Composition for cryoprotection of viral vector or vlp

Abstract

Provided are a composition comprising optionally viral vector or virus-like particle (VLP), a buffer, an ionic salt, a carbohydrate and optionally a cryoprotectant, and also the use thereof in the preparation of a kit for delivering a viral vector or VLP into a cell of a subject.

Description

Composition for cryoprotection of viral vector or VLP

[0001] CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATION

[0002] This application claims priority benefits of International Application No. PCT / CN2024 / 079942 filed March 04, 2024. The entire content of the foregoing application is hereby incorporated by reference.TECHNICAL FIELD

[0003] The present disclosure belongs to the field of the formulation for cryopreserving a viral vector or a virus-like particle (VLP) . Specifically, the present disclosure relates to a composition comprising optionally viral vector or virus-like particle (VLP) , a buffer, an ionic salt, a carbohydrate, and optionally a cryoprotectant and also the use thereof in the preparation of a kit for delivering a viral vector into a cell of a subject.BACKGROUND

[0004] The basic concerns for viral vectors such as retroviral vector (RVV) , adenoviral vectors, or adeno-associated viral vector are stability and structural integrity thereof during transit and storage, following multiple freeze-thaw cycles. For example, retroviral vectors (RVV) , also known as reverse transcription viral vectors, are RNA viral vectors that are commonly used in gene therapy applications due to the high transduction efficiency and ability to achieve significant and durable transgene expression. Due to the low stability, which is easily affected by environmental factors such as temperature and pH, retroviral vectors must be stored at ultra-low temperatures or made into lyophilized preparations to maintain the biological activity. But the loss of activity is even more serious during the freeze-drying process.

[0005] Typically, those used for preserving viral vectors especially retroviral vectors are liquid preparations that typically contains DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline) or other buffers, culture media, etc., and may be supplemented with excipients such as sucrose, sorbitol, glycerol, etc. The formulations are stored in an ultra-low temperature (≤ -65 ℃) environment, transported under cryogenic freezing conditions and thawed before use. The loss of biological activity of viral vectors especially retroviral vectors mostly occurs during the preservation and thawing phases. One of the main challenges for preservation stabilization at temperatures below freezing point is to prevent the physical destruction to structural and functional components during freezing and preservation phases.

[0006] Virus-like particles (VLPs) are highly organized particles self-assembled by viral structural proteins. Their structure is very similar to natural viral particles, but the lack of viral genome makes them unstable under changing conditions, especially during downstream processing (DSP) . In general, VLPs with host-derived envelopes are more sensitive to environment than VLPs containing only proteins. Changes in conditions such as temperature, shear, and chemical treatments can disrupt the integrity and stability of particles, which is consistent with the instability of enveloped viral vector especially retroviral vector particles.

[0007] Currently, there is no ideal cryoprotective solution to protect viral vectors especially retroviral vectors, whether preserving under ultra-low temperature conditions or adding protectants such as glycerol is not effective in preventing the loss of infective titer during storage. To protect VLP from physical and chemical disruption, it is necessary to develop a formulation that can provide an effective protection to maintain the biological activity of VLP.SUMMARY

[0008] To improve stability and reduce loss of biological activity of viral vectors (e.g., retroviral vectors)  / VLP during cryopreservation, the present disclosure investigated basic buffer, pH, salt concentration, sugar / polyol, DMSO, Poloxamer, Polysorbate and other substances for the effect in the preservation of viral vectors (e.g., retroviral vectors) and screened out a cryopreservation solution, which significantly increases the freeze-thaw stability of viral vectors (e.g., retroviral vectors) . The formulation can also be applied to the cryopreservation of VLP based on viral vector backbones (e.g., retroviral vector backbones) , and the biological activity after freeze-thaw can be increased significantly. The present disclosure significantly improves the biological activity retention of viral vectors (e.g., retroviral vectors) , which can provide stable, reliable and consistent viral vectors for cell preparations.

[0009] Based on the shortcomings of the prior art, one of the main objects of the present disclosure is to provide a composition comprising viral vector or virus-like particle (VLP) , a buffer, an ionic salt, a carbohydrate, and optionally a cryoprotectant, wherein

[0010] the buffer is one or more selected from the group consisting of PIPES, HEPES, Tris and PB,

[0011] the ionic salt is one or two selected from the group consisting of sodium chloride and magnesium chloride,

[0012] the carbohydrate is one or more selected from the group consisting of trehalose, sucrose and mannitol,

[0013] the cryoprotectant is one or more selected from the group consisting of DMSO, Glycerol, Poloxamer and Polysorbate.

[0014] In certain embodiments,

[0015] (1) the buffer is HEPES, and / or

[0016] (2) the ionic salt is one or two selected from the group consisting of sodium chloride and magnesium chloride, and / or

[0017] (3) the carbohydrate is trehalose, and / or

[0018] (4) the cryoprotectant is one or two selected from the group consisting of DMSO and Poloxamer.

[0019] In certain embodiments,

[0020] (1) the concentration of HEPES is about 10-50 mM, or about 10-20, 15-25, 20-30, 25-35, 30-40, or 35-50mM; and / or

[0021] (2) the concentration of sodium chloride is about 30-150 mM, or about 30-40, 35-50, 40-55, 45-60, 50-65, 55-70, 60-75, 65-80, 70-85, 75-90, 80-95, 85-100, 90-105, 95-110, 100-115, 105-120, 110-125, 115-130, 120-135, 125-140, 130-145, or 140-150mM; and / or

[0022] (3) the concentration of magnesium chloride is about 10-30 mM, or about 10-20, 15-25, or 20-30mM; and / or

[0023] (4) the concentration of trehalose is about 0.5%w / v-10%w / v, or about 0.5%w / v-1.5%w / v, 1%w / v-3%w / v, 2.5%w / v-4%w / v, 3.5%w / v-5%w / v, 4.5%w / v-6%w / v, 5.5%w / v-7%w / v, 6.5%w / v-8%w / v, 7.5%w / v-9%w / v, or 8.5%w / v-10%w / v; and / or

[0024] (5) the concentration of Poloxamer is about 0.05%w / v-5%w / v, or about 0.05%w / v-0.2%w / v, 0.1%w / v-0.3%w / v, 0.2%w / v-0.4%w / v, 0.3%w / v-0.5%w / v, 0.4%w / v-0.6%w / v, 0.5%w / v-0.7%w / v, 0.6%w / v-0.8%w / v, 0.7%w / v-0.9%w / v, 0.8%w / v-1%w / v, 0.9%w / v-2%w / v, 1%w / v-3%w / v, 2%w / v-4%w / v, or 3%w / v-5%w / v; and / or

[0025] (6) the concentration of DMSO is about 5%v / v-20%v / v, or about 5%v / v-15%v / v, or 10%v / v-20%v / v.

[0026] In certain embodiments,

[0027] (1) the concentration of HEPES is about 10, 15, 20, 25, 30, 40, or 50 mM; and / or

[0028] (2) the concentration of sodium chloride is about 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, or 150 mM; and / or

[0029] (3) the concentration of magnesium chloride is about 10, 15, 20, 25, or 30 mM; and / or

[0030] (4) the concentration of trehalose is about 0.5%w / v, 1%w / v, 1.5%w / v, 2%w / v, 2.5%w / v, 3%w / v, 3.5%w / v, 4%w / v, 4.5%w / v, 5%w / v, 5.5%w / v, 6%w / v, 6.5%w / v, 7%w / v, 7.5%w / v, 8%w / v, 8.5%w / v, 9%w / v, 9.5%w / v, or 10%w / v; and / or

[0031] (5) the concentration of Poloxamer is about 0.05%w / v, 0.1%w / v, 0.2%w / v, 0.3%w / v, 0.4%w / v, 0.5%w / v, 0.6%w / v, 0.7%w / v, 0.8%w / v, 0.9%w / v, 1%w / v, 2%w / v, 3%w / v, 4%w / v, or 5%w / v; and / or

[0032] (6) the concentration of DMSO is about 5%v / v, 10%v / v, 15%v / v, or 20%v / v.

[0033] In certain embodiments, the Poloxamer is one or more selected from the group consisting of P101, P105, P108, P122, P123, P124, P181, P182, P183, P184, P185, P188, P212, P215, P217, P231, P234, P235, P237, P238, P282, P284, P288, P331, P333, P334, P335, P338, P401, P402, P403, P407; and / or the Polysorbate is one or more selected from the group consisting of PS20, PS40, PS60, PS80.

[0034] In certain embodiments, the Poloxamer is P188, and / or the Polysorbate is PS80.

[0035] In certain embodiments, the composition comprises viral vector or virus-like particle (VLP) , HEPES, sodium chloride, magnesium chloride and trehalose, wherein

[0036] (1) HEPES is about 20 mM,

[0037] (2) sodium chloride is about 50 mM,

[0038] (3) magnesium chloride is about 20 mM,

[0039] (4) the concentration of trehalose is about 1%w / v.

[0040] In certain embodiments, the composition comprises viral vector or virus-like particle (VLP) , HEPES, sodium chloride, magnesium chloride, trehalose and P188 or DMSO, wherein

[0041] (1) HEPES is about 20 mM,

[0042] (2) sodium chloride is about 50 mM,

[0043] (3) magnesium chloride is about 20 mM,

[0044] (4) the concentration of trehalose is about 1%w / v,

[0045] (5) the concentration of P188 is about 0.5%w / v, or the concentration of DMSO is about 15%v / v or 20%v / v.

[0046] In certain embodiments, the composition comprises viral vector or virus-like particle (VLP) , HEPES, sodium chloride, magnesium chloride, trehalose and P188, wherein

[0047] (1) HEPES is about 20 mM,

[0048] (2) sodium chloride is about 50 mM,

[0049] (3) magnesium chloride is about 20 mM,

[0050] (4) the concentration of trehalose is about 1%w / v,

[0051] (5) the concentration of P188 is about 0.5%w / v.

[0052] In certain embodiments, the pH of the composition is about 6.5-8.5.

[0053] In certain embodiments, the pH of the composition is about 6.5-8.0 or 7.0-8.5.

[0054] In certain embodiments, the pH of the composition is about 7.0.

[0055] In certain embodiments, the viral vector is retroviral vector (RVV) , adenoviral vector, or adeno-associated viral vector.

[0056] In certain embodiments, the RVV is lentiviral vector or γ-retroviral vector.

[0057] In certain embodiments, the viral vector comprises a transgene.

[0058] In certain embodiments, the transgene encodes a protein.

[0059] In certain embodiments, the protein comprises a chimeric antigen receptor (CAR) .

[0060] In certain embodiments, the VLP is derived from retroviral vector (RVV) , adenoviral vector, or adeno-associated viral vector.

[0061] In certain embodiments, the RVV is lentiviral vector or γ-retroviral vector.

[0062] In certain embodiments, the composition is for viral vector or virus-like particle (VLP) cryopreservation.

[0063] Based on the shortcomings of the prior art, one of the main objects of the present disclosure is to provide a composition comprising a buffer, an ionic salt, a carbohydrate, and optionally a cryoprotectant, wherein

[0064] the buffer is one or more selected from the group consisting of PIPES, HEPES, Tris and PB,

[0065] the ionic salt is one or two selected from the group consisting of sodium chloride and magnesium chloride,

[0066] the carbohydrate is one or more selected from the group consisting of trehalose, sucrose and mannitol,

[0067] the cryoprotectant is one or more selected from the group consisting of DMSO, Glycerol, Poloxamer and Polysorbate.

