Antibodies targeting CD3, CD28, and PD-l1 and uses thereof

Abstract

Provided are antibodies, such as multispecific antibodies, and antibody fragments targeting CD3, CD28, PD-L1, and tumor-associated antigens and applications of the antibodies for cancer treatment. The antibodies and antibody fragments are effective in treating cancers and / or other diseases, disorders, and conditions where pathogenesis can be treated with T cell redirection modalities.

Description

Antibodies Targeting CD3, CD28, and PD-L1 and Uses ThereofCross Reference to Related Application

[0001] This application claims the priority to and benefits of International Application No. PCT / CN2024 / 083530, filed on March 25, 2024, the contents of which are hereby incorporated herein by reference in their entirety. Field of Disclosure

[0002] The present disclosure relates to antibodies that target CD3, CD28, PD-L1, and tumor-associated antigens and applications of the antibodies for cancer treatment. Sequence Listing

[0003] This application contains a Sequence Listing as an XML file entitled “Sequence Listing. xml” having a size of 174, 606 bytes and created on March 19, 2024. The information contained in the Sequence Listing is incorporated by reference herein. Background of Disclosure

[0004] CD3+ bispecific T-cell redirection molecules engage T cells and tumor cells simultaneously to form an artificial immunologic synapse, which then results in the lysis of the target tumor cells. Since the approval of the first bispecific CD3+ T cell engager (BiTE) -Blinatumomab (anti-CD3 × anti-CD19) to treat patients with Philadelphia chromosome-negative B-cell acute lymphoblastic leukemia (ALL) by the United States Food and Drug Administration (FDA) in 2014 (D. Przepiorka et al., 2015) , there are tremendous efforts to develop next-generation CD3+ bispecific antibodies for both hematological and solid tumors with more than a hundred clinical trials (S. Wang et al., 2021) . In order to improve the clinical benefit, there are still obstacles to be overcome (A. Singh et al., 2021) . One of the major mechanisms for resistance to Blinatumomab is the upregulation of immune checkpoints after Blinatumomab therapy (J. Feucht et al., 2016; J. Sam et al., 2020) . The addition of checkpoint inhibition antibodies to CD3+ bispecific T cell redirection antibodies could reverse the resistance and improve the BiTE-mediated cytotoxicity (J. Feucht et al., 2016; J. Sam et al., 2020) . CD3 engagement and PD-L1 blockade was also integrated into one molecule to increase efficacy (M. Passariello et al., 2022) .

[0005] Many of the current generation of CD3+ bispecific antibodies lack the presence of a costimulatory signaling, which is called “signal 2” . The ligation of costimulatory molecule in T cells with its ligands is required to form an immune synapse for durable T cell activation, proliferation, and cytokine release. In the absence of a second signal, T cell stimulation through CD3 alone typically leads to activation-induced cell death (N. Borthwick et al., 2000) . The value of co-stimulation has also been validated by the successful development of 2nd-generation CAR-Ts, which include at least one costimulatory moiety (A. J. Harrison et al., 2021) . Therefore, the unsustained T cell activity may be one of the reasons that treated patients with large tumor burden had lower complete regression (CR) rate when compared to treated patients with small tumors (H. Liu et al., 2023) . There are descriptions of the combination of “costimulatory bispecifics” that cross-link a tumor-associated antigen (TAA) (P. G. Groothuis et al. ) to CD28 on T cells (TAA x CD28 bispecifics) . The TAA x CD3 bispecifics had an improved antitumor activity with the addition of a TAA x CD28 when compared to TAA x CD3 alone (D. Skokos et al., 2020) . Summary of Disclosure

[0006] In one aspect, the present disclosure provides novel anti-CD3, anti-CD28, and anti-PD-L1 antibodies and multispecific (e.g., bispecific, trispecific, or tetra-specific) antibodies comprising one or more of these antibodies. In some embodiments, domains with a range of affinities are integrated into a single molecule with multiple specificities, including architectures such as (1) anti-CD3 x anti-TAA, (2) anti-CD3 x anti-CD28 x anti-TAA, (3) anti-CD3 x anti-PD-L1 x anti-TAA, and (4) anti-CD3 x anti-CD28 x anti-PD-L1 x anti-TAA. These molecules are designed to vary binding affinity and molecular format to enable improved T-cell redirection for tumor cytotoxicity with decreased cytokine release for patients with unmet medical needs, such as in hematological and solid tumors.

[0007] In some embodiments, the disclosure provides an anti-CD3 or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence comprising: SEQ ID NOs: 1 and 16; SEQ ID NOs: 2 and 16; SEQ ID NOs: 3 and 16; SEQ ID NOs: 4 and 16; SEQ ID NOs: 5 and 16; SEQ ID NOs: 6 and 16; SEQ ID NOs: 7 and 16; SEQ ID NOs: 8 and 16; SEQ ID NOs: 9 and 16; SEQ ID NOs: 10 and 16; SEQ ID NOs: 11 and 16; SEQ ID NOs: 2 and 17; SEQ ID NOs: 3 and 17; SEQ ID NOs: 4 and 17; SEQ ID NOs: 5 and 17; SEQ ID NOs: 6 and 17; SEQ ID NOs: 7 and 17; SEQ ID NOs: 8 and 17; SEQ ID NOs: 9 and 17; SEQ ID NOs: 10 and 17; SEQ ID NOs: 11 and 17; SEQ ID NOs: 9 and 18; SEQ ID NOs: 9 and 19; SEQ ID NOs: 12 and 16; SEQ ID NOs: 13 and 16; SEQ ID NOs: 14 and 16; SEQ ID NOs: 15 and 16; SEQ ID NOs: 1 and 20; SEQ ID NOs: 2 and 20; SEQ ID NOs: 3 and 20; SEQ ID NOs: 4 and 20; SEQ ID NOs: 5 and 20; SEQ ID NOs: 6 and 20; SEQ ID NOs: 7 and 20; SEQ ID NOs: 8 and 20; SEQ ID NOs: 9 and 20; SEQ ID NOs: 10 and 20; SEQ ID NOs: 11 and 20; SEQ ID NOs: 12 and 20; SEQ ID NOs: 13 and 20; SEQ ID NOs: 14 and 20; SEQ ID NOs: 15 and 20; SEQ ID NOs: 60 and 61; respectively.

[0008] In some embodiments, the heavy chain variable domain of the binding moiety that has binding specificity for CD3 are present in a human VH framework; and the light chain variable domain of the first binding moiety are present in a human V lambda framework. In some embodiments, the disclosure provides an anti-CD3 or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-15 or an antigen-binding fragment thereof, and a light chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 16-20 or an antigen-binding fragment thereof.

[0009] In some embodiments, the disclosure provides an anti-CD28 or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence comprising: SEQ ID NOs: 21 and 25; SEQ ID NOs: 22 and 25; SEQ ID NOs: 23 and 25; SEQ ID NOs: 24 and 25; SEQ ID NOs: 21 and 26; SEQ ID NOs: 22 and 26; SEQ ID NOs: 23 and 26; SEQ ID NOs: 24 and 26; SEQ ID NOs: 21 and 27; SEQ ID NOs: 22 and 27; SEQ ID NOs: 23 and 27; SEQ ID NOs: 24 and 27; SEQ ID NOs: 62 and 63; respectively.

[0010] In some embodiments, the heavy chain variable domain of the binding moiety that has binding specificity for CD28 are present in a human VH framework; and the light chain variable domain of the first binding moiety are present in a human V kappa framework. In some embodiments, the disclosure provides an anti-CD28 or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 21-24 or an antigen-binding fragment thereof, and a light chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 25-27 or an antigen-binding fragment thereof.

[0011] In some embodiments, the disclosure provides an anti-PD-L1 antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence comprising: SEQ ID NOs: 28 and 29 and SEQ ID NOs: 28 and 30, respectively.

[0012] In some embodiments, the heavy chain variable domain of the binding moiety that has binding specificity for PD-L1 are present in a human VH framework; and the light chain variable domain of the first binding moiety are present in a human V kappa framework. In some embodiments, the disclosure provides an anti-PD-L1 antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity to SEQ ID NO: 28 or an antigen-binding fragment thereof, and a light chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 29 and 30 or an antigen-binding fragment thereof.

[0013] In some embodiments, the disclosure provides an anti-PD-L1 antibody, comprising at least one variable-heavy-chain-only single domain or an antigen-binding fragment thereof, comprising a variable-heavy-chain-only region sequence comprising: SEQ ID NOs: 31-58, respectively.

[0014] In some embodiments, the present disclosure provides an anti-PD-L1 antibody or an antigen-binding fragment thereof, comprising at least one variable-heavy-chain-only single domain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the at least one variable-heavy-chain-only (VHO) single-domain comprises an amino acid sequence with at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 31-58 or an antigen-binding fragment thereof.

[0015] The anti-CD3, anti-CD28, or anti-PD-L1 antibodies or antigen binding fragments thereof disclosed herein may be human, humanized, or chimeric antibodies or antigen binding fragments.

[0016] The anti-CD3, anti-CD28, or anti-PD-L1 antibodies or antigen binding fragments thereof disclosed herein may be full length IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 antibodies or maybe antigen binding fragments thereof, such as a VHH, Fab, F (ab') 2, or scFv fragment. The antibody backbones may be modified to affect functionality, e.g., to eliminate residual effector functions.

[0017] Aspects of the disclosure include isolated multispecific antibodies comprising: a first heavy chain polypeptide subunit comprising a mutated human IgG1 constant region comprising mutations L234A, L235A, and F405L; and a second heavy chain polypeptide subunit comprising a mutated human IgG1 constant region comprising mutations L234A, L235A, K409R, and H435R. In some embodiments, the mutated human IgG1 constant region of the first heavy chain polypeptide subunit comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 73, and the mutated human IgG1 constant region of the second heavy chain polypeptide subunit comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 74.

[0018] In some embodiments, the multispecific antibodies disclosed herein further comprise a binding moiety having a binding specificity to a protein other than CD3, CD28, or PD-L1. In some embodiments, the binding moiety comprises one single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the binding moiety comprises a light chain polypeptide subunit and a heavy chain polypeptide subunit. In some embodiments, the protein other than CD3 is a tumor-associated antigen. In some embodiments, the TAA is receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ROR1) . In some embodiments, the TAA is trophoblast glycoprotein (TPBG, 5T4) . In some embodiments, the TAA is epidermal growth factor receptor.

[0019] In some embodiments, the present disclosure provides a multispecific antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain protein comprising, from the N-to the  C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a CD3 associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as disclosed herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the second binding arm can target a ROR1 associated pathway and comprise an anti-ROR1 antibody or antigen binding fragment as disclosed herein. The signal sequences A and B can be the same or different from one another.

[0020] In some embodiments, the present disclosure provides a multispecific antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain protein comprising, from the N-to the  C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a CD3 associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the second binding arm can target a 5T4 associated pathway and comprise an anti-5T4 antibody or antigen binding fragment as described herein. The signal sequences A and B can be the same or different from one another.

[0021] In some embodiments, the present disclosure provides a multispecific antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain fusion protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -a scFv or an antigen-binding fragment thereof- an optional linker A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the scFv or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a ROR1-associated pathway and comprise an anti-ROR1 antibody or antigen binding fragment as disclosed herein; and the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a CD3-associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as disclosed herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the second binding arm can target a CD28 associated pathway and comprise an anti-CD28 or antigen binding fragment as disclosed herein. The signal sequences A and B can be the same or different from one another and the  linker A can be the same or different from one another.

[0022] In some embodiments, the present disclosure provides a multispecific antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain fusion protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -a VHH A or an antigen-binding fragment thereof - an optional linker A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the VHH A or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a EGFR-associated pathway and comprise an anti-EGFR antibody or antigen binding fragment as described herein; and the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a CD3-associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain fusion protein comprising, from  the N-to the C-terminus, an optional signal sequence A -a VHH B or an antigen-binding fragment thereof - an optional linker A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the VHH B or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a PD-L1-associated pathway and comprise an anti-PD-L1 antibody or antigen binding fragment as described herein; and the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the second binding arm can target a CD28-associated pathway and comprise an anti-CD28 or antigen binding fragment as described herein. The signal sequences A and B can be the same or different from one another and the  linker A can be the same or different from one another.

[0023] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific or multispecific antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain fusion protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -a scFv or an antigen-binding fragment thereof- an optional linker A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the scFv or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a ROR1-associated pathway and comprise an anti-ROR1 antibody or antigen binding fragment as described herein; and the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a CD3-associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain fusion protein comprising, from  the N-to the C-terminus, an optional signal sequence A -a VHH or an antigen-binding fragment thereof- an optional linker A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the VHH or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a PD-L1-associated pathway and comprise an anti-PD-L1 antibody or antigen binding fragment as described herein; and the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the second binding arm can target a control antibody or antigen binding fragment as described herein, which served as an inert binding fragment. The signal sequences A and B can be the same or different from one another and the  linker A can be the same or different from one another.

[0024] In some embodiments, in a multispecific antibody disclosed herein, the IgG is human IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4.

[0025] In some embodiments, in a multispecific antibody disclosed herein, the first binding arm is monovalent, bivalent, or multivalent, and the second binding arm is monovalent, bivalent, or multivalent.

[0026] In some embodiments, in a multispecific antibody disclosed herein, the first binding arm comprises one single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof, one IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and one IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof is optionally connected to the IgG heavy chain or antigen-binding fragment thereof.

[0027] In some embodiments, in a multispecific antibody disclosed herein, the first binding arm comprises one single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof, one IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and one IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof is optionally connected to the IgG heavy chain or antigen-binding fragment thereof in the first arm; the second binding arm comprises one variable-heavy-chain-only single domain, one IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and one the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the variable-heavy-chain-only single domain is optionally connected to the IgG heavy chain or antigen-binding fragment thereof in the second arm.

[0028] In some embodiments, in a multispecific antibody disclosed herein, the first binding arm comprises one variable-heavy-chain-only single domain, one IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and one IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the variable-heavy-chain-only single domain is optionally connected to the IgG heavy chain or antigen-binding fragment thereof in the first arm; the second binding arm comprises one variable-heavy-chain-only single domain, one IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and one IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the variable-heavy-chain-only single domain is optionally connected to the IgG heavy chain or antigen-binding fragment thereof in the second arm.

[0029] In some embodiments, in a multispecific antibody disclosed herein, the IgG heavy chain of the first binding arm (anti-CD3 arm) comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1-15, and 60, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-15, or an antigen-binding fragment thereof, and the IgG light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 16-20, and 61, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 16-20, or antigen-binding fragment thereof; the IgG heavy chain of the second binding arm (anti-ROR1 arm) comprises an amino  acid sequence selected from SEQ ID NO: 66, or an antigen-binding fragment thereof, and the IgG light chain of the second binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 67, or antigen-binding fragment thereof.

[0030] In some embodiments, in a multispecific antibody disclosed herein, the IgG heavy chain of the first binding arm (anti-CD3 arm) comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1-15, and 60, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-15, or an antigen-binding fragment thereof, and the IgG light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 16-20, and 61, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 16-20, or antigen-binding fragment thereof; the IgG heavy chain of the second binding arm (anti-5T4 arm) comprises an amino acid  sequence selected from SEQ ID NO: 64, or an antigen-binding fragment thereof, and the IgG light chain of the second binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 65, or antigen-binding fragment thereof.

[0031] In some embodiments, in a multispecific antibody disclosed herein, the IgG heavy chain of the first binding arm (anti-CD3 arm) comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1-15, and 60, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-15, or an antigen-binding fragment thereof, and the IgG light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 16-20, and 61, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 16-20, or antigen-binding fragment thereof; the single-chain fragment variable (scFv) heavy chain of the first binding arm (ROR1- binding fragment) comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 66, or an antigen-binding fragment thereof, and the single-chain fragment variable (scFv) light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 67, or antigen-binding fragment thereof; the IgG heavy chain of the second binding arm (anti-CD28 arm) comprises an amino acid  sequence selected from SEQ ID NOs: 21-24, and 62, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 21-24, or an antigen-binding fragment thereof, and the IgG light chain of the second binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 25-27, and 63, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 25-27, or antigen-binding fragment thereof.

[0032] In some embodiments, in a multispecific antibody disclosed herein, the IgG heavy chain of the first binding arm (anti-CD3 arm) comprises an amino acid  sequence selected from SEQ ID NOs: 1-15, and 60, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-15, or an antigen-binding fragment thereof, and the IgG light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 16-20, and 61, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 16-20, or antigen-binding fragment thereof; the variable-heavy-chain-only single domain of the first binding arm (EGFR-binding  fragment) comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 59, or an antigen-binding fragment thereof; the IgG heavy chain of the second binding arm (anti-CD28 arm) comprises an amino acid  sequence selected from SEQ ID NOs: 21-24, and 62, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 21-24, or an antigen-binding fragment thereof, and the IgG light chain of the second binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 25-27, and 63, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 25-27, or antigen-binding fragment thereof; the variable-heavy-chain-only single domain of the second binding arm (PD-L1-binding  fragment) comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 31-58, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 31-57, or an antigen-binding fragment thereof.

[0033] In some embodiments, in a multispecific antibody disclosed herein, the IgG heavy chain of the first binding arm (anti-CD3 arm) comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1-15, and 60, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-15, or an antigen-binding fragment thereof, and the IgG light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 16-20, and 61, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 16-20, or antigen-binding fragment thereof; the single-chain fragment variable (scFv) heavy chain of the first binding arm (ROR1- binding fragment) comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 66 or an antigen-binding fragment thereof, and the single-chain fragment variable (scFv) light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 67, or antigen-binding fragment thereof; the variable-heavy-chain-only single domain of the second binding arm (PD-L1-binding  fragment) comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 31-58, or an antigen-binding fragment thereof.

[0034] In some embodiments, an antibody or multispecific antibody disclosed herein comprises a modified Fc to extend the half-life of the multispecific antibody, enhance resistance of the multispecific antibody to proteolytic degradation, reduce effector functionality of the multispecific antibody, facilitate generation of the multispecific antibody by Fc heterodimerization, facilitate multimerization of the multispecific antibody, and / or improve manufacturing and drug stability of the multispecific antibody.

[0035] In another aspect, the present disclosure provides a composition comprising an antibody or multispecific antibody or antibody fragment disclosed herein. In certain embodiments, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising an antibody or multispecific antibody or antibody fragment disclosed herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0036] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding an anti-CD3 or an antigen-binding fragment thereof.

[0037] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding an anti-CD28 or an antigen-binding fragment thereof.

[0038] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding an anti-PD-L1 antibody or an antigen-binding fragment thereof.

[0039] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding an anti-EGFR antibody or an antigen-binding fragment thereof.

[0040] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding an anti-CD3 or an antigen-binding fragment thereof.

[0041] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding an anti-ROR1 antibody or an antigen-binding fragment thereof.

[0042] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding an anti-5T4 antibody or an antigen-binding fragment thereof.

[0043] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding the multispecific antibody, or one or more of the first heavy chain protein or first heavy chain fusion protein, the first light chain fusion protein, the second heavy chain protein or heavy chain fusion protein, or the second light chain protein disclosed herein.

[0044] In another aspect, the present disclosure provides a recombinant vector, such as an expression vector, comprising a nucleic acid disclosed herein.

[0045] In another aspect, the present disclosure provides a host cell comprising a recombinant vector such as an expression vector or a nucleic acid disclosed herein.

[0046] In another aspect, the present disclosure provides a method for preparing an antibody or multispecific antibody disclosed herein, comprising culturing a host cell disclosed herein, growing the host cell in a host cell culture, providing host cell culture conditions wherein a nucleic acid disclosed herein is expressed, and recovering the antibody or multispecific antibody from the host cell or from the host cell culture. In certain embodiments, the multispecific antibody is obtained using controlled Fab arm exchange.

[0047] Aspects of the disclosure include methods for treating a disease or condition characterized by expression of ROR1, comprising administering to an individual in need an effective dose of a multispecific antibody targeting at least ROR1, or a pharmaceutical composition described herein. In some embodiments, the disease is a cancer. In some embodiments, the cancer is a mantle cell lymphoma. In some embodiments, the cancer is a triple negative breast cancer.

[0048] Aspects of the invention include methods for treating a disease or condition characterized by expression of 5T4, comprising administering to an individual in need an effective dose of a multispecific antibody targeting at least 5T4, or a pharmaceutical composition, described herein. In some embodiments, the disease is a cancer. In some embodiments, the cancer is a triple negative breast cancer.

[0049] Aspects of the invention include methods for treating a disease or condition characterized by expression of EGFR, comprising administering to an individual in need an effective dose of a multispecific antibody targeting at least EGFR, or a pharmaceutical composition, described herein. In some embodiments, the disease is a cancer. In some embodiments, the cancer is a triple negative breast cancer. In some embodiments, the cancer is a non-small cell lung cancer.

[0050] Aspects of the invention include methods for treating a disease or condition characterized by expression of PD-L1, comprising administering to an individual in need an effective dose of a multispecific antibody targeting at least PD-L1, or a pharmaceutical composition, described herein. In some embodiments, the disease is a cancer. In some embodiments, the cancer is a mantle cell lymphoma. In some embodiments, the cancer is a triple negative breast cancer.

