (m, 10H) , 2.68 –2.45 (m, 9H) , 2.43 –2.32 (m, 3H) , 2.27 –2.16 (m, 1H) , 2.11 –1.99 (m, 5H) , 1.78 –1.60 (m, 4H) , 1.28 –1.16 (m, 8H) , 0.88 (t, J = 7.5 Hz, 3H) .

[0269] Example 10: chiral synthesis of compound 5 and determination of the absolute configuration of ACE-OH

[0270] Compound 1 (7 mg, 21.3 μmol, 1.0 equiv) in a flame-dried screw-capped culture tube was azeotropted with toluene for three times. To the above tube was sequentially added CH2Cl2 (0.21 mL) , triethylamine (5.8 μL, 42.7 μmol, 2.0 equiv) , p-bromobenzoyl chloride (9.4 mg, 42.7 μmol, 2.0 equiv) and DMAP (cat. a grain) at 0 ℃. Then the resulting mixture was stirred at room temperature for 1h under argon atmosphere before being quenched with saturated aq. NH4Cl. The reaction mixture extracted with dichloromethane (10 mL *3) . The combined organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure. Purification by preparative TLC (methanol : dichloromethane, 1: 20) to afford compound 2 (9.2 mg, 79%) as a white solid. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) : δ 7.89 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 7.58 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 7.23 –7.13 (m, 3H) , 7.08 –6.88 (m, 4H) , 6.00 (q, J = 6.9 Hz, 1H) , 4.10 (s, br, 2H) , 3.09 (t, J = 7.0 Hz, 2H) , 2.63 (s, 6H) , 2.38 (s, br, 2H) , 1.65 (d, J = 6.0 Hz, 3H) . 13C NMR (126 MHz, CD3OD) : δ 166.38, 146.66, 146.62, 142.70, 133.03, 132.27, 130.76, 129.15, 128.59, 128.39, 128.32, 126.72, 126.63, 123.82, 121.24, 117.08, 115.01, 74.68, 57.73, 46.02, 45.19, 25.37, 22.51. [α] 23.0 D = -72.28° (c = 0.184, MeOH) .

[0271] Compound 3 (7 mg, 13.7 μmol, 1.0 equiv) was dissolved in ethyl acetate (10 mL) and the solution was washed with saturated aq. K2CO3 (5 mL) . The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure to give the free tertiary amine as an oil. The free tertiary amine in a flame-dried screw-capped culture tube was azeotropted with toluene for three times. To the above tube was sequentially added CH2Cl2 (0.10 mL) and iodomethane (0.2 mL) at room temperature. Then the resulting mixture was stirred at room temperature under argon atmosphere for 30 min before being concentrated under reduced pressure to give crude compound 4 as a white solid. Purification by preparative reverse-phase HPLC (10%-95%CH3CN (containing 0.1%HCOOH) in water (containing 0.1%HCOOH) ) to afford compound 5 (4.2 mg, 54%) as a white solid. 1H NMR (500 MHz, CD3OD ) : δ 8.44 (s, 1H) , 7.94 (d, J = 8.0 Hz, 2H) , 7.68 (d, J = 8.5 Hz, 2H) , 7.25 (t, J = 7.5 Hz, 1H) , 7.19 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 7.12 (s. br, 2H) , 7.07 (d, J = 8.0 Hz, 1H) , 7.00 (t, J = 7.5 Hz, 1H) , 6.03 (q, J = 6.5 Hz, 1H) , 4.18 –4.04 (m, 2H) , 3.43 (t, br, J = 8.0 Hz, 2H) , 2.98 (s, 9H) , 2.25 (s, br, 2H) , 1.67 (d, J = 6.5 Hz, 3H) . 13C NMR (126 MHz, CD3OD ) : δ 168.90, 166.55, 146.28, 146.01, 143.08, 133.09, 132.23, 130.67, 129.27, 128.91, 128.79, 128.63, 127.38, 127.20, 124.43, 121.60, 117.34, 115.87, 74.96, 65.60, 53.55, 53.52, 53.49, 44.77, 22.41, 21.61. [α] 27.2 D = -91.67° (c = 0.084, MeOH) .

[0272] Note: crude compound 4 was used to obtained crystal directly. For characterization, the crude compound 4 was purified by preparative reverse-phase HPLC to give compound 5.

[0273] Data X-ray Crystallographic data for compound 4 is shown in Figure 4D.

[0274] Table 1. Crystal and refinement data for compound 3

[0275] Table 2. Atomic coordinates (*104) and equivalent isotropic displacement parameters for 3. U (eq) is defined as one third of the trace of the orthogonalized Uij tensor.

