Antibodies targeting FAP and LRRC15 and fusion proteins targeting hyaluronan and uses thereof

Abstract

Provided are antibodies and fragments targeting FAP, LRRC15, and HA. Multispecific antibodies that target multiple targets including, but not limited to, CD3, EGFR, FAP, LRRC15, and HA are also provided. The antibodies of the disclosure can treat cancers and / or other diseases, disorders, and conditions where pathogenesis can be treated with T cell redirection or stroma remodeling modalities.

Description

Antibodies Targeting FAP and LRRC15 and Fusion Proteins Targeting Hyaluronan and Uses ThereofCross Reference to Related Application

[0001] This application claims the priority to and benefits of International Application No. PCT / CN2024 / 083531, filed on March 25, 2024, the contents of which are hereby incorporated herein by reference in their entirety. Field of Disclosure

[0002] The present disclosure relates to antibodies targeting FAP and LRRC15 and antigen binding fragments thereof, and Fc-fusions of human hyaluronidase (HYAL) enzyme and fragments thereof for targeting hyaluronan (HA) , and their applications as therapeutic approaches for treating various solid tumors. Sequence Listing

[0003] This application contains a Sequence Listing as an XML file entitled “Sequence Listing. xml” having a size of 342.171 bytes and created on March 20, 2024. The information contained in the Sequence Listing is incorporated by reference herein. Background of Disclosure

[0004] Solid tumors can develop in various tissues and organs, leading to a range of malignancies. Solid tumor cells are often surrounded by desmoplastic stroma, comprising cancer-associated fibroblasts (CAFs) and extracellular matrix (ECM) . Pancreatic cancer is an extreme case that comprises stroma component up to 90%of the tumor mass. The stroma acts as a dense mechanical barrier against vascularization, limits exposure to chemotherapy, excludes immune cell infiltration, and promotes cancer invasiveness (Mancini et al., 2021; Xiao et al., 2023; Xu et al., 2022) . Therefore, effectively targeting the stroma as a monotherapy or in combination with other modalities is a promising strategy to combat solid tumors, which could potentially disrupt the pro-tumor microenvironment, inhibit angiogenesis, facilitate immune cell infiltration, and remodel stromal components.

[0005] CAFs are a key component of the tumor stroma and play a crucial role in promoting tumor growth, invasion, and metastasis. The acquisition of a CAF phenotype is associated with the expression of a variety of CAF-related markers (Han et al., 2020) . Fibroblast activation protein (FAP) is one of the most viable CAF‐markers and plays a role in tumor progression. FAP+ CAFs contribute to an immunosuppressive tumor microenvironment and are associated with poor patient outcomes in ovarian cancer (Hussain et al., 2020) , making FAP a promising therapeutic target. Various strategies targeting FAP have shown therapeutic effects in distinct murine tumor models, including small molecule inhibitors, nanomaterials, monoclonal antibodies (mAbs) , antibody-drug conjugates (ADCs) , chimeric antigen receptor (CAR) T cells, and oncolytic adenovirus. So far, FAP is one of the promising therapeutic targets for CAFs (Adams et al., 2004; Fabre et al., 2020; Freedman et al., 2018; Kakarla et al., 2013; Santos et al., 2009; Wang et al., 2014; Xin et al., 2021) .

[0006] Leucine-rich repeat-containing protein 15 (LRRC15) is identified as another important marker for CAF that is highly expressed on stromal fibroblasts of multiple solid tumors, as well as cancer cells of mesenchymal origin. While its expression in normal tissues is low, making it another ideal target for tumor stroma, high LRRC15 expression has prognostic value to be a biomarker predictive of higher tumor grade and adverse outcome in both osteosarcoma and soft-tissue sarcomas (Ben-Ami et al., 2020; Cui et al., 2020) . Moreover, LRRC15+ CAFs promote tumor growth and suppress CD8+ T cell function. Therefore, developing treatments to reduce these cell population may improve patient survival and response to immunotherapy (Krishnamurty et al., 2022) . Therapeutic agents targeting LRRC15, such as antibody-drug conjugates and T cell engagers, have demonstrated anti-tumor effects in various cancer indications preclinically (Purcell et al., 2018) .

[0007] Hyaluronan (HA) is a prominent component of the extracellular matrix in tumors, and its aberrant metabolism contributes to tumor progression (Donelan et al., 2022) . The degradation of HA is catalyzed by hyaluronidase enzymes. In humans, there are several hyaluronidases, including HYAL1, HYAL2, HYAL3, and PH20 (SPAM1) . These enzymes play important roles in various physiological and pathological processes, such as tissue remodeling, embryogenesis, wound healing, and cancer progression (Kaul et al., 2021) . PH20, the only enzyme with neutral-active properties, is widely used to hydrolyze hyaluronic acid in the tumor or used to be co-administered with a subcutaneously injected mAbs to increase its permeability (Locke et al., 2019) . Moreover, a pegylated recombinant human PH20 (PEGPH20) variant has been shown to be able to remodel the stroma of HA-rich tumors, improving the intra-tumor distribution of anticancer drugs and enhancing their therapeutic efficacy without increasing toxicity (Morosi et al., 2021) . Despite promising results in phase I-II studies for high HA-expressing tumors, the phase III study of Pegvorhyaluronidase alfa (PEGPH20) in combination with chemotherapy for pancreatic cancer failed to meet its primary endpoint, indicating that HA depletion alone may not be sufficient for effective treatment (Hakim et al., 2019; Van Cutsem et al., 2020) .

[0008] CD3 antigens are cell surface proteins found on T cells, a type of white blood cell that plays a crucial role in the immune system's ability to recognize and destroy abnormal cells, including cancer cells. T cell engagers are a type of immunotherapy that harnesses the power of T cells to target and kill cancer cells (Peri et al., 2023) . These therapies work by using bispecific antibodies that bind to both the CD3 antigen on T cells and a tumor-associated antigen (TAA) on cancer cells, bringing the two cell types into close proximity and activating the T cells to attack the cancer cells (Vafa &Trinklein, 2020) . New therapies can be developed to target CD3 and cancer associated fibroblasts. Summary of Disclosure

[0009] In one aspect, the present disclosure provides novel multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibodies that combine one or more of anti-FAP antibody, anti-LRRC15 antibody and anti-CD3 antibody or their antigen binding fragments, and Fc-fusions of hyaluronidases. These antibodies or enzymes integrate domains with a variety of affinities and activities into a single molecule with multiple specificities. In some embodiments, a multifunctional antibody platform disclosed herein comprises architectures and compositions such as: 1) anti-CD3 x anti-FAP, 2) anti-CD3 x anti-LRRC15, and 3) anti-FAP x anti-LRRC15 x hyaluronidase. These molecules are designed to have varying binding affinities, activities, and molecular formats to enable optimal T-cell redirection for tumor cytotoxicity. The combination of a human hyaluronidase fusion protein with CAF homing and a direct tumor-targeting molecule can remodel the TME and produce synergistic effects against solid tumors, offering promising anti-tumor activity for patients with unmet medical needs in multiple solid tumors.

[0010] In some embodiments, the disclosure provides an anti-FAP antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence comprising: SEQ ID NOs: 1 and 4; SEQ ID NOs: 1 and 5; SEQ ID NOs: 2 and 4; SEQ ID NOs: 2 and 5; SEQ ID NOs: 3 and 4; SEQ ID NOs: 3 and 5; SEQ ID NOs: 6 and 9; SEQ ID NOs: 6 and 10; SEQ ID NOs: 6 and 11; SEQ ID NOs: 7 and 9; SEQ ID NOs: 7 and 10; SEQ ID NOs: 7 and 11; SEQ ID NOs: 8 and 9; SEQ ID NOs: 8 and 10; SEQ ID NOs: 8 and 11; SEQ ID NOs: 12 and 15; SEQ ID NOs: 13 and 15; SEQ ID NOs: 14 and 15; SEQ ID NOs: 12 and 16; SEQ ID NOs: 13 and 16; SEQ ID NOs: 14 and 16; SEQ ID NOs: 17 and 18; SEQ ID NOs: 149 and 150; or SEQ ID NOs: 151 and 152; respectively.

[0011] In some embodiments, the heavy chain variable domain of the binding moiety that has binding specificity for FAP are present in a human VH framework; and the light chain variable domain of the first binding moiety are present in a human V kappa framework. In some embodiments, the disclosure provides an anti-FAP antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, and 17 or an antigen-binding portion thereof, and a light chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16, and 18 or an antigen-binding portion thereof.

[0012] In some embodiments, the disclosure provides a multispecific antibody comprising the anti-FAP antibody or antigen-binding fragment disclosed herein.

[0013] In some embodiments, the disclosure provides an anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence comprising: SEQ ID NOs: 129 and 130; SEQ ID NOs: 131 and 132; or SEQ ID NOs: 153 and 154; respectively.

[0014] In some embodiments, the disclosure provides an anti-LRRC15 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising: a heavy chain variable region comprising complementarity determining region (CDR)  sequences HCDR1, HCDR2, and HCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 comprises: SEQ ID NOs: 217, 325, and 350; SEQ ID NOs: 198, 199, and 200; SEQ ID NOs: 198, 351, and 201; SEQ ID NOs: 202, 203, and 204; SEQ ID NOs: 198, 351, and 205; SEQ ID NOs: 198, 206, and 207; SEQ ID NOs: 198, 199, and 209; SEQ ID NOs: 198, 203, and 210; SEQ ID NOs: 198, 351, and 211; SEQ ID NOs: 198, 199, and 212; SEQ ID NOs: 198, 206, and 213; SEQ ID NOs: 198, 199, and 214; SEQ ID NOs: 208, 203, and 215; SEQ ID NOs: 216, 217, and 218; SEQ ID NOs: 208, 203, and 219; SEQ ID NOs: 198, 203, and 220; SEQ ID NOs: 208, 203, and 221; SEQ ID NOs: 198, 203, and 222; SEQ ID NOs: 198, 351, and 223; SEQ ID NOs: 198, 351, and 224; SEQ ID NOs: 208, 203, and 225; SEQ ID NOs: 198, 203, and 226; SEQ ID NOs: 202, 199, and 227; SEQ ID NOs: 198, 228, and 229; SEQ ID NOs: 198, 203, and 230; SEQ ID NOs: 198, 203, and 231; SEQ ID NOs: 198, 203, and 232; SEQ ID NOs: 208, 206, and 233; SEQ ID NOs: 198, 351, and 234; SEQ ID NOs: 198, 235, and 236; SEQ ID NOs: 198, 199, and 237; SEQ ID NOs: 198, 351, and 238; SEQ ID NOs: 198, 203, and 239; SEQ ID NOs: 216, 203, and 240; SEQ ID NOs: 198, 203, and 241; SEQ ID NOs: 198, 351, and 242; SEQ ID NOs: 198, 243, and 244; SEQ ID NOs: 198, 351, and 245; SEQ ID NOs: 208, 351, and 246; SEQ ID NOs: 216, 203, and 247; SEQ ID NOs: 198, 199, and 248; SEQ ID NOs: 202, 203, and 249; SEQ ID NOs: 198, 203, and 250; SEQ ID NOs: 216, 203, and 251; SEQ ID NOs: 198, 252, and 253; SEQ ID NOs: 208, 254, and 255; SEQ ID NOs: 198, 256, and 257; SEQ ID NOs: 198, 203, and 258; SEQ ID NOs: 198, 259, and 260; SEQ ID NOs: 216, 261, and 262; SEQ ID NOs: 208, 272, and 273; SEQ ID NOs: 198, 263, and 264; SEQ ID NOs: 208, 206, and 265; SEQ ID NOs: 202, 203, and 266; SEQ ID NOs: 198, 199, and 267; SEQ ID NOs: 216, 256, and 268; SEQ ID NOs: 198, 199, and 269; SEQ ID NOs: 198, 261, and 270; SEQ ID NOs: 202, 203, and 271; SEQ ID NOs: 216, 272, and 274; SEQ ID NOs: 198, 206, and 275; SEQ ID NOs: 208, 276, and 277; SEQ ID NOs: 198, 203, and 278; SEQ ID NOs: 198, 199, and 279; SEQ ID NOs: 198, 280, and 281; SEQ ID NOs: 216, 203, and 282; SEQ ID NOs: 202, 283, and 284; SEQ ID NOs: 216, 285, and 286; SEQ ID NOs: 198, 285, and 287; SEQ ID NOs: 208, 288, and 289; SEQ ID NOs: 198, 261, and 290; SEQ ID NOs: 198, 261, and 291; SEQ ID NOs: 208, 288, and 292; SEQ ID NOs: 202, 293, and 294; SEQ ID NOs: 198, 295, and 296; SEQ ID NOs: 198, 297, and 298; SEQ ID NOs: 198, 299, and 300; SEQ ID NOs: 198, 217, and 301; SEQ ID NOs: 198, 302, and 303; SEQ ID NOs: 216, 285, and 304; SEQ ID NOs: 198, 203, and 305; SEQ ID NOs: 208, 297, and 306; SEQ ID NOs: 216, 285, and 307; SEQ ID NOs: 216, 297, and 308; SEQ ID NOs: 202, 309, and 310; SEQ ID NOs: 216, 311, and 312; SEQ ID NOs: 202, 313, and 314; SEQ ID NOs: 216, 315, and 316; SEQ ID NOs: 208, 317, and 318; SEQ ID NOs: 198, 309, and 319; SEQ ID NOs: 202, 320, and 321; SEQ ID NOs: 208, 322, and 323; SEQ ID NOs: 198, 297, and 324; SEQ ID NOs: 216, 325, and 326; SEQ ID NOs: 202, 217, and 327; SEQ ID NOs: 198, 322, and 328; SEQ ID NOs: 198, 252, and 329; SEQ ID NOs: 208, 330, and 331; SEQ ID NOs: 198, 313, and 332; SEQ ID NOs: 216, 333, and 334; SEQ ID NOs: 198, 252, and 335; SEQ ID NOs: 198, 199, and 336; SEQ ID NOs: 216, 337, and 338; SEQ ID NOs: 202, 320, and 339; SEQ ID NOs: 208, 330, and 340; SEQ ID NOs: 208, 295, and 341; SEQ ID NOs: 198, 280, and 342; SEQ ID NOs: 202, 309, and 343; SEQ ID NOs: 198, 203, and 344; or SEQ ID NOs: 198, 235, and 345; respectively.

[0015] In some embodiments, the heavy chain variable domain of the binding moiety that has binding specificity for LRRC15 are present in a human VH framework; and the light chain variable domain of the first binding moiety are present in a human V kappa framework. In some embodiments, the disclosure provides an anti-LRRC15 or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 129 and 131 or an antigen-binding portion thereof, and a light chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 130 and 132 or an antigen-binding portion thereof.

[0016] In some embodiments, the disclosure provides an anti-LRRC15 antibody, comprising at least one variable-heavy-chain-only single domain (VHO) or an antigen-binding portion thereof, selected from SEQ ID NOs. 19-128. In some embodiments, the disclosure provides an anti-LRRC15 antibody comprising tandem (such as two, three, or four) variable-heavy-chain-only single domains (VHOs) selected from SEQ ID NOs: 19-128, respectively.

[0017] In some embodiments, the present disclosure provides an anti-LRRC15 antibody or an antigen-binding portion thereof, comprising at least one variable-heavy-chain-only single domain (VHO) or an antigen-binding portion thereof, wherein the at least one variable-heavy-chain-only single-domain comprises an amino acid sequence with at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 19-128 or an antigen-binding portion thereof.

[0018] In some embodiments, the disclosure provides a multispecific antibody comprising the anti-LRRC15 antibody or antigen-binding fragment disclosed herein.

[0019] In some embodiments, the disclosure provides an anti-CD3 antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence comprising: SEQ ID NOs: 133 and 136; SEQ ID NOs: 134 and 136; SEQ ID NOs: 135 and 136; SEQ ID NOs: 140 and 142; SEQ ID NOs: 137 and 143; SEQ ID NOs: 155 and 156; or SEQ ID NOs: 157 and 158; respectively.

[0020] In some embodiments, the heavy chain variable domain of the binding moiety that has binding specificity for CD3 are present in a human VH framework; and the light chain variable domain of the first binding moiety are present in a human V lambda or kappa framework. In some embodiments, the disclosure provides an anti-CD3 antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 133-135 and 137-140 or an antigen-binding portion thereof, and a light chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 136 and 141-143 or an antigen-binding portion thereof.

[0021] In some embodiments, the disclosure provides an Fc-hyaluronidase fusion, comprising at least one hyaluronidase domain or portion thereof, wherein the hyaluronidase domain sequence is selected from SEQ ID NOs: 352-358 and 144-148. In some embodiments the Fc-hyaluronidase fusion is soluble.

[0022] In some embodiments, the present disclosure provides an Fc-hyaluronidase fusion or portion thereof, comprising at least one hyaluronidase domain or portion thereof, wherein the at least one hyaluronidase domain comprises an amino acid sequence with at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 352-358 and 144-148 or a portion thereof. In some embodiments the Fc-hyaluronidase fusion is soluble.

[0023] In some embodiments, the disclosure provides a multispecific antibody comprising at least one hyaluronidase domain or portion thereof disclosed herein.

[0024] In some embodiments, the disclosure provides an anti-EGFR antibody, comprising at least one variable-heavy-chain-only single domain (VHO) or an antigen-binding portion thereof, wherein the VHO is selected from SEQ ID NOs: 165 and 166. In some embodiments, the disclosure provides an anti-EGFR antibody comprising tandem (e.g., two, three, or four) variable-heavy-chain-only single domain (VHO) selected from SEQ ID NOs: 165 and 166.

[0025] In some embodiments, the disclosure provides an anti-cMet antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence comprising: SEQ ID NOs: 161 and 162; respectively.

[0026] In some embodiments, the disclosure provides an anti-VEGF antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence selected from SEQ ID NOs: 163 and 164; respectively.

[0027] In some embodiments, the disclosure provides an anti-5T4 antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence selected from SEQ ID NOs: 159 and 160; respectively.

[0028] The anti-FAP, anti-LRRC15, anti-CD3, anti-EGFR, anti cMet, anti-VEGF, or anti-5T4 antibodies or antigen binding fragments thereof disclosed herein may be human, humanized, or chimeric antibodies, or antigen binding fragments.

[0029] The anti-FAP, anti-LRRC15, anti-CD3, anti-EGFR, anti cMet, anti-VEGF, or anti-5T4 antibodies or antigen binding fragments thereof disclosed herein may be full length IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 antibodies or maybe antigen binding fragments thereof, such as a VHH, Fab, F (ab') 2, or scFv fragment. The antibody backbones may be modified to affect functionality, e.g., to eliminate residual effector functions.

[0030] The hyaluronidase domain or portion thereof disclosed herein may be fused to Fc regions from full length IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 antibodies. The antibody backbones may be modified to affect functionality, e.g., to eliminate residual effector functions.

[0031] Aspects of the disclosure include multiple specific (e.g., bispecific or trispecific) antibodies comprising: a first heavy chain polypeptide subunit comprising a mutated human IgG1 constant region comprising mutations L234A, L235A, and F405L; and a second heavy chain polypeptide subunit comprising a mutated human IgG1 constant region comprising mutations L234A, L235A, K409R, and H435R. In some embodiments, the mutated human IgG1 constant region of the first heavy chain polypeptide subunit comprises a sequence of SEQ ID NO: 176, and the mutated human IgG1 constant region of the second heavy chain polypeptide subunit comprises a sequence of SEQ ID NO: 177.

[0032] Aspects of the disclosure include multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibodies comprising: a first heavy chain polypeptide subunit comprising a mutated human IgG1 constant region comprising mutations L234A, L235A, and F405L; and a second heavy chain polypeptide subunit comprising a mutated human IgG1 constant region comprising mutations L234A, L235A, and K409R. In some embodiments, the mutated human IgG1 constant region of the first heavy chain polypeptide subunit comprises a sequence of SEQ ID NO: 176, and the mutated human IgG1 constant region of the second heavy chain polypeptide subunit comprises a sequence of SEQ ID NO: 178.

[0033] Aspects of the disclosure include isolated multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibodies comprising: a first heavy chain polypeptide subunit comprising a mutated human IgG1 constant region comprising mutations F243L, R292P, Y300L, V305I, P396 and S354C, T366W; and a second heavy chain polypeptide subunit comprising a mutated human IgG1 constant region comprising mutations F243L, R292P, Y300L, V305I, P396 and T366S, L368A, Y407V, Y349C. In some embodiments, the mutated human IgG1 constant region of the first heavy chain polypeptide subunit comprises a sequence of SEQ ID NO: 189, and the mutated human IgG1 constant region of the second heavy chain polypeptide subunit comprises a sequence of SEQ ID NO: 190.

[0034] In another aspect, the present disclosure provides a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain protein comprising, from the N-to the  C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the first binding arm can target a CD3 associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the second binding arm can target a FAP associated pathway and comprise an anti-FAP antibody or antigen binding fragment as described herein. The signal sequences A and B can be the same or different from one another.

[0035] In some embodiments, the present disclosure provides a multispecific antibody, comprising: 1) a first binding arm targeting CD3 comprising: a first heavy chain protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment  thereof, and a first light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein: the IgG heavy chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises an  amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 133-135 and 137-140 or an antigen-binding fragment thereof, the IgG light chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises an  amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 136 and 141-143 or an antigen-binding fragment thereof; and 2) a second binding arm targeting FAP comprising: a second heavy chain protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment  thereof, and a second light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein: the IgG heavy chain or antigen-binding fragment of the second binding arm comprises an  amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, and 17 or an antigen-binding fragment thereof, the IgG light chain or antigen-binding fragment of the second binding arm comprises an  amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16, and 18 or an antigen-binding fragment thereof.

[0036] In another aspect, the present disclosure provides a multispecific (bispecific or trispecific) antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain protein comprising, from the N-to the  C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the first binding arm can target a CD3 associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the second binding arm can target a 5T4 associated pathway and comprise an anti-5T4 antibody or antigen binding fragment as described herein. The signal sequences A and B can be the same or different from one another.

[0037] In another aspect, the present disclosure provides a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain protein comprising, from the N-to the  C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the first binding arm can target a CD3 associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the second binding arm can target an LRRC15 associated pathway and comprise an anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment as described herein. The signal sequences A and B can be the same or different from one another.

[0038] In some embodiments, the present disclosure provides a multispecific (e.g., bispecific) antibody, comprising: 1) a first binding arm targeting CD3 comprising: a first heavy chain protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment  thereof, and a first light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein: the IgG heavy chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises an  amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 133-135 and 137-140 or an antigen-binding fragment thereof, the IgG light chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises an  amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 136 and 141-143 or an antigen-binding fragment thereof; and 2) a second binding arm targeting LRRC15 comprising: a second heavy chain protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment  thereof, and a second light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein: the IgG heavy chain or antigen-binding fragment of the second binding arm comprises an  amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 129 and 131 or an antigen-binding fragment thereof, the IgG light chain or antigen-binding fragment thereof of the second binding arm  comprises an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 130 and 132 or an antigen-binding fragment thereof.

[0039] In another aspect, the present disclosure provides a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain protein comprising, from the N-to the  C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the first binding arm can target a CD3 associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain comprising at least one variable-heavy-chain only (VHO) single domain or an antigen-binding portion thereof, wherein the VHO or an antigen-binding portion thereof of the first binding arm can target an LRRC15-associated pathway and comprise an anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment as described herein. The signal sequences A and B can be the same or different from one another.

[0040] In some embodiments, the present disclosure a multispecific antibody, comprising: 1) a first binding arm targeting CD3 comprising: a first heavy chain protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment  thereof, and a first light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein: the IgG heavy chain or antigen-binding fragment thereof of the first binding arm  comprises an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 133-135 and 137-140 or an antigen-binding fragment thereof, the IgG light chain or antigen-binding fragment thereof of the first binding arm comprises  an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 136 and 141-143 or an antigen-binding fragment thereof; and 2) a second binding arm targeting LRRC15 comprising: a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising an IgG heavy  chain comprising at least one variable-heavy-chain only (VHO) single domain or an antigen-binding fragment thereof, wherein: the variable-heavy-chain only (VHO) heavy chain or antigen-binding fragment of the  second binding arm comprises a heavy chain variable region comprising any set of the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 set forth in Table 4 or any of the heavy chain variable region sequences set forth in Table 4 or 5.

[0041] In another aspect, the present disclosure provides a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody comprising: a heavy chain fusion protein comprising: from the N-to the C-terminus, an optional  signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof -an optional linker A -at least one variable-heavy-chain only (VHO) single domain or an antigen-binding portion thereof, and a light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the first binding arm can target a FAP-associated pathway and comprise an anti-FAP or antigen binding fragment as described herein; and the VHO or antigen-binding portion thereof can target an LRRC15-associated pathway and comprise an anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment as described herein; The signal sequences A and B can be the same or different from one another. The linkers  A and B can be the same or different from one another.

[0042] In some embodiments, the present disclosure a multispecific antibody, comprising: a heavy chain fusion protein targeting FAP and LRRC15 comprising: from the N-to the C-terminus, an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof - an optional linker -at least one variable-heavy-chain only (VHO) single domain or an antigen-binding fragment thereof, and a light chain protein targeting FAP comprising an IgG light chain or an antigen-binding  fragment thereof. wherein: the IgG heavy chain or antigen-binding fragment comprises an amino acid sequence  having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, and 17 or an antigen-binding fragment thereof, the variable-heavy-chain only (VHO) single domain or antigen-binding fragment  comprises a heavy chain variable region comprising any set of the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 set forth in Table 4 or any of the heavy chain variable region sequences set forth in Table 4 or 5, the IgG light chain or antigen-binding fragment comprises an amino acid sequence  having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16, and 18 or an antigen-binding fragment thereof.

[0043] In another aspect, the present disclosure provides a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain fusion protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -a hyaluronidase domain or portion thereof -an optional linker A -an Fc chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the hyaluronidase domain or portion thereof of the first binding arm can hydrolyze the hyaluronic acid (HA) and comprise a hyaluronidase domain or portion as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain fusion protein comprising, from  the N-to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof -an optional linker B -at least one variable-heavy-chain only (VHO) single domain or an antigen-binding portion thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the second binding arm can target a FAP-associated pathway and comprise an anti-FAP or antigen binding fragment as described herein; and the VHO or antigen-binding portion thereof of the second binding arm can target an LRRC15-associated pathway and comprise an anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment as described herein. The signal sequences A and B can be the same or different from one another. The linkers  A and B can be the same or different from one another.

[0044] In some embodiments, the present disclosure a multispecific antibody, comprising: 1) a first binding arm targeting HA comprising: a first heavy chain fusion protein comprising a hyaluronidase domain or fragment thereof -an  optional linker A -an Fc region or a fragment thereof; and 2) a second binding arm targeting FAP and LRRC15 comprising: a second heavy chain fusion protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding  fragment thereof -an optional linker B -at least one variable-heavy-chain only (VHO) single domain or an antigen-binding fragment thereof, and a second light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof, wherein: the hyaluronidase domain or fragment of the first binding arm comprises any one of SEQ ID  NOs: 352-358 and 144-146 or an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 352-358 and 144-146, and wherein: the IgG heavy chain or antigen-binding fragment comprises an amino acid sequence  having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, and 17 or an antigen-binding fragment thereof, the variable-heavy-chain only (VHO) single domain or antigen-binding fragment  comprises a heavy chain variable region comprising any set of the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 set forth in Table 4 or any of the heavy chain variable region sequences set forth in Table 4 or 5, the IgG light chain or antigen-binding fragment comprises an amino acid sequence  having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16, and 18 or an antigen-binding fragment thereof.