[0051] In another aspect, the present disclosure provides a method for mediating ROR1, 5T4, EGFR, or PD-L1 in a subject in need thereof, comprising administering to the subject an effective amount of an antibody or multispecific antibody or a pharmaceutical composition disclosed herein.

[0052] These and other embodiments of the present disclosure are described in greater detail herein.Brief Description of the Drawings

[0053] Figure 1 demonstrates concentration dependent ELISA binding of anti-CD3 antibodies to recombinant human CD3 (Figure 1A) and recombinant cynomolgus monkey CD3 (Figure 1B) . ELISA binding assays show binding to both recombinant human and cynomolgus CD3 protein coated in plates by a serial dilution of anti-CD3 antibodies. The Y axes units are OD 450nm. The x axes units are the concentration of the respective test articles in nM (nmol / L) units. The results showed that all the test molecules showed strong binding to both human and cynomolgus CD3 protein (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 60, 1, 8 and 9-12 for GENCD3-1, huSP34_v1, v8, v9, v36, v37, v38, and v39, respectively; light chain variable sequences of SEQ ID NOs: 61, 16, and 20 for GENCD3-1, huSP34_v1, v8, v9, v36, v37, v38, and v39 respectively, as shown in Table 3) .

[0054] Figure 2 demonstrate concentration dependent flow cytometry binding of anti-CD3 antibodies to primary human T cells bearing CD3 from a PBMC preparation (Figure 2A and 2B) . Cell binding assays showed different levels of binding to CD3+ T cells isolated from frozen human PBMCs by a serial dilution of anti-CD3 antibodies. The Y axes units are geometric Mean Fluorescence Intensity (gMFI) . The x axes units are the concentration of the respective test articles in nM (nmol / L) units. The results showed that all the test molecules showed varying level of binding capacity to CD3 primary cells (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 1-3 and 7-12 for huSP34_v1, v8, v28, v29, v30, v34, v35, v36, v37, v38, and v39, respectively; light chain variable sequences of SEQ ID NOs: 16 and 20 for huSP34_v1, v8, v28, v29, v30, v34, v35, v36, v37, v38, and v39, respectively, as shown in Table 3) .

[0055] Figure 3 demonstrates concentration dependent ELISA binding of anti-CD28 antibodies to recombinant human (Figure 3A) and cynomolgus monkey CD28 (Figure 3B) . ELISA binding assays showed binding to recombinant CD28 protein coated in plates by a serial dilution of the anti-CD28 antibodies. The Y axes units are absorbances at 450 nm. The x axes units are the concentrations of the respective test articles in nM (nmol / L) units. The results showed that all the test molecules showed varying level of binding to human / cynomolgus CD28 protein (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 21, 22, and 24 for CD28-3, 4, 6, 7, 8, 10, 11, and 12, respectively; light chain variable sequences of SEQ ID NOs: 25-27 for CD28-3, 4, 6, 7, 8, 10, 11, and 12, respectively, as shown in Table 5) .

[0056] Figure 4 demonstrates concentration dependent flow cytometry binding of anti-CD28 antibodies to RPMI-8226 cell line bearing CD28 (Figure 4A and 4B) . Cell binding assays showed binding to CD28+ RPMI-8226 cells by a serial dilution of anti-CD28 antibodies. The Y axes units are geometric Mean Fluorescence Intensity (gMFI) . The x axes units are the concentration of the respective test articles in nM (nmol / L) units. The results showed that all the test molecules showed varying levels of binding to CD28+ RPMI-8226 multiple myeloma cells (heavy chain variable sequences of SEQ ID NO: 62, 21, 22, and 24 for TGN-1412, CD28-3, 4, 6, 7, 8, 10, 11, and 12, respectively; light chain variable sequences of SEQ ID NO: 63 and 25-27 for TGN-1412, CD28-3, 4, 6, 7, 8, 10, 11, and 12, respectively, as shown in Table 5) .

[0057] Figure 5 demonstrates the blocking of the PD-1-PD-L1 binding by anti-PD-L1 antibodies. PD1 -PD-L1 blocking was measured by using a reporter gene activation assay. The Y axes units are fold of reporter gene activation. The x axes units are the concentration of the respective test articles in nM (nmol / L) units. The results showed that all the test molecules showed varying levels of PD-L1 / PD-1 blockade activities (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 28, 34, 36, 45, 52, and 55 for PD-L1-v2-IgG K409R, PD-L1_TS294-786, PD-L1_TS297-294, and PD-L1_TS737-705, respectively; light chain variable sequences of SEQ ID NO: 30 for PD-L1-v2-IgG K409R, respectively, as shown in Table 6) .

[0058] Figure 6 demonstrates a ROR1 x CD3 bispecific antibody inducing PBMC killing in heme cancer cell lines. Serial dilutions of ROR1 x CD3 bispecific antibodies, with a unique CD3 targeting arm (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 1, 3-4, 7-8 and 10 for huSP34_v1, v3, v4, v8, v10, v30, v34, v35, and v37, respectively; light chain variable sequences of SEQ ID NOs: 16 and 20 for huSP34_v1, v3, v4, v8, v10, v30, v34, v35, and v37, respectively, as shown in Table 3) each paired with the same benchmark anti-ROR1 arm JNJ134, were tested for the ability to kill ROR1+ Jeko-1 human mantle cell lymphoma (MCL) cells in the presence of human PBMCs (Figure 6A and 6B) . In this experiment, Jeko-1 cells were mixed with PBMCs in a 5: 1 E: T ratio along with the addition of bispecific antibody. JNJ134 is a binding arm to ROR1 with a heavy chain variable sequence of SEQ ID NO: 66; light chain variable sequence of SEQ ID NO: 67. Varying levels of T cell killing were observed. The x-axis shows the concentration of antibody used in nM (nmol / L) and the y-axis shows the %cell lysis of tumor cells 48 hours after addition of antibody.

[0059] Figure 7 demonstrates dose responses of 5T4 x CD3 bispecific antibody-inducing PBMC killing in a solid tumor cell line. 5T4 x CD3 bispecific antibodies, with CD3 targeting arm of huSP34_v1 (heavy chain variable sequence with SEQ ID NO: 1; light chain variable sequence with SEQ ID NO: 16) and huSP34_v9 (heavy chain variable sequence with SEQ ID NO: 9; light chain variable sequence with SEQ ID NO: 16) each paired with the same 5T4 targeting arm, were tested for the ability to kill 5T4+ MDA-MB-231 human triple negative breast cancer tumor cells in the presence of human PBMC. In this experiment, 5T4+ tumor cells were mixed with PBMCs in a 10: 1 E: T ratio along with the addition of a bispecific antibody. 5T4-2 is a binding arm with heavy chain variable sequence of SEQ ID NO: 64; light chain variable sequence of SEQ ID NO: 65) . GENCD3-1 is a binding arm to CD3 with a heavy chain variable sequence of SEQ ID NO: 60; light chain variable sequences of SEQ ID NO: 61. The x-axis shows the concentration of antibody used in nM (nmol / L) and the y-axis shows the %cell lysis of tumor cells 48 hours after addition of antibody.

[0060] Figure 8 demonstrates an anti-CD28 arm enhanced CD3 driven PBMC Cell lysis killing by a ROR1 x CD3 antibody. The additional benefit of integrating an anti-CD28 arm to the ROR1 x CD3 were tested by comparing ROR1 x CD3 x CD28 with ROR1 x CD3 x inert arm for the activity of killing of ROR1+ MCL tumor cell lines -MAVER-1 (Figure 8A) and MDA-MB-231 (Figure 8B) in the presence of human PBMCs. CD28-8 (heavy chain variable sequence of SEQ ID NO: 22; light chain variable sequence of SEQ ID NO: 26) was paired with huSP34_v1 and a ROR1 targeting arm. The x-axis shows the concentration of antibody used in nM (nmol / L) and the y-axis shows the %cell lysis of tumor cells 24 hours after addition of antibody. The schematic structures of the tested antibodies are shown in Figure 8C.

[0061] Figure 9 demonstrates contribution of an anti-PD-L1 arm to the PBMC killing induced by a ROR1 x CD3 antibody. The additional benefit of integrating an anti-PD-L1 arm to the ROR1 x CD3 were tested by comparing ROR1 x CD3 x PD-L1 with ROR1 x CD3 x inert arm for the activity of killing ROR1+ MCL tumor cell lines -MAVER-1 (Figure 9A) and MDA-MB-231 (Figure 9B) in the presence of human PBMCs. PD-L1_56tav1 (heavy chain variable sequence of SEQ ID NO: 58) was paired with huSP34_v1 and a ROR1 targeting arm. The x-axis shows the concentration of antibody used and the y-axis shows the %cell lysis of tumor cells 24 hours after addition of antibody. The schematic structures of the tested antibodies are shown in Figure 9C.

[0062] Figure 10 demonstrates CD3 x CD28 x PD-L1 x EGFR tetra-specific antibody-mediated solid tumor cell lysis. Multispecific antibodies and control molecules with one or two functional arms inert, were tested for the ability to kill EGFR+ and PD-L1+ human tumor cell lines - non-small cell lung cancer cell line H1975 (Figure 10A) , and triple negative breast cancer cell line BT-20 (Figure 10B) , in the presence of human PBMCs. For H1975, cells were mixed with T cells, isolated from PBMCs, in a 5: 1 E: T ratio along with the addition of tetra-specific antibodies. For BT-20, cells were mixed with PBMCs in a 10: 1 E: T ratio along with the addition of tetra-specific antibody. The x-axis shows the concentration of antibody used in nM (nmol / L) and the y-axis shows the %cell lysis of tumor cells 48 hours after addition of antibody. The schematic structures of the tested antibodies are shown in Figure 10C. Figure 10D presents alternative arrangements of binding arms in certain multispecific antibodies described herein.

[0063] Figure 11 demonstrates antitumor efficacy of 5T4 x CD3 bispecific antibodies in treating pancreatic tumor and triple negative breast solid tumor models using humanized PBMC solid tumor xenograft models. 5T4-2 x huSP34_v1 (comprising 5T4-2 (SEQ ID NO: 65 as light chain variable sequence and SEQ ID NO: 64 as heavy chain variable sequence) and huSP34_v1 (SEQ ID NO: 16 as light chain variable sequence and SEQ ID NO: 1 as heavy chain variable sequence) ) at 0.5 mg / kg, 1 mg / kg and 3 mg / kg was tested in both 5T4+ human pancreatic cancer BxPC3 (Figure 11A) and human breast cancer MDA-MB-231 (Figure 11B) xenograft models reconstituted with human PBMC. 5T4-2 x GENCD3-1 (SEQ ID NO: 61 as light chain and SEQ ID NO: 60 as heavy chain) was served as a known binding specificity control molecule.

[0064] Figure 12 demonstrates antitumor efficacy of CD3 x CD28 x PD-L1 x EGFR tetra specific antibody in treating a humanized PBMC solid tumor xenograft model. The tetra specific antibody CD3 x CD28 x PD-L1 x EGFR (comprising huSP34_v1 (SEQ ID NO: 16 as light chain and SEQ ID NO: 1 as heavy chain) , CD28-8 (SEQ ID NO: 26 as light chain and SEQ ID NO: 22 as heavy chain) , PD-L1_56tav1 (SEQ ID NO: 58 as heavy chain) and EGFR 9G8 VHO (SEQ ID NO: 68 as heavy chain) ) at 0.1 mg / kg and 0.5 mg / kg was tested in human triple negative breast cancer xenograft model BT20 (Fig. 12A) reconstituted with human PBMC. Two comparator antibodies: (1) a human IgG1 Ab lacking specificity to the tumor cell (labeled as “Isotype” ) and (2) an antibody having anti-EGFR binding but lacking both CD28 and PD-L1 binding specificities (labeled as “R108 x inert” ) ; and (3) an antibody having anti-EGFR binding and both CD28 and PD-L1 binding specificities (labeled as “R108 x L51” ) were used to confirm the contribution from CD28 and PD-L1 targeting. Tumors were collected at the end of the study and tumor infiltrating lymphocytes were analyzed by flow cytometry (Fig. 12B) .Detailed descriptionDefinitions

[0065] All publications, including but not limited to patents and patent applications, cited in this specification are herein incorporated by reference as though fully set forth. If certain content of a reference cited herein contradicts or is inconsistent with the present disclosure, the present disclosure controls.

[0066] It is to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to be limiting. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the disclosure pertains.

[0067] Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice for testing of the present disclosure, exemplary materials and methods are described herein. In describing and claiming the present disclosure, the following terminology will be used.

[0068] As used in this specification and the appended claims, the singular forms “a, ” “an, ” and “the” include plural referents unless the content clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “a cell” includes a combination of two or more cells, and the like.

[0069] “Antibodies” is meant in a broad sense and includes immunoglobulin molecules including monoclonal antibodies including murine, human, humanized and chimeric monoclonal antibodies, antibody fragments, trispecific or multi-specific antibodies, dimeric, tetrameric or multimeric antibodies, single chain antibodies, domain antibodies and any other modified configuration of the immunoglobulin molecule that comprises an antigen binding site of the required specificity.

[0070] “Full length antibody molecules” are comprised of two heavy chains (HC) and two light chains (LC) inter-connected by disulfide bonds as well as multimers thereof (e.g., IgM) . Each heavy chain is comprised of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (comprised of domains CH1, hinge, CH2 and CH3) . Each light chain is comprised of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) . The VH and the VL regions may be further subdivided into regions of hyper variability, termed complementarity determining regions (CDR) , interspersed with framework regions (FR) . Each VH and VL is composed of three CDRs and four FR segments, arranged from amino-to-carboxyl-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4.

[0071] “Complementarity determining regions (CDR) ” are “antigen binding sites” in an antibody. CDRs may be defined using various terms: (i) Complementarity Determining Regions (CDRs) , three in the VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) and three in the VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) are based on sequence variability (E.A. Kabat, 1991; T.T. Wu et al., 1970) . (ii) “Hypervariable regions, ” “HVR, ” or “HV, ” three in the VH (H1, H2, H3) and three in the VL (L1, L2, L3) refer to the regions of an antibody variable domains which are hypervariable in structure as defined by Chothia and Lesk (C. Chothia et al., 1987) . The International ImMunoGeneTics (IMGT) database (http:  / / www_imgt_org) provides a standardized numbering and definition of antigen-binding sites. The correspondence between CDRs, HVs and IMGT delineations are described (M.P. Lefranc et al., 2003) . The term “CDR, ” “HCDR1, ” “HCDR2, ” “HCDR3, ” “LCDR1, ” “LCDR2” and “LCDR3” as used herein includes CDRs defined by any of the methods described supra, Kabat, Chothia or IMGT, unless otherwise explicitly stated in the specification.

[0072] Immunoglobulins may be assigned to five major classes, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, depending on the heavy chain constant region amino acid sequence. IgA and IgG are further sub-classified as the isotypes IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. Antibody light chains of any vertebrate species may be assigned to one of two clearly distinct types, namely kappa (κ) and lambda (λ) , based on the amino acid sequences of their constant regions.

[0073] “Antibody fragment, ” “Antigen-binding fragment, ” or “antigen-binding portion, ” refers to a portion of an immunoglobulin molecule that retains the heavy chain and / or the light chain antigen binding site, such as heavy chain complementarity determining regions (HCDR) 1, 2 and 3, light chain complementarity determining regions (LCDR) 1, 2 and 3, a heavy chain variable region (VH) , or a light chain variable region (VL) . Antibody fragments include well known Fab, F (ab’) 2, Fd and Fv fragments as well as domain antibodies (dAb) consisting of one VH domain. VH and VL domains may be linked together via a synthetic linker to form various types of single chain antibody designs where the VH / VL domains may pair intramolecularly, or intermolecularly in those cases when the VH and VL domains are expressed by separate single chain antibody constructs, to form a monovalent antigen binding site, such as single chain Fv (scFv) or diabody; described for example in Int. Disclosure Publ. Nos. WO1998 / 44001, WO1988 / 01649, WO1994 / 13804 and WO1992 / 01047.

[0074] “Monoclonal antibody” refers to an antibody population with single amino acid composition in each heavy and each light chain, except for possible well-known alterations such as removal of C-terminal lysine from the antibody heavy chain. Monoclonal antibodies typically bind one antigenic epitope, except that multispecific monoclonal antibodies bind multiple distinct antigenic epitopes. Monoclonal antibodies may have heterogeneous glycosylation within the antibody population. Monoclonal antibody may be monospecific or multi-specific, or monovalent, bivalent or multivalent. A trispecific antibody is included in the term monoclonal antibody.

[0075] “Isolated antibody” refers to an antibody or antibody fragment that is substantially free of other antibodies having different antigenic specificities. “Isolated antibody” encompasses antibodies that are isolated to a higher purity, such as antibodies that are 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%pure.

[0076] “Humanized antibody” refers to an antibody in which the antigen binding sites are derived from non-human species and the variable region frameworks are derived from human immunoglobulin sequences. Humanized antibodies may include substitutions in the framework so that the framework may not be an exact copy of expressed human immunoglobulin or human immunoglobulin germline gene sequences.

[0077] “Human antibody” refers to an antibody having heavy and light chain variable regions in which both the framework and the antigen binding site are derived from sequences of human origin and is optimized to have minimal immune response when administered to a human subject. If the antibody contains a constant region or a portion of the constant region, the constant region also is derived from sequences of human origin.

[0078] .

[0079] The numbering of amino acid residues in the antibody constant region throughout the specification is according to the EU index as described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (E.A. Kabat, 1991) , unless otherwise explicitly stated.

[0080] Conventional one and three-letter amino acid codes are used herein as shown in Table 1. Table 1

[0081] The polypeptides, nucleic acids, fusion proteins, and other compositions provided herein may encompass polypeptides, nucleic acids, fusion proteins, and the like that have a recited percent identity to an amino acid sequence or DNA sequence provided herein. The term “identity” refers to a relationship between the sequences of two or more polypeptide molecules or two or more nucleic acid molecules, as determined by aligning and comparing the sequences. “Percent identity, ” “percent homology, ” “sequence identity, ” or “sequence homology” and the like mean the percent of identical residues between the amino acids or nucleotides in the compared molecules and is calculated based on the size of the smallest of the molecules being compared. For these calculations, gaps in alignments (if any) are preferably addressed by a particular mathematical model or computer program (i.e., an “algorithm” ) . Methods that can be used to calculate the identity of the aligned nucleic acids or polypeptides include those described in Computational Molecular Biology (A. Lesk, 1988) ; Biocomputing Informatics and Genome Projects (D.W. Smith, 1994) ; Computer Analysis of Sequence Data, Part I (A.M. Griffin et al., 1994) ; Sequence Analysis in Molecular Biology (G. v. Heijne, 1987) ; Sequence Analysis Primer (M.R. Gribskov et al., 2020) ; 1991, New York: M. Stockton Press; and SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (H. Carrillo et al., 1988) . In calculating percent identity, the sequences being compared are typically aligned in a way that gives the largest match between the sequences.

[0082] The constant region sequences of the mammalian IgG heavy chain are designated in sequence as CH1-hinge-CH2-CH3. The “hinge, ” “hinge region” or “hinge domain” of an IgG is generally defined as including Glu216 and terminating at Pro230 of human IgG1 according to the EU Index but functionally, the flexible portion of the chain may be considered to include additional residues termed the upper hinge region referred to as residues Glu216 to Gly237 and the lower hinge referred to as residues 233 to 239 of the Fc region where FcγR binding was generally attributed. Hinge regions of other IgG isotypes may be aligned with the IgG1 sequence by placing the first and last cysteine residues forming inter-heavy chain S-Sbonds. Although boundaries may vary slightly, as numbered according to the EU Index, the CH1 domain is adjacent to the VH domain and amino terminal to the hinge region of an immunoglobulin heavy chain molecule and includes the first (most amino terminal) constant region of an immunoglobulin heavy chain, e.g., from about EU positions 118-215. The Fc domain extends from amino acid 231 to amino acid 447; the CH2 domain is from about Ala231 to Lys340 or Gly341 and the CH3 from about Gly341 or Gln342 to Lys447. The residues of the IgG heavy chain constant region of the CH1 region terminate at Lys. An Fc domain containing molecule may comprise at least the CH2 and the CH3 domains of an antibody constant region, e.g., comprising at least a region from about Ala231 to Lys447 of IgG heavy chain constant region. The Fc domain containing molecule may optionally comprise at least a portion of the hinge region.

[0083] “Epitope” refers to a portion of an antigen to which an antibody specifically binds. Epitopes typically consist of chemically active (such as polar, non-polar or hydrophobic) surface groupings of moieties such as amino acids or polysaccharide side chains and may have specific three-dimensional structural characteristics, as well as specific charge characteristics. An epitope may be composed of contiguous and / or discontiguous amino acids that form a conformational spatial unit. For a discontiguous epitope, amino acids from differing portions of the linear sequence of the antigen come in close proximity in 3-dimensional space through the folding of the protein molecule. Antibody “epitope” depends on the methodology used to identify the epitope.

[0084] “Inert” (such as “inert binding” ) as used herein means that an antibody or an antigen-binding fragment does not bind to a desired target, e.g., a tumor antigen. For example, an inert arm in a multispecific antibody means a moiety formed by one or more domains without a specific binding capacity in the multispecific antibody, e.g., anti-gp120 or anti-GFP. Examples of multispecific antibodies comprising inert arms are depicted in Figure 9C.

