Anti-4-BB single domain antibodies, bispecific antibodies and uses thereof

Abstract

Provided is a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, a heavy chain antibody comprising the single domain antibody, a bispecific antibody comprising the single domain antibody, an immunoconjugate comprising the single domain antibody, and a pharmaceutical composition and use thereof for treatment, prevention or diagnosis of cancers.

Description

ANTI-4-BB SINGLE DOMAIN ANTIBODIES, BISPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOFTechnical Filed

[0001] The present disclosure relates to anti-4-1BB single domain antibodies, heavy chain antibodies, bispecific antibodies, immunoconjugates, pharmaceutical compositions and uses thereof in treating, preventing or diagnosing cancers.Background

[0002] 4‐1BB (CD137, tumor necrosis factor receptor superfamily 9) , a member of the TNF receptor superfamily (TNFRSF) , is a costimulatory molecule. 4-1BB is widely expressed on activated T cells, activated NK cells, NKT cells, B cells, eosinophils, mast cells, neutrophils, mature Tregs, activated monocytes, and dendritic cells. In different cells, 4-1BB signaling shows different mechanisms of action after activation, and 4‐1BB plays an important role in regulating the activity of a variety of immune cells. 4-1BB agonists can enhance immune cell proliferation, survival, cytokine secretion and cytolytic activity of CD8 T cells, and 4-1BB target drugs have a wide range of application prospects.

[0003] Trastuzumab (Herceptin) , a monoclonal antibody targeting HER2 / neu, is used to treat HER2 breast cancer. Its sales exceeded $6 billion in 2013 and has been growing steadily for many years. Compared with chemotherapy alone, the combination therapy with Herceptin can reduce the mortality by 11%, and the response rate can be increased from 32%to 50%. Therefore, better HER2-targeted drugs and treatment strategies are urgently needed to improve the response rate.

[0004] Blockade of PD-L1 expression on tumor cells via anti-PD-L1 monoclonal antibody (mAb) has shown great promise for successful cancer treatment by overcoming T cell exhaustion. Several PD-L1 mAbs, including atezolizumab (Tecentriq) and durvalumab (Imfinzi) , are FDA-approved to treat non-small cell lung cancer (NSCLC) , bladder cancer, and Merkel cell carcinoma of the skin. However, the overall response rate to anti-PD-L1 mAb therapy is still very low in patients with melanoma (26%) , NSCLC (21%) , and renal cell carcinoma (13%) .Summary

[0005] In one aspect, provided is a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 that are same with respective CDR1, CDR2, and CDR3 of an anti-4-1BB single domain antibody having an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO. 1 to 13.

[0006] In some embodiments, the CDR1, CDR2, and CDR3 are defined according to a CDR definition scheme selected from a group consisting of IMGT, Kabat, Contact, Chothia, Martin, PyIgClassify, and any combination thereof.

[0007] In some embodiments, the CDR1, CDR2, and CDR3, according to IMGT definition scheme, of the single domain antibody specifically binding to 4-1BB have amino acid sequences as shown in

[0008] (a) SEQ ID NO: 35, 36, and 37, respectively;

[0009] (b) SEQ ID NO: 38, 39, and 40, respectively;

[0010] (c) SEQ ID NO: 41, 42, and 43, respectively;

[0011] (d) SEQ ID NO: 44, 42, and 45, respectively;

[0012] (e) SEQ ID NO: 46, 42, and 45, respectively;

[0013] (f) SEQ ID NO: 47, 48, and 49, respectively;

[0014] (g) SEQ ID NO: 41, 50, and 51, respectively;

[0015] (h) SEQ ID NO: 52, 42, and 53, respectively;

[0016] (i) SEQ ID NO: 54, 55, and 56, respectively;

[0017] (j) SEQ ID NO: 57, 48, and 58, respectively;

[0018] (k) SEQ ID NO: 59, 48, and 60, respectively; or

[0019] (l) SEQ ID NO: 61, 48, and 62, respectively..

[0020] In some embodiments, the single domain antibody comprises an amino acid sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 1 to 13, and an amino acid sequence having at least 80%identity to each thereof.

[0021] In some embodiments, the single domain antibody is a humanized antibody, a human antibody, a chimeric antibody, or a camelized antibody.

[0022] Another aspect of the disclosure provides a heavy chain antibody comprising a single domain antibody as disclosed herein and an Fc portion linked to the single domain antibody.

[0023] Another aspect of the disclosure provides a bispecific antibody comprising a single domain antibody as disclosed herein, and a second binding domain specifically binding to a second target selected from a tumor associated antigen and a tumor specific antigen.

[0024] In some embodiments, the second target is selected from a group consisting of HER2, 5T4, PSMA, BCMA, FGFR, CD20, CD33, CD19, CD22, CD123, CD30, GPC-3, CEA, EGFR1, EGFR2, EGFR3, TGF-β, ROR1, PD-L1, Claudin18.2, EpCAM, GD2, MSLN, EGFR, MUC1, MUC2, EGFRVIII, CD38, Trop-2, c-MET, Nectin-4, CD79b, CCK4, GPA33, HLA-A2, CLEC12A, p-cadherin, TDO2, MART-1, Pmel 17, MAGE-1, AFP, CA125, TRP-1, TRP-2, NY-ESO, PSA, CDK4, BCA225, CA 125, MG7-Ag, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, TAAL6 and TAG72.

[0025] In some embodiments, the single domain antibody is linked to a complete IgG antibody, optionally via a peptide linker. In some embodiments, the peptide linker consists of glycine and serine residues. In some embodiments, the single domain antibody is linked to the C terminus of a heavy chain, the C terminus of a light chain, or the N terminus of a heavy chain, of the complete IgG antibody.

[0026] In some embodiments, the complete IgG antibody is an anti-Her2 antibody. In some embodiments, the anti-Her2 antibody comprises a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.

[0027] In some embodiments, the bispecific antibody comprises:

[0028] (a) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0029] (b) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0030] (c) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0031] (d) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0032] (e) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0033] (f) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0034] (g) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0035] (h) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0036] (i) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0037] (j) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0038] (k) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0039] (l) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14; or

[0040] (m) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.

[0041] In preferable embodiments, the bispecific antibody comprises a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.

[0042] Another aspect of the disclosure provides an immunoconjugate, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof, comprising a single domain antibody as disclosed herein, a heavy chain antibody as disclosed herein, or a bispecific antibody as disclosed herein; and an active moiety.

[0043] In some embodiments, the active moiety is selected from a group consisting of a toxin, a peptide tag, sortag, a radionuclide, a near-infrared fluorochromes, and a nanoparticle.

[0044] Another aspect of the disclosure provides a pharmaceutical composition comprising a single domain antibody as disclosed herein, a heavy chain antibody as disclosed herein, a bispecific antibody as disclosed herein, or an immunoconjugate as disclosed herein; and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0045] Further aspects of the disclosure provide a nucleic acid molecule encoding a single domain antibody as disclosed herein, a heavy chain antibody as disclosed herein, or a bispecific antibody as disclosed herein, or an immunoconjugate as disclosed herein; an expression vector comprising the nucleic acid molecule as disclosed herein; and a non-human host cell comprising the expression vector as disclosed herein.

[0046] Further aspect of the disclosure provides use of a single domain antibody as disclosed herein, a heavy chain antibody as disclosed herein, a bispecific antibody as disclosed herein, an immunoconjugate as disclosed herein, or a composition as disclosed herein in the preparation of a medicament for treatment of a cancer.

[0047] Further aspect of the disclosure provides a single domain antibody as disclosed herein, a heavy chain antibody as disclosed herein, a bispecific antibody as disclosed herein, an immunoconjugate as disclosed herein, or a composition as disclosed herein for use in treatment of a cancer.

[0048] Further aspect of the disclosure provides a method for treatment of cancer comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a single domain antibody as disclosed herein, a heavy chain antibody as disclosed herein, a bispecific antibody as disclosed herein, an immunoconjugate as disclosed herein, or a composition as disclosed herein.

[0049] Further aspect of the disclosure provides a polypeptide comprising a single domain antibody as disclosed herein, or a heavy chain antibody as disclosed herein; and one or more amino acid residues covalently linked to the N terminus, C terminus or anywhere therebetween of the single domain antibody as disclosed herein or the heavy chain antibody as disclosed herein.

[0050] The present invention provides bispecific antibodies against HER2 and 4‐1BB. Bispecific antibodies have high binding affinity for both HER2 protein and 4‐1BB protein. These anti-HER2 / 4-1BB bispecific antibodies (BM231) , displaying distinct affinities, demonstrated varying activation potentials in vitro and divergent efficacy and safety profiles in vivo with respect to tumor inhibition.

[0051] The present invention further provides bispecific antibodies against PD-L1 and 4‐1BB (BM331) . These bispecific antibodies can bind to human 4-1BB proteins, can specifically bind to CHO cell line that overexpressing human 4-1BB protein, and can activate 4-1BB NFκB-Luc Jurkat cells in a PD-L1 dependent manner. Most importantly, these PDL1-41BB bispecific antibodies show excellent anti-tumor activities in C57BL / 6-hPD-1 / hPD-L1 / h4-1BB mice bearing MC38-hPD-L1 cells, with the maximum TGI of 100%.

[0052] The present invention provides bispecific antibodies against HER2 and 4 -1BB. In some embodiments, the antibody of the present disclosure includes a “conditional agonist” anti-4-1BB arm that fails to activate 4-1BB signaling in the absence of binding of the anti-HER2 arm to the HER2 protein expressed on the cell. The antibodies of the present invention are considered to be safer compared to known anti-4-1BB agonist antibodies, which are often associated with target toxic dose limits. In tissues that do not express HER2, such as the liver, the antibodies of the present invention are not expected to trigger a cytotoxic immune response because they cannot activate 4-1BB signaling. In contrast, in tumor tissue expressing and / or available for HER2, the antibodies of the present invention can initiate an effective immune response against tumor cells. Thus, unlike the anti-4-1BB antibodies currently being developed clinically with targeted / intrinsic toxicity, the antibodies disclosed herein can be effective and safe while treating cancer.

[0053] 4-1BB is a classic agonism-type immune checkpoint target, and the development of monoclonal antibodies targeting it has encountered challenges associated with efficacy and adverse events such as liver toxicity. In ongoing research and development efforts, toxicity remains a critical consideration in the strategic positioning of 4-1BB as a target. The present invention offers several advantages. Firstly, the combination of an anti-4-1BB and Herceptin bispecific antibody enables efficient targeting of Herceptin to the tumor microenvironment, characterized by high HER2 expression. Consequently, the bispecific antibody can accumulate in the tumor microenvironment, promoting a higher local concentration. Secondly, 4-1BB activation within the tumor microenvironment can stimulate immune cells to eliminate tumor cells and enhance response rates. Thirdly, due to the targeted nature of Herceptin, the anti-HER2 / 4-1BB bispecific antibody can reduce systemic toxicity by minimizing the concentration of HER2 / 4-1BB in the peripheral blood compared to monoclonal antibodies. In summary, the combination of an anti-4-1BB single-domain antibody and Herceptin (Fab) holds the potential to enhance the response rate achieved by Herceptin alone, leveraging the advantages of 4-1BB as an "immune accelerator" while mitigating the systemic toxicity associated with 4-1BB targeting.

[0054] 4-1BB signaling activation is the expected mechanism for agonist antibodies, such as Urelumab (BMS‐663513) . However, the anti-4-1BB portion of the antibodies of the present invention does not require this independent activating activity. Indeed, it is preferable that the anti-4-1BB moiety of this antibody does not independently activate 4-1BB in the absence of HER2 binding. Interestingly, when the anti-HER2 arm binds to the HER2 protein on the cell surface, this HER2 binding can trigger 4-1BB signaling activation that mediates the HER2-dependent activation of BM231 dual antibody. In particular, the antibodies of the present invention also do not feature FcγRⅡB-dependent activation of 4-1BB signaling, whereas Utomilumab (PF-05082566) and Urelumab (BMS-663513) can activate 4-1BB downstream signaling in an FcγRⅡB-dependent manner.

[0055] These and other aspects and advantageous of the present disclosure will be apparent from the detailed description of the invention that follows.Brief Description of the Drawings

[0056] Figure 1 displays the ELISA results of BM157 binding with antigens.

[0057] Figure 2 illustrates the molecular form of the anti-HER2 / 4-1BB bispecific antibody (BM231) in the present invention.

[0058] Figure 3 displays the ELISA results of BM231 binding with antigens.

[0059] Figure 4 demonstrates the cell-based binding of 4-1BB or HER2 with BM231.

[0060] Figure 5 presents the binding results of the dual antigen capture ELISA.

[0061] Figure 6 showcases the HER2-dependent 4-1BB signaling activation by BM231.

[0062] Figure 7 depicts the BM231-induced cytokine production by PBMC in the presence of HER2-expressing cells.

[0063] Figure 8 illustrates the promotion of CD8 T cell granzyme B expression by BM231.

[0064] Figure 9 showcases the antigen recognition epitope study of BM231.

[0065] Figure 10 demonstrates the in vivo efficacy of BM231 in the hu4-1BB-KI mouse model.

[0066] Figure 11 shows the promotion of lymphocyte amplification or infiltration in the tumor microenvironment by BM231-60.

[0067] Figure 12 displays the significant alteration of gene expression profile with BM231-60 treatment.

[0068] Figure 13 presents the histopathological analysis of mouse liver tissue by H&E staining.

[0069] Figure 14 exhibits the dose gradient efficacy experiment of BM231-60 in vivo.

[0070] Figure 15 shows the 4-1BB signaling activation by BM231 without FcγRⅡB dependence.

[0071] Figure 16 demonstrates the systemic activation study of BM231-60 in mice.

[0072] Figure 17 showcases the liver toxicity study of BM231-60 in mice.

[0073] Figure 18 illustrates the diagram of bispecific antibodies BM331-01 to BM331-06 according to some embodiments of the present disclosure.

[0074] Figure 19 shows the PD-L1 binding affinity of BM331-01～06.

[0075] Figure 20 shows the binding of BM331 to soluble human 4-1BB as measured by BLI.

[0076] Figure 21 shows the binding affinity of BM331-01 / 02 to hPD-L1 or h4-1BB overexpression cells by FACS.

[0077] Figure 22 shows BM331 bispecific antibodies activate 4-1BB signaling in a PD-L1-dependent manner.

[0078] Figure 23 shows control antibodies IgG1, BM110-96 (Imfinzi) , or BM110-98 (Tecentriq) did not induce detectable fluorescence in the presence of either MC38 cells or MC38-PD-L1-C7 cells.

[0079] Figure 24 shows the in vivo effects on tumor volume of each group for BM331 bispecific antibodies.

[0080] Figure 25 shows the safety profiles for BM331 bispecific antibodies as compared to Urelumab.Detailed Description of the Invention

[0081] Definition

[0082] Unless stated otherwise, the following terms and phrases as used herein are intended to have the following meanings.

[0083] As used herein, the term “complete IgG antibody” generally refers to a tetramer comprising at least two heavy (H) chains and two light (L) chains inter-connected by disulfide bonds. Each heavy chain (HC) is comprised of a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region is comprised of three domains, CH1, CH2 and CH3. Each light chain (LC) is comprised of a light chain variable region (abbreviated herein as VL) and a light chain constant region. The light chain constant region is comprised of one domain, CL. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, termed complementarity determining regions (CDR) , interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FR) . Each VH and VL is composed of three CDRs and four FRs arranged from amino-terminus to carboxy -terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, and FR4. The variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with an antigen. The constant regions of the antibodies may mediate the binding of the immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (e.g., effector cells) and the first component (Clq) of the classical complement system.

[0084] The term “complete IgG antibody” includes, but is not limited to, monoclonal antibodies, human antibodies, humanized antibodies, and chimeric antibodies. The antibodies can be of any isotype / class (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA and IgY) or subclass (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) .

[0085] A “heavy chain antibody” is devoid of a light chain and in the case of the heavy chain antibodies in camelids the CH1 domain is also missing. Consequently, a camelid heavy chain antibody associates with its cognate antigen via a single domain, the variable heavy chain domain of a heavy chain antibody or VHH. The terms VHH, VH, nanobody or single domain antibody are used interchangeably herein. Therefore, an anti-4-1BB VH is an anti-4-1BB VHH, or an anti-4-1BB nanobody, or an anti-4-1BB single domain antibody. VHH antibodies are the isolated VHH domains of heavy-chain only antibodies produced by camelid species, such as alpaca, llama, and camel. These proteins consist of framework regions and three highly variable loops: CDR1, CDR2 and CDR3. Research has shown that it is the CDR3 loop that enables VHH antibodies to have such a wide range of bind specificities; the CDR3 loop tends to be 3-4 residues longer than that of conventional antibodies, allowing them to use these protrusions to extend into “hidden” epitope cavities; the CDR3 loop also has more variation in amino acid sequences in VHH antibodies than conventional antibodies, leading to ～7%higher sequence diversity per residue.

