Compositions and methods for the treatment of heart disease

Abstract

Provided herein are compositions for treating or preventing cardiomyopathy. The compositions comprise a first polynucleotide and a second polynucleotide. The first polynucleotide comprises a capsid sequence. The second polynucleotide comprises a MYBPC3 gene sequence. Also provided herein are the recombinant adeno-associated virus particles, systems, methods, and kits for practicing or using the same.

Description

COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF HEART DISEASECROSS-REFERENCE

[0001] This application claims the benefit of PCT Application No. PCT / CN2024 / 074687, filed January 30, 2024, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety. SEQUENCE LISTING

[0002] The instant application contains a Sequence Listing which has been submitted electronically in XML file format and is hereby incorporated by reference in its entirety. Said XML copy is entitled 57837-743_602_SL. xml, was created on January 21, 2025 and is 131, 689 bytes in size.BACKGROUND

[0003] Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is a cardiomyopathy caused by genetic factors, and is one of the most prevalent myocardial disease, a leading cause of sudden cardiac death among young people, with no curative treatment approved. Genetic mutations were observed in HCM. In HCM, the sarcomeres replicate irregularly, causing cardiomyocytes to increase in size and disrupting the normal alignment of cardiomyocytes, a phenomenon known as myocardial disarray. One of the mutated genes in HCM is MYBPC3 that encodes cardiac myosin binding protein C (cMyBP-C) . BRIEF SUMMARY

[0004] Currently, there are needs in the development of effective drugs and methods in treating hypertrophic cardiomyopathy (HCM) . The compositions, recombinant adeno-associated virus (rAAV) particles, systems, methods, and kits of the present disclosure solve the needs thereof.

[0005] In one aspect, disclosed herein is a recombinant adeno-associated virus (rAAV) particle, comprising a polynucleotide sequence comprising a coding sequence encoding human cardiac isoform of myosin binding protein C (cMyBP-C) , wherein the coding sequence is a MYBPC3 gene sequence, wherein the MYBPC3 gene sequence is a codon-optimized gene sequence or a wild type gene sequence.

[0006] In another aspect, disclosed herein is a composition comprising: (i) a first polynucleotide sequence encoding a recombinant adeno-associated virus (rAAV) capsid protein, and (ii) a second polynucleotide sequence comprising a coding sequence encoding human cardiac isoform of myosin binding protein C (cMyBP-C) , wherein the coding sequence is a MYBPC3 gene sequence, wherein the MYBPC3 gene sequence is a codon-optimized gene sequence or a wild type gene sequence.

[0007] In still another aspect, disclosed here is a recombinant adeno-associated virus (rAAV) particle, prepared by introducing the composition disclosed herein into a host cell, wherein the introducing is transforming, transfecting, infecting, transducing, or a combination thereof.

[0008] In another aspect, disclosed herein is a method for preparing a rAAV particle, comprising introducing the composition disclosed herein to a host cell, wherein the introducing is transforming, transfecting, infecting, transducing, or a combination thereof.

[0009] In another aspect, disclosed herein is a system for treating hypertrophic cardiomyopathy (HCM) in a subject in need thereof, comprising the rAAV particle disclosed herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0010] In another aspect, disclosed herein is a kit comprising the system disclosed herein and instructions.

[0011] In another aspect, disclosed therein is a method for treating hypertrophic cardiomyopathy (HCM) in a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the rAAV particles disclosed herein, or the system disclosed herein.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0012] The features of the disclosure are set forth with particularity in the appended claims. A better understanding of the features and the disclosure will be obtained by reference to the following detailed description that sets forth illustrative embodiments, in which the principles of the disclosure are utilized, and the accompanying drawings (also “Figure” and “FIG. ” herein) , of which:

[0013] FIG. 1 shows heart weight to body weight (HW / BW) ratio in KO mice treated with vehicle or various vector constructs.

[0014] FIG. 2 shows mRNA expression of MYBPC3 transgene in the mouse tissues from various vector constructs.

[0015] FIG. 3 shows expression of human cMyBP-C protein in the mouse tissues from various vector constructs.

[0016] FIG. 4 shows mRNA levels of biomarkers in the mouse heart from various vector constructs.DETAILED DESCRIPTION

[0017] Additional aspects and advantages of the present disclosure will become readily apparent to those skilled in this art from the following detailed description, wherein only illustrative embodiments of the present disclosure are shown and described. As will be realized, the present disclosure is capable of other and different embodiments, and its several details are capable of modifications in various obvious respects, all without departing from the disclosure. Accordingly, the drawings and description are to be regarded as illustrative in nature, and not as restrictive.

[0018] Unless otherwise indicated, the practice of some embodiments disclosed herein comprises conventional techniques of immunology, biochemistry, chemistry, molecular biology, microbiology, cell biology, virology, genomics, and recombinant DNA technologies. See, e.g., Sambrook and Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (2012) ; The Current Protocols in Molecular Biology series (F.M. Ausubel, et al. eds. ) ; The Methods In Enzymology series (Academic Press, Inc. ) ; PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G. R. Taylor eds (1995) ) , Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual; and Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6th Edition (R. I. Freshney, ed. (2010) ) , each of which is incorporated herein by reference for such disclosure. Definitions

[0019] As used in the specification and claims, the singular forms “a” , “an, ” and “the” include plural references unless the context clearly dictates otherwise. For example, the term “rAAV particle” includes one or more rAAV particles.

[0020] The term “about” or “approximately” refers to a particular value within the acceptable error range determined by a person of ordinary skill in the art, which depends in part on how the value is measured or determined, i.e., the limitations of the measurement system. For example, according to the practice in the art, “about” can mean within 1 or more than 1 standard deviation. Alternatively, “about” can mean a range of up to 20 %, up to 10 %, up to 5 %, or up to 1 %of a given value. Alternatively, particularly with respect to biological systems or processes, the term can mean within an order of magnitude, up to 5-fold, or up to 2-fold, of a value. Where particular values can be described in the application and claims, unless otherwise stated the term “about” meaning up to an acceptable error range for the particular value should be assumed.

[0021] As used herein, the terms “polypeptide, ” “peptide, ” and “protein” are used interchangeably herein to refer to polymers of amino acids of any length. The polymer can be linear, cyclic or branched. The polymer can contain modified amino acids and can be interrupted by non-amino acids. The term also includes amino acid polymers that have been modified, such as by sulfation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation, iodination, methylation, oxidation, proteolytic treatment, phosphorylation, isoprenylation, racemization, selenization, transfer RNA-mediated addition of amino acids to proteins (such as arginylation) , ubiquitination, or any other operations, such as conjugation with labeling components. A polypeptide or amino acid sequence “derived” from a given protein refers to the origin of the polypeptide. Preferably, the polypeptide has an amino acid sequence that is substantially the same as the amino acid sequence of the polypeptide encoded in the sequence, or a part thereof, wherein the part consists of at least 10-20 amino acids, at least 20-30 amino acids, at least 30-50 amino acids, or it can be identified immunologically with the polypeptide encoded in the sequence. The term also includes polypeptides expressed from a designated nucleic acid sequence. As used herein, the term “domain” refers to a part of a protein that is physically or functionally distinguished from other parts of the protein or peptide. Physically defined domains include amino acid sequences that are extremely hydrophobic or hydrophilic, such as those that are membrane-bound or cytoplasmic-bound. The domain can also be defined by internal homology caused by gene duplication, for example. Functionally defined domains have different biological functions. For example, the protein-binding domain refers to the part of the protein-binding unit that binds to the protein. The functionally defined domain does not need to be encoded by a continuous amino acid sequence, and the functionally defined domain may contain one or more physically defined domains.

[0022] As used herein, the term “amino acid” refers to natural and / or unnatural or synthetic amino acids, including but not limited to D or L optical isomers, as well as amino acid analogs and peptidomimetics. Standard one-letter or three-letter codes are used to designate amino acids. In this context, amino acids are usually represented by one-letter and three-letter abbreviations well known in the art. For example, alanine can be represented by A or Ala.

[0023] As used herein, in the case of a polypeptide, a “sequence” is the sequence of amino acids in the polypeptide in the direction from the amino terminal to the carboxy terminal, wherein the residues adjacent to each other in the sequence are in the polypeptide. It is continuous in the primary structure. The sequence can also be a linear sequence of a part of a polypeptide known to contain additional residues in one or two directions.

[0024] As used herein, in the case of a polynucleotide, a “sequence” is the sequence of nucleotides in the polynucleotide in the direction from the 5’ end to the 3’ end, wherein the nucleotides adjacent to each other in the sequence are in the polynucleotide. It is continuous in the primary structure. The sequence can also be a linear sequence of a part of a polynucleotide known to contain additional nucleotides in one or two directions.

[0025] As used herein, “identity, ” “homology, ” or “sequence identity” refers to the similarity or interchangeability between two or more polynucleotide sequences or between two or more polypeptide sequences. When using program such as Emboss Needle or BestFit to determine the sequence identity, homology, or similarity between two different amino acid sequences, the default settings may be used, or an appropriate scoring matrix may be selected, such as blosum45 or BLOSUM80, to optimize the identity, similarity, or homology score. Preferably, homologous polynucleotides are those that hybridize under stringent conditions as defined herein and have at least 70 %, preferably at least 80 %, more preferably at least 90 %, more preferably at least 95 %, more preferably at least 97 %, more preferably at least 98 %, and even more preferably at least 99 %sequence identity. When a sequence of comparable length is optimally aligned, homologous polypeptide preferably has at least 80 %, at least 90 %, at least 95 %, at least 97 %, at least 98 %sequence identity, or at least 99 %sequence identity.

[0026] With regard to the polypeptide or polynucleotide herein, the “percent sequence identity (%) ” is defined as the percentage of amino acid residues or nucleotides in the query sequence that are identical to the amino acid residues or nucleotides of the second, reference polypeptide / polynucleotide sequence or part thereof calculated after aligning the sequences and introducing gaps if necessary to obtain the maximum sequence identity percentage, and not removing any conservative substitutions that are regarded as part of sequence. The alignment aimed at determining the percentage of amino acid sequence identity can be achieved in various ways within the skill of the art, such as using publicly available computer software, such as the BLAST, BLAST-2, ALIGN, NEEDLE, or Megalign (DNASTAR) software. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including the full length of the sequences being compared is eligible for any algorithms needed to obtain maximal alignment. The percent identity can be measured over the length of the entire defined polypeptide / polynucleotide sequence, or can be measured over a shorter length, for example, the length of a fragment taken from a larger, defined polypeptide / polynucleotide sequence, such as A fragment of at least 5, at least 10, at least 15, at least 20, at least 50, at least 100, or at least 200 consecutive residues / nucleotides. These lengths are exemplary only, and it should be understood that the forms herein shown in the drawings, or the sequence supported in the Sequence Listing can be used to describe any fragment length thereon may be measured with a percentage of the length.

[0027] The proteins described herein may have one or more modifications relative to the reference sequence. The modification may be deletion, insertion or addition, or substitution or substitution of amino acid residues. “Deletion” refers to a change in amino acid sequence due to the lack of one or more amino acid residues. “Insertion” or “addition” refers to an amino acid sequence change that results in the addition of one or more amino acid residues compared to a reference sequence. “Substitution” or “substitution” refers to the replacement of one or more amino acids with different amino acids. In the present disclosure, the mutation of the polypeptide relative to the reference sequence can be determined by comparing the polypeptide with the reference sequence. The optimal alignment of sequences for comparison can be performed according to any known method in the art.

[0028] As used herein, the term “extracted” refers to the isolation and / or separation of cellular or other components that are associated with, in nature, polynucleotides, peptides, polypeptides, proteins, antibodies or fragments thereof under normal circumstances. Those skilled in the art should understand that non-naturally occurring polynucleotides, peptides, polypeptides, proteins, antibodies, or fragments thereof do not need to be “isolated” to be distinguished from their naturally occurring counterparts. In addition, “concentrated” , “isolated” or “diluted” polynucleotides, peptides, polypeptides, proteins, antibodies, or fragments thereof are distinguishable from their naturally occurring counterparts because of their concentration or number of molecules per unit volume is greater than ( “concentrated” ) or less than its naturally occurring counterpart ( “isolated” ) . Enrichment can be measured based on absolute amounts, such as the weight of solution per unit volume, or it can be measured relative to the second, potentially reference species present in the source mixture.

[0029] The terms “polynucleotide” , “nucleic acid” , “nucleotide” and “oligonucleotide” are used interchangeably. They refer to polymeric forms of nucleotides of any length (whether they ae deoxyribonucleotides or ribonucleotides) or their analogs. A polynucleotide can have any three-dimensional structure and can perform any known or unknown function. The following are non-limiting examples of polynucleotides: coding or non-coding regions of genes or gene fragments, loci determined from linkage analysis, exons, introns, messenger RNA (mRNA) , transfer RNA, ribosomal RNA, ribozymes, cDNA, recombinant polynucleotides, branched polynucleotides, isolated plasmids, vectors, any DNA isolated sequence, any RNA sequence, nucleic acid probes, primers, or a synthetic oligonucleotide DNA. Polynucleotides may contain modified nucleotides, such as methylated nucleotides and nucleotide analogs. If present, modifications to the nucleotide structure can be imparted before or after polymer assembly. The sequence of nucleotides can be interrupted by non-nucleotide components. The polynucleotide can be further modified after polymerization, for example, by conjugation with a labeling component. When referring to a DNA / RNA, A can mean adenine, C can mean cytosine, G can mean guanine, T can mean thymine, U can mean uracil. U and T can be used interchangeably when referring to a DNA or an RNA.

[0030] When applied to polynucleotides, “recombinant” means that the polynucleotide is the product of cloning, restriction digestion, ligation, other procedures that produce constructs different from those found in nature, or any combinations thereof. When applied to polypeptides, “recombinant” means that the polypeptide is the expressed / translated product of a recombinant polynucleotide.

[0031] The terms “gene” or “gene fragment” are used interchangeably herein. They refer to a polynucleotide containing at least one open reading frame, the open reading frame capable of encoding a particular protein after transcription and translation. Gene or gene fragment may be a gene group, the cDNA, or synthetic, as long as the polynuclear nucleotide comprises a sequence having at least one open reading frame, the open reading frame may cover the entire coding region or a section thereof.

[0032] The term “variant” as used herein generally refers to a polynucleotide or polypeptide having a sequence substantially similar to a reference polynucleotide or polypeptide. Procedures for the introduction of nucleotide and amino acid changes in a polynucleotide, protein or polypeptide (see, e.g., Sambrook et al. (1989) ) . In the case of a polynucleotide, a variant can have deletions, substitutions, additions of one or more nucleotides at the 5′end, 3′end, and / or one or more internal sites in comparison to the reference polynucleotide. Similarities and / or differences in sequences between a variant and the reference polynucleotide can be detected using conventional techniques known in the art, for example polymerase chain reaction (PCR) and hybridization techniques. Variant polynucleotides also include synthetically derived polynucleotides, such as those generated, for example, by using site-directed mutagenesis. Generally, a variant of a polynucleotide, including, but not limited to, a DNA, can have at least about 50%, about 55%, about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 91%, about 92%, about 93%, about 94%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, about 99%or more sequence identity to the reference polynucleotide as determined by sequence alignment programs. In the case of a polypeptide, a variant can have deletions, substitutions, additions of one or more amino acids in comparison to the reference polypeptide. Similarities and / or differences in sequences between a variant and the reference polypeptide can be detected using conventional techniques known in the art, for example Western blot. Generally, a variant of a polypeptide, can have at least about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 91%, about 92%, about 93%, about 94%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, about 99%or more sequence identity to the reference polypeptide as determined by sequence alignment programs.

[0033] As used herein, the term “expression” refers to the process by which polynucleotides are transcribed into mRNAs, and / or the process by which transcribed mRNAs (also referred to as “transcripts” ) is subsequently translated into peptides, polypeptides, or proteins. The transcripts and the encoded polypeptides are collectively referred to as gene products. If the polynucleotide is derived from genomic DNA, expression may include splicing of mRNA in eukaryotic cells.