[0085] A “leader sequence” as used herein includes any signal peptide that can be processed by a mammalian cell, including the human B2M leader. Such sequences are well-known in the art.

[0086] The terms “peptide, ” “polypeptide, ” and “protein” are used interchangeably herein, and refer to a polymeric form of amino acids of any length, which can include coded and non-coded amino acids, chemically or biochemically modified or derivatized amino acids, and polypeptides having modified peptide backbones. The terms also include polypeptides that have co-translational (e.g., signal peptide cleavage) and post-translational modifications of the polypeptide, such as, for example, disulfide-bond formation, glycosylation, acetylation, phosphorylation, proteolytic cleavage, and the like.

[0087] Furthermore, as used herein, a “polypeptide” refers to a protein that includes modifications, such as deletions, additions, and substitutions (generally conservative in nature as would be known to a person in the art) to the native sequence, as long as the protein maintains the desired activity. These modifications can be deliberate, as through site-directed mutagenesis, or can be accidental, such as through mutations of hosts that produce the proteins, or errors due to PCR amplification or other recombinant DNA methods.

[0088] The term “recombinant, ” as used herein to describe a nucleic acid molecule, means a polynucleotide of genomic, cDNA, viral, semisynthetic, and / or synthetic origin, which, by virtue of its origin or manipulation, is not associated with all or a portion of the polynucleotide sequences with which it is associated in nature. The term “recombinant, ” as used with respect to a protein or polypeptide, refers to a polypeptide produced by expression from a recombinant polynucleotide. The term “recombinant, ” as used with respect to a host cell or a virus, refers to a host cell or virus into which a recombinant polynucleotide has been introduced. Recombinant is also used herein to refer to, with reference to a material (e.g., a cell, a nucleic acid, a protein, or a vector) , that the material has been modified by the introduction of a heterologous material (e.g., a cell, a nucleic acid, a protein, or a vector) .

[0089] The terms “polynucleotide, ” “oligonucleotide, ” “nucleic acid” and “nucleic acid molecule” are used interchangeably herein to include a polymeric form of nucleotides, either ribonucleotides or deoxyribonucleotides. This term refers only to the primary structure of the molecule.

[0090] “Vector” refers to a polynucleotide capable of being duplicated within a biological system or that can be moved between such systems. Vector polynucleotides typically contain elements, such as origins of replication, polyadenylation signal or selection markers, that function to facilitate the duplication or maintenance of these polynucleotides in a biological system, such as a cell, virus, animal, plant, and reconstituted biological systems utilizing biological components capable of duplicating a vector. The vector polynucleotide may be DNA or RNA molecules, cDNA, or a hybrid of these, single stranded or double stranded.

[0091] “Expression vector” refers to a vector that can be utilized in a biological system or in a reconstituted biological system to direct the translation of a polypeptide encoded by a polynucleotide sequence present in the expression vector.

[0092] As used herein, the term “heterologous” used in reference to nucleic acid sequences, proteins or polypeptides, means that these molecules are not naturally occurring in the cell from which the heterologous nucleic acid sequence, protein or polypeptide was derived. For example, the nucleic acid sequence coding for a human polypeptide that is inserted into a cell that is not a human cell is a heterologous nucleic acid sequence in that particular context. Whereas heterologous nucleic acids may be derived from different organism or animal species, such nucleic acid need not be derived from separate organism species to be heterologous. For example, in some instances, a synthetic nucleic acid sequence or a polypeptide encoded therefrom may be heterologous to a cell into which it is introduced in that the cell did not previously contain the synthetic nucleic acid. As such, a synthetic nucleic acid sequence or a polypeptide encoded therefrom may be considered heterologous to a human cell, e.g., even if one or more components of the synthetic nucleic acid sequence or a polypeptide encoded therefrom was originally derived from a human cell.

[0093] A “host cell, ” as used herein, denotes an in vivo or in vitro eukaryotic cell or prokaryotic cell or a cell from a multicellular organism (e.g., a cell line) cultured as a unicellular entity, which eukaryotic cells can be, or have been, used as recipients for a nucleic acid (e.g., an expression vector that comprises a nucleotide sequence encoding a multimeric polypeptide of the present disclosure) , and include the progeny of the original cell which has been genetically modified by the nucleic acid. It is understood that the progeny of a single cell may not necessarily be completely identical in morphology or in genomic or total DNA complement as the original parent, due to natural, accidental, or deliberate mutation. A “recombinant host cell” (also referred to as a “genetically modified host cell” ) is a host cell into which has been introduced a heterologous nucleic acid, e.g., an expression vector. For example, a genetically modified eukaryotic host cell is genetically modified by virtue of introduction into a suitable eukaryotic host cell a heterologous nucleic acid, e.g., an exogenous nucleic acid that is foreign to the eukaryotic host cell, or a recombinant nucleic acid that is not normally found in the eukaryotic host cell.

[0094] “Specific binding” or “specifically binds” or “binds” or “targets” or “targeting” refer to an antibody binding to a specific antigen with greater affinity than for other antigens. Typically, the antibody “specifically binds” when the equilibrium dissociation constant (KD) for binding is about 1×10-8 M or less, for example about 1×10-9 M or less, about 1×10-10 M or less, about 1×10-11 M or less, or about 1×10-12 M or less, typically with the KD that is at least one hundred-fold less than its KD for binding to a non-specific antigen (e.g., BSA, casein) . The KD may be measured using standard procedures.

[0095] As used herein, the terms “treatment, ” “treating, ” and the like, refer to obtaining a desired pharmacologic and / or physiologic effect. The effect may be prophylactic in terms of completely or partially preventing a disease or symptom thereof and / or may be therapeutic in terms of a partial or complete cure for a disease and / or adverse effect attributable to the disease. “Treatment, ” as used herein, covers any treatment of a disease in a mammal, e.g., in a human, and includes: (a) preventing the disease from occurring in a subject which may be predisposed to the disease but has not yet been diagnosed as having it; (b) inhibiting the disease, i.e., arresting its development; and (c) relieving the disease, i.e., causing regression of the disease.

[0096] The terms “individual, ” “subject, ” “host, ” and “patient, ” used interchangeably herein, refer to a mammal, including, but not limited to, murines (e.g., rats, mice) , lagomorphs (e.g., rabbits) , non-human primates, humans, canines, felines, ungulates (e.g., equines, bovines, ovines, porcines, caprines) , etc.

[0097] A “therapeutically effective amount” or “efficacious amount” refers to the amount of an agent, or combined amounts of two agents, that, when administered to a mammal or other subject for treating a disease, is sufficient to affect such treatment for the disease. The “therapeutically effective amount” will vary depending on the agent (s) , the disease and its severity and the age, weight, etc., of the subject to be treated.

[0098] Before the present disclosure is further described, it is to be understood that this disclosure is not limited to particular embodiments described, as such may, of course, vary. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to be limiting, since the scope of the present disclosure will be limited only by the appended claims.

[0099] The following examples described the invention in further detail which are not intended to limit the scope of protection for the invention. Composition of antibody and antigen-binding fragment Anti-CD3 antibodies

[0100] In some embodiments, the present disclosure provides anti-CD3 antibodies and antigen-binding fragments thereof.

[0101] In some embodiments, the present disclosure provides an anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising: a heavy chain variable region comprising complementarity determining region (CDR)  sequences HCDR1, HCDR2, and HCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 comprise: SEQ ID NOs: 92, 90, and 91; SEQ ID NOs: 89, 93, and 91; SEQ ID NOs: 92, 93, and 91; SEQ ID NOs: 89, 90, and 94; SEQ ID NOs: 89, 90, and 95; SEQ ID NOs: 89, 90, and 96; or SEQ ID NOs: 97, 90, and 96; respectively; and / or a light chain variable region comprising complementarity determining region (CDR)  sequences LCDR1, LCDR2, and LCDR3, wherein the LCDR1, LCDR2, and LCDR3 comprise: SEQ ID NOs: 101, 102, and 100; SEQ ID NOs: 103, 104, and 100; SEQ ID NOs: 101, 104, and 100; or SEQ ID NOs: 105, 104, and 100; respectively.

[0102] As non-limiting examples, the disclosure provides for anti-CD3 heavy and light chain variable region amino acid sequences set forth as SEQ ID NOs: 1-20 in Table 2, and SEQ ID NOs: 60 and 61 in Table 8.

[0103] In some embodiments, the disclosure provides an anti-CD3 or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity (e.g., 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) to any one of SEQ ID NOs: 1-15 or an antigen-binding fragment thereof, and / or a light chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity (e.g., 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) to any one of SEQ ID NOs: 16-20 or an antigen-binding fragment thereof.

[0104] In some embodiments, the disclosure provides an anti-CD3 or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence comprising: SEQ ID NOs: 1 and 16; SEQ ID NOs: 2 and 16; SEQ ID NOs: 3 and 16; SEQ ID NOs: 4 and 16; SEQ ID NOs: 5 and 16; SEQ ID NOs: 6 and 16; SEQ ID NOs: 7 and 16; SEQ ID NOs: 8 and 16; SEQ ID NOs: 9 and 16; SEQ ID NOs: 10 and 16; SEQ ID NOs: 11 and 16; SEQ ID NOs: 2 and 17; SEQ ID NOs: 3 and 17; SEQ ID NOs: 4 and 17; SEQ ID NOs: 5 and 17; SEQ ID NOs: 6 and 17; SEQ ID NOs: 7 and 17; SEQ ID NOs: 8 and 17; SEQ ID NOs: 9 and 17; SEQ ID NOs: 10 and 17; SEQ ID NOs: 11 and 17; SEQ ID NOs: 9 and 18; SEQ ID NOs: 9 and 19; SEQ ID NOs: 12 and 16; SEQ ID NOs: 13 and 16; SEQ ID NOs: 14 and 16; SEQ ID NOs: 15 and 16; SEQ ID NOs: 1 and 20; SEQ ID NOs: 2 and 20; SEQ ID NOs: 3 and 20; SEQ ID NOs: 4 and 20; SEQ ID NOs: 5 and 20; SEQ ID NOs: 6 and 20; SEQ ID NOs: 7 and 20; SEQ ID NOs: 8 and 20; SEQ ID NOs: 9 and 20; SEQ ID NOs: 10 and 20; SEQ ID NOs: 11 and 20; SEQ ID NOs: 12 and 20; SEQ ID NOs: 13 and 20; SEQ ID NOs: 14 and 20; SEQ ID NOs: 15 and 20; SEQ ID NOs: 60 and 61; respectively.

[0105] The anti-CD3 antibodies of the present disclosure encompass full length antibody comprising two heavy chains and two light chains. The antibodies can be human or humanized chimeric antibodies. Humanized antibodies, as used herein, include chimeric antibodies and CDR-grafted antibodies. chimeric antibodies are antibodies that include a nonhuman antibody variable region linked to a human constant region. CDR-grafted antibodies are antibodies that include the CDRs from a non-human "donor" antibody linked to the framework region from a human "recipient" antibody. Exemplary human or humanized antibodies include IgG, IgM, IgE, IgA, and IgD antibodies. The present antibodies can be of any class (IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, etc. ) or isotype. For example, a human antibody can comprise an IgG Fc domain, such as at least one of isotypes, IgGl, IgG2, IgG3, or IgG4.

[0106] In some embodiments, the anti-CD3 or antigen-binding fragment thereof is selected from the group consisting of a whole antibody, an antibody fragment, a human antibody, humanized antibody, a single chain antibody, a conjugate, an antibody mimetic, and a defucosylated antibody. In further examples, the anti-CD3 fragment is selected from the group consisting of a UniBody, a variable heavy only single domain antibody, and a Nanobody. In some examples, the anti-CD3 fragment is selected from the group consisting of a single domain VHH, a single domain VHO, an Affibody, a DARPin, an Anticalin, an Avimer, a Versa body, and a Duocalin.

[0107] In some embodiments, the anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof can be part of a multispecific antibody, such as a bispecific antibody, a trispecific antibody, or tetra-specific antibody. For example, the multispecific antibody can comprises a binding moiety that targets one or more other targets such as CD28 and / or TAAs, such as PD-L1, ROR1, 5T4, and EGFR. Table 2. Variable Region Sequences of anti-CD3 huSP34 antibodies Table 3. Anti-CD3 antibodies Anti-CD28 antibodies

[0108] In some embodiments, the present disclosure provides anti-CD28 antibodies and antigen-binding fragments thereof.

[0109] In some embodiments, the present disclosure provides an anti-CD28 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising: a heavy chain variable region comprising complementarity determining region (CDR)  sequences HCDR1, HCDR2, and HCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 comprise: SEQ ID NOs: 106, 107, and 109; or SEQ ID NOs: 92, 107, and 108; respectively; and / or a light chain variable region comprising complementarity determining region (CDR)  sequences LCDR1, LCDR2, and LCDR3, wherein the LCDR1, LCDR2, and LCDR3 comprise: SEQ ID NOs: 113, 111, and 112; or SEQ ID NOs: 114, 115, and 112; respectively.

[0110] As non-limiting examples, the disclosure provides for anti-CD28 amino acid sequences set forth as SEQ ID NOs: 21-27 in Table 4, and SEQ ID NOs: 62 and 63 in Table 8.

[0111] In some embodiments, the disclosure provides an anti-CD28 or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity (e.g., 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) to any one of SEQ ID NOs: 21-24 and / or an antigen-binding fragment thereof, and a light chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity (e.g., 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) to any one of SEQ ID NOs: 25-27 or an antigen-binding fragment thereof.

[0112] In some embodiments, the disclosure provides an anti-CD28 or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence comprising: SEQ ID NOs: 21 and 25; SEQ ID NOs: 22 and 25; SEQ ID NOs: 23 and 25; SEQ ID NOs: 24 and 25; SEQ ID NOs: 21 and 26; SEQ ID NOs: 22 and 26; SEQ ID NOs: 23 and 26; SEQ ID NOs: 24 and 26; SEQ ID NOs: 21 and 27; SEQ ID NOs: 22 and 27; SEQ ID NOs: 23 and 27; SEQ ID NOs: 24 and 27; SEQ ID NOs: 62 and 63; respectively.

[0113] The anti-CD28 antibodies of the present disclosure encompass full length antibody comprising two heavy chains and two light chains. The antibodies can be human or humanized chimeric antibodies.

[0114] In some embodiments, the anti-CD28 or antigen-binding fragment thereof is selected from the group consisting of a whole antibody, an antibody fragment, a human antibody, humanized antibody, a single chain antibody, a conjugate, an antibody mimetic, and a defucosylated antibody. In further examples, the anti-CD28 fragment is selected from the group consisting of a UniBody, a variable heavy only single domain antibody, and a Nanobody. In some examples, the anti-CD28 fragment is selected from the group consisting of a single domain VHH, a single domain VHO, an Affibody, a DARPin, an Anticalin, an Avimer, a Versa body, and a Duocalin.

[0115] In some embodiments, the anti-CD28 antibody or antigen-binding fragment thereof can be part of a multispecific antibody, such as a bispecific antibody, a trispecific antibody, or tetra-specific antibody. For example, the multispecific antibody can comprises a binding moiety that targets one or more other targets such as CD3 and / or TAAs, such as PD-L1, ROR1, 5T4, and EGFR. Table 4. Variable Region Sequences of anti-CD28 antibodies Table 5. Anti-CD28 antibodies Anti-PD-L1 antibodies

[0116] In some embodiments, the present disclosure provides anti-PD-L1 antibodies and antigen-binding fragments thereof.

[0117] In some embodiments, the present disclosure provides an anti-PD-L1 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising: a heavy chain variable region comprising complementarity determining region (CDR)  sequences HCDR1, HCDR2, and HCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 comprise: SEQ ID NOs: 122, 123, and 124; SEQ ID NOs: 125, 126, and 127; SEQ ID NOs: 97, 128, and 129; SEQ ID NOs: 125, 130, and 131; SEQ ID NOs: 132, 133, and 134; SEQ ID NOs: 132, 133, and 135; SEQ ID NOs: 132, 128, and 136; SEQ ID NOs: 132, 137, and 138; SEQ ID NOs: 125, 139, and 140; SEQ ID NOs: 97, 141, and 142; SEQ ID NOs: 125, 143, and 144; SEQ ID NOs: 125, 145, and 146; SEQ ID NOs: 97, 147, and 148; SEQ ID NOs: 125, 149, and 150; SEQ ID NOs: 132, 185, and 151; SEQ ID NOs: 125, 152, and 153; SEQ ID NOs: 97, 133, and 154; SEQ ID NOs: 97, 133, and 155; SEQ ID NOs: 125, 156, and 157; SEQ ID NOs: 125, 158, and 159; SEQ ID NOs: 160, 161, and 162; SEQ ID NOs: 160, 161, and 163; SEQ ID NOs: 132, 164, and 165; SEQ ID NOs: 97, 166, and 127; SEQ ID NOs: 97, 167, and 134; respectively; and / or a light chain variable region comprising complementarity determining region (CDR)  sequences LCDR1, LCDR2, and LCDR3, wherein the LCDR1, LCDR2, and LCDR3 comprise: SEQ ID NOs: 119, 120, and 121; respectively.

[0118] As non-limiting examples, the disclosure provides for anti-PD-L1 amino acid sequences set forth as SEQ ID NO: 28-58 in Table 6.

[0119] In some embodiments, the disclosure provides an anti-PD-L1 or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity (e.g., 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) to any one of SEQ ID NO: 28 or an antigen-binding fragment thereof, and / or a light chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity (e.g., 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) to any one of SEQ ID NOs: 29 and 30, or an antigen-binding fragment thereof.

[0120] In some embodiments, the disclosure provides an anti-PD-L1 or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence comprising: SEQ ID NOs: 28 and 29 and SEQ ID NOs: 28 and 30, respectively.

[0121] In some embodiments, the present disclosure provides an anti-PD-L1 or an antigen-binding fragment thereof, comprising at least one variable-heavy-chain-only single domain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the at least one variable-heavy-chain-only (VHO) single-domain comprises an amino acid sequence with at least 85%identity (e.g., 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) to any one of SEQ ID NOs: 31-57 or an antigen-binding fragment thereof.

[0122] In some embodiments, the anti-PD-L1 antibodies of the present disclosure encompass full length antibody comprising two heavy chains and two light chains, or two variable-heavy-chain-only single domain fusion heavy chains. The antibodies can be human or humanized chimeric antibodies.

[0123] In some embodiments, the anti-PD-L1 antibodies of the present disclosure may comprise, in tandem, two to four, such as two or three, IgG variable-heavy-chain-only single domains or antigen-binding fragment thereof, wherein the two or three IgG variable heavy chain only single domains or an antigen-binding fragment thereof are optionally connected via one or more linkers. The binding arm targeting a PD-L1 associated pathway, such as PD-L1, can be monovalent, bivalent, trivalent, tetravalent, etc. For example, there can be a dual or tri or quad epitope recognition for PD-L1 in an antibody to enhance specificity of engagement.

[0124] In some embodiments, the anti-PD-L1 or antigen-binding fragment thereof is selected from the group consisting of a whole antibody, an antibody fragment, a human antibody, humanized antibody, a single chain antibody, a conjugate, an antibody mimetic, and a defucosylated antibody. In further examples, the anti-PD-L1 fragment is selected from the group consisting of a UniBody, a variable heavy only single domain antibody, and a Nanobody. In some examples, the anti-PD-L1 fragment is selected from the group consisting of a single domain VHH, a single domain VHO, an Affibody, a DARPin, an Anticalin, an Avimer, a Versa body, and a Duocalin.

[0125] In some embodiments, the anti-PD-L1 or antigen-binding fragment thereof can be part of a multispecific antibody, such as a bispecific antibody, a trispecific antibody, or tetra-specific antibody. For example, the multispecific antibody can comprises a binding moiety that binds one or more other targets, such as CD3 and CD28, and / or TAAs, such as ROR1, 5T4, and EGFR. Table 6. Variable Region Sequences of anti-PD-L1 antibodies Table 7. Anti-PD-L1 antibodies Anti-5T4 antibodies

[0126] In some embodiments, the disclosure provides for anti-5T4 amino acid sequences set forth as SEQ ID NOs: 64-65 in Table 8.

[0127] In some embodiments, the disclosure provides an anti-5T4 antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain sequence and a light chain sequence comprising: SEQ ID NOs: 64 and 65; respectively.

[0128] The anti-5T4 antibodies of the present disclosure encompass full length antibody comprising two heavy chains and two light chains. The antibodies can be human or humanized chimeric antibodies.

[0129] In some embodiments, the anti-5T4 antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from the group consisting of a whole antibody, an antibody fragment, a human antibody, humanized antibody, a single chain antibody, a conjugate, an antibody mimetic, and a defucosylated antibody. In further examples, the anti-5T4 antibody fragment is selected from the group consisting of a UniBody, a variable heavy only single domain antibody, and a Nanobody. In some examples, the anti-5T4 antibody fragment is selected from the group consisting of a single domain VHH, a single domain VHO, an Affibody, a DARPin, an Anticalin, an Avimer, a Versa body, and a Duocalin.