[0086] The term “Fc portion” refers to a polypeptide comprising a C-terminal part of an immunoglobulin H chain and retaining at least one functionality of a Fc-region of an IgG region, in particular the function of binding to FcRn. The antibody effector functions are determined by sequences in the Fc region. A Fc portion can comprise a CH2 domain, a CH3 domain or a CH2-CH3 polypeptide chain. The CH2-CH3 polypeptide chain assembles with another CH2-CH3 polypeptide chain to a dimer of two CH2-CH3 polypeptides combined with one another, wherein the dimerization is promoted by covalent linkage in the Hinge region NC-terminal to the CH2 domain. Hence, in some embodiments the Fc portion comprises a dimer of two CH2-CH3 polypeptide chains and a Hinge region. Preferably, the Fc portion comprises constant domains of the Ig class, e.g., IgA, IgD, IgE, IgM, preferably IgG1, IgG2, IgG2, IgG4, in particular IgG1 constant domains. An example of an Fc region has the amino acid sequence as depicted in SEQ ID NO: 63. One or more amino acid substitutions may be introduced into a Fc region, such as S228P.

[0087] The “hinge” domain may be of the same or different IgG class as the Fc portion or an engineered, not naturally occurring Hinge domain. An example of an IgG Hinge region has the amino acid sequence as depicted in SEQ ID NO: 64. Included are also variants of wild-type Hinge regions, such as shortened Hinge regions.

[0088] “Linker” refers to a sequence of amino acids comprising a linker peptide joining two juxtaposed variable domains forming an antigen-binding moiety with the C-terminus of one domain linked to the N-terminus of the other juxtaposed domain or vice versa. Regarding the amino acid composition, a peptide linker sequence is selected that does not interfere with the formation of Fv, i.e. VH / VL, antigen binding-and recognition sites as well as does not interfere with the multimerization, e.g., dimerization of the polypeptides of a multispecific antigen-binding protein. For example, a linker comprising glycine and serine residues generally provides protease resistance. In some embodiments (G2S) X peptide linkers are used, wherein, for example, x = 1-20, e.g., (G2S) , (G2S) 2, (G2S) 3, (G2S) 4, (G2S) 5, (G2S) 6, (G2S) 7 or (G2S) 8 , or (G3S) X peptide linkers are used, wherein, for example, x=1-15 or (G4S) X peptide linkers are used, wherein, for example, x=1-10, preferably 1-6. The amino acid sequence of the linker can be optimized, for example, by phage-display methods to improve the formation of the antigen binding site and production yield of the polypeptide.

[0089] The term “target” or “target antigen” refers to an antigen which is expressed by or associated with a type of cell, i.e., target cell, or virus-infected cell to which the NK cells should be directed to induce or trigger the NK cell cytotoxicity. Examples of a target antigen may be tumor specific antigen (TSA) or tumor associated antigen (TAA) . The TSA or TAA may be expressed on the surface of the target cell or displayed by an MHC complex as an MHC-restricted peptide. Examples of tumor antigens include but are not limited to HER2, 5T4, PSMA, BCMA, FGFR, CD20, CD33, CD19, CD22, CD123, CD30, GPC-3, CEA, EGFR1, EGFR2, EGFR3, TGF-β, ROR1, PD-L1, Claudin18.2, EpCAM, GD2, MSLN, EGFR, MUC1, MUC2, EGFRVIII, CD38, Trop-2, c-MET, Nectin-4, CD79b, CCK4, GPA33, HLA-A2, CLEC12A, p-cadherin, TDO2, MART-1, Pmel 17, MAGE-1, AFP, CA125, TRP-1, TRP-2, NY-ESO, PSA, CDK4, BCA225, CA 125, MG7-Ag, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, TAAL6 and TAG72.

[0090] The term “binding domain” characterizes in connection with the present invention a domain which (specifically) binds to  / interacts with  / recognizes a given target epitope or a given target side on the target molecules (antigens) , e.g., 4-1BB and a target cell surface antigen, respectively. The structure and function of the first binding domain (recognizing e.g., 4-1BB) , and preferably also the structure and / or function of the second binding domain (recognizing the target cell surface antigen) , is / are based on the structure and / or function of an antibody, e.g., of a full-length or whole immunoglobulin molecule and / or is / are drawn from the variable heavy chain (VH) and / or variable light chain (VL) domains of an antibody or fragment thereof. Preferably the first binding domain is characterized by the presence of three light chain CDRs (i.e., CDR1, CDR2 and CDR3 of the VL region) and / or three heavy chain CDRs (i.e. CDR1, CDR2 and CDR3 of the VH region) . The second binding domain preferably also comprises the minimum structural requirements of an antibody which allow for the target binding.

[0091] The term “ (specifically) binds to” , “ (specifically) recognizes, ” “is (specifically) directed to, ” or “ (specifically) reacts with” means in accordance with this invention that a binding domain interacts or specifically interacts with a given epitope or a given target side on the target molecules (antigens) , e.g. 4-1BB, and the target cell surface antigen, e.g., HER2, respectively.

[0092] The term “does not essentially  / substantially bind” or “is not capable of binding” means that a binding domain of the present invention does not bind a protein or antigen other than 4-1BB, and  / or the target cell surface antigen, i.e., does not show reactivity of more than about 30%, preferably not more than about 20%, more preferably not more than about 10%, particularly preferably not more than about 9%, about 8%, about 7%, about 6%or about 5%with proteins or antigens other than 4-1BB, and / or the target cell surface antigen, whereby binding to 4-1BB, and / or the target cell surface antigen, respectively, is set to be about 100%.

[0093] As used herein, the term “complementarity determining domains” is used herein interchangeably with the term “complementary determining regions” ( “CDRs” ) , and generally refers to the hypervariable regions of VL and VH. The CDRs are the target protein-binding site of the antibody chains that harbors specificity for such target protein. There are three CDRs (CDR1-3, numbered sequentially from the N-terminus) in each human VL or VH, constituting about 15-20%of the variable domains. CDRs can be referred to by their region and order. For example, “VH CDR1” or “HCDR1” both refer to the first CDR of the heavy chain variable region. The CDRs are structurally complementary to the epitope of the target protein and are thus directly responsible for the binding specificity. The remaining stretches of the VL or VH, the so-called framework regions, exhibit less variation in amino acid sequence (Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W. H. Freeman &Co., New York, 2000) . In the art, the CDR of the antibody can be defined by various methods / schemes, such as a Kabat definition scheme based on sequence variability (see Kabat et al., protein sequence in immunology, 5th edition, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991) ) , a Chothia definition scheme based on the position of a structural loop region (see A1-Lazikani et al., Jmol Biol 273: 927-48, 1997) and a IMGT definition scheme based on the concept of IMGT-ONTOLOGY and IMGT Scientific chart rules. In certain embodiments, the present application uses the IMGT rules to define the CDRs of an antibody. The definition rules of Martin, PyIgClassify and Combined definition rules of Kabat, Chothia, IMGT, Martin and PyIgClassify are also included in this application (see Mark L. Chiu et al., Antibodies 8 (4) , 55, 2019) .

[0094] Table A. Comparation of CDR numbering among different definition schemes (in Chothia numbering)

[0095] wherein, Laa-Lbb or Haa-Hbb may refer to, from N-terminal, the amino acids sequence from NO. aa to NO. bb of light chain or heavy chain respectively. For example, L24-L34 refers to the amino acid sequence from NO. 24 to NO. 34 of light chain.

[0096] Both the light and heavy chains are divided into regions of structural and functional homology. The terms “constant” and “variable” are used functionally. In this regard, it will be appreciated that the variable domains of both the light (VL) and heavy (VH) chain portions determine antigen recognition and specificity. Conversely, the constant domains of the light chain (CL) and the heavy chain (CH1, CH2 or CH3) confer important biological properties such as secretion, transplacental mobility, Fc receptor binding, complement binding, and the like. By convention, the numbering of the constant region domains increases as they become more distal from the antigen binding site or amino terminus of the antibody. The N-terminus is a variable region and at the C-terminus is a constant region; the CH3 and CL domains actually comprise the carboxy-terminal domains of the heavy and light chain, respectively.

[0097] As used herein, the term “humanized antibody” generally refers to an antibody which includes sequences of heavy chain variable regions and light chain variable regions derived from non-human species (e.g., mice) , but in which at least a portion of the VH and / or VL sequences have been changed to be similar to the human germline variable sequences. For example, the term “humanized antibody” is an antibody or a variant, derivative, analogue or fragment thereof that can bind to a related antigen with immune specificity and includes a framework region (FR) which includes substantially an amino acid sequence of a human antibody and a complementary determining region (CDR) which includes substantially an amino acid sequence of a non-human antibody. In the context of CDR, the term “substantially” means that the amino acid sequence of CDR has at least 80%, e.g., at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%or at least 99%identity with an amino acid sequence of CDR of a non-human antibody. The humanized antibodies include substantially at least one, typically two variable domains (Fab, Fab’ , F (ab’ ) 2, Fab, Fv) , wherein all or substantially all CDR regions correspond to the CDR region of a non-human immunoglobulin and all or substantially all framework regions are frame regions with consensus sequence of human immunoglobulin. In some embodiments, the humanized antibody can further include at least a portion of a constant region of immunoglobulin (Fc) , typically a constant region of human immunoglobulin.

[0098] As used herein, the term “human antibody” generally refers to an antibody with variable and constant regions derived from the sequence of immunoglobulin of human germ line. Human antibodies are well known in the prior art (e.g., van Dijk, M. A. and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374) . The human antibodies can also be generated in transgenic animals (e.g., mice) which can generate a complete or selected set of human antibodies in absence of generated endogenous immunoglobulin after immunization (e.g., Jakobovits, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A. et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M. et al., YearImmunol. 7 (1993) 33-40) . The human antibodies can also be generated in a phage display library (e.g., Hoogenboom, H. R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597) . The term “human antibody” can also include antibodies modified in the constant regions.

[0099] As used herein, the term “chimeric antibody” generally refers to an engineered antibody which in its broadest sense contains one or more regions from one antibody and one or more regions from one or more other antibody (ies) . In particular a chimeric antibody comprises a VH domain and a VL domain of an antibody derived from a non-human animal, in association with a CH domain and a CL domain of another antibody, in particular a human antibody. As the non-human animal, any animal such as camel, mouse, rat, hamster, rabbit or the like can be used.

[0100] The term “bispecific antibody” as used herein refers to an antibody having tw specificities to one or more antigens or to different epitopes of the same antigen. For example, a bispecific antibody may comprise a first specificity to a first antigen (e.g., 4-1BB) and a second specificity to a second antigen (e.g., a tumor associated antigen or tumor specific antigen) different from the first antigen. For example, a bispecific antibody may comprise a first specificity to a first epitope of an antigen and a second specificity to a second different epitope of the same antigen (e.g., 4-1BB) .

[0101] By “purified” and “isolated” it is meant, when referring to a polypeptide or a nucleotide sequence, that the indicated molecule is present in the substantial absence of other biological macromolecules of the same type. The term “purified” as used herein in particular means at least 75%, 85%, 95%or 98%by weight, of biological macromolecules of the same type are present. An “isolated” nucleic acid molecule that encodes a particular polypeptide refers to a nucleic acid molecule that is substantially free of other nucleic acid molecules that do not encode the subject polypeptide; however, theytoxane may include some additional bases or moieties, which do not deleteriously affect the basic characteristics of the composition. The present invention may contain, for example, an isolated antigen-binding protein, an isolated antibody or an antigen-binding fragment thereof, an isolated polypeptide, an isolated nucleic acid molecule or molecules.

[0102] As used herein, the term “affinity” is generally defined by the equilibrium association between the whole antibody and the antigen. Affinity may be expressed for example in half-maximal effective concentration (EC50) or the equilibrium dissociation constant (KD) . Affinity can be experimentally assessed by a variety of known methods, such as measuring association and dissociation rates with surface Plasmon resonance or measuring the EC50 in an immunochemical assay (ELISA, FACS) .

[0103] The term “conservatively modified variant” applies to both amino acid and nucleic acid sequences. With respect to particular nucleic acid sequences, conservatively modified variant refers to those nucleic acids which encode identical or essentially identical amino acid sequences or where the nucleic acid does not encode an amino acid sequence, to essentially identical sequences. Because of the degeneracy of the genetic code, a large number of functionally identical nucleic acids encode any given protein. For instance, the codons GCA, GCC, GCG and GCU all encode the amino acid alanine. Thus, at every position where an alanine is specified by a codon, the codon can be altered to any of the corresponding codons described without altering the encoded polypeptide. Such nucleic acid variations are “silent variations, ” which are one species of conservatively modified variations. Every nucleic acid sequence herein which encodes a polypeptide also describes every possible silent variation of the nucleic acid. One of skill will recognize that each codon in a nucleic acid (except AUG, which is ordinarily the only codon for methionine, and TGG, which is ordinarily the only codon for tryptophan) can be modified to yield a functionally identical molecule. Accordingly, each silent variation of a nucleic acid that encodes a polypeptide is implicit in each described sequence.

[0104] For polypeptide sequences, “conservatively modified variants” include individual substitutions, deletions or additions to a polypeptide sequence which result in the substitution of an amino acid with a chemically similar amino acid. Conservative substitution tables providing functionally similar amino acids are well known in the art. Such conservatively modified variants are in addition to and do not exclude polymorphic variants, interspecies homologs, and alleles. The following eight groups contain amino acids that are conservative substitutions for one another: 1) Alanine (A) , Glycine (G) ; 2) Aspartic acid (D) , Glutamic acid I; 3) Asparagine (N) , Glutamine (Q) ; 4) Arginine I, Lysine (K) ; 5) Isoleucine (I) , Leucine (L) , Methionine (M) , Valine (V) ; 6) Phenylalanine (F) , Tyrosine (Y) , Tryptophan (W) ; 7) Serine (S) , Threonine (T) ; and 8) Cysteine (C) , Methionine (M) (see, e.g., Creighton, Proteins (1984) ) . In some aspects, the term “conservative sequence modifications” are used to refer to amino acid modifications that do not significantly affect or alter the binding characteristics of the antibody containing the amino acid sequence.

[0105] As used herein, the term “percent identical” or “percent identity, ” in the context of two or more nucleic acids or polypeptide sequences, refers to the extent to which two or more sequences or subsequences that are the same. Two sequences are “identical” if they have the same sequence of amino acids or nucleotides over the region being compared. Two sequences are “substantially identical” if two sequences have a specified percentage of amino acid residues or nucleotides that are the same (i.e., 60%identity, optionally 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%or 99%identity over a specified region or, when not specified, over the entire sequence) , when compared and aligned for maximum correspondence over a comparison window or designated region as measured using one of the following sequence comparison algorithms or by manual alignment and visual inspection. Optionally, the identity exists over a region that is at least about 30 nucleotides (or 10 amino acids) in length or more preferably over a region that is 100 to 500 or 1000 or more nucleotides (or 20, 50, 200 or more amino acids) in length. Two examples of algorithms that are suitable for determining percent sequence identity and sequence similarity are the BLAST and BLAST 2.0 algorithms, which are described in Altschul et al, Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, 1977; and Altschul et al , J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990, respectively.

[0106] Other than percentage of sequence identity noted above, another indication that two nucleic acid sequences or polypeptides are substantially identical is that the polypeptide encoded by the first nucleic acid is immunologically cross reactive with the antibodies raised against the polypeptide encoded by the second nucleic acid. Thus, a polypeptide is typically substantially identical to a second polypeptide, for example, where the two peptides differ only by conservative substitutions. Another indication that two nucleic acid sequences are substantially identical is that the two molecules or their complements hybridize to each other under stringent conditions. Yet another indication that two nucleic acid sequences are substantially identical is that the same primers can be used to amplify the sequence.