[0034] As used herein, the term “expression cassette” refers to a nucleic acid molecule which comprises a biologically useful nucleic acid sequence (e.g., a gene cDNA encoding a protein, enzyme or other useful gene product, mRNA, etc. ) and regulatory sequences operably linked thereto which direct or modulate transcription, translation, and / or expression of the nucleic acid sequence and its gene product. The expression cassette may contain regulatory sequences upstream (5’ to) of the gene sequence, e.g., one or more of a promoter, an enhancer, an intron, etc., and one or more of an enhancer, or regulatory sequences downstream (3’ to) a gene sequence, e.g., 3’ untranslated region (3’ UTR) comprising a polyadenylation site, among other elements. In certain embodiments, the regulatory sequences are operably linked to the nucleic acid sequence of a gene product, wherein the regulatory sequences are separated from nucleic acid sequence of a gene product by an intervening nucleic acid sequences, i.e., 5’ -untranslated regions (5’ UTR) . In certain embodiments, the expression cassette comprises nucleic acid sequence of one or more of gene products. In some embodiments, the expression cassette can be a monocistronic or a bicistronic expression cassette. In other embodiments, the term “transgene” refers to one or more DNA sequences from an exogenous source which are inserted into a target cell. Typically, such an expression cassette can be used for generating a viral vector and contains the coding sequence for the gene product described herein flanked by packaging signals of the viral genome and other expression control sequences such as those described herein. In certain embodiments, a vector sequence may contain two or more expression cassettes.

[0035] As used herein, the term “operably connected” or “operably linked” or “effectively connected” generally refers to the juxtaposition of the components to allow them to function in their intended manner. For example, if a promoter sequence promotes transcription of a coding sequence, the promoter sequence is operably linked or connected to the coding sequence.

[0036] As used herein, the term “operably linked” sequences include both regulatory sequences that are contiguous or non-contiguous with the nucleic acid sequence and regulatory sequences that act in trans or cis nucleic acid sequence. Such regulatory sequences typically include, e.g., one or more of a promoter, an enhancer, an intron, a Kozak sequence, a polyadenylation sequence, and a TATA signal.

[0037] As used herein, the term “vector” refers to a nucleic acid delivery vehicle into which polynucleotides can be inserted. When the vector can express the protein encoded by the inserted polynucleotide, the vector is called an expression vector. The vector can be introduced into the host cell through transformation, transduction, infection, or transfection, so that the genetic material it carries can be expressed in the host cell. Vectors are well known to those skilled in the art, including but not limited to: plasmids; phagemids; artificial chromosomes, such as yeast artificial chromosomes (YAC) , bacterial artificial chromosomes (BAC) or artificial chromosomes (PAC) derived from P1 ; bacteriophages such as lambda phage or M13 phage body and animal viruses. Animal viruses that can be used as vectors include, but are not limited to, retroviruses (including lentiviruses) , adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses (such as herpes simplex virus) , poxviruses, baculoviruses, papillomaviruses, and papillae Polyoma vacuole virus (such as SV40) . A vector can contain a variety of elements that control expression, including but not limited to promoter sequences, transcription initiation sequences, enhancer sequences, selection elements, and reporter genes. In addition, the vector may also contain an origin of replication site.

[0038] As used herein, the term “vector sequence” refers to the nucleic acid sequence packaged inside a parvovirus (e.g., rAAV) capsid which forms a viral particle. Such a nucleic acid sequence contains AAV inverted terminal repeat sequences (ITRs) . In the examples herein, a vector sequence contains, at a minimum, from 5’ to 3’ , an AAV 5’ ITR (also referred to as 5’ ITR) , coding sequence (s) (i.e., transgene (s) ) , and an AAV 3’ ITR (also referred to as 3’ ITR) . ITRs from AAV2, a different source AAV than the capsid, or other than full-length ITRs may be selected. In certain embodiments, the ITRs are from the same AAV source as the AAV which provides the rep function during production or a transcomplementing AAV. Further, other ITRs, e.g., self-complementary (scAAV) ITRs, may be used. Both single-stranded AAV and self-complementary (sc) AAV are encompassed with the rAAV. The transgene is a nucleic acid coding sequence, heterologous to the vector sequences, which encodes a polypeptide, protein, functional RNA molecule (e.g., miRNA, miRNA inhibitor) or other gene product, of interest. The nucleic acid coding sequence is operatively linked to regulatory components in a manner which permits transgene transcription, translation, and / or expression in a cell of a target tissue. Suitable components of a vector sequence are discussed in more detail herein. In one example, a “vector sequence” contains, at a minimum, from 5’ to 3’ , a vector-specific sequence, a nucleic acid sequence encoding protein of interest operably linked to regulatory control sequences (which direct their expression in a target cell) , where the vector-specific sequence may be a terminal repeat sequence which specifically packages the vector sequence into a viral vector capsid or envelope protein. For example, AAV inverted terminal repeats are utilized for packaging into AAV and certain other parvovirus capsids. In certain embodiments, the vector sequence is an expression cassette having inverted terminal repeat (ITR) sequences necessary for packaging the vector sequence into the AAV capsid at the extreme 5’ and 3’ end and containing therebetween a transgene as described herein operably linked to sequences which direct expression thereof. In certain embodiments, a vector sequence may comprise at a minimum from 5’ to 3’, an AAV 5’ ITR, coding sequence (s) , and an AAV 3’ ITR. In certain embodiments, the ITRs are from AAV2, a different source AAV than the capsid, or other than full-length ITRs may be selected. In certain embodiments, the ITRs are from the same AAV source as the AAV which provides the rep function during production or a transcomplementing AAV. Further, other ITRs may be used.

[0039] The term “codon optimization” as used herein refers to the use of redundancy in the genetic code to change the nucleotide sequence while maintaining the same protein sequence it encodes. In some cases, codon optimization may be increased or decreased to promote the expression of the protein encoded. This is done by selecting the preference for codon usage for specific cell types such as the relative abundance of tRNA in the cell type. In some cases, a rare tRNA codon may be selected to reduce the expression in a particular cell type. In some cases, codon optimization can also increase the fidelity of sequence replication, that is, less mutations occur during the polynucleotide replication cycle, such as during cloning.

[0040] One method of codon optimization is to reduce the number of CpG dinucleotides in the transgene construct including the coding sequence. Without wishing to be bound by any particular theory of operation, some potential benefits of CpG reduction may be possible. For example, methylation at CpG dinucleotides can silence gene transcription. Reducing the number of CpG dinucleotides in a coding sequence can reduce the level of methylation and increase the transcription efficiency. Too many of these CpG dinucleotides in the transgene construct may identify it as being unnatural. In addition, eukaryotic cells exhibits evolutionary conserved mechanisms of innate immunity as defense mechanisms against viral infections. Unmethylated CpG islands can be recognized as a viral DNA in host cells, thereby triggering pathways, such as Toll-Like Receptor (TLR) 9 signaling, leading to programmed cell death. Further, unmethylated CpG dinucleotides can stimulate an immune response triggering inflammation. Thus, reducing the CpG number in the transgene construct may be beneficial for durable expression.

[0041] In some embodiments, reducing the number of CpG dinucleotides in the promoter sequence may increase the durability of the transgene construct. Methylation of CpG dinucleotides within the promoter region can be a major factor limiting long-lasting gene expression. In some embodiments, varying the number of CpG dinucleotides in the transgene construct may increase the durability of the transgene construct.

[0042] As used herein, the term “host cell” refers to a cell that can be used to be introduced with a vector, which includes, but is not limited to, prokaryotic cells such as Escherichia coli or Bacillus subtilis, or yeast or fungal cells such as Aspergillus, or insect cells such as Drosophila S2 cells or Sf9 cells, or animal cells such as fibroblasts, CHO cells, COS cells, NSO cells, BHK cells, HEK293 cells, HEK293 derivatives 293T cells, HeLa cells, or human cells.

[0043] An “effective amount” as used herein refers to at least the minimum amount required to achieve a measurable improvement or prevention of a particular condition. The effective amount herein can vary with the patient's disease state, age, sex, weight and other factors. An effective amount is also an amount in which the therapeutic benefit exceeds any toxic or adverse effects of the treatment. In the treatment of cancer or tumor, the effective dose of the drug can have the following effects: reduce the number of cancer cells, reduce tumor size, inhibit the infiltration of cancer cells into peripheral organs, inhibit tumor metastasis, inhibit tumor growth to a certain extent alleviate one or more symptoms related to the disease, or any combinations thereof. The effective amount can be administered in one or more applications or doses.

[0044] As used herein, the terms “recipient, ” “individual, ” “subject, ” “host, ” and “patient” are used interchangeably herein, and refer to any mammalian subject to be diagnosed, medicated, or treated, especially humans.

[0045] As used herein, the terms “treatment” and “medication” refer to obtaining a desired pharmacological and / or physiological effect. The effect may be prophylactic in terms of completely or partially preventing the disease or its symptoms, and / or may be therapeutic in terms of partially or completely stabilizing or curing the disease and / or adverse reactions attributed to the disease. “Treatment” as used herein encompasses any treatment of diseases in mammals, such as mice, rats, rabbits, pigs, primates, including humans and other apes, especially humans, and the term includes: (a) preventing a disease or symptom from occurring in subjects who may be susceptible to the disease or symptom but not yet diagnosed; (b) inhibiting disease symptoms; (c) preventing the development of the disease; (d) relieving symptoms of the disease; (e) causing the disease or symptoms to subside; or any combination thereof. The term “kit” as used herein refers to a combination packaged for common use or commercially available. For example, the kit of the present disclosure may include the composition of the present disclosure, and instructions for using the composition or the kit. The term “instructions” refers to the explanatory inserts usually contained in commercial packages of therapeutic products, which contain information about indications, use, dosage, administration, combination therapy, contraindications, warnings about the use of such therapeutic products, or any combination thereof.

[0046] While various embodiments of the disclosure have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. Numerous variations, changes, and substitutions may occur to those skilled in the art without departing from the disclosure. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the disclosure described herein may be employed. Hypertrophic Cardiomyopathy (HCM)

[0047] Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is an abnormal condition in which sarcomeres replicate and cause heart muscle cells to increase in size. The enlarged heart muscle cells result in the thickening of the heart muscle. In addition, the abnormal heart muscle cells disrupt the normal alignment of muscle cells, also called “myocardial disarray” . HCM also can cause disruptions of the electrical functions of the heart. Mutations in one of 9 sarcomeric genes may cause HCM resulting from the mutated proteins in the sarcomere. For example, hypertrophic cardiomyopathy may be inherited as an autosomal dominant trait, with mutations reported in cardiac troponin T (TNNT2) ; myosin heavy chain (MYH7) ; tropomyosin 1 (TPM1) ; myosin binding protein C (MYBPC3) ; 5′-AMP-activated protein kinase subunit gamma-2 (PRKAG2) ; troponin I type 3 (TNNI3) ; titin (TTN) ; myosin, light chain 2 (MYL2 or MLC-2) ; actin, alpha cardiac muscle 1 (ACTC1) ; and cardiac LIM protein (CSRP3 or CLP) .

[0048] In HCM the cardiomyocytes may be stimulated with positive inotropic stress, such as a beta-adrenergic agonist before, during or after contacting with the candidate agent. Under such conditions, HCM cardiomyocytes may display higher hypertrophic responses, which can be reversed by a beta-adrenergic blocker. As described above for HCM patients, HCM cardiomyocytes may exhibit increased cell size and up-regulation of HCM related genes, and more irregularity in contractions characterized by immature beats, including a higher frequency of abnormal Ca2+ transients, characterized by secondary immature transients. These cardiomyocytes have increased intracellular Ca2+ levels, and in some embodiments candidate agents that target calcineurin or other targets associated with calcium affinity. Cardiac Myosin Binding Protein C (cMyBP-C) and the MYBPC3 Gene

[0049] Cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is a 140-kDa sarcomeric thick filament protein encoded by the MYBPC3 gene and present in vertebrate cardiomyocytes. It consists of eleven immunoglobulin-like and fibronectin-like domains, termed C0–C10, respectively. It is a myosin-associated protein that binds at about 43 nm intervals along the myosin thick filament backbone, stretching for about 200 nm on either side of the M-line within the crossbridge-bearing zone (C-region or C-zone) of the A band in striated muscle. The cMyBP-C isoform in cardiac muscle differs from those expressed in slow skeletal muscle (encoded by the MYBPC1 gene) and fast skeletal muscle (encoded by the MYBPC2 gene) by three features: (1) an additional immunoglobulin (Ig) -like domain on the N-terminus, (2) a linker region between the second and third Ig domains, and (3) an additional loop in the sixth Ig domain.

[0050] cMyBP-C may have defined roles in the structural assembly and stability of the sarcomere, and in the modulation of contraction. For example, this sarcomeric protein may be linked to cardiac contractility, presumably using the phosphorylation status of cMyBP-C to regulate the force and rate of cardiac contractions. For example, reduced phosphorylation of cMyBP-C has been linked to compromised contractility in heart failure patients. While cMyBP-C is highly phosphorylated under normal physiological conditions, its phosphorylation levels drop in diseased states in patients with hypertrophic cardiomyopathy (HCM) .

[0051] From about 150 to about 350 HCM mutations have been reported in the MYBPC3 gene, which has about 24,000 base pairs of genomic DNA and about 35 exons. About one-third of all cardiomyopathy cases may involve mutations in the MYBPC3 gene. MYBPC3 mutations can lead to different forms of cardiomyopathies, such as dilated cardiomyopathy and left ventricular noncompaction cardiomyopathy.

[0052] The use of small parvovirus adeno-associated virus (AAV) -based vectors may enable efficient transduction of postmitotic tissues in vivo, including the heart. Thus, these vectors can be used as gene therapies targeting heart tissues. Accordingly, AAV-mediated gene transfer of a full-length or modified MYBPC3 gene may prevent or ameliorate the development of cardiac hypertrophy and dysfunction.

[0053] In some embodiments, the transgene vector construct encodes a protein sequence sharing at least 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identity to the wild type cMyBP-C. In some embodiments, the wild type cMyBP-C is SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the transgene vector construct encodes a protein sequence sharing at least 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identity to any one of SEQ ID NOs: 2-24.

[0054] In some embodiments, the transgene sequence shares at least 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identity to the wild type MYBPC3 gene. In some embodiments, the wild type MYBPC3 gene is SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the transgene sequence is a codon-optimized MYBPC3 gene. In some embodiments, the transgene sequence is any one of SEQ ID NOs: 26-33. Recombinant AAV Vector

[0055] Adeno-associated virus (AAV) belong to the parvovirus, a single strand DNA (ssDNA) virus. The full-length genome of the AAV contains approximately 4.7 kilobases (kb) , comprising inverted terminal repeats (ITR) DNA sequences at both ends of the virus encompassing two open reading frames (ORF) called rep and cap.

[0056] The “AAV inverted terminal repeat (ITR) ” sequence is a sequence of about 145 nucleotides that exists at both ends of the natural single-stranded AAV genome. ITR is required for the efficient replication of the genome nucleic acid sequences of the symmetrical AAV particles, which can be used as a viral DNA synthesis origin of replication and are necessary structural components for the recombinant AAV vector.

[0057] The “rep” gene contains polynucleotide sequences encoding four rep proteins rep78, rep68, rep52, and rep40 required for the life cycle of AAV. The “cap” gene contains polynucleotide sequences encoding the AAV capsid proteins VP1, VP2, and VP3 proteins. The AAV capsid proteins VP1, VP2 and VP3 are capable to form a 24-subunit symmetrical AAV capsid through interaction between them.

[0058] AAV can effectively infect dividing and non-dividing human cells, and its genome can be integrated into a single chromosomal site in the host genome. Most importantly, although AAV already exists in humans, current research believes that AAV is not related to any disease. Based on its high safety, low immunogenicity, broad host range, ability to mediate stable long-term expression of exogenous genes in vivo, AAV has become the most promising vector system in gene therapy.

[0059] To date, more than 13 AAV serotypes has been identified according to the tissues or different cell types they infect. Further, according to the TABLE 1 below, different AAVs have been developed as advantageous vector systems for transfection of specific cell types. Among the many AAV serotypes, serotype 2 (AAV2) is the most widely studied and used AAV. It can infect, including but not limited to, retinal epithelium, photoreceptor cells, skeletal muscle, central nervous system and heart cells; and has been used as a carrier for many clinical tails in progress.TABLE 1: AAV Serotypes and the Target Tissues Used in Gene Therapy

[0060] The term “recombinant AAV vector (rAAV vector) ” as used herein refers to a polynucleotide vector containing one or more heterologous sequences (i.e., nucleic acid sequences not derived from AAV) flanked by two AAV ITR sequences. When present in host cells expressing AAV rep and cap proteins, the rAAV vector can replicate and be packaged into AAV virus particles.

[0061] In some embodiments, the AAV capsid proteins are from AAV9.

