Antimicrobial peptides

Abstract

Disclosed herein are novel antimicrobial peptides with useful, improved, or superior properties such as antimicrobial activity, desirable levels of hemolytic activity, and therapeutic index against a broad range of microorganisms including gram-negative and gram-positive bacteria and other organisms having a cellular or structural component of a lipid bilayer membrane. Also provided are methods of making and using such peptides to control microbial growth and in pharmaceutical compositions for the treatment of infections caused by such microorganisms.

Description

ANTIMICROBIAL PEPTIDESFIELD

[0001] The invention relates to the general field of antimicrobial peptides and their use in killing or inhibiting the growth of microbes and treating microbial infections.

[0002] REFERENCE TO AN ELECTRONIC SEQUENCE LISTING

[0003] The contents of the electronic sequence listing (235102000240SEQLIST. xml; Size: 51, 982 bytes; and Date of Creation: April 16, 2024) is herein incorporated by reference in its entirety.BACKGROUND

[0004] In recent decades, the frequent and irregular use of antibiotics has made bacterial resistance a public safety crisis. The emergence of multidrug-resistant (MDR) pathogens has dealt a huge blow to the viability of antibiotic use and poses a major threat to human health. MDR organisms are becoming more prevalent and even displaying extra-drug resistance (XDR) and pan-drug resistance (PDR) . As a result, community-derived infections and hospital-acquired infections have become notably more challenging to manage. According to the latest survey by the U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) , antibiotic resistance causes millions of people around the world to become ill each year, and it is estimated that by 2050, the number of deaths caused by antibiotic resistance will reach tens of millions. Therefore, the development of new antibacterial drugs has become a top priority.

[0005] Antimicrobial peptides (AMPs) are the earliest immune active molecules produced by organisms that evolved to adapt to the environment and survive. They are an important part of the natural immune system and play an extremely important role in the host's immune defense against pathogens; therefore, they are known as "natural antibacterial agents" . Unmodified, these peptides are potent, broad-spectrum antibiotics which demonstrate potential as novel therapeutic agents. AMPs have been demonstrated to kill Gram-negative and Gram-positive bacteria (including strains that are resistant to conventional antibiotics) , mycobacteria (including Mycobacterium tuberculosis) , enveloped viruses, and fungi.

[0006] Naturally occurring AMPs are typically short peptides, generally between 12 and 50 amino acids. These peptides often include two or more positively charged residues provided by arginine, lysine or histidine (in acidic environments) and frequently a large proportion (generally >50%) of hydrophobic residues (see, e.g., Papagianni et al. (2003) Biotechnol Adv 21: 465;  Sitaram and Nagaraj (2002) Curr Pharm Des 8: 727; Durr et al. (2006) Biochim. Biophys. Acta 1758: 1408-1425) .

[0007] AMPs have shown unprecedented advantages as promising biomaterials against multidrug-resistant bacteria. Compared to traditional antibiotics, the amphiphilic structure of AMPs can selectively bind to and penetrate cell membranes, thereby destroying the integrity of the cell membrane and killing the pathogen. Without wishing to be bound by any particular theory, it is believed that the bacterial cell membrane is the target of AMPs. Therefore, precisely because of the low likelihood of variation in the cell membrane structure, the probability of sensitive bacteria developing resistance is minimal.

[0008] Currently, AMPs are considered ideal candidates to replace antibiotics due to their strong antibacterial potential and unique mechanism of action. So far, more than 3000 AMPs have been recorded in the Antimicrobial Peptide Database (APD) , covering functions such as antibacterial, antifungal, antiviral, and antiparasitic.

[0009] Despite the advantages, organism-derived AMPs are organism-specific, so it is difficult to directly apply them to the human body as such AMPs might be highly toxic. For this reason, many AMPs cannot be used as drugs. In addition, the structure of linear AMPs is unstable and has proteolytic instability, making it difficult for clinical transformation and application.SUMMARY

[0010] In some embodiments, provided herein is an antimicrobial peptide comprising an 11-amino acid portion comprising 5 to 6 hydrophilic residues and 6 to 5 hydrophobic residues, wherein the antimicrobial peptide has an ellipticity of 60%to 100%relative to that of a peptide having the sequence LysD-LysD-LeuD-LeuD-LysD-LeuD-LeuD-LysD-LysD-LeuD-LeuD (SEQ ID NO: 13) , wherein the antimicrobial peptide does not comprise Lys-Lys-Leu-Leu-Phe-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys (SEQ ID NO: 14) . In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises a sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

[0011] In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises a variant of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the variant peptide comprises: 1) a substitution of a lysine (Lys) residue with an arginine (Arg) , a histidine (His) , an ornithine (Orn) , a diaminobutyric acid (Dab) , or a diaminopropionic acid (Dap) , and / or 2) a substitution of a leucine (Leu) residue with an alanine (Ala) , an isoleucine (Ile) , a phenylalanine (Phe) , a tryptophan (Trp) or a valine (Val) . In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises a substitution of a Lys residue with an Arg, a His, an Orn, a Dab or a Dap. In some embodiments, the antimicrobial peptide  comprises two or more substitutions of Lys residues with Arg, His, Dab, Dap, or Orn. In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises substitutions of all Lys residues of SEQ ID NO: 1 with Arg, His, Dab, Dap, or Orn. In some embodiments, all Lys residues of SEQ ID NO: 1 are substituted with Dab.

[0012] In any of the embodiments herein, the antimicrobial peptide can comprise a substitution of a Leu residue with an Ala, an Ile, a Phe, a Trp or a Val. In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises two or more substitutions of Leu residues with Ala, Phe, Ile, Trp or Val. In some embodiments, the Leu residues at positions 10 and 11 of SEQ ID NO: 1 are substituted with Phe.

[0013] In any of the embodiments herein, the antimicrobial peptide can comprise substitutions of all Lys residues of SEQ ID NO: 1 with Dab and substitutions of the Leu residues at positions 10 and 11 of SEQ ID NO: 1 with Phe. In any of the embodiments herein, the Leu residue at position 7 of SEQ ID NO: 1 can be substituted with Val. In any of the embodiments herein, all Lys residues of SEQ ID NO: 1 can be substituted with Dab, the Leu residues at positions 10 and 11 of SEQ ID NO: 1 can be substituted with Phe, and the Leu residue at position 7 of SEQ ID NO: 1 can be substituted with Val.

[0014] In any of the embodiments herein, the antimicrobial peptide can comprise substitution of two residues with each other.

[0015] In any of the embodiments herein, the antimicrobial peptide can comprise a sequence set forth in SEQ ID NO: 7.

[0016] In any of the embodiments herein, the antimicrobial peptide can comprise a sequence set forth in SEQ ID NO: 9.

[0017] In any of the embodiments herein, the antimicrobial peptide can have a length of 11 amino acids.

[0018] In any of the embodiments herein, the antimicrobial peptide can have a net charge of +5 or +6.

[0019] In any of the embodiments herein, the antimicrobial peptide can comprise a blocked N-terminus. In some embodiments, the N-terminus of the antimicrobial peptide is blocked through acylation, alkylation, arylation, esterification, or fatty acidation. In any of the embodiments herein, the N-terminus of the antimicrobial peptide can be blocked by an acetyl group.

[0020] In any of the embodiments herein, the antimicrobial peptide can comprise a free N-terminus.

[0021] In any of the embodiments herein, the antimicrobial peptide can comprise a blocked C-terminus. In some embodiments, the C-terminus is blocked through acylation, alkylation, arylation, esterification, fatty acidation, or reduction. In any of the embodiments herein, the C-terminus can be blocked by an NH2 group.

[0022] In any of the embodiments herein, the antimicrobial peptide can comprise a free C-terminus.

[0023] In any of the embodiments herein, at least one of the amino acids in the antimicrobial peptide can be a D-amino acid.

[0024] In some embodiments, all amino acids in the antimicrobial peptide are D-amino acids.

[0025] In any of the embodiments herein, the antimicrobial peptide can comprise a sequence set forth in SEQ ID NO: 16.

[0026] In any of the embodiments herein, the antimicrobial peptide can comprise a sequence set forth in SEQ ID NO: 17.

[0027] In any of the embodiments herein, the antimicrobial peptide can comprise a sequence set forth in SEQ ID NO: 18.

[0028] In any of the embodiments herein, at least one of the amino acids in the antimicrobial peptide can be a L-amino acid.

[0029] In some embodiments, no more than 30%of the amino acids in the antimicrobial peptide are L-amino acids.

[0030] In some embodiments, all amino acids in the antimicrobial peptide are L-amino acids.

[0031] In any of the embodiments herein, the antimicrobial peptide can adopt an α-helical secondary structure in a hydrophobic environment and a random coil structure in an aqueous medium.