[0068] In certain embodiments,

[0069] (1) the buffer is HEPES, and / or

[0070] (2) the ionic salt is one or two selected from the group consisting of sodium chloride and magnesium chloride, and / or

[0071] (3) the carbohydrate is trehalose, and / or

[0072] (4) the cryoprotectant is one or two selected from the group consisting of DMSO and Poloxamer.

[0073] In certain embodiments,

[0074] (1) the concentration of HEPES is about 10-50 mM, or about 10-20, 15-25, 20-30, 25-35, 30-40, 35-45, or 40-50mM; and / or

[0075] (2) the concentration of sodium chloride is about 30-150 mM, or about 30-40, 35-50, 40-55, 45-60, 50-65, 55-70, 60-75, 65-80, 70-85, 75-90, 80-95, 85-100, 90-105, 95-110, 100-115, 105-120, 110-125, 115-130, 120-135, 125-140, 130-145, or 140-150mM; and / or

[0076] (3) the concentration of magnesium chloride is about 10-30 mM, or about 10-20, 15-25, or 20-30mM; and / or

[0077] (4) the concentration of trehalose is about 0.5%w / v-10%w / v, or about 0.5%w / v-1.5%w / v, 1%w / v-3%w / v, 2.5%w / v-4%w / v, 3.5%w / v-5%w / v, 4.5%w / v-6%w / v, 5.5%w / v-7%w / v, 6.5%w / v-8%w / v, 7.5%w / v-9%w / v, or 8.5%w / v-10%w / v; and / or

[0078] (5) the concentration of Poloxamer is about 0.05%w / v-5%w / v, or about 0.05%w / v-0.2%w / v, 0.1%w / v-0.3%w / v, 0.2%w / v-0.4%w / v, 0.3%w / v-0.5%w / v, 0.4%w / v-0.6%w / v, 0.5%w / v-0.7%w / v, 0.6%w / v-0.8%w / v, 0.7%w / v-0.9%w / v, 0.8%w / v-1%w / v, 0.9%w / v-2%w / v, 1%w / v-3%w / v, 2%w / v-4%w / v, or 3%w / v-5%w / v; and / or

[0079] (6) the concentration of DMSO is about 5%v / v-20%v / v, or about 5%v / v-15%v / v, or 10%v / v-20%v / v.

[0080] In certain embodiments,

[0081] (1) the concentration of HEPES is about 10, 15, 20, 25, 30, 40, or 50 mM; and / or

[0082] (2) the concentration of sodium chloride is about 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, or 150 mM; and / or

[0083] (3) the concentration of magnesium chloride is about 10, 15, 20, 25, or 30 mM; and / or

[0084] (4) the concentration of trehalose is about 0.5%w / v, 1%w / v, 1.5%w / v, 2%w / v, 2.5%w / v, 3%w / v, 3.5%w / v, 4%w / v, 4.5%w / v, 5%w / v, 5.5%w / v, 6%w / v, 6.5%w / v, 7%w / v, 7.5%w / v, 8%w / v, 8.5%w / v, 9%w / v, 9.5%w / v, or 10%w / v; and / or

[0085] (5) the concentration of Poloxamer is about 0.05%w / v, 0.1%w / v, 0.2%w / v, 0.3%w / v, 0.4%w / v, 0.5%w / v, 0.6%w / v, 0.7%w / v, 0.8%w / v, 0.9%w / v, 1%w / v, 2%w / v, 3%w / v, 4%w / v, or 5%w / v; and / or

[0086] (6) the concentration of DMSO is about 5%v / v, 10%v / v, 15%v / v, or 20%v / v.

[0087] In certain embodiments, the Poloxamer is one or more selected from the group consisting of P101, P105, P108, P122, P123, P124, P181, P182, P183, P184, P185, P188, P212, P215, P217, P231, P234, P235, P237, P238, P282, P284, P288, P331, P333, P334, P335, P338, P401, P402, P403, P407; and / or the Polysorbate is one or more selected from the group consisting of PS20, PS40, PS60, PS80.

[0088] In certain embodiments, the Poloxamer is P188, and / or the Polysorbate is PS80.

[0089] In certain embodiments, the composition comprises HEPES, sodium chloride, magnesium chloride and trehalose, wherein

[0090] (1) HEPES is about 20 mM,

[0091] (2) sodium chloride is about 50 mM,

[0092] (3) magnesium chloride is about 20 mM,

[0093] (4) the concentration of trehalose is about 1%w / v.

[0094] In certain embodiments, the composition comprises HEPES, sodium chloride, magnesium chloride, trehalose and P188 or DMSO, wherein

[0095] (1) HEPES is about 20 mM,

[0096] (2) sodium chloride is about 50 mM,

[0097] (3) magnesium chloride is about 20 mM,

[0098] (4) the concentration of trehalose is about 1%w / v,

[0099] (5) the concentration of P188 is about 0.5%w / v, or the concentration of DMSO is about 15%v / v or 20%v / v.

[0100] In certain embodiments, the composition comprises HEPES, sodium chloride, magnesium chloride, trehalose and P188, wherein

[0101] (1) HEPES is about 20 mM,

[0102] (2) sodium chloride is about 50 mM,

[0103] (3) magnesium chloride is about 20 mM,

[0104] (4) the concentration of trehalose is about 1%w / v,

[0105] (5) the concentration of P188 is about 0.5%w / v.

[0106] In certain embodiments, the pH of the composition is about 6.5-8.5.

[0107] In certain embodiments, the pH of the composition is about 6.5-8.0 or 7.0-8.5.

[0108] In certain embodiments, the pH of the composition is about 7.0.

[0109] In certain embodiments, the composition is for viral vector or virus-like particle (VLP) cryopreservation.

[0110] In certain embodiments, the viral vector is retroviral vector (RVV) , adenoviral vector, or adeno-associated viral vector.

[0111] In certain embodiments, the RVV is lentiviral vector or γ-retroviral vector.

[0112] In certain embodiments, the viral vector comprises a transgene.

[0113] In certain embodiments, the transgene encodes a protein.

[0114] In certain embodiments, the protein comprises a chimeric antigen receptor (CAR) .

[0115] In certain embodiments, the VLP is derived from retroviral vector (RVV) , adenoviral vector, or adeno-associated viral vector.

[0116] In certain embodiments, the RVV is lentiviral vector or γ-retroviral vector.

[0117] A second object of the present disclosure is to provide a method for cryopreserving a viral vector or a virus-like particle (VLP) by using the composition disclosed herein above.

[0118] Another object of the present disclosure is to provide a method for delivering a viral vector or VLP, into a cell of a subject, the method comprising administering the composition disclosed herein above to the subject.

[0119] And yet another object of the present disclosure is to provide use of the composition disclosed herein above in the preparation of a kit for delivering a viral vector or VLP into a cell of a subject.

[0120] Viral vectors (e.g., retroviral vectors) are oversized biomolecules with complex nucleic acids, proteins and envelope structures, which makes the screening of stabilizers very difficult and different from that for previous antibody and protein drugs. The stabilizer formulations are usually more complex and have ineffective protection, the loss of activity after a freeze-thaw is usually 50%or even more.

[0121] Compared with the prior art, the technical solution of the present disclosure has at least the following beneficial effects.

[0122] The formulation from the present disclosure has a very superior cryoprotection effect that can maintain the biological activity of viral vectors (e.g., retroviral vectors) or VLP at a significantly high level, e.g., a level of more than 40%, 50%, 60%, or 70%, especially more than 70%.

[0123] In addition, the present disclosure is to provide formulations, which are with well-defined ingredients and relatively simple components, wherein all reagents are compliant with pharmacopoeial standards and can support applications in both the clinical stage and the commercialization stage.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0124] FIG. 1 shows effect of basic buffer and pH on freeze-thaw stability of RVV.

[0125] FIG. 2 shows effect of salt concentration on freeze-thaw stability of RVV.

[0126] FIG. 3 shows effect of MgCl2 on freeze-thaw stability of RVV.

[0127] FIG. 4 shows effect of carbohydrate on freeze-thaw stability of RVV.

[0128] FIG. 5 shows effect of cryoprotectant on freeze-thaw stability of RVV.

[0129] FIG. 6 shows effect of P188 or PS80 on freeze-thaw stability of retrovirus-derived VLP.

[0130] DEFINITIONS

[0131] In the present disclosure, unless otherwise stated, scientific and technical terms used herein have meanings commonly understood by those skilled in the art. In addition, the laboratory procedures of cell culture, biochemistry, cell biology, nucleic acid chemistry and the like used herein are all routine steps widely used in the corresponding fields. Meanwhile, in order to better understand the present disclosure, definitions and explanations of related terms are provided below.

[0132] As used herein, the term "about" refers to a value that is within 10%above or below the numerical value being described, i.e. ± 10%of the numerical value. For instance, a value of "about 50 mM" denotes a concentration of from 45 mM to 55 mM.

[0133] As used herein, the singular forms “a, ” “an” and “the” include plural referents unless the content clearly dictates otherwise. For example, reference to “an ionic salt” includes a mixture of two or more such ionic salts, reference to “a carbohydrate” includes a mixture of two or more such carbohydrates or a plurality of such carbohydrates, and the like.

[0134] As used herein, the term “comprise” or variations thereof such as “comprises” or “comprising” are to be read to indicate the inclusion of any recited integer (e.g., a feature, element, characteristic, property, method / process step or limitation) or group of integers (e.g., features, element, characteristics, properties, method / process steps or limitations) but not the exclusion of any other integer or group of integers. Thus, as used herein, the term “comprising” is inclusive and does not exclude additional, unrecited integers or method / process steps.

[0135] As used herein, the term DMSO means Dimethyl sulfoxide.

[0136] As used herein, the terms “Poloxamer” or “Poloxamers” defined as polyoxyethylene, polyoxypropylene block polymers. Poloxamer includes but not limited to Poloxamer 101 (P101) , Poloxamer 105 (P105) , Poloxamer 108 (P108) , Poloxamer 122 (P122) , Poloxamer 123 (P123) , Poloxamer 124 (P124) , Poloxamer 181 (P181) , Poloxamer 182 (P182) , Poloxamer 183 (P183) , Poloxamer 184 (P184) , Poloxamer 185 (P185) , Poloxamer 188 (P188) , Poloxamer 212 (P212) , Poloxamer 215 (P215) , Poloxamer 217 (P217) , Poloxamer 231 (P231) , Poloxamer 234 (P234) , Poloxamer 235 (P235) , Poloxamer 237 (P237) , Poloxamer 238 (P238) , Poloxamer 282 (P282) , Poloxamer 284 (P284) , Poloxamer 288 (P288) , Poloxamer 331 (P331) , Poloxamer 333 (P333) , Poloxamer 334 (P334) , Poloxamer 335 (P335) , Poloxamer 338 (P338) , Poloxamer 401 (P401) , Poloxamer 402 (P402) , Poloxamer 403 (P403) , Poloxamer 407 (P407) .