[0276] Based on the crystal and refinement data for compound 3, Compound 3 was determined to be configuration and thus the active metabolite of ACE is determined to be (S) - (-) -ACE-OH.

[0277] Example 11: (biological) materials, assays and methods used in the invention

[0278] Unless specified otherwise herein, the materials including chemical materials, biological materials, reagents are either commercially available or can be prepared by those skilled in the art according to known methods.

[0279] Unless specified otherwise herein, the assays and the methods, including those conditions employed by those assays or methods are known to those skilled in the art.

[0280] A. Cell culture

[0281] The human cell lines A549, HCT-116, HeLa, DLD-1 and HEK293T were gifts from Dr. Deepak Nijhawan’s lab at University of Texas Southwestern Medical Center. NK-92MI was a gift from Dr. Feng Shao from National Institute of Biological Sciences, Beijing. Mino was obtained from ATCC. SiHa, HuH-7, ME-180 and HaCaT were obtained from Cell Resource Center, Peking Union Medical College (Beijing, China) . All cell lines were confirmed to be mycoplasma free by PCR. Regular adherent cell culture methods were used to culture cells in tissue-culture incubators with 5%CO2 at 37℃. A549 and DLD-1 were grown in RPMI-1640 medium with 10%fetal bovine serum (FBS) and 2 mM L-glutamine. HCT-116, HEK293T, HeLa, SiHa, HuH-7, ME-180 and HaCaT cells were grown in DMEM medium with 10%FBS and 2 mM L-glutamine. NK-92MI cells were grown in alpha Minimum Essential Medium (MEM) supplemented with 0.2 mM inositol, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.02 mM folic acid, 10mM HEPEs, non-essential amino acid (NEAA) and 20%FBS.

[0282] B. Chemicals

[0283] Acepromazine (CAS: 3598-37-6) , Chlorpromazine (CAS: 69-09-0) , Bortezomib (CAS: 179324-69-7) , MLN4924 (CAS: 905579-51-3) , TAK243 (CAS: 1450833-55-2) , Biotin (CAS: 58-85-5) were purchased from TargetMol (Topscience, Shanghai, China) . All of these chemicals were prepared as 10 mM stocks in DMSO (CAS: 67-68-5) purchased from Solarbio Life Science, Beijing, China and further diluted in DMSO to the desirable concentrations.

[0284] C. Construction of reporter cell lines

[0285] Control sgRNA-H2B-GFP and IFNGR1 sgRNA-H2B-mcherry was cloned into the pLenti-U6-Puro backbone by replacing its multiple cloning site with sgRNA fused to H2B-GFP or H2B-mcherry. The resulting plasmid was packaged into lentivirus to transduce A549 cells. Stable cell lines were obtained by selection of transduced cells with 2 μg / ml of puromycin.

[0286] D. High-throughput small-molecule screening

[0287] A compound library with 81845 small molecules (Life Chemicals, Niagara-on-the-Lake, Canada) containing FDA-approved drugs were used in primary screening. The screening procedures were as follows. A549 control sgRNA-H2B-GFP cells and A549 IFNGR1 sgRNA-H2B-mcherry cells were mixed. Three thousand mixed cells in 50 μL of medium were plated per well in 384-well flat clear bottom white polystyrene TC-treated microplates (Corning, Corning, USA) and allowed to attach to plates overnight. Compounds from the screening library were added to the cells with Biomek FXP automated workstation at a final concentration of 10 μM. Seventy-two hours later, the images were collected with a PerkinElmer Opera LX high-content screening system following vendor instructions. The number of green and red cells were measured by columbus online analysis software.

[0288] E. NK killing assay

[0289] 10,000 A549 cells were seeded in 6-well plate. On the next day, the original medium is removed. NK-92MI cells were added to the target cells at various effector / target cell (E / T) ratios. DMSO or 10μM acepromazine were added to the cell at the same time. 48 hrs later, the cells were stained with crystal violet (Beyotime, Shanghai, China, C0121) for 20 min at room temperature, and then de-stained with water. Images were taken with VILBER FX7 imager.

[0290] To perform quantitative NK killing experiment with flow cytometry. WT A549 and IFNGR1 KO A549 cells, which are green and red respectively, were mixed equally and treated with acepromazine and different amount of NK cells. 48h later, the number of green and red cells were measured by flow cytometry.