[0130] In some embodiments, the anti-5T4 antibody or antigen-binding fragment thereof can be part of a multispecific antibody, such as a bispecific antibody, a trispecific antibody, or tetra-specific antibody. For example, the multispecific antibody can comprises a binding moiety that binds one or more other targets, such as CD3 and CD28, and / or TAAs, such as PD-L1, ROR1, and EGFR. Anti-ROR1 antibodies

[0131] In some embodiments, the disclosure provides for anti-ROR1 amino acid sequences set forth as SEQ ID NOs: 66 and 67 in Table 8.

[0132] In some embodiments, the disclosure provides an anti-ROR1 antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a light chain sequence and a heavy chain sequence comprising: SEQ ID NOs: 66 and 67; respectively.

[0133] The anti-ROR1 antibodies of the present disclosure encompass full length antibody comprising two heavy chains and two light chains. The antibodies can be human or humanized chimeric antibodies.

[0134] In some embodiments, the anti-ROR1 antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from the group consisting of a whole antibody, an antibody fragment, a human antibody, humanized antibody, a single chain antibody, a conjugate, an antibody mimetic, and a defucosylated antibody. In further examples, the anti-ROR1 antibody fragment is selected from the group consisting of a UniBody, a variable heavy only single domain antibody, and a Nanobody. In some examples, the anti-ROR1 antibody fragment is selected from the group consisting of a single domain VHH, a single domain VHO, an Affibody, a DARPin, an Anticalin, an Avimer, a Versa body, and a Duocalin.

[0135] In some embodiments, the anti-ROR1 antibody or antigen-binding fragment thereof can be part of a multispecific antibody, such as a bispecific antibody, a trispecific antibody, or tetra-specific antibody. For example, the multispecific antibody can comprises a binding moiety that binds one or more other targets, such as CD3 and CD28, and / or TAAs, such as PD-L1, 5T4, and EGFR. Anti-EGFR antibodies

[0136] In some embodiments, the disclosure provides for anti-EGFR amino acid sequences set forth as SEQ ID NOs: 59 and 68 in Table 8

[0137] In some embodiments, the disclosure provides an anti-EGFR antibody or antigen binding fragment thereof, comprising at least one variable-heavy-chain-only single domain or an antigen-binding fragment thereof, comprising a variable-heavy-chain-only region sequence comprising: SEQ ID NOs: 59 and 68; respectively.

[0138] In some embodiments, the anti-EGFR antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from the group consisting of a whole antibody, an antibody fragment, a human antibody, humanized antibody, a single chain antibody, a conjugate, an antibody mimetic, and a defucosylated antibody. In further examples, the anti-EGFR antibody fragment is selected from the group consisting of a UniBody, a variable heavy only single domain antibody, and a Nanobody. In some examples, the anti-EGFR antibody fragment is selected from the group consisting of a single domain VHH, a single domain VHO, an Affibody, a DARPin, an Anticalin, an Avimer, a Versa body, and a Duocalin.

[0139] In some embodiments, the anti-EGFR antibody or antigen-binding fragment thereof can be part of a multispecific antibody, such as a bispecific antibody, a trispecific antibody, or tetra-specific antibody. For example, the multispecific antibody can comprises a binding moiety that binds one or more other targets, such as CD3 and CD28, and / or TAAs, such as PD-L1, ROR1 and 5T4. Bispecific ROR1 x CD3 antibodies

[0140] In some embodiments, the present disclosure provides a ROR1 x CD3 bispecific antibody that targets simultaneously one or more proteins linked to ROR1-associated pathways as well as one or more proteins that can activate the CD3 T cell activity.

[0141] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific antibody that targets human ROR1 and CD3 simultaneously and is capable of effectively blocking ROR1 at the protein level. The bispecific antibody binds both CD3 and ROR1 proteins and binds to one protein without affecting the binding of the other protein, that is, having the ability to bind CD3 and ROR1 simultaneously. The bispecific antibody disclosed herein inhibits ROR1-mediated disease or disorders, such as the mantle cell lymphoma or triple negative breast cancer.

[0142] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific or antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain protein comprising, from the N-to the  C-terminus, a signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a CD3 associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the second binding arm can target a ROR1 associated pathway and comprise an anti-ROR1 antibody or antigen binding fragment as described herein. The signal sequences A and B can be the same or different from one another.

[0143] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific antibody that can be generated using well established point mutations in the CH1, CH2, and CH3 domains via controlled Fab arm exchange or via co-expression. In some embodiment, all constructs are symmetric so that there is no preference for the selection of point mutations of the respective parental antibodies.

[0144] In some embodiments of the bispecific antibody disclosed herein, the binding arm that targets CD3 has a binding valency of one. The bispecific antibody is preferably designed to have monovalent CD3-binding (i.e., one Fab arm binding to the epitope of CD3) . Bivalent CD3 binding is linked to excess of activation-induced cell death in effector cells that could limit the efficacy of T cell redirection. In addition, a bivalent CD3 redirection molecule can result in tumor antigen-independent immune effector cell activation that can increase systemic toxicity in the patient. The use of a high affinity of anti-CD3 Fab arm can also increase toxicity. High affinity variants of anti-CD3 Fab or scFv are typically poorly tolerated in cynomolgus monkeys because of resulting extensive cytokine release. High affinity for CD3 also shifted bispecific antibody biodistribution from tumors to CD3 rich tissue that led to increased risk of cytokine release syndrome. Thus, it is highly desirable for the binding affinity of the anti-CD3 arm to be lower than that of anti-ROR1 arm. Bivalent anti-CD3 agents can increase avidity in binding to CD3 and could lead to increase in cytokine release syndrome from off-tumor CD3 positive cells.

[0145] In some embodiments of the bispecific antibody disclosed herein, the second binding arm targets an ROR1 associated pathway. The bispecific antibody is preferably designed to have monovalent ROR1-binding (i.e., one Fab arm binding to the epitope of ROR1) . The second binding arm targeting a ROR1 associated pathway, such as ROR1, can be monovalent, bivalent, trivalent, tetravalent, etc. For example, there can be a dual or tri or quad epitope recognition for ROR1 in a bispecific antibody to enhance specificity of engagement.

[0146] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein comprises a heavy chain sequence selected from SEQ ID NOs: 1-15, 60, and 66, and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 16-20, 61 and 67, respectively.

[0147] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein may comprise a first binding arm tarting CD3. For example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a first binding arm comprising an anti-CD3 moiety comprising three heavy chain CDRs and three light chain CDRs selected from the HCDRs and LCDRs provided in Table 2. For another example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a first CD3 binding arm comprising a human IgG1 heavy chain and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 1-15, 60 and 16-20, 61, respectively.

[0148] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein may comprise a second binding arm targeting ROR1. For example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a second ROR1 binding arm comprising a human IgG1 heavy chain and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 66 and 67, respectively.

[0149] Other bispecific TAA x CD3 antibodies that simultaneously target a TAA and CD3 (e.g., 5T4 x CD3 antibodies described in the section below) can also be obtained based on the above description of ROR1 x CD3 antibodies. The bispecific antibody disclosed herein may further comprise one or more moieties that target one or more other targets disclosed herein to make a trispecific, tetra-specific, etc., antibody. Bispecific 5T4 x CD3 antibodies

[0150] In some embodiments, the present disclosure provides a 5T4 x CD3 bispecific antibody that targets simultaneously proteins linked to 5T4-associated pathways as well as proteins that can activate the CD3 T cell activity.

[0151] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific antibody that targets human 5T4 and CD3 simultaneously and is capable of effectively blocking 5T4 protein at the protein level. The bispecific antibody binds both CD3 and 5T4 proteins and binds to one protein without affecting the binding of the other protein, that is, having the ability to bind CD3 and 5T4 simultaneously. The bispecific antibody disclosed herein inhibits 5T4-mediated disease or disorders, such as the mantle cell lymphoma or triple negative breast cancer.

[0152] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain protein comprising, from the N-to the  C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a CD3 associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the second binding arm can target a 5T4 associated pathway and comprise an anti-5T4 antibody or antigen binding fragment as described herein. The signal sequences A and B can be the same or different from one another.

[0153] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific antibody that can be generated using well established point mutations in the CH1, CH2, and CH3 domains via controlled Fab arm exchange or via co-expression. In some embodiment, all constructs are symmetric so that there is no preference for the selection of point mutations of the respective parental antibodies.

[0154] In some embodiments of the bispecific antibody disclosed herein, the binding arm that targets CD3 has a binding valency of one. The bispecific antibody is preferably designed to have monovalent CD3-binding (i.e., one Fab arm binding to the epitope of CD3) . Bivalent CD3 binding is linked to excess of activation-induced cell death in effector cells that could limit the efficacy of T cell redirection. In addition, a bivalent CD3 redirection molecule can result in tumor antigen-independent immune effector cell activation that can increase systemic toxicity in the patient. The use of a high affinity of anti-CD3 Fab arm can also increase toxicity. High affinity variants of anti-CD3 Fab or scFv are typically poorly tolerated in cynomolgus monkeys because of resulting extensive cytokine release. High affinity for CD3 also shifted bispecific antibody biodistribution from tumors to CD3 rich tissue that led to increased risk of cytokine release syndrome. Thus, it is highly desirable for the binding affinity of the anti-CD3 arm to be lower than that of anti-5T4 arm. Bivalent anti-CD3 agents can increase avidity in binding to CD3 and could lead to increase in cytokine release syndrome from off-tumor CD3 positive cells.

[0155] In some embodiments of the bispecific antibody disclosed herein, the second binding arm target a 5T4 associated pathway. The bispecific antibody is preferably designed to have monovalent 5T4-binding (i.e., one Fab arm binding to the epitope of 5T4) . The second binding arm targeting a 5T4 associated pathway, such as 5T4, can be monovalent, bivalent, trivalent, tetravalent, etc. For example, there can be a dual or tri or quad epitope recognition for 5T4 in a bispecific antibody to enhance specificity of engagement.

[0156] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein comprises a heavy chain sequence selected from SEQ ID NOs: 1-15, 60 and 64, respectively, and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 16-20, 61 and 65, respectively.

[0157] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein may comprise a first binding arm tarting CD3. For example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a first binding arm comprising an anti-CD3 moiety comprising three heavy chain CDRs and three light chain CDRs selected from the HCDRs and LCDRs provided in Table 2. For another example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a first CD3 binding arm comprising a human IgG1 heavy chain and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 1-15, 60 and 16-20, 61, respectively.

[0158] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein may comprise a second binding arm tarting 5T4. For example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a second 5T4 binding arm comprising a human IgG1 heavy chain and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 64 and 65, respectively.

[0159] The bispecific antibody disclosed herein may further comprise one or more moieties that target one or more other targets disclosed herein to make a trispecific, tetra-specific, etc., antibody. Multispecific ROR1 x CD3 x CD28 antibodies

[0160] In some embodiments, the present disclosure provides a ROR1 x CD3 x CD28 multispecific antibody that targets simultaneously proteins linked to ROR1-associated pathways as well as proteins that can activate the CD3 / CD28 T cell activity. CD3 / CD28 and ROR1 targets have differential expression levels in pathological sites and normal tissues.

[0161] In some embodiments, the present disclosure provides a multispecific antibody that targets human ROR1, CD3, and CD28 simultaneously and is capable of effectively blocking ROR1 at the protein level. The multispecific antibody binds CD3, CD28, and ROR1 proteins and binds to one protein without affecting the binding of the other protein, that is, having the ability to bind CD3, CD28 and ROR1 simultaneously. The multispecific antibody disclosed herein inhibits ROR1-mediated disease or disorders, such as the mantle cell lymphoma or triple negative breast cancer.

[0162] In some embodiments, the present disclosure provides a multispecific antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain fusion protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -one single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof - an optional linker B -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein at least one single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a ROR1 associated pathway and comprise an anti-ROR1 antibody or antigen binding fragment as described herein; and the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a CD3 associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the second binding arm can target a CD28 associated pathway and comprise an anti-CD28 or antigen binding fragment as described herein. The signal sequences A and B can be the same or different from one another.

[0163] In some embodiments, the present disclosure provides a multispecific antibody that can be generated using well established point mutations in the CH1, CH2, and CH3 domains via controlled Fab arm exchange or via co-expression. In some embodiment, all constructs are symmetric so that there is no preference for the selection of point mutations of the respective parental antibodies.

[0164] Figure 8C illustrates several formats of a multispecific antibody disclosed herein. Figure 8C shows multispecific antibodies that have two different sets of heavy chain (HC) and light chain (LC) pairing as a "first arm" (targeting CD3 and ROR1) and a "second arm" (targeting CD28) . Figure 8C shows that the ROR1-CD3 binding arm (first arm) of the multispecific Ab can comprise a human IgG with an HC and an LC, wherein the light chain comprises from the N-terminus to the C-terminus: an LC variable region VL and constant light chain CL, and wherein the heavy chain comprises from the N-terminus to the C-terminus: one single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof, a regular HC variable region VH, a CH1 domain, and an Fc region; and the CD28 binding arm (second arm) of the multispecific Ab can comprise a human IgG with an HC and an LC, wherein the light chain comprises from the N-terminus to the C-terminus: LC variable region VL and constant light chain CL, and wherein the heavy chain comprises from the N-terminus to the C-terminus: an HC variable region VH, a CH1 domain, and an Fc region. As non-limiting examples, the disclosure provides for the "first arm" (targeting CD3 and ROR1) comprising amino acid sequences set forth as SEQ ID NO: 16 in Table 2, and SEQ ID NO: 85 in Table 14.

[0165] In some embodiments of the multispecific antibody disclosed herein, the binding arm that targets CD28 has a binding valency of one. CD28 is a co-stimulatory receptor on T cells that interacts with CD80 and CD86 on antigen-presenting cells (APCs) . This interaction provides a second signal, known as co-stimulation, which is required for optimal T cell activation. CD28 signaling enhances T cell activation, proliferation, and survival by increasing IL-2 production, upregulating anti-apoptotic proteins, promoting T cell survival, influencing T cell differentiation, and increasing expression of activation markers. Overall, CD28 function is crucial for effective T cell signaling and immune response. The multispecific antibody is preferably designed to have monovalent CD28-binding (i.e., one Fab arm binding to the epitope of CD3) . Bivalent CD28 binding is linked to excess of activation-induced cell death in effector cells that could limit the efficacy of T cell redirection. In addition, a bivalent CD28 redirection molecule can result in tumor antigen-independent immune effector cell activation that can increase systemic toxicity in the patient. The use of a high affinity anti-CD28 Fab arm can also increase toxicity. High affinity variants of anti-CD28 Fab or scFv are typically poorly tolerated in cynomolgus monkeys because of resulting extensive cytokine release. High affinity for CD28 also shifted multispecific antibody biodistribution from tumors to CD28 rich tissue that led to increased risk of cytokine release syndrome. Thus, it is highly desirable for the binding affinity of the anti-CD28 arm to be lower than that of anti-ROR1 arm (and / or an arm that targets another TAA if the multispecific antibody comprises such an arm) . Bivalent anti-CD28 agents can increase avidity in binding to CD28 and could lead to an increase in cytokine release syndrome from off-tumor CD3 and CD28 dual positive T cells.

[0166] In some embodiments of the multispecific antibody disclosed herein, the first binding arm comprises one single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof targeting a ROR1 associated pathway. The multispecific antibody is preferably designed to have monovalent ROR1-binding (i.e., one Fab arm binding to the epitope of ROR1) . The single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof of the first binding arm targeting a ROR1 associated pathway, such as ROR1, can be monovalent, bivalent, trivalent, tetravalent, etc. For example, there can be a dual or tri or quad epitope recognition for ROR1 in a multispecific antibody to enhance specificity of engagement.

[0167] In some embodiments, a multispecific antibody disclosed herein comprises a heavy chain sequence selected from SEQ ID NOs: 1-15, 21-24, and 66 and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 16-20, 25-27, and 67, respectively.

[0168] In some embodiments, a multispecific antibody disclosed herein may comprise a first binding arm tarting CD3 and ROR1. For example, a multispecific antibody disclosed herein comprises a first binding arm comprising an anti-CD3 moiety comprising three heavy chain CDRs and three light chain CDRs selected from the HCDRs and LCDRs provided in Table 2. For example, a multispecific antibody disclosed herein comprises a first binding arm comprising a human IgG1 heavy chain and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 1-15 and 16-20, respectively, targeting human CD3; and at least one single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof sequence selected from SEQ ID NOs: 66 and 67, respectively, targeting human ROR1.

[0169] In some embodiments, a multispecific antibody disclosed herein may comprise a second binding arm tarting CD28. For example, a multispecific antibody disclosed herein comprises a second binding arm comprising an anti-CD28 moiety comprising three heavy chain CDRs and three light chain CDRs selected from the HCDRs and LCDRs provided in Table 4. For example, a multispecific antibody disclosed herein comprises a second CD28 binding arm comprising a human IgG1 heavy chain and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 21-24 and 25-27, respectively.

[0170] The multispecific antibody disclosed herein may further comprise one or more moieties that target one or more other targets disclosed in, such as other TAAs. Multispecific ROR1 x CD3 x PD-L1 antibodies

[0171] In some embodiments, the present disclosure provides a ROR1 x CD3 x PD-L1 multispecific antibody that targets simultaneously proteins linked to ROR1-associated pathways, PD-L1-associated pathways as well as proteins that can activate the CD3 T cell activity. ROR1 or PD-L1 targets have differential expression levels in pathological sites and normal tissues.

[0172] In some embodiments, the present disclosure provides a multispecific antibody that targets human ROR1, CD3, and PD-L1 simultaneously and is capable of effectively blocking ROR1 or PD-L1 proteins at the protein level. The multispecific antibody binds CD3, PD-L1, and ROR1 proteins and binds to one protein without affecting the binding of the other proteins, that is, having the ability to bind CD3, PD-L1, and ROR1 simultaneously. The multispecific antibody disclosed herein inhibits ROR1 or PD-L1-mediated disease or disorders, such as the mantle cell lymphoma or triple negative breast cancer.

[0173] In some embodiments, the present disclosure provides a multispecific antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain fusion protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A - one single-chain fragment variable (scFv) or an antigen-binding fragment thereof- an optional linker A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the scFv or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a ROR1-associated pathway and comprise an anti-ROR1 antibody or antigen binding fragment as described herein; and the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a CD3-associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain fusion protein comprising, from  the N-to the C-terminus, an optional signal sequence A -a VHH or an antigen-binding fragment thereof- an optional linker A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the VHH or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a PD-L1-associated pathway and comprise an anti-PD-L1 antibody or antigen binding fragment as described herein; and the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the second binding arm can target a control antibody or antigen binding fragment as described herein, which served as an inert binding fragment. The signal sequences A and B can be the same or different from one another.

[0174] The present disclosure provides a multispecific antibody that can be generated using well established point mutations in the CH1, CH2, and CH3 domains via controlled Fab arm exchange or via co-expression. In some embodiment, all constructs are symmetric so that there is no preference for the selection of point mutations of the respective parental antibodies.

[0175] Figure 9C illustrates several format of a multispecific antibody disclosed herein. Figure 9C shows multispecific antibodies that have two different sets of heavy chain (HC) and light chain (LC) pairing as a "first arm" (targeting CD3 and ROR1) and a "second arm" (targeting PD-L1) . Figure 9C shows that the ROR1-CD3 binding arm (first arm) of the multispecific Ab can comprise a human IgG with an HC and an LC, wherein the light chain comprises from the N-terminus to the C-terminus: LC variable region VL and constant light chain CL, and wherein the heavy chain comprises from the N-terminus to the C-terminus: an scFv or antigen-binding fragment thereof, a regular HC variable region VH, a CH1 domain, and an Fc region; and the PD-L1 binding arm (second arm) of the multispecific Ab can comprise a human IgG with an HC and an LC, wherein the light chain comprises from the N-terminus to the C-terminus: LC variable region VL and constant light chain CL, and wherein the heavy chain fusion comprises from the N-terminus to the C-terminus: one variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereof, a regular HC variable region VH, a CH1 domain, and an Fc region. As non-limiting examples, the disclosure provides for the “first arm” (targeting CD3 and ROR1) comprising amino acid sequences set forth as SEQ ID NO: 16 in Table 2, and SEQ ID NO: 85 in Table 14.

[0176] In some embodiments of the multispecific antibody disclosed herein, the first binding arm comprises one single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof targeting a ROR1 associated pathway The multispecific antibody is preferably designed to have monovalent ROR1-binding (i.e., one Fab arm binding to the epitope of ROR1) . The single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof of the first binding arm targeting a ROR1 associated pathway, such as ROR1, can be monovalent, bivalent, trivalent, tetravalent, etc. For example, there can be a dual or tri or quad epitope recognition for ROR1 in a multispecific antibody to enhance specificity of engagement.

[0177] In some embodiments of the multispecific antibody disclosed herein, the second binding arm comprises a variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereof targeting a PD-L1 associated pathway. The multispecific antibody is preferably designed to have monovalent PD-L1-binding (i.e., one Fab arm binding to the epitope of PD-L1) . The variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereof of the second binding arm targeting an PD-L1 associated pathway, such as PD-L1, can be monovalent, bivalent, trivalent, tetravalent, etc. For example, there can be a dual or tri or quad epitope recognition for PD-L1 in a multispecific antibody to enhance specificity of engagement.