[0032] In some embodiments, provided herein is a method of killing a microbial organism, comprising contacting the microbial organism with the antimicrobial peptide of any of the embodiments disclosed herein.

[0033] In some embodiments, provided herein is a method of treating a microbial infection in an individual, comprising contacting the individual with an effective amount of the antimicrobial peptide of any of the embodiments disclosed herein.

[0034] In some embodiments, provided herein is use of the antimicrobial peptide of any of the embodiments disclosed herein for the manufacture of a medicament for treating a microbial infection. In any of the embodiments herein, the infection can be caused by a microbial organism  selected from the group consisting of: methicillin-resistant Staphylococcus aureus, methicillin-sensitive Staphylococcus aureus, erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes, erythromycin-sensitive Streptococcus pyogenes, imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa, and imipenem-sensitive Pseudomonas aeruginosa. In any of the embodiments herein, the infection can be selected from the group consisting of: primary skin infections caused by drug-resistant bacteria, secondary skin infections, burn wound infections, and bedsore infections.

[0035] In some embodiments, provided herein is a method of making the antimicrobial peptide of any of the embodiments herein, comprising synthesizing the antimicrobial peptide using solid-phase chemical synthesis.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0036] FIGs. 1A-1D show the peptides set forth in SEQ ID NO: 14 (peptide PL-33) , SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, and SEQ ID NO: 18 and their helical wheel and helical net patterns. FIG. 1A shows the sequence of SEQ ID NO: 14 and its helical wheel and helical net pattern. FIG. 1B shows the sequence of SEQ ID NO: 16 and its helical wheel and helical net pattern. FIG. 1C shows the sequence of SEQ ID NO: 17 and its helical wheel and helical net pattern. FIG. 1D shows the sequence of SEQ ID NO: 18 and its helical wheel and helical net pattern. The amino acids that are shaded represent hydrophobic amino acids, and are located on the non-polar / hydrophobic face of the helix. The amino acids that are unshaded represent hydrophilic amino acids, which are found on the polar / hydrophilic face. Ac refers to N-terminal acetylation, and NH2 refers to C-terminal amidation.

[0037] FIG. 2 shows the ellipticity of the peptides set forth in SEQ ID NOs: 16, 17, and 18 measured at different wavelengths.

[0038] FIG. 3 shows the retention time curves of the peptides set forth in SEQ ID NOs: 16, 17, and 18 in RP-HPLC.DETAILED DESCRIPTION

[0039] The present application provides novel antimicrobial peptides (AMPs) and uses thereof. The AMPs show low toxicity to human cells while retaining very strong antimicrobial activity. The AMPs provide a solution to the increasingly serious problem of drug resistance in bacteria and fungi and stubborn infections in patients. The AMPs can be applied to various diseases related to stubborn infections and common infections, and can be used as an excellent substitute drug or auxiliary drug for existing antibiotics.

[0040] Generally, only L-amino acids are the isomers found throughout natural peptides and proteins; D-amino acids are the isomeric forms rarely seen in natural peptides / proteins except in some bacterial cell walls. Without wishing to be bound by a particular theory, it is believed that by substituting different D-amino acids into the center of the hydrophobic face of an amphipathic α-helical peptide, disruption of the alpha-helical structure can occur. Different D-amino acids can disrupt the α-helical structure to different degrees, while the destabilized structure can still be induced to fold into an α-helix in a hydrophobic medium.

[0041] In some embodiments, the AMPs described herein adopt a secondary structure in a hydrophobic environment and a random structure in water. In other words, many of these peptides are unstructured in free solution, and fold into their final configuration upon partitioning into biological membranes. This allows the AMP to readily permeabilize through a cell membrane.

[0042] The ability to associate with membranes is a definitive feature of AMPs, although membrane permeabilization is not necessary. In some embodiments, the AMPs kill bacteria by disrupting the bacterial cell membrane. In some embodiments, the AMPs kill bacteria by interfering with the metabolism of the bacteria. In some embodiments, the AMPs kill the bacteria by targeting a cytoplasmic component within the bacteria. In some embodiments, the AMPs process two or more of these properties. Thus, for example, in some embodiments, the AMPs disrupt the bacterial cell membrane and interfere with the metabolism of the bacteria. In some embodiments, the AMPs disrupt the bacterial cell membrane and target a cytoplasmic component within the bacteria. In some embodiments, the AMPs interfere with the metabolism of the bacteria and target a cytoplasmic component within the bacteria. In some embodiments, the AMPs disrupts the bacterial cell membrane, interferes with the metabolism of the bacteria, and targets a cytoplasmic component within the bacteria.

[0043] Without wishing to be bound by a particular theory, from numerous structure / activity studies on both natural and synthetic AMPs, it is believed that a number of factors are crucial for their antibacterial activity, including a suitable charge number at a neutral pH value, the presence of both hydrophobic residues and hydrophilic residues, an amphipathic nature with the hydrophobic residues and hydrophilic residues separated when forming a secondary structure, and inducible or pre-formed secondary structures (e.g., α-helices or β-sheets) . The AMPs described herein contain a specific combination of amino acids that carefully balances these crucial factors, thereby producing AMPs with high antimicrobial activities and low toxicities.

[0044] In some embodiments, the AMP has a secondary structure (such as an α-helical structure) in a hydrophobic environment. In some embodiments, the AMP adopts an α-helical structure in 50%trifluoroethanol (a simulation of the hydrophobic environment of cell membranes) , which can be detected, for example, by circular dichroism (CD) .

[0045] In some embodiments, the AMP has very little (e.g., undetectable using the traditional CD method) α-helical structure in a hydrophilic environment (such as 0.01 M PBS buffer) , and optionally forms an α-helix structure in 50%trifluoroethanol. Such structural features may be important for the mechanism of antimicrobial peptide activity, such as a) reduced ability to form aggregates in a hydrophilic environment, i.e., self-associating ability; b) increased ability to pass through the cell wall to reach the cell membrane of the microbe. In addition, the destruction of the α-helical structure in a hydrophilic environment will not affect the electrostatic attraction between AMPs (positively charged) and the cell wall of microorganisms (negatively charged) , whereas the lack of structure can reduce the affinity of the peptide for the cell wall surface (e.g., via hydrophobic interactions between hydrophobic groups in the cell wall and the hydrophobic surface of the peptides) , allowing AMPs to pass through the cell wall more easily and enter the interface region of the membrane where the peptide is parallel to the surface of the membrane. Here, the AMPs can be induced into an α-helical structure by the hydrophobic environment of the cell membrane. Without being bound by any theory, the nonpolar face of the AMP can interact with the hydrophobic part of the cell membrane, while the polar groups and positively charged groups on the polar face can interact with the negatively charged groups of the phospholipids on the cell membrane.

[0046] When the AMP has an α-helical structure, the AMP molecule is positively charged and amphipathic. For example, α-helical AMPs have a nonpolar or hydrophobic face on one side of the molecule and a polar or positively charged face on the other side of the molecule. Thus, in some embodiments, the AMP described herein is amphipathic in a hydrophobic environment.

[0047] It is well accepted that the amphipathicity of AMPs is beneficial for their mechanism of action, since the positively charged polar face will help the molecules reach the bio-membrane through electrostatic interaction with the negatively charged head groups of phospholipids, and then the nonpolar face of the peptides will allow insertion into the membrane through hydrophobic interactions, causing increased permeability and loss of barrier function of target cells. Thus, peptide self-association (i.e., the ability to dimerize) in an aqueous solution is a very important parameter to measure antimicrobial activity and hemolytic activity. If the self-association ability  of a peptide in aqueous media is too strong (forming dimers and burying the non-polar face) , it could decrease the ability of the peptide to dissociate and penetrate the biomembrane and to kill microbes.

[0048] The present application in one aspect provides an AMP comprising an 11-amino acid portion comprising 5 to 6 hydrophilic residues and 6 to 5 hydrophobic residues, wherein the AMP has an ellipticity of 60%to 100%relative to that of a peptide having the sequence LysD-LysD-LeuD-LeuD-LysD-LeuD-LeuD-LysD-LysD-LeuD-LeuD (SEQ ID NO: 13, hereafter amino acid with a subscript D represents D-amino acid) , wherein the AMP does not comprise Lys-Lys-Leu-Leu-Phe-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys (SEQ ID NO: 14) .

[0049] In another aspect, there is provided a method of using the antimicrobial peptide described herein for killing microbial organisms and / or treating infectious diseases.

[0050] In another aspect, there is provided a method of making the antimicrobial peptides described herein.

[0051] All publications, including patent documents, scientific articles and databases, referred to in this application are incorporated by reference in their entirety for all purposes to the same extent as if each individual publication were individually incorporated by reference. If a definition set forth herein is contrary to or otherwise inconsistent with a definition set forth in the patents, applications, published applications and other publications that are herein incorporated by reference, the definition set forth herein prevails over the definition that is incorporated herein by reference.