[0107] As used herein, the term “nucleic acid molecule” is used herein interchangeably with the term “polynucleotide” and generally refers to deoxyribonucleotides or ribonucleotides and polymers thereof in either single-or double-stranded form. The term encompasses nucleic acids containing known nucleotide analogs or modified backbone residues or linkages, which are synthetic, naturally occurring, and non-naturally occurring, which have similar binding properties as the reference nucleic acid, and which are metabolized in a manner similar to the reference nucleotides. Examples of such analogs include, without limitation, phosphorothioates, phosphoramidates, methyl phosphonates, chiral-methyl phosphonates, 2-O-methyl ribonucleotides, peptide-nucleic acids (PNAs) .

[0108] As used herein, the term “polypeptide” is used herein interchangeably with the term “protein” and refers to a polymer of amino acid residues. The terms apply to amino acid polymers in which one or more amino acid residue is an artificial chemical mimetic of a corresponding naturally occurring amino acid, as well as to naturally occurring amino acid polymers and non-naturally occurring amino acid polymer. Unless otherwise indicated, a particular polypeptide sequence also implicitly encompasses conservatively modified variants thereof.

[0109] As used herein, the term “immunoconjugate” as used herein generally refers to the linkage of an antibody or an antigen binding fragment thereof with another agent, such as a payload, a drug moiety, a chemotherapeutic agent, a toxin, an immunotherapeutic agent, an imaging probe, and the like. The linkage can be a covalent bond or non-covalent interactions such as through electrostatic forces. Various linkers, known in the art, can be employed in order to form the immunoconjugate. Additionally, the immunoconjugate can be provided in the form of a fusion protein that may be expressed from a polynucleotide encoding the immunoconjugate. As used herein, “fusion protein” refers to a protein created through the joining of two or more genes or gene fragments which originally coded for separate proteins (including peptides and polypeptides) . Translation of the fusion gene results in a single protein with functional properties derived from each of the original proteins.

[0110] As used herein, the term “toxin, ” “cytotoxin” or “cytotoxic agent” as used herein, generally refers to any agent that is detrimental to the growth and proliferation of cells and may act to reduce, inhibit or destroy a cell or malignancy.

[0111] As used herein, “cancer” or “tumor” as used interchangeably herein is meant to a group of diseases which can be treated according to the disclosure and involve abnormal cell growth with the potential to invade or spread to other parts of the body. Not all tumors are cancerous; benign tumors do not spread to other parts of the body. Possible signs and symptoms include: a new lump, abnormal bleeding, a prolonged cough, unexplained weight loss, and a change in bowel movements among others. There are over 100 different known cancers that affect humans. As used herein, “cancer” includes, without limitation, a solid cancer (e.g., a tumor) and a hematologic malignancy. A “hematologic malignancy” , also known as a blood cancer, is a cancer that originates in blood-forming tissue, such as the bone marrow or other cells of the immune system. Hematologic malignancies include, without limitation, leukemias (such as acute myeloid leukemia (ANIL) , acute promyelocytic leukemia, acute lymphoblastic leukemia (ALL) , acute mixed lineage leukemia, chronic myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , hairy, cell leukemia and large granular lymphocytic leukemia) , myelodysplastic syndrome (MDS) , myeloproliferative disorders (polycythemia vera, essential thrombocytosis, primary myelofibrosis and chronic myeloid leukemia) , lymphomas, multiple myeloma, MGUS and similar disorders, Hodgkin’s lymphoma, non-Hodgkin lymphoma (NHL) , primary mediastinal large B-cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma, transformed follicular lymphoma, splenic marginal zone lymphoma, lymphocytic lymphoma, T-cell lymphoma, and other B-cell malignancies. “Solid cancers” include, without limitation, fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteogenic sarcoma, chordoma, angiosarcoma, endotheliosarcoma, lymphangiosarcoma, lymphangioendotheliosarcoma, synovioma, mesothelioma, Ewing’s tumor, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, colon cancer, colorectal cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, bone cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, esophogeal cancer, stomach cancer, oral cancer, nasal cancer, throat cancer, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, sebaceous gland carcinoma, papillary carcinoma, papillary adenocarcinomas, cystadenocarcinoma, medullary carcinoma, bronchogenic carcinoma, renal cell carcinoma, hepatoma, bile duct carcinoma, choriocarcinoma, seminoma, embryonal carcinoma, Wilms’ tumor, cervical cancer, uterine cancer, testicular cancer, small cell lung carcinoma, bladder carcinoma, lung cancer, epithelial carcinoma, glioma, glioblastoma multiforme, astrocytoma, medulloblastoma, craniopharyngioma, ependymoma, pinealoma, hemangioblastoma, acoustic neuroma, oligodendroglioma, meningioma, skin cancer, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma.

[0112] As used herein, the term “anti-tumor agent” or “antitumor drug” as used herein generally refers to any agent that can be used to treat a cell proliferative disorder such as cancer, including but not limited to, cytotoxic agents, chemotherapeutic agents, radiotherapy and radiotherapeutic agents, targeted anti-cancer agents, and immunotherapeutic agents.

[0113] As used herein, the term “anti-tumor activity” means a reduction in the rate of tumor cell proliferation, viability or metastatic activity. A possible way of showing anti-tumor activity is to show a decline in growth rate of tumor cells, tumor size stasis or tumor size reduction. Such activity can be assessed using accepted in vitro or in vivo tumor models, including but not limited to xenograft models, allograft models, MMTV models, and other known models known in the art to investigate anti-tumor activity.

[0114] As used herein, the term “subject” includes human and non-human animals. Non-human animals include all vertebrates, e.g., mammals and non-mammals, such as non-human primates, sheep, dog, cow, chickens, amphibians, and reptiles. Except when noted, the terms “patient” or “subject” are used herein interchangeably.

[0115] As used herein, the term “pharmaceutically acceptable” generally refers to one or more non-toxic substances that do not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active ingredient. Such formulations may typically contain salts, buffers, preservatives, compatible carriers, and optionally other therapeutic agents. Such pharmaceutically acceptable formulations may also typically contain compatible solid or liquid fillers, diluents, or encapsulating materials suitable for administration to humans. When used in medicine, the salt should be a pharmaceutically acceptable salt, but non-pharmaceutically acceptable salts can be conveniently used to prepare pharmaceutically acceptable salts and cannot be excluded from the scope of the present invention. Such pharmacologically and pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, salts prepared from the following acids: hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, maleic acid, acetic acid, salicylic acid, citric acid, boric acid, formic acid, malonic acid, succinic acid, etc. Pharmacologically acceptable salts can also be prepared as alkali metal salts or alkaline earth metal salts, such as sodium, potassium or calcium salts. The term “solvate” is used herein in the conventional sense to refer to a complex of a solute (e.g., an active compound, a salt of an active compound) and a solvent. Solvates usually do not significantly alter the physiological activity or toxicity of the compound and therefore can act as pharmacological equivalents. If the solvent is water, the solvent compound may be conveniently referred to as a hydrate, e.g., monohydrate, dihydrate, trihydrate, etc.

[0116] As used herein, the terms “treat, ” “treating, ” or “treatment” of any disease or disorder generally refer in one aspect, to ameliorating the disease or disorder (i.e., slowing or arresting or reducing the development of the disease or at least one of the clinical symptoms thereof) . In another aspect, “treat, ” “treating, ” or “treatment” refers to alleviating or ameliorating at least one physical parameter including those which may not be discernible by the patient. In yet another aspect, “treat, ” “treating, ” or “treatment” refers to modulating the disease or disorder, either physically, (e.g., stabilization of a discernible symptom) , physiologically, (e.g., stabilization of a physical parameter) or both. In yet another aspect, “treat, ” “treating, ” or “treatment” refers to preventing or delaying the onset or development or progression of the disease or disorder.

[0117] As used herein, the term “therapeutically acceptable amount” or “therapeutically effective dose” interchangeably refers to an amount sufficient to effect the desired result (i.e., a reduction in tumor size, inhibition of tumor growth, prevention of metastasis, inhibition or prevention of viral, bacterial, fungal or parasitic infection) . In some embodiments, a therapeutically acceptable amount does not induce or cause undesirable side effects. A therapeutically acceptable amount can be determined by first administering a low dose, and then incrementally increasing that dose until the desired effect is achieved. A “prophylactically effective dosage, ” and a “therapeutically effective dosage, ” of the molecules of the present disclosure can prevent the onset of or result in a decrease in severity of, respectively, disease symptoms, including symptoms associated with cancer.

[0118] As used herein, the terms “comprising” , “containing” , “having” , “include” , and “including” are to be construed as “including, but not limited to” unless otherwise noted. The terms “a, ” “an, ” and “the” and similar referents in the context of describing the invention and, specifically, in the context of the appended claims, are to be construed to cover both the singular and the plural unless otherwise noted. The use of any and all examples or exemplary language ( “for example” , “e.g. ” , “such as” ) is intended merely to illustrate aspects or embodiments of the invention, and is not to be construed as limiting the scope thereof, unless otherwise claimed.

[0119] As used herein, the term “about” when referring to a measurable value such as an amount, a temporal duration, and the like, is meant to encompass variations of ±20%or in some instances ±10%or in some instances ±5%or in some instances ±1%or in some instances ±0.1%from the specified value, as such variations are appropriate to perform the disclosed methods.

[0120] The term “vector” includes shuttle and expression vectors. Typically, a vector could be a plasmid construct that also include an origin of replication (e.g., the Col E1 origin of replication) and a selectable marker (e.g., ampicillin or tetracycline resistance) , for replication and selection, respectively, of the plasmids in bacteria. An “expression vector” refers to a vector that contains the necessary control sequences or regulatory elements for expression of the antibodies including antibody fragment of the present disclosure, in bacterial or eukaryotic cells.

[0121] Anti-4-1BB Single Domain Antibodies

[0122] In one aspect, the present disclosure provides single domain antibodies specifically binding to 4-1BB (also referred to as BM157 collectively herein) .

[0123] The present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 that are same with respective CDR1, CDR2, and CDR3 of an anti-4-1BB single domain antibody having an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO. 1 to 13.

[0124] In some embodiments, the CDR1, CDR2, and CDR3 are defined according to a CDR definition scheme selected from a group consisting of IMGT, Kabat, Contact, Chothia, Martin, PyIgClassify, and any combination thereof. In preferable embodiments, the CDR1, CDR2, and CDR3 are defined according to IMGT, Kabat, Contact, or Chothia definition scheme. In preferable embodiments, the CDR1, CDR2, and CDR3 are defined according to IMGT definition scheme.

[0125] In some embodiments, the CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme have amino acid sequences as shown in

[0126] (a) SEQ ID NO: 35, 36, and 37, respectively;

[0127] (b) SEQ ID NO: 38, 39, and 40, respectively;

[0128] (c) SEQ ID NO: 41, 42, and 43, respectively;

[0129] (d) SEQ ID NO: 44, 42, and 45, respectively;

[0130] (e) SEQ ID NO: 46, 42, and 45, respectively;

[0131] (f) SEQ ID NO: 47, 48, and 49, respectively;

[0132] (g) SEQ ID NO: 41, 50, and 51, respectively;

[0133] (h) SEQ ID NO: 52, 42, and 53, respectively;

[0134] (i) SEQ ID NO: 54, 55, and 56, respectively;

[0135] (j) SEQ ID NO: 57, 48, and 58, respectively;

[0136] (k) SEQ ID NO: 59, 48, and 60, respectively; or

[0137] (l) SEQ ID NO: 61, 48, and 62, respectively.

[0138] Therefore, in one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme having amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 35, 36, and 37, respectively.

[0139] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme having amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 38, 39, and 40, respectively.

[0140] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme having amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 41, 42, and 43, respectively.

[0141] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme having amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 44, 42, and 45, respectively.

[0142] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme having amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 46, 42, and 45, respectively.

[0143] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme having amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 47, 48, and 49, respectively.

[0144] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme having amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 41, 50, and 51, respectively.

[0145] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme having amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 52, 42, and 53, respectively.

[0146] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme having amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 54, 55, and 56, respectively.

[0147] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme having amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 57, 48, and 58, respectively.

[0148] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme having amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 59, 48, and 60, respectively.

[0149] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme having amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 61, 48, and 62, respectively.

[0150] In preferable embodiments, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 1 to 13, and an amino acid sequence having at least 80%identity to each thereof.

[0151] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 1 or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identity to SEQ ID NO. 1.

[0152] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 2 or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identity to SEQ ID NO. 2.

[0153] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 3 or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identity to SEQ ID NO. 3.

[0154] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 4 or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identity to SEQ ID NO. 4.

[0155] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 5 or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identity to SEQ ID NO. 5.

[0156] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 6 or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identity to SEQ ID NO. 6.

[0157] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 7 or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identity to SEQ ID NO. 7.

[0158] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 8 or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identity to SEQ ID NO. 8.

[0159] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 9 or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identity to SEQ ID NO. 9.

[0160] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 10 or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identity to SEQ ID NO. 10.

[0161] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 11 or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identity to SEQ ID NO. 11.

[0162] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 12 or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identity to SEQ ID NO. 12.

[0163] In one embodiment, the present disclosure provides a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 13 or an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identity to SEQ ID NO. 13.

[0164] In any of the embodiments of anti-4-1BB single domain antibody disclosed herein, the single domain antibody may be a humanized antibody, a human antibody, a chimeric antibody, or a camelized antibody. Preferably, the single domain antibody is a humanized antibody or a human antibody. More preferably, the single domain antibody is a humanized antibody.

[0165] In some embodiments, provided is a polypeptide comprising an anti-4-1BB single domain antibody as described herein and one or more amino acid residues covalently linked to the N terminus, C terminus or anywhere therebetween of the anti-4-1BB single domain antibody, and preferably the anti-4-1BB single domain antibody comprises an amino acid sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 1 to 13.

[0166] Anti-4-1BB Heavy Chain Antibodies

[0167] Another aspect of the disclosure provides a heavy chain antibody comprising a single domain antibody as disclosed herein, and an Fc portion linked to the single domain antibody.

[0168] In some embodiments, an anti-4-1BB heavy chain antibody is provided wherein the heavy chain antibody comprises a single domain antibody comprising CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme haING amino acid sequences as shown in

[0169] (a) SEQ ID NO: 35, 36, and 37, respectively;

[0170] (b) SEQ ID NO: 38, 39, and 40, respectively;

[0171] (c) SEQ ID NO: 41, 42, and 43, respectively;

[0172] (d) SEQ ID NO: 44, 42, and 45, respectively;

[0173] (e) SEQ ID NO: 46, 42, and 45, respectively;

[0174] (f) SEQ ID NO: 47, 48, and 49, respectively;

[0175] (g) SEQ ID NO: 41, 50, and 51, respectively;

[0176] (h) SEQ ID NO: 52, 42, and 53, respectively;

[0177] (i) SEQ ID NO: 54, 55, and 56, respectively;

[0178] (j) SEQ ID NO: 57, 48, and 58, respectively;

[0179] (k) SEQ ID NO: 59, 48, and 60, respectively; or

[0180] (l) SEQ ID NO: 61, 48, and 62, respectively.

[0181] In some embodiments, an anti-4-1BB heavy chain antibody is provided wherein the heavy chain antibody comprises an amino acid sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 1 to 13 and an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%identity to each thereof.

[0182] In some embodiments, an anti-4-1BB heavy chain antibody is provided wherein the heavy chain antibody comprises a single domain antibody comprising an amino acid sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 1 to 13, and the single domain antibody is linked to a Fc portion having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 63.

[0183] In any of the embodiments of anti-4-1BB heavy chain antibody disclosed herein, the anti-4-1BB heavy chain antibody may be a humanized antibody, a human antibody, a chimeric antibody, or a camelized antibody. Preferably, the anti-4-1BB heavy chain antibody is a humanized antibody or a human antibody. More preferably, the anti-4-1BB heavy chain antibody is a humanized antibody.

[0184] In some embodiments, provided is a polypeptide comprising an anti-4-1BB heavy chain antibody as described herein and one or more amino acid residues covalently linked to the N terminus, C terminus or anywhere therebetween of the anti-4-1BB heavy chain antibody, and preferably the anti-4-1BB heavy chain antibody comprises an amino acid sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 1 to 13, and a Fc portion having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 63.

[0185] Bispecific Antibodies

[0186] Another aspect of the invention provides a bispecific antibody (e.g., BM231 or BM331) comprising a single domain antibody as disclosed herein.

[0187] In some embodiments, the bispecific antibody comprises the single domain antibody binding specifically to 4-1BB as disclosed herein, and a second binding domain specifically binding to a second target selected from a tumor associated antigen and a tumor specific antigen.