[0178] In some embodiments, a multispecific antibody disclosed herein comprises a heavy chain sequence selected from SEQ ID NOs: 1-15, 31-58 and 66, and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 16-20 and 67, respectively.

[0179] In some embodiments, a multispecific antibody disclosed herein may comprise a first binding arms tarting CD3 and ROR1. For example, a multispecific antibody disclosed herein comprises a first binding arm comprising an anti-CD3 moiety comprising three heavy chain CDRs and three light chain CDRs selected from the HCDRs and LCDRs provided in Table 2. For example, a multispecific antibody disclosed herein comprises a first binding arm comprising a human IgG1 heavy chain and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 1-15 and 16-20, respectively, and targeting human CD3; and at least one single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof sequence selected from SEQ ID NOs: 66 and 67, respectively, and targeting human ROR1;

[0180] In some embodiments, a multispecific antibody disclosed herein may comprise a second binding arms tarting PD-L1. For example, a multispecific antibody disclosed herein comprises a second binding arm comprising an anti-PD-L1 moiety comprising three heavy chain CDRs selected from the HCDRs provided in Table 6. For example, a multispecific antibody disclosed herein comprises a second binding arm comprising at least one variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereofselected from SEQ ID NOs: 31-58 and targeting human PD-L1.

[0181] The multispecific antibody disclosed herein may further comprise one or more moieties that target one or more other targets disclosed in, such as other TAAs. Multispecific EGFR x CD3 x PD-L1 x CD28 antibodies

[0182] In some embodiments, the present disclosure provides an EGFR x CD3 x PD-L1 x CD28 multispecific antibody that targets simultaneously proteins linked to EGFR and PD-L1 associated pathways as well as proteins that can activate the CD3 / CD28 T cell activity. CD3, CD28, EGFR, and PD-L1 targets have differential expression levels in pathological sites and normal tissues.

[0183] In some embodiments, the present disclosure provides a multispecific antibody that targets human EGFR, PD-L1, CD3, and CD28 simultaneously and is capable of effectively blocking EGFR and / or PD-L1 proteins at the protein level. The multispecific antibody binds CD3, CD28, EGFR, and PD-L1 proteins and binds to one protein without affecting the binding of the other proteins, that is, having the ability to bind CD3, CD28, EGFR, and PD-L1 simultaneously. The multispecific antibody disclosed herein inhibits EGFR or PD-L1-mediated disease or disorders, such as the non-small cell lung cancer or triple negative breast cancer.

[0184] In some embodiments, the present disclosure provides a multispecific antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain fusion protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -one variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereof - an optional linker A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein at least one variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a EGFR associated pathway and comprise an anti-EGFR antibody or antigen binding fragment as described herein; and the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the first binding arm can target a CD3 associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -one variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereof - an optional linker A -an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein at least one variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereof of the second binding arm can target a PD-L1 associated pathway and comprise an anti-PD-L1 antibody or antigen binding fragment as described herein; and the IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof and the IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof of the second binding arm can target a CD28 associated pathway and comprise an anti-CD28 or antigen binding fragment as described herein. The signal sequences A and B can be the same or different from one another.

[0185] The present disclosure provides a multispecific antibody that can be generated using well established point mutations in the CH1, CH2, and CH3 domains via controlled Fab arm exchange or via co-expression. In some embodiment, all constructs are symmetric so that there is no preference for the selection of point mutations of the respective parental antibodies.

[0186] Figure 10C illustrate several formats of a multispecific antibody disclosed herein. Figure 10C shows multispecific antibodies that have two different sets of heavy chain (HC) and light chain (LC) pairing as a "first arm" (targeting CD3 and EGFR) and a "second arm" (targeting CD28 and PD-L1) . Figure 10C shows that the EGFR-CD3 binding arm (first arm) of the multispecific Ab can comprise a human IgG with an HC and an LC, wherein the light chain comprises from the N-terminus to the C-terminus: LC variable region VL and constant light chain CL, and wherein the heavy chain fusion comprises from the N-terminus to the C-terminus: one variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereof, a regular HC variable region VH, a CH1 domain, and an Fc region; and the PD-L1-CD28 binding arm (second arm) of the multispecific Ab can comprise a human IgG with an HC and an LC, wherein the light chain comprises from the N-terminus to the C-terminus: LC variable region VL and constant light chain CL, and wherein the heavy chain comprises from the N-terminus to the C-terminus: one variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereof, a regular HC variable region VH, a CH1 domain, and an Fc region. As non-limiting examples, the disclosure provides for the "first arm" (targeting CD3 and EGFR) comprising amino acid sequences set forth as SEQ ID NO: 16 in Table 2, and SEQ ID NOs: 86 and 88 in Table 14; the disclosure provides for the "second arm" (targeting PD-L1 and CD28) comprising amino acid sequences set forth as SEQ ID NO: 26 in Table 3, and SEQ ID NO: 87 in Table 14

[0187] In some embodiments of the multispecific antibody disclosed herein, the binding arm that targets CD28 has a binding valency of one. CD28 is a co-stimulatory receptor on T cells that interacts with CD80 and CD86 on antigen-presenting cells (APCs) . This interaction provides a second signal, known as co-stimulation, which is required for optimal T cell activation. CD28 signaling enhances T cell activation, proliferation, and survival by increasing IL-2 production, upregulating anti-apoptotic proteins, promoting T cell survival, influencing T cell differentiation, and increasing expression of activation markers. Overall, CD28 function is crucial for effective T cell signaling and immune response. The multispecific antibody is preferably designed to have monovalent CD28-binding (i.e., one Fab arm binding to the epitope of CD3) . Bivalent CD28 binding is linked to excess of activation-induced cell death in effector cells that would limit the efficacy of T cell redirection. In addition, a bivalent CD28 redirection molecule can result in tumor antigen-independent immune effector cell activation that can increase systemic toxicity in the patient. The use of a high affinity of anti-CD28 Fab arm can also increase toxicity. High affinity variants of anti-CD28 Fab or scFv are typically poorly tolerated in cynomolgus monkeys because of resulting extensive cytokine release. High affinity for CD28 also shifted multispecific antibody biodistribution from tumors to CD28 rich tissue that led to increased risk of cytokine release syndrome. Thus, it is highly desirable for the binding affinity of the anti-CD28 arm to be lower than that of anti-EGFR arm. Bivalent anti-CD28 agents can increase avidity in binding to CD28 and could lead to an increase in cytokine release syndrome from off-tumor CD3 and CD28 dual positive T cells.

[0188] In some embodiments of the multispecific antibody disclosed herein, the first binding arm comprises variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereof targeting an EGFR associated pathway. The multispecific antibody is preferably designed to have monovalent EGFR-binding (i.e., one Fab arm binding to the epitope of EGFR) . The variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereof of the first binding arm targeting an EGFR associated pathway, such as EGFR, can be monovalent, bivalent, trivalent, tetravalent, etc. For example, there can be a dual or tri or quad epitope recognition for EGFR in a multispecific antibody to enhance specificity of engagement.

[0189] In some embodiments of the multispecific antibody disclosed herein, the second binding arm comprises a variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereof targeting a PD-L1 associated pathway. The multispecific antibody is preferably designed to have monovalent PD-L1-binding (i.e., one Fab arm binding to the epitope of PD-L1) . The variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereof of the second binding arm targeting an PD-L1 associated pathway, such as PD-L1, can be monovalent, bivalent, trivalent, tetravalent, etc. For example, there can be a dual or tri or quad epitope recognition for PD-L1 in a multispecific antibody to enhance specificity of engagement.

[0190] In some embodiments, a multispecific antibody disclosed herein comprises a heavy chain sequence selected from SEQ ID NOs: 1-15, 21-24, 31-58 and 59, 68, and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 16-20 and 25-27, respectively.

[0191] In some embodiments, a multispecific antibody disclosed herein may comprise a first binding arms tarting CD3 and EGFR. For example, a multispecific antibody disclosed herein comprises a first binding arm comprising an anti-CD3 moiety comprising three heavy chain CDRs and three light chain CDRs selected from the HCDRs and LCDRs provided in Table 2. For example, a multispecific antibody disclosed herein comprises a first binding arm comprising a human IgG1 heavy chain and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 1-15 and 16-20, respectively, targeting human CD3; and at least one variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereof sequence selected from SEQ ID NOs: 59 and 68, targeting human EGFR.

[0192] In some embodiments, a multispecific antibody disclosed herein may comprise a second binding arms tarting CD28 and PD-L1. For example, a multispecific antibody disclosed herein comprises a second binding arm comprising an anti-CD28 moiety comprising three heavy chain CDRs and three light chain CDRs selected from the HCDRs and LCDRs provided in Table 4. For example, a multispecific antibody disclosed herein comprises a second binding arm comprising an anti-PD-L1 moiety comprising three heavy chain CDRs selected from the HCDRs provided in Table 6. For example, a multispecific antibody disclosed herein comprises a second binding arm comprising a human IgG1 heavy chain and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 21-24 and 25-27, respectively, targeting human CD28; and at least one variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereof sequence selected from SEQ ID NOs: 31-58, targeting human PD-L1.

[0193] The multispecific antibody disclosed herein may further comprise one or more moieties that target one or more other targets disclosed in, such as other TAAs. Table 8. Variable Region Sequences of benchmark antibodies Table 9. Benchmark antibodies Table 10. Sequences of Fc Leader Sequences

[0194] In certain embodiments, a leader peptide is chosen to drive the secretion of the antibody described in this disclosure into the cell culture supernatant as a secreted respective parental antibody protein. Any leader peptide for any known secreted proteins  / peptides can be used.

[0195] As used herein, a “leader peptide” or “signal peptide” or “leader sequence” includes a short peptide, usually 16-30 amino acids in length, that is present at the N-terminus of most of newly synthesized proteins that are destined towards the secretory pathway. Although lead peptides are extremely heterogeneous in sequence, and many prokaryotic and eukaryotic lead peptides are functionally interchangeable even between different species, the efficiency of protein secretion may be strongly determined by the sequence of the lead  / signal peptide.

[0196] In certain embodiments, the leader peptide is from a protein residing either inside certain organelles (such as the endoplasmic reticulum, Golgi, or endosomes) , secreted from the cell, or inserted into most cellular membranes may be used.

[0197] In certain embodiments, the leader peptide is from a eukaryotic protein.

[0198] In certain embodiments, the leader peptide is from a secreted protein, e.g., a protein secreted outside a cell.

[0199] In certain embodiments, the leader peptide is from a transmembrane protein.

[0200] In certain embodiments, the leader peptide contains a stretch of amino acids that is recognized and cleaved by a signal peptidase.

[0201] In certain embodiments, the leader peptide does not contain a cleavage recognition sequence of a signal peptidase.

[0202] In certain embodiments, the leader peptide is a signal peptide for tissue plasminogen activator (tPA) , herpes simplex virus glycoprotein D (HSV gD) , a growth hormone, a cytokine, a lipoprotein export signal, CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB or GM-CSFR, or S. cerevisiae mating factor α-1 signal peptide.

[0203] In some embodiments, a leader sequence as described herein may be a mammalian CD4 or CD8 leader sequence, including but not limited to, e.g., a human CD4 or CD8 leader sequence, a non-human primate CD4 or CD8 leader sequence, a rodent CD4 or CD8 leader sequence, and the like. In some embodiments, a CD4 or CD8 leader comprises an amino acid sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%, amino acid sequence identity with the human CD4 or CD8 leader sequences. IgG Fc of antibody

[0204] The antibodies disclosed herein, such as the anti-CD3, anti-CD28, anti-EGFR, anti-PD-L1, anti-ROR1, anti-5T4, ROR1 x CD3, 5T4 x CD3, ROR1 x CD3 x CD28, ROR1 x CD3 x PD-L1, and EGFR x CD3 x CD28 x PD-L1 antibodies disclosed herein, may comprise a modified Fc region, wherein the modified Fc region comprises at least one amino acid modification relative to a native Fc region, for example, to extend the half-life of the antibodies, enhance resistance of the antibodies to proteolytic degradation, reduce effector functionality of the antibodies, facilitate generation of the bispecific or multispecific antibodies by Fc heterodimerization, facilitate the multimerization of the bispecific or multispecific, and / or improve manufacturing and drug stability of the bispecific or multispecific antibodies.

[0205] In some embodiments, the Fc domain is altered to allow for silencing of the Fc domain to minimize effector function activity which can cause immune cell depletion and cytokine release syndrome.

[0206] In some embodiments, the anti-CD3, anti-CD28, anti-EGFR, anti-PD-L1, anti-ROR1, anti-5T4, ROR1 x CD3, 5T4 x CD3, ROR1 x CD3 x CD28, ROR1 x CD3 x PD-L1, and EGFR x CD3 x CD28 x PD-L1 antibodies as described herein are provided with a modified Fc region wherein a naturally occurring Fc region is modified to extend the half-life of the antibody when compared to the parental native antibody in a biological environment, for example, the serum half-life or a half-life measured by an in vitro assay. Exemplary mutations that may be made singularly or in combination are T250Q, M252Y, I253A, S254T, T256E, P2571, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A, and H435R mutations.

[0207] The present antibody or multispecific antibody may comprise with an IgG Fc domain comprising an amino acid sequence having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%, amino acid sequence identity to an IgG1 Fc sequence as SEQ ID NO: 69.

[0208] The present anti-CD3, anti-CD28, anti-EGFR, anti-PD-L1, anti-ROR1, anti-5T4, ROR1 x CD3, 5T4 x CD3, ROR1 x CD3 x CD28, ROR1 x CD3 x PD-L1, and EGFR x CD3 x CD28 x PD-L1 antibodies may comprise an IgG Fc domain comprising an amino acid sequence having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%, amino acid sequence identity to an IgG2 Fc sequence as SEQ ID NO: 70.

[0209] The present anti-CD3, anti-CD28, anti-EGFR, anti-PD-L1, anti-ROR1, anti-5T4, ROR1 x CD3, 5T4 x CD3, ROR1 x CD3 x CD28, ROR1 x CD3 x PD-L1, and EGFR x CD3 x CD28 x PD-L1 antibodies may comprise an IgG Fc domain comprising an amino acid sequence having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%, amino acid sequence identity to an IgG3 Fc sequence as SEQ ID NO: 71.

[0210] The present anti-CD3, anti-CD28, anti-EGFR, anti-PD-L1, anti-ROR1, anti-5T4, ROR1 x CD3, 5T4 x CD3, ROR1 x CD3 x CD28, ROR1 x CD3 x PD-L1, and EGFR x CD3 x CD28 x PD-L1 antibodies may comprise an IgG Fc domain comprising an amino acid sequence having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%, amino acid sequence identity to an IgG4 Fc sequence as SEQ ID NO: 72.

[0211] A S228P mutation may be made into IgG4 antibodies to enhance IgG4 stability.

[0212] The present anti-CD3, anti-CD28, anti-EGFR, anti-PD-L1, anti-ROR1, anti-5T4, ROR1 x CD3, 5T4 x CD3, ROR1 x CD3 x CD28, ROR1 x CD3 x PD-L1, and EGFR x CD3 x CD28 x PD-L1 antibodies may comprise a modified Fc region, wherein the modified Fc region comprises at least one amino acid modification relative to a native Fc region. In some embodiments, the present anti-CD3, anti-CD28, anti-EGFR, anti-PD-L1, anti-ROR1, anti-5T4, ROR1 x CD3, 5T4 x CD3, ROR1 x CD3 x CD28, ROR1 x CD3 x PD-L1, EGFR x CD3 x CD28 x PD-L1 antibodies are provided with a modified Fc region where a naturally-occurring Fc region is modified to extend the half-life of the antibody when compared to the parental native antibody in a biological environment, for example, the serum half-life or a half-life measured by an in vitro assay. Exemplary mutations that may be made singularly or in combination are T250Q, M252Y, I253A, S254T, T256E, P257I, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A and H435R mutations.

[0213] In certain embodiments, the extension of half-life can be realized by engineering the M252Y / S254T / T256E mutations, collectively designated as YTE mutations, in IgG1 Fc as shown in SEQ ID NO: 75, numbering according to the EU Index (W.F. Dall'Acqua et al., 2006) .

[0214] In certain embodiments, the extension of half-life can also be realized by engineering the M428L / N434S mutations, collectively designated as LS mutations, collectively designated as LS mutations, in IgG1 Fc as shown in SEQ ID NO: 76 (J. Zalevsky et al., 2010) .

[0215] In certain embodiments, the extension of half-life can also be realized by engineering the T250Q / M428L mutations in IgG1 Fc (P.R. Hinton et al., 2006) .

[0216] In certain embodiments, the extension of half-life can also be realized by engineering the N434A mutations in IgG1 Fc (R.L. Shields et al., 2001) .

[0217] In certain embodiments, the extension of half-life can also be realized by engineering the T307A / E380A / N434A mutations in IgG1 Fc (S.B. Petkova et al., 2006) .

[0218] The effect of Fc engineering on the extension of antibody half-life can be evaluated in PK studies in mice relative to antibodies with native IgG Fc.

[0219] In some embodiments, the present anti-CD3, anti-CD28, anti-EGFR, anti-PD-L1, anti-ROR1, anti-5T4, ROR1 x CD3, 5T4 x CD3, ROR1 x CD3 x CD28, ROR1 x CD3 x PD-L1, and EGFR x CD3 x CD28 x PD-L1 antibodies are provided with a modified Fc region where a naturally-occurring Fc region is modified to enhance antibody resistance to proteolytic degradation by a protease that cleaves the wild-type antibody between or at residues 222-237 (EU numbering) .

[0220] In certain embodiments, the resistance to proteolytic degradation can be realized by engineering E233P / L234A / L235A mutations in the hinge region with G236 deleted when compared to a parental native antibody, as shown in SEQ ID NO: 77, residue numbering according to the EU Index (M. Kinder et al., 2013) .

[0221] In instances where effector functionality is to be enhanced, the antibodies of the disclosure may be engineered to introduce at least one mutation in the antibody Fc that increases the binding of the antibody to an activating Fcγ receptor (FcγR) and / or increases Fc effector functions such as C1q binding, complement dependent cytotoxicity (CDC) , antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or phagocytosis (ADCP) . Such modifications can comprise low or null Fc fucosylation, and / or engineering of Fc mutations such as S239E / I332E / A330L, S239D / I332E / A330L, S239D / I332E, S239D, I332E, and S298A / E333A / K334A.

[0222] In certain embodiments, the enhancement of effector functions can be realized by engineering F243L / R292P / Y300L / V305I / P396L mutations, collectively designated as LPLIL mutations, when compared to a parental native antibody, as shown in SEQ ID NO: 78, residue numbering according to the EU Index (J.B. Stavenhagen et al., 2008) .

[0223] In certain embodiments, the enhancement of the effector functions can be realized by engineering E345R as shown in SEQ ID NO: 79 or other Fc clustering mutations on the multispecific antibodies using residue numbering according to the EU Index.

[0224] In certain embodiments, the enhancement of effector functions can be realized by engineering F243L / R292P / Y300L / V305I / P396L mutations, collectively designated as LPLIL mutations, and E345R mutation when compared to a parental native antibody, as shown in SEQ ID NO: 80, residue numbering according to the EU Index.

[0225] In instances where effector functionality is not desired, the antibodies of the disclosure may be engineered to introduce at least one mutation in the antibody Fc that reduces binding of the antibody to an activating Fcγ receptor (FcγR) and / or reduces Fc effector functions such as C1q binding, complement dependent cytotoxicity (CDC) , antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or phagocytosis (ADCP) .

[0226] Fc positions that may be mutated to reduce binding of the antibody to the activating FcγR and subsequently to reduce effector functions include those described for example in. (S. Bolt et al., 1993; S.Y. Chu et al., 2008; R.L. Shields et al., 2001; O. Vafa et al., 2014; D. Xu et al., 2000) .

[0227] Exemplary mutations that may be made singularly or in combination are K214T, E233P, L234V, L234A, deletion of G236, V234A, F234A, L235A, G237A, P238A, P238S, D265A, S267E, H268A, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, P329A, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, A330S and P331S mutations on an IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 framework.

[0228] Exemplary combination mutations that may be made to reduce ADCC are L234A / L235A on IgG1, V234A / G237A / P238S / H268A / V309L / A330S  / P331S on IgG2, F234A / L235A on IgG4, S228P / F234A / L235A on IgG4, N297A on IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, V234A / G237A on IgG2, K214T / E233P / L234V / L235A / G236-deleted / A327G / P331A / D365E / L358M on IgG1, H268Q / V309L / A330S / P331S on IgG2, S267E / L328F on IgG1, L234F / L235E / D265A on IgG1, L234A / L235A / G237A / P238S  / H268A / A330S / P331S on IgG1, S228P / F234A / L235A / G237A / P238S on IgG4, and S228P / F234A / L235A / G236-deleted / G237A / P238S on IgG4. Hybrid IgG2 / 4 Fc domains may also be used, such as Fc with residues 117-260 from IgG2 and residues 261-447 from IgG4.