[0291] F. Cell viability assay

[0292] Three thousand A549 cells in 100μL of medium were plated per well in 96-well flat clear bottom white polystyrene TC-treated microplates (Corning, Corning, USA) . Then cells were dosed with a serial dilution of compounds with a D300e digital dispenser (Tecan,  Switzerland) . Cell survival was measured 72 hr later using CellTiter-Glo luminescent cell viability assay kit (Promega, Madison, USA) according to the manufacturer’s instructions. Luminescence was recorded by EnVison multimode plate reader (PerkinElmer, Waltham, USA) . IC50 was determined with GraphPad Prism using baseline correction (by normalizing to DMSO control) , the asymmetric (four parameters) equation, and least squares fit.

[0293] G. LC-MS

[0294] Stock standard solutions of acepromazine and acepromazine-OH at 1 mM was used to prepare working standard solutions of 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 nM by serial dilution in methanol / water (1: 1) . Biological samples were resuspended with 1 mL methanol / water (1: 1) . The standard solutions and biological samples were transferred to 250 μL inserts in auto-sampler vials for analysis. The standards and samples were analyzed using an Agilent 1290 infinity UHPLC system coupled to an Agilent 6495 triple quadrupole mass spectrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) , employing the ESI source. A Zorbax Eclipse Plus C18 column (2.1 mm x 50 mm, 1.8 μm; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) was used for separation. The injection volume was 2 μL. The mobile phases consisted of 0.1%formic acid in water (A) and 0.1%formic acid in acetonitrile (B) . The following gradient was applied: 0-1 min, 5%B; 1-4 min, 5-95%B; 4-5 min, 95%B; 5-5.01 min, 95-5%B; 5.01-7 min, 5%B. The flow rate was 0.3 mL / min and the column temperature was 35 ℃. The mass spectrometer was operated in multiple reaction monitoring (MRM) mode and in positive ESI mode. For the analysis of acepromazine and acepromazine-OH, MRM transitions of m / z 327.2→86.1 (CE 19 V) and 329.2→328.7 (CE 3V) were monitored, respectively. The dwell time was 200 ms.Absolute concentrations of acepromazine and acepromazine-OH were calculated using Agilent Mass Hunter Quantitative Analysis B. 07.00 software.

[0295] H. Genome-wide CRISPR screening

[0296] In total, 2.6 *106 A549-cas9 cells were infected with Brunello CRISPR sgRNA library at a multiplicity of infection (MOI) of ～0.3 with 100*coverage. Twenty-four hours after infection, the cells were reseeded and selected with 2 μg / ml puromycin for 3 days. The cells were then divided into four groups: untreated, IFNγ, ACE, and IFNγ combined with ACE. The concentrations were increased in a gradient to ensure that the number of cells remained basically the same. After 4 weeks culture, harvest cell and extracted genomic DNA as previously described. DNA fragments containing sgRNA sequences were amplified from isolated genomic DNA by two rounds of PCR using NEBNext Ultra II Q5 master mix (NEB, Ipswich, USA) . For the first round of PCR, twenty 25-μl PCR reactions (each containing 2.6 mg of genomic DNA template) were performed with the forward primer NGS-Lib-KO-Fwd-1 (5’ CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGA CGAAACACC 3’ ) and the reverse primer NGS-Lib-KO-Rev-0 (5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAA-3’) with a thermal cycler program consisting of initial denaturation at 98℃ for 5 min, followed by 19 cycles of (98℃ denaturation for 10 s, 69℃ annealing for 30 s, and 65℃ extension for 45 s) , and a final extension at 65℃ for 5 min. Products of the first-round PCR were pooled and purified by a DNA clean and concentrator kit (Zymo, Irvine, USA) and diluted to 2 ng / mL. For the second round of PCR, eight 25-μl PCR reactions (each containing 2 ng of the purified first-round PCR product) were performed for each sample with the indexed forward primer NEBNext i5 Primer (5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-8-nucleotide index -ACACGACGCTCTTCCGATCT-3’) and indexed reverse primers NEBNext i7 Primer (5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-8-nucleotide index-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’) . The same cycling conditions were used for second-round PCR as the first-round PCR except 10 cycles were used. Products of the second-round PCR reactions were subjected to electrophoresis on a 2%agarose gel. The expected ～300 bp amplicons were excised and extracted from the gel and sequenced by Illumina HiSeq PE150 (Berry Genomics, Beijing, China) . Raw sequencing data have been deposited to (data) . CRISPR screening data were analyzed by MAGeCK (v0.5.9.2) as previously described.