[0052] I. ANTIMICROBIAL PEPTIDES

[0053] The present application provides antimicrobial peptides with enhanced antimicrobial activity and reduced toxicity. In one aspect, provided herein is an antimicrobial peptide comprising an 11-amino acid portion comprising 5 to 6 hydrophilic residues and 6 to 5 hydrophobic residues, wherein the antimicrobial peptide has an ellipticity of 60%to 100%relative to that of a peptide having the sequence LysD-LysD-LeuD-LeuD-LysD-LeuD-LeuD-LysD-LysD-LeuD-LeuD (SEQ ID NO: 13) , wherein the antimicrobial peptide does not comprise Lys-Lys-Leu-Leu-Phe-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys (SEQ ID NO: 14) .

[0054] The antimicrobial peptide of the present invention has an ellipticity of 60%to 100%relative to that of a peptide having the sequence LysD-LysD-LeuD-LeuD-LysD-LeuD-LeuD-LysD- LysD-LeuD-LeuD (SEQ ID NO: 13) . The ellipticity of a peptide can be measured by methods known in the art, such as circular dichroism (CD) spectroscopy.

[0055] In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises a variant of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the variant peptide comprises a substitution of a hydrophilic residue with a hydrophilic residue and / or a substitution of a hydrophobic residue with a hydrophobic residue. Examples of hydrophilic residues include but are not limited to: arginine (Arg) , histidine (His) , lysine (Lys) , ornithine (Orn) , diaminobutyric acid (Dab) , diaminopropionic acid (Dap) , asparagine (Asn) , glutamine (Gln) , and cysteine (Cys) . Examples of hydrophobic residues include but are not limited to: leucine (Leu) , alanine (Ala) , isoleucine (Ile) , phenylalanine (Phe) , tryptophan, valine (Val) , glysine (Gly) , and proline (Pro) . The variant peptide also comprises 5 to 6 hydrophilic residues and 6 to 5 hydrophobic residues, and has an ellipticity of 60%to 100%relative to that of a peptide having the sequence LysD-LysD-LeuD-LeuD-LysD-LeuD-LeuD-LysD-LysD-LeuD-LeuD (SEQ ID NO: 13) .

[0056] In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises a variant of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the variant peptide comprises: 1) a substitution of a lysine (Lys) residue with an arginine (Arg) , a histidine (His) , an ornithine (Orn) , a diaminobutyric acid (Dab) , a diaminopropionic acid (Dap) , and / or 2) a substitution of a leucine (Leu) residue with an alanine (Ala) , an isoleucine (Ile) , a phenylalanine (Phe) , a tryptophan (Trp) or a valine (Val) . In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises a sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

[0057] In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises a variant of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the variant peptide comprises a substitution of a Lys residue with an arginine (Arg) , a histidine (His) , an ornithine (Orn) , a diaminobutyric acid (Dab) , or a diaminopropionic acid (Dap) . For example, the variant peptide may comprise a sequence set for in SEQ ID NO: 3. In some embodiments, the variant peptide comprises two or more substitutions of lysine residues with Arg, His, Dab, Dap, or Orn. In some embodiments, all lysine residues are substituted with Dab. For example, the variant peptide may comprise a sequence set for in SEQ ID NO: 2.

[0058] In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises a variant of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the variant peptide comprises a substitution of a Leu residue with an alanine (Ala) , an isoleucine (Ile) , a phenylalanine (Phe) , a tryptophan (Trp) or a valine (Val) . For example, the variant peptide may comprise a sequence set forth in SEQ ID NO: 4. In some embodiments, the variant peptide comprises two or more substitutions of Leu residues  with Ala, Phe, Ile, Trp or Val. For example, the variant peptide may comprise a sequence set forth in SEQ ID NO: 6.

[0059] In some embodiments, all Lys residues of SEQ ID NO: 1 are substituted with Dab and the Leu residues at positions 10 and 11 of SEQ ID NO: 1 are substituted with Phe. In some embodiments, all Lys residues of SEQ ID NO: 1 are substituted with Dab, the Leu residues at positions 10 and 11 of SEQ ID NO: 1 are substituted with Phe, and the Leu residue at position 7 of SEQ ID NO: 1 is substituted with Val.

[0060] In some embodiments, the variant peptide comprises the substitution of two residues with each other. For instance, the variant peptide may comprise a substitution of a residue at position x with a residue at position y and a substitution of the residue at position y with the residue at position x, where x≠y. For example, a variant peptide may comprise a substitution of the Leu at position 4 with the Lys at position 5 and a substitution of the Lys at position 5 with the Leu at position 4 of SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises a variant of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the variant peptide comprises: 1) a substitution of a lysine (Lys) residue with an arginine (Arg) , a histidine (His) , an ornithine (Orn) , a diaminobutyric acid (Dab) , a diaminopropionic acid (Dap) , and / or 2) a substitution of a leucine (Leu) residue with an alanine (Ala) , an isoleucine (Ile) , a phenylalanine (Phe) , a tryptophan (Trp) or a valine (Val) , and 3) substitution of any two residues with each other.

[0061] In a particular embodiment, the antimicrobial peptide comprises a variant of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the variant peptide comprises substitution of all Lys residues with Dab, substitution of Leu residues at positions 10 and 11 with Phe, substitution of the residues at position 5 and position 11 with each other, and substitution of the residues at position 9 and position 10 with each other. In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.

[0062] In a particular embodiment, the antimicrobial peptide comprises a variant of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the variant peptide comprises substitution of all Lys residues with Dab, substitution of Leu residues at positions 10 and 11 with Phe, substitution of Leu residues at position 7 and Val, substitution of the residues at position 5 and position 11 with each other, and substitution of the residues at position 9 and position 10 with each other. In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9.

[0063] In some embodiments, the antimicrobial peptide has a length of 11 amino acids, and comprises 5 hydrophilic amino acids and 6 hydrophobic amino acids. In some embodiments, the antimicrobial peptide has a length of 11 amino acids, and comprises 6 hydrophilic amino acids and 5 hydrophobic amino acids.

[0064] In some embodiments, the antimicrobial peptide has a net positive charge. In some embodiments, the antimicrobial peptide has a net +5 charge. In some embodiments, the antimicrobial peptide has a net +6 charge. Without wishing to be bound by any theory, antimicrobial peptides can cause bacterial cell lysis by direct cell-surface damage via electrostatic interactions between the cationic side chains of the peptide and the negatively charged cell surface.

[0065] In some embodiments, the antimicrobial peptide has a free N-terminus. In some embodiments, the antimicrobial peptide can comprise a blocked N-terminus. N-terminal can be blocked through acylation, alkylation (such as methylation, PEG, biotinylation and fluorescence reagent) , arylation, esterification, and fatty acidation etc. Suitable blocking groups include, but are not limited to, an acetyl group, an alkylation group, an arylation group, a fatty acidation group etc.

[0066] In some embodiments, the antimicrobial peptide has a free C-terminus. In some embodiments, the antimicrobial peptide can comprise a blocked C-terminus. C-terminal can be blocked through acylation, alkylation (such as methylation, PEG, biotinylation and fluorescence reagent) , arylation, esterification, fatty acidation, and reduction and etc. Suitable blocking groups include, but are not limited to, an NH2 group, an alkylation group, an arylation group, a fatty acidation group etc.

[0067] In some embodiments, at least one of the amino acids in the antimicrobial peptide is a D-amino acid. In some embodiments, at least any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%amino acids in the antimicrobial peptide is a D-amino acid. In some embodiments, all amino acids in the antimicrobial peptide are D-amino acids.

[0068] One or more D-amino acids of the antimicrobial peptide could be replaced with one or more corresponding amino acids in the L configuration. For instance, a DabD could be replaced with a DabL. Therefore, the antimicrobial peptide could comprise a mix of D-amino acids and L-amino acids. The position of the amino acid that is being replaced with an L-amino acid might have an impact on the secondary structure of the peptide. Without wishing to be bound by any theory, an amino acid towards the center of the peptide being replace with an L-amino acid might  have a more significant impact on the secondary structure than an amino acid towards either end of the peptide being replace with an L-amino acid.

[0069] In some embodiments, at least one of the amino acids in the antimicrobial peptide is an L-amino acid. In some embodiments, at least any of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%amino acids in the antimicrobial peptide is an L-amino acid. In some embodiments, all amino acids in the antimicrobial peptide are L-amino acids.