[0062] The term “recombinant AAV (rAAV) virus” or “rAAV viral particle” as used herein refers to rAAV vector encapsulated by at least one AAV capsid protein into AAV viral particles. Currently used host cells for rAAV viral particle production is derived from mammalian cell types, such as human embryonic kidney 293 (HEK293) cells, 293T cells, human fibrosarcoma (HT-1080) cells, differentiated hepatocyte-derived carcinoma (Huh-7) cells, PER. C6 cells, COS cells, murine myeloma (NS0) cells, HeLa cells, Baby Hamster Kidney (BHK) cells, KB cells, and other mammalian cell lines. The rAAV virus particles can be produced in the mammalian cell culture system by providing the rAAV plasmids and helper plasmids to the mammalian cell. Recently, an rAAV virus particle production system using insect cells such as Sf9 cells has been developed due to its higher productivity and scalability. However, to produce AAV in insect cells, some modifications must be made to obtain the correct stoichiometric ratio of the AAV capsid protein.

[0063] Baculovirus is a double-stranded circular DNA virus, belonging to Baculoviridae virus family, and has a genome size of 90 kb-230 kb. Baculoviruses are parasites exclusive to arthropods and known to infect more than 600 species of insects. Using Autographa Californica Multicapsid Nuclear Polyhedrosis Virus (AcMNPV) , Smith et al. successfully expressed human beta-interferon in the Sf9 cell line in 1983, developing the first baculovirus expression system (Mol. Cell Biol., 1983, 3: 2156-2165, which is incorporated herein by reference for such disclosure) . Since then, the baculovirus expression system has been continuously improved and developed, and it has become a very widely used eukaryotic expression system. In 2002, Urabe et al. showed that the baculovirus-infected Sf9 insect cell can support AAV replication, using three recombinant baculoviruses carrying AAV's rep gene, cap gene, and ITR core expression elements to co-infect the Sf9 cells and successfully prepared rAAV virus particles (Hum. Gene Ther. 2002; 13: 1935–1943, which is incorporated herein by reference for such disclosure) . On this basis, researchers have successively developed systems that are more suitable for large-scale preparation of rAAV virus particles.

[0064] At present, there are mainly two methods for large-scale preparation of rAAV virus particles using the baculovirus expression system: Two Bac system and One Bac system. The main process of the two baculovirus systems prepared rAAV viral particles is that the rep gene and the cap gene of the AAV is integrated into one baculovirus genome, and the ITR core element expressing the gene of interest is integrated into another baculovirus genome. The above two recombinant baculoviruses are then used to co-infect host cells to produce rAAV virus particles carrying the target gene. The main process of using One Bac system relies on packaging cell lines to prepare rAAV virus particles. A packaging cell line that can induce the expression of rep genes and cap genes is first established. This packaging cell line is integrated with the rep genes and cap gene expression elements. The rep gene and the cap gene are both placed under the control of the strong baculovirus late gene expression promoter polyhedrin (polh) . The hr2 enhancer sequence and the AAV rep protein binding sequence are further inserted upstream of the polh promoter. After being infected with a recombinant baculovirus containing AAV ITR and the target gene, the rep gene and cap gene in the packaging cell line are induced, and the rAAV virus particles containing the target gene insert are produced.

[0065] In some embodiments, the vector sequence from 5’ ITR to 3” ITR shares at least 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identity to anyone of PA456 (SEQ ID NO: 34) , PA457 (SEQ ID NO: 35) , PA458 (SEQ ID NO: 36) , or PA459 (SEQ ID NO: 37) .

[0066] In some embodiments, the rAAV vector used to carry the gene of interest in the rAAV virus particle may also include one or more “expression control elements” . The term “expression control element” or “expression regulatory element” as used herein refers to a nucleic acid sequence that affects the expression of an operably linked polynucleotide, including polynucleotide sequences that promote the transcription and translation of heterologous polynucleotides. The expression control elements that can be used in the present disclosure include, but are not limited to, promoters, enhancers, intron splicing signals, poly A sequences, or inverted terminal repeats (ITR) .

[0067] A “promoter” is a DNA sequence located adjacent to a heterologous polynucleotide sequence encoding a target product, which is usually operably linked to an adjacent sequence, such as a heterologous polynucleotide. Compared to the amount expressed in the absence of a promoter, a promoter generally increases the amount of heterologous polynucleotide expression.

[0068] Examples of promoter include, but are not limited to, the phosphoglycerate kinase (PKG) promoter, CAG (composite of the CMV enhancer the chicken beta actin promoter (CBA) and the rabbit beta globin intron. ) , NSE (neuronal specific enolase) , synapsin or NeuN promoters, the SV40 early promoter, mouse mammary tumor virus LTR promoter; adenovirus major late promoter (Ad MLP) ; a herpes simplex virus (HSV) promoter, a cytomegalovirus (CMV) promoter such as the CMV immediate early promoter region (CMVIE) , SFFV promoter, rous sarcoma virus (RSV) promoter, synthetic promoters, hybrid promoters, and the like. Other promoters can be of human origin or from other species, including from mice. Common promoters include, e.g., the human cytomegalovirus (CMV) immediate early gene promoter, the SV40 early promoter, the Rous sarcoma virus long terminal repeat, [beta] -actin, rat insulin promoter, the phosphoglycerate kinase promoter, the desmin promoter and similar muscle-specific promoters, the EF1-alpha promoter, the CAG promoter and other constitutive promoters, hybrid promoters with multi-tissue specificity, promoters specific for neurons like synapsin and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter, all of which are promoters well known and readily available to those of skill in the art, can be used to obtain high-level expression of the coding sequence of interest. In addition, sequences derived from non-viral genes, such as the murine metallothionein gene, also find use herein. Such promoter sequences are commercially available from, e.g., Stratagene (San Diego, Calif. ) . Promoter is also described in WO 2011 / 005968, which is incorporated herein by reference for such disclosure. In some cases, the promoter is a heart specific promoter.

[0069] In some embodiment, the promoter is a ubiquitous promoter, a muscle promoter, or a cardiac promoter. In some embodiments, the cardiac promoter is a cardiac troponin T (TNNT2 or cTnT) promoter (SEQ ID NO: 38) , an alpha myosin heavy chain (α-MHC) promoter, a beta myosin heavy chain (β-MHC) promoter, a cardiac troponin I (cTnI) promoter, a cardiac troponin C promoter, a natriuretic peptide A gene (NPPA) promoter, a myosin light chain 2 (MLC-2) promoter (SEQ ID NO: 39) , a myosin light chain 2v (MLC-2v) promoter, a cardiac sodium–calcium exchanger-1 (NCX1) promoter, an alpha-cardiac actin promoter, an alpha-tropomyosin promoter, an alpha-cardiac actin promoter, an alpha-tropomyosin promoter, a cardiac myosin-binding protein C promoter, a sarco / endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase isoform 2 (SERCA2) promoter, or any other cardiac promoter.

[0070] An “enhancer” is a sequence that enhances the activity of a promoter. Different from the promoter, an enhancer does not have the promoter activity, and may generally depend on its location relative to the promoter (i.e., upstream or downstream of the promoter) . Non-limiting examples of enhancer elements (or portions thereof) that can be used in the present disclosure include baculovirus enhancers and enhancer elements found in insect cells.

[0071] A “stuffer sequence” refers to a nucleotide sequence of a larger nucleic acid molecule (such as, but not limited, to a vector) , and is usually to create a desired gap or separation between two nucleic acid features (such as, but not limited, between a promoter and a coding sequence) or to extend the nucleic acid molecule a desired length. The stuffer sequence does not contain protein coding information and may have unknown or synthetic origin, not related to other nucleic acid sequences within the larger nucleic acid molecule, or any combination thereof.

[0072] As used herein, the term “intron” generally refers to a DNA molecule that may be isolated or identified from a gene and may be defined generally as a region spliced out during messenger RNA (mRNA) processing prior to translation. Alternately, an intron may be a synthetically produced or manipulated DNA element. An intron may contain enhancer elements that effect the transcription of operably linked genes. An intron may be used as a regulatory element for modulating expression of an operably linked transcribable DNA molecule. A construct may comprise an intron, and the intron may or may not be heterologous with respect to the transcribable DNA molecule.

[0073] In some embodiments, the promoter that is operably connected to the coding sequence of MYBPC3 is: a ubiquitous promoter, a muscle promoter, or a cardiac promoter, or a combination thereof. In some embodiments, the cardiac promoter is a cardiac troponin T (TNNT2 or cTnT) promoter (SEQ ID NO: 38) , an alpha myosin heavy chain (α-MHC) promoter, a beta myosin heavy chain (β-MHC) promoter, a cardiac troponin I (cTnI) promoter, a cardiac troponin C promoter, a natriuretic peptide A gene (NPPA) promoter, a myosin light chain 2 (MLC-2) promoter (SEQ ID NO: 39) , a myosin light chain 2v (MLC-2v) promoter, a cardiac sodium–calcium exchanger-1 (NCX1) promoter, an alpha-cardiac actin promoter, an alpha-tropomyosin promoter, an alpha-cardiac actin promoter, an alpha-tropomyosin promoter, a cardiac myosin-binding protein C promoter, a sarco / endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase isoform 2 (SERCA2) promoter, or any other cardiac promoter. In some embodiments, the promoter is a cardiac troponin T promoter. In some embodiments, the promoter comprise a sequence of SEQ ID NO: 38. Compositions

[0074] In one aspect, the present disclosure provides a combination comprising: (i) a first polynucleotide sequence encoding a recombinant adeno-associated virus (rAAV) capsid protein, and (ii) a second polynucleotide sequence comprising a coding sequence encoding human cardiac isoform of myosin binding protein C (cMyBP-C) , wherein the coding sequence is a MYBPC3 gene sequence, wherein the MYBPC3 gene sequence is a codon-optimized gene sequence or a wild type gene sequence (SEQ ID NO: 25) .

[0075] In some embodiments, the rAAV is a self-complementary adeno-associated virus (scAAV) vector or a single-stranded AAV (ssAAV) vector. In some embodiments, the sequence of the variant of cMyBP-C is selected from the amino acid sequences comprising SEQ ID NOs: 2-24. In some embodiments, the nucleotide sequence encoding the cMyBP-C is selected from the sequences comprising SEQ ID NOs: 26-33. In some embodiments, the rAAV protein is an adeno-associated virus (AAV) capsid protein. In some embodiments, the AAV capsid protein is an AAV1 capsid, an AAV2 capsid, an AAV3 capsid, an AAV4 capsid, an AAV5 capsid, an AAV6 capsid, an AAV7 capsid, an AAV8 capsid, an AAV9 capsid, an AAV10 capsid, and AAV11 capsid, an AAV12 capsid, an AAV13 capsid, an AAVrh10 capsid, an AAVrh74 capsid, an AAV2i8 capsid, an Anc80L65 capsid, an MyoAAV capsid, an AAVHSC capsid, an AAV-DJ capsid, a KP1 capsid, an LK03 capsid, an NP59 capsid, or fragments or variants thereof, or fragments or variants thereof. In some embodiments, the AAV capsid protein is an AAV9 capsid.

[0076] In some embodiments, the second polynucleotide further comprises a first gene expression control element comprising a promoter, wherein the gene expression control element is operably connected to the coding sequence of MYBPC3. In some embodiments, the promoter is a ubiquitous promoter, a muscle promoter, or a cardiac promoter. In some embodiments, the cardiac promoter is a cardiac troponin T (TNNT2 or cTnT) promoter (SEQ ID NO: 38) , an alpha myosin heavy chain (α-MHC) promoter, a beta myosin heavy chain (β-MHC) promoter, a cardiac troponin I (cTnI) promoter, a cardiac troponin C promoter, a natriuretic peptide A gene (NPPA) promoter, a myosin light chain 2 (MLC-2) promoter (SEQ ID NO: 39) , a myosin light chain 2v (MLC-2v) promoter, a cardiac sodium–calcium exchanger-1 (NCX1) promoter, an alpha-cardiac actin promoter, an alpha-tropomyosin promoter, an alpha-cardiac actin promoter, an alpha-tropomyosin promoter, a cardiac myosin-binding protein C promoter, a sarco / endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase isoform 2 (SERCA2) promoter, or any other cardiac promoter. In some embodiments, the promoter is a cardiac troponin T promoter. In some embodiments, the promoter comprise a sequence sharing at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 99%identity to SEQ ID NO: 38. In some embodiments, the promoter comprise a sequence of SEQ ID NO: 38.

[0077] In some embodiments, the polynucleotide sequence further comprises a second gene expression control element, and the second gene expression control element comprises an intron, wherein the second gene expression control element is operably connected to the coding sequence of MYBPC3. In some embodiments, the intron shares at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 99%identity to one of SV40 intron (SV40i) (SEQ ID NO: 40) , modified SV40 intron (mSV40i) , EF1-alpha intron (EF1Ai) , hemoglobin beta gene intron (HBBi) , rabbit β-globin intron, chimeric intron, hybrid intron, or other synthetic intron.

[0078] In some embodiments, the intron is mSV40i, EF1Ai, synthetic intron, and AAT / HBBi, or a combination thereof. In some embodiments, the intron comprises a sequence having at least 90%sequence identity to mSV40i, EF1Ai, synthetic intron, and AAT / HBBi, or a combination thereof. In some embodiments, the intron comprises a sequence having at least 75 %, 80%, 85%, 90%, or 95%sequence identity with mSV40i, EF1Ai, synthetic intron, and AAT / HBBi, or a combination thereof. In some embodiments, the intron comprises a sequence having at least 90%identity to mSV40i, EF1Ai, synthetic intron, and AAT / HBBi, or a combination thereof.

[0079] In some embodiments, the polynucleotide sequence further comprises a polyadenylation sequence extended from the 3’ end of the coding sequence of MYBPC3. In some embodiments, the polyadenylation sequence is a wild type or modified poly (A) sequence sharing at least 80%identity to one of modified SV40 late poly (A) , SV40 early poly (A) , SV40 late poly (A) , human growth hormone poly (A) , bovine growth hormone poly (A) , rabbit beta-globin poly (A) (SEQ ID NO: 41) , any modified rabbit beta-globin poly (A) , or a synthetic poly (A) (SEQ ID NO: 42) .

[0080] In some embodiments, the polyadenylation sequence is selected from the group consisting of a modified SV40 late poly (A) , SV40 early poly (A) , SV40 late poly (A) , rabbit beta-globin poly (A) , modified synthetic poly (A) , human growth hormone poly (A) , and bovine growth hormone poly (A) . In some embodiments, the polyadenylation sequence comprises a sequence having at least 90%identity to a modified SV40 late poly (A) , SV40 early poly (A) , SV40 late poly (A) , rabbit beta-globin poly (A) , modified synthetic poly (A) , human growth hormone poly (A) , and bovine growth hormone poly (A) .

[0081] In some embodiments, the polyadenylation sequence shares at least 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%identity to any one of modified SV40 late poly (A) , SV40 early poly (A) , SV40 late poly (A) , rabbit beta-globin poly (A) , modified synthetic poly (A) , human growth hormone poly (A) , and bovine growth hormone poly (A) . In some embodiments, the polyadenylation sequence comprises a sequence having at least 90%identity to a modified SV40 late poly (A) , SV40 early poly (A) , SV40 late poly (A) , rabbit beta-globin poly (A) , modified synthetic poly (A) , human growth hormone poly (A) , and bovine growth hormone poly (A) .

[0082] In some embodiments, the coding sequence of MYBPC3 comprises a reduced number of CpG dinucleotides as compared to the wild type MYBPC3 sequence. In some embodiments, the coding sequence of MYBPC3 comprises less than 100, less than 80, lessen than 60, less than 40, less than 20, less than 15, less than 10, or less than 5 CpG dinucleotides. In some embodiments, the coding sequence of MYBPC3 comprises not more than 50%of CpG as compared to the wild type MYBPC3 sequence. In some embodiments, the coding sequence of MYBPC3 comprises 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, or 41-50 CpG dinucleotides. In some embodiments, the coding sequence of MYBPC3 comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, or 50 CpG dinucleotides. In some embodiments, the coding sequence of MYBPC3 comprises from 0 to 50 CpG dinucleotides. In some embodiments, the coding sequence of MYBPC3 comprises 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100 CpG dinucleotides. In some embodiments, the coding sequence of MYBPC3 comprises from 50 to 100 CpG dinucleotides. In some embodiments, the coding sequence of MYBPC3 comprises from 100 to 150 CpG dinucleotides. In some embodiments, the coding sequence of MYBPC3 comprises no more than 196 CpG dinucleotides. In some embodiments, the coding sequence of MYBPC3 comprises is SEQ ID NOs: 26-33. In some embodiments, wherein the polynucleotide sequence comprises not more than 200 or not more than 100 CpG dinucleotides. In some embodiments, the polynucleotide sequence comprises from 200 to 500 CpG dinucleotides.