[0229] In certain embodiments, the reduction of effector functions can be realized by engineering L234A / L235A mutations, collectively designated as AA mutations, when compared to a parental native antibody, as shown in SEQ ID NO: 81, residue numbering according to the EU Index.

[0230] In certain embodiments, the reduction of effector functions can be realized by engineering L234F / L235E / D265A mutations, collectively designated as FEA mutations, when compared to a parental native antibody, as shown in SEQ ID NO: 82, residue numbering according to the EU Index.

[0231] In some embodiments, the anti-CD3, anti-CD28, anti-EGFR, anti-PD-L1, anti-ROR1, anti-5T4, ROR1 x CD3, 5T4 x CD3, ROR1 x CD3 x CD28, ROR1 x CD3 x PD-L1, and EGFR x CD3 x CD28 x PD-L1 antibodies are provided with a modified Fc region where a naturally-occurring Fc region is modified to facilitate the generation of multispecific antibody by Fc heterodimerization.

[0232] In certain embodiments, the Fc heterodimerization can be realized by engineering F405L (as SEQ ID NO: 83) and K409R (as SEQ ID NO: 84) mutations on two parental antibodies and the generation of a multispecific antibody in a process known as Fab arm exchange (A.F. Labrijn et al., 2014) .

[0233] In certain embodiments, the Fc heterodimerization can also be realized by Fc mutations to facilitate Knob-in-Hole strategy (see, e.g., Intl. Publ. No. WO 2006 / 028936) . An amino acid with a small side chain (hole) is introduced into one Fc domain and an amino acid with a large side chain (knob) is introduced into the other Fc domain. After co-expression of the two heavy chains, a heterodimer is formed as a result of the preferential interaction of the heavy chain with a “hole” with the heavy chain with a “knob” (J.B. Ridgway et al., 1996) . Exemplary Fc mutation pairs forming a knob and a hole include: T366Y / F405A, T366W / F405W, F405W / Y407A, T394W / Y407T, T394S / Y407A, T366W / T394S, F405W / T394S and T366W / T366S / L368A / Y407V.

[0234] In certain embodiments, the Fc heterodimerization can be realized by engineering T366W and T366S / L368A / Y407V mutations on two parental antibodies and the generation of a multispecific antibody by co-expression or by a process known as Fab arm exchange.

[0235] In certain embodiments, the Fc heterodimerization can also be realized by Fc mutations to facilitate the electrostatically-matched interactions strategy (K. Gunasekaran et al., 2010) . Mutations can be engineered to generate positively charged residues at one Fc domain and negatively charged residues at the other Fc domain as described in US Patent Publ. No. US2010 / 0015133; US Patent Publ. No. US2009 / 0182127; US Patent Publ. No. US2010 / 028637 or US Patent Publ. No. US2011 / 0123532. Heavy chain heterodimerization can be formed by electrostatically-matched interactions between two mutated Fc.

[0236] In some embodiments, the present anti-CD3, anti-CD28, anti-EGFR, anti-PD-L1, anti-ROR1, anti-5T4, ROR1 x CD3, 5T4 x CD3, ROR1 x CD3 x CD28, ROR1 x CD3 x PD-L1, and EGFR x CD3 x CD28 x PD-L1 antibodies are provided with a modified Fc region where a naturally-occurring Fc region is modified to facilitate the multimerization of the antibody upon interaction with cell surface receptors, although such engineered antibody can exist as a monomer in solution. The Fc mutations that facilitate antibody multimerization include, but not limited to, E345R mutation, E430G mutation, E345R / E430G mutations, E345R / E430G / Y440R mutations as described in Complement is activated by IgG hexamers assembled at the cell surface (C.A. Diebolder et al., 2014) . Such mutations may also include, but not limited to, T437R mutation, T437R / K248E mutations, T437R / K338A mutations as described in (D. Zhang et al., 2017) . Antibodies of the disclosure may have amino acid substitutions in the Fc region that improve  manufacturing and drug stability. An example for IgG1 is H224S (or H224Q) in the hinge 221-DKTHTC-226 (EU numbering) which blocks radically induced cleavage; and for IgG4, the S228P mutation blocks half-antibody exchange.

[0237] Antibodies of the disclosure further comprising conservative modifications are within the scope of the disclosure. “Conservative modifications” refer to amino acid modifications that do not significantly affect or alter the binding characteristics of the antibody containing the amino acid sequences. Conservative modifications include amino acid substitutions, additions and deletions. Conservative substitutions are those in which the amino acid is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. The families of amino acid residues having similar side chains are well defined and include amino acids with acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid) , basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine) , nonpolar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine) , uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine, tyrosine, tryptophan) , aromatic side chains (e.g., phenylalanine, tryptophan, histidine, tyrosine) , aliphatic side chains (e.g., glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine) , amide (e.g., asparagine, glutamine) , beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) and sulfur-containing side chains (cysteine, methionine) . Furthermore, any native residue in the polypeptide may also be substituted with alanine, as has been previously described for alanine scanning mutagenesis. Amino acid substitutions to the antibodies of the disclosure may be made by known methods for example by PCR mutagenesis (US Disclosure No. 4,683,195) . Alternatively, libraries of variants may be generated for example using random (NNK) or non-random codons, for example DVK codons, which encode 11 amino acids (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp) . The resulting antibody variants may be tested for their characteristics using assays described herein.

[0238] The antibodies of the disclosure may be post-translationally modified by processes such as glycosylation, isomerization, deglycosylation or non-naturally occurring covalent modification such as the addition of polyethylene glycol moieties (pegylation) and lipidation. Such modifications may occur in vivo or in vitro. For example, the antibodies of the disclosure may be conjugated to polyethylene glycol (PEGylated) to improve their pharmacokinetic profiles. Conjugation may be carried out by techniques known to those skilled in the art. Conjugation of therapeutic antibodies with PEG has been shown to enhance pharmacodynamics while not interfering with function.

[0239] Antibodies of the disclosure may be modified to improve stability, selectivity, cross-reactivity, affinity, immunogenicity or other desirable biological or biophysical property are within the scope of the disclosure. Stability of an antibody is influenced by a number of factors, including (1) core packing of individual domains that affects their intrinsic stability, (2) protein / protein interface interactions that have impact upon the HC and LC pairing, (B.K. McNeil et al. ) burial of polar and charged residues, (4) H-bonding network for polar and charged residues; and / or (5) surface charge and polar residue distribution among other intra-and inter-molecular forces (A.  et al., 2001) Potential structure destabilizing residues may be identified based upon the crystal structure of the antibody or by molecular modelling in certain cases, and the effect of the residues on antibody stability may be tested by generating and evaluating variants harboring mutations in the identified residues. One of the ways to increase antibody stability is to raise the thermal transition midpoint (Tm) as measured by differential scanning calorimetry (D.R. Spigel et al. ) . In general, the protein Tm is correlated with its stability and inversely correlated with its susceptibility to unfolding and denaturation in solution and the degradation processes that depend on the tendency of the protein to unfold. A number of studies have found correlation between the ranking of the physical stability of formulations measured as thermal stability by DSC and physical stability measured by other methods. Formulation studies suggest that a Fab Tm has implication for long-term physical stability of a corresponding mAb. Expression and purification of antibodies

[0240] The antibodies of the disclosure can be encoded by one or more nucleic acids for protein expression. For example, a ROR1xCD3 bispecific antibody of the present disclosure can be encoded by a single nucleic acid (e.g., a single nucleic acid comprising nucleotide sequences that encode the light and heavy chain polypeptides of the antibody) , or by two or more separate nucleic acids, each of which encodes a different part of the parental antibody.

[0241] The appropriate recombinant DNA is prepared by the DNA recombination techniques and then transfected into mammalian cells, the corresponding anti-CD3, anti-CD28, anti-ROR1, anti-5T4, anti-ROR1 x CD3, anti-EGFR x CD3, anti-PD-L1 x CD28 antibodies are expressed, purified, identified, and / or screened.

[0242] A multispecific antibody can be generated using the controlled Fab arm exchange or other bispecific antibody generation process to produce a multispecific antibody which shows biological effects of simultaneous binding to corresponding antigens. For example, a ROR1xCD3 bispecific antibody can be generated from anti-ROR1 and anti-CD3 antibodies, or ROR1xCD3xCD28 multispecific antibodies can be generated from anti-ROR1xCD3 and anti-CD28 antibodies using the controlled Fab arm exchange or other bispecific antibody generation process. Binding affinities and blocking efficiencies of multispecific antibodies can be identified through in vitro experiments.

[0243] The nucleic acids described herein can be inserted into vectors, e.g., nucleic acid expression vectors and / or targeting vectors. Such vectors can be used in various ways, e.g., for the expression of an antibody described herein in a cell or transgenic animal. Vectors are typically selected to be functional in the host cell in which the vector will be used. A nucleic acid molecule encoding an antibody described herein may be amplified  / expressed in prokaryotic, yeast, insect (baculovirus systems) and / or eukaryotic host cells. Selection of the host cell will depend in part on whether the antibodies disclosed herein, such as a ROR1xCD3 bispecific antibody described herein, is to be post-translationally modified (e.g., glycosylated and / or phosphorylated) . If so, yeast, insect, or mammalian host cells are preferable. Expression vectors typically contain one or more of the following components: a promoter, one or more enhancer sequences, an origin of replication, a transcriptional termination sequence, a complete intron sequence containing a donor and acceptor splice site, a leader sequence for secretion, a ribosome binding site, a polyadenylation sequence, a polylinker region for inserting the nucleic acid encoding the polypeptide to be expressed, and a selectable marker element.

[0244] In some embodiments, a leader or signal sequence is engineered at the N-terminus of the antibodies, e.g., a ROR1xCD3 bispecific antibody, described herein to guide its secretion. For instance, the secretion of the ROR1xCD3 bispecific antibody from a host cell will result in the removal of the signal peptide from the antibody. Thus, the mature ROR1xCD3 bispecific antibody will lack any leader or signal sequence. In some embodiments, such as where glycosylation is desired in a eukaryotic host cell expression system, one may manipulate the various presequences to improve glycosylation or yield. For example, one may alter the peptidase cleavage site of a signal peptide, or add presequences, which may also affect glycosylation.

[0245] The disclosure further provides a cell (e.g., an isolated or purified cell) comprising a nucleic acid or vector of the disclosure. The cell can be any type of cell capable of being transformed with the nucleic acid or vector of the disclosure so as to produce a polypeptide encoded thereby. For example, to express the ROR1xCD3 antibody described herein, DNAs encoding partial or full-length light and heavy chains, obtained as described above, are inserted into expression vectors such that the genes are operatively linked to transcriptional and translational control sequences.

[0246] Methods of introducing nucleic acids and vectors into isolated cells and the culture and selection of transformed host cells in vitro are known in the art and include, e.g., the use of calcium chloride-mediated transformation, transduction, conjugation, triparental mating, DEAE, dextran-mediated transfection, infection, membrane fusion with liposomes, high velocity bombardment with DNA-coated microprojectiles, direct microinjection into single cells, and electroporation.

[0247] After introducing the nucleic acid or vector of the disclosure into the cell, the cell is cultured under conditions suitable for expression of the encoded sequence. The antibody or antigen binding fragment then can be isolated from the cell.

[0248] In certain embodiments, two or more vectors that together encode the antibodies described herein, e.g., the anti-CD3, anti-CD28, anti-ROR1, anti-5T4, anti-ROR1 x CD3, anti-EGFR x CD3, anti-PD-L1 x CD28 antibodies described herein, can be introduced into the cell.

[0249] Purification of an antibody, e.g., a ROR1 x CD3 bispecific antibody, described herein, which is secreted into the cell media, can be accomplished using a variety of techniques including affinity, immunoaffinity or ion exchange chromatography, molecular sieve chromatography, preparative gel electrophoresis or isoelectric focusing, chromatofocusing, and high-pressure liquid chromatography. For example, antibodies comprising an Fc region may be purified by affinity chromatography with Protein A, which selectively binds the Fc region. Modified forms of the antibodies, such as a ROR1xCD3 bispecific antibody, may be prepared with affinity tags, such as hexahistidine or other small peptide such as FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn. ) or Myc (Invitrogen) at either its carboxyl or amino terminus and purified by a one-step affinity column. For example, Poly histidine binds with great affinity and specificity to nickel, thus an affinity column of nickel (such as the nickel columns) can be used for purification of Poly histidine-tagged selective binding agents. In some instances, more than one purification step may be employed. Target binding and functional activity of anti-CD3 anti-CD28 and anti-PD-L1

[0250] In vitro binding and cell-based assays are well described in the art for use in determining the anti-CD3 antibodies, anti-CD28 antibodies and anti-PD-L1 antibodies of the present disclosure in binding to its corresponding antigens. For example, the binding of an antibody may be determined by ELISA by immobilizing a recombinant or purified antigen, sequestering the antibody with the immobilized antigen and determining the amount of bound antibody. This can also be performed using a surface plasmon resonance or biolayer interferometry instrument for kinetic analysis of binding interactions. For cell-based binding assay, the binding of antibody may be determined by flow cytometry by incubating the antibody with cells expressing the antigen on the cell surface and determining the amount of the antibody bound to the cell surface antigen.

[0251] In vitro and cell-based functional assays are well described in the art for use in determining the functional activities of the antibodies described herein, e.g., the anti-CD3 antibodies, anti-CD28 antibodies, and anti-PD-L1 antibodies as monospecific, or bispecific, trispecific, or tetra specific antibodies pairing with different TAAs of the present disclosure. For example, the effects of these antibodies described herein based on CD3 mediated T cell activation can be assessed by reporter-based cell assays, T cell activation and proliferation assays, and T cell mediated cytotoxicity assays.

[0252] Besides in vitro functional activity, animal models and ex vivo functional assays are well described in the art for use in determining the in vivo efficacy of antibodies described herein, e.g., the anti-CD3 antibodies, anti-CD28 antibodies and anti-PD-L1 antibodies as monospecific, or bispecific, trispecific or tetra specific antibodies pairing with different TAAs of the present disclosure. The anti-tumor efficacy of the antibodies described herein can be assessed by xenograft mouse models with human tumor cell lines and patient derived primary tumor cells. The anti-tumor efficacy of antibodies described herein can also be assessed in xenograft models along with the reconstitution of human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) in immunodeficient mice. Pharmaceutical Compositions

[0253] The antibodies described herein, e.g., a multispecific antibody comprising anti-CD3, anti-CD28 and / or anti-PD-L1, can be formulated in compositions, especially pharmaceutical compositions, for use in the methods described herein. Such compositions comprise a therapeutically or prophylactically effective amount of the antibody described in this disclosure in mixture with a suitable carrier, e.g., a pharmaceutically acceptable agent. Typically, the antibody described in this disclosure is sufficiently purified for administration to an animal before formulation in a pharmaceutical composition.

[0254] Pharmaceutically acceptable agents include carriers, excipients, diluents, antioxidants, preservatives, coloring, flavoring and diluting agents, emulsifying agents, suspending agents, solvents, fillers, bulking agents, buffers, delivery vehicles, tonicity agents, cosolvents, wetting agents, complexing agents, buffering agents, antimicrobials, and surfactants.

[0255] Pharmaceutical compositions can be in a liquid form or in a lyophilized or freeze-dried form and may include one or more lyoprotectants, excipients, surfactants, high molecular weight structural additives, and / or bulking agents.

[0256] Pharmaceutical compositions can be prepared to be suitable for parenteral administration. Exemplary compositions are suitable for injection or infusion into an animal by any route available to the skilled worker, such as intraarticular, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral (intraparenchymal) , intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intralesional, intrarectal, transdermal, oral, and inhaled routes.

[0257] Pharmaceutical compositions described herein can be formulated for controlled or sustained delivery in a manner that provides local concentration of the product (e.g., bolus, depot effect) , sustained release, and / or increased stability or half-life in a particular local environment. Methods of Use

[0258] The antibodies described herein, e.g., a multispecific antibody comprising anti-CD3, anti-CD28 and / or anti-PD-L1 antibody described herein, is useful for the treatment or prevention of cancers, such as breast, ovarian, gastric, lung, pancreatic, and other cancers.

[0259] The disclosure also provides use of antibodies described herein, e.g., anti-CD3, anti-CD28 and PD-L1 antibodies or a composition comprising anti-CD3, anti-CD28 and PD-L1 antibodies of the present disclosure in the manufacture of a medicament for treating or preventing a disease or condition, e.g., cancer, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the antibodies or the composition.

[0260] The disclosure also provides the antibodies described herein, e.g., anti-CD3, anti-CD28 and PD-L1 antibodies or a composition comprising anti-CD3, anti-CD28 and PD-L1 antibodies of the present disclosure for use in a method of treating or preventing a disease or condition, e.g., cancer, in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the antibodies or the composition.

[0261] All combinations of the various elements described herein are within the scope of the disclosure unless otherwise indicated herein or otherwise clearly contradicted by context.

[0262] This disclosure will be better understood from the following Experimental Details. However, one skilled in the art will readily appreciate that the specific methods and results discussed are merely illustrative of the disclosure.

[0263] Example 1: Expression and purification of anti-CD3, anti-CD28, anti-PD-L1 monospecific antibodies and multispecific antibodies comprising anti-CD3, anti-CD28, anti-PD-L1

[0264] For each monospecific antibody of the huSP34 variants, plasmids encoding heavy chains and light chains were co-transfected into Expi293F cells following the transfection kit instructions (Thermo Scientific) . Cells were spun down five days post transfection, and the supernatant are passed through a 0.2μm filter. The purifications of the supernatants were conducted by affinity chromatography over protein A agarose columns (GE Healthcare Life Sciences) . The purified monospecific antibody was buffer exchanged into DPBS, pH7.2 by dialysis, and protein concentrations were determined by UV absorbance at 280 nm. Variants of anti-CD28, anti-PD-L1, anti-TAA, or anti-CD3-TAA monospecific antibodies were prepared and purified in a similar way.

[0265] Example 2: Characterization of anti-CD3 antibodies

[0266] Biotin labeled human recombinant CD3 protein, consisting of CD3 epsilon and CD3 delta chains, was bound to a streptavidin coated ELISA plate to capture the test antibodies on the solid phase. Varying concentrations of the tested anti-CD3 antibodies (huSP34 variants) were then added to the coated plates and the bound antibodies were detected and quantified using standard ELISA protocols. The results, shown in Table 11 and Figure 1A, demonstrated the ability of these anti-CD3 antibodies to bind to the intended human CD3 target. The antibodies display a range of affinities for the antigen in this assay format. This range of affinities is valuable since different CD3 affinities may be ideal in disease specific applications or in specific pairings with other antibodies in a multispecific (e.g., bispecific) format.

[0267] Biotin labeled cynomolgus monkey recombinant CD3 protein, consisting of CD3 epsilon and CD3 delta chains, was bound to a streptavidin coated ELISA plate to capture the test antibodies on the solid phase. Varying concentrations of the tested anti-CD3 antibodies (huSP34 variants) was then added to the coated plates and the bound antibodies were detected and quantified using standard ELISA protocols. The results, shown in Table 11 and Figure 1B, demonstrated the ability of these anti-CD3 species to bind and cross react with cynomolgus monkey CD3 protein in addition to their demonstrated binding to the human CD3 protein. The ability to also bind the cynomolgus monkey CD3 protein is an important property enabling for drug development since it can facilitate the use of these animals for toxicology and other needed studies for these antibodies and especially for multispecific (e.g., bispecific) antibodies that contain them. Table 11. ELISA binding of the anti-CD3 variants

[0268] Binding affinities of anti-CD3 antibodies were determined via bio-layer interferometry (BLI, Octet) . The anti-CD3 antibodies tested in this example were bivalent monospecific binder to CD3. Antibodies were captured on AHC2 Biosensors. Various concentration of soluble human CD3E&D with his-tag were used as analyte. The antibody-analyte association and dissociation were performed in kinetics buffer (1×PBS, pH 7.4, with 0.05%Tween-20, 0.1%BSA) at 27℃. Kinetic association (ka) and dissociation (kd) rate constants were determined by fitting the association and dissociation-time curves. Binding dissociation equilibrium constants (KD) were calculated from the kinetic rate constants as: KD (M) = kdis  / ka

[0269] The results, shown in Table 12, demonstrated the affinity of these anti-CD3 antibodies to bind to the intended human CD3 target. The antibodies display a range of affinities for the antigen in this assay format. This range of affinities is valuable since different CD3 affinities may be ideal in disease specific applications or in specific pairings with other antibodies in a multispecific (e.g., bispecific) format. Table 12. Affinity of anti-CD3 variants KD is the dissociation constant, ka is the kinetic association rate constant, kdis is the  kinetic dissociation rate constant.

[0270] The binding titration of anti-CD3 antibodies to primary human PBMC containing CD3 positive T cells were measured by flow cytometric analysis. Antibodies were incubated with pan T cells isolated from PBMCs for 1 hour at 4 ℃, followed by detection with Alexa Fluor 647-labeled anti-human IgG antibody for an additional 30 minutes, and then cells were analyzed by flow cytometry on Beckman Cytoflex. The results are shown in Figure 2. These data demonstrated that the tested anti-CD3 antibodies are capable of binding to the human CD3 protein as it is natively presented on the surface of the intended target T cells in addition to their demonstrated ability to bind to isolated recombinant protein. Hence, the CD3 antibodies demonstrated both antigen and cell binding capabilities.