[0188] In some embodiments, the second target is selected from a group consisting of HER2, 5T4, PSMA, BCMA, FGFR, CD20, CD33, CD19, CD22, CD123, CD30, GPC-3, CEA, EGFR1, EGFR2, EGFR3, TGF-β, ROR1, PD-L1, Claudin18.2, EpCAM, GD2, MSLN, EGFR, MUC1, MUC2, EGFRVIII, CD38, Trop-2, c-MET, Nectin-4, CD79b, CCK4, GPA33, HLA-A2, CLEC12A, p-cadherin, TDO2, MART-1, Pmel 17, MAGE-1, AFP, CA125, TRP-1, TRP-2, NY-ESO, PSA, CDK4, BCA225, CA 125, MG7-Ag, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, TAAL6 and TAG72. Preferably, the second target is HER2, 5T4, BCMA, CD20, CD19, CD30, Claudin18.2, MUC1, Trop-2, c-MET, or Nectin-14. More preferably, the second target is HER2. More preferably, the second target is PD-L1.

[0189] In some embodiments, the bispecific antibody comprises a first binding domain specifically binding to 4-1BB, and second binding domain specifically binding to HER2, wherein the first binding domain is a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 that are same with respective CDR1, CDR2, and CDR3 of an anti-4-1BB single domain antibody having an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO. 1 to 13.

[0190] In some embodiments, the bispecific antibody comprises a first binding domain specifically binding to 4-1BB, and second binding domain specifically binding to HER2, wherein the first binding domain is a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises the CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme having amino acid sequences as shown in

[0191] (a) SEQ ID NO: 35, 36, and 37, respectively;

[0192] (b) SEQ ID NO: 38, 39, and 40, respectively;

[0193] (c) SEQ ID NO: 41, 42, and 43, respectively;

[0194] (d) SEQ ID NO: 44, 42, and 45, respectively;

[0195] (e) SEQ ID NO: 46, 42, and 45, respectively;

[0196] (f) SEQ ID NO: 47, 48, and 49, respectively;

[0197] (g) SEQ ID NO: 41, 50, and 51, respectively;

[0198] (h) SEQ ID NO: 52, 42, and 53, respectively;

[0199] (i) SEQ ID NO: 54, 55, and 56, respectively;

[0200] (j) SEQ ID NO: 57, 48, and 58, respectively;

[0201] (k) SEQ ID NO: 59, 48, and 60, respectively; or

[0202] (l) SEQ ID NO: 61, 48, and 62, respectively.

[0203] In some embodiments, the bispecific antibody comprises a first binding domain specifically binding to 4-1BB, and second binding domain specifically binding to HER2, wherein the first binding domain is a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 1 to 13.

[0204] In some embodiments, the bispecific antibody comprises a first binding domain specifically binding to 4-1BB, and second binding domain specifically binding to a second target selected from a tumor associated antigen and a tumor specific antigen, the first binding domain is a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, and the second binding domain is a complete IgG (such as IgG1 or IgG4) antibody or an antigen binding fragment thereof such as Fab, Fv, scFv, or F(ab’ ) 2, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 that are same with respective CDR1, CDR2, and CDR3 of an anti-4-1BB single domain antibody having an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO. 1 to 13; preferably, the CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme have amino acid sequences as shown in

[0205] (a) SEQ ID NO: 35, 36, and 37, respectively;

[0206] (b) SEQ ID NO: 38, 39, and 40, respectively;

[0207] (c) SEQ ID NO: 41, 42, and 43, respectively;

[0208] (d) SEQ ID NO: 44, 42, and 45, respectively;

[0209] (e) SEQ ID NO: 46, 42, and 45, respectively;

[0210] (f) SEQ ID NO: 47, 48, and 49, respectively;

[0211] (g) SEQ ID NO: 41, 50, and 51, respectively;

[0212] (h) SEQ ID NO: 52, 42, and 53, respectively;

[0213] (i) SEQ ID NO: 54, 55, and 56, respectively;

[0214] (j) SEQ ID NO: 57, 48, and 58, respectively;

[0215] (k) SEQ ID NO: 59, 48, and 60, respectively; or

[0216] (l) SEQ ID NO: 61, 48, and 62, respectively.

[0217] In some embodiments, the bispecific antibody comprises a first binding domain specifically binding to 4-1BB, and second binding domain specifically binding to a second target selected from a tumor associated antigen and a tumor specific antigen, the first binding domain is a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, the second binding domain is a complete IgG antibody, and the single domain antibody is linked to the C terminus of a heavy chain of the complete IgG (such as IgG1 or IgG4) antibody; wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 that are same with respective CDR1, CDR2, and CDR3 of an anti-4-1BB single domain antibody having an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO. 1 to 13; preferably, the CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme have amino acid sequences as shown in

[0218] (a) SEQ ID NO: 35, 36, and 37, respectively;

[0219] (b) SEQ ID NO: 38, 39, and 40, respectively;

[0220] (c) SEQ ID NO: 41, 42, and 43, respectively;

[0221] (d) SEQ ID NO: 44, 42, and 45, respectively;

[0222] (e) SEQ ID NO: 46, 42, and 45, respectively;

[0223] (f) SEQ ID NO: 47, 48, and 49, respectively;

[0224] (g) SEQ ID NO: 41, 50, and 51, respectively;

[0225] (h) SEQ ID NO: 52, 42, and 53, respectively;

[0226] (i) SEQ ID NO: 54, 55, and 56, respectively;

[0227] (j) SEQ ID NO: 57, 48, and 58, respectively;

[0228] (k) SEQ ID NO: 59, 48, and 60, respectively; or

[0229] (l) SEQ ID NO: 61, 48, and 62, respectively.

[0230] In some embodiments, the bispecific antibody comprises a single domain antibody specifically binding to 4-1BB as disclosed herein, and a complete anti-HER2 IgG (such as IgG1 or IgG4) antibody, and the single domain antibody is linked to the C terminus of a heavy chain, the C terminus of a light chain of the complete IgG antibody via a peptide linker; wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 that are same with respective CDR1, CDR2, and CDR3 of an anti-4-1BB single domain antibody having an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO. 1 to 13; preferably, the CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme have amino acid sequences as shown in

[0231] (a) SEQ ID NO: 35, 36, and 37, respectively;

[0232] (b) SEQ ID NO: 38, 39, and 40, respectively;

[0233] (c) SEQ ID NO: 41, 42, and 43, respectively;

[0234] (d) SEQ ID NO: 44, 42, and 45, respectively;

[0235] (e) SEQ ID NO: 46, 42, and 45, respectively;

[0236] (f) SEQ ID NO: 47, 48, and 49, respectively;

[0237] (g) SEQ ID NO: 41, 50, and 51, respectively;

[0238] (h) SEQ ID NO: 52, 42, and 53, respectively;

[0239] (i) SEQ ID NO: 54, 55, and 56, respectively;

[0240] (j) SEQ ID NO: 57, 48, and 58, respectively;

[0241] (k) SEQ ID NO: 59, 48, and 60, respectively; or

[0242] (l) SEQ ID NO: 61, 48, and 62, respectively.

[0243] In some embodiment, the complete IgG antibody has a substitution in the Fc portion. In some embodiment, the complete IgG antibody has L234A and L235A substitutions ( “LALA” ) . In some embodiment, the complete IgG antibody has an N297A substitution. In some embodiment, the complete IgG antibody has “LALA” and N297A substitutions. In some embodiment, the complete IgG antibody has a S228P substitution. In some embodiments, the complete IgG antibody is a IgG4 antibody with a S228P substitution. In the present disclosure, all amino acid positions are in accordance with EU numbering.

[0244] In some embodiments, the anti-Her2 antibody comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 83, and a light chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 82. In some embodiments, the anti-Her2 antibody is a IgG4 antibody with a S228P substitution and comprises a heavy chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 83, and a light chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 82.

[0245] In some embodiments, the anti-Her2 antibody comprises a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.

[0246] In some embodiments, the bispecific antibody comprises:

[0247] (a) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0248] (b) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0249] (c) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0250] (d) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0251] (e) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0252] (f) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0253] (g) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0254] (h) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0255] (i) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0256] (j) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0257] (k) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;

[0258] (l) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14; or

[0259] (m) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.

[0260] In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and Her-2, comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14. In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and Her-2, comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14. In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and Her-2, comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14. In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and Her-2, comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14. In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and Her-2, comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14. In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and Her-2, comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14. In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and Her-2, comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.

[0261] In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and Her-2, comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14. In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and Her-2, comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14. In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and Her-2, comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14. In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and Her-2, comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14. In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and Her-2, comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14. In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and Her-2, comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.

[0262] In some embodiments, the bispecific antibody comprises a first binding domain specifically binding to 4-1BB, and second binding domain specifically binding to PD-L1, wherein the first binding domain is a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 that are same with respective CDR1, CDR2, and CDR3 of an anti-4-1BB single domain antibody having an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO. 1 to 13.

[0263] In some embodiments, the bispecific antibody comprises a first binding domain specifically binding to 4-1BB, and second binding domain specifically binding to PD-L1, wherein the first binding domain is a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises the CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme having amino acid sequences as shown in

[0264] (a) SEQ ID NO: 35, 36, and 37, respectively;

[0265] (b) SEQ ID NO: 38, 39, and 40, respectively;

[0266] (c) SEQ ID NO: 41, 42, and 43, respectively;

[0267] (d) SEQ ID NO: 44, 42, and 45, respectively;

[0268] (e) SEQ ID NO: 46, 42, and 45, respectively;

[0269] (f) SEQ ID NO: 47, 48, and 49, respectively;

[0270] (g) SEQ ID NO: 41, 50, and 51, respectively;

[0271] (h) SEQ ID NO: 52, 42, and 53, respectively;

[0272] (i) SEQ ID NO: 54, 55, and 56, respectively;

[0273] (j) SEQ ID NO: 57, 48, and 58, respectively;

[0274] (k) SEQ ID NO: 59, 48, and 60, respectively; or

[0275] (l) SEQ ID NO: 61, 48, and 62, respectively.

[0276] In some embodiments, the bispecific antibody comprises a first binding domain specifically binding to 4-1BB, and second binding domain specifically binding to PD-L1, wherein the first binding domain is a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 1 to 13.

[0277] In some embodiments, the bispecific antibody comprises a single domain antibody specifically binding to 4-1BB as disclosed herein, and a complete anti-PD-L1 IgG (such as IgG1 or IgG4) antibody, and the single domain antibody is linked to the C terminus of a heavy chain, the C terminus of a light chain of the complete IgG antibody via a peptide linker; wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 that are same with respective CDR1, CDR2, and CDR3 of an anti-4-1BB single domain antibody having an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO. 1 to 13; preferably, the CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme have amino acid sequences as shown in

[0278] (a) SEQ ID NO: 35, 36, and 37, respectively;

[0279] (b) SEQ ID NO: 38, 39, and 40, respectively;

[0280] (c) SEQ ID NO: 41, 42, and 43, respectively;

[0281] (d) SEQ ID NO: 44, 42, and 45, respectively;

[0282] (e) SEQ ID NO: 46, 42, and 45, respectively;

[0283] (f) SEQ ID NO: 47, 48, and 49, respectively;

[0284] (g) SEQ ID NO: 41, 50, and 51, respectively;

[0285] (h) SEQ ID NO: 52, 42, and 53, respectively;

[0286] (i) SEQ ID NO: 54, 55, and 56, respectively;

[0287] (j) SEQ ID NO: 57, 48, and 58, respectively;

[0288] (k) SEQ ID NO: 59, 48, and 60, respectively; or

[0289] (l) SEQ ID NO: 61, 48, and 62, respectively.

[0290] In any one of the embodiments providing a bispecific antibody comprising a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, and a complete anti-PD-L1 IgG (such as IgG1 or IgG4) antibody as described above, the complete anti-PD-L1 IgG (such as IgG1 or IgG4) antibody comprises:

[0291] (a) a heavy chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 69, and a light chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 70; or

[0292] (b) a heavy chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 74, and a light chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 75.

[0293] In any one of the embodiments providing a bispecific antibody comprising a single domain antibody specifically binding to 4-1BB, and a complete anti-PD-L1 IgG (such as IgG1 or IgG4) antibody as described above, the complete anti-PD-L1 IgG (such as IgG1 or IgG4) antibody comprises a substitution at a position selected from a group consisting of N297, L234, L235 and P331. In preferable embodiments, the IgG1 antibody comprises a substitution selected from a group consisting of N297A, L234A, L234F, L235A, L235E and P331S. For example, the IgG1 anti-PD-L1 antibody comprises a N297A substitution, L234A and L235A substitutions, or L234F, L235E and P331S substitutions. In preferable embodiments, the IgG4 antibody comprises a S228P substitution.

[0294] In preferable embodiments, the complete anti-PD-L1 antibody comprises

[0295] (a) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 65, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68;

[0296] (b) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 66, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68;

[0297] (c) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 67, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68;

[0298] (d) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 71, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 73; or

[0299] (e) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 72, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 73.

[0300] In preferable embodiments, the bispecific antibody comprises

[0301] (a) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68;

[0302] (b) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 77, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68;

[0303] (c) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 78, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68;

[0304] (d) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 79, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68;

[0305] (e) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 80, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 73; or

[0306] (f) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 81, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 73.

[0307] In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and PD-L1 comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68. In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and PD-L1 comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 77, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68. In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and PD-L1 comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 78, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68. In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and PD-L1 comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 79, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68. In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and PD-L1 comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 80, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 73. In one preferable embodiment, provided is a bispecific antibody targeting both 4-1BB and PD-L1 comprising a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 81, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 73.

[0308] Immunoconjugates

[0309] Another aspect of the disclosure relates to an immunoconjugate, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof, comprising a single domain antibody according to the “Anti-4-1BB Single Domain Antibodies” section described above, a heavy chain antibody according to the “Anti-4-1BB Heavy Chain Antibodies” section described above, or a bispecific antibody according to the “Bispecific Antibodies” section described above; and an active moiety conjugated to the single domain antibody.

[0310] In some embodiments, the active moiety is selected from a group consisting of a toxin, a peptide tag, sortag, a radionuclide, a near-infrared fluorochromes, and a nanoparticle.

[0311] In some embodiments, the toxin is selected from the group consisting of a cytotoxic agent, a cytokine, a nucleic acid, a nucleic acid-associated molecule, a radionuclide, a chemokine, an ytoxa (co) -stimulatory molecule, an immunosuppressive molecule, a death ligand, an apoptosis-inducing protein, a kinase, a prodrug-converting enzyme, a Rnase, an agonistic antibody or antibody fragment, an antagonistic antibody or antibody fragment, a growth factor, a hormone, a coagulation factor, a fibrinolytic protein, peptides mimicking these, and fragments, fusion proteins and derivatives thereof.

[0312] In some embodiments, the radionuclide comprises: At211, I131, I125, I123, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, Tc99, S35, F19, N15, C14, C13 or H3, optionally the radionuclide can be conjugated to the antibody via a chelating agent.

[0313] In some embodiments, provided is an immunoconjugate, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof, comprising a single domain antibody specifically binding to 4-1BB comprising CDR1, CDR2, and CDR3 that are same with respective CDR1, CDR2, and CDR3 of an anti-4-1BB single domain antibody having an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO. 1 to 13; preferably, the CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme have amino acid sequences as shown in

[0314] (a) SEQ ID NO: 35, 36, and 37, respectively;

[0315] (b) SEQ ID NO: 38, 39, and 40, respectively;

[0316] (c) SEQ ID NO: 41, 42, and 43, respectively;

[0317] (d) SEQ ID NO: 44, 42, and 45, respectively;

[0318] (e) SEQ ID NO: 46, 42, and 45, respectively;

[0319] (f) SEQ ID NO: 47, 48, and 49, respectively;

[0320] (g) SEQ ID NO: 41, 50, and 51, respectively;

[0321] (h) SEQ ID NO: 52, 42, and 53, respectively;

[0322] (i) SEQ ID NO: 54, 55, and 56, respectively;

[0323] (j) SEQ ID NO: 57, 48, and 58, respectively;

[0324] (k) SEQ ID NO: 59, 48, and 60, respectively; or

[0325] (l) SEQ ID NO: 61, 48, and 62, respectively;

[0326] and an active moiety conjugated to the single domain antibody, wherein the active moiety is selected from a group consisting of a toxin, a peptide tag, sortag, a radionuclide, a near-infrared fluorochromes, and a nanoparticle.

[0327] In some embodiments, provided is an immunoconjugate, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof, comprising a single domain antibody comprising an amino acid sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 1 to 13; and an active moiety conjugated to the single domain antibody, wherein the active moiety is selected from a group consisting of a toxin, a peptide tag, sortag, a radionuclide, a near-infrared fluorochromes, and a nanoparticle.