[0083] In some embodiments, the recombinant rAAV protein comprises an AAV cap protein. In some embodiments, the AAV cap protein can be any structural protein known in the art that can form a functional AAV capsid (i.e., packaging DNA and infecting target cells) . In some embodiments, the cap protein includes VP1, VP2, and VP3. In some embodiments, the cap protein does not need to comprise all of VP1, VP2, and VP3, as long as it can produce a functional AAV capsid. In some embodiments, the cap protein includes VP1 and VP2. In some embodiments, the cap protein comprises VP1 and VP3. In some embodiments, the cap protein includes VP2 and VP3. In some embodiments, the case, the cap protein comprises VP1. In some embodiments, the cap protein includes VP2. In some embodiments, the cap protein includes VP3.

[0084] VP1, VP2, or VP3 may be derived from any AAV serotype. In some embodiments, the VP1 may be derived from AAV serotype 1 (AAV1) , AAV serotype 2 (AAV2) , AAV2 variants, AAV serotype 3 (AAV3, including serotypes 3A and 3B) , AAV serotype 4 (AAV4) , the AAV serotype 5 (AAV5) , the AAV serotype 6 (AAV6) , the AAV serotype 7 (AAV7) , the AAV serotype 8 (AAV8) , the AAV serotype 9 (AAV9) , the AAV serotype 10 (AAV10) , AAV serotype 11 (AAV11) , AAV serotype 12 (AAV12) , AAV serotype 13 (AAV13) , AAVrh10, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, or any other known AAVs. In some embodiments, the VP1 and the wildtype VP1 derived from AAV1, AAV2, AAV3, (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, may have at least 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, or more sequence identity. In some embodiments case, the VP1 has one or more amino acid substitutions, deletions, additions, or any combination thereof compared to the wildtype VP1 derived from AAV1, AAV2, AAV3 (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, of AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, or MyoAAV.

[0085] In some embodiments, the VP2 may be derived from AAV serotype 1 (AAV1) , AAV serotype 2 (AAV2) , AAV2 variants, AAV serotype 3 (AAV3, including serotypes 3A and 3B) , AAV serotype 4 (AAV4) , the AAV serotype 5 (AAV5) , the AAV serotype 6 (AAV6) , the AAV serotype 7 (AAV7) , the AAV serotype 8 (AAV8) , the AAV serotype 9 (AAV9) , the AAV serotype 10 (AAV10) , AAV serotype 11 (AAV11) , AAV serotype 12 (AAV12) , AAV serotype 13 (AAV13) , AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, or any other known AAVs. In some embodiments, the VP2 and the wildtype VP2 derived from AAV1, AAV2, AAV3, (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, or MyoAAV, may have at least 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, or more sequence identity. In some embodiments case, the VP2 has one or more amino acid substitutions, deletions, additions, or any combination thereof compared to the wildtype VP2 derived from AAV1, AAV2, AAV3 (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, of AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, or MyoAAV.

[0086] The VP3 may be derived from AAV serotype 1 (AAV1) , AAV serotype 2 (AAV2) , AAV2 variants, AAV serotype 3 (AAV3, including serotypes 3A and 3B) , AAV serotype 4 (AAV4) , the AAV serotype 5 (AAV5) , the AAV serotype. 6 (AAV6) , the AAV serotype 7 (AAV7) , the AAV serotype 8 (AAV8) , the AAV serotype 9 (AAV9) , the AAV serotype 10 (AAV10) , AAV serotype 11 (AAV11) , AAV serotype 12 (AAV12) , AAV serotype 13 (AAV13) , AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, AAV-DJ, AAVHSC, LK03, KP1, NP59 or any other known AAVs. In some embodiments, the VP3 and the wildtype VP3 derived from AAV1, AAV2, AAV2 variants, AAV3, (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, AAV-DJ, AAVHSC, LK03, KP1, or NP59 may have at least 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, or more sequence identity. In some embodiments case, the VP3 has one or more amino acid substitutions, deletions, additions, or any combination thereof compared to the wildtype VP3 derived from AAV1, AAV2, AAV2 variants, AAV3 (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, of AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, AAV-DJ, AAVHSC, LK03, KP1 or NP59.

[0087] In some embodiments, the cap protein comprises VP1, VP2, VP3, or any combinations thereof derived from AAV of the same serotype; for example, the cap protein may comprise VP1, VP2, VP3, or any combinations thereof derived from AAV2, AAV2 variants, AAV5, or AAV8. In some embodiments, the cap comprises VP1, VP2, VP3, or any combinations thereof derived from different serotypes of AAV; for example, the cap protein may comprise any one or more of VP1, VP2, VP3, or any combination thereof of AAV1, AAV2, AAV2 variants, AAV3, (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, AAV-DJ, AAVHSC, LK03, KP1, or NP59.

[0088] In some embodiments, the cap protein may be cloned into pUC19, pUC57, pFastBac1, modified pUC19, modified pUC57, or modified pFastBac1. In some embodiments, the cap protein may be cloned into pUC57. In some embodiments, the cap protein may be cloned into pFastBac1. In some embodiments, the cap protein may be cloned into modified pUC57. In some embodiments, the cap protein may be cloned into modified pFastBac1.

[0089] In some embodiments, the polynucleotide sequence encoding the cap protein is operably linked to a first promoter. The first promoter may be any suitable promoter known in the art that can drive the expression of the cap protein. In some embodiments, the first promoter may be a tissue-specific promoter, a constitutive promoter, or a regulatable promoter. In some embodiments, the first promoter can be selected from different sources, for example, the first promoter can be a viral promoter, a plant promoter, or a mammalian promoter.

[0090] The first promoter can include, but are not limited to, a human cytomegalovirus (CMV) immediate-early enhancer or promoter, a SV40 early enhancer or promoter, a JC polyomavirus promoter, a myelin basic Protein (MBP) or a glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoter, a herpes simplex virus (HSV-1) latency-related promoter (LAP) , a Rous sarcoma virus (RSV) long terminal repeat (LTR) promoter, a neuron specific promoter (NSE) , a platelet-derived growth factor (PDGF) promoter, hSYN, a melanin aggregation hormone (MCH) promoter, CBA, a matrix metal protein promoter (MMP) , a chicken β-actin promoter, CAG, MNDU3, PGK and an EF1a promoter.

[0091] In some embodiments, the first promoter is a promoter suitable for expression in insect cells. In some embodiments, the promoter suitable for expression in insect cells include, but are not limited to a polh promoter, a p10 promoter, a basic promoter, an inducible promoter, an E1 promoter, or a ΔE1 promoter. In some embodiments, the first promoter is a polh promoter. In some embodiments, the first promoter is a p10 promoter.

[0092] In some embodiments, the 3’ end of a DNA sequence, such as, for example, the cap protein sequence or the MYBPC3 sequence, further comprises a polyadenylation sequence or “poly A sequence” . In some embodiments, the 3’ end of the MYBPC3 further comprises a polyadenylation sequence or “poly A sequence” . In some embodiments, the polyadenylation sequences or “poly A sequences” may range from about l to about 500 base pairs (bp) . In some embodiments, the polyadenylation sequence or “poly A sequence” may be, but is not limited to, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 50, 100, 200, or 500 nucleotides.

[0093] In some embodiments, the coding sequence of MYBPC3 protein is operably linked to a promoter. The promoter may be any suitable promoter known in the art that can drive the expression of the cMyBP-C protein. In some embodiments, the promoter may be a tissue-specific promoter, a constitutive promoter, or a regulatable promoter. In some embodiments, the promoter can be selected from different sources, for example, the promoter can be a viral promoter, a plant promoter, or a mammalian promoter. In some embodiment, the promoter is a ubiquitous promoter, a muscle promoter, or a cardiac promoter. In some embodiments, the cardiac promoter is a cardiac troponin T (TNNT2 or cTnT) promoter (SEQ ID NO: 38) , an alpha myosin heavy chain (α-MHC) promoter, a beta myosin heavy chain (β-MHC) promoter, a cardiac troponin I (cTnI) promoter, a cardiac troponin C promoter, a natriuretic peptide A gene (NPPA) promoter, a myosin light chain 2 (MLC-2) promoter (SEQ ID NO: 39) , a myosin light chain 2v (MLC-2v) promoter, a cardiac sodium–calcium exchanger-1 (NCX1) promoter, an alpha-cardiac actin promoter, an alpha-tropomyosin promoter, an alpha-cardiac actin promoter, an alpha-tropomyosin promoter, a cardiac myosin-binding protein C promoter, a sarco / endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase isoform 2 (SERCA2) promoter, or any other cardiac promoter. In some embodiments, the promoter for the capsid protein sequence is a chicken beta-actin (CAG) promoter, modified MLV long terminal repeat promoter (MNDU3) , mouse phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, and a human elongation factor-1 alpha (EF1a) promoter. In some embodiments, the promoter includes, but is not limited to, a human cytomegalovirus (CMV) immediate-early enhancer or promoter, a SV40 early enhancer or promoter, a JC polyomavirus promoter, a myelin basic Protein (MBP) or a glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoter, a herpes simplex virus (HSV-1) latency-related promoter (LAP) , a Rous sarcoma virus (RSV) long terminal repeat (LTR) promoter, a neuron specific promoter (NSE) , a platelet-derived growth factor (PDGF) promoter, hSYN, a melanin aggregation hormone (MCH) promoter, CBA, or a matrix metal protein promoter (MMP) .

[0094] In some embodiments, the rep protein can be a replication protein necessary for any rAAV vector to replicate and be packaged into rAAV viral particles. In some embodiments, the rep protein comprises rep78, rep68, rep52 or rep40. In some embodiments, the rep protein may not comprise all of rep78, rep68, rep52, or rep40, as long as it can allow the rAAV vector to replicate or be packaged into rAAV virus particles. In some embodiment, the rep protein comprises any three of rep78, rep 68, rep52 or rep 40. In some embodiment, the rep protein comprises any two of rep78, rep 68, rep52 or rep 40. In some embodiment, the rep protein comprises any one of rep78, rep 68, rep52 or rep 40. In some embodiment, the rep protein comprises rep78 or rep52. In some embodiment, the rep protein comprises rep78 or rep 40. In some embodiment, the rep protein comprises rep68 or rep52. In some embodiment, the rep protein comprises rep68 or rep40.

[0095] Proteins rep78, rep68, rep52, or rep40 may be derived from any AAV serotype. In some embodiments, the rep78 may be derived from AAV serotype 1 (AAV1) , AAV serotype 2 (AAV2) , AAV serotype 3 (AAV3, including serotypes 3A and 3B) , AAV serotype 4 (AAV4) , the AAV serotype 5 (AAV5) , the AAV serotype 6 (AAV6) , the AAV serotype 7 (AAV7) , the AAV serotype 8 (AAV8) , the AAV serotype 9 (AAV9) , the AAV serotype 10 (AAV10) , AAV serotype 11 (AAV11) , AAV serotype 12 (AAV12) , AAV serotype 13 (AAV13) , AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, or any other known AAVs. In some embodiments, the rep78 and the wildtype rep78 derived from AAV1, AAV2, AAV3, (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, or MyoAAV, may have at least 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, or more sequence identity. In some embodiments case, the rep78 has one or more amino acid substitutions, deletions, additions, or any combination thereof compared to the wildtype rep78 derived from AAV1, AAV2, AAV3 (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, or MyoAAV.

[0096] In some embodiments, the rep68 may be derived from AAV serotype 1 (AAV1) , AAV serotype 2 (AAV2) , AAV serotype 3 (AAV3, including serotypes 3A and 3B) , AAV serotype 4 (AAV4) , the AAV serotype 5 (AAV5) , the AAV serotype 6 (AAV6) , the AAV serotype 7 (AAV7) , the AAV serotype 8 (AAV8) , the AAV serotype 9 (AAV9) , the AAV serotype 10 (AAV10) , AAV serotype 11 (AAV11) , AAV serotype 12 (AAV12) , AAV serotype 13 (AAV13) , AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, or any other known AAVs. In some embodiments, the rep68 and the wildtype rep68 derived from AAV1, AAV2, AAV3, (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, or MyoAAV, may have at least 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, or more sequence identity. In some embodiments case, the rep68 has one or more amino acid substitutions, deletions, additions, or any combination thereof compared to the wildtype rep68 derived from AAV1, AAV2, AAV3 (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV-rh10, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, or MyoAAV.

[0097] In some embodiments, the rep52 may be derived from AAV serotype 1 (AAV1) , AAV serotype 2 (AAV2) , AAV serotype 3 (AAV3, including serotypes 3A and 3B) , AAV serotype 4 (AAV4) , the AAV serotype 5 (AAV5) , the AAV serotype 6 (AAV6) , the AAV serotype 7 (AAV7) , the AAV serotype 8 (AAV8) , the AAV serotype 9 (AAV9) , the AAV serotype 10 (AAV10) , AAV serotype 11 (AAV11) , AAV serotype 12 (AAV12) , AAV serotype 13 (AAV13) , AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, or any other known AAVs. In some embodiments, the rep52 and the wildtype rep52 derived from AAV1, AAV2, AAV3, (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, or MyoAAV, may have at least 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, or more sequence identity. In some embodiments case, the rep52 has one or more amino acid substitutions, deletions, additions, or any combination thereof compared to the wildtype rep52 derived from AAV1, AAV2, AAV3 (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, or MyoAAV.

[0098] In some embodiments, the rep protein comprises rep78, rep68, rep52, or rep40, or any combinations thereof derived from AAV of the same serotype; for example, the rep protein may comprise rep78, rep68, rep52, rep40, or any combinations thereof derived from AAV2. In some embodiments, the rep protein comprises rep78, rep68, rep52, rep40, or any combinations thereof derived from different serotypes of AAVs; for example, the rep protein may comprise any one or more of rep78, rep68, rep52, rep40, or any combination thereof of AAV1, AAV2, AAV3, (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, or MyoAAV.

[0099] In some embodiments, the second sequence encoding the rep protein is operably linked to a second promoter. The second promoter may be any suitable promoter known in the art that can drive the expression of the rep protein. In some embodiments, the second promoter may be a tissue-specific promoter, a constitutive promoter, or a regulatable promoter. In some embodiments, the second promoter can be selected from different sources, for example, the second promoter can be a viral promoter, a plant promoter, or a mammalian promoter.

[0100] In some embodiments, the rep protein may be cloned into pUC19, pUC57, pFastBac1, modified pUC57, or modified pFastBac1. In some embodiments, the rep protein may be cloned into pUC57. In some embodiments, the rep protein may be cloned into pFastBac1. In some embodiments, the rep protein may be cloned into modified pUC57. In some embodiments, the rep protein may be cloned into modified pFastBac1.

[0101] The second promoter can include, but are not limited to, a human cytomegalovirus (CMV) immediate-early enhancer or promoter, a SV40 early enhancer or promoter, a JC polyomavirus promoter, a myelin basic protein (MBP) or a glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoter, a herpes simplex virus (HSV-1) latency-related promoter (LAP) , a Rous sarcoma virus (RSV) long terminal repeat (LTR) promoter, a neuron specific promoter (NSE) , a platelet-derived growth factor (PDGF) promoter, hSYN, a melanin aggregation hormone (MCH) promoter, CBA, a matrix metal protein promoter (MPP) , a chicken β-actin promoter, CAG, MNDU3, PGK and an EF1a promoter.

[0102] In some embodiments, the second promoter is a promoter suitable for expression in insect cells. In some embodiments, the promoter suitable for expression in insect cells include, but are not limited to a polh promoter, a p10 promoter, a basic promoter, an inducible promoter, an E1 promoter, or a ΔE1 promoter. In some embodiments, the second promoter is a polh promoter. In some embodiments, the second promoter is a p10 promoter.

[0103] In some embodiments, the cap protein and rep protein are derived from AAV of the same serotype; for example, the cap protein and rep protein may be derived from AAV1, AAV2, AAV2 variants, AAV3 (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, or any other known AAVs.