[0271] Example 3: Characterization of anti-CD28 antibodies

[0272] Biotin labeled human / cynomolgus (the amino acid sequence of human, cynomolgus and rhesus macaque CD28 are the same) recombinant CD28 protein, was bound to a streptavidin coated ELISA plate to capture the test antibodies on the solid phase. Varying concentrations of the tested anti-CD28 antibodies were then added to the coated plates and the bound antibodies were detected and quantified using standard ELISA protocols. The results, shown in Figure 3, demonstrated the ability of these anti-CD28 antibodies to bind to the intended human / cynomolgus CD28 target. The antibodies display a range of affinities for the antigen in this assay format. This range of affinities is valuable since different CD28 affinities may be ideal in disease specific applications or in specific pairings with other antibodies in a multispecific (e.g., bispecific) format.

[0273] Binding titration of anti-CD28 antibodies to RPMI-8226 human multiple myeloma cell line expressing CD28 were measured by flow cytometric analysis. Antibodies were incubated with RPMI-8226 cells for 1 hour at 4 ℃, followed by detection with Alexa Fluor 647-labeled anti-human IgG antibody for an additional 30 minutes, and then cells were analyzed by flow cytometry on Beckman Cytoflex. The results are shown in Figure 4. These data demonstrated that the tested anti-CD3 antibodies are capable of binding to the human CD3 protein as it is natively presented on the surface of the intended target T cells in addition to their demonstrated ability to bind to isolated recombinant protein. Hence, the CD3 antibodies demonstrated both antigen and cell binding capabilities.

[0274] Example 4: Characterization of anti-PD-L1 antibodies

[0275] Biotin labeled human recombinant PD-L1 protein was bound to a streptavidin coated ELISA plate to capture the test antibodies on the solid phase. Varying concentrations of the tested anti-PD-L1 antibodies were then added to the coated plates and the bound antibodies were detected and quantified using standard ELISA protocols. The results, shown in Table 13, demonstrated the ability of these anti-PD-L1 antibodies to bind to the intended human PD-L1 target.

[0276] Biotin labeled cynomolgus monkey recombinant PD-L1 protein was bound to a streptavidin coated ELISA plate to capture the test antibodies on the solid phase. Varying concentrations of the tested anti-PD-L1 antibodies was then added to the coated plates and the bound antibodies were detected and quantified using standard ELISA protocols. The results, shown in Table 13, demonstrated the ability of these anti-PD-L1 species to bind and cross react with cynomolgus monkey PD-L1 protein in addition to their demonstrated binding to the human PD-L1 protein. The ability to also bind the cynomolgus monkey PD-L1 protein is an important enabling property for drug development since it can facilitate the use of these animals for toxicology and other needed studies for these antibodies and especially for multispecific (e.g., bispecific) antibodies that contain them. Table 13. ELISA binding of the anti-PD-L1 variants

[0277] PD-L1 reporter assay was used to test the blocking capabilities of anti-PD-L1 antibodies. The PD-1 Effector Cell Line (Jurkat / NFAT-Luc / PD-1) and PD-L1 Target Cell (CHO-K1 / aAPC / PD-L1) were co-cultured in a 96-well or 384-well plate. When the PD-1 / PD-L1 interaction was disrupted by anti-PD-L1 antibodies, the TCR-mediated luminescence will be activated. The TCR activation induced luminescence (via activation of the NFAT pathway) can be detected and quantified by using reagents with luciferase signal. The results, as shown in Table 14 and representative figure provided in Figure 5, demonstrated the capability of these anti-PD-L1 antibodies to block the PD1 / PD-L1 interaction. The antibodies displayed a range of blocking activities, which will be valuable in disease specific applications or in specific pairings with other antibodies in a multispecific (e.g., bispecific) format. Table 14. Blocking activities of the anti-PD-L1 variants

[0278] Example 5: Anti-ROR1 x CD3 antibodies had directed PBMC killing effect of Jeko-1, a ROR1 positive target cell line

[0279] Bispecific antibodies comprising a single anti-ROR1 arm (JNJ134) paired with a variety of anti-CD3 arms, respectively, were mixed in a series of increasing concentrations of the bispecific antibodies with PBMC and a target cell line. The target cell line was the Jeko-1 human ROR1 positive mantle cell lymphoma cell line. The results shown in Figure 6 are representative curves, demonstrating concentration dependent T cell killing as a consequence of the binding of the bispecific antibodies to both CD3 and ROR1 proteins. The data further supported the conclusion that the binding mediated the desired T cell directed target cancer cell killing. Due to the limit of the experimental setting, for example the limited coculture time, some of the variants showed minimal killing effect due to the low affinity binding of CD3 arm, which will be useful in some specific diseases to reduce the cytokine release syndrome while maintain the killing effect of diseased cells.

[0280] Example 6: Anti-5T4 x CD3 antibodies had directed PBMC killing of MDA-MB-231, a 5T4 positive target cell line

[0281] Bispecific antibodies comprising a single anti-5T4 arm paired with two anti-CD3 variants - huSP34_v1 and huSP34_v9, respectively, were mixed in a series of increasing concentrations of the bispecific antibodies with PBMC and a target cell line. The target cell line was the MDA-MB-231 human 5T4 positive triple-negative breast cancer cell line. The results shown in Figure 7 demonstrated concentration dependent T cell killing as a consequence of the binding of the bi-specific antibodies to both CD3 and 5T4 proteins. The data further supported the conclusion that the binding mediated the desired T cell directed target cancer cell killing.

[0282] Example 7: Anti-CD28 arm potentiate PBMC cytotoxicity induced by CD3 engagers

[0283] In order to verify the benefit of addition of an anti-CD28 arm to CD3 engagers, anti-ROR1 x CD3 x CD28, and anti-ROR1 x CD3 x inert trispecific antibodies were designed and generated. Schematic structures of the tri-specific antibodies were shown in Figure 8C. Trispecific antibodies were mixed in a series of increasing concentrations with PBMCs and a target cell line. The target cell lines were ROR1 positive MAVER-1 and MDA-MB-231, respectively. The results shown in Figure 8A (MAVER-1) and 8B (MDA-MB-231) demonstrated concentration dependent T cell killing of anti-ROR1 x CD3 x inert trispecific antibody although the killing effect is minimal, while the molecule with anti-CD28 incorporated enhanced both the potency and efficacy of T cell killing compared to the anti-ROR1 x CD3 x inert. The data further supported the conclusion that anti-CD28 arm potentiates PBMCs cytotoxicity induced by CD3 engagers.

[0284] Example 8: Anti-PD-L1 arm potentiate PBMC cytotoxicity induced by CD3 engagers

[0285] In order to verify the enhancement of PBMCs killing by an anti-PD-L1 arm, anti-ROR1 x CD3 x PD-L1 x inert and anti-ROR1 x CD3 x inert trispecific antibodies were designed and generated. Schematic structures of the trispecific antibodies are shown in Figure 9C. The trispecific antibodies were mixed in a series of increasing concentrations with PBMCs and a target cell line. The target cell lines were ROR1 positive MAVER-1 and MDA-MB-231, respectively. The results shown in Figure 9A (MAVER-1) and 9B (MDA-MB-231) showed minimal killing effect of anti-ROR1 x CD3 x inert trispecific antibody, while the antibody with anti-PD-L1 incorporated enhanced both the potency and efficacy of T cell killing compared to the anti-ROR1 x CD3 x inert, which is especially obvious in PD-L1 positive MDA-MB-231 cell line. The data further supported the conclusion that the anti-PD-L1 arm potentiates PBMCs cytotoxicity induced by CD3 engagers.

[0286] Example 9: CD3 x CD28 x PD-L1 x EGFR tetra-specific antibody-mediated solid tumor cell lysis

[0287] To further verify the PBMC killing effect of anti-CD3 x CD28 x PD-L1 x EGFR, Anti-CD3 x CD28 x PD-L1 x EGFR, anti-CD3 x inert arm x EGFR x PD-L1, anti-inert arm x CD28 x PD-L1 x EGFR, and anti-CD3 x CD28 x inert x inert arm tetra-specific antibodies were designed and generated. Schematic structures of these tetra-specific antibodies were shown in Figure 10C. Tetra-specific antibodies were mixed in a series of increasing concentrations with PBMCs and a target cell line. The target cell lines were EGFR and PD-L1 positive H1975 human non-small cell lung cancer cell line and BT-20 human breast cancer cell line with low EGFR and high PD-L1 expression. The results shown in Figure 10A (H1975) and 10B (BT20) demonstrated concentration dependent T cell killing of anti-CD3 x CD28 x PD-L1 x EGFR tetra-specific antibody. The killing effects were CD3 and TAA dependent, as the comparator molecule either without TAA (EGFR / PD-L1) binding arms or without a CD3 binding arm did not produce any killing effect for both cell lines. The antibody without CD28 binding domain slightly compromised the killing potencies (increased EC50 values) as observed in both cell lines.

[0288] Example 10: Anti-tumor efficacy of anti-CD3 x 5T4 bispecific antibodies in PBMC humanized mouse model

[0289] The efficacy of anti-CD3 x 5T4 bispecific antibodies in tumor cell killing was evaluated in a PBMC humanized mouse tumor model. The novel anti-CD3 (huSP34_v1) was paired in a bispecific antibody with an anti-5T4 arm, denoted as 5T4-2, known to be capable of binding to 5T4, on tumor cells to assess the ability of huSP34_v1 to direct T cell killing of a 5T4 expressing cell. The positive control anti-CD3 arm was designated as GEN_CD3 with well-defined capability to bind to CD3 on T cells, and was paired with 5T4-2 as well to make a bispecific antibody as benchmark. These bispecific antibodies were evaluated in two 5T4 positive tumor models-BxPC3 human pancreatic cancer and MDA-MB-231 human breast cancer models, respectively. PBMCs containing CD3 positive effector T cells were engrafted in immunocompromised mice 3 days before BxPC3 tumor cell inoculation and 6 days after MDA-MB-231 cell inoculation depending on the tumor growth rate. The humanized tumor-bearing mice were randomized into treatment groups when the tumors were established and the first day of dose administration was denoted as day 0. The test molecules were intraperitoneally administered to the mice and the antibody-mediated tumor shrinkage was assessed (Figure 11A and 11B) . The results of the experiment shown in Figure 11 demonstrated that the 5T4-2 / huSP34_v1 were highly active in inhibiting tumor growth in both models, with low and medium dose levels (0.5 and 1 mg / kg) showing even better tumor inhibition effect than high dose level (3 mg / kg) , which could be explained by the bell‐shaped concentration response relationship observed for CD3 bispecific antibodies (A. Betts et al., 2020) . The benchmark molecule, 5T4-2 x GEN_CD3 at high dose level (3 mg / kg) , only showed minimum tumor inhibition effects in both models, and the anti-tumor activity was either comparable or inferior to 5T4-2 / huSP34_v1 in BxPC3 (Figure 11 A) and in MDA-MB-231 (Figure 11 B) xenograft models, respectively. A primary conclusion is that huSP34_v1 of the bispecific tested in this experiment is highly efficacious in redirecting CD3+ T cells for killing against the two solid tumor models in vivo.

[0290] Example 11: Anti-tumor efficacy of anti-CD3 x CD28 x PD-L1 x EGFR multispecific antibodies in BT20 human breast cancer model

[0291] The efficacy of anti-CD3 x CD28 x PD-L1 x EGFR multispecific antibodies in tumor cell killing was evaluated in a PBMC humanized mouse tumor model. The tetra specific antibody - anti-CD3 x CD28 x PD-L1 x EGFR, along with comparator molecule lacking specificities to both CD28 and PD-L1 were evaluated in a BT20 TNBC model, which has low EGFR and high PD-L1 expression. PBMCs containing CD3+ effector T cells were engrafted in immunocompromised mice 10 days before BT20 tumor cell inoculation. The humanized tumor-bearing mice were randomized into treatment groups when the tumors were established and the first day of dose administration was denoted as day 0. The tumors from some of the treatment groups were collected at the end of the study (day 25) to assess the infiltrated immune cells by flow cytometry. The test molecules were intraperitoneally administered to the mice and the antibody-mediated tumor shrinkage was assessed (Figure 12A) . The results of the experiment shown in Figure 12A demonstrated that the tetra-specific antibody - anti-CD3 x CD28 x PD-L1 x EGFR, was active in inhibiting well established BT20 tumors at both dose levels tested. With both PD-L1 and CD28 targeting arms silenced, the bispecific CD3 x EGFR even showed a trend of tumor growth promoting effect, highlighting the critical role of CD28 and PD-L1 targeting arms. Consistent with the observed tumor growth inhibition effect, the infiltration of CD45+human lymphocytes were increased in the tumor treated with the tetra-specific antibody (Figure 12B) . A primary conclusion is that the anti-CD3 arm-huSP34_v1, anti-CD28 arm-CD28-8 and anti-PD-L1 arm -PD-L1_56tav1 of the tetra-specific antibody tested in this experiment are highly efficacious either as T cell redirector and stimulators or as homing TAA in the BT20 TNBC model in vivo. Table 15. Sequences of fusion heavy chains in multispecific antibodies Table 16. Multispecific antibodies References Betts, A., & van der Graaf, P.H. (2020) . Mechanistic Quantitative Pharmacology Strategies for the Early  Clinical Development of Bispecific Antibodies in Oncology. Clinical Pharmacology & Therapeutics, 108 (3) , 528-541. doi: 10.1002 / cpt. 1961 Bolt, S., Routledge, E., Lloyd, I., Chatenoud, L., Pope, H., Gorman, S.D., Clark, M., & Waldmann, H. (1993) .  The generation of a humanized, non-mitogenic CD3 monoclonal antibody which retains in vitro immunosuppressive properties. Eur J Immunol, 23 (2) , 403-411. doi: 10.1002 / eji. 1830230216 Borthwick, N., Lowdell, M., Salmon, M., & Akbar, A. (2000) . Loss of CD28 expression on CD8+ T cells is  induced by IL-2 receptor chain signalling cytokines and type I IFN, and increases susceptibility to activation-induced apoptosis. International Immunology, 12, 1005-1013. doi: 10.1093 / intimm / 12.7.1005 Carrillo, H., & Lipman, D. (1988) . The Multiple Sequence Alignment Problem in Biology. SIAM Journal on  Applied Mathematics, 48 (5) , 1073-1082. Retrieved from http:  / / www. jstor. org / stable / 2101469 Chothia, C., & Lesk, A.M. (1987) . Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins.  J Mol Biol, 196 (4) , 901-917. Retrieved from http:  / / www. ncbi. nlm. nih. gov / pubmed / 3681981 Chu, S.Y., Vostiar, I., Karki, S., Moore, G.L., Lazar, G.A., Pong, E., Joyce, P.F., Szymkowski, D.E., &  Desjarlais, J.R. (2008) . Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Mol Immunol, 45 (15) , 3926-3933. doi: 10.1016 / j. molimm. 2008.06.027 Dall'Acqua, W.F., Kiener, P.A., & Wu, H. (2006) . Properties of human IgG1s engineered for enhanced  binding to the neonatal Fc receptor (FcRn) . J Biol Chem, 281 (33) , 23514-23524. doi: 10.1074 / jbc. M604292200 Diebolder, C.A., Beurskens, F.J., de Jong, R.N., Koning, R.I., Strumane, K., Lindorfer, M.A., Voorhorst,  M., Ugurlar, D., Rosati, S., Heck, A.J., van de Winkel, J.G., Wilson, I.A., Koster, A.J., Taylor, R.P., Saphire, E.O., Burton, D.R., Schuurman, J., Gros, P., & Parren, P.W. (2014) . Complement is activated by IgG hexamers assembled at the cell surface. Science, 343 (6176) , 1260-1263. doi: 10.1126 / science. 1248943 Feucht, J., Kayser, S., Gorodezki, D., Hamieh, M.,  M., Blaeschke, F., Schlegel, P.,  H.,  Quintanilla-Fend, L., Ebinger, M., Lang, P., Handgretinger, R., & Feuchtinger, T. (2016) . T-cell responses against CD19+ pediatric acute lymphoblastic leukemia mediated by bispecific T-cell engager (BiTE) are regulated contrarily by PD-L1 and CD80 / CD86 on leukemic blasts. Oncotarget, 7 (47) , 76902-76919. doi: 10.18632 / oncotarget. 12357 Gribskov, M.R., & Devereux, J. (2020) . Sequence analysis primer. Griffin, A.M., & Griffin, H.G. (1994) . Computer analysis of sequence data. Totowa, N.J.: Humana Press  Totowa, N.J. Groothuis, P.G., Jacobs, D.C., Hermens, I.A., Damming, D., Berentsen, K., Mattaar-Hepp, E., Stokman,  M.E., van Boekel, T., Rouwette, M., & van der Vleuten, M.A. (2023) . Preclinical Profile of BYON3521 Predicts an Effective and Safe MET Antibody-Drug Conjugate. Molecular Cancer Therapeutics, 22 (6) , 765-777. Gunasekaran, K., Pentony, M., Shen, M., Garrett, L., Forte, C., Woodward, A., Ng, S.B., Born, T., Retter,  M., Manchulenko, K., Sweet, H., Foltz, I.N., Wittekind, M., & Yan, W. (2010) . Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostatic steering effects: applications to bispecific molecules and monovalent IgG. J Biol Chem, 285 (25) , 19637-19646. Harrison, A.J., Du, X., von Scheidt, B., Kershaw, M.H., & Slaney, C.Y. (2021) . Enhancing co-stimulation of  CAR T cells to improve treatment outcomes in solid cancers. Immunother Adv, 1 (1) , ltab016. doi: 10.1093 / immadv / ltab016 Heijne, G. v. (1987) . Sequence analysis in molecular biology : treasure trove or trivial pursuit. San Diego:  Academic Press San Diego. Hinton, P.R., Xiong, J.M., Johlfs, M.G., Tang, M.T., Keller, S., & Tsurushita, N. (2006) . An engineered  human IgG1 antibody with longer serum half-life. J Immunol, 176 (1) , 346-356. Retrieved from http:  / / www. ncbi. nlm. nih. gov / pubmed / 16365427 Kabat, E.A. (1991) . Sequences of proteins of immunological interest. In E.A. Kabat (Ed. ) , (5th ed. ed. ) .  Bethesda, MD : : U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health. Kinder, M., Greenplate, A.R., Grugan, K.D., Soring, K.L., Heeringa, K.A., McCarthy, S.G., Bannish, G.,  Perpetua, M., Lynch, F., Jordan, R.E., Strohl, W.R., & Brezski, R.J. (2013) . Engineered protease-resistant antibodies with selectable cell-killing functions. J Biol Chem, 288 (43) , 30843-30854. doi: 10.1074 / jbc. M113.486142 Labrijn, A.F., Meesters, J.I., de Goeij, B.E., van den Bremer, E.T., Neijssen, J., van Kampen, M.D.,  Strumane, K., Verploegen, S., Kundu, A., Gramer, M.J., van Berkel, P.H., van de Winkel, J.G., Schuurman, J., & Parren, P.W. (2014) . Efficient generation of stable bispecific IgG1 by controlled Fab-arm exchange. Proc Natl Acad Sci U S A, 110 (13) , 5145-5150. Lefranc, M.P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V., &  Lefranc, G. (2003) . IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol, 27 (1) , 55-77. Retrieved from http:  / / www. ncbi. nlm. nih. gov / pubmed / 12477501 Lesk, A. (1988) . Computational molecular biology: Oxford University Press, Inc. Liu, H., Xi, R., Mao, D., Zhao, X., & Wu, T. (2023) . Efficacy and Safety of Blinatumomab for the Treatment  of Relapsed / Refractory Acute Lymphoblastic Leukemia: A Systemic Review and Meta-Analysis. Clin Lymphoma Myeloma Leuk, 23 (3) , e139-e149. doi: 10.1016 / j. clml. 2022.12.009 McNeil, B.K., Sorbellini, M., Grubb, R.L., 3rd, Apolo, A., Cecchi, F., Athauda, G., Cohen, B., Giubellino, A.,  Simpson, H., Agarwal, P.K., Coleman, J., Getzenberg, R.H., Netto, G.J., Shih, J., Linehan, W.M., Pinto, P.A., & Bottaro, D.P. (2014) . Preliminary evaluation of urinary soluble Met as a biomarker for urothelial carcinoma of the bladder. J Transl Med, 12, 199. doi: 10.1186 / 1479-5876-12-199 Passariello, M., Yoshioka, A., Takahashi, K., Hashimoto, S.I., Inoue, T., Nakamura, K., & De Lorenzo, C.  (2022) . Novel tri-specific tribodies induce strong T cell activation and anti-tumor effects in vitro and in vivo. J Exp Clin Cancer Res, 41 (1) , 269. doi: 10.1186 / s13046-022-02474-3 Petkova, S.B., Akilesh, S., Sproule, T.J., Christianson, G.J., Al Khabbaz, H., Brown, A.C., Presta, L.G.,  Meng, Y.G., & Roopenian, D.C. (2006) . Enhanced half-life of genetically engineered human IgG1 antibodies in a humanized FcRn mouse model: potential application in humorally mediated autoimmune disease. Int Immunol, 18 (12) , 1759-1769. doi: 10.1093 / intimm / dxl110 Przepiorka, D., Ko, C.W., Deisseroth, A., Yancey, C.L., Candau-Chacon, R., Chiu, H.J., Gehrke, B.J.,  Gomez-Broughton, C., Kane, R.C., Kirshner, S., Mehrotra, N., Ricks, T.K., Schmiel, D., Song, P., Zhao, P., Zhou, Q., Farrell, A.T., & Pazdur, R. (2015) . FDA Approval: Blinatumomab. Clin Cancer Res, 21 (18) , 4035-4039. doi: 10.1158 / 1078-0432. Ccr-15-0612 Ridgway, J.B., Presta, L.G., & Carter, P. (1996) . 'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains  for heavy chain heterodimerization. Protein Eng, 9 (7) , 617-621. doi: 10.1093 / protein / 9.7.617 Sam, J., Colombetti, S., Fauti, T., Roller, A., Biehl, M., Fahrni, L., Nicolini, V., Perro, M., Nayak, T., Bommer,  E., Schoenle, A., Karagianni, M., Le Clech, M., Steinhoff, N., Klein, C.,  P., & Bacac, M. (2020) . Combination of T-Cell Bispecific Antibodies With PD-L1 Checkpoint Inhibition Elicits Superior Anti-Tumor Activity. Front Oncol, 10, 575737. doi: 10.3389 / fonc. 2020.575737 Shields, R.L., Namenuk, A.K., Hong, K., Meng, Y.G., Rae, J., Briggs, J., Xie, D., Lai, J., Stadlen, A., Li, B.,  Fox, J.A., & Presta, L.G. (2001) . High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem, 276 (9) , 6591-6604. doi: 10.1074 / jbc. M009483200  Shields, R.L., Namenuk, A.K., Hong, K., Meng, Y.G., Rae, J., Briggs, J., Xie, D., Lai, J., Stadlen, A., Li, B.,  Fox, J.A., & Presta, L.G. (2001) . High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem, 276 (9) , 6591-6604. doi: 10.1074 / jbc. M009483200 Singh, A., Dees, S., & Grewal, I.S. (2021) . Overcoming the challenges associated with CD3+ T-cell  redirection in cancer. Br J Cancer, 124 (6) , 1037-1048. doi: 10.1038 / s41416-020-01225-5 Skokos, D., Waite, J.C., Haber, L., Crawford, A., Hermann, A., Ullman, E., Slim, R., Godin, S., Ajithdoss, D.,  Ye, X., Wang, B., Wu, Q., Ramos, I., Pawashe, A., Canova, L., Vazzana, K., Ram, P., Herlihy, E., Ahmed, H., Oswald, E., Golubov, J., Poon, P., Havel, L., Chiu, D., Lazo, M., Provoncha, K., Yu, K., Kim, J., Warsaw, J.J., Stokes Oristian, N., Siao, C.J., Dudgeon, D., Huang, T., Potocky, T., Martin, J., MacDonald, D., Oyejide, A., Rafique, A., Poueymirou, W., Kirshner, J.R., Smith, E., Olson, W., Lin, J., Thurston, G., Sleeman, M.A., Murphy, A.J., & Yancopoulos, G.D. (2020) . A class of costimulatory CD28-bispecific antibodies that enhance the antitumor activity of CD3-bispecific antibodies. Sci Transl Med, 12 (525) . doi: 10.1126 / scitranslmed. aaw7888 Smith, D.W. (1994) . Biocomputing : informatics and genome projects. San Diego: Academic Press San  Diego. Spigel, D.R., Ervin, T.J., Ramlau, R.A., Daniel, D.B., Goldschmidt, J.H., Jr., Blumenschein, G.R., Jr.,  Krzakowski, M.J., Robinet, G., Godbert, B., Barlesi, F., Govindan, R., Patel, T., Orlov, S.V., Wertheim, M.S., Yu, W., Zha, J., Yauch, R.L., Patel, P.H., Phan, S.C., & Peterson, A.C. (2013) . Randomized phase II trial of Onartuzumab in combination with erlotinib in patients with advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol, 31 (32) , 4105-4114. doi: 10.1200 / jco. 2012.47.4189 Stavenhagen, J.B., Gorlatov, S., Tuaillon, N., Rankin, C.T., Li, H., Burke, S., Huang, L., Johnson, S., Koenig,  S., & Bonvini, E. (2008) . Enhancing the potency of therapeutic monoclonal antibodies via Fc optimization. Adv Enzyme Regul, 48, 152-164. doi: 10.1016 / j. advenzreg. 2007.11.011 Tarhini, A.A., Rafique, I., Floros, T., Tran, P., Gooding, W.E., Villaruz, L.C., Burns, T.F., Friedland, D.M.,  Petro, D.P., Farooqui, M., Gomez-Garcia, J., Gaither-Davis, A., Dacic, S., Argiris, A., Socinski, M. A., Stabile, L.P., & Siegfried, J.M. (2017) . Phase 1 / 2 study of rilotumumab (AMG 102) , a hepatocyte growth factor inhibitor, and erlotinib in patients with advanced non-small cell lung cancer. Cancer, 123 (15) , 2936-2944. doi: 10.1002 / cncr. 30717 Vafa, O., Gilliland, G.L., Brezski, R.J., Strake, B., Wilkinson, T., Lacy, E.R., Scallon, B., Teplyakov, A., Malia,  T.J., & Strohl, W.R. (2014) . An engineered Fc variant of an IgG eliminates all immune effector functions via structural perturbations. Methods, 65 (1) , 114-126. doi: 10.1016 / j. ymeth. 2013.06.035 Wang, S., Chen, K., Lei, Q., Ma, P., Yuan, A.Q., Zhao, Y., Jiang, Y., Fang, H., Xing, S., Fang, Y., Jiang, N.,  Miao, H., Zhang, M., Sun, S., Yu, Z., Tao, W., Zhu, Q., Nie, Y., & Li, N. (2021) . The state of the art of bispecific antibodies for treating human malignancies. EMBO Mol Med, 13 (9) , e14291. doi: 10.15252 / emmm. 202114291 A., & Plückthun, A. (2001) . Stability engineering of antibody single-chain Fv fragments. J Mol Biol,  305 (5) , 989-1010. doi: 10.1006 / jmbi. 2000.4265 Wu, T.T., & Kabat, E.A. (1970) . An analysis of the sequences of the variable regions of Bence Jones  proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity. J Exp Med, 132 (2) , 211-250. Retrieved from http:  / / www. ncbi. nlm. nih. gov / pubmed / 5508247 Xu, D., Alegre, M.L., Varga, S.S., Rothermel, A.L., Collins, A.M., Pulito, V.L., Hanna, L.S., Dolan, K.P.,  Parren, P.W., Bluestone, J.A., Jolliffe, L.K., & Zivin, R.A. (2000) . In vitro characterization of five humanized OKT3 effector function variant antibodies. Cell Immunol, 200 (1) , 16-26. doi: 10.1006 / cimm. 2000.1617 Zalevsky, J., Chamberlain, A.K., Horton, H.M., Karki, S., Leung, I.W., Sproule, T.J., Lazar, G.A.,  Roopenian, D.C., & Desjarlais, J.R. (2010) . Enhanced antibody half-life improves in vivo activity. Nat Biotechnol, 28 (2) , 157-159. doi: 10.1038 / nbt. 1601 Zhang, D., Armstrong, A.A., Tam, S.H., McCarthy, S.G., Luo, J., Gilliland, G.L., & Chiu, M.L. (2017) .  Functional optimization of agonistic antibodies to OX40 receptor with novel Fc mutations to promote antibody multimerization. MAbs, 9, 1129-1142.