[0137] As used herein, the term “Polysorbate” refers to a class of emulsifiers used in some pharmaceuticals and food preparation. Polysorbates are oily liquids derived from ethoxylated sorbitan (a derivative of sorbitol) esterified with fatty acids. Polysorbate includes but not limited to polysorbate 20 (PS20) , polysorbate 40 (PS40) , polysorbate 60 (PS60) , polysorbate 80 (PS80) .

[0138] As used herein, the term PIPES means 1, 4-piperazinediethanesulfonic acid.

[0139] As used herein, the term HEPES means 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid.

[0140] As used herein, the term Tris means Tris (hydroxymethyl) aminomethane.

[0141] As used herein, the term PB means Phosphate buffer, which is the most widely used buffer in biochemical research, typically consisting of sodium phosphate buffer (NaH2PO4 & Na2HPO4) and potassium phosphate buffer (K2HPO4 & KH2PO4) .

[0142] As used herein, the term "buffer" refers to a mixture of a weak acid and its conjugate base or a weak base and its conjugate acid. For instance, as used herein, a "1, 4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) buffer" refers to a mixture that includes 1, 4-piperazinediethanesulfonic acid and the 1, 4-piperazinediethanesulfonate anion (e.g., sodium 1, 4-piperazinediethanesulfonate) . Likewise, a "HEPES buffer" as used herein refers to a mixture that includes 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid and the 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonate anion (e.g., sodium 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonate) . Due to the chemical equilibrium that is established between a weak acid and its conjugate base, a solution containing a buffer resists abrupt changes in pH upon the addition of small quantities of acid or base to the solution.

[0143] As used herein, the term "freeze-thaw" refers to exposure of a liquid mixture, such as an aqueous solution or suspension, to a temperature at or less than its freezing point until the mixture is frozen, followed by thawing the mixture at a temperature greater than its freezing point. The freezing step can be performed, e.g., by placing the mixture in an environment in which the temperature is from about -80 ℃ to about -20 ℃. The mixture can remain frozen, e.g., for a period of one or more days, weeks, months, or years prior to thawing. The thawing step can be performed by exposing the mixture to conditions in which the temperature is from about 2 ℃ to about 8 ℃, or by storing the mixture at room temperature (e.g., the ambient temperature of a laboratory, or about 25 ℃) . Alternatively, thawing can take place by use of a water bath (e.g., at 37℃) .

[0144] As used herein, the term "carbohydrate" refers to a carbohydrate that does not exist in a state of chemical equilibrium with an aldehyde, and thus lacks the ability to be oxidized to a carboxylic acid by transition metal cations, such as silver (Ag+) and copper (Cu2+) . Exemplary carbohydrates include, without limitation, disaccharides such as sucrose, trehalose, and palatinitol, trisaccharides such as raffinose and melezitose, as well as tetrasaccharides such as stachyose. Carbohydrates additionally include monosaccharide derivatives such as sorbitol, mannitol, erythritol, and xylitol, disaccharide derivatives such as lacitol and maltitol, aldonic acids and their lactones such as gluconic acid, gluconic acid γ-lactone, aldaric acids and their lactones such as ribaraic acid, arabinaric acid, and galactaric acid, uronic acids such as glucuronic acid, galaccuronic acid, and itiannuronic acid, ester derivatives such as trehalose octaacetate, sucrose octaacetate, and cellobiose octaacetate, and ether derivatives in which hydroxyl groups are O-alkylated. Carbohydrates include those that have a D or L stereochemical orientation.

[0145] As used herein, the term "%w / v" or "percent by weight per volume" denotes the percentage weight (in grams) of a single component relative to the total volume of the mixture that contains the component. For instance, 500 mg (i.e. 0.5 g) of a component in a total volume of 8 ml is 6.25%w / v, and 500 mg (i.e. 0.5 g) of a component in a total volume of 5 ml is 10%w / v.

[0146] As used herein, the term "%v / v" or "percent by volume per volume" denotes the percentage volume of a single component relative to the total volume of the mixture that contains the component. For instance, 10 mL of a component in a total volume of 100 ml is 10%v / v.

[0147] As used herein, the term "transgene" may refer to a nucleic acid sequence that encodes a protein or functional RNA product that is not naturally expressed in the cell into which the transgene is to be introduced. Alternatively, a transgene may be homologous to an endogenous gene of the cell into which the transgene is to be introduced but is designed to be inserted into the genome of the target cell to alter the genome of the cell into which it is inserted. For instance, a transgene may be homologous to an endogenous gene of a target cell but is to be inserted at a location within the genome of the target cell that differs from the location of the naturally occurring gene.

[0148] As used herein, the term "viral titer" refers to the number of infectious vector particles, or "transducing units, " that result in the production of a transgene product in a target cell. Viral titer can be measured by a functional assay, such as an assay described in Xiao et al., Exp. Neurobiol. 144: 113-124, 1997, or Fisher et al., J. Virol. 70: 520-532, 1996, the disclosures of both of which are incorporated herein by reference. Alternatively, viral titer can be measured by determining the quantity of viral DNA that has integrated into a host cell genome, e.g., using polymerase chain reaction (PCR) techniques known in the art.

[0149] In the present disclosure, the cells after viral vector transduction are detected by flow cytometry, and the titer is calculated according to the following formula:

[0150] Titer (TU / mL) = (N × F × 1000)  /  (V / D)

[0151] N: HT1080 cells number

[0152] F: Positive rate

[0153] D: Virus vectors dilution fold

[0154] V: Virus vectors volume added to each well

[0155] Specifically, HT1080 cells (ATCC) in exponential growth phase are centrifuged and counted. The cell density is adjusted to 1.2×105 cells / mL. The cells are plated in a sterile 24-well flat-bottom plate at 500 μL / well. After being cultured for 24h the cell density is counted to confirm the number of cells to be infected. Serially diluted virus vectors are added to each well of the 24-well plate. The cells are cultured for 72 hours in an incubator. The cells in each well are collected and the detection antibody is added. After further incubation and washing, the cells are analyzed by flow cytometry to determine the proportion of positive cells. Wells with 5-30%positive rates and showing a linear relationship to virus vector concentration are selected, and the virus titers are calculated according to the above formula.

[0156] As used herein, the term “viral vector” means a vector construct with viral components, such as capsid and / or coat proteins, that has been adapted to comprise and deliver a transgene or nucleic acid material that encodes a therapeutic, such as a therapeutic protein, which transgene or nucleic acid material can be expressed as provided herein. “Expressed” or “expression” or the like refers to the synthesis of a functional (i.e., physiologically active for the desired purpose) product after the transgene or nucleic acid material is transduced into a cell and processed by the transduced cell. Such a product is also referred to herein as an “expression product” .

[0157] Viral vectors contain structural and / or functional genetic elements that are primarily derived from a virus. For example, the term “retroviral vector” refers to a viral vector containing structural and functional genetic elements, or portions thereof, that are primarily derived from a retrovirus. And for another example, the term “lentiviral vector” refers to a viral vector containing structural and functional genetic elements, or portions thereof, that are primarily derived from a lentivirus.

[0158] As referred herein, the term “retrovirus” refers to one or more members of the family Retroviridae, which are enveloped viruses with a small spherical shape containing two single stranded RNA molecules. Retroviruses convert their RNA molecules into DNA, which is then integrated into the host genome of the infected cell. Retrovirus-based vectors are well-known in the field of gene therapy for cancer treatment where immune cells are re-programmed to target and destroy cancer cells.

[0159] As referred to herein, the term “adenovirus” refers to a nonenveloped virus with an icosahedral nucleocapsid containing a double stranded DNA of the family Adenoviridae. Over 50 adenoviral subtypes have been isolated from humans and many additional subtypes have been isolated from other mammals and birds. All adenoviruses are morphologically and structurally similar. In humans, however, adenoviruses show diverging immunological properties and are, therefore, divided into serotypes.

[0160] As used herein, the term “adeno-associated virus (AAV) ” refers to a small sized, replicative-defective, nonenveloped virus containing a single stranded DNA of the family Parvoviridae and the genus Dependoparvovirus. Over 10 adeno-associated virus serotypes have been identified so far, with serotype AAV2 being the best characterized. Other non-limiting examples of AAV serotypes are ANC80, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, and AAV11. In addition to these serotypes, AAV pseudotypes have been developed. An AAV pseudotype contains the capsid of a first serotype and the genome of a second serotype (e.g. the pseudotype AAV2 / 5 would correspond to an AAV with the genome of serotype AAV2 and the capsid of AAV5) .

[0161] As referred herein, the term “lentivirus” refers to an enveloped virus with a small spherical shape containing two single stranded RNA molecules belonging to the family Retroviridae. Lentiviruses contain gag, pol, and env genes and are further distinguished from other retrovirus family members by having two regulatory genes, tat and rev. Lentivirus vectors are widely known in the art as useful tools in molecular biology to induce expression of genes of interest in cultured cells and animal tissues.

[0162] As used herein, the terms "virus-like particle" , “VLP” refer to a nonreplicating, viral shell. VLPs are generally composed of one or more viral proteins, such as, but not limited to those proteins referred to as capsid, coat, shell, surface and / or envelope proteins, or particle-forming polypeptides derived from these proteins. VLPs can also be described as “enveloped” if they contain a cell derived lipid membrane or “non-enveloped” if assembly with protein without a lipid membrane. VLPs can form spontaneously upon recombinant expression of the protein in an appropriate expression system. Methods for producing particular VLPs are known in the art. The presence of VLPs following recombinant expression of viral proteins can be detected using conventional techniques known in the art, such as by electron microscopy, biophysical and immunological characterizations, and the like. See, e.g., Baker et al., Biophys. J. (1991) 60: 1445-1456; Hagensee et al., J. Virol. (1994) 68: 4503-4505. For example, VLPs can be isolated by density gradient centrifugation and / or identified by characteristic density banding. Alternatively, cryoelectron microscopy can be performed on vitrified aqueous samples of the VLP preparation in question, and images recorded under appropriate exposure conditions. Additional methods of VLP purification include, but are not limited to, chromatographic techniques such as affinity, ion exchange, size exclusion, and reverse phase procedures.

[0163] As used herein, the term "Chimeric Antigen Receptor" or alternatively a "CAR" refers to a recombinant polypeptide construct comprising at least an extracellular antigen binding domain, a transmembrane domain and a cytoplasmic signaling domain (also referred to herein as "an intracellular signaling domain" ) comprising a functional signaling domain derived from a stimulatory molecule as defined herein. The domains in the CAR polypeptide construct may be in the same polypeptide chain, for example, comprise a chimeric fusion protein. The domains in the CAR polypeptide construct may be not contiguous with each other, for example, are in different polypeptide chains.

[0164] As used herein, the terms “extracellular domain” or “extracellular region” are used interchangeably herein to refer to the portion of a receptor that is outside the cell membrane. The extracellular domain can be entire portion of a receptor that is outside the cell membrane, or just a part thereof (e.g., at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%of the entire portion) . The extracellular domain can be derived from the extracellular domain of a wild-type receptor or a functional variant thereof. The extracellular domain may have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, and / or substitutions.