[0104] In some embodiments, the cap protein and the rep protein are derived from different serotypes of AAV; for example, the cap protein and the rep protein may be derived from AAV1, AAV2, AAV3, (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, or any other known AAVs. For example, in some embodiments, the cap protein may be derived from AAV5, and the rep protein is derived from the AAV2. In some embodiments, the cap protein may be derived from AAV8 variants, and the rep protein is derived from the AAV2. In some embodiments, the cap protein may be derived from AAV3 variants, and the rep protein is derived from the AAV2.

[0105] In some embodiments, the first promoter and the second promoter may be the same promoter. For example, the first promoter and the second promoter may be selected from the group consisting of a polh promoter, a p10 promoter, a basic promoter, an inducible promoter, an E1 promoters, and a ΔE1 promoter. For example, in some embodiments, the first promoter and the second promoter are both polh promoters. In some embodiments, the first promoter and the second promoter are both p10 promoters.

[0106] In some embodiments, the first promoter and the second promoter may comprise different promoters. For example, the first promoter and the second promoter may be from the group consisting of a polh promoter, a p10 promoter, a basic promoter, an inducible promoter, an E1 promoters, and a ΔE1 promoter. For example, in some embodiments, the first promoter is the polh promoter and the second promoter is the p10 promoter. In some embodiments, the first promoter is the p10 promoter and the second promoter is the polh promoter.

[0107] In some embodiments, the first or second promoter may be cloned into pUC57, pFastBac1, modified pUC57, or modified pFastBac1. In some embodiments, the first or second promoter may be cloned into pUC57. In some embodiments, the first or second promoter may be cloned into pFastBac1. In some embodiments, the first or second promoter may be cloned into modified pUC57. In some embodiments, the first or second promoter may be cloned into modified pFastBac1.

[0108] In some embodiments, the cap protein, rep protein, first promoter, and second promoter may be cloned into pUC57, pFastBac1, modified pUC57, or modified pFastBac1. In some embodiments, the cap protein, rep protein, first promoter, and second promoter may be cloned into pUC57. In some embodiments, the cap protein, rep protein, first promoter, and second promoter may be cloned into pFastBac1. In some embodiments, the cap protein, rep protein, first promoter, and second promoter may be cloned into modified pUC57. In some embodiments, the cap protein, rep protein, first promoter, and second promoter may be cloned into modified pFastBac1.

[0109] In some embodiments, the first sequence and the second sequence are linked by a sequence encoding a linker, such as, for example a cleavable linker. In some embodiments, the cleavable linker is a sequence comprising a 2A peptide. In some embodiments, the 2A peptide may be selected from the 2A peptides derived from Aphthorvirus or Cardiovirus, such as foot-and-mouth disease virus (FMDV) , Equine rhinitis A virus (ERAV) , Thosea asigna virus (TaV) or porcine teschovirus (PTV-1) . In some embodiments, the sequence encoding the linker further comprises a promoter sequence. In some embodiments, the promoter is an FMDV promoter.

[0110] In some embodiments, the polynucleotide comprising the MYBPC3 sequence further comprises an enhancer region. In some embodiments, the enhancer region includes an SV40 enhancer, an immediate early cytomegalovirus enhancer, and an enhancer derived from an immunoglobulin gene. In some embodiments, the enhancer region is located upstream of the promoter. In some embodiments, the enhancer is located upstream of the cardiac promoter. In some embodiments, the enhancer region is located downstream of the promoter. In some embodiments, the enhancer is located downstream of the cardiac promoter.

[0111] In some embodiments, the polynucleotide comprising the MYBPC3 sequence further comprises an inverted terminal repeat (ITR) . In some embodiments, the second polynucleotide comprises at least one inverted terminal repeat (ITR) . In some embodiments, the second polynucleotide comprises two inverted terminal repeats (ITR) . In some embodiments, the two ITRs are the same. In some embodiments, the two ITRs are different. In some embodiments, the inverted terminal repeat (ITR) is an ITR derived from AAV. In some embodiment, the 5’ ITR is SEQ ID NO: 43. In some embodiments, the 3’ ITR is SEQ ID NO: 44. In some embodiments, the ITR may be derived from AAV1, AAV2, AAV3, (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, and any other known ITRs of AAVs. In some embodiments, the ITR may have one or more base mutations, insertions or deletions, compared to the one derived from AAV1, AAV2, AAV3, (including AAV3A and 3B) , AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVrh10, AAVrh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, and any other known wild-type ITRs of AAVs, wherein the ITR retain the desired terminal repeat function, such as target gene replication, virus packaging, viral genome integration, or any combination thereof. In some cases, the ITR sequence is an AAV2 ITR sequence. In some cases, the ITR sequence is a variant of AAV2 ITR sequence.

[0112] In some embodiments, the MYBPC3 coding sequence may be cloned into pUC57, pFastBac1, modified pUC57, or modified pFastBac1. In some embodiments, the MYBPC3 coding sequence may be cloned into pUC57. In some embodiments, the MYBPC3 coding sequence may be cloned into pFastBac1. In some embodiments, the MYBPC3 coding sequence may be cloned into modified pUC57. In some embodiments, the MYBPC3 coding sequence may be cloned into modified pFastBac1.

[0113] In some embodiments, the polynucleotide comprising the MYBPC3 sequence further comprises one or more stuffer sequences. In some embodiments, the stuffer sequence is located upstream of the cardiac promoter. In some embodiments, the stuffer sequence is located downstream of the cardiac promoter. In some embodiments, the stuffer sequence is located at the 5’ end of the 5’ ITR sequence. In some embodiments, the stuffer sequence is located at the 3’ end of the 5’ ITR sequence. In some embodiments, the stuffer sequence is located at the 5’ end of the 3’ ITR sequence. In some embodiments, the stuffer sequence is located at the 5’ end of the 3’ ITR sequence. In some embodiments, the stuffer sequence is located at the 3' end of the 3'ITR sequence

[0114] In some embodiments, the length of the stuffing sequence may be about 0 kb -5 kb, such as but not limited to 0.005 kb, 0.1 kb, 0.2 kb, 0.3 kb, 0.4 kb, 0.5 kb, 0.6 kb, 0.7 kb, 0.8 kb, 0.9 kb, 1 kb, 1.1 kb, 1.2 kb, 1.3 kb, 1.4 kb, 1.5 kb, 1.6 kb, 1.7 kb, 1.8 kb, 1.9 kb, 2 kb, 2.1 kb, 2.2 kb, 2.3 kb, 2.4 kb, 2.5 kb, 2.6 kb, 2.7 kb, 2.8 kb, 2.9 kb, 3 kb, 3.1 kb, 3.2 kb, 3.3 kb, 3.4 kb, 3.5 kb, 3.6 kb, 3.7 kb, 3.8 kb, 3.9 kb, 4.0 kb, 4.1 kb, 4.2 kb, 4.3 kb, 4.4 kb, 4.5 kb, 4.6 kb, 4.7 kb, 4.8 kb, 4.9 kb or 5.0 kb. Recombinant AAV virus particles

[0115] In another aspect, the present disclosure provides a recombinant adeno-associated virus (rAAV) particle prepared by introducing or transfecting the composition of the present disclosure into a host cell. In some embodiments, the host cell is an insect cell, a human cell or an animal cell. In some embodiments, the insect cell is Drosophila S2 cells or Sf9 cells. In some embodiments, the animal cell is fibroblasts, Chinese hamster ovary (CHO) cells, COS cells, murine myeloma (NS0) cells, Baby Hamster Kidney (BHK) cells. In some embodiments, the human cell is human embryonic kidney 293 (HEK293) cells, human fibrosarcoma (HT-1080) cells, differentiated hepatocyte-derived carcinoma (Huh-7) cells, HeLa cells, or PER. C6 cells. In some embodiments, the host cell is a mammalian cell. In some embodiments, the mammalian cell is HEK293 cell or its derivatives such as 293T cells.

[0116] In some embodiments, the preparation includes, but is not limited to, electroporation, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection. In some embodiments, the composition is transfected into the 293T cells with a helper plasmid. In some embodiments, the 293T cells are used to produce the rAAV virus particles.

[0117] In some embodiments, the composition of the present disclosure may be delivered into the insect cell by any method known in the art. In some embodiments, the method includes, but is not limited to, electroporation, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, and / or infection. In some embodiments, the composition is infected into the insect cell. In some embodiments, the composition is stably transfected into the insect cell.

[0118] In some embodiments, the method for preparing recombinant AAV virus particles may comprise generating bacmid DNA and / or baculovirus / Sf9 system. In some embodiments, the method for preparing recombinant AAV virus particles may comprise generating bacmid DNA containing MYBPC3 coding sequence. In some embodiments, the method for preparing recombinant AAV virus particles may comprise generating bacmid DNA containing rAAV rep-cap coding sequence. In some embodiments, the method for preparing recombinant AAV virus particles may comprise transfecting a host cell with the bacmid DNA to produce baculoviruses. In some embodiments, the method for preparing recombinant AAV virus particles may comprise transfecting a host cell with the bacmid DNA containing MYBPC3 coding sequence to produce baculoviruses. In some embodiments, the method for preparing recombinant AAV virus particles may comprise transfecting a host cell with the bacmid DNA containing rAAV rep-cap coding sequence to produce baculoviruses. In some embodiments, the method for preparing recombinant AAV virus particles may further comprise mixing the two baculoviruses to infect a host cell (such as the Sf9 cell) to obtain packaged rAAV / MYBPC3-optimized virus particles of the present disclosure.

[0119] In some embodiments, the method for preparing recombinant AAV virus particles may comprise (1) generating a bacmid DNA containing MYBPC3 coding sequence, (2) generating a bacmid DNA containing rAAV cap coding sequence, (3) transfecting a host cell with the bacmid DNA to produce baculoviruses, (4) transfecting a host cell with the bacmid DNA containing MYBPC3 coding sequence to produce baculoviruses, (5) transfecting a host cell with the bacmid DNA containing rAAV cap coding sequence to produce baculoviruses, and (6) mixing the two baculoviruses to infect a host cell (such as the Sf9 cell) to obtain packaged rAAV / MYBPC3-optimized virus particles of the present disclosure.

[0120] If necessary, in some cases, the rAAV virus particles can be isolated and purified from the insect cells according to conventional methods known to those skilled in the art. For example, the rAAV can be purified using centrifugation, HPLC, hydrophobic interaction chromatography (HIC) , anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, size exclusion chromatography, ultrafiltration, gel electrophoresis, affinity chromatography, other purification techniques, or any combinations thereof. Systems

[0121] In another aspect, the present disclosure provides a system for treating HCM in a subject in need thereof, which comprises the rAAV particles of the present disclosure and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

[0122] As used herein, “pharmaceutically or therapeutically acceptable carrier or excipient” refers to a carrier medium that does not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active ingredient and is non-toxic to the host or patient. The type of carrier used in the pharmaceutical formulation depend on the method of administration of the therapeutic compound. Many methods of preparing pharmaceutical compositions for multiple routes of administration are well known in the art.

[0123] In various embodiments, the rAAV particle or compositions of the present disclosure may also be provided in combination with an additional agent in the treatment of HCM. Methods

[0124] In another aspect, the present disclosure provides a method for treating HCM, which comprises administering a therapeutically effective amount of the system or composition of the present disclosure to a subject in need thereof.

[0125] In some embodiments, the present disclosure provides methods for treating HCM, which comprises administering to a subject in need of treatment an rAAV particle or a pharmaceutical composition comprising a DNA sequence encoding cMyBP-C at an effective dose and an administration interval such that at least one symptom or feature of HCM is reduced in intensity, severity, or frequency or has delayed in onset.

[0126] In some embodiments, the present disclosure provides methods and compositions for delivering a DNA sequence encoding cMyBP-C to a subject for the treatment of HCM. A suitable DNA sequence encodes any full length, fragment or portion of a cMyBP-C protein which can be substituted for naturally-occurring cMyBP-C protein activity and / or reduce the intensity, severity, and / or frequency of one or more symptoms associated with HCM.

[0127] In some embodiments, the system comprising the rAAV particles is provided in a therapeutically effective amount that achieves the desired biological effect at a medically acceptable level of toxicity. The dosage can vary according to the route of administration and the severity of the disease. The dosage can also be adjusted according to the weight, age, sex, degree of symptoms of each patient to be treated, or any combinations thereof. The precise dosage and route of administration can ultimately be determined by the treating doctor or veterinarian. Understandably, the dosage may need to be routinely changed according to the age and weight of the patient and the severity of the condition to be treated.

[0128] In some embodiments, the therapeutically effective amount is generally about 1×10^8 to 1×10^18 rAAV virus particles. In some embodiments, the therapeutically effective amount is generally about 1×10^9 to 1×10^17 rAAV virus particles. In some embodiments, the therapeutically effective amount is generally about 1×10^10 to 1×10^17 rAAV virus particles. In some embodiments, the therapeutically effective amount is generally about 1×10^11 to 1×10^17 rAAV virus particles. In some embodiments, the therapeutically effective amount is generally about 1×10^12 to 1×10^17 rAAV virus particles. In some embodiments, the therapeutically effective amount is generally about 1×10^13 to 1×10^17 rAAV virus particles. In some embodiments, the therapeutically effective amount is generally about 1×10^14 to 1×10^17 rAAV virus particles. In some embodiments, the therapeutically effective amount is generally about 1×10^15 to 1×10^17 rAAV virus particles. In some embodiments, the therapeutically effective amount is generally about 1×10^16 to 1×10^17 rAAV virus particles.

[0129] In some embodiments, the frequency of administration may be applied at least once a day, including 2, 3, 4, or 5 times a day. In some embodiments, the treatment can last for 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days, 17 days, 18 days, 19 days, 20 days, 21 days, 22 days, 23 days, 24 days, 25 days, 26 days, 27 days, 28 days, 29 days, 30 days, 31 days, 32 days, 33 days, 34 days, 35 days, 36 days, 37 days, 38 days, 39 days, 40 days, 41 days, 42 days, 43 days, 44 days, 45 days, 46 days, 47 days, 48 days, 49 days, 50 days, 60 days, 70 days, 80 days, 90 days, 100 days, 150 days, 200 days, 250 days, 300 days, 400 days, 500 days, 750 days, 1000 days, or more than 1000 days.

[0130] Provided methods of the present invention contemplate single as well as multiple administrations of a therapeutically effective amount of the therapeutic agents (e.g., rAAV comprising a DNA sequence encoding a cMyBP-C protein) described herein. Therapeutic agents can be administered at regular intervals, depending on the nature, severity and extent of the subject's condition (e.g., HCM) . In some embodiments, a therapeutically effective amount of the therapeutic agents (e.g., rAAV comprising a DNA sequence encoding a cMyBP-C protein) described here may be administered intra-vascularly periodically at regular intervals (e.g., once every year, once every six months, once every five months, once every three months, bimonthly (e.g., once every two months) , monthly (e.g., once every month) , biweekly (e.g., once every two weeks, every other week) , weekly, daily or continuously) .

[0131] In some embodiments, provided rAAV and / or compositions comprising rAAV are formulated such that they are suitable for extended-release of the DNA encoding a cMyBP-C protein contained therein. Such extended-release compositions may be conveniently administered to a subject at extended dosing intervals. For example, in some embodiments, the compositions of the present disclosure are administered to a subject twice day, daily or every other day. In some embodiments, the compositions of the present invention are administered to a subject twice a week, once a week, every 7 days, every 10 days, every 14 days, every 28 days, every 30 days, every two weeks (e.g., every other week) , every three weeks, or more preferably every four weeks, once a month, every six weeks, every eight weeks, every other month, every three months, every four months, every six months, every eight months, every nine months or annually. Also contemplated are compositions which are formulated for depot administration (e.g., intramuscularly, subcutaneously) to either deliver or release rAAV over extended periods of time.

[0132] In some embodiments, a therapeutically effective amount of the composition can be determined based on the total amount of the therapeutic agent contained in the pharmaceutical compositions of the present disclosure. As disclosed above, a therapeutically effective amount is sufficient to achieve a meaningful benefit to the subject (e.g., treating, modulating, curing, preventing and / or ameliorating HCM) . For example, a therapeutically effective amount can be an amount sufficient to achieve a desired therapeutic and / or prophylactic effect. In some cases, the amount of a therapeutic agent (e.g., rAAV comprising a DNA sequence encoding a cMyBP-C protein) administered to a subject in need thereof depends upon the characteristics of the subject. Such characteristics include the condition, disease severity, general health, age, sex and body weight of the subject. In some cases, both objective and subjective assays can optionally be employed to identify optimal dosage ranges.