[0297] I. Western blotting

[0298] Cells were washed with DPBS to remove residual medium and then lysed in SDS lysis buffer (20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 1%SDS, pH 8.0) containing 0.5 units / μl benzonase, EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche, Basel, Switzerland) . The protein lysates were centrifuged (12000 g, 10 min, 4℃) , and the concentration of the supernatants was determined using the BCA Protein Assay. Between 5 μg and 30 μg of protein from the samples was separated on a 4%-20%gradient SDS–PAGE gel and transferred to nitrocellulose membranes with a pore size of 0.5 microns. The membranes were blocked in 5%nonfat milk PBST solution (0.1%v / v Tween-20) for 30 min and then were sequentially incubated with the primary antibody overnight at 4 ℃ and the secondary antibody at room temperature for 1 h. The primary antibodies used are as follows: rabbit polyclonal anti-Stat1 (1: 5,000, Cell Signaling Technology, 9172) , rabbit monoclonal anti-Phospho-Stat1 (1: 5,000, Cell Signaling Technology, 7649) , mouse monoclonal anti-Flag-HRP (1: 10000, Sigma-Aldrich, A8592) , mouse monoclonal anti-β-actin-HRP (1: 10,000, Huaxingbio, HX18271) , rabbit monoclonal anti-TRIM21 (1: 5000, Abcam, AB207728) , rabbit polyclonal anti-GLE1 (1: 5000, ABclonal, A13207) , anti-SMPD4 (1: 5000, ABclonal, A15473) , anti-NUP35 (1: 5000, ABclonal, A12762) , anti-NUP98 (1: 5000, ABclonal, A0530) . The secondary antibody used is goat polyclonal anti-rabbit IgG(1: 10,000, Cell Signaling Technology, 7074) . M5 HiPer ECL Western HRP Substrate (Mei5bio, Beijing, China) was used for the detection of HRP enzymatic activity. Western blot images were taken with a VILBER FUSION FX7 imager.

[0299] J. Quantitative mass spectrometry

[0300] A549 cells were treated with 10 μM acepromazine or DMSO for 6 h in triplicates, followed by quantitative proteomics analysis (Deep kinase, Beijing, China) . In brief, cell pellets were lysed with lysis buffer (8 M urea, 50 mM Tris-HCl, 1%Triton X-100, pH=7.4) containing protease and phosphatase inhibitors (Catalog #539134, Merck; Catalog #524625, Merck) . Protein concentration was determined using the Pierce BCA Protein Assay Kit (Catalog #23225, Thermo Scientific) . Cell lysates were reduced with 10 mM dithiothreitol (DTT) , alkylated with 40 mM iodoacetamide (IAM) , then quenched with 5 mM dithiothreitol (DTT) . Alkylated samples were cleaned up using the SP3 method. All LC-MS / MS experiments were performed on an Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific) equipped with an UltiMate 3000_UPLC system (Thermo Scientific) . The MS analysis was performed with Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific) . The project-specific DIA spectral library was first generated by DIA-MS2pep. Protein sequences for database search were reviewed Human proteome (uniport _UP000005640, 82685 entries) . The run-specific FDR of identifications at both peptide and protein levels were estimated by Percolator. The spectral library was further generated and submitted to DIA-NN software for protein quantification. Precursor and protein FDR was set to 1%.

[0301] K. TurboID

[0302] A549 cells pretreated with 10 ng / ml IFNγ overnight were treated with 100 nM Bortezomib for 2 hrs and with 20 μM ACE or DMSO for 4 hrs. Cells were then treated with 50 μM biotin for 2 hrs. Cells were scraped and rinsed with PBS. Cell pellets were lysed in 180 ul of RIPA Lysis buffer (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1%SDS, 0.5%sodium deoxycholate, 1%Triton X-100, 1*protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich) , and 1 mM PMSF) and incubated with 60 μl of streptavidin beads at 4℃ overnight. Beads were washed with 1 M KCl, 0.1 M Na2CO3, RIPA buffer and TBS in sequence. Then beads were eluted with 25 μl Elution buffer I (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 M urea, 5 ng / ul Sequencing Grade Modified Trypsin (Promega) , 1 mM DTT) and 50 μl elution buffer II (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 M urea, 5 mM iodoacetamide. The eluate was digested overnight at 400 rpm on a metal bath at 32℃. The eluate was terminated with 1 μl of trifluoroacetic acid and dried by vacuum centrifugation, followed by proteomics analysis.