[0165] As used herein, the terms “intracellular domain” , “intracellular region” or “cytoplasmic region” are used interchangeably herein to refer to the portion of a receptor that is inside the cell. The intracellular domain can be entire portion of a receptor that is inside the cell, or just a part thereof (e.g., at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%of the entire portion) . The intracellular domain can be derived from the intracellular domain of a wild-type receptor or a functional variant thereof. The intracellular domain may have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, and / or substitutions.

[0166] As used herein, the terms “transmembrane domain” or “transmembrane region” or are used interchangeably herein to refer to the portion of a receptor that is embedded in the cell membrane. The transmembrane domain can be entire portion of a receptor that is embedded in the cell membrane, or just a part thereof (e.g., at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%of the entire portion) . The transmembrane domain can be derived from the transmembrane domain of a wild-type receptor or a functional variant thereof. The transmembrane domain may have one or more mutations, including e.g., insertions, deletions, and / or substitutions. The transmembrane domain may be a transmembrane domain of a CAR.Detailed Description

[0167] The present disclosure is based on the discovery that the formulation composition provided by the present disclosure exhibits a very superior cryoprotection effect. Said formulation composition can significantly increases the freeze-thaw stability of viral vectors e.g., retroviral vectors. The formulation composition can also be applied to the cryopreservation of VLP based on viral vector backbones e.g., retroviral vector backbones, and the biological activity after freeze-thaw can be increased significantly. The present disclosure significantly improves the biological activity retention of viral vectors e.g., retroviral vectors, which can provide stable, reliable and consistent viral vectors for cell preparations.

[0168] Components of the formulation composition

[0169] The formulation composition of the present disclosure may include a variety of components. Specifically, said composition may comprises optionally viral vector or virus-like particle (VLP) , a buffer, an ionic salt, a carbohydrate, and optionally a cryoprotectant. Therein, the buffer may be one or more selected from the group consisting of PIPES, HEPES, Tris and PB, the ionic salt may be one or two selected from the group consisting of sodium chloride and magnesium chloride, the carbohydrate may be one or more selected from the group consisting of trehalose, sucrose and mannitol, and the cryoprotectant may be one or more selected from the group consisting of DMSO, Glycerol, Poloxamer and Polysorbate.

[0170] The formulation composition of the present disclosure may be aqueous mixtures, such as aqueous solutions or suspensions. It may comprise HEPES. HEPES may be present in the composition e.g., at a concentration of about 10-50 mM; or about 10-40, 15-45, 20-50 mM; or about 10-30, 15-35, 20-40, 25-45, 30-50 mM; or about 10-20, 15-25, 20-30, 25-35, 30-40, 35-45, 40-50 mM; or about 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM, 26 mM, 27 mM, 28 mM, 29 mM, 30 mM, 31 mM, 32 mM, 33 mM, 34 mM, 35 mM, 36 mM, 37 mM, 38 mM, 39 mM, 40 mM, 41 mM, 42 mM, 43 mM, 44 mM, 45 mM, 46 mM, 47 mM, 48 mM, 49 mM, 50 mM.

[0171] The formulation composition of the present disclosure may comprise sodium chloride or magnesium chloride or the combination thereof. When sodium chloride is comprised, it may be present in the composition e.g., at a concentration of 30-150 mM; or about 30-140, 35-145, 40-150 mM; or about 30-130, 35-135, 40-140, 45-145, 50-150 mM; or about 30-120, 35-125, 40-130, 45-135, 50-140, 55-145, 60-150 mM; or about 30-110, 35-115, 40-120, 45-125, 50-130, 55-135, 60-140, 65-145, 70-150 mM; or about 30-100, 35-105, 40-110, 45-115, 50-120, 55-125, 60-130, 65-135, 70-140, 75-145, 80-150 mM; or about 30-90, 35-95, 40-100, 45-105, 50-110, 55-115, 60-120, 65-125, 70-130, 75-135, 80-140, 85-145, 90-150 mM; or about 30-80, 35-85, 40-90, 45-95, 50-100, 55-105, 60-110, 65-115, 70-120, 75-125, 80-130, 85-135, 90-140, 95-145, 100-150 mM; or about 30-70, 35-75, 40-80, 45-85, 50-90, 55-95, 60-100, 65-105, 70-110, 75-115, 80-120, 85-125, 90-130, 95-135, 100-140, 105-145, 110-150 mM; or about 30-60, 35-65, 40-70, 45-75, 50-80, 55-85, 60-90, 65-95, 70-100, 75-105, 80-110, 85-115, 90-120, 95-125, 100-130, 105-135, 110-140, 115-145, 120-150 mM; or about 30-50, 35-55, 40-60, 45-65, 50-70, 55-75, 60-80, 65-85, 70-90, 75-95, 80-100, 85-105, 90-110, 95-115, 100-120, 105-125, 110-130, 115-135, 120-140, 125-145, 130-150 mM; or about 30-40, 35-50, 40-55, 45-60, 50-65, 55-70, 60-75, 65-80, 70-85, 75-90, 80-95, 85-100, 90-105, 95-110, 100-115, 105-120, 110-125, 115-130, 120-135, 125-140, 130-145, 140-150mM; or about 30 mM, 31 mM, 32 mM, 33 mM, 34 mM, 35 mM, 36 mM, 37 mM, 38 mM, 39 mM, 40 mM, 41 mM, 42 mM, 43 mM, 44 mM, 45 mM, 46 mM, 47 mM, 48 mM, 49 mM, 50 mM, 51 mM, 52 mM, 53 mM, 54 mM, 55 mM, 56 mM, 57 mM, 58 mM, 59 mM, 60 mM, 61 mM, 62 mM, 63 mM, 64 mM, 65 mM, 66 mM, 67 mM, 48 mM, 69 mM, 70 mM, 71 mM, 72 mM, 73 mM, 74 mM, 75 mM, 76 mM, 77 mM, 78 mM, 79 mM, 80 mM, 81 mM, 82 mM, 83 mM, 84 mM, 85 mM, 86 mM, 87 mM, 88 mM, 89 mM, 90 mM, 91 mM, 92 mM, 93 mM, 94 mM, 95 mM, 96 mM, 97 mM, 98 mM, 99 mM, 100 mM, 101 mM, 102 mM, 103 mM, 104 mM, 105 mM, 106 mM, 107 mM, 108 mM, 109 mM, 110 mM, 111 mM, 112 mM, 113 mM, 114 mM, 115 mM, 116 mM, 117 mM, 118 mM, 119 mM, 120 mM, 121 mM, 122 mM, 123 mM, 124 mM, 125 mM, 126 mM, 127 mM, 128 mM, 129 mM, 130 mM, 131 mM, 132 mM, 133 mM, 134 mM, 135 mM, 136 mM, 137 mM, 138 mM, 139 mM, 140 mM, 141 mM, 142 mM, 143 mM, 144 mM, 145 mM, 1 46 mM, 147 mM, 148 mM, 149 mM, 150 mM. When magnesium chloride is comprised, it may be present in the composition e.g., at a concentration of 10-30 mM; or about 10-20, 15-25, 20-30mM; or about 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM, 26 mM, 27 mM, 28 mM, 29 mM, 30 mM.

[0172] The formulation composition of the present disclosure may comprise trehalose. Trehalose may be present in the composition e.g., at a concentration of about 0.5%w / v-10%w / v; or about 0.5%w / v-9.5%w / v, 1%w / v-10%w / v; or about 0.5%w / v-8.5%w / v, 1%w / v-9%w / v, 1.5%w / v-9.5%w / v, or 2%w / v-10%w / v; or about 0.5%w / v-7.5%w / v, 1%w / v-8%w / v, 1.5%w / v-8.5%w / v, 2%w / v-9%w / v, 2.5%w / v-9.5%w / v, or 3%w / v-10%w / v; or about 0.5%w / v-6.5%w / v, 1%w / v-7%w / v, 1.5%w / v-7.5%w / v, 2%w / v-8%w / v, 2.5%w / v-8.5%w / v, 3%w / v-9%w / v, 3.5%w / v-9.5%w / v, or 4%w / v-10%w / v; or about 0.5%w / v-5.5%w / v, 1%w / v-6%w / v, 1.5%w / v-6.5%w / v, 2%w / v-7%w / v, 2.5%w / v-7.5%w / v, 3%w / v-8%w / v, 3.5%w / v-8.5%w / v, 4%w / v-9%w / v, 4.5%w / v-9.5%w / v, or 5%w / v-10%w / v; or about 0.5%w / v-4.5%w / v, 1%w / v-5%w / v, 1.5%w / v-5.5%w / v, 2%w / v-6%w / v, 2.5%w / v-6.5%w / v, 3%w / v-7%w / v, 3.5%w / v-7.5%w / v, 4%w / v-8%w / v, 4.5%w / v-8.5%w / v, 5%w / v-9%w / v, 5.5%w / v-9.5%w / v, or 6%w / v-10%w / v; or about 0.5%w / v-3.5%w / v, 1%w / v-4%w / v, 1.5%w / v-4.5%w / v, 2%w / v-5%w / v, 2.5%w / v-5.5%w / v, 3%w / v-6%w / v, 3.5%w / v-6.5%w / v, 4%w / v-7%w / v, 4.5%w / v-7.5%w / v, 5%w / v-8%w / v, 5.5%w / v-8.5%w / v, 6%w / v-9%w / v, 6.5%w / v-9.5%w / v, or 7%w / v-10%w / v; or about 0.5%w / v-2.5%w / v, 1%w / v-3%w / v, 1.5%w / v-3.5%w / v, 2%w / v-4%w / v, 2.5%w / v-4.5%w / v, 3%w / v-5%w / v, 3.5%w / v-5.5%w / v, 4%w / v-6%w / v, 4.5%w / v-6.5%w / v, 5%w / v-7%w / v, 5.5%w / v-7.5%w / v, 6%w / v-8%w / v, 6.5%w / v-8.5%w / v, 7%w / v-9%w / v, 7.5%w / v-9.5%w / v, or 8%w / v-10%w / v; or about 0.5%w / v-2%w / v, 1%w / v-2.5%w / v, 1.5%w / v-3%w / v, 2%w / v-3.5%w / v, 2.5%w / v-4%w / v, 3%w / v-4.5%w / v, 3.5%w / v-5%w / v, 4%w / v-5.5%w / v, 4.5%w / v-6%w / v, 5%w / v-6.5%w / v, 5.5%w / v-7%w / v, 6%w / v-7.5%w / v, 6.5%w / v-8%w / v, 7%w / v-8.5%w / v, 7.5%w / v-9%w / v, 8%w / v-9.5%w / v, or 8.5%w / v-10%w / v; or about 0.5%w / v-1.5%w / v, 1%w / v-2%w / v, 1.5%w / v-2.5%w / v, 2%w / v-3%w / v, 2.5%w / v-3.5%w / v, 3%w / v-4%w / v, 3.5%w / v-4.5%w / v, 4%w / v-5%w / v, 4.5%w / v-5.5%w / v, 5%w / v-6%w / v, 5.5%w / v-6.5%w / v, 6%w / v-7%w / v, 6.5%w / v-7.5%w / v, 7%w / v-8%w / v, 7.5%w / v-8.5%w / v, 8%w / v-9%w / v, 8.5%w / v-9.5%w / v, or 9 %w / v-10%w / v; or about 0.5%w / v, 0.6%w / v, 0.7%w / v, 0.8%w / v, 0.9%w / v, 1%w / v, 1.1%w / v, 1.2%w / v, 1.3%w / v, 1.4%w / v, 1.5%w / v, 1.6%w / v, 1.7%w / v, 1.8%w / v, 1.9%w / v, 2%w / v, 2.1%w / v, 2.2%w / v, 2.3%w / v, 2.4%w / v, 2.5%w / v, 2.6%w / v, 2.7%w / v, 2.8%w / v, 2.9%w / v, 3%w / v, 3.1%w / v, 3.2%w / v, 3.3%w / v, 3.4%w / v, 3.5%w / v, 3.6%w / v, 3.7%w / v, 3.8%w / v, 3.9%w / v, 4%w / v, 4.1%w / v, 4.2%w / v, 4.3%w / v, 4.4%w / v, 4.5%w / v, 4.6%w / v, 4.7%w / v, 4.8%w / v, 4.9%w / v, 5%w / v, 5.1%w / v, 5.2%w / v, 5.3%w / v, 5.4%w / v, 5.5%w / v, 5.6%w / v, 5.7%w / v, 5.8%w / v, 5.9%w / v, 6%w / v, 6.1%w / v, 6.2%w / v, 6.3%w / v, 6.4%w / v, 6.5%w / v, 6.6%w / v, 6.7%w / v, 6.8%w / v, 6.9%w / v, 7%w / v, 7.1%w / v, 7.2%w / v, 7.3%w / v, 7.4%w / v, 7.5%w / v, 7.6%w / v, 7.7%w / v, 7.8%w / v, 7.9%w / v, 8%w / v, 8.1%w / v, 8.2%w / v, 8.3%w / v, 8.4%w / v, 8.5%w / v, 8.6%w / v, 8.7%w / v, 8.8%w / v, 8.9%w / v, 9%w / v, 9.1%w / v, 9.2%w / v, 9.3%w / v, 9.4%w / v, 9.5%w / v, 9.6%w / v, 9.7%w / v, 9.8%w / v, 9.9%w / v, or 10%w / v.