[0328] In some embodiments, provided is an immunoconjugate, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof, comprising a single domain antibody comprising an amino acid sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 1 to 13; and an active moiety conjugated to the single domain antibody, wherein the active moiety is a toxin, a radionuclide, or a near-infrared fluorochromes.

[0329] In some embodiments, provided is an immunoconjugate, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof, comprising a single domain antibody comprising an amino acid sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 1 to 13; and a cytotoxic agent conjugated to the single domain antibody.

[0330] In some embodiments, provided is an immunoconjugate, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof, comprising a single domain antibody comprising an amino acid sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 1 to 13; and a radionuclide agent conjugated to the single domain antibody.

[0331] Pharmaceutical Compositions

[0332] The present disclosure, in another aspect, provides a pharmaceutical composition comprising the single domain antibody, the heavy chain antibody, the bispecific antibody or the immunoconjugate (hereinafter “antibody or immunoconjugate” ) as disclosed herein, and a pharmaceutically acceptable carrier. The compositions are suitable for veterinary or human administration.

[0333] The present compositions can be in any form that allows for the composition to be administered to a patient. For example, the composition can be in the form of a solid, liquid or gas (aerosol) . Typical routes of administration include, without limitation, oral, topical, parenteral, sublingual, rectal, vaginal, ocular, intra-tumor, and intranasal. Parenteral administration includes subcutaneous injections, intravenous, intramuscular, intrasternal injection or infusion techniques. In one aspect, the compositions are administered parenterally. In yet another aspect, the compositions are administered intravenously.

[0334] Pharmaceutical compositions can be formulated so as to allow the active ingredient to be bioavailable upon administration of the composition to a patient. Compositions can take the form of one or more dosage units, where for example, a tablet can be a single dosage unit, and a container of an immunoconjugate in aerosol form can hold a plurality of dosage units.

[0335] Materials used in preparing the pharmaceutical compositions can be non-toxic in the amounts used. It will be evident to those of ordinary skill in the art that the optimal dosage of the active ingredient (s) in the pharmaceutical composition will depend on a variety of factors. Relevant factors include, without limitation, the type of animal (e.g., human) , the particular form of the immunoconjugate, the manner of administration, and the composition employed.

[0336] The pharmaceutically acceptable carrier or vehicle can be particulate, so that the compositions are, for example, in tablet or powder form. The carrier (s) can be liquid, with the compositions being, for example, an oral syrup or injectable liquid. In addition, the carrier (s) can be gaseous or particulate, so as to provide an aerosol composition useful in, e.g., inhalatory administration.

[0337] The composition can be in the form of a liquid, e.g., an elixir, syrup, solution, emulsion or suspension. The liquid can be useful for oral administration or for delivery by injection. When intended for oral administration, a composition can comprise one or more of a sweetening agent, preservatives, dye / colorant and flavor enhancer. In a composition for administration by injection, one or more of a surfactant, preservative, wetting agent, dispersing agent, suspending agent, buffer, stabilizer and isotonic agent can also be included.

[0338] The liquid compositions, whether they are solutions, suspensions or other like form, can also include one or more of the following: sterile diluents such as water for injection, saline solution, preferably physiological saline, Ringer’s solution, isotonic sodium chloride, fixed oils such as synthetic mono or digylcerides which can serve as the solvent or suspending medium, polyethylene glycols, glycerin, cyclodextrin, propylene glycol or other solvents; antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl paraben; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; buffers such as acetates, citrates or phosphates and agents for the adjustment of tonicity such as sodium chloride or dextrose. A parenteral composition can be enclosed in ampoule, a disposable syringe or a multiple-dose vial made of glass, plastic or other material. Physiological saline is an exemplary adjuvant. An injectable composition is preferably sterile.

[0339] The amount of the antibody or immunoconjugate that is effective in the treatment of a particular disorder or condition will depend on the nature of the disorder or condition and can be determined by standard clinical techniques. In addition, in vitro or in vivo assays can optionally be employed to help identify optimal dosage ranges. The precise dose to be employed in the compositions will also depend on the route of administration, and the seriousness of the disease or disorder, and should be decided according to the judgment of the practitioner and each patient’s circumstances.

[0340] The compositions comprise an effective amount of an antibody or an immunoconjugate such that a suitable dosage will be obtained. Typically, this amount is at least about 0.01%of an antibody or an immunoconjugate by weight of the composition. When intended for oral administration, this amount can be varied to range from about 0.1%to about 80%by weight of the composition. In one aspect, oral compositions can comprise from about 4%to about 50%of the antibody or the immunoconjugate by weight of the composition. In yet another aspect, present compositions are prepared so that a parenteral dosage unit contains from about 0.01%to about 2%by weight of the antibody or the immunoconjugate.

[0341] For intravenous administration, the composition can comprise from about 0.01 to about 100 mg of an antibody or an immunoconjugate per kg of the animal’s body weight. In one aspect, the composition can include from about 1 to about 100 mg of an antibody or an immunoconjugate per kg of the animal’s body weight. In another aspect, the amount administered will be in the range from about 0.1 to about 25 mg / kg of body weight of the antibody or the immunoconjugate.

[0342] Generally, the dosage of an antibody or an immunoconjugate administered to a patient is typically about 0.01 mg / kg to about 2000 mg / kg of the animal’s body weight. In one aspect, the dosage administered to a patient is between about 0.01 mg / kg to about 10 mg / kg of the animal’s body weight, in another aspect, the dosage administered to a patient is between about 0.1 mg / kg and about 250 mg / kg of the animal’s body weight, in yet another aspect, the dosage administered to a patient is between about 0.1 mg / kg and about 20 mg / kg of the animal’s body weight, in yet another aspect the dosage administered is between about 0.1 mg / kg to about 10 mg / kg of the animal’s body weight, and in yet another aspect, the dosage administered is between about 1 mg / kg to about 10 mg / kg of the animal’s body weight.

[0343] The antibodies, the immunoconjugates or compositions can be administered by any convenient route, for example by infusion or bolus injection, by absorption through epithelial or mucocutaneous linings (e.g., oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc. ) . Administration can be systemic or local. Various delivery systems are known, e.g., encapsulation in liposomes, microparticles, microcapsules, capsules, etc., and can be used to administer an antibody or an immunoconjugate or composition. In certain embodiments, more than one antibody, immunoconjugate or composition is administered to a patient.

[0344] In specific embodiments, it can be desirable to administer one or more antibodies, immunoconjugates or compositions locally to the area in need of treatment. This can be achieved, for example, and not by way of limitation, by local infusion during surgery; topical application, e.g., in conjunction with a wound dressing after surgery; by injection; by means of a catheter; by means of a suppository; or by means of an implant, the implant being of a porous, non-porous, or gelatinous material, including membranes, such as sialastic membranes, or fibers. In one embodiment, administration can be by direct injection at the site (or former site) of a cancer, tumor or neoplastic or pre-neoplastic tissue. In another embodiment, administration can be by direct injection at the site (or former site) of a manifestation of an autoimmune disease.

[0345] In certain embodiments, it can be desirable to introduce one or more antibody, immunoconjugate or compositions into the central nervous system by any suitable route, including intraventricular and intrathecal injection. Intraventricular injection can be facilitated by an intraventricular catheter, for example, attached to a reservoir, such as an Ommaya reservoir.

[0346] Pulmonary administration can also be employed, e.g., by use of an inhaler or nebulizer, and formulation with an aerosolizing agent, or via perfusion in a fluorocarbon or synthetic pulmonary surfactant.

[0347] In yet another embodiment, the antibody, immunoconjugate or compositions can be delivered in a controlled release system, such as but not limited to, a pump or various polymeric materials can be used. In yet another embodiment, a controlled-release system can be placed in proximity of the target of the antibody, immunoconjugate or compositions, e.g., the brain, thus requiring only a fraction of the systemic dose.

[0348] The term “carrier” refers to a diluent, adjuvant or carrier, with which an antibody or a immunoconjugate is administered. Such pharmaceutical carriers can be liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. The carriers can be saline, gum acacia, gelatin, starch paste, talc, keratin, colloidal silica, urea, and the like. In addition, auxiliary, stabilizing, thickening, lubricating and coloring agents can be used. In one embodiment, when administered to a patient, the antibody or the immunoconjugate or compositions and pharmaceutically acceptable carriers are sterile. Water is an exemplary carrier when the antibodies or immunoconjugates are administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable pharmaceutical carriers also include carriers such as starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol and the like. The present compositions, if desired, can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents.

[0349] In an embodiment, the immunoconjugates are formulated in accordance with routine procedures as a pharmaceutical composition adapted for intravenous administration to animals, particularly human beings. Typically, the carriers or vehicles for intravenous administration are sterile isotonic aqueous buffer solutions. Where necessary, the compositions can also include a solubilizing agent. Compositions for intravenous administration can optionally comprise a local anesthetic such as lignocaine to ease pain at the site of the injection. Generally, the ingredients are supplied either separately or mixed together in unit dosage form, for example, as a dry lyophilized powder or water free concentrate in a hermetically sealed container such as an ampoule or sachette Indicating the quantity of active agent. Where a immunoconjugate is to be administered by Infusion, It can be dispensed, for example, with an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline. Where the antibody or the immunoconjugate is administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline can be provided so that the ingredients can be mixed prior to administration.

[0350] The composition can include various materials that modify the physical form of a solid or liquid dosage unit. For example, the composition can include materials that form a coating shell around the active ingredients. The materials that form the coating shell are typically inert, and can be selected from, for example, sugar, shellac, and other enteric coating agents. Alternatively, the active ingredients can be encased in a gelatin capsule.

[0351] The compositions can consist of gaseous dosage units, e.g., it can be in the form of an aerosol. The term aerosol is used to denote a variety of systems ranging from those of colloidal nature to systems consisting of pressurized packages. Delivery can be by a liquefied or compressed gas or by a suitable pump system that dispenses the active ingredients.

[0352] Whether in solid, liquid or gaseous form, the present compositions can include a pharmacological agent used in the treatment of cancer.

[0353] Uses and Therapies

[0354] The antibodies and immunoconjugates are useful for inhibiting the multiplication of a tumor cell or cancer cell, causing apoptosis in a tumor or cancer cell, or for treating cancer in a patient. The antibodies and the immunoconjugates can be used accordingly in a variety of settings for the treatment of animal cancers. The antibodies and immunoconjugates can be used to deliver a drug or drug unit to a tumor cell or cancer cell. Without being bound by theory, in one embodiment, the antibody or the antibody moiety of the immunoconjugate disclosed herein binds to or associates with 4-1BB expressed on, or associated with, an immune cell surface.

[0355] The present disclosure, in a further aspect, provides a method for treating cancer in a subject, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the single domain antibody, the heavy chain antibody, the bispecific antibody or the immunoconjugate disclosed herein.

[0356] The present disclosure, in a further aspect, provides a method for prevention of cancer in a subject at a risk of suffering from the cancer, comprising administering to the subject a prophylactically effective amount of the single domain antibody, the heavy chain antibody, the bispecific antibody or the immunoconjugate disclosed herein.

[0357] The present disclosure, in a further aspect, provides a method for diagnosing, for example in vitro, a cancer in a subject, comprising isolating a sample from the subject; contacting, for example in vitro, the sample with the single domain antibody, the heavy chain antibody, the bispecific antibody or the immunoconjugate disclosed herein; detecting a signal generated by the contacting; comparing the signal with a threshold; and determining whether the subject is suffered from the cancer based on an outcome of the comparation.

[0358] The cancer may be a solid cancer or a hematologic malignancy. A “hematologic malignancy” , also known as a blood cancer, is a cancer that originates in blood-forming tissue, such as the bone marrow or other cells of the immune system. Hematologic malignancies include, without limitation, leukemias (such as acute myeloid leukemia (ANIL) , acute promyelocytic leukemia, acute lymphoblastic leukemia (ALL) , acute mixed lineage leukemia, chronic myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia (CLL) , hairy, cell leukemia and large granular lymphocytic leukemia) , myelodysplastic syndrome (MDS) , myeloproliferative disorders (polycythemia vera, essential thrombocytosis, primary myelofibrosis and chronic myeloid leukemia) , lymphomas, multiple myeloma, MGUS and similar disorders, Hodgkin’s lymphoma, non-Hodgkin lymphoma (NHL) , primary mediastinal large B-cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma, transformed follicular lymphoma, splenic marginal zone lymphoma, lymphocytic lymphoma, T-cell lymphoma, and other B-cell malignancies. “Solid cancers” include, without limitation, fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteogenic sarcoma, chordoma, angiosarcoma, endotheliosarcoma, lymphangiosarcoma, lymphangioendotheliosarcoma, synovioma, mesothelioma, Ewing’s tumor, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, colon cancer, colorectal cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, bone cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, esophogeal cancer, stomach cancer, oral cancer, nasal cancer, throat cancer, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, sebaceous gland carcinoma, papillary carcinoma, papillary adenocarcinomas, cystadenocarcinoma, medullary carcinoma, bronchogenic carcinoma, renal cell carcinoma, hepatoma, bile duct carcinoma, choriocarcinoma, seminoma, embryonal carcinoma, Wilms’ tumor, cervical cancer, uterine cancer, testicular cancer, small cell lung carcinoma, bladder carcinoma, lung cancer, epithelial carcinoma, glioma, glioblastoma multiforme, astrocytoma, medulloblastoma, craniopharyngioma, ependymoma, pinealoma, hemangioblastoma, acoustic neuroma, oligodendroglioma, meningioma, skin cancer, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma. Preferably, the cancers treatable by the present disclosure include breast cancer.

[0359] In some embodiments, provided are methods for treating or preventing cancer are provided, including administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of an antibody or an immunoconjugate disclosed herein and a chemotherapeutic agent. In one embodiment, the chemotherapeutic agent is that with which treatment of the cancer has not been found to be refractory. In another embodiment, the chemotherapeutic agent is that with which the treatment of cancer has been found to be refractory. The antibodies or the immunoconjugates can be administered to a patient that has also undergone surgery as treatment for the cancer. In some embodiments, the patient has been found to be refractory to a HER2 antibody, for example, Trastuzumab or Margetuximab. In some embodiments, the patient has been found to be refractory to a PD-L1 antibody, for example, atezolizumab (Tecentriq) and durvalumab (Imfinzi) .

[0360] In a specific embodiment, the antibody or the immunoconjugate is administered concurrently with the chemotherapeutic agent or with radiation therapy. In another specific embodiment, the chemotherapeutic agent or radiation therapy is administered prior or subsequent to administration of an antibody or an immunoconjugate, in one aspect at least an hour, five hours, 12 hours, a day, a week, a month, in further aspects several months (e.g., up to three months) , prior or subsequent to administration of an antibody or an immunoconjugate.

[0361] A chemotherapeutic agent can be administered over a series of sessions. Suitable chemotherapeutic agents include, but are not limited to, methotrexate, taxol, L-asparaginase, mercaptopurine, thioguanine, hydroxyurea, cytarabine, cyclophosphamide, ifosfamide, nitrosoureas, cisplatin, carboplatin, mitomycin, dacarbazine, ytoxanzine, topotecan, nitrogen mustards, ytoxan, etoposide, 5-fluorouracil, BCNU, irinotecan, camptothecins, bleomycin, doxorubicin, idarubicin, daunorubicin, dactinomycin, plicamycin, mitoxantrone, asparaginase, vinblastine, vincristine, vinorelbine, paclitaxel, and docetaxel. With respect to radiation, any radiation therapy protocol can be used depending upon the type of cancer to be treated. For example, but not by way of limitation, x-ray radiation can be administered; in particular, high-energy megavoltage (radiation of greater that 1 MeV energy) can be used for deep tumors, and electron beam and orthovoltage x-ray radiation can be used for skin cancers. Gamma-ray emitting radioisotopes, such as radioactive isotopes of radium, cobalt and other elements, can also be administered.

[0362] Additionally, methods of treatment of cancer with an antibody or an immunoconjugate disclosed herein are provided as an alternative to chemotherapy or radiation therapy where the chemotherapy or the radiation therapy has proven or can prove too toxic, e.g., results in unacceptable or unbearable side effects, for the subject being treated. The animal being treated can, optionally, be treated with another cancer treatment such as surgery, radiation therapy or chemotherapy, depending on which treatment is found to be acceptable or bearable.