[0303] L. Nuclear pore protein sgRNA cloning and CRISPR-suppressor screening

[0304] The nuclear pore protein sgRNA tiling library included 9740 sgRNAs, which are every sgRNA with an NGG PAM and a cleavage site within the 27 nuclear pore protein (table) coding sequences. The nuclear pore protein tiling library were synthesized by Genewiz (Suzhou, Jiangsu Province, China) . Oligos containing the sgRNA sequences were cloned into lenti-guide-puro (#52963; Addgene, Watertown, Massachusetts, USA) in a pooled fashion. Then 1 *107 A549-cas9 cells were infected with tiling library at a multiplicity of infection (MOI) of ～0.3 with 1000*coverage. After 3 days of selection by 2 μg / ml puromycin, the cells were divided into 2 groups: DMSO and ACE, and concentrations were increased gradiently. After 3 weeks of culture, the methods described above was used to harvest the cells, extract the genome, clone the sgRNA-containing DNA fragment, perform next-generation sequencing, and analyze the data.

[0305] M. Isolation of Acepromazine resistant A549-sgNup98-752 clones

[0306] Parental A549 were infected with lentivirus containing sgNup98-752. Stable cell lines were obtained by selection of transduced cells with 2 mg / ml of puromycin. One million resulting cells were plated on 10 cm plates and treated with 10 μM acepromazine continuously for three weeks, with media change every 3 to 4 days. Acepromazine resistant clones were isolated, expanded, and tested for their sensitivity to acepromazine using cell viability assay.

[0307] N. Protein expression and purification

[0308] Human TRIM21 PRYSPRY (residues 287-465) was cloned into pET28a vector with an N-terminal 6xhis tag. D355A mutations were introduced to TRIM21 PRYSPRY by overlap extension PCR. Bacterial protein expression was carried out in E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RIL cells. Cells were grown in 2xTY medium (supplemented with 0.5%glucose, 2 mM MgSO4 and Kanamycin) at 37 ℃ and induced at OD600 around 0.6–1 with 1 mM isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside (IPTG) . Cells were lysed by sonication in binding buffer A (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1M NaCl, 2 mM TECP) supplemented with 10 mM imidazole and 1x cOmplete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche, Bazel, Switzerland) . The lysate was clarified by centrifugation at 15,000 g for 1 hr at 4℃. Recombinant proteins were purified by Ni NTA Beads (Smart Lifesciences, Changzhou, China, SA004010) and washed with buffer B (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 1 mM TECP, 30 mM imidazole) . The proteins were eluted with buffer C (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 1 mM TECP, 30 mM imidazole) . The flow-through containing TRIM21 PRYSPRY was concentrated by ultrafiltration, loaded onto Superdex 75 Increase 10 / 300 GL column (Cytiva, Marlborough, MA, USA) , and then fractionated in 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 mM TECP. All of the purified proteins were concentrated to 20 mg / mL for crystallization.

[0309] O. Isothermal Titration Calorimetry (ITC)

[0310] ITC was performed using a Microcal PEAQ-ITC (Malvern Panalytical, Malvern, Worcestershire, United Kingdom) with protein solution in the cell and compound solution in the syringe. Experiments were carried out at 25 ℃. The titrations consisted of 19 injections, an initial injection of 0.4 μl and then 18 injections of 2 μl.The stirring speed in the reaction cell was 1000 rpm. Data were analyzed using non-linear least squares regression using Microcal PEAQ analysis software. Drifts in the baseline were corrected during data analysis.

[0311] P. Crystallization and X-ray data collection

[0312] Protein –ACE / S-OH-ACE / R-OH-ACE co-crystals were obtained by mixing the compound with purified TRIM21 PRYSPRY (D355A) in a molar ratio of 2: 1. All crystals were grown by a vapor diffusion method in hanging-drops at 20℃. Hampton Crystal Index TM was used for initial crystallization screens. The best co-crystals were grown at 20℃ above a well solution containing 0.1 M Tris (pH 7.0) , 3.5 M sodium formate. Macroseeding was used to improve crystal quality. X-ray diffraction data were collected at Shanghai Synchrotron Radiation Facility BL02U1 beamline (Trim21-ACE complex and Trim21-R-OH-ACE complex) and BL17UM beamline (Trim21-S-OH-ACE complex) 1, 2. Data were processed using the XDS, POINTLESS and AIMLESS programs3–5.

[0313] Q. Structure determination and Refinement

[0314] The crystal structure of TRIM21 in complex with ligands was solved by molecular replacement with the program Phaser6, using a previously reported TRIM21-IgG-Fc complex structure (PDB ID: 2IWG) as the search model7. Further manual model building was facilitated by using Coot8, combined with the structure refinement using phenix. refine9.