[0173] The formulation composition of the present disclosure may comprise DMSO or Poloxamer or the combination thereof.

[0174] When DMSO is comprised, it may be present in the composition e.g., at a concentration of about 5%v / v-20%v / v; or about 5%v / v-15%v / v, or 10%v / v-20%v / v; or about 5%v / v-10%v / v, 10%v / v-15%v / v, or 15%v / v-20%v / v; or about 5%v / v-7.5%v / v, 7.5%v / v-10%v / v, 10%v / v-12.5%v / v, 12.5%v / v-15%v / v, 15%v / v-17.5%v / v, or 17.5%v / v-20%v / v; or about 5%v / v, 6%v / v, 7%v / v, 7.5%v / v, 8%v / v, 9%v / v, 10%v / v, 11%v / v, 12%v / v, 12.5%v / v, 13%v / v, 14%v / v, 15%v / v, 16%v / v, 17%v / v, 17.5%v / v, 18%v / v, 19%v / v, 20%v / v.

[0175] When Poloxamer is comprised, it may be present in the composition e.g., at a concentration of about 0.05%w / v-5%w / v; or about 0.05%w / v-4%w / v, 0.1%w / v-4.1%w / v, 0.2%w / v-4.2%w / v, 0.3%w / v-4.3%w / v, 0.4%w / v-4.4%w / v, 0.5%w / v-4.5%w / v, 0.6%w / v-4.6%w / v, 0.7%w / v-4.7%w / v, 0.8%w / v-4.8%w / v, 0.9%w / v-4.9%w / v, or 1%w / v-5%w / v; or about 0.05%w / v-3%w / v, 0.1%w / v-3.1%w / v, 0.2%w / v-3.2%w / v, 0.3%w / v-3.3%w / v, 0.4%w / v-3.4%w / v, 0.5%w / v-3.5%w / v, 0.6%w / v-3.6%w / v, 0.7%w / v-3.7%w / v, 0.8%w / v-3.8%w / v, 0.9%w / v-3.9%w / v, 1%w / v-4%w / v, 1.1%w / v-4.1%w / v, 1.2%w / v-4.2%w / v, 1.3%w / v-4.3%w / v, 1.4%w / v-4.4%w / v, 1.5%w / v-4.5%w / v, 1.6%w / v-4.6%w / v, 1.7%w / v-4.7%w / v, 1.8%w / v-4.8%w / v, 1.9%w / v-4.9%w / v, or 2%w / v-5%w / v; or about 0.05%w / v-2%w / v, 0.1%w / v-2.1%w / v, 0.2%w / v-2.2%w / v, 0.3%w / v-2.3%w / v, 0.4%w / v-2.4%w / v, 0.5%w / v-2.5%w / v, 0.6%w / v-2.6%w / v, 0.7%w / v-2.7%w / v, 0.8%w / v-2.8%w / v, 0.9%w / v-2.9%w / v, 1%w / v-3%w / v, 1.1%w / v-3.1%w / v, 1.2%w / v-3.2%w / v, 1.3%w / v-3.3%w / v, 1.4%w / v-3.4%w / v, 1.5%w / v-3.5%w / v, 1.6%w / v-3.6%w / v, 1.7%w / v-3.7%w / v, 1.8%w / v-3.8%w / v, 1.9%w / v-3.9%w / v, 2%w / v-4%w / v, 2.1%w / v-4.1%w / v, 2.2%w / v-4.2%w / v, 2.3%w / v-4.3%w / v, 2.4%w / v-4.4%w / v, 2.5%w / v-4.5%w / v, 2.6%w / v-4.6%w / v, 2.7%w / v-4.7%w / v, 2.8%w / v-4.8%w / v, 2.9%w / v-4.9%w / v, or 3%-5%w / v; or about 0.05%w / v-1.5%w / v, 0.1%w / v-1.6%w / v, 0.2%w / v-1.7%w / v, 0.3%w / v-1.8%w / v, 0.4%w / v-1.9%w / v, 0.5%w / v-2%w / v, 0.6%w / v-2.1%w / v, 0.7%w / v-2.2%w / v, 0.8%w / v-2.3%w / v, 0.9%w / v-2.4%w / v, 1%w / v-2.5%w / v, 1.1%w / v-2.6%w / v, 1.2%w / v-2.7%w / v, 1.3%w / v-2.8%w / v, 1.4%w / v-2.9%w / v, 1.5%w / v-3%w / v, 1.6%w / v-3.1%w / v, 1.7%w / v-3.2%w / v, 1.8%w / v-3.3%w / v, 1.9%w / v-3.4%w / v, 2%w / v-3.5%w / v, 2.1%w / v-3.6%w / v, 2.2%w / v-3.7%w / v, 2.3%w / v-3.8%w / v, 2.4%w / v-3.9%w / v, 2.5%w / v-4%w / v, 2.6%w / v-4.1%w / v, 2.7%w / v-4.2%w / v, 2.8%w / v-4.3%w / v, 2.9%w / v-4.4%w / v, 3%w / v-4.5%w / v, 3.1%w / v-4.6%w / v, 3.2%w / v-4.7%w / v, 3.3%w / v-4.8%w / v, 3.4%w / v-4.9%w / v, or 3.5%w / v-5%w / v; or about 0.05%w / v-1%w / v, 0.1%w / v-1.1%w / v, 0.2%w / v-1.2%w / v, 0.3%w / v-1.3%w / v, 0.4%w / v-1.4%w / v, 0.5%w / v-1.5%w / v, 0.6%w / v-1.6%w / v, 0.7%w / v-1.7%w / v, 0.8%w / v-1.8%w / v, 0.9%w / v-1.9%w / v, 1%w / v-2%w / v, 1.1%w / v-2.1%w / v, 1.2%w / v-2.2%w / v, 1.3%w / v-2.3%w / v, 1.4%w / v-2.4%w / v, 1.5%w / v-2.5%w / v, 1.6%w / v-2.6%w / v, 1.7%w / v-2.7%w / v, 1.8%w / v-2.8%w / v, 1.9%w / v-2.9%w / v, 2%w / v-3%w / v, 2.1%w / v-3.1%w / v, 2.2%w / v-3.2%w / v, 2.3%w / v-3.3%w / v, 2.4%w / v-3.4%w / v, 2.5%w / v-3.5%w / v, 2.6%w / v-3.6%w / v, 2.7%w / v-3.7%w / v, 2.8%w / v-3.8%w / v, 2.9%w / v-3.9%w / v, 3%w / v-4%w / v, 3.1%w / v-4.1%w / v, 3.2%w / v-4.2%w / v, 3.3%w / v-4.3%w / v, 3.4%w / v-4.4%w / v, 3.5%w / v-4.5%w / v, 3.6%w / v-4.6%w / v, 3.7%w / v-4.7%w / v, 3.8%w / v-4.8%w / v, 3.9%w / v-4.9%w / v, or 4%w / v-5%w / v; or about 0.05%w / v-0.5%w / v, 0.1%w / v-0.6%w / v, 0.2%w / v-0.7%w / v, 0.3%w / v-0.8%w / v, 0.4%w / v-0.9%w / v, 0.5%w / v-1%w / v, 0.6%w / v-1.1%w / v, 0.7%w / v-1.2%w / v, 0.8%w / v-1.3%w / v, 0.9%w / v-1.4%w / v, 1%w / v-1.5%w / v, 1.1%w / v-1.6%w / v, 1.2%w / v-1.7%w / v, 1.3%w / v-1.8%w / v, 1.4%w / v-1.9%w / v, 1.5%w / v-2%w / v, 1.6%w / v-2.1%w / v, 1.7%w / v-2.2%w / v, 1.8%w / v-2.3%w / v, 1.9%w / v-2.4%w / v, 2%w / v-2.5%w / v, 2.1%w / v-2.6%w / v, 2.2%w / v-2.7%w / v, 2.3%w / v-2.8%w / v, 2.4%w / v-2.9%w / v, 2.5%w / v-3%w / v, 2.6%w / v-3.1%w / v, 2.7%w / v-3.2%w / v, 2.8%w / v-3.3%w / v, 2.9%w / v-3.4%w / v, 3%w / v-3.5%w / v, 3.1%w / v-3.6%w / v, 3.2%w / v-3.7%w / v, 3.3%w / v-3.8%w / v, 3.4%w / v-3.9%w / v, 3.5%w / v-4%w / v, 3.6%w / v-4.1%w / v, 3.7%w / v-4.2%w / v, 3.8%w / v-4.3%w / v, 3.9%w / v-4.4%w / v, 4%w / v-4.5%w / v, 4.1%w / v-4.6%w / v, 4.2%w / v-4.7%w / v, 4.3%w / v-4.8%w / v, 4.4%w / v-4.9%w / v, or 4.5%w / v-5%w / v; or about 0.05%w / v-0.3%w / v, 0.1%w / v-0.4%w / v, 0.2%w / v-0.5%w / v, 0.3%w / v-0.6%w / v, 0.4%w / v-0.7%w / v, 0.5%w / v-0.8%w / v, 0.6%w / v-0.9%w / v, 0.7%w / v-1%w / v, 0.8%w / v-1.1%w / v, 0.9%w / v-1.2%w / v, 1%w / v-1.3%w / v, 1.1%w / v-1.4%w / v, 1.2%w / v-1.5%w / v, 1.3%w / v-1.6%w / v, 1.4%w / v-1.7%w / v, 1.5%w / v-1.8%w / v, 1.6%w / v-1.9%w / v, 1.7%w / v-2%w / v, 1.8%w / v-2.1%w / v, 1.9%w / v-2.2%w / v, 2%w / v-2.3%w / v, 2.1%w / v-2.4%w / v, 2.2%w / v-2.5%w / v, 2.3%w / v-2.6%w / v, 2.4%w / v-2.7%w / v, 2.5%w / v-2.8%w / v, 2.6%w / v-2.9%w / v, 2.7%w / v-3%w / v, 2.8%w / v-3.1%w / v, 2.9%w / v-3.2%w / v, 3%w / v-3.3%w / v, 3.1%w / v-3.4%w / v, 3.2%w / v-3.5%w / v, 3.3%w / v-3.6%w / v, 3.4%w / v-3.7%w / v, 3.5%w / v-3.8%w / v, 3.6%w / v-3.9%w / v, 3.7%w / v-4%w / v, 3.8%w / v-4.1%w / v, 3.9%w / v-4.2%w / v, 4%w / v-4.3%w / v, 4.1%w / v-4.4%w / v, 4.2%w / v-4.5%w / v, 4.3%w / v-4.6%w / v, 4.4%w / v-4.7%w / v, 4.5%w / v-4.8%w / v, 4.6%w / v-4.9%w / v, or 4.7%w / v-5%w / v; or about 0.05%w / v-0.2%w / v, 0.1%w / v-0.3%w / v, 0.2%w / v-0.4%w / v, 0.3%w / v-0.5%w / v, 0.4%w / v-0.6%w / v, 0.5%w / v-0.7%w / v, 0.6%w / v-0.8%w / v, 0.7%w / v-0.9%w / v, 0.8%w / v-1%w / v, 0.9%w / v-1.1%w / v, 1%w / v-1.2%w / v, 1.1%w / v-1.3%w / v, 1.2%w / v-1.4%w / v, 1.3%w / v-1.5%w / v, 1.4%w / v-1.6%w / v, 1.5%w / v-1.7%w / v, 1.6%w / v-1.8%w / v, 1.7%w / v-1.9%w / v, 1.8%w / v-2%w / v, 1.9%w / v-2.1%w / v, 2%w / v-2.2%w / v, 2.1%w / v-2.3%w / v, 2.2%w / v-2.4%w / v, 2.3%w / v-2.5%w / v, 2.4%w / v-2.6%w / v, 2.5%w / v-2.7%w / v, 2.6%w / v-2.8%w / v, 2.7%w / v-2.9%w / v, 2.8%w / v-3%w / v, 2.9%w / v-3.1%w / v, 3%w / v-3.2%w / v, 3.1%w / v-3.3%w / v, 3.2%w / v-3.4%w / v, 3.3%w / v-3.5%w / v, 3.4%w / v-3.6%w / v, 3.5%w / v-3.7%w / v, 3.6%w / v-3.8%w / v, 3.7%w / v-3.9%w / v, 3.8%w / v-4%w / v, 3.9%w / v-4.1%w / v, 4%w / v-4.2%w / v, 4.1%w / v-4.3%w / v, 4.2%w / v-4.4%w / v, 4.3%w / v-4.5%w / v, 4.4%w / v-4.6%w / v, 4.5%w / v-4.7%w / v, 4.6%w / v-4.8%w / v, 4.7%w / v-4.9%w / v, 4.8%w / v-5%w / v, or 4.9%w / v-5%w / v; or about 0.05%w / v, 0.06%w / v, 0.07%w / v, 0.08%w / v, 0.09%w / v, 0.1%w / v, 0.2%w / v, 0.3%w / v, 0.4%w / v, 0.5%w / v, 0.6%w / v, 0.7%w / v, 0.8%w / v, 0.9%w / v, 1%w / v, 1.1%w / v, 1.2%w / v, 1.3%w / v, 1.4%w / v, 1.5%w / v, 1.6%w / v, 1.7%w / v, 1.8%w / v, 1.9%w / v, 2%w / v, 2.1%w / v, 2.2%w / v, 2.3%w / v, 2.4%w / v, 2.5%w / v, 2.6%w / v, 2.7%w / v, 2.8%w / v, 2.9%w / v, 3%w / v, 3.1%w / v, 3.2%w / v, 3.3%w / v, 3.4%w / v, 3.5%w / v, 3.6%w / v, 3.7%w / v, 3.8%w / v, 3.9%w / v, 4%w / v, 4.1%w / v, 4.2%w / v, 4.3%w / v, 4.4%w / v, 4.5%w / v, 4.6%w / v, 4.7%w / v, 4.8%w / v, 4.9%w / v, 5%w / v. The formulation composition of the present disclosure may exhibit a pH, e.g., of from about 6.5 to about 8.5, e.g., about 6.5 to about 8.0 or about 7.0 to about 8.5 (e.g., about 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 or 8.5) .