[0363] The antibodies or the immunoconjugates can also be used in an in vitro or ex vivo fashion, such as for the treatment of certain cancers, including, but not limited to leukemias and lymphomas, such treatment involving autologous stem cell transplants. This can involve a multi-step process in which the animal’s autologous hematopoietic stem cells are harvested and purged of all cancer cells, the animal’s remaining bone-marrow cell population is then eradicated via the administration of a high dose of an antibody or an immunoconjugate with or without accompanying high dose radiation therapy, and the stem cell graft is infused back into the animal. Supportive care is then provided while bone marrow function is restored and the animal recovers.

[0364] Equivalently, the present disclosure also provides the single domain antibody, the heavy chain antibody, the bispecific antibody or the immunoconjugate as disclosed herein for use in the treatment of cancer in a subject. Equivalently, the present disclosure also provides use of the single domain antibody, the heavy chain antibody, the bispecific antibody or the immunoconjugate as disclosed herein in the manufacturing of a medicament for treatment of cancer in a subject.

[0365] The present disclosure, in a further aspect, provides a method for detecting 4-1BB positive sample in vitro, comprising contacting in vitro the sample with the single domain antibody, the heavy chain antibody, the bispecific antibody or the immunoconjugate disclosed herein; detecting a signal generated by the contacting; comparing the signal with a threshold; and determining whether the sample is positive for 4-1BB.

[0366] Sequence Listings Examples

[0367] Example 1: Phage library screening and identification

[0368] The phage selection method was optimized by reducing the antigen dosage and increasing the frequency of magnetic bead washes. Briefly, a 1 mL incubation system was prepared by amalgamating the fully human single-domain antibody phage library with MPBS and biotinylated antigen. The antigen quantity was gradually diminished in each round of incubation at room temperature using a shaker for 30 minutes. Subsequently, 20 μL of magnetic beads were added, and the mixture was further incubated at room temperature for 1.5 hours. Solid-liquid separation was achieved using a magnetic rack, and the number of magnetic bead washes was augmented with each round of selection. Following infection of TG1 cells, 10 μL of M13 helper phage was added, and the phage was precipitated using PEG8000 the following day for the subsequent round of selection. Monoclonal antibodies demonstrating specific binding to the 4-1BB antigen were chosen for further analysis of their distinctive sequences and sequence diversity. These anti-4-1BB fully human single-domain antibodies were numbered BM157. Binding activity was measured by ELISA after prokaryotic expression, as shown in Figure 1, with an EC50 range of 7 -585 nM (Table 1) .

[0369] Table 1. Anti-4-1BB fully human single-domain antibody (BM157) ELISA EC50 (nM) statistics

[0370] Example 2: Production of anti-HER2 / 4-1BB bispecific antibody

[0371] Anti-HER2 / 4-1BB bispecific antibody (BM231) selected the IgG-like form. IgG4 Fc was used as the backbone of bispecific antibody. The end of the Fc was linked to the anti-4-1BB fully human single-domain antibody through a 3 (G4S) short peptide, which was paired with the Herceptin light chain for eukaryotic expression to form a bivalent bifunctional antibody. The structure of BM231 is shown in Figure 2. Corresponding list of anti-4-1BB fully human single-domain antibody and anti-HER2 / 4-1BB bispecific antibody antibodies as shown in Table 2.

[0372] Table 2. Corresponding list of anti-4-1BB fully human single-domain antibody and anti-HER2 / 4-1BB bispecific antibody

[0373] The N-terminus retains high affinity and specificity for HER2 tumor antigens, and becomes the "helmsman" of bispecific antibodies targeting tumor cells. IgG4, as a backbone connecting Herceptin (Fab) and anti-4-1BB fully human single-domain antibody, has no ADCC and ADC effect, and is also the weakest binding antibody type to FcγR among IgG antibodies, so it is expected to minimize FcγR-mediated 4-1BB-Clustering. A total of 13 fully human anti-4-1BB single-domain antibodies were screened from the fully human phage display library and used to construct BM231.

[0374] BM231-99 was used as a positive control in this study. The molecular design of BM231-99 was similar to that of anti-HER2 / 4-1BB bispecific antibody, in which the terminal fully human single-domain antibody was replaced by TJ-41B02. TJ-41B02 is a form of scFv. In this study, the VL and VH of scFv were linked by a 4 (G4S) short adaptor peptide, that is, VL-4 (G4S) -VH, TJ-41B02 amino acid sequence is from patent application no. CN 201980079076.9.

[0375] Example 3: Antigen binding of anti-HER2 / 4 ‐1BB bispecific antibody

[0376] A 96-half well microtiter plate was coated with 50 μL of 2 μg / mL antigen protein diluted in PBS at 4 ℃ overnight, including: 4-1BB-Fc, HER2-Fc. Fc-isotype was used as a control antigen to detect the nonspecificity of BM231. The microtiter plates were then blocked with 100 μL / well of 3%BSA and incubated in a constant temperature incubator at 37 ℃ for 1 hour. Threefold dilutions of antibody from 500 nM were added to each well for a total of three repeat Wells per concentration and incubated for 1.5 h at 37 ℃. Plates were washed with 0.05%PBST and then incubated with Anti-Fab-HRP (SIGMA) antibody for 45 min at 37 ℃. After washing, the plates were developed with TMB substrate and detected with a microplate reader at OD405nm, and the data were analyzed with Graph Pad Prism 8 software to calculate EC50.

[0377] As shown in Figure 3 and Table 3, the results show that all 13 BM231 and BM231-99 retain high affinity for HER2 with EC50 around 0.5 nM, and most of the bispecific antibodies hardly bind to the negative control antibody. The EC50 of BM231-99 with extracellular full-length 4-1BB antigen ranged from 0.79 nM to 139.2 nM.Bm231-99 showed a strong binding activity to 4-1BB with an EC50 of 0.82 nM, and Urelumab showed the strongest binding activity to 4-1BB. The EC50 is around 0.3 nM.

[0378] Table 3. Anti-HER2 / 4-1BB bispecific antibody ELISA EC50 (nM) statistics.

[0379] Example 4: Binding of bispecific antibodies to cell surface 4‐1BB or HER2

[0380] To evaluate the cell-surface antigen binding properties of BM231, the binding of anti-HER2 ‐4‐1BB antibody to FCHO expressing 4‐1BB and SKOV3 overexpressing HER2 were analyzed by FACS. The total number of 1×105 FCHO‐4‐1BB cells in each well was incubated for 30 min at 4 ℃ with antibody serially diluted in FACS buffer (containing 2%FBS in PBS) at a maximum antibody concentration of 500 nM in 10 gradients of one-third dilution. After washing with FACS buffer, FITC anti-human Fc antibody was added to each well and incubated for 30 min at 4 ℃. After washing, the MFI of FITC was determined by FACS with IgG4-isotype as a negative control antibody (Baiying Biological) . Statistics of 50 values are presented in Table 4. As shown in Figure 4, Some of the anti-HER2 / 4‐1BB antibodies tested (BM231-60 / 61 / 66 / 74 / 77) showed a concentration-dependent binding ability to 4‐1BB, and BM180-96 (Urelumab) had an EC50 of 0.72 nM. The EC50 of BM231 bispecific antibodies ranged from 3.85 nM to 42.21nM, and the EC50 of BM130-97 (Herceptin) was 20.76 nM.

[0381] Table 4. Cell-binding EC50 (nM) statistics of anti-HER2 / 4-1BB bispecific antibodies

[0382] Example 5: Double antigen capture ELISA

[0383] To further demonstrate that anti-HER2 / 4‐1BB antibodies can bind both HER2 and 4‐1BB, a double antigen capture ELISA assay was performed. Briefly, microtiter plates were coated with human HER2‐Fc protein in PBS at 100 ng / well overnight at 4 ℃ and then blocked with 100 μL / well of 3%BSA for 1 h at 37 ℃. A threefold dilution of BM231 diluted starting at 500 nM was added to each well and incubated for 1.5 hours at 37 ℃. Plates were washed with 0.05%PBST and then incubated for 1 h at 37 ℃ with 100 ng / well of human / cynomolgus / moues 4‐1BB‐His protein diluted in 1%BSA. The plates were washed with 0.05%PBST and then incubated with anti-His-HRP (GENEWIZ) for 45 min at 37 ℃. After washing, the plates were stained with TMB substrate and detected by microplate reader at OD405nm. The data were analyzed by Graph Pad Prism 8 software to calculate EC50.

[0384] As shown in Figure 5, BM231 had good binding activity with both human 4-1BB antigen and human HER2 antigen. Species cross-double antigen ELISA data showed that BM231 had good binding activity with monkey 4-1BB antigen and human HER2 antigen at the same time.

[0385] Example 6: HER2-dependent activation of 4-1BB signaling by anti-HER2 / 4‐1BB bispecific antibody

[0386] Functional characterization of cell line-based anti-HER2 / 4‐1BB bispecific antibodies was performed to test the ability of bispecific antibodies to promote 4‐1BB signaling. In this study, 4-1BB-NF-κB‐Luc2p-Jurkat cell line (Nanjing Cobioer) was used as the effector cells, SKOV3 and MC38 cells with or without HER2 expression were used as the target cells, and huHER2-MC38 cell line with stable expression of human HER2 was also used as the target cells. The 4-1BB-NF-κB ‐Luc2p-Jurkat cell line was genetically modified to stably express 4‐1BB and luciferase. Luciferase expression is induced upon antibody binding to the 4‐1BB receptor. In brief, BM231 was incubated at a maximum concentration of 300 nM, and the antibody was diluted in a gradient of 1640 medium containing 5%FBS, one third diluted for 11 gradients. 4‐1BB-NF-κB‐Luc2p-Jurkat cells were centrifuged at 1600 rpm to collect cell resuspension counts, the ratio of effector cells to target cells was 1: 1, 2.5×104 target cells plus 2.5×104 effector cells were seeded in a 96-well plate in a total volume of 50 μL per well. Then 25 μL of gradient diluted antibody to be tested was added to each well, and the actual final concentration of antibody used was 100 nM. The cells were incubated for 5 h at 37 ℃ in a 5 %CO2 constant temperature incubator. 75 μL assay substrate (promega) was added to each well of the assay plate after 5 hours. After 10 minutes of incubation at room temperature, 100 μL per well was transferred to a 96-well white opaque plate for chemiluminescence measurement using a microplate reader. Four-parameter logarithmic curve analysis was performed with GraphPad software.

[0387] As shown in Figure 6, Table 5, the BM180-96 (Urelumab) monoclonal antibody dose-dependently enhanced 41BB performance in the absence of target cells or in the presence of MC38 cells, with an EC50 of around 0.09 nM. However, BM231 bispecific antibodies and BM231-99 had no agonist activity in the same experimental environment. BM231 bispecific antibodies could dose-dependently activate 4-1BB signaling when co-incubated with 4-1BB-NF-κB ‐Luc2p-Jurkat effector cells and SKOV3 or huHER2-MC38 cells. This suggests that the activity of BM231 (anti-HER2  / 4‐1BB bispecific antibody) is dependent on HER2 expression.

[0388] Table 5. BM231 activated Reporter cells in a HER2-dependent manner EC50 (nM) statistics.

[0389] Example 7: Anti-HER2 / 4-1BB bispecific antibody promotes PBMC activation activity

[0390] To test the ability of anti-HER2 / 4‐1BB bispecific antibody (BM231) to activate human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) , cytokine production assays were used. Human PBMC cells were co-stimulated with human anti-CD3 antibody and BM231-60, BM231-77, BM231-99, HER2 high expression SKOV3 cells were used as target cells, and FCHO was used as control target cells. 96-well plates were coated with 0.25 μg / mL human anti-CD3 antibody in 200 μL per well. Human peripheral blood mononuclear cells (2×105 / well) were co-cultured with SKOV3 or control FCHO cells (2×104 / well) in the presence of human anti-CD3 antibody. Serial dilutions of bispecific antibodies were added to the mixed cultures, and the highest concentration used for detection of IFN-γ was 2000 nM in 8 gradients of 1 / 5 dilutions. For the detection of IL-2, the highest concentration used was 80 nM in six gradients of 1 / 5 dilution. After 48 hours, the culture medium supernatant was removed to measure the level of IL-2 expression using the Human IL-2 kit of Perkinelmer. After 72 hours, the culture medium supernatant was removed to measure IFN-γ expression using Perkinelmer's Human IFN-γ kit cytokine assay.

[0391] As shown in Figure 7, all antibodies failed to effectively stimulate IFN-γsecretion by PBMC cells when co-incubated with HER2-negative FCHO cells, with BM231-08 and BM231-76 showing A tendency to reduce secretion even at the highest concentrations with high background values (Figure 7A) . However, all bispecific antibodies activated PBMC in a HER2-dependent manner to promote IFN-γproduction after co-incubation with HER2-overexpressing SKOV3 cells, which increased with the concentration of antibodies (Figure 7B) . The EC50 values of BM231-60 were the highest: 57.9 nM, but the highest expression of IFN-γ was not as high as that of the other bispecific antibodies. Compared with the negative control group (Figure 7 C) , the expression level of IL-2 in the experimental group co-incubated with SKOV3 was increased by 4-to 5-fold as a whole (Figure 7 D) , indicating that BM231 significantly activated PBMC to promote IL-2 production.

[0392] Example 8: Anti-HER2 / 4-1BB bispecific antibody promotes the expression of granzyme B by cytotoxic T cells

[0393] CD3 was diluted to 0.1 μg / mL with PBS to coat plates, and PBMC (2×105 / well) were co-activated with BM231 for 24 h. The highest concentration of BM231 bispecific antibody was 2000 nM. Three gradients were diluted in one-tenth dilutions. Cells were first stained with NIR live or dead staining solution reagent, then blocked by Fc-block incubation for 10 min, and washed once with staining Buffer. Cell surface markers, including human CD45, CD3, CD4 and CD8, were stained at room temperature in the dark for 30 min, washed with staining Buffer, and centrifuged at 1500 rpm for 3 min to remove the supernatant. 200 μL fixation / membrane breaking working solution was added to each well and incubated for 30 min at room temperature in the dark. Samples were centrifuged at 2500 rpm for 5 min at room temperature and the supernatant was discarded. 200 μL of 1×membrane breaking solution was added to each well, the samples were centrifuged at 2500 rpm for 5 min at room temperature, and the supernatant was discarded. Finally, the intracellular staining was performed, and the intracellular staining flow antibody Granzyme B (GZMB) was diluted with 1× membrane breaking solution, the volume was adjusted to about 100 μL per well, and the cells were incubated at room temperature in the dark for more than 30 minutes. Experimental samples were examined by flow cytometry, and experimental data were evaluated by FlowJo analysis.

[0394] As shown in Figure 8, the CD3+ %of PBMC stimulated with CD3 and BM231 for 24 hours increased by about 10%compared with the negative control group (Figure 8A) , while the percentage of CD3+CD4+ %double positive cell population did not increase compared with the negative control group. With the increase of BM231 concentration, the percentage of CD3+CD8+ double positive cells increased by about 10-15%compared with the negative control group (Figure 8C) . CD8+GZMB+ %was also increased by about 10-12% (Figure 8D) . These results indicated that co-stimulation of PBMC with CD3 and BM231 mainly promoted the activation and expansion of cytotoxic T cells and enhanced the killing level of CTL.

[0395] Example 9: Study on antigen recognition epitopes of anti-HER2 / 4-1BB bispecific antibodies

[0396] To evaluate the antigen recognition epitopes of BM231-60, BM231-77 bispecific antibodies, as well as the positive control bispecific antibody BM231-99, we first constructed extracellular domain antigens of 4-1BB, including 4-1BB-CRD1-2-Fc, 4-1BB-CRD2-3-Fc, and 4-1BB-CRD3-4-Fc. ELISA was performed to differentiate the antigen recognition epitopes of BM231 bispecific antibodies, with Fc-isotype serving as the negative control antigen. As shown in Figure 9A, comparative analysis revealed that the 4-1BB antigen recognition epitopes of BM231-60, BM231-77, and the positive control bispecific antibody BM231-99 were all CRD4, while the 4-1BB antigen recognition epitope of the positive control monoclonal antibody BM180-96 (Urelumab) was CRD1.

[0397] To further compare whether the antigen recognition epitopes of 4-1BB are completely identical among pairwise combinations, especially for BM231-60, BM231-77, and BM231-99, which all recognize the CRD4 epitope, we first performed kinetic binding assays. Then, we conducted epitope competition experiments using BLI technology to measure the epitope inhibition rate. The kinetic binding data of BM231-60, BM231-77, BM231-99, and BM180-96 (Urelumab) to biotinylated 4-1BB antigen protein are shown in Figure 9B, with respective KD values of 4.29 nM, 18 nM, 2.81 nM, and 0.166 nM.