[0045] In another aspect, the present disclosure provides a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain fusion protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -a hyaluronidase domain or portion thereof -an optional linker A -an Fc chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the hyaluronidase domain or portion thereof of the first binding arm can hydrolyze the hyaluronic acid (HA) and comprise a hyaluronidase domain or portion as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain fusion protein comprising, from  the N-to the C-terminus, an optional signal sequence A -at least one variable-heavy-chain only (VHO) single domain -an optional linker B -an Fc region, wherein the variable-heavy-chain only single domain or an antigen-binding portion thereof of the second binding arm can target an EGFR-associated pathway and comprise an anti-EGFR or antigen binding fragment as described herein; The signal sequences A and B can be the same or different from one another. The linkers  A and B can be the same or different from one another.

[0046] In some embodiments, the present disclosure provides a multispecific antibody comprising: 1) a first binding arm targeting HA comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain fusion protein comprising, from the N-to  the C-terminus, a hyaluronidase domain or fragment thereof -an optional linker A -an Fc region or a fragment thereof, 2) a second binding arm targeting EGFR comprising: a second binding arm comprising: a second heavy chain fusion protein comprising, from the  N-to the C-terminus, at least one variable-heavy-chain only (VHO) single domain that is capable of binding EGFR -an optional linker B -an Fc region or a fragment thereof; wherein: the hyaluronidase domain or fragment of the first binding arm comprises any one of SEQ  ID NOs: 352-358 and 144-146 or an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 352-358 and 144-146.

[0047] In another aspect, the present disclosure provides a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain fusion protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -tandem VHOs -an optional linker A -an Fc region, wherein the tandem VHOs or an antigen-binding portions thereof of the first binding arm can target an EGFR-associated pathway and comprise an anti-EGFR or antigen binding fragment as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the first binding arm can target a cMet-associated pathway and comprise an anti-cMet or antigen binding fragment as described herein. The signal sequences A and B can be the same or different from one another. The linkers  A and B can be the same or different from one another.

[0048] In another aspect, the present disclosure provides a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain protein comprising, from the N-to the  C-terminus, an optional signal sequence A -tandem VHOs -an optional linker A -an Fc region -an optional linker B -an scFv or an antigen-binding portion thereof, wherein the tandem VHOs and scFv or an antigen-binding portions thereof of the first binding arm can target EGFR-and VEGF-associated pathways, respectively; and comprise an anti-EGFR and an anti-VEGF or antigen binding fragments as described herein; a second binding arm comprising: a second heavy chain fusion protein comprising, from  the N-to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the first binding arm can target a cMet-associated pathway and comprise an anti-cMet or antigen binding fragment as described herein; The signal sequences A and B can be the same or different from one another. The linkers  A and B can be the same or different from one another.

[0049] In certain embodiments, in a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody disclosed herein, the IgG is human IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4.

[0050] In certain embodiments, in a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody disclosed herein, the first binding arm is monovalent, bivalent, or multivalent; and the second binding arm is monovalent, bivalent, or multivalent.

[0051] In certain embodiments, in a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody disclosed herein, the second binding arm comprises two, three, or four IgG variable-heavy-chain-only single domains in tandem, wherein the two, three, or four IgG variable-heavy-chain-only single domains are optionally connected via one or more linker sequences.

[0052] In certain embodiments, in a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody disclosed herein, the IgG heavy chain of the first binding arm (anti-CD3 arm) comprises an amino acid  sequence selected from SEQ ID NOs: 133-135, 137-140, 155, and 157, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 133-135 and 137-140, or an antigen-binding portion thereof, and the IgG light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 136, 141-143, 156, and 158, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 136 and 141-143, or antigen-binding portion thereof; the IgG heavy chain of the second binding arm (anti-FAP arm) comprises an amino acid  sequence selected from SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, 17, 149 and 151, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14 and 17, or an antigen-binding portion thereof, and the IgG light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16, 18, 150 and 152, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16 and 18, or antigen-binding portion thereof.

[0053] In certain embodiments, in a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody disclosed herein, the IgG heavy chain of the first binding arm (anti-CD3 arm) comprises an amino acid  sequence selected from SEQ ID NOs: 133-135, 137-140, 155, and 157, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 133-135, and 137-140, or an antigen-binding portion thereof, and the IgG light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 136, 141-143, 156, and 158, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 136 and 141-143, or antigen-binding portion thereof; the IgG heavy chain of the second binding arm (anti-5T4 arm) comprises an amino acid  sequence selected from SEQ ID NO: 159, and the IgG light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 160.

[0054] In certain embodiments, in a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody disclosed herein, the IgG heavy chain of the first binding arm (anti-CD3 arm) comprises an amino acid  sequence selected from SEQ ID NOs: 133-135, 137-140, 155 and 157, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 133-135 and 137-140, or an antigen-binding portion thereof, and the IgG light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 136, 141-143, 156 and 158, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 136 and 141-143, or antigen-binding portion thereof; the IgG heavy chain of the second binding arm (anti-LRRC15 arm) comprises an amino  acid sequence selected from SEQ ID NOs: 129, 131, and 153, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 129 and 131, or an antigen-binding portion thereof, and the IgG light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 130, 132, and 154, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 130 and 132, or antigen-binding portion thereof.

[0055] In certain embodiments, in a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody disclosed herein, the IgG heavy chain of the first binding arm (anti-CD3 arm) comprises an amino acid  sequence selected from SEQ ID NOs: 133-135, 137-140, 155, and 157, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 133-135 and 137-140, or an antigen-binding portion thereof, and the IgG light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 136, 141-143, 156, and 158, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 136 and 141-143, or antigen-binding portion thereof; the variable-heavy-chain-only single domain of the second binding arm (LRRC15- binding portion) comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 19-128, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 19-128, or an antigen-binding portion thereof.

[0056] In certain embodiments, in a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody disclosed herein, the IgG heavy chain of the first binding arm (anti-FAP arm) comprises an amino acid  sequence selected from SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, 17, 149, and 151 an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, and 17, or an antigen-binding portion thereof, and the IgG light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16, 18, 150, and 152, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16, and 18, or antigen-binding portion thereof; the variable-heavy-chain-only single domain of the second binding arm (LRRC15- binding portion) comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 19-128, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 19-128, or an antigen-binding portion thereof.

[0057] In certain embodiments, in a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody disclosed herein, the IgG heavy chain of the first binding arm (Fc-hyaluronidase fusion arm) comprises an  amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 352-358 and 144-148, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 352-358 and 144-148, or a portion thereof; the IgG heavy chain of the second binding arm (anti-FAP arm) comprises an amino acid  sequence selected from SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, 17, 149, and 151, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, and 17, or an antigen-binding portion thereof, and the IgG light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16, 18, 150, and 152, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16, and 18, or antigen-binding portion thereof; the variable-heavy-chain-only single domain of the second binding arm (LRRC15- binding portion) comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 19-128, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 19-128, or an antigen-binding portion thereof.

[0058] In certain embodiments, in a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody disclosed herein, the IgG heavy chain of the first binding arm (Fc-hyaluronidase fusion arm) comprises an  amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 352-358 and 144-148, an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 352-358 and 144-148, or a portion thereof; the variable-heavy-chain-only single domain of the second binding arm (EGFR-binding  portion) comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 165 and 166.

[0059] In certain embodiments, in a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody disclosed herein, the tandem variable-heavy-chain-only single domains of the first binding arm (EGFR- binding portion) comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 165 and 166; the IgG heavy chain of the second binding arm (anti-cMet arm) comprises an amino acid  sequence selected from SEQ ID NO: 161, and the IgG light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 162.

[0060] In certain embodiments, in a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody disclosed herein, the tandem variable-heavy-chain-only single domain or an antigen-binding portion of the  first binding arm (EGFR-binding portion) comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 165 and 166; and an scFv or an antigen-binding portion thereof of the first binding arm (VEGF-binding portion) comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 163 and 164; the IgG heavy chain of the second binding arm (anti-cMet arm) comprises an amino acid  sequence selected from SEQ ID NO: 161, and the IgG light chain of the first binding arm comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 162.

[0061] In certain embodiments, an antibody or multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody disclosed herein comprises a modified Fc to extend the half-life of the multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody, enhance resistance of the multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody to proteolytic degradation, reduce effector functionality of the multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody, facilitate generation of the multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody by Fc heterodimerization, facilitate multimerization of the multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody, and / or improve manufacturing and drug stability of the multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody.

[0062] In another aspect, the present disclosure provides a composition comprising an antibody or multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody disclosed herein. In certain embodiments, the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising an antibody or bispecific or trispecific antibody disclosed herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0063] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding an anti-CD3 or an antigen-binding portion thereof.

[0064] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding an anti-FAP or an antigen-binding portion thereof.

[0065] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding an anti-LRRC15 antibody or an antigen-binding portion thereof.

[0066] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding a human hyaluronidase enzyme domain or portion thereof or an Fc-fusion thereof.

[0067] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding an anti-EGFR or an antigen-binding portion thereof.

[0068] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding an anti-cMet antibody or an antigen-binding portion thereof.

[0069] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding an anti-VEGF antibody or an antigen-binding portion thereof.

[0070] In another aspect, the present disclosure provides a nucleic acid encoding the multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody, the first heavy chain protein or first heavy chain fusion protein, the first light chain protein, the second heavy chain protein or heavy chain fusion protein, and / or the second light chain protein disclosed herein.

[0071] In another aspect, the present disclosure provides a recombinant vector, such as an expression vector, comprising a nucleic acid disclosed herein.

[0072] In another aspect, the present disclosure provides a host cell comprising a recombinant vector such as an expression vector or a nucleic acid disclosed herein.

[0073] In another aspect, the present disclosure provides a method for preparing an antibody or multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody disclosed herein, comprising culturing a host cell disclosed herein, growing the host cell in a host cell culture, providing host cell culture conditions wherein a nucleic acid disclosed herein is expressed, and recovering the antibody or multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody from the host cell or from the host cell culture. In certain embodiments, the multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody is obtained using controlled Fab arm exchange.

[0074] Aspects of the invention include methods for treating a disease or condition characterized by expression of FAP, comprising administering to an individual in need an effective dose of a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody, or a pharmaceutical composition, described herein. In some embodiments, the disease is a cancer. In some embodiments, the cancer is a glioblastoma. In some embodiments, the cancer is a human non-small cell lung cancer.

[0075] Aspects of the invention include methods for treating a disease or condition characterized by expression of LRRC15, comprising administering to an individual in need an effective dose of a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody, or a pharmaceutical composition, described herein. In some embodiments, the disease is a cancer. In some embodiments, the cancer is a glioblastoma. In some embodiments, the cancer is an osteosarcoma.

[0076] Aspects of the invention include methods for treating a disease or condition characterized by expression of hyaluronic acid (HA) , comprising administering to an individual in need an effective dose of a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody, or a pharmaceutical composition, described herein. In some embodiments, the disease is a cancer. In some embodiments, the cancer is a colon carcinoma.

[0077] Aspects of the invention include methods for treating a disease or condition characterized by expression of EGFR, comprising administering to an individual in need an effective dose of a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody, or a pharmaceutical composition, described herein. In some embodiments, the disease is a cancer. In some embodiments, the cancer is a non-small cell lung cancer.

[0078] Aspects of the invention include methods for treating a disease or condition characterized by expression of cMet, comprising administering to an individual in need an effective dose of a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody, or a pharmaceutical composition, described herein. In some embodiments, the disease is a cancer. In some embodiments, the cancer is a non-small cell lung cancer.

[0079] Aspects of the invention include methods for treating a disease or condition characterized by expression of VEGF, comprising administering to an individual in need an effective dose of a multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody, or a pharmaceutical composition, described herein. In some embodiments, the disease is a cancer. In some embodiments, the cancer is a non-small cell lung cancer.

[0080] In another aspect, the present disclosure provides a method for mediating FAP, LRRC15, HA, EGFR, cMet, or VEGF in a subject in need thereof, comprising administering to the subject an effective amount of an antibody or multispecific (e.g., bispecific or trispecific) antibody or a pharmaceutical composition disclosed herein.

[0081] These and other embodiments of the present disclosure are described in greater detail herein.Brief Description of the Drawings

[0082] Figure 1 illustrates concentration-dependent ELISA binding of anti-FAP antibodies to recombinant human FAP, recombinant cynomolgus monkey FAP, and recombinant mouse FAP. The Y-axis units represent OD 450nm, while the X-axis units represent the concentration of the respective test articles in nM (nanomoles per liter) . The results show that all test molecules exhibited various levels of binding affinity to human, mouse, and cynomolgus FAP proteins, with the exception of a few that only showed binding to mouse FAP proteins. The heavy chain variable sequences and light chain variable sequences for the respective anti-FAP antibodies, FAP_MO36_v1, v2, v3, v4, v5, v6, FAP_MO33_v1, v2, v3, v4, v5, v6, FAP_MFP5_v0, v1, v2, v3, v4, v5, v6, v7, FAP_BIBH1_v1 and FAP_4B9 are provided as SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, 17, 149, 151 and SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16, 18, 150, 152, respectively.

[0083] Figure 2 displays concentration-dependent ELISA binding of FAP x CD3 bispecific antibodies to recombinant human FAP, recombinant cynomolgus monkey FAP, and recombinant mouse FAP. The Y-axis units represent OD 450nm, while the X-axis units represent the concentration of the respective test articles in nM (nanomoles per liter) . The bispecific antibodies contain a unique FAP targeting arm (with heavy chain variable sequences and light chain variable sequences provided as SEQ ID NOs: 1, 3, 7 and SEQ ID NOs: 5, 11 for FAP_MO36_v6, FAP_MO33_v6, FAP_MO33_v2, respectively) paired with an anti-CD3 arm (with heavy chain variable sequences and light chain variable sequences provided as SEQ ID NOs: 137, 140 and SEQ ID NOs: 142, 143 for Cris7_v3 and Cris7_v4, respectively) . The results showed that the test molecules had varying binding capabilities to human, mouse, and cynomolgus FAP proteins.

[0084] Figure 3 depicts concentration-dependent flow cytometry binding of anti-FAP antibodies to the U-87 MG (Figures 3A and 3B) and IMR-90 (Figures 3C) cell lines bearing FAP. The Y-axis units represent geometric Mean Fluorescence Intensity (gMFI) , while the X-axis units represent the concentration of the respective test articles in nM (nanomoles per liter) . The results show that all the test molecules exhibited varying levels of binding to FAP+ U-87 MG and IMR-90 cells. The heavy chain variable sequences and light chain variable sequences for the anti-FAP antibodies FAP_MO36_v1, v2, v3, v4, v5, v6, v7, FAP_MO33_v1, v2, v3, v4, v5, v6, FAP_MFP5_v0, v2, v3, v4, v5, v6, v7. FAP_BIBH1_v1 and FAP_4B9 are provided as SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, 17, 149, 151 and SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16, 18, 150, 152, respectively.

[0085] Figure 4 illustrates concentration-dependent T cell activation by FAP x CD3 bispecific antibodies in NFAT reporter assay. The bispecific antibodies contain a unique FAP targeting arm (with heavy chain variable sequences and light chain variable sequences for FAP_MO36_v6, FAP_MO33_v6 and FAP_4B9 provided as SEQ ID NOs: 3, 7, 149 and SEQ ID NOs: 5, 11, 150, respectively) paired with an anti-CD3 arm (with heavy chain variable sequences and light chain variable sequences for Cris7_v3, v4, 40G5_CD3 and 1979_CD3 provided as SEQ ID NOs: 137, 140, 155, 157 and SEQ ID NOs: 142, 143, 156, 158, respectively) . In the presence of FAP+ U-87 MG cells and serial diluted antibodies, T cell activation was measured using a reporter gene activation assay. The Y-axis units represent the luminescence signal of reporter gene activation, while the X-axis units represent the concentration of the respective test articles in nM (nanomoles per liter) . The results show that all the test molecules exhibited varying levels of T cell activation activity.

[0086] Figure 5 displays the ability of FAP x CD3 bispecific antibodies to induce PBMC (peripheral blood mononuclear cell) killing in the U-87 MG cell line. Serial dilutions of the bispecific antibodies, with a unique FAP targeting arm (with heavy chain variable sequences and light chain variable sequences for FAP_4B9 and FAP_MO36_v6 provided as SEQ ID NOs: 7, 149 and SEQ ID NOs: 11, 150, respectively) paired with an anti-CD3 arm (with heavy chain variable sequences and light chain variable sequences for 40G5_CD3 provided as SEQ ID NOs: 155 and SEQ ID NOs: 156, respectively) , were tested for their ability to kill FAP+U-87 MG human glioblastoma cells in the presence of human PBMCs. The experiment involved mixing PBMCs with U-87MG cells in a 5: 1 E: T (Effector: Tumor) ratio along with the addition of the bispecific antibody. Varying levels of T cell killing were observed. The x-axis represents the concentration of the antibody used in nM (nanomoles per liter) , and the y-axis represents the percentage of cell lysis of tumor cells 48 hours after the addition of the antibody.

[0087] Figure 6 illustrates antitumor effectiveness of FAP x CD3 bispecific antibodies combined with EGFR x cMet x VEGF (TAVO412) trispecific antibodies in treating A549 models of non-small cell lung cancer using PBMC humanized solid tumor xenograft models. FAP x CD3 (with heavy chain variable sequences and light chain variable sequences for FAP_4B9 provided as SEQ ID NOs: 149 and 150, respectively; and for 40G5_CD3 provided as SEQ ID NOs: 155 and 156, respectively) and TAVO412 (with heavy chain variable sequences and light chain variable sequences provided as SEQ ID NOs: 161, 163, 165-166 and 162, 164, respectively) were tested at 1 mg / kg and 2 mg / kg, respectively, in A549 xenograft models reconstituted with human PBMC. The schematic structures of the tested antibodies are depicted in Figure 6B and 6C. The combination treatment showed better tumor growth inhibition effect compared to any monotherapy.

[0088] Figure 7 displays concentration-dependent ELISA binding of anti-LRRC15 antibodies to recombinant human LRRC15 (Figure 7A-7L) . The ELISA binding assays demonstrated the binding to recombinant human LRRC15 protein coated on a plate by a series of anti-LRRC15 antibodies. The Y-axis units are OD 450nm, and the X-axis units are the concentration of the respective test articles in nM (nmol / L) units. The results revealed that all the test molecules exhibited varying levels of binding affinity to human LRRC15 protein (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 19-128 and 153 provided for anti-LRRC15_VHO245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 494, 499, 504, 511, 512, 513, and Abbv85, respectively; light chain variable sequence of SEQ ID NO: 154 provided for Abbv85) .

[0089] Figure 8 displays concentration-dependent ELISA binding of anti-LRRC15 antibodies to recombinant cynomolgus LRRC15 (Figure 8A-8L) . The ELISA binding assays demonstrated the binding to recombinant cynomolgus LRRC15 protein coated on a plate by a series of anti-LRRC15 antibodies. The Y-axis units are OD 450nm, and the X-axis units are the concentration of the respective test articles in nM (nmol / L) units. The results revealed that all the test molecules exhibited varying levels of binding affinity to cynomolgus LRRC15 protein (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 19-128 and 153 provided for anti-LRRC15_VHO245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 494, 499, 504, 511, 512, 513, and Abbv85, respectively; light chain variable sequence of SEQ ID NO: 154 provided for Abbv85) .

[0090] Figure 9 displays concentration-dependent ELISA binding of anti-LRRC15 antibodies to recombinant mouse LRRC15 (Figure 9A-9L) . The ELISA binding assays demonstrated the binding to recombinant mouse LRRC15 protein coated on a plate by a series of anti-LRRC15 antibodies. The Y-axis units are OD 450nm, and the X-axis units are the concentration of the respective test articles in nM (nmol / L) units. The results revealed that all the test molecules exhibited varying levels of binding affinity to mouse LRRC15 protein (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 19-128 and 153 provided for anti-LRRC15_VHO245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 494, 499, 504, 511, 512, 513, and Abbv85, respectively; light chain variable sequence of with SEQ ID NO: 154 provided for Abbv85) .

[0091] Figure 10 illustrates concentration-dependent ELISA binding of LRRC15 x CD3 antibodies to recombinant human and mouse LRRC15 (Figure 10A and 10B) . The figure depicts the ELISA binding activity of a serial dilutions of LRRC15 x CD3 bispecific antibodies, each with a unique LRRC15 targeting arm (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 109, 114, 119, 129 and 153 for LRRC15_VHO494-499, 499-494, 504-494, 494-504, Abbv85, and LRRC15-6; light chain variable sequences of SEQ ID NOs: 130 and 154 for Abbv85 and LRRC15-6, respectively) paired with an anti-CD3 arm (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 133, 135 and 155 for huSP34_v1, v9, and 40G5_CD3; light chain variable sequences of SEQ ID NOs: 136 and 156 for huSP34_v1, v9, and 40G5_CD3) . The ELISA binding assays demonstrate the binding to recombinant human and mouse LRRC15 protein coated on a plate by a series of LRRC15 x CD3 antibodies. The Y-axis units are OD 450nm, and the X-axis units are the concentration of the respective test articles in nM (nmol / L) units. The results indicate that all the test molecules exhibited varying levels of binding affinity to human and mouse LRRC15 protein, respectively.

[0092] Figure 11 depicts concentration-dependent flow cytometry binding of anti-LRRC15 antibodies to the U-118 MG human glioma cell line bearing LRRC15 (Figures 11A-11J) . The cell binding assays demonstrated the binding to LRRC15+ U-118 MG cells by a serial dilution of anti-LRRC15 antibodies. The Y-axis units are geometric Mean Fluorescence Intensity (gMFI) , and the X-axis units are the concentration of the respective test articles in nM (nmol / L) units. The results indicated that all the test molecules exhibited varying levels of binding to LRRC15+ U-118 MG cells (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 19-67, 74-76, 92, 99, 108-127 and 153 for LRRC15_VHO245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 452, 459, 460, 461, 477, 484, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, and Abbv85; light chain variable sequences of SEQ ID NOs: 154 for Abbv85) .

[0093] Figure 12 illustrates concentration-dependent flow cytometry binding of LRRC15 x CD3 antibodies to the U-118 MG human glioma cell line bearing LRRC15 (Figure 12A) . The cell binding activities were tested by flow cytometry of a serial dilutions of LRRC15 x CD3 bispecific antibodies, with a unique LRRC15 targeting arm (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 109, 114, 119 and 129 for LRRC15_VHO494-499, 499-494, 504-494, 494-504, and LRRC15-6, respectively; light chain variable sequence of SEQ ID NO: 130 for LRRC15-6) each paired with an anti-CD3 arm (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 133 and 155 for huSP34_v1 and 40G5_CD3, respectively; light chain variable sequences of SEQ ID NOs: 136 and 156 for huSP34_v1 and 40G5_CD3, respectively) . The Y-axis units are geometric Mean Fluorescence Intensity (gMFI) , and the X-axis units are the concentration of the respective test articles in nM (nmol / L) units. The results indicate that all the test molecules exhibited varying levels of binding to LRRC15+ U-118 MG cells.

[0094] Figure 13 depicts concentration-dependent T cell activation by LRRC15 x CD3 bispecific antibodies in NFAT reporter assay. T cell activation activities were tested with a serial dilutions of LRRC15 x CD3 bispecific antibodies, with a unique LRRC15 targeting arm (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 109, 114, 119 and 131 for LRRC15_VHO494, 499, 504, 494-499, 499-494, 494-504, 504-494, and LRRC15-7, respectively; light chain variable sequence of SEQ ID NO: 132 for LRRC15-7) each paired with an anti-CD3 arm (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 133 and 155 for huSP34_v1 and 40G5_CD3, respectively; light chain variable sequences of SEQ ID NOs: 136 and 156 for huSP34_v1 and 40G5_CD3, respectively) . In the presence of LRRC15+ U-87 MG human glioma cells (Figure 13A) or U-2 OS human osteosarcoma cells (Figure 13B) , T cell activation was measured using a reporter gene activation assay with the addition of test antibodies. The Y-axis units represent the luminescence signal of reporter gene activation, and the X-axis units represent the concentration of the respective test articles in nM (nmol / L) units. The results indicate that all the test molecules exhibited varying levels of T cell activation activity.

[0095] Figure 14 illustrates the capability of LRRC15 x CD3 bispecific antibodies to induce T cell cytotoxicity in the U-118 MG human glioma cell line. Serial dilutions of LRRC15 x CD3 bispecific antibodies, with a unique LRRC15 targeting arm (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 109, 114, 119 and 129 for LRRC15_VHO494, 499, 504, 494-499, 499-494, 494-504, 504-494, and LRRC15-6, respectively; light chain variable sequence of SEQ ID NO: 130 for LRRC15-6) each paired with an anti-CD3 arm (heavy chain variable sequences of SEQ ID NOs: 133 and 155 for huSP34_v1 and 40G5_CD3, respectively; light chain variable sequences of SEQ ID NOs: 136 and 156 for huSP34_v1 and 40G5_CD3, respectively) , were tested for the ability to kill LRRC15+ U-118 MG human glioblastoma cells in the presence of human PBMCs (Figures. 14A and 14B) . In this experiment, U-118 MG cells were mixed with PBMCs in a 5: 1 E: T ratio along with the addition of bispecific antibody. Varying levels of T cell killing were observed. The x-axis shows the concentration of antibody used in nM (nmol / L) , and the y-axis shows the %cell lysis of tumor cells 48 hours after the addition of the antibody.

[0096] Figure 15 depicts concentration-dependent flow cytometry binding of EGFR x HYAL bispecific antibodies to the HCC827 human non-small cell lung cancer cell line bearing EGFR (Figure 15A) . Serial dilutions of EGFR x HYAL bispecific antibodies, with a unique EGFR targeting arm (heavy chain variable sequence of SEQ ID NO: 165) paired with the HYAL arm (SEQ ID NO: 148) , were used. The Y-axis units represent geometric Mean Fluorescence Intensity (gMFI) , and the X-axis units represent the concentration of the respective test articles in nM (nmol / L) units. The results indicated that EGFR x HYAL molecules have a similar cell binding ability as the EGFR-inert arm antibody to EGFR+ HCC827 cells. The schematic structures of the tested antibodies or fusion protein are shown in Figures 15B-D.

[0097] Figure 16 displays SDS-PAGE analysis of HYAL-Fc fusion proteins with different linkers. HYAL (SEQ ID NO: 148) is fused to an Fc domain with a flexible linker (SEQ ID NO: 167, Figure 16A) , a rigid linker (SEQ ID NO: 170, Figure 16B) , or (SEQ ID NO: 171, Figure 16C) . The SDS-PAGE analysis shows that the HYAL-Fc fusion displays a monomer band under reducing conditions and a homodimer band under non-reducing conditions. The dark arrows with a solid line indicate the band for the fragment, and arrows with a dashed line indicate the band for aggregation. M represents the marker, R denotes reducing conditions, and N-R represents non-reducing conditions.

[0098] Figure 17 illustrates concentration-dependent flow cytometry binding of FAP x LRRC15 bispecific antibodies to U-87 MG and IMR90 cell lines (Figure 17A, 17B) . Serial dilutions of anti-FAP antibody and FAP x LRRC15 bispecific antibodies, with a FAP arm of FAP_4B9 (heavy chain variable sequences provided as SEQ ID NO: 149; light chain variable sequence as SEQ ID NO: 150) , and an LRRC15 arm (heavy chain variable sequences as SEQ ID NOs: 109, 114 for LRRC15_VHO494-499 and LRRC15_VHO499-494) were tested for binding activity to tumor cells. The Y-axis units represent geometric Mean Fluorescence Intensity (gMFI) , and the X-axis units represent the concentration of the respective test articles in nM (nmol / L) units. The results indicate that all the test molecules showed varying levels of binding to U-87 MG and IMR-90 cells, respectively. The schematic structures of the tested antibodies are shown in Figure 17C.

[0099] Figure 18 demonstrates antitumor efficacy of the FAP x LRRC15 x HYAL trispecific antibody in RKO colorectal carcinoma cell xenograft model. FAP x LRRC15 x HYAL (comprising FAP_4B9 (SEQ ID NO: 149 as heavy chain variable sequence and SEQ ID NO:150 as light chain variable sequence) , LRRC15_VHO494-499 (SEQ ID NOs: 109 and 114 as heavy chain variable sequence) , and HYAL (SEQ ID NO: 148) ) at 5 mg / kg induced tumor growth inhibition (Figure 18A) and tumor weight reduction (Figure 18B) in the RKO xenograft model. The schematic structure of the tested antibody is shown in Figure 18C. The FAP x LRRC15 x HYAL trispecific antibody comprises sequences comprising SEQ ID NOs: 190-192.

[0100] Figure 19 demonstrates antitumor efficacy of the FAP x LRRC15 x HYAL trispecific antibody in combination with 5T4 x CD3 in treating RKO colorectal carcinoma cell xenograft model. FAP x LRRC15 x HYAL (comprising FAP_4B9 (SEQ ID NO: 149 as heavy chain variable sequence and SEQ ID NO: 150 as light chain variable sequence) , LRRC15_VHO494-499 (SEQ ID NOs: 109 and 114 as heavy chain variable sequence) , and HYAL (SEQ ID NO: 148) at a dose of 5 mg / kg, in combination with 5T4 x CD3 (comprising 5T4 (SEQ ID NO: 159 as heavy chain variable sequence and SEQ ID NO: 160 as light chain variable sequence) and CD3 (SEQ ID NO: 155 as heavy chain variable sequence and SEQ ID NO: 156 as light chain variable sequence) at a dose of 0.5 mg / kg were tested in RKO (Figure 19A) xenograft model reconstituted with human PBMC. 5T4 x CD3 bispecific as a monotherapy showed no tumor inhibition effect, while the combination with FAP x LRRC15 x HYAL delayed the tumor growth compared to the control tumor. The schematic structures of the tested antibodies are shown in Figures 19B and 19C.

[0101] Figure 20 demonstrates antitumor efficacy of the FAP x LRRC15 x HYAL trispecific antibody in combination with TAVO412A for treating RKO colorectal carcinoma cell xenograft model. The study tested combination of FAP x LRRC15 x HYAL (comprising FAP_4B9 (SEQ ID NO: 149 as heavy chain variable sequence and SEQ ID NO: 150 as light chain variable sequence) , LRRC15_VHO494-499 (SEQ ID NO: 109 and 114 as heavy chain variable sequence) , and HYAL (SEQ ID NO: 148) at 5 mg / kg, and TAVO412A (comprising cMet (SEQ ID NO: 161 as heavy chain variable sequence and SEQ ID NO: 162 as light chain variable sequence) , EGFR (SEQ ID NO: 163 and 164 as heavy chain variable sequence) ) at 10 mg / kg in RKO xenograft model reconstituted with human PBMC (Figure. 20A) . TAVO412A as a monotherapy showed minimal tumor inhibition effect, while the combination with FAP x LRRC15 x HYAL delayed the tumor growth compared to the control tumor. The schematic structures of the tested antibodies are shown in Figures 20B and 20C. The TAVO412A bispecific antibody comprises sequences comprising SEQ ID NOs: 193, 195 and 196.

[0102] Figure 21 displays structural formats of trispecific antibodies targeting FAP, LRRC15, and HA. Different formats of trispecific antibody that may have unique utilities are shown in Figures 21A-F. Definitions

[0103] All publications, including but not limited to disclosures and disclosure applications, cited in this specification are herein incorporated by reference as though fully set forth. If certain content of a reference cited herein contradicts or is inconsistent with the present disclosure, the present disclosure controls.

[0104] It is to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to be limiting. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the disclosure pertains.

[0105] Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice for testing of the present disclosure, exemplary materials and methods are described herein. In describing and claiming the present disclosure, the following terminology will be used.

[0106] As used in this specification and the appended claims, the singular forms “a, ” “an, ” and “the” include plural referents unless the content clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to “acell” includes a combination of two or more cells, and the like.

[0107] “Antibodies” is meant in a broad sense and includes immunoglobulin molecules including monoclonal antibodies including murine, human, humanized and chimeric monoclonal antibodies, antibody fragments, multi-specific (e.g., bispecific or trispecific) antibodies, dimeric, tetrameric or multimeric antibodies, single chain antibodies, domain antibodies and any other modified configuration of the immunoglobulin molecule that comprises an antigen binding site of the required specificity.

[0108] “Full length antibody molecules” are comprised of two heavy chains (HC) and two light chains (LC) inter-connected by disulfide bonds as well as multimers thereof (e.g., IgM) . Each heavy chain is comprised of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (comprised of domains CH1, hinge, CH2 and CH3) . Each light chain is comprised of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL) . The VH and the VL regions may be further subdivided into regions of hyper variability, termed complementarity determining regions (CDR) , interspersed with framework regions (FR) . Each VH and VL is composed of three CDRs and four FR segments, arranged from amino-to-carboxyl-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4.

[0109] “Complementarity determining regions (CDR) ” are “antigen binding sites” in an antibody. CDRs may be defined using various terms: (i) Complementarity Determining Regions (CDRs) , three in the VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) and three in the VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) are based on sequence variability (Kabat, 1991; Wu &Kabat, 1970) . (ii) “Hypervariable regions, ” “HVR, ” or “HV, ” three in the VH (H1, H2, H3) and three in the VL (L1, L2, L3) refer to the regions of an antibody variable domains which are hypervariable in structure as defined by Chothia and Lesk (Chothia &Lesk, 1987) . The International ImMunoGeneTics (IMGT) database (http:  / / www_imgt_org) provides a standardized numbering and definition of antigen-binding sites. The correspondence between CDRs, HVs and IMGT delineations are described (Lefranc et al., 2003) . The term “CDR, ” “HCDR1, ” “HCDR2, ” “HCDR3, ” “LCDR1, ” “LCDR2” and “LCDR3” as used herein includes CDRs defined by any of the methods described supra, Kabat, Chothia or IMGT, unless otherwise explicitly stated in the specification.

[0110] Immunoglobulins may be assigned to five major classes, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, depending on the heavy chain constant region amino acid sequence. IgA and IgG are further sub-classified as the isotypes IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. Antibody light chains of any vertebrate species may be assigned to one of two clearly distinct types, namely kappa (κ) and lambda (λ) , based on the amino acid sequences of their constant regions.

[0111] “Antibody fragment, ” “antigen-binding fragment, ” or “antigen-binding portion, ” refers to a portion of an immunoglobulin molecule that retains the heavy chain and / or the light chain antigen binding site, such as heavy chain complementarity determining regions (HCDR) 1, 2 and 3, light chain complementarity determining regions (LCDR) 1, 2 and 3, a heavy chain variable region (VH) , or a light chain variable region (VL) . Antibody fragments include well known Fab, F (ab’ ) 2, Fd and Fv fragments as well as domain antibodies (dAb) consisting of one VH domain. VH and VL domains may be linked together via a synthetic linker to form various types of single chain antibody designs where the VH / VL domains may pair intramolecularly, or intermolecularly in those cases when the VH and VL domains are expressed by separate single chain antibody constructs, to form a monovalent antigen binding site, such as single chain Fv (scFv) or diabody; described for example in Int. Disclosure Publ. Nos. WO1998 / 44001, WO1988 / 01649, WO1994 / 13804 and WO1992 / 01047.

[0112] “Monoclonal antibody” refers to an antibody population with single amino acid composition in each heavy and each light chain, except for possible well-known alterations such as removal of C-terminal lysine from the antibody heavy chain. Monoclonal antibodies typically bind one antigenic epitope, except that trispecific monoclonal antibodies bind two distinct antigenic epitopes. Monoclonal antibodies may have heterogeneous glycosylation within the antibody population. Monoclonal antibody may be monospecific or multi-specific, or monovalent, bivalent or multivalent. A trispecific antibody is included in the term monoclonal antibody.

[0113] “Isolated antibody” refers to an antibody or antibody fragment that is substantially free of other antibodies having different antigenic specificities. “Isolated antibody” encompasses antibodies that are isolated to a higher purity, such as antibodies that are 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or 100%pure.

[0114] “Humanized antibody” refers to an antibody in which the antigen binding sites are derived from non-human species and the variable region frameworks are derived from human immunoglobulin sequences. Humanized antibodies may include substitutions in the framework so that the framework may not be an exact copy of expressed human immunoglobulin or human immunoglobulin germline gene sequences.

[0115] “Human antibody” refers to an antibody having heavy and light chain variable regions in which both the framework and the antigen binding site are derived from sequences of human origin and is optimized to have minimal immune response when administered to a human subject. If the antibody contains a constant region or a portion of the constant region, the constant region also is derived from sequences of human origin.

[0116] The numbering of amino acid residues in the antibody constant region throughout the specification is according to the EU index as described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (Kabat, 1991) , unless otherwise explicitly stated.

[0117] Conventional one and three-letter amino acid codes are used herein as shown in Table 1. Table 1. Amino acids

[0118] The polypeptides, nucleic acids, fusion proteins, and other compositions provided herein may encompass polypeptides, nucleic acids, fusion proteins, and the like that have a recited percent identity to an amino acid sequence or DNA sequence provided herein. The term “identity” refers to a relationship between the sequences of two or more polypeptide molecules or two or more nucleic acid molecules, as determined by aligning and comparing the sequences. “Percent identity, ” “percent homology, ” “sequence identity, ” or “sequence homology” and the like mean the percent of identical residues between the amino acids or nucleotides in the compared molecules and is calculated based on the size of the smallest of the molecules being compared. For these calculations, gaps in alignments (if any) are preferably addressed by a particular mathematical model or computer program (i.e., an “algorithm” ) . Methods that can be used to calculate the identity of the aligned nucleic acids or polypeptides include those described in Computational Molecular Biology (Lesk, 1988) ; Biocomputing Informatics and Genome Projects (Smith, 1994) ; Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin &Griffin, 1994) ; Sequence Analysis in Molecular Biology (Heijne, 1987) ; Sequence Analysis Primer (Gribskov &Devereux, 2020) ; 1991, New York: M. Stockton Press; and SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (Carrillo &Lipman, 1988) . In calculating percent identity, the sequences being compared are typically aligned in a way that gives the largest match between the sequences.

[0119] The constant region sequences of the mammalian IgG heavy chain are designated in sequence as CH1-hinge-CH2-CH3. The “hinge, ” “hinge region” or “hinge domain” of an IgG is generally defined as including Glu216 and terminating at Pro230 of human IgG1 according to the EU Index but functionally, the flexible portion of the chain may be considered to include additional residues termed the upper and lower hinge regions, such as from Glu216 to Gly237 and the lower hinge has been referred to as residues 233 to 239 of the Fc region where FcγR binding is generally attributed. Hinge regions of other IgG isotypes may be aligned with the IgG1 sequence by placing the first and last cysteine residues forming inter-heavy chain S-Sbonds. Although boundaries may vary slightly, as numbered according to the EU Index, the CH1 domain is adjacent to the VH domain and amino terminal to the hinge region of an immunoglobulin heavy chain molecule and includes the first (most amino terminal) constant region of an immunoglobulin heavy chain, e.g., from about EU positions 118-215. The Fc domain extends from amino acid 231 to amino acid 447; the CH2 domain is from about Ala231 to Lys340 or Gly341 and the CH3 from about Gly341 or Gln342 to Lys447. The residues of the IgG heavy chain constant region of the CH1 region terminate at Lys. The Fc domain containing molecule comprises at least the CH2 and the CH3 domains of an antibody constant region, and therefore comprises at least a region from about Ala231 to Lys447 of IgG heavy chain constant region. The Fc domain containing molecule may optionally comprise at least a portion of the hinge region.

[0120] “Epitope” refers to a portion of an antigen to which an antibody specifically binds. Epitopes typically consist of chemically active (such as polar, non-polar or hydrophobic) surface groupings of moieties such as amino acids or polysaccharide side chains and may have specific three-dimensional structural characteristics, as well as specific charge characteristics. An epitope may be composed of contiguous and / or discontiguous amino acids that form a conformational spatial unit. For a discontiguous epitope, amino acids from differing portions of the linear sequence of the antigen come in close proximity in 3-dimensional space through the folding of the protein molecule. Antibody “epitope” depends on the methodology used to identify the epitope.

[0121] A “leader sequence” as used herein includes any signal peptide that can be processed by a mammalian cell, including the human B2M leader. Such sequences are well-known in the art.

[0122] The terms “peptide, ” “polypeptide, ” and “protein” are used interchangeably herein, and refer to a polymeric form of amino acids of any length, which can include coded and non-coded amino acids, chemically or biochemically modified or derivatized amino acids, and polypeptides having modified peptide backbones. The terms also include polypeptides that have co-translational (e.g., signal peptide cleavage) and post-translational modifications of the polypeptide, such as, for example, disulfide-bond formation, glycosylation, acetylation, phosphorylation, proteolytic cleavage, and the like.

[0123] Furthermore, as used herein, a “polypeptide” refers to a protein that includes modifications, such as deletions, additions, and substitutions (generally conservative in nature as would be known to a person in the art) to the native sequence, as long as the protein maintains the desired activity. These modifications can be deliberate, as through site-directed mutagenesis, or can be accidental, such as through mutations of hosts that produce the proteins, or errors due to PCR amplification or other recombinant DNA methods.

[0124] The term “recombinant, ” as used herein to describe a nucleic acid molecule, means a polynucleotide of genomic, cDNA, viral, semisynthetic, and / or synthetic origin, which, by virtue of its origin or manipulation, is not associated with all or a portion of the polynucleotide sequences with which it is associated in nature. The term “recombinant, ” as used with respect to a protein or polypeptide, refers to a polypeptide produced by expression from a recombinant polynucleotide. The term “recombinant, ” as used with respect to a host cell or a virus, refers to a host cell or virus into which a recombinant polynucleotide has been introduced. Recombinant is also used herein to refer to, with reference to material (e.g., a cell, a nucleic acid, a protein, or a vector) that the material has been modified by the introduction of a heterologous material (e.g., a cell, a nucleic acid, a protein, or a vector) .

[0125] The terms “polynucleotide, ” “oligonucleotide, ” “nucleic acid” and “nucleic acid molecule” are used interchangeably herein to include a polymeric form of nucleotides, either ribonucleotides or deoxyribonucleotides. This term refers only to the primary structure of the molecule.

[0126] “Vector” refers to a polynucleotide capable of being duplicated within a biological system or that can be moved between such systems. Vector polynucleotides typically contain elements, such as origins of replication, polyadenylation signal or selection markers, that function to facilitate the duplication or maintenance of these polynucleotides in a biological system, such as a cell, virus, animal, plant, and reconstituted biological systems utilizing biological components capable of duplicating a vector. The vector polynucleotide may be DNA or RNA molecules, cDNA, or a hybrid of these, single stranded or double stranded.

[0127] “Expression vector” refers to a vector that can be utilized in a biological system or in a reconstituted biological system to direct the translation of a polypeptide encoded by a polynucleotide sequence present in the expression vector.

[0128] As used herein, the term “heterologous” used in reference to nucleic acid sequences, proteins or polypeptides, means that these molecules are not naturally occurring in the cell from which the heterologous nucleic acid sequence, protein or polypeptide is derived. For example, the nucleic acid sequence coding for a human polypeptide that is inserted into a cell that is not a human cell is a heterologous nucleic acid sequence in that particular context. Whereas heterologous nucleic acids may be derived from different organism or animal species, such nucleic acid need not be derived from separate organism species to be heterologous. For example, in some instances, a synthetic nucleic acid sequence or a polypeptide encoded therefrom may be heterologous to a cell into which it is introduced in that the cell did not previously contain the synthetic nucleic acid. As such, a synthetic nucleic acid sequence or a polypeptide encoded therefrom may be considered heterologous to a human cell, e.g., even if one or more components of the synthetic nucleic acid sequence or a polypeptide encoded therefrom is originally derived from a human cell.

[0129] A “host cell, ” as used herein, denotes an in vivo or in vitro eukaryotic cell or a cell from a multicellular organism (e.g., a cell line) cultured as a unicellular entity, which eukaryotic cells can be, or have been, used as recipients for a nucleic acid (e.g., an expression vector that comprises a nucleotide sequence encoding a multimeric polypeptide of the present disclosure) , and include the progeny of the original cell which has been genetically modified by the nucleic acid. It is understood that the progeny of a single cell may not necessarily be completely identical in morphology or in genomic or total DNA complement as the original parent, due to natural, accidental, or deliberate mutation. A “recombinant host cell” (also referred to as a “genetically modified host cell” ) is a host cell into which has been introduced a heterologous nucleic acid, e.g., an expression vector. For example, a genetically modified eukaryotic host cell is genetically modified by virtue of introduction into a suitable eukaryotic host cell a heterologous nucleic acid, e.g., an exogenous nucleic acid that is foreign to the eukaryotic host cell, or a recombinant nucleic acid that is not normally found in the eukaryotic host cell.

[0130] “Specific binding” or “specifically binds” or “binds” refer to an antibody binding to a specific antigen with greater affinity than for other antigens. Typically, the antibody “specifically binds” when the equilibrium dissociation constant (KD) for binding is about 1×10-8 M or less, for example about 1×10-9 M or less, about 1×10-10 M or less, about 1×10-11 M or less, or about 1×10-12 M or less, typically with the KD that is at least one hundred-fold less than its KD for binding to a non-specific antigen (e.g., BSA, casein) . The KD may be measured using standard procedures.

[0131] As used herein, the terms “treatment, ” “treating, ” and the like, refer to obtaining a desired pharmacologic and / or physiologic effect. The effect may be prophylactic in terms of completely or partially preventing a disease or symptom thereof and / or may be therapeutic in terms of a partial or complete cure for a disease and / or adverse effect attributable to the disease. “Treatment, ” as used herein, covers any treatment of a disease in a mammal, e.g., in a human, and includes: (a) preventing the disease from occurring in a subject which may be predisposed to the disease but has not yet been diagnosed as having it; (b) inhibiting the disease, i.e., arresting its development; and (c) relieving the disease, i.e., causing regression of the disease.

[0132] The terms “individual, ” “subject, ” “host, ” and “patient, ” used interchangeably herein, refer to a mammal, including, but not limited to, murines (e.g., rats, mice) , lagomorphs (e.g., rabbits) , non-human primates, humans, canines, felines, ungulates (e.g., equines, bovines, ovines, porcines, caprines) , etc.

[0133] A “therapeutically effective amount” or “efficacious amount” refers to the amount of an agent, or combined amounts of two agents, that, when administered to a mammal or other subject for treating a disease, is sufficient to affect such treatment for the disease. The “therapeutically effective amount” will vary depending on the agent (s) , the disease and its severity and the age, weight, etc., of the subject to be treated.

[0134] Before the present disclosure is further described, it is to be understood that this disclosure is not limited to particular embodiments described, as such may, of course, vary. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to be limiting, since the scope of the present disclosure will be limited only by the appended claims.

[0135] The following examples described the invention in further detail which are not intended to limit the scope of protection for the invention. Composition of antibody and antigen-binding fragment Anti-FAP antibodies

[0136] In some embodiments, the present disclosure provides anti-FAP antibodies and antigen-binding portions thereof. As non-limiting examples, the disclosure provides amino acid sequences for anti-FAP antibodies set forth as SEQ ID NOs: 1-18 in Table 2, and SEQ ID NOs: 149-152 in Table 10.

[0137] In some embodiments, the disclosure provides an anti-FAP antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity (e.g., 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) to any one of SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14 and 17 or an antigen-binding portion thereof, and a light chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity (e.g., 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) to any one of SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16 and 18 or an antigen-binding portion thereof.

[0138] In some embodiments, the disclosure provides an anti-FAP antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence comprising: SEQ ID NOs: 1 and 4; SEQ ID NOs: 1 and 5; SEQ ID NOs: 2 and 4; SEQ ID NOs: 2 and 5; SEQ ID NOs: 3 and 4; SEQ ID NOs: 3 and 5; SEQ ID NOs: 6 and 9; SEQ ID NOs: 6 and 10; SEQ ID NOs: 6 and 11; SEQ ID NOs: 7 and 9; SEQ ID NOs: 7 and 10; SEQ ID NOs: 7 and 11; SEQ ID NOs: 8 and 9; SEQ ID NOs: 8 and 10; SEQ ID NOs: 8 and 11; SEQ ID NOs: 12 and 15; SEQ ID NOs: 13 and 15; SEQ ID NOs: 14 and 15; SEQ ID NOs: 12 and 16; SEQ ID NOs: 13 and 16; SEQ ID NOs: 14 and 16; SEQ ID NOs: 17 and 18; SEQ ID NOs: 149 and 150; SEQ ID NOs: 151 and 152; respectively.

[0139] The anti-FAP antibodies of the present disclosure encompass full length antibody comprising two heavy chains and two light chains. The antibodies can be human, humanized, or chimeric antibodies. Humanized antibodies, as used herein, include chimeric antibodies and CDR-grafted antibodies. Chimeric antibodies are antibodies that include a nonhuman antibody variable region linked to a human constant region. CDR-grafted antibodies are antibodies that include the CDRs from a non-human "donor" antibody linked to the framework region from a human "recipient" antibody. Exemplary human or humanized antibodies include IgG, IgM, IgE, IgA, and IgD antibodies. The present antibodies can be of any class (IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, etc. ) or isotype. For example, a human antibody can comprise an IgG Fc domain, such as at least one of isotypes, IgGl, IgG2, IgG3, or IgG4.

[0140] Molecules, such as antibody-drug conjugates and multispecific antibodies, which comprise the anti-FAP antibodies or antigen-binding fragments disclosed herein, are also within the scope of the present disclosure.

[0141] In some embodiments, the anti-FAP or antigen-binding portion thereof is selected from the group consisting of a whole antibody, an antibody fragment, a human antibody, humanized antibody, a single chain antibody, a conjugate, an antibody mimetic, and a defucosylated antibody. In further examples, the anti-FAP fragment is selected from the group consisting of a UniBody, a variable heavy only single domain antibody, and a Nanobody. In some examples, the anti-FAP fragment is selected from the group consisting of a single domain VHH, a single domain VHO, an Affibody, a DARPin, an Anticalin, an Avimer, a Versa body, and a Duocalin. Table 2. Variable Region Sequences of anti-FAP antibodies Table 3. Anti-FAP antibodies Anti-LRRC15 antibodies

[0142] In some embodiments, the present disclosure provides anti-LRRC15 antibodies and antigen-binding portions thereof. As non-limiting examples, the disclosure provides for anti-LRRC15 amino acid sequences set forth as SEQ ID NOs: 19-132 in Table 4 and SEQ ID NOs: 153-154 in Table 10.

[0143] In some embodiments, the disclosure provides an anti-LRRC15 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising: a heavy chain variable region comprising complementarity determining region (CDR)  sequences HCDR1, HCDR2, and HCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 comprises: SEQ ID NOs: 217, 325, and 350; SEQ ID NOs: 198, 199, and 200; SEQ ID NOs: 198, 351, and 201; SEQ ID NOs: 202, 203, and 204; SEQ ID NOs: 198, 351, and 205; SEQ ID NOs: 198, 206, and 207; SEQ ID NOs: 198, 199, and 209; SEQ ID NOs: 198, 203, and 210; SEQ ID NOs: 198, 351, and 211; SEQ ID NOs: 198, 199, and 212; SEQ ID NOs: 198, 206, and 213; SEQ ID NOs: 198, 199, and 214; SEQ ID NOs: 208, 203, and 215; SEQ ID NOs: 216, 217, and 218; SEQ ID NOs: 208, 203, and 219; SEQ ID NOs: 198, 203, and 220; SEQ ID NOs: 208, 203, and 221; SEQ ID NOs: 198, 203, and 222; SEQ ID NOs: 198, 351, and 223; SEQ ID NOs: 198, 351, and 224; SEQ ID NOs: 208, 203, and 225; SEQ ID NOs: 198, 203, and 226; SEQ ID NOs: 202, 199, and 227; SEQ ID NOs: 198, 228, and 229; SEQ ID NOs: 198, 203, and 230; SEQ ID NOs: 198, 203, and 231; SEQ ID NOs: 198, 203, and 232; SEQ ID NOs: 208, 206, and 233; SEQ ID NOs: 198, 351, and 234; SEQ ID NOs: 198, 235, and 236; SEQ ID NOs: 198, 199, and 237; SEQ ID NOs: 198, 351, and 238; SEQ ID NOs: 198, 203, and 239; SEQ ID NOs: 216, 203, and 240; SEQ ID NOs: 198, 203, and 241; SEQ ID NOs: 198, 351, and 242; SEQ ID NOs: 198, 243, and 244; SEQ ID NOs: 198, 351, and 245; SEQ ID NOs: 208, 351, and 246; SEQ ID NOs: 216, 203, and 247; SEQ ID NOs: 198, 199, and 248; SEQ ID NOs: 202, 203, and 249; SEQ ID NOs: 198, 203, and 250; SEQ ID NOs: 216, 203, and 251; SEQ ID NOs: 198, 252, and 253; SEQ ID NOs: 208, 254, and 255; SEQ ID NOs: 198, 256, and 257; SEQ ID NOs: 198, 203, and 258; SEQ ID NOs: 198, 259, and 260; SEQ ID NOs: 216, 261, and 262; SEQ ID NOs: 208, 272, and 273; SEQ ID NOs: 198, 263, and 264; SEQ ID NOs: 208, 206, and 265; SEQ ID NOs: 202, 203, and 266; SEQ ID NOs: 198, 199, and 267; SEQ ID NOs: 216, 256, and 268; SEQ ID NOs: 198, 199, and 269; SEQ ID NOs: 198, 261, and 270; SEQ ID NOs: 202, 203, and 271; SEQ ID NOs: 216, 272, and 274; SEQ ID NOs: 198, 206, and 275; SEQ ID NOs: 208, 276, and 277; SEQ ID NOs: 198, 203, and 278; SEQ ID NOs: 198, 199, and 279; SEQ ID NOs: 198, 280, and 281; SEQ ID NOs: 216, 203, and 282; SEQ ID NOs: 202, 283, and 284; SEQ ID NOs: 216, 285, and 286; SEQ ID NOs: 198, 285, and 287; SEQ ID NOs: 208, 288, and 289; SEQ ID NOs: 198, 261, and 290; SEQ ID NOs: 198, 261, and 291; SEQ ID NOs: 208, 288, and 292; SEQ ID NOs: 202, 293, and 294; SEQ ID NOs: 198, 295, and 296; SEQ ID NOs: 198, 297, and 298; SEQ ID NOs: 198, 299, and 300; SEQ ID NOs: 198, 217, and 301; SEQ ID NOs: 198, 302, and 303; SEQ ID NOs: 216, 285, and 304; SEQ ID NOs: 198, 203, and 305; SEQ ID NOs: 208, 297, and 306; SEQ ID NOs: 216, 285, and 307; SEQ ID NOs: 216, 297, and 308; SEQ ID NOs: 202, 309, and 310; SEQ ID NOs: 216, 311, and 312; SEQ ID NOs: 202, 313, and 314; SEQ ID NOs: 216, 315, and 316; SEQ ID NOs: 208, 317, and 318; SEQ ID NOs: 198, 309, and 319; SEQ ID NOs: 202, 320, and 321; SEQ ID NOs: 208, 322, and 323; SEQ ID NOs: 198, 297, and 324; SEQ ID NOs: 216, 325, and 326; SEQ ID NOs: 202, 217, and 327; SEQ ID NOs: 198, 322, and 328; SEQ ID NOs: 198, 252, and 329; SEQ ID NOs: 208, 330, and 331; SEQ ID NOs: 198, 313, and 332; SEQ ID NOs: 216, 333, and 334; SEQ ID NOs: 198, 252, and 335; SEQ ID NOs: 198, 199, and 336; SEQ ID NOs: 216, 337, and 338; SEQ ID NOs: 202, 320, and 339; SEQ ID NOs: 208, 330, and 340; SEQ ID NOs: 208, 295, and 341; SEQ ID NOs: 198, 280, and 342; SEQ ID NOs: 202, 309, and 343; SEQ ID NOs: 198, 203, and 344; or SEQ ID NOs: 198, 235, and 345; respectively.

[0144] In some embodiments, the disclosure provides an anti-LRRC15 or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity (e.g., 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) to any one of SEQ ID NO: 129 and 131 or an antigen-binding portion thereof, and a light chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity (e.g., 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) to any one of SEQ ID NOs: 130 and 132, or an antigen-binding portion thereof.

[0145] In some embodiments, the disclosure provides an anti-LRRC15 or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence comprising: SEQ ID NOs: 129 and 130; SEQ ID NOs: 131 and 132; SEQ ID NOs: 153 and 154; respectively.

[0146] In some embodiments, the present disclosure provides an anti-LRRC15 or an antigen-binding portion thereof, comprising at least one variable-heavy-chain-only single domain or an antigen-binding portion thereof, wherein the at least one variable-heavy-chain-only (VHO) single-domain comprises an amino acid sequence with at least 85%identity (e.g., 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) to any one of SEQ ID NOs: 19-128 or an antigen-binding portion thereof.

[0147] In some embodiments, the anti-LRRC15 antibodies of the present disclosure encompass full length antibody comprising two heavy chains and two light chains, or two variable-heavy-chain-only single domain fusion heavy chains. The antibodies can be human, humanized, or chimeric antibodies. Molecules, such as antibody-drug conjugates and multispecific antibodies, which comprise the anti-FAP antibodies or antigen-binding fragments disclosed herein, are also within the scope of the present disclosure.

[0148] In some embodiments, the anti-LRRC15 antibodies of the present disclosure may comprise, in tandem, two to four, such as two or three, IgG variable-heavy-chain-only single domains or antigen-binding portion thereof, wherein the two or three IgG variable heavy chain only single domains or an antigen-binding portion thereof are optionally connected via one or more linkers. A tandem of VHOs means that multiple (e.g., 2, 3, or 4) VHOs are connected sequentially optionally via one or more linkers. The binding arm targeting an LRRC15 associated pathway, such as LRRC15, can be monovalent, bivalent, trivalent, tetravalent, etc. For example, there can be a dual or tri or quad epitope recognition for LRRC15 in an antibody to enhance specificity of engagement.

[0149] In some embodiments, the anti-LRRC15 or antigen-binding portion thereof is selected from the group consisting of a whole antibody, an antibody fragment, a human antibody, humanized antibody, a single chain antibody, a conjugate, an antibody mimetic, and a defucosylated antibody. In further examples, the anti-LRRC15 fragment is selected from the group consisting of a UniBody, a variable heavy only single domain antibody, and a Nanobody. In some examples, the anti-LRRC15 fragment is selected from the group consisting of a single domain VHH, a single domain VHO, an Affibody, a DARPin, an Anticalin, an Avimer, a Versa body, and a Duocalin. Table 4. Variable Region Sequences of anti-LRRC15 antibodies Table 5. Anti-LRRC15 antibodies Anti-CD3 antibodies

[0150] In some embodiments, the present disclosure provides anti-CD3 antibodies and antigen-binding portions thereof. As non-limiting examples, the disclosure provides for anti-CD3 heavy and light chain variable region amino acid sequences set forth as SEQ ID NOs: 133-143 in Table 6, and SEQ ID NOs: 155-158 in Table 10. Certain anti-CD3 antibodies are disclosed in WO202315170A.

[0151] In some embodiments, the disclosure provides an anti-CD3 or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity (e.g., 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) to any one of SEQ ID NOs: 133-135 and 137-140 or an antigen-binding portion thereof, and a light chain sequence comprising an amino acid sequence with at least 85%identity (e.g., 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) to any one of SEQ ID NOs: 136 and 141-143 or an antigen-binding portion thereof.

[0152] In some embodiments, the disclosure provides an anti-CD3 or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence comprising: SEQ ID NOs: 133 and 136; SEQ ID NOs: 134 and 136; SEQ ID NOs: 135 and 136; SEQ ID NOs: 140 and 142; SEQ ID NOs: 137 and 143; SEQ ID NOs: 155 and 156; SEQ ID NOs: 157 and 158; respectively.

[0153] The anti-CD3 antibodies of the present disclosure encompass full length antibody comprising two heavy chains and two light chains. The antibodies can be human, humanized, or chimeric antibodies. Molecules, such as antibody-drug conjugates and multispecific antibodies, which comprise the anti-FAP antibodies or antigen-binding fragments disclosed herein, are also within the scope of the present disclosure.

[0154] In some embodiments, the anti-CD3 or antigen-binding portion thereof is selected from the group consisting of a whole antibody, an antibody fragment, a human antibody, humanized antibody, a single chain antibody, a conjugate, an antibody mimetic, and a defucosylated antibody. In further examples, the anti-CD3 fragment is selected from the group consisting of a UniBody, a variable heavy only single domain antibody, and a Nanobody. In some examples, the anti-CD3 fragment is selected from the group consisting of a single domain VHH, a single domain VHO, an Affibody, a DARPin, an Anticalin, an Avimer, a Versa body, and a Duocalin. Table 6. Variable Region Sequences of humanized anti-CD3 antibodies Table 7. Anti-CD3 antibodies Human hyaluronidase variants

[0155] In some embodiments, the disclosure provides engineered hyaluronidases set forth as SEQ ID NOs: 352-358 and 144-146 for fragments thereof (Table 8) and hyaluronidases set forth as SEQ ID NOs: 147-148 (Table 9) .

[0156] In some embodiments, the present disclosure provides a fusion protein, comprising at least one hyaluronidase domain or portion thereof and an Fc or a portion thereof, wherein the at least one hyaluronidase domain comprises an amino acid sequence with at least 85%(e.g., 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%) identity to any one of SEQ ID NOs: 352-354 or a portion thereof. In some embodiments, the fusion protein is soluble.

[0157] In some embodiments, the Fc-hyaluronidase fusion of the present disclosure encompass two Fc fusion heavy chains. The fusions can incorporate human, humanized, or chimeric antibodies to form multispecific molecules. In some embodiments, the Fc-hyaluronidase fusions include a hyaluronidase enzyme domain linked to a human Fc region from exemplary human or humanized antibodies. Exemplary human or humanized antibodies include IgG, IgM, IgE, IgA, and IgD antibodies. The present antibodies can be of any class (IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, etc. ) or isotype. For example, a human antibody can comprise an IgG Fc domain, such as at least one of isotypes, IgGl, IgG2, IgG3, or IgG4.

[0158] In some embodiments, the Fc-hyaluronidase fusion comprises a full length human hyaluronidase. Table 8. Sequences of hyaluronidase variants Table 9. Sequences of hyaluronidases Anti-cMet antibodies

[0159] In some embodiments, the disclosure provides amino acid sequences of anti-cMet antibodies set forth as SEQ ID NOs: 161 and 162 in Table 10.

[0160] In some embodiments, the disclosure provides an anti-cMet antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a light chain sequence and a heavy chain sequence comprising: SEQ ID NOs: 161 and 162; respectively.

[0161] The anti-cMet antibodies of the present disclosure encompass full length antibody comprising two heavy chains and two light chains. The antibodies can be human, humanized, or chimeric antibodies.

[0162] In some embodiments, the anti-cMet antibody or antigen-binding portion thereof is selected from the group consisting of a whole antibody, an antibody fragment, a human antibody, humanized antibody, a single chain antibody, a conjugate, an antibody mimetic, and a defucosylated antibody. In further examples, the anti-cMet antibody fragment is selected from the group consisting of a UniBody, a variable heavy only single domain antibody, and a Nanobody. In some examples, the anti-cMet antibody fragment is selected from the group consisting of a single domain VHH, a single domain VHO, an Affibody, a DARPin, an Anticalin, an Avimer, a Versa body, and a Duocalin. Anti-VEGF antibodies

[0163] In some embodiments, the disclosure provides amino acid sequences of anti-VEGF amino acid antibodies set forth as SEQ ID NOs: 163 and 164 in Table 10.

[0164] In some embodiments, the disclosure provides an anti-cMet antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a light chain sequence and a heavy chain sequence comprising: SEQ ID NOs: 163 and 164; respectively.

[0165] The anti-cMet antibodies of the present disclosure encompass full length antibody comprising two heavy chains and two light chains. The antibodies can be human, humanized, or chimeric antibodies.

[0166] In some embodiments, the anti-VEGF antibody or antigen-binding portion thereof is selected from the group consisting of a whole antibody, an antibody fragment, a human antibody, humanized antibody, a single chain antibody, a conjugate, an antibody mimetic, and a defucosylated antibody. In further examples, the anti-VEGF antibody fragment is selected from the group consisting of a UniBody, a variable heavy only single domain antibody, and a Nanobody. In some examples, the anti-VEGF antibody fragment is selected from the group consisting of a single domain VHH, a single domain VHO, an Affibody, a DARPin, an Anticalin, an Avimer, a Versa body, and a Duocalin. Anti-EGFR antibodies

[0167] In some embodiments, the disclosure provides amino acid sequences of anti-EGFR antibodies set forth as SEQ ID NOs: 165-166 in Table 10.

[0168] In some embodiments, the disclosure provides an anti-EGFR antibody or antigen binding fragment thereof, comprising at least one variable-heavy-chain-only single domain or an antigen-binding portion thereof, comprising a variable-heavy-chain-only region sequence comprising: SEQ ID NOs: 165-166; respectively. In some embodiments, the anti-EGFR antibodies of the present disclosure may comprise, in tandem, two to four, such as two or three, variable-heavy-chain-only single domains or antigen-binding portion thereof, wherein the two or three variable heavy chain only single domains or an antigen-binding portion thereof are optionally connected via one or more linkers.

[0169] In some embodiments, the anti-EGFR antibody or antigen-binding portion thereof is selected from the group consisting of a whole antibody, an antibody fragment, a human antibody, humanized antibody, a single chain antibody, a conjugate, an antibody mimetic, and a defucosylated antibody. In further examples, the anti-EGFR antibody fragment is selected from the group consisting of a UniBody, a variable heavy only single domain antibody, and a Nanobody. In some examples, the anti-EGFR antibody fragment is selected from the group consisting of a single domain VHH, a single domain VHO, an Affibody, a DARPin, an Anticalin, an Avimer, a Versa body, and a Duocalin. Table 10. Variable Region Sequences of benchmark antibodies used herein Table 11. Benchmark antibodies Bispecific FAP x CD3 antibodies

[0170] In some embodiments, the present disclosure provides a FAP x CD3 bispecific antibody that targets simultaneously proteins linked to FAP-associated pathways as well as proteins that can activate the CD3 T cell activity.

[0171] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific antibody that targets and binds to human FAP and CD3 simultaneously and is capable of effectively blocking FAP proteins at the protein level. The bispecific antibody binds both CD3 and FAP proteins and binds to one protein without affecting the binding of the other protein, that is, having the ability to bind CD3 and FAP simultaneously. The bispecific antibody disclosed herein inhibits FAP-mediated disease or disorders, such as the glioblastoma or non-small cell lung cancer.

[0172] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific or trispecific antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain protein comprising, from the N-to the  C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the first binding arm can target a CD3 associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the second binding arm can target a FAP associated pathway and comprise an anti-FAP antibody or antigen binding fragment as described herein; and the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the second binding arm can target a control antibody or antigen binding fragment as described herein, which can serve as an inert binding portion. The signal sequences A and B can be the same or different from one another.

[0173] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific antibody that can be generated using well established point mutations in the CH1, CH2, and CH3 domains via controlled Fab arm exchange or via co-expression. In some embodiment, all constructs are symmetric so that there is no preference for the selection of point mutations of the respective parental antibodies.

[0174] In some embodiments of the bispecific antibody disclosed herein, the binding arm that targets CD3 has a binding valency of one. The bispecific antibody is preferably designed to have monovalent CD3-binding (i.e., one Fab arm binding to the epitope of CD3) . Bivalent CD3 binding is linked to excess of activation-induced cell death in effector cells that would limit the efficacy of T cell redirection. In addition, a bivalent CD3 redirection molecule can result in tumor antigen-independent immune effector cell activation that can increase systemic toxicity in the patient. The use of a high affinity of anti-CD3 Fab arm can also increase toxicity. High affinity variants of anti-CD3 Fab or scFv are typically poorly tolerated in cynomolgus monkeys because of resulting extensive cytokine release. High affinity for CD3 also shifted bispecific antibody biodistribution from tumors to CD3 rich tissue that led to increased risk of cytokine release syndrome. Thus, it is highly desirable for the binding affinity of the anti-CD3 arm to be lower than that of anti-FAP arm. Bivalent anti-CD3 agents can increase avidity in binding to CD3 and could lead to increase in cytokine release syndrome from off-tumor CD3 positive cells.

[0175] In some embodiments of the bispecific antibody disclosed herein, the second binding arm targets an FAP associated pathway. The bispecific antibody is preferably designed to have monovalent FAP-binding (i.e., one Fab arm binding to the epitope of FAP) . The second binding arm targeting a FAP associated pathway, such as FAP, can be monovalent, bivalent, trivalent, tetravalent, etc. For example, there can be a dual or tri or quad epitope recognition for FAP in a bispecific antibody to enhance specificity of engagement.

[0176] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein comprises a heavy chain sequence selected from SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, 17, 133-135, 137-140, 149, 151, 155 and 157, and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16, 18, 136, 141-143, 150, 152, 156 and 158, respectively.

[0177] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein may comprise a first binding arms targeting CD3. For example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a first CD3 binding arm comprising a human IgG1 heavy chain and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 133-135, 137-140, 155, 157 and 136, 141-143, 156, 158, respectively.

[0178] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein may comprise a second binding arm targeting FAP. For example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a second FAP binding arm comprising a human IgG1 heavy chain and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, 17, 149, 151 and 4-5, 9-11, 15-16, 18, 150, 152, respectively. Bispecific 5T4 x CD3 antibodies

[0179] In some embodiments, the present disclosure provides a 5T4 x CD3 bispecific antibody that targets simultaneously proteins linked to 5T4-associated pathways as well as proteins that can activate the CD3 T cell activity.

[0180] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific antibody that targets and binds to human 5T4 and CD3 simultaneously and is capable of effectively blocking 5T4 proteins at the protein level. The bispecific antibody binds both CD3 and 5T4 proteins and binds to one protein without affecting the binding of the other protein, that is, having the ability to bind CD3 and 5T4 simultaneously. The bispecific antibody disclosed herein inhibits 5T4-mediated disease or disorders, such as the glioblastoma or non-small cell lung cancer.

[0181] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific or trispecific antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain protein comprising, from the N-to the  C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the first binding arm can target a CD3 associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the second binding arm can target a 5T4 associated pathway and comprise an anti-5T4 antibody or antigen binding fragment as described herein; and the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the second binding arm can target a control antibody or antigen binding fragment as described herein, which served as an inert binding portion. The signal sequences A and B can be the same or different from one another.

[0182] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific antibody that can be generated using well established point mutations in the CH1, CH2, and CH3 domains via controlled Fab arm exchange or via co-expression. In some embodiment, all constructs are symmetric so that there is no preference for the selection of point mutations of the respective parental antibodies.

[0183] In some embodiments of the bispecific antibody disclosed herein, the binding arm that targets CD3 has a binding valency of one. The bispecific antibody is preferably designed to have monovalent CD3-binding (i.e., one Fab arm binding to the epitope of CD3) . Bivalent CD3 binding is linked to excess of activation-induced cell death in effector cells that would limit the efficacy of T cell redirection. In addition, a bivalent CD3 redirection molecule can result in tumor antigen-independent immune effector cell activation that can increase systemic toxicity in the patient. The use of a high affinity of anti-CD3 Fab arm can also increase toxicity. High affinity variants of anti-CD3 Fab or scFv are typically poorly tolerated in cynomolgus monkeys because of resulting extensive cytokine release. High affinity for CD3 also shifted bispecific antibody biodistribution from tumors to CD3 rich tissue that led to increased risk of cytokine release syndrome. Thus, it is highly desirable for the binding affinity of the anti-CD3 arm to be lower than that of anti-5T4 arm. Bivalent anti-CD3 agents can increase avidity in binding to CD3 and could lead to increase in cytokine release syndrome from off-tumor CD3 positive cells.

[0184] In some embodiments of the bispecific antibody disclosed herein, the second binding arm targeting an 5T4 associated pathway. The bispecific antibody is preferably designed to have monovalent 5T4-binding (i.e., one Fab arm binding to the epitope of 5T4) . The second binding arm targeting a 5T4 associated pathway, such as 5T4, can be monovalent, bivalent, trivalent, tetravalent, etc. For example, there can be a dual or tri or quad epitope recognition for 5T4 in a bispecific antibody to enhance specificity of engagement.

[0185] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein comprises a heavy chain sequence selected from SEQ ID NOs: 133-135, 137-140, 155, 157 and 159, and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 136, 141-143, 156, 158 and 160, respectively.

[0186] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein may comprise a first binding arms targeting CD3. For example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a first CD3 binding arm comprising a human IgG1 heavy chain and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 133-135, 137-140, 155, and 157 and 136, 141-143, 156, and 158, respectively.

[0187] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein may comprise a second binding arm targeting 5T4. For example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a second 5T4 binding arm comprising a human IgG1 heavy chain and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 159 and 160, respectively. Bispecific LRRC15 x CD3 antibodies

[0188] In some embodiments, the present disclosure provides an LRRC15 x CD3 bispecific antibody that targets simultaneously proteins linked to LRRC15-associated pathways as well as proteins that can activate the CD3 T cell activity.

[0189] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific antibody that targets and binds to human LRRC15 and CD3 simultaneously and is capable of effectively blocking LRRC15 proteins at the protein level. The bispecific antibody binds both CD3 and LRRC15 proteins and binds to one protein without affecting the binding of the other protein, that is, having the ability to bind CD3 and LRRC15 simultaneously. The bispecific antibody disclosed herein inhibits LRRC15-mediated disease or disorders, such as the glioblastoma or osteosarcoma.

[0190] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific or trispecific antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain protein comprising, from the N-to the  C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the first binding arm can target a CD3 associated pathway and comprise an anti-CD3 or antigen binding fragment as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain fusion protein comprising, from  the N-to the C-terminus, an optional signal sequence A -at least one VHH or an antigen-binding portion thereof-an optional linker A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the at least one VHH or an antigen-binding portion thereof of the first binding arm can target an LRRC15-associated pathway and comprise an anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment as described herein; or a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the second binding arm can target an LRRC15 associated pathway and comprise an anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment as described herein; and the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the second binding arm can target a control antibody or antigen binding fragment as described herein, which served as an inert binding portion. The signal sequences A and B can be the same or different from one another.

[0191] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific antibody that can be generated using well established point mutations in the CH1, CH2, and CH3 domains via controlled Fab arm exchange or via co-expression. In some embodiment, all constructs are symmetric so that there is no preference for the selection of point mutations of the respective parental antibodies.

[0192] In some embodiments of the bispecific antibody disclosed herein, the binding arm that targets CD3 has a binding valency of one. The bispecific antibody is preferably designed to have monovalent CD3-binding (i.e., one Fab arm binding to the epitope of CD3) . Bivalent CD3 binding is linked to excess of activation-induced cell death in effector cells that would limit the efficacy of T cell redirection. In addition, a bivalent CD3 redirection molecule can result in tumor antigen-independent immune effector cell activation that can increase systemic toxicity in the patient. The use of a high affinity of anti-CD3 Fab arm can also increase toxicity. High affinity variants of anti-CD3 Fab or scFv are typically poorly tolerated in cynomolgus monkeys because of resulting extensive cytokine release. High affinity for CD3 also shifted bispecific antibody biodistribution from tumors to CD3 rich tissue that led to increased risk of cytokine release syndrome. Thus, it is highly desirable for the binding affinity of the anti-CD3 arm to be lower than that of anti-LRRC15 arm. Bivalent anti-CD3 agents can increase avidity in binding to CD3 and could lead to increase in cytokine release syndrome from off-tumor CD3 positive cells.

[0193] In some embodiments of the bispecific antibody disclosed herein, the second binding arm targeting an LRRC15 associated pathway. The bispecific antibody is preferably designed to have monovalent LRRC15-binding (i.e., one Fab or VHO arm binding to the epitope of LRRC15) . The second binding arm targeting an LRRC15 associated pathway, such as LRRC15, can be monovalent, bivalent, trivalent, tetravalent, etc. For example, there can be a dual or tri or quad epitope recognition for LRRC15 in a bispecific antibody to enhance specificity of engagement.

[0194] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein comprises a heavy chain sequence selected from SEQ ID NOs: 19-129, 131, 133-135, 137-140, 153, 155, 157, respectively, and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 130, 132, 136, 141-143, 154, 156, 158, respectively.

[0195] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein may comprise a first binding arms targeting CD3. For example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a first CD3 binding arm comprising a human IgG1 heavy chain and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 133-135, 137-140, 155, 157 and 136, 141-143, 156, 158, respectively.

[0196] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein may comprise a second binding arms targeting LRRC15. For example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a second LRRC15 binding arm comprising a human IgG1 heavy and light chain sequences selected from SEQ ID NOs: 129, 131, 153 and 130, 132, 154, respectively.

[0197] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein may comprise a second binding arms targeting LRRC15. For example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a second LRRC15 binding arm comprising at least one (e.g., two, three, or four VHOs in tandem) VHO sequence selected from SEQ ID NOs: 19-128, respectively. Trispecific FAP x LRRC15 x HYAL antibodies

[0198] In some embodiments, the present disclosure provides a FAP x LRRC15 x HYAL trispecific antibody that targets simultaneously proteins linked to FAP-or LRRC15-associated pathways as well as proteins that can have the HA-hydrolyzed activity. FAP, LRRC15 and HA targets have differential expression levels in pathological sites and normal tissues.

[0199] In some embodiments, the present disclosure provides a trispecific antibody that targets and binds to human FAP, LRRC15 and HA simultaneously and is capable of effectively blocking FAP or LRRC15 proteins at the protein level and hydrolyzing the HA polymer. The trispecific antibody binds FAP and LRRC15 proteins or HA polymers and binds to one protein or portion thereof without affecting the binding of the other portion, that is, having the ability to bind FAP, LRRC15 and hydrolyze HA simultaneously. The trispecific antibody disclosed herein inhibits FAP-or LRRC15-mediated disease or disorders, such as the colon carcinoma.

[0200] In some embodiments, the present disclosure provides a trispecific antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain fusion protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -a hyaluronidase domain or portion thereof-an optional linker A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the hyaluronidase domain or portion thereof of the first binding arm can hydrolyze the hyaluronic acid (HA) and comprise a hyaluronidase domain or portion as described herein; and a second binding arm comprising: a second heavy chain fusion protein comprising, from  the N-to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof -an optional linker B -at least one variable-heavy-chain only (VHO) single domain or an antigen-binding portion thereof, and a second light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the second binding arm can target a FAP-associated pathway and comprise an anti-FAP or antigen binding fragment as described herein; and the VHO or antigen-binding portion thereof of the second binding arm can target an LRRC15-associated pathway and comprise an anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment as described herein. The signal sequences A and B can be the same or different from one another. Linkers A  and B can be the same or different from one another.

[0201] The present disclosure provides a trispecific antibody that can be generated using well established point mutations in the CH1, CH2, and CH3 domains via controlled Fab arm exchange or via co-expression. In some embodiment, all constructs are symmetric so that there is no preference for the selection of point mutations of the respective parental antibodies.

[0202] Figure 18C illustrate the format of a trispecific antibody disclosed herein. Figure 18C shows a trispecific antibody as indicated under the notations of "first arm" (hyaluronidase enzyme domain hydrolyzing HA) and "second arm" (targeting FAP and LRRC15) . Figure 18C shows that the Fc-hyaluronidase fusion arm (first arm) of the trispecific Ab can comprise a human IgG with an HC, wherein the heavy chain fusion comprises from the N-terminus to the C-terminus: one hyaluronidase enzyme domain or fragment thereof, and an Fc region; and the FAP-LRRC15 binding arm (second arm) of the trispecific Ab can comprise a human IgG with an HC and an LC, wherein the light chain comprises from the N-terminus to the C-terminus: LC variable region VL, and constant light chain CL, and wherein the heavy chain fusion comprises from the N-terminus to the C-terminus: an HC variable region VH, a CH1 domain, an Fc region and a linker and a tandem of two VHOs. As non-limiting examples, the disclosure provides for "first arm" (hyaluronidase) amino acid sequence set forth as SEQ ID NO: 191 in Table 19. As non-limiting examples, the disclosure provides for "second arm" (FAP x LRRC15) amino acid sequence set forth as SEQ ID NO: 192 in Table 19.

[0203] Targeting CAF (cancer-associated fibroblast) by anti-FAP and anti-LRRC15 antibodies for homing of hyaluronidase into solid tumors is to specifically target and penetrate the dense stroma of the tumor microenvironment, where CAFs are abundant. This can be achieved by engineering hyaluronidase to have a high affinity for the extracellular matrix components, particularly hyaluronic acid, which is a major component of the stroma. Additionally, the dual-targeting strategy aims to minimize off-target effects and maximize the therapeutic efficacy of hyaluronidase within the solid tumors.

[0204] In some embodiments, a trispecific antibody disclosed herein comprises a heavy chain sequence selected from SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, 17, 19-128, 149, and 151 and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16, 18, 150, and 152, respectively.

[0205] In some embodiments, a trispecific antibody disclosed herein comprises a HYAL-Fc fusion chain sequence selected from SEQ ID NOs: 352-358 and 144-146, respectively.

[0206] In some embodiments, a trispecific antibody disclosed herein may comprise a first binding arm targeting tumor antigens on cancer cells or CAFs. For example, a trispecific antibody disclosed herein comprises a first binding arm comprising a human hyaluronidase enzyme sequence selected from SEQ ID NOs: 352-358 and 144-148, respectively.

[0207] In some embodiments, a trispecific antibody disclosed herein may comprise a second binding arm targeting FAP and LRRC15. For example, a trispecific antibody disclosed herein comprises a second binding arm comprising a human IgG1 heavy chain and a light chain sequence, targeting FAP, selected from SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, 17, 149, and 151 and 4-5, 9-11, 15-16, 18, 150, and 152, respectively; and at least one VHO or antigen-binding fragment thereof, targeting human LRRC15, selected from SEQ ID NOs: 19-128.  Bispecific EGFR x HYAL antibodies

[0208] In some embodiments, the present disclosure provides an EGFR x HYAL bispecific antibody that targets simultaneously proteins linked to EGFR-associated pathways as well as proteins that have the HA-hydrolyzing activity. EGFR and HA targets have differential expression levels in pathological sites and normal tissues.

[0209] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific antibody that targets and binds to human EGFR and HA simultaneously and is capable of effectively blocking EGFR protein at the protein level and hydrolyzing the HA polymers. The bispecific antibody binds EGFR protein or HA polymers and binds to one protein or portion thereof without affecting the binding of the other portion, that is, having the ability to bind EGFR and hydrolyze HA simultaneously. The bispecific antibody disclosed herein inhibits EGFR-mediated diseases or disorders, such as the colon carcinoma.

[0210] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain fusion protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -a hyaluronidase domain or portion thereof-an optional linker A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the hyaluronidase domain or portion thereof of the first binding arm comprises a hyaluronidase domain or portion as described herein and can hydrolyze the hyaluronic acid (HA) and; and a second binding arm comprising: a second heavy chain fusion protein comprising, from  the N-to the C-terminus, an optional signal sequence A -at least one variable-heavy-chain only (VHO) single domain or an antigen-binding portion thereof, wherein the VHO or antigen-binding portion thereof of the second binding arm comprises an anti-EGFR antibody or antigen binding fragment as described herein and can target an EGFR-associated pathway. The signal sequences A and B can be the same or different from one another.

[0211] The present disclosure provides a bispecific antibody that can be generated using well established point mutations in the CH1, CH2, and CH3 domains via controlled Fab arm exchange or via co-expression. In some embodiment, all constructs are symmetric so that there is no preference for the selection of point mutations of the respective parental antibodies.

[0212] Figure 15B illustrate the format of a bispecific antibody disclosed herein. Figure 15B shows a bispecific antibody comprising a "first arm" (hyaluronidase enzyme domain hydrolyzing HA) and a "second arm" (targeting EGFR) . Figure 15B shows that the Fc-hyaluronidase fusion arm (first arm) of the bispecific antibody can comprise a heavy chain fusion, wherein the heavy chain fusion comprises from the N-terminus to the C-terminus: one hyaluronidase enzyme domain or fragment thereof, and an Fc region; and the EGFR binding arm (second arm) of the bispecific antibody can comprise a human heavy chain, wherein the heavy chain comprises from the N-terminus to the C-terminus: a VHO, a linker and an Fc region. As non-limiting examples, the disclosure provides for the "first arm" (hyaluronidase) amino acid sequence set forth as SEQ ID NO: 148 in Table 9. As non-limiting examples, the disclosure provides for the "second arm" (EGFR) amino acid sequence set forth as SEQ ID NO: 165 in Table 10.

[0213] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein comprises at least one VHO or antigen-binding fragment thereof selected from SEQ ID NOs: 165 and 166.

[0214] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein comprises a HYAL-Fc fusion chain comprising a sequence selected from SEQ ID NOs: 352-358 and 144-146, respectively.

[0215] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein may comprise a first binding arm targeting HA. For example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a first binding arm comprising a human hyaluronidase enzyme sequence selected from SEQ ID NOs: 352-358 and 144-148, respectively;

[0216] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein may comprise a second binding arm targeting EGFR. For example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a second binding arm comprising at least one (e.g., two, three, or four VHOs in tandem) VHO or antigen-binding fragment thereof, targeting human EGFR, selected from SEQ ID NOs: 165 and 166. Bispecific FAP x LRRC15 antibodies

[0217] In some embodiments, the present disclosure provides a FAP x LRRC15 bispecific antibody that targets simultaneously proteins linked to FAP-or LRRC15-associated pathways. FAP, LRRC15 targets have differential expression levels in pathological sites and normal tissues.

[0218] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific antibody that targets and binds to human FAP and LRRC15 simultaneously and is capable of effectively blocking FAP or LRRC15 proteins at the protein level. The bispecific antibody binds FAP and LRRC15 proteins and binds to one protein or portion thereof without affecting the binding of the other portion, that is, having the ability to bind FAP and LRRC15 simultaneously. The bispecific antibody disclosed herein inhibits FAP-or LRRC15-mediated disease or disorders, such as the glioblastoma.

[0219] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific antibody comprising: a heavy chain fusion protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional  signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof -an optional linker -at least one variable-heavy-chain only (VHO) single domain or an antigen-binding portion thereof, and a light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof can target a FAP-associated pathway and comprise an anti-FAP or antigen binding fragment as described herein; and the VHO or antigen-binding portion thereof can target an LRRC15-associated pathway and comprise an anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment as described herein. The signal sequences A and B can be the same or different from one another.

[0220] The present disclosure provides a bispecific antibody that can be generated using well established point mutations in the CH1, CH2, and CH3 domains via controlled Fab arm exchange or via co-expression. In some embodiment, all constructs are symmetric so that there is no preference for the selection of point mutations of the respective parental antibodies.

[0221] Figure 17C illustrate a format of a bispecific antibody disclosed herein. Figure 17C shows a bispecific antibody as indicated to target FAP and LRRC15. Figure 17C shows that the bispecific Ab can comprise a FAP-LRRC15 binding arm The bispecific antibody can comprise a human IgG with an HC and an LC, wherein the light chain comprises from the N-terminus to the C-terminus: LC variable region VL and constant light chain CL, and wherein the heavy chain fusion comprises from the N-terminus to the C-terminus: an HC variable region VH targeting FAP, a CH1 domain, an Fc region and a linker and a tandem of two VHOs targeting LRRC15. As non-limiting examples, the disclosure provides for a heavy chain fusion of an FAP x LRRC15 binding arm with amino acid sequence set forth as SEQ ID NO: 192 in Table 19.

[0222] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein comprises a heavy chain sequence selected from SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, 17, 19-128, 149, and 151 and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16, 18, 150, and 152, respectively.

[0223] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein may comprise a binding arm targeting FAP and LRRC15. For example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a binding arm comprising a human IgG1 heavy chain and a light chain sequence, targeting human FAP, selected from SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14, 17, 149, and 151 and 4-5, 9-11, 15-16, 18, 150, and 152, respectively; and at least one VHO or antigen-binding fragment thereof, targeting human LRRC15, selected from SEQ ID NOs: 19-128. Trispecific EGFR x cMet x VEGF antibodies

[0224] In some embodiments, the present disclosure provides an EGFR x cMet x VEGF trispecific antibody (see, e.g., Intl. Publ. No. WO 2023 / 069888 A1) that targets simultaneously proteins linked to EGFR-associated pathways, cMet-associated pathways or VEGF-associated pathways. EGFR and cMet and VEGF targets have differential expression levels in pathological sites and normal tissues.

[0225] In some embodiments, the present disclosure provides a trispecific antibody that targets and binds to human EGFR and cMet and VEGF simultaneously and is capable of effectively blocking EGFR or cMet or VEGF proteins at the protein level. The trispecific antibody binds EGFR or cMet or VEGF proteins and binds to one protein without affecting the binding of the other protein, that is, having the ability to bind EGFR, cMet and VEGF simultaneously. The trispecific antibody disclosed herein inhibits EGFR or cMet or VEGF-mediated disease or disorders, such as the non-small cell lung cancer.

[0226] In some embodiments, the present disclosure provides trispecific antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain fusion protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -VHH -an optional linker B -VHH -an optional linker A -Fc -an optional linker C -a scFv or an antigen-binding portion thereof, wherein the VHOs and scFv or an antigen-binding portions thereof of the first binding arm can target a EGFR-and VEGF-associated pathways, respectively, and comprise an anti-EGFR and an anti-VEGF or antigen binding fragments as described herein;  a second binding arm comprising: a second heavy chain fusion protein comprising, from  the N-to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, a signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the second binding arm can target a cMet-associated pathway and comprise an anti-cMet or antigen binding fragment as described herein; The signal sequences A and B can be the same or different from one another. The linkers  A, B, and C can be the same or different from one another.

[0227] In certain embodiments, the Fc heterodimerization can also be realized by Fc mutations to facilitate a Knob-in-Hole strategy (see, e.g., Intl. Publ. No. WO 2006 / 028936) . An amino acid with a small side chain (hole) is introduced into one Fc domain and an amino acid with a large side chain (knob) is introduced into the other Fc domain. After co-expression of the two heavy chains, a heterodimer is formed as a result of the preferential interaction of the heavy chain with a "hole" with the heavy chain with a "knob" (Ridgway et al., 1996) . Exemplary Fc mutation pairs forming a knob and a hole are: T366Y / F405A, T366W / F405W, F405W / Y407A, T394W / Y407T, T394S / Y407A, T366W / T394S, F405W / T394S and T366W / T366S / L368A / Y407V. Instead of co-expression, the controlled Fab arm exchange can be applied to generate trispecific antibodies from separate transfections and purification of the corresponding parental antibodies.

[0228] In some embodiments, a trispecific antibody disclosed herein comprises a heavy chain sequence selected from SEQ ID NOs: 161, 163, 165, 166, and a light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 162 and 164, respectively.

[0229] In some embodiments, a trispecific antibody disclosed herein may comprise a first binding arms targeting EGFR and VEGF. For example, a trispecific antibody disclosed herein comprises a first binding arm comprising at least one VHO or antigen-binding fragment thereof, targeting human EGFR, selected from SEQ ID NOs: 165 and 166, respectively; and one single-chain fragment variable (scFv) domain or antigen-binding fragment thereof, targeting human VEGF, selected from SEQ ID NOs: 163 and 164, respectively.

[0230] In some embodiments, a trispecific antibody disclosed herein may comprise a second binding arm targeting cMet. For example, a trispecific antibody disclosed herein comprises a second binding arm comprising an IgG heavy chain and a light chain or antigen-binding fragment thereof, targeting human cMet, selected from SEQ ID NOs: 161 and 162. Bispecific EGFR x cMet antibodies

[0231] In some embodiments, the present disclosure provides an EGFR x cMet bispecific antibody (see, e.g., Intl. Publ. No. WO 2023 / 069888 A1) that targets simultaneously proteins linked to EGFR-associated pathways and cMet-associated pathways. EGFR and cMet targets have differential expression levels in pathological sites and normal tissues.

[0232] In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific antibody that targets and binds to human EGFR and cMet simultaneously and is capable of effectively blocking EGFR or cMet proteins at the protein level. The bispecific antibody binds EGFR or cMet proteins and binds to one protein without affecting the binding of the other protein, that is, having the ability to bind EGFR and cMet simultaneously. The bispecific antibody disclosed herein inhibits EGFR or cMet-mediated disease or disorders, such as the colorectal cancer.

[0233] In some embodiments, the present disclosure provides bispecific antibody comprising: a first binding arm comprising: a first heavy chain fusion protein comprising, from the N- to the C-terminus, an optional signal sequence A -VHH -an optional linker B -VHH -an optional linker A -Fc, wherein the tandem VHOs or antigen-binding portions thereof of the first binding arm can target an EGFR-associated pathways, and comprise an anti-EGFR or antigen binding fragments as described herein; a second binding arm comprising: a second heavy chain fusion protein comprising, from  the N-to the C-terminus, an optional signal sequence A -an IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof, and a first light chain protein comprising, from the N-to the C-terminus, an optional signal sequence B -an IgG light chain or an antigen-binding portion thereof, wherein the IgG heavy chain or an antigen-binding portion thereof and the IgG light chain or an antigen-binding portion thereof of the second binding arm can target a cMet-associated pathway and comprise an anti-cMet or antigen binding fragment as described herein; The signal sequences A and B can be the same or different from one another. The linkers  A and B can be the same or different from one another.

[0234] In certain embodiments, the Fc heterodimerization can also be realized by Fc mutations to facilitate a Knob-in-Hole strategy (see, e.g., Intl. Publ. No. WO 2006 / 028936) . An amino acid with a small side chain (hole) is introduced into one Fc domain and an amino acid with a large side chain (knob) is introduced into the other Fc domain. After co-expression of the two heavy chains, a heterodimer is formed as a result of the preferential interaction of the heavy chain with a "hole" with the heavy chain with a "knob" (Ridgway et al., 1996) . Exemplary Fc mutation pairs forming a knob and a hole are: T366Y / F405A, T366W / F405W, F405W / Y407A, T394W / Y407T, T394S / Y407A, T366W / T394S, F405W / T394S and T366W / T366S / L368A / Y407V. Instead of co-expression, the controlled Fab arm exchange can be applied to generate bispecific antibodies from separate transfections and purification of the corresponding parental antibodies.

[0235] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein comprises a heavy chain sequence selected from SEQ ID NOs: 161, 165, 166, and a light chain sequence of SEQ ID NO: 162, respectively.

[0236] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein may comprise a first binding arms targeting EGFR. For example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a first binding arm comprising at least one VHO or antigen-binding fragment thereof, targeting human EGFR, selected from SEQ ID NOs: 165 and 166.

[0237] In some embodiments, a bispecific antibody disclosed herein may comprise a second binding arms targeting cMet. For example, a bispecific antibody disclosed herein comprises a second binding arm comprising an IgG heavy chain and a light chain or antigen-binding fragment thereof, targeting human cMet, selected from SEQ ID NOs: 161 and 162. Table 12. Sequences of synthetic linkers Table 13. Sequences of Fc Leader Sequences

[0238] In certain embodiments, a leader peptide is chosen to drive the secretion of the antibody described in this disclosure into the cell culture supernatant as a secreted antibody protein. Any leader peptide for any known secreted proteins  / peptides can be used.

[0239] As used herein, a “leader peptide” or “signal peptide” or “leader sequence” includes a short peptide, usually 16-30 amino acids in length, that is present at the N-terminus of most of newly synthesized proteins that are destined towards the secretory pathway. Although lead peptides are extremely heterogeneous in sequence, and many prokaryotic and eukaryotic lead peptides are functionally interchangeable even between distinct species, the efficiency of protein secretion may be strongly determined by the sequence of the lead  / signal peptide.

[0240] In certain embodiments, the leader peptide that is from a protein residing either inside certain organelles (such as the endoplasmic reticulum, Golgi, or endosomes) , secreted from the cell, or inserted into most cellular membranes may be used.

[0241] In certain embodiments, the leader peptide is from a eukaryotic protein.

[0242] In certain embodiments, the leader peptide is from a secreted protein, e.g., a protein secreted outside a cell.

[0243] In certain embodiments, the leader peptide is from a transmembrane protein.

[0244] In certain embodiments, the leader peptide contains a stretch of amino acids that is recognized and cleaved by a signal peptidase.

[0245] In certain embodiments, the leader peptide does not contain a cleavage recognition sequence of a signal peptidase.

[0246] In certain embodiments, the leader peptide is a signal peptide for tissue plasminogen activator (tPA) , herpes simplex virus glycoprotein D (HSV gD) , a growth hormone, a cytokine, a lipoprotein export signal, CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB or GM-CSFR, or S. cerevisiae mating factor α-1 signal peptide.

[0247] In some embodiments, a leader sequence as described herein may be a mammalian CD4 or CD8 leader sequence, including but not limited to, e.g., a human CD4 or CD8 leader sequence, a non-human primate CD4 or CD8 leader sequence, a rodent CD4 or CD8 leader sequence, and the like. In some embodiments, a CD4 or CD8 leader comprises an amino acid sequence having at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%, amino acid sequence identity with the human CD4 or CD8 leader sequences. IgG Fc of antibody

[0248] The anti-FAP, anti-LRRC15, anti-CD3, and Fc-hyaluronidase fusions and multispecific antibodies, such as FAP x CD3, LRRC15 x CD3, FAP x LRRC15 x HYAL bispecific or trispecific antibodies, disclosed herein may comprise a modified Fc region, wherein the modified Fc region comprises at least one amino acid modification relative to a native Fc region, for example, to extend the half-life of the bispecific or trispecific antibody, enhance resistance of the bispecific or trispecific antibody to proteolytic degradation, reduce effector functionality of the bispecific or trispecific antibody, facilitate generation of the bispecific or trispecific antibody by Fc heterodimerization, facilitate the multimerization of the bispecific or trispecific, and / or improve manufacturing and drug stability of the bispecific or trispecific antibody.

[0249] In some embodiments, the Fc domain is altered to allow for silencing of the Fc domain to minimize effector function activity which can cause immune cell depletion and cytokine release syndrome.

[0250] In some embodiments, anti-FAP, anti-LRRC15, anti-CD3, and Fc-hyaluronidase fusions and multispecific antibodies such as FAP x CD3, LRRC15 x CD3, FAP x LRRC15 x HYAL bispecific or trispecific antibodies as described herein are provided with a modified Fc region wherein a naturally occurring Fc region is modified to extend the half-life of the antibody when compared to the parental native antibody in a biological environment, for example, the serum half-life or a half-life measured by an in vitro assay. Exemplary mutations that may be made singularly or in combination are T250Q, M252Y, I253A, S254T, T256E, P2571, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A, and H435R mutations.

[0251] In some embodiments, the present antibodies and Fc-hyaluronidase fusions may comprise an IgG Fc domain comprising an amino acid sequence having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%, amino acid sequence identity to an IgG1 Fc sequence such as SEQ ID NO: 172.

[0252] In some embodiments, the present antibodies and Fc-hyaluronidase fusions may comprise an IgG Fc domain comprising an amino acid sequence having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%, amino acid sequence identity to an IgG2 Fc sequence such as SEQ ID NO: 173.

[0253] In some embodiments, the present antibodies and Fc-hyaluronidase fusions may comprise an IgG Fc domain comprising an amino acid sequence having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%, amino acid sequence identity to an IgG3 Fc sequence such as SEQ ID NO: 174.

[0254] In some embodiments, the present antibodies and Fc-hyaluronidase fusions may comprise an IgG Fc domain comprising an amino acid sequence having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99%, or 100%, amino acid sequence identity to an IgG4 Fc sequence such as SEQ ID NO: 175.

[0255] In some embodiments, the S228P mutation may be made into IgG4 antibodies to enhance IgG4 stability.

[0256] In some embodiments, the antibodies and Fc-hyaluronidase fusions may comprise a modified Fc region, wherein the modified Fc region comprises at least one amino acid modification relative to a native Fc region. In some embodiments, the present antibodies and Fc-hyaluronidase fusions are provided with a modified Fc region where a naturally-occurring Fc region is modified to extend the half-life of the antibody when compared to the parental native antibody in a biological environment, for example, the serum half-life or a half-life measured by an in vitro assay. Exemplary mutations that may be made singularly or in combination are T250Q, M252Y, I253A, S254T, T256E, P257I, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A and H435R mutations.

[0257] In certain embodiments, the extension of half-life can be realized by engineering the M252Y / S254T / T256E mutations, collectively designated as YTE mutations, e.g., in IgG1 Fc such as SEQ ID NO: 179, numbering according to the EU Index (Dall'A cqua et al., 2006) .

[0258] In certain embodiments, the extension of half-life can also be realized by engineering the M428L / N434S mutations, collectively designated as LS mutations, collectively designated as LS mutations, e.g., in IgG1 Fc such as SEQ ID NO: 180 (Zalevsky et al., 2010) .

[0259] In certain embodiments, the extension of half-life can also be realized by engineering the T250Q / M428L mutations in IgG1 Fc (Hinton et al., 2006) .

[0260] In certain embodiments, the extension of half-life can also be realized by engineering the N434A mutations in IgG1 Fc (Shields et al., 2001a) .

[0261] In certain embodiments, the extension of half-life can also be realized by engineering the T307A / E380A / N434A mutations in IgG1 Fc (Petkova et al., 2006) .

[0262] The effect of Fc engineering on the extension of antibody half-life can be evaluated in PK studies in mice relative to antibodies with native IgG Fc.

[0263] In some embodiments, the present antibodies and Fc-hyaluronidase fusions are provided with a modified Fc region where a naturally-occurring Fc region is modified to enhance the antibody resistance to proteolytic degradation by a protease that cleaves the wild-type antibody between or at residues 222-237 (EU numbering) .

[0264] In certain embodiments, the resistance to proteolytic degradation can be realized by engineering E233P / L234A / L235A mutations in the hinge region with G236 deleted when compared to a parental native antibody, such as SEQ ID NO: 181, residue numbering according to the EU Index (Kinder et al., 2013) .

[0265] In instances where effector functionality is to be enhanced, the antibodies of the disclosure may be engineered to introduce at least one mutation in the antibody Fc that increases the binding of the antibody to an activating Fcγ receptor (FcγR) and / or increases Fc effector functions such as C1q binding, complement dependent cytotoxicity (CDC) , antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or phagocytosis (ADCP) . Such modifications can comprise low or null Fc fucosylation, and / or engineering of Fc mutations such as S239E / I332E / A330L, S239D / I332E / A330L, S239D / I332E, S239D, I332E, S298A / E333A / K334A.

[0266] In certain embodiments, the enhancement of effector functions can be realized by engineering F243L / R292P / Y300L / V305I / P396L mutations, collectively designated as LPLIL mutations, when compared to a parental native antibody, such as SEQ ID NO: 182, residue numbering according to the EU Index (Stavenhagen et al., 2008) .

[0267] In certain embodiments, the enhancement of the effector functions can be realized by engineering E345R, such as SEQ ID NO: 183, or other Fc clustering mutations on the antibodies (e.g., trispecific antibody) using residue numbering according to the EU Index.

[0268] In certain embodiments, the enhancement of effector functions can be realized by engineering F243L / R292P / Y300L / V305I / P396L mutations, collectively designated as LPLIL mutations, and E345R mutation when compared to a parental native antibody, such as SEQ ID NO:184, residues numbering according to the EU Index.

[0269] In instances where effector functionality is not desired, the antibodies of the disclosure may be engineered to introduce at least one mutation in the antibody Fc that reduces binding of the antibody to an activating Fcγ receptor (FcγR) and / or reduces Fc effector functions such as C1q binding, complement dependent cytotoxicity (CDC) , antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or phagocytosis (ADCP) .

[0270] Fc positions that may be mutated to reduce binding of the antibody to the activating FcγR and subsequently to reduce effector functions are those described for example in (Bolt et al., 1993; Chu et al., 2008; Shields et al., 2001b; Vafa et al., 2014; Xu et al., 2000) .

[0271] Exemplary mutations that may be made singularly or in combination are K214T, E233P, L234V, L234A, deletion of G236, V234A, F234A, L235A, G237A, P238A, P238S, D265A, S267E, H268A, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, P329A, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, A330S and P331S mutations on IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 framework.

[0272] Exemplary combination mutations that may be made to reduce ADCC are L234A / L235A on IgG1, V234A / G237A / P238S / H268A / V309L / A330S / P331S on IgG2, F234A / L235A on IgG4, S228P / F234A / L235A on IgG4, N297A on IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, V234A / G237A on IgG2, K214T / E233P / L234V / L235A / G236-deleted / A327G / P331A / D365E / L358M on IgG1, H268Q / V309L / A330S / P331S on IgG2, S267E / L328F on IgG1, L234F / L235E / D265A on IgG1, L234A / L235A / G237A / P238S  / H268A / A330S / P331S on IgG1, S228P / F234A / L235A / G237A / P238S on IgG4, and S228P / F234A / L235A / G236-deleted / G237A / P238S on IgG4. Hybrid IgG2 / 4 Fc domains may also be used, such as Fc with residues 117-260 from IgG2 and residues 261-447 from IgG4.

[0273] In certain embodiments, the reduction of effector functions can be realized by engineering L234A / L235A mutations, collectively designated as AA mutations, when compared to a parental native antibody, such as SEQ ID NO: 185, residue numbering according to the EU Index.

[0274] In certain embodiments, the reduction of effector functions can be realized by engineering L234F / L235E / D265A mutations, collectively designated as FEA mutations, when compared to a parental native antibody, such as SEQ ID NO: 186, residue numbering according to the EU Index.

[0275] In some embodiments, antibodies and Fc-hyaluronidase fusions are provided with a modified Fc region where a naturally-occurring Fc region is modified to facilitate the generation of multispecific antibodies (e.g., trispecific antibody) by Fc heterodimerization.

[0276] In certain embodiments, the Fc heterodimerization can be realized by engineering F405L (as SEQ ID NO: 187) and K409R (as SEQ ID NO: 188) mutations on two parental antibodies and the generation of a multispecific (e.g., bispecific) antibody in a process known as Fab arm exchange (Labrijn, Meesters, de Goeij, et al., 2014; Shields et al., 2001a) .

[0277] In certain embodiments, the Fc heterodimerization can also be realized by Fc mutations to facilitate Knob-in-Hole strategy (see, e.g., Intl. Publ. No. WO 2006 / 028936) . An amino acid with a small side chain (hole) is introduced into one Fc domain and an amino acid with a large side chain (knob) is introduced into the other Fc domain. After co-expression of the two heavy chains, a heterodimer is formed as a result of the preferential interaction of the heavy chain with a “hole” with the heavy chain with a “knob” (Ridgway et al., 1996) . Exemplary Fc mutation pairs forming a knob and a hole are: T366Y / F405A, T366W / F405W, F405W / Y407A, T394W / Y407T, T394S / Y407A, T366W / T394S, F405W / T394S and T366W / T366S / L368A / Y407V.

[0278] In certain embodiments, the Fc heterodimerization can be realized by engineering T366W and T366S / L368A / Y407V mutations on two parental antibodies and the generation of a multispecific (e.g., bispecific) antibody by co-expression or by a process known as Fab arm exchange.

[0279] In certain embodiments, the Fc heterodimerization can also be realized by Fc mutations to facilitate the electrostatically-matched interactions strategy (Gunasekaran et al., 2010) . Mutations can be engineered to generate positively charged residues at one Fc domain and negatively charged residues at the other Fc domain as described in US Patent Publ. No. US2010 / 0015133; US Patent Publ. No. US2009 / 0182127; US Patent Publ. No. US2010 / 028637 or US Patent Publ. No. US2011 / 0123532. Heavy chain heterodimerization can be formed by electrostatically-matched interactions between two mutated Fc.

[0280] In some embodiments, the present antibodies and Fc-hyaluronidase fusions are provided with a modified Fc region where a naturally-occurring Fc region is modified to facilitate the multimerization of the antibody upon interaction with cell surface receptors, although such engineered antibody can exist as a monomer in solution. The Fc mutations that facilitate antibody multimerization include, but not limited to, E345R mutation, E430G mutation, E345R / E430G mutations, E345R / E430G / Y440R mutations as described in Complement is activated by IgG hexamers assembled at the cell surface (Diebolder et al., 2014) . Such mutations may also include, but not limited to, T437R mutation, T437R / K248E mutations, T437R / K338A mutations as described in (Zhang et al., 2017) .

[0281] Antibodies of the disclosure further comprising conservative modifications are within the scope of the disclosure. “Conservative modifications” refer to amino acid modifications that do not significantly affect or alter the binding characteristics of the antibody containing the amino acid sequences. Conservative modifications include amino acid substitutions, additions and deletions. Conservative substitutions are those in which the amino acid is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. The families of amino acid residues having similar side chains are well defined and include amino acids with acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid) , basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine) , nonpolar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine) , uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine, tyrosine, tryptophan) , aromatic side chains (e.g., phenylalanine, tryptophan, histidine, tyrosine) , aliphatic side chains (e.g., glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine) , amide (e.g., asparagine, glutamine) , beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine) and sulfur-containing side chains (cysteine, methionine) . Furthermore, any native residue in the polypeptide may also be substituted with alanine, as has been previously described for alanine scanning mutagenesis. Amino acid substitutions to the antibodies of the disclosure may be made by known methods for example by PCR mutagenesis (US Disclosure No. 4,683, 195) . Alternatively, libraries of variants may be generated for example using random (NNK) or non-random codons, for example DVK codons, which encode 11 amino acids (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp) . The resulting antibody variants may be evaluated for their characteristics using assays described herein.

[0282] The antibodies of the disclosure may be post-translationally modified by processes such as glycosylation, isomerization, deglycosylation or non-naturally occurring covalent modification such as the addition of polyethylene glycol moieties (pegylation) and lipidation. Such modifications may occur in vivo or in vitro. For example, the antibodies of the disclosure may be conjugated to polyethylene glycol (PEGylated) to improve their pharmacokinetic profiles. Conjugation may be conducted by techniques known to those skilled in the art. Conjugation of therapeutic antibodies with PEG has been shown to enhance pharmacodynamics while not interfering with function.

[0283] Antibodies of the disclosure may be modified to improve stability, selectivity, cross-reactivity, affinity, immunogenicity or other desirable biological or biophysical property are within the scope of the disclosure. Stability of an antibody is influenced by a number of factors, including (1) core packing of individual domains that affects their intrinsic stability, (2) protein / protein interface interactions that have impact upon the HC and LC pairing, (McNeil et al.) burial of polar and charged residues, (4) H-bonding network for polar and charged residues; and / or (5) surface charge and polar residue distribution among other intra-and inter-molecular forces ( &Plückthun, 2001) Potential structure destabilizing residues may be identified based upon the crystal structure of the antibody or by molecular modelling in certain cases, and the effect of the residues on antibody stability may be tested by generating and evaluating variants harboring mutations in the identified residues. One of the ways to increase antibody stability is to raise the thermal transition midpoint (Tm) as measured by differential scanning calorimetry (Spigel et al. ) . In general, the protein Tm is correlated with its stability and inversely correlated with its susceptibility to unfolding and denaturation in solution and the degradation processes that depend on the tendency of the protein to unfold. A number of studies have found correlation between the ranking of the physical stability of formulations measured as thermal stability by DSC and physical stability measured by other methods. Formulation studies suggest that a Fab Tm has implication for long-term physical stability of a corresponding antibody.

[0284] Antibodies of the disclosure may have amino acid substitutions in the Fc region that improve manufacturing and drug stability. An example for IgG1 is H224S (or H224Q) in the hinge 221-DKTHTC-226 (EU numbering) which blocks radically induced cleavage; and for IgG4, the S228P mutation blocks half-antibody exchange. Expression and purification of antibody

[0285] The antibodies or fusion proteins of the disclosure can be encoded by one or more nucleic acids for protein expression. For example, a FAP x CD3 bispecific antibody of the present disclosure can be encoded by a single nucleic acid (e.g., a single nucleic acid comprising nucleotide sequences that encode the light and heavy chain polypeptides of the antibody) , or by two or more separate nucleic acids, each of which encodes a different part of the parental antibody.

[0286] The appropriate recombinant DNA is prepared by the DNA recombination techniques and then transfected into mammalian cells, the corresponding proteins, such as anti-FAP, anti-LRRC15, anti-FAP / LRRC15, anti-CD3 antibodies and Fc-hyaluronidase fusions are expressed, purified, identified, and / or screened.

[0287] A multispecific such as bispecific or trispecific, antibody can be generated using the controlled Fab arm exchange or other bispecific antibody generation process to produce a multispecific such as bispecific or trispecific antibody which shows biological effects of simultaneous binding to corresponding antigens. For example, FAP x CD3 bispecific antibody can be generated from anti-FAP and anti-CD3 antibodies, or FAP x LRRC15 x HYAL trispecific antibodies can be generated from anti-FAP x LRRC15 antibodies and HYAL-Fc fusion protein using the controlled Fab arm exchange or other bispecific antibody generation process. Affinity and blocking efficiency of multispecific antibodies, such as bispecific or trispecific antibodies, are identified through in vitro experiments.

[0288] The nucleic acids described herein can be inserted into vectors, e.g., nucleic acid expression vectors and / or targeting vectors. Such vectors can be used in many ways, e.g., for the expression of an antibody described herein in a cell or transgenic animal. Vectors are typically selected to be functional in the host cell in which the vector will be used. A nucleic acid molecule encoding an antibody described herein may be amplified  / expressed in prokaryotic, yeast, insect (baculovirus systems) and / or eukaryotic host cells. Selection of the host cell will depend in part on whether the antibodies disclosed herein, such as a FAP x CD3 bispecific antibody described herein, is to be post-translationally modified (e.g., glycosylated and / or phosphorylated) . If so, yeast, insect, or mammalian host cells are preferable. Expression vectors typically contain one or more of the following components: a promoter, one or more enhancer sequences, an origin of replication, a transcriptional termination sequence, a complete intron sequence containing a donor and acceptor splice site, a leader sequence for secretion, a ribosome binding site, a polyadenylation sequence, a polylinker region for inserting the nucleic acid encoding the polypeptide to be expressed, and a selectable marker element.

[0289] In some embodiments, a leader or signal sequence is engineered at the N-terminus of the antibodies, e.g., a FAP x CD3 bispecific antibody, described herein to guide its secretion. The secretion of the FAP x CD3 bispecific antibody from a host cell will result in the removal of the signal peptide from the antibody. Thus, the mature FAP x CD3 bispecific antibody will lack any leader or signal sequence. In some embodiments, such as where glycosylation is desired in a eukaryotic host cell expression system, one may manipulate the various presequences to improve glycosylation or yield. For example, one may alter the peptidase cleavage site of a signal peptide, or add presequences, which also may affect glycosylation.

[0290] The disclosure further provides a cell (e.g., an isolated or purified cell) comprising a nucleic acid or vector of the disclosure. The cell can be any type of cell capable of being transformed with the nucleic acid or vector of the disclosure so as to produce a polypeptide encoded thereby. For example, to express the FAP x CD3 antibody described herein, DNAs encoding partial or full-length light and heavy chains, obtained as described above, are inserted into expression vectors such that the genes are operatively linked to transcriptional and translational control sequences.

[0291] Methods of introducing nucleic acids and vectors into isolated cells and the culture and selection of transformed host cells in vitro are known in the art and include the use of calcium chloride-mediated transformation, transduction, conjugation, triparental mating, DEAE, dextran-mediated transfection, infection, membrane fusion with liposomes, high velocity bombardment with DNA-coated microprojectiles, direct microinjection into single cells, and electroporation.

[0292] After introducing the nucleic acid or vector of the disclosure into the cell, the cell is cultured under conditions suitable for expression of the encoded sequence. The antibody, antigen binding fragment, or portion of the antibody then can be isolated from the cell.

[0293] In certain embodiments, two or more vectors that together encode the multispecific proteins such as the anti-FAP, anti-LRRC15, anti-FAP / LRRC15, anti-CD3 antibodies and Fc-hyaluronidase fusions described herein, can be introduced into the cell.

[0294] Purification of an antibody, e.g., a FAP x CD3 bispecific antibody, described herein, which is secreted into the cell media, can be accomplished using a variety of techniques including affinity, immunoaffinity or ion exchange chromatography, molecular sieve chromatography, preparative gel electrophoresis or isoelectric focusing, chromatofocusing, and high-pressure liquid chromatography. For example, proteins comprising an Fc region may be purified by affinity chromatography with Protein A, which selectively binds the Fc region. Modified forms of the antibodies, such as a FAP x CD3 bispecific antibody, may be prepared with affinity tags, such as hexahistidine or other small peptide such as FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn. ) or Myc (Invitrogen) at either its carboxyl or amino terminus and purified by a one-step affinity column. For example, Poly histidine binds with great affinity and specificity to nickel, thus an affinity column of nickel (such as the  nickel columns) can be used for purification of Poly histidine-tagged selective binding agents. In some instances, more than one purification step may be employed. Target binding and functional activity of anti-FAP and anti-LRRC15 antibodies, and  enzyme activity of hyaluronidase

[0295] In vitro binding and cell-based assays are well described in the art for use in characterizing the anti-FAP antibodies and anti-LRRC15 antibodies of the present disclosure in binding to its corresponding antigens. For example, the binding of an antibody may be determined by ELISA by immobilizing recombinant or purified antigen, sequestering the antibody with the immobilized antigen and determining the amount of bound antibody. This can also be performed using a surface plasmon resonance or biolayer interferometry instrument for kinetic analysis of binding interactions. For cell-based binding assay, the binding of antibody may be determined by flow cytometry by incubating the antibody with cells expressing antigens on the cell surface and determining the amount of antibody bound to the cell surface antigen.

[0296] In vitro and cell-based functional assays are well described in the art for use in determining the functional activities of the anti-CD3 antibodies, anti-FAP antibodies and anti-LRRC15 antibodies as well as multispecific (e.g., bispecific, trispecific or tetra-specific) antibodies including portions targeting different TAAs of the present disclosure. For example, the effects of these antibodies described herein based on CD3 mediated T cell activation can be assessed by reporter-based cell assays, T cell activation and proliferation assays, and T cell mediated cytotoxicity assays.

[0297] A modified turbidimetric assay in acidified serum solution is well described in the art for use in determining the ability to hydrolyze HA of the recombinant hyaluronidase enzymes and Fc-fusions of hyaluronidase enzymes of the present disclosure.

[0298] In addition to in vitro functional activity, the art describes the use of animal models and ex vivo assays to determine the in vivo efficacy of the anti-FAP antibodies, anti-LRRC15 antibodies, and the enzyme activity of hyaluronidase as well as multispecific (e.g., bispecific, trispecific, or tetra-specific) including portions targeting different targets in the present disclosure. For example, the anti-tumor efficacy of these antibodies can be evaluated using xenograft mouse models with human tumor cell lines and patient-derived primary tumor cells. Furthermore, the anti-tumor efficacy of the described antibodies can also be assessed in xenograft models in conjunction with the reconstitution of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in immunodeficient mice. Pharmaceutical Compositions

[0299] The antibodies of the disclosure, such as a trispecific antibody comprising anti-FAP, anti-LRRC15 and / or HYAL-Fc, can be formulated in compositions, especially pharmaceutical compositions, for use in the methods herein. Such compositions comprise a therapeutically or prophylactically effective amount of the antibody described in this disclosure in mixture with a suitable carrier, e.g., a pharmaceutically acceptable agent. Typically, the antibody described in this disclosure is sufficiently purified for administration to an animal before formulation in a pharmaceutical composition.

[0300] Pharmaceutically acceptable agents include carriers, excipients, diluents, antioxidants, preservatives, coloring, flavoring and diluting agents, emulsifying agents, suspending agents, solvents, fillers, bulking agents, buffers, delivery vehicles, tonicity agents, cosolvents, wetting agents, complexing agents, buffering agents, antimicrobials, and surfactants.

[0301] The composition can be in liquid form or in a lyophilized or freeze-dried form and may include one or more lyoprotectants, excipients, surfactants, high molecular weight structural additives and / or bulking agents.

[0302] Compositions can be suitable for parenteral administration. Exemplary compositions are suitable for injection or infusion into an animal by any route available to the skilled worker, such as intraarticular, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral (intraparenchymal) , intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intralesional, intrarectal, transdermal, oral, and inhaled routes.

[0303] Pharmaceutical compositions described herein can be formulated for controlled or sustained delivery in a manner that provides local concentration of the product (e.g., bolus, depot effect) sustained release and / or increased stability or half-life in a particular local environment. Methods of Use

[0304] In some embodiments, the present disclosure provides antibodies for treating various diseases or conditions, For example, The present disclosure provides antibodies such as a trispecific antibody comprising anti-FAP, anti-LRRC15 antibodies and Fc-fusion hyaluronidase, for the treatment or prevention of a disease or condition, e.g., cancer, such as breast, ovarian, gastric, lung, pancreatic, and other cancers.

[0305] In some embodiments, the present disclosure provides a method for treating a FAP-mediated disease or disorder in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of the anti-FAP antibody or antigen binding fragment; the anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment; the Fc-fusion hyaluronidase; the multispecific antibodies, and / or the conjugates, or the pharmaceutical composition disclosed herein. The FAP-mediated disease or disorder includes, but is not limited to, cancers such as breast cancer, ovarian cancer, lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer) , pancreatic cancer, glioblastoma, gastro-intestinal cancers, pancreatic / ampullary cancers, desmoid tumors, thyroid cancers, and colorectal carcinoma.

[0306] In some embodiments, the present disclosure provides a method for treating an LRRC15-mediated disease or disorder in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of the anti-FAP antibody or antigen binding fragment; the anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment; the Fc-fusion hyaluronidase; the multispecific antibodies, and / or the conjugates, or the pharmaceutical composition disclosed herein. The LRRC15-mediated disease or disorder includes, but is not limited to, cancers such as glioblastoma, osteosarcoma, sarcomas, melanoma, prostate cancers, breast cancers, head and neck cancers, lung cancers, cervical cancers, and colorectal carcinoma.

[0307] In some embodiments, the present disclosure provides a method for treating an EGFR-mediated disease or disorder in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of the Fc-fusion hyaluronidases, the multispecific antibodies, and / or the conjugates, or the pharmaceutical composition disclosed herein. The EGFR-mediated disease or disorder includes, but is not limited to, non-small cell lung cancer and colorectal carcinoma.

[0308] In some embodiments, the present disclosure provides a method for treating an HA-mediated disease or disorder in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of the anti-FAP antibody or antigen binding fragment; the anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment of any one of claims 4-8; the Fc-fusion hyaluronidases; or the multispecific antibody; and / or the conjugate, or the pharmaceutical composition disclosed herein. The HA-mediated disease or disorder includes, but is not limited to, non-small cell lung cancer, colorectal cancer, triple negative breast cancer, prostate cancer, gastric cancer and pancreatic ductal adenocarcinoma.

[0309] The disclosure also provides use of the antibodies such as multispecific proteins, Fc-fusion hyaluronidases, conjugates, and pharmaceutical compositions of the present disclosure in the manufacture of a medicament for treating or preventing a disease or condition, e.g., a, FAP-mediated disease or disorder, an LRRC15-mediated disease or disorder, an EGFR-mediated disease or disorder, or an HA-mediated disease or disorder.

[0310] All combinations of the various elements described herein are within the scope of the disclosure unless otherwise indicated herein or otherwise clearly contradicted by context.

[0311] This disclosure will be better understood from the following Experimental Details. However, one skilled in the art will readily appreciate that the specific methods and results discussed are merely illustrative of the disclosure.

[0312] Example 1: Expression and purification of anti-FAP, anti-LRRC15 and anti-CD3 antibodies

[0313] Plasmids encoding heavy and light chains for each monoclonal antibody of anti-FAP, anti-LRRC15, and anti-CD3 variants in a human IgG1 backbone were co-transfected into Expi293F cells, following the transfection kit instructions (Thermo Scientific) . Similarly, for anti-LRRC15 VHOs antibodies, the plasmid encoding the VHO heavy chain was transfected into Expi293F cells using the same transfection kit instructions. Subsequently, the cells were spun down five days post-transfection, and the supernatant was passed through a 0.2 μm filter. The purification of the supernatants was conducted by affinity chromatography over protein A agarose columns (GE Healthcare Life Sciences) . The purified monoclonal antibody underwent buffer exchange into DPBS, pH 7.2 by dialysis, and protein concentrations were determined by UV absorbance at 280 nm. The protein purity was further confirmed by SDS-PAGE or SEC.

[0314] Example 2: Expression and purification of the HYAL-His6 and HYAL-Fc fusion proteins

[0315] For HYAL-His and HYAL-Fc fusion proteins, plasmids encoding fusion chains were transfected into Chinese hamster ovary (CHO) -K1 cell line by electroporation, following the transfection kit instructions (Etta Biotech) . Subsequently, the cells were spun down six days post-transfection, and the supernatant were passed through a 0.2 μm filter. The purification of the supernatants was conducted by affinity chromatography over Ni-NTA or protein A agarose columns (GE Healthcare Life Sciences) . The purified fusion proteins underwent buffer exchange into DPBS, pH 7.2 by dialysis, and protein concentrations were determined by UV absorbance at 280 nm. The protein purity was further confirmed by SDS-PAGE or SEC-HPLC analysis. As Table 14 depicted, the results indicated that fusing HYAL to an Fc region led to higher expression titer and higher purity compared to HYAL with a poly-histidine expression tag. Additionally, there was no observed difference in enzyme activity between the two different fusions. Table 14. Expression, purification and enzyme activity comparison of HYAL-His6 and  HYAL-Fc

[0316] Example 3: Enzyme activity measurement of hyaluronidase variants

[0317] The enzymatic activity of hyaluronidase enzyme fusing to poly-histidine or Fc was determined using a micro-turbidity assay (Rapport et al., 1950) . This assay measured the turbidity of the reaction mixture (%Transmittance at 600 nm, Light path = 1 cm) and was based on the reaction of hyaluronidase with hyaluronic acid, which produced di and monosaccharides as well as smaller hyaluronic acid fragments. One unit of hyaluronidase activity was defined as the amount of enzyme that caused a change in A600 of 0.330 per minute at pH 5.35 at 37 ℃ in a 2.0 mL reaction mixture (45-minute assay) . The method involved the generation of an insoluble precipitate by the HYAL enzyme when acidified serum albumin interacted with hyaluronic acid. To perform the assay, the following reagents were prepared: Hyaluronic Acid Solution (0.03%w / v) , Enzyme Diluent (20 mM Sodium Phosphate with 77 mM Sodium Chloride and 0.01%w / v Bovine Serum Albumin, pH 7.0 at 37 ℃) , and Acidic Albumin Solution (24 mM Sodium Acetate, 79 mM Acetic Acid with 0.1%w / v Bovine Serum Albumin, pH 3.75 at 25 ℃) .

[0318] Briefly, a working solution of 2-5 U / mL standard hyaluronidase (Sigma, H3506) was prepared in enzyme diluent. Hyaluronidase serial dilutions and culture supernatant were also prepared in enzyme diluent. Subsequently, 1 mL of hyaluronic acid solution (0.03%w / v) was added to all tubes, followed by incubation for 45 minutes at 37 ℃. After incubation, 0.5 mL of each tube was transferred into suitable cuvettes containing 2.5 mL of acidic albumin, and the transmittance percent of each cuvette was evaluated at 600 nm. Finally, the activity of hyaluronidase enzymes was determined according to the standard curve of hyaluronidase serial dilutions.

[0319] Example 4: Bispecific or trispecific antibodies generation by controlled Fab-arm exchange technology

[0320] The bispecific or trispecific antibodies described in this disclosure were generated using controlled Fab-arm exchange (cFAE) technology (cFAE) (Labrijn, Meesters, Priem, et al., 2014) . Briefly, the two parental IgG1 antibodies, each containing a single matching point mutation (F450L and K409R) in the CH3 domain, were separately expressed. They were then mixed at a 1: 1 molar ratio under permissive redox conditions (75 mM β-MEA, Sigma, M9768) in vitro, allowing for the recombination of half-molecules (37℃ for 5 hours in a water bath) . Subsequently, the reductant was removed by dialysis in DPBS to enable the reoxidation of interchain disulfide bonds. Finally, exchange efficiency and the final product were analyzed using chromatography-based methods. Notably, EGFR x HYAL bispecific antibody was generated by cFAE. This new architecture had no effect on the enzyme activity (Table 15) .

[0321] Example 5: ELISA binding of anti-FAP hit antibodies

[0322] An ELISA-based binding assay was used to assess the binding to human, cynomolgus and mouse recombinant FAP protein by the anti-FAP mAbs (Figure. 1) or anti-FAP x anti-CD3 bispecific antibodies (Figure. 2) . Briefly, biotin-labeled human, cynomolgus and mouse recombinant FAP protein was captured on a streptavidin pre-coated ELISA 96-well plate to capture the test antibodies on the solid phase. Varying concentrations of the anti-FAP antibodies were added to the coated plates, and the bound antibodies were detected and quantified using standard ELISA protocols. The results, presented in Figures 1 and 2, demonstrated the ability of these anti-FAP antibodies to bind to the intended human, cynomolgus and mouse FAP target, displaying a range of affinities for the corresponding antigen in this assay format. This range of affinities is valuable for disease-specific applications or in specific pairings with other antibodies in a bispecific format. The ability of anti-FAP hits to cross-reactively bind with cynomolgus or mouse FAP antigens offers the potential to conduct pre-clinical efficacy and toxicity studies in these two species.

[0323] Example 6: Cell binding of anti-FAP hit antibodies

[0324] The binding titration of anti-FAP or anti-FAP x anti-CD3 bispecific antibodies to FAP positive U-87 MG (Figures. 3A and 3B) and IMR-90 (Figure 3C) was assessed using flow cytometric analysis. The antibodies were incubated with tumor cells for 1 hour at 4 ℃, followed by detection with Alexa Fluor 647-labeled anti-human IgG antibody. Then the cells were analyzed by flow cytometry on Beckman Cytoflex. The results, shown in Figure. 3, demonstrated that the tested anti-FAP antibodies can bind to the human FAP protein as it is naturally presented on the surface of the intended target cells, in addition to their ability to bind to isolated recombinant protein. Therefore, the FAP antibodies exhibited both antigen and cell binding capabilities.

[0325] Example 7: FAP x CD3 bispecific antibodies induce T cell activation in U-87 MG cells

[0326] Besides the binding properties, the anti-FAP hits were further validated for their activity for T cell activation by generating bispecific antibodies paring with various anti-CD3 antibodies. The NFAT luciferase reporter Jurkat cell line expressed firefly luciferase under the control of the NFAT response elements stably integrated into the Jurkat cell genome. Jurkat-NFAT effector cells (Vazyme, DD1302) were used to assess the T cell activation activity. Experiments were conducted following the manufacturer’s instructions. Briefly, target cells (U-87 MG) were seeded into each well of the 96-well white plate and incubated overnight. The medium was removed on the next day, and Jurkat-NFAT effector cells were added into each well for an E: T ratio of 6: 1. Also, antibodies with a serial of three-fold dilution were added into each well. The plate is further incubated at 37℃, 5%CO2 for 6 h. After incubation, the plate was equilibrated at room temperature for 10 min and then Bio-Lite luciferase assay substrate (Vazyme, DD1201-01) was added into each well for another 10 min in the dark for signal stabilization. The final luminescence signal was measured using a multi-plate reader (Tecan) .

[0327] FAP x CD3 bispecific antibodies were found to induce T cell activation with presence of U-87 MG cells in a concentration-dependent manner, as depicted in Figure 4. In Figure 4A, the FAP_MO36_v6 x Cris7_v4 bispecific antibodies exhibited comparable T cell activation activity to the FAP_MO33_v6 x Cris7_v4. However, the FAP_MO36_v6 x Cris7_v3 bispecific antibodies showed lower T cell activation activity than the FAP_MO33_v6 x Cris7_v3. In Figure 4B, FAP_MO36_v6 x Cris7_v4 bispecific antibodies displayed comparable T cell activation activity to the FAP_MO36_v7 x Cris7_v4, and higher than other FAP_MO36_v6 x CD3 bispecific antibodies, including anti-CD3 variants like 40G5_CD3 and 1979_CD3. In Figure 4C, the FAP_4B9 x 40G5_CD3 showed higher T cell activation activity than FAP_MO36_v6 x 40G5_CD3 antibodies. Antibodies that display a range of activities will be valuable in disease specific applications or in specific pairings with other antibodies in a bispecific format.

[0328] Example 8: FAP x CD3 bispecific antibodies induce T cell cytotoxicity in U-87 MG cells

[0329] A range of concentrations of bispecific antibodies, combining a single anti-CD3 arm (40G5_CD3) with two different anti-FAP arms, FAP_4B9 and FAP_MO36_v6, were mixed with PBMC and the U-87 MG human FAP-positive glioblastoma cell line (E: T ratio = 10: 1) for 48 hours to evaluate T cell cytotoxicity. The results illustrated in Figure 5, depicted concentration-dependent T cell killing due to the binding of the bispecific antibodies to both CD3 and FAP proteins, supporting the conclusion that this binding facilitated the desired T cell-directed killing of target cancer cells. Notably, FAP_4B9 x 40G5_CD3 exhibited higher potency and efficacy than FAP_MO36_v6 x 40G5_CD3 bispecific antibodies. The experimental limitations, such as the restricted coculture time, resulted in minimal killing effects for some variants due to the low-affinity binding of the CD3 arm, which could be beneficial in specific diseases by reducing cytokine release syndrome while maintaining the killing effect on diseased cells.

[0330] Example 9: In vivo anti-tumor activity of FAP x CD3 in combination with EGFR x cMET x VEGF (TAVO412) on non-small cell lung cancer cell line A549 derived xenograft model

[0331] Cancer-associated fibroblasts (CAFs) in the tumor stroma have abundant and stable expression of FAP. An FAP x CD3 bispecific can induce the lysis of CAF to remodel the stroma, thereby enhancing the infiltration of therapeutic agents and improving the immunosuppressive microenvironment. In vivo efficacy of the anti-CD3 x FAP bispecific antibody was evaluated in a PBMC humanized mouse tumor model, as a monotherapy or in combination with an EGFR x cMet x VEGF (TAVO412, Figure. 6B) trispecific antibodies (see, e.g., Intl. Publ. No. WO 2023 / 069888 A1) . TAVO412 has several mechanisms of action in inhibiting tumor growth: 1 -blocking EGFR and cMet pathways that drive cancer growth and proliferation; 2 -immune-mediated killing of tumor cells using antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) , antibody dependent cellular phagocytosis (ADCP) , and complement dependent cytotoxicity (CDC) ; and 3 -blocking VEGF to reduce angiogenesis.

[0332] The bispecific antibody FAP x CD3 that included the anti-CD3 arm 40G5_CD3 and the anti-FAP arm FAP_4B9 was evaluated for its in vivo anti-tumor activity in a FAP positive cell-derived xenograft model of A549 human non-small cell lung cancer. PBMC was engrafted into immunocompromised mice prior to A549 tumor cell inoculation. Once tumors were established, the humanized tumor-bearing mice were randomly assigned to treatment groups and the test molecules were administered intraperitoneally. Subsequently, the antibody-mediated tumor shrinkage was assessed. The experimental results, as shown in Figure. 6A, revealed that mono-treatment with FAP x CD3 at a dose of 1 mg / kg had minimal inhibitory effects on tumor growth, whereas TAVO412 mono-treatment at a dose of 2 mg / kg inhibited tumor growth by 27%. Notably, when combined with TAVO412, FAP x CD3 further increased tumor growth inhibition to 48%. These findings indicated that the FAP x CD3 bispecific antibodies effectively redirected CD3+ T cells for killing cancer-associated fibroblasts in the stroma, thereby enhancing the anti-tumor activity of TAVO412.

[0333] Example 10: ELISA binding of anti-LRRC15 hit antibodies

[0334] An ELISA-based binding assay was used to assess the binding to human (Figure 7) , cynomolgus (Figure 8) and mouse (Figure 9) recombinant LRRC15 antigens by the anti-LRRC15 mAbs (Figures 7-9) or anti-LRRC15 x anti-CD3 bispecific antibodies (Figure 10) . Briefly, biotin-labeled human, cynomolgus and mouse recombinant LRRC15 proteins were captured on a streptavidin pre-coated ELISA 96-well plate to capture the test antibodies on the solid phase. Varying concentrations of the tested anti-LRRC15 antibodies were added to the coated plates, and the bound antibodies were detected and quantified using standard ELISA protocols. The results, presented in Figures 7-10, demonstrated the ability of these anti-LRRC15 antibodies to bind to the intended human, cynomolgus and mouse LRRC15 target, displaying a range of affinities for the antigen in this assay format, compared to the positive anti-LRRC15 mAbs (Abbv85) derived from ABBV-085, an antibody-drug conjugate against LRRC15 (Hingorani et al., 2021) . This range of affinities is valuable for disease-specific applications or in specific pairings with other antibodies in a bispecific format. The ability of anti-LRRC15 hits to cross-reactively bind with cynomolgus or mouse LRRC15 antigens offers the potential to conduct pre-clinical efficacy and toxicity studies in these two species.

[0335] Example 11: Cell binding of anti-LRRC15 hit antibodies in U-118 MG cells

[0336] Flow cytometric analysis was used to assess the binding of anti-LRRC15 monospecific antibodies or anti-LRRC15 x anti-CD3 bispecific antibodies to LRRC15-positive cancer cell line -U-118 MG human glioblastoma cell line. The results, depicted in Figures 11-12, indicated that the tested anti-LRRC15 antibodies could bind to the human LRRC15 protein naturally presented on the target cell surface, as well as to isolated recombinant protein. Additionally, some anti-LRRC15 tandem VHOs were designed for enhanced antigen binding due to bivalency, as depicted in Figure 12A. Despite comparable cell binding levels between anti-LRRC15_VHO494-499 and anti-LRRC15_VHO499-494 in tandems with both permutations, anti-LRRC15_VHO494-504 exhibited higher binding than anti-LRRC15_VHO504-494, indicating a specific permutation preferential binding mode during tandem VHOs design. Overall, the results demonstrated the anti-LRRC15 antibodies'capability for both antigen and cell binding, enabling the subsequent assessment of LRRC15-mediated cell functions.

[0337] Example 12: LRRC15 x CD3 bispecific antibodies induce T cell activation in U-87 MG and U-2 OS cells

[0338] The NFAT reporter assay procedure used here is same as the T cell activation analysis of anti-FAP x anti-CD3 described in Example 7. The U-87 MG (glioblastoma) and U-2 OS (Osteosarcoma) cell lines, both positive for LRRC15, were used as target cells. LRRC15 x CD3 bispecific antibodies were found to induce T cell activation in these cancer cells in a concentration-dependent manner, as shown in Figure 13. Additionally, nearly all tandem anti-LRRC15_VHOs demonstrated higher efficacy and potency in activating T cells than the single VHO antibodies, indicating that the bivalent binding of tandem VHOs enhanced the stability of association between target cells and T cells. These results demonstrated that bispecific antibodies with tandem VHO targeting LRRC15 was more effective at inducing T cell activation, which could be valuable in disease-specific applications or in specific pairings with other antibodies in a bispecific format.

[0339] Example 13: LRRC15 x CD3 bispecific antibodies induce T cell cytotoxicity in U-87 MG cells

[0340] The T cell cytotoxicity effect of anti-LRRC15 x anti-CD3 antibodies was further confirmed in vitro with the presence of human PBMCs and U-87 MG cancer cells. Bispecific antibodies were combined in increasing concentrations with PBMCs and the target cell line. The PBMC killing assay procedure closely resembled the T cell cytotoxicity analysis of anti-FAP x anti-CD3 described in Example 8. The results, depicted in Figure 14, demonstrated concentration-dependent T cell killing due to the binding of the bispecific antibodies to both CD3 and LRRC15 proteins, supporting the conclusion that this binding facilitated the desired T cell-directed killing of target cancer cells. Notably, LRRC15_VHO494-499 x huSP34_v1 exhibited the highest killing efficacy among all test antibodies (Figure 14A) . In Figure 14B, the tandem anti-LRRC15 VHOs x CD3 antibodies demonstrated higher killing potency and efficacy than single anti-LRRC15_VHO x CD3 bispecific antibodies. Experimental limitations, such as the restricted coculture time, which resulted in suboptimal killing effects for some variants due to the low-affinity binding of the CD3 arm, should be considered. However, this could be beneficial in specific diseases by reducing cytokine release syndrome while maintaining the killing effect on diseased cells.

[0341] Example 14: Cell binding of EGFR x HYAL antibodies to HCC827 cells

[0342] To assess the architecture of bispecific antibodies comprising a hyaluronidase and an antigen-binding domain, a binding titration of proteins, including anti-EGFR x HYAL and anti-EGFR x inert arm bispecific antibodies, as well as HYAL-Fc fusion, to EGFR-positive expression cancer cell lines was conducted using flow cytometric analysis. The schematic structures of the tested antibodies are depicted in Figures 15B, 15C, and 15D, respectively. The cell binding assay procedure closely resembled the cell binding analysis of anti-FAP x anti-CD3 described in Example 6. The results, shown in Figure 15A and Table 15, demonstrated that the HYAL-Fc fusion protein exhibited no cell binding to HCC827 cancers, and the anti-EGFR x HYAL and anti-EGFR x inert arm bispecific antibodies showed comparable binding potency and efficacy. Taken together, these findings indicate that the hyaluronidase in bispecific antibodies did not affect the target cell binding. Table 15. Cell binding of anti-EGFR x HYAL bispecific antibodies in HCC827 cells

[0343] Example 15: Screening of hyaluronidase variants

[0344] The recombinant soluble human hyaluronidase PH20 (36-482) has been identified as a minimally active domain, as described in US007767429B2. In this disclosure, two types of mutations were introduced into the human hyaluronidase PH20 active domain with Fc fusions for different enzyme properties and applications in the treatment of diseases, such as various solid tumors. One type of mutation is based on the "consensus" sequence derived from 100 closest orthologs from primates, mammals, and rodents. Mutations in the hydrophobic core, based on the structural model of PH20 derived from the structure of HYAL1, are excluded. Constructs with these consensus mutations included PH20 mut1, PH20 mut2, and PH20 mut3, all sharing less than 95%identity to the wild-type unmodified sequence. The other type of mutations is designed to make substrate binding pH-dependent by introducing His residues in the active site in place of substrate-binding residues, including Y264H, D310H, Y219H, Y92H, V93H, L342H, and T341H / L342S. The human PH20 hyaluronidase with these mutations is fused to a human IgG1 Fc region (L234A / L235A / K409R, SEQ ID NO: 178) with a GGGGS flexible linker (SEQ ID NO: 167) . Expression, purification, and enzyme activity determination of PH20 hyaluronidase variants are summarized in Table 16. All of these Fc-hyaluronidase fusion variants have an expression titer of 2-26 mg / L in CHO expression systems and a good monomeric purity of more than 90%on average by SEC-HPLC analysis.

[0345] Regarding enzyme activity, the wild-type PH20 (36-482) exhibited the highest catalytic activity of 80,000 Units / mg, followed by PH20 V93H (30,000 Units / mg) , PH20 mut1 and PH20 mut2 (20,000 Units / mg) , PH20 L342H (15,000 Units / mg) , PH20 T341H / L342S (2,000 Units / mg) , PH20 Y92H (500 Units / mg) , and PH20 Y264H and Y219H (200 Units / mg) . The hyaluronidase variants displayed a range of activities, which will be valuable in disease-specific applications or in specific pairings with other antibodies in an Fc-fusion format. In addition, the mutations described above can indeed be further combined to create hyaluronidase variants with even more diverse enzyme properties. By combining different mutations, it is possible to generate a wide range of hyaluronidase variants with unique characteristics tailored for specific applications in the treatment of diseases. This approach allows for the customization of enzyme properties to meet the specific needs of different therapeutic strategies and disease targets. Table 16. Screening of hyaluronidase variants

[0346] Example 16: Linker screening for HYAL-Fc fusion proteins

[0347] Flexible and rigid linkers play an increasingly important role in constructing stable and bioactive fusion proteins, offering advantages such as improved biological activity, increased expression yield, and desirable pharmacokinetic profiles (Chen et al., 2013) . In this disclosure, we compared the use of flexible (GGGGS) n and rigid (EAAAK) n linkers in the expression and purification of HYAL-Fc fusion proteins. Some linkers are listed in Table 12. Alpha-helix-forming linkers with the sequence (EAAAK) n have been widely used in constructing recombinant fusion proteins. As shown in Table 17, Fc-hyaluronidase fusion with different linkers had comparable expression titers of around 30 mg / L in CHO expression systems and monomeric purities ranging from 82%to 91%by SEC-HPLC analysis. SDS-PAGE analysis indicated that fusion proteins with rigid linkers tended to have fragmentation bands (Figures. 16B and 16C) , while those with flexible linkers tended to have aggregation bands (Figure. 16A) . Table 17. Linker screening of HYAL-Fc fusions

[0348] Example 17: Cell binding of FAP x LRRC15 bispecific antibodies in U-87 MG and IMR-90 cells

[0349] In this disclosure, we developed a CAF-targeted hyaluronidase by dual binding of FAP and LRRC15. Flow cytometric analysis was used to evaluate the binding of FAP x LRRC15 bispecific antibodies to FAP antigen on the cell surface. The schematic structures of FAP x LRRC15 antibody and FAP mAb are shown in Figures 17C and 17D, respectively. The cell binding assay was conducted using two different FAP-positive cell lines: U-87 MG, a human glioblastoma cancer cell with LRRC15 expression, and IMR-90, a human fibroblast cell line with no LRRC15 expression. As shown in Figure 17, the FAP x LRRC15 bispecific antibodies exhibited higher binding levels than FAP mAbs in FAP and LRRC15 double-positive cells U-87 MG (Figure 17A) , but no obvious increase in binding level was observed when testing antibodies binding to IMR-90, a FAP-positive and LRRC15-negative expression cell line (Figure. 17B) . These results suggest that dual binding of FAP and LRRC15 can enhance CAF targeting, thereby improving the homing of hyaluronidase into the stroma.

[0350] Example 18: Screening of HA positive CDX models using IHC staining

[0351] Hyaluronidases are enzymes that break down hyaluronic acid (HA) in the stroma, leading to the remodeling of the tumor microenvironment and potentially enhancing the therapeutic benefits. In order to evaluate the in vivo activity of hyaluronidase or multispecific antibodies containing hyaluronidase, it is essential to find tumors with a high level of HA in the stroma. The levels of HA in the stroma were confirmed by conducting HA staining on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples derived from different cancer cell line-derived xenograft (CDX) tumor models. This was achieved using a specific biotin-conjugated HA binding protein (HABP, Amsbio, AMS. HKD-BC41) . Formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples from various CDX models were stained with HABP, with some samples undergoing pre-treatment with hyaluronidase as a negative control. Table 18 listed the CDX models evaluated, including non-small cell lung cancer (NSCLC) tumor models (H1975 and HCC827) , a colorectal tumor model (RKO) , triple-negative breast cancer (TNBC) tumor models, prostate cancer (PC-3) , gastric cancer (MKN45) , and pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) (AsPC-1) . All of these tumors showed positive HA staining with varying levels, and the depletion of HA after hyaluronidase treatment was also observed. These staining results supported the wide distribution of HA in the tumor stroma, indicating that targeting HA by hyaluronidases may have broad applications in treating various solid tumors.

[0352] IHC staining of FAP and LRRC15 in FFPE samples from various CDX models confirmed the positive staining in all the tested tumors. This results showed that CAF targets, FAP or LRRC15, could serve to direct hyaluronidase into the tumor stroma. Table 18. Screening of HA positive CDX models using HA staining

[0353] Example 19: In vivo anti-tumor activity of FAP x LRRC15 x HYAL antibodies in a colorectal carcinoma mouse model

[0354] The xenograft model experiments were conducted following specific guidelines and in accordance with animal care and use protocols approved by the GenePharma Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) . Female Balb / c nude mice were subcutaneously implanted with tumor cells, and treatments commenced when the mean tumor volume reached 100-200 mm3. The testing antibodies were administered intraperitoneally (i. p. ) at a twice-weekly dosing regimen. Tumor growth and body weight were monitored twice weekly until the endpoint, and tumor volume is calculated using the formula length x width2 x 0.5. Tumor growth inhibition (TGI) was calculated as TGI %= 1 -TIC, where T and C represented the mean tumor volume of the treated and control groups on the last day, respectively.

[0355] In the in vivo anti-tumor activity evaluation of FAP x LRRC15 x HYAL antibodies in a colorectal carcinoma mouse model (RKO) , results indicated that treatment with FAP x LRRC15 x HYAL at a dose level of 5 mg / kg inhibited tumor growth by 55% (Figure 18A) and led to nearly 60%tumor weight loss (Figure 18B) compared to the isotype control. The schematic structure of the FAP x LRRC15 x HYAL antibody is provided in Figure 18C. These findings demonstrated that the depletion of HA in the stroma by a cancer-associated fibroblast (CAF) -targeted hyaluronidase can exhibit anti-tumor activity in vivo.

[0356] Example 20: In vivo anti-tumor activity of FAP x LRRAC15 x HYAL antibody in combination with 5T4 x CD3 in an RKO colorectal carcinoma xenograft model

[0357] HA depletion will remodel the stroma, thereby enhancing the infiltration of both therapeutic agents and immune cells. In vivo efficacy of 5T4 x CD3 bispecific antibodies in tumor cell killing was evaluated in a PBMC humanized mouse tumor model, as a monotherapy or in combination with an FAP x LRRC15 x HYAL trispecific antibody. FAP x LRRC15 x HYAL trispecific antibody was expected to remodel the ECM and facilitate the recruitment and activation of T cells at the tumor site by 5T4 x CD3 bispecific antibody, leading to the targeted destruction of tumor cells by the immune system. This mechanism of action shows how a targeted HYAL can enhance the activity of TAA x CD3 bispecific antibodies (T cell engager immunotherapy) in the treatment of solid tumor cancers. The schematic structures of the FAP x LRRC15 x HYAL and 5T4 x CD3 antibodies are provided in Figures 19B and 19C, respectively.

[0358] Human PBMCs containing CD3-positive effector T cells were engrafted into immunocompromised mice prior to RKO tumor cell inoculation. Once tumors were established, the humanized tumor-bearing mice were randomly assigned to treatment groups and administered with the test molecules intraperitoneally. Subsequently, the antibody-mediated tumor shrinkage was assessed. The experimental results, as shown in Figure 19A, revealed that mono-treatment with 5T4 x CD3 at a dose of 0.5 mg / kg had minimal inhibitory effects on tumor growth. Notably, when combined with FAP x LRRC15 x HYAL at 5 mg / kg, 5T4 x CD3 further increased tumor growth inhibition to 45%. These findings indicated that the combination of FAP x LRRC15 x HYAL enhanced the anti-tumor activity of 5T4 x CD3 bispecific antibodies.

[0359] Example 21: In vivo anti-tumor activity of FAP x LRRAC15 x HYAL antibody in combination with EGFR x cMET (TAVO412A) in an RKO colorectal carcinoma xenograft model

[0360] In addition to evaluating the efficacy of FAP x LRRC15 x HYAL in combination with TAA x CD3 bispecific antibodies, the in vivo efficacy of FAP x LRRC15 x HYAL was also evaluated in a PBMC humanized mouse tumor model when combined with an EGFR x cMet bispecific antibody (see, e.g., Intl. Publ. No. WO 2023 / 069888 A1) . TAVO412A has several mechanisms of action in inhibiting tumor growth: 1 -blocking EGFR and cMet pathways that drive cancer growth and proliferation; 2 -immune-mediated killing of tumor cells using antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) , antibody dependent cellular phagocytosis (ADCP) , and complement dependent cytotoxicity (CDC) .

[0361] Monotherapy with TAVO412A at a dose of 10 mg / kg had minimal inhibitory effects on tumor growth, but when combined with FAP x LRRC15 x HYAL, TAVO412A produced a tumor growth inhibition of 53%, which was much enhanced compared to TAVO412A alone (Figure 20A) . The schematic structures of FAP x LRRC15 x HYAL and 5T4 x CD3 antibodies are provided in Figure 20B and 20C, respectively. These results indicated that the combination of FAP x LRRC15 x HYAL with EGFR x cMet bispecific antibodies enhanced the anti-tumor activity.

[0362] Example 22: Structural designs for trispecific antibodies targeting FAP, LRRC15, and HA

[0363] Figure 21 depicts formats for FAP x LRRC15 x HYAL trispecific antibodies. For example, Figure 21A shows a first heavy chain with FAP and LRRC15 binding arms, and a second chain comprising a N-terminal hyaluronidase fused to an Fc region; Figure 21B shows a first heavy chain with FAP binding arm, and a second chain comprising a N-terminal hyaluronidase and a C-terminal LRRC15 binding arm fused to an Fc region, respectively; Figure 21C shows a first heavy chain with FAP and LRRC15 binding arms, and a second chain comprising a N-terminal hyaluronidase and a C-terminal LRRC15 binding arm fused to an Fc region, respectively; Figure 21D shows a first heavy chain with FAP and LRRC15 binding arms, and a second chain comprising a C-terminal hyaluronidase fused to an Fc region; Figure 21E shows a first heavy chain with FAP binding arm, and a second chain comprising a C-terminal hyaluronidase and a N-terminal LRRC15 binding arm fused to an Fc region, respectively; Figure 21F shows a first heavy chain with FAP binding arm and a C-terminal hyaluronidase fused to an Fc region, and a second chain comprising a N-terminal LRRC15 binding arm. Antibodies in these different formats may have different binding and functional properties. Table 19. Sequences of multispecific antibodies Table 20. Multispecific antibodies References Adams, S., Miller, G.T., Jesson, M.I., Watanabe, T., Jones, B., &Wallner, B.P. (2004) . PT-100, a small  molecule dipeptidyl peptidase inhibitor, has potent antitumor effects and augments antibody-mediated cytotoxicity via a novel immune mechanism. Cancer Res, 64 (15) , 5471-5480. https:  / / doi. org / 10.1158 / 0008-5472. Can-04-0447 Ben-Ami, E., Perret, R., Huang, Y., Courgeon, F., Gokhale, P.C., Laroche-Clary, A., Eschle, B.K.,  Velasco, V., Le Loarer, F., Algeo, M.P., Purcell, J., Demetri, G.D., &Italiano, A. (2020) . LRRC15 Targeting in Soft-Tissue Sarcomas: Biological and Clinical Implications. Cancers (Basel) , 12 (3) . https:  / / doi. org / 10.3390 / cancers12030757 Bolt, S., Routledge, E., Lloyd, I., Chatenoud, L., Pope, H., Gorman, S.D., Clark, M., &Waldmann, H.  (1993) . The generation of a humanized, non-mitogenic CD3 monoclonal antibody which retains in vitro immunosuppressive properties. Eur J Immunol, 23 (2) , 403-411. https:  / / doi. org / 10.1002 / eji. 1830230216 Carrillo, H., &Lipman, D. (1988) . The Multiple Sequence Alignment Problem in Biology. SIAM Journal  on Applied Mathematics, 48 (5) , 1073-1082. http:  / / www. jstor. org / stable / 2101469 Chen, X., Zaro, J.L., &Shen, W.C. (2013) . Fusion protein linkers: property, design and functionality.  Adv Drug Deliv Rev, 65 (10) , 1357-1369. https:  / / doi. org / 10.1016 / j. addr. 2012.09.039 Chothia, C., &Lesk, A.M. (1987) . Canonical structures for the hypervariable regions of  immunoglobulins. J Mol Biol, 196 (4) , 901-917. http:  / / www. ncbi. nlm. nih. gov / pubmed / 3681981 Chu, S.Y., Vostiar, I., Karki, S., Moore, G.L., Lazar, G.A., Pong, E., Joyce, P.F., Szymkowski, D.E.,  &Desjarlais, J.R. (2008) . Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Mol Immunol, 45 (15) , 3926-3933. https:  / / doi. org / 10.1016 / j. molimm. 2008.06.027 Cui, J., Dean, D., Wei, R., Hornicek, F.J., Ulmert, D., &Duan, Z. (2020) . Expression and clinical  implications of leucine-rich repeat containing 15 (LRRC15) in osteosarcoma. J Orthop Res, 38 (11) , 2362-2372. https:  / / doi. org / 10.1002 / jor. 24848 Dall'A cqua, W.F., Kiener, P.A., &Wu, H. (2006) . Properties of human IgG1s engineered for enhanced  binding to the neonatal Fc receptor (FcRn) . J Biol Chem, 281 (33) , 23514-23524. https:  / / doi. org / 10.1074 / jbc. M604292200 Diebolder, C.A., Beurskens, F.J., de Jong, R.N., Koning, R.I., Strumane, K., Lindorfer, M.A.,  Voorhorst, M., Ugurlar, D., Rosati, S., Heck, A.J., van de Winkel, J.G., Wilson, I.A., Koster, A.J., Taylor, R.P., Saphire, E.O., Burton, D.R., Schuurman, J., Gros, P., &Parren, P.W. (2014) . Complement is activated by IgG hexamers assembled at the cell surface. Science, 343 (6176) , 1260-1263. https:  / / doi. org / 10.1126 / science. 1248943 Donelan, W., Dominguez-Gutierrez, P.R., &Kusmartsev, S. (2022) . Deregulated hyaluronan metabolism  in the tumor microenvironment drives cancer inflammation and tumor-associated immune suppression [Systematic Review] . Frontiers in Immunology, 13. https:  / / doi. org / 10.3389 / fimmu. 2022.971278 Fabre, M., Ferrer, C., Domínguez-Hormaetxe, S., Bockorny, B., Murias, L., Seifert, O., Eisler, S.A.,  Kontermann, R.E., Pfizenmaier, K., Lee, S.Y., Vivanco, M.D.,  P.P., Perea, S., Abbas, M., Richter, W., Simon, L., &Hidalgo, M. (2020) . OMTX705, a Novel FAP-Targeting ADC Demonstrates Activity in Chemotherapy and Pembrolizumab-Resistant Solid Tumor Models. Clin Cancer Res, 26 (13) , 3420-3430. https:  / / doi. org / 10.1158 / 1078-0432. Ccr-19-2238 Freedman, J.D., Duffy, M.R., Lei-Rossmann, J., Muntzer, A., Scott, E.M., Hagel, J., Campo, L., Bryant,  R.J., Verrill, C., Lambert, A., Miller, P., Champion, B.R., Seymour, L.W., &Fisher, K.D. (2018) . An Oncolytic Virus Expressing a T-cell Engager Simultaneously Targets Cancer and Immunosuppressive Stromal Cells. Cancer Res, 78 (24) , 6852-6865. https:  / / doi. org / 10.1158 / 0008-5472. Can-18-1750 Gribskov, M.R., &Devereux, J. (2020) . Sequence analysis primer. Oxford University Press New York.  Griffin, A.M., &Griffin, H. G. (1994) . Computer analysis of sequence data. Humana Press Totowa, N.J. Gunasekaran, K., Pentony, M., Shen, M., Garrett, L., Forte, C., Woodward, A., Ng, S. B., Born, T., Retter, M., Manchulenko, K., Sweet, H., Foltz, I.N., Wittekind, M., &Yan, W. (2010) . Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostatic steering effects: applications to bispecific molecules and monovalent IgG. J Biol Chem, 285 (25) , 19637-19646. Hakim, N., Patel, R., Devoe, C., &Saif, M.W. (2019) . Why HALO 301 Failed and Implications for  Treatment of Pancreatic Cancer. Pancreas (Fairfax) , 3 (1) , e1-e4. https:  / / doi. org / 10.17140 / POJ-3-e010 Han, C., Liu, T., &Yin, R. (2020) . Biomarkers for cancer-associated fibroblasts. Biomarker Research,  8 (1) , 64. https:  / / doi. org / 10.1186 / s40364-020-00245-w Heijne, G.v. (1987) . Sequence analysis in molecular biology : treasure trove or trivial pursuit. Academic  Press San Diego. Hingorani, P., Roth, M.E., Wang, Y., Zhang, W., Gill, J.B., Harrison, D.J., Teicher, B., Erickson, S.,  Gatto, G., Smith, M.A., Kolb, E. A., &Gorlick, R. (2021) . ABBV-085, Antibody-Drug Conjugate Targeting LRRC15, Is Effective in Osteosarcoma: A Report by the Pediatric Preclinical Testing Consortium. Mol Cancer Ther, 20 (3) , 535-540. https:  / / doi. org / 10.1158 / 1535-7163. Mct-20-0406 Hinton, P.R., Xiong, J.M., Johlfs, M.G., Tang, M.T., Keller, S., &Tsurushita, N. (2006) . An  engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life. J Immunol, 176 (1) , 346-356. http:  / / www. ncbi. nlm. nih. gov / pubmed / 16365427 Hussain, A., Voisin, V., Poon, S., Karamboulas, C., Bui, N.H.B., Meens, J., Dmytryshyn, J., Ho, V.W.,  Tang, K.H., Paterson, J., Clarke, B.A., Bernardini, M.Q., Bader, G.D., Neel, B.G., &Ailles, L.E. (2020) . Distinct fibroblast functional states drive clinical outcomes in ovarian cancer and are regulated by TCF21. J Exp Med, 217 (8) . https:  / / doi. org / 10.1084 / jem. 20191094Kabat, E.A. (1991) . Sequences of proteins of immunological interest. In E.A. Kabat (Ed. ) , (5th ed. ed. ) . Bethesda, MD : : U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health. Kakarla, S., Chow, K.K., Mata, M., Shaffer, D.R., Song, X.T., Wu, M.F., Liu, H., Wang, L.L., Rowley,  D.R., Pfizenmaier, K., &Gottschalk, S. (2013) . Antitumor effects of chimeric receptor engineered human T cells directed to tumor stroma. Mol Ther, 21 (8) , 1611-1620. https:  / / doi. org / 10.1038 / mt. 2013.110 Kaul, A., Short, W.D., Wang, X., &Keswani, S. G. (2021) . Hyaluronidases in Human Diseases.  International Journal of Molecular Sciences, 22 (6) , 3204. https:  / / www. mdpi. com / 1422-0067 / 22 / 6 / 3204 Kinder, M., Greenplate, A.R., Grugan, K.D., Soring, K.L., Heeringa, K.A., McCarthy, S.G., Bannish,  G., Perpetua, M., Lynch, F., Jordan, R.E., Strohl, W.R., &Brezski, R.J. (2013) . Engineered protease-resistant antibodies with selectable cell-killing functions. J Biol Chem, 288 (43) , 30843-30854. https:  / / doi. org / 10.1074 / jbc. M113.486142 Krishnamurty, A.T., Shyer, J.A., Thai, M., Gandham, V., Buechler, M.B., Yang, Y.A., Pradhan, R.N.,  Wang, A.W., Sanchez, P.L., Qu, Y., Breart, B., Chalouni, C., Dunlap, D., Ziai, J., Elstrott, J., Zacharias, N., Mao, W., Rowntree, R.K., Sadowsky, J., Lewis, G.D., Pillow, T.H., Nabet, B.Y., Banchereau, R., Tam, L., Caothien, R., Bacarro, N., Roose-Girma, M., Modrusan, Z., Mariathasan, S., Müller, S., &Turley, S. J. (2022) . LRRC15+ myofibroblasts dictate the stromal setpoint to suppress tumour immunity. Nature, 611 (7934) , 148-154. https:  / / doi. org / 10.1038 / s41586-022-05272-1 Labrijn, A.F., Meesters, J.I., de Goeij, B.E., van den Bremer, E.T., Neijssen, J., van Kampen, M.D.,  Strumane, K., Verploegen, S., Kundu, A., Gramer, M.J., van Berkel, P.H., van de Winkel, J.G., Schuurman, J., &Parren, P.W. (2014) . Efficient generation of stable bispecific IgG1 by controlled Fab-arm exchange. Proc Natl Acad Sci U S A, 110 (13) , 5145-5150. Labrijn, A.F., Meesters, J.I., Priem, P., de Jong, R. N., van den Bremer, E.T., van Kampen, M.D.,  Gerritsen, A.F., Schuurman, J., &Parren, P. W. (2014) . Controlled Fab-arm exchange for the generation of stable bispecific IgG1. Nat Protoc, 9 (10) , 2450-2463. https:  / / doi. org / 10.1038 / nprot. 2014.169 Lefranc, M.P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V., & Lefranc, G. (2003) . IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol, 27 (1) , 55-77. http:  / / www. ncbi. nlm. nih. gov / pubmed / 12477501 Lesk, A. (1988) . Computational molecular biology. Oxford University Press, Inc. Locke, K.W., Maneval, D.C., &LaBarre, M.J. (2019) .  drug delivery technology: a  novel approach to subcutaneous administration using recombinant human hyaluronidase PH20. Drug Deliv, 26 (1) , 98-106. https:  / / doi. org / 10.1080 / 10717544.2018.1551442 Mancini, S.J.C., Balabanian, K., Corre, I., Gavard, J., Lazennec, G., Le Bousse-Kerdilès, M. -C.,  Louache, F., Maguer-Satta, V., Mazure, N.M., Mechta-Grigoriou, F., Peyron, J. -F., Trichet, V., &Herault, O. (2021) . Deciphering Tumor Niches: Lessons From Solid and Hematological Malignancies [Mini Review] . Frontiers in Immunology, 12. https:  / / doi. org / 10.3389 / fimmu. 2021.766275 McNeil, B.K., Sorbellini, M., Grubb, R.L., 3rd, Apolo, A., Cecchi, F., Athauda, G., Cohen, B.,  Giubellino, A., Simpson, H., Agarwal, P.K., Coleman, J., Getzenberg, R.H., Netto, G. J., Shih, J., Linehan, W.M., Pinto, P.A., &Bottaro, D.P. (2014) . Preliminary evaluation of urinary soluble Met as a biomarker for urothelial carcinoma of the bladder. J Transl Med, 12, 199. https:  / / doi. org / 10.1186 / 1479-5876-12-199 Morosi, L., Meroni, M., Ubezio, P., Fuso Nerini, I., Minoli, L., Porcu, L., Panini, N., Colombo, M.,  Blouw, B., Kang, D. W., Davoli, E., Zucchetti, M., D’Incalci, M., &Frapolli, R. (2021) . PEGylated recombinant human hyaluronidase (PEGPH20) pre-treatment improves intra-tumour distribution and efficacy of paclitaxel in preclinical models. Journal of Experimental &Clinical Cancer Research, 40 (1) , 286. https:  / / doi. org / 10.1186 / s13046-021-02070-x Peri, A., Salomon, N., Wolf, Y., Kreiter, S., Diken, M., &Samuels, Y. (2023) . The landscape of T cell  antigens for cancer immunotherapy. Nature Cancer, 4 (7) , 937-954. https:  / / doi. org / 10.1038 / s43018-023-00588-x Petkova, S.B., Akilesh, S., Sproule, T.J., Christianson, G.J., Al Khabbaz, H., Brown, A.C., Presta, L. G., Meng, Y.G., &Roopenian, D.C. (2006) . Enhanced half-life of genetically engineered human IgG1 antibodies in a humanized FcRn mouse model: potential application in humorally mediated autoimmune disease. Int Immunol, 18 (12) , 1759-1769. https:  / / doi. org / 10.1093 / intimm / dxl110 Purcell, J.W., Tanlimco, S.G., Hickson, J., Fox, M., Sho, M., Durkin, L., Uziel, T., Powers, R., Foster,  K., McGonigal, T., Kumar, S., Samayoa, J., Zhang, D., Palma, J. P., Mishra, S., Hollenbaugh, D., Gish, K., Morgan-Lappe, S.E., Hsi, E.D., &Chao, D.T. (2018) . LRRC15 Is a Novel Mesenchymal Protein and Stromal Target for Antibody-Drug Conjugates. Cancer Research, 78 (14) , 4059-4072. https:  / / doi. org / 10.1158 / 0008-5472. Can-18-0327 Rapport, M.M., Meyer, K., &Linker, A. (1950) . Correlation of reductimetric and turbidimetric methods  for hyaluronidase assay. J Biol Chem, 186 (2) , 615-623. Ridgway, J.B., Presta, L.G., &Carter, P. (1996) . 'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3  domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng, 9 (7) , 617-621. https:  / / doi. org / 10.1093 / protein / 9.7.617 Santos, A.M., Jung, J., Aziz, N., Kissil, J.L., &Puré, E. (2009) . Targeting fibroblast activation protein  inhibits tumor stromagenesis and growth in mice. J Clin Invest, 119 (12) , 3613-3625. https:  / / doi. org / 10.1172 / jci38988 Shields, R.L., Namenuk, A.K., Hong, K., Meng, Y.G., Rae, J., Briggs, J., Xie, D., Lai, J., Stadlen, A., Li,  B., Fox, J.A., &Presta, L.G. (2001a) . High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem, 276 (9) , 6591-6604. https:  / / doi. org / 10.1074 / jbc. M009483200 Shields, R.L., Namenuk, A.K., Hong, K., Meng, Y.G., Rae, J., Briggs, J., Xie, D., Lai, J., Stadlen, A., Li,  B., Fox, J.A., &Presta, L. G. (2001b) . High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem, 276 (9) , 6591-6604. https:  / / doi. org / 10.1074 / jbc. M009483200 Smith, D.W. (1994) . Biocomputing : informatics and genome projects. Academic Press San Diego. Spigel, D.R., Ervin, T.J., Ramlau, R.A., Daniel, D.B., Goldschmidt, J.H., Jr., Blumenschein, G.R., Jr.,  Krzakowski, M.J., Robinet, G., Godbert, B., Barlesi, F., Govindan, R., Patel, T., Orlov, S.V., Wertheim, M.S., Yu, W., Zha, J., Yauch, R.L., Patel, P.H., Phan, S.C., &Peterson, A.C. (2013) . Randomized phase II trial of Onartuzumab in combination with erlotinib in patients with advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol, 31 (32) , 4105-4114. https:  / / doi. org / 10.1200 / jco. 2012.47.4189 Stavenhagen, J.B., Gorlatov, S., Tuaillon, N., Rankin, C.T., Li, H., Burke, S., Huang, L., Johnson, S.,  Koenig, S., &Bonvini, E. (2008) . Enhancing the potency of therapeutic monoclonal antibodies via Fc optimization. Adv Enzyme Regul, 48, 152-164. https:  / / doi. org / 10.1016 / j. advenzreg. 2007.11.011 Vafa, O., Gilliland, G.L., Brezski, R.J., Strake, B., Wilkinson, T., Lacy, E.R., Scallon, B., Teplyakov,  A., Malia, T. J., &Strohl, W. R. (2014) . An engineered Fc variant of an IgG eliminates all immune effector functions via structural perturbations. Methods, 65 (1) , 114-126. https:  / / doi. org / 10.1016 / j. ymeth. 2013.06.035 Vafa, O., &Trinklein, N. D. (2020) . Perspective: Designing T-Cell Engagers With Better Therapeutic  Windows. Front Oncol, 10, 446. https:  / / doi. org / 10.3389 / fonc. 2020.00446 Van Cutsem, E., Tempero, M.A., Sigal, D., Oh, D. -Y., Fazio, N., Macarulla, T., Hitre, E., Hammel, P.,  Hendifar, A.E., Bates, S.E., Li, C. -P., Hingorani, S.R., de la Fouchardiere, C., Kasi, A., Heinemann, V., Maraveyas, A., Bahary, N., Layos, L., Sahai, V., Zheng, L., Lacy, J., Park, J. O., Portales, F., Oberstein, P., Wu, W., Chondros, D., &Bullock, A. J. (2020) . Randomized Phase III Trial of Pegvorhyaluronidase Alfa With Nab-Paclitaxel Plus Gemcitabine for Patients With Hyaluronan-High Metastatic Pancreatic Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology, 38 (27) , 3185-3194. https:  / / doi. org / 10.1200 / JCO. 20.00590 Wang, L.C., Lo, A., Scholler, J., Sun, J., Majumdar, R.S., Kapoor, V., Antzis, M., Cotner, C.E.,  Johnson, L.A., Durham, A.C., Solomides, C.C., June, C.H., Puré, E., &Albelda, S. M. (2014) . Targeting fibroblast activation protein in tumor stroma with chimeric antigen receptor T cells can inhibit tumor growth and augment host immunity without severe toxicity. Cancer Immunol Res, 2 (2) , 154-166. https:  / / doi. org / 10.1158 / 2326-6066. Cir-13-0027 A., &Plückthun, A. (2001) . Stability engineering of antibody single-chain Fv fragments. J Mol  Biol, 305 (5) , 989-1010. https:  / / doi. org / 10.1006 / jmbi. 2000.4265 Wu, T.T., &Kabat, E.A. (1970) . An analysis of the sequences of the variable regions of Bence Jones  proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity. J Exp Med, 132 (2) , 211-250. http:  / / www. ncbi. nlm. nih. gov / pubmed / 5508247 Xiao, Z., Todd, L., Huang, L., Noguera-Ortega, E., Lu, Z., Huang, L., Kopp, M., Li, Y., Pattada, N.,   Zhong, W., Guo, W., Scholler, J., Liousia, M., Assenmacher, C. -A., June, C.H., Albelda, S. M., &Puré, E. (2023) . Desmoplastic stroma restricts T cell extravasation and mediates immune exclusion and immunosuppression in solid tumors. Nature Communications, 14 (1) , 5110. https:  / / doi. org / 10.1038 / s41467-023-40850-5 Xin, L., Gao, J., Zheng, Z., Chen, Y., Lv, S., Zhao, Z., Yu, C., Yang, X., &Zhang, R. (2021) . Fibroblast  Activation Protein-α as a Target in the Bench-to-Bedside Diagnosis and Treatment of Tumors: A Narrative Review [Review] . Frontiers in Oncology, 11. https:  / / doi. org / 10.3389 / fonc. 2021.648187 Xu, D., Alegre, M.L., Varga, S. S., Rothermel, A.L., Collins, A.M., Pulito, V.L., Hanna, L.S., Dolan,  K.P., Parren, P.W., Bluestone, J.A., Jolliffe, L.K., &Zivin, R.A. (2000) . In vitro characterization of five humanized OKT3 effector function variant antibodies. Cell Immunol, 200 (1) , 16-26. https:  / / doi. org / 10.1006 / cimm. 2000.1617 Xu, M., Zhang, T., Xia, R., Wei, Y., &Wei, X. (2022) . Targeting the tumor stroma for cancer therapy.  Molecular Cancer, 21 (1) , 208. https:  / / doi. org / 10.1186 / s12943-022-01670-1 Zalevsky, J., Chamberlain, A.K., Horton, H.M., Karki, S., Leung, I.W., Sproule, T.J., Lazar, G.A.,  Roopenian, D.C., &Desjarlais, J. R. (2010) . Enhanced antibody half-life improves in vivo activity. Nat Biotechnol, 28 (2) , 157-159. https:  / / doi. org / 10.1038 / nbt. 1601 Zhang, D., Armstrong, A.A., Tam, S.H., McCarthy, S.G., Luo, J., Gilliland, G.L., &Chiu, M.L. (2017) .  Functional optimization of agonistic antibodies to OX40 receptor with novel Fc mutations to promote antibody multimerization. MAbs, 9, 1129-1142.

Claims

1.An anti-FAP antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain sequence comprising an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 1-3, 6-8, 12-14 and 17 or an antigen-binding fragment thereof, and a light chain sequence comprising an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 4-5, 9-11, 15-16 and 18 or an antigen-binding fragment thereof.2.The anti-FAP antibody or antigen binding fragment of claim 1, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence comprising: SEQ ID NOs: 1 and 4; SEQ ID NOs: 1 and 5; SEQ ID NOs: 2 and 4; SEQ ID NOs: 2 and 5; SEQ ID NOs: 3 and 4; SEQ ID NOs: 3 and 5; SEQ ID NOs: 6 and 9; SEQ ID NOs: 6 and 10; SEQ ID NOs: 6 and 11; SEQ ID NOs: 7 and 9; SEQ ID NOs: 7 and 10; SEQ ID NOs: 7 and 11; SEQ ID NOs: 8 and 9; SEQ ID NOs: 8 and 10; SEQ ID NOs: 8 and 11; SEQ ID NOs: 12 and 15; SEQ ID NOs: 13 and 15; SEQ ID NOs: 14 and 15; SEQ ID NOs: 12 and 16; SEQ ID NOs: 13 and 16; SEQ ID NOs: 14 and 16; or SEQ ID NOs: 17 and 18; respectively.3.A multispecific antibody comprising the anti-FAP antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 1-2.4.An anti-LRRC15 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising:a heavy chain variable region comprising complementarity determining region (CDR) sequences HCDR1, HCDR2, and HCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, and HCDR3 comprises:SEQ ID NOs: 217, 325, and 350;SEQ ID NOs: 198, 199, and 200;SEQ ID NOs: 198, 351, and 201;SEQ ID NOs: 202, 203, and 204;SEQ ID NOs: 198, 351, and 205;SEQ ID NOs: 198, 206, and 207;SEQ ID NOs: 198, 199, and 209;SEQ ID NOs: 198, 203, and 210;SEQ ID NOs: 198, 351, and 211;SEQ ID NOs: 198, 199, and 212;SEQ ID NOs: 198, 206, and 213;SEQ ID NOs: 198, 199, and 214;SEQ ID NOs: 208, 203, and 215;SEQ ID NOs: 216, 217, and 218;SEQ ID NOs: 208, 203, and 219;SEQ ID NOs: 198, 203, and 220;SEQ ID NOs: 208, 203, and 221;SEQ ID NOs: 198, 203, and 222;SEQ ID NOs: 198, 351, and 223;SEQ ID NOs: 198, 351, and 224;SEQ ID NOs: 208, 203, and 225;SEQ ID NOs: 198, 203, and 226;SEQ ID NOs: 202, 199, and 227;SEQ ID NOs: 198, 228, and 229;SEQ ID NOs: 198, 203, and 230;SEQ ID NOs: 198, 203, and 231;SEQ ID NOs: 198, 203, and 232;SEQ ID NOs: 208, 206, and 233;SEQ ID NOs: 198, 351, and 234;SEQ ID NOs: 198, 235, and 236;SEQ ID NOs: 198, 199, and 237;SEQ ID NOs: 198, 351, and 238;SEQ ID NOs: 198, 203, and 239;SEQ ID NOs: 216, 203, and 240;SEQ ID NOs: 198, 203, and 241;SEQ ID NOs: 198, 351, and 242;SEQ ID NOs: 198, 243, and 244;SEQ ID NOs: 198, 351, and 245;SEQ ID NOs: 208, 351, and 246;SEQ ID NOs: 216, 203, and 247;SEQ ID NOs: 198, 199, and 248;SEQ ID NOs: 202, 203, and 249;SEQ ID NOs: 198, 203, and 250;SEQ ID NOs: 216, 203, and 251;SEQ ID NOs: 198, 252, and 253;SEQ ID NOs: 208, 254, and 255;SEQ ID NOs: 198, 256, and 257;SEQ ID NOs: 198, 203, and 258;SEQ ID NOs: 198, 259, and 260;SEQ ID NOs: 216, 261, and 262;SEQ ID NOs: 208, 272, and 273;SEQ ID NOs: 198, 263, and 264;SEQ ID NOs: 208, 206, and 265;SEQ ID NOs: 202, 203, and 266;SEQ ID NOs: 198, 199, and 267;SEQ ID NOs: 216, 256, and 268;SEQ ID NOs: 198, 199, and 269;SEQ ID NOs: 198, 261, and 270;SEQ ID NOs: 202, 203, and 271;SEQ ID NOs: 216, 272, and 274;SEQ ID NOs: 198, 206, and 275;SEQ ID NOs: 208, 276, and 277;SEQ ID NOs: 198, 203, and 278;SEQ ID NOs: 198, 199, and 279;SEQ ID NOs: 198, 280, and 281;SEQ ID NOs: 216, 203, and 282;SEQ ID NOs: 202, 283, and 284;SEQ ID NOs: 216, 285, and 286;SEQ ID NOs: 198, 285, and 287;SEQ ID NOs: 208, 288, and 289;SEQ ID NOs: 198, 261, and 290;SEQ ID NOs: 198, 261, and 291;SEQ ID NOs: 208, 288, and 292;SEQ ID NOs: 202, 293, and 294;SEQ ID NOs: 198, 295, and 296;SEQ ID NOs: 198, 297, and 298;SEQ ID NOs: 198, 299, and 300;SEQ ID NOs: 198, 217, and 301;SEQ ID NOs: 198, 302, and 303;SEQ ID NOs: 216, 285, and 304;SEQ ID NOs: 198, 203, and 305;SEQ ID NOs: 208, 297, and 306;SEQ ID NOs: 216, 285, and 307;SEQ ID NOs: 216, 297, and 308;SEQ ID NOs: 202, 309, and 310;SEQ ID NOs: 216, 311, and 312;SEQ ID NOs: 202, 313, and 314;SEQ ID NOs: 216, 315, and 316;SEQ ID NOs: 208, 317, and 318;SEQ ID NOs: 198, 309, and 319;SEQ ID NOs: 202, 320, and 321;SEQ ID NOs: 208, 322, and 323;SEQ ID NOs: 198, 297, and 324;SEQ ID NOs: 216, 325, and 326;SEQ ID NOs: 202, 217, and 327;SEQ ID NOs: 198, 322, and 328;SEQ ID NOs: 198, 252, and 329;SEQ ID NOs: 208, 330, and 331;SEQ ID NOs: 198, 313, and 332;SEQ ID NOs: 216, 333, and 334;SEQ ID NOs: 198, 252, and 335;SEQ ID NOs: 198, 199, and 336;SEQ ID NOs: 216, 337, and 338;SEQ ID NOs: 202, 320, and 339;SEQ ID NOs: 208, 330, and 340;SEQ ID NOs: 208, 295, and 341;SEQ ID NOs: 198, 280, and 342;SEQ ID NOs: 202, 309, and 343;SEQ ID NOs: 198, 203, and 344; orSEQ ID NOs: 198, 235, and 345; respectively.5.The anti-LRRC15 antibody or an antigen-binding fragment of claim 4, comprising at least one variable-heavy-chain-only single-domain or an antigen-binding fragment thereof, wherein the at least one variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment thereof comprises an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 19-128 or an antigen-binding fragment thereof.6.The anti-LRRC15 antibody or an antigen-binding fragment of claim 5, wherein the at least one variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment comprises two, three, or four variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment in tandem.7.An anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment thereof, comprising a heavy chain sequence comprising an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 129 and 131 or an antigen-binding fragment thereof, and a light chain sequence comprising an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 130 and 132 or an antigen-binding fragment thereof.8.The anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment of claim 7, comprising a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence comprising: SEQ ID NOs: 129 and 130; or SEQ ID NOs: 131 and 132, respectively.9.A multispecific antibody comprising the anti-LRRC15 antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 4-8.10.An engineered hyaluronidase or fragment thereof comprising any one of SEQ ID NOs: 352-358 and 144-146 or an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 352-358 and 144-146.11.The engineered hyaluronidase or fragment of claim 10, wherein the engineered hyaluronidase or fragment is fused to an Fc or fragment thereof.12.A multiple specific antibody comprising the engineered hyaluronidase or fragment of any one of claims 10-11.13.A multispecific antibody, comprising:3) a first binding arm targeting CD3 comprising:a first heavy chain protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a first light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof,wherein:the IgG heavy chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 133-135 and 137-140 or an antigen-binding fragment thereof,the IgG light chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 136 and 141-143 or an antigen-binding fragment thereof; and4) a second binding arm targeting FAP comprising:a second heavy chain protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a second light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof,wherein:the IgG heavy chain or antigen-binding fragment of the second binding arm comprises the heavy chain sequence of any one of claims 1-2,the IgG light chain or antigen-binding fragment of the second binding arm comprises the light chain sequence of any one of claims 1-2.14.A multispecific antibody, comprising:3) a first binding arm targeting CD3 comprising:a first heavy chain protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a first light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof,wherein:the IgG heavy chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 133-135 and 137-140 or an antigen-binding fragment thereof,the IgG light chain or antigen-binding fragment of the first binding arm comprises an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 136 and 141-143 or an antigen-binding fragment thereof; and4) a second binding arm targeting LRRC15 comprising:a second heavy chain protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a second light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof,wherein:the IgG heavy chain or antigen-binding fragment of the second binding arm comprises the heavy chain sequence of any one of claims 7-8,the IgG light chain or antigen-binding fragment thereof of the second binding arm comprises the light chain sequence of any one of claims 7-8.15.A multispecific antibody, comprising:3) a first binding arm targeting CD3 comprising:a first heavy chain protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof, and a first light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof,wherein:the IgG heavy chain or antigen-binding fragment thereof of the first binding arm comprises an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 133-135 and 137-140 or an antigen-binding fragment thereof,the IgG light chain or antigen-binding fragment thereof of the first binding arm comprises an amino acid sequence having at least 85%identity to any one of SEQ ID NOs: 136 and 141-143 or an antigen-binding fragment thereof; and4) a second binding arm targeting LRRC15 comprising:a second binding arm comprising: a second heavy chain protein comprising an IgG heavy chain comprising at least one variable-heavy-chain only (VHO) single domain or an antigen-binding fragment thereof,wherein:the variable-heavy-chain only (VHO) heavy chain or antigen-binding fragment of the second binding arm comprises the heavy chain variable region of claim 4.16.The multispecific antibody of claim 15, wherein the variable-heavy-chain only (VHO) heavy chain or antigen-binding fragment thereof of the second binding arm comprises the at least one variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment of claim 5.17.The multispecific antibody of claim 15 or 16, wherein the at least one variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment comprises two, three, or four variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment in tandem.18.A multispecific antibody, comprising:a heavy chain fusion protein targeting FAP and LRRC15 comprising:from the N-to the C-terminus, an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof -an optional linker -at least one variable-heavy-chain only (VHO) single domain or an antigen-binding fragment thereof, anda light chain protein targeting FAP comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof.wherein:the IgG heavy chain or antigen-binding fragment comprises the heavy chain sequence of any one of claims 1-2,the variable-heavy-chain only (VHO) single domain or antigen-binding fragment comprises the heavy chain variable region of claim 4,the IgG light chain or antigen-binding fragment comprises the light chain sequence of any one of claims 1-2.19.The multispecific antibody of claim 18, wherein the variable-heavy-chain only (VHO) single domain or an antigen-binding fragment comprises the at least one (e.g., 2, 3, or 4) variable-heavy-chain-only single-domain or antigen-binding fragment of claim 5.20.A multispecific antibody, comprising:3) a first binding arm targeting HA comprising:a first heavy chain fusion protein comprising a hyaluronidase domain or fragment thereof -an optional linker A -an Fc region or a fragment thereof; and4) a second binding arm targeting FAP and LRRC15 comprising:a second heavy chain fusion protein comprising an IgG heavy chain or an antigen-binding fragment thereof -an optional linker B -at least one variable-heavy-chain only (VHO) single domain or an antigen-binding fragment thereof, and a second light chain protein comprising an IgG light chain or an antigen-binding fragment thereof,wherein:the hyaluronidase domain or fragment of the first binding arm comprises the engineered hyaluronidase or fragment of claim 10,wherein:the IgG heavy chain or antigen-binding fragment of the second binding arm comprises the heavy chain sequence of any one of claims 1-2,the IgG light chain or antigen-binding fragment of the second binding arm comprises the light chain sequence of any one of claims 1-2,the variable-heavy-chain only (VHO) single domain or an antigen-binding fragment of the second arm comprises the heavy chain variable region of claim 4.21.The multispecific antibody of claim 20, wherein the variable-heavy-chain only (VHO) single domain or an antigen-binding fragment of the second binding arm comprises at least one (e.g., 2, 3, or 4) variable-heavy-chain-only single-domain or an antigen-binding fragment of claim 5.22.A multispecific antibody, comprising:1) a first binding arm targeting HA comprising:a first binding arm comprising: a first heavy chain fusion protein comprising, from the N-to the C-terminus, a hyaluronidase domain or fragment thereof -an optional linker A -an Fc region or a fragment thereof,2) a second binding arm targeting EGFR comprising:a second binding arm comprising: a second heavy chain fusion protein comprising, from the N-to the C-terminus, at least one variable-heavy-chain only (VHO) single domain that is capable of binding EGFR -an optional linker B -an Fc region or a fragment thereof;wherein:the hyaluronidase domain or fragment of the first binding arm comprises the engineered hyaluronidase or fragment of claim 10.23.The multispecific antibody of any one of claims 12-22, wherein the first binding arm is monovalent or multivalent (e.g., bivalent) , and the second binding arm is monovalent or multivalent (e.g., bivalent) .24.The multispecific antibody of claims 13-17, wherein the CD3-targeting binding arm comprises a heavy chain sequence and a light chain sequence comprising: SEQ ID NOs: 133 and 136; SEQ ID NOs: 134 and 136; SEQ ID NOs: 135 and 136; SEQ ID NOs: 140 and 142; or SEQ ID NOs: 137 and 143; respectively.25.The multispecific antibody of claims 20-22, wherein the hyaluronidase enzyme domain or fragment thereof comprises an amino acid sequence comprising any one of SEQ ID NOs: 352-354.26.A conjugate comprising the anti-FAP antibody or antigen binding fragment of any one of claims 1-2; the anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment of any one of claims 4-8; the engineered hyaluronidase or fragment of any one of claims 10-11; or the multispecific antibody of any one of claims 3, 9, and 12-25; conjugated to a cytotoxic agent.27.A pharmaceutical composition comprising the anti-FAP antibody or antigen binding fragment of any one of claims 1-2; the anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment of any one of claims 4-8; the engineered hyaluronidase or fragment of any one of claims 10-11; the multispecific antibody of any one of claims 3, 9, and 12-25; or the conjugate of claim 26, and a pharmaceutically acceptable carrier.28.A nucleic acid encoding the anti-FAP antibody or antigen binding fragment of any one of claims 1-2; the anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment of any one of claims 4-8; the engineered hyaluronidase or fragment of any one of claims 10-11; or the multispecific antibody of any one of claims 3, 9, and 12-25 or any portion thereof.29.A host cell comprising the nucleic acid of claim 28.30.A method for preparing the anti-FAP antibody or antigen binding fragment of any one of claims 1-2; the anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment of any one of claims 4-8; the engineered hyaluronidase or fragment of any one of claims 10-11; or the multispecific antibody of any one of claims 3, 9, and 12-25; comprising: culturing the host cell of claim 29, growing the host cell in a host cell culture, providing the host cell culture conditions wherein the nucleic acid of claim 26 is expressed, and recovering the antibody, fragment, or multispecific antibody from the host cell or from the host cell culture.31.A method for treating a FAP-mediated disease or disorder in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of the anti-FAP antibody or antigen binding fragment of any one of claims 1-2; the anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment of any one of claims 4-8; the engineered hyaluronidase or fragment of any one of claims 10-11; or the multispecific antibody of any one of claims 3, 9, and 12-25; the conjugate of claim 26, or the pharmaceutical composition of claim 27.32.The method for treating FAP-mediated disease or disorder of claim 31, wherein the FAP-mediated disease or disorder is selected from breast cancer, ovarian cancer, lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer) , pancreatic cancer, glioblastoma, gastro-intestinal cancers, pancreatic / ampullary cancers, desmoid tumors, thyroid cancers, and colorectal carcinoma.33.A method for treating an LRRC15-mediated disease or disorder in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of the anti-FAP antibody or antigen binding fragment of any one of claims 1-2; the anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment of any one of claims 4-8; the engineered hyaluronidase or fragment of any one of claims 10-11; or the multispecific antibody of any one of claims 3, 9, and 12-25; the conjugate of claim 26, or the pharmaceutical composition of claim 27.34.The method for treating LRRC15-mediated disease or disorder of claim 33, wherein the LRRC15-mediated disease or disorder is selected from glioblastoma, osteosarcoma, sarcomas, melanoma, prostate cancers, breast cancers, head and neck cancers, lung cancers, cervical cancers, and colorectal carcinoma.35.A method for treating an EGFR-mediated disease or disorder in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of the engineered hyaluronidase or fragment of any one of claims 10-11, the multispecific antibody of any one of claims 22-23, the conjugate of claim 26, or the pharmaceutical composition of claim 27.36.The method for treating EGFR-mediated disease or disorder of claim 35, wherein the EGFR-mediated disease or disorder is selected from non-small cell lung cancer and colorectal carcinoma.37.A method for treating an HA-mediated disease or disorder in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a pharmaceutically effective amount of the anti-FAP antibody or antigen binding fragment of any one of claims 1-2; the anti-LRRC15 antibody or antigen binding fragment of any one of claims 4-8; the engineered hyaluronidase or fragment of any one of claims 10-11; or the multispecific antibody of any one of claims 3, 9, and 12-25; the conjugate of claim 26, or the pharmaceutical composition of claim 27.38.The method for treating HA-mediated disease or disorder of claim 34, wherein the HA-mediated disease or disorder is selected from non-small cell lung cancer, colorectal cancer, triple negative breast cancer, prostate cancer, gastric cancer and pancreatic ductal adenocarcinoma.

Images