[0133] A therapeutically effective amount is commonly administered in a dosing regimen that may comprise multiple unit doses. For any particular therapeutic protein or therapeutic agent or therapeutic composition, a therapeutically effective amount (and / or an appropriate unit dose within an effective dosing regimen) can vary, for example, depending on route of administration, on combination with other pharmaceutical agents. In some cases, the specific therapeutically effective amount (and / or unit dose) for any particular patient can depend upon a variety of factors including the disorder being treated and the severity of the disorder; the activity of the specific pharmaceutical agent employed; the specific composition employed; the age, body weight, general health, sex and diet of the patient; the time of administration, route of administration, and / or rate of excretion or metabolism of the specific protein employed; the duration of the treatment; etc.

[0134] In some cases, a therapeutically effective dose of the provided composition, when administered regularly, results in increased expression of cardiac cMyBP-C protein as compared to baseline levels before treatment. In some embodiments, administering the provided composition results in the expression of a cMyBP-C protein level at or above about 100 ng / mg, about 200 ng / mg, about 300 ng / mg, about 400 ng / mg, about 500 ng / mg, about 600 ng / mg, about 700 ng / mg, about 800 ng / mg, about 900 ng / mg, about 1,000 ng / mg, about 1,200 ng / mg or about 1,400 ng / mg of total protein in the heart.

[0135] In some embodiments, the composition is administered by intra-vascular injection (intravenous or intra-arterial injection) or directly injecting into the heart. In some embodiment, The dose of rAAV vector to be administered in methods disclosed herein may vary depending, for example, on the particular rAAV vector, the mode of administration, the treatment goal, the individual subject, and the cell type (s) being targeted, and may be determined by methods standard in the art.

[0136] In some embodiments, one or more neuropsychiatric tests can be used to determine a therapeutically effective dose. In some embodiments, an improvement on one or more neuropsychiatric tests of at least 10%, 20%, 30%, 40%or 50%as compared to either the individual before treatment, or an untreated control individual, indicates that a particular dose is a therapeutically effective amount. In some embodiments, a suitable neuropsychiatric test may be the Inattentive portion of the Attention Deficit and Hyperactivity Disorder Rating Scale (ADHD-RS) and / or the Profile of Mood States (POMS) .

[0137] The therapeutically effective dose ranges may be expressed in units of viral genomes (vg) per kilogram (kg) of bodyweight (vg / kg) . In some embodiments, the therapeutically effective dose is about 1×107 vg / kg, 1×108 vg / kg, 1×109 vg / kg, 1×1010 vg / kg, 1×1011 vg / kg, 1×1012 vg / kg, 1×1013 vg / kg, 1×1014 vg / kg, 1×1015 vg / kg, 1×1016 vg / kg, or 1×1017 vg / kg. In some embodiment, the therapeutically effective dose is about 1×107 vg / kg, 2×107 vg / kg, 3×107 vg / kg, 4×107 vg / kg, 5×107 vg / kg, 6×107 vg / kg, 7×107 vg / kg, 8×107 vg / kg, or 9×107 vg / kg. In some embodiment, the therapeutically effective dose is about 1×108 vg / kg, 2×108 vg / kg, 3×108 vg / kg, 4×108 vg / kg, 5×108 vg / kg, 6×108 vg / kg, 7×108 vg / kg, 8×108 vg / kg, or 9×108 vg / kg. In some embodiment, the therapeutically effective dose is about 1×109 vg / kg, 2×109 vg / kg, 3×109 vg / kg, 4×109 vg / kg, 5×109 vg / kg, 6×109 vg / kg, 7×109 vg / kg, 8×109 vg / kg, or 9×109 vg / kg. In some embodiment, the therapeutically effective dose is about 1×1010 vg / kg, 2×1010 vg / kg, 3×1010 vg / kg, 4×1010 vg / kg, 5×1010 vg / kg, 6×1010 vg / kg, 7×1010 vg / kg, 8×1010 vg / kg, or 9×1010 vg / kg. In some embodiment, the therapeutically effective dose is about 1×1011 vg / kg, 2×1011 vg / kg, 3×1011 vg / kg, 4×1011 vg / kg, 5×1011 vg / kg, 6×1011 vg / kg, 7×1011 vg / kg, 8×1011 vg / kg, or 9×1011 vg / kg. In some embodiment, the therapeutically effective dose is about 1×1012 vg / kg, 2×1012 vg / kg, 3×1012 vg / kg, 4×1012 vg / kg, 5×1012 vg / kg, 6×1012 vg / kg, 7×1012 vg / kg, 8×1012 vg / kg, or 9×1012 vg / kg. In some embodiment, the therapeutically effective dose is about 1×1013 vg / kg, 2×1013 vg / kg, 3×1013 vg / kg, 4×1013 vg / kg, 5×1013 vg / kg, 6×1013 vg / kg, 7×1013 vg / kg, 8×1013 vg / kg, or 9×1013 vg / kg. In some embodiment, the therapeutically effective dose is about 1×1014 vg / kg, 2×1014 vg / kg, 3×1014 vg / kg, 4×1014 vg / kg, 5×1014 vg / kg, 6×1014 vg / kg, 7×1014 vg / kg, 8×1014 vg / kg, or 9×1014 vg / kg. In some embodiment, the therapeutically effective dose is about 1×1015 vg / kg, 2×1015 vg / kg, 3×1015 vg / kg, 4×1015 vg / kg, 5×1015 vg / kg, 6×1015 vg / kg, 7×1015 vg / kg, 8×1015 vg / kg, or 9×1015 vg / kg. In some embodiment, the therapeutically effective dose is about 1×1016 vg / kg, 2×1016 vg / kg, 3×1016 vg / kg, 4×1016 vg / kg, 5×1016 vg / kg, 6×1016 vg / kg, 7×1016 vg / kg, 8×1016 vg / kg, or 9×1016 vg / kg.

[0138] In some embodiments, the therapeutically effective dose ranges from about 1×107 to about 1×108 vg / kg, about 1×108 to about 1×109 vg / kg, about 1×109 to about 1×1010 vg / kg, about 1×1011 to about 1×1012 vg / kg, about 1×1012 to about 1×1013 vg / kg, about 1×1013 to about 1×1014 vg / kg, about 1×1014 to about 1×1015 vg / kg, about 1×1015 to about 1×1016 vg / kg, or about 1×1016 to about 1×1017 vg / kg.

[0139] In some embodiment, the therapeutically effective dose ranged from about 1×107 to about 2×107 vg / kg, from about 2×107 to about 3×107 vg / kg, from about 3×107 to about 4×107 vg / kg, from about 4×107 to about 5×107 vg / kg, from about 5×107 to about 6×107 vg / kg, from about 6×107 to about 7×107 vg / kg, from about 7×107 to about 8×107 vg / kg, from about 8×107 to about 9×107 vg / kg, or from about 9×107 to about 1×108 vg / kg.

[0140] In some embodiment, the therapeutically effective dose ranges from about 1×108 to about 2×108 vg / kg, from about 2×108 to about 3×108 vg / kg, from about 3×108 to about 4×108 vg / kg, from about 4×108 to about 5×108 vg / kg, from about 5×108 to about 6×108 vg / kg, from about 6×108 to about 7×108 vg / kg, from about 7×108 to about 8×108 vg / kg, from about 8×108 to about 9×108 vg / kg, or from about 9×108 to about 1×109 vg / kg.

[0141] In some embodiment, the therapeutically effective dose ranges from about 1×109 to about 2×109 vg / kg, from about 2×109 to about 3×109 vg / kg, from about 3×109 to about 4×109 vg / kg, from about 4×109 to about 5×109 vg / kg, from about 5×109 to about 6×109 vg / kg, from about 6×109 to about 7×109 vg / kg, from about 7×109 to about 8×109 vg / kg, from about 8×109 to about 9×109 vg / kg, or from about 9×109 to about 1×1010 vg / kg.

[0142] In some embodiment, the therapeutically effective dose ranges from about 1×1010 to about 2×1010 vg / kg, from about 2×1010 to about 3×1010 vg / kg, from about 3×1010 to about 4×1010 vg / kg, from about 4×1010 to about 5×1010 vg / kg, from about 5×1010 to about 6×1010 vg / kg, from about 6×1010 to about 7×1010 vg / kg, from about 7×1010 to about 8×1010 vg / kg, from about 8×1010 to about 9×1010 vg / kg, or from about 9×1010 to about 1×1011 vg / kg.

[0143] In some embodiment, the therapeutically effective dose ranges from about 1×1011 to about 2×1011 vg / kg, from about 2×1011 to about 3×1011 vg / kg, from about 3×1011 to about 4×1011 vg / kg, from about 4×1011 to about 5×1011 vg / kg, from about 5×1011 to about 6×1011 vg / kg, from about 6×1011 to about 7×1011 vg / kg, from about 7×1011 to about 8×1011 vg / kg, from about 8×1011 to about 9×1011 vg / kg, or from about 9×1011 to about 1×1012 vg / kg.

[0144] In some embodiment, the therapeutically effective dose ranges from about 1×1012 to about 2×1012 vg / kg, from about 2×1012 to about 3×1012 vg / kg, from about 3×1012 to about 4×1012 vg / kg, from about 4×1012 to about 5×1012 vg / kg, from about 5×1012 to about 6×1012 vg / kg, from about 6×1012 to about 7×1012 vg / kg, from about 7×1012 to about 8×1012 vg / kg, from about 8×1012 to about 9×1012 vg / kg, or from about 9×1012 to about 1×1013 vg / kg.

[0145] In some embodiment, the therapeutically effective dose ranges from about 1×1013 to about 2×1013 vg / kg, from about 2×1013 to about 3×1013 vg / kg, from about 3×1013 to about 4×1013 vg / kg, from about 4×1013 to about 5×1013 vg / kg, from about 5×1013 to about 6×1013 vg / kg, from about 6×1013 to about 7×1013 vg / kg, from about 7×1013 to about 8×1013 vg / kg, from about 8×1013 to about 9×1013 vg / kg, or from about 9×1013 to about 1×1014 vg / kg.

[0146] In some embodiment, the therapeutically effective dose ranges from about 1×1014 to about 2×1014 vg / kg, from about 2×1014 to about 3×1014 vg / kg, from about 3×1014 to about 4×1014 vg / kg, from about 4×1014 to about 5×1014 vg / kg, from about 5×1014 to about 6×1014 vg / kg, from about 6×1014 to about 7×1014 vg / kg, from about 7×1014 to about 8×1014 vg / kg, from about 8×1014 to about 9×1014 vg / kg, or from about 9×1014 to about 1×1015 vg / kg.

[0147] In some embodiment, the therapeutically effective dose ranges from about 1×1015 to about 2×1015 vg / kg, from about 2×1015 to about 3×1015 vg / kg, from about 3×1015 to about 4×1015 vg / kg, from about 4×1015 to about 5×1015 vg / kg, from about 5×1015 to about 6×1015 vg / kg, from about 6×1015 to about 7×1015 vg / kg, from about 7×1015 to about 8×1015 vg / kg, from about 8×1015 to about 9×1015 vg / kg, or from about 9×1015 to about 1×1016 vg / kg.

[0148] In some embodiment, the therapeutically effective dose ranges from about 1×1016 to about 2×1016 vg / kg, from about 2×1016 to about 3×1016 vg / kg, from about 3×1016 to about 4×1016 vg / kg, from about 4×1016 to about 5×1016 vg / kg, from about 5×1016 to about 6×1016 vg / kg, from about 6×1016 to about 7×1016 vg / kg, from about 7×1016 to about 8×1016 vg / kg, from about 8×1016 to about 9×1016 vg / kg, or from about 9×1016 to about 1×1017 vg / kg.

[0149] In some embodiments, the therapeutically effective dose is or greater than about 1×107 vg / kg, 1×108 vg / kg, 1×109 vg / kg, 1×1010 vg / kg, 1×1011 vg / kg, 1×1012 vg / kg, 1×1013 vg / kg, 1×1014 vg / kg, 1×1015 vg / kg, 1×1016 vg / kg, or 1×1017 vg / kg. In some embodiments, the therapeutically effective dose is administered at a dose of or less than about 1×107 vg / kg, 1×108 vg / kg, 1×109 vg / kg, 1×1010 vg / kg, 1×1011 vg / kg, 1×1012 vg / kg, 1×1013 vg / kg, 1×1014 vg / kg, 1×1015 vg / kg, 1×1016 vg / kg, or 1×1017 vg / kg.

[0150] In some embodiments, the therapeutically effective dose ranges from about 0.005 to 500 mg / kg body weight, e.g., from about 0.005 to 400 mg / kg body weight, from about 0.005 to 300 mg / kg body weight, from about 0.005 to 200 mg / kg body weight, from about 0.005 to 100 mg / kg body weight, from about 0.005 to 90 mg / kg body weight, from about 0.005 to 80 mg / kg body weight, from about 0.005 to 70 mg / kg body weight, from about 0.005 to 60 mg / kg body weight, from about 0.005 to 50 mg / kg body weight, from about 0.005 to 40 mg / kg body weight, from about 0.005 to 30 mg / kg body weight, from about 0.005 to 25 mg / kg body weight, from about 0.005 to 20 mg / kg body weight, from about 0.005 to 15 mg / kg body weight, from about 0.005 to 10 mg / kg body weight. In some embodiments, the DNA sequence coding cMyBP-C is administered at a dose ranging from about 0.1-5.0 mg / kg body weight, for example about 0.1-4.5, 0.1-4.0, 0.1-3.5, 0.1-3.0, 0.1-2.5, 0.1-2.0, 0.1-1.5, 0.1-1.0, 0.1-0.5, 0.1-0.3, 0.3-5.0, 0.3-4.5, 0.3-4.0, 0.3-3.5, 0.3-3.0, 0.3-2.5, 0.3-2.0, 0.3-1.5, 0.3-1.0, 0.3-0.5, 0.5-5.0, 0.5-4.5, 0.5-4.0, 0.5-3.5, 0.5-3.0, 0.5-2.5, 0.5-2.0, 0.5-1.5, or 0.5-1.0 mg / kg body weight.

[0151] In some embodiments, the therapeutically effective dose is or greater than about 0.1 mg / kg body weight, about 0.5 mg / kg body weight, about 1.0 mg / kg body weight, about 3 mg / kg body weight, about 5 mg / kg body weight, about 10 mg / kg body weight, about 15 mg / kg body weight, about 20 mg / kg body weight, about 30 mg / kg body weight, about 40 mg / kg body weight, about 50 mg / kg body weight, about 60 mg / kg body weight, about 70 mg / kg body weight, about 80 mg / kg body weight, about 90 mg / kg body weight, about 100 mg / kg body weight, about 150 mg / kg body weight, about 200 mg / kg body weight, about 250 mg / kg body weight, about 300 mg / kg body weight, about 350 mg / kg body weight, about 400 mg / kg body weight, about 450 mg / kg body weight, or about 500 mg / kg body weight. In some embodiments, the therapeutically effective dose is administered at a dose of or less than about 5.0, 4.5, 4.0, 3.5, 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.8, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, or 0.1 mg / kg body weight. Kits

[0152] In another aspect, the present disclosure provides a kit for treating HCM, which includes the system and instructions of the present disclosure. In some embodiments, the instructions are used to teach a method of administering the system to treat HCM.

[0153] In some embodiments, the kit further comprises a container. In some embodiments, the container is configured to deliver the system described herein. In some embodiments, the container includes vials, bottles, tubes, and syringes. In some embodiments, the container is a syringe used to administer the system.