[0398] Based on the kinetic binding data of the test samples, the antibody concentrations were determined. SA probe was selected, and the experiment was conducted at 37℃. The SA probe was first equilibrated in 200 μL ultrapure water for 100 s, then bound to biotinylated 4-1BB antigen for 15 s. After that, it was equilibrated in 0.02%PBST for 200 s and then bound to antibody 1 (Ab1) for 800 s. The mixture of Ab2 and Ab1 was then bound for 800 s. The inhibition rate was calculated using the formula: (Ab2 with Ab1  / Ab2 without Ab1) × %. The inhibition rate data is presented in Figure 9C. Values below 30 %indicate that the two antibodies have completely identical antigen recognition epitopes, values between 30 %and 70 %indicate partial shared epitopes, and values above 70 %indicate completely different antigen epitopes. Based on the epitope competition experiment data from the binding zone antigen ELISA, it was confirmed that BM231-60 and BM231-77 have identical antigen recognition epitopes: CRD4. They share approximately 50 %of the same epitopes with BM231-99. BM180-96 (Urelumab) recognizes the CRD1 epitope, which is consistent with the literature and completely different from the epitopes of BM231 bispecific antibodies.

[0399] Example 10: Antitumor activity of BM231 in hu4-1BB-KI mouse model

[0400] We utilized a humanized mouse model expressing human 4-1BB extracellular domain, hu4-1BB-KI mice were subcutaneously engrafted with MC38-huHER2 tumor cells. Each group consisted of 5 mice, and they were intraperitoneally injected with the following antibodies every three days: IgG4-isotype control (10 mg / kg) , BM231-60 bispecific antibody (10 mg / kg) , BM231-77 bispecific antibody (10 mg / kg) , BM231-99 bispecific antibody (10 mg / kg) , and BM180-96 (Urelumab) antibody (10 mg / kg) . During the experiment, tumor volume was measured using calipers 2-3 times per week. As shown in Figure 10A, BM231 bispecific antibodies exhibited varying degrees of tumor inhibition activity in mice. The tumor volume for each mouse in each group is presented in Figure 10B. The tumor growth inhibition rate (TG1) was calculated based on the last three measurements as shown in Figure 10C, using the formula: 100 × (tumor volume of control group -tumor volume of treatment group)  /  (tumor volume of control group -tumor volume of control group on day 0) . Among them, BM231-60 showed the best antitumor activity with a tumor inhibition rate of 76.75%on day 14, which was 2.5 times higher than the positive control bispecific antibody BM231-99.

[0401] Example 11: BM231-60 treatment promotes expansion or infiltration of mCD45 in the tumor microenvironment

[0402] To further investigate the mechanism of action of the antibody, tumor tissue was collected at the endpoint of the in vivo efficacy experiment. Immunohistochemistry was performed to detect the percentage of mCD45 cells (mCD4 %) in the tumor. As shown in Figure 11, the bispecific antibody specifically increased the percentage of mCD45 cells in the tumor microenvironment, especially BM231-60. Statistical analysis of inter-group comparisons revealed a significant difference between BM231-60 and the positive control bispecific antibody BM231-99. This indicates that BM231-60 has better anti-tumor activity than the positive control BM231-99 due to its promotion of increased expansion or infiltration of lymphocytes.

[0403] Example 12: BM231-60 treatment significantly altered gene expression profiles

[0404] To further understand the mechanism of action of the BM231-60 antibody, tumor tissue was collected at the endpoint of the in vivo efficacy experiment. RNA high-throughput sequencing (NGS) was performed on the tumor tissue to analyze the effect of the treatment group compared to the control group on the transcription levels of lymphocytes in the tumor microenvironment. Three groups of tumor tissues were selected for analysis, including a negative control group (IgG4-isotype) , a positive control group treated with the BM231-99 bispecific antibody, and the experimental group treated with BM231-60. Three tumor tissue samples were randomly selected from each group and sent to Genewiz for transcriptome sequencing.

[0405] The data shows that treatment with BM231-60 significantly altered the gene expression profile (Figure 12A) . Analysis revealed that compared to the negative control group, BM231-60 significantly increased the expression of various granule enzymes (Figure 12B) . Comparative analysis of the expression profiles of various immune cells (Figure 12C) revealed that BM231-60 exhibited higher expression percentages at the transcriptional level for T cells, CD8 T cells, and monocytes, which are associated with tumor killing, compared to the negative control group and BM231-99.

[0406] The percentage of expression at the transcriptional level for B cell-derived cells involved in antigen presentation was also significantly enhanced in the BM231-60 group. Additionally, fibroblast growth was observed in the BM231-60 treatment group. However, the percentage of expression at the transcriptional level for NK cells, memory B cells, and endothelial cells was lower in the BM231-60 group compared to the control group. There were no significant differences observed in other cells. In summary, BM231-60 exhibits good anti-tumor activity in vivo, possibly due to its enhancement of B cell antigen presentation and promotion of T cell expansion, particularly CD8 T cells. Since the expression of NK cells in the BM231-60 treatment group is downregulated, it is reasonable to speculate that the upregulation of various granule enzymes associated with T cell activation in BM231-60 is mainly derived from the expanded CD8 T cells in the tumor microenvironment, rather than NK cells.

[0407] Example 13: H&E histopathological analysis of mouse liver tissue

[0408] To visually assess the impact of BM231 on hepatic tissue in mice, we selected three mice randomly from each experimental group at the conclusion of the animal efficacy study for histopathological analysis using H&E staining (Figure 13) . Pathological examination revealed varying degrees of hepatocyte degeneration, minimal venous congestion, and a slight influx of inflammatory cells across all experimental groups. The IgG4-isotype, BM231-99, and BM231-77 groups exhibited sporadic hepatocyte necrosis, while the BM180-96 (Urelumab) group displayed slightly more pronounced inflammatory cell infiltration compared to the BM231-60 group.

[0409] Example 14: In vivo dose gradient pharmacodynamic experiment of BM231-60 bispecific antibody

[0410] To evaluate the anti-tumor effectiveness of the BM231-60 bispecific antibody, hu4-1BB-KI mice were subcutaneously implanted with HER2-MC38 cells and treated with different concentrations of BM231-60 bispecific antibody. Each group comprised eight mice, receiving intraperitoneal injections of the following antibodies every three days for a total of six doses: IgG4-isotype control (12 mg / kg) , BM231-99 (12 mg / kg) , BM130-97 (Herceptin: 9.72 mg / kg) , BM231-60 (12 mg / kg) , BM231-60 (4 mg / kg) , and BM231-60 (1 mg / kg) . Tumor volume was measured twice a week throughout the experiment using calipers. As depicted in Figure 14A, BM231-60 exhibited optimal anti-tumor activity at moderate doses. The tumor growth volume data for each mouse in every group are presented in Figure 14B. Analysis of the individual tumor growth curves revealed that the BM231-60 (4 mg / kg) group demonstrated significant and consistent tumor inhibition activity across all mice. In one particular mouse, the measured tumor volume at the end of the experiment was 27 mm3, which was lower than the group average. Notably, one mouse in the BM231-60 (12 mg / kg) group displayed significantly faster tumor growth compared to others in the experiment, indicating that the medium-dose group exhibited superior and more stable anti-tumor activity than the high-dose group, which was influenced by individual differences.

[0411] Simultaneously, we computed the tumor inhibition rate based on the last three measurements, as illustrated in Figure 14C. The middle dose group (4 mg / kg) of BM231-60 demonstrated an impressive tumor inhibition rate of 80.23%against HER2-MC38 tumor growth at the conclusion of the experiment. The TGI for the BM231-60 (12 mg / kg) group was 67.63%. Combined analyses confirmed that the intermediate dose of BM231-60 had optimal antitumor activity. To further elucidate the disparities among the experimental endpoints, a scatter plot depicting the tumor volume for each group on day 21 was generated, with each point representing the tumor volume of an individual mouse, as depicted in Figure 14D. According to t-test data analysis comparing the two groups, the low, medium, and high dose groups of BM231-60 exhibited statistically significant differences from the negative control group (P = 0.0466, 0.002, 0.0116, respectively) . Additionally, a significant difference was observed between the medium dose group of BM231-60 and the high dose group of BM231-99 (P = 0.011) .

[0412] Example 15: BM231 does not mediate 4 1BB signaling activation via FcγRⅡB

[0413] For agonistic antibodies, the interaction between the Fc domain and FcγR is instrumental in modulating their agonistic activity. It has been demonstrated that FcγRⅡB plays a crucial role in the cross-linking and bridging aggregation of 4-1BB, thereby enhancing its agonistic activity. However, in the case of the 4-1BB bispecific antibody, FcγRⅡB-mediated cross-linking raises concerns about off-target activation and potential systemic safety issues. Despite opting for the IgG4 antibody subtype, which exhibits the lowest affinity for Fc receptors, in the design of the BM231 bispecific antibody molecule, it is imperative to ascertain whether FcγRⅡB-dependent activation occurs. To address this, stable FcγRⅡB-CHO-K1 cell lines were generated as target cells for T cell functional assays. The effector cells used were the 4-1BB-NF-κB‐Luc2p-Jurkat cell line (Nanjing Kebai) , and each well contained a mixture of 2.5×104 effector cells and 2.5×104 target cells. The total volume in each well was 50 μL, and three replicate wells were included for each experimental group. Subsequently, 25 μL of the gradient-diluted antibody to be tested was added to each well, achieving a final antibody concentration of 100 nM. The cells were then incubated for 5 hours at 37 ℃ in a 5 %CO2 regulated incubator. Following incubation, 75 μL of assay substrate (Promega) was added to each well of the assay plate. After a 10 minute incubation at room temperature, 100 μL from each well was mixed, transferred to a 96-well white opaque plate, and subjected to chemiluminescence measurement using a microplate reader. Finally, four-parameter logarithmic curve analysis was performed using GraphPad software.

[0414] As shown in Figure 15, the positive control monoclonal antibody BM180-96 (Urelumab) not only independently activated the downstream signaling pathway of 4-1BB, but this activation was significantly enhanced under the condition of co-incubation with FcγRⅡB-CHO-K1 stable cells, and the EC50 value was increased by about 10 times. However, BM231-60, BM231-77 and BM231-99 did not activate 4-1BB signaling independently or through FcγRⅡB mediated cross-linking. BM231-60, BM231-77 and BM231-99 all have CRD4 epitope. Therefore, it is tentatively speculated that the CRD4 antigen recognition epitope is a safer epitope than CRD1. These results indicated that BM231-60 and BM231-77 did not have the risk of FcγRⅡB-mediated off-target activation.

[0415] Example 16: BM231-60 in vivo systemic activation study

[0416] Considering the widespread expression of 4-1BB in vivo, to confirm whether BM231-60 has off-target toxicity in vivo, especially whether the peripheral blood immune system is activated indiscriminately, the dose of BM231-60 was increased to 15 mg / kg, 10 mice per group. Hu4-1bb-ki mice implanted with HER2-MC38 cells were treated with high doses of the following antibodies by intraperitoneal injection every 3 days: IgG4-isotype control (15 mg / kg) , BM180-96 (Urelumab: 12.23 mg / kg) , BM231-60 (15 mg / kg) . Tumor volume was measured with calipers 2-3 times per week during the experimental period. Blood samples were collected from 5 mice in each group on Day 2, Day 9 and Day 16 for flow cytometry analysis, and serum samples were collected from another 5 mice in each group for soluble 4-1BB (s4-1BB) analysis.

[0417] To assess the potential off-target toxicity of BM231-60 in vivo, particularly its indiscriminate activation of the peripheral blood immune system, it is necessary to increase the dosage of BM231-60 to 15 mg / kg and include 10 mice per group. Hu4-1bb-ki mice, which were implanted with HER2-MC38 cells, were subjected to high-dose intraperitoneal injections of the following antibodies every 3 days: IgG4-isotype control (15 mg / kg) , BM180-96 (Urelumab: 12.23 mg / kg) , and BM231-60 (15 mg / kg) . Tumor volume was measured using calipers 2-3 times per week throughout the experimental period. Flow cytometry analysis was performed on blood samples collected from 5 mice in each group on Day 2, Day 9, and Day 16, while serum samples were collected from another 5 mice in each group for soluble 4-1BB (s4-1BB) analysis.

[0418] As depicted in Figure 16, the tumor volume statistics graph demonstrates that BM180-96 (Urelumab) exhibits superior tumor inhibition effects at a dosage of 15 mg / kg compared to BM231-60 (Figure 16A) . The statistical analysis of peripheral blood T cell percentages (mCD3+ %) on Day 2, Day 9, and Day 16 is presented in Figure 16B. Comparing the differences between groups, it was observed that BM231-60 does not significantly differ from the negative control group in terms of mCD3+ percentage on Day 2, Day 9, and Day 16. This indicates that BM231-60 does not induce extensive activation and amplification of peripheral blood T cells in the B-h4-1BB mouse model, therefore suggesting no systemic toxicity. While there is minimal difference between the initial mCD3+ percentage of BM180-96 (Urelumab) and the negative control group, a significant difference emerges on Day 9, with an approximately 11%increase in percentage compared to the negative control group and BM231-60. This trend persists until the end of the experiment (Day 16) .

[0419] Soluble 4-1BB (s4-1BB) , lacking the transmembrane domain and secreted by cells, exists in a soluble trimeric form. Although it possesses binding activity, it cannot activate downstream signaling of 4-1BB. Studies have shown that the expression of s4-1BB in lymphocytes requires strong activation. Therefore, we also quantitatively measured the level of s4-1BB in the serum of animals subjected to high-dose toxicity experiments, in order to evaluate the level of activation of BM231 in peripheral blood. A human s4-1BB ELISA kit was used for quantitative detection of s4-1BB in the serum samples. The experimental data, presented in Figure 16C, revealed significant differences between groups. The serum s4-1BB level of BM180-96 (Urelumab) was significantly higher than that of the experimental group. From Day 2 to Day 9, the s4-1BB level increased from 5453.48 pg / mL to 16555.5 pg / mL. On Day 16, a slight decrease in s4-1BB expression was observed, but it remained at a high level. This indicates that BM180-96 (Urelumab) induces strong activation of the immune system in peripheral blood. The s4-1BB level in BM231-60 serum samples is approximately one-eighth of that in BM180-96 (Urelumab) , significantly lower than the activation level of BM180-96 (Urelumab) . The limited expression of s4-1BB in peripheral blood by BM231-60 suggests that it does not induce strong overactivation. This further demonstrates that the systemic safety of BM231-60 is significantly superior to that of Urelumab.

[0420] Example 17: BM231-60 in vivo hepatotoxicity study

[0421] To assess the potential hepatotoxicity of BM231-60 at high doses, serum samples were collected on Day 2, Day 9, and Day 16 for the measurement of aspartate transaminase (AST) and alanine transaminase (ALT) , while liver tissue was subjected to immunohistochemical analysis.

[0422] As shown in Figure 17, each sample was assayed in triplicate, and each data point represents the average of three replicate wells. The data reveals that on Day 2, there were no significant changes in AST and ALT levels between the experimental and control groups. On Day 9, there was a notable increase in AST levels for BM180-96 (Urelumab) (Figure 17A) , but without statistical significance. However, as the duration of treatment extended to Day 16, both BM180-96 (Urelumab) and BM231-60 exhibited significant differences in AST levels. BM231-60 did not significantly differ from the negative control group, indicating minimal hepatotoxicity even at high doses and suggesting a certain level of safety. On Day 9, there was a significant difference in ALT levels between BM180-96 (Urelumab) and BM231-60 (Figure 17B) . Overall, the AST and ALT measurements demonstrate that BM231-60 is a safer candidate molecule compared to Urelumab.

[0423] As depicted in Figures 17C-F, under high-dose conditions (15 mg / kg) , BM180-96 (Urelumab) showed significantly higher percentages of mCD45, mCD3, mCD4, and mCD8 compared to the BM231-60 group, with significant differences observed in all comparisons. In contrast, at the same dosage, BM231-60 did not significantly differ from the negative control group (IgG4-isotype) in terms of mCD45, mCD4, and mCD8 percentages. Although there was a significant difference in mCD3 percentage between BM231-60 and the negative control group, the average difference between the two groups was only around 0.45 %.