[0176] Hereabove, the Poloxamer may be P188, and / or the Polysorbate may be PS80.

[0177] Transgene expression

[0178] Viral vectors for use with the compositions and methods of the present disclosure may include a transgene, such as a protein-encoding transgene designed for integration into the chromosomal DNA of a target cell. Exemplary transgenes include those that encode a chimeric antigen receptor (CAR) . The CAR may include several domains, such as an extracellular domain, a transmembrane domain, and an intracellular domain, which contains one or more signaling domains. In these cases, the signaling domains may contain one or more primary signaling domains (such as a CD3-zeta stimulatory domain) and / or one or more costimulatory signaling domains (such as CD27, CD28, 4-1 BB (CD137) , OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) , CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3, or a ligand that specifically binds with CD83.

[0179] In certain cases, the transgene can include an extracellular domain (containing antigen binding domain, such as a scFv or sdAb) that binds a particular target antigen (such as a protein or carbohydrate) . Exemplary antigens include CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, C-type lectin-like molecule-1, CD33, epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII) , ganglioside G2 (GD2) , ganglioside GD3, TNF receptor family member B cell maturation (BCMA) , Tn antigen ( (Tn Ag) or (GalNAca-Ser / Thr) ) , prostate-specific membrane antigen (PSMA) , Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ROR1) , Fms-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) , Tumor-associated glycoprotein 72 (TAG 72) , CD38, CD44v6, Carcinoembryonic antigen (CEA) , Epithelial cell adhesion molecule (EPCAM) , B7H3 (CD276) , KIT (CD117) , lnterleukin-13 receptor subunit alpha-2, mesothelin, Interleukin IL-1 receptor alpha (IL-1Ra) , prostate stem cell antigen (PSCA) , Protease Serine 21, vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) , Lewis (Y) antigen, CD24, Platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFR-beta) , Stage-specific embryonic antigen-4 (SSEA-4) , CD20, Folate receptor alpha, Receptor tyrosine-protein kinase ERBB2 (Her2 / neu) , Mucin 1 (MUC1) , epidermal growth factor receptor (EGFR) , neural cell adhesion molecule (NCAM) , Prostase, prostatic acid phosphatase (PAP) , elongation factor 2 mutated (ELF2M) , Ephrin B2, fibroblast activation protein alpha (FAP) , insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1 receptor) , carbonic anhydrase IX (CAIX) , Proteasome (Prosome, Macropain) Subunit, Beta Type 9 (LMP2) , glycoprotein 100 (gp100) , oncogene fusion protein consisting of breakpoint cluster region (BCR) and Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 (Abl) (bcr-abl) , tyrosinase, ephrin type-A receptor 2 (EphA2) , Fucosyl GM1, sialyl Lewis adhesion molecule (sLe) , ganglioside GM3, transglutaminase 5 (TGM5) , high molecular weight-melanoma-associated antigen (HMW-MAA) , o-acetyl-GD2 ganglioside (OAcGD2) , Folate receptor beta, tumor endothelial marker 1 (TEM1 / CD248) , tumor endothelial marker 7-related (TEM7R) , claudin 6 (CLDN6) , thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) , G protein-coupled receptor class C group 5, member D (GPRC5D) , chromosome X open reading frame 61 (CXORF61) , CD97, CD179a, anaplastic lymphoma kinase (ALK) , Polysialic acid, placenta-specific 1 (PLAC1) , hexasaccharide portion of globoH glycoceramide (GloboH) , mammary gland differentiation antigen (NY-BR-1) , uroplakin 2 (UPK2) , Hepatitis A virus cellular receptor 1 (HAVCR1) , adrenoceptor beta 3 (ADRB3) , pannexin 3 (PANX3) , G protein-coupled receptor 20 (GPR20) , lymphocyte antigen 6 complex locus K (LY6K) , Olfactory receptor 51E2 (OR51 E2) , TCR Gamma Chain Alternate Reading Frame Protein (TARP) , Wilms tumor protein (WT1) , Cancer-testis antigen 1B (NY-ESO-1 / CTAG1B) , Cancer / testis antigen 2 (LAGE-1 a) , Melanoma-associated antigen 1 (MAGE-A1) , ETS translocation-variant gene 6 (ETV6) , sperm protein 17 (SPA17) , X Antigen Family Member 1A (XAGE1A) , Tie 2, melanoma cancer testis antigen-1 (MAD-CT-1) , melanoma cancer testis antigen-2 (MAD-CT-2) , Fos-related antigen 1, tumor protein p53 (p53) , p53 mutant, prostein, prostate carcinoma tumor antigen-1, melanoma antigen recognized by T cells 1 (MART-1) , Rat sarcoma (Ras) mutant, human Telomerase reverse transcriptase (hTERT) , sarcoma translocation breakpoints, melanoma inhibitor of apoptosis (ML-IAP) , ERG (transmembrane protease serine 2 (TMPRSS2) ETS fusion gene, N-Acetyl glucosaminyl-transferase V (NA17) , paired box protein Pax-3 (PAX3) , Androgen receptor, Cyclin B1, v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene neuroblastoma derived homolog (MYCN) , Ras Homolog Family Member C (RhoC) , Tyrosinase-related protein 2 (TRP-2) , Cytochrome P450 1 B1 (CYP1B1) , CCCTC-Binding Factor (Zinc Finger Protein) -Like, Squamous Cell Carcinoma Antigen Recognized By T Cells 3 (SART3) , Paired box protein Pax-5 (PAX5) , proacrosin binding protein sp32 (OY-TES1) , lymphocyte-specific protein tyrosine kinase (LCK) , A kinase anchor protein 4 (AKAP-4) , synovial sarcoma, X breakpoint 2 (SSX2) , Receptor for Advanced Glycation Endproducts (RAGE-1) , renal ubiquitous 1 (RU1) , renal ubiquitous 2 (RU2) , legumain, human papilloma virus E6 (HPV E6) , human papilloma virus E7 (HPV E7) , intestinal carboxyl esterase, heat shock protein 70-2 mutated (mut hsp70-2) , CD79a, CD79b, CD72, Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 (LAIR1) , Fc fragment of IgA receptor (FCAR or CD89) , Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A member 2 (LILRA2) , CD300 molecule-like family member f (CD300LF) , C-type lectin domain family 12 member A (CLEC12A) , bone marrow stromal cell antigen 2 (BST2) , EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 2 (EMR2) , lymphocyte antigen 75 (LY75) , Glypican-3 (GPC3) , Fc receptor-like 5 (FCRL5) , and immunoglobulin lambda-like polypeptide 1 (IGLL1) .