[0070] In some embodiments, the antimicrobial peptide disclosed herein comprises a variant of an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the variant peptide comprises a substitution of a Lys residue with an arginine (Arg) , a histidine (His) , an ornithine (Orn) , a diaminobutyric acid (Dab) , a diaminopropionic acid (Dap) , and / or 2) a substitution of a leucine (Leu) residue with an alanine (Ala) , an isoleucine (Ile) , a phenylalanine (Phe) , a tryptophan (Trp) , or a valine (Val) . In some embodiments, the variant peptide disclosed herein comprises substitution of one or more LysD residues with ArgL, ArgD, HisL, HisD, OrnL, OrnD, DabL, DabD, DapL, or DapD; and / or substitution of one or more LeuD residues with AlaL, AlaD, IleL, IleD, PheL, PheD, TrpL, TrpD, ValL, or ValD.

[0071] In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu) . In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16 (Ac-LysD-LysD-LeuD-LeuD-LysD-LysD-LeuD-LysD-LysD-LeuD-LeuD-NH2) , wherein the subscript D represents D-amino acid, Ac represents N-terminal acetylation, and NH2 represents C-terminal amidation.

[0072] In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 (Dab-Dab-Leu-Leu-Phe-Dab-Leu-Dab-Phe-Dab-Dab) . In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17 (Ac-DabD-DabD-LeuD-LeuD-PheD-DabD-LeuD-DabD-PheD-DabD-DabD-NH2) , wherein the subscript D represents D-amino acid, Ac represents N-terminal acetylation, and NH2 represents C-terminal amidation.

[0073] In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 (Dab-Dab-Leu-Leu-Phe-Dab-Val-Dab-Phe-Dab-Dab) . In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18 (Ac-DabD-DabD-LeuD-LeuD-PheD-DabD-ValD-DabD-PheD-DabD-DabD-NH2) , wherein the  subscript D represents D-amino acid, Ac represents N-terminal acetylation, and NH2 represents C-terminal amidation.

[0074] Table 1 shows the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 7, and 9.

[0075] In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7. In some embodiments, the microbial peptide comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9. In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16. In some embodiments, the antimicrobial peptide comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17. In some embodiments, the microbial peptide comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18. In some embodiments, the microbial peptide comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the microbial peptide comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. In some embodiments, the microbial peptide comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. In some embodiments, the microbial peptide comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5. In some embodiments, the microbial peptide comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6. In some embodiments, the microbial peptide comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. In some embodiments, the microbial peptide comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10. In some embodiments, the microbial peptide comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11. In some embodiments, the microbial peptide comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12. In some embodiments, the microbial peptide comprises an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13.

[0076] Table 1. Sequences of examplary antimicrobial peptides.

[0077] In some embodiments, the antimicrobial peptide of the present invention shows a minimum inhibitory concentration (MIC) against one or more of Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, and Pseudomonas aeruginosa that is lower than or equal to the MIC of a reference peptide (such as SEQ ID NO: 14) , indicating antimicrobial activity that is higher than or equal to the reference peptide. In some embodiments, the antimicrobial peptide of  the present invention shows hemolytic activity (MHC) that is higher than or equal to the MHC of a reference peptide (such as SEQ ID NO: 14) , indicating increased or the same safety compared to the reference peptide.

[0078] In an exemplary embodiment, provided herein is the use of an antimicrobial peptide in the preparation of a pharmaceutical composition for treating microbial infection.

[0079] The antimicrobial peptides disclosed herein and their compositions can be prepared as any medically available biological carrier or preparation form and administered to patients with infectious diseases.

[0080] In an exemplary embodiment, provided herein is a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition comprises an effective amount of the antimicrobial peptides disclosed herein, and a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent. In certain embodiments, pharmaceutically acceptable carriers include those approved by a regulatory agency of the Federal or a state government or listed in the U.S. Pharmacopeia or other generally recognized pharmacopeia for use in / on animals, and more particularly in / on humans. A carrier refers to, for example, a diluent, adjuvant, excipient, auxiliary agent or vehicle with which an active agent of the present invention is administered.

[0081] II. METHOD OF KILLING MICROBIAL ORGANISMS

[0082] In some aspects, provided herein is a method of killing a microbial organism. In some embodiments, the method of killing a microbial organism comprises contacting the microbial organism with the antimicrobial peptide or the pharmaceutical composition disclosed herein. The microbial organism can be an extracellular microbial organism or an intracellular microbial organism. The contact can occur in a subject comprising a microbial organism. Alternatively, the method of killing a microbial organism can be an in vitro method. In some embodiments, the growth or proliferation of a microbial organism is inhibited after contacting antimicrobial peptide or the pharmaceutical composition disclosed herein.

[0083] In another aspect, the present invention may be used as a food preservative or in treating food products to control, reduce, or eliminate potential pathogens or contaminants. A peptide of the invention may be used as a disinfectant, for use in or with any product that must remain microbe-free or be within certain tolerances. In an embodiment, treatment with a peptide provides at least partial regulation of infection or contamination.

[0084] In an embodiment, it is also possible to incorporate or distribute the peptides within materials, on devices, or on objects (e.g., on an accessible surface) , where microbial growth or viable presence is undesirable, as a method of microbicidal or microbiostatic inhibition of microbial growth by administering to the devices or objects a microbicidal or microbiostatic effective amount of peptide. In an embodiment, such devices or objects include, but are not limited to, linens, cloth, plastics, latex fabrics, natural rubbers, implantable devices, surfaces, or storage containers.

[0085] III. METHOD OF TREATING MICROBIAL INFECTIONS

[0086] In clinical practice, microbial infections include infections caused by one or more pathogens of bacteria, viruses, fungi, or protozoa. Common clinical infectious eye diseases, such as conjunctivitis and keratitis, are mostly bacterial infections. A large number of clinical etiological analyses have shown that Gram-positive cocci, such as Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus and Micrococcus, are the main pathogenic bacteria; Gram-negative bacilli, such as Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli are the second most common pathogenic bacteria. However, the process of clinical detection of the specific kind of infection and determination of treatment options is relatively cumbersome. The present invention provides antimicrobial peptides to treat complex and resistant pathogen infections.

[0087] In some aspects, provided herein is a method of treating a microbial infection in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of the antimicrobial peptide or the pharmaceutical composition disclosed herein. In a particular embodiment, the microbial infection involves one or more of each of those kinds of organisms, e.g. two different kinds of bacteria, and so forth. In some embodiments, the infection is caused by a microbial organism selected from the group consisting of: methicillin-resistant Staphylococcus aureus, methicillin-sensitive Staphylococcus aureus, erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes, erythromycin-sensitive Streptococcus pyogenes, imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa, and imipenem-sensitive Pseudomonas aeruginosa. In some embodiments, the infection is selected from a group consisting of: primary skin infections caused by drug-resistant bacteria, secondary skin infections, burn wound infections, and bedsore infections.

[0088] In some aspects, the antimicrobial peptide of the present invention is for use in the manufacture of a medicament for treating microbial infections. The medicament can be administered in a variety of unit dosage forms, depending upon the method of administration.  Suitable unit dosage forms include, but are not limited to powders, tablets, pills, capsules, lozenges, suppositories, patches, nasal sprays, injectables, implantable sustained-release formulations, lipid complexes, etc.

[0089] In some embodiments, the medicament is for intravenous administration, oral administration in oral solid or liquid dosage forms, or topical dosage forms. In some embodiments, the dosage of the antimicrobial peptide is 0.01 to 500 mg per dose for intravenous administration or oral administration, and 1 / 10000 -10%per dose for topical dosage. In some embodiments, the dosage range of the preferred formulation of the crude drug of the present invention is 0.01 to 500 mg / kg.

[0090] It will be understood that a composition for application, e.g., by systemic injection, will contain an antimicrobial peptide in a therapeutically effective amount or a therapeutically effective amount of an antimicrobial peptide can be conjugated to another molecule with specificity for the target cell type. The other molecule can be an antibody, ligand, receptor, or other recognition molecule. In an embodiment, the choice of the peptide is made with consideration of immunogenicity and toxicity for an actually or potentially infected host, the effective dose of the peptide, and the sensitivity of the target microbe to the peptide, as known in the art.

[0091] In an embodiment, the method of inhibiting the growth of bacteria using the peptides of the invention may further include the addition of one or more other antimicrobial agents (e.g., a conventional antibiotic) for combination or synergistic therapy. The appropriate amount of the peptide administered will typically depend on the susceptibility of a bacterium, such as whether the bacterium is Gram-negative or Gram-positive, and will be easily discernible by one of the ordinary skill in the art.

[0092] While the invention is described with respect to use in humans, it is also suitable for animals, e.g., veterinary use. Thus, certain preferred organisms include, but are not limited to humans, non-human primates, canines, equines, felines, porcine, ungulates, lagomorphs, and the like.