[0154] EMBODIMENTS 1. A recombinant adeno-associated virus (rAAV) particle, comprising a polynucleotide  sequence comprising a coding sequence encoding human cardiac isoform of myosin binding protein C (cMyBP-C) , wherein the coding sequence is a MYBPC3 gene sequence, wherein the MYBPC3 gene sequence is a codon-optimized gene sequence or a wild type gene sequence. 2. The rAAV particle of Embodiment 1, wherein the MYBPC3 gene sequence is a full-length  human MYBPC3 gene sequence (SEQ ID NO: 25) or a variant thereof. 3. The rAAV particle of Embodiments 1 and 2, wherein the codon-optimized MYBPC3  sequence comprises no CpG dinucleotide or a number of CpG dinucleotides, preferably, no more than 196 CpG dinucleotides. 4. The rAAV particle of Embodiments 1-3, wherein an encoded cMyBP-C protein sequence  shares at least 90%identity to an amino acid sequence of wild type human cMyBP-C protein (SEQ ID NO: 1) . 5. The rAAV particle of any one of Embodiments 1-4, wherein a vector sequence of the  polynucleotide sequence is selected from the group comprising sequencies sharing at least 80%identity to one of PA456 (SEQ ID NO: 34) , PA457 (SEQ ID NO: 35) , PA458 (SEQ ID NO: 36) , or PA459 (SEQ ID NO: 37) . 6. The rAAV particle of any one of Embodiments 1-5, wherein the polynucleotide sequence  further comprises a first gene expression control element comprising a promoter, wherein the first gene expression control element is operably connected to the MYBPC3 gene sequence. 7. The rAAV particle of Embodiment 6, wherein the promoter is a ubiquitous promoter, a  muscle promoter, or a cardiac promoter. 8. The rAAV particle of Embodiment 7, wherein the cardiac promoter is a cardiac troponin T  (TNNT2 or cTnT) promoter (SEQ ID NO: 38) , an alpha myosin heavy chain (α-MHC) promoter, a beta myosin heavy chain (β-MHC) promoter, a cardiac troponin I (cTnI) promoter, a cardiac troponin C promoter, a natriuretic peptide A gene (NPPA) promoter, a myosin light chain 2 (MLC-2) promoter (SEQ ID NO: 39) , a myosin light chain 2v (MLC-2v) promoter, a cardiac sodium–calcium exchanger-1 (NCX1) promoter, an alpha-cardiac actin promoter, an alpha-tropomyosin promoter, an alpha-cardiac actin promoter, an alpha-tropomyosin promoter, a cardiac myosin-binding protein C promoter, a sarco / endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase isoform 2 (SERCA2) promoter, or any other cardiac promoter. 9. The rAAV particle of Embodiment 7, wherein the promoter is a cardiac troponin T promoter. 10. The rAAV particle of Embodiment 9, wherein the cardiac troponin T promoter comprises a  polynucleotide sequence sharing at least 90%identity to SEQ ID NO: 38. 11. The rAAV particle of Embodiment 9, wherein the cardiac troponin T promoter comprises a  polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 38. 12. The rAAV particle of any one of Embodiments 1-11, wherein the polynucleotide sequence  further comprises a second gene expression control element, wherein the second gene expression control element comprises an intron, wherein the second gene expression control element is operably connected to the MYBPC3 gene sequence. 13. The rAAV particle of Embodiment 12, wherein the intron shares at least 80%identity to one  of SV40 intron (SV40i) (SEQ ID NO: 40) , modified SV40 intron (mSV40i) , EF1-alpha intron (EF1Ai) , hemoglobin beta gene intron (HBBi) , rabbit β-globin intron, chimeric intron, hybrid intron, or other synthetic intron. 14. The rAAV particle of any one of Embodiments 1-13, wherein the polynucleotide sequence  further comprises a polyadenylation sequence extended from the 3’ end of the MYBPC3 gene sequence. 15. The rAAV particle of Embodiment 14, wherein the polyadenylation sequence is a wild type  or modified poly (A) sequence sharing at least 80%identity to one of modified SV40 late poly (A) , SV40 early poly (A) , SV40 late poly (A) , human growth hormone poly (A) , bovine growth hormone poly (A) , rabbit beta-globin poly (A) (SEQ ID NO: 41) , any modified rabbit beta-globin poly (A) , or a synthetic poly (A) (SEQ ID NO: 42) . 16. The rAAV particle of any one of Embodiments 1-15, further comprising a 5’ ITR sequence  which is located at upstream of the promoter sequence and a 3’ ITR sequence which is located at downstream of the polyadenylation sequence. 17. The rAAV particle of Embodiment 16, wherein the 5’ ITR and the 3’ ITR are from wildtype  AAV2 ITR sequences, or any variants of AAV2 ITR sequences, or ITR sequences from other AAV serotypes, or any combination of ITR sequences. 18. The rAAV particle of any one of Embodiments 1-17, further comprising adeno-associated  virus (AAV) capsid proteins. 19. The rAAV particle of Embodiment 18, wherein the AAV capsid proteins are from AAV1,  AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAVRh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, or fragments or variants thereof. 20. The rAAV particle of Embodiment 19, wherein the AAV capsid proteins are from AAV9. 21. The rAAV particle of any one of Embodiments 1-20, wherein the MYBPC3 gene sequence  comprises a reduced number of CpG dinucleotides as compared to the wild type human MYBPC3 gene sequence. 22. The rAAV particle of Embodiment 21, wherein the MYBPC3 gene sequence comprises less  than 100, less than 80, lessen than 60, less than 40, less than 20, less than 15, less than 10, or less than 5 CpG dinucleotides. 23. The rAAV particle of Embodiment 22, wherein the MYBPC3 gene sequence comprises no  CpG dinucleotide. 24. A composition comprising: (i) a first polynucleotide sequence encoding a recombinant adeno-associated virus  (rAAV) capsid protein, and (ii) a second polynucleotide sequence comprising a coding sequence encoding human  cardiac isoform of myosin binding protein C (cMyBP-C) , wherein the coding sequence is a MYBPC3 gene sequence, wherein the MYBPC3 gene sequence is a codon-optimized gene sequence or a wild type gene sequence. 25. The composition of Embodiment 24, wherein a vector sequence of the polynucleotide  sequence is selected from the group comprising sequencies sharing at least 80%identity to one of PA456 (SEQ ID NO: 34) , PA457 (SEQ ID NO: 35) , PA458 (SEQ ID NO: 36) , or PA459 (SEQ ID NO: 37) . 26. The composition of Embodiment 24, wherein the MYBPC3 gene sequence is a full-length  human MYBPC3 gene sequence or a variant of it. 27. The composition of Embodiment 24, wherein an encoded cMyBP-C protein sequence  shares at least 90%identity to an amino acid sequence of the wild type human cMyBP-C protein (SEQ ID NO: 1) . 28. The composition of any one of Embodiments 24-27, wherein the rAAV capsid protein is  an adeno-associated virus (AAV) capsid protein. 29. The composition of Embodiment 28, wherein the AAV capsid proteins are from AAV1,  AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAVRh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, or fragments or variants thereof. 30. The composition of Embodiment 29, wherein the AAV capsid proteins are from AAV9. 31. The composition of any one of Embodiments 24-30 wherein the second polynucleotide  sequence further comprises a first gene expression control element comprising a promoter, wherein the first gene expression control element is operably connected to the MYBPC3 gene sequence. 32. The composition of Embodiment 31, wherein the promoter is a ubiquitous promoter, a  muscle promoter, or a cardiac promoter. 33. The composition of Embodiment 32, wherein the cardiac promoter is a cardiac troponin T  (TNNT2 or cTnT) promoter (SEQ ID NO: 38) , an alpha myosin heavy chain (α-MHC) promoter, a beta myosin heavy chain (β-MHC) promoter, a cardiac troponin I (cTnI) promoter, a cardiac troponin C promoter, a natriuretic peptide A gene (NPPA) promoter, a myosin light chain 2 (MLC-2) promoter (SEQ ID NO: 39) , a myosin light chain 2v (MLC-2v) promoter, a cardiac sodium–calcium exchanger-1 (NCX1) promoter, an alpha-cardiac actin promoter, an alpha-tropomyosin promoter, an alpha-cardiac actin promoter, an alpha-tropomyosin promoter, a cardiac myosin-binding protein C promoter, a sarco / endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase isoform 2 (SERCA2) promoter, or any other cardiac promoter. 34. The composition of Embodiment 32, wherein the promoter is a cardiac troponin T  promoter (SEQ ID NO: 38) . 35. The composition of any one of Embodiments 24-34, wherein the second polynucleotide  sequence further comprises a second gene expression control element, wherein the second gene expression control element comprises an intron, wherein the second gene expression control element is operably connected to the MYBPC3 gene sequence. 36. The composition of Embodiment 35, wherein, the intron shares at least 80%identity to one  of SV40 intron (SV40i) (SEQ ID NO: 40) , modified SV40 intron (mSV40i) , EF1-alpha intron (EF1Ai) , hemoglobin beta gene intron (HBBi) , rabbit β-globin intron, chimeric intron, hybrid intron, or other synthetic intron. 37. The composition of any one of Embodiments 24-36, wherein the second polynucleotide  further comprises a polyadenylation sequence extended from the 3’ end of the MYBPC3 gene sequence. 38. The composition of Embodiment 37, wherein the polyadenylation sequence is a wild type  or modified poly (A) sequence sharing at least 80%identity to one of modified SV40 late poly (A) (SV40pA) , SV40 early poly (A) , SV40 late poly (A) , human growth hormone poly (A) , bovine growth hormone poly (A) , rabbit beta-globin poly (A) (SEQ ID NO: 41) , any modified rabbit beta-globin poly (A) , or a synthetic poly (A) (SEQ ID NO: 42) . 39. The composition of any one of Embodiments 24-38, wherein the MYBPC3 gene sequence  comprises a reduced number of CpG dinucleotides as compared to the wild type human MYBPC3 gene sequence. 40. The composition of Embodiment 39, wherein the MYBPC3 gene sequence comprises less  than 100, less than 80, lessen than 60, less than 40, less than 20, less than 15, less than 10, or less than 5 CpG dinucleotides. 41. The composition of Embodiment 40, wherein the MYBPC3 gene sequence comprises no  CpG dinucleotide. 42. A recombinant adeno-associated virus (rAAV) particle, prepared by introducing the  composition of any one of Embodiments 24-41 into a host cell, wherein the introducing is transforming, transfecting, infecting, transducing, or a combination thereof. 43. The rAAV particle of Embodiment 42, wherein the host cell is an insect cell, a human cell  or an animal cell. 44. The rAAV particle of Embodiment 43, wherein the insect cell is Drosophila S2 cells or  Sf9 cells. 45. The rAAV particle of Embodiment 43, wherein the animal cell is fibroblasts, Chinese  hamster ovary (CHO) cells, COS cells, murine myeloma (NS0) cells, or Baby Hamster Kidney (BHK) cells. 46. The rAAV particle of Embodiment 43, wherein the human cell is human embryonic kidney  293 (HEK293) cells or its derivatives (e.g., 293T cells, 293F cells, and etc. ) , human fibrosarcoma (HT-1080) cells, differentiated hepatocyte-derived carcinoma (Huh-7) cells, HeLa cells, or PER. C6 cells. 47. A method for preparing a rAAV particle, comprising introducing the composition of any  one of Embodiments 24-41 to a host cell, wherein the introducing is transforming, transfecting, infecting, transducing, or a combination thereof. 48. The method of Embodiment 47, wherein the host cell is an insect cell, a human cell or an  animal cell. 49. The method of Embodiment 47, wherein the insect cell is Drosophila S2 cells or Sf9 cells. 50. The method of Embodiment 47, wherein the animal cell is fibroblasts, Chinese hamster  ovary (CHO) cells, COS cells, murine myeloma (NS0) cells, Baby Hamster Kidney (BHK) cells, 51. The method of Embodiment 47, wherein the human cell is human embryonic kidney 293  (HEK293) cells or its derivatives (e.g., 293T cells, 293F cells, and etc. ) , human fibrosarcoma (HT-1080) cells, differentiated hepatocyte-derived carcinoma (Huh-7) cells, HeLa cells, or PER. C6 cells. 52. The method of Embodiment 47, further comprising: generating bacmid and baculovirus;  co-infecting Sf9 cells with AAV Rep and Cap baculoviruses and MYBPC3 gene expression cassette baculoviruses; thereby producing the rAAV particle. 53. The method of Embodiment 47, further comprising: co-transfecting a RepCap plasmid, a  helper plasmid, and the MYBPC3 gene expression cassette plasmid, thereby producing rAAV particle. 54. A system for treating hypertrophic cardiomyopathy (HCM) in a subject in need thereof,  comprising the rAAV particle of any one of Embodiments 1-23, and 42-46, and a pharmaceutically acceptable carrier. 55. A kit, comprising the system of Embodiment 54 and instructions. 56. A method for treating hypertrophic cardiomyopathy (HCM) in a subject in need thereof,  comprising administering a therapeutically effective amount of the rAAV particles of any one of Embodiments 1-23, and 42-46, or the system of Embodiment 54 to the subject. 57. The method of Embodiment 56, wherein the rAAV particles of any one of Embodiments  1-23, 42-46, or the system of Embodiment 54 is administered by intravenous or intracoronary injection or infusion or by direct administration to a heart of the subject. 58. The method of Embodiment 56 or Embodiment 57, wherein the therapeutically effective  amount is 1×109 to 1×1017 of the rAAV particle.

[0155] Some embodiments of the present disclosure are further illustrated by the following examples, which should not be construed as limiting. Those skilled in the art will understand that the techniques disclosed in the following examples represent techniques that the inventors have found to work well in the implementation of the embodiments of the present disclosure described herein, and can therefore be considered to constitute a useful tool for implementing these embodiments. Preferred way. However, based on the present disclosure, those skilled in the art will understand that without departing from the spirit and scope of the present disclosure, many changes can be made in the specific embodiments disclosed herein, and the same or similar results can still be obtained. EXAMPLES

[0156] These examples are provided for illustrative purposes only and not to limit the scope of the claims provided herein.

[0157] Example 1-Design of Recombinant AAV Constructs

[0158] The cap and rep coding sequences derived from AAV9 and AAV2, respectively, together with their corresponding promoters are synthesized and cloned into a modified pFastBac1 backbone or a pUC vector backbone to obtain the first polynucleotide comprising the coding sequences of cap and rep proteins.

[0159] The construct designs with various combinations (the expression cassettes) are shown in TABLE 2. The amino acid sequence encoding the full-length wild type cMyBP-C polypeptide is shown in SEQ ID NO: 1. Variants of the full-length human cMyBP-C protein can comprise mutations at: P147L, V158M, V168M, R177H, V189I, S217G, S236G, G278E, R326Q, R382W, G507R, N515S, A522T, A833V, V896M, P910T, R1002W, R1036C, I1131T, R1138H, V1158I, or R1228C, or a combination thereof (SEQ ID NOs: 2-24) . The polynucleotide sequence for the full-length human wildtype natural MYBPC3 gene nucleotide coding sequence is shown as SEQ ID NO: 25. The codon-optimized MYBPC3 gene nucleotide coding sequences are listed as SEQ ID NO: 26-33. Specific transgene constructs are shown as PA456 (SEQ ID NO: 34) , PA457 (SEQ ID NO: 35) , PA458 (SEQ ID NO: 36) , and PA459 (SEQ ID NO: 37) . Selected sequences for the promoters, introns, and poly (A) signal sequences are listed in SEQ ID NO: 38-42. The expression cassettes with AAV2 ITR flanked on both ends were cloned into a modified pFastBac1 to obtain the second polynucleotide comprising the coding sequence of MYBPC3.

[0160] To select the best transgene expression cassette, various constructs are created and tested. Some of the vectors thus made are listed in TABLE 2.

[0161] TABLE 2: Designs of MYBPC3 Transgene Vector Abbreviations -TNNT2: troponin T2 (cardiac type, cTnT) promoter; MYBPC3: myosin  binding protein C3 gene; co: codon optimization; spA: synthetic polyadenylation; SV40i: simian virus 40 intron; rbGpA: rabbit β-globin polyadenylation signal; CMV: cytomegalovirus enhancer; MLC2: myosin light chain 2 promoter.

[0162] Example 2 -Comparing HW / BW Ratio Among The Various Designed Constructs In A KO Mice Model.

[0163] AAV vectors reduce heart weight to body weight (HW / BW) ratio and alleviate disease phenotype. 2×10^14 vg / kg AAV vectors were injected in neonatal Mybpc3 KO mice at P1. Vector constructs PA456, PA457, and PA458 all induced significant reduction of heart weight to body weight ratio compared to vehicle treated knock out (KO) mice at week 6 post vector injection. The results are summarized in FIG. 1.

[0164] Example 3 -Comparing MYBPC3 mRNA Expression Levels In Tissues Among The Various Designed Constructs.

[0165] AAV vectors induce high mRNA expression of MYBPC3 transgene in the mouse heart. Different vectors gave rise to different levels of mRNA expression at 6 weeks post injection. The expression is highly specific to the heart, but not in the liver or in the muscle. Veh: Vehicle control; 456-459: different vectors from PA456 to PA459. Results are summarized in FIG. 2.

[0166] Example 4 -Comparing cMyBP-C Protein Expression Levels In Tissues Among The Various Designed Constructs.