[0315] R. MST measurements between TRIM21 PRYSPRY and compounds

[0316] The purified TRIM21 PRYSPRY domain was labeled using Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (MO-L011, NanoTemper Technologies GmbH, Munich, Germany) . The labeled protein was diluted to 50nM in PBST buffer during measurement (137 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, 0.05%Tween-20) . ACE, (S) -ACEOH and (R) -ACEOH were prepared by 16-step serial dilution in PBST buffer, and the max concentration is 5 mM. The protein and compound mixture was loaded into standard treated capillaries (MO-K022, NanoTemper Technologies GmbH, Munich, Germany) . Measurements were performed on a Monolith NT. 115 with blue / red filters (NanoTemper Technologies GmbH, Munich, Germany) at 25 ℃ using 80%MST power. All experiments were repeated three times for each measurement. Data analyses were performed using the Nano Affinity Analysis software.

[0317] S. Confocal image acquisition and processing

[0318] Transfected cells were cultured on glass bottom plates (NEST, 801002) and stained with Hoechst (1 ug / ml, Absin, abs813337) for 5 minutes before capturing. All confocal images were captured using a Nikon A1 sim confocal microscope and were then processed using IMARIS software.

[0319] T. Opera quantification of TrimTAC-induced condensates degradation

[0320] 10,000 A549-Nup98N-mEGFP-BD2-IRES-mcherry cells or other condensates associated cells were plated in 384-well flat clear bottom white polystyrene TC-treated microplates (Corning, Corning, USA) and allowed to attach to plates overnight. Then cells were dosed with a serial dilution of compounds with TrimTAC. Four hours later, the images were collected with a PerkinElmer Opera LX high-content screening system following vendor instructions. The total intensity of EGFP and mcherry were measured by columbus online analysis software.

[0321] U. NPC degradation assay

[0322] All NPC proteins were split into multiple domains and A549-PML-mEGFP-NPC domains cell lines were constructed. The cells were plated 10,000 per well in 384-well flat clear bottom white polystyrene TC-treated microplates (Corning, Corning, USA) and allowed to attach to plates overnight. Then cells were treated with 10uM acepromazine or not for 8 hours. The images were collected with a PerkinElmer Opera LX high-content screening system following vendor instructions. The total intensity of EGFP was measured by columbus online analysis software.

[0323] V. Statistical analysis

[0324] Statistical analyses were performed with GraphPad Prism 8.0. Student’s t test was used to evaluate the statistically significant difference between the two sample groups. When comparing more than two independent groups, ANOVA was used to evaluate statistical significance. Multiple comparison tests were performed when ANOVA was significant. All tests were two-tailed, and p < 0.05 was considered statistically significant.

[0325] It is to be understood that, if any prior art publication is referred to herein; such reference does not constitute an admission that the publication forms a part of the common general knowledge in the art in any country.

[0326] Although the foregoing invention has been described in some details by way of illustration and example for purposes of clarity of understanding, it is apparent to those skilled in the art that certain minor changes and modifications will be practiced. Therefore, the description and Examples should not be construed as limiting the scope of the invention.