[0093] IV. METHOD OF MAKING ANTIMICROBIAL PEPTIDES

[0094] The antimicrobial peptides of the present invention can be prepared by artificial synthesis, such as peptide solid-phase synthesis. Techniques for solid phase synthesis are well known to those of skill in the art and are described, for example, by Barany and Merrifield (1963)  Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part Ac, Merrifield et al. (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156, and Stewart et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, III, the content of each of which is incorporated herein in its entirety.

[0095] It is noted that in the chemical synthesis of peptides, particularly peptides comprising D amino acids, the synthesis usually produces a number of truncated peptides in addition to the desired full-length product. Thus, the peptides are typically purified using, e.g., HPLC. D-amino acids, beta-amino acids, non-natural amino acids, and the like can be incorporated at one or more positions in the peptide simply by using the appropriately derivatized amino acid residue in the chemical synthesis. Modified residues for solid-phase peptide synthesis are commercially available from a number of suppliers (see, e.g., Advanced Chem Tech, Louisville; Nova Biochem, San Diego; Sigma, St. Louis; Bachem California Inc., Torrance, etc., the content of which is incorporated herein in its entirety) .

[0096] One of the skills in the art would recognize that after chemical synthesis or purification, the peptide (s) may possess a conformation substantially different from the desired native conformation. In this case, it may be necessary to denature and reduce the peptide and then cause the molecule to re-fold into the preferred conformation. Methods of reducing and denaturing proteins and inducing re-folding are well known to those of skill in the art (see, e.g., Debinski et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; and Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270, the content of each of which is incorporated herein in its entirety) . Debinski et al., for example, describe the denaturation and reduction of inclusion body proteins in guanidine-DTE. The protein is then refolded in a redox buffer containing oxidized glutathione and L-arginine.

[0097] V. DEFINITIONS

[0098] Unless defined otherwise, all terms of art, notations and other technical and scientific terms or terminology used herein are intended to have the same meaning as is commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the claimed subject matter pertains. In some cases, terms with commonly understood meanings are defined herein for clarity and / or for ready reference, and the inclusion of such definitions herein should not necessarily be construed to represent a substantial difference over what is generally understood in the art.

[0099] When used herein, the term “amino acid” is intended to refer to any natural or non-natural amino acid, whether made naturally or synthetically, including any such in L-or D-configuration. The term can also encompass amino acid analog compounds used in peptidomimetics or peptoids. The term can include a modified or unusual amino acid or a synthetic derivative of an amino acid, e.g., diaminobutyric acid, diaminopropionic acid and the like.

[0100] The antimicrobial peptides of the invention are composed of amino acids linked together by peptide bonds. The peptides are in general in alpha-helical conformation under hydrophobic conditions. Sequences are conventionally given from the amino terminus to the carboxyl terminus. Unless otherwise noted, the amino acids are L-amino acids. When all the amino acids are L-configuration, the peptide is said to be an L-enantiomer. When all the amino acids are D-configuration, the peptide is said to be a D-enantiomer.

[0101] The term “minimal inhibitory concentration” (MIC) refers to the lowest concentration of an antimicrobial agent (e.g., a peptide) required to prevent growth or otherwise modify a function of a microorganism under certain conditions, for example in liquid broth medium, and can be determined for a number of different microorganisms according to standard techniques well known in the art.

[0102] The term “minimal hemolytic concentration” (MHC) refers to the lowest concentration of an agent or peptide required to cause hemolysis of blood cells. MHC can be determined with red blood cells (RBC) from various species, including human red blood cells (hRBC) .

[0103] The following abbreviations are used herein: A, Ala, Alanine; M, Met, Methionine; C, Cys, Cysteine; D, Asp, Aspartic Acid; E, Glu, Glutamic Acid; F, Phe, Phenylalanine; G, Gly, Glycine; H, His, Histidine; I, Ile, Isoleucine; K, Lys, Lysine; L, Leu, Leucine; N, Asn, Asparagine; P, Pro, Proline; Q, Glu, Glutamine; R, Arg, Arginine; S, Ser, Serine; T, Thr, Threonine; V, Val, Valine; W, Trp, Tryptophan; Y, Tyr, Tyrosine; Dab, diaminobutyric acid; Dap, diaminopropionic acid; Orn, ornithine; RP-HPLC, reversed-phase high-performance liquid chromatography; MIC, minimal inhibitory concentration; MHC, minimal hemolytic concentration; CD, circular dichroism spectroscopy; TFE, trifluoroethanol; TFA, trifluoroacetic acid; RBC, red blood cells; hRBC, human red blood cells.

[0104] The term “antimicrobial activity” refers to the ability of a peptide of the present invention to modify a function or metabolic process of a target microorganism, for example, so as to at least partially affect replication, vegetative growth, toxin production, survival, viability in a quiescent state, or another attribute. In an embodiment, the term relates to the inhibition of the  growth of a microorganism. In a particular embodiment, antimicrobial activity relates to the ability of a peptide to kill at least one microbial species. In a particular embodiment, the microbial species are selected from the group consisting of Gram-positive and Gram-negative bacteria. In an embodiment, the term can be manifested as microbicidal or microbiostatic inhibition of microbial growth.

[0105] The term “microorganism” or “microbe” herein refers broadly to bacteria, fungi, viruses, and protozoa. In particular, the term is applicable to a microorganism having a cellular or structural component of a lipid bilayer membrane. In specific embodiments, the membrane is a cytoplasmic membrane. Pathogenic bacteria, fungi, viruses, and protozoa as known in the art are generally encompassed. Bacteria can include Gram-negative and Gram-positive bacteria in addition to organisms classified in orders of the class Mollicutes and the like, such as species of the Mycoplasma and Acholeplasma genera. Specific examples of potentially sensitive Gram-negative bacteria include, but are not limited to, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Hemophilus influenza, Neisseria, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus and Helicobacter pylori. Examples of potentially sensitive Gram-positive bacteria include, but are not limited to, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Streptococcus agalactiae, Group A Streptococcus, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Group B Gram-positive Streptococcus, Corynebacterium xerosis, and Listeria monocytogenes. Examples of potentially sensitive fungi include yeasts such as Candida albicans. Examples of potentially sensitive viruses include measles virus, herpes simplex virus (HSV-1 and -2) , herpes family members (HIV, hepatitis C, vesicular, stomatitis virus (VSV) , visna virus, and cytomegalovirus (CMV) . Examples of potentially sensitive protozoa include Giardia.

[0106] “Therapeutically effective” as used herein, refers to an amount of formulation, composition, or reagent in a pharmaceutically acceptable carrier or a physiologically acceptable salt of an active compound, that is of sufficient quantity to ameliorate the undesirable state of the patient, animal, material, or object so treated. “Ameliorate” refers to a lessening of the detrimental effect of the disease state or disorder, or reduction in contamination, in the receiver of the treatment.

[0107] The peptides of the invention have antimicrobial activity by themselves or when covalently conjugated or otherwise coupled or associated with another molecule, e.g., polyethylene glycol or a carrier protein such as bovine serum albumin, so long as the peptides are positioned such that they can come into contact with a cell or unit of the target microorganism.  These peptides may be modified by methods known in the art provided that the antimicrobial activity is not destroyed or substantially compromised.

[0108] VI. EXEMPLARY EMBODIMENTS

[0109] Embodiment 1. An antimicrobial peptide comprising an 11-amino acid portion comprising 5 to 6 hydrophilic residues and 6 to 5 hydrophobic residues, wherein the antimicrobial peptide has an ellipticity of 60%to 100%relative to that of a peptide having the sequence LysD-LysD-LeuD-LeuD-LysD-LeuD-LeuD-LysD-LysD-LeuD-LeuD (SEQ ID NO: 13) , wherein the antimicrobial peptide does not comprise Lys-Lys-Leu-Leu-Phe-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys (SEQ ID NO: 14) .

[0110] Embodiment 2. The antimicrobial peptide of embodiment 1, wherein the antimicrobial peptide comprises a sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

[0111] Embodiment 3. The antimicrobial peptide of embodiment 1, wherein the antimicrobial peptide comprises a variant of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the variant peptide comprises: 1) a substitution of a lysine (Lys) residue with an arginine (Arg) , a histidine (His) , an ornithine (Orn) , a diaminobutyric acid (Dab) , or a diaminopropionic acid (Dap) , and / or 2) a substitution of a leucine (Leu) residue with an alanine (Ala) , an isoleucine (Ile) , a phenylalanine (Phe) , a tryptophan (Trp) or a valine (Val) .

[0112] Embodiment 4. The antimicrobial peptide of embodiment 3, wherein the antimicrobial peptide comprises a substitution of a Lys residue with an Arg, a His, an Orn, a Dab or a Dap.