[0167] AAV vectors induce high expression of human cMyBP-C protein in the mouse heart at 6 weeks post injection. The cMyBP-C expression is highly specific to the heart, but not in the liver or in the muscle. 456-459: different vectors from PA456 to PA459. Results are summarized in FIG. 3.

[0168] Example 5 -Comparing Disease Biomarker Levels In Tissues Among The Various Designed Constructs.

[0169] AAV vectors reduce disease biomarkers at mRNA level in the heart at 6 weeks post injection. Nppa and Nppb encodes ANP (atrial natriuretic peptide) and BNP (B-type natriuretic peptide) , respectively. Both hormones are secreted by the heart and are involved in cardiac development, cardiorenal homeostasis, and implicated in response to cardiac injury and stress. Both Nppa and Nppb genes were elevated in vehicle treated Mybpc3 KO mice compared to WT (wild-type) and significantly decreased with treatment from most of AAV vectors (PA456 to PA459) . Results are summarized in FIG. 4.

[0170] Example 6 -Evaluation of the effect of various constructs in the juvenile Mybpc3 KO mice.

[0171] Juvenile Mybpc3 KO mice (～4 weeks old) are administered with various doses (1×1013 to 3×1014 vg / kg) of AAV vectors or vehicles as a control. Echocardiography is used to assess cardiac function changes 4 weeks after injection, 8 weeks after injection and 18 weeks after injection. AAV vectors significantly improve left ventricular ejection fraction (LVEF) and fractional shortening of the mice. Heart stress and damage biomarkers (cTnI and NT-proBNP) in the serum are significantly decreased 8 weeks after injection. Masson’s trichrome staining shows that heart fibrosis is improved with AAV treatment. RT-qPCR shows mRNA of human MYBPC3 gene is highly expressed in the heart tissue, but not in the liver or the spleen. Immunofluorescence staining shows that human cMyBP-C protein is highly expressed in the cardiomyocytes, and colocalized to the α-actinin in the sarcomere, indicating its proper function for cardiomyocyte contraction. Collectively, the data suggest that AAV vector constructs significantly improve the cardiac function and reduce heart damage in juvenile Mybpc3 KO mice.

[0172] Example 7 -Evaluation of the effect of various constructs in the adult Mybpc3 KO mice.

[0173] Adult Mybpc3 KO mice (～3.5 months old) are injected with 5×1013 and 1.5×1014 vg / kg of AAV vectors or vehicles as a control. Echocardiography is used to assess cardiac function changes before injection, 6 weeks after injection and 12 weeks after injection. Wild type mice serve as wild-type control for cardiac function. AAV vectors significantly improve left ventricular ejection fraction (LVEF) and cardiac output of the mice. Western blotting shows that cMyBP-C protein is only expressed in the heart, but not expressed in the liver. Immunochemistry staining shows broad human cMyBP-C protein expression in the heart. The data demonstrates that the AAV vector constructs can specifically transduce the heart and improve the cardiac function in adult Mybpc3 KO mice, suggesting that these AAV vector constructs are promising AAV gene therapy to treat adult HCM patients.

[0174] While preferred embodiments of the present disclosure have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. It is not intended that the disclosure be limited by the specific examples provided within the specification. While the disclosure has been described with reference to the aforementioned specification, the descriptions and illustrations of the embodiments herein are not meant to be construed in a limiting sense. Numerous variations, changes, and substitutions will now occur to those skilled in the art without departing from the disclosure. Furthermore, it shall be understood that all aspects of the disclosure are not limited to the specific depictions, configurations or relative proportions set forth herein which depend upon a variety of conditions and variables. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the disclosure described herein may be employed in practicing the disclosure. It is therefore contemplated that the disclosure shall also cover any such alternatives, modifications, variations or equivalents. It is intended that the following claims define the scope of the disclosure and that methods and structures within the scope of these claims and their equivalents be covered thereby.

[0175] SEQUENCE LISTING

Claims

1.A recombinant adeno-associated virus (rAAV) particle, comprising a polynucleotide sequence comprising a coding sequence encoding human cardiac isoform of myosin binding protein C (cMyBP-C) , wherein the coding sequence is a MYBPC3 gene sequence, wherein the MYBPC3 gene sequence is a codon-optimized gene sequence or a wild type gene sequence.2.The rAAV particle of claim 1, wherein the MYBPC3 gene sequence is a full-length human MYBPC3 gene sequence (SEQ ID NO: 25) or a variant thereof.3.The rAAV particle of claims 1 and 2, wherein the codon-optimized MYBPC3 sequence comprises no CpG dinucleotide or a number of CpG dinucleotides, preferably, no more than 196 CpG dinucleotides.4.The rAAV particle of claims 1-3, wherein an encoded cMyBP-C protein sequence shares at least 90%identity to an amino acid sequence of wild type human cMyBP-C protein (SEQ ID NO: 1) .5.The rAAV particle of any one of claims 1-4, wherein a vector sequence of the polynucleotide sequence is selected from the group comprising sequencies sharing at least 80%identity to one of PA456 (SEQ ID NO: 34) , PA457 (SEQ ID NO: 35) , PA458 (SEQ ID NO: 36) , or PA459 (SEQ ID NO: 37) .6.The rAAV particle of any one of claims 1-5, wherein the polynucleotide sequence further comprises a first gene expression control element comprising a promoter, wherein the first gene expression control element is operably connected to the MYBPC3 gene sequence.7.The rAAV particle of claim 6, wherein the promoter is a ubiquitous promoter, a muscle promoter, or a cardiac promoter.8.The rAAV particle of claim 7, wherein the cardiac promoter is a cardiac troponin T (TNNT2 or cTnT) promoter (SEQ ID NO: 38) , an alpha myosin heavy chain (α-MHC) promoter, a beta myosin heavy chain (β-MHC) promoter, a cardiac troponin I (cTnI) promoter, a cardiac troponin C promoter, a natriuretic peptide A gene (NPPA) promoter, a myosin light chain 2 (MLC-2) promoter (SEQ ID NO: 39) , a myosin light chain 2v (MLC-2v) promoter, a cardiac sodium–calcium exchanger-1 (NCX1) promoter, an alpha-cardiac actin promoter, an alpha-tropomyosin promoter, an alpha-cardiac actin promoter, an alpha-tropomyosin promoter, a cardiac myosin-binding protein C promoter, a sarco / endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase isoform 2 (SERCA2) promoter, or any other cardiac promoter.9.The rAAV particle of claim 7, wherein the promoter is a cardiac troponin T promoter.10.The rAAV particle of claim 9, wherein the cardiac troponin T promoter comprises a polynucleotide sequence sharing at least 90%identity to SEQ ID NO: 38.11.The rAAV particle of claim 9, wherein the cardiac troponin T promoter comprises a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 38.12.The rAAV particle of any one of claims 1-11, wherein the polynucleotide sequence further comprises a second gene expression control element, wherein the second gene expression control element comprises an intron, wherein the second gene expression control element is operably connected to the MYBPC3 gene sequence.13.The rAAV particle of claim 12, wherein the intron shares at least 80%identity to one of SV40 intron (SV40i) (SEQ ID NO: 40) , modified SV40 intron (mSV40i) , EF1-alpha intron (EF1Ai) , hemoglobin beta gene intron (HBBi) , rabbit β-globin intron, chimeric intron, hybrid intron, or other synthetic intron.14.The rAAV particle of any one of claims 1-13, wherein the polynucleotide sequence further comprises a polyadenylation sequence extended from the 3’ end of the MYBPC3 gene sequence.15.The rAAV particle of claim 14, wherein the polyadenylation sequence is a wild type or modified poly (A) sequence sharing at least 80%identity to one of modified SV40 late poly (A) (SV40pA) , SV40 early poly (A) , SV40 late poly (A) , human growth hormone poly (A) , bovine growth hormone poly (A) , rabbit beta-globin poly (A) (SEQ ID NO: 41) , any modified rabbit beta-globin poly (A) , or a synthetic poly (A) (SEQ ID NO: 42) .16.The rAAV particle of any one of claims 1-15, further comprising a 5’ ITR sequence which is located at upstream of the promoter sequence and a 3’ ITR sequence which is located at downstream of the polyadenylation sequence.17.The rAAV particle of claim 16, wherein the 5’ ITR and the 3’ ITR are from wildtype AAV2 ITR sequences, or any variants of AAV2 ITR sequences, or ITR sequences from other AAV serotypes, or any combination of ITR sequences.18.The rAAV particle of any one of claims 1-17, further comprising adeno-associated virus (AAV) capsid proteins.19.The rAAV particle of claim 18, wherein the AAV capsid proteins are from AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAVRh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, or fragments or variants thereof.20.The rAAV particle of claim 19, wherein the AAV capsid proteins are from AAV9.21.The rAAV particle of any one of claims 1-20, wherein the MYBPC3 gene sequence comprises a reduced number of CpG dinucleotides as compared to the wild type human MYBPC3 gene sequence.22.The rAAV particle of claim 21, wherein the MYBPC3 gene sequence comprises less than 100, less than 80, lessen than 60, less than 40, less than 20, less than 15, less than 10, or less than 5 CpG dinucleotides.23.The rAAV particle of claim 22, wherein the MYBPC3 gene sequence comprises no CpG dinucleotide.24.A composition comprising:(i) a first polynucleotide sequence encoding a recombinant adeno-associated virus (rAAV) capsid protein, and(ii) a second polynucleotide sequence comprising a coding sequence encoding human cardiac isoform of myosin binding protein C (cMyBP-C) , wherein the coding sequence is a MYBPC3 gene sequence, wherein the MYBPC3 gene sequence is a codon-optimized gene sequence or a wild type gene sequence.25.The composition of claim 24, wherein a vector sequence of the polynucleotide sequence is selected from the group comprising sequencies sharing at least 80%identity to one of PA456 (SEQ ID NO: 34) , PA457 (SEQ ID NO: 35) , PA458 (SEQ ID NO: 36) , or PA459 (SEQ ID NO: 37) .26.The composition of claim 24, wherein the MYBPC3 gene sequence is a full-length human MYBPC3 gene sequence or a variant of it.27.The composition of claim 24, wherein an encoded cMyBP-C protein sequence shares at least 90%identity to an amino acid sequence of the wild type human cMyBP-C protein (SEQ ID NO: 1) .28.The composition of any one of claims 24-27, wherein the rAAV capsid protein is an adeno-associated virus (AAV) capsid protein.29.The composition of claim 28, wherein the AAV capsid proteins are from AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAVRh74, AAV2i8, Anc80L65, MyoAAV, or fragments or variants thereof.30.The composition of claim 29, wherein the AAV capsid proteins are from AAV9.31.The composition of any one of claims 24-30 wherein the second polynucleotide sequence further comprises a first gene expression control element comprising a promoter, wherein the first gene expression control element is operably connected to the MYBPC3 gene sequence.32.The composition of claim 31, wherein the promoter is a ubiquitous promoter, a muscle promoter, or a cardiac promoter.33.The composition of claim 32, wherein the cardiac promoter is a cardiac troponin T (TNNT2 or cTnT) promoter (SEQ ID NO: 38) , an alpha myosin heavy chain (α-MHC) promoter, a beta myosin heavy chain (β-MHC) promoter, a cardiac troponin I (cTnI) promoter, a cardiac troponin C promoter, a natriuretic peptide A gene (NPPA) promoter, a myosin light chain 2 (MLC-2) promoter (SEQ ID NO: 39) , a myosin light chain 2v (MLC-2v) promoter, a cardiac sodium–calcium exchanger-1 (NCX1) promoter, an alpha-cardiac actin promoter, an alpha-tropomyosin promoter, an alpha-cardiac actin promoter, an alpha-tropomyosin promoter, a cardiac myosin-binding protein C promoter, a sarco / endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase isoform 2 (SERCA2) promoter, or any other cardiac promoter.34.The composition of claim 32, wherein the promoter is a cardiac troponin T promoter (SEQ ID NO: 38) .35.The composition of any one of claims 24-34, wherein the second polynucleotide sequence further comprises a second gene expression control element, wherein the second gene expression control element comprises an intron, wherein the second gene expression control element is operably connected to the MYBPC3 gene sequence.36.The composition of claim 35, wherein, the intron shares at least 80%identity to one of SV40 intron (SV40i) (SEQ ID NO: 40) , modified SV40 intron (mSV40i) , EF1-alpha intron (EF1Ai) , hemoglobin beta gene intron (HBBi) , rabbit β-globin intron, chimeric intron, hybrid intron, or other synthetic intron.37.The composition of any one of claims 24-36, wherein the second polynucleotide further comprises a polyadenylation sequence extended from the 3’ end of the MYBPC3 gene sequence.38.The composition of claim 37, wherein the polyadenylation sequence is a wild type or modified poly (A) sequence sharing at least 80%identity to one of modified SV40 late poly (A) (SV40pA) , SV40 early poly (A) , SV40 late poly (A) , human growth hormone poly (A) , bovine growth hormone poly (A) , rabbit beta-globin poly (A) (SEQ ID NO: 41) , any modified rabbit beta-globin poly (A) , or a synthetic poly (A) (SEQ ID NO: 42) .39.The composition of any one of claims 24-38, wherein the MYBPC3 gene sequence comprises a reduced number of CpG dinucleotides as compared to the wild type human MYBPC3 gene sequence.40.The composition of claim 39, wherein the MYBPC3 gene sequence comprises less than 100, less than 80, lessen than 60, less than 40, less than 20, less than 15, less than 10, or less than 5 CpG dinucleotides.41.The composition of claim 40, wherein the MYBPC3 gene sequence comprises no CpG dinucleotide.42.A recombinant adeno-associated virus (rAAV) particle, prepared by introducing the composition of any one of claims 24-41 into a host cell, wherein the introducing is transforming, transfecting, infecting, transducing, or a combination thereof.43.The rAAV particle of claim 42, wherein the host cell is an insect cell, a human cell or an animal cell.44.The rAAV particle of claim 43, wherein the insect cell is Drosophila S2 cells or Sf9 cells.45.The rAAV particle of claim 43, wherein the animal cell is fibroblasts, Chinese hamster ovary (CHO) cells, COS cells, murine myeloma (NS0) cells, or Baby Hamster Kidney (BHK) cells.46.The rAAV particle of claim 43, wherein the human cell is human embryonic kidney 293 (HEK293) cells or its derivatives (e.g., 293T cells, 293F cells, and etc. ) , human fibrosarcoma (HT-1080) cells, differentiated hepatocyte-derived carcinoma (Huh-7) cells, HeLa cells, or PER. C6 cells.47.A method for preparing a rAAV particle, comprising introducing the composition of any one of claims 24-41 to a host cell, wherein the introducing is transforming, transfecting, infecting, transducing, or a combination thereof.48.The method of claim 47, wherein the host cell is an insect cell, a human cell or an animal cell.49.The method of claim 47, wherein the insect cell is Drosophila S2 cells or Sf9 cells.50.The method of claim 47, wherein the animal cell is fibroblasts, Chinese hamster ovary (CHO) cells, COS cells, murine myeloma (NS0) cells, Baby Hamster Kidney (BHK) cells.51.The method of claim 47, wherein the human cell is human embryonic kidney 293 (HEK293) cells or its derivatives (e.g., 293T cells, or 293F cells) , human fibrosarcoma (HT-1080) cells, differentiated hepatocyte-derived carcinoma (Huh-7) cells, HeLa cells, or PER. C6 cells.52.The method of claim 47, further comprising: generating bacmid and baculovirus; co-infecting Sf9 cells with AAV Rep and Cap baculoviruses and MYBPC3 gene expression cassette baculoviruses; thereby producing the rAAV particle.53.The method of claim 47, further comprising: co-transfecting a RepCap plasmid, a helper plasmid, and the MYBPC3 gene expression cassette plasmid, thereby producing rAAV particle.54.A system for treating hypertrophic cardiomyopathy (HCM) in a subject in need thereof, comprising the rAAV particle of any one of claims 1-23, and 42-46, and a pharmaceutically acceptable carrier.55.A kit, comprising the system of claim 54 and instructions.56.A method for treating hypertrophic cardiomyopathy (HCM) in a subject in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of the rAAV particles of any one of claims 1-23, and 42-46, or the system of claim 54 to the subject.57.The method of claim 56, wherein the rAAV particles of any one of claims 1-23, 42-46, or the system of claim 54 is administered by intravenous or intracoronary injection or infusion or by direct administration to a heart of the subject.58.The method of claim 56 or claim 57, wherein the therapeutically effective amount is 1×109 to 1×1017 of the rAAV particle.

Images