[0180] EXAMPLES

[0181] The present disclosure is now be described with reference to the following examples which are intended to illustrate the present disclosure (rather than to limit the present disclosure) .

[0182] Unless otherwise specified, the molecular biology experimental methods and immunoassays used in the present disclosure were carried out substantially by referring to the methods described in J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, and F. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley &Sons, Inc., 1995; restriction enzymes were used under conditions recommended by the product manufacturer. If the specific conditions were not indicated in the examples, the conventional conditions or the conditions recommended by the manufacturer were used. If the reagents or instruments used were not specified by the manufacturer, they were all conventional products that were commercially available. Those skilled in the art will understand that the examples describe the present disclosure by way of examples, and are not intended to limit the scope of protection claimed by the present disclosure. All publications and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety.

[0183] Below are the compositions of various solutions:

[0184] Table 1

[0185] Table 2

[0186] Table 3

[0187] Table 4

[0188] Key reagents / consumables

[0189] EXAMPLE 1: Screening of basic buffer components

[0190] First, the basic buffer components based on PIPES, HEPES, TRIS, and PB combined with different pH values were screened. The specific formulations for Buffers 1-13 are shown in Table 1.

[0191] The experiment protocol is as follow:

[0192] 1) Adherent HEK 293T cells were cultured and transfected 22 ± 4 h after cell inoculation. Transient transfection was performed using triple retrovirus-based plasmids (Gag-Pol, EnV, and Transfer plasmids) and transfection reagent PEIpro-HQ. Medium was changed to virus-producing medium 6 h after transfection. The retroviral vectors were harvested 39-42 h after the change of medium.

[0193] 2) The harvested supernatant was subjected to tangential flow ultrafiltration using a hollow fiber filter (Repligen) after clarification filtration and Benzonase nuclease digestion.

[0194] 3) The retroviral vectors were transferred from medium to diafiltration Buffers 1-13 respectively, and then concentrated to 1 / 20 -1 / 40 of the initial volume, i.e., concentrated by 20-40 folds.

[0195] 4) After diafiltration and concentration, a sterile filtration (Cobetter) was performed. The retroviral vectors were taken to detect FACS infection titer in fresh state.

[0196] 5) The retroviral vectors were stored under ultra-low temperature (≤ -65℃) condition. After more than 24 hours, they were taken out and thawed at room temperature, and then detected for FACS infection titer.

[0197] 6) Freeze-thaw stability study: The freeze-thaw stability of retroviral vectors in diafiltration Buffers 1-13 was calculated through "thawed infectious titer  / fresh infectious titer *100%= Activity recovery" . The closer the value is to 100%, the better the stability, and vice versa.

[0198] The results of the above experiment are shown in Figure 1. It can be seen from Figure 1 that the protection effect of Buffer 4 (HEPES component) and Buffer 1 (PIPES component) were comparable, but there are no commercially grade reagents for PIPES. According to the Pharmacopoeia and relevant industry regulations, for viral vector formulation components low-risk grade level should be prioritized. Therefore, PIPES was excluded, and Buffer 4 (PIPES component) and Buffer 7 (TRIS component) were chosen for the next round of screening.

[0199] EXAMPLE 2: Screening of salt concentration

[0200] According to the screening results for the basic buffer, it was found that the stability of retroviral vectors was relatively better when preserved in Buffer 1, Buffer 4 or Buffer 7. Since Buffer 1 is PIPES buffer system and there are no commercially available grade reagents for clinical use, Buffer 4 and Buffer 7 were prioritized for the subsequent salt concentration study. The specific formulations for Buffers 14-21 are shown in Table 2.

[0201] The experiment protocol is as follow:

[0202] 1) Adherent HEK 293T cells were cultured and transfected 22 ± 4 h after cell inoculation. Transient transfection was performed using triple retrovirus-based plasmids (Gag-Pol, EnV, and Transfer plasmid) and transfection reagent PEIpro-HQ. Medium was changed to virus-producing medium 6 h after transfection. The retroviral vectors were harvested 39-42 h after the change of medium.

[0203] 2) The harvested supernatant was subjected to tangential flow ultrafiltration using a hollow fiber filter (Repligen) after clarification filtration and Benzonase nuclease digestion.

[0204] 3) The retroviral vectors were transferred from medium to diafiltration Buffers 14-21 respectively, and then concentrated to 1 / 20 -1 / 40 of the initial volume, i.e., concentrated by 20-40 folds.

[0205] 4) After diafiltration and concentration, a sterile filtration (Cobetter) was performed. The retroviral vectors were taken to detect FACS infection titer in fresh state.

[0206] 5) The retroviral vectors were stored under ultra-low temperature (≤ -65℃) condition. After more than 24 hours, they were taken out and thawed at room temperature, and then detected for FACS infection titer.

[0207] 6) Freeze-thaw stability study: The freeze-thaw stability of retroviral vectors in diafiltration Buffers 14-21 was calculated through "thawed infectious titer  / fresh infectious titer *100%= Activity recovery" . The closer the value is to 100%, the better the stability, and vice versa.

[0208] The results of the above experiment are shown in Figure 2. It can be seen from Figure 2 Buffer 14 (50 mM NaCl) was selected to proceed to the next round of screening.

[0209] EXAMPLE 3: Study of MgCl2

[0210] Based on the screening results for the buffer and salt concentration, Buffer 14 with best performance was selected to continue to the subsequent studies.

[0211] Based on the study of NaCl concentration, a study for whether containing MgCl2 or not was carried out to compare the effect of stability. The specific formulations for Buffer 14 and Buffer 22 are shown in Table 2.

[0212] The experiment protocol is as follow:

[0213] 1) Adherent HEK 293T cells were cultured and transfected 22 ± 4 h after cell inoculation. Transient transfection was performed using triple retrovirus-based plasmids (Gag-Pol, EnV, and Transfer plasmid) and transfection reagent PEIpro-HQ. Medium was changed to virus-producing medium 6 h after transfection. The retroviral vectors were harvested 39-42 h after the change of medium.

[0214] 2) The harvested supernatant was subjected to tangential flow ultrafiltration using a hollow fiber filter (Repligen) after clarification filtration and Benzonase nuclease digestion.

[0215] 3) The retroviral vectors were transferred from medium to diafiltration Buffer 14 and Buffer 22 respectively, and then concentrated to 1 / 20 -1 / 40 of the initial volume, i.e., concentrated by 20-40 folds.

[0216] 4) After diafiltration and concentration, a sterile filtration (Cobetter) was performed. The retroviral vectors were taken to detect FACS infection titer in fresh state.

[0217] 5) The retroviral vectors were stored under ultra-low temperature (≤ -65℃) condition. After more than 24 hours, they were taken out and thawed at room temperature, and then detected for FACS infection titer.

[0218] 6) Freeze-thaw stability study: The freeze-thaw stability of retroviral vectors in diafiltration Buffer 14 and diafiltration Buffer 22 was calculated through "thawed infectious titer  / fresh infectious titer *100%= Activity recovery" . The closer the value is to 100%, the better the stability, and vice versa.

[0219] 7) Long-term stability study: The retroviral vectors stored at 1M (month) , 2M, 3M, and 6M respectively in ultra-low temperature were taken, detected for the infection titers after being thawed, and the long-term stability curve was drawn.

[0220] The results of the above experiment are shown in Figure 3. It can be seen from Figure 3 that Buffer 22 containing MgCl2 had a significant advantage in the long-term stability of retroviral vectors. Buffer 14 without MgCl2 showed a gradual decrease in the bioactivity with prolongation of storage time. Therefore, MgCl2 component was added to buffer in subsequent studies.

[0221] EXAMPLE 4: Screening of carbohydrate

[0222] Based on the screening results for buffer, salt and MgCl2, Buffer 22 with best performance was selected to continue to the subsequent studies. The specific formulations for Buffers 23-27 are shown in Table 3.

[0223] The experiment protocol is as follow:

[0224] 1) Adherent HEK 293T cells were cultured and transfected 22 ± 4 h after cell inoculation. Transient transfection was performed using triple retrovirus-based plasmids (Gag-Pol, EnV, and Transfer plasmid) and transfection reagent PEIpro-HQ. Medium was changed to virus-producing medium 6 h after transfection. The retroviral vectors were harvested 39-42 h after the change of medium.

[0225] 2) The harvested supernatant was subjected to tangential flow ultrafiltration using a hollow fiber filter (Repligen) after clarification filtration and Benzonase nuclease digestion.

[0226] 3) The retroviral vectors were transferred from medium to diafiltration Buffers 23-27 respectively, and then concentrated to 1 / 20 -1 / 40 of the initial volume, i.e., concentrated by 20-40 folds.

[0227] 4) After diafiltration and concentration, a sterile filtration (Cobetter) was performed. The retroviral vectors were taken to detect FACS infection titer in fresh state.

[0228] 5) The retroviral vectors were stored under ultra-low temperature (≤ -65℃) condition. After more than 24 hours, they were taken out and thawed at room temperature, and then detected for FACS infection titer.

[0229] 6) Freeze-thaw stability study: The freeze-thaw stability of retroviral vectors in diafiltration Buffers 23-27 was calculated through "thawed infectious titer  / fresh infectious titer *100%= Activity recovery" . The closer the value is to 100%, the better the stability, and vice versa.

[0230] The results of the above experiment are shown in Figure 4. It can be seen from Figure 4 Buffer 24 (20 mM HEPES+50 mM NaCl+20 mM MgCl2+1%Trehalose) was selected to proceed in subsequent studies.

[0231] EXAMPLE 5: Screening of cryoprotectant

[0232] Based on above results, Buffer 24 was selected to continue with the cryoprotectant study. On the basic Buffer 24, various cryoprotectants such as DMSO, Glycerol, P188 or PS80 were added at different concentrations to investigate the effect on freeze-thaw stability of retroviral vectors. The specific formulations for Formulations 1-16 are shown in Table 4.

[0233] The experiment protocol is as follow:

[0234] 1) Adherent HEK 293T cells were cultured and transfected 22 ± 4 h after cell inoculation. Transient transfection was performed using triple retrovirus-based plasmids (Gag-Pol, EnV, and Transfer plasmid) and transfection reagent PEIpro-HQ. Medium was changed to virus-producing medium 6 h after transfection. The retroviral vectors were harvested 39-42 h after the change of medium.

[0235] 2) The harvested supernatant was subjected to tangential flow ultrafiltration using a hollow fiber filter (Repligen) after clarification filtration and Benzonase nuclease digestion.

[0236] 3) The retroviral vectors were transferred from medium to diafiltration Buffer 24, and then concentrated to 1 / 20 -1 / 40 of the initial volume, i.e., concentrated by 20-40 folds.