[0113] Embodiment 5. The antimicrobial peptide of embodiment 4, wherein the antimicrobial peptide comprises two or more substitutions of Lys residues with Arg, His, Dab, Dap, or Orn.

[0114] Embodiment 6. The antimicrobial peptide of embodiment 5, wherein the antimicrobial peptide comprises substitutions of all Lys residues of SEQ ID NO: 1 with Arg, His, Dab, Dap, or Orn.

[0115] Embodiment 7. The antimicrobial peptide of embodiment 6, wherein all Lys residues of SEQ ID NO: 1 are substituted with Dab.

[0116] Embodiment 8. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 3-7, wherein the antimicrobial peptide comprises a substitution of a Leu residue with an Ala, an Ile, a Phe, a Trp or a Val.

[0117] Embodiment 9. The antimicrobial peptide of claim 8, wherein the antimicrobial peptide comprises two or more substitutions of Leu residues with Ala, Phe, Ile, Trp or Val.

[0118] Embodiment 10. The antimicrobial peptide of embodiment 9, wherein the Leu residues at positions 10 and 11 of SEQ ID NO: 1 are substituted with Phe.

[0119] Embodiment 11. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 3-10, wherein the antimicrobial peptide comprises substitutions of all Lys residues of SEQ ID NO: 1 with Dab and substitutions of the Leu residues at positions 10 and 11 of SEQ ID NO: 1 with Phe.

[0120] Embodiment 12. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 8-11, wherein the Leu residue at position 7 of SEQ ID NO: 1 is substituted with Val.

[0121] Embodiment 13. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 3-12, wherein all Lys residues of SEQ ID NO: 1 are substituted with Dab, the Leu residues at positions 10 and 11 of SEQ ID NO: 1 are substituted with Phe, and the Leu residue at position 7 of SEQ ID NO: 1 is substituted with Val.

[0122] Embodiment 14. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 3-13, wherein the antimicrobial peptide comprises substitution of two residues with each other.

[0123] Embodiment 15. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 3-14, wherein the antimicrobial peptide comprises a sequence set forth in SEQ ID NO: 7.

[0124] Embodiment 16. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 3-14, wherein the antimicrobial peptide comprises a sequence set forth in SEQ ID NO: 9.

[0125] Embodiment 17. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 1-16, wherein the antimicrobial peptide has a length of 11 amino acids.

[0126] Embodiment 18. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 1-17, wherein the antimicrobial peptide has a net charge of +5 or +6.

[0127] Embodiment 19. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 1-18, wherein the antimicrobial peptide comprises a blocked N-terminus.

[0128] Embodiment 20. The antimicrobial peptide of embodiment 19, wherein the N-terminus of the antimicrobial peptide is blocked through acylation, alkylation, arylation, esterification, or fatty acidation.

[0129] Embodiment 21. The antimicrobial peptide of embodiment 19 or 20, wherein the N-terminus of the antimicrobial peptide is blocked by an acetyl group.

[0130] Embodiment 22. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 1-18, wherein the antimicrobial peptide comprises a free N-terminus.

[0131] Embodiment 23. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 1-22, wherein the antimicrobial peptide comprises a blocked C-terminus.

[0132] Embodiment 24. The antimicrobial peptide of embodiment 23, wherein the C-terminus is blocked through acylation, alkylation, arylation, esterification, fatty acidation, or reduction.

[0133] Embodiment 25. The antimicrobial peptide of embodiment 23 or 24, wherein the C-terminus is blocked by an NH2 group.

[0134] Embodiment 26. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 1-22, wherein the antimicrobial peptide comprises a free C-terminus.

[0135] Embodiment 27. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 1-26, wherein at least one of the amino acids in the antimicrobial peptide is a D-amino acid.

[0136] Embodiment 28. The antimicrobial peptide of embodiment 27, wherein all amino acids in the antimicrobial peptide are D-amino acids.

[0137] Embodiment 29. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 1-28, wherein the antimicrobial peptide comprises a sequence set forth in SEQ ID NO: 16.

[0138] Embodiment 30. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 1-28, wherein the antimicrobial peptide comprises a sequence set forth in SEQ ID NO: 17.

[0139] Embodiment 31. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 1-28, wherein the antimicrobial peptide comprises a sequence set forth in SEQ ID NO: 18.

[0140] Embodiment 32. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 1-29, wherein at least one of the amino acids in the antimicrobial peptide is a L-amino acid.

[0141] Embodiment 33. The antimicrobial peptide of embodiment 32, wherein no more than 30%of the amino acids in the antimicrobial peptide are L-amino acids.

[0142] Embodiment 34. The antimicrobial peptide of embodiment 33, wherein all amino acids in the antimicrobial peptide are L-amino acids.

[0143] Embodiment 35. The antimicrobial peptide of any one of embodiments 1-34, wherein the antimicrobial peptide adopts an α-helical secondary structure in a hydrophobic environment and a random coil structure in an aqueous medium.

[0144] Embodiment 36. A method of killing a microbial organism, comprising contacting the microbial organism with the antimicrobial peptide of any one of embodiments 1-35.

[0145] Embodiment 37. A method of treating a microbial infection in an individual, comprising contacting the individual with an effective amount of the antimicrobial peptide of any one of embodiments 1-35.

[0146] Embodiment 38. Use of the antimicrobial peptide of any one of embodiments 1-35 for the manufacture of a medicament for treating a microbial infection.

[0147] Embodiment 39. The method or use of any one of embodiments 36-38, wherein the infection is caused by a microbial organism selected from the group consisting of: methicillin-resistant Staphylococcus aureus, methicillin-sensitive Staphylococcus aureus, erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes, erythromycin-sensitive Streptococcus pyogenes, imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa, and imipenem-sensitive Pseudomonas aeruginosa.

[0148] Embodiment 40. The method or use of any one of embodiments 36-39, wherein the infection is selected from the group consisting of: primary skin infections caused by drug-resistant bacteria, secondary skin infections, burn wound infections, and bedsore infections.

[0149] Embodiment 41. A method of making the antimicrobial peptide of any one of embodiments 1-35, comprising synthesizing the antimicrobial peptide using solid-phase chemical synthesis.

[0150] VII. EXAMPLES

[0151] The following examples are included for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention.

[0152] Example 1 Features of the antimicrobial peptides of the present invention

[0153] SEQ ID NO: 1 comprises 11 amino acid residues and is an amphiphilic α-helical antimicrobial peptide with one polar face and one nonpolar face. Its polar face consists of 6 hydrophilic amino acids (lysine) and its non-polar face consists of 5 hydrophobic amino acids (leucine) . The hydrophobic amino acids on the surface of the peptide constitute the overall hydrophobic surface of the peptide through hydrophobic interactions.

[0154] SEQ ID NOs: 7 and 9 comprise multiple substitutions compared to SEQ ID NO: 1 (FIGs. 1B-1D) . Peptides with multiple substitutions were shown to maintain strong biological activities compared to peptides with a single substitution. Additionally, it was shown that peptides that comprise rearrangement of amino acid residues (substitution of two residues with each other) especially hydrophilic amino acid residues exhibit strong biological activities. The rearrangement could comprise reorganization of hydrophobic amino acid residues on non-polar faces, reorganization of hydrophilic amino acid residues on polar faces, or reorganization of amino acid residues on polar and non-polar faces without substantially changing the amphiphilicity of the peptide molecule.

[0155] Example 2 Peptides comprising amino acid substitutions

[0156] Further peptides of the present invention are variant peptides formed by substituting amino acid residues at a one or more sites (Table 2) .

[0157] Table 2. Residue substitution for SEQ ID NO: 1

[0158] Peptides in the present invention were synthesized by solid-phase synthesis, using t-butyloxycarbonyl chemistry and MBHA (4-methylbenzhydrylamine) resin (0.97 mmol / g) , as described previously (Chen et al., J Pept Res 59, 18-33) . However, it is understood in the art that there are other suitable peptide synthetic devices or that manual peptide synthesis could be carried out to produce the peptides of the present invention. The crude peptides synthesized were separated and purified by preparative reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) using a Zorbax 300 SB-C8 column (Agilent Technologies; 250×9.4mm inner diameter; 6.5μm particle size;  pore size) using a linear AB gradient (0.1%acetonitrile / min) at a flow rate of 2 ml / min, where mobile phase A and mobile phase B were 0.1%TFA in acetonitrile. The purity of the peptides was verified by analytical RP-HPLC as described below. The peptides were further characterized by mass spectrometry and amino acid analysis.

[0159] RP-HPLC Analyses: Analyses were conducted using a Zorbax 300 SB-C8 column (Agilent Technologies; 150×4.6 mm inner diameter; 5μm particle size;  pore size) using a linear AB gradient (1%acetonitrile / min) at a flow rate of 1 ml / min, where mobile phase A was 0.1%aqueous trifluoroacetic acid (TFA) in water and mobile phase B was 0.1%TFA in acetonitrile.