Claims

1.An anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising:a heavy chain variable region comprising complementarity determining region (CDR) sequences HCDR1, HCDR2, and HCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 comprise:SEQ ID NOs: 92, 90, and 91;SEQ ID NOs: 89, 93, and 91;SEQ ID NOs: 92, 93, and 91;SEQ ID NOs: 89, 90, and 94;SEQ ID NOs: 89, 90, and 95;SEQ ID NOs: 89, 90, and 96; orSEQ ID NOs: 97, 90, and 96; respectively; and / ora light chain variable region comprising complementarity determining region (CDR) sequences LCDR1, LCDR2, and LCDR3, wherein the LCDR1, LCDR2, and LCDR3 comprise:SEQ ID NOs: 101, 102, and 100;SEQ ID NOs: 103, 104, and 100;SEQ ID NOs: 101, 104, and 100; orSEQ ID NOs: 105, 104, and 100; respectively.2.An anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising:a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1-15 or an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-15; and / ora light chain variable region comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 16-20, or an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 16-20.3.The anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment of claim 2, wherein the heavy chain variable region and the light chain variable region comprise:SEQ ID NOs: 1 and 16;SEQ ID NOs: 2 and 16;SEQ ID NOs: 3 and 16;SEQ ID NOs: 4 and 16;SEQ ID NOs: 5 and 16;SEQ ID NOs: 6 and 16;SEQ ID NOs: 7 and 16;SEQ ID NOs: 8 and 16;SEQ ID NOs: 9 and 16;SEQ ID NOs: 10 and 16;SEQ ID NOs: 11 and 16;SEQ ID NOs: 2 and 17;SEQ ID NOs: 3 and 17;SEQ ID NOs: 4 and 17;SEQ ID NOs: 5 and 17;SEQ ID NOs: 6 and 17;SEQ ID NOs: 7 and 17;SEQ ID NOs: 8 and 17;SEQ ID NOs: 9 and 17;SEQ ID NOs: 10 and 17;SEQ ID NOs: 11 and 17;SEQ ID NOs: 9 and 18;SEQ ID NOs: 9 and 19;SEQ ID NOs: 12 and 16;SEQ ID NOs: 13 and 16;SEQ ID NOs: 14 and 16;SEQ ID NOs: 15 and 16;SEQ ID NOs: 1 and 20;SEQ ID NOs: 2 and 20;SEQ ID NOs: 3 and 20;SEQ ID NOs: 4 and 20;SEQ ID NOs: 5 and 20;SEQ ID NOs: 6 and 20;SEQ ID NOs: 7 and 20;SEQ ID NOs: 8 and 20;SEQ ID NOs: 9 and 20;SEQ ID NOs: 10 and 20;SEQ ID NOs: 11 and 20;SEQ ID NOs: 12 and 20;SEQ ID NOs: 13 and 20;SEQ ID NOs: 14 and 20; orSEQ ID NOs: 15 and 20; respectively.4.A multispecific antibody comprising the anti-CD3 antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1-3.5.The multispecific antibody of claim 4, wherein the multispecific antibody further comprises an antibody or antigen-binding fragment targeting a tumor-associated antigen.6.An anti-CD28 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising:a heavy chain variable region comprising complementarity determining region (CDR) sequences HCDR1, HCDR2, and HCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 comprise:SEQ ID NOs: 106, 107, and 109; orSEQ ID NOs: 92, 107, and 108; respectively; and / ora light chain variable region comprising complementarity determining region (CDR) sequences LCDR1, LCDR2, and LCDR3, wherein the LCDR1, LCDR2, and LCDR3 comprise:SEQ ID NOs: 113, 111, and 112; orSEQ ID NOs: 114, 115, and 112; respectively.7.An anti-CD28 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising:a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 21-24 or an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 21-24; and / ora light chain variable region comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 25-27, or an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 25-27.8.The anti-CD28 antibody or antigen-binding fragment of claim 7, wherein the heavy chain variable region and the light chain variable region comprise:SEQ ID NOs: 21 and 25;SEQ ID NOs: 22 and 25;SEQ ID NOs: 23 and 25;SEQ ID NOs: 24 and 25;SEQ ID NOs: 21 and 26;SEQ ID NOs: 22 and 26;SEQ ID NOs: 23 and 26;SEQ ID NOs: 24 and 26;SEQ ID NOs: 21 and 27;SEQ ID NOs: 22 and 27;SEQ ID NOs: 23 and 27; orSEQ ID NOs: 24 and 27; respectively.9.A multispecific antibody comprising the anti-CD28 antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 6-8.10.The multispecific antibody of claim 9, wherein the multispecific antibody further comprises an antibody or antigen-binding fragment targeting a tumor-associated antigen.11.An anti-PD-L1 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising:a heavy chain variable region comprising complementarity determining region (CDR) sequences HCDR1, HCDR2, and HCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 comprise:SEQ ID NOs: 122, 123, and 124;SEQ ID NOs: 125, 126, and 127;SEQ ID NOs: 97, 128, and 129;SEQ ID NOs: 125, 130, and 131;SEQ ID NOs: 132, 133, and 134;SEQ ID NOs: 132, 133, and 135;SEQ ID NOs: 132, 128, and 136;SEQ ID NOs: 132, 137, and 138;SEQ ID NOs: 125, 139, and 140;SEQ ID NOs: 97, 141, and 142;SEQ ID NOs: 125, 143, and 144;SEQ ID NOs: 125, 145, and 146;SEQ ID NOs: 97, 147, and 148;SEQ ID NOs: 125, 149, and 150;SEQ ID NOs: 132, 185, and 151;SEQ ID NOs: 125, 152, and 153;SEQ ID NOs: 97, 133, and 154;SEQ ID NOs: 97, 133, and 155;SEQ ID NOs: 125, 156, and 157;SEQ ID NOs: 125, 158, and 159;SEQ ID NOs: 160, 161, and 162;SEQ ID NOs: 160, 161, and 163;SEQ ID NOs: 132, 164, and 165;SEQ ID NOs: 97, 166, and 127; orSEQ ID NOs: 97, 167, and 134; respectively.12.The anti-PD-L1 antibody or antigen-binding fragment of claim 11, wherein the anti-PD-L1 antibody or antigen-binding fragment further comprises a light chain variable region comprising complementarity determining region (CDR) sequences LCDR1, LCDR2, and LCDR3, wherein the LCDR1, LCDR2, and LCDR3 comprise:SEQ ID NOs: 119, 120, and 121; respectively.13.An anti-PD-L1 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising:a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 28 and 31-57, or an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 28 and 31-57.14.The anti-PD-L1 antibody or antigen-binding fragment of claim 13, wherein the anti-PD-L1 antibody or antigen-binding fragment further comprises a light chain variable region comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 29-30, or an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 29-30.15.The anti-PD-L1 antibody or antigen-binding fragment of claim 14, wherein the heavy chain variable region and the light chain variable region comprise:SEQ ID NOs: 28 and 29; orSEQ ID NOs: 28 and 30; respectively.16.A multispecific antibody comprising the anti-PD-L1 antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 11-15.17.The multispecific antibody of claim 16, wherein the multispecific antibody further comprises an antibody or antigen-binding fragment targeting a tumor-associated antigen.18.A multispecific antibody, comprising:1) a first binding arm targeting CD3 comprising:a first heavy chain protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a first light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof,wherein:the IgG heavy chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises the heavy chain variable region of any one of claims 1-3,the IgG light chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises the light chain variable region of any one of claims 1-3; and2) a second binding arm targeting ROR1 comprising:a second heavy chain protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a second light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof,wherein:the IgG heavy chain or antigen-binding fragment and the IgG light chain or antigen binding fragment of the second binding arm bind to ROR1.19.A multispecific antibody, comprising:1) a first binding arm targeting CD3 comprising:a first heavy chain protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a first light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof,wherein:the IgG heavy chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises the heavy chain variable region of any one of claims 1-3, andthe IgG light chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises the light chain variable region of any one of claims 1-3; and2) a second binding arm targeting 5T4 comprising:a second heavy chain protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a second light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof,wherein:the IgG heavy chain or antigen-binding fragment and the IgG light chain or antigen-binding fragment of the second binding arm bind to 5T4.20.A multispecific antibody, comprising:1) a first binding arm targeting CD3 and ROR1 comprising:a first heavy chain fusion protein comprising a single-chain fragment variable (scFv) domain or an antigen-binding fragment thereof and an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof,and a first light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof,wherein:the single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof is connected to the IgG heavy chain or antigen-binding fragment thereof optionally via a linker,wherein:the IgG heavy chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises the heavy chain variable region of any one of claims 1-3 or SEQ ID NO: 60, andthe IgG light chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises the light chain variable region of any one of claims 1-3 or SEQ ID NO: 61, andwherein:the single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment binds to ROR1; and2) a second binding arm targeting CD28 comprising:a second heavy chain protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and an optional second light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof,wherein:the IgG heavy chain or antigen-binding fragment of the second binding arm comprises the heavy chain variable region of any one of claims 6-8 or SEQ ID NO: 62, andthe IgG light chain or antigen-binding fragment of the second binding arm comprises the light chain variable region of any one of claims 6-8 or SEQ ID NO: 63.21.A multispecific antibody, comprising:1) a first binding arm targeting CD3 and ROR1 comprising:a first heavy chain fusion protein comprising a single-chain fragment variable (scFv) domain or an antigen-binding fragment thereof and an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof,and a first light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof,wherein:the single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof is connected to the IgG heavy chain or antigen-binding fragment thereof optionally via a linker,wherein:the IgG heavy chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises the heavy chain variable region of any one of claims 1-3 or SEQ ID NO: 60, andthe IgG light chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises the light chain variable region of any one of claims 1-3 or SEQ ID NO: 61, andwherein:the variable-heavy-chain-only single domain or antigen-binding fragment of the first binding arm binds to ROR1; and2) a second binding arm targeting PD-L1 comprising:a second heavy chain protein comprising a variable-heavy-chain-only single domain or an antigen-binding fragment thereof, wherein:wherein:the variable-heavy-chain-only single domain or antigen-binding fragment of the second binding arm comprises the heavy chain variable region of any one of claims 11 and 13 or SEQ ID NO: 58.22.The multispecific antibody of claim 21, wherein the second heavy chain protein of the second binding arm further comprises an inert IgG heavy chain, wherein the variable-heavy-chain-only single domain or antigen-binding fragment thereof is connected to the inert IgG heavy chain optionally via a linker; and wherein the second binding arm further comprises an inert IgG light chain.23.A multispecific antibody, comprising:1) a first binding arm targeting CD3 and EGFR comprising:a first heavy chain fusion protein comprising a variable-heavy-chain-only single-domain or an antigen-binding fragment thereof and an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof,and a first light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof,wherein:the single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof is connected to the IgG heavy chain or antigen-binding fragment thereof optionally via a linker,wherein:the IgG heavy chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises the heavy chain variable region of any one of claims 1-3 or SEQ ID NO: 60,the IgG light chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises the light chain variable region of any one of claims 1-3 or SEQ ID NO: 61, andwherein:the variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment targets EGFR; and2) a second binding arm targeting PD-L1 and CD28 comprising:a second heavy chain fusion protein comprising a variable-heavy-chain-only single-domain or an antigen-binding fragment thereof and an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof,and a second light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof;wherein:the single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof is connected to the IgG heavy chain or antigen-binding fragment thereof optionally via a linker,wherein:the IgG heavy chain or antigen-binding fragment thereof of the second binding arm comprises the heavy chain variable region of any one of claims 6-8 or SEQ ID NO: 62, the IgG light chain or antigen-binding fragment thereof of the second binding arm comprises the light chain variable region of any one of claims 6-8 or SEQ ID NO: 63, andwherein:the variable-heavy-chain-only single domain or antigen-binding fragment thereof of the second binding arm comprises the heavy chain variable region of any one of claims 11 and 13 or SEQ ID NO: 58.24.The multispecific antibody of any one of claims 18-23, wherein the multispecific antibody further comprises a moiety targeting a TAA, wherein the TAA is selected from PD-L1, ROR1, 5T4, and EGFR.25.The multispecific antibody of any one of claims 18-24, wherein the first binding arm is monovalent, and the second binding arm is monovalent.26.A conjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1-25, wherein the antibody or antigen-binding fragment is conjugated to a cytotoxic agent.27.A pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1-25 or the conjugate of claim 26, and a pharmaceutically acceptable carrier.28.A nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1-25.29.A host cell comprising the nucleic acid of claim 28.30.A method for preparing the antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1-25, comprising: culturing the host cell of claim 29, growing the host cell in a host cell culture, providing host cell culture conditions wherein the nucleic acid of claim 28 is expressed, and recovering the antibody or antigen-binding fragment from the host cell or from the host cell culture.31.A method for treating a TAA-mediated disease or disorder in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of the antibody or antigen binding fragment of any one of claims 1-25.32.The method for treating the TAA-mediated disease or disorder of claim 31, wherein the TAA is selected from PD-L1, ROR1, 5T4, and EGFR.33.A method for treating cancer in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of the antibody or antigen binding fragment of any one of claims 1-25, or the conjugate of claim 26, or the pharmaceutical composition of claim 27.34.The method for treating cancer of claim 33, wherein the cancer is selected from mantle cell lymphoma, non-small cell lung cancer, and triple negative breast cancer.35.A method for treating a PD-L1-mediated disease or disorder in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of the anti-PD-L1 antibody or antigen binding fragment of any one of claims 1-25, the conjugate of claim 26, or the pharmaceutical composition of claim 27.36.The method for treating PD-L1-mediated disease or disorder of claim 35, wherein the PD-L1-mediated disease or disorder is selected from non-small cell lung cancer and triple negative breast cancer.

Images