Claims

1.A method for degrading a target protein in a cell via the TRIM21 E3 Ligase ubiquitin proteasome pathway, comprising contacting the target protein with an effective amount of a compound selected from the compound of Formula (I) , the compound of Formula (II) , or a molecular glue compound or a PROTAC bearing the compound of Formula (I) or (II) as the ligand for recruiting TRIM21 ligase,Said compound of Formula (I) is a compound having the formula (I) , or a pharmaceutically acceptable salt thereof, an isomer thereof, or a deuterated analog thereof,whereinX is O, S or NR1, wherein R1 is hydrogen or alkyl;n is 1 to 12;Ra and Rb are each independently hydrogen or alkyl;Rc and Rd are each independently hydrogen, alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, or heteroaryl, each of said alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, or heteroaryl is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, heteroaryl, cyano, hydroxy, hydroxy, alkoxy, -NRm1C (O) NRn1Rp1, -NRm1C (O) Rn1, -C (O) NRm1Rn1, -NRm1Rn1, -C (O) Rm1, or -C (O) ORm1;or Rc and Rd, together with the nitrogen atom to which they are attached, form a 3 to 12-membered ring comprising 0 to 3 additional heteroatoms selected from oxygen, nitrogen, or sulfur, and said ring is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, heteroaryl, cyano, hydroxy, hydroxyalkyl, alkoxy, hydroxyalkoxy, -NRm2Rn2, -C (O) Rm2, -C (O) ORm2, -NRm2C (O) NRn2Rp2, -NRm2C (O) Rn2, or -C (O) NRm2Rn2;Re is hydrogen, alkyl, -NRm2Rn2, -NRm2C (O) NRn2Rp2, -NRm2C (O) Rn2, cycloalkyl, aryl, or heterocyclyl, each of said alkyl, cycloalkyl, aryl, heterocyclyl, or heteroaryl is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, heteroaryl, cyano, hydroxy, hydroxyalkyl, alkoxy, hydroxyalkoxy, -NRm3C (O) NRn3Rp3, -NRm3C (O) Rn3, -C (O) NRm3Rn3, -NRm3Rn3, -C (O) Rm3, or -C (O) ORm3;p is 0 to 3;q is 0 to 4;Rf and Rg are each independently halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heterocyclyl, heteroaryl, cyano, hydroxy, alkoxy, -NRm2C (O) NRn2Rp2, -NRm2C (O) Rn2, -C (O) NRm2Rn2, -NRm2Rn2, -C (O) Rm2, or -C (O) ORm2;whereinRm1, Rn1, Rp1, Rm2, Rn2, Rp2, Rm3, Rn3, and Rp3 are each independently hydrogen, alkyl, haloalkyl, alkoxyalkyl-, phenyl, cycloalkyl, heteroaryl, or heterocyclyl; orSaid compound of Formula (II) is a compound having the formula (II) , or a pharmaceutically acceptable salt thereof, an isomer thereof, or a deuterated analog thereof,whereinX is O, S or NR1, wherein R1 is hydrogen or alkyl;n is 1 to 12;Ra and Rb are each independently hydrogen or alkyl;Rc and Rd are each independently hydrogen, alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, or heteroaryl, each of said alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, or heteroaryl is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, heteroaryl, cyano, hydroxy, hydroxy, alkoxy, -NRm1C (O) NRn1Rp1, -NRm1C (O) Rn1, -C (O) NRm1Rn1, -NRm1Rn1, -C (O) Rm1, or -C (O) ORm1;or Rc and Rd, together with the nitrogen atom to which they are attached, form a 3 to 12-membered ring comprising 0 to 3 additional heteroatoms selected from oxygen, nitrogen, or sulfur, and said ring is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, heteroaryl, cyano, hydroxy, hydroxyalkyl, alkoxy, hydroxyalkoxy, -NRm2Rn2, -C (O) Rm2, -C (O) ORm2, -NRm2C (O) NRn2Rp2, -NRm2C (O) Rn2, or -C (O) NRm2Rn2;Re1 and Re2 are each independently hydrogen, alkyl, -NRm2Rn2, -NRm2C (O) NRn2Rp2, -C (O) NRm2Rn2, cycloalkyl, aryl, heterocyclyl, or heteroaryl, each of said alkyl, cycloalkyl, aryl, heterocyclyl, or heteroaryl is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, heteroaryl, cyano, hydroxy, hydroxyalkyl, alkoxy, hydroxyalkoxy, -NRm3C (O) NRn3Rp3, -NRm3C (O) Rn3, -C (O) NRm3Rn3, -NRm3Rn3, -C (O) Rm3, or -C (O) ORm3;p is 0 to 3;q is 0 to 4;Rf and Rg are each independently halogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heterocyclyl, heteroaryl, cyano, hydroxy, alkoxy, -NRm2C (O) NRn2Rp2, -NRm2C (O) Rn2, -C (O) NRm2Rn2, -NRm2Rn2, -C (O) Rm2, -C (O) ORm2, cycloalkyl, phenyl, heteroaryl or heterocyclyl;whereinRm1, Rn1, Rp1, Rm2, Rn2, Rp2, Rm3, Rn3, and Rp3 are each independently hydrogen, alkyl, haloalkyl, alkoxyalkyl-, phenyl, cycloalkyl, heteroaryl, or heterocyclyl.2.The method according to claim 1, wherein X is S.3.The method according to claim 1 or 2, wherein n is 1 to 6, or 2 to 4, or 3.4.The method according to any one of claims 1 to 3, wherein Ra and Rb are each hydrogen.5.The method according to any one of claims 1 to 4, wherein Rc and Rd are each independently hydrogen or alkyl.6.The method according to any one of claims 1 to 5, wherein Rc and Rd, together with the nitrogen atom to which they are attached, form a 5-to 7-membered ring comprising 0 to 1 additional heteroatoms selected from oxygen, nitrogen, or sulfur, and said ring is unsubstituted or substituted with one or more substitutes