[0160] Characterization of helical structure: The mean residue molar ellipticities of antimicrobial peptides were measured by circular dichroism (CD) spectroscopy using a Jasco J-720 spectropolarimeter (Jasco, Easton, MD) in hydrophilic conditions (10 mM PBS buffer, pH 7.2) as well as in the presence of an α-helix inducing solvent, 2, 2, 2-Trifluoroethanol (TFE) (50 mM KH2PO4 / K2HPO4 / 100 mM KCl, pH 7 buffer / 50%TFE) (to simulate the hydrophobic environment of the cell membrane) at 25 ℃. Each peptide was measured in a 1 mm quartz test tube at 75 μM and scanned from 190 nm to 250 nm. The larger the ellipticity, the greater the helical degree of the peptide.

[0161] As shown in FIG. 2, peptides comprising the sequences set forth in SEQ ID NOs: 16, 17, and 18, and an acetyl group at the N-terminus and an NH2 group at the C-terminus, and amino  acids in the peptides being D-amino acids unless otherwise specified, were fully folded into α-helical structure under induction of 50%TFE. The helical degree of the three peptides decreased compared to SEQ ID NO: 14.

[0162] Additionally, the ellipticity of the peptides was further compared to a highly hydrophobic peptide (SEQ ID NO: 13) . As shown in Table 3, the peptides of the present invention have relative ellipticity ranging from about 60 to about 100 compared to the highly hydrophobic SEQ ID NO: 13.

[0163] Table 3. Peptide ellipticity

[0164] In RP-HPLC, retention is dominated by the overall hydrophobic or nonpolar nature of the analytes. Hydrophobic binding domains created by the secondary structure of the peptide affect the binding of the peptide to the stationary phase of the reversed-phase column, and this effect is particularly significant in amphipathic peptides. As a result, amphiphilic α-helical peptides retain longer than non-amphipathic peptides with the same amino acid composition. The conditions for RP-HPLC (such as the hydrophobic stationary phase and the non-polar eluent) could induce and stabilize the helical structure of potential helical peptides in a way that is similar to that of trifluoroethanol. Therefore, the change in hydrophobicity brought about by different amino acid substitutions can be directly reflected in the retention time of RP-HPLC.

[0165] Furthermore, the self-associating ability of the peptide set forth in SEQ ID NO: 1 and related peptides was determined by temperature profiling in reversed-phase chromatography. Self-associating ability results from interactions with the nonpolar face of the α-helix of amphiphilic peptides. α-helical structures can be induced by the hydrophobic conditions of the column (e.g., the hydrophobic stationary phase and the hydrophobic organic reagent in the mobile phase) and by using acetonitrile containing 0.1%TFA. Temperature profiling in reversed-phase chromatography has been used on many different kinds of molecules, including cyclic β-sheet peptides, monomeric α-helical peptides and dimeric α-helical peptides and dimeric helical peptides forming superhelical structures. The elution of peptides on chromatographic reversed-phase columns mainly depends on adsorption and desorption. Even if a peptide is strongly bound to the hydrophobic stationary phase, the peptide will partition between the mobile phase and the  stationary phase when the concentration of acetonitrile in the mobile phase reaches a certain threshold. The mechanism behind it has been hypothesized as follows: 1) amphipathic α-helical molecules capable of dimer formation at low temperatures will certainly form dimers in aqueous solutions (hydrophobic, non-polar face) in reversed-phase chromatography; 2) since the dimer is destroyed at high temperatures, the monomer-dimer equilibrium favors the monomer direction; 3) when the temperature is high enough, only monomers exist in aqueous solutions; 4) peptides can only bind to the stationary phase of the column in the form of monomers; that is, dimers can only exist in the solution, and only the dimers that have been destroyed can be combined with the stationary phase of the column.

[0166] Usually, the self-association is achieved through the hydrophobic interaction of the hydrophobic surface of the peptide, which causes the binding ability of the polymer to the stationary phase of the column to be weakened, so the retention time is relatively low. As the temperature increases, the balance of polymer-monomer interconversion shifts toward monomers. The distribution of high-concentration monomers on the chromatographic column increases the binding probability of the peptide to the chromatographic column, so the retention time is relatively increased. It is worth noting that increasing the temperature also introduces other effects, such as a reduction of the viscosity of the mobile phase and an increase in the mass transfer between the mobile phase and the stationary phase.

[0167] A disordered peptide (peptide C) was used as the control in temperature profiling in reversed-phase chromatography. Peptide C is 18 amino acids long and comprises the sequence Ac-ELEKGGLEGEKGGKELEK-NH2 (SEQ ID NO: 15) . Peptide C remains disordered even under strong induction by 50%TFE at 10℃. Since peptide C is in a disordered state of monomers in both the aqueous phase and the hydrophobic medium, the change in its retention behavior from 10℃ to 80℃ only reflects the influence of temperature on the retention behavior of the peptide. The retention time decreases linearly with increasing temperature due to higher solute diffusivity and enhanced mass transfer caused by the high temperature between the stationary and mobile phases. Peptides exist in the state of polymers at 10 ℃, but at 80℃ the polymers decompose into monomers due to high-temperature denaturation of the peptides. Therefore, using peptide C as the control, retention only correlates with the self-associating ability of the peptide. The ability to self-associate is directly related to the hydrophobicity of peptides. When the temperature is raised, the α-helical structure is destroyed, the disordered structure of the peptide increases, and the retention time decreases.

[0168] PA represents the dissociation constant of each peptide in temperature profiling in reversed-phase chromatography, and it is used to quantify the ability of peptides to form aggregates in an aqueous solution. It is defined as the largest value of ( (tRt-tR10peptide) - (tRt-tR10peptide C) ) , wherein (tRt-tR10peptide) represents the retention time difference of the peptide at a given temperature (t) and at 10 ℃. Peptide C is a control peptide with a disordered structure, and its retention behavior in RP-HPLC can be used to control for changes in the RP-HPLC system due to temperature changes. Therefore, the data accurately reflect changes in the physical properties of peptides at different temperatures.

[0169] FIG. 3 shows how the retention time changes in RP-HPLC from 10 ℃ to 80 ℃ for each peptide. As shown by the retention time of the disordered control peptide C, the retention time decreases linearly with increasing temperature. Conversely, for polymerized peptides, increasing the temperature will destroy the polymer and convert it into a monomer, which has a strong ability to bind to the stationary phase of the column, so that the retention time will reach its maximum. Above this critical temperature, we observed that the retention time of the peptide begins to decrease as the temperature continues to increase. This is mainly due to reduced mobile phase viscosity and increased mass transfer, as well as high-temperature denaturation of peptide molecules.

[0170] The peptides set forth in SEQ ID NOs: 16, 17, and 18 exhibited different self-interacting abilities in the aqueous solution. As shown in FIG. 3, the self-associating abilities of the peptides of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 are similar, and are both lower compared with SEQ ID NO: 14, indicating reduced hemolytic toxicity and improved antibacterial specificity. The peptides in the figure comprise an acetyl group at the N-terminus and an NH2 group at the C-terminus, and the amino acids in the peptides are D-amino acids unless otherwise specified.

[0171] Example 3 Biological activities of SEQ ID NO: 1 and its analogs

[0172] Four strains of microorganisms (Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, and Candida albicans ATCC 10231) were tested for drug susceptibility by microbroth dilution in a 96-well plate. The microorganisms were cultured in Lysogeny broth (LB) or Sabouraud agar. The peptides of the present invention were dissolved and diluted in Mueller Hinton broth (M-H broth) to 512 μg / ml, after which 100 μl was added to the first row of the 96-well plate, and subsequently the second to the tenth rows by serial dilution. The 11th row was a positive control containing 100 μl of M-H broth, and the 12th row was a negative control containing 200 μl of M-H broth. 100 μl of the  prepared bacterial solution to each well of the 1st to the 11th row so that the final concentrations of the peptides were 128 μg / ml, 64 μg / ml, 32 μg / ml, 16 μg / ml, 8 μg / ml, 4 μg / ml, 2 μg / ml, 1 μg / ml, 0.5 μg / ml, and 0.25 μg / ml, respectively, and that the concentration of the microorganisms was 105 CFU / well. There were 3 duplicates for each peptide at each concentration. The plate was shaken lightly for 5 min, and placed in a 37℃ incubator for 18 hours. The minimum concentration at which no turbidity occurs in the well is the minimum inhibitory concentration (MIC) of the peptide against the strain.