[0237] 4) After diafiltration and concentration, a sterile filtration (Cobetter) was performed.

[0238] 5) The filtered viral vectors and the protectant were mixed together in a certain ratio to form the final concentration of Formulation, and then detected for FACS infection titer in fresh state.

[0239] 6) The retroviral vectors were stored under ultra-low temperature (≤ -65℃) condition. After more than 24 hours, they were taken out and thawed at room temperature, and then detected for FACS infection titer.

[0240] 7) Freeze-thaw stability study: The freeze-thaw stability of retroviral vectors in Formulations 1-16 was calculated through "thawed infectious titer  / fresh infectious titer *100%= Activity recovery" . The closer the value is to 100%, the better the stability, and vice versa.

[0241] The results of the above experiment are shown in Figure 5. It can be seen from Figure 5 0.5%P188 was chosen as cryoprotectant and the final formulation was 20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 1%Trehalose, pH 7.0, 0.5%P188.

[0242] EXAMPLE 6: VLP cryopreservation

[0243] The final screened Formulation (Formulation 12) was applied to the cryopreservation of VLP to examine the freeze-thaw stability. At the same time, the effect of 0.05%PS80 as cryoprotectant (other components were kept the same, see Formulation 16) on the freeze-thaw stability of VLP was investigated.

[0244] The experiment protocol is as follow:

[0245] 1) Adherent HEK 293T cells were cultured and transfected 22 ± 4 h after cell inoculation. Transient transfection was performed using four retrovirus-based plasmids (Gag-cas9, Gag-pol, EnV, sgRNA) and transfection reagent PEIpro-HQ. Medium was changed to virus-producing medium 6 h after transfection. VLP were harvested 39-42 h after the change of medium.

[0246] 2) The harvested supernatant was subjected to tangential flow ultrafiltration using a hollow fiber filter (Repligen) after clarification filtration and Benzonase nuclease digestion.

[0247] 3) The VLP were transferred from medium to diafiltration Buffer 24, and then concentrated to 1 / 20 -1 / 40 of the initial volume, i.e., concentrated by 20-40 folds.

[0248] 4) After diafiltration and concentration, a sterile filtration (Cobetter) was performed.

[0249] 5) The filtered VLP and 5%P188 solution were taken, mixed up in a ratio of "VLP: 5%P188 = 9: 1" to form the final concentration according to the Formulation 12. CD 52 positivity on the Primary T cells after VLP treatment in the fresh state was detected and the efficiency of Knock Out (KO) was calculated.

[0250] 6) The filtered VLP and 0.5%PS80 solution were taken, mixed up in a ratio of "VLP: 0.5%PS80 = 9: 1" to form the final concentration according to the Formulation 16. CD 52 positivity on the Primary T cells after VLP treatment in the fresh state was detected and the efficiency of Knock Out (KO) was calculated.

[0251] 7) The VLP from steps 5 and 6 were stored under ultra-low temperature (≤ -65℃) condition. After more than 24 hours, they were taken out and thawed at room temperature, and then detected for the efficiency of KO.

[0252] 8) Freeze-thaw stability study: The freeze-thaw stability of VLP in Formulation 12 and Formulation 16 was calculated through "thawed efficiency of KO / fresh efficiency of KO*100%= Activity recovery" . The closer the value is to 100%, the better the stability, and vice versa.

[0253] The results of the above experiment are shown in Figure 6. It can be seen from Figure 6 the biological activity of VLP in Formulation 12 could be maintained at 70%after freeze-thaw, and the same protection level could be achieved for retroviral vectors in Formulation 12. In contrast, PS80 (Formulation 16) did not provide protection.

[0254] Conclusion: The formulation can significantly improve the biological activity of RVV and VLP during cryopreservation, which could be maintained at more than 70%after freeze-thaw.

Claims

1.A composition comprising a buffer, an ionic salt, a carbohydrate, and optionally a cryoprotectant, whereinthe buffer is one or more selected from the group consisting of PIPES, HEPES, Tris and PB,the ionic salt is one or two selected from the group consisting of sodium chloride and magnesium chloride,the carbohydrate is one or more selected from the group consisting of trehalose, sucrose and mannitol,the cryoprotectant is one or more selected from the group consisting of DMSO, Glycerol, Poloxamer and Polysorbate.2.A composition comprising viral vector or virus-like particle (VLP) , a buffer, an ionic salt, a carbohydrate, and optionally a cryoprotectant, whereinthe buffer is one or more selected from the group consisting of PIPES, HEPES, Tris and PB,the ionic salt is one or two selected from the group consisting of sodium chloride and magnesium chloride,the carbohydrate is one or more selected from the group consisting of trehalose, sucrose and mannitol,the cryoprotectant is one or more selected from the group consisting of DMSO, Glycerol, Poloxamer and Polysorbate.3.The composition of claim 1 or 2, wherein:(1) the buffer is HEPES, and / or(2) the ionic salt is one or two selected from the group consisting of sodium chloride and magnesium chloride, and / or(3) the carbohydrate is trehalose, and / or(4) the cryoprotectant is one or two selected from the group consisting of DMSO and Poloxamer.4.The composition of any one of claims 1-3, wherein:(1) the concentration of HEPES is about 10-50 mM, or about 10-20, 15-25, 20-30, 25-35, 30-40, 35-45, or 40-50mM; and / or(2) the concentration of sodium chloride is about 30-150 mM, or about 30-40, 35-50, 40-55, 45-60, 50-65, 55-70, 60-75, 65-80, 70-85, 75-90, 80-95, 85-100, 90-105, 95-110, 100-115, 105-120, 110-125, 115-130, 120-135, 125-140, 130-145, or 140-150mM; and / or(3) the concentration of magnesium chloride is about 10-30 mM, or about 10-20, 15-25, or 20-30mM; and / or(4) the concentration of trehalose is about 0.5%w / v-10%w / v, or about 0.5%w / v-1.5%w / v, 1%w / v-3%w / v, 2.5%w / v-4%w / v, 3.5%w / v-5%w / v, 4.5%w / v-6%w / v, 5.5%w / v-7%w / v, 6.5%w / v-8%w / v, 7.5%w / v-9%w / v, or 8.5%w / v-10%w / v; and / or(5) the concentration of Poloxamer is about 0.05%w / v-5%w / v, or about 0.05%w / v-0.2%w / v, 0.1%w / v-0.3%w / v, 0.2%w / v-0.4%w / v, 0.3%w / v-0.5%w / v, 0.4%w / v-0.6%w / v, 0.5%w / v-0.7%w / v, 0.6%w / v-0.8%w / v, 0.7%w / v-0.9%w / v, 0.8%w / v-1%w / v, 0.9%w / v-2%w / v, 1%w / v-3%w / v, 2%w / v-4%w / v, or 3%w / v-5%w / v; and / or(6) the concentration of DMSO is about 5%v / v-20%v / v, or about 5%v / v-15%v / v, or 10%v / v-20%v / v.5.The composition of any one of claims 1-4, wherein:(1) the concentration of HEPES is about 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, or 50 mM; and / or(2) the concentration of sodium chloride is about 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, or 150 mM; and / or(3) the concentration of magnesium chloride is about 10, 15, 20, 25, or 30 mM; and / or(4) the concentration of trehalose is about 0.5%w / v, 1%w / v, 1.5%w / v, 2%w / v, 2.5%w / v, 3%w / v, 3.5%w / v, 4%w / v, 4.5%w / v, 5%w / v, 5.5%w / v, 6%w / v, 6.5%w / v, 7%w / v, 7.5%w / v, 8%w / v, 8.5%w / v, 9%w / v, 9.5%w / v, or 10%w / v; and / or(5) the concentration of Poloxamer is about 0.05%w / v, 0.1%w / v, 0.2%w / v, 0.3%w / v, 0.4%w / v, 0.5%w / v, 0.6%w / v, 0.7%w / v, 0.8%w / v, 0.9%w / v, 1%w / v, 2%w / v, 3%w / v, 4%w / v, or 5%w / v; and / or(6) the concentration of DMSO is about 5%v / v, 10%v / v, 15%v / v, or 20%v / v.6.The composition of any one of claims 1-5, whereinthe Poloxamer is one or more selected from the group consisting of P101, P105, P108, P122, P123, P124, P181, P182, P183, P184, P185, P188, P212, P215, P217, P231, P234, P235, P237, P238, P282, P284, P288, P331, P333, P334, P335, P338, P401, P402, P403, P407; and / orthe Polysorbate is one or more selected from the group consisting of PS20, PS40, PS60, PS80.7.The composition of claim 6, wherein the Poloxamer is P188, and / or the Polysorbate is PS80.8.The composition of any one of claims 1-7, wherein the composition comprises HEPES, sodium chloride, magnesium chloride and trehalose, wherein(1) HEPES is about 20 mM,(2) sodium chloride is about 50 mM,(3) magnesium chloride is about 20 mM,(4) the concentration of trehalose is about 1%w / v.9.The composition of any one of claims 1-8, wherein the composition comprises HEPES, sodium chloride, magnesium chloride, trehalose and P188 or DMSO, wherein(1) HEPES is about 20 mM,(2) sodium chloride is about 50 mM,(3) magnesium chloride is about 20 mM,(4) the concentration of trehalose is about 1%w / v,(5) the concentration of P188 is about 0.5%w / v, or the concentration of DMSO is about 15%v / v or 20%v / v.10.The composition of any one of claims 1-9, wherein the composition comprises HEPES, sodium chloride, magnesium chloride, trehalose and P188, wherein(1) HEPES is about 20 mM,(2) sodium chloride is about 50 mM,(3) magnesium chloride is about 20 mM,(4) the concentration of trehalose is about 1%w / v,(5) the concentration of P188 is about 0.5%w / v.11.The composition of any one of claims 1-10, wherein the pH of the composition is about 6.5-8.5.12.The composition of any one of claims 1-11, wherein the pH of the composition is about 6.5-8.0 or 7.0-8.5.13.The composition of any one of claims 1-12, wherein the pH of the composition is about 7.0.14.The composition of any one of claims 1-13, wherein the composition is for viral vector or virus-like particle (VLP) cryopreservation.15.The composition of claim 14, wherein the viral vector is retroviral vector (RVV) , adenoviral vector, or adeno-associated viral vector.16.The composition of claim 15, wherein the RVV is lentiviral vector or γ-retroviral vector.17.The composition of any one of claims 14-16, wherein the viral vector comprises a transgene.18.The composition of claim 17, wherein the transgene encodes a protein.19.The composition of claim 18, wherein the protein comprises a chimeric antigen receptor (CAR) .20.The composition of claim 14, wherein the VLP is derived from retroviral vector (RVV) , adenoviral vector, or adeno-associated viral vector.21.The composition of claim 20, wherein the RVV is lentiviral vector or γ-retroviral vector.22.A method for cryopreserving a viral vector or a virus-like particle (VLP) by using the composition according to any one of claims 1 to 21.23.A method for delivering a viral vector or VLP, into a cell of a subject, the method comprising administering the composition of any one of claims 1-21 to the subject.24.Use of the composition of any one of claims 1-21 in the preparation of a kit for delivering a viral vector or VLP into a cell of a subject.