selected from halogen, alkyl, hydroxy, hydroxyalkyl, alkoxy, or hydroxyalkoxy.7.The method according to any one of claims 1 to 6, wherein Rc and Rd, together with the nitrogen atom to which they are attached, form a 6-membered ring comprising 0 to 1 additional nitrogen heteroatom and said ring is substituted with one or more substitutes selected from halogen, alkyl, hydroxy, hydroxyalkyl, alkoxy, or hydroxyalkoxy.8.The method according to any one of claims 1 to 7, wherein p is 0.9.The method according to any one of claims 1 to 8, wherein q is 0.10.The method according to any one of claims 1 to 9, wherein Re is hydrogen, alkyl, or -NRm2Rn2, wherein Rm2 and Rn2 are defined as in Formula (I) .11.The method according to any one of claims 1 to 10, wherein Re1 and Re2 are each independently hydrogen, alkyl, aryl, or -NRm2Rn2, wherein Rm2 and Rn2 are defined as in Formula (I) .12.The method according to any one of claims 1 to 10, wherein Re1 is alkyl and Re2 is hydrogen, alkyl, aryl, or -NRm2Rn2, wherein Rm2 and Rn2 are defined as in Formula (I) .13.The method according to any one of claims 1 to 12, wherein Re1 and Re2 are different.14.The method according to any one of claims 1 to 13, wherein the carbon atom to which Re1 and Re2 are attached is a chiral center.15.The method according to any one of claims 1 to 14, wherein the carbon atom to which Re1 and Re2 are attached is in a (S) -or (R) -configuration.16.The method according to any one of claims 1 to 15, wherein the carbon atom to which Re1 and Re2 are attached is in a (S) -configuration.17.The method according to any one of claims 1 to 16, wherein X is S; n is 1 to 6, or 2 to 4, or 3; Ra and Rb are each hydrogen; p and q are each 0; Rc and Rd are each independently alkyl; or Rc and Rd, together with the nitrogen atom to which they are attached, form a 5-to 7-membered ring comprising 0 to 1 additional heteroatoms selected from oxygen, nitrogen, or sulfur, and said ring is unsubstituted or substituted with one or more substitutes selected from halogen, alkyl, hydroxy, hydroxyalkyl, alkoxy, or hydroxyalkoxy; or Rc and Rd, together with the nitrogen atom to which they are attached, form a 6-membered ring comprising 0 to 1 additional nitrogen heteroatom and said ring is substituted with one or more substitutes selected from halogen, alkyl, hydroxy, hydroxyalkyl, alkoxy, or hydroxyalkoxy; Re is alkyl; or Re1 and Re2 are each independently hydrogen, alkyl; or Re1 is hydrogen and Re2 is hydrogen or alkyl.18.The method according to any one of claims 1 to 17, wherein the compound is 19.The method according to any one of claims 1 to 17, wherein the compound is 20.The method according to any one of claims 1 to 19, wherein the contacting is in vitro.21.The method according to any one of claims 1 to 20, wherein the contacting in vivo.22.The method according to any one of claims 1 to 21, wherein said method further comprises administering said compound to a subject.23.The method according to any one of claims 1 to 22, wherein said target protein is any protein that forms multimers defined as multiple copies of a polypeptide encoded by a gene form a complex.24.The method according to any one of claims 1 to 23, wherein said target protein is a multimeric protein that causes human disease.25.The method according to any one of claims 1 to 24, wherein said target protein is protein aggregates or protein condensates.26.The method according to any one of claims 1 to 24, wherein said target protein is amyloids or amyloid-like aggregates.27.The method according to any one of claims 1 to 24, wherein amyloid-like protein aggregates include Tau, alpha-Synuclein, and mutant Huntingtin.28.The method according to any one of claims 1 to 24, wherein the target protein is NUP98-fusion proteins, EWS-FLI1, Tau fibrils, alpha-Synuclein fibrils, mutant Huntingtin, cGAS, or NLRP3.29.The method according to any one of claims 1 to 28, wherein the degrading is achieved by recruitment of TRIM21 ubiquitin E3 ligase.30.The method according to any one of claims 1 to 29, wherein the compound of Formula (I) or the compound of Formula (II) induces the recruitment of TRIM21 to the vicinity of the NPC to trigger the degradation of nuclear pore proteins.31.A method for treating or preventing a disease characterized by amyloid or amyloid-like aggregates, comprising administering a subject in need thereof a therapeutically effective amount of the compound of Formula (I) , the compound of Formula (II) , or a molecular glue compound or a PROTAC bearing the compound of Formula (I) or (II) as the ligand for recruiting TRIM21 ligase.32.The method of claim 31, wherein the disease is Alzheimer’s, Huntington’s, and Parkinson’s diseases, type 2 diabetes, autoimmune disease, or amyloidosis resulting from the systemic or local deposition of amyloid fibrils in intracellular and extracellular spaces of tissues and organs.

Images