[0173] The hemolytic activity (MHC) of each of the peptides was measured. The MIC and MHC of the first set of peptides are shown in Table 4. Compared to the control (SEQ ID NO: 14) , the peptides showed higher MHC, indicating increased safety. Some peptides also showed reduced MIC compared to the control, such as SEQ ID NOs: 1 and 16.

[0174] Table 4. MIC and MHC of peptides of the present invention

[0175] Example 4: In vivo toxicity of SEQ ID NOs: 16, 17, and 18

[0176] ICR mice were randomly divided into groups according to body weight, with 4 mice in each group, half male and half female. The mice were fasted for 12 hours prior to peptide administration. Each of the peptides was diluted with sterile saline. Starting at 25 mg / kg, the dose  was increased or decreased by a factor of 2 to determine the Dn and Dm values. Based on the Dn and Dm values, 5 groups were set up, with a 0.8 dose ratio between the groups, and 8 mice in each group, half male and half male. After the peptide was injected into the tail vein, the animals were observed for a week for behaviors, poison reactions, and death. The LD50 values and 95%confidence intervals were calculated as shown in Table 5. The results showed that SEQ ID NOs: 16, 17, and 18 had a higher LD50, indicating lower toxicity. The peptides comprise an acetyl group at the N-terminus and an NH2 group at the C-terminus, and the amino acids in the peptides are D-amino acids unless otherwise specified.

[0177] Table 5. In vivo toxicity of SEQ ID NOs: 16, 17, and 18

[0178] The present invention is not intended to be limited in scope to the particular disclosed embodiments, which are provided, for example, to illustrate various aspects of the invention. Various modifications to the compositions and methods described will become apparent from the description and teachings herein. Such variations may be practiced without departing from the true scope and spirit of the disclosure and are intended to fall within the scope of the present disclosure.

[0179] SEQUENCES

Claims

1.An antimicrobial peptide comprising an 11-amino acid portion comprising 5 to 6 hydrophilic residues and 6 to 5 hydrophobic residues, wherein the antimicrobial peptide has an ellipticity of 60%to 100%relative to that of a peptide having the sequence LysD-LysD-LeuD-LeuD-LysD-LeuD-LeuD-LysD-LysD-LeuD-LeuD (SEQ ID NO: 13) , wherein the antimicrobial peptide does not comprise Lys-Lys-Leu-Leu-Phe-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys (SEQ ID NO: 14) .2.The antimicrobial peptide of claim 1, wherein the antimicrobial peptide comprises a sequence set forth in SEQ ID NO: 1.3.The antimicrobial peptide of claim 1, wherein the antimicrobial peptide comprises a variant of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the variant peptide comprises: 1) a substitution of a lysine (Lys) residue with an arginine (Arg) , a histidine (His) , an ornithine (Orn) , a diaminobutyric acid (Dab) , or a diaminopropionic acid (Dap) , and / or 2) a substitution of a leucine (Leu) residue with an alanine (Ala) , an isoleucine (Ile) , a phenylalanine (Phe) , a tryptophan (Trp) or a valine (Val) .4.The antimicrobial peptide of claim 3, wherein the antimicrobial peptide comprises a substitution of a Lys residue with an Arg, a His, an Orn, a Dab or a Dap.5.The antimicrobial peptide of claim 4, wherein the antimicrobial peptide comprises two or more substitutions of Lys residues with Arg, His, Dab, Dap, or Orn.6.The antimicrobial peptide of claim 5, wherein the antimicrobial peptide comprises substitutions of all Lys residues of SEQ ID NO: 1 with Arg, His, Dab, Dap, or Orn.7.The antimicrobial peptide of claim 6, wherein all Lys residues of SEQ ID NO: 1 are substituted with Dab.8.The antimicrobial peptide of any one of claims 3-7, wherein the antimicrobial peptide comprises a substitution of a Leu residue with an Ala, an Ile, a Phe, a Trp or a Val.9.The antimicrobial peptide of claim 8, wherein the antimicrobial peptide comprises two or more substitutions of Leu residues with Ala, Phe, Ile, Trp or Val.10.The antimicrobial peptide of claim 9, wherein the Leu residues at positions 10 and 11 of SEQ ID NO: 1 are substituted with Phe.11.The antimicrobial peptide of claim any one of claims 3-10, wherein the antimicrobial peptide comprises substitutions of all Lys residues of SEQ ID NO: 1 with Dab and substitutions of the Leu residues at positions 10 and 11 of SEQ ID NO: 1 with Phe.12.The antimicrobial peptide of any one of claims 8-11, wherein the Leu residue at position 7 of SEQ ID NO: 1 is substituted with Val.13.The antimicrobial peptide of claim any one of claims 3-12, wherein all Lys residues of SEQ ID NO: 1 are substituted with Dab, the Leu residues at positions 10 and 11 of SEQ ID NO: 1 are substituted with Phe, and the Leu residue at position 7 of SEQ ID NO: 1 is substituted with Val.14.The antimicrobial peptide of any one of claims 3-13, wherein the antimicrobial peptide comprises substitution of two residues with each other.15.The antimicrobial peptide of any one of claims 3-14, wherein the antimicrobial peptide comprises a sequence set forth in SEQ ID NO: 7.16.The antimicrobial peptide of any one of claims 3-14, wherein the antimicrobial peptide comprises a sequence set forth in SEQ ID NO: 9.17.The antimicrobial peptide of any one of claims 1-16, wherein the antimicrobial peptide has a length of 11 amino acids.18.The antimicrobial peptide of any one of claims 1-17, wherein the antimicrobial peptide has a net charge of +5 or +6.19.The antimicrobial peptide of any one of claims 1-18, wherein the antimicrobial peptide comprises a blocked N-terminus.20.The antimicrobial peptide of claim 19, wherein the N-terminus of the antimicrobial peptide is blocked through acylation, alkylation, arylation, esterification, or fatty acidation.21.The antimicrobial peptide of claim 19 or 20, wherein the N-terminus of the antimicrobial peptide is blocked by an acetyl group.22.The antimicrobial peptide of any one of claims 1-18, wherein the antimicrobial peptide comprises a free N-terminus.23.The antimicrobial peptide of any one of claims 1-22, wherein the antimicrobial peptide comprises a blocked C-terminus.24.The antimicrobial peptide of claim 23, wherein the C-terminus is blocked through acylation, alkylation, arylation, esterification, fatty acidation, or reduction.25.The antimicrobial peptide of claim 23 or 24, wherein the C-terminus is blocked by an NH2 group.26.The antimicrobial peptide of any one of claims 1-22, wherein the antimicrobial peptide comprises a free C-terminus.27.The antimicrobial peptide of any one of claims 1-26, wherein at least one of the amino acids in the antimicrobial peptide is a D-amino acid.28.The antimicrobial peptide of claim 27, wherein all amino acids in the antimicrobial peptide are D-amino acids.29.The antimicrobial peptide of any one of claims 1-28, wherein the antimicrobial peptide comprises a sequence set forth in SEQ ID NO: 16.30.The antimicrobial peptide of any one of claims 1-28, wherein the antimicrobial peptide comprises a sequence set forth in SEQ ID NO: 17.31.The antimicrobial peptide of any one of claims 1-28, wherein the antimicrobial peptide comprises a sequence set forth in SEQ ID NO: 18.32.The antimicrobial peptide of any one of claims 1-29, wherein at least one of the amino acids in the antimicrobial peptide is a L-amino acid.33.The antimicrobial peptide of claim 32, wherein no more than 30%of the amino acids in the antimicrobial peptide are L-amino acids.34.The antimicrobial peptide of claim 33, wherein all amino acids in the antimicrobial peptide are L-amino acids.35.The antimicrobial peptide of any one of claims 1-34, wherein the antimicrobial peptide adopts an α-helical secondary structure in a hydrophobic environment and a random coil structure in an aqueous medium.36.A method of killing a microbial organism, comprising contacting the microbial organism with the antimicrobial peptide of any one of claims 1-35.37.A method of treating a microbial infection in an individual, comprising contacting the individual with an effective amount of the antimicrobial peptide of any one of claims 1-35.38.Use of the antimicrobial peptide of any one of claims 1-35 for the manufacture of a medicament for treating a microbial infection.39.The method or use of any one of claims 36-38, wherein the infection is caused by a microbial organism selected from the group consisting of: methicillin-resistant Staphylococcus aureus, methicillin-sensitive Staphylococcus aureus, erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes, erythromycin-sensitive Streptococcus pyogenes, imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa, and imipenem-sensitive Pseudomonas aeruginosa.40.The method or use of any one of claims 36-39, wherein the infection is selected from the group consisting of: primary skin infections caused by drug-resistant bacteria, secondary skin infections, burn wound infections, and bedsore infections.41.A method of making the antimicrobial peptide of any one of claims 1-35, comprising synthesizing the antimicrobial peptide using solid-phase chemical synthesis.

Images