[0424] In summary, BM231-60 demonstrates minimal promotion of inflammatory cell infiltration in liver tissue and is a safer bispecific antibody compared to Urelumab.

[0425] Example 18: Construction of BM331-01～06 (PD-L1 / 4-1BB) Bispecific Antibodies

[0426] Using the human PD-L1-targeting monoclonal antibodies Tecentriq or Imfinzi as the backbone, the bispecific antibodies BM331-01 to BM331-06 were constructed by fusing the 4-1BB-targeting nanobodies BM157-39 or BM157-94 at the C-terminus of heavy chains. These bispecific antibodies are either of the IgG1 or IgG4 subtype and include specific site mutations, as detailed in Fig. 18. The amino acid sequences of each of the BM331 bispecific antibodies (BM331-01, BM331-02, BM331-03, BM331-04, BM331-05, and BM331-06) are shown in the Sequence Listings.

[0427] Subsequently, light and heavy chain plasmids of BM331-01～06 were transfected into 293F or CHO host cells in a 2: 1 ratio. After 5 or 14 days of incubation, the supernatant is collected and purified with protein A. The purity of the resulting antibody > 95%and was used for subsequent experiments.

[0428] Example 19: Binding Affinity of BM331-01～06 to PD-L1 or 4-1BB Proteins by ELISA

[0429] ELISA assays were conducted as briefly described: h4-1BB-his or hPD-L1-his antigens were coated onto 96-well ELISA plates at 2μg / mL; bispecific antibodies BM331-01～05 were diluted from 500nM to 12 different concentrations by 3-fold serial dilution; secondary antibody (anti-human IgG Fc-HRP) was used to detect BM331-01 / 02 / 03 / 05 binding signal. The absorbance signal at 405 nm (OD405) was recorded using a microplate reader (Thermo, model not specified) , and the data were processed and analyzed using three-parameter nonlinear curve fitting with GraphPad Prism 7 software.

[0430] BM331-04 / 06 were diluted from 1000nM to 10 different concentrations by 3-fold serial dilution for human 4-1BB binding, and from 500nM to 8 different concentrations by 4-fold serial dilution for cyno 4-1BB binding and from 25nM to 7 different concentrations by 4-fold serial dilution for human PD-L1 binding. The other experimental steps are the same as described above.

[0431] As shown in Fig. 19, BM331-01～06 have similar hPD-L1 binding affinity compared to Tecentriq or Imfinzi. BM331-04 / 06 cross binding to human and cyno 4-1BB.

[0432] Example 20: Binding Affinity of BM331-01～06 to Human 4-1BB Protein by BLI

[0433] The binding of BM331 to soluble human 4-1BB were measured by BLI using an Octet-Red96 system (Pall ForteBio) in 96-well plates (Greiner) at 37℃. Purified biotinylated or his-tagged human 4-1BB were diluted in PBS with 0.02%Tween 20 (pH 7.4) and loaded onto streptavidin or Ni-NTA coated Dip-and-Read biosensor tips (Pall ForteBio) (20s) . Next, the tips were washed in the same buffer (400 s) and were placed for 500s in wells containing BM331, which were two-fold diluted from 500nM to 31.2nM or 15.6nM in PBS with 0.02%Tween 20. Then the sensor surfaces were regenerated with glycine buffer (pH 1.7) after 500s of dissociation.

[0434] The experiments included the following steps at 37℃: (1) equilibration step with assay buffer (PBS with 0.02%Tween 20, pH 7.4) for 10 min, (2) baseline step with assay buffer for 100 s, (3) loading step with 3 μg / ml biotinylated or his-tagged human 4-1BB in assay buffer for 20s, (4) baseline step with assay buffer for 400s, (5) association step with varying concentrations of BM331 in assay buffer for 500s or 800s, (6) dissociation step with assay buffer for 500s or 800s, and (7) regeneration step with glycine buffer (pH 1.7) for 5 s, repeat three times. The curves were fitted based on the 1: 1 binding kinetic model using ForteBio Data Analysis software.

[0435] As shown in Fig. 20, the equilibrium dissociation constant (KD) of BM331-01～BM331-06 was 1.47 nM to 33.2nM. The BM331-01 / 03 / 05 displayed very similar binding kinetics, while the BM331-02 / 04 / 06 displayed slightly faster on-rate (1.12× 105 M-1s-1, 6.80× 104 M-1s-1, and 5.92× 105 M-1s-1, respectively) and faster off-rate (1.94 × 10-3 s-1, 2.26 × 10-3 s-1, and 4.24 × 10-3 s-1, respectively) .

[0436] Example 21: Binding Affinity of BM331-01 / 02 to hPD-L1 or h4-1BB Overexpression Cells by FACS

[0437] BM331-01 and BM331-02 were diluted from 100nM to 10 different concentrations by 3-fold serial dilution and incubated with MC38-PD-L1-C7 cells (Cobioer) that overexpress human PD-L1 proteins. And then Goat anti-Human IgG Fc Secondary Antibody, FITC (3μL / well) was added to detect the positive binding.

[0438] To detect binding activities to FCHO-4-1BB cells (Cobioer) that overexpress human 4-1BB, BM331-01 and BM331-02 were diluted from 500nM to 10 different concentrations by 3-fold serial dilution. Finally, Goat anti-Human IgG Fc Secondary Antibody, FITC (3μL / well) was added to detect the positive binding.

[0439] As shown in Fig. 21, at the cellular level, BM331-01 and BM331-02 have similar affinities for PDL1 or 41BB.

[0440] Example 22: BM331 Bispecific Antibodies Activate 4-1BB Signaling in a PD-L1-Dependent Manner

[0441] To determine whether BM331 activates 4-1BB signal in a TAA-dependent manner, we utilized MC38-PD-L1-C7 cells (Cobioer) as target cells and 4-1BB / NFκB-Luc / Jurkat (Cobioer) as effector cells. The main experimental procedure is briefly described as follows: 2x10^4 / well of MC38-PD-L1-C7 cells or MC38 cells were seeded in a 96-well plate one day in advance. Then, 4-1BB / NFκB-Luc / Jurkat cells were added at a 1: 1 ratio, along with BM331 antibodies starting at 100 nM and serially diluted 3-fold across 11 gradients. After co-incubation at 37℃ for 6 hours, the fluorescence signal was detected using Steady-Glo reagent (Promega) . The data were analyzed by GraphPad Prism 7.

[0442] As shown in Fig. 22, BM331-01 to BM331-06 only concentration-dependently activated 4-1BB / NFκB-Luc / Jurkat cells when co-incubated with MC38 cells overexpressing human PD-L1 (MC38-PD-L1-C7) , but not with wild-type MC38 cells. This indicates that the BM331 bispecific antibody activates 4-1BB signaling in a PD-L1-dependent manner. The ability of BM331-01 to BM331-06 to activate 4-1BB signaling was similar, with EC50 values all below 1 nM. However, control antibodies IgG1, BM110-96 (Imfinzi) , or BM110-98 (Tecentriq) did not induce detectable fluorescence in the presence of either MC38 cells or MC38-PD-L1-C7 cells, demonstrating that the BM331 antibody specifically activates 4-1BB signaling (Figure 23) .

[0443] Example 23: In vivo Pharmacology Study for BM331 Bispecific Antibodies

[0444] In vivo pharmacology study was conducted by using female C57BL / 6-hPD-1  / hPD-L1  / h4-1BB mice (Biocytogen) aged 8-10 weeks to establish MC38-PD-L1 tumor model. Briefly, on the day of cell inoculation, each mouse was subcutaneously inoculated with MC38-PD-L1-C7 (Cobioer) cells (5E6 per mouse) into the right forelimb. When the mean tumor volume of each group of mice reached 100 mm3, the mice were divided into 12 groups, n=6.

[0445] All antibodies were injected i.p. twice a week for a total of 4 weeks. After the start of administration, the body weight and the tumor volume were measured three times a week. The tumor volume was calculated as follows: tumor volume (mm3) = 0.5 × long diameter of tumor × short diameter of tumor2. The data were analyzed by GraphPad Prism 7.

[0446] As shown in Fig. 24, tumor volume of each group was showed as mean±SEM. All BM331 bispecific antibodies significantly inhibited tumor growth at the low dose of 4 mg / kg or the high dose of 12 mg / kg. Specifically, on day 26, the TGI (tumor growth inhibition) for BM331-01 at 12 mg / kg was 101.05%, which was higher than the TGI of 93.69%at 4 mg / kg (Figure 24A) . The anti-tumor activities of BM331-03 and BM331-05 at both high and low doses were similar to those of BM331-01 (Figure 24B and 24D) . Furthermore, the TGIs for BM331-04 and BM331-06 at the high dose of 12 mg / kg were 102.04%and 101.57%, respectively (Figure 24C, 24E and 24F) . These bispecific antibodies exhibited stronger inhibitory effects compared to BM180-96 (anti-4-1BB antibody, Urelumab) and BM110-98 / BM110-96 anti-PD-L1 antibody, Tecentriq / Imfinzi) even at lower dosage (Figure 24F) . The body weight of mice in all groups remained stable and showed a slight increase (Figure 24G) .

[0447] Before the experiment (0h) and 24 hours after the last administration, we collected serum from the mice of each group. The result shows that after 8 dose administrations, BM331-04 exhibited AST levels similar to its molar-equivalent parent drug Tecentriq, while BM331-06 demonstrated lower AST levels compared to Urelumab and its parent drugs Imfinzi (Figure 25) . Additionally, pathology score of the liver indicated that the BM331-04 group had less necrosis and bleeding than the Urelumab group. The BM331-06 group showed lower scores for edema, necrosis, bleeding, and inflammatory infiltration compared to the Urelumab group, indicating that both BM331-04 and BM331-06 have better safety profiles than Urelumab (Figure 25) .

Claims

1.A single domain antibody specifically binding to 4-1BB, wherein the single domain antibody comprises CDR1, CDR2, and CDR3 that are same with respective CDR1, CDR2, and CDR3 of an anti-4-1BB single domain antibody having an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO. 1 to 13.2.The single domain antibody of claim 1, wherein the CDR1, CDR2, and CDR3 are defined according to a CDR definition scheme selected from a group consisting of IMGT, Kabat, Contact, Chothia, Martin, PyIgClassify, and any combination thereof.3.The single domain antibody of claim 1, wherein the CDR1, CDR2, and CDR3 according to IMGT definition scheme have amino acid sequences as shown in(a) SEQ ID NO: 35, 36, and 37, respectively;(b) SEQ ID NO: 38, 39, and 40, respectively;(c) SEQ ID NO: 41, 42, and 43, respectively;(d) SEQ ID NO: 44, 42, and 45, respectively;(e) SEQ ID NO: 46, 42, and 45, respectively;(f) SEQ ID NO: 47, 48, and 49, respectively;(g) SEQ ID NO: 41, 50, and 51, respectively;(h) SEQ ID NO: 52, 42, and 53, respectively;(i) SEQ ID NO: 54, 55, and 56, respectively;(j) SEQ ID NO: 57, 48, and 58, respectively;(k) SEQ ID NO: 59, 48, and 60, respectively; or(l) SEQ ID NO: 61, 48, and 62, respectively.4.The single domain antibody of claim 1, wherein the single domain antibody comprises an amino acid sequence selected from a group consisting of SEQ ID NO: 1 to 13, and an amino acid sequence having at least 80%identity to each thereof.5.The single domain antibody according to any one of claims 1 to 4, wherein the single domain antibody is a humanized antibody, a human antibody, a chimeric antibody, or a camelized antibody.6.A heavy chain antibody comprising a single domain antibody according to any one of claims 1 to 5, and an Fc portion linked to the single domain antibody.7.A bispecific antibody comprising a single domain antibody binding specifically to 4-1BB according to any one of claims 1 to 5, and a second binding domain specifically binding to a second target selected from a tumor associated antigen and a tumor specific antigen.8.The bispecific antibody according to claim 7, wherein the second target is selected from a group consisting of HER2, 5T4, PSMA, BCMA, FGFR, CD20, CD33, CD19, CD22, CD123, CD30, GPC-3, CEA, EGFR1, EGFR2, EGFR3, TGF-β, ROR1, PD-L1, Claudin18.2, EpCAM, GD2, MSLN, EGFR, MUC1, MUC2, EGFRVIII, CD38, Trop-2, c-MET, Nectin-4, CD79b, CCK4, GPA33, HLA-A2, CLEC12A, p-cadherin, TDO2, MART-1, Pmel 17, MAGE-1, AFP, CA125, TRP-1, TRP-2, NY-ESO, PSA, CDK4, BCA225, CA 125, MG7-Ag, NY-CO-1, RCAS 1, SDCCAG16, TAAL6 and TAG72.9.The bispecific antibody according to claim 7 or 8, wherein the single domain antibody is linked to a complete IgG antibody, optionally via a peptide linker, such as a peptide linker consists of glycine and serine residues.10.The bispecific antibody according to claim 9, wherein the single domain antibody is linked to the C terminus of a heavy chain, the C terminus of a light chain, or the N terminus of a heavy chain, of the complete IgG antibody, preferably the to the C terminus of a heavy chain of the complete IgG antibody.11.The bispecific antibody according to claim 10, wherein the complete IgG antibody is an anti-Her2 antibody.12.The bispecific antibody according to claim 11, wherein the anti-Her2 antibody comprises(a) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;(b) L234A and L235A substitutions, and optionally an N297A substitution; preferably, the anti-Her2 antibody is an IgG4 antibody comprising a S228P substitution; or(c) a heavy chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 83, and a light chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 82.13.The bispecific antibody according to claim 11 or 12, wherein the bispecific antibody comprises:(a) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;(b) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;(c) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;(d) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;(e) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;(f) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;(g) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;(h) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;(i) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;(j) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;(k) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14;(l) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14; or(m) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.14.The bispecific antibody according to claim 10, wherein the complete IgG antibody is a complete anti-PD-L1 antibody; preferably, the anti-PD-L1 antibody comprises:(a) a heavy chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 69, and a light chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 70; or(b) a heavy chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 74, and a light chain variable region having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 75;optionally, the complete anti-PD-L1 antibody is a IgG1 or IgG4 antibody; preferably, the IgG1 antibody comprises a substitution at a position selected from a group consisting of N297, L234, L235 and P331; more preferably, the IgG1 antibody comprises a substitution selected from a group consisting of N297A, L234A, L234F, L235A, L235E and P331S, for example the IgG1 antibody comprises a N297A substitution, L234A and L235A substitutions, or L234F, L235E and P331S substitutions; preferably, the IgG4 antibody comprises a S228P substitution;preferably, the complete anti-PD-L1 antibody comprises(a) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 65, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68;(b) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 66, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68;(c) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 67, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68;(d) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 71, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 73; or(e) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 72, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 73.15.The bispecific antibody according to claim 14, wherein the bispecific antibody comprises:(a) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68;(b) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 77, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68;(c) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 78, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68;(d) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 79, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68;(e) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 80, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 73; or(f) a heavy chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 81, and a light chain having an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 73.16.An immunoconjugate, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof, comprising a single domain antibody according to any of claims 1 to 5, a heavy chain antibody according to claim 6, or a bispecific antibody according to any of claims 7 to 15; and an active moiety; preferably, the active moiety is selected from a group consisting of a toxin, a peptide tag, sortag, a radionuclide, a near-infrared fluorochromes, and a nanoparticle.17.A pharmaceutical composition comprising a single domain antibody according to any of claims 1 to 5, a heavy chain antibody according to claim 6, a bispecific antibody according to any of claims 7 to 15, or an immunoconjugate according to claim 16; and a pharmaceutically acceptable carrier.18.A nucleic acid molecule encoding a single domain antibody according to any of claims 1 to 5, a heavy chain antibody according to claim 6, or a bispecific antibody according to any of claims 7 to 15, or an immunoconjugate according to claim 16.19.An expression vector comprising the nucleic acid molecule according to claim 18.20.A non-human host cell comprising the expression vector according to claim 19.21.Use of a single domain antibody according to any of claims 1 to 5, a heavy chain antibody according to claim 6, a bispecific antibody according to any of claims 7 to 15, an immunoconjugate according to claim 16, or a pharmaceutical composition of claim 17 in the preparation of a medicament for treatment prevention or diagnosis of a cancer.22.A polypeptide comprising a single domain antibody according to any of claims 1 to 5 or a heavy chain antibody according to claim 6; and one or more amino acid residues covalently linked to the N terminus, C terminus or anywhere therebetween of the single domain antibody or the heavy chain